Así como actualmente se produce la insulina recombinante, es posible producir a

escala masiva y con métodos biotecnológicos distintas hormonas. Una de estas

hormonas, muy importante para el tratamiento de diversas patologías asociadas con el
desarrollo, es la Hormona del Crecimiento Humana, HGH (Human Growth Hormone). En
el siguiente ejercicio tienes que clonar el gen de dicha hormona en un plásmido y
seleccionar las colonias de bacterias que la expresan.
Abajo se muestra el mapa de un plásmido comercial que permite seleccionar moléculas
recombinantes mediante el sistema de alfa complementación. En el mapa se señalan
diferentes zonas importantes, tales como el sitio de Origen de replicación (ori), el gen
LacZ y su promotor (promLacZ), el gen de resistencia a ampicilina (Ap R) y los sitios
múltiples de clonación (MCS, multiple cloning sites). Como se indica, el tamaño del
plásmido es de 2,686 pb, las cuales se empiezan a contar a partir del final del ori en
contra de las agujas del reloj. Los números indican la posición de los distintos sitios de
restricción en el plásmido (por ejemplo, el sitio BamHI se encuentra a 2500 pb y EcoRI
a 460 pb).
A partir de una biblioteca de cDNA, aislaste el fragmento que contiene el gen de la
HGH. Abajo se encuentra el mapa de dicho fragmento, la sección en amarillo indica
donde se encuentra el gen, además se muestran entre paréntesis las posiciones de los
distintos sitios de corte para diferentes enzimas de restricción.

Con base en lo anterior:

a) Indica que enzima(s) de restricción elegirías para clonar el gen de la

HGH en el plásmido pUC19 en la orientación correcta y explica
brevemente por qué.
Enzimas de restricción: Sma I y Pst I
Eligiria estas ya que solo cortan la region codificante removiendo aminoácidos
innecesarios. Ademas se encuentran en la región de polilinker del vector.

b) Dibuja un esquema en donde muestres el proceso de corte y ligación

del gen con el plásmido de acuerdo a los sitios de corte de la(s) enzima(s)
que elegiste, e indica las bases que reconoce(n) dicha(s) enzima(s) para
hacer la digestión.

El siguiente paso consiste en transformar una cepa adecuada con el vector de

clonación y seleccionar aquellas en las que se haya clonado el inserto que codifica a la
HGH.
Considerando que el gen está clonado dentro de un segmento de DNA del gen lacZ que
codifica el a péptido, explica:

c) ¿Qué cepa bacteriana elegirías para transformarla con el producto de

la ligación?
 Se sugiere utilizar la cepa E. coli JM 119

d) ¿Cómo identificarías a las bacterias que contienen al plásmido? y ¿cómo

a aquellas que contienen al plásmido con el inserto del gen de la HGH?

Se prueba la resistencia al antibiótico ampicilina ya que el vector puc19 que utilizamos

confiere resistencia a esta como marcador de transformación. Se debe tener cuidado
con las colonias satelite.

Conforme a lo anterior, seleccionaste una bacteria que contiene al plásmido con el gen
de la HGH. Una manera de verificar que realmente esa bacteria contiene el vector con
el inserto clonado es mediante digestión con enzimas de restricción. Los productos de
la digestión se corren en un gel de agarosa y se observa si el patrón de bandas (el
número y tamaño de las bandas que aparecen en el gel) corresponde a lo esperado.
Tomando en cuenta esto:

e) Propón dos enzimas de restricción para hacer dos digestiones que

permitan determinar que el gen de la HGH está clonado en pUC19.

Utilizaria Sma I y Pst I para un gel confiable.

f) Representa un gel en donde dibujes dos carriles con las bandas esperadas,
de acuerdo a los sitios de restricción y el tamaño de los productos de cada
digestión, comparándolos con los patrones obtenidos en las digestiones de
plásmidos que no contengan el inserto.

g) Si quisieras probar esto mismo con una reacción de PCR ¿qué primers
tendrías que diseñar? Has un esquema de una electroforesis en donde
analizas los productos que obtendrías en una reacción en la que empleas
como molde el pUC19 vacío en comparación con una reacción en la que
empleas como molde el pUC19 conteniendo el gen HGH?
>gi|20809248:63-716 Homo sapiens growth hormone 1 (GH1), transcript variant 1, mRNA
ATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCC
CTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATA
TCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAA
ACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTT
CGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGC
TGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAG
AACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTG
TGGCTTCTAG

Los primers necesarios serían

GTCGAGGATCTTCGGTGTCG

GACGTCATGGCTACAGGCTC

2) Se desea modificar genéticamente al genero Gossypium para que sea capaz

de crecer a partir de aguas tratadas con altos niveles de fosfatos, nitratos, pesticidas y
residuos organicos.

Para esto se propone seguir la siguiente metodología usando el mecanismo natural de

infección de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens
 1. Primero se extrae el material
genético de donde se quiera
obtener los genes de
resistencia y crecimiento con
altas cantidades de agua del
genero Eichhornia. Conocido
ampliamente por su
crecimiento en aguas
residuales, estancadas y
como agente depurador en
esta clase de espejos de agua.
2. Se utilizaria PCR normal para
amplificar el genoma
completo identificando los
genes que confieren dichas
caracteristicas mencionadas
anteriormente.
3. Se liga el gen con el plásmido Ti de Agrobacterium con un gen de resistencia a algún
antibiótico, se prepara agrobacterium para transformarla, y se transforma usando
transformación con cloruro de calcio.
4. Se cultiva Agrobacterium con el plásmido modificado.
5. Se crecen callos de especies de Gossypium, el tejido se infecta con el Agrobacterium
esperando sea transformado y cultivar en otro tipo de medio que induzca la el crecimiento
de la planta con el antibiótico para seleccionar sólo los productos transformados