INSTITUTO TECNOLOGICO DE

ACAPULCO
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
M.A. MIGUEL ANGEL DIAZ ALDAY
DISEÑO EXPERIMENTAL IX
“IDENTIFICACION DE SHIGELLA EN VICERAS DE
PUERCO”

GRUPO ¨A¨ DE 8:00 A 10:00 A.M

EQUIPO 4
ALUMNA: OLGADILIA CHALMA MARTINEZ.
NUMERO DE CONTROL: 16320347

ACAPULCO GUERRERO, A 3 DE NOVIEMBRE DEL 2019.

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 INDICE

Introducción…………………………………………….……….…3

Marco teórico ……………………………………………….….….4

Objetivo general……………………………………………….…..9

Objetivos específicos………………………………………….….9

Planteamiento del problema………………………………....…..9

Justificación…………………………………………………....….9

Material, equipo, reactivo…………………………………….…10

Metodología…………..…………………………………..….…..11

Bibliografías……………………………………………………...14

2
 INTRODUCCIÓN
El género Shigella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Como el nombre lo
indica, Enterobactericeae comprende bacterias que proliferan en el intestino; varios
géneros de esta familia contienen especies patógenas. Además de shigella, se
incluyen especies patógenas transmitidas por los alimentos de los géneros
Escherichia, Salmonella y Yersinia (Yousef y Carlstrom, 2006).
Shigella es un bacilo gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,
que se encuentra estrechamente relacionada con el género Escherichia, por sus
propiedades bioquímicas, serológicas y por similitudes genéticas. Se caracteriza
por no fermentar la lactosa, ser inmóvil, no produce lisina decarboxilasa y raramente
produce gas a partir de hidratos de carbono. Su identificación se basa en
características bioquímicas y antigénicas (Perilla y col., 2004).
Las distintas especies de Shigella constituyen la principal causa de disentería,
diarrea caracterizada por eliminación frecuente de heces con pus, sangre y/o
mucus. El ser humano es el único reservorio conocido de este agente. La mayoría
de los casos ocurren en niños, en general trasmitidos por contacto directo. Los
brotes a gran escala, vinculados a alimentos, son más raros. A pesar de ello,
constituye un importante problema de salud pública mundial, debido
fundamentalmente a su elevada transmisibilidad, la emergencia de cepas
resistentes a antimicrobianos y la falta de vacunas efectivas (Neglia y col., 2006).
Los métodos convencionales de detección de Salmonella y Shigella dependen de
las características del cultivo. Estos métodos implican el preenriquecimiento y el
enriquecimiento selectivo, seguidos de los pasos de aislamiento y las pruebas de
identificación. Los pasos de enriquecimiento y aislamiento son técnicas
principalmente de cultivo, en tanto que la identificación se basa en el análisis
bioquímico (Yousef y Carlstrom, 2006, NOM-114-SSA1-1994).

Figura: Colonias sospechosas de shigella en agar MCK y XLD.

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 MARCO TEÓRICO
Generalidades.
Shigella es un bacilo gran negativo aeróbico no móvil que se transmite de persona a
persona por la ruta fecal-oral, requiriendo una pequeña carga de microorganismos
de (10 a 100 bacterias) para causar infección siendo el hombre su único
hospedador natural, Se reconocen cuatro grupos de esta especie: S. dysenteriae,
S.flexneri, S.boydi y S.sonnei las cuales son la principal causa de disentería
(diarrea caracterizada por eliminación frecuente de heces, conteniendo
pus, sangre y/o mucus) y son causa común de gastroenteritis bacteriana.
(Cabrera. Et al. 2005). Es frecuente en los países tropicales y subtropicales en
desarrollo, además es una importante causa de mortalidad en los países en vías de
desarrollo, lo que representa alrededor del 25% del total de las defunciones que
ocurren en los niños menores de 5 años en el mundo (Martínez. Et al. 2008). La
enfermedad causada por Shigella se conoce como shigelosis o disentería bacilar.
El número de personas infectadas por Shigella cuyo origen fueron los alimentos es
bajo comparado con salmonella y campylobacter. En países avanzados los
causantes de shigelosis en alimentos son principalmente sonnei en torno al 70%
y flexneri aproximadamente el 25%.

Shigella dysenteriae.
Las cepas de Shigella dysenteriae serotipo 1 difieren de otras cepas de Shigella por
varias razones:
• Solo S. dysenteriae 1 causa epidemias de disentería grandes y prolongadas.
• La infección con S. dysenteriae 1 causa enfermedad con mayor letalidad que las
infecciones producidas por otros grupos de Shigella.
• La resistencia a los antimicrobianos se desarrolla más rápidamente y ocurre con
mayor frecuencia cuando se trata de cepas de S. dysenteriae 1 que con otros
grupos. (Bopp. Et al. 2004)
Con frecuencia origina una diarrea profusa y teñida de sangre. Además de producir
la toxina Shiga (potente neurotóxica, que determina convulsiones y es responsables
de la acumulación de líquidos en el asa intestinal y de la diarrea acuosa que puede
observarse en la fase inicial de la Shigelosis) que puede provocar trastornos
sistémicos profundos. (Mossel. Et al.2007)
Ecología.
Shigella Invade las células epiteliales del intestino grueso y la porción distal del
intestino delgado, alcanza las submucosas del colon y es capaz de ulcerar
esos tejidos. (León.2002)

4
 Patología.
Una vez que el individuo ingiere el microorganismo este debe fijarse al intestino
delgado y multiplicarse; en esta etapa no se observa ningún fenómeno clínico y los
síntomas solamente aparecen después de que la bacteria se traslada a través del
epitelio, se multiplica formando cúmulos bacilares en el interior de la pared se
presenta la inflamación, la lesión progresa y desciende al colon dando lugar a
fenómenos hemorrágicos, necrosis y a la formación de ulceras. Las manifestaciones
clínicas pueden variar, pero algunos de los síntomas incluyen diarrea, dolor
abdominal, fiebre y vomito (León.2002).
Esta bacteria tiene un periodo de incubación relativamente corto,
generalmente de unas 48horas, pero varía de 7 a 66 horas, Predomina en los
meses de verano y la trasmisión intrafamiliar ocurre frecuentemente. (Mossel. Et
al.2007)
La temperatura optima de crecimiento de los agentes causales es de 37oc,
creciendo dentro de un intervalo de temperaturas comprendido entre 10 y 40oc.
Estos microorganismos toleran concentraciones de sal del 5 al 6 % y son
relativamente termosensibles también liberan una endotoxina
denaturaleza polisacarídica que ataca la mucosa intestinal (Frazier. Et al. 2001).
Para el tratamiento de la shigelosis y cualquier enfermedad diarreica la primera
consideración en tratar es la corrección de las anormalidades que resulta de la
deshidratación: la acidosis metabólica y la pérdida significativa de potasio, aunque
la deshidratación severa es rara en shigelosis, con hidratación apropiada la
shigelosis es generalmente una enfermedad autolimitada. La decisión para
prescribir antibióticos es indicada por la severidad de la enfermedad, la edad del
paciente y la probabilidad de mayor transmisión de la infección. Los antibacterianos
(trimetropim-sulfametoxazol, ciprofloxacina u ofloxacina en adultos sulfametoprim-
sulfametoxazol, ampicilina o acido nalidíxico en niños) acortan el curso de
enfermedad y su intensidad y la duración de la excreción del agente patógeno;
deben utilizarse en aquellos casos que lo justifiquen la gravedad de la enfermedad,
o como la protección a los contactos (como guarderías o instituciones) cuando este
indicado desde el punto de vista epidemiológico. La elección de medicamentos
específicos dependerá del antibiograma de la cepa aislada o de los patrones de
sensibilidad local a los agentes antimicrobianos. (León, 20002).

Shigella en alimentos.
El alimento desempeña un papel importante únicamente como vector inespecífico.
Se ha demostrado que los productos siguientes han tenido un papel epidemiológico:
 1. Los alimentos ni excesivamente ácidos ni excesivamente secos para permitir
el crecimiento, o al menos la supervivencia de las shigellas.
 2. Los productos muy manipulados, como las carnes cortadas, los sándwiches y
las ensaladas.
 3. Los alimentos que se han dejado durante un tiempo a temperatura ambiente.
5
 4. Los alimentos que se consumen sin cocción o cocinado adicional, incluye los
sándwiches, las ensaladas y los alimentos marinos pelados y cocidos.
Muchos de los casos de shigelosis transmitida por los alimentos no se han
declarado oficialmente, la mayor parte de los mismos pueden transcurrir sin ser
detectados (Mossel. Et al.2007).
Las pruebas de identificación bioquímicas estándar y las técnicas serológicas
constituyen los métodos de detección rutinaria de Shigella sp.
El personal infectado que maneja los alimentos es la fuente más frecuente de la
contaminación de los alimentos por Shigella por lo que una buena higiene personal
es necesaria para controlar al microorganismo (León.2002).

Métodos para la detección de Shigella.

Los métodos rápidos para la identificación de para Shigella pueden ser los
siguientes:
Métodos de PCR: se realizan en Kits de PCR utilizados para la detección y
cuantificación simultánea de varios patógenos importantes, este método consiste
en realizar un número de copias de la curva estándar que se proporciona para la
cuantificación mediante una plantilla de la extracción interna (ADN o ARN), como

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controles de la calidad de la extracción de ácidos nucleicos, además elimina los
resultados falsos negativos.
Técnica de epifluorescencia: La cual es una forma de identificación de
microorganismos por la emisión de colores, causada por la longitud de onda que
emiten las muestras al aplicarles fluorocromos (sustancias fluorescentes). Esta
técnica se basa en la filtración de la muestra a través de una membrana de
policarbonato donde quedan retenidos los microorganismos (la muestra
previamente se trata con detergentes y enzimasproteolíticas con el fin de evitar la
saturación del filtro con partículas del alimento). Posteriormente, la membrana se
tiñe con naranja de acridina, que es un fluorocromo nucleofilico que origina distintos
patrones de fluorescencia en el ADN y el ARN dependiendo de la fase de
crecimiento celular. Los filtros teñidos se observan en un microscopio de
fluorescencia y los recuentos de microorganismos se obtienen mediante el contaje
de las partículas fluorescentes en un número determinado de campos de
fluorescencia. Las células viables emiten una fluorescencia que va del naranja al
rojo y las células muertas emiten fluorescencia verde. (Martin)
APIS: Son kits de pruebas bioquímicas que se componen de diferentes pocillos
donde se agrega la muestra y determina la presencia de ciertas bacterias. La
muestra es colocada en los pocillos de los kits para identificar a la bacteria y conocer
si el número de bacterias presentes son causa alarmante para la salud de los que
consumen este tipo de alimentos.

Técnicas de identificación.
Otra manera de identificar a la bacteria Shigella es mediante su aislamiento
en medios de cultivo. Para un aislamiento óptimo de este microorganismo, deben
utilizarse dos medios selectivos diferentes: uno de siembra para propósitos
generales de baja selectividad, como el AMC (Agar MacConkey), y otro de agar más
selectivo, como es el agar DXL (Agar desoxicolato xilosa lisina). No se debe utilizar
agar SS (agar salmonella-Shigella), porque frecuentemente inhibe el crecimiento
de S. dysenteriae serotipo 1. (Bopp. Et al. 2004)
Después de obtener las muestras, los medios selectivos se pueden inocular utiliza
hisopos o el asa de siembra. Cuando se inoculan las muestras a una placa para
aislamiento, la superficie completa de la placa de agar debe ser utilizada para
aumentar las oportunidades de obtener colonias bien aisladas. Los medios de alta
selectividad (por ejemplo, DXL) requieren, cuando se estrían, más solapamiento
que los medios de baja selectividad (por ejemplo, AMC), por lo cual debe prestarse
especial atención al estriado.
Después de la incubación, registre la cantidad y el tipo de crecimiento (por ejemplo,
si fermenta o no fermenta la lactosa ya que con esta bacteria no
existe fermentación). En AMC las colonias de Shigella aparecen convexas,
incoloras, de aproximadamente 2–3 mm de diámetro, aunque las colonias de S.
dysenteriae pueden ser más pequeñas. Las colonias de Shigella en agar DXL son
de color rosado a rojo, transparentes, lisas, de aproximadamente 1 a 2 mm de

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diámetro, aunque las colonias de agar DXL de S. dysenteriae son frecuentemente
diminutas. Seleccione las colonias sospechosas de las placas de AMC y agar DXL
e inocúlelas en medios de pesquisaje apropiados, tales como agar hierro de Kligler
(AHK) o agar hierro triple azúcar (AHTA).
Para el AHK o el AHTA Seleccione cuidadosamente al menos una colonia bien
aislada de cada tipo en cada tipo de placa de las que fueron estriadas para
aislamiento, con una aguja de inoculación toque ligeramente solo el centro de la
colonia sin tocar el resto de la colonia ni la superficie de la placa porque si lo hace,
puede tomar contaminantes que podrían estar en la superficie del agar.

Figura 1. Se han diseñado varios medios para crecer

selectivamente bacterias entéricas y permitir la
diferenciación de Salmonella y Shigella de E. coli. Los
medios de recubrimiento principales que se muestran
aquí son agar eosina azul de metileno (EMB), agar
MacConkey, agar ENDO, agar entérico Hektoen (HE)
y agar Salmonella-Shigella (SS).

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 OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia de Shigella en visceras de cerdo utilizando medios
selectivos y diferenciales así como pruebas de identificación bioquímica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar si las viseras de puerco son aptas para el consumo humano.
• Aplicar adecuadamente la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la
detección del género Shigella.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Si se lleva a cabo correctamente la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana
para la detección de Shigella y se encuentra la presencia de una cantidad
considerable de este microorganismo, ¿Las vísceras de puerco serán aptas para el
consumo humano?

JUSTIFICACIÓN

La Shigella es un grupo de bacterias, es la causa más común de las enfermedades

transmitidas por los alimentos, estos no son específicos ya que pueden encontrarse
en muchos de ellos como ensaladas, tubérculos, carnes, pescados, etc. El papel de
los alimentos en la transmisión de la shigelosis es muy importante, aunque actúan,
únicamente, como vectores no específicos.
La Shigella se transmiten a los alimentos a través de las manos de los portadores o
enfermos si están infectadas con heces, residuos de alimentos, manipulación de
agua contaminada e insectos que han estado contactado con heces de enfermos.
Es necesario conocer la mejor forma de identificar la presencia de shigella en la
carne de cerdo, específicamente en sus vísceras para así determinar las posibles
consecuencias que conlleva consumir este producto.

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 MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVO

Material Reactivos Equipo Muestras

Cajas petri Caldo nutritivo Autoclave Viseras de
puerco.

Tubos de ensaye de 13x100 Agar XLD Incubadora

Matraz aforado Agar EMB Mechero

Probeta de 100 mL TSI Balanza analítica

Porta objetos Caldo urea
Pipeta Medio SIM
Papel filtro Medio MIO
Vasos de precipitado LIA
Gasas Citrato de Simmons.
Papel estraza Agua destilada.
Papel aluminio SSF
Pipeta de 1 mL
Algodón
Asa bacteriológica
Jeringa
Cinta testigo

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 METODOLOGÍA

El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se considera

como una unidad analítica, en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta
cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción de 1:9 en
el medio de pre-enriquecimiento. La mínima muestra recomendada es de 25.0 g, es
decir, una unidad analítica.
El procedimiento se realizará por duplicado, una de forma directa y otra de forma
indirecta.

PRE- ENRIQUECIMIENTO.

1. Pesar en área aséptica 25.0 g de muestra a analizar.

2. Preparar 225.0 mL de caldo lactosado y esterilizar.
3. Homogeneizar la muestra con el diluyente.
4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de
boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura
ambiente con la tapa perfectamente cerrada.
7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
8. Incubar la muestra homogénea a 35 2 C durante 24 h.

AISLAMIENTO EN CAJAS PETRI.

1.-Preparar los agares SS, XLD, EMB.

2.-Vaciar los agares en las cajas petri.
3.-Una vez ya solidificados los agares se procede a sembrar con la técnica de estriá
cruzada.
4.-Incubar de 18-24 horas a 35 +/- 37º C.

SKRINNINING.

1.-A partir de los resultados de la fase anterior realizar skrinning.

2.-Preparar 1 tubo de agar TSI.
3.-Preparar 1 tubo de caldo Urea.
4.-Preparar lisina, purpura de bromotimol y agar bacteriológico para LIA.
5.-Inocular en cada uno a partir de las colonias sospechosas.
6.- Incubar de 18-24 horas a 37º C

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

Citrato de Simmons.
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI e inocular
por estría en el tubo con agar citrato de Simmons.
2. Incubar a 37 C durante 96(+,-2 h)
3. Interpretar los resultados.

Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad).

1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular por
punción vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que
presente crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovac’s.
4. Interpretar resultados.

IMVIC.

1. Producción de indol (I)

•Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.

• Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
• La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera una
prueba positiva.

2. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

• Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

• Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
• Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.

3. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

• Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h.

• Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y agitar.
• Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

4. Utilización del citrato (C)

• Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
• Incubar a 35°C por 96 h.
• El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera
una prueba positiva
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Fenilalanina.
1. Coger un inóculo del microorganismo problema, haciendo uso de un asa de
siembra, procedente de un cultivo previo en placa.
2. Sembrar el microorganismo problema en el medio de fenilalanina utilizando
la técnica de slam o lengüeta.
3. Incubar a 37º C de 18 a 24 horas.
4. Pasado el yiemepo añadir 4 o 5 gotas de Cl3 Fe haciendo uso de una
pipeta pasteur. Procurar que se deslice bien por el agar inclinando el tubo.
5. Esperar 2 minutos.
6. Observar y anotar la reacción resultante.

Caldo KCN.
1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI e inocular en
el tubo con caldo KCN.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
3. Interpretar resultados.

Tinción de gram.
1.- Colocar 4 gotas de agua salina en el portaobjeto y luego esterilizar el asa
bacteriológica.
2.- Tomar una pequeña muestra de la cepa y mezclar con la primera gota y así
sucesivamente.
3.- Fijar el material pasando el portaobjeto 3 o 4 veces por la llama, para evitar que
sea arrastrado por agua de lavado.
4.- Colocar el portaobjetos sobre un soporte y cubrir con solución de cristal violeta
durante 1 minuto.
5.- Lavar cuidadosamente con abundante agua.
6.- Cubrir con solución de yodo durante 1 minuto y lavar con agua.
7.- Decolorar durante 20 segundos exactamente con solución de alcohol-acetona
y lavar con agua.
8.-Cubrir con solución safranina por 1 minuto y lavar.
9.-Observar en el microscopio.

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 BIBLIOGRAFÍAS
6.-NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos
de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores.
Determinación de microorganismos patógenos.
Ryan KJ; Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiolog (4th ed. Edición).
McGraw Hill.

World Health Organization (Página principal). Enfermedades diarreicas.

Actualizado: febrero 2009; acceso: 14 de febrero de 2013; (aprox. 5 pantallas); en
inglés.Disponible en h ttp://www.who.int/vaccine_research/diseases/diarrhoeal/en/i
ndex6.html
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). National Shigella Surveillance
Overview. Atlanta, Georgia: US Department of Health and Human Services, CDC,
2011.

5.-NORMA Oficial Mexicana NOM- 213-SSA1-2002 Productos y servicios.

Productos cárnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.
www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/159ssa16.html

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