Departamento de Ingeniería Bioquímica

Biocatálisis
Unidad 3: Inhibición enzimática
Unidad 4. Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Carlos Alvarez-Vasco, Ph.D.

Universidad Icesi, Cali-CO. Septiembre 24, 2018
Importancia Ejemplos Terminos Propiedades

Guía del día.

 Unidad 3: Inhibición enzimática.
• Modelo Generalizado
• Verificación de los objetivos

 Unidad 4. Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

• Objetivos Unidad 4
• Generalidades

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 Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Modelo cinético generalizado

S: sustrato, inhibidor acompetitivo
P1: producto, inhibidor competitivo
P2: producto, inhibidor no competitivo

𝐾 𝐾

𝐾 𝐾 𝐾

Es posible generar las ecuaciones para cualquier modelo cinético de reacción donde la
etapa catalítica es irreversible que involucre un solo sustrato, y/o inhibición
3 por
Departamento de Ingeniería Bioquímicaproducto.
 Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Modelo cinético generalizado

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Pregunta: Verifique de
Departamento la expresión para cada modelo (Kahoot)
Ingeniería Bioquímica K=Km k=Kcat
Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado. Inhibición
competitiva por producto.

Actividad

Para el caso de la enzima β-galactosidasa, que cataliza la hidrolisis de lactosa en

glucosa y galactosa, esta es inhibida competitivamente por la galactosa.

Empleando el modelo generalizado determine el modelo de inhibición por

producto.

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Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado. Inhibición
competitiva por producto.

Para el caso de la enzima β-galactosidasa, que cataliza la hidrolisis de lactosa en

glucosa y galactosa, esta es inhibida competitivamente por la galactosa. Del
modelo generalizado solo los términos K, K1, k tienen valores finitos. Entonces:

Tanto VAP como KAP son funciones de la concentración del inhibidor.

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Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado. Inhibición
competitiva por producto.

Actividad

En el caso de la penicilina acilasa, que cataliza la hidrolisis de la penicilina G en

acido 6-aminopenicilanico y acido fenilacético, la enzima es inhibida no
competitivamente por parte del 6-aminopenicilanico e inhibida competitivamente
por el ácido fenilacético.

Empleando el modelo generalizado determine el modelo de inhibición por

producto.

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Departamento de Ingeniería Bioquímica
 Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado. Inhibición
competitiva por producto.
En el caso de la penicilina acilasa, que cataliza la hidrolisis de la penicilina G en acido
6-aminopenicilanico y acido fenilacético, la enzima es inhibida no competitivamente
por parte del 6-aminopenicilanico e inhibida competitivamente por el ácido
fenilacético. Del modelo generalizado, sólo K, K1, K2, K’’2, KIV y k tienen valores
finitos.

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Departamento de Ingeniería Bioquímica
Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado.
Inhibición acompetitiva por sustrato

Actividad

Para el caso de la enzima β-fructofuranosidasa (invertasa), que cataliza la

hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa, esta es inhibida acompetitivamente
por altas concentraciones de sacarosa.

Empleando el modelo generalizado determine el modelo de inhibición por

sustrato.

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Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Modelo cinético generalizado.
Inhibición acompetitiva por sustrato

Para el caso de la enzima β-fructofuranosidasa (invertasa), que cataliza la

hidrolisis de sacarosa en glucosa y fructosa, esta es inhibida acompetitivamente
por altas concentraciones de sacarosa. Del modelo generalizado solo los
términos K, K´´ y k tienen valores finitos. Entonces:

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 Generalidades Inhibición Rev Mod Generalizado Inhibición Irrev

Unidad 3: Inhibición enzimática.

Verificación de los objetivos (4 clases)

• Comprender y distinguir los diferentes tipos de inhibición enzimática.

• Expresar ecuaciones cinéticas de inhibición enzimática de acuerdo al tipo de

inhibición que las afecta.

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 Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización
de enzimas.

Objetivos (4 clases)

 Identificar métodos de extracción físicos o químicos adecuados para obtener

enzimas específicas.

 Conocer diferentes estrategias de purificación empleadas para enzimas de

acuerdo a la matriz de contaminantes.

 Calcular los rendimientos y eficiencias de los diferentes métodos.

 Describir los beneficios y limitaciones de las diferentes estrategias de

inmovilización enzimática.
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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Métodos físicos y químicos para la extracción de enzimas

• Es el primer paso en el análisis de las enzimas (y proteínas en general).

• Permite recuperar la enzima de interés de un tejido o célula particular.
• Para estabilizar la enzima: Evitar ataques proteolíticos o modificaciones
químicas causadas por compuestos en la matriz.

Debido a que las enzimas son muy heterogéneas, no hay un método

particular que se pueda aplicar para una optima extracción de enzimas.

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Producción de enzimas

• Altos rendimientos (cantidad de proteína por gramo de tejido o células)

• Alta pureza (disminuir contaminantes)

Enzimas industriales
• 55% provienen de hongos y levaduras.
• 33% provienen de bacterias.
• 8% provienen de tejido animal.
• 4% provienen de tejido de plantas.

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 Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Producción de enzimas

1. Mas baratos de producir.

2. Los rendimientos son mas predecibles y fáciles de controlar.
3. Los materiales de partida tienen una composición mas constante (matriz).
4. Los tejidos de plantas y animales contienen mas materiales potencialmente
tóxicos que los microorganismos: Fenoles, inhibidores enzimáticos y
proteasas.
La gran mayoría de las enzimas microbianas provienen de un numero limitado de
generos:

Aspergillus, Bacillus y Kluyveromyces (Saccharomyces)

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Algunas enzimas de importancia industrial y sus fuentes

Intra/extr Scale of
EC
Enzyme a Source a production Industrial use
number b c d
-cellular

Animal enzymes

Catalase 1.11.1.6 Liver I - Food

Chymotrypsin 3.4.21.1 Pancreas E - Leather

Lipase e 3.1.1.3 Pancreas E - Food

Rennet f 3.4.23.4 Abomasum E + Cheese

Trypsin 3.4.21.4 Pancreas E - Leather

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Departamento de year
d +++ > 100 ton Ingeniería
-1; ++ >Bioquímica
10 ton year-1; + > 1 ton year-1; - < 1 ton year-1.
Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Algunas enzimas de importancia industrial y sus fuentes

EC Intra/extra Scale of
Enzyme a Source Industrial use
number b -cellular c production d

Plant enzymes

Actinidin 3.4.22.14 Kiwi fruit E - Food

a-Amylase 3.2.1.1 Malted barley E +++ Brewing

b-Amylase 3.2.1.2 Malted barley E +++ Brewing

Bromelain 3.4.22.4 Pineapple latex E - Brewing

b-Glucanase a 3.2.1.6 Malted barley E ++ Brewing

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Departamento de year
d +++ > 100 ton Ingeniería
-1; ++ >Bioquímica
10 ton year-1; + > 1 ton year-1; - < 1 ton year-1.
Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Algunas enzimas de importancia industrial y sus fuentes

Intra/extr Scale of
EC
Enzyme a Source a production Industrial use
number b d
-cellular c

Bacterial enzymes

a-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch

b-Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + Starch

Asparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli I - Health

Fructose
Glucose isomerase h 5.3.1.5 Bacillus I ++
syrup
Pharmaceutic
Penicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - 18
al
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d +++ > 100 ton year-1; ++ > 10 ton year-1; + > 1 ton year-1; - < 1 ton year-1.
Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Algunas enzimas de importancia industrial y sus fuentes

Intra/extr Scale of
EC
Enzyme a Source a productio Industrial use
number b
-cellular c nd

Fungal enzymes
a-Amylase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Baking

3.5.1.1 Pharmaceu
Aminoacylase Aspergillus I -
4 tical
Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ Starch
Catalase 1.11.1.6 Aspergillus I - Food

Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Waste 19

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d +++ > 100 ton year-1; ++ > 10 ton year-1; + > 1 ton year-1; - < 1 ton year-1.
Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Algunas enzimas de importancia industrial y sus fuentes

Intra/extr Scale of
EC
Enzyme a Source a productio Industrial use
number b
-cellular c nd

Yeast enzymes
Saccharomyc Confectioner
Invertasep 3.2.1.26 I/E -
es y
Kluyveromyce
Lactasel 3.2.1.23 I/E - Dairy
s
Lipase e 3.1.1.3 Candida E - Food
Saccharomyc
Raffinaseo 3.2.1.22 I - Food
es
20
d
+++ > 100 year-1; year-1; year-1; year-1.
Departamento deton ++Bioquímica
Ingeniería > 10 ton + > 1 ton - < 1 ton
Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Extracción de enzimas
Los métodos de extracción varían dependiendo de la fuente (material de partida),
la localización dentro de la célula y la potencial aplicación (fija el grado de pureza
requerido).

Durante los procesos de extracción y purificación, las enzimas pueden ser

sometidas a condiciones físicas o químicas que modifiquen sus estructuras y
potencialmente cambien su actividad.
1. Las enzimas podrían ser degradadas por proteasas o inactivadas por
fosfatasa.
2. Las regiones hidrofóbicas podrían quedar expuestas, y generar la
agregación con otras proteínas lo cual conlleva a la formación de
precipitados irreversibles.
Es necesario agregar aditivos durante el proceso de extracción.
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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Extracción de enzimas

1. Ataque proteolítico: Debido a la presencia de contaminación con proteasas del

mismo extracto de donde la enzima fue extraída.
2. Defosforilación e inactivación de las enzimas: Las fosfatasas juegan un papel
muy importante en la regulación de células eucariotas.
3. Procesos oxidativos: Pueden modificar e inactivar las enzimas.
4. Presencia de iones: Pueden ser necesarios o perjudiciales.
5. Estabilización de la proteína: Las muestras diluidas tienden a desnaturalizarse.

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Extracción de enzimas

La fosforilación es la modificación post-translational mas común, con

aproximadamente 80% ocurriendo en la serina, 20% en la threonina y 0,1-1% en la
tyrosina.

La ruptura celular destruye el ambiente celular finamente controlado,

permitiendo que las proteasa y fosfatasas trabajen de forma no regulada.

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Extracción de enzimas

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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Unidad 4: Extracción, purificación e Inmovilización de enzimas.

Extracción de enzimas

El método de extracción depende

en gran medida de la fuente.

Tejido animal
Membrana celular: Detergentes
Tejido vegetal
Pared celular: Romper la pared.

Microorganismos
Membrana celular y/o pared celular.
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Introducción Métodos físicos Métodos químicos Ejemplos

Extracción de enzimas

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