ANÁLISIS DE ÁCIDOS CLOROGÉNICOS EN PULPA DE CAFÉ POR MEDIO DE

HPLC.
Yeimy Liliana Villamil Rivera ; Jhonatan Alexander Ospina Rodríguez1
1

1. Estudiantes del programa Biología, Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad

del Tolima.
RESUMEN

El café (Coffea arábiga) es uno de uno de los cultivos de mayor importancia económica y
social en nuestro país. La pulpa es uno de los principales subproductos derivados del
procesamiento húmedo del café. En la actualidad muchos estudios han propuesto el
aprovechamiento de estos subproductos dada su composición química, debido a que se reporta
un alto contenido de compuestos fenólicos con actividad antioxidante, como ácidos
clorogénicos, epicatequina, entre otros. Para este trabajo se buscaron estudios previos
enfocados al análisis de los ácidos clorogénicos por medio de la cromatografía líquida de alto
rendimiento HPLC. Los resultados obtenidos demuestran la presencia de estos ácidos en la
pulpa seca con valores de 0.045g/ 100g de muestra; en menor proporción 0.006g/ 100g de
muestra húmeda. Se evidenció que la concentración del solvente influye en el rendimiento de
los sistemas puesto que a concentraciones de etanol-agua (40:60) se presentó un mayor
rendimiento a los 20 min de extracción en pulpa seca, por el contrario, en pulpa húmeda el
mayor rendimiento se presentó en los solventes etanol-agua (60:40) a diferentes tiempos de
extracción. Por medio de HPLC es posible realizar análisis estructural, funcional y purificación
de compuestos fenólicos como los ácidos clorogénicos en subproductos del café.

PALABRAS CLAVE
Pulpa de café, ácidos clorogénicos, HPLC, extracción

ABSTRACT
Coffee (Coffea arábiga) is one of the most economically and socially important crops in our
country. The pulp is one of the main by-products derived from the wet processing of coffee.
Currently many studies have proposed the use of these byproducts given their chemical
composition, because it is reported a high content of phenolic compounds with antioxidant
activity, such as chlorogenic acids, epicatechin, among others. For this work, previous studies
focused on the analysis of chlorogenic acids by means of high performance liquid
chromatography HPLC were searched. The results obtained show the presence of these acids
in the dried pulp with values of 0.045g / 100g of sample; in smaller proportion 0.006g / 100g
of wet sample. It was evidenced that the concentration of the solvent influences the
performance of the systems since at concentrations of ethanol-water (40:60) a higher yield was
presented after 40 min of extraction in dry pulp, on the contrary, in wet pulp the Higher yield
was presented in the ethanol-water solvents (60:40) at different extraction times. By means of
HPLC it is possible to perform structural and functional analysis and purification of phenolic
compounds such as chlorogenic acids in coffee by-products.

KEYWORDS
Coffee pulp, chlorogenic acids, HPLC, extraction
INTRODUCCIÓN
El café es una de las bebidas más
consumidas en el mundo gracias a su efecto
energizante, sabor, aroma, cotidianidad de
consumo en la sociedad, entre otros
factores. En américa después de Brasil se
ubica Colombia como el segundo productor
de café, según cifras del Ministerio de
Agricultura del año 2016 en el país había
777.704,93 hectáreas cultivadas y pasos:
853.919,94 toneladas producidas, a su vez
en el departamento del Tolima había
100.328,18 hectáreas y 105.976,17
toneladas producidas en el año, lo que
equivale al 12,41% de la producción
nacional.
Según la Federación Nacional de Cafeteros
esta planta tiene su desarrollo en alturas que
van desde los 1000 a los 2000 metros sobre
el nivel del mar, requiere una precipitación
entre 1000 y 3000 mm anuales, temperatura
entre los 18 y 22,5°C y humedad menor a
80. Estas características favorecen su
cultivo en municipios del Tolima, según el
Comité Departamental de Cafeteros hay 38
municipios productores de café de los 47
del Tolima, alrededor de 62.100 fincas
cafeteras pertenecientes a 51,582
caficultores y caficultoras. Este cultivo
hace parte de la cultura de las comunidades,
actualmente se posiciona como una base de
la economía de muchas familias del país.
La taxonomía completa del café Coffea
arábica según el NCBI es desde la categoría
mayor a
inferior: Eukaryota; Viridiplantae;
Streptophyta; Streptophytina;
Embryophyta; Tracheophyta;
Euphyllophyta; Spermatophyta;
Magnoliophyta; Mesangiospermae;
eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae;
asterids; lamiids; Gentianales; Rubiaceae;
Ixoroideae; Gardenieae complex;
Bertiereae - Coffeeae clade ; Coffeeae ;
Coffea .
El proceso de producción se hace
manualmente en la mayoría de los casos,
basados en la información de la página web
de la Federación Nacional de Cafeteros; el
proceso en general consta de los siguientes
1. Siembra:
a. Semillas: Dispone de un tiempo 2
meses germinando y 6 meses almácigo
b. Germinador y almácigo:
Disponer de una infraestructura adecuada
para mantener
germinando la semilla en
condiciones ideales.
c. Adecuación del terreno: tener en
cuenta la distancia optima entre
plantas, el sombrío, entre otros
factores.
2. Crecimiento y producción: control de
plagas, arvenses, fertilización, podas, etc.
3. Cosecha: Proceso manual
4. Poscosecha: Manejo de productos y
subproductos del beneficiado.
Durante la cosecha el café es lavado y
separada la pulpa de los granos para
posteriormente hacer el secado, tostadura,
trituración y demás procesos para generar
un producto final. Sin embargo, en este
proceso van quedando subproductos que
algunas veces son desaprovechados y que si
no se da un manejo adecuado pueden llegar
a generar focos de contaminación. La pulpa
es uno de estos subproductos, que se
obtiene del proceso de descerezar el café
maduro mediante una maquina
despulpadora o descerezadora, el proceso
consiste en el paso del café a través de dos
rodillos giratorios que con o sin ayuda de
agua separa el grano de la pulpa y el
mucilago. La pulpa constituye
aproximadamente el 40 % en peso del fruto
del café en base húmeda y el 29 % en base
seca (Serrat-Díaz, De la Fé-Isaac, De la Fé-
Isaac Lic., & Montero-Cabrales, 2018)
El mucílago (otro subproducto) representa
el 22% en peso del café despulpado y el
13% del peso del grano maduro y
contribuye con el 28% de la contaminación
generada por el beneficio húmedo
tradicional del café, lo que equivale en
promedio a una demanda química de
oxígeno (DQO) de 120.000 mg/l (Arias
Zabala, Henao Navarrete, & Castrillon
Gutierres, 2009)
Como la pulpa es el principal y más
abundante subproducto del café, este
trabajo se enfocará en esta. Los principales
componentes de la pulpa se muestran en la
Tabla 1, datos que corresponden a la pulpa
fresca, pulpa deshidratada, y una muestra
de pulpa almacenada por tres días después
de haber sido obtenida.

Tabla 1 Composición química de la pulpa de café (%)

Fresca Deshidratada Fermentada naturalmente y

deshidratada

Humedad 76,7 12,6 7,9

Materia seca 23,3 87,4 92,1

Extracto etéreo 0,48 2,5 2,6

Fibra cruda 3,4 21,0 20,8

Proteína cruda N*6.25 2,1 11,2 10,7

Cenizas 1,5 8,3 8,8

Extracto libre de 15,8 44,4 49,2

nitrógeno

Como se puede observar en la tabla anterior componentes de este subproducto, estas

el contenido de humedad de la pulpa de café
es muy alto, encontrando valores más altos
en fresco, también se observa que el
material ya deshidratado contiene cerca de
11% de proteína cruda, 21 % de fibra cruda,
8% de cenizas y 44% de extracto libre de
nitrógeno, estos valores son muy similares
a la composición química de la pulpa de
café fermentada y deshidratada. A
continuación, se muestran otros
sustancias son de interés debido a su uso
como materia prima para uso industrial y
algunos por su actividad antioxidante,
como son los ácidos clorogénicos. Según
Elías (1978) quien cita a (Malina y col.
1974) se han encontrado cifras de ácidos
clorogénicos con valores de 2,71% ,
mientras que otros autores como Bressani y
Elías (1976) han reportado valores de 2,6%
para este mismo compuesto. Las anteriores
cifras son muy similares a las mostradas en
la siguiente tabla, diferencias en estas
pueden corresponder al uso de diferentes
Tabla 2 Contenido de otros compuestos en la pulpa del café
Compuesto
Taninos
Sustancias pécticas totales
Azúcares reductores
Azúcares no reductores
Cafeína
Ácido Clorogénico
Ácido cafeico total
Los fenoles presentes en vegetales son un
grupo grande y heterogéneo de compuestos
que se considera protegen, in vivo, el ADN
celular, los lípidos y las proteínas, del daño
generado por los radicales libres (Herrera
Rincon, 2016). Diferentes investigaciones
han encontrado propiedades antioxidantes
en el café, por medio de estudios
epidemiológicos se ha demostrado que
reduce de manera significativa el riesgo de
diabetes tipo 2, cirrosis hepática, cáncer de
hígado y colorrectal, enfermedades
cardiovasculares e inflamatorias y
enfermedades neurodegenerativas como el
Alzheimer y el Parkinson (Fonseca Garcia,
Calderón Jaimes, & Rivero, 2014)
Los ácidos clorogénicos son los fenoles con
mayor capacidad antioxidante en el café:
variedades de café, prácticas agrícolas o
técnicas de procesamiento.
% base seca
1.80 - 8,56
6,5
12,4
2,0
1,3
2,6
1,6
Son ésteres del ácido quínico, de los cuales
el más abundante es el 5-cafeoilquínico.
Estos se encuentran en las paredes
celulares, esterificados a los polisacáridos,
se sintetizan a partir de la fenilalanina y
funcionan como intermediarios en la
biosíntesis de la lignina. Su fórmula
química es C16H18O9; 1,4,5- Trihydroxi-
ciclohexano carboxílico 3-(3,4-
dihidroxicinamato) 3-[[3-(Di-hidroxifenil)-
1-oxo-2-propenil]oxi] 1,4,5-
trihidroxiciclohexano-carboxílico (Marín
García & Puerta Quintero, 2008) (Figura 1).
Estudios realizados por (Ramírez-Martínez,
1988) reportan que la pulpa fresca de café
contiene ácido clorogénico (ácido 5-
cafeoilquinico), el cual alcanza el 42,2%
del total de compuestos fenólicos
identificados en este sustrato.
Figura 1 Estructura química de los ácidos clorogénicos. Tomado de:
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_clorog%C3%A9nico#/media/Archivo:Chlorogen
ic-acid-2D.svg
Trabajos previos identificaron por HPLC
varios polifenoles en la pulpa, tales como:
ácido 5-cafeoilquínico, epicatequina, ácido
3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5-
dicafeoilquínico, ácido 4,5-
dicafeoilquínico, catequina, ácido pro-
tocatéquico, rutina, ácido ferúlico y ácido
5-feruloilquinico (Fonseca Garcia,
Calderón Jaimes, & Rivero, 2014).
Los análisis por cromatografía agrupan un
conjunto variable de técnicas basadas en la
separación de componentes de una mezcla
y su posterior detección. El proceso se
realiza gracias a la separación de una
mezcla en dos fases: una estacionaria que
generalmente es un sólido y una móvil que
consiste en un fluido (gas, líquido o fluido
supercritico); los distintos compuestos
presentes en la muestra interactúan con los
compuestos presentes en la columna, de
modo que dependiendo la afinidad entre
ambos, estos se retienen en mayor o menor
medida al flujo de la fase móvil (Jiménez
Arias, 2016)
Los compuestos que presentan poca
afinidad a la fase estacionaria son
arrastrados fácilmente por la fase móvil,
llegando más rápidamente al detector del
equipo, los menos afines son arrastrados
con mayor dificultad (Jiménez Arias,
2016). El tiempo que cada compuesto
requiere para llegar al detector atravesando
la columna cromatografía se le conoce
como tiempo de retención; generalmente se
analizan muestras con compuestos que
tengan distintos tiempos de retención para
genera la separación y su final
cuantificación al llegar al detector.
La cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) permite realizar
análisis estructurales y funcionales, y
purificación de muchas moléculas en poco
tiempo. Esta técnica produce resultados
perfectos en la separación de aminoácidos,
carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos,
proteínas. esteroides, fenoles y otras
moléculas biológicamente activas (Coskun,
2016). La separación se puede producir por
adsorción, partición, intercambio iónico,
exclusión, afinidad.
Como se ha mencionado, el mal manejo de
los subproductos puede ser generador de
contaminación en agua, suelo y aire
(Fonseca et. al., 2014). Esta problemática
ha ocasionado la búsqueda de usos
alternativos de estos subproductos, con el
fin de minimizar el impacto ambiental. Se
han empleado la pulpa y la cáscara como
fertilizante y compost (Moreno Clavijo &
Romero Jiménez , 2016). Se ha estudiado la
pulpa del café como sustituto en los
concentrados para animales (Noriega
Salazar , Silva Acuña , & García de Salcedo
, 2009). Se ha evaluado el uso de los
subproductos del café como fuente de
energía renovable por ejemplo, la pulpa y el
mucilago en la producción de biogás
(Rodríguez Valencia & Zambrano Franco,
2010) y bioetanol (Vazquez Lopez , 2016),
y el pergamino como combustible.
En los últimos años se ha sugerido el uso de
los subproductos del café como fuente
promisoria de sustancias químicas
funcionales y bioactivas para la industria
alimenticia y farmaceútica, como los
polifenoles y la cafeína (Fonseca et. al.,
2014). Por la importancia del café en
términos productivos, ambientales y
económicos, este trabajo tiene como
objetivo analizar diferentes fuentes
bibliográficas donde utilizan la
cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) un método químico analítico
aplicado a los subproductos del café para la
identificación y cuantificación de ácidos
clorogénicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cuantificación de los ácidos clorogénicos
De acuerdo con Kuhnert et. al (2012), la
cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) es uno de los principales métodos
y más confiable empleado para el análisis
de ácidos clorogénicos, debido a la
posibilidad de identificación de los
compuestos mediante sus tiempos de
retención y la posibilidad de contrastar con
la información existente.
Para la utilización de esta técnica es
necesario inyectar un volumen en el equipo
y posteriormente ser arrastrado a lo largo de
la columna por la fase móvil, donde a
medida que la muestra fluye a través de la
columna cromatografía, los distintos
compuestos presentes en la muestra
interactúan con los demás presentes en la
columna, por ende, dependiendo de la
afinidad entre ambos, estos se retienen en
menor o mayor medida dependiendo de la
fase móvil (Jiménez Arias, 2016).
El tratamiento o la preparación de la
muestra corresponde a uno de las etapas
fundamentales en el análisis por HPLC, la
cual, según autores como (Papadoyanis &
Samanidou, 2009) se estima que contribuye
con el 30% de las fuentes de error, además
de ser la etapa que mayor tiempo consume
con alrededor de dos tercios del tiempo de
análisis. Por tanto, la preparación de la
muestra debe ser rápida y simple, poseer
una alta eficiencia de extracción, no tener
alta cantidad de pasos para reducir la
posibilidad de pérdidas, emplear el mínimo
de reactivos y presentar un bajo costo frente
a equipos requeridos (Jiménez Arias,
2016).
Preparación de la muestra
Existen diferentes metodologías para la
extracción y preparación de muestras de
subproductos de café para la extracción de
ácidos clorogénicos. A continuación, se
muestran algunas de las metodologías más
utilizadas para luego hacer el análisis por
HPLC. Para la preparación de las muestras
de pulpa para la posterior extracción de
ácidos clorogénicos existen diferentes
Tabla 3 . Condiciones de extracción de ácido clorogénico de pulpa seca y pulpa húmeda de
café
Para el caso de la pulpa seca se requiere
realizar una hidratación una hora antes de
realizar la extracción. Según este método,
para la purificación de ácido clorogénico se
debe comenzar a partir de extractos
obtenidos con una relación 1:10 pulpa:
solvente a partir de pulpa húmeda, y 1:20 a
partir de pulpa seca. Como se muestra en la
tabla 3 el agua como solvente de extracción
se utiliza a 80 °C (durante 10 minutos para
pulpa seca y 20 minutos para pulpa
húmeda). Las proporciones para
extracciones con etanol: agua para pulpa
seca son (60:40), mientras que para pulpa
húmeda se utilizan proporciones de 20:80 y
40:60 durante 5 y 40 minutos
respectivamente. La purificación de ácido
clorogénico se lleva a cabo mediante
extracciones sucesivas con acetato de etilo
de acuerdo a lo reportado por otros autores.
(Peña Aguilar, 2017)
Otro método de preparación de muestras de
café para análisis de ácido clorogénico
reportado por (López Bóbeda, 2008),
primero que todo se debe hacer la
métodos; uno de ellos se basa en utilizar
como solventes etanol-agua (Peña Aguilar,
2017) teniendo en cuenta las proporciones
que se exponen en la Tabla 3.
preparación de las diluciones estándar de
ácido clorogénico, para esto se prepara una
solución de 1000 µg/mL de metanol. De
esta se toma 1, 1.5, y 5 mL aforando a 10
mL con metanol para obtener las soluciones
de 100, 150 y 500 µg/mL de solución de
100 µg/mL se toman cinco mL y se procede
de la misma forma para obtener las
soluciones de 1, 10 50, 80 µg/mL.
Posterior a esto, se congelan las muestras
para minimizar la degradación del ácido
clorogénico. Las muestras deben ser
liofilizadas; en primera medida son molidas
para luego ser pasadas por un tamiz de 600
µm. Después se toma 1g la muestra para ser
extraído en un Erlenmeyer de 250 mL
conteniendo 100 mL de mezcla metanol-
agua (70/30) y 0.5% (masa/volumen) de
Na2SO3. El erlenmeyer debe ser agitado
durante aproximadamente 10 horas a una
temperatura de 4°C en oscuridad a una
agitación de 125 rpm.
Por último, se expone un tercer método, el
cual se basa en la utilización de distintos
equipos para el procesamiento de la
muestra colectada. A través de esta técnica
se contempla tanto la porción líquida
obtenida luego del prensado como también
la porción sólida. Primero, la pulpa se debe
secar hasta una humedad cercana al 5% y
luego ser molido usando un molino ciclón
centrífugo y extraerlo utilizando metanol al
80% acidificado con 1% de ácido acético
glacial, en un baño maría a 55 °C con
agitación constante (Rodríguez et. al.,
2010). Tras la extracción las muestras se
deben filtrar empleando papel filtro y aforar
con la disolución usada para la extracción.
Finalmente se debe filtrar por medio de un
filtro de 0.25 µm para llevar a cabo el
análisis por HPLC ( (López Bóbeda, 2008).
Análisis de ácidos clorogénicos por
medio de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC).
Las condiciones experimentales para
realizar los análisis cromatográficos son
diferentes en algunos estudios encontrados:
en el trabajo realizado por (Jiménez Arias,
2016) para la cuantificación de los
compuestos de interés se usó un equipo de
cromatografía líquida de alta resolución
compuesto por:
- Horno Shimadzu CTO-20A para la
columna cromatográfica
- inyector automático de muestras
Shimadzu SIL-20A HT, controlado
por módulo CBM-20A.
- Bomba cuaternaria Shimadzu LC-
20AT
- Detector de arreglo de diopodos
PDA Shimadzu e integrador LC-
Solutions.
López Bóbeda (2008) usó una tasa de flujo
de 0.8mL/min; la fase móvil constó de dos
solventes, A y B. El solvente A fue agua
con 2 mM de ácido fosfórico, pH 2.7,
conteniendo 5% de metanol; el solvente B
fue metanol conteniendo 5 % de 2 mM de
ácido fosfórico, pH 3.9. Por otra parte,
Peña-Aguilar et. al. (2017) hizo la
separación cromatografía en una columna
Phenomenex ODS-C18 (150 x 4.6 mm), 4
µm de espesor de fase, de acuerdo a las
siguientes condiciones: Inyección de
muestra 20 µL, flujo de 1 mL/min, siendo
la fase móvil: Solvente A: Agua: Ácido
Fórmico (98:2), Solvente B: Metanol, con
los siguientes gradientes: 0 min 10%B, 7
min 20% B, 10 min 30% B, 15 min 40% B,
20 min 45% B, 25 min 70% B, 27 min 70%
B, 28 min 10% B, 30 min 10 % B.
La detección se hizo a una longitud de onda
de 325 nm, correspondiente la máxima
absorción del ácido clorogénico (Ky et al.,
1997; López Bóbeda, 2008). La duración
del análisis de cromatográfico del estándar
fue 15 min por corrida.
De la cromatografía se obtienen señales con
las cuales se determinan las
concentraciones de los compuestos de
interés; se elaboran curvas de calibración
con el objetivo de establecer las ecuaciones
que permitan asociar la señal obtenida
mediante los cromatogramas con la
concentración de ácidos clorogénicos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Analizando los resultados obtenidos en los
diferentes trabajos consultados se evidencia
algunas similitudes. Para la mezcla de
solventes de etanol-agua, se observan
tendencias muy similares en los sistemas de
solventes a partir de pulpa seca y húmeda.
Los mayores rendimientos se presentaron
con etanol: agua (40:60) a los 20 minutos
de extracción, para etanol: agua (60:40) en
todos los tiempos; los mejores rendimientos
de extracción se observan en los extractos
etanólicos con una proporción de 60:40
(López Bóbeda, 2008) (Figura 2).
Por otra parte en la muestra a partir de pulpa
húmeda se observaron los mejores
rendimientos en los dos sistemas de etanol:
agua de 40:60 a 40 minutos de extracción y
60:40 a 40 y 60 minutos de extracción
(Figura 3).

Figura 2 Contenido de ácidos clorogénicos en extractos acuosos y etanólicos a partir de pulpa

seca a diferentes tiempos de extracción (Adaptado de López Bóbeda (2008)).

Figura 3 Contenidos de ácidos clorogénicos en extractos acuosos y etanólicos a partir de pulpa

húmeda a diferentes tiempos de extracción. (Adaptado de López Bóbeda (2008)).
Según los anteriores gráficos se puede ácidos clorogénicos en la pulpa seca
observar que hay una mayor producción de obteniendo valores cercanos a 0,045 g en
100 g de muestra; Por el contrario, aunque
en la pulpa húmeda hay presencia de estos
ácidos es mucho menor con valores
aproximados a 0,006 g. Esto concuerda con
los datos de la literatura, en los cuales se
afirma que hay mayor contenido de este
compuesto en una base seca.
Figura 4 Cromatogramas de patrones de los ácidos analizados y sus tiempos de retención
(Adaptado de Jiménez Arias (2016)).
A partir de las señales presentes en los
cromatogramas se determinaron los
tiempos de retención mostrados por los
compuestos de interés, es decir, el tiempo
que tarda en atravesar la columna de
cromatografía, lo cual permitió identificar
los compuestos de las muestras analizadas
(Jimenez Arias, 2016).
CONCLUSIONES
Por medio de HPLC es posible realizar
análisis estructural, funcional y en ácidos clorogénicos.
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En el trabajo desarrollado por Jiménez
Arias (2016) realizaron curvas de
calibración para tres ácidos con el fin de
cuantificar los compuestos de interés
(Figura 4)
purificación de compuestos fenólicos como
los ácidos clorogénicos en subproductos del
café. Los resultados de la extracción
muestran que dependiendo del compuesto
usado en la fase móvil existirá una mayor o
menor extracción, siendo el etanol el mejor
solvente. Es posible afirmar que no solo los
granos de café poseen cantidades
importantes de poli fenoles, sino que
también los productos derivados del
procesamiento del fruto del café son ricos
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