UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL

Laboratorio Biotecnología Industrial

PRACTICA 7
RECUENTO EN PLACA

GRUPO: 3

INTEGRANTES:

Chicaiza Daniel

Gavilanes Paul

Gualoto David

Lima Alexander

Vaca Tamia

Salguero Josue

DOCENTE:

Dr. Pablo Araujo

AYUDANTE DE CÁTEDRA: Francisco González-Valerio

Quinto Semestre

Quito – Ecuador
 RESUMEN

Determinación de la concentración de las diluciones y observación de las

colonias formadas.
Se prepara tubos de ensayo con el método de dilución seriada de la muestra
base en un diluyente a su vez se preparan y rotula placas petrifilm en una área
aséptica se toma la muestra del primer tubo de ensayo y se lo coloca en el
primer petrifilm, se siembra de la misma manera cada una de las diluciones
en las placas petrifilm y repetir el procedimiento hasta el cuarto tubo se
procede a incubar por 24 horas y observar el crecimiento. Se realiza el
recuento de colonias bajo el manual de nuestro petrifilm y se obtiene el
número de UFC; este método permite tener un conteo más específico y
diferenciado debido a los colores que son fácilmente observables.

PALABRAS CLAVE: CRECIMIENTO_MICROBIANO/ DILUCION

SERIADA/ PETRIFILM / TIEMPO_GENERACIONAL/ RECUENTO DE
PLACAS.
 PRÁCTICA 7
RECUENTOS EN PLACA
1. OBJETIVOS
 Aplicar la técnica de dilución seriada.
 Determinación de la concentración de las diluciones.
 Observación de las colonias formadas.
2. TEORÍA
2.1. Dilución seriada.
En muchos casos se necesita preparar disoluciones con concentraciones
extremadamente bajas de un soluto, hasta un punto que es difícil o imposible en la
práctica medir la cantidad necesaria de producto sólido o el volumen de solución
madre. En esas situaciones es necesario preparar una solución de mayor concentración
(solución de stock o solución madre) y hacer diluciones sucesivas a partir de ésta hasta
alcanzar la concentración deseada.

 Banco De Diluciones Seriadas

En otros casos, muy frecuentes en estudios biológicos, se intenta analizar la variación
de algún parámetro que depende de la concentración de un soluto y se necesita preparar
soluciones con distintas concentraciones del mismo.
En este caso es muy conveniente hacer un banco de diluciones seriadas que no son más
que un tipo de diluciones sucesivas manteniendo constante el factor de dilución en cada
paso. (3M, CP 01210)
2.2. Siembras en placas petrifilm
Las Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios (Aerobic Count AC) son un medio de
cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes del Agar Standard Methods, un
agente gelificante soluble en agua fría, y un tinte indicador de color rojo que facilita el
recuento de las colonias. Las Placas Petrifilm AC se utilizan para el recuento de la
población total existente de bacterias aerobias en productos, superficies, etc.
(3M, CP 01210)
2.3. Técnicas de recuento.
Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente
disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de
muestras filtradas en membranas y transparentadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado

de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las
superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de
dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza
 iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono). (Covadonga
Vázquez, 2011)

Figura 2.3-1 Ejemplo de Conteo Celular (Lugones, 2012)

2.4. Recuento de colonias en petrifilm. (UFC)

Recuento de bacterias aerobias “estimado”
Cuando el número de colonias es mayor a 250 (como se puede observar en la figura 5), por su
excesivo crecimiento, los recuentos deben ser estimados. Determine el promedio de colonias
en un cuadrado (1 cm2) y multiplíquelo por 20 para obtener el recuento total por placa. El
área de inoculación de PetrifilmAC es de 20 cm2. El rango recomendado de recuento en la
Placa PetrifilmAC está entre 25-250 colonias
Recuento de bacterias aerobias = MNPC
Con recuentos muy altos, el área total de crecimiento puede virar o colorearse rosa, como se
muestra en la figura 7. Se podría observar colonias individuales sólo en el filo o borde del área
de crecimiento. Registre este conteo como muy numeroso para contar (MNPC). (3M, CP
01210)

3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material y Equipos
  Lámpara de alcohol
 Pipeta Semiautomática.
 Placas petrifilm
 Jeringuillas de insulina
 Tubos de Ensayo.
 Gradilla
3.2. Sustancias y reactivos
 Medios de cultivo
 Agua destilada
 Sustancia a diluir.

3.3. Procedimiento
3.3.1. Se preparan 5 placas petrifilm.
3.3.2. Rotular las placas petrifilm.
3.3.3. Preparar el área aséptica
3.3.4. Colocar en 4 tubos de ensayo 9 ml de agua peptonada.
3.3.5. Colocar en el primer tubo de ensayo 1 ml de la muestra madre y homogenizar.
3.3.6. Tomar 1 ml de la primera dilución y colocarlos en el segundo tubo de ensayo.
3.3.7. Repetir el procedimiento hasta el cuarto tubo.
3.3.8. Sembrar cada una de las diluciones en las placas petrifilm
3.3.9. Proceder a incubar por 24 horas y observar el crecimiento.
3.3.10. Realizar el recuento de colonias.

4. DATOS
4.1 Datos Experimentales.
Tabla 4.1-1
Observación de la dilución.
Dilución Observación

105 La solución presenta un color amarillento turbio, no

se observa formación de partículas flotantes.

104 La solución presenta un color amarillento turbio, no

se observa formación de partículas flotantes.
 103 La solución presenta un color amarillento menos
turbio, no se observa formación de partículas
flotantes.

102 La solución es casi transparente, presenta un muy

ligero todo amarillo.

101 La solución es transparente, no hay formación de

partículas flotantes.

Fuente: Laboratorio de Biotecnología Industrial. Centro de Biología. Universidad Central

del Ecuador.

Tabla 4.1-2
Datos iniciales.
Variable Valor

Ca0 106 g/mL

Volumen Agua 9 mL

Fuente: Laboratorio de Biotecnología Industrial. Centro de Biología. Universidad Central

del Ecuador.

4.2. Cálculo de la concentración obtenida.

𝑪𝒂𝒙 = 𝑪𝒂𝟎 ∗ 𝒇
𝑔 𝑔
𝐶𝑎1 = 106 ∗ 10−1 = 1 ∗ 105
𝑚𝐿 𝑚𝐿

𝒙 = 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏.
𝑪𝒂 = 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒄𝒊𝒆 𝒂
𝒇 = 𝒇𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏.

4.3. Cálculo de conteo de colonias

Tabla 4.1-3
Colonias observadas en petrifilm aerobio

Variable Valor
Colonias observadas Incontable Incontable Incontable 94 Incontable
Volumen de muestra 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
utilizado
 Dilución 1 2 3 4 5
Fuente: Laboratorio de Biotecnología Industrial. Centro de Biología. Universidad Central
del Ecuador.

Tabla 4.1-3
Colonias observadas en petrifilm Entereobacteriaceae

Variable Valor
Colonias Incontable Incontable Incontable Incontable Incontable
observadas
Volumen de 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
muestra utilizado
Dilución 1 2 3 4 5
Fuente: Laboratorio de Biotecnología Industrial. Centro de Biología. Universidad Central
del Ecuador.

𝒇
#𝑼𝑭𝑪 = 𝑪𝑶 ∗
𝒗
1 ∗ 10−4
#𝑈𝐹𝐶 = 94 ∗ = 9,4 ∗ 10−3
1

𝑪𝒐 = 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒐𝒃𝒔𝒆𝒓𝒗𝒂𝒅𝒂𝒔
𝒇 = 𝒇𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏.
𝑽 = 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂.

RESULTADOS
Tabla 5-1
Observaciones de crecimiento microbiano.
Crecimiento Observación.
microbiano
Aerobia Entereobacteriaceae

Dilución 1 La Placa de recuento de Existe formación de burbujas de

Petrifilm Aerobic muestra un
Plato aeróbico de petrifilm
sin colonias lo que quiere
decir que es difícil ver
colonias distintas de E. coli,
porque son incoloras o tienen
un color gris claro- beige.
aire concentradas en el centro de
la placa, las enterobacterias solo
produjeron colonias que están
asociadas con burbujas de gas,
las cuales son TNTC.
 Dilución 2 La Placa de recuento de
Petrifilm Aerobic muestra un
Plato aeróbico de petrifilm
sin colonias lo que quiere
decir que es difícil ver
colonias distintas de E. coli,
porque son incoloras o tienen
un color gris claro- beige.
Dilución 3 La Placa de recuento muestra
un Plato aeróbico de petrifilm
sin colonias lo que quiere
decir que es difícil ver
colonias distintas de E. coli,
porque son incoloras o tienen
un color gris claro- beige.
Dilución 4 Se observa colonias
distribuidas uniformemente,
Las placas de recuento de
colonias son rojas y se
pueden distinguir fácilmente
de las partículas de alimentos
opacos que pueden causar
confusión con el agarre
Platos.
Dilución 5 Placa de conteo aeróbico de
Petrifilm con colonias que
también lo son numerosos
para contar (TNTC).
Tabla 5-2
Resultados
Dilución Vol. Agua Ca0
(mL)
Aero.
1 9 106 --
Existe formación de pequeñas
burbujas de aire, que son más
grandes en los bordes de la placa,
las enterobacterias solo
produjeron colonias que están
asociadas con burbujas de gas,
las cuales son TNTC.
Existe formación de burbujas de
aire de diversos tamaños en toda
la placa, solo produjeron
colonias que están asociadas con
burbujas de gas, las cuales son
TNTC.
Existe formación de pequeñas
burbujas de aire en toda la placa,
solo produjeron colonias que
están asociadas con burbujas de
gas, las cuales son TNTC.
Existe formación de pequeñas
burbujas de aire en toda la placa,
solo produjeron colonias que
están asociadas con burbujas de
gas, las cuales son TNTC.
Ca #UFC
Ente. Aero. Ente.
-- -- --
 2 9 106 -- -- -- --

3 9 106 -- -- -- --

4 9 106 102 -- 9,4*10-3 --

5 9 106 -- -- -- --

5. DISCUSIÓN
El método cualitativo utilizado en la práctica fue el adecuado, debido a fue posible
contabilizar la cantidad de microorganismos presentes en una muestra mediante el
uso de placas petrifilm. Durante la práctica existieron errores aleatorios tales como al
momento de colocar la muestra en la placa no se distribuyó de manera adecuada,
ocasionando que no cubra toda la superficie de los nutrientes y además existió
formación de burbujas dentro de la placa, afectando el campo visual hacia el analista
lo que impidió la correcta visualización en el microscopio y por lo tanto el conteo.
Sin embargo, dichos errores no afectaron significativamente la práctica ya que logro
cuantificar el número de microorganismos en la placa. En base a la experiencia se
recomienda, que al colocar la muestra dentro de la placa de petrifilm, no se ejerza
demasiada presión esto para evitar que el medio de cultivo se expanda e impedir
posteriores burbujeos previos al conteo celular.

6. CONCLUSIONES
6.1 Se determinó que el método de recuento de placas es de mucha utilidad ya que permitió
especificar el número aproximado de microorganismos que se encuentran en una muestra de
E. Coli, por lo que se puede deducir que este método puede ser utilizado de manera
alternativa, de los métodos analizados las anteriores prácticas, ya que permite identificar y
contar las UFC. (David Gualoto)
6.2 Al realizar el recuento se obtuvo un cambio del color del gel a amarillo y muchas burbujas
de gas indican colonias TNTC, es decir sin incontables, debido a la alta concentración,
entonces para tener un recuento más preciso se debe diluir la muestra. (Alexander Lima)
6.3 De acuerdo a la tabla de resultados 5-1, para la placa petrifilm Entereobacteriaceae se
formaron burbujas, por lo que se concluye que la E.Coli en este medio produce algún gas o
vapor, lo cual impide visualizar la formación de colonias. (Josué Salguero)
6.4 Analizando la tabla de resultados se puede ver como las diferentes diluciones permiten o
no determinar el tamaño de la población bacteriana de las muestras. Siendo algunas
inevitablemente incontables por la presencia de burbujas de gas, propias de microorganismos
aerobios, por lo tanto en los métodos de recuento de microrganismo son inevitables los
errores, especialmente cuando se analiza muestras pequeñas.(Paul Gavilanes)
6.5 Se formaron muchas burbujas de gas en las placas de petrifil Entereobacteriaceae con lo
que se pudo determinar que estas burbujas están asociadas a las colonias, mientras que en las
placas de petrofilm Aerobia existieron: en la primera, segunda y tercera dilución que no
existían colonias ya que puede que estas bacterias sean incoloras o tomen un color Beige,
mientras que en la cuarta si se pudo obtener un conteo de colonias las cuales se puede decir
que estas ya estaban consumiendo mejor el medio de cultivo y de la misma manera paso en
la quinta dilución,
6.6 La dilución seriada nos permite tener un conteo visible en nuestros petrifilm sobre el
recuento de placas de E-coli con la visualización de pigmentos que se encuentran las colonias
de aerobios ya que se tiñen de rojoy se las diferencia de partículas, residuos o producto, ya
que éstos tienen un color opaco(Tamia Vaca)

7. CUESTIONARIO.
7.1.¿Qué permite determinar el estudio cuantitativo de bacterias?
Señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar
por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta
celular, masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o
indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad celular
(indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población
bacteriana).
7.2.Describa como obtendría una dilución de 10-5 de una solución 1/100 de la muestra
a analizar

1
Tubo 1: 100 se toma 1 ml de esta solución

1
Tubo 1: 1000 se toma 1 ml de esta solución

1
Tubo 1: 10000 se toma 1 ml de esta solución

1
Tubo 1: 100000 y se obtendría una dilución de 10-5

7.3.¿Qué es un organismo indicador, y que propiedades debería tener?

Es un microorganismo cuya presencia permite determinar la existencia de un patógeno.
Este indicador se usa mayoritariamente en la determinación de contaminación de las
aguas.
  No encontrarse en agua no contaminada.
 Estar presente en el agua contaminada manteniendo una correlación con los
patógenos.
 Ser más abundante que los patógenos.
 Sobrevivir en el agua más tiempo que los patógenos.
 No multiplicarse en el agua.
 Ser detectado, de la forma, más rápida, fácil y económica.
 En lo posible tener criterios microbiológicos comunes internacionalmente.
7.4.Cómo se define a un coliforme? Como se relaciona esta definición con las pruebas
presuntivas, de confirmación y finales?
Un coliforme es un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características
bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación del agua
y los alimentos.
Se relaciona con las pruebas presuntivas, de confirmación y finales, ya que una reacción
negativa o positiva va a indicar o no la presencia de coliformes.
7.5.Cómo se diferencia entre coliformes y coliformes fecales en el laboratorio?
Se los diferencia realizando la prueba de sustrato definido (coliformes) y la prueba de
presencia-ausencia (coliformes y E. coli). Para ésta técnica debemos pasar el agua por un
filtro de membrana, al filtro se lo transfiere a la superficie de un medio sólido o sobre un
soporte absorbente que contiene el medio líquido deseado.
7.6.Ventajas y desventajas entre el uso del método tradicional y el Petrifilm?
Ventajas: Colonias más vistosas, existe gran variedad de medios, los medios son de rápida
solidificación.
Desventajas: Se requiere mucho tiempo para preparar los medios de cultivo, los medios son
susceptibles a cambios de pH, la mala homogenización del medio dificulta el recuento de
colonias
Petrifilm
Ventajas: No se prepara medio de cultivo, las placas ocupan menos espacio que las cajas
Petri, reducción de tiempo y mano de obra, altamente selectivos.
Desventajas: Se pueden generar burbujas de aire, las placas son costosas, se puede derramar
la muestra por lo que se debe tener mucho cuidado.

7.7.Para el caso del Petrifilm® ¿Por qué las colonias Mesófilos aerobias se observan de
color rojo?
Se debe al uso de un indicador rojo en la placa que colorea todas las colonias de mesofilos
aerobias, y el film superior atrapa el gas en caso de que éste sea producido por las bacterias.
Las bacterias acidificantes aparecen como colonias rojas rodeadas por una zona amarilla
asociada a la producción de ácido que es detectado por el indicador de pH del medio.
(Petrifilm, 2008)

7.8.¿Porque se utiliza agua Peptonada y no agua destilada para hacer las diluciones?
Porque el agua peptonada es un diluyente enriquecedor de bacterias, la peptona proporciona
nutrientes necesarios para el desarrollo microbiano mientras que el agua destilada
condiciona el crecimiento de los microorganismos si no es previamente sometida a
controles periódicos que aseguren su calidad especialmente su conductividad, pH y grado
de contaminación microbiana.

7.9.¿Cuáles son las ventajas y desventajas de realizar el método de recuento en placa?

VENTAJAS DESVENTAJAS

Fácil de leer colonias puntiformes. Se necesita un dispersor diferente para

cada una de las placas

Distinción de mohos/ levaduras. Se debe tener cuidado al momento de

dispersar la muestra para evitar que se
derrame

Diferenciación entre colonias/partículas Se generan burbujas de aire al momento

de dejar caer el film superior

Identificación de E.coli. La placa de mesofilos en muchas

ocasiones no permite diferenciar colonias
claras y dificulta la interpretación

Requieren menor espacio en Es necesario ajustar el pH de algunas

muestras antes de su inoculación
incubación y almacenaje.

Fácilmente transportables para Placas son costosas

muestreos en planta.

8. ANEXOS
8.1.Diagrama del equipo.
8.2.Diagrama del crecimiento microbiano.

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https://es.scribd.com/doc/38138496/Recuento-y-Cuantificacion-de-Microorganismos
ANEXO 1
8.1. Diagrama del Equipo.

Figura 8.1-1
Diagrama del Equipo

Fuente: Laboratorio de Biotecnología Industrial , 2019.

Nombres Fecha Universidad Central del Ecuador

Dibuja: Grupo N°3 05/06/2019 Facultad de Ingeniería Química

Revisa: González-V 05/06/2019 Laboratorio Biotecnología Industrial

Escala:

RECUENTO EN PLACA 1
 ANEXO 2
8.2. Curva de crecimiento Microbiano

Figura 8.1-2
Diagrama 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 = 𝑓(𝑡)

Curva de crecimiento microbiano

140

120

100

80

60

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6

T=20min T=40min

Fuente: Excel, Laboratorio de Biotecnología Industrial, 2019.

Escala:

x Cuadrante 1:1

y 𝐵𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 1:20

Nombres Fecha Universidad Central del Ecuador

Dibuja: Grupo N°3 05/06/2019 Facultad de Ingeniería Química

Revisa: González-V 05/06/2019 Laboratorio Biotecnología Industrial

Escala:

RECUENTO EN PLACA 2