Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC

Resolución de Problemas en
HPLC:Troubleshooting
Técnicas, Consejos , y Trucos

Agilent Technologies

Page 1
 Pasos en la Resolución de Problemas
Una vez que has detectado que hay un problema!
¿Cómo lo solucionas?
•1st ¿Falló el sistema o la calibración de la muestra?
Hacer Blancos
2ndd Revisar
•2 R i ell cumplimiento
li i del
d l método
é d
– ¿ Se ha seguido el procedimiento adecuadamente?
– ¿ Son correctos los parámetros en el instrumento?
•3rd Hágase más preguntas!
– ¿Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez?
– ¿ Se ha cambiado alguna cosa?
•4th Revise TODOS los parámetros!
– Lo obvio no es siempre la causa
–¿¿Hubo más de un cambio?

Page 2
 Componentes del Sistema HPLC

Bomba
Inyector
yecto /Automuestreador
/ uto uest eado
Columna
Detector
Sistema de datos/Integrador

Los p
problemas p
pueden estar relacionados con todos los
componentes del sistema

Page 3
Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas
Column Problem Percentage of Respondents

Alta presión, fritas obstruidas 24%

Pobre reproducibilidad (formas de 16%
pico, retención)
Recuperación de muestra 14%
Perdida de resolución 13%
Inestabilidad 11%
Volumenes muertos 8.1%
Fugas, conexiones 4.8%
Rango de pH 2.0%
%
Bajo numero de platos 2.0%
Saturación de la columna 2 0%
2.0%
Cost 1.7%
Miscellaneous 15%

Page 4
 Tipos de problemas del Sistema y la Columna

A. Presión

B. Forma del Pico

C. Retención

Page 5
 Problemas de Presión

Sintomas de la columna Posibles causas

Alta - Frita obstruida
- Contaminación de la
columna
- Obstrucción en el
empaquetamiento
Baja presión - Fuga
- Flujo incorrecto

Page 6
Corrección de la sobrepresión
Determinación de la causa y corrección de una presión alta

Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema

sistema.
Comprobar la presión del sistema con y sin columna.

Si la presión con columna es alta:

• Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro)
• Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte)
• Lavar la columna
Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueado
Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular
Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón

Page 7
Obstrucción del empaquetado

Tamaño de Area Diam intersticial Porosidad de

partícula (um2) medio (um) la frita(um)
5.0 2.7 0.9 2.0
3.5 1.3 0.6 2.0
30
3.0 10
1.0 06
0.6 20
2.0
2.7 0.7 0.5 2.0
1.8 04
0.4 0.4 05
0.5
1.7 0.3 0.3 0.5

Cuidado
C id d con las l fases
f móviles
ó il tamponadas
t d
Los tampones contienen material insoluble– filtrar
La solubilidad del tampón decrece con el aumento del %
de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos
*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)

Page 8
Solubilidad del tampón

La
a Tabla
ab a I p
presenta
ese ta u
una
a est
estimación
ac ó de la
a co
concentration
ce t at o
soluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a pH 7.0)
en tres solventes orgánicos

Page 9
Solubilidad de 5 tampones en mezclas con
(a) metanol
metanol, (b) acetonitrilo
acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano

metanol
acetonitrilo THF

El trazo — representa acetato amónico a pH 5.0, •••• representa fosfato amónico

a pH 33.0,
0 --- representa fosfato potásico a pH 3
3.0,
0 –••– representa fosfato
amónico a pH 7.0, y – – representa fosfato potásico a pH 7.0.

Page 10
 Cambiar la frita puede no ser buena idea
Puede que no sea posible con columnas de nueva generación
Puede dañar columnas de alto rendimiento

Compression
Column Ferrule
Inlet Frit
Wear gloves
Do not allow bed to dry
y
Do not touch the column -
body heat will extrude packing
Column Body Do not overtighten

Female End Fitting

Male End Fitting

g

Consejo: Prevenir es mucho mejor!

Page 11
 El Truco:
Tecnicas de Prevención- La mejor elección!

• Usar protección de la columna

- Filtros en linea
- Salva columnas Fácil
• Filtrar las muestras
• Filtrar fases móviles tamponadas

• Extracción de la muestra(i.e. SPE)

No tan fácil
• Lavado apropiado de la columna

Page 12
 Limpieza de la columna
Limpiar con solventes más fuertes que la fase
móvil
Opciones de Solventes de Fase Reversa
en orden de fuerza creciente
Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas
• Fase Móvil sin sales de tampón
p
• 100% Metanol
Esto lleva tiempo, • 100% Acetonitrilo Debe
amenudo se realiza • 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol revertirse para
Offline • 100% Isopropanol Re-Equilibrar
• 100% Cloruro de Metileno*
• 100% Hexano*
Hexano

*Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con
Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa.
reversa

Page 13
Li i
Limpieza de
d lla columna–
l f
fase normall

Use al menos 50mL o 20−30

20 30 volumenes de columna para las columnas analíticas
• Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente:

Solvent Composition
Methanol:Chloroform 50:50%
Ethyl Acetate 100%

Page 14
 ¿Cuáles son los problemas más comunes
de la forma de pico?

1. Picos dividos

2. Colas en los picos (simetría <1 )

3 Picos anchos (mala resolución.

3. resolución Rs<2)

• Muchos problemas de formas de pico son combinaciones-

combinaciones i.e.
ie
ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención.

•Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el

cromátograma.

•Cada
C d uno d
de estos
t problemas
bl pueden
d ttener múltiples
últi l causas.

Page 15
 Picos dobles por perturbacion en el flujo

•Perturbación en el flujo por un volumen muerto

•La
L muestra
t fluye
fl por diferentes
dif t vias
i a través
t é de
d
la columna
•Pobre empaquetamiento
p q de las partículas
p
•El pH alto disuelva la Silice

Normal Picos
dobles
Picos dobles o partidos

Consejo: Un efecto similar se produce con una frita

parcialmente obstruida
Page 16
 Picos divididos por efectos del solvente
de inyección
Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H2O : 18% ACN
Volumen de inyección: 30 μL Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida
1

A Solvente de inyección
A. B Solvente de inyección
B.
100% Acetonitrilo Fase Móvil
2
2

0 10 0 10
Time (min) Time (min)

Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemas
en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento
Truco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil

Page 17
 Colas,
C l ensanchamiento
h i t
y perdida de eficacia

Pueden ser causadas por:

• “Interacciones secundarias” en
la Columna
• Contaminación en la Columna
• Envejecimiento
E j i i t d de lla columna
l
• Saturación de la columna
• Efectos extra columna

Page 18
 Forma del pico: Colas en los picos

Causas
Simetría > 1.2
Algunos picos con cola:
ƒ Interacciones secundarias – Efectos de
Retención
ƒ Interacciones con silanoles residuales
residuales.
ƒ Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico
mayor.
Normal Cola
Todos los picos con colas:
ƒ Efectos extra-columna.
ƒ Acumulación de contaminación en la
entrada de la columna.
ƒ Metales pesados.
ƒ Mala columna.
Normal Colas

Page 19
 Colas en los picos- Contaminación en la
Columna
Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está Dañada
Truco: Revetir la columna y analizar–Si hay mejora, una limpieza puede
ayudar-No
ayudar No hay mejora-Columna
mejora Columna Dañada y necesita ser reemplazada

Test QC despues lavado

Test QC dirección Test Q
QC dirección inversa 100% IPA,
IPA 35°C
35 C
correcta
Platos TF 3
Platos TF 3
Platos TF
3
1. 7629 2.08 1. 7448 1.06
1. 7906 1.43
2
2. 12043 1 64
1.64 2
2. 12237 1 21
1.21
2. 12443 1.21
3. 13727 1.69 3. 15366 1.11
3. 17999 1.19
4 13355 1.32 2 4 19067 1.17 2
4 17098 1.25
2

4
1
4
1 1 4

0.0 2.5 5.0 0.0 2.5 5.0 0.0 2.5 5.0

Time (min) Time (min) Time (min)

Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H2O : 80% MeOH Flujo: 1.0 mL/min
Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno

Page 20
Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting)

2000

1500

mAU
1000

500

0
0 5 10 15 20 25

Ti
Tiempo(min)
( i )
Normal Fronting
Simetría < 0.9

Causas:
ƒ Saturación de columna

Page 21
 Colas en los picos/Ensanchamiento
Efectos de carga de muestra
Columnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 mL/min
Temperatura:
T t 40°C M
Muestra:
t 1
1. D
Desipramina
i i 2
2. N
Nortriptilina
t i tili 3
3. D
Doxepina
i 4
4. IImipramina
i i 5
5. A
Amitriptilina
it i tili 6
6. T
Trimipramina
i i i

A. Alta Carga
g Ensanchamiento
Factor de Cola C
C.
x10 Platos de una C8
Eclipse XDB-C8
USP TF (5%) i

A B C D
1. 1.60 1.70 1. 850 5941
2. 2.00 1.90 2. 815 7842
0 5 10 0 5 10 3. 2776 6231
3. 1.56 1.56 Time (min) Time (min)
4. 2.13 1.70 4. 2539 8359
5. 2.15 1.86 B
B. D.
5. 2735 10022
6. 1.25 1.25 Baja Carga 6. 5189 10725

0 5
0 5 Time (min)
Time (min)

Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada

Page 22
Forma de Picos: Picos Anchos

Todos los picos ensanchan:

• Pérdida de Eficacia de la columna.
• Volumen muerto.
• Gran Volumen de Inyección.
Inyección

Algunos picos ensanchan:

• Elución tardía de una muestra previa
(Pico fantasma)
fantasma).
– Alto Peso Molecular.
– Muestra - Proteina o Polímero.

Page 23
Dispersión Extra-Columna

Aumentando el Volumen Extra-Columna

n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector y

la columna y entre la columna y el detector.

n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos están

hechas con los fittings adecuados.

n Use una celda de detector de bajo volumen.

n Inyecte pequeños volumenes de muestra.

Page 24
Consejo: Malas Conexiones en el HPLC
pueden
d Causar
C Ensanchamiento
E h i t de d Picos
Pi
El Sistema se ha optimizado y :
– Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas
– Se
S usó
ó ell di
diametro
t más
á pequeño
ñ dde ttubo
b
– Una celda de flujo de volumen adecuado
Los Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiado
Volumen Extra-Columna
¿Qué
Q é está
tá mal?
l?
¿ha hecho las conexiones adecuadamente?

Page 25
 Conectores de Columna Usados en HPLC

Troubleshooting LC Fittings
Fittings, Part II
II. J.
J WW. Dolan and P. Upchurch LC/GC Magazine 6:788 (1988)
P Upchurch.

Swagelok
g Waters
0.090 0.130
in. in.

Parker Rheodyne
0.170
0.090
in.
in.

Valco Uptight
0.080 0.090
in. in.

Page 26
¿Qué Ocurre si las conexiones no son correctas?

Incorrecto … demasiado largo

La Férrula no asienta adecuadamente

Incorrecto … demasiado corto

X Cámara de mezcla
Si la distancia X es muy larga, habrá fuga

Si la distancia X es demasiado corta, se

generará un volumen muerto o cámara de
mezcla

Page 27
 Los cambio en Retención puedes ser Químicos o
Físicos

P d estar
Pueden t causados
d por:
• Envejecimiento
j de la columna
• Contaminación de la columna
• Equilibración insuficiente
• Pobre combinación columna/fase móvil
• Cambio en la fase móvil
• Cambio en el flujo.
• Diferentes volumenes de retraso del gradiente

Page 28
 Envejecimiento
j de la fase móvil/Equilibración
q
Causan Cambios en la Retención/Selectividad
Columna 1 – Tras lavado con
Columna 1 - Inicial C l
Columna 1 – Dia
Di siguiente
i i t 1% H3PO4 /Equilibración

1 1

2 2

0 3 5 9 12 15 0 3 5 9 12 15
Time (min) Time (min)

• El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase

movil/
o / acondicionamiento
aco d c o a e to de la a co
columna
u a
• La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto
quelante de metal) resuelto por “des-activación” de la
contaminación activa del metal

Page 29
Los compuestos sensibles a los metales
pueden
d Quelarse
Q l
Pista: Busca un par solitario de Electrones en

:
:O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6
miembros con un Metal
H O

: : : :
H C O C
M +2
OH + M +2 O
H

Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros

: : :
N: M +2 C O
M +2
C N OH
: :

OH

8-hidroxiquinolina a-benzoinoxomina
Complejo Anillo de 5- Complejo Anillo de 5-
miembros miembros

Page 30
 Un lavado Acido puede mejorar la forma de
pico
i
Antes del lavado Después del lavado ácido
acido
id 50 – 100 mLs
L 1% H3PO4

HO OH -
OH
M+2
HO OH OH

1. 2. -
OH 1. 2. OH

Columnas: ZORBAX SB-Phenyl

1
4.6 x 150 mm
2
1
Fase Móvil: 75% 25 mM tampón
fosfato amónico / 25% CAN

Flujo: 1.0 mL/min.

2 Temperatura: RT
Tamaño muestra: 5 mL

Tf: 3.7 Tf: 1.2

• Se usó una solución del 1% H3PO4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse
un 0.5 % .

Page 31
 pH de la Fase Móvil y pH de tampones
¿Porqué son tan importantes en HPLC?
•El pH afecta la Ionización
– Superficie de la Silica de la Columna
– Componentes de Interés de Muestra

• Tampones
– Resisten Cambios de pH y Mantienen la Retención
– Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables

• Efectos en el tiempo de Vida de la Columna

–ppHs
s bajos liberan
be a las
as cade
cadenasas a
alquilicas
qu cas de la
a Fase
ase es
estacionaria
ac o a a
– pHs altos Disuelven la Silica
Los cambios de pH tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote

Page 32
 ¿Porqué preocuparse del pH?
pH pKa y Ácidos Débiles
pH,
[[RCOO-][H+]
RCOOH RCOO- + _
H+ Ka =
[RCOOH]
COOH COO

Ka = 6.4 x 10-5
+ H+ pKa = 4.2

A pH 4.2 – la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporción

de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre
A pH 5.2 – el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye.
A pH 3.2 – el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta.

Page 33
 Efecto del pH en la Forma de Pico
a o cerca del pKa de la Muestra
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN
Flujo: 1.0 mL/min.
/ Temperatura: RT

CH3CHCOOH

pH 4
4.4
4 pH 3
3.0
0
CH2CH(CH3)2

Ibuprofeno
pKa = 4.4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min) Time (min)

• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto
debe evitarse.
evitarse

Page 34
 ¿Porqué preocuparse del pH?
pH, pKa y Bases Débiles

R3NH+ R3N + H+ [R3N][H+]

Ka =
[R3NH+]

∅
+
CH CH
Ka = 1 x 10-99
∅
H
3 3
pKa = 9

∅
CHOCH CH N
2 2

∅
CHOCH CH N
2 2
+ H+
CH
3
CH
3

A pH 9 – la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas

en relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre
A pH
H 10 – 91% de
d la
l muestra
t es difenhidramina
dif hid i desprotonada.
d t d
A pH 8 – 91% de la muestra es difenhidramina protonada.

Page 35
pH vs. Selectivdad para Acidos y Bases
Columna: Nucleosil-C18 Columna: mBondapak-C18
Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostato Fase Móvil: 60% 25 mM tampón fostato
Muestra: Acidos Biliares 40% Metanol
1 Ácido Salicílico
1. 5
40 2. Fenobarbital
1.5 3. Fenacetin
SCD
6 4. Nicotina
5. Metamfetamina
30
1.0
UDC
5
4 SOC
logg k«

Retentioon
3 C 20
0.5
2 + 12-OC + +
J.C. 111(1975) 149
1 4
7,12 - OC +

0.0 J.C. 268(1983) 1 10 3

+
+
1
-0.5 10 2
3 4 5 6 7 8 pH 3 5 7 9
A B C ELUENT pH

•La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el pH.

pH

Page 36
 Importancia del pH y los Tampones
Un Ejemplo Práctico

•Por qué la Muestra impone las condiciones de uso

•Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad
•Qué
Q é pasa cuando
d se iignora ell ttampón
ó o se usa
inadecuadamente

Page 37
 Tampones más usados en Fase Reversa HPLC

Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)

Phosphate 2.1 1.1-3.1 200
7.2 6.2-8.2
12.3 11.3-13.3
Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210
Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210
Citrate 3.1 2.1-4.1 230
4.7 3.7-5.7
5.4 4.4-6.4
Tris 8.3 7.3-9.3 205
Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200
Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200
* Volatile buffers for LC/MS applications
La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un pH igual al pKa del tampon. La mayoría de
l tampones tienen
los i una capacidad
id d adecuada
d d de
d tamponamiento
i para controlar
l ell pH
Hdde lla ffase
movil solo en ±1 unidades de su pKa

Page 38
Importancia del pH y Tampones - Un Ejemplo Práctico
Condiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos Cardíacos

Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm

Fase Móvil: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 3 0 (1.1-3.1)
(1 1-3 1)
55% MeOH
Flujo: 2.0 mL/min.
Temperatura: 35°C
Detección: UV 254 nm
Muestra: Fármacos Cardíacos
1. Diltiazem
2. Dipyridamol
3. Nifedipina
4 Lidoflazina
4.
2
3 5. Flunarizina
5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (min)

Page 39
 No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el
pH …
Columna: StableBond SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 20% H2O
B: 80% MeOH
Flujo: 1.0 mL/min.
Temperatura: 35°C
Detección UV:254 nm
Fuertes Muestra: Fármacos Cardíacos
interacciones
secundarias
Incluso a muyy alto % MeOH La mayóría
y de
d lla muestra
de t componentes fuertemente retenidos muestran
(aminas) con pobre forma de pico debido al IEX en la
la superficie de superficie
la columna

0 5 10 15 20 25
Time (min)

• Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones.
separaciones

Page 40
¿Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón?

Columna: StableBond SB-C18

4.6 x 150 mm, 5 mm
Fase Móvil: A: 30% 25 mM NaH2PO4, pH 4.8 no tamponado
Se añadió B: 70% MeOH
Flujo: 1 0 mL/min
1.0 mL/min.
t
tampón,
ó Temperatura: 35°C
pero no Detección UV:254 nm
1 Muestra: Fármacos Cardíacos
controla el 1 Diltiazem
1.
2. Dipyridamol
pH a 4.8 Forma de Pico Inadecuada 3. Nifedipina
4. Lidoflazina
5. Flunarizina
5

3
4

0 5 10 15 20 25
Time (min)

Page 41
 No olvidar- Elegir la columna adecuada al pH de la
Fase Móvil para el Máximo Tiempo de Vida
pH Alto y Temperatura Ambiente (pH 11 RT)

Fase Móvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA

(~ pH 11, disolución de la sílica)

Inicial

Después de 30 inyecciones

Consejo: Usar las columnas diseñadas para el pH elegido

Page 42
 Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector
El Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal!
Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y
Reducir la Sensibilidad
Tiempo de Respuesta
0.1 seg
Agilent 1100 DAD
1er pico = 1.2 seg
A 20 pts/seg = 24 pts 0.2 seg Agilent 1100 WPS with ADVR
Columna: Poroshell 300SB-C18
2 1 x 75 mm
2.1 mm, 5 um
0.5 seg Fase Móvil:
A: 95% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
B: 5% H2O, 5% CAN con 0.1% TFA
1er p
pico = 1.2 seg
g Flujo: 2 mL/min
A 5 pts/seg = 6 pts 1 0 seg
1.0
Temperatura: 70°C
Detector: UV 215 nm
Embolada de Piston : 20
2.0 seg
Muestra:
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1. Neurotensina 3. Lisozima
Time (min)
2. RNasaA 4. Mioglobina

• Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos.

Page 43
Conclusiones
¾ Los problemas en Columnas HPLC más comunes son:
• Alta Presión ((Prevenir mejor
j q que curar))
• Malas Formas de Pico
• Cambio en la Retención/Selectividad
¾ A menudo estos problemas no están asociados con la columna y pueden
ser causados por el instrumento o por problemas químicos:
• pH de la Fase Móvil
• Conexiones del Instrumento
• Parámetros del Detector
• Contaminación por Metales
¾Comenzar con las pregunta correctas
• Encontrar las resp
respuesta
esta
• Las respuestas conducirán a soluciones

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