UN METODO DE TINCION POLICROMICO DE USO RAPIDO

M. DURFORT (1)

L'auteur considere l'intret actuellement vivant de I'application des mthodes dc colorations classiques, des monocrhomes aux polychromes, ainsi qur: leurs posibles modifications pour l'tude des structures histologiques et des components cytoplasmiques avec le
microscope photonique, malgr le fait qu'au moment actuel la plupart des travaux sont
ports avec le microscope lectronique simplement pour le fait relement important que
la observation au microscope optique c'est la phase obligatoire pour tout type d'tude
ultrastruturale.
On prsente une technique pense par WITLINen 1970 pour les tudes hmayologiques
et quelle donne des rsultats insuperables pour leur information et vitesse, dans i'tude des
appositions de gonades miles, ainsi que pour les tudes des cromosomes et pour la coloration des coupes fines et semifines des organes animaux.

Actualmente, cuando la mayoria de 10s trabajos histolgicos y citolgicos se centran en estudios ultraestructurales al microscopio electrnico
itiene sentido insistir en la bsqueda de nuevas tcnicas de tincin para
visualizar de forma especifica 10s distintos elementos tisulares y las diferentes estructuras citoplasmticas al microscopio fotnico?
Desde la utilizacin de 10s primeros colorantes naturales, ya por LEEUWENHOEK en el siglo XVII hasta la aplicacin de las anilinas en mtodos
dicrmicos, tricrmicos y policrmicos, cuyo auge se sita en el siglo XIX
y primeras dcadas del siglo xx, hasta las mis depuradas tcnicas citoquimicas de deteccin de mucopolisacridos, ADN, ARN, hierro, calcio, vitaminas, etc. muchas han sido las variantes ideadas y 10s xitos conseguidos.
Una simple hojeada a 10s grandes tratados de tcnica histolgica, LANGERON (1949), MARTOJA
(1970), POLICARD
y col. (1957), ROMEIS
(1928),
a los numerosos manuales existentes, a las revistas especializadas como el
Stain Technology (2), hace posible apreciar que la preparacin de la mayoria de las soluciones tintoriales puede hacerse atendiendo a tal o cua1
modalidad, existiendo gran diversidad de mtodos en la preparacin de
dichas soluciones, siendo quizs uno de 10s ejemplos mis ilustrativos el
que encontramos al querer preparar una hematoxilina, colorante natural
( I ) Departamcnto dc Morfologia y Microscopis. Facultad de Biologia. Univcrsidcd
de Barcelona.
(2) Official Organ of thc Biological Stain Commission. Publ. Williams and Wilkins.
Co. Bnltimore. Maryland.

de carcter bsico y posiblemente el de uso ms universal; al consultar

cualquier manual o tcnica uno se encuentra con mltiples tipos de hematoxilina, asi en la magnifica Guia Formulari0 de ROMEIS,en su 11.R edicin
de 1924, hallamos descritas 25 modalidades correspondientes a veinte
FRIEDLANautores, desde APATHYa WEIGERT,pasando por DELAFIELD,
DER,HARRIS,HEIDENHAIN,
MAYER,SCHULTZE,
entre otros.
Algunas de estas variantes consisten en minimos detalles, que podrian
parecer insignificantes pero que su resultado es realmente sorprendente,
ensaya con xito la adicin de cido actico, en
asi, por ejemplo, ERHLICH
pequea prchporcin, a la hematoxilina de FRIEDLANDER,
evitando de esta
manera procesos de sobretincin. Otro ejemplo podemos hallarlo en la
preparacin del reactivo de SCHIFF,utilllizado tanto en la tcnica del PAS
como en el mtodo de FEULGEN-ROSSENBECK
(1924) para la demostracin del ADN y del ARN dicho reactivo puede prepararse como mnim0
de tres formas distintas, atendiendo al mtodo de COLEMAN,
al de LILLIEO
bien al de GRAUMANN,
el autor de la presente nota prefiere el mtodo de
LILLIEal de 10s otros dos autores.
Volvemos a plantearnos la pregunta inicial: en la era de la microscopia
electrnica y cuando la mayoria de las casas constructoras de microscopios fotnicos disean y lanzan al mercado nuevos modelos de contraste
de fases y de contraste interferencial, de cmodo manejo y de indudable
eficacia para visualizar b s componentes celulares sin necesidad de. someter
las clulas a procesos tintoriales i,es justificado buscar nuevas tcnicas, variantes y combinaciones a 10s mtodos ya existentes?
Los intentos en este sentido por parte de 10s histlogos parecen indicar
que si, ya que sin olvidar las clsicas tcnicas de tincin de 10s orgnulos
citoplasmticos con anilinas y mediante impregnaciones, se han ido diseando nuevos mtodos y entre otros puede hacerse referencia a la tcnica
de TAKAYA
(1967) para la tincin especifica de mitocondrias, en la que
intervienen el Luxo1 fast, el azul MBS y la phloxina (especie de eosina); la
tcnica del verde de malaquita-pironia, como modificacin a la tcnica del
verde de metilo-pironina de BRACHET(1953) para la tincin especifica
del ADN y del ARN, propuesta por BAKERy WILLIAMSen 1965.
En esta nota se da a conocer una tcnica que si bien fue ideada por
WITLINen 1970 para el estudio de extensiones de sangre, su aplicacin
sobre otros tipos de materiales nos ha dado resultados muy satisfactorios y
por consiguiente, ofrecemos a 10s zool6gos.
Las clsicas tinciones de extensiones sanguneas son en general, mtodos dicrmicos, tricrmicos y en ocasiones policrmicos, en 10s que
actan colorantes cidos y bsicos, cuyos efectos en ocasiones se contrarestan, entre las soluciones ms usuales es obligado recordar por su calidad la de MAY-GRUNWALD
O JENNER(1902) formada por eosinato de
(1904) a base de azul de
metileno, la solucin de GIEMSAO ROMANOWSKY
metileno, azur de metileno y eosina, la tcnica de PAPPENHEIM
(1912) o
coloracin panptica que consiste en dejar actuar primer0 el MAY-GRUND-

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y posteriormente el GIEMSAy entre las no tan frecuentes puede citarse la tcnica de EHRLICH-BIONDI
a base de verde de metilo, fuchsina
cida y orange G, solucin suministrada por la casa GRUBLER.
Cada una de estas tcnicas, junto con las numerosas variantes existentes, ponen de manifiesto 10s detalles nucleares y 10s distintos tipos de granulaciones que presenta la serie leucocitaria, de tanto inters en 10s estud i o ~hematolgicos.
WITLINen 1970 disea una tcnica con la que consigue resultados
superiores a 10s obtenidos con el mtodo de WRIGHT-GIEMSA,
difiriendo
del mismo por su extraordinaria rapidez, todo el proceso de fijacin y tincin se lleva a cabo en 15 segundos, siendo la segunda gran ventaja el
hecho de que sin tomar precauciones especiales no quedan precipitados,
cosa que suele ocurrir tras la aplicacin de 10s mtodos anteriormente
mencionados, a no ser que 10s reactivos sean de primerisima calidad y el
agua de 10s lavados sea ligeramente alcalina.
Al igual que las dems soluciones tintoriales que se usan para las extensiones de sangre, es preferible adquirirlas ya preparadas en el comercio;
el mtodo de WITLINque comprende tres soluciones, altamente txicas,
la solucin fijadora, la solucin I (colorante acidfilo) y la solucin I1 (colorante basfilo) ha sido comercializado por la casa Harleco, con el nombre de Diff-Quick.
Hemos aplicado con mucho xito esta tcnica sobre extensiones de
sangre de anfibios y aves, teniendo que incrementar ligeramente 10s tiempos de permanencia en cada solucin, pasando de 10s 5 segundos reglamentarios para las extensiones de sangre humana a un minuto de permanencia en cada reactivo. Pero han sido 10s resultados obtenidos en la tinein de aplastamiento (1) de gnadas masculinas que han permitido contabilizar 10s cromosomas y apreciar las distintas categorias celulares del
testiculo 10 que ha impulsado la redaccin de esta nota.
WALD

Tcnica a seguir para la tincin de un squash de testiculo.

A.

1. Aplastar suavemente un testiculo abierto por la mitad sobre un

portaobjetos previamente desengrasado con alcohol.
2. Dejar secar durante un par de minutos.
3. Sumergir tres veces consecutivas el portaobjetos en un recipiente
cilndric0 (tipo borrel) que contenga la solucin fijadora. Cada inmersin debe ser de unos treinta segundos.
4. Escurrir verticalmente el portaobjetos sobre un papel de filtro.
5. Sumergir tres veces consecutivas, durante treinta segdndos, cada vez,
el portaobjetos en la solucin I.

(1)

Posiblemente la traduccin correcta de squash sea la de aplastamiento.

6. Escurrir sobre papel de filtro.

7. Sumergir finalmente el portaobjetos en la soluci6n I1 como en 10s
dos casos anteriores.
8. Lavar la preparacin durante 10 segundos en agua corriente.
9. Dejar secar al aire.
10. Montaje facultativa, pero recomendado, en blsamo. del Canad,
Rhenohistol, Euparal, DePeX, o cn cualquier otra resina.
Los cromosomas aparecen muy bien diferenciados, por 10 que su contaje resulta sumamente fcil, siendo adems esta tcnica mucho mis cmoda que la aplicacin de las clsicas de tincin en orceina actica o de carmin borcico, que son mis largas, necesitan calentamiento y son poc0
permanentes.
Hemos efectuado ensayos comparatives con testiculos de rana, pollo,
ratn y cobaya entre 10s vertebrados y como invertebrados la hemos ensayado sobre gnada masculina de mejilln; la aplicacin de la tcnica
en gnada femenina no ha dado resultados satisfactorios.

B. Tcnica a seguir para la tincin de cortes.

Las secciones de 4 a 12 micras de grosor, obtenidas tras inclusin en
parafina, se someten al consabido desparafinado ccn xilol, durante unos
15 minutos y posteriormente se pasan a alcohol absoluto durante unos 15
minutos y posteriormente, segn la forma descrita anteriormente, se someten 10s cortes a las soluciones: Fijadora, I y I1 del Diff-Quick, tomando
las siguientes precauciones:
a).-Incrementar hasta cinco minutos el tiempo de permanencia en
cada solucin.
b).-Al ltimo lavado en agua corriente conviene aadir a la misma
unas gotas de cido actico glacial, dos gotas por cada 50 CC. de
agua.
c).-Tras este lavado, de 10 segundos, se seca con precaucin y rapidez 10s bordes del portaobjetos y se deja actuar durante cinco segundos alcohol absoluto. Debe tenerse mucha precaucin en este
paso, ya que el alcohol arrastra el colorante de la solucin, quedando desteidos 10s ncleos y 10s cromosomas.
d).-Tras
un rhpido secado de 10s bordes del portaobjetos, se deja
actuar de 5 a 10 minutos el xilol. Observacin: no debe someterse
previamente el corte a la accin de una esencia, como habitualmente se hace, ya que se desteiria la preparacin.
e).-Finalmente, se mc-nta el corte en cualquicr resina o en el blsamo
del Canad.

Un mtodo de tincin policromico

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Tras la ap'icacin de esta tcnica se consigue una preparacin definitiva en la que destacan muy bien 10s nclecs y cromosomas, quedando
asimismo bien diferenciados 10s tejidos que componen 10s distintos rganos, si bien esta tincin, en ningn momento puede superar 10s resultados
obtenidos con tcnicas del tip0 del Azan o del Mallory, esta ultima extraordinariamente rpida y demostrativa, aunque deba someterse a un
proceso de hidratacin completa prcvia la tincin y el material debe
tratarse con dos mordientes y diferenciarse con alcohol absoluto-azul de
anilina.
Esta tcnica se ha ensayado igualmente sobre cortes semifinos, de 0.5
a 1 micra de grosor que se utilizan ccm3 ccntrol de 10s cortes ultrafinos
estudiados al microscopio electrnico. Hasta el momento no existe ningn
mtodo realmente eficaz para eliminar el medio de inclusin (plstico)
utilizado en las inclusiones destinadas a la microscopia electrnica, por 10
que las tinciones convencionales no pueden aplicarse con xito sobre estos
cortes, ya que 10s colorantes son repelidos por 10s plsticos, salvo algunas
excepciones, como el azul de metileno al 1 % con o sin borax, el azul de
toluidina a la misma proporcin, en ambos casos se trabaja sobre una
platina caliente a 600C, de 3 a 5 minutos. El Diff-Quick proporciona resultados satisfactorios, pero hay que alargar considerablemente 10s tiempos
de permanencia en cada solucin, siendo el tiempo ptimo de 10 a 15
minutos, atendiendo al tipo de material.

A nlisis de la tcnica

La solucin que se aplica en primer lugar es un fijador alcohlico que

contiene un agente que acta de mordiente, 10 que hace posible la tincin
en tiempos tan cortos. Hemos ensayado d:: sustituir la solucin fiiadora
por una permanencia de tres minutos en metanol, fijador habitualmente
usado en las tcnicas de tincin de extensicnes de sangre y hemos comprobado que las soluciones colorantes no actan con el tiempo indicado,
teniendo que incrementar 10s tiempos de permanencia "en las mismas a
15 minutos, 10 cua1 no representa n i n g ~ n aventaja (1). La soluci6n Ies a
base de eosina, es decir, es cida mientras que la solucin I1 es de tipo
bsico, formada posib!emente por el azul de metileno y el azul de toluidina.
Despus de 10 expuesto consideramos que es realmente interesante
continuar haciendo ensayos con mtodos nuev0.s y con variantes a 10s
mtodos clsicos y en este sentido es curioso sealar que mientras redactbamos las presentes lineas hemos recibido unas separatas de MARTOJA
y

(1) El motivo de haber ensayado sustituir la solucin fijadora del Diff-Quick por el
metanol ha sido motivada por el hecho de ser muy volatil y por consiguiente es el primer
reactivo en gastarse.

MARTOJA,
entre las cuales paradjicamente hay una cuyo titulo es <Les
colorations polychromes sont-elles des mthodes actuelles?>, trabajo dedicado al profesor Manfred GABE,eminente tcnico histlogo al que SC lc
deben ncmerosas tcnicas ncevas y variantes a otras ya existentes, asi
como una magnfica obra que est en la linea de 10s grandes tratados.

BIBLIOGRAFIA
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Misc. Zool. IV (2): 205-210, 1978.