DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LA TÉCNICA DE MILLER

(DNS)

Resumen

En la presente práctica se llevará a cabo la determinación de azúcares reductores. La

cantidad de azúcares reductores se determinará colorimétricamente aplicando el método

del ácido dinitrosalicílico (DNS) a una gama de soluciones patrón de glucosa, a objeto de

obtener la correspondiente curva de calibrado.

Palabras clave: carbohidratos, azucares reductores, método colorimétrico.

Abreviaturas empleadas: DNS, ácido dinitrosalicílico.

1. Introducción y objetivo

Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrogeno y oxigeno. Todos los

carbohidratos son azucares pequeños, solubles en agua (glucosa y fructosa, por ejemplo)

o bien cadenas, como el almidón y la celulosa, que se elaboran enlazando subunidades

de azúcar.

En la naturaleza, los carbohidratos se presentan como monosacáridos (azucares

simples), oligosacáridos (contienen de dos a diez unidades monosacáridas) y

polisacáridos (glúcidos poliméricos mas grandes). Los monosacáridos se clasifican en

aldosas si tienen grupo aldehído y cetosas si tienen un grupo cetona. Todos los

monosacáridos, aldosas o cetosas y la mayoría de los disacáridos son azucares

reductores (excepto la sacarosa) porque uno de sus dos carbonos anoméricos no está

formando enlace glucosídico.

Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los

azucares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo

para reconocer azucares que pueden existir como aldehído o cetona libre. Los azucares

que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma

inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores.

El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico
para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la
determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Esta
técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.

Objetivo:
Construcción de una curva patrón para calcular el coeficiente de correlación
mediante el método DNS.
2. Material

3.1. Material
*
* Tubo de ensaye con rosca (25)
* Gradilla para tubos (1)
* Probeta de 100mL (1)
* Vasos de pp de 100mL (2)
* Pipetas de 1mL (2)
* Pipetas de 2mL (2)
* Pipetas de 5mL (2)
* Pipetas de 10mL (2)
* Matraz aforado de 100mL (1)
* Matraz aforado de 250mL (1)
* Baño María (1)
* Piseta con agua destilada (1)
* Agitador magnético (1)
* Termómetro (1)
* Frasco ámbar (1)
* Celdas para espectrofotómetro (2)
* Papel seda
3.2.
3.3. Equipo
*
* Vórtex
* Parrilla de agitación y calentamiento
* Espectrofotómetro
3.4.
3.5. Reactivos
*
* Acido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
* Hidróxido de sodio anhidro (NaOH)
* Fenol (C6H6O)
* Sulfito de sodio anhidro (Na2SO4)
* Glucosa (C6H12O6)

3. Método

4.6. Reactivo DNS

Disolver 2.5g de DNS, 2.5g de NaOH, 0.125g de Na2SO4 y 0.5g de C6H6O en
200mL de agua destilada. Aforar a 250mL con agua destilada. Colocar la solución en el

frasco ámbar y etiquetarla.

4.7. Solución patrón de glucosa (1.0g/L)

Disolver 0.1g de glucosa en 90mL de agua destilada, agitar hasta disolver y aforar a

100mL.

4.8. Curva patrón

A partir de una solución de glucosa y por dilución con agua destilada, preparar una gama
de soluciones de glucosa de distinta concentración (por duplicado), como se indica en el

anexo (An1; Tabla 1).

A cada uno de los tubos, adicionar 1mL del reactivo DNS y agitar con el Vórtex. Poner en

baño María en ebullición durante 5 minutos, enfriar, agregar 8mL de agua destilada y

determinar la absorbancia a 575nm, utilizando como blanco el tubo 1.

4. Resultados

En el anexo (An2) se reportan los valores de las absorbancias obtenidas (tabla 2); la

media de cada duplicado, la desviación estándar y él % de error (tabla 3).

La Grafica 1 muestra la curva patrón obtenida a partir de los datos experimentales (los

valores representados son el promedio de las absorbancias por duplicado); ajustándola a

la recta se obtuvo la ecuación:

y= 0.0442x – 0.0508

donde la pendiente (m) es 0.0442 y la ordenada al origen (b) es 0.0508.

R = 0.9921

5. Discusión

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración del material que absorbe

la luz

6. Cuestionario

1. Explique el fundamento de la técnica de DNS.

Se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor
al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo), cuya presencia puede detectarse por

lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570nm.

2. ¿Para que se utiliza el NaOH, el fenol y el sulfito de sodio en la técnica de DNS?

Los carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas.

Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con

una deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen

varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos

para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos

fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más

común es con fenol. Este método es fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como

oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo

hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma en que procede la reacción no es

estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo tanto se realiza una curva

patrón.

3. ¿Porque es importante esta técnica en microbiología?

Sirve en la aplicaciones industriales las cuales hay varios microorganismos que

desarrollan varias rutas, lo que hace la técnica DNS en corresponder a la gama de

azucares reaccionando en su metabolismo donde degradan azúcar para convertirlo en

ATP, ya que varios microorganismo sirven para la producción de vinagre, vinos ,

mantequilla , yogurt y pan enfatizando ayuda a precisar una reacción enzimática.

4. ¿Que interferencias puede tener este método?

Una de las cuales pueda ser que el blanco, se encuentre contaminado, o en su defecto

que la a cantidad de solubilidad de agua con el gradiente de glucosa se en mayor

proporción que la del soluto, haciendo que los valores de la observancia se alteren.

5. De algunos ejemplos de azucares reductores y explique porque la sacarosa no es un

azúcar reductor.

La sacarosa no es un azúcar reductor porque tiene los dos carbonos anoméricos

formando parte del enlace que une los dos monosacáridos.

6. ¿Que es la glucosilación avanzada?

Los azúcares reductores provocan la alteración de las proteínas mediante la reacción de

glucosilación no enzimática también denominada reacción de Maillard o glicación.

Desde el punto de vista químico, la glucosilación se define como la reacción de grupos -

amino primarios de aminoácidos, péptidos y proteínas con el grupo carbonilo de los

azúcares reductores. A lo largo de esta reacción se pueden distinguir tres etapas:

inicialmente se produce la asociación del azúcar con la proteína, formando un compuesto

denominado base de Schiff.

7. Explique con un esquema de reacción como se forman los compuestos bicarbonílicos.

Esta reacción se basa con la base de Schiff que da como subsecuente producto de

Amadori.

Anexo

An1.
Tabla 1. Gama de soluciones de glucosa de diferente concentración. |

Tubo | Volumen de laSolución Patrón (mL) | Volumen de Agua(mL) | Concentración(mg/L)

1 | 0.0 | 1.0 | 0.0 |

2 | 0.1 | 0.9 | 100 |

3 | 0.2 | 0.8 | 200 |

4 | 0.3 | 0.7 | 300 |

5 | 0.4 | 0.6 | 400 |

6 | 0.5 | 0.5 | 500 |

7 | 0.6 | 0.4 | 600 |

8 | 0.7 | 0.3 | 700 |

9 | 0.8 | 0.2 | 800 |
10 | 0.9 | 0.1 | 900 |
11 | 1.0 | 0.0 | 1000 |

An2.

Tabla 2. Absorbancia reportada (575nm) |

Tubo | Absorbancia | Tubo | Absorbancia |
1 | Blanco | 12 | - |
2 | 0.041 | 13 | 0.056 |
3 | 0.043 | 14 | 0.084 |
4 | 0.115 | 15 | 0.149 |
5 | 0.169 | 16 | 0.179 |
6 | 0.211 | 17 | 0.206 |
7 | 0.254 | 18 | 0.242 |
8 | 0.320 | 19 | 0.293 |
9 | 0.324 | 20 | 0.368 |
10 | 0.393 | 21 | 0.393 |
11 | 0.423 | 22 | 0.497 |

Tabla 3. Media de absorbancias por duplicado, desviación estándar y % de error |

Media | DesviaciónEstándar | % deerror |
0|||
0.04 | | |
0.06 | | |
0.13 | | |
0.17 | | |
0.20 | | |
0.24 | | |
0.30 | | |
0.34 | | |
0.39 | | |
0.46 | | |

Concentración(mg/L) | PromedioAbsorbancia575nm |
0.0 | 0 |
100 | 0.04 |
200 | 0.06 |
300 | 0.13 |
400 | 0.17 |
500 | 0.20 |
600 | 0.24 |
700 | 0.30 |
800 | 0.34 |
900 | 0.39 |
1000 | 0.46 |

Grafica 1. Curva patrón para la determinación de azucares reductores (DNS)

Conclusión
Debido a nuestros resultados nos damos cuenta que

Referencias bibliográficas
(Chaplin, 1986),
Kowluru, R.A., Heidorn, D.B., Edmondson, S.P., Bitensky, M.W., Kowluru, A., Downer,
N.W., Whaley, T.W., Trewhella, J. Glycation of calmodulin: chemistry and structural and
functional consequences. Biochemistry 28,2220-2228,1989
The Glycation Homepage (www.geocities.com/CapeCanaveral/8824/)
78 ways sugar can ruin your health (www.rheumatic.org/sugar.htm)
Maillard Reaction (chemistry.miningco.com/library/weekly/aa122898.htm)