adn antiguo2.

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INTRODUCCIÓN. Figura 2.
Dóble hélice

E
l avance y sofisticación de las de ADN.
técnicas en biología molecular ha
permitido uno de los grandes
hitos de la ciencia moderna: la posi-
Fernández Pérez-Pérez A.
bilidad de recuperar material genéti-
Domínguez E.
co de restos biológicos antiguos. Las
posibilidades que esta nueva disci-
plina -a la que denominamos "pale-
ogenética"- ofrece son múltiples:
caracterización genética de nuestros
autenticidad de algunos de los resul-
antepasados próximos, análisis del
tados obtenidos. Algunos investi-
material genético de especies extin- Turbón D. Arroyo-Pardo E.1 gadores creyeron que las secuen-
tas para tratar de esclarecer su
Unidad de Antropología cias de ADN presuntamente
relación con otras actuales -por Departamento de Biología Animal antiguas no eran sino ADN moderno
ejemplo, los Neandertales- o el Facultad de Ciencias Biológicas introducido en la muestra por fallos
seguimiento de migraciones históri- Avda. Diagonal 645
27
de procedimiento; es decir, lo que los
cas o prehistóricas. 08028-Barcelona.
especialistas denominan "contami-
Toda la tecnología empleada en el 1
Laboratorio de Biología Forense
naciones".5-7 Con la llegada de la
estudio de biomoléculas antiguas Departamento de Toxicología y Reacción en Cadena de la
tiene una base teórica y fisicoquími- Legislación Sanitaria Polimerasa (PCR)8,9 -y en parte con
ca de gran importancia. Los orígenes Facultad de Medicina la secuenciación automática- la tec-
Universidad Complutense de Madrid nología del ADN antiguo (ADNa) ha
de esta nueva disciplina cabe bus-
28040-Madrid sufrido una auténtica revolución (ver
carlos a mediados de los años 80 E-mail: earroyop@med.ucm.es
con el trabajo pionero de Higuchi y figura 3). La PCR ha hecho posible
colaboradores.1 Gracias a este
equipo se obtuvo por vez primera ADN de una especie
extinta: el cuagga (Equus quagga), un équido de África
del Sur que se extinguió hace aproximadamente 140
años. Desde entonces se ha conseguido aislar ADN de
restos de una gran variedad de especies vegetales y
animales, incluido el hombre (ver figuras 1 y 2).2-4
Desgraciadamente, este entusiasmo inicial se trocó al
poco tiempo en escepticismo al ser puesta en duda la

Figura 1.
Esquema de la
situación del
ADN dentro Figura 3. Esquema de la Reacción en Cadena de la
del núcleo Polimerasa (PCR). El proceso iterativo (ciclos) aumenta
celular. el número de copias de ADN.

ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES

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la obtención de información genética a partir de canti-
dades ínfimas y muy fragmentadas de ADN y el uso de
secuenciadores automáticos ha permitido analizar de
forma rápida la variabilidad de las secuencias, para
comparar muestras antiguas con modernas, e inferir así
conclusiones filogenéticas.
más satisfactorios (ver figura 4).13 Particularmente los
dientes constituyen un depósito natural de ácidos nu-
cleicos notablemente protegido de factores medioam-
bientales.6

En general, hay que abordar tres problemas clave para

garantizar el éxito en la recuperación de ADNa:

a) La presencia de inhibidores de la Taq polimerasa,

derivados del suelo en que se ha conservado el resto o
de procesos bioquímicos degradativos acontecidos tras
la muerte del individuo.

b) El aislamiento de ADN "template" auténticamente Figura 4. Imagen de un insecto encerrada en ámbar. La

antiguo, libre de ADN exógeno moderno.
c) El daño molecular ocasionado en el ADN antiguo
recuperado.
Desde que aparecieron las primeras publicaciones
sobre ADNa a mediados de los años 80, estos tres pun-
tos han sido objeto de controversia. Los trabajos ini-
ciales de Höss y Pääbo10 y de Tuross11 no sólo permi-
tieron en su momento profundizar en los fundamentos
moleculares de estas dificultades sino que sentaron las
bases para un estudio más profundo del ADNa, que
excedía con mucho la mera recuperación de fragmen-
tos mediante PCR. De hecho, fueron ellos los que
establecieron que la extracción y amplificación del ADN
28 antiguo se complica por todos aquellos mecanismos de
descomposición que acompañan a las muestras ente-
rradas o suficientemente antiguas. Como demostraron
aquellos trabajos pioneros, el ADN se comporta como
otras moléculas que, tras la muerte del individuo, pasan
de la biosfera a la geosfera.12 Desgraciadamente, este
enfoque sólo se abordó decididamente a mediados de
los años 90.
posibilidad de recuperar ADN de este tipo de fósiles ha sido
objeto de mucha controversia.
Tras la muerte de un organismo su ADN es rápidamente
degradado por nucleasas endógenas. Ciertas condi-
ciones pueden ralentizar e incluso detener este proce-
so, como una rápida deshidratación que impida la
actuación de microorganismos, la presencia de ele-
vadas concentraciones de sales o las altas tempera-
turas (ver figuras 5 y 6). Una vez esta actividad
endonucleásica ha cesado, hongos y bacterias colo-
nizadoras continúan el proceso degradativo. Tras la
acción de estos microorganismos el ADN todavía queda
a merced de procesos de degradación química medi-
ante reacciones de hidrólisis y oxidación.

Por último, a juicio de algunos autores5, a los resultados

obtenidos a partir de restos no humanos, se les debe
Figura 5. Los individuos momificados pueden ser objeto de
pedir un cierto "sentido filogenético"; es decir, que su
toma de muestras para estudios de ADN antiguo.
amplificación produzca resultados no humanos y que,
además, esté de acuerdo con la información filogenéti-
ca disponible para la especie en cuestión. Este criterio
-en parte discutible- no puede aplicarse con el mismo
rigor al caso de los restos humanos; pero debe sub-
rayarse en todos los demás aspectos el procedimiento
metodológico es, salvo excepciones, el mismo en
humanos que en otros organismos vivos. A lo largo del
presente trabajo revisaremos las cuestiones más can-
dentes desde los inicios de la bioquímica del ADN
antiguo hasta el presente.

1.- DAÑO Y DEGRADACIÓN DEL ADN ANTIGUO

El material de partida para los estudios de ADN antiguo
es variado, normalmente restos de tejidos blandos (por
ejemplo, piel y músculo) o huesos y dientes, siendo
estos dos últimos materiales los que ofrecen resultados
Figura 6. Yacimiento neolítico de Tell Halula (Siria). Las
condiciones climáticas favorecen una rápida evaporación del
agua, una elevada tasa de racemización y una preservación
de ácidos nucleicos.

ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES

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Como consecuencia de estos procesos el material
genético preservado en restos antiguos presenta un
conjunto de características que lo diferencian del ADN
de organismos actuales (ADN fresco) y que impone un
conjunto de limitaciones a su recuperación (ver figura
7).
Figura 7. Corte
esquemático de
un diente. El
interior de la
cámara pulpar
retiene gran
cantidad de
ADN post-
mortem.
En primer lugar, el ADN antiguo está sumamente frag-
mentado. Algunos autores mantienen que no es posible
la amplificación por PCR de fragmentos de ADN de
tamaño superior a 150 pares de bases (bp) en tejidos
blandos.3 Este límite es sensiblemente superior en teji-
dos sólidos como hueso o diente, siendo de 300 pares
de bases (bp) para ADN mitocondrial y de poco más de
100 bp para material nuclear.14,15 La longitud del frag-
mento a amplificar guarda una relación inversamente
proporcional con la cantidad de producto obtenido tras
la amplificación.16 Sin embargo no parece existir una
correlación entre la antigüedad de la muestra y su
grado de fragmentación.3 Esto se debe a que la
degradación del ADN depende más de las condiciones
medioambientales en sí, que del tiempo que éste ha
estado expuesto a ellas. Así, aunque la cantidad total de
ADN antiguo presente en la muestra sea en principio
suficiente para garantizar su recuperación mediante
una PCR exitosa, la fragmentación de este material
hace que sólo sean recuperables aquellos fragmentos
más pequeños.
En la estructura del ADN existen dos lugares especial-
mente sensibles a la hidrólisis: los enlaces fosfodiéster,
que unen las diferentes desoxirribosas entre sí, y los
enlaces glicosídicos, que conectan éstas a las bases
nitrogenadas (ver figura 8). La rotura de los enlaces
fosfodiéster rompe la cadena de ADN y la de los
enlaces glicosídicos suele provocar la pérdida de la
base nitrogenada correspondiente formándose sitios
apurínicos (AP sites) o sin base (baseless) en un pro-
ceso conocido como depurinización o depirimidinación.
Este proceso tiene lugar "in vivo" aproximadamente
cada 10 horas, aunque puede verse acelerado por fac-
tores como la temperatura, la fuerza iónica del entorno,
el pH o la presencia de metales pesados. Tras la pro-
ducción de un sitio apurínico, puede tener lugar la rotu-
ra, conocida como β-eliminación, de la cadena de ADN
en ese punto.
Figura 8. Posibles sitios moleculares susceptibles de daño
molecular.
Además del daño hidrolítico, el ADN está sometido a
alteraciones de carácter oxidativo durante el proceso de
descomposición. Este daño se da bien por efecto de
una radiación ionizante directa sobre el ADN, bien por la
acción de radicales libres, generalmente del tipo
superóxido (O2+), peróxido de hidrógeno (H2O2) e
hidroxilo (OH-), o bien por otras especies reactivas
como el electrón hidratado (eaq-) y los protones (H+).
Todos estos compuestos, esencialmente subproductos
de reacciones celulares endógenas, también pueden
29
ser generados tras la exposición de la célula a radia-
ciones ionizantes, luz ultravioleta o ser el resultado de
degradación bacteriana y/o fúngica. Algunas de estas
especies pueden reaccionar con las bases nitroge-
nadas del ADN modificándolas, como sucede con los
electrones hidratados y los protones producidos por
radiación ionizante en solución acuosa.17,18 Otras en
cambio, como el radical superóxido (O2- ) y el peróxido
de hidrógeno (H2O2) no producen daño directo en el
ADN salvo cuando son convertidos en OH-.19 Como
ejemplo de daño molecular fisiológico, se ha comproba-
do in vivo que los radicales hidroxilo pueden modificar
las proteínas asociadas al ADN originando enlaces
covalentes ADN-proteína (DPCs: ADNprotein cross-
links). También puede suceder que el radical hidroxilo
arranque un protón del grupo metilo de la timina.17
Además, la presencia de iones hierro, cobre y otros
compuestos, sobre todo cuando estos iones no están
quelados, facilita la formación de radicales hidroxilo a
partir de O2- y H2O2 que producen un daño extensivo
en el ADN.20
La adición de estas especies reactivas a los dobles
enlaces de la molécula de ADN se traduce en la forma-
ción de aductos con capacidad de bloquear la PCR,
haciendo que aunque se obtenga ADN endógeno, éste
sea inservible.
Tras analizar diversos extractos de ADN de tejidos de
diferentes épocas mediante Cromatografía de Gases /
ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES
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Espectrometría de Masas (GC/MS) se comprobó que Tabla 1. Comparación de tres protocolos para la extracción
un gran porcentaje de las bases nitrogenadas estaba de ADNa.
modificado.21 La 5-OH-5-Metil Hidantoína es uno de los
productos mayoritarios resultantes de la degradación de
la timina en ADN expuesto a radiaciones γ, mientras
que la 8-OH-Guanina se genera tras el ataque de radi-
cales hidroxilo. La cantidad de los dos primeros tipos de
modificaciones en los extractos de ADN guarda una
relación inversa con la eficiencia de su amplificación,
probablemente causada por el bloqueo que provocan
estos productos en la PCR.

El radical hidroxilo reacciona con la mayoría del ADN

por adición a los dobles enlaces de las bases; sin
embargo, una pequeña cantidad también reacciona con
el esqueleto de azúcar arrancando un protón y origi-
nando radicales de azúcares.17 Estos azúcares daña-
dos pueden encontrarse en forma libre o unidos todavía
al ADN.22,23

2.- AISLAMIENTO DEL ADN ANTIGUO Y

CONTAMINACIÓN
Otra de las dificultades del aislamiento del ADN antiguo
es la posibilidad de contaminación con ADN moderno,
de manera que se amplifique éste en vez de aquél.24
Desde los inicios de la disciplina del ADN antiguo se ha
propuesto un conjunto de criterios para tratar de contro-
lar esta contaminación exógena.

30 Primero se propuso una esterilización extensiva de las

áreas de trabajo con HCl seguida de su exposición a luz
UV. Con el HCl se buscaba producir la hidrolisis ácida
del ADN y con la radiación UV, la formación de aductos
covalentes no válidos para la reacción de PCR. El si-
guiente paso, la delimitación de áreas de trabajo -la
separación de las áreas de extracción de ADN respec-
to de las de amplificación del ADN- pretendía anular la
posibilidad de carry-over, término mediante el cual se
designa el arrastre de moléculas de ADN provenientes
de amplificaciones anteriores.25 Además, se impuso el
uso de campanas de flujo laminar o de seguridad
biológica, instrumentos imprescindibles que impedían la
contaminación de las muestras en el área de trabajo.
Todas estas medidas de seguridad "clásicas" siguen
todavía hoy vigentes, si bien durante los últimos años
otras nuevas han venido a sumarse.
Con motivo de la polémica suscitada acerca de la ampli-
ficación real de ADN antiguo, Béraud-Colomb y cola-
boradores26 describieron detalladamente en 1995 las
precauciones que debían tomarse para minimizar la
contaminación potencial de ADN moderno exógeno,
añadiendo ocho medidas de seguridad adicionales a las
preexistentes (ver tabla 1). La novedad de sus pro-
puestas radicaba en un exhaustivo control de los re-
activos así como el empleo sistemático de controles en
la reacción de PCR.
Tras la secuenciación en 1997 de la región D-loop del
ADN mitocondrial de un resto neandertal por el equipo
de Svante Pääbo9, Ward y Stringer introdujeron cuatro
puntos adicionales para la recuperación fiable de este
tipo de material genético en restos antiguos.27 Su pro-
puesta incorporaba parámetros bioquímicos como
medida indirecta de la degradación del ADN tales como
la racemización de aminoácidos,28 además de la estima
del número de moléculas "template" intactas. Según
estos autores si la amplificación se inicia a partir de un
número demasiado bajo de estas moléculas, se pro-
ducen resultados inconsistentes y poco fiables.
Tradicionalmente esta determinación se ha venido
haciendo por "PCR competitiva", pero actualmente este
método está siendo desplazado por la PCR en tiempo
real o Real Time PCR (RT-PCR), mucho más sensible y
específico.
Otro punto novedoso del protocolo de Ward y Stringer
consiste en la clonación de los productos amplificados.
Esta técnica permite separar las diferentes moléculas
de cada producto final de amplificación, resultando útil
para detectar ADN contaminante y posibles errores de
la Taq polimerasa introducidos durante el proceso de
amplificación.
Por último, los dos autores consideraban necesario
repetir las amplificaciones, para confirmar los resulta-
dos. El último de estos criterios, introducido a raíz del
trabajo de Krings et al 29 implica la replicación del pro-
ceso de extracción y amplificación en dos laboratorios
independientes. De esta forma puede conseguirse

ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES

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monitorizar la contaminación introducida por los investi-
gadores directamente implicados en el análisis de las
muestras, así como el ya mencionado carry over in-
herente a cada laboratorio.
3.- INHIBIDORES DE LA REACCIÓN DE PCR:
La co-purificación junto con el ADN procedente de teji-
dos blandos, huesos y dientes de otras sustancias fue
observada ya en los primeros estudios de ADN
antiguo.2,3,30,31 Posteriormente, con la generalización
del uso de la PCR en el campo del ADNa, se relacionó
esta observación inicial con la presencia, en algunos de
estos extractos, de sustancias inhibidoras de esta re-
acción.
Los mecanismos de acción de estas moléculas
inhibidoras continúan siendo un misterio, pero existe un
conjunto de observaciones empíricas que ofrecen
interesantes pistas al respecto.
Por ejemplo, la inhibición aparece en diferentes extrac-
tos de diferente procedencia y el patrón de absorción de
luz de ciertos extractos con poder inhibidor difiere de
aquellos que no tienen este poder. Muchos extractos
con capacidad inhibidora presentan una coloración
marrón y, en algunos casos, al visualizar una alícuota
de los mismos en un gel de electroforesis se ha obser-
vado la emisión de fluorescencia. El protocolo de
extracción convencional de ADN (método Fenol-
Cloroformo) no consigue eliminar estas moléculas
inhibidoras. Además éstas son retenidas por el filtro de
30000 daltons utilizado para concentrar el ADN en el
paso final de extracción.
En todo caso existen estrategias para eliminar o ate-
nuar la inhibición, bien aumentando la pureza del ADN
extraído, bien tratando de contrarrestar el efecto
inhibidor durante la propia reacción de amplificación. La
mayor parte de estas medidas resultan en un incre-
mento del riesgo de contaminación con ADN exógeno
de la muestra, pues aumentan la manipulación por
parte del investigador. Sin embargo existen otras que
producen mejoras sustanciales en la amplificación y
que no presentan este inconveniente, como es el alma-
cenamiento de los extractos en frío durante varios días
previamente a su amplificación. Este procedimiento
provoca la formación de un precipitado blanquecino que
queda adherido a la pared del tubo y cuya eliminación
por precipitación consigue revertir la capacidad de
amplificación.32,33
La naturaleza del inhibidor está todavía por determinar,
aunque se han propuesto un conjunto de moléculas
candidatas, básicamente compuestos del suelo o pro-
ductos de degradación del organismo. A continuación
se citan los más importantes.
Ácidos húmicos y fúlvicos
La posible acción inhibidora de los ácidos húmicos y
fúlvicos sobre las enzimas de biología molecular fue
señalada por vez primera por Svante Pääbo.3 Los áci-
dos húmicos y fúlvicos son una familia de moléculas
muy abundantes en el suelo, que pueden acompañar al
ADN en el proceso de purificación y que son inhibidores
muy potentes de la reacción de PCR (ver figuras 9 y
10). Tan solo 100 ngr. de ácido fúlvico son suficientes
para la inhibición total de una amplificación control de
fago λ.11 Las propiedades fluorescentes de esta familia
de compuestos se han relacionado con la fluorescencia
observada en agarosa de algunos de los extractos de
ADN antiguo.
Residuos de porfirinas o productos derivados de su
degradación:
Los derivados de la porfirina o sus productos de
degradación han sido señalados como tales inhibidores
por algunos autores durante los años 90.32,33 La acción
inhibidora de estas moléculas se debe a su capacidad
para secuestrar iones metálicos, necesarios para el fun-
cionamiento de polimerasas, gracias a estructuras si- 31
milares al grupo hemo. Las porfirinas se encuentran
presentes en sangre, tejidos blandos y en hojas vege-
tales, y constituyen una familia molecular que puede
considerarse como derivada de un compuesto tetrapi-
rrólico original: la porfina. Las porfirinas más abun-
dantes son las protoporfirinas y aunque pueden
describirse quince protoporfirinas isómeras, solo una
Figura 10. Estructura química del ácido húmico.
Figuras 9 . Estructura química del ácido fúlvico.
ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES
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forma, la protoporfirina IX, está presente en la natu-
raleza.
La protoporfirina IX forma complejos quelatos tetraden-
tados con iones diversos (hierro, zinc, níquel, cobalto,
etc) y también con iones magnesio, en los que el metal
se une por enlaces coordinados a los 4 nitrógenos de
los anillos pirrólicos. La capacidad de la protoporfirina
IX para quelar iones magnesio, necesarios para el fun-
cionamiento de la Taq polimerasa, hace que este tipo
de compuestos presente un poder inhibidor de la re-
acción de PCR potencial.1 Además, los derivados por-
firínicos tienden a formar agregados que quedan así
retenidos junto al ADN en la membrana de muchos pro-
cedimientos de filtrado, como el Centriplus 30000,
empleados durante la extracción de ADN antiguo.
Productos de Maillard
La reacción de Maillard es sobradamente conocida en
el campo de la tecnología de los alimentos desde me-
diados de los años 60. Consiste en la reacción de un
grupo carbonilo con un grupo amino para dar una serie
de intermediarios como compuestos carbonílicos (cade-
nas carbonílicas) y deoxiosonas, estos últimos cuando
hay azúcares implicados en la reacción. Aunque los
productos de Maillard son muchos y variados -desde
grupos carbonilo unidos a cadenas cortas de carbono
hasta heterociclos como furanos y pirroles- el producto
final de la reacción son las melanoidinas, cuya estruc-
tura es en buena parte desconocida. Su coloración ma-
32 rrón y su elevado peso molecular -hasta 100.000 dal-
tons- ha sido relacionada por muchos autores con la
capacidad inhibidora de algunos extractos de ADNa.3,4
Los productos de Maillard pueden tener numerosos gru-
pos reactivos, entre los que se cuentan los grupos
hidroxilo, carbonilo y metilo que pueden reaccionar con
el ADN.
El propio daño molecular en el ADN puede inducir la
producción de reacciones de Maillard, puesto que las
pentosas liberadas tras la ruptura de sus enlaces fos-
fodiéster y N-glicosídico constituyen también un sustra-
to para esta reacción.
Productos de degradación del ADN
La degradación del material genético, sea por rotura de
sus enlaces o por modificaciones químicas tales como
la reducción de azúcares, genera ciertos productos
capaces de inducir la inhibición directa de su propia
amplificación.34-36
No hay que confundir sin embargo el poder inhibidor de
un extracto de ADNa con la imposibilidad de su amplifi-
cación. El daño extensivo en el ADN (por frag-
mentación, por modificación de sus bases...) hace in-
viable su amplificación. Sin embargo a menos que éste
genere productos capaces de interferir en la reacción
de amplificación no podrá hablarse de inhibición sensu
strictu.
ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES
Algunos autores han estudiado el efecto del daño post-
mortem en los resultados de secuencias de ADNa y han
podido detectar directamente transiciones denomi-
nadas de "tipo 1" (A->G ó T->C) y de "tipo 2" (C->T ó G-
>A) que pueden enmascarar como mutaciones lo que
no es más que un daño molecular.37 Por este motivo,
dado que una reducción de 20ºC en la temperatura
implica una disminución de entre 10 y 25 veces en la
tasa de reacciones químicas, la congelación de mues-
tras puede ser un factor determinante a la hora de
preservar un ADN durante largo tiempo. Así, para mues-
tras de gran antigüedad, en el período comprendido
entre 40000 y 50000 años, la baja temperatura parece
ser de gran importancia para la ralentización de los pro-
cesos responsables de la degradación de los ácidos
nucleicos durante el período postmortem.21
4.- ESTEREOQUÍMICA DE AMINOACIDOS Y ADN
ANTIGUO:
Todos los aminoácidos a excepción de la Glicina
pueden presentarse en dos formas isoméricas -L y D-
pero en la biosíntesis proteica únicamente son uti-
lizadas las formas L. Cuando un organismo muere sus
aminoácidos sufren un proceso de racemización38 cuya
tasa difiere para cada aminoácido y a su vez, depende
de factores tales como la presencia de agua, la tempe-
ratura, el pH y la quelación de ciertos iones metálicos a
las proteínas. Muchos de estos factores afectan tam-
bién a la principal reacción hidrolítica responsable de la
degradación espontánea del ADN, la depurinización.
Por esta razón, se ha considerado el estudio de la
racemización de los aminoácidos como un método útil a
la hora de estimar la probabilidad de recuperar informa-
ción genética fiable de un resto antiguo. En 1975,
Helfman y Bada28 observaron que durante el enveje-
cimiento se va produciendo una racemización gradual
del ácido aspártico, en la dentina y en el esmalte den-
tario, de forma que el incremento de la concentración de
D-aspártico es dependiente de la edad con una tasa de
transformación del 0,1% al año.39 A partir de estos ha-
llazgos, han sido muchos los equipos de investigación
que han utilizado la racemización de este aminoácido
para estimar la edad de un resto cadavérico.34,40 Así, se
ha medido la racemización en tejidos con una baja tasa
de "turn-over" proteico, tales como sustancia blanca del
cerebro40, discos intervertebrales41, fibras elásticas del
parénquima pulmonar42, cristalino ocular43 y hueso.44
Teniendo en cuenta que la racemización de los amino-
ácidos sigue una ley de tasa reversible de primer orden,
la reacción de la racemización es:
donde D/L es la relación de formas D y L y t es el tiem-
po. El término logarítmico t=0 describe la cantidad de
ácido D-aspártico formado mediante el procedimiento
de hidrólisis con HCl 6 M a 100ºC durante 6 horas y K
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expresa la tasa de racemización.
Mediante esta ecuación se ha podido observar que la
tasa de racemización es de 5,3 x 10-3 para la fracción
peptídica ácido-soluble de la dentina45,46; de 3,1 x 10-3
para el cartílago39, y de solo 1,8 x 10-3 para la corres-
pondiente fracción de hueso. En la fracción de colágeno
ácido-insoluble de la dentina es de 1,0 x 10-3 y de 3,3 x
10-3 en cartílago47,48, con un valor para hueso de solo
0,47 x 10-3.49 No parece muy fácil explicar el porqué la
tasa de racemización difiere entre las dos fracciones de
hueso y no de cartílago. La diferencia entre los dos
compartimentos de la dentina es más sencilla de
explicar dado que el colágeno en este tejido no está
sujeto a ninguna remodelación, mientras que la fracción
peptídica ácido-soluble puede tener intercambio nutri-
cional con la circulación a través de los túbulos y per-
itúbulos de dentina (ver figura 11).
Figura 11. Toma
de muestra de
dentina para su
posterior empleo
en análisis de
aminoácidos. Se
trabaja en entorno
estéril con un ta-
ladro.
Una de las explicaciones para justificar que la co-
rrelación entre D/L y la edad sea menor en hueso que
en dentina o en cartílago, es la elevada remodelación
del primero o que pueda existir contaminación con pro-
teínas de otras fuentes como tejido conectivo y sangre
que pueden incrementar de forma significativa la canti-
dad de forma L.
También se ha estudiado el grado de racemización de
otros aminoácidos como alanina y leucina, pero el ácido
aspártico tiene la ventaja de que tiene una alta energía
de activación y su tasa de racemización es una de las
más rápidas y es constante en un amplio rango de tem-
peratura (a pH neutro).
Según parece, los factores que influyen en el proceso
de racemización son también responsables de la
degradación del ADN.38 Tras estudiar el grado de
racemización de muestras de diferentes organismos y
épocas, Poinar y colaboradores establecieron que para
relaciones D/L Aspártico mayores de 0.08 no era posi-
ble obtener una secuencia fiable de ADN. Parecía exis-
tir además una relación clara entre la amplitud de este
aminoácido y la longitud de secuencia de ADN que
podía recuperarse: en muestras con una D/L igual a
0.05 se obtenían secuencias de entre 140 y 340 pares
de bases, mientras que en aquellas con una tasa de
racemización mayor tan sólo era posible amplificar frag-
mentos más cortos.49
La ventaja de este método es que permite identificar
aquellas muestras antiguas que no contienen ADN
antiguo endógeno y amplificable de una forma rápida y
sin necesidad de destruirlas totalmente. Sin embargo, al
carecer el método de Poinar y colaboradores de una
estandarización en cuanto al tipo de tejido estudiado,
cabría plantearse si los valores de racemización pro-
puestos son extrapolables a otros estudios de ADN
antiguo realizados con un material diferente.
5.- REAL TIME-PCR y ADN ANTIGUO.
Los procedimientos de Real Time PCR (RT-PCR) han
desplazado hoy en día a otras técnicas para la cuantifi-
cación de ADN. Debido a su sensibilidad y especificidad
su uso se ha incorporado rápidamente en el campo del
ADNa.
La variante más famosa de esta técnica necesita de un
par de primers o cebadores e incorpora además una
sonda marcada (sonda TaqMan) complementaria a la
región de ADN que se quiere amplificar. Los pasos del
proceso pueden verse en la figura 12. La sonda en
cuestión presenta un reporter fluorescente (TAMRA) en
un extremo y un quencher no fluorescente en el otro,
que absorbe la fluorescencia emitida por el reporter
cuando ambos están unidos a la sonda.
33
Figura 12. Esquema de la PCR en tiempo real o “Real
Time PCR”.
Si la secuencia blanco está presente, la sonda hibrida
con ella y se inicia la elongación a partir del extremo 3'
del primer forward, como en una reacción normal de
PCR. Ahora bien, cuando la cadena en elongación,
junto con la polimerasa, alcanza el extremo 5' de la
sonda, ésta es degradada por la actividad 5' exonu-
cleasa que presenta la polimerasa. El resultado es que
el quencher es separado del reporter de manera que la
señal del reporter se ve considerablemente aumentada.
El número de moléculas iniciales de ADN es propor-
cional a la intensidad de fluorescencia emitida.
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Midiendo esta fluorescencia puede estimarse la con-

centración de un ADN problema comparándola con
unos patrones de concentraciones conocidas.

Recientemente la casa comercial Applied Biosystems

ha comercializado una nueva modalidad de sondas,
denominadas TaqMan MGB (Minor Groove Binding),
que presentan la particularidad que se unen al surco
pequeño de la doble hélice de ADN y aumentan así la
temperatura de desnaturalización Tm, permitiendo el
uso de sondas con menos pares de bases.

La ventaja de este procedimiento es que permite cuan-

tificar una secuencia de ADN específica y no la cantidad
total de ADN, tal y como sucede con otras técnicas
como la espectrofotometría. Además, marcando dife-
rentes sondas con diferentes fluorocromos pueden
cuantificarse distintas secuencias a la vez. La principal
desventaja es que este método requiere una sonda
diferente para cada secuencia a cuantificar, lo que suele
encarecer bastante el proceso. Un ejemplo de RT-PCR
puede verse en la figura 13.

Figura 14. Estructura genética del ADN mitocondrial.

Figura 15.
Retrato de la
familia imperial
Zarista. El mis-
terioso destino
34 Figura 13. Ejemplo de un resultado de RT-PCR producido
de la princesa
Anastasia solo
por un extracto de ADN procedente del yacimiento neolítico
pudo resol-
de Tel-Hallula (Siria), con una antigüedad aproximada de
verse por el
unos 10.000 años. Los colores verde y rojo corresponden a
estudio del
dos réplicas de la misma muestra que aparecen casi super-
ADN de sus
puestas. Como se ve, a partir de los 33 ciclos de PCR -eje
restos.
de abcisas- la fluorescencia crece exponencialmente
(Imagen de los autores).

6.- ALGUNOS EJEMPLOS DE ANÁLISIS DE ADNa:

Identificación del Duque de Widukind:
Göttingen (Alemania) y, de momento, nada ha podido
concluirse acerca de la identidad de los tres individuos
El duque de Widukind vivió en el siglo VIII y fue el jefe
estudiados.
de los sajones que combatió por la fuerza de las armas,
durante 7 años, la cristianización y el imperio franco de
La identificación de los Romanov:
Carlomagno, antes de bautizarse finalmente en 785.
Tras su muerte, acaecida entre el 900 y el 910 d.C., su
Durante el golpe de estado bolchevique en la Rusia de
cuerpo fue enterrado en la Iglesia de Enger, en
1917, la familia imperial zarista fue apresada por los
Westfalia (Alemania). El estudio realizado en su sepul-
insurgentes. El Zar Nicolás II, la Zarina Alejandra y sus
tura encontró, junto al supuesto esqueleto de Widukind,
cinco hijos, Olga, Tatiana, María, Anastasia, y el
el de otros dos individuos de origen desconocido.50 Las
Zarevich Nicolás fueron capturados y, el 16 de julio de
condiciones de enterramiento hicieron posible la recu-
1918, asesinados junto a dos sirvientes y al doctor
peración de secuencias de ADN mitocondrial de los tres
Botkin, médico de la familia, en la casa Ipatiev, en
individuos (ver figura 14). Dos de ellos poseían las
Ekaterimburgo (ver figura 15). Los cadáveres fueron
mismas mutaciones mitocondriales indicando la posible
rociados con cal viva y enterrados en una fosa común,
relación por vía materna, ya que el ADN mitocondrial se
si bien por el relato de los propios asesinos, dos cuer-
hereda solo matrilinealmente, mientras que el tercero
pos fueron enterrados en un lugar diferente (supuesta-
difería en una única mutación de los otros dos. A fecha
mente los de Anastasia y el Zarevich Nicolás). En 1919
de hoy, el estudio molecular de los restos de la iglesia
el forense Nicolai Sokolov documentó el hecho pero
de Enger continúa realizándose en la Universidad de

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hubo que esperar hasta 1991 en que unos historiadores
amateur descubrieron una fosa común con 9 cuerpos.
En 1992, se inició un estudio genético para tratar de
aclarar la procedencia de los restos. Se estudiaron
diferentes marcadores genéticos: ADN mitocondrial,
secuencias cromosómicas de microsatélites y ADN de
cromosomas sexuales (gen de la amelogenina). Este
último tipo, utilizado comúnmente para asignar molecu-
larmente el sexo a una muestra, permitió saber que se
trataba de 4 restos de varón y 5 de mujer, tal y como
establecía el registro histórico. El estudio de los
microsatélites de ADN demostró que los esqueletos 4 y
7 eran padres de 3, 5 y 6. Los restos 1, 8 y 9, al no estar
relacionados, podrían ser los sirvientes. Para saber si
los individuos estudiados eran o no los Romanov se
recurrió a comparar su ADN con el de descendientes
actuales vivos por línea materna. El príncipe Felipe de
Inglaterra, actual duque de Edimburgo, al estar rela-
cionado por vía materna con la Zarina Alejandra, debía
compartir con ella su mismo ADN mitocondrial. De la
misma manera, el ADN mitocondrial de los descen-
dientes de Louisse de Hessen-Cassel, emparentados
debía ser idéntico al del Zar Nicolás II (ver figura 16).
Figura 16. Arbol genealógico de la Zarina Alejandra (a) y
del Zar Nicolás II (b). Los individuos sombreados com-
parten el mismo ADN mitocondrial (Tomado de Gill et al.
1994, Ref. 51).
El resultado de los análisis realizados apoya la hipóte-
sis de que los restos se correspondían con los del
crimen de Ekaterimburgo: los individuos 4 y 7 eran el
Zar y la Zarina respectivamente; 3, 5 y 6 eran sus hijas;
1, 8 y 9 eran los sirvientes y el 2 era el Dr. Botkin.51 Este
mismo estudio permitió aclarar el enigma de la supues-
ta princesa Anastasia -Ana Anderson- que desde 1921
decía ser hija del Zar y que finalmente presentó una
secuencia mitocondrial inconsistente con los restos
encontrados.52 A pesar de todo, esta investigación ha
recibido también críticas.53
El enigma de los neandertales.
Los neandertales (Homo sapiens neanderthalensis)
poblaron Europa y Oriente Próximo entre hace 200.000
y 30.000 años aproximadamente (ver figura 17). En
torno al 40.000-30.000 B.P. comenzó a proliferar y
extenderse una nueva forma humana que los expertos
han pasado a denominar hombre anatómicamente
moderno (Homo sapiens sapiens), debido a su mor-
fología más grácil, semejante a la actual. Durante algún
tiempo ambas subespecies coexistieron hasta que los
neandertales fueron absorbidos o desplazados por los
hombres anatómicamente modernos. Este hecho ha lle-
vado a los paleontólogos a preguntarse hasta qué punto
no hubo hibridación entre ambas formas y si entre
ambos taxa no existió relación filogenética.
Figura 17. Cráneo de Hombre
de Neanderthal. Pese a su
antigüedad (30000-150000
años), este tipo de restos pre-
senta cierto número de copias
integras de ADN.
35
En 1997, Mathias Krings, del equipo de Svante Pääbo,
consiguió secuenciar la región de control I (HVR-I) de
un ADN mitocondrial extraído de un húmero derecho del
ejemplar tipo del hombre de Neandertal, encontrado en
la cueva de Feldhofer, en Alemania, cerca de
Düsseldorf, en 1856, y que se conservaba en el
"Rheinisches Landesmuseum" de Bonn.29 Los fósiles
hallados en Feldhofer fueron datados entre 40.000 y
50.000 años. El procedimiento empleado consistió en
amplificar mediante PCR una serie de fragmentos cor-
tos solapantes a partir de 3.5 gr de polvo de hueso. Se
realizó un estudio de racemización de aminoácidos y,
además, cada fragmento amplificado fue clonado hasta
8 veces, estableciéndose una secuencia consenso.
Finalmente, los fragmentos fueron ensamblados hasta
completar la secuencia de la región en cuestión. Este
análisis fue replicado por Mark Stoneking y Anne Stone
en Pennsylvania State University (USA) para monito-
rizar la posible introducción de ADN exógeno a la mues-
tra.
El estudio comparado de la secuencia neandertal
obtenida y un gran número de secuencias humanas
actuales demostró que aquella se situaba totalmente
fuera del rango de variación de estos últimos: la
secuencia neandertal presentó 27 diferencias con
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respecto a una secuencia consenso
de referencia54, mientras que los
humanos actuales difirieron tan solo
en 5-8 posiciones. Posteriormente,
fue secuenciada la región de control
II (HVR-II) del mismo ejemplar tipo e
incluso otros ejemplares de nean-
dertal, que resultaron ser consis-
tentes con la primera secuencia
original.55-57 Krings, Pääbo y cola-
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en su artículo que los neandertales
no habían contribuido al "pool"
genético de los humanos actuales,
a pesar de que su trabajo se basa-
ba en una secuencia única. Este tra-
bajo y las conclusiones derivadas
del mismo han sido objeto de
numerosas controversias.58,59
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