Perspectiva general del LC

y cómo solucionar
problemas diarios en el
laboratorio

Dra. Adriana Confalonieri

Directora Técnica
Centro de Alta Tecnología Analítica
Analytical Technologies

June 29, 2020

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Perspectiva general del HPLC
• El impacto de la desgasificación

June 29, 2020

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Desgasificación de la fase móvil
¿Por qué es necesaria en el HPLC ?
Los problemas más habituales que pueden haber en el análisis con HPLC
son la formación de burbujas o un mal mezclado en los solventes. Esto
puede prevenirse si se desgasifica la fase móvil.

Los desgasificadores son necesarios para eliminar los gases disueltos en el

solvente antes de que sean mezclados y comprimidos por la bomba. La
formación de burbujas ocurre especialmente si se mezcla a baja presión
con una bomba cuaternaria. Como resultado, se podrá observar una línea
de base en el detector con deriva o
ruidosa y puede ocurrir que los tiempos
de retención y áreas de los picos no
sean estables.

June 29, 2020

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Desgasificación de la fase móvil

Problemas habituales asociados con la desgasificación

Líneas de base inestables y ruidosas

• Baja precisión en el flujo de la bomba debido a cavitaciones en la
cámara del pistón
• Las burbujas de aire pasan a través del detector, resultando en picos
falsos
• Las burbujas de aire que viajan a través de la fáse móvil, pueden
contribuir a la formación de volúmenes muertos dentro de la columna.

June 29, 2020

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Desgasificación de la fase móvil
Técnicas de desgasificación
Las formas más usadas para desgasificar las fases móviles del
HPLC son:

• Purga con helio

• Desgasificación al vacío
• Sonicado

• Como el desgasificador al vacío en línea se ofrece en la mayoría de los

sistemas comerciales disponibles, la sonicación en combinación con
la desgasificación online, brinda resultados satisfactorios

June 29, 2020

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Mantenimiento por el usuario
• Cuidado de la columna y el proceso de limpieza
• Contaminación del HPLC

June 29, 2020

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Limpieza de la columna

Tips para la limpieza de la columna:

• Lave con solventes más fuertes que su fase móvil.

• Asegúrese que el detector se encuentra fuera de la
trayectoria del flujo.
• No añada un solvente orgánico directamente a un buffer, ya
que esto puede causar que precipiten las sales del buffer y
provoque mayor contrapresión.
• Investigue el tipo de fase móvil y de muestras utilizadas .

June 29, 2020

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Limpieza de la columna

Lave con solventes más fuertes que su fase móvil.

Elecciones de solventes de fase reversa

en orden de su fuerza de elución
Use por lo menos 25 mL de cada solvente en las columnas analíticas

Fase móvil sin sales buffer

100% metanol
Este tiempo en general 100% acetonitrilo Debe darse
se consume en forma vuelta para
75% ACN:25% isopropanol re
offline 100% isopropanol equilibrarse
100% cloruro de metileno*
100% hexano*

*Tip: cuando use ya sea hexano o cloruro de metileno, la columna debe

lavarse con isopropanol antes de volver a su fase reversa

June 29, 2020

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Limpieza de la columna

Cómo hacer el lavado de la columna:

• Quite la columna del sistema, y conecte la salida en el tubo que

sale de la bomba.

• No conecte su columa al detector cuando realice el lavado. En su

lugar, coloque el extremo de la entrada dentro de un vaso de
precipitados para capturar el solvente o el agua.

• No utilice un flujo alto. Empiece con un flujo bajo y aumente

lentamente el flujo según lo requiera para expulsar las partículas.

June 29, 2020

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El truco:
Técnicas de prevención – ¡Una mejor opción!!

• Use columnas de protección

• Filtros en línea
• Guarda columnas Fáciles
• Filtrar las muestras
• Filtrar las fases móviles

• Limpieza de la muestra (ej: SPE) Difíciles

• Lavado de la columna entre
cada corrida con solvente fuerte

June 29, 2020

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Filtros baratos previenen que se tape la frita de la
columna
Celulosa regenerada (RC) Recomendada
•Membrana hidrofílica universal,
compatible con la mayoría de los solventes
– acuosos y orgánicos
•Alta pureza, extremadamente bajo
contendio de extractables
•Superficie más uniforme

Filtros en línea de Uso y reemplazo fácil

Fritas disponibles de porosidad 0,2, 0,5 y 2,0μ
Mucho más barato que una columna
Más fácil y rápido de reemplazar que la frita de la
columna
June 29, 2020
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Contaminación del LC

Lavado exhaustivo

Si el sistema está contaminado y/o ha estado apagado por un

período largo de tiempo, tal vez necesite un lavado profundo. Con
un capilar de restricción en lugar de la columna, corra un solvente de
lavado a un flujo bajo (0,5 mL/min). Agilent recomienda una
composición 50:20:15:15 IPA:ACN:H2O:MeCl2 y ofrece el producto
G1969-85026 (500 mL). Luego de esto, lave con IPA por 40 min,
más tarde con 50:50 de MeOH/agua por otros 30 minutos. El
sistema debería estar limpio y listo para ser purgado con su fase
móvil de trabajo.

Bomba→Compartimiento de columna (@75°C)→

Capilar de restricción→ALS→Detector→Descarte

June 29, 2020

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Contaminación del LC

Crecimiento microbiano: - Depósitos en las válvulas de

bola, de entrada o de salida,
resultando en un flujo inestable o
- Elimínelo lavando el sistema con
fallas totales en la bomba
un solvente orgánico
- Taponamiento de los poros
- Crece inmediatamente en Fase
pequeños de los filtros en la
móvil acuosa
entrada del solvent
- Favorecido por la luz
- Taponamiento de los filtros de la
- Inhibido por solventes orgánicos columna obteniendo una presión
y algunos aditivos (azida de alta en el sistema
sodio)
- Las ventanas de la celda del
detector se ensucian, dando
mayor ruido

June 29, 2020

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Contaminación en el LC

Contaminación del Acetonitrilo

- Un acetonitrilo envejecido o de mala calidad puede dejar residuos que se

unen a los componentes del LC
- Puede comprometer el rendimiento de la bomba en el canal orgánico (B)

Incluso el mayor grado de calidad de solvent puede incluír polímeros u

otras micro partículas.
Los polímeros construyen capas pegajosas sobre la bola y el asiento
de las válvulas por lo que disminuye su tiempo de vida útil.
Una forma de limpiar la polimerización del ACN en los componentes
del sistema, es lavando el sistema con 50:50 Agua:MeOH

June 29, 2020

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Contaminación del LC

Precipitación del Buffer/Sales:

- Sea consciente de la miscibilidad
- Se previene fácilmente lavando con agua pura
- Se mejorará la vida útil del pistón de la bomba si se usa el lavador
de sellos
- Cualquier sistema que use una fase móvil acuosa con sólo agua y
buffer, debería lavarse con agua y con por lo menos un 15% de
MeOH o IPA. La efectividad de este lavado con agua puede
aumentarse si se usa agua caliente y si se reemplaza la columna
por un capilar de restricción
¿

June 29, 2020

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Recomendaciones
Solventes
Usar solo solventes de grado HPLC
Físico – particulados, el acetonitrilo envejecido es “pegajoso”
Químico – Un background de UV alto y Ruidoso, especialmente a
bajas longitudes de onda
Se recomienda la filtración para los buffers. Asegúrese que el
material del filtro es compatible.

Botellas
Minimizar el rellenado de los solventes
Las botellas debería cambiarse y limpiarse durante la semana
Mire si hay crecimiento microbiano
Use filtros en la entrada del solvente 5043-1218
Tapa segura A-Line
2 puertos 1 válvula de ventilación

June 29, 2020

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Recomendaciones

Limpieza de los filtros de entrada del

solvente
Los filtros de vidrio pueden romperse si no se usan
recipientes de plástico durante el sonicado

5041-2168
Los filtros de acero inoxidable pueden
01018-60025
sonicarse
Lavado del sistema y cómo se deja en tiempos largos
Se recoienda la limpieza con Isopropanol y dejarlo en este solvente
Todas las sales deberían lavarse con agua antes de introducer el isopropanol
Asegúrese de lavar cada cámara del desgasificador
Limpie las sales del sensor de pérdidas si las observa

June 29, 2020

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Solución de problemas
• Problemas de presión
• Problemas en la forma del pico
• Platos teóricos
• Respuestas bajas (área / altura)
• Picos desconocidos
• Problemas en los tiempos de retención

June 29, 2020

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 Pasos a seguir para solucionar problemas
¡Ha reconocido que hay un problema!
¿Cómo lo arregla?
•1 ¿Hizo un test de Adecuación de sistema ?
•2 Revise el método para ver si se cumple
– ¿El procedimiento se está siguiendo apropiadamente?
– ¿La configuración del instrumento es correcta?
•3 ¡Hágase más preguntas!
–¿Cuándo fue la última vez que funcionó correctamente el
sistema?
– ¿Cambió algo?
•4 ¡Revise todos los parámetros!
– Lo obvio no siempre es la causa del problema
–¿Hubo más de un cambio?
June 29, 2020
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Componentes del HPLC

• Bomba
• Inyector/Autosampler
• Columna
• Detector
• Sistema de datos/Integrador

Los problemas pueden relacionarse a todos los componentes

del sistema

June 29, 2020

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Problemas de presión
Identifying/Resolving Repair Issues
Presión alta

Consideraciones
- ¿Cuál es la presión esperada para el método/columna utilizada?
- ¿La presión está siguiendo una tendencia? (use los datos viejos para
determinarlo)

Solucionar los problemas

- Module el sistema para encontrar la Fuente de la presión alta
- 1-Abra la valvula de purga
- 2-Quite la columna
- 3-Rastree la contribución de la presión para cada
módulo/componente del LC
June 29, 2020
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Problemas de presión
Identifying/Resolving Repair Issues
Presión alta

High Pressure
Fuentes comunes de presión alta
- Frita de la válvula de purga
- Asiento de la aguja del inyector automático
- Columna

Cómo desbloquear el asiento de la aguja

- Use la función ‘change needle/seat’ en el menú de mantenimiento
del ALS
- Quite el asiento de la aguja , y cambielo

June 29, 2020

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Determinar la causa y corregirla
Contrapresión muy alta
• Mire la presión con y sin columna – muchos problemas de presión son
debidos a bloqueos en el sistema o en el guarda columna.
•Quite la columna - ¿La presión sigue alta?
•Quite el guarda columna – ¿La presión sigue alta?
•Si la presión es alta:
• Haga un lavado en la columna – Se Limpia la superficie “sucia” de la frita
– Se elimina contaminación de la columna por
– Compuestos adsorbidos de alto peso molecular,
– Precipitados de la muestra o de buffer
- Compuestos muy retenidos

June 29, 2020

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Problemas de presión
Identifying/Resolving Repair Issues
Presión baja
Consideraciones
- ¿Conexiones apropiadas?

Fuentes comunes de presión baja

- Pérdidas
- Flujo incorrecto
- Válvula de purga abierta

Solución de problemas
- Inspeccione que no hayan pérdidas en ningún módulo
- Revise las conexiones

June 29, 2020

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Problemas con la forma del pico

¿Cuáles son los problemas habituales en la forma del pico?

1. Picos partidos
2. Picos con cola
3. Picos anchos

• Muchos problemas con la forma del pico, son

combinaciones de varios problemas - ej. ¿son picos anchos
y con cola o anchos con tiempo de retención mayor?
• Los síntomas no afectan necesariamente a todos los picos
del cromatograma
• Cada uno de estos problemas tiene múltiples causas
June 29, 2020
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Los picos se parten porque el camino de la
muestra se ve interrumpido por el volumen muerto
• Camino del flujo interrumpido por el volumen
muerto
• La muestra puede fluir por distintos caminos
dentro de la columna
• El relleno poco empacado se asienta con el uso
• un pH alto disuelve la sílice

Picos
dobles
Partición o picos dobles

Tip: Un efecto similar puede ser causado por una frita

parcialmente obstruída
June 29, 2020
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Partición de picos por contaminación en la
columna

Inyección 1 luego del

Inyección 1 Inyección 30 lavado con 100% de
ACN

Tip: el lavado de la columna elimina la división del pico, que resulta de un

contaminante en la columna. ¿Cómo puede pevenirse? (guarda columna, limpieza de
la muestra con SPE, lavar la columna en forma periódica)

June 29, 2020

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División de los picos por efectos del solvente de
inyección

A. Solvente de
inyección: 100% B. Solvente de
Acetonitrilo inyección: Fase móvil

Tip: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede causar problemas
en la forma del pico como división o ensanchamiento.
Truco: Mantenga la concentración orgánica en el solvente de la muestra ≤ Fase
móvil

June 29, 2020

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Cola en el pico, ensanchamiento y pérdida de
eficiencia
Puede ser causado por:

• “interacciones secundarias” en la columna

• Contaminación de la columna
• Envejecimiento de la columna
• Carga de la columna
• Efectos extra-columnares

June 29, 2020

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Forma del pico: Picos con cola

Simetría > 1,2 Causas

Algunos picos con cola
• Efectos secundarios – de retención
• Interacciones de silanol residuales
• Picos de elución pequeños en la
cola de picos grandes
Con cola

Todos los picos con cola

• Efectos extra columnares
• Contaminación en la entrada de la
columna
• Metales pesados
Con cola • Columna dañada

June 29, 2020

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Picos con cola
Identificar las “interacciones secundarias” en la
columna

Sin TEA

Tip: el modificador de la fase móvil (TEA) compite con la muestra por los
sitios de intercambio iónicos en la superficie a pH intermedios

June 29, 2020

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Picos con cola
El pH bajo minimiza las “interacciones secundarias”
de las aminas

Tip: reducir el pH de la fase móvil reduce las interacciones con silanoles y los
picos con cola.

June 29, 2020

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Picos con cola – Contaminación en la columna
Tip: Prueba rápida para determinar si la columna está sucia o dañada
Truco: Ponga la columna al revés y corra la muestra –Si mejora, posiblemente
una limpieza ayudará
-No mejora→La columna está dañada y debe reemplazarse
Prueba QC en Prueba QC en dirección Prueba QC luego de limpiar
dirección normal inversa con 100% IPA, 35°C

June 29, 2020

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Forma del pico: Picos con frente

Con frente
Simetría < 0,9

Causas
• Columna saturada

June 29, 2020

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Efectos de picos con cola/mucha carga de
muestra (ensanchamiento)

Con mucha carga Ensanchados

Con cola
Platos
x10 competitivos C8

Baja carga

Tip: Evalúe ambos volúmenes y la masa inyectada

June 29, 2020

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Forma del pico: Picos anchos

Todos los picos son anchos:

• Pérdida de eficiencia en la
columna.
• Columna vacía.
• Volumen de inyección muy grande.

Algunos picos anchos:

• Elución tardía de una muestra
anterior (pico fantasma).
– Peso molecular grande.
– Muestra – Proteína o polímero.

June 29, 2020

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Tip: Conexiones del HPLC mal hechas pueden
causar picos anchos
El sistema fue optimizado y:

– Los largos de los capilares son mínimos

– Se usa el diámetro más chico
– Se utiliza una celda con volumen apropiado

¿Qué está mal?

¿Hizo las conexiones en forma apropiada?

June 29, 2020

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Platos teóricos

Los platos teóricos son proporcionales al cuadrado de la

relación del tiempo de retención y del ancho del pico.
Tip:
Eficiencia de la columna
Si los platos teóricos
calculados para el pico son • Platos teóricos:
excesivamente bajos
podría indicar un pico
“fantasma”. El pico ancho
es proporcional al tiempo El ancho del pico es
de retención, por lo que proporcional al tiempo de
picos inusualmente anchos retención:
en el medio de picos
mucho más angostos,
suelen ser picos de
corridas anteriores.

June 29, 2020

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Baja respuesta en los picos (área / altura)
El problema de la variabilidad de la altura/área del pico
(irreproducible) es muy común y es algo complejo de solucionar, ya
que hay muchas causas posibles.
Si los picos son todos bajos a lo largo del cromatograma en
múltiples analitos:

Algunas razones posibles podrían ser:

1. Error en los cálculos/diluciones
2. El volumen de inyección no está bien medido
3. El volumen de inyección se pierde parcialmente por alguna
pérdida
4. Ensanchamiento del pico
5. El detector necesita un mantenimiento
June 29, 2020
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Baja respuesta en el pico (área/altura)
Error de cálculo/dilución
Este es uno de los problemas más comunes y fáciles para resolver, también
suele ser lo menos sospechado.

Observe si encuentra una relación exacta del error, como puede ser
resultados que están cercanos a exactamente 50% menos (la mitad).

Trate de buscar a alguien que no haya estado involucrado en su proyecto,

que prepare su estándar o haga los cálculos iniciales para ver si obtiene un
resultado diferente.

¡Este puede ser un caso clásico de la visión en un túnel!

June 29, 2020

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Respuesta baja en picos (área / altura)
El volumen de inyección se está midiendo incorrectamente
Esto depende de cuán específica sea la configuración del inyector y del
sistema.
Esto podría ocurrir por:

a. Un programa incorrecto en el volumen de inyección

b. Un tamaño incorrecto en el tamaño de la jeringa, en el loop de la
muestra o un volúmen inadecuado de la muestra cargada en el inyector.
c. No funciona bien la valvula del muestreador o el dispositivo de
medición.

June 29, 2020

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Baja respuesta en los picos (área / altura)
El volumen de inyección se pierde parcialmente por una
pérdida
Esto podría ocurrir en cualquiera de los siguientes sitios:

a. Pérdida en el inyector por conexiones o capilares o debido a un mal

funcionamiento/pérdida de la válvula de inyección de la muestra.
Un problema de este tipo podría dar resultados muy variables

a. Pérdidas aguas abajo de la válvula del inyector- Si tiene una pérdida

muy grande entre la válvula y el detector, ya sea antes o después de la
columna, puede resultar en una baja respuesta. Si la pérdida es antes
de la columna, la presión de su sistema también bajará. Si la pérdida es
después de la columna o en el detector, verá alteraciones en la línea de
base, como si tuviera burbujas en el sistema.

June 29, 2020

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Baja respuesta en los picos (área / altura)
Ensanchamiento del pico

Cuando los picos se ensanchan, la altura disminuye.

Los picos muy anchos serán más difíciles de integrar en forma
apropiada.

Trate de comparar las áreas de sus picos en vez de las alturas y

vea si esto explica lo que observa.

June 29, 2020

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Baja respuesta en el pico (área / altura)
El detector necesita mantenimiento
La lámpara del detector podría estar cercana al final de su vida
útil y debe reemplazarse.

Si la línea de base o el background es alto, la celda puede

estar contaminada y debe limpiarse.
Estos problemas usualmente están acompañados también de
derivas y/o ruido en la línea de base y disminución constante
en la respuesta a lo largo del tiempo.

June 29, 2020

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Picos desconocidos “fantasmas”

Picos fantasmas:
- Son picos que aparecen incluso cuando no se inyecta la
muestra

Pueden aparecer por distintos motivos:

• La elución de analitos retenidos de la anterior inyección

• Contaminación en la fase móvil
• Preparación de la muestra
• Contaminación en el sistema
• Contaminación en la columna

June 29, 2020

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Picos desconocidos “fantasmas”
Elución de analitos retenidos de inyecciones anteriores

Muestra 2: Maleato de clorferamina

Muestra 1: Maleato de clorferamina
y pseudoefedrina
Pico 1: maleato
Pico 1: maleato
Pico 2: pseudoefedrina
Pico 3: clorfenilamina (de la
primera inyección)
Platos

Pico “Fantasma” de
la primera inyección

Tip: Platos extremadamente bajos para picos moderadamente retenidos son

una indicación de que hay un pico que eluyó tardíamente en la corrida anterior
June 29, 2020
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Picos desconocidos “fantasmas”
Contaminación en la fase móvil

Determinar que los picos fantasmas provienen de una contaminación en

la fase móvil
Una forma para determinar que los
picos fantasmas provienen de una La contaminación ese impactada por el
contaminación en la fase móvil: tiempo de equilibrio

• Modifique el gradiente y observe

su línea de base durante el re-
equilibrio.
• Cuanto más tiempo de equilibrio
tenga, mayor tiempo podrán
acumularse los contaminantes en
la columna

June 29, 2020

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Problemas en el tiempo de retención
Cambios en la retención – Misma columna, a lo largo
del tiempo:
Puede ser causado por:
- Envejecimiento de la columna
- Contaminación en la columna
- No se alcanzó el equilibrio
- Combinación de una mala columna y fase móvil
- Cambios en la fase móvil (se evaporó el TFA/desgasificado de
MP)
- Cambio en el flujo
- Otros problemas en el instrumento
June 29, 2020
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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar? ….
Flujo:
Bajo algunas condiciones en la configuración del HPLC los componentes
eluyen en un volumen fijo no en un tiempo fijo. Si podemos asumir que el flujo
es constante, entonces podemos tener el mismo tiempo de retención.
Por lo que si el tiempo de retención varía en todos los picos, lo primero que
tienen que mirar es el flujo.

Cómo solucionarlo:
• Mida el flujo del solvente que va al descarte usando una pequeña probeta
• También observe la contrapresión. A un flujo dado del solvente a través de
la columna a una temperature dada, se genera una contrapresión
constante, por lo tanto si la contrapresión cambia también lo hace el flujo.

Flujo bajo = tiempos de retención mayores. Primero sospeche de una pérdida o de

una burbuja de aire.
June 29, 2020
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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
%B:
La concentración del modificador orgánico en el eluyente (%B) tiene un efecto
mercado en el tiempo de retención.
Por lo que si el tiempo de retención cambia, verifique el %B (ej: para un
eluyente de agua:metanol 50:50, %B = metanol, debería ser 50%).

Esto podría cambiar por el método usado para mezclar o porque la relación
cambió desde que se hizo esta dilución.

Solución del problema:

• Si duda del eluyente, prepare una solución nueva, midiendo cada solvente
en forma separada y luego mézclelas.
Evite solventes viejos, botellas que estén cerca de una ventana donde le dé el
sol y desgasifique al vacío los eluyentes pre-mezclados.
June 29, 2020
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Problemas con el tiempo de retención
Un ejemplo práctico...
Distintas fases móviles pueden
brindar distinta selectividad

Anisol
Fenetanol
p-F-Fenetanol
Tolueno

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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
pH :

Cambiar el pH de la solución buffer puede afectar los tiempos de retención.

Verificar esta parte de la validación del método, pero en algunos casos los
tiempos de retención varían con el pH. Tenga en mente que el rango de pH
de la columna es 2<pH<7.

Concentración del Buffer (incluyendo la concentración

ácida para la supresión de iones):
Los tiempos de elución son afectados en la mayoría de los casos por la
concentración de buffers.
Agunas veces en los casos de buffers débiles, la concentración de buffer es
demasiado baja como para mantener el pH, pero hay que evitar
concentraciones altas (>0,1M) siempre que se pueda.
June 29, 2020
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Problemas en el tiempo de retención
Un ejemplo práctico...

Efecto del pH en la retención

June 29, 2020

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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
Envejecimiento de la columna (Degradación de la fase
estacionaria):
Si el pH baja 2 unidades, la fase unida puede despojarse de la fase
estacionaria.
Esto aplica para la mayoría de las columnas que utilizan uniones del tipo
siloxano Si-O-Si para unirse en forma covalente a la fase unida. La unión se
hidroliza a pH menor a 2, cambiando la columna, gradualmente, a una
columna de sílice.
En esta situación verá un cambio gradual pero irreversible en los tiempos
de retención.

Cómo solucionarlo:
• Pruebe con otra columna y anote el número de lote

June 29, 2020

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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
Burbujas de aire:

Si hay aire en la cámara del pistón o en la válvula check de la bomba, el

flujo disminuye, en general de forma irreproducible.
Esto lleva a tener tiempos de retención mayores y variables.

Cómo solucionarlos:
• Inspeccione si hay contrapresión fluctuando (para confirmar la presencia
de burbujas de aire)
• Purgue el sistema
• Compruebe el rendimiento del instrumento

June 29, 2020

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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
Pérdidas:

Si hay una pérdida, una parte del flujo se desvía del sistema y el flujo a
través de la columna se reduce.
Por lo que el tiempo de retención aumenta.
.

Cómo solucionarlo:
• Revise las conexiones (pruebe poner un pequeño trozo de papel
alrededor de las conexiones críticas)
• Coloque la columna otra vez

June 29, 2020

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Problemas en el tiempo de retención
¿Dónde mirar...?
Temperatura:

La mayoría de las separaciones son dependientes de la temperatura.

Algunas son más rápidas y más reproducibles a temperaturas elevadas,

pero para algunos picos la temperatura es específica para su resolución.

Entonces, si el tiempo de retención cambia, verifique que el calentador de

la columna está configurado a la temperatura correcta.

June 29, 2020

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Permitidos y prohibidos en HPLC

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√ Use fase móvil acuosa en los canales A y D.
√ Use fase móvil orgánica en los canales B y C.
√ Siempre aumente el flujo a un máximo de 0,1 mL/min cuando conecte la columna.
√ Desgasifique y filtre (0,2 o 0,45 um) todas las fases móviles, incluyendo al acetonitrilo.
X Limpie pero no sonique los filtros en línea de vidrio una vez por semana con agua e IPA.
√ Use fases móviles acuosas y acetonitrilo en botellas color ámbar.
√ Inspeccione que no hayan depósitos de buffer y límpielos con agua.
√ Realice un lavado con agua caliente una vez por semana.
√ Lave la columna y el sistema al finalizar el análisis.
X No deje fases móviles acuosas por más de 2-3 días.
√ Lave cada canal por lo menos por 5 minutos cuando se introduce una fase móvil.
√ Siempre cierre el comp. de columna, durente el análisis.
√ Use el vial de lavado para todas las muestras y no le ponga septum a la tapa.
√ Minimice la velocidad de toma de muestra en muestras viscosas.
√ Llene los viales solo hasta el cuello/marca del vial.
√ Seleccione un ancho de pico apropiados, en el caso del PDA: Bandwidth > slitwidth
√ Siempre use longitudes de 90mm length 0,17mm id. SS en la entrada a la columna

June 29, 2020

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X No almacene solventes acuosos sin flujo por más de un día.
√ Reemplace la frita si la contrapresión es muy alta con la válvula abierta.
√ Siempre use capilares con largos estándares en el sistema.
√ Todos los capilares tienen un Código de colores que especifican su DI.
X No reemplace un capilar de SS en lugar del loop,éste no estará calibrado.
√ Use tuercas de PEEK hasta 200 bares y después utilice SS.
√ Ponga las columnas largas (25 a 30cm) en el peltier inferior.
√ Desconecte la celda durante el lavado del sistema y de la columna.
X No pase flujos muy altas sin la columna ya que los gaskets podrían perder al tener una presión
alta.
X No corte/acorte la salida del tubo, es esencial para mantener una contrapresión suficiente en la
celda.
Inspeccione las pérdidas de sensores, si están negros, apáguelo y déjelo enfriar con agua,
√ séquelos y vuelva a prenderlos.

√ Siempre prefiera un stroke automático.

√ Siempre use la presión máxima de trabajo de la columna como presión máxima en el método.
√ Evite shocks mecánicos en las columnas porque puede distorsionar la fase estacionaria.
X No coloque una columna en un horno caliente sin flujo.

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¡Muchas gracias!

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