PURIFICACIÓN DEL PATÓGENO Colletotrichum gloesporioides MEDIANTE MÉTODOS DE

LABORATORIO

Maribel García Barrero

Indira Lorena Gonzales Ruiz

María Alejandra Méndez Corchuelo

Michael Andrés Días Castellanos

INTRODUCCIÓN

Para estudiar las propiedades de un organismo, es necesario no sólo su aislamiento a

partir de una población microbiana natural mixta, sino también su mantenimiento y el de
su descendencia en estado aislado, en un ambiente artificial en el que se impida el acceso
de otros microorganismos. La manera más fácil de obtener cultivos puros de los
microorganismos que forman colonias sobre los medios sólidos, se lleva a cabo mediante
la separación e inmovilización de los organismos individuales sobre o dentro de un medio
nutritivo solidificado; cada célula crecerá dando una colonia aislada cuya transferencia
puede hacerse fácilmente. La sustancia solidificante ideal para la mayor parte de los
medios de cultivo microbiológicos es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas
algas rojas. En una concentración de 1,5-2 %, en suspensión acuosa, se disuelve a 100 °C
formando una solución clara que solidifica a 45 °C, la cual no volverá a licuarse hasta
temperaturas mayores de 80 °C, de manera que cualquier temperatura empleada para la
incubación posterior puede ser usada. Para tal fin se emplea un asa de alambre estéril que
se introduce en la suspensión original para luego hacer una serie de estrías paralelas, no
superpuestas, sobre una placa de agar. Al ir avanzando la estría, el inóculo va
disminuyendo hasta obtener colonias bien aisladas sobre el agar. Dilución. Los métodos de
siembra en placa por lo general son satisfactorios para el aislamiento de bacterias y
hongos. Sin embargo, muchos protozoos son sólo cultivables en Microbiología y
Parasitología Médicas 5 0 medio líquido. El método más sencillo de aislamiento en medios
líquidos es el método de las diluciones. Con una suspensión del microorganismo, se realiza
una dilución en serie utilizando un medio estéril y se inocula un gran número de tubos con
el medio de cultivo, con partes alícuotas de cada una de las diluciones sucesivas. Como
resultado de esto, si un tubo muestra algún crecimiento subsiguiente, existe una elevada
probabilidad de que este crecimiento sea el resultado de la introducción de un solo
organismo.
 Para poder aislar microorganismos es necesario obtener cultivos puro a partir de
resiembras consecutivas en un medio sólido conteniendo agar. Esta técnica de aislamiento
se utilizó por primera vez en el laboratorio de Koch en 1881 y continúa siendo
ampliamente usada en diversas áreas microbiológicas debido a su simplicidad y utilidad.
Efectuando el mismo aislamiento pero a partir de plantas inoculadas artificialmente. Las
características culturales del patógeno deberán corresponderse con las del
microorganismo que se inoculó, con lo que se cumplirá con el 4º postulado de Koch el
cual fundamenta que el microorganismo debe reaislarse de los tejidos inoculados,
cultivarse e identificarse con el original.

OBJETIVOS

GENERAL: Preparar medios de cultivo puro con las técnicas de aislamiento de agentes
fitopatógenos a partir de la inoculación de atracnosis (Colletotrichum gloesporioides) en
maracuyá.

ESPECIFICOS:
 Purificar el cultivo para obtener el hongo Colletotrichum gloesporioides de forma
aislada.
 Hacer reconocimiento del micelio producido por Colletotrichum gloesporioides en
medio de cultivo, descripción morfológica, entre otros.

CULTIVO DE HONGOS
Se denomina cultivo al proceso de propagar los microorganismos, proporcionándoles las
condiciones ambientales adecuadas. Los microorganismos en fase de crecimiento realizan
réplicas de sí mismos y requieren de los elementos que se encuentran en su composición
química, Se le deben brindar los elementos nutritivos en una forma accesible desde el
punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica
con el objetivo de sintetizar macromoléculas y conservar los gradientes químicos
esenciales a través de sus membranas. Durante el crecimiento se deben regular los
factores nutricionales (carbono, nitrógeno, azufre y fósforo, elementos trazas y vitaminas)
y los factores físicos (pH, temperatura, oxígeno, humedad, presión hidrostática, presión
osmótica y radiación).

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el
aislamiento, determinación, desarrollo, reproducción e identificación de aquellos
organismos productores de enfermedades de las plantas, que se comportan como
parásitos facultativos. Para lograr el desarrollo y reproducción de las diferentes especies
fitopatógenos, los medios de cultivo deben reunir características especiales en cuanto a
nutrientes, humedad, pH y luz.

Nutrientes: En el medio de cultivo deberán estar presentes elementos nutricionales tales

como fuentes de carbono, nitrógeno, macroelementos (P, K, Mg, Ca), microelementos (Fe,
Zn, Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc

Humedad: Deberá proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopatógenos

que se desee cultivar. Por lo general requieren del 50 % o más. Temperatura. Los valores
óptimos de ésta son muy variables para cada especie, pero la mayoría de ellas pueden
crecer en un rango de 20 a 25 ºC. Este es un factor determinante para el desarrollo y la
reproducción.

pH: También en este caso los valores óptimos son muy variables, pero en general los
hongos fitopatógenos se desarrollan y reproducen mejor en pH ligeramente ácidos,
mientras que las bacterias prefieren los ligeramente alcalinos.

Luz: Este factor en algunos casos afecta la reproducción de los hongos fitopatógenos, pero
en general no influye. Asepsia. Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a
salvo de cualquier contaminación por otros microorganismos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo con su composición o a su

consistencia, quedando de la siguiente manera:
Medios de cultivo sintéticos: Son aquellos medios de cultivo en los que se conoce con
exactitud la composición de cada uno de sus componentes, por ejemplo, agar y Czapek.

Medios de cultivo complejo o semisintéticos. En estos la composición de uno de sus

elementos no se conoce de manera exacta, o bien, se integran de sustancias naturales y
sustancias sintéticas, por ejemplo PDA (papa-dextrosa-agar).

Consistencia

Medios sólidos: Materiales que al enfriarse quedan sólidos por completo. Son muy
empleados para el aislamiento y la reproducción de hongos y bacterias, contienen
esencialmente agar, gelatina.

Entre los medios de cultivo de uso frecuente en Fitopatología están los siguientes:

1. PDA (papa-dextrosa-agar)
2. AN (agar nutritivo)
3. HFA (harina de frijol-agar)
4. VM (Ougo Va agar)
5. AVA (avena-agar)
6. TSA (jugo de tomate-sal-agar)
7. MM (medio de Martin)
8. VFA (vainas de frijol-agar)
9. AA (agua-agar)
10. HMA (harina de maíz-agar)
11. JFA (jugo de frijol-agar)
12. JTA jugo de tomate-agar)
13. MSA (malta-sal-agar)
14. BA (Bonner Addoat)
15. BK (medio B de King)

La mayor parte de los hongos existen en la naturaleza y proliferan con facilidad en

presencia de fuentes simples de nitrógeno y carbohidratos. Los cultivos para hongos se
hacen comúnmente en juegos de pares, uno incubado entre 25 a 30 °C y el otro entre 35 a
37 °C.

MATERIALES

 Asa microbiológica
 Pinzas de disección
 Agujas de disección
 cajas de PETRI con Medio PDA-A
 Mechero
 Soporte con anillo
 Cultivo de hongo sin purificar

METODOLOGÍA
1. Tomar con asa microbiológica una porción del crecimiento miceliar de Colletotrichum
gloesporioides.
2. Colocar esta muestra en el centro de una placa de agar nutritivo PDA-A.
3. Introducir una varilla acodada de vidrio en un vaso con etanol.
4. Flamear brevemente la varilla empapada en etanol y dejarla enfriar.
5. Extender la muestra uniformemente por la superficie del agar usando la varilla estéril e
incubar con temperatura controlada a 37°C.
6. Repetir dos veces más para tener un triplicado. Repetir el mismo procedimiento con el
cultivo saturado.
7. Colocar todas las cajas sembradas en la incubadora en posición invertida a 20°C durante
8 días (comprobar el crecimiento).
9. En la siguiente sesión, examinar las cajas y registrar los resultados para cada tipo de
medio de cultivo.
10. Regresar las cajas al profesor para que se desechen adecuadamente.

Figura 1. Técnica de siembra por extensión con varilla de vidrio

 Figura 2. Colletotrichum
gloesporioides aislado de
Dioscorea alata cv.
Florido. (A) Colonia
cultivada en medio PDA
luego de 7 días de
incubación. (B) Apresorios
circulares con márgenes
enteros y (C) conidios
ovoides, cilíndricos y con
ápices obtusos. Barra = 10
μm.

BIBLIOGRAFÍA

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