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Sociedad Científica Peruana de Microbiología

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS MICROBIOLOGICOS – SOCPEMI 2012

En la actualidad la documentación garantiza la fiabilidad de los resultados en el


laboratorio.

La exactitud y el valor clínico de las pruebas que el laboratorio realiza sobre la muestra
clínica y sobre el microorganismo aislado dependen de la calidad de la muestra, del tipo de
pruebas realizadas sobre la misma y de las técnicas utilizadas para la realización de las
pruebas. Para ello es necesario establecer normas que establezcan lo que es una prueba
inadecuada y definir las pruebas adecuadas para tipos específicos de muestras. Asimismo,
se deben especificar los criterios para realizar una prueba adecuada y proporcionar
información para evitar las deficiencias en la solicitud de pruebas.

La implementación de este Manual en los laboratorios de Microbiología Clínica ayudaría


que los ensayos se lleven a cabo con un alto grado de calidad y que se acompañen de una
mejora en el servicio ofrecido al paciente así como de una mejora en la sistemática de
trabajo, que facilite la labor al personal del laboratorio.

Siendo iniciativa de la Sociedad Científica Peruana de Microbiología (SOCPEMI) , la de


iniciar la estandarización de documentos como uso o consulta por parte de los que
laboramos en los laboratorios de microbiología de centros asistenciales de nuestro país.

JUNTA DIRECTIVA:

Presidente: Lic.TM María del Carmen Quispe Manco


Vicepresidente: Lic.TM Roberto Rojas León
Tesorera: Lic.TM Juana María Guzmán Ruíz
Secretario: Lic.TM Luis Alvarado Ríos
Vocal: Lic.TM José María Olivo López
Vocal: Lic.TM Carlos Benítez Azabache
Sociedad Científica Peruana de Microbiología

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL


CULTIVO DE ORINA
(UROCULTIVO)

AUTORES

Javier Soto Pastrana


Licenciado en Tecnología Médica
Responsable Técnico del Laboratorio de Microbiología
Integrante del Comité de Control de Infecciones Intrahospitalarias
Hospital Nacional Docente Madre Niño San Bartolomé

Alfredo Guillén Oneeglio


Médico Cirujano
Jefe de Microbiología de la Clínica San Borja
Profesor Asociado, Facultad de Tecnología Médica
Universidad Nacional Federico Villarreal
Profesor de Microbiología Médica
Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC)

Roberto Rojas León


Licenciado en Tecnología Médica
Servicio de Microbiología
Instituto Nacional de Salud del Niño
Profesor Asociado, Facultad de Tecnología Médica
Universidad Nacional Federico Villarreal
Sociedad Científica Peruana de Microbiología

SOCIEDAD CIENTIFICA PERUANA DE MICROBIOLOGIA


2012
Contenidos
1. Introducción
2. Toma de muestra, transporte y manejo
3. Materiales
4. Procedimiento
5. Control de calidad
6. Reporte de resultados
7. Interpretación
8. Limitaciones
9. Referencias

Tablas
Tabla 1 Frecuencia de agentes uropatógenos en el Hospital Nacional Docente San
Bartolomé. 2010, Lima – Perú.
Tabla 2 Microbiota urinaria
Tabla 3 Definiciones
Tabla 4 Flujo de trabajo para el procesamiento de urocultivos
Tabla 5 Reporte de aislamientos con pruebas mínimas
Anexos
Anexo 1
Determinación de sustancias antibacterianas residuales en orina
Anexo 2
Uso y calibración de asas microbiológicas
Figuras
Figura 1
Figura 2
Figura 3

Fotos
Foto 1. Siembra por estrías en biplaca de agar sangre y MacConkey de Escherichia coli.
Foto 2. Siembra por estrías en biplaca de agar sangre y MacConkey de Staphylococcus
saprophyticus
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I. INTRODUCCIÓN

Las infecciones del tracto urinario (ITU) representan una de las primeras causas de
consulta médica y hospitalizaciones. Estudios epidemiológicos por E. H. Kass (14)
mostraron que los recuentos bacterianos mayores de 105 UFC/ml, de un cultivo puro de
bacilos gram negativos en orina estaban asociados con infecciones agudas bacterianas
del tracto urinario. Otros investigadores reportaron que también podían ser significativos
los recuentos mayores de 102 UFC/ml en mujeres con disuria e ITU aguda (6, 7, 15). Para
niños y pacientes cateterizados, los recuentos menores también pueden ser significativos
(4, 16, 17); por lo que se debe realizar y reportar el recuento de colonias.
La orina es un fluido corporal normalmente estéril, sin embargo, es fácilmente
contaminada con la microbiota del perineo, próstata, uretra o vagina al momento de
obtener la muestra. El laboratorio de microbiología debe proporcionar instrucciones
detalladas para asegurar la apropiada toma de muestra, conservación, rotulación y
transporte de la orina para su cultivo.
Los agentes etiológicos de ITU generalmente provienen de la propia microbiota intestinal
del paciente, siendo Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis,
Staphylococcus saprophyhticus y Enterococcus faecalis, los más frecuentes en pacientes
ambulatorios; y Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. y especies de
Candida en pacientes hospitalizados. En la tabla 1, presentamos los agentes más
frecuentes en urocultivos en un hospital nacional, sin embargo, esto puede variar de
establecimiento en establecimiento, según la población atendida. La tabla 2, es una lista
de la microbiota frecuente en orina infectada y contaminada.
Las definiciones utilizadas en urocultivos se encuentran en la tabla 3 y nos permitirá
interpretar mejor las solicitudes y hallazgos del urocultivo.
Una de las funciones del microbiólogo es determinar si el recuento de colonias es
significativo y que el paciente necesita tratamiento, esto dependerá de diferentes factores,
que están asociados al cuadro clínico, la forma de obtención de la muestra, tratamiento
previo, entre otros. Dado de que el laboratorio generalmente solo conoce detalles como la
edad, sexo y tipo de muestra del paciente, le es difícil determinar su significancia.
La determinación de la piuria, es un factor que ayuda a interpretar si el paciente tiene una
ITU, pero es necesario estandarizar este procedimiento que tiene una baja
reproducibilidad y es realizada e interpretada de manera diferente por los laboratorios
clínicos.
La finalidad de este manual es estandarizar el procedimiento para que sus resultados
sean reproducibles y los médicos tratantes interpreten adecuadamente sus hallazgos para
lograr un tratamiento adecuado del paciente y evitar las recurrencias.
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FASE PREANALITICA
II. TOMA DE MUESTRA, TRANSPORTE Y MANEJO
Es responsabilidad del Jefe del Laboratorio de Microbiología, en la instrucción del
personal de salud sobre la apropiada toma de muestra.
A. Toma de muestra
1. Muestra obtenida del chorro medio
a. Preparación en mujeres
(1) Separar los labios mayores, lavar la vulva
completamente desde adelante hacia atrás
utilizando dos torundas de algodón embebidas en
jabón, en forma sucesiva. Prestar especial
atención al meato uretral. No utilizar jabones con
desinfectantes (benzalconio, hexaclorofeno u otro
similar), porque una sola gota de residuo puede
esterilizar la orina antes de que la muestra llegue
al laboratorio.
(2) Luego con dos torundas de algodón adicionales y
agua o solución salina estéril lavar la vulva.
Comentario: La recolección de muestras de orina de
chorro medio debería ser evitada durante la menstruación
b. Preparación en varones
(1) no circuncidados. Retraer el prepucio y lavar el
glande y pene completamente, de manera sucesiva
con dos torundas embebidas con jabón, prestando
especial atención al meato uretral. Luego enjuague el
glande con agua o solución salina estéril,
sucesivamente con torundas de algodón adicionales.
(2) circuncidados, no requieren mayor preparación
c. Recolección de la muestra. Después de 1 o 2 segundos de
iniciada la micción, acercar el frasco estéril en la dirección
del chorro de orina para obtener la muestra, instruir al
paciente que no debe parar y recomenzar la micción del
“chorro medio” durante la recolección.
Comentario: Nunca obtener orina del bacín, del urinario o
papagayo.
No se observó diferencia en las tasas de contaminación
cuando un frasco nuevo no estéril, se utilizó para la
recolección de orina.
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2. Muestra obtenida de paciente con sonda Foley


a. Limpiar con algodón embebido en alcohol la porción distal
de la sonda
b. Usando una aguja y jeringa, colectar la orina a través de la
sonda y colocar su contenido en un frasco estéril. No
obtener orina a partir de la bolsa colectora por que suele
estar contaminada.
3. Muestra obtenida por catéter vesical
a. Un catéter vesical es insertado por un profesional de la
salud, para obtener orina directamente de la vejiga.
b. Este procedimiento debe ser realizado con una técnica
aséptica, para evitar el riesgo de introducir microorganismos
en la vejiga.
c. Desechar los 15 a 30 ml iniciales de orina y enviar el chorro
siguiente para el cultivo.
4. Muestra obtenida por punción suprapúbica
a. La obtención de orina por aspiración suprapúbica
directamente de la vejiga, es realizada por el médico o
personal de salud entrenado. Este método es el preferido
para niños, para pacientes en los cuales la interpretación de
los resultados de orina emitida es difícil, o cuando se
sospechan bacterias anaerobias como causa de la infección.
b. La vejiga debe estar llena y palpable antes de la aspiración.
c. Desinfectar la piel sobre la vejiga.
d. Hacer una punción a través de la epidermis encima de la
sínfisis pubiana.
e. Aspirar usando una aguja y jeringa. Coloque la muestra de
orina en un recipiente estéril antes de su envío al laboratorio.
La jeringa unida a la aguja no debe ser aceptada por ser un
agente punzocortante y representar un riesgo biológico para
el personal.
f.
B. Momento de la toma de muestra
1. Obtener la primera muestra de la mañana siempre que sea posible.
Permitiendo que la orina permanezca en la vejiga durante toda la
noche o por lo menos 4 h, de esta forma se disminuirá el número de
resultados falsos negativos.
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2. En pacientes con sintomatología de ITU se pueden aceptar


muestra en cualquier momento del día, teniendo en cuenta que sus
recuentos pueden ser menores de 105 UFC/ml.
3. No forzar la ingesta de líquidos para tratar de obtener la orina del
paciente, lo cual puede diluir la orina y disminuir el recuento de
colonias.
4. Es preferible que el paciente no esté tomando antibióticos al
momento de la toma de muestra, ya que los cultivos pueden resultar
negativos.
C. Transporte de la muestra
1. La orina debe ser transportada inmediatamente al laboratorio
después de su obtención, pudiendo permanecer a temperatura
ambiente hasta 2 h, Si la orina no puede ser procesada se puede
conservar hasta 24 h en refrigeración después de su obtención. NO
CONGELAR la muestra.
D. Rotulación de la muestra y solicitud enviada
1. Rotular el frasco de orina con información del paciente y la hora de
su obtención. En el petitorio del laboratorio debe indicarse los
siguientes datos mínimos: edad, sexo, tipo de muestra, tratamiento
previo a las 24 h y otros datos de acuerdo a la población en estudio.
Comentario: Cuando se solicitan el cultivo para levaduras, inocular
10 µl por placa y mantener los cultivos de 48 h para detectar
levaduras con recuentos bajos.
E. Criterios de rechazo
1. Solicite una nueva muestra de orina cuando la muestra ha sido
conservada por más de 2 hrs a temperatura ambiente.
2. Toda muestra que no esté adecuadamente rotulada será
rechazada.
3. Rechazar orinas de 24 hrs de colección.
4. Rechazar muestras de orina obtenidas con el mismo método de
colección dentro de las 48 hrs de recepción de la primera muestra.
Llamar a esta una muestra duplicada.
5. No se recomienda el uso de bolsas colectoras de orina en
pacientes pediátricos, por dificultades en su interpretación, salvo
cuando los resultados son negativos.
6. Las puntas de sonda Foley son inaceptables para cultivo.
7. Rechazar orina de la bolsa colectora de un paciente con sonda
Foley.
8. Rechazar muestras que llegan en frascos abiertos y derramados.
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9. Rechazar muestras con solicitud de cultivo anaeróbico, cuando no


son tomadas por punción suprapúbica.
10. Si una muestra mal tomadas, transportada, o manipulada no
puede ser reemplazada, se debe colocar al final del reporte que la
calidad de la muestra no era la adecuada y a quien se le informó.
Generalmente, las muestras de orina de pacientes hospitalizados
son fáciles de obtener.

FASE ANALITICA

III. MATERIALES
A. Medios de cultivo
1. Agar Sangre
2. Agar MacConkey
3. Agar CLED (Cisteína Lactosa Deficiente en Electrolitos)
Comentario. Su uso permite la detección de colonias E. coli enanas,
que pueden pasar desapercibida en agar MacConkey así también
impide el velamiento producido por colonias de Proteus spp.
4. Agar chocolate: empleado para muestras de orina de riñón o
muestras colectadas quirúrgicamente por cistoscopia.
5. Medios cromogénicos para urocultivo que permite la detección rápida
de los uropatógenos más comunes y a su vez infecciones mixtas.
B. Coloración de Gram
1. Cristal violeta
2. Lugol de Gram
3. Alcohol acetona
4. Safranina
C. Suministros
1. Método del asa
a. Use asas de nicrom o de plástico descartables estériles.
Tamaños
(1) Asa de 1 µl para detección de recuento de colonias
mayores de 1,000 UFC/ml.
(2) Asa de 10 µl para la detección de recuento de colonias
entre 100 y 1,000 UFC/ml.
2. Método de la micropipeta
a. Usar una micropipeta calibrada de 1 a 10 µL
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b. Puntas de pipetas estériles


Comentario. Se recomienda utilizar micropipetas diferentes para
cada volumen, porque ir de un extremo al otro del rango, tiende a
descalibrar el instrumento.

IV. PROCEDIMIENTO
A. Métodos microscópicos y otros métodos directos
El laboratorio debe determinar cuál es el mejor método para la detección de
piuria, de acuerdo a la población que atiende y para lo cual se tiene los
varios procedimientos. La presencia de muchas células epiteliales
escamosas y diferentes morfotipos microbianos sugieren contaminación.
1. Examen directo
a. Colocar 10 µl de orina bien mezclada sin centrifugar sobre
una lámina portaobjetos, colocar un cubreobjetos y observar
a 400x
b. La presencia de más de 5 leucocitos por campo es
considerado como indicativo de piuria.
Nota: este resultado tiene una especificidad de 90% para
predecir una infección urinaria asociada a catéter con más
de 105 UFC/mL, pero una sensibilidad de solo 37%.
2. Sedimento urinario
a. Centrifugar 10 ml de orina x 5 min. a 400 G, este
procedimiento debe estar estandarizado para dar resultados
confiables.
b. La presencia de más de 10 leucocitos por campo es
indicativo de piuria
Comentario: una limitación del análisis del sedimento urinario
es ser operador dependiente.
Comentario: están disponibles sistemas comerciales
basados en citometría de flujo entre otros, para la detección
de piuria.
3. Coloración de Gram:
a. Colocar 10 µl de orina bien mezclada sin centrifugar sobre
una lámina portaobjetos, y deje que se seque al aire sin
extenderla. Fijar con metanol.
b. Determinar el número de organismos por campo de aceite de
inmersión. Un organismo observado a 1,000x correlaciona
con un recuento de colonias de 105/ml de orina.
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Comentario: La tinción de Gram es útil para determinar


rápidamente el tipo y el recuento de bacterias y células en la
orina y debe ser realizada cuando sea solicitada. Para los
pacientes hospitalizados, la coloración de Gram de la orina
puede ayudar a diagnosticar la causa de la sepsis antes que los
cultivos de sangre den positivos
B. Métodos de cultivo
1. Usar biplacas con Agar Sangre y Agar MacConkey (ver foto 1)
2. Para las muestras de orina emitidas por chorro medio y los
obtenidos por catéteres, cultivar 1 µl de orina. Para las otras
muestras cultivar 10 µl.
Comentario: El recuento de colonias se debe realizar en el agar
sangre. Las demás placas deben ser estriadas de tal forma que se
obtengan colonias aisladas para reducir al mínimo los resultados
falsos negativos de los cultivos, debido a la inhibición
antimicrobiana. Si el recuento de colonias no puede ser realizado
debido a una abrumadora propagación de Proteus, una estimación
del recuento se puede hacer de las placas de aislamiento.
3. Métodos de inoculación para el recuento de colonias
a. Método del asa calibrada
(1) Usando un asa calibrada flameada y enfriada o una
descartable, mantener el asa verticalmente, y
sumergir solamente el aro por debajo de la superficie
de la muestra de orina, sin centrifugar y bien
mezclada (figura 1).
(2) Llevar una asada de la orina bien mezclada sobre la
placa de agar sangre haciendo una línea recta a lo
largo y por el centro del agar y estriar la orina
mediante una serie de pases en ángulos de 90° a
través del inóculo (método solo para 1 µl).Ver figura
2.
(3) Para el aislamiento de colonias usar Agar MacConkey
siguiendo el procedimiento anterior.
(4) Cuando se utilizan 10 µl de muestra tomar una asada
de orina bien mezclada para inocular y estriar en
cuadrantes las placas de agar, como se indica en la
figura 3.
b. Método de la micropipeta
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(1) Con una pipeta y punta estéril, aspirar la cantidad


necesaria de orina bien mezclada y colocarlo en un
extremo de la placa, dejar que la gota escurra hacia
el otro lado.
(2) Estriar como en el caso anterior
4. Incubar en ambiente aeróbico durante toda la noche de 35 a 37 ° C.
a. Realizar cultivos anaeróbicos solamente cuando sea
solicitado en aspiración suprapúbica, cuando se sospecha
en una fístula vesiculoentérica y cuando se observen
diferentes morfotipos bacterianos en el examen directo pero
no crecen en cultivo aeróbico.
b. Si es conveniente, incubar el Agar Sangre en 5% de CO2
para mejorar el desarrollo de los organismos gram-positivos
y bacterias dependientes de CO2.
5. Lectura de los medios de cultivo
a. Examinar los cultivos que han sido incubados durante toda la
noche, pero hacer la lectura final a las 24 hrs.
b. En los siguientes caso se debe incubar el cultivo hasta por
48 horas:
(1) Muestra colectada por una técnica invasiva, tal como
aspiración suprapúbica o por cateterización.
(2) Presencia de pequeñas o escasas colonias que son
apenas perceptibles.
(3) El resultado del cultivo no correlacionan con los
hallazgos de la coloración de Gram o el cuadro
clínico (por ejemplo, el paciente tiene piuria estéril o
síntomas sin un cultivo positivo).
(4) El paciente está inmunocomprometido, incluyendo
pacientes trasplantados.
(5) Cultivos de levaduras o de hongos que sean
solicitados o pacientes en riesgo de tener infección
por hongos por ejemplo UCI neonatal.
c. Para los cultivos positivos, examinar los medios de cultivo
para la cuantificación y tipo morfológico de los organismos
presentes.
(1) Con un asa de 1 µl, una colonia equivale a 1,000
UFC/ml.
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(2) Con un asa de 10 µl, una colonia equivale a 100 UFC


/ ml.
(3) Cuando las colonias son demasiado numerosos para
contar.
(a) El máximo recuento usando el asa de 1 µl
es >105 UFC/ ml.
(b) El máximo recuento usando el asa de 10 µl
es >104 UFC/ml.
6. Estudio posterior de los cultivos positivos
a. Determine el recuento de colonias de cada morfotipo en el
cultivo por separado examinando el agar sangre.
b. Usando las tablas 3 y 4, determinar la extensión del estudio
para cada organismo.
c. Para las pruebas de identificación mínima, consulte la Tabla
5.
d. No identificar microbiota urogenital normal a nivel de género
o de especie.
e. Streptococcus agalactiae debe ser reportado de mujeres en
edad fértil y de diabéticos conocidos, independientemente
del recuento.
f. Debido a que E. coli representa el 80% de los patógenos en
cultivos de orina, utilice métodos de identificación rápida
para identificar esta especie. Véase Tabla 5.
g. Para la identificación final proceder de acuerdo a métodos
establecidos en el laboratorio.
h. Realizar pruebas de susceptibilidad de acuerdo a métodos
establecidos en el laboratorio.
7. Mantenga las placas con cultivo positivo a temperatura ambiente
hasta 48 h, por si el médico solicitara algún estudio adicional.
8. Mantenga las muestras de orina en refrigeración por lo menos 24
horas para resolver cualquier problema con la muestra o resultados
del cultivo.
V. CONTROL DE CALIDAD
A. Inspeccione las asas calibradas no descartables periódicamente para
confirmar que siguen siendo redondas y están libres de dobleces,
abolladuras, corrosión, o material incinerado. En el anexo 2 están los
procedimientos de control de calidad de asas microbiológicas.
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B. Si utiliza asas descartables, chequear el certificado de validación de


recuento del fabricante con cada lote. El proveedor debe suministrar una
copia de este certificado con cada lote de asas que venda.
C. Verificar que los medios de cultivo cumplan con la fecha de expiración y los
parámetros de control de calidad de cada laboratorio.
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FASE POSTANALITICA

VI. REPORTE DE RESULTADOS


A. Informar los resultados del examen directo, coloración Gram o sedimento.
B. Resultados Negativos
1. Si no se observa crecimiento sobre todos los medios de cultivo,
reportar "Urocultivo negativo”.
2. Si se cultivaron 1 µl, reportar "Recuento: menor de 1,000 UFC/ml".
3. Si se cultivaron 10 µl, reportar "Recuento: menor de 100 UFC/ml".
4. Si solamente se observa microbiota urogenital o de la piel, reportar
como cultivo negativo y el recuento será de “10,000 UFC/ml de
microbiota urogenital normal.”
C. Resultados Positivos
1. Como es especificado en la tabla 3, los cultivos mixtos son
reportados con el recuento en UFC/ml, seguido por “múltiple
morfotipo bacteriano presente; posible contaminación; se sugiere
nueva muestra, con pronto envío al laboratorio, si está clínicamente
indicado.”
2. Reportar el recuento de colonias de cada patógeno por separado,
seguida por la identificación presuntiva, mínima, o definitiva y
resultados de la prueba de susceptibilidad, como se indica en la
tabla 3 y 4.
D. Mantener copia de los resultados en sistema manual o electrónico.
VII. INTERPRETACION
A. El criterio de ≥105 UFC/ml para significancia puede ser aplicado a la mayoría
de las muestras enviados para cultivo. Sin embargo, lo siguiente será
cierto.
1. Un cultivo mixto en un paciente ambulatorio no complicado
probablemente indica contaminación.
2. Recuentos menores (<104/ml) de bacterias comúnmente
encontrados sobre la piel y genital interno y externo son
considerados ser contaminantes, pero en circunstancias especiales,
un recuento de Enterobacteriaceae de 102 UFC/ml o más, pueden
ser considerado significativo.
3. Recuento de colonias <105 UFC/ml en muestras emitidas con
presencia de disuria y síntomas de ITU puede ser significativo.
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B. No realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana directamente de la


muestra de orina. Estos métodos no están estandarizados.
C. El urocultivo con removedor de antibióticos no está estandarizado ni
validado.
VIII. LIMITACIONES
A. Mujeres con ITU no complicada para las cuales la etiología microbiana está
establecida (p. ej. E. coli o S. saprophyticus) pueden ser tratados
empíricamente con una sola dosis alta o una de curso corto (3 días) de
agente antimicrobiano. El cultivo de orina para identificación y prueba de
susceptibilidad del organismo causante deben ser realizados en el caso
donde hay fracaso en el tratamiento y recaída, sospecha clínica de
pielonefritis o infección recurrente.
B. En casos de piuria estéril, la coloración Gram es importante. Si son vistos
organismos pero no cultivables y el hallazgo persiste, puede ser indicado
un cultivo anaeróbico.
C. Resultado falso negativo es debido, en parte, a sustancias interferentes,
orina diluida, bajo pH e interpretación subjetiva del criterio de trabajo
adicional del cultivo.
D. El síndrome uretral agudo debido a uretritis deben ser sospechado en
mujeres sexualmente activas, quienes tienen disuria y piuria pero urocultivo
negativo. Se debe realizar investigación para detectar la presencia de N.
gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Ureaplasma urealyticum.
E. Disuria también ocurre en pacientes con vulvovaginitis y el hisopado vaginal
debe ser enviado para la detección de vaginosis bacteriana, candidiasis y
Trichomoniosis.
F. En caso de piuria estéril, debe sospecharse también de TBC renal. La
muestra para cultivo debe ser la primera orina de la mañana por tres días
consecutivos. No se recomienda orina de 24 h.
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IX. REFERENCIAS

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Tabla 1. Frecuencia de agentes uro patógenos en el Hospital


Nacional Docente San Bartolomé. 2010, Lima – Perú.

Microorganismo n (%)

Escherichia coli 832 72

Klebsiella pneumoniae 77 7

Proteus mirabilis 44 4

Staphylococcus saprophyticus 41 4

Enterococcus faecalis 35 3

Candida albicans 23 2

Pseudomonas aeruginosa 21 2

Candida sp. 16 1

Estafilococos coagulasa negativa 16 1

Enterobacter cloacae 12 1

Streptococcus agalactiae 7 1

Fuente: Laboratorio de Microbiología, Hospital Nacional Docente San Bartolomé.


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Tabla 2 Microbiota urinaria

Ampliar el estudio si el cultivo es


Microbiota Microorganismo significativo
(ver tabla 4)
Urogenital Estreptococo grupo viridans, Reportar como microbiota urogenital.
Neisseria spp., difteroides,
Lactobacillus spp., anaerobios
Piel Difteroides, Staphylococcus Reportar como microbiota urogenital o de piel a
spp. menos que esté presente en cantidades >10
veces o más que otra microbiota. Entonces
tratar como uropatógena.
Uropatógenos Bacilos Gram-negativos ID hasta nivel de especie y ATB
Staphylococcus ID y ATB de S. aureus;
ID de Staphylococcus saprophyticus con disco
de novobiocina para mujeres en edad fértil;
ATB generalmente no es necesario para S.
saprophyticus u otro estafilococo coagulasa-
negativo.
Levaduras ID de C. albicans y Candida glabrata;
ID de otras a nivel de especie solo si es
solicitada
Estreptococo beta-hemolítico ID, especialmente del grupo B en mujeres en
edad fértil
Enterococcus spp. Comprobar VRE en pacientes hospitalizados;
ID a nivel de especie y ATB solo en VRE y
cuando sea solicitado
G. vaginalis ID sólo si el número es 10 veces mayor que
toda
la otra microbiota
Aerococcus urinae ID solo si el número es 10 veces mayor que la
de
toda la otra microbiota (20) (ver Tabla 5 para
pruebas para la identificación)
Corynebacterium (ureasa ID y ATB si el número es 10 veces mayor que
positivo) la
de toda la otra microbiota y ≥ 100,000 UFC.
Abreviaciones: ATB, prueba de susceptibilidad antimicrobiana;
ID, identificación; VRE, enterococo vancomicino resistente.
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Tabla 3. Definiciones
Término Definición
Bacteriuria Presencia de bacteria uropatógena en la orina
Cistitis Inflamación de la vejiga
Cistostomía Procedimiento quirúrgico de insertar un tubo directamente en
la vejiga a través de la región suprapúbica para drenar orina.
Disuria Dolor o ardor al orinar, una común queja en la presentación
de ITU
Nefrostomía Procedimiento quirúrgico con colocación directa de un tubo en
el riñón.
Prostatitis Infección de la glándula prostática; el paciente puede
presentar
fiebre o ser asintomático.
Pielonefritis Infección aguda del riñón y pelvis renal usualmente con fiebre,
escalofríos y dolor lumbar; crónico; puede ser sin síntomas.
Piuria Recuento de leucocitos en orina de 8-10/µl (o >5/campo de
alto poder en un urianálisis convencional), lo cual correlaciona
con un índice de excreción de Leucocitos >400,000 GB/h)
Uretritis Inflamación de la uretra; puede ser causada por enfermedad
sexualmente transmitida o uropatógenos.
Urosepsis Pielonefritis acompañado de bacteriemia y shock séptico.
Urostomía Procedimiento quirúrgico que conduce a una abertura externa
en la
pared abdominal, usualmente hecha con una asa intestinal,
para la salida de la orina.
Aspiración Espécimen de orina colectado con una jeringa y aguja
suprapúbica insertada
directamente a través de la piel en la vejiga.
Orina de catéter Espécimen colectado por la inserción de un catéter en la
uretra.
ITU No complicada Infección principalmente en mujeres sanas, quienes no tienen
anormalidades estructurales o funcionales del tracto urinario.
ITU Complicada Infección en un paciente con anormalidad estructural y/o
funcional del tracto urinario (por ej. lesión en médula espinal,
vejiga neurogénica, obstrucción del tracto urinario, etc.) que
reduce la eficacia de la terapia antimicrobiana.
ITU Asintomática Infección con > 105 bacterias/ml sin síntomas de infección
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Tabla 4. Flujo de trabajo para el procesamiento de urocultivos
Tiempo para
Tipo de orina Inoculación No. de aislamientos reporte final
1 uropatógeno 2 uropatógenosª ≥3 uropatógenos
Chorro medio; obtenidos de Estriar 1 µl en AS y MAC <10,000 UFC/ml, ID mínimab, Bacterias con < 100,000 CFU/ ml, Reportar como cultivo negativo, 1 o 2 días
pacientes ambulatorios <65 años reportar como cultivo negativo ID minima indicar el recuento y en (incubación mínima,
de edad. observaciones "Presencia de flora 18 h)°
mixta". Sugerir remitir una nueva
muestra si fuera pertinente.
≥10,000 UFC/ml (o ≥1,000 UFC Bacterias con ≥100,000 UFC/ml,
de uropatógeno/ml en mujeres de ID definitiva y ATB
14-30 años de edad), ID°
definitivac y ATB
Sonda Foley, paciente Estriar 1 µl en AS y MAC <10,000 UFC/ml, ID° mínima, Bacterias con < 100,000 CFU/ ml, Si no hay presencia de leucocituria 2 o 3 días
hospitalizado o geriátrico (≥ 65 reportar como cultivo negativo ID minima Reportar como cultivo negativo, (incubación mínima,
años de edad) indicar el recuento y en 36 h)
observaciones "Presencia de flora
mixta". Sugerir remitir una nueva
muestra si fuera pertinente.
≥10,000 UFC/ml, identificación Bacterias con ≥100,000 CFU/ml, Si el paciente tiene leucocituria, o es
definitiva y ATB ID definitiva y ATB sintomático o febril, seguir con el
protocolo de 2 uropatógenos.
Catéter vesical; paciente Estriar 10 µl en AS y MAC 100 A 1,000 UFC/ml con Bacterias con < 1,000 CFU/ ml, ID Bacterias con < 10,000 CFU/ ml, ID 2 o 3 días
pediátrico cateterizado, punción ACH para situaciones microbiota normal de urogenital o minima minima (incubación mínima
suprapúbic, cultivo de levaduras especiales piel, ID mínimab, reportar como 48 h)
cultivo negativo
≥1,000 UFC/ml o cualquier Bacterias con ≥1,000 UFC/ml, ID Bacterias con ≥10,000 UFC/ml, ID
cultivo puro de bajo recuento de definitiva y ATB definitiva y ATB
uropatógeno, ID definitiva y ATB Contactar con el médico para determinar
si se sigue con el proceso

a) La presencia de microbiota de la piel o urogenital en una cantidad 10 veces menor a los uropatogenos, es considerada como contaminación y no debe ser considerada para el flujo de trabajo

b) Para la identificación mínima ver el cuadro respectivo


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c) En este grupo etareo, cualquier recuento de Streptococcus grupo B se debe reportar. Descartar la
presencia de S. saprophyticus, que es importante a esta edad
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Tabla 5. Reporte de aislamientos con pruebas mínimas

Reporte Pruebas Mínimas


Colonias secas, lactosa positiva en agar MacConkey,
Escherichia coli (probable)
indol positivo y oxidasa negativa (del agar sangre).

Colonias lactosa negativa en agar MacConkey,


Pseudomonas aeruginosa (probable) superficie opaca, oxidasa positiva, indol negativo y
tiene olor característico de Pseudomonas.

Colonias mucosas, blancas, convexas; presencia de


Candida sp. levaduras en montaje húmedo.

Colonias doradas o amarillo pálido, cocos gram


positivos, catalasa positiva y coagulasa en lámina
Staphylococcus aureus positiva. Pueden ser β hemolíticos en el agar sangre.

Colonias blancas, cocos gram positivos, catalasa


positiva y coagulasa en lámina negativa.
Staphylococcus coagulasa negativa Colonias amarillas, no beta hemolíticas, identificar
como Staphylococcus saprophyticus (probable).

Cocos gram positivos en cadenas cortas, catalasa


Enterococcus sp. negativa, PYR positivo. Bilis esculina rápida positiva.

Cocos gran positivos en parejas y cadenas largas,


catalasa negativa. Alfa hemolíticas, PYR negativo.
Descartar Aerococcus urinae (presencia de tétradas y
Streptococcus grupo viridans
racimos en la coloración de Gram) si el número es
significativo.

Colonias puntiformes, bacilos gram positivos, catalasa


Lactobacillus spp.
negativo, alfa hemolíticos.

Corynebacterium spp. Colonias puntiformes blancas, bacilos gram positivos,


catalasa positiva. Descartar Corynebacterium
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urealyticum con una prueba rápida de ureasa si el


número es significativo.
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ANEXO I
DETERMINACIÓN DE SUSTANCIAS ANTIBACTERIANAS RESIDUALES EN
ORINA

I. Principio
Determinar la presencia de sustancias antibacterianas residuales en orina. Este
procedimiento se aplica en todos los casos en los que se solicite urocultivo.
II. Materiales
 Pinzas
 Discos de papel de filtro estériles de Papel filtro Whatman N° 3 o similar
 Placa de Agar Mueller Hinton 100 x 15 mm
 Tubo con solución salina estéril x 2 mL
 Alicate sacabocados para 6 mm de diámetro o perforador
 Cepa de Bacillus subtilis ATCC 6633.
III. Procedimiento
 Hacer una suspensión de Bacillus subtilis en un tubo con solución salina
estéril que sea similar al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland
 Sembrar la placa de agar Mueller Hinton con la suspensión de bacterias de
manera similar a un antibiograma.
 Dejar secar a temperatura ambiente aproximadamente 15 min.
 Tomar con la pinza un disco de papel filtro y colocarlo en la placa sembrada
según una plantilla numerada o colocando el número en la parte posterior
de la placa.
 Colocar 10 µL de orina con una asa calibrada o una micropipeta
 Se debe colocar el número correspondiente a la muestra.
 La placa será incubada a 35°C por 18 horas en aerobiosis.
IV. Interpretación
Se buscará la presencia de un halo de inhibición alrededor del disco con la orina.
Cualquier diámetro de halo se considerará como prueba positiva. La ausencia de
halo se considera como prueba negativa.
V. Reporte de resultados
El resultado se informa como “Actividad antimicrobiana: Positiva o Negativa”
VI. Comentario
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 El medio de cultivo debe estar a temperatura ambiente y la superficie debe


estar seca.
 No se ha determinado cual es el efecto de la demora en colocar los discos
sobre el medio de cultivo sembrado.
 Mantener la cepa de Bacillus subtilis en un tubo o placa de agar Mueller
Hinton, todas la semanas hacer una resiembra para la prueba. No utilizar el
cultivo de una placa donde se haya realizado la prueba.
VII. Referencias
1. Maturin LJ. Bacteriological Analytical Manual, Inhibitory Substances in Milk,
FDA, 2001.
2. Ghosh HK. Role of bacterial growth inhibitors in urine in diagnostic culture. J
Clin Pathol. 1970. 23: 627-628.
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ANEXO 2
USO Y CALIBRACION DE ASAS MICROBIOLOGICAS

I. PRINCIPIO
El volumen de fluido transferido por una asa calibrada depende del volumen y la forma del
recipiente que contiene el líquido y la dirección y profundidad del asa cuando es
introducido en el líquido. La variabilidad de los resultados es por la tensión superficial y la
superficie humedecida del asa. Líquidos en recipientes con diámetros pequeños (<1 cm)
tienen alta tensión superficial, el cual resulta en una menor transferencia, dado que la
fuerza vidrio-liquido y plástico-liquido (fuerza adhesiva) son mayores que las fuerzas
liquido-liquido (fuerza cohesiva). Cuando el alambre por encima del aro del asa es
humedecido por la inmersión profunda en el líquido, exceso de líquido drena por el
alambre y aumenta el volumen transferido.
Las asas cuantitativas son usadas comúnmente para realizar cultivos cuantitativos y
verificar el inoculo de las pruebas de susceptibilidad. Las asas cuantitativas son menos
exactas que las pipetas, estas todavía son una excelente manera para realizar cultivos
semicuantitativos o diluciones. Las asas cuantitativas son usadas cuando el error ≤ 20%
es aceptable. Las asas son calibradas por método colorimétrico o por método de la broca.
II. TIPOS DE ASAS
A. El volumen es 1 o 10 µl
B. Las asas reusables son hechos de alambre, usualmente platino o nicrom
C. Las asas descartables son hechos de plásticos
III.MATERIALES
Método colorimétrico
A. Agua destilada
B. Colorante solución de azul de Evans al 0.75% (CAE)
i. Solución Stock
1. Adicionar 0.75 g de CAE a 100 ml de agua.
2. Filtrar la solución con papel filtro Whatman Nº 40
3. Guardar a temperatura ambiente en frasco oscuro por 6 meses
C. Colorante Violeta de Genciana solución comercial al 1 – 2 %, solución stock
(opcional)
i. Soluciones de trabajo
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1. Prepare diluciones del colorante (azul de Evans o violeta de


genciana) en agua destilada para obtener las diluciones 1:500,
1:1000, 1:2000, y 1:4000, diluyendo 1 ml de la solución stock
del colorante en 49 ml de agua destilada.
2. Diluya 1 ml de la dilución 1:50 en 9 ml de agua destilada. Esta
es una dilución 1:500.
3. Realizar diluciones seriada al doble empezando con 5 ml de la
dilución 1:500 y 5 ml de agua destilada, para preparar el resto
de las diluciones.
4. Guardar las 4 diluciones hasta por 6 meses pero prepare nueva
diluciones si la lectura de algunos de ellos difiere el 3% de la
lectura previa.
D. SUMINISTROS
i. Cubetas de vidrio cuadradas con 1 cm de trayectoria de luz. Use la
misma cubeta para todas las medidas.
ii. Cristalería: varias tubos limpios de 15 ml de volumen, varias pipetas de
1 y 10 ml.
iii. Espectrofotómetro de buena calidad con las siguientes
especificaciones: lineal hasta 2.0 de unidades de absorbancia a 350
nm; ancho de banda espectral, ≤ a 2nm (348 a 352 nm); precisión de ≤
0.001 Å/h; exactitud de longitud de onda seleccionada, ≤ 1 nm.
IV. CONTROL DE CALIDAD
A. Consideraciones generales
i. Asas reusables
1. Inspeccionar las asas calibradas regularmente para confirmar
que ellos permanecen redondas y están libres de curvas,
abolladuras, corrosión o material incinerado.
2. Verificar mensualmente las asas para garantizar que el volumen
transferido es exacto.
ii. Verificar el volumen transferido del asa descartable tras recibir un
nuevo lote de asas. El desempeño satisfactorio de varios lotes, y el
certificado del fabricante de un control de calidad hecho en casa elimina
la necesidad de la calibración de rutina.
B. Métodos para la calibración de asas
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Procedimiento de calibración por el método colorimétrico


i. Colocar el espectrofotómetro en modo absorbancia, usando una
longitud de onda de 600 nm.
ii. Calibrar a cero con agua destilada
iii. Medir y anotar la absorbancia de cada dilución del colorante (1:500,
1:1000, 1:2000, 1:4000)
iv. Graficar la densidad óptica (eje vertical) contra cada una de las
concentraciones de las diluciones (eje horizontal) en la hoja de trabajo
(ver grafica ). Dibujar una sola línea que más se acerque a los cuatro
puntos para construir la curva de calibración.
v. Usando el asa de 1µl, transferir 10 asadas de la solución colorante
stock elegido a 10 ml de agua destilada. Después mezclar
completamente, medir y anotar la absorbancia de esta solución. La
absorbancia debería corresponder a la dilución 1: 1000 en la curva de
calibración.
vi. Preparar y evaluar tres soluciones de prueba adicionales para un total
de cuatro lecturas. Anotar las lecturas en la hoja de trabajo y determinar
el promedio. Luego calcular el porcentaje de inexactitud siguiendo las
instrucciones de la hoja de trabajo.
vii. Si el promedio de las lecturas es mayor de ± 20% de la dilución de la
solución stock 1:1000, el asa es inexacta. Seguir con la acción
correctiva.
viii. Para calibrar el asa 10 µl, transferir 10 asadas de la solución stock del
colorante elegido en 100 ml de agua destilada usando el asa de 10 µl.
Después mezclar completamente, medir y anotar la absorbancia de
esta solución. Prepare y evalúe tres soluciones de prueba adicional
para un total de cuatro lecturas. Luego calcule el porcentaje de
inexactitud siguiendo las instrucciones de la hoja de trabajo. La lectura
final debería ser la misma que la del asa de 1µl, por ejemplo ± 20% de
la dilución 1:1000 de la solución stock.
C. Acción correctiva
i. Si la carga del asa no cae dentro del límite de tolerancia especificado,
el asa puede ser descartado y reemplazado o reparado y calibrarlo
nuevamente.
ii. Reparar mediante inmersión en arena fina para remover depósitos, y
limpiarlo humedeciendo con alcohol y luego flamearlo.
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iii. Las asas pueden ser retornados a su diámetro calibrado usando brocas
de 1.5 mm de diámetro para asas de 1µl y brocas de 4 mm de diámetro
para asas de 10µl. Las asas arregladas deben ser calibradas antes de
ser puesto en servicio nuevamente.
iv. Para las asas descartables inexactas, contactar con el proveedor para
reemplazarlos.
V. PROCEDIMIENTO PARA EL USO DEL ASA
A. Para asas reusables, flamear e y enfriar antes de la primera y después de cada
transferencia. Use una nueva asa descartable no humedecida para cada
transferencia.
B. El líquido debería estar en un recipiente de boca ancha (diámetro >1 cm).
C. Rotar la muestra en el recipiente para mezclar la suspensión bacteriana de
manera uniforme.
D. Mantener el asa verticalmente, e introducirlo el aro del asa justo por debajo de
la superficie del líquido. Evitar alguna burbuja en el menisco del líquido.
E. Verificar para asegurar que ninguna burbuja están dentro del asa.
F. Mover el asa hacia arriba y hacia abajo solamente.
G. Transferir el contenido del asa a la placa contactando el líquido sobre la
superficie del agar en la placa, hasta que el líquido ya no sea visible en el asa.
Diseminar con el asa o, para una mayor exactitud, diseminar con una varilla
doblada (asa de “Drigalski”).
VI. LIMITACIONES
Asas cuantitativa, tanto descartables y reusables, serian groseramente inexactas si
burbujas están presentes en la película del líquido transferido. Evitar la formación de
burbujas cuando se agita el líquido. Inspeccionar cuidadosamente que el asa cargada
no presente burbujas. Remover las burbujas por flameo (asas reusables),
reemplazando (asas descartables) o por reinmersión (para cualquiera de las asas).
VII. REFERENCIAS
1. Albers AC, Fletcher RD. 1983. Accuracy of calibrated-loop transfer. J Clin
Microbiol. 18:40-42.
2. Clarridge JE, Pezzlo MT, Vosti KL. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of urinary
tract infections. 1978. Weissfeld AS (Coordinating ed.). American Society for
Microbiology, Washington, D. C.
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HOJA DE TRABAJO 1
Calibración colorimétrica de asas cuantitativa

Volumen del asa Fecha


Fecha de puesto en uso Iniciales del operador
Fabricante del asa N° de lote

Muestra Absorbancia Cálculos



1 Promedio menos la (a)
Absorbancia estándar
diluida 1:1000
2 Divide (a) por la estándar de (b)
absorbancia 1:1000
3 % de inexactitud: multiplicar (c) %
(b) por 100
4 El valor (c) debe ser ± 20%: Es aceptable?
SI / NO
Suma de las
4 lecturas
Promedio
(dividir entre
4)

Acción Correctiva:
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Revisado por: ___________________________________
Fecha: ___________________
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Figuras

Figura 1. Usando un asa calibrada flameada y enfriada o una descartable, mantener el


asa verticalmente, y sumergir solamente el aro por debajo de la superficie de la muestra
de orina, sin centrifugar y bien mezclada
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Figura 2. Llevar una asada de la orina bien mezclada sobre la placa de agar sangre
haciendo una línea recta a lo largo y por el centro del agar y estriar la orina mediante una
serie de pases en ángulos de 90° a través del inóculo (método solo para 1 µl).
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Figura 3. Cuando se utilizan 10 µl de muestra tomar una asada de orina bien mezclada
para inocular y estriar en cuadrantes las placas de agar, como se indica en la figura.

Foto 1. Siembra por estrías en biplaca de agar sangre y MacConkey de Escherichia coli.

Foto 2. Siembra por estrías en biplaca de agar sangre y MacConkey de Staphylococcus


saprophyticus
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EMPRESAS AUSPICIADORAS

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