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Urocultivo

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Un procedimiento corto
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El Urocultivo

EL urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye un método excelente para cultivar la mayor parte de microorganismos que infectan el aparato urinario. La combinación de piuria con bacteriuria considerable sugiere la presencia de una infección urinaria. UTILIDAD CLINICA: 1. Cuando los síntomas indican una posible infección urinaria como: dolor y sensación de calor al orinar, así como urgencia frecuente de orinar. 2. Cuando un paciente esta canalizado por largo tiempo, aunque no muestre síntomas de infección. 3. En mujeres embarazadas para monitorear cualquier bacteria en la orina que pueda causar algún problema al bebé. RECOLECCION DE LA MUESTRA PARA CULTIVO: PRINCIPIO GENERALES: · La muestra ideal es la primera de la mañana debido a que la cuenta bacteriana es mayor. · Se requiere de 3 a 5 ml de orina reciente en un recipiente estéril, también se puede obtener mediante una sonda uretral, suprapubica o permanencia. Las muestras para urocultivos no se toman de bolsas recolectoras de orina que forman parte del sistema de drenaje a través de una sonda. · Se lleva la orina al laboratorio y se examina lo mas pronto posible, de no ser así, la orina se puede refrigerar hasta 2hrs antes de someterla a cultivo. · En caso que el diagnostico sea de citomeglavirus, deberán mantenerse a temperatura ambiental, ya que la refrigeración destruye a los virus. · Para establecer bacteriuriua, se toman 2 muestras sucesivas del chorro medio. · Las muestras se deben de obtener antes de un tratamiento con antibióticos. · El personal de salud instruye al paciente respecto de la técnica adecuada para recolectar la muestra. · La muestra de orina se cubre y el recipiente se rotula y se incluye lo siguiente información: · Ficha de identificación, Nombre del medico, Diagnostico probable, Método de recolección, Hora en que se obtuvo la muestra, Administración de líquidos forzados o intravenosos, Administración de sustancias quimioterapeuticas especificas. TECNICAS PARA OBTENER UNA MUESTRA LIMPIA DE ORINA O DEL CHORRO MEDIO Toma de Muestras en Mujeres: La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir las mismas instrucciones en su casa. Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo siguiente: a) jabón desinfectante

b) agua hervida o agua estéril c) gasa estéril o un paño acabado de lavar d) el recipiente para tomar la muestra. Proceda primero a lavarse las manos y luego siéntese en el inodoro, lo más hacia atrás que pueda. Separe los labios genitales con una mano y mantenga los pliegues separados y proceda a asearse toda la zona genital con el jabón desinfectante. Enjuague con abundante agua estéril y luego seque bien con gasa estéril o con un paño limpio. Proceda a recoger la orina, destapando previamente el frasco SÓLO EN EL MOMENTO DE LA MICCIÓN y sin tocar con los dedos su interior, coloque la tapa con el lado plano hacia abajo. No toque el interior del recipiente o de la tapa. Empiece a orinar la poceta y recoja en el frasco, sólo la muestra del chorro del medio es decir, no debe recoger ni la primera, ni la última parte del chorro de orina. Tape muy bien el frasco y rotúlelo con su nombre. Tráigalo al Laboratorio lo más pronto posible, en un recipiente con hielo, cuidando de que no se bote el contenido. Toma de Muestras en Hombres: La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello no es posible, seguir las mismas instrucciones en su casa. Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener a la mano lo siguiente: a) jabón desinfectante b) agua hervida o agua estéril a temperatura ambiente c) gasa estéril o un paño acabado de lavar d) el recipiente para tomar la muestra. Lavarse con jabón desinfectante primero las manos y luego la cabeza del pene empezando por la abertura uretral y continúe en dirección a usted, como muestra la ilustración, previa retracción del prepucio, si no está circuncidado. Luego enjuagar bien con agua estéril o previamente hervida (a temperatura ambiente) y secar con gasa estéril. Destape el frasco recolector sólo en el momento de la micción y sin tocar con los dedos su parte interna, coloque la tapa con el lado plano hacia abajo. Comience a orinar en la poceta y recoja en el frasco sólo la muestra del chorro del medio, es decir, no debe recoger ni la primera ni la última parte del chorro de orina. Tapar bien el frasco, rotularlo con su nombre y traerlo al laboratorio lo más pronto posible, en un recipiente con hielo y cuidando de que no se bote. El examen microbiológico de una muestra de orina se denomina Urocultivo. Éste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo. A. Examen cuantitativo Método de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminación, se realiza de la siguiente manera: · Se homogeneiza la muestra mediante agitación.

· Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiológico, estériles. · Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilución al 1:100. · Se deposita 1 ml. de cada dilución en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vacía un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45°. Mediante rotación suave, se favorece la distribución homogénea de la siembra. Método de Kass · Se incuban todas las siembras a 37° durante 24 a 48 horas. Para calcular el número de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas éstas, basta multiplicar su número por la dilución respectiva para obtener la cuenta total. Método del asa calibrada. Esta estimación cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de diámetro). Después de incubar las siembras a 37° durante 24 a 48 horas, se cuenta el número de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina.

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera: · No hubo desarrollo microbiano. · Menos de 10 000 colonias por ml. · Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml. · Más de 100 000 colonias por ml. Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con más de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infección es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos. Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en

infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstrucción uretral, infecciones crónicas e infecciones por cocos gram positivos. b. Examen cualitativo El estudio cualitativo, que conduce a la identificación del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patógenas urinarias y permite la identificación de los microorganismos contaminados. Su contenido en cisteína y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carácter invasor de las colonias de Proteus. Así se facilita la identificación de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros agentes que pueden contaminar la orina. La identificación final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioquímicas y características serológicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de revivida o de reinfección. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del antibiótico. Éste último se obtiene al comparar el antibiograma de cepas aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa. * Métodos rápidos de diagnóstico. · Existen varios procedimientos prácticos y económicos para el diagnóstico rápido de infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son útiles para investigar grandes grupos de personas. Estos métodos pueden ser microscópicos, químicos o de microcultivo. · La coloración de un frotis de orina no centrifugada mediante el método de Gram constituye un índice práctico para diferenciar entre infección y contaminación urinarias. En efecto, la observación de un bacilo gram negativo por campo microscópico puede realizarse cuando la muestra contiene más de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este método, provoca resultados falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o más bacterias gram negativas por campo microscópico de sedimento urinario, aunque dicho número permita sospechar recuentos superiores a 100 000 microorganismos por ml. · Los procedimientos químicos están basados en propiedades enzimáticas de las bacterias, que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar: catalasa, reducción de nitratos, reducción de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos métodos, aunque rápidos y económicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse en propiedades metabólicas de las bacterias y no en su desarrollo y observación, y producir muchos falsos negativos.

Placas de agar McConkey y de agar CLED, donde ha crecido un Escherichia Coli en cultivo puro, con un recuento superior a 100.000 UFC/ml. (cultivo sembrado con asa calibrada de 1/1000). SIGNIFICADO CLINICO: Los siguientes microorganismos en titulación suficiente se consideran patógenos: · Escherichia coli, Enterococcos, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella, Enterobacter, algunas especie de Serratia, Mycobacterium tuberculosis, Especies de Proteus, Pseudomona aeruginosa, Estreptococco hemolitico genralmente del gurpo B, Candida albicans y otras levaduras. INTERFERENCIAS: · Pacientes que estén recibiendo líquidos forzados, la orina esta tan diluida que la cuenta de los colonias disminuye por debajo de los 105/mililitro. · La contaminación bacteriana puede provenir de: · vello peri anal, bacterias localizadas debajo del prepucio, bacterias de las secreciones vaginales, de la vulva o de la porcion distal de la uretra, bacterias provenbientyes de las manos, pies o ropa. 1- Siembra La siembra debe realizarse de la orina sin centrifugar con un ansa calibrada, lo que permitirá obtener una estimación semicuantitativa del desarrollo microbiano. Existen numerosos medios de cultivo para sembrar una muestra de orina. La elección del medio de cultivo debe contemplar la relación costo-beneficio, de modo de elegir la opción que permita la recuperación de la mayoría de los patógenos con el menor costo posible. Para tal fin, el microbiólogo debe tener en cuenta cierta información básica: i. El 70-80% de los urocultivos enviados al laboratorio resultan "negativos". ii. El 85-90% de las IU son producidas por enterobacterias. iii. De los gérmenes gram-positivos, los que se aislan con mayor frecuencia son enterococos y estafilococos. iv. El medio CLDE permite el desarrollo de bacilos gram-negativos, estafilococos y enterococos. Los medios de Levine, EMB o MacConkey permiten únicamente la recuperación de bacilos gram-negativos. La mayoría de los gérmenes (incluyendo estreptococos y corinebacterias) desarrollan en agar sangre, pero este medio no permite la recuperación de Haemophilus spp., ni neisserias patógenas (gonococos y muchas cepas de meningococos). El agar chocolate posibilita la recuperación de todos los microorganismos mencionados anteriormente. Teniendo en cuenta estos conceptos, el microbiólogo tiene varias opciones para la siembra racional de la orina. Siembra de acuerdo a la observación previa del sedimento. Este procedimiento ofrece la ventaja de cultivar el microorganismo en el medio más apropiado, tanto para su desarrollo, como para su caracterización macroscópica (aspecto de la colonia, fermentación de lactosa, tipo de hemólisis, etc), por lo que posibilita orientar con mayor certeza el esquema inicial de identificación. La desventaja es que demanda más tiempo que la siembra "a ciegas".

Uno podría entonces establecer el siguiente esquema de siembra de acuerdo al sedimento: i. Sedimento normal y ausencia de gérmenes: media placa de CLDE. ii. Sedimento patológico y ausencia de gérmenes: media placa de agar sangre o chocolate y media de CLDE, Levine o MacConkey. iii. Presencia de bacilos, independientemente del sedimento: placa entera de CLDE, Levine o MacConkey. iv. Presencia de cocos, independientemente del sedimento: placa entera de agar sangre o agar chocolate. b. Siembra "a ciegas". Esta opción es más práctica y sencilla que la anterior. Sin embargo, tiene la desventaja de la demora potencial en la recuperación o identificación del microorganismo. En la Argentina y en Europa el medio más utilizado es el CLDE. Se puede sembrar media placa, pero esto muchas veces entorpece la obtención de colonias aisladas o la visualización de mezcla de gérmenes. Se debe recordar además, que en este medio no desarrollan varias especies que pueden causar IU (corinebacterias, estreptococos y otros), por lo que un sedimento patológico sin recuperación de gérmenes, o cualquier otro elemento que sugiera IU, debe promover la resiembra de la orina en agar sangre o agar chocolate, antes de asumir la muestra como "negativa". En los EEUU se prefiere realizar la siembra inicial en agar MacConkey y agar sangre. c. Según patología de base. Si se tiene oportunidad de conocer la patología de base del paciente mediante una buena comunicación con el médico tratante, o de la solicitud expresa por escrito en forma rutinaria al recibir la muestra, se puede establecer alguna discriminación en los medios a emplear. Los urocultivos de pacientes urópatas, con malformaciones, tumores, instrumentación o traumatismos de las vías urinarias merecen la utilización de 2 medios (CLDE y agar chocolate). Para el resto de pacientes, alcanzaría sólo con la siembra de una placa de CLDE. 2- Incubación a. Atmósfera. Dado que la mayoría de los patógenos urinarios son facultativos, no se utiliza rutinariamente la siembra en medios para gérmenes anaerobios ni se realiza la incubación en anaerobiosis. Estas condiciones se utilizan en la situación puntual en que se sospecha la presencia de anaerobios (muy infrecuente). En este caso, la muestra debe recolectarse por punción suprapúbica y remitirse rápidamente la jeringa sin burbujas al laboratorio. Si se incluyen placas de agar chocolate o sangre en el esquema de siembra, se recomienda incubarlas en atmósfera enriquecida con CO2 al 5-7% (lata con vela). Las placas de CLDE, Levine o MacConkey se incuban en atmósfera ambiental. b. Temperatura. Excepto en casos muy especiales de sospecha de algún tipo de micosis, la incubación debe realizarse a 35 ± 2 °C. c. Tiempo. Si bien existen trabajos recientes que recomiendan un tiempo de incubación de 24h y hasta de 12-16h, nosotros preferimos adoptar una posición conservadora con las placas de agar sangre y chocolate y aconsejamos no descartarlas antes de las 48h de incubación, especialmente cuando se trata de pacientes urópatas con sospecha de infecciones micóticas, o bajo tratamiento antibiótico. 3-Interpretación e informe a. Cultivo monomicrobiano. Como se ha dicho, la interpretación del cultivo debe realizarse conjuntamente con la valoración de otros datos (ver tablas 1 y 2). En este sentido, resulta útil recordar cuales son las posibilidades de éxito al asumir la presencia de una IU cuando se relaciona el recuento de colonias con los síntomas.

Tabla 4. Correlación entre el recuento bacteriano y la presencia de síntomas para la documentación de infección urinaria en adultos Posibilidad (%) de IU con síntomas:* Recuento (ufc/ml)* Ausentes Presentes 80 (1 5 muestra) 95 Mujeres >10 95 (1 muestra) 4 5 5 95 Mujeres 10 - 10 3 <5 70 Mujeres 10 3 5 ND 95 Hombres 10 - >10 * Cultivo monomicrobiano ** IU, Infección urinaria: ND, no determinado. La tabla 4 es un resumen de las conclusiones de los trabajos de mayor relevancia en lo que respecta a los criterios de interpretación de un urocultivo monomicrobiano tomado por chorro medio (flora única o predominio del 90% de un germen en una mezcla) en pacientes adultos. Si bien esta tabla resulta ilustrativa, es muy probable que el microbiólogo no cuente con los datos de los síntomas del paciente en la mayoría de los casos. Afortunadamente, en ciertos grupos de pacientes, existe una correlación aceptable entre los síntomas y la presencia de reacción inflamatoria en el sedimento de orina. Por lo tanto, el microbiólogo podría inferir la presencia de síntomas en base al sedimento de orina, sólo a los fines de adoptar un criterio de informe, y asumir para sí el término de bacteriuria significativa (BS) en lugar del de infección urinaria. De este modo, se puede reformular la tabla 4 y adoptar un criterio de informe en base a la propuesta de la tabla 5. Tabla 5. Criterios de informe de un cultivo de orina monomicrobiano en pacientes adultos Criterio de informe según leucocituria en el Recuento (ufc/ml) sedimento (Nro/cpo 400X) >5 <5 5 BS BSp Mujeres >10 4 5 BS NM Mujeres 10 - 10 3 BS NEG Mujeres 10 5 BS BSp Hombres >10 3 4 BS NEG Hombres 10 - >10

BS, bacteriuria significativa. Informar especie y antibiograma. BSp, probable bacteriuria significativa, informar especie, antibiograma y consignar, a modo de observación, que llama la atención la escasa reacción inflamatoria. NM, solicitar nueva muestra. NEG, informar ausencia de desarrollo microbiano En dicha tabla, la mención de BS sugiere que el informe debería incluir el recuento, el nombre de la especie y el antibiograma. El hecho de informar al médico estos tres elementos, expresa claramente que para el microbiólogo, desde el punto de vista del laboratorio, el hallazgo es significativo. Es necesario enfatizar, que los criterios de informe son difíciles de unificar y que algunos casos particulares pueden escapar a la propuesta de la tabla 5. Esta propuesta puede extenderse a las muestras tomadas por sonda. Sin embargo, debe recordarse que virtualmente cualquier recuento es significativo cuando se trata de bacilos gram-negativos aislados de una punción suprapúbica. Para los cocos grampositivos, especialmente estafilococos, se habla de recuentos mayores de 103, puesto que éstos podrían ser contaminantes adquiridos de piel durante el procedimiento de la punción. En el caso de los pacientes pediátricos, resulta imperioso establecer los criterios de interpretación en base al tipo de muestra y al sexo. Tabla 6. Criterios de interpretación del urocultivo según el tipo de muestra en pacientes pediátricos Posibilidad de IU en muestra de**: Recuento (ufc/ml)* >5 <5 Chorro Medio 5 BSp (1 muestra) BS Mujeres >10 BS (2 muestras) 4 5 NM BSp Mujeres 10 - 10 3 4 NS NM Mujeres 10 - 10 3 NS NS Mujeres 10 5 BS BS Hombres >10 4 5 BS BSp Hombres 10 - >10 3 4 NM NM Hombres 10 - >10 3 NS NS Hombres <10 * Cultivo monomicrobiano ** BSp, probable bacteriuria significativa, BS, bacteriuria significativa; NS, no significativo; NM; pedir nueva muestra Como se muestra en la tabla 6, las posibilidades de padecer IU varían en este sentido. Con respecto a la punción suprapúbica, se sugiere el mismo criterio que para los adultos (ver arriba).

b. Cultivo polimicrobiano. Cuando se habla de cultivo polimicrobiano de orina, se hace referencia a la presencia de 2 o más gérmenes, habitualmente dos, en recuentos mayores de 105 UFC/ml y en proporciones similares. El predominio de un germen en una muestra en una proporción del 90% debe asumirse como monomicrobiano. La IU mixta, producida por 2 o más gérmenes, es extremadamente infrecuente (<0,3%) en pacientes ambulatorios no sondados. El microbiólogo debe saber que el informe de una IU mixta infiere inexorablemente la presencia de un factor urológico predisponente. Por otra parte, esta infección es más prevalente en los pacientes internados sondados y en algunos enfermos con determinadas patologías que afectan el tracto urinario. Por lo tanto, toda IU polimicrobiana, debería documentarse con, por lo menos, 2 muestras. La ausencia de reacción inflamatoria siempre debería despertar la sospecha de una probable contaminación. Resumiendo, la IU polimicrobiana significativa puede ser asumida como tal, con bajo margen de error, si se documenta una mezcla con más de 105 UFC/ml de 2 o más gérmenes en igual proporción, en 2 muestras de orina correctamente recolectadas, las cuales deberían mostrar además un sedimento francamente patológico. 4- Identificación Escapa al objetivo de esta entrega la recomendación de guías para la identificación bacteriana. El microbiólogo debe adaptar su esquema de trabajo de acuerdo a sus necesidades, pero sin caer en la simplificación extrema ni en la improvisación. En la bibliografía se recomiendan algunos textos para la diseñó la tabla 7. identificación bacteriana. 5- Antibiograma Una vez que se ha determinado que un cultivo es significativo, el microbiólogo debe realizar el antibiograma. Para tal fin, resulta suficiente en la mayoría de los casos, el ensayo de difusión con discos en agar (método de Kirby-Bauer). Si bien los detalles técnicos de este método pueden encontrarse en una variedad de libros de texto, por lo que no serán discutidos en esta entrega, la elección de los discos no es una práctica sencilla. Tabla 7. Antibióticos sugeridos para ensayar con fines terapéuticos en infecciones urinarias Antibiótico a ensayar (x) en : DROGA Enterobacteria BNNF Estafilococo Enterococo A I PEN x* AMP x x ^ x AMS x x x@ x OXA x* CTN x x ^ TMS x x x NIT x x x x NOR x x x x x CIP ^ ^ ^ ^ ^ CTX x

CAZ IMI GEN AMK PIP VAN

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PEN, penicilina; AMP, ampicilina; AMS, aminopenicilina-sulbactama; OXA, oxacilina; CTN, cefalotina; TMS, cotrimoxazol; NIT nitrofuranto«na; NOR, norfloxacina; CIP, ciprofloxacina; CTX, cefotaxima o ceftriaxona; CAZ, ceftacidima; IMI, imipenem; GEN, gentamicina; AMK, amicacina; PIP, piperacilina; VAN, vancomicina. A, ambulatorio; I, internado, BNNF, principalmente Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii ï Probar PEN para informar AMP y OXA para informar OXA y CTN, @ sÚlo en A. baumannii, & con disco de alta carga, sÚlo en internados. ^ Informar AMP, CTN, y CIP de acuerdo a los resultados de PEN, OXA y NOR, respectivamente. La tabla 7 muestra una lista de antibióticos sugeridos para ensayar sólo con fines terapéuticos. Por lo tanto, la tabla no incluye ciertas drogas útiles para la vigilancia de algunos mecanismos de resistencia de importancia clínica, ni para la búsqueda de resistencia asociada, ni para la sospecha de determinadas especies por el antibiotipo. El microbiólogo debe recordar que lo importante es ensayar e informar los antibióticos de elección para el tratamiento de la IU y los que sean apropiados para las distintas especies (no informar un antibiótico frente a una especie que es naturalmente resistente al mismo). Finalmente, se debe considerar el precio y la toxicidad de la droga. Es decir, tratar de informar la droga más barata y menos tóxica, cuando esto sea posible. En base a estas consideraciones se

Tinción de Gram
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quienladesarrollóen1844. La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM. Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min. con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram positivas y gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de su pared. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las gram positivas como las gram negativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

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