17.3.04 AOAC Método oficial 991.

14
Recuentos de coliformes y Escherichia coli en alimentos
Película seca rehidratable
(Petrifilm E. coli / placa de recuento de coliformes)

Consulte la tabla 991.14 para ver los resultados del estudio interlaboratorio que respalda la
aceptación del método.

A. Principio

Ver 989.10A

B. Aparato y reactivo

Ver 989.10B

Placas de recuento de E. coli: las placas son similares a las placas de recuento de coliformes, 989.10B
(véase 17.3.03), con adición de 5-bromo-4cloro-3indol-B-D-glucorónido e indicador de actividad de
glucuronidasa.

Esto permite leer coliformes y E. coli en la misma placa.

Las placas de recuento de Petrifilm E. Coli (productos de microbiología, San Pablo, MN, EE. UU.)
Cumplen estas especificaciones.

C. Preparación de la suspensión de prueba.

ver 966.23B (ver 17.2.01) y 986.33 C (ver 17.3.02)

D. Análisis

(a) Recuento de coliformes: coloque la película seca. placa de recuento de E.coli. B, o lugar de
recuento de coliformes, 989.10 B (b) (Ver 17.3.03), en superficie plana. Levante la película superior e
inocule 1 ml de suspensión de prueba en el centro de la base de la película. Coloque con cuidado la
película superior sobre el inóculo. Distribuya la suspensión de prueba sobre el área de crecimiento
prescrita con presión hacia abajo en el centro del dispositivo separador de plástico (lado plano hacia
abajo). Placa de descanso sin perturbar 1 min para permitir que el gel se solidifique. Incubar las
placas 24 ± 2 h a 35 ± 1º C.

En la incubadora, coloque las placas en posición horizontal, con el lado despejado hacia arriba, en
pilas que no excedan de 20 unidades. Cuente las placas inmediatamente después del período de
incubación. Una vez completada la incubación, las placas pueden almacenarse congeladas (<15ºC)
hasta 7 días. Esto debe evitarse como práctica habitual. Use el contador de colonias estándar para
contar. El iluminador de lupa también se puede usar para facilitar el conteo. Los coliformes aparecen
como colonias rojas que tienen una o más burbujas de gas asociadas (dentro del diámetro de una
colonia) con ellas. Cuente todas las colonias en rango contable (15-150 colonias). Las colonias rojas
sin burbujas de gas no se cuentan como organismos coliformes.
(b) Recuento de E. coli: utilice la placa de recuento de E. coli y proceda como en (a). Incubar y 24 ±
2h adicionales (48±4h en total). mi. Las colonias de col aparecen como colonias azules asociadas con
burbujas de gas, otros coliformes aparecen como colonias rojas con gas.

17.3.04 A

Método oficial AOAC 2000.15

Enumeración rápida de coliformes en los alimentos.

Método de película seca rehidratable.

(Aplicable a la determinación de coliformes confirmados a las 14 y 24 h en alimentos. No aplicable a

las papas hash brown)

Consulte las tablas 2000.15 A y B para ver los resultados del estudio interlaboratorio que respalda la
aceptación del método.

A. Principio

El método utiliza placas de cultivo bacteriano de medio seco y gel soluble en agua fría. Se añaden
suspensiones de prueba sin diluir o diluidas a las placas a un volumen de 1,0 ml por placa. Cuando se
aplica al esparcidor de plástico colocado sobre una película de recubrimiento, extienda la suspensión
uniformemente sobre un área de crecimiento de 20 cm 2. El agente gelificante se deja solidificar, y las
placas se incuban y se cuentan. Se puede usar una pipeta serológica o una pipeta automática para la
adición de suspensión para el análisis de recuento bacteriano.

B. Aparato y reactivo

(a) placas de recuento rápido de coliformes petrifilm (RCC). (Las placas disponibles en los productos
de 3M Microbiology, )contienen nutrientes modificados de bilis roja violeta (VRB), gelificante soluble
en agua fría, tinte indicador de tetrazolio e indicador de pH.

(b) Esparcidor de plástico: provisto de placas de petrifilm, tiene un lado empotrado y un lado plano
liso, diseñado para extender la suspensión de manera uniforme sobre el área de crecimiento de la
placa.

(c) Pipetas: pipetas serológicas de 1,0 y 10,0 ml con graduaciones de 0,1 ml. Las pipetas deben
entregar con precisión el volumen requerido. No use pipeta <10% de su volumen total. Por ejemplo,
para administrar 1 ml, no use pipeta> 10 ml, para administrar 0.1 ml, no use pipeta> 1 ml. (Se puede
usar pipeteador 3M calibrado, pipeteador electrónico, o equivalente, para administrar 1.0 ml)

(d) Contador de colonias

(e) Solución de hidróxido de sodio estéril - 1 M. Disuelva 40 g de NaOH en 1 litro de agua. Autoclave
15 min a 121 C

(f) Agua de dilución: prepare la solución madre disolviendo 34 g de H 2PO4 en 500 ml de agua,
ajústela a pH 7,2 con NaOH 1 M (aprox. 175 ml) y diluya a 1 L con agua. Prepare el agua tamponada
para las diluciones diluyendo 1,25 ml de solución madre a 1 litro con agua hervida y enfriada.
Autoclave 15 min a 121 C

(g) Licuadora o estomago: licuadora en guerra o equivalente, 400 stomacher o equivalente.

C. Preparación de la suspensión de prueba.

Prepare la suspensión de prueba como en 966.23B (ver 17.2.01). Las diluciones especificadas son
para máxima sensibilidad. Se pueden colocar diluciones más altas en placas según sea necesario. No
use diluyentes que contengan citrato de tiosulfato. Mezcle todas las diluciones agitando 25 x 30 cm
en 7 s. Mezclar o licuar sólidos 2 min para homogenizar productos.

(a) Leche entera, leche al 2%, leche al 1%, leche descremada y leche cruda - Placa 1 ml de producto
sin diluir o diluido en la placa de recuento de coliformes de película seca. El recuento de colonias
incubadas en la placa sin diluir es: recuento/g.

(b) Helados y mezclas, leche con chocolate. - Hacer una dilución 1:10 del producto (11 g / 99 ml de
agua de dilución, B (f)). Placa 1 ml en placa de recuento de coliformes de película seca, B (a) Incubar.
Multiplique el recuento de colonias por dilución para obtener el recuento / g.

(c) Mantequilla y margarina - Proceda como en (b) con diluyente precalentado a 40-45 º C. No use
solución tampón de citrato para homogeneizar el producto.

d) Crema agria, yogurt y yogurt congelado - Proceda como en (b) Después de la dilución, ajuste el pH
a 6.5-7.5 con NaOH 1 M, B (e), (aproximadamente 0.1 ml / g de producto)

(e) Queso cheedar, requesón, leche en polvo instantánea sin grasa, suero en polvo y productos
relacionados - Proceda como en (b). No use solución tampón de citrato para homogeneizar el
producto.

(f) Alimentos no lácteos: pese 50 g de la porción de prueba en el vaso de la licuadora estéril. Agregue
450 ml de diluyente y mezcle durante 2 minutos en un vaso mezclador de alta velocidad a 16000-
18000 rpm. Según sea necesario, ajuste el pH de la suspensión a 6.5-7.5 con NaOH 1 M,
(aproximadamente 0,1 ml / g de suspensión). Si la muestra de prueba completa contiene <50 g, pese
una porción de la muestra de prueba y agregue diluyente estéril para hacer una dilución 1:10.
Prepare todas las diluciones decimales con 90 ml estériles más 10 ml, dilución previa a menos que se
especifique lo contrario.

D. Análisis

Coloque la placa de petrifilm RCC seca, B (a), sobre una superficie plana. Levante la película superior
e inocule 1 ml de suspensión en el centro de la película de fondo. Con cuidado, enrolle la película
superior sobre el inóculo. Distribuya el inóculo sobre un área de crecimiento de 20 cm 2 con presión
hacia abajo en el centro del dispositivo separador de plástico (lado plano hacia abajo). Deje la placa
intacta para permitir que el agente gelificante se solidifique. Incubar las placas hasta 24 h a 35 ± 1ºC.
En la incubadora, coloque las placas en posición horizontal o en el estante para placas Petrifilm, con
el lado despejado hacia arriba, en pilas que no excedan las 20 unidades. Cuente las placas dentro de
1 h después de completar el período de incubación.

Las placas Petrifilm RCC se pueden contar en un contador de colonias estándar u otra lupa
iluminada. No cuente las colonias de la espuma porque se eliminan de la influencia selectiva del
medio. No cuente las burbujas de artefactos que puedan estar presentes.

Los coliformes confirmados aparecerán como colonias rojas asociadas con el gas después de 8-24 h
de incubación. Son colonias rojas asociadas con una o más burbujas de gas y con o sin zonas de ácido
amarillo. Se deben seleccionar placas con 10-150 colonias. Si ninguna placa tiene al menos 10
colonias rojas con gas, registre el recuento exacto en el inóculo menos diluido. Si todas las placas
tienen conteos> 150, determine el conteo estimado contando el número de colonias en uno o más
cuadrados representativos, determinando el número promedio por cuadrado y luego multiplique el
número promedio por 20 (el área de crecimiento circular es de aproximadamente 20 cm2). Si las
placas están demasiado llenas para estimar los recuentos, informe el recuento como demasiado
numeroso para contar.

17.2.09

Método oficial AOAC 997.02

Conteo de Levaduras y moho en los alimentos

Método de película seca rehidratable

(Aplicable a la enumeración de levaduras y mohos totales en alimentos).

Consulte las tablas 997.02A y B para ver los resultados del estudio interlaboratorio que respalda la
aceptación del método.

A. Principio

El método utiliza placas de cultivo de medio seco suplementado con antibióticos, colorante para
mejorar la visualización del crecimiento y gelificante soluble en agua fría. Las suspensiones sin diluir
se agregan a las placas a una velocidad de 1 ml / placa. Las suspensiones se extienden sobre un área
de crecimiento de aproximadamente 30 cm 2. El agente gelificante se deja solidificar, las placas se
incuban y se cuentan la levadura y los moho.
B. Aparato y reactivo

(a) Placas de recuento de levadura y moho: contienen nutrientes complementados con

clortetraciclina, cloranfenicol, gelificante soluble en agua fría y colorante sensible a la presencia de
fosfatasa (5 bromo 4-cloro-3 indolil fosfato) que mejora la visualización de la levadura y el
crecimiento de moho. El área de crecimiento circular de una sola placa contiene treinta contornos
cuadrados de 1 x 1 cm en la base de la película.

(b) Esparcidor de plástico. - Provisto de placas Petrifilm, diseñadas para extender la suspensión
uniformemente sobre el área de crecimiento de la placa.

(c) Pipetas: pipeta serológica o jeringa de pipeteo que suministre con precisión 1,0 ml.
(d) Contador de colonias: aparato estándar, modelo Quebec preferido, o uno que proporcione
aumento equivalente (1.5 x) y visibilidad.

(e) Licuadora: licuadora mecánica de alta velocidad que gira a 10000 - 12000 rpm, o stomacher.

(f) Agua de dilución: agua de dilución tamponada con fosfato de Butterfields. Coloque 34 g de
KH2PO4 en un matraz aforado de 1 litro y disuélvalo en 500 ml de H2O. Autoclave 15 min a 121 ºC.
Almacene la solución madre en un matraz volumétrico de 1L y diluya el volumen con H2O. Dispensar
90 o 99 ± 1 ml, en botellas. Autoclave 15 min a 121º C.
C. Instrucciones generales

Almacene bolsas de papel de aluminio con las placas de recuento de levadura y hongo sin abrir a
≤8ºC. Después de abrir, regrese las placas no utilizadas a la bolsa de aluminio. Guarde la bolsa de
aluminio sellada a ≤8ºC en un lugar seco. Use las placas dentro de 1 mes después de abrir.

La exposición de las placas de recuento de levadura y moho a temperaturas >25ºC y/o humedades
>50% HR puede afectar el rendimiento de las placas.

Después del uso, las placas contienen levadura viable y / o cultivos de moho.

Autoclave las placas usadas, 15 min a 121 °C antes del desecho.

E. Análisis

Coloque la superficie de la placa de recuento de levadura y moho. Levante la película superior,

sostenga la pipeta perpendicular a la placa e inocule cuidadosamente 1 ml de suspensión de prueba
en el centro de la base de la película. Coloque la película superior sobre el inóculo.

Levante el esparcidor de plástico con un mango circular. Alinee el centro del esparcidor con el centro
aproximado de la placa. Distribuya la suspensión uniformemente utilizando una suave presión hacia
abajo en el centro del esparcidor. No deslice el esparcidor por la película. Retire el esparcidor y deje
la placa sin perturbar durante 1 minuto para dejar que el gel solidifique.
Coloque las placas en la incubadora en posición horizontal, con el lado limpio hacia arriba, en pilas
que no excedan las 20 unidades. Incubar las placas 5 días a 20-25 ºC.

Cuente las placas inmediatamente después del período de incubación. Las levaduras aparecen en
color verde azulado o blanquecino y forman pequeñas colonias definidas.

Las colonias de moho son generalmente azules, pero también pueden asumir su pigmentación
natural. (por ejemplo, negro, amarillo, verde). Tienden a ser más grandes y más difusos que las
colonias de levadura.

Para calcular el recuento de levadura y moho, multiplique el número total de colonias / placa de
levadura y moho (o el número promedio de colonias / placa, si se cuentan placas duplicadas de la
misma dilución) por el factor de dilución apropiado. Al contar colonias en placas duplicadas de
diluciones consecutivas, calcule el número medio de colonias para cada dilución antes de determinar
el recuento promedio de levaduras y mohos uld.

Los recuentos estimados se pueden hacer en placas con> 150 colonias y se deben informar como
recuentos estimados.

Al hacer tales recuentos, determine el recuento promedio / 1 cm3 y multiplique por 30 (el área de
crecimiento circular es aproximadamente 30 cm2)

Un alto número de colonias de moho puede causar que el área de crecimiento se vuelva azul, negra,
amarilla, etc. Cuando esto ocurra, no haga recuentos estimados, sino que diluya más y suspenda la
prueba de placa para obtener un recuento más preciso.
 17.5.07

Método oficial AOAC 2001.05

Enumeración rápida de Staphylococcus aureus en alimentos seleccionados.

Método de placa de recuento 3M Petrifilm Rapid S. aureus.

Aplicable a la enumeración de organismos Staphyloccus aureus confirmados en pastas rellenas de

carne de res y queso, croquetas de patata congeladas, empanadas de pollo cocidas, natillas de
huevo, carne de cerdo cruda molida congelada y leche deshidratada instantánea sin grasa.

A.Principio

El agente gelificante se deja solidificar, y las placas se incuban a 35 ± 1ºC durante 24 ± 2h. La placa se
incuba a una temperatura alta (62 ± 2ºC) para desactivar la desoxirribonucleasa lábil al calor; luego
se coloca un disco indicador que detecta la enzima TNasa estable al calor entre las películas superior
e inferior de la placa. Las placas con discos se incuban a 35 ± 1ºC durante 1-3 h para identificar
estafilococos positivos para TNasa.

B. Aparato y reactivo

(a) Placas Petrifilm Rapid S. aureus (RSA). Las placas, disponibles en 3M Microbiology Products,
contienen nutrientes Baird-Parker modificados y un gelificante soluble en agua fría.

(b) Petrifilm TNase Reactive disk- (Disks Microbiology Products) contiene ADN, Toluidina Blue-O e
indicador de tetrazolio.

(c) Esparcidor de plástico - Con mango (productos de microbiología 3M)

(d) Pipetas: pipetas serológicas calibradas de 1,0 y 10,0 ml con graduaciones de 0,1 ml. (Se puede
usar una pipeta electrónica calibrada para administrar 1,0 ml)

(e) Contador de colonias: aparato estándar, modelo de Quebec, disponible de muchos proveedores,
o uno que proporcione aumento y visibilidad equivalentes.

(f) Solución de hidróxido de sodio - Estéril, 1M. Disuelva 40 g de NaOH en agua y diluya a 1 L.
Autoclave 15 min a 121º C.

(g) Agua de dilución-

(1) Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 ml de agua, ajustar a pH 7,2 con NaOH 1M (aproximadamente
175 ml) y diluir a 1L

(2) Diluyente - Diluya 1,25 ml de solución madre a 1L con agua hervida y enfriada. Autoclave 15 min
a 121º C.

(h) Licuadora: licuadora de alta velocidad (16000-18000 rpm) con frasco estéril.

(i) Incubadoras: mantener a 35 ± 1ºC y 62 ± 2ºC.

C. Preparación de la suspensión de prueba.

Use la balanza con capacidad de 2 kg y legibilidad de 0.1 g para pesar asépticamente 50 g de la

porción de prueba sin descongelar en el vaso de la licuadora

B (h) Agregue 450 ml de diluyente, B (g) (2) y mezcle a 16000-18000 rpm durante 2 minutos para
homogeneizar. Si la muestra de prueba completa es <50 g, pese una porción de la muestra de
prueba y agregue agua de dilución para hacer una dilución de 1:10. Según sea necesario, ajuste el pH
de la muestra de prueba diluida a 6.5 - 7.5 con NaOH, B (f), (aproximadamente 0.1 ml / g de porción
de prueba).

No use agua de peptona tamponada de diluyentes que contengan citrato o tiosulfato.

Prepare todas las diluciones decimales con 90 ml de agua de dilución más 10 ml de la dilución
anterior. No use pipetas para administrar <10 % ml; para administrar 0.1 ml, no use pipeta> 1 ml.

Mezcle todas las diluciones agitando 25 veces a hasta de 30 cm en 7 s.

D. Análisis

Coloque la placa seca de Petrifilm RSA, B (a), sobre una superficie plana. Levante la película superior
e inocule 1 ml. pruebe la suspensión en el centro de la película inferior. Con cuidado, enrolle la
película superior sobre el inóculo. Distribuya la suspensión de prueba sobre un área de crecimiento
de 30 cm2 con presión hacia abajo sobre el mango del esparcidor de plástico, B (c). Deje la placa
intacta para permitir que el agente gelificante se solidifique. Incubar las placas durante 24 ± 2 h a
35± 1ºC.

En la incubadora, coloque las placas en posición horizontal o en un estante para placas Petrifilm, con
el lado despejado hacia arriba, en pilas que no excedan las 20 unidades.

Después de la incubación, coloque las placas en 62 + - 2 C en la incubadora durante 1 h en pilas que

no excedan las 10 unidades.
Abra las placas de Petrifilm y coloque el disco reactivo de Petrifilm TNasa, B (b), en cada pozo
formado por la presa de espuma, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo de los
discos.

Los discos están recubiertos con sustrato en ambos lados; por lo tanto, la orientación en relación con
las placas Petrifilm no importa. Baje la película superior sobre el disco con cuidado de no atrapar
burbujas de aire entre la película y el disco. Para asegurar un contacto uniforme entre el disco y el
medio, aplique una presión suave sobre el área reactiva del disco. Deslice una varilla doblada a
través de la placa para completar el contacto entre el disco y el gel empujando las burbujas de aire
más allá del borde del disco. Incubar las placas Petrifilm con sus discos a 35 ± 1ºC.

Después de 1 h, retire las placas de Petrifilm de la incubadora. Usando un contador de colonias, B

(e), cuente y registre colonias "confirmadas" con una zona rosa alrededor de un centro rojo, azul o
incoloro. En placas donde cada colonia tiene una zona, la prueba se considera completa y la
incubación debe finalizar. Vuelva a incubar todas las otras placas durante 2 h adicionales a 35 + - 1 C.
Cuente y registre todas las colonias típicas después de la segunda incubación.

Seleccione placas con 15-100 colonias. Si las placas están demasiado llenas para los recuentos
estimados, o la difusión de las zonas rosadas es tan grande que el color no puede asociarse con
colonias individuales, informe el recuento como TNTC (demasiado numeroso para contar).

17.05.08

2003.07

Enumeración de Staphylococcus Aureus en alimentos procesados y preparados.

 Método de placa de conteo exprés de Petrifilm Staph 3M.

(Aplicable a la enumeración de S. Aureus en lasaña congelada, natillas, vegetales mixtos congelados,

croquetas de patata congeladas y champiñones congelados recubiertos con mantequilla)

Precaución: Autoclave material después de su uso.

Consulte la tabla 2003.07 para ver los resultados del estudio interlaboratorio que respalda la
aceptación del método.

A. Principio.

La placa de conteo Staph Express de petrifilm es un sistema de medio de cultivo listo para la muestra
que contiene un agente gelificante soluble en agua fría.

El medio cromogénico modificado de Baird-Parker en la placa es selectivo y diferencial para S.

aureus.

Se añaden porciones de prueba diluidas a un volumen de 1,0 ml por placa. El agente gelificante se
deja solidificar después de la inoculación, y la placa se incuba durante 24 ±2 h a 35 ±1º C.

Las colonias rojo-violeta están presentes, cuente las colonias, la prueba está completa.

Si se encuentra flora de fondo en las pruebas, el disco Petrifilm Staph Express se usa para identificar
S. aureus de todas las colonias sospechosas.

Utilice el disco de petrifilm Staph Express siempre que haya colonias distintas de la roja-violeta en la
placa, por ejemplo, colonias negras o colonias azul/verdes.

El disco de petrifilm staph express contiene un colorante y ácido desoxirribonucleico.

S. aureus produce desoxirribonucleasa (DNasa), que reacciona con el tinte para formar zonas
rosadas.
El disco se inserta en la placa, y la placa y el disco se incuban durante un mínimo de 1 h y un máximo
de 3 h a 35 ±1 ºC o 37 ± 1º C.

S. aureus (y ocasionalmente S. hyicus y S. intermedius, que pueden producir enterotoxinas)

producen una zona rosa. Cuente la zona rosa como S. aureus, independientemente del tamaño de la
zona.

B. Aparatos y reactivos

(a) Placa 3M Petrifilm Staph Express Count - Placas, disponibles en medio Baird-Parker modificado
cromogénico 3M Microbiology y un agente gelificante soluble en agua fría.

(b) Discos 3M Petrifilm Staph Express: los discos, disponibles en 3M Microbiology, contienen
toluidina azul-O y ADN.

(c) Esparcidor de plástico: esparcidor con mango, disponible en suspensión de prueba 3M de manera
uniforme sobre el área de crecimiento de la placa.
(d) Pipetas: se utilizarán pipetas serológicas calibradas de 1,0 y 10,0 ml para administrar 1,0 ml. No
use pipetas para entregar <10% de su volumen total. Por ejemplo, para administrar 1 ml, no use
pipeta> 10 ml; para administrar 0.1 ml, no use pipeta> 1 ml.

(e) Contador de colonias: Aparato estándar, modelo de Quebec disponible de muchos proveedores,
o uno que proporcione aumento y visibilidad equivalentes.

(f) Solución de hidróxido de sodio: estéril, 1M. Disuelva 20 g de NaOH en 500 ml de agua en un
recipiente Nalgene autoclavable de 500 ml. Autoclave 15 min a 121º C.

(g) Agua de dilución tamponada con fosfato - (1) Solución madre - Disolver 34 g de KH2PO4 en 500
ml de H2O, ajustar a pH 7,2 con aproximadamente 172 ul de NaOH 1 M, y diluir a 1L. Almacenar en
el refrigerador.

(2) Diluyente: diluya 1,25 ml de solución madre a 1 L con H2O. Prepare blancos de dilución con esta
solución, dispensando lo suficiente como para permitir la pérdida durante el autoclavado.

Autoclave 15 min a 121 ºC

(h) Licuadora: licuadora de alta velocidad (16000-18000 rpm) con frasco estéril.

(i) Incubadora - Mantenimiento 35 ± 1 ºC o 37 ± 1ºC

(j) Balanza - 2000 ± 0.1 g de capacidad.

(k) Tiras indicadoras de pH - Para medir un rango de 6.0 - 8 .0.

C. Preparación de la suspensión de prueba.

Use la balanza, B (j), para pesar asépticamente una porción de prueba de 50 g en la jarra de la
licuadora, B (h) Agregue 450 ml de diluyente, B (g) (2) y mezcle a 16000-18000 rpm durante 2
minutos para homogeneizar. Si la muestra de prueba completa es <50 g, pese la porción de muestra
de prueba y agregue agua diluyente para hacer una dilución 1:10. Según sea necesario, ajuste el pH
de la porción de prueba diluida a 6.0-8.0 con NaOH 1 M, B (f), (aproximadamente 0.1 ml / g de
porción de prueba).

No use diluyentes que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato, ya que pueden inhibir el crecimiento.
Prepare todas las diluciones decimales con 90 ml de diluyente más 10 ml de la dilución anterior.

Las pipetas, B (d), deben entregar con precisión el volumen requerido. Mezcle todas las diluciones
agitando 25 veces a través de 30 cm en 7 segundos.

D.Análisis

Coloque la placa de conteo rápido Petrifilm Staph.

B (a), sobre una superficie plana, levante la película superior e inocule 1 ml de suspensión de prueba
en el centro de la película de fondo. Con cuidado, enrolle la película superior sobre el inóculo

Distribuya la suspensión de prueba sobre un área de crecimiento de 30 cm2 con presión hacia abajo
sobre el mango del esparcidor de plástico, B (c). Deje la placa intacta para permitir que el agente
gelificante se solidifique. Incubar las placas a 35 + - 1 C o 37 + - 1 C durante 24 + - 2 h.

En la incubadora, B (i), coloque la placa en posición horizontal en pilas que no excedan las 20
unidades. Cuente las placas con el contador de colonias, B (e). Observa los colores de las colonias. Si
no hay colonias o solo hay colonias rojo-violeta después de 24 + - 2 h, cuente las colonias rojo-violeta
en la placa como S. aureus; La prueba está completa. Si hay otros colores de colonias que no sean
rojo-violeta, use un disco expreso Petrifilm Staph, B (b).

Inserte el disco petrifilm staph express en su lugar. Aplique presión deslizando un dedo enguantado

firmemente sobre toda el área del disco (incluidos los bordes) para garantizar un contacto uniforme
del disco con el gel y eliminar las burbujas de aire. Incubar las placas y los discos, en pilas de no más
de 20 unidades, durante al menos 60 min y no más de 3 h a 35 ± 1 ºC o 37 ± 1 ºC. Enumerar las zonas
rosadas como S. aureus, independientemente de si las colonias son o no colonias. presente. Las
zonas rosadas generalmente están asociadas con S. aureus pero pueden indicar S. Hyicus o S.
intermedius. Las colonias no asociadas con una zona rosa no son S. aureus y no deben contarse.
Nota de seguridad: el kit de prueba en sí no contiene ningún componente patógeno, pero la
suspensión de prueba enriquecida puede contener S. aureus. Por lo tanto, deseche todas las
muestras de prueba de acuerdo con los procedimientos estándar de residuos de laboratorio.

17.5.09 Método oficial AOAC

2003.08 Enumeración de Staphyloccus aureus en productos lácteos seleccionados

Método de placa de conteo exprés de estafilococos Petrifilm 3M

(Aplicable a la enumeración de S. aureus en helados, leche cruda, yogurt, suero en polvo y queso)
Precaución: autoclave material después de su uso.

Consulte la tabla 2003.08 para ver los resultados del estudio interlaboratorio que respalda la
aceptación del método.
 A. Principio

La placa de conteo exprés de petrifilm Staph es un sistema de medio de cultivo listo para muestras
que contiene un agente gelificante soluble en agua fría. El medio cromogénico modificado de Baird-
Parker en la placa es selectivo y diferencial para S. aureus.

La porción de prueba diluida se agrega a un volumen de 1.0 ml por placa. El agente gelificante se
deja solidificar después de la inoculación, y la placa se incuba durante 24 ± 2 h a 35 ± 1 ºC.

Las colonias rojo-violetas en la placa son S.aureus. Cuando solo están presentes colonias rojo-
violeta, cuente las colonias, la prueba se completa.

Si se encuentra flora de fondo en la testina, el disco de petrifilm staph express se usa para indetificar
S.aureus de todas las colonias sospechosas. Utilice el disco de petrifilm staph express siempre que
haya colonias distintas de la violeta- roja en la placa; por ejemplo, colonias negras o colonias azul-
verdes. El disco de petrifilm staph express contiene un colorante y ácido desoxirribonucleico. S.
aureus produce desoxirribonucleasa (DNasa), que reacciona con el tinte para formar zonas rosadas.
El disco se inserta en la placa, y la placa y el disco se incuban durante un mínimo de 1 h y un máximo
de 3 h a 35± 1º C o 37 ± 1ºC. S. aureus (y ocasionalmente, S. hyicus y S. intermedius, que pueden
producir enterotoxinas) producen una zona rosa. Cuente las zonas rosadas como S.aureus,
independientemente del tamaño de la zona.