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Laboratorio de Tecnología de Fermentación: Evaluación de la influencia de fuentes de

carbono y de nitrógeno sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

EVALUACION DE LA INFLUIENCIA DE FUENTES DE CARBONO Y NITROGENO EN

EL CRECIMIENTO DE S. cerevisiae

TECNOLOGIA DE FERMENTACIONES 19-02

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
FACULTAD DE INGENIERÍA

OBJETIVO GENERAL:

 Analizar el efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno sobre la formación de

biomasa de S. cerevisiae
 Reforzar los conceptos de experimentación y modelamiento de una fermentación batch
aprendidos en clase.

1. Introducción.

Los medios de cultivo deben proveer los requerimientos básicos para el desarrollo y proliferación de
los microorganismos, para tal fin, dentro de su composición normalmente se incluyen: fuente de
carbono, fuente de nitrógeno (macronutrientes), sales minerales, vitaminas, cofactores
(micronutrientes). También es básico tener en cuenta los diferentes factores ambientales que están
directamente relacionados con el crecimiento de estos como son: temperatura, pH, oxígeno,
concentración de solutos, entre otros.

Los medios de cultivo pueden clasificarse de la siguiente manera:

-Medios químicamente definidos (se conocen todos los componentes y concentraciones exactas
de estos dentro del medio).

- Medios complejos (no se conoce por completo su composición química, ni concentración de

componentes y en muchos casos se trabaja sobre la base de subproductos agroindustriales).

El correcto diseño de un medio de cultivo permitirá el crecimiento y producción de los metabolitos

de interés bajo condiciones controladas de laboratorio, para luego poder predecir y alcanzar niveles
de producción que sean rentables para el sector industrial.

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carbono y de nitrógeno sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

2. Preguntas preliminares a la práctica:

2.1. Lea de manera comprensiva el contenido de la guía, antes de la sesión de trabajo y consulte sobre
los aspectos que no comprenda. Comparta estas inquietudes con sus compañeros y con el docente
hasta que haya claridad conceptual.

2.2. Realice antes de la práctica los cálculos necesarios para la formulación del medio de cultivo.

2.3. Revise previo a la práctica de laboratorio la hoja de seguridad del Reactivo DNS (ácido 3,5-
dinitrosalicilico).

2.4. Se recomienda traer para la práctica: Sharpie, cinta de enmascarar, calculadora.

2.5 Consulte en la literatura la respuesta fisiológica y metabolismo de S. cerevisiae cuando es crecida

sobre cada uno de los nutrientes empleados en la practica (Metabolismo de carbohidratos y de
nitrógeno)

3. Fundamento teórico.

Saccharomyces cerevisiae es una levadura que en condiciones aeróbicas produce dióxido de carbono,
agua y una producción relativamente alta de biomasa, mientras en condiciones anaeróbicas tiene una
velocidad relativamente lenta de crecimiento, que se acopla a una alta conversión de azúcar en alcohol
y dióxido de carbono. Dentro de sus requerimientos nutricionales se encuentra el carbono, como el
mayor compuesto encontrado en la célula, utilizando para su metabolismo glúcidos como hexosas,
disacáridos y trisacáridos. El Nitrógeno se encuentra en la célula formando parte esencial de las
proteínas, aminoácidos y ácidos nucleicos; el Fósforo se encuentra en los ácidos nucleicos, en la
lecitina y en diversos compuestos fosforilados que participan activamente en los procesos de
degradación oxidativa y de intercambio energético (ATP, ADP, AMP, NADP). Para que las fuentes
de Nitrógeno, Fósforo y Carbono presentes en el sustrato sean aprovechados por la levadura se
requiere que se encuentren en forma asimilable.

La evaluación de nutrientes en los medios de cultivo en donde se realizan cambios deliberados en las
variables de entrada de un sistema (Biomasa inicial-sustrato inicial), para observar e identificar los
cambios que pudieran darse en la salida (Biomasa formada-sustrato consumido-producto formado)
se hacen cada vez más importantes en los bioprocesos ya que permiten comparar parámetros en
términos de rendimiento y productividad lo que permite hacer una toma de decisiones más eficiente.

Teniendo en cuenta lo anterior, esta práctica tiene como objetivo Evaluar el efecto de diferentes
fuentes de Carbono y Nitrógeno en la formación de biomasa de S. cerevisiae.

4. Seguridad durante la práctica

4.1. Equipos de protección personal.

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

 Bata de laboratorio
 Guantes de nitrilo

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 Gafas de seguridad
 Zapatos cerrados

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su
intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

4.2. Manejo de residuos químicos y biológicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prácticas del laboratorio en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales
están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.
2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no
controladas y potencialmente peligrosas.
3. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la
práctica.

NOTA: Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le
indicará la forma correcta de hacerlo.

Observación: Por favor tenga en cuenta organizarse muy bien las actividades de cada uno de los
integrantes del grupo antes de la práctica y permita que los encargados de la misma les ayuden a
coordinar para que el flujo de actividades sea el adecuado.

5. Materiales

5.1 Reactivos

 Glucosa anhidra
 Galactosa
 Extracto de levadura (considere un aporte del 11,4% de Nitrógeno por parte del extracto peso
húmedo)
 Sulfato de amonio anhidro (NH4)2SO4
 Nitrato de amonio anhidroNH4NO3
 Solución salina 0,85% (p/v)
 Tiamina 4 mg/L
 Piridoxina 4 mg/L
 Pantotenato 4 mg/L
 Reactivo DNS (Ácido 3,5-dinitrosalicílico).*Ver preparación anexo #1
 Agua Tipo II.
 Solución salina 0.85% (p/v) estéril 3L

5.2 Materiales para la preparación del inoculo

 Solución de células suspendidas en NaCl 0,9%

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5.3 Equipos

 Balanza
 Cabina de flujo laminar
 Balanza de humedad
 Bomba de vacío
 Microscopio
 Autoclave
 Shaker termostatado
 Espectrofotómetro
 Nevera
 Micropipetas 10-100uL
 Micropipetas 100-1000uL
 Micropipetas 1000-5000uL

5.4 Material de vidrio estéril

 Erlenmeyers de 250 mL (12)

 Erlenmeyers de 100 mL (6)
 Tubos falcon 50 mL (6)
 Tubos falcon 15 mL (20)
 Frasco con desprendimiento lateral (12)
 Tubo de ensayo con tapa 13*100 (50)

5.5 Otros
 Caja puntas amarillas esteriles
 Caja de puntas azules esteriles
 Caja de puntas blancas estériles
 Caja de celdas desechables
 Caja de filtros de membrana 0,45um
 Tubos Eppendorf 1.5 ml
 Gradilla para tubos Eppendorf
 Pinzas
 Beaker x 5mL o vidrio reloj

5.6 Microorganismo
 Saccharomyces cerevisiae

6. Procedimiento:

6.1 Preparación de los medios de cultivo:

 Realizar los cálculos necesarios previamente al día de la práctica teniendo en cuenta los siguientes
aspectos:

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carbono y de nitrógeno sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

- El medio de cultivo debe formularse para producir 2.4 g/L de biomasa.

- La fórmula elemental de S. cerevisiae es: CH1.8 O 0.5 N0.2
- Las fuentes de carbono a evaluar son: Glucosa y Galactosa
- Las fuentes de Nitrógeno son: Extracto de levadura y Sulfato de amonio y Nitrato de
amonio.
-El nutriente limitante debe ser la fuente de Carbono. En todos los casos 5% de cenizas.
- La fuente de Nitrógeno debe calcularse con un exceso del 20%
 Determinar el número de experimentos a realizar, con las dos fuentes de carbono (FC) y tres
fuentes de nitrógeno (FN).
 Cada unidad experimental tendrá una réplica (duplicado).
 El asistente de docencia estará encargado de preparar los medios de cultivo de acuerdo al
diseño que ustedes establezcan teniendo en cuenta las correcciones pertinentes.
 Completar información en la tabla N° 1.1 y 1.2.

6.2 Inoculación:

 A partir de la suspensión celular dada por el asistente (X1) calcular el volumen de inoculo a
adicionar teniendo presente que la X0 de cada unidad experimental debe ser aproximadamente
de 0.4 g/L
 Tenga presente que él % del volumen inoculo no sea superior al 2%.
 Establezca una estrategia de inoculación calculando el volumen que debe ser adicionado a
las unidades experimentales luego de consultar el valor de la concentración de biomasa de la
suspensión prepara por el asistente de docencia.
 Tome un tubo Falcon con la solución de inoculo y agítela con el vortex por unos segundos y
luego cerca al mechero transfiera el volumen calculado al Erlenmeyer que contiene los 100
ml de medio de cultivo (unidad experimental).
 Homogenizar y en condiciones estériles tomar una muestra de 1mL (trate de ser preciso en la
toma de este volumen) y adicionar al correspondiente tubo Eppendorf ya previamente
marcado y pesado.
 Flamear la boca del Erlenmeyer, tapar con tapón de algodón y papel de aluminio, e incubar
a 32°C, 120 rpm
 Seguidamente usted procederá a pesar el tubo Eppendorf (lleno con la muestra) en la balanza
analítica y registrará el valor en la tabla. Luego coordinadamente con los responsables de la
práctica procederá a centrifugar los dos tubos (ensayo y replica) en la centrifuga refrigerada
(programa #, 1 minuto, 6000 rpm y 4°C).
 Al finalizar, usted tendrá que recuperar el sobrenadante en los otros dos tubos Eppendorf que
tiene en la gradilla y conservar el precipitado de células en el otro tubo. A este último será
necesario adicionar solución de NaCl (1%) hasta alcanzar el mismo volumen de la muestra
en el respectivo tubo Eppendorf. A continuación, llevarlo al vortex por un minuto hasta que
todas las células se resuspendan.
 Realizar la lectura en el espectrofotómetro vernier a la longitud de onda de 421 nm utilizando
como blanco (solución NaCl 1 %), reemplazar el valor de la absorbancia en la ecuación de
peso seco vs absorbancia que se le suministrará y calcular el respectivo valor de
concentración de Biomasa inicial (mg de biomasa/mL). Posteriormente conociendo el peso
de la masa de 1mL de la muestra tomada, exprese el valor en unidades de mg de biomasa
seca/g de caldo de mosto.
 Para poder calcular el valor de MX correspondiente a este tiempo del cultivo usted debe pesar
en la balanza analítica el Erlenmeyer con el cultivo (previamente usted debió haber registrado
el valor del peso de este recipiente vacío junto con el tapón).

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𝑀𝑋 = 𝑀𝑇𝑅 ∗ 𝐶𝑋, donde 𝑀𝑇𝑅 : Masa total del cultivo en el tiempo (t) (mg) y 𝐶𝑋: concentración de
biomasa (mg de biomasa/mg de mosto.
 Nota: Si el valor de la absorbancia es mayor a 1.0 realice dilución de la muestra con el
mismo caldo estéril. Tenga en cuenta el factor de dilución aplicada y multiplíquelo por
la absorbancia leída ante de realizar el cálculo final en la ecuación.

Deberá haber por cada unidad experimental un control que será pesado en cada
muestreo para poder estimar la tasa de evaporación del medio.

6.3 Cuantificación del consumo de la fuente de carbono (nutriente limitante)

 Del respectivo tubo Eppendorf donde guardó el sobrenadante de la muestra centrifugada tome
el volumen sugerido en la siguiente tabla para continuar con el protocolo de la técnica de
DNS.

Tabla 1. Protocolo de la técnica DNS

Tubo 1 Tubo 2

(Blanco) (Muestra)

Muestra a evaluar (mL) - 0.25

Agua Tipo II (ml) 0.25 -

Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25

Caliente a ebullición los tubos de 13 x 100 mm sin el papel de aluminio por cinco minutos y
posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos

Agua tipo II (ml) 2.5 2.5

Proteja los tubos de la luz y realice las determinaciones de absorbancia a longitud de onda (λ) 540nm,
ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba

Nota: Cuidado con los blancos. En el caso de los experimentos que usan extracto de levadura,
reflexione como sería estos?

 Reemplace en curva de calibración del azúcar empleado (glucosa o galactosa según el caso)
y calcule la concentración de azúcar reductor (mg/ml). Este valor corresponderá a la
concentración de sustrato (CS). De manera similar al ítem anterior usted podrá expresar este
valor como mg de azúcar reductor/mg de mosto de cultivo. Por ende, usted podrá calcular el
respectivo valor de MS.

𝑀𝑆 = 𝑀𝑇𝑅 ∗ 𝐶𝑆

Nota: Si el valor de la absorbancia es mayor a 1.2 realice dilución de la muestra con agua destilada.
Tenga en cuenta la dilución realizada para el cálculo final.

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Si de acuerdo a su diseño experimental, la concentración de azucares reductores inicial es mayor

de 2 g/L usted deberá hacer una apropiada dilución para que entre en el rango de la curva

6.5. Estimación de la velocidad de consumo del nutriente limitante y de formación de biomasa.

Para es esta parte de la práctica usted tendrá que repetir lo indicado en el ítem 6.2 a tres
tiempos adicionales de cultivo (2, 4, 8, 10, 22, 24 horas). Para estos puntos es necesario
tener en cuenta y controlar la evaporación del líquido en el Erlenmeyer.

6.6 Cuantificación de Biomasa final por espectrofotometría

 Una vez transcurrido el tiempo de incubación (28 horas) tomar una muestra de 1mL de igual
manera como se indicó en 6,2 y estime el valor de CX. que corresponderá a la concentración
de biomasa final (CXf). Recuerde igual estimar el valor Mx y pesar el Erlenmeyer para saber
la masa total de mosto a este tiempo.

En este punto del cultivo con seguridad va a requerir hacer dilución de la suspensión de levaduras
luego del centrifugado de la muestra.

6.7. Cuantificación de sustrato final

De forma similar al ítem 6.3 tome los sobrenadantes del tiempo final y determine Cs.

6.8. Cuantificación de Biomasa final por filtración

 Luego de estimar la masa total de mosto, esta debe ser filtrada con sistema al vacío usando
membrana de 0,45 μm, la cual debe ser previamente pesada en balanza analítica.
 Llevar a secar hasta peso constante en horno a 80°C por 24 horas.
 Luego de atemperar el filtro con la muestra pesar para estimar la diferencia de peso. El
valor obtenido lo debe dividir por el peso de mosto total que usted estimó.

Ecuaciones para DNS; y=Absorbancia, X [g/L]: Galactosa : Y=0.460X-0.019 r2 = 0.992

Glucosa: Y=0.477X-0.043 r2 = 0.996

13. Bibliografía

 Pedroza, A; Matiz, A; Quevedo, B; Aguirre, A. Manual de Introducción a la Biotecnología.

Octubre 30 2007 ISBN 978-958-716-028- 4. Editorial Pontificia Universidad Javeriana.
116p
 Universidad Nacional de Colombia. Práctica fermentación. Facultad de Ingeniería.
Departamento de Ingeniería Química. Bogotá, 200.
 Vijayendran Raghevendran, Jens Nielsen, and Lisbeth Olsson‡. (2005) Teaching Microbial
Physiology Using Glucose Repression Phenomenon in Baker’s Yeast as an Example.
Biochemistry and Molecular Biology Education. Vol. 33, No. 6, pp. 404–410.

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carbono y de nitrógeno sobre el crecimiento de S. cerevisiae.

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

ALUMNO: _________________________________________ CÓDIGO: ___________________

DATOS DEL LABORATORIO

1. TABLAS DE RESULTADOS

1.1 Diseño experimental para la evaluación de medios:

Variables
Experimento Fuente de C Fuente de N
1

1.2 Cálculos para la preparación de medios de cultivo:

Medio de Fuente de C Fuente de N (g) Volumen de Volumen de

cultivo (g) agua (mL) solución de
vitaminas
1

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1.3 Esquema de Inoculación de S. cerevisiae:

Ecuación curva patrón DNS: ________________________________

1.5.3 Determinación de longitud de onda por medio de espectro de absorción (Biomasa).

Longitud de Onda Abs

350

405

500

540

620

Longitud de onda escogida: ______________

Ecuación de peso seco Saccharomyces cerevisiae: ___________________________

1.6 Cuantificación del crecimiento microbiano y consumo de sustrato:

EXP FUENTES BIOMASA SUSTRATO (DNS)

EVALUADAS INICIAL INICIAL
C N Abs Dln Xo (g/L) Abs Dln So
(g/L)
1

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EXP FUENTES BIOMASA SUSTRATO (DNS)

EVALUADAS FINAL FINAL
C N Abs Dln Xo (g/L) Abs Dln So
(g/L)
1

Volumen filtrado___________________ mL

Peso biomasa filtrada: _______________ g

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7. PREGUNTAS

2.1 Calcule las respectivas velocidades totales (de consumo y de formación) y velocidades especificas
en biomasa (qS, μ) para cada uno de los ensayos. Compare los valores y haga un análisis del porqué
de las diferencias. Explique en términos del metabolismo de estos compuestos por parte de la
levadura.

2.2 Verificar el valor final de biomasa (mg) seca obtenida (tanto por la medición de OD como por
filtración) y compárelo con lo estimado teóricamente. A que se puede deber las diferencias? Explique.

2.3 Asumiendo un tiempo tm de 4 horas (tiempo de preparación de los ensayos), calcule y grafique la
productividad mg biomasa/g mosto*h, incluya la desviación estándar y compare los resultados
obtenidos.

2.4 Cómo puede usted estar seguro de que el medio de cultivo estuvo limitado por las respectivas
fuentes de carbono? Explique

2.5 Cómo puede usted verificar que las otras condiciones ambientales se mantuvieron constantes?

2.6 Estime los nuevos valores de Yx/s para las fuentes de carbono de acuerdo al método enseñado en
clases. Compare con los estimados. Explique las diferencias.

2.7 Escriba balanceadamente las ecuaciones estequiometricas para cada tratamiento de acuerdo a lo
aprendido en termodinámica II. Tome como fórmula elemental del extracto de levaduras la siguiente:
𝐶𝐻1.58 𝑂0.31 𝑁0.27 𝑆0.004

ANALISIS DE RESULTADOS

Usted deberá presentar el detalle de los cálculos. Recuerde que la práctica es colaborativa por lo cual
debe trabajar adecuadamente para el suministro de valores correctos para todos.

Haga un análisis de los resultados, empleé las herramientas estadísticas y de diseño experimental que
conoce y ha manejado en el curso de modelos predictivos.

4. CONCLUSIONES

Emita un par de conclusiones del experimento con base en lo que ha aprendido en el curso de
tecnología de fermentación y la literatura sobre fisiología de levaduras

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ANEXOS
1. Preparación del reactivo ácido 3,5 di-nitrosalicílico (DNS)
Deposite 50 ml de agua destilada en un vaso de precipitado de 250 mL, adicione la totalidad
del hidróxido de sodio y disuelva con agitación en plancha magnética a temperatura ambiente.
Posteriormente adicione lentamente el tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por
completo. Para proteger el reactivo de la luz, envuelva el vaso de precipitado con papel
aluminio y agregue lentamente el DNS. Enrase con agua destilada hasta 100 ml en un balón
volumétrico aforado de 100 ml. Deje en agitación toda la noche en un frasco oscuro. (No
refrigerar-puede durar por aproximadamente 2 meses)

2. Preparación de la solución patrón de glucosa 2 g/L

Pese 2 g de glucosa anhidra en balanza analítica y disuelva en 500 ml de agua destilada
utilizando un balón volumétrico aforado de 1000 ml, homogenice y complete hasta 1000 ml
con agua destilada. La solución patrón se debe alicuotar y congelar a -15 ºC. Rotule el frasco
con el nombre y concentración de la solución, así como la fecha de preparación.

3. Elaboración de curva patrón de DNS (se realizará una para todos los grupos)
Prepare 6 soluciones con un volumen final de 2 ml con las siguientes concentraciones (0.5,
0.7, 1.0, 1.5, 1.7 y 2.0 g/L. Utilice como diluyente agua destilada.
4. A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas deposite 0.25 ml de cada
una en tubos de 13x100 mm y siga el protocolo descrito en la tabla N°1.

Tabla 1. Metodología para elaborar curva de calibración de glucosa

Reactivo Blanco Concentración g/l

0.50 0.70 1.00 1.50 1.70 2.00

Glucosa - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

(ml)

Agua 0.25 - - - - - -

(ml)

Reactivo 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

DNS

(ml)

Caliente a ebullición los tubos de 13 x 100 mm sin el papel de aluminio por cinco minutos y posteriormente
detenga la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos

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