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El Urocultivo

EL urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye un método


excelente para cultivar la mayor parte de microorganismos que infectan el aparato urinario.
La combinación de piuria con bacteriuria considerable sugiere la presencia de una infección
urinaria.

UTILIDAD CLINICA:
1. Cuando los síntomas indican una posible infección urinaria como: dolor y sensación de
calor al orinar, así como urgencia frecuente de orinar.
2. Cuando un paciente esta canalizado por largo tiempo, aunque no muestre síntomas de
infección.
3. En mujeres embarazadas para monitorear cualquier bacteria en la orina que pueda causar
algún problema al bebé.

RECOLECCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO: PRINCIPIO GENERALES:


· La muestra ideal es la primera de la mañana debido a que la cuenta bacteriana es mayor.
· Se requiere de 3 a 5 ml de orina reciente en un recipiente estéril, también se puede obtener
mediante una sonda uretral, suprapubica o permanencia.

Las muestras para urocultivos no se toman de bolsas recolectoras de orina que forman parte
del sistema de drenaje a través de una sonda.
· Se lleva la orina al laboratorio y se examina lo mas pronto posible, de no ser así, la orina
se puede refrigerar hasta 2hrs antes de someterla a cultivo.
· En caso que el diagnostico sea de citomeglavirus, deberán mantenerse a temperatura
ambiental, ya que la refrigeración destruye a los virus.
· Para establecer bacteriuriua, se toman 2 muestras sucesivas del chorro medio.
· Las muestras se deben de obtener antes de un tratamiento con antibióticos.
· El personal de salud instruye al paciente respecto de la técnica adecuada para recolectar la
muestra.
· La muestra de orina se cubre y el recipiente se rotula y se incluye lo siguiente
información:
· Ficha de identificación, Nombre del medico, Diagnostico probable, Método de
recolección, Hora en que se obtuvo la muestra, Administración de líquidos forzados o
intravenosos, Administración de sustancias quimioterapeuticas especificas.

TECNICAS PARA OBTENER UNA MUESTRA LIMPIA DE ORINA O DEL


CHORRO MEDIO

Toma de Muestras en Mujeres:

La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir


las mismas instrucciones en su casa.
Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo
siguiente:
a) jabón desinfectante
b) agua hervida o agua estéril
c) gasa estéril o un paño acabado de lavar
d) el recipiente para tomar la muestra.

Proceda primero a lavarse las manos y luego siéntese en el inodoro, lo más hacia atrás que
pueda. Separe los labios genitales con una mano y mantenga los pliegues separados y
proceda a asearse toda la zona genital con el jabón desinfectante. Enjuague con abundante
agua estéril y luego seque bien con
gasa estéril o con un paño limpio.
Proceda a recoger la orina, destapando previamente el frasco SÓLO EN EL
MOMENTO DE LA MICCIÓN y sin tocar con los dedos su interior, coloque la tapa con el
lado plano hacia abajo. No toque el interior del recipiente o de la tapa. Empiece a orinar la
poceta y recoja en el frasco, sólo la muestra del chorro del medio es decir, no debe recoger
ni la primera, ni la última parte del chorro de orina. Tape muy bien el frasco y rotúlelo con
su nombre.
Tráigalo al Laboratorio lo más pronto posible, en un recipiente con hielo, cuidando de que
no se bote el contenido.

Toma de Muestras en Hombres:

La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir


las mismas instrucciones en su casa.
Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo
siguiente:
a) jabón desinfectante
b) agua hervida o agua estéril a temperatura ambiente
c) gasa estéril o un paño acabado de lavar
d) el recipiente para tomar la muestra.
Lavarse con jabón desinfectante primero las manos y luego la cabeza del pene empezando
por la abertura uretral y continúe en dirección a usted, como muestra la ilustración, previa
retracción del prepucio, si no está circuncidado.
Luego enjuagar bien con agua estéril o previamente hervida (a temperatura ambiente) y
secar con gasa estéril.

Destape el frasco recolector sólo en el momento de la micción y sin tocar con los dedos su
parte interna, coloque la tapa con el lado plano hacia abajo. Comience a orinar en la poceta
y recoja en el frasco sólo la muestra del chorro del medio, es decir, no debe recoger ni la
primera ni la última parte del chorro de orina. Tapar bien el frasco, rotularlo con su nombre
y traerlo al laboratorio lo más pronto posible, en un recipiente con hielo y cuidando de que
no se bote. El examen microbiológico de una muestra de orina se denomina Urocultivo.
Éste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo.

A. Examen cuantitativo
Método de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para
evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de
contaminación, se realiza de la siguiente manera:
· Se homogeneiza la muestra mediante agitación.
· Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa
o de suero fisiológico, estériles.
· Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilución al 1:100.
· Se deposita 1 ml. de cada dilución en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se
vacía un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45°. Mediante
rotación suave, se favorece la distribución homogénea de la siembra.

Método de Kass

· Se incuban todas las siembras a 37° durante 24 a 48 horas.


Para calcular el número de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias.
Contadas éstas, basta multiplicar su número por la dilución respectiva para obtener la
cuenta total.

Método del asa calibrada.

Esta estimación cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar
con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4
mm. de diámetro). Después de incubar las siembras a 37° durante 24 a 48 horas, se cuenta
el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de
platino contiene 0.01 ml. de orina.

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:


· No hubo desarrollo microbiano.
· Menos de 10 000 colonias por ml.
· Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml.
· Más de 100 000 colonias por ml.

Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con más de 100 000 colonias por ml., la
probabilidad de infección es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se
logra en tres recuentos sucesivos.

Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000
colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000
colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas
infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000
colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en
infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstrucción uretral, infecciones
crónicas e infecciones por cocos gram positivos.

b. Examen cualitativo
El estudio cualitativo, que conduce a la identificación del agente, se realiza mediante la
siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de
Levine o MacConkey.
Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patógenas
urinarias y permite la identificación de los microorganismos contaminados. Su contenido en
cisteína y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento
de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carácter invasor de las colonias de Proteus.
Así se facilita la identificación de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros
agentes que pueden contaminar la orina.

La identificación final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades


bioquímicas y características serológicas. Esto permite establecer relaciones de identidad
entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de
revivida o de reinfección. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del
serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps.
aeruginosa) y del antibiótico. Éste último se obtiene al comparar el antibiograma de cepas
aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe
correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa.

* Métodos rápidos de diagnóstico.


· Existen varios procedimientos prácticos y económicos para el diagnóstico rápido de
infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son útiles para investigar grandes
grupos de personas.
Estos métodos pueden ser microscópicos, químicos o de microcultivo.
· La coloración de un frotis de orina no centrifugada mediante el método de Gram
constituye un índice práctico para diferenciar entre infección y contaminación urinarias.

En efecto, la observación de un bacilo gram negativo por campo microscópico puede


realizarse cuando la muestra contiene más de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la
dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este método, provoca resultados
falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o más bacterias gram negativas
por campo microscópico de
sedimento urinario, aunque dicho número permita sospechar recuentos superiores a 100 000
microorganismos por ml.

· Los procedimientos químicos están basados en propiedades enzimáticas de las bacterias,


que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar:
catalasa, reducción de nitratos, reducción de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos
métodos, aunque rápidos y económicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse
en propiedades
metabólicas de las bacterias y no en su desarrollo y observación, y producir muchos falsos
negativos.
Placas de agar McConkey y de agar CLED, donde ha crecido un Escherichia Coli en
cultivo puro, con un recuento superior a 100.000 UFC/ml. (cultivo sembrado con asa
calibrada de 1/1000).

SIGNIFICADO CLINICO:
Los siguientes microorganismos en titulación suficiente se consideran patógenos:
· Escherichia coli, Enterococcos, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella, Enterobacter, algunas
especie de Serratia, Mycobacterium tuberculosis, Especies de Proteus, Pseudomona
aeruginosa, Estreptococco hemolitico genralmente del gurpo B, Candida albicans y otras
levaduras.

INTERFERENCIAS:

· Pacientes que estén recibiendo líquidos forzados, la orina esta tan diluida que la cuenta de
los colonias disminuye por debajo de los 105/mililitro.
· La contaminación bacteriana puede provenir de:
· vello peri anal, bacterias localizadas debajo del prepucio, bacterias de las secreciones
vaginales, de la vulva o de la porcion distal de la uretra, bacterias provenbientyes de las
manos, pies o ropa.

1- Siembra
La siembra debe realizarse de la orina sin centrifugar con un ansa calibrada, lo que
permitirá obtener una estimación semicuantitativa del desarrollo microbiano. Existen
numerosos medios de cultivo para sembrar una muestra de orina. La elección del medio de
cultivo debe contemplar la relación costo-beneficio, de modo de elegir la opción que
permita la recuperación de la mayoría de los patógenos con el menor costo posible.
Para tal fin, el microbiólogo debe tener en cuenta cierta información básica:
i. El 70-80% de los urocultivos enviados al laboratorio resultan "negativos".
ii. El 85-90% de las IU son producidas por enterobacterias.
iii. De los gérmenes gram-positivos, los que se aislan con mayor frecuencia son
enterococos y estafilococos.
iv. El medio CLDE permite el desarrollo de bacilos gram-negativos, estafilococos y
enterococos. Los medios de Levine, EMB o MacConkey permiten únicamente la
recuperación de bacilos gram-negativos. La mayoría de los gérmenes (incluyendo
estreptococos y corinebacterias) desarrollan en agar sangre, pero este medio no permite la
recuperación de Haemophilus spp., ni neisserias patógenas (gonococos y muchas cepas de
meningococos).
El agar chocolate posibilita la recuperación de todos los microorganismos mencionados
anteriormente.
Teniendo en cuenta estos conceptos, el microbiólogo tiene varias opciones para la siembra
racional de la orina.
Siembra de acuerdo a la observación previa del sedimento. Este procedimiento ofrece la
ventaja de cultivar el microorganismo en el medio más apropiado, tanto para su desarrollo,
como para
su caracterización macroscópica (aspecto de la colonia, fermentación de lactosa, tipo de
hemólisis, etc), por lo que posibilita orientar con mayor certeza el esquema inicial de
identificación. La desventaja es que demanda más tiempo que la siembra "a ciegas".
Uno podría entonces establecer el siguiente esquema de siembra de acuerdo al sedimento:
i. Sedimento normal y ausencia de gérmenes: media placa de CLDE.
ii. Sedimento patológico y ausencia de gérmenes: media placa de agar sangre o chocolate y
media de CLDE, Levine o MacConkey.
iii. Presencia de bacilos, independientemente del sedimento: placa entera de CLDE, Levine
o MacConkey.
iv. Presencia de cocos, independientemente del sedimento: placa entera de agar sangre o
agar chocolate.
b. Siembra "a ciegas". Esta opción es más práctica y sencilla que la anterior. Sin embargo,
tiene la desventaja de la demora potencial en la recuperación o identificación del
microorganismo. En la Argentina y en Europa el medio más utilizado es el CLDE. Se puede
sembrar media placa, pero esto muchas veces entorpece la obtención de colonias aisladas o
la visualización de mezcla de gérmenes. Se debe recordar además, que en este medio no
desarrollan varias especies que pueden causar IU (corinebacterias, estreptococos y otros),
por lo que un sedimento patológico sin recuperación de gérmenes, o cualquier otro
elemento que sugiera IU, debe promover la resiembra de la orina en agar sangre o agar
chocolate, antes de asumir la muestra como "negativa". En los EEUU se prefiere realizar la
siembra inicial en agar MacConkey y agar sangre.
c. Según patología de base. Si se tiene oportunidad de conocer la patología de base del
paciente mediante una buena comunicación con el médico tratante, o de la solicitud expresa
por escrito en forma rutinaria al recibir la muestra, se puede establecer alguna
discriminación en los medios a emplear. Los urocultivos de pacientes urópatas, con
malformaciones, tumores, instrumentación o traumatismos de las vías urinarias merecen la
utilización de 2 medios (CLDE y agar chocolate). Para el resto de pacientes, alcanzaría sólo
con la siembra de una placa de CLDE.
2- Incubación
a. Atmósfera. Dado que la mayoría de los patógenos urinarios son facultativos, no se utiliza
rutinariamente la siembra en medios para gérmenes anaerobios ni se realiza la incubación
en anaerobiosis. Estas condiciones se utilizan en la situación puntual en que se sospecha la
presencia de anaerobios (muy infrecuente). En este caso, la muestra debe recolectarse por
punción suprapúbica y remitirse rápidamente la jeringa sin burbujas al laboratorio. Si se
incluyen placas de agar chocolate o sangre en el esquema de siembra, se recomienda
incubarlas en atmósfera enriquecida con CO2 al 5-7% (lata con vela). Las placas de CLDE,
Levine o MacConkey se incuban en atmósfera ambiental.
b. Temperatura. Excepto en casos muy especiales de sospecha de algún tipo de micosis, la
incubación debe realizarse a 35 ± 2 °C.
c. Tiempo. Si bien existen trabajos recientes que recomiendan un tiempo de incubación de
24h y hasta de 12-16h, nosotros preferimos adoptar una posición conservadora con las
placas de agar sangre y chocolate y aconsejamos no descartarlas antes de las 48h de
incubación, especialmente cuando se trata de pacientes urópatas con sospecha de
infecciones micóticas, o bajo tratamiento antibiótico.
3-Interpretación e informe
a. Cultivo monomicrobiano. Como se ha dicho, la interpretación del cultivo debe realizarse
conjuntamente con la valoración de otros datos (ver tablas 1 y 2). En este sentido, resulta
útil recordar cuales son las posibilidades de éxito al asumir la presencia de una IU cuando
se relaciona el recuento de colonias con los síntomas.
Tabla 4. Correlación entre el recuento bacteriano y la presencia de síntomas
para la documentación de infección urinaria en adultos
Posibilidad (%) de IU con
Recuento (ufc/ml)* síntomas:*
Ausentes Presentes
80 (1
5 muestra)
95
Mujeres >10 95 (1
muestra)
4 5
5 95
Mujeres 10 - 10
3
<5 70
Mujeres 10
3 5
ND 95
Hombres 10 - >10
* Cultivo monomicrobiano
** IU, Infección urinaria: ND, no determinado.
La tabla 4 es un resumen de las conclusiones de los trabajos de mayor relevancia en lo que
respecta a los criterios de interpretación de un urocultivo monomicrobiano tomado por
chorro medio (flora única o predominio del 90% de un germen en una mezcla) en pacientes
adultos. Si bien esta tabla resulta ilustrativa, es muy probable que el microbiólogo no
cuente con los datos de los síntomas del paciente en la mayoría de los casos.
Afortunadamente, en ciertos grupos de pacientes, existe una correlación aceptable entre los
síntomas y la presencia de reacción inflamatoria en el sedimento de orina. Por lo tanto, el
microbiólogo podría inferir la presencia de síntomas en base al sedimento de orina, sólo a
los fines de adoptar un criterio de informe, y asumir para sí el término de bacteriuria
significativa (BS) en lugar del de infección urinaria. De este modo, se puede reformular la
tabla 4 y adoptar un criterio de informe en base a la propuesta de la tabla 5.
Tabla 5. Criterios de informe de un cultivo de orina monomicrobiano
en pacientes adultos
Criterio de informe según
leucocituria en el
Recuento (ufc/ml) sedimento (Nro/cpo 400X)
>5 <5
5
BS BSp
Mujeres >10
4 5
BS NM
Mujeres 10 - 10
3
BS NEG
Mujeres 10
5
BS BSp
Hombres >10
3 4
BS NEG
Hombres 10 - >10
BS, bacteriuria significativa. Informar especie y antibiograma.
BSp, probable bacteriuria significativa, informar especie, antibiograma y consignar, a modo
de observación, que llama la atención la escasa reacción inflamatoria.
NM, solicitar nueva muestra.
NEG, informar ausencia de desarrollo microbiano
En dicha tabla, la mención de BS sugiere que el informe debería incluir el recuento, el
nombre de la especie y el antibiograma. El hecho de informar al médico estos tres
elementos, expresa claramente que para el microbiólogo, desde el punto de vista del
laboratorio, el hallazgo es significativo. Es necesario enfatizar, que los criterios de informe
son difíciles de unificar y que algunos casos particulares pueden escapar a la propuesta de
la tabla 5. Esta propuesta puede extenderse a las muestras tomadas por sonda. Sin embargo,
debe recordarse que virtualmente cualquier recuento es significativo cuando se trata de
bacilos gram-negativos aislados de una punción suprapúbica. Para los cocos gram-
positivos, especialmente estafilococos, se habla de recuentos mayores de 103, puesto que
éstos podrían ser contaminantes adquiridos de piel durante el procedimiento de la punción.
En el caso de los pacientes pediátricos, resulta imperioso establecer los criterios de
interpretación en base al tipo de muestra y al sexo.
Tabla 6. Criterios de interpretación del urocultivo según
el tipo de muestra en pacientes pediátricos
Posibilidad de IU en muestra
de**:
Recuento (ufc/ml)*
>5
<5
Chorro Medio
5 BSp (1 muestra)
BS
Mujeres >10 BS (2 muestras)
4 5
NM BSp
Mujeres 10 - 10
3 4
NS NM
Mujeres 10 - 10
3
NS NS
Mujeres 10
5
BS BS
Hombres >10
4 5
BS BSp
Hombres 10 - >10
3 4
NM NM
Hombres 10 - >10
3
NS NS
Hombres <10
* Cultivo monomicrobiano
** BSp, probable bacteriuria significativa, BS, bacteriuria significativa; NS, no
significativo; NM; pedir nueva muestra
Como se muestra en la tabla 6, las posibilidades de padecer IU varían en este sentido. Con
respecto a la punción suprapúbica, se sugiere el mismo criterio que para los adultos (ver
arriba).
b. Cultivo polimicrobiano. Cuando se habla de cultivo polimicrobiano de orina, se hace
referencia a la presencia de 2 o más gérmenes, habitualmente dos, en recuentos mayores de
105 UFC/ml y en proporciones similares. El predominio de un germen en una muestra en
una proporción del 90% debe asumirse como monomicrobiano. La IU mixta, producida por
2 o más gérmenes, es extremadamente infrecuente (<0,3%) en pacientes ambulatorios no
sondados. El microbiólogo debe saber que el informe de una IU mixta infiere
inexorablemente la presencia de un factor urológico predisponente. Por otra parte, esta
infección es más prevalente en los pacientes internados sondados y en algunos enfermos
con determinadas patologías que afectan el tracto urinario. Por lo tanto, toda IU
polimicrobiana, debería documentarse con, por lo menos, 2 muestras. La ausencia de
reacción inflamatoria siempre debería
despertar la sospecha de una probable contaminación. Resumiendo, la IU polimicrobiana
significativa puede ser asumida como tal, con bajo margen de error, si se documenta una
mezcla con más de 105 UFC/ml de 2 o más gérmenes en igual proporción, en 2 muestras de
orina correctamente recolectadas, las cuales deberían mostrar además un sedimento
francamente patológico.
4- Identificación
Escapa al objetivo de esta entrega la recomendación de guías para la identificación
bacteriana. El microbiólogo debe adaptar su esquema de trabajo de acuerdo a sus
necesidades, pero sin caer en la simplificación extrema ni en la improvisación. En la
bibliografía se recomiendan algunos textos para la diseñó la tabla 7.
identificación bacteriana.
5- Antibiograma
Una vez que se ha determinado que un cultivo es significativo, el microbiólogo debe
realizar el antibiograma. Para tal fin, resulta suficiente en la mayoría de los casos, el ensayo
de difusión con discos en agar (método de Kirby-Bauer). Si bien los detalles técnicos de
este método pueden encontrarse en una variedad de libros de texto, por lo que no serán
discutidos en esta entrega, la elección de los discos no es una práctica sencilla.
Tabla 7. Antibióticos sugeridos para ensayar
con fines terapéuticos en infecciones urinarias

Antibiótico a ensayar (x) en :


DROGA Enterobacteria
BNNF Estafilococo Enterococo
A I
PEN x*
AMP x x ^ x
AMS x x x@ x
OXA x*
CTN x x ^
TMS x x x
NIT x x x x
NOR x x x x x
CIP ^ ^ ^ ^ ^
CTX x
CAZ x x
IMI x x
GEN x x x&
AMK x x
PIP x x
VAN x x

PEN, penicilina; AMP, ampicilina; AMS, aminopenicilina-sulbactama; OXA, oxacilina;


CTN, cefalotina; TMS, cotrimoxazol; NIT nitrofuranto«na; NOR, norfloxacina; CIP,
ciprofloxacina; CTX, cefotaxima o ceftriaxona; CAZ, ceftacidima; IMI, imipenem; GEN,
gentamicina; AMK, amicacina; PIP, piperacilina; VAN, vancomicina. A, ambulatorio; I,
internado, BNNF, principalmente Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii
ï Probar PEN para informar AMP y OXA para informar OXA y CTN, @ sÚlo en A.
baumannii, & con disco de alta carga, sÚlo en internados.
^ Informar AMP, CTN, y CIP de acuerdo a los resultados de PEN, OXA y NOR,
respectivamente.
La tabla 7 muestra una lista de antibióticos sugeridos para ensayar sólo con fines
terapéuticos. Por lo tanto, la tabla no incluye ciertas drogas útiles para la vigilancia de
algunos mecanismos de resistencia de importancia clínica, ni para la búsqueda de
resistencia asociada, ni para la sospecha de determinadas especies por el antibiotipo. El
microbiólogo debe recordar que lo importante es ensayar e informar los antibióticos de
elección para el tratamiento de la IU y los que sean apropiados para las distintas especies
(no informar un antibiótico frente a una especie que es naturalmente resistente al mismo).
Finalmente, se debe considerar el precio y la toxicidad de la droga. Es decir, tratar de
informar la droga más barata y menos tóxica, cuando esto sea posible. En base a estas
consideraciones se
Tinción de Gram
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram,
quienladesarrollóen1844.

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio


bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de
Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM.

Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con


calor se tiñe 1 min. con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada
durante 1 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar.

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos
distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las


diferencias constitutivas en la estructura de su pared. La pared de la célula bacteriana sirve
para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El
material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared
de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de
peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la
célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado,
contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por
una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo
10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales


de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción
de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su
funcionamiento.

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de
cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las gram positivas
como las gram negativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente
activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células
y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias
en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no
se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos
dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la
célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano).

La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo


y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más
espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que
éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las
moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de
la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules,
pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después
de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí
solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las
células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo
preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.

3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal
violeta - yodo.
El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos
organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas
veces grampositivos y otras gramnegativos.