Teoría

electroforesis en gel de agarosa es la forma más fácil y más popular de la separación y el análisis
de ADN. Aquí moléculas de ADN se separan sobre la base de carga mediante la aplicación de un
campo eléctrico al aparato electroforético. moléculas más cortas migran más fácilmente y se
mueven más rápido que las moléculas más largas a través de los poros del gel y este proceso se
denomina tamizado. El gel puede ser utilizado para observar el ADN con el fin de cuantificar o
para aislar una banda en particular. El ADN puede ser visualizado en el gel por la adición de
bromuro de etidio.

La agarosa es un polisacárido obtenido de las algas umbilicalis Porphyra rojos. Su nombre

sistemático es (1 4) -3, 6-anhidro-al-galactopiranosil (1 3) -β-D- galactopyranan. Agarosa
hace una matriz inerte. La mayoría de los geles de agarosa se hacen entre 0,7% y 2% de
agarosa. Un gel de 0,7% mostrará una buena separación de fragmentos grandes de ADN (5-10kb)
y un gel al 2% se mostrará una buena resolución para pequeños fragmentos con rango de tamaño
de 0.2-1kb. Geles bajo porcentaje son muy débiles (Nota: - pueda romper cuando se levanta),
pero los geles alto porcentaje son generalmente frágiles y no se establece de manera uniforme. El
volumen de agarosa requerida para una preparación de minigel es de alrededor de 30-50 ml y por
un gel más grande, que es de alrededor de 250 ml.

Estructura de agarosa

Factores que afectan el movimiento

de ADN:

voltaje aplicado

La tasa de migración de los fragmentos de ADN lineal a través de gel de agarosa es proporcional
a la tensión aplicada al sistema. A medida que aumenta la tensión, la velocidad de DNA también
se incrementa. Pero la tensión debe ser limitado debido a que se calienta y, finalmente, hace
que el gel se derrita.
El bromuro de etidio (EtBr)

Es un agente de intercalación que se intercala entre las bases de ácido nucleico y permite la
detección conveniente de fragmentos de ADN en gel. Cuando se expone a la luz ultravioleta, que
será fluorescente con un color anaranjado. Después de que el funcionamiento de ADN a través de
un gel tratado con EtBr, cualquier banda que contiene más de ~ 20 ng de ADN se convierte
claramente visible bajo luz UV. EtBr es un conocido "mutágeno", sin embargo, las alternativas
más seguras disponibles. Se puede incorporar con geles de agarosa o muestras de ADN antes de
la carga, para la visualización de los fragmentos. La unión de bromuro de etidio para ADN altera
su masa y rigidez, y por lo tanto su movilidad.

Los tampones

Varios tampones diferentes se han recomendado para la electroforesis de DNA. Los tampones más
comúnmente usados son Tris-acetato-EDTA (TAE) y Tris-borato-EDTA (TBE). La tasa de migración
de fragmentos de ADN en ambos de estos tampones es algo diferente debido a las diferencias en
la fuerza iónica. Estos tampones proporcionan los iones de apoyo a la conductividad.

Conformación de DNA

ADN con diferentes conformaciones que no ha sido cortado con una enzima de restricción migrará
con diferentes velocidades. Mellado o ADN circular abierta se moverá lentamente que el ADN lineal
y super enrollada (lento al más rápido: muescas ni abierta circular, lineal, o plásmido súper
enrollado). Súper circular helicoidal, muescas ADN circulares y lineales migrar geles a diferentes
velocidades a través de gel de agarosa.Las noblezas relativas de estas tres formas dependen de
la concentración, el tipo de agarosa usado para hacer el gel, voltaje aplicado, tampón, y la
densidad de giros helicoidales súper.