AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

RESUMEN
Se tomó como base el método 1601 de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de
América y un método de obtención de enterovirus a partir de aguas residuales (criadero de pollo).
Durante el desarrollo del procedimiento se realizaron múltiples pruebas y utilizando como medio de
cultivo BHI los aislamientos de bacteriófagos obtenidos a partir de aguas residuales.
Palabras claves: aislamiento, bacteriófagos, salmonella, aguas residuales.
OBJETIVOS
 establecer una técnica para el aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas residuales
específicos para Salmonella

INTRODUCCION
Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente por los microbiólogos
Frederick W. Twort en 1915 y Félix d’Hérelle en 1917. Siendo esta la última clase principal de virus
en ser descubierta; este tipo de virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la
naturaleza. En esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y en el lugar
en que se encuentre su célula huésped. Los bacteriófagos son virus que infectan y se multiplican en
la bacteria, llevando a la destrucción la célula hospedera con la liberación de bacteriófagos que re-
infectan otras bacterias. Los bacteriófagos fueron descubiertos en las primeras décadas del siglo XX,
pero su uso clínico no se extendió en países occidentales sino hasta la década del 80, debido a
diferentes razones. A pesar de que se realizaron múltiples esfuerzos para generalizar su uso como
agentes terapéuticos en las décadas de 1920 y 1930 fueron cayendo en el olvido por la ciencia de la
época debido al descubrimiento de los antibióticos.
Los bacteriófagos se componen de un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN) encapsulado por una
cubierta proteica que exhibe los elementos estructurales necesarios para una infección específica.
Algunos presentan una envoltura lipídica que se deriva de la célula hospedera. Los bacteriófagos,
entre otras utilidades dentro de las ya conocidas, sirven como herramienta para la modificación
genómica bacteriana y para la construcción de vacunas a nivel terapéutico. Además, en terapias
alternativas, para el tratamiento de infecciones producidas por bacterias; dicha utilidad es sustentada
por investigadores y científicos a través de estudios rigurosos, donde se han aislado bacteriófagos y
posterior a esto se han caracterizado de forma específica, siendo utilizados respectivamente de
acuerdo con el interés investigativo. [Gaviria A, Gabriel; González de S, María; Castaño O, Técnica
para aislamiento de bacteriófagos específicos para E.coli DH5a a partir de aguas residuales Revista
MVZ Córdoba, vol. 17, núm. 1, enero-abril, 2012]
MARCO TEORICO

Aislamiento En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran

diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la
separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.

Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la
inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos. Al
depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta quedará
inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes del medio. Las nuevas
células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras sucesivas generaciones conformarán lo
que denominamos una "colonia" que no es más que un montón de células derivadas de una sola célula
madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible
al ojo humano y presenta diferentes características según el microorganismo que la genera.

Salmonella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae constituido

por bacilos gramnegativos intracelulares anaerobios facultativos con flagelos peritricos. Constituye
un grupo importante de patógenospara animales y humanos. Está compuesto por dos especies: S.
enterica y S. bongori de las cuales la S. enterica representa la especie de mayor patogenicidad.
Aguas residuales se centra en los contaminantes microbianos que se encuentran en las aguas
residuales, los métodos de detección de estos contaminantes, y métodos de limpieza de agua
de la contaminación microbiana.
Medio solido (BHl)
Fundamento
La infusión de cerebro y corazón ha resultado ser efectiva en el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos, incluidos muchos tipos de patógenos. Se ha utilizado como medio base para las
nuevas fórmulas de medios de cultivo cuando se suplementa con sangre o agentes selectivos. Brain
Heart Infusion (BHI) Agar sin suplemento se recomienda actualmente como medio universal para
bacteriología aerobia y para la recuperación primaria de hongos y Actinomycetales a partir de
muestras clínicas y no clínicas, BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar obtiene los nutrientes de la
infusión de cerebro y corazón, la peptona y la glucosa. Las peptonas y la infusión son fuentes de
nitrógeno orgánico, carbono, azufre, vitaminas y sustancias de traza. La glucosa es la fuente de
carbohidratos que los microorganismos utilizan mediante fermentación. Se utiliza fosfato disódico
como tampón en el medio.

MATERIALES Y MÉTODOS
 Filtro
 Caja de Petri
 Tubos tipo falcon
 Salmonella
 Solución buffer
 Micro pipeta
 Incubadora
  Tubos de ensayo
 Beaker
 Centrifugadora

Para alcanzar los objetivos propuestos se desarrollaron la siguiente metodología, se utilizaron 1 ml

de la muestra de agua residual y como microorganismo Salmonella para la obtención de
bacteriófagos. Se realizaron distintas pruebas, siguiendo lo sugerido por varios autores. Esto se realizó
para brindar una mayor confiabilidad de los resultados en cuanto a la estandarización de la técnica
para el aislamiento de bacteriófagos a partir de aguas residuales.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Día 1: se llevó a cabo el aislamiento, en nuestro caso trabajamos con residuales de criadero pollo,
primero tomamos una solución buffer de 10 ml, a esta solución se le agrego 1 ml de la muestra y 1
ml de nuestro microorganismo a sembrar, luego de esto se llevó a agitación constante y se procedió
a incubar durante 48 horas. Pudimos observar que no hubo ninguna clase de contaminación
Día 2: se tomó la muestra preparada en el día 1 y llevamos a centrifugar por 30 minutos y procedimos
a filtrar con una jeringa. Tomamos 0.1 de la muestra filtrada y 0.1 del microorganismo (Salmonella),
y lo adicionamos en un medio de cultivo semisólido (BHI) y lo adicionamos a las cajas de Petri para
llevar a incubación durante 24 horas.
Día 3: las muestras que se obtuvieron positivas, sin contaminación la llevamos propagación, tomamos
10 ml de la solución buffer y se lo adicionamos a la caja de Petri que resulto positiva.
Día 4: se tomó toda la muestra que se encontraban en las cajas de Petri y en lo adicionamos en un
tuba para llevar a centrifugar por 30 minutos, filtramos y tomamos 0.1 del microorganismo y 0.1 de
la muestra filtrada en se adiciono en el medio de cultivo BHI.
Día 5: se repitió el mismo procedimiento del día 3.

Fig. 1

Como se observa en la figura 1 adicionamos 5 ml de la solución buffer en la caja de Petri, donde el

día anterior se había sembrado 0.1 de la muestra filtrada de aguas residuales de criadero de pollo y
0.1 del microorganismo. Se llevó a incubadora por 24 horas.
Día 6: procedimos a recoger la solución preparada en el día anterior y lo adicionamos en tubos de
falcon como se observa en la figura 2.

Fig. 2

Luego se llevó a centrifugar por 30 minutos y filtramos, se tomó 0.1 de la muestra filtrada y 0.1 del
microorganismo (Salmonella) y lo adicionamos en el medio de cultivo BHI semisólido y se agregó a
una caja de Petri como se observa en la figura 3 y se incubo por 24 horas.

Fig. 3

Día 7: se tomaron las muestras positivas, es decir donde hubo crecimiento de fagos, como se observa
en la figura 4, los fagos se muestran como pequeñas burbujas trasparentes de forma circular.

Fig. 4
Se tomó un tubo de ensayo que contenía 6 ml del caldo liquido BHI y le adicionamos 0.1 ml del
microorganismo Salmonella y tomamos los fagos que crecieron en la caja de Petri y lo agregamos en
el tubo que contenía el caldo liquido como se muestra en la figura 5 y se llevó a incubadora de
agitación por 24 horas.

Fig. 5

Día 8: se confirmó si hubo o no crecimiento de fagos. En nuestro caso no hubo ningún tipo de
crecimiento de fago como podemos ver en las figuras 6 y 7.

Fig. 6 Fig. 7

Debido a un mal procedimiento en el dia 7, los fagos no presentaron crecimiento en el caldo BHI,
esto se presentó a raíz de que al momento de tomar estos, es decir, (fagos), no se tuvo en cuenta, que
solo se debía agregar una sola lisis, en el caso contrario agregamos un gran número, lo cual, como
consecuencia, no facilitó el crecimiento en este caldo (BHI).

En las observaciones que se realizaron al tratamiento control se determinó que éste obedece a las
características propias de la muestra control, ya que, a medida que se encuentra el bacteriófago
purificado, se espera una mayor acción lítica a las bacterias que se tienen como anfitrión, en este caso
Salmonella. Tanto la cantidad de unidades formadoras de placa, como la pureza en que encuentren
los bacteriófagos, están directamente relacionadas con el tipo de bacteriófago que se utilice en la
prueba control.
CONCLUSIONES
 Se logró establecer una tecnica microbiológica para el aislamiento de bacteriófagos
específicos para microorganismo Salmonella y como muestra aguas residuales de criadero
de pollo.
 El aislamiento de microorganismos son procedimientos rutinarios en los laboratorios de
microbiología ya que muchas veces se deben analizar muestras obtenidas de distintos
ambientes y lugares para ver su posible potencial infeccioso, por lo que se aprovechan las
características metabólicas de los microorganismos para descartar o confirmar su
presencia en determinadas muestras. Es importante conocer las características que los
medios selectivos y diferenciales ofrecen ya que así será más sencilla la identificación.

REFERENCIAS:

 Ramirez, G., et.al., 2011 Manual de Prácticas de Microbiología General, Facultad de

Química, UNAM: México, pp. 129 – 139.
 Madigan, M., Martinko, J., Parker, J., Brock, 2010 Biología de los microorganismos.
10ª edición.
 Ávila, S., Estupiñan, S0., 2006 Calidad bacteriológica del agua del humedal de Jaboque,
Bogotá, Colombia. Caldasia.28 (1): 67-78.