TOXICOLOGÍA AMBIENTAL

ETAPA 3. EJECUCION Y SEGUIMIENTO

PRESENTADO POR:
ANGELA VIVIANA NIETO PAMPLONA
CODIGO: 1128626370

GRUPO: 358027_19

TUTORA:
BILMA ADELA FLORIDO

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA (UNAD)

INGENIERÍA AMBIENTAL
MAYO 11 DEL 2018
INTRODUCCION

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática de
toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos Fito tóxicos de
compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el
desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la
evaluación de los efectos Fito tóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición
en la elongación de la radícula y del hipocotilo.

Es importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días de desarrollo
de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia
tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo
tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas
de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de las semillas, por
lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicación de esta prueba
son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plántulas en general.

El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente determinado es de gran

importancia para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluación del desarrollo de la
radícula y del hipocotilo constituye indicadores representativos para determinar la capacidad de
establecimiento y desarrollo de la planta. A diferencia de la prueba tradicional de germinación de
semillas, la evaluación del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas
permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración
tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden
retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo,
dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto. De esta manera, la inhibición en la
elongación de la radícula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la
evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la
proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.

A diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas
como organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de
muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtración
previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pre tratamiento y simplificando el
procedimiento de prueba. Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas
acuáticos, la información generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos acerca
del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales cercanas a las márgenes
de cuerpos de agua contaminados, siendo también una especie interesante de considerar por su
importancia desde el punto de vista hortícola. Por otra parte, es de fácil y rápida germinación por
lo que es posible desarrollar la prueba en pocos días. Este bioensayo de toxicidad ha sido
recomendado y aplicado por diferentes organismos de protección ambiental para la evaluación
eco toxicológica de muestras ambientales y compuestos puros, además de la evaluación del
efecto fitotóxico de plaguicidas sobre especies no blanco, necesarios para el registro de estos
compuestos (OECD, 1984; Wang, 1987; USEPA, 1989). En la incorporación de esta prueba en
una batería de bioensayos es importante considerar el compromiso entre la sensibilidad de la
especie L. sativa, el reducido tiempo de exposición de la prueba con semillas, los bajos costos
asociados y que no requiere equipamiento sofisticado, en particular en la aplicación a muestras
ambientales o en el monitoreo de procesos de detoxificación, saneamiento, control de efluentes o
reuso de biosólido

La contaminación química del agua que en su mayoría proviene del uso de agroquímicos,
actividades industriales y fuentes domésticas, y que posteriormente es expulsada al medio de
manera indiscriminada y sin ningún tipo de control, se ha convertido en los últimos años en la
principales causantes de alteraciones en el ecosistema acuático y terrestre, ya que, la mayoría de
estos vertimientos contiene sustancias potencialmente toxicas que alteran el ciclo de vida normal
de los organismos.

En relación a lo anterior, con el fin de conocer dichos efectos, se llevó a cabo un Bioensayo de
toxicidad con semillas de lechuga, a partir de una muestra de agua tomada en el Rio Pasto; donde
a partir del proceso experimental, se evidencio afectación de los agentes físico-químicos de la
muestra en las semillas de lechuga, lo que ocasiono inhibición en la germinación de la semilla y
elongación de radícula principalmente.

El trabajo lo desarrolle en mi casa, siguiendo el protocolo de la guía de actividades y empleando

todos los materiales requeridos para el montaje del bioensayo.
 Diagrama de flujo del procesos
PREPARACIÓN DE
SOLUCIONES

Control Control Control Muestra Muestra

Muestra
positivo 20 semillas negativo 20 semillas negativo 20 semillas R1 20 semillas R2 20 semillas
20 semillas
de lechuga de lechuga de lechuga de lechuga de lechuga
de lechuga
4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL

Caja de Petri Caja de Petri Caja de Petri Caja de Petri Caja de Petri Caja de Petri
+ papel filtro + papel filtro + papel filtro + papel filtro + papel filtro + papel filtro

Se envuelven las cajas de

Petri en papel aluminio

Se introducen las cajas de

Petri en una bolsa plástica

Se dejaron durante 120

horas (5 días)
Descripción de la muestra.

ORGANISMOS DE PRUEBA

En este ensayo se usan semillas de lechuga de la especies L. sativa L variedad

mantecosa.

OBTENCIÓN, CONTROL Y CONSERVACIÓN DE LAS SEMILLAS

La obtención de las semillas de lechuga se realiza en semillerías locales, procurando

que sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), con buen poder germinativo
y baja variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo.

VERIFICACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LAS SEMILLAS

Previo a la implementación de la prueba, es recomendable verificar que cada lote

nuevo de semillas que se utilice tenga un porcentaje de germinación superior al 90%,
sincronización en la germinación y baja variabilidad de la elongación de la radícula e
hipocotilo (coeficiente de variación < 30%). Ensayos de toxicidad aguda con semillas
de lechuga 59 Es necesario además caracterizar las condiciones de germinación del
lote de semillas, evaluando la respuesta frente a la luz (fotoblastismo positivo o
negativo: germinación en presencia o ausencia de luz, respectivamente) y la
temperatura óptima de germinación. Con el fin de reducir la variabilidad en los
resultados, para el caso de semillas no seleccionadas y que presenten gran
heterogeneidad en el tamaño, es conveniente realizar una selección previa
descartando las fracciones de mayor y menor tamaño y utilizando solamente la
fracción más numerosa y de tamaño intermedio. La fracción de menor tamaño puede
presentar un alto porcentaje de semillas vanas, mientras que las semillas de mayor
tamaño pueden ser más vigorosas, variando la sensibilidad frente a los compuestos
tóxicos. Si no es posible obtener lotes de semillas con poder germinativo igual o
mayor al 90%, se debe aumentar el número de semillas por caja para obtener un
número mínimo de 18 semillas germinadas. Por otra parte, si se desea aumentar la
confiabilidad de los resultados, o en caso de contar con semillas que posean una alta
variabilidad en la elongación de la radícula de los controles negativos, aún habiéndolas
seleccionado de tamaño uniforme, se recomienda aumentar el número de réplicas por
tratamiento. Las semillas seleccionadas se almacenan fraccionadas a 4º C, en
oscuridad y en ambiente seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor
al menos durante 2 años. Un indicador de la reducción de la vitalidad y
envejecimiento de las semillas es la reducción en el poder germinativo y el aumento
en la variabilidad de las medidas de elongación de radícula e hipocotilo en el control
negativo. En este caso se recomienda realizar las pruebas de toxicidad utilizando un
nuevo lote de semillas.
La muestra de agua utilizada fue tomada en el Rio Pasto, en la zona baja, sector Noroccidental de
la ciudad de Pasto. El punto donde se tomó la muestra se localiza en las coordenadas geográficas
1°13’55.29”N – 77°17’22.49”O.
En este punto el agua presenta un color oscuro y muy mal olor; a simple vista en el rio se
observan residuos sólidos que son arrastrados por la corriente. Las características físico-químicas
del agua son altamente toxicas y perjudiciales para los seres vivos, ya que recibe vertimientos de
la ciudad, principalmente de empresas industriales como las curtiembres, que vienen generado un
deterioro progresivo en la dinámica y vida del rio.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBA

PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES

Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mínimo de 5 o 6

diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera que se obtengan valores
de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para las muestras ambientales se
recomienda el uso de un factor de dilución de 0.3 o 0.5 para la preparación de la serie
de diferentes concentraciones. El uso de un factor de 0.3 permite evaluar la toxicidad
considerando el intervalo entre el 100% y 1% de la muestra realizando 5 diluciones
(100, 30, 10, 3 y 1%). Al aplicar un factor de dilución de 0.5, es necesario utilizar
mayor número de diluciones para abarcar el mismo intervalo de concentraciones
(100, 50, 25, 12, 6, 3 y 1.5%) pero se obtiene mayor precisión en los resultados.
Para la preparación de cada dilución se utiliza agua dura reconstituida (es posible el
uso de agua mineral dura para consumo humano), realizando el control negativo con
el agua de dilución empleada.

DESARROLLO DE LA PRUEBA

Para llevar a cabo el ensayo se deben realizar los siguientes pasos: Colocar en cada
caja Petri un disco de papel de filtro Marcar correctamente cada caja con la dilución
correspondiente, así como la fecha y hora de inicio y término del bioensayo Saturar el
papel de filtro con 4 o 5 mL de la dilución evitando que se formen bolsas de aire Con
la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas, dejando espacio
suficiente entre las semillas para permitir la elongación de las raíces. Tapar las
cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad. Dado que
algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que se produzca
la germinación (semillas fotoblásticas negativas), las cajas de Petri deben cubrirse de
la luz inmediatamente después de colocarlas las semillas en su interior y durante el
período de ensayo Incubar por 120 horas (5 días) a una temperatura de 22 ± 2 ºC
Realizar repeticiones para cada dilución ensayada.

Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad

Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos

expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control
negativo, sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de
muestra. Terminado el período de exposición (120 horas), se procede a cuantificar el
efecto en la germinación y en la elongación de la radícula y del hipocotilo.

1. Calculo de porcentaje de germinación

Cajas de Petri
Control Control Control Muestr
Variables (-) (-) (+) a Muestra R1 Muestra R2
Número de
semillas 11 7 6 9 8 6
germinadas
Promedio de
controles 9        
negativos
Porcentaje de
      100 88,89 66,67
germinación

2. Calculo del porcentaje de inhibición de la germinación

(SgCneg−Sg M R)
% Inhibicion germinación= ∗100
SgCneg
(9−7,67)
% Inhibicion germinación= ∗100
9
% Inhibicion germinación=14,78

3. Medida de elongación de hipocotilo en cada caja de Petri

Semilla Caja de Caja de Caja de Caja de Caja de Caja de

 Petri Petri
Petri Petri Petri Petri Muestra Muestra
Control (-) Control (-) Control (+) Muestra R1 R2
1 31 25 2 27 20 31
2 20 23   25 22 4
3 13 17   5 14 19
4 29 29   22 19 28
5 26 18   20 9 25
6 18 13   13   18
7 15 21        
8 22          
9 28          
10 17          
11 18          
Promedio EH 21,55 20,86 2,00 18,67 16,80 20,83
Desviación
estándar 6,09 5,37   8,26 5,26 9,66
Coheficiente
de variación 28,26 25,73   44,26 31,33 46,38

4. Cálculo de porcentaje de inhibición de hipocotilo.

% Inhibición Desarrollo Hipocotilo=( PromedioPromedio

EH Cneg−Promedio EH M
EH Cneg )∗100
21,20−18,77
% Inhibición Desarrollo Hipocotilo=( )∗100
21,20
% Inhibición Desarrollo Hipocotilo=11,46

5. Medida de elongación de la radícula en cada caja de Petri.

Caja de Caja de
Caja de Caja de Caja de Caja de Petri Petri
Semilla
Petri Petri Petri Petri Muestra Muestra
Control (-) Control (-) Control (+) Muestra R1 R2
 1 28 21 0 13 15 13
2 21 19   10 28 9
3 9 15   0 9 12
4 17 21   14 12 18
5 23 10   11 7 16
6 16 11   6   12
7 13 18        
8 19          
9 22          
10 14          
11 16          
Promedio EH 18,00 16,43   9,00 14,20 13,33
Desviación
estándar 5,31 4,54   5,22 8,29 3,20
Coeficiente
de variación 29,50 27,64   57,95 58,37 24,03

6. Cálculo de la inhibición de radícula

% Inhibición Desarrollo Radícula=( PromedioPromedio

EH Cneg−Promedio EH M
EH Cneg )∗100
17,21−12,18
% Inhibición Desarrollo Radícula=( )∗100
17,21
% Inhibición Desarrollo Radícula=29,23

7. Cálculo de índice de germinación IG

Longitud radícula Muestra( mm)

% Longitud de radícula muestra= ∗100
Longitud radícula Control negativo( mm)
12,18
% Longitud de radícula muestra= ∗100
17,21
% Longitud de radícula muestra=70,77
 Numero de semillas germinadas muestra
% germinación muestra= ∗100
Numero de semillas germinadas Control negativo
5,67
% germinación muestra= ∗100
9
% germinación muestra=63

Longitud de radícula muestra ( % )∗Germinación de lamuestre (%)

IG=
100
70,77 %∗63 %
IG=
100
IG=44,58 %

8. Análisis de resultados

En algunas semillas germinadas de la muestra se observa un color café oscuro en los

cotiledones. Así mismo se evidencia esta coloración leve en las semillas que no germinaron, lo
cual es un indicador de fitotoxicidad.

Los porcentajes de inhibición obtenidos y calculados fueron germinación 14,78%, elongación

hipocotilo 11,46% y elongación de radícula 29,23%, con lo cual podemos asumir que los tóxicos
presentes en la muestra de agua del Rio Pasto, tuvo mas efecto en el desarrollo del hipocotilo y
en la germinación de las semillas principalmente.
En cuanto al índice de germinación – IG, se presenta una inhibición en crecimiento y germinación
significativa del 44,58%.

Conclusiones
De acuerdo a la experiencia y a los cálculos realizados la muestra tomada no supera el porcentaje
del 50% de inhibición de crecimiento de radícula o hipocotilo.
Evidentemente, existe un alto riesgo de toxicidad en la muestra tomada del rio pasto, ya que esta
fuente hídrica recibe constantemente descargas de empresas industriales como curtiembres,
plantas de sacrificio, servitecas, entre otras; dicha toxicidad se pudo observar en el bioensayo,
mediante la presencia de manchas de color café en las semillas y afectaciones en la germinación
de las mismas durante las 120 horas de exposición.
Registro Fotográfico.
BIBLIOGRAFÍA

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