Orígenes de la replicación del ADN en los tres dominios de la vida.

La replicación del ADN es esencial para la propagación de la vida. Es algo sorprendente

entonces, que a pesar de la naturaleza vital de este proceso, los organismos celulares
muestran una gran variedad en los mecanismos que emplean para asegurar la duplicación
apropiada del genoma. Esta diversidad se manifiesta a lo largo de líneas evolutivas
clásicas, con combinaciones distintas de arquitectura de replicón y proteínas de replicación
que se encuentran en los tres dominios de la vida: las Bacterias, la Eukarya y la
Archaea. Además, aunque existen paralelismos mecánicos, incluso dentro de un
determinado dominio de la vida, la forma en que se definen los orígenes de la replicación
muestra una notable variación.
El origen de los orígenes.

En un artículo ya clásico de 1963, Jacob, Brenner y Cuzin propusieron que, de una manera
análoga a la interacción de los reguladores de acción trans con operadores de actuación
cis en el control de la expresión génica, un factor iniciador actuaría en un replicador.
secuencia en el cromosoma para controlar y facilitar la replicación del ADN [1]. Sin
embargo, en contraste con los modelos entonces prevalentes para la regulación negativa
de la expresión génica, se propuso que el factor iniciador de la replicación actuaría
positivamente para la replicación pro-mota en el replicador, o como se llama ahora, el origen
de la replicación. En los siguientes 40 años, se ha aprendido mucho sobre la naturaleza de
los iniciadores y los orígenes de la replicación, particularmente en sistemas modelo
simples. Sin embargo, muchos de los detalles moleculares de la base de la selección de
origen siguen siendo poco conocidos, particularmente en eucariotas superiores.

Las bacterias

En las bacterias, el origen de la replicación se denomina oriC, y típicamente existe un único

origen por cromatografía bacteriana. mosome [2]. En Escherichia coli, oriC se encuentra
entre los genes gldA y mioC. La región oriC de 250 pb contiene múltiples secuencias
repetidas que contienen un elemento de consenso de nueve pares de bases denominado
cuadro DnaA [3]. Otras bacterias también poseen orígenes únicos de replicación con
múltiples cajas DnaA, aunque tanto el número preciso como la distribución de estas cajas
varían entre las especies [4]. Curiosamente, en muchas bacterias, el origen de la replicación
se encuentra adyacente al gen de DnaA, lo que sugiere un mecanismo para el control
coordinado de la actividad de origen y los niveles de proteínas iniciáticas [4]. Una caja DnaA
de consenso individual está unida por un monómero de la proteína DnaA y esta interacción
induce una curva pronunciada en el sitio de unión [5]. Sin embargo, en los orígenes
bacterianos naturales hay múltiples cuadros de DnaA y estos organizan eventos de unión
cooperativa complejos a cuadros de DnaA con diversos grados de conformidad con la
secuencia de consenso. Una ramificación particularmente interesante de esto es que una
caja DnaA con poca conservación al consenso puede no ser capaz de unir DnaA por sí
sola. Sin embargo, la unión a este sitio 'débil' puede facilitarse mediante la unión de DnaA
a un sitio adyacente de consenso de alta afinidad [4].

Los orígenes bacterianos de replicación también poseen un segundo elemento conservado,

una región altamente rica en AT. El desenrollamiento de este ADN intrínsecamente fundible
es un paso clave en el inicio de la replicación en los orígenes. En condiciones in vitro
altamente definidas, DnaA es capaz de mediar el desenrollamiento parcial de esta región
por sí solo (Fig. 1). Parece, por lo tanto, que la combinación de la flexión del ADN inducida
por DnaA y las interacciones cooperativas entre los monómeros DnaA en el ADN dan como
resultado una tensión topológica local que se manifiesta al desenrollar esta región del
dúplex intrínsecamente menos estable [6].

Otro nivel de complejidad surge del hecho de que DnaA es un miembro de

la familia AAA + de ATP-ases. Esta clase de proteína posee un dominio de unión a
nucleótidos que puede unirse a ATP y catalizar su hidrólisis. La conformación
del dominio AAA + se altera dependiendo del estado de fosforilación del nucleótido
unido. Además, las proteínas AAA + a menudo existen como multímeros y las subunidades
vecinas se comunican

Fig. 1. Dibujo del ensamblaje de la maquinaria de replicación de ADN en la región de E. coli oriC. Se muestra la unión de
DnaA (óvalos verdes) a las cajas DnaA (cajas azules). Esto conduce a la distorsión local del ADN y facilita la unión de DnaA
al ADN fundido en una región rica en AT (región púrpura). DnaB (azul), en un complejo con DnaC (melocotón) se recluta a la
región fundida, seguido de la disociación de DnaC como se detalla en el texto.

al extender los llamados dedos de arginina a la subunidad de unión a ATP de un vecino

[7]. Por lo tanto, existe la capacidad de transducir los efectos del ATP a la hidrólisis de ADP
en una subunidad a través de una red de proteínas de interacción. Se ha encontrado que
aunque ADP - DnaA y ATP - DnaA tienen afinidades similares para las cajas de DnaA en
sentido contrario [8], la forma unida a ATP es capaz de reconocer un elemento adicional de
seis pares de bases, lo que proporciona un consenso DNA 'fuerte' La caja está presente en
los alrededores. Además, las versiones monocatenarias de estas secuencias hexaméricas
de 'caja ATP-DnaA' también pueden ser reconocidas por ATP-DnaA. Seis de estas cajas
de ATP-DnaA se encuentran en la región rica en AT de E. coli oriC. Por lo tanto, una vez
que la tensión topológica inducida por la unión de DnaA ha fundido esta región, las cajas
de ATP-DnaA monocatenarias expuestas se pueden unir mediante ATP-DnaA que
estabiliza el ADN en la forma fundida [4, 8].

Es evidente, por lo tanto, que la combinación de múltiples sitios de reconocimiento de

ADN, la distorsión del ADN dúplex y las interacciones cooperativas entre las proteínas
iniciadoras unidas al ADN en los orígenes bacterianos conduce a una arquitectura compleja
de nucleoproteínas, cuya estocoquimetría precisa no está clara, ya que ambos medios La
fusión inicial y estabiliza el ADN monocatenario resultante. Por lo tanto, no es sorprendente
que las proteínas bacterianas de la cromatina arquitectónica, como la HU y la IHF,
desempeñen funciones importantes para facilitar el ensamblaje de este complejo [9].

Una vez que se forma el complejo de origen-DnaA fundido, se puede cargar la helicasa
replicativa DnaB. Aunque DnaA interactúa físicamente con DnaB [4], esta reacción requiere
la acción de otra proteína, DnaC [10–13]. Es interesante que DnaC, al igual que DnaA, es
un miembro de la familia de ATPasas AAA + , sin embargo, el papel de la ATP parece ser
más sutil que simplemente una fuente de energía para facilitar la carga de la helicasa DnaB
en forma de anillo. De hecho, la hidrólisis de ATP por DnaC no es necesaria para la carga
de DnaB, ya que esta reacción se puede realizar mediante ATP – DnaC, ADP– DnaC o
incluso formas libres de nucleótidos de DnaC [14]. Más bien, el papel de la ATP en la
reacción es servir como un interruptor que controla la actividad de la helicasa. La forma de
DnaC unida a ATP inhibe severamente la actividad de heli-caso de DnaB y también
aumenta la afinidad de DnaC por el ADN de cadena sencilla. En contraste, ADP: DnaC no
inhibe la helicasa DnaB y tiene una afinidad de unión al ADN inferior. Por lo tanto, se ha
propuesto que el ATP-DnaC interactúa con DnaB y facilita la carga de la helicasa en la
región de una sola hebra del origen fundido. Sin embargo, la alta afinidad de ATP - DnaC
por el ADN enlaza efectivamente DnaB al origen, evitando su translocación y, por lo tanto,
suprimiendo su actividad helicasa. Posteriormente, la hidrólisis de ATP to ADP by DnaC
lanza DnaB, lo que le permite actuar como la helicasa replicativa [14].

Orígenes eucariotas

La identificación de sitios de iniciación en organismos eucariotas ha sido una

tarea ardua. En contraste con los sitios únicos y claramente definidos de
replicación bacteriana, la síntesis de ADN eucariótico comienza a partir de
cientos o incluso miles de orígenes, que rara vez contienen motivos de secuencia
obvios, y con frecuencia son difíciles de caracterizar (revisados en [15–
19]). Esta complejidad se ve agravada por el hecho de que la activación del
origen eucariótico es asíncrona. Además, el uso del sitio de iniciación muestra
una flexibilidad considerable en diferentes condiciones de crecimiento o en
diferentes etapas de desarrollo. En años más recientes, se ha hecho cada vez
más evidente que los factores epigenéticos rigen la regulación de la actividad
de origen eucariótico (revisado en [15,16]). Estas modulaciones proporcionan
la elasticidad necesaria para la iniciación coordinada desde múltiples sitios.

Lecciones de levadura en ciernes

Si bien el inicio de la replicación eucariótica es inevitablemente más
complicado que el proceso bacteriano, se pueden dibujar algunos alelos entre
los dos sistemas. Estas similitudes son quizás más evidentes en la levadura en
ciernes Saccharomyces cerevisiae, donde se han identificado motivos de
secuencia conservada en los orígenes. Los sitios de inicio de levadura en
ciernes, o las secuencias de replicación autónoma (ARS), son regiones no
codificantes de ADN, de aproximadamente 100 a 200 pb de longitud. Estos
sitios abarcan la secuencia de consenso ARS breve, altamente conservada y
esencial (elemento ACS o A), y los motivos más divergentes conocidos como
elementos B [20, 21]. Es importante señalar, sin embargo, que S. cerevisiae y
sus parientes cercanos parecen ser los únicos organismos eucarióticos que
utilizan elementos de secuencia específicos dentro de sus
orígenes. Afortunadamente, estos elementos conservados fueron instrumentales
para el aislamiento del complejo de reconocimiento de origen (ORC) (complejo
de replicación de origen)[22]. Este complejo, constituido por la interacción de
seis proteínas estrechamente asociadas (Orc1–6) (revisado en [21]), se ha
identificado como el iniciador de la replicación eucariota, que realiza una
función análoga a la bacteria DnaA. Antes de que comience la síntesis de ADN,
la ORC recluta una cantidad de proteínas adicionales al origen para formar el
complejo prerreplicativo (pre-RC), otorgando la licencia del sitio para su inicio
(Fig. 2; revisado en [23 - 25]). Como se ve en las bacterias, un paso clave en la
función de origen es el reclutamiento de la helicasa replicativa. En eukary-otes,
el complejo de mantenimiento minicromosómico hexamérico (MCM),
compuesto por las seis proteínas relacionadas

Orígenes de la replicación del ADN.

 Fig. 2. Modelo para el reclutamiento del complejo de mantenimiento
minicromosómico eucariótico (MCM) a un origen de replicación. El origen está
limitado por primera vez por la ORC heterohexamericana (azul claro). Luego
se recluta Cdc6 (rojo) y, junto con Cdt1 (naranja), recluta el complejo MCM
(azul oscuro) al origen.

Mcm2–7, es el candidato más probable para este rol. Al igual que en las
bacterias, este reclutamiento requiere proteínas suplementarias, y los factores
Cdc6 y Cdt1 han demostrado ser críticos para el proceso de carga [20,23–
25]. Curiosamente, Cdc6 muestra homología con la subunidad Orc1 y, por lo
tanto, Cdc6 y Orc1 se derivan probablemente de un ancestro común (ver más
abajo). Además, recientemente se ha demostrado que la propia ORC también
participa activamente en el montaje de MCM en la levadura en ciernes [26]. La
formación y activación del pre-RC es crucial para la regulación de la
replicación, asegurando que cualquier origen potencial solo se puede disparar
una vez por ciclo celular [23,24].
De nuevo, como en las bacterias, los múltiples componentes de la pre-RC
eucariótica poseen dominios ATPasa. Más específicamente, las subunidades
ORC Orc1, 4 y 5 tienen dominios AAA + , al igual que Cdc6, y los estudios
genéticos han revelado que la mutación de los sitios de unión de ATP en ORC
o Cdc6 perjudica la carga de la helicasa MCM en los orígenes. De hecho, con
la excepción de Schizosaccharomyces pombe que se discute más adelante, todas
las ORC eucarióticas caracterizadas requieren ATP para unirse al ADN
[21]. Aunque a este nivel la carga de MCM puede. Al parecer superficialmente
similares al sistema bacteriano, hay una serie de diferencias fundamentales entre
los sistemas bacteriano y eucariótico. Primero, en el sistema de bases, una vez
que DnaA ha formado la forma abierta apropiada del origen, DnaB se carga y
se inicia la réplica. En contraste, no hay evidencia de que la ORC funda el ADN
[27] y, además, la ORC permanece unida a los orígenes a lo largo del ciclo
celular

[21]. Una segunda diferencia entre los sistemas radica en la observación de

que, en bacterias, se recluta un solo par de helicasas DnaB [13]. En contraste,
muchas moléculas MCM se cargan por origen (revisadas en [28]).

Curiosamente, esta carga iterativa de MCM ha demostrado recientemente ser

dependiente de la actividad ATPasa de ORC [26]. Más específicamente, el
análisis mutacional del dedo de arginina de Orc4 dio como resultado un
complejo de proteína mutante que aún podía unir tanto el ATP como el ADN,
pero tenía una actividad ATPasa dañada. Este complejo mutante admitió una
sola ronda de carga de MCM pero no pudo mediar la carga iterativa. Por lo
tanto, parece que el complejo iniciador eucariótico, ORC, desempeña un papel
activo en el proceso de carga de helicasa [26].
 Finalmente, se ha hecho evidente que el estado de la cromatina en un origen
dado en levaduras en ciernes puede tener consecuencias importantes para la
actividad de origen. Por ejemplo, la posición de los nucleosomas en un origen
puede verse influida por la unión de ORC [29]. Además, el estado de acetilación
de la cromatina puede influir en el tiempo de cocción del origen en la levadura
en ciernes. Más específicamente, se ha demostrado que la eliminación de la
histona desacetilasa, RPD3, resulta en una activación más temprana de los
orígenes en S. cerevisiae [30]. Por lo tanto, parece que los factores epigenéticos
tienen la capacidad de regular la actividad de origen en este modelo de
eucariotas.

Orígenes en otros eucariotas

Aunque hasta ahora se han identificado homólogos de las subunidades del iniciador ORC
en cada órgano eucariótico analizado, las secuencias de origen han demostrado ser
considerablemente más esquivas. De hecho, incluso en las levaduras en ciernes, la
definición de origen no es tan simple como a menudo se describe. Por ejemplo, es
problemático predecir los orígenes de la levadura solo por secuencia, debido a que un gran
número de elementos candidatos de ACS dentro del genoma no coinciden con las zonas
de iniciación y, además, algunos elementos de ACS se desvían del consenso [31]. Además,
también se han descrito orígenes compuestos complejos, que contienen múltiples
elementos de ACS.

[32]. Recientemente, el uso de técnicas globales basadas en microarrays ha evitado las

dificultades asociadas con las búsquedas basadas en secuencias y se ha mapeado con
éxito.

la distribución de los orígenes de replicación en todo el genoma de la levadura en ciernes

[33,34]. Además de identificar nuevos orígenes de replicación, estos análisis también han
revelado información valiosa sobre la duplicación del genoma.

Levadura de fision

Se han identificado orígenes de replicación en la levadura de fisión, S.

pombe. Sorprendentemente, estos muestran poca similitud con los de la levadura en
ciernes y carecen de secuencias de sensatez detectables. La principal característica común
a las regiones de origen de S. pombe es que son ricas en bases A y T. Curiosamente, la
ORC de S. pombe reconoce los orígenes únicamente a través de una característica única,
un dominio de unión al ADN de gancho AT en la subunidad Orc4 [35-37], y adicionalmente,
la ORC de S. pombe no requiere que el ATP se una a los orígenes. Análisis recientes han
sugerido que S. pombe puede tener restricciones bastante relajadas para lo que constituye
un origen de replicación. Primero, las regiones ricas en A + T del genoma fueron
identificadas bioinformáticamente. Veinte de estas islas ricas en AT fueron elegidas al azar
y probadas en análisis de gel 2D para buscar una posible actividad de origen. Dieciocho de
estas regiones mostraron evidencia clara de intermedios de replicación indicativos de
actividad de origen [38]. Más recientemente, con referencia a la

S. En la secuencia del genoma de Pombe, se observó que las características compartidas

por los orígenes caracterizados de replicación, es decir, la riqueza en AT y la composición
de la cadena asimétrica, eran comunes a muchas regiones intergénicas en el genoma de
este organismo. Usando un cribado genético para la actividad de origen, se encontró que
cuatro de las 26 regiones intergénicas analizadas tenían la capacidad de apoyar el
mantenimiento de un episoma [39]. Además, la dimerización de las regiones intergénicas
llevó al descubrimiento de que otras 10 regiones intergénicas podrían funcionar como
orígenes en este contexto [37]. A la luz de estos datos, se ha propuesto que S. pombe utiliza
un modo de replicación distinto de la hipótesis del replicón original [39]. Por lo tanto, en
lugar de depender de un sistema altamente selectivo como en las bacterias o incluso las
levaduras en ciernes, S. pombe parece tener poca dependencia de la secuencia en la
selección de los orígenes; más bien hace uso de un motivo de unión a ADN relativamente
promiscuo para dirigir la unión de ORC a características comunes en el genoma. En
consecuencia, la selección del origen en S. pombe puede ser un fenómeno bastante
estocástico. Además, como las regiones ricas en AT se mapean en regiones intergénicas,
es posible que la selectividad de ori-gin puede estar en parte gobernada por fenómenos
epigenéticos como el estado de la cromatina en estas regiones intergénicas. En este
sentido, es tentador especular que la capacidad de estas regiones intergénicas ricas en AT
para funcionar como orígenes de replicación en S. pombe puede correlacionarse con el
estado de los promotores para las encompasas.

cantar genes. Esto podría manifestarse tanto a nivel del entorno de cromatina inmediata de
la región intergénica como a nivel del estado topológico del ADN como resultado de la
transcripción de los genes adyacentes.

Orígenes en los eucariotas superiores

Aunque la ORC se conserva en eucariotas superiores y es claramente esencial para la

replicación, las bases moleculares de la identidad y función de origen siguen siendo poco
comprendidas. De hecho, estudios iniciales revelaron que una variedad sorprendentemente
diversa de moléculas, incluso de fuentes completamente heterólogas, podrían replicarse en
los sistemas libres de células de Xenopus (revisado en [40]). Uno de los orígenes
eucarióticos superiores mejor caracterizados se encuentra en el locus de amplificación de
coriones en Drosophila melanogaster. Esta región experimenta una amplificación localizada
dinámica por múltiples rondas de re-replicación durante el desarrollo de ovocitos. Los
análisis han revelado que los elementos ACE3 y ori b , importantes para la amplificación,
están limitados por la ORC de Drosophila [41]. Además, un complejo que contiene el
homólogo de Drosophila del factor de transcripción Myb también se une a estos dos
elementos [42]. Además, los experimentos de inmunoprecipitación sugieren interacciones
directas entre Myb y la ORC, y las células mutantes en Myb mostraron niveles
drásticamente reducidos de replicación del ADN [40]. Estos datos, junto con la observación
de que Myb se requiere para la progresión de la fase S en muchos (aunque no todos) tipos
de células de Dro-sophila, sugieren un papel amplio para Myb en la replicación del ADN
[42]. Además, la interacción entre los factores de transcripción y la maquinaria de
replicación puede ser fundamental para ejercer el control del desarrollo de la replicación del
ADN de maneras específicas para el tejido y el tiempo. Más recientemente, un estudio ha
revelado que el estado de la cromatina del locus de amplificación de corión tiene un papel
importante en la actividad de origen de la administración. Se descubrió que los loci de
amplificación del corion se ubican conjuntamente con la histona H4 hiperacetilada [43]. Más
generalmente, la reducción genética o química de los niveles de histona desacetilasa
produjo una replicación elevada en todo el genoma, lo que sugiere un vínculo causal entre
la acetilación y la replicación de la histona. Significativamente, unir una histona desacetilasa
al locus de amplificación del corion dio lugar a una represión local de la replicación y, por el
contrario, unir una histona acetilasa dio lugar a una estimulación local de la replicación. Por
lo tanto, parece que el estado epigenético o estructural local de la cromatina en la vecindad
de un origen puede influir en la actividad de esta región [43]. Por lo tanto, es posible que el
efecto estimulante que tiene Drosophila Myb en la réplica puede deberse en parte a su
reclutamiento de actividades modificadoras de croma-estaño. La interacción entre la

los mecanismos de transcripción y replicación han sido subrayados aún más por un análisis
basado en micromatrices de los perfiles de replicación y transcripción del brazo izquierdo
del cromosoma 2 de Drosophila [44]. Este trabajo reveló que las regiones de replicación
temprana se correlacionaban con las ubicaciones activas de transcripción. Además, estas
regiones de reproducción temprana también se correlacionaron con los sitios de unión de
ORC. Estos sitios mostraron una preponderancia de regiones ricas en AT y generalmente
se ubicaron en regiones intergénicas. Interesantemente, también hubo una superposición
significativa entre los sitios de unión ORC y ARN polimerasa II [44]. Este último hallazgo
enfatiza aún más la conexión entre los aparatos de transcripción y replicación y, como se
analizó anteriormente, sugiere que los factores de transcripción específicos del gen podrían
facilitar el reclutamiento de ORC, ya sea a través de la interacción proteína-proteína directa
o generando un entorno de cromatina favorable a la unión de ORC.

Esta interacción entre las maquinarias de transcripción y replicación también se ha

observado en los sistemas sin células Xenopus. El ADN plasmídico introducido en los
extractos de huevo de Xenopus forma cromatina y la replicación se inicia en posiciones
aleatorias alrededor del plásmido. Sin embargo, cuando se introduce un plásmido que
contiene un promotor fuerte en condiciones en las que ese promotor está activo, el plásmido
muestra un inicio de replicación preferencial en la vecindad del promotor [45].Curiosamente,
la transcripción no fue necesaria para la localización de la actividad de origen, de hecho, el
potente activador, GAL4-VP16, solo, es capaz de especificar la ubicación de inicio. Por lo
tanto, es probable que GAL4-VP16 actúe para facilitar una estructura de cromatina abierta
que conduzca al ensamblaje pre-RC. De acuerdo con esta posibilidad, se encontró que
había un aumento de la acetilación de histona H3 en las proximidades de la iniciación de la
replicación localizada. Interesantemente, este estudio descubrió que, si bien la ORC estaba
asociada con el ADN plasmídico, no mostraba ninguna localización preferencial, incluso en
presencia de GAL4-VP16, lo que sugiere que puede unirse de forma aleatoria pero activa
de una manera específica al locus [ 45].

Otro estudio también ha encontrado una relación estrecha entre la actividad del promotor
y la función de origen, en este caso en el contexto de un episoma de mamífero. El plásmido
pEPI-1 se replica de manera estable una vez por ciclo celular en un rango de líneas
celulares de mamíferos. Trabajos recientes han demostrado que la replicación estable
depende de la presencia del promotor CMV fuerte en el plásmido [46]. Sin embargo, los
intentos de mapear los sitios de iniciación de la replicación en el plásmido revelaron que la
iniciación ocurrió en posiciones aparentemente aleatorias alrededor del episoma. Del
mismo modo, no se detectó una localización distinta o preferida de la ORC [47]. Dada la
dependencia de la replicación de la presencia del promotor de CMV, nuevamente es
tentador especular que la cromatina remodela

Las actividades ling reclutadas por transactivadores unidos al promotor facilitan la

generación de una estructura de cromatina permisiva en el episoma. Además, es posible
que la naturaleza circular y el tamaño pequeño (<7000 pb) del episoma puedan tener
consecuencias topológicas que también promuevan la unión de ORC. De hecho,
recientemente se ha demostrado que la ORC de Dro-sophila purificada tiene poca o
ninguna especificidad de secuencia en la selección del sitio de unión, pero muestra una
preferencia considerable (aproximadamente 30 veces) por el ADN superenrollado
negativamente [48].

Por lo tanto, los eucariotas parecen utilizar una sorprendente diversidad de mecanismos
para definir los orígenes de la replicación, que van desde la unión específica de secuencia
de alta afinidad hasta la secuencia aparentemente no específica pero la unión dependiente
de la topología. Además, los fenómenos epigenéticos desempeñan claramente un papel
importante en el control de la selectividad del uso del origen. Finalmente, la observación de
que Myb puede interactuar directamente con ORC abre la posibilidad de facilitar el
reclutamiento de ORC en sitios regulados por el desarrollo dentro del cromosoma.

Archaea

En contraste con la riqueza de detalles moleculares, genéticos y bioquímicos que ahora se

conocen sobre los orígenes de replicación y su interacción con iniciadores en bacterias y
eucariotas, se sabe muy poco acerca de las bases moleculares del inicio de la replicación
en el tercer dominio de la vida. la arquea

Está bien establecido que las arqueas poseen una mezcla intrigante de características
bacterianas y eucariotas, así como aspectos que son exclusivos de este dominio de la
vida. Los cromosomas arqueales se parecen a los de la mayoría de las bacterias: son
pequeños, circulares y tienen unidades de transcripción de poli-tris. Además, es probable
que las arqueas tengan transcripción y traducción acopladas. Sin embargo, se ha hecho
evidente que los mecanismos de procesamiento de información centrales de las arqueas
están fundamentalmente relacionados con los de los eucariotas. Por lo tanto, las máquinas
de transcripción y replicación de ADN de las arqueas están estrechamente relacionadas,
pero son mucho más sencillas que sus homólogas eucariotas y distintas de las de las
bacterias [49,50]. Por lo tanto, las arqueas se presentan como un sistema modelo
potencialmente simple para comprender los eventos conservados en la replicación del
ADN. Varios estudios han descrito las propiedades bioquímicas de las proteínas de
replicación de ADN arqueales (revisadas en [50]). También es de considerable interés
comprender cómo los cromosomas de tipo bacteriano simples de las arqueas se replican
mediante un aparato de replicación de tipo eucariótico, para dilucidar la naturaleza del
órgano replicón arqueal. Y establecer los mecanismos por los cuales se definen los
orígenes de la replicación archaeal.

Los intentos iniciales para identificar los orígenes arqueales de la replicación fueron de
naturaleza bioinformática, aprovechando la observación de que las cadenas adelantadas y
rezagadas a menudo tienen una composición diferencial de nucleótidos. Tales análisis
condujeron a la predicción de la existencia de orígenes únicos de replicación en
Methanobacterium thermoautotrophi-cum (ahora llamado Methanothermobacter
thermoautotro-phicus) y Pyrococcus horikoshii [51]. El trabajo posterior confirmó la posición
del origen de la replicación en Pyrococcus, proporcionando la primera prueba experimental
de un origen localizado de replicación en las arqueas.

[52]. Curiosamente, en una situación que recuerda a la de varias bacterias donde su

origen es adyacente al gen del iniciador, DnaA, el único ori-gin de Pyrococcus, denominado
oriC, se encuentra inmediatamente corriente arriba del gen de la proteína iniciadora de
replicación candidata, un homo -logo de Orc1 y Cdc6 [52]. Como se mencionó
anteriormente, las proteínas eucarióticas Orc1 y Cdc6 muestran una similitud de secuencia
y, presumiblemente, se derivan de un cáncer común . Los genomas arqueales codifican
proteínas que están aproximadamente igualmente relacionadas con Orc1 y Cdc6, y aunque
el genoma individual se proyecta de diversas maneras

refiérase a estos como Orc o Cdc6 en esta revisión, describiremos estas proteínas como
Orc1 ⁄ Cdc6. La cartografía fina del origen de la replicación de Pyrococcus in vivo reveló
que el sitio de inicio de la síntesis de la cadena principal era adyacente a un motivo de
repetición de función desconocida presente en dos copias invertidas en el Pyrococcus oriC
[53]. Adición-

Los estudios de inmunoprecipitación con cromatina aliados indicaron que, in vivo, el

producto del gen orc1 ⁄ cdc6 se asoció específicamente con el origen de la replicación
[54]. Por lo tanto, parece que en Pyrococcus, hay una arquitectura de replicón de tipo
bacteriano con un único origen de replicación que se reconoce (y probablemente se define)
por un homólogo de componentes del pre-RC eucariótico.

Un estudio genético en una segunda especie arqueal, Halo-bacterium NRC-1 proporcionó

evidencia de un origen de replicación adyacente al gen orc7 que codifica el ortólogo de la
proteína Pyrococcus Orc1 ⁄ Cdc6 [55].

Interesante, Halobacterium codifica un total de 10 homólogos de Orc1 ⁄ Cdc6 y tiene tres

respuestas distintas

contras; Un cromosoma principal y dos plásmidos grandes. El cromosoma grande codifica

cuatro homólogos de Orc1 1 Cdc6 y los homólogos restantes se codifican en los
plásmidos. Sin embargo, solo el gen orc7 en el cromosoma principal parece estar asociado
con un origen de replicación. Se desconoce si existen orígenes adicionales en el
cromosoma principal de Halobacterium. Curiosamente, un estudio de bioinformática ha
sugerido que puede existir un segundo origen en

Halobacterium [56], pero los intentos de identificar experimentalmente este origen de citas
no han tenido éxito [55]. Por lo tanto, la evidencia disponible apunta a que tanto los
cromosomas principales de Pyrococcus como los de Halobacterium tienen una situación
similar a la bacteriana de un único origen de replicación.

Se ha demostrado que existe una situación muy diferente en el archaeon hipertermofílico

Sulfolobus solfataricus. Este organismo pertenece a la Crenarchaea, un reino distinto de
Halobacterium y Pyrococcus (ambos Euryarchaea). S. solfataricus codifica treshomólogos
de Orc1 ⁄ Cdc6 y, en un enfoque de mapeo de gel 2D [57], se demostró que los orígenes
de la representación, denominados oriC1 y oriC2, están estrechamente vinculados a dos
de estos genes (cdc6-1 y cdc6-3). Los puntos de inicio de la replicación se mapearon
en ambos orígenes y se encontró que se encuentran en una región rica en AT (Fig. 3). Esta
región estaba flanqueada por diversos motivos de repetición y se encontró que estos eran
sitios de unión para las proteínas Orc1 ⁄ Cdc6. El origen de oriC1 se localiza corriente arriba
del gen cdc6-1, que codifica el ortólogo de Sulf olobus de las proteínas Pyro-coccus Orc ⁄
Cdc6 y Halobacterium Orc7. Además, los elementos de secuencia unidos por Cdc6–1 en
Sulfolobus oriC1 están relacionados con repeticiones de secuencia tanto en el origen de
Halobacterium como en el de Pyroccocus. De hecho, estos motivos
conservados, denominados elementos de la caja de reconocimiento de origen (ORB), tanto
en Pyrococcus como en Halobacterium, pueden ser reconocidos por la proteína Sulfolobus
Cdc6-1 purificada [57]. Por lo tanto, parece que estos elementos ORB, como las cajas DnaA
en bacterias, son características conservadas de

Fig. 3. Modelo para el reconocimiento de un origen de replicación arqueal (basado en S. solfataricus oriC1 [55]). Los cuadros
verdes representan elementos de ORB que son reconocidos por la proteína azul oscuro Orc1 ⁄ Cdc6 (codificada por el gen
cdc6-1). Se supone que este evento conducirá al reclutamiento del complejo MCM (púrpura), sin embargo, actualmente se
desconoce si se requieren factores adicionales para este proceso.

Una serie de orígenes de replicación arqueales y esto ha permitido la predicción de la

localización de los orígenes de replicación en una diversa gama de
arqueas. Interesantemente, el segundo origen de Sulfolobus tiene repeticiones de
secuencia que están relacionadas con una repetición invertida del núcleo pre-enviada en
los elementos ORB completos. Estos elementos más cortos, denominados mini-ORB,
también fueron capaces de unirse a Cdc6-1, pero lo hicieron con una afinidad al menos 10
veces menor que los elementos ORB [57]. Los mini-ORB también aparecen ampliamente
conservados y recientemente se han identificado en el origen predicho en M.
thermoautotrophicus [58].

La presencia de sitios de unión Orc1 ⁄ Cdc6 ampliamente conservados en arqueas

recuerda a las cajas DnaA en bacterias. El paralelo con el sistema bacteriano puede
extenderse aún más con la elucidación de las estructuras cristalinas de las proteínas DnaA
[59] y Orc1 ⁄ Cdc6 [60,61]. Como puede verse en la Fig. 4 , ambas proteínas
poseen dominios AAA + N-terminales y dominios de unión a ADN C-terminales (DBD). En
DnaA, el DBD contiene un helix-turn-helix; en las proteínas arqueas, el DBD tiene un
dominio de hélice alada (revisado en [62]). Curiosamente, la posición relativa
del dominio AAA + y el dominio de hélice alada de Aeropyrum pernix Orc1 1 Cdc6 homólogo
se vio influida por la naturaleza del nucleótido unido por la proteína, lo que sugiere que la
unión y la hidrólisis de ATP podrían modular la naturaleza de Interacción proteína-ADN [61].
Curiosamente, sin embargo, los estudios bioquímicos con la S. solfa-t La proteína aricus
Cdc6-1 no detectó ningún efecto significativo de la presencia o ausencia de ATP o ADP en
la capacidad de esta proteína para unirse a los elementos ORB [57].

Fig. 4. Estructuras de DnaA bacteriano y arcaico Orc1 ⁄ Cdc6. La figura se generó utilizando el paquete de
software PYMOL (http: // pymol.sourceforge.net) y las coordenadas de los archivos PDB 1FNN (Orc1 ⁄ Cdc6) y 1L8Q
(DnaA). Los dominios AAA + de ambas proteínas se muestran en cian con ADP indicado en rojo. El dominio de unión al ADN
que contiene helix-turn-helix (HTH) de DnaA está en verde y el dominio que contiene hélice alada (WH) de Orc1 ⁄ Cdc6 está
en azul oscuro.

Orígenes de la replicación del ADN NP Robinson y SD Campana

Si bien los elementos ORB ⁄ mini-ORB parecen estar ampliamente conservados y quizás
desempeñan un papel análogo a las cajas DnaA, claramente no son las únicas secuencias
unidas por los homólogos de Orc1 ⁄ Cdc6 en archaea. Sulfolo-bus oriC1 y oriC2 también
son reconocidos por la proteína Cdc6-2 y oriC2 está unido adicionalmente por Cdc6-3.

[57]. Sin embargo, aún no ha sido posible establecer secuencias de consenso para el
reconocimiento del ADN por estas dos proteínas. Es posible que la proteína Cdc6-2 pueda
desempeñar un papel regulador en la actividad de origen, ya que se encontró que estaba
en los niveles más altos en las células postreplicativas, y los datos preliminares sugieren
que Cdc6-3 puede actuar para facilitar el reconocimiento de mini-ORB por Cdc6-1 (NP
Robin-son & SD Bell, datos no publicados). Por lo tanto, la expresión diferencial de
estas proteínas puede jugar un papel clave en la regulación de la actividad de origen en
Sulfolobus [57]. ¿Qué tan útil es este mecanismo potencial?

Actualmente, la arquea no está clara, pero es interesante observar que muchas arqueas
codifican más de un homólogo de Orc1 ⁄ Cdc6 [ 50].

El Sulfolobus oriC1 y oriC2 se identificaron utilizando un enfoque de locus candidato en

un análisis de electroforesis en gel 2D para identificar intermedios de replicación asociados
con el inicio de la replicación. Sin embargo, la bioinformática había sugerido que podría
existir un tercer origen en el genoma de Sulfo-lobus [56]. Esta propuesta fue confirmada por
un análisis de frecuencia de marcadores basado en microarray de genoma completo que,
además de confirmar la identidad de los dos orígenes Sulfolobus caracterizados
previamente, presentó evidencia convincente de un tercer origen, oriC3

[63]. Este origen ahora se ha mapeado bien y se ha demostrado que se une a los tres
homólogos de Orc1 ⁄ Cdc6 (NP Robinson y SD Bell, datos no publicados). El análisis de
frecuencia de marcadores también reveló que los tres orígenes parecen dispararse de
forma síncrona, sin embargo, la forma en que se controla esto sigue siendo desconocida
[63].

Por lo tanto, aunque queda mucho por conocer acerca de los mecanismos, y
particularmente del control, de la iniciación de la replicación del ADN arcaico, estos estudios
iniciales sugieren que existe un nivel intrigante de complejidad en el sistema arqueal. La
combinación de múltiples orígenes de repetición en algunas especies, junto con múltiples
proteínas iniciadoras, algunas de las cuales parecen estar reguladas por el ciclo celular,
sugiere que las redes reguladoras comparativamente sofisticadas regularán la actividad de
origen en estos organismos.

Finalmente, en bacterias, se ha demostrado que las proteínas nucleoides juegan un papel

clave en el ensamblaje de la geometría apropiada del complejo DnaA-oriC. Además, como
se discutió anteriormente, la arquitectura de la cromatina local puede jugar un papel
importante en la modulación, e incluso posiblemente facilitando, el reclutamiento de la ORC
eucariota. En este sentido es probable que los arcaeales

Las proteínas de la cromatina pueden desempeñar un papel en la asistencia al ensamblaje

pre-RC en los orígenes. Además, el descubrimiento de que la proteína de la cromatina Alba
está regulada por acetilación reversible en Sulfolobus [64] presenta la posibilidad
emocionante del control epigenético de la actividad de origen en las arqueas.

Referencias