FARMACOLOGIA EXPO 1

Modelado de farmacocinética y farmacodinámica de corticosteroides - I: determinación y predicción de la

unión de tejidos con dexametasona y metilprednisolona en la rata

Resumen
Las propiedades de unión a plasma y tejido de dos corticosteroides, dexametasona (DEX) y metilprednisolona (MPL),
se evaluaron en la rata en previsión de desarrollar modelos de PBPK y PK / PD. Los coeficientes de partición de
tejido-a plasma (K P ) de DEX y MPL se determinó en el hígado, músculo y pulmón in vivo después de la infusión en
estado estacionario y la inyección en bolo en ratas. Dado que K P a menudo se rige por la unión reversible a
macromoléculas en sangre y tejido, se hizo un intento de evaluar los valores de K P de DEX y MPL mediante estudios
de unión in vitro utilizando homogeneizados de tejido de rata y comparar estas estimaciones con las obtenidas
de la cinética in vivo después de la dosificación El K P de ambos esteroides también se predijeron en tejidos de ratas
usando ecuaciones mecánicas basadas en la composición del tejido y se compararon. La unión plasmática de DEX y
MPL fue lineal con unión moderada (60.5 y 82.5%) en ratas macho y hembra. In vivo estimaciones de captación de
esteroides aparecieron lineal a través de las concentraciones ensayadas y K P fue más alta en el hígado y el más
bajo en el músculo para ambos esteroides. La evaluación de la unión hepática de MPL in vitro se vio gravemente
afectada por la pérdida de fármaco a 37 ° C en homogeneizados de hígado masculino, mientras que DEX fue estable
tanto en homogeneizados de hígado masculinos como femeninos. Con la excepción de MPL en el hígado, in
vitro derivada de K P estimaciones razonablemente de acuerdo con in vivo valores. Las ecuaciones mecanicistas
modestamente predijeron K P para ambas drogas. El metabolismo de los tejidos, la unión de tejidos saturables y la
captación activa son posibles factores que pueden complicar las evaluaciones de la unión de esteroides a los
tejidos in vivo cuando se usan homogeneizados de tejidos.

DECLARACIÓN DE IMPORTANCIA Suponiendo la hipótesis de la hormona libre, la proporción de la fracción de

fármaco libre en el plasma (fu, p) y en los tejidos (fu, t) define el coeficiente de partición de tejido a plasma (KP), un
parámetro importante en la farmacocinética de base fisiológica ( PBPK) que determina las concentraciones totales de
drogas dentro de los tejidos y el volumen de distribución en estado estacionario. Este estudio evaluó las propiedades
de unión a plasma y tejido de los corticosteroides sintéticos, dexametasona y metilprednisolona en ratas utilizando
técnicas de ultrafiltración y homogeneización de tejidos. Se evaluó la extrapolación in vitro-in vivo e in silico-in vivo de
KP para ambos fármacos en hígado, músculo y pulmón. Aunque bastante exitoso en todos los tejidos, los estudios de
homogeneización in vitro subestimaron severamente el KP de metilprednisolona en el hígado, en parte atribuible al
extenso metabolismo hepático.

Introducción
Las drogas interactúan con proteínas y otras macromoléculas en los fluidos y tejidos corporales. Dichas interacciones
de unión influyen en la farmacocinética y farmacodinámica de los fármacos. La unión a proteínas transportadoras,
transportadores y enzimas específicos puede influir en la captación y el metabolismo de los tejidos, mientras que la
unión de alta afinidad a los receptores, en algunos casos, influye en la captación de los tejidos (Levy, 1994), y es
fundamental para provocar respuestas farmacológicas. Una porción apreciable de la droga en el cuerpo puede
interactuar reversiblemente con proteínas y constituyentes celulares de una manera no específica. Dicha unión no
específica es un determinante importante de la distribución del fármaco en el cuerpo y, por lo tanto, juega un papel
importante en la farmacocinética. La ecuación de Gillette con base fisiológica (Gillette, 1971) caracteriza los efectos
del tamaño corporal y la unión del plasma y el tejido en el volumen de distribución en estado estacionario (𝑉𝑠𝑠):

Donde 𝑉𝑝 es el volumen plasmático, 𝑉𝑇i representa los volúmenes de tejidos específicos, y 𝑓𝑢p, y 𝑓𝑢t, son las
fracciones del fármaco no unido en plasma y en tejidos específicos (se supone que son parámetros independientes
de la concentración). El 𝑉𝑠𝑠, junto con el aclaramiento, influye en aspectos importantes de la farmacocinética, incluido
el tiempo medio de residencia (MRT) y las concentraciones tisulares totales. Las simulaciones y la evidencia
experimental limitada sugieren una mayor influencia de la unión del tejido en la vida media en comparación con la
unión al plasma (Craig y Welling, 1977; Kurz y Fichtl, 1983). La relación de 𝑓𝑢p y 𝑓𝑢t, define el coeficiente de
partición de tejido a plasma (Kp), un parámetro importante utilizado en el modelado farmacocinético basado en
fisiología (PBPK).
Si bien las concentraciones de fármaco no unidas en plasma se pueden evaluar fácilmente, el estudio de la unión de
tejidos se complica por factores metodológicos como el aislamiento de tejidos, el procesamiento de muestras, el
sistema experimental y la separación de fármacos unidos versus libres. Se han desarrollado enfoques
computacionales basados en la composición de tejidos, in vivo e in vitro. Los métodos in vivo miden la absorción de
drogas en los tejidos una vez que se ha establecido un estado estable entre el plasma y los espacios de tejido
equilibrado. El fármaco en el tejido, en exceso del que se difunde en el agua del tejido, se considera unido a los
constituyentes celulares en ausencia de metabolismo, transporte activo y efectos de ionización (Khalafallah y Jusko,
1984a).
Como se revisó extensamente (Fichtl et al., 1991; Pacifici y Viani, 1992), la unión de tejidos puede estudiarse ex vivo
usando órganos perfundidos, cortes de tejido y homogeneizados de tejido. Los órganos como el hígado, los riñones y
los pulmones se pueden aislar y evaluar la unión del tejido midiendo la concentración en el estado estacionario en el
tejido y la concentración libre en el perfundido. Sin embargo, la duración limitada de la viabilidad de los órganos
puede limitar este enfoque en los estudios vinculantes. Las rodajas de tejido incubadas ofrecen la ventaja de ser
técnicamente simples y pueden aplicarse a la mayoría de los tejidos. Sin embargo, de forma similar a los órganos
perfundidos, la absorción neta del fármaco en rodajas puede representar la suma de varios procesos (transporte,
metabolismo y atrapamiento lisosómico), incluida la unión. Los homogeneizados de tejidos se han aplicado con éxito
para generar datos de unión para numerosos fármacos en diversos tejidos (Lin et al., 1982; Fichtl et al., 1991;
Kalvass et al., 2007; Berry et al., 2010). Las ventajas de este método incluyen su simplicidad, aplicabilidad en la
mayoría de los tejidos, y los resultados obtenidos por esta técnica no se ven distorsionados por la posible absorción
activa en las células (Fichtl et al., 1991). Sin embargo, las limitaciones incluyen la necesidad de dilución y
homogeneización de tejidos, lo que altera la arquitectura celular y puede alterar las características de unión del tejido.

Enfoques mecanicistas para predecir las concentraciones de tejido y 𝑉𝑠𝑠 intento de estimar, en base a la unión a
proteínas plasmáticas y glóbulos rojos, lipofilia y pKa, el alcance potencial de la división del fármaco en componentes
del tejido, como agua del tejido, albúmina, lípidos neutros / cargados y neutro / fosfolípidos cargados (Poulin y Theil,
2000; Berezhkovskiy, 2004; Rodgers et al., 2005; Rodgers y Rowland, 2006). Estos métodos han tenido bastante
éxito en predecir 𝑉𝑠𝑠 para varios medicamentos (Graham et al., 2012); aunque factores como el transporte activo, la
unión a proteínas específicas y el atrapamiento lisosómico pueden limitar su aplicabilidad en algunos casos.

Los corticosteroides sintéticos, dexametasona (DEX) y metilprednisolona (MPL), se prescriben con frecuencia con
diferentes regímenes de dosificación, exponiendo así los tejidos del cuerpo a un amplio rango de concentraciones. La
teoría clásica sostiene, de acuerdo con la "hipótesis de la hormona libre" (Mendel, 1989), que los esteroides no
unidos se difunden en los espacios intracelulares. Sin embargo, la evidencia experimental limitada indica un papel
para la absorción de membrana activa y los transportadores en la disposición de esteroides (Schinkel et al., 1995;
Lackner et al., 1998; Crowe y Tan, 2012). La presencia ubicua del receptor de glucocorticoides en varios tejidos
puede influir en la captación de esteroides en los tejidos debido a la unión de alta afinidad en el citosol. Si bien la
farmacocinética plasmática de ambos esteroides se ha investigado en ratas y humanos (Dunn et al., 1991; Hochhaus
et al., 2001; Samtani y Jusko, 2005; Hazra et al., 2007), hay información limitada sobre su distribución en tejidos. Los
estudios en conejos mostraron que la prednisolona es absorbida por varios tejidos en cantidades que exceden la
difusión del fármaco libre en el agua del tejido (Khalafallah y Jusko, 1984a; Khalafallah y Jusko, 1984b).

El objetivo de este primer informe de una serie de tres partes fue determinar la unión de DEX y MPL in vitro utilizando
homogeneizados de tejidos y comparar los resultados con los datos obtenidos in vivo en ratas macho y hembra. Se
realizó una comparación adicional con predicciones basadas en tres ecuaciones mecanicistas de composición tisular
de unión en tejidos de rata. Los resultados de los estudios in vitro e in vivo se utilizaron para apoyar el desarrollo de
un modelo PBPK mínimo de MPL en ratas, presentado en un artículo complementario (Ayyar et al., 2019).

Resultados

Unión a proteínas plasmáticas. Los estudios de unión a proteínas de DEX y MPL se llevaron a cabo utilizando
plasma de ratas Wistar machos y hembras normales. La unión al plasma de MPL se evaluó sobre concentraciones
totales que varían de 163 a 22,230 ng / mL (~ 0.4 a 60 μM). La figura 1 (izquierda) demuestra la falta de dependencia
de la concentración de la unión de MPL en plasma. La unión al plasma de MPL en ambos sexos fue esencialmente
idéntica, con un límite de 60.5 ± 1.6% en hombres y un límite de 60.4 ± 2.3% en mujeres. Este porcentaje de MPL
unido es comparable a una estimación reportada previamente en ratas macho de 63.1 ± 0.8% obtenidas usando
diálisis de equilibrio (Haughey y Jusko, 1991). La linealidad de la unión indica una unión no saturable de baja afinidad
a las proteínas plasmáticas. Este hallazgo es consistente con la unión a proteínas plasmáticas de MPL observada en
humanos y conejos (Ebling et al., 1986). Sin embargo, el porcentaje unido en ratas fue más bajo que en humanos
(77,6%) y conejos (78,5%), lo que indica una diferencia de especie. La unión lineal de estos esteroides permite el
cálculo de solo constantes de afinidad de unión compuesta NN AA ∙ KK AA. Suponiendo que la albúmina es la única
proteína de unión no específica (550 μM en ratas hembras y 510 μM en ratas machos) (Rose y Klemcke, 2015; Li et
al., 2017a), NN AA ∙ KK AA oscila entre 3.0 x 10 3 M a 3.2 x 10 3 M. La estimación de NN AA ∙ KK AA para MPL está
muy de acuerdo con un valor previamente informado obtenido en un medio de incubación de hepatocitos (suero de
caballo inactivo; 3.15 x 10 3 M) (Morais y Wagner, 1985) . Esto también es similar a los valores de prednisolona (~
2.0 x 10 3 M) en plasma de rata macho (Rocci et al., 1980). Se evaluó la unión al plasma de DEX (Fig. 1; derecha)
sobre concentraciones totales que oscilan entre 11 y 12.712 ng / ml (~ 0.03 a 32.4 μM) en plasma de ratas macho,
hembra estro y hembra proestro. No se observaron diferencias entre los tres grupos. La unión a proteínas
plasmáticas de DEX fue independiente de la concentración (lineal) en todo el rango probado. El grado de unión al
plasma de DEX fue mayor en comparación con MPL al 82.5%, que es comparable a un valor informado previamente
para DEX en plasma de ratas macho (84.7 ± 0.7%) (Peets et al., 1969).
Distribución de tejidos in vivo. La distribución de tejido a plasma en estado estacionario de MPL y DEX se midió en
hígado, músculo y pulmón obtenidos de ratas Wistar macho. Los valores de KK PP para cada fármaco después de la
infusión en estado estacionario se calcularon usando la ecuación. (1) para músculos y pulmones y usando la
ecuación. (2) para el hígado. Los valores de KP de DEX en estos tejidos también se evaluaron mediante inyección de
bolo SC (2,25 mg / kg) en ratas macho. Los perfiles de concentración-tiempo de MPL después de un bolo IM de 50
mg / kg se midieron en plasma e hígado de ratas macho y hembra, y los valores de KK PP resultantes se calcularon
usando la ecuación. (3) La KP calculada de MPL y DEX en hígado, músculo y pulmón de rata después de la
inyección en bolo y / o la infusión en estado estacionario se muestran en la Fig. 2. Para MPL, KP fue más alta en
hígado (12.8 ± 1.2) y más baja en músculo ( 1.8 ± 0.4). Los valores de KP para MPL obtenidos en hígados
masculinos a través de bolo IM e infusión SC y en hígados femeninos después de bolo IM fueron similares (13.4 ± 0.9
vs. 13.5 ± 1.4 vs. 11.4 ± 1.4) después de la corrección para la extracción de órganos usando la ecuación. los tejidos
El KK PP fue más alto en el hígado (bolo: 5.5 ± 0.3 vs. infusión: 4.8 ± 0.5), mientras que a diferencia de MPL, DEX
mostró una acumulación similar en ambos pulmones (bolo: 0.53 ± 0.02 vs. infusión: 0.43 ± 0.05) y músculo ( bolo:
0,50 ± 0,03 frente a infusión: 0,49 ± 0,04).

Estabilidad del fármaco en los tejidos homogeneizados. La estabilidad de MPL y DEX a 37 o C se evaluó con el
tiempo en plasma y en homogeneizados de tejidos. El agotamiento de cualquiera de los esteroides fue mínimo
durante el transcurso del experimento en homogeneizados de plasma, músculo y pulmón (no se muestra), y no
pareció presentar ningún problema al analizar los datos de unión. Se produjo un agotamiento robusto para MPL en
homogeneizados de hígado masculino, con la tasa y el grado de pérdida de sustrato inversamente proporcional al
grado de dilución de homogeneizado. La tasa de agotamiento de MPL en los homogeneizados de hígado masculino
obedeció a una cinética de pérdida de primer orden durante hasta 10 minutos después de la incubación a 37 ° C (Fig.
3; izquierda), seguido de una meseta en concentraciones superiores a 15 minutos. De interés, se produjo un
agotamiento insignificante de MPL en homogeneizados de hígado de rata hembra, y las concentraciones se
mantuvieron estables durante la duración del experimento (Fig. 3; derecha). La preparación de homogeneizados de
hígado usando hígado en polvo criopreservado solo disminuyó modestamente el grado de pérdida de MPL a 37 o C
(Figura 1 suplementaria). No se produjo un agotamiento significativo de DEX en homogeneizados de hígado de rata
macho o hembra (Figura complementaria 2).

Unión in vitro en homogeneizados de tejidos. El efecto de la dilución de los homogeneizados de tejidos sobre la
unión de MPL se examinó a través de diluciones de 3 a 10 veces de homogenados de hígado y pulmón. Como se
muestra en la Fig. 4 y en la Figura 3 complementaria, el grado de unión de MPL fue directamente proporcional a la
concentración de proteína total en los homogeneizados de tejido. Las fracciones de tejido libre (ff uu, tt) para MPL en
hígado, músculo y pulmón se presentan en la Tabla 1, al igual que los valores K P de MPL calculados sobre la base
de estudios de unión in vitro. Como se muestra en la Fig. 5, la unión de DEX fue proporcional a la concentración de
proteína total en homogeneizados de tejido. Las fracciones de tejido libre (ff uu, tt) para DEX en hígado, músculo y
pulmón se presentan en la Tabla 2, al igual que los valores K P de DEX calculados en base a estudios de unión in
vitro.

La fu, t para MPL en el hígado se estimó en 0.162 ± 0.01 en varones y 0.066 ± 0.003 en mujeres que corresponden a
valores de K P derivados in vitro de 2.5 ± 0.2 y 6.1 ± 0.4. Por lo tanto, los estudios de homogeneización, en las
condiciones descritas, significativamente menos de lo previsto KP in vivo de MPL en el hígado masculino y, en menor
medida, en el hígado femenino. Se estimó que ff uu, tt para MPL en pulmón y músculo de ratas machos era 0.192 ±
0.01 y 0.298 ± 0.05, correspondientes a valores de KP derivados in vitro de 2.1 ± 0.1 y 1.4 ± 0.2, de acuerdo con su in
vivo valores. Para DEX, el ff uu, tt en el hígado fue similar en machos y hembras en las dos concentraciones
probadas, y comparable al valor obtenido para MPL en hígados de ratas hembras (~ 0.06). Los valores de KP in vitro
derivados de DEX en el hígado fueron aproximadamente dos veces más bajos en comparación con las estimaciones
in vivo. La fu, t para DEX en el pulmón fue de 0.115 ± 0.006, y la KP in vivo se predijo en exceso alrededor de 3
veces. En el músculo, la fu, t de DEX fue de 0.115 ± 0.006, y la K P in vivo se predijo en más de 3 veces. En
músculo, el fu, t de DEX fue 0.23

Predicción de esteroides Kp en tejidos de rata. Las estimaciones de KP obtenidas para MPL y DEX a partir de
estudios in vivo e in vitro se compararon con los valores de KP en tejidos de ratas calculados utilizando los enfoques
basados en la composición de tejidos propuestos por el Método 1 (Poulin y Theil, 2002) y corregidos por el Método 2
(Berezhkovskiy , 2004), y Método 3 (Rodgers y Rowland, 2006) usando el Simulador GastroPlus TM PBPK. Los
valores pronosticados de KP para MPL y DEX usando estos enfoques se enumeran en las Tablas 1 y 2. Todos los
métodos subestiman los valores de KP severamente para ambos fármacos en el hígado, pero están algo más cerca
de pulmón y músculo.

Discusión
El presente estudio informa datos de unión de tejidos para DEX y MPL en la rata, obtenidos utilizando diferentes
métodos. Un objetivo principal de este trabajo fue examinar si las evaluaciones in vitro de la partición y unión del
fármaco utilizando homogeneizados de tejidos (junto con la información de unión al plasma in vitro) podrían usarse
para predecir de manera confiable la distribución de MPL y DEX en los tejidos in vivo en tejidos seleccionados. Para
que esto sea posible, se deben cumplir varias condiciones: 1) la unión inespecífica a los componentes del plasma y
los tejidos domina el proceso de distribución del tejido, 2) los esteroides se distribuyen y se unen de manera
relativamente uniforme dentro de cada órgano, 3) la cinética de la absorción del fármaco en los tejidos no es limitante
de la velocidad (es decir, la entrada es rápida), 4) los procesos de unión contributiva no son saturantes, y 5) el
transporte activo de entrada o salida no contribuye significativamente a la distribución. Tales suposiciones también
son operables con el uso de métodos in silico de predicción de Kp.

Consideraciones técnicas: Se ha argumentado que la unión del fármaco a la albúmina sérica (bovina) depende de
la concentración de albúmina de manera compleja (Shen y Gibaldi, 1974). Sin embargo, se encontró que la unión de
MPL y DEX al plasma de rata y a los homogeneizados de tejido (hígado y pulmón) está relacionada linealmente con
la concentración de proteínas (Fig. 4-5 y Figura 3 complementaria). Esto es consistente con otros informes que
demuestran que la unión al fármaco es independiente de la concentración de proteína homogenada (Lin et al., 1982;
Kurz y Fichtl, 1983; Schuhmann et al., 1987). Algunos estudios han empleado diálisis de equilibrio para la separación
del fármaco unido y libre en estudios de homogeneización. Esta técnica implica largos tiempos de equilibrio durante
los cuales puede ocurrir la descomposición del tejido (Pacifici y Viani, 1992), así como cambios de volumen (Boudinot
y Jusko, 1984). La ultrafiltración también presenta ciertas limitaciones. Primero, la unión no específica del fármaco al
filtro y al aparato de recolección puede confundir las mediciones de unión. En segundo lugar, la filtración de más del
20% del volumen de la muestra puede conducir a cambios en el equilibrio de unión (Shen y Gibaldi, 1974). Los
experimentos preliminares de recuperación confirmaron la unión insignificante de DEX y MPL al aparato. Además, las
condiciones de filtración se optimizaron de modo que el volumen del filtrado fuera inferior al 15% del volumen de
muestra inicial. Con el fin de prevenir el metabolismo del fármaco durante la diálisis de equilibrio en homogeneizados
de tejidos diluidos, Lin et al. realizó estudios de unión de etoxibenzamida a 4 ° C (Lin et al., 1982). Aunque no es
aparente para la etoxibenzamida, las fracciones no unidas para varias otras drogas tienden a disminuir con un
aumento de la temperatura (Ballard, 1974). Por lo tanto, los estudios de homogeneizado in vitro para DEX y MPL
descritos en este informe se realizaron mediante ultrafiltración a 37 ° C. El fármaco total era estable a esta
temperatura y, por lo tanto, no presentaba un problema para analizar los datos de unión, excepto para MPL en
homogeneizados de hígado masculino, donde se produjo un agotamiento robusto tras la incubación. Por lo tanto, se
siguió el curso temporal de las concentraciones totales de MPL en los homogeneizados de hígado durante el
experimento y se usó para corregir la pérdida del fármaco. A pesar de esta aparente corrección, la unión de MPL en
el hígado masculino se homogeneiza por debajo de las estimaciones in vivo por aproximadamente cuatro veces. La
unión in vitro de MPL se evaluó a una concentración inicial de 10 μg / ml. La baja sensibilidad del ensayo de HPLC en
tejidos (50 ng / ml) junto con pequeños volúmenes de filtrado (25-60 μL) impidió el examen de la unión del tejido MPL
dependiente de la concentración a concentraciones más bajas. Sin embargo, un solo experimento de validación (no
mostrado) realizado a 1 μg / ml usando homogeneizados hepáticos diluidos 4X con filtrados agrupados de múltiples
dispositivos arrojó una relación ligada / libre comparable a la obtenida a 10 μg / ml (0.9 vs. 1.1), sugerente de unión
independiente de la concentración dentro de este rango. El grado de pérdida de MPL en homogeneizados fue similar
en ambas concentraciones. Una característica destacada de este estudio fue la investigación de la unión in vitro de
dos esteroides (DEX y MPL) en tres tejidos distintos (hígado, pulmón y músculo esquelético), para los cuales los
valores de KP in vivo variaron en un amplio rango (0,5 - 13).

Los estudios de homogeneizado in vitro examinaron la unión del tejido y la estabilidad de MPL en su forma de alcohol
libre; por lo tanto, la conversión de profármacos no confunde las evaluaciones de la unión de MPL. Nuestras
evaluaciones in vivo midieron las concentraciones totales de MPL en plasma y tejidos de ratas después de la
dosificación IM y SC de su profármaco de succinato soluble en agua, MPS. Dado que la MPS sufre una conversión
incompleta (10-20%) a MPL en ratas (Kong y Jusko, 1991), la inestabilidad de los profármacos ex vivo puede
conducir a una sobreestimación de las concentraciones de MPL en los puntos temporales tempranos. Las medidas
tomadas para minimizar la posible hidrólisis ex vivo de succinato de MPL fueron: 1) uso de EDTA como
anticoagulante al recolectar sangre, 2) centrifugación rápida de sangre después de la recolección a 4 ° C, 3)
almacenamiento de muestras de plasma y músculo a -20 ° C y -80 ° C, 4) evitar ciclos repetidos de congelación-
descongelación, y 5) usar una temperatura fría (4 ° C) antes de la extracción del fármaco en cloruro de metileno para
la medición por HPLC. Después de una dosis en bolo de MPS IM en ratas macho, se midió una alta concentración de
MPL en el sitio de inyección local (en relación con el plasma) minutos después de la dosificación (Hazra et al., 2007),
lo que indica una rápida y significativa conversión de MPS en el tejido sitio previo a la entrada en circulación. Kong y
Jusko (1991) demostraron usando hígados de rata perfundidos que solo 8 - 20% de MPS formaron MPL. Estos
hallazgos sugieren colectivamente un impacto modesto de MPS en la acumulación de MPL en los tejidos. Existen
diferencias entre especies pronunciadas en la interconversión de MPS a MPL. La disponibilidad de MPL de MPS es
incompleta en ratas, monos y perros (10-20%), mientras que está casi completa (80-90%) en conejos y humanos
(Kong y Jusko, 1991). Múltiples estudios de MPS en humanos indican una conversión muy rápida y extensa de
profármaco a MPL activo (Derendorf et al., 1985; Al-Habet y Rogers, 1989), lo que puede confundir la absorción y las
concentraciones de tejido de MPL en puntos temporales tempranos.

Enlace a homogeneizados en comparación con los datos in vivo. Hubo un acuerdo razonable entre la unión del
homogeneizado y la distribución in vivo en el caso del músculo esquelético y el pulmón para ambos esteroides. Esto
permite algunas especulaciones sobre el modo de absorción de las drogas en el tejido de la rata. El hecho de que el
alcance de la distribución in vivo de ambos esteroides en ambos tejidos podría reproducirse razonablemente en
homogeneizados en las condiciones descritas sugiere una ausencia de mecanismos activos en la concentración
probada. Estas observaciones pueden ser válidas para ambos esteroides a concentraciones de fármaco más bajas,
ya que la absorción lineal de prednisolona se documentó en cortes musculares de conejo en un amplio rango de
concentraciones (Khalafallah y Jusko, 1984a). Por lo tanto, los valores de KP obtenidos usando homogeneizados
pueden usarse para informar este parámetro para el desarrollo de modelos de PBPK en el caso de ambos esteroides.

Unión a corticosteroides en el hígado. Las concentraciones totales de DEX fueron relativamente estables a lo largo
de los experimentos de unión en homogenados de hígado masculinos y femeninos, y los valores de KP derivados de
in vitro para DEX en el hígado de ambos sexos estuvieron razonablemente de acuerdo con los valores in vivo. Por
otro lado, los experimentos in vitro no predijeron la Kp de MPL en los homogeneizados de hígado tanto masculinos
(cuatro veces) como femeninos (dos veces) en comparación con las estimaciones in vivo. La pérdida in vitro robusta
de MPL en homogeneizados masculinos se planteó como una razón para la sub-predicción. Fue interesante
encontrar que, en ausencia de cualquier pérdida perceptible de MPL en los homogeneizados de hígado femenino,
hubo una mejora doble, pero no obstante, una predicción doble de la Kp in vivo. En base a estas observaciones, es
posible que el metabolismo in vitro solo explique parcialmente la desconexión con los datos de unión in vivo. Lackner
y col. han proporcionado evidencia de la presencia de un sitio sensible a glucocorticoides en membranas plasmáticas
de hígado de rata altamente purificadas (libres de receptores de transcortina y glucocorticoides), que se demostró
que mediante la captación activa de alta afinidad de glucocorticoides endógenos y algunos exógenos (Lackner et al.,
1998). Los estudios de unión competitiva indicaron que la prednisolona, un esteroide que se diferencia solo por un
grupo –metilo en la posición C6 en comparación con MPL, mostró una especificidad mejorada aproximadamente 3
veces mayor que la corticosterona, mientras que otros esteroides altamente potentes como DEX, betametasona y
cortivazol, todos ellos con un grupo OH o CH3 en la posición C16, exhibieron baja especificidad (Lackner et al.,
1998). Estas observaciones parecen ofrecer una base racional para la totalidad de nuestros hallazgos con respecto a
la predicción in vitro-in vivo de la unión de DEX y MPL en el hígado y otros tejidos usando homogeneizados; un
sistema donde tales procesos activos de importación no serían operativos. La absorción no lineal de prednisolona en
el tejido observada in vivo y en cortes de hígado de conejo se atribuyó al receptor de glucocorticoides saturable o a la
unión de transcortina (Khalafallah y Jusko, 1984a). El último mecanismo no es aplicable ya que DEX y MPL no se
unen a la transcortina. La influencia de la unión específica de esteroides de alta afinidad y baja capacidad a los
receptores de glucocorticoides tisulares es posible in vivo. Estos receptores son ubicuos en los tejidos de mamíferos
y más abundantes en el hígado (Tomkins et al., 1974). El argumento a favor de la captación de esteroides hepáticos
debido a la unión al receptor se fortalece aún más en base a los hallazgos de la unión de prednisolona no lineal en
cortes de hígado de conejo, pero la captación lineal en el corazón, el músculo esquelético y la grasa (Khalafallah y
Jusko, 1984a). La evaluación de factores como la unión al receptor y el transporte activo en la captación hepática
requerirá pruebas experimentales más centradas utilizando fracciones citosólicas y concentraciones muy bajas de
fármaco. Los tres métodos basados en la composición de tejidos subestimaron severamente los valores de KP para
ambos esteroides en el hígado, lo que indica una vez más que es probable que haya mecanismos adicionales de
captación de esteroides hepáticos.

En conclusión, los valores de Kp para MPL y DEX determinados a partir de datos de unión in vitro y calculados a
partir de parámetros cinéticos obtenidos después de administrar el fármaco por dos rutas diferentes estaban en
razonable acuerdo para pulmón y músculo. Esta observación sugiere que los datos de unión in vitro obtenidos
pueden, al menos en estos dos tejidos, usarse para predecir la distribución in vivo. El metabolismo de los tejidos, la
unión de tejidos saturables y la captación activa son posibles factores que pueden complicar las evaluaciones del
transporte hepático de esteroides in vivo cuando se usan homogeneizados de tejidos. Estos hallazgos están en
general de acuerdo con la declaración de Mendel (1989) de que, para algunos esteroides, la hipótesis de la hormona
libre "probablemente sea válida con respecto a algunos tejidos, pero no con respecto a otros (en particular, el
hígado)".