UNIVERSIDAD

NACIONAL
AUTÓNOMA DE
MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES CUAUTITLÁN
LICENCIATURA EN QUÍMICA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL
Grupo: 2651
REPORTE DE LA PRÁCTICA 3.- HOMOGENEIZACIÓN, CENTRIFUGACIÓN Y
CROMATOGRAFÍA.

EQUIPO 8
Gómez González Fernanda Saraí
Pérez Bonilla Mario Edgar
Balderas Zempoaltecalt Ain-ek
Pérez Espinosa Rubén Ángel

Fecha de realización de la práctica: 20 de febrero, 2018

Fecha de entrega del reporte: 27 de febrero, 2018

Semestre 2018-ll

Asesores: Martha Patricia Zúñiga Cruz, Yesica Natali Álvarez Pacheco

INTRODUCCIÓN.

Los experimentos que se llevan a cabo en un laboratorio de Bioquímica tienen como

objetivo separar, caracterizar, modificar o cuantificar las biomoléculas. En la mayoría de los
casos se trabaja con muestras complejas que contienen un gran número de biomoléculas
distintas. Por este motivo, los métodos experimentales utilizados en Bioquímica tienen que
ser altamente específicos y su funcionamiento se basa en las propiedades físicas, químicas
o bioquímicas de las biomoléculas. El conocimiento cada vez más detallado de la estructura
y función de las biomoléculas permite el desarrollo de nuevos y sofisticados métodos
experimentales. A su vez, los nuevos métodos permiten adquirir nuevos conocimientos
bioquímicos.

Algunos compuestos poseen propiedades químicas que les diferencian de otros como el
color, olor, sabor, etc. Muchas biomoléculas tienen un color característico que permite
identificarlos rápidamente (por ejemplo, el color rojo de la hemoglobina, el color naranja de
los carotenos, el color verde de la clorofila, etc.).

Si queremos separar biomoléculas que tienen los mismos grupos funcionales, sus
propiedades químicas serán muy parecidas o idénticas. Por tanto, habrá que utilizar
métodos experimentales basados en las propiedades físicas de las biomoléculas como, por
ejemplo, el tamaño, la forma, la carga o la polaridad.

Los objetivos básicos del análisis bioquímico son la; separación, purificación, identificación,
determinación de la estructura y mantenimiento de la integridad estructural para cumplir con
estos objetivos se dispone de muy variadas técnicas, estas se emplean de acuerdo a las
características de la muestra y al objeto de estudio y se elige aquel que presente los
mejores resultados. Esta práctica se estudiara y usaran algunas de estas técnicas como la
homogeneización, centrifugación, y cromatografía para identificar a los compuestos
responsables de dar color a la hoja de espinaca (pigmentos).

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:

Identificar los métodos más usados en bioquímica para el análisis de una muestra, al
conocer el fundamento de cada uno de ellos, así como las ventajas que prescentan, con
ayuda de estos métodos practicar la homogeinizacion mecánica con mortero, realizar la
centrifugación del homogeneizado obtenido, separar pigmentos vegetales por cromatografía
en papel y columna.

OBJETIVOS PARTICULARES.

· Conocer el procedimento de homogenización y centrifugación de una muestra

biológica.
· Llevar a cabo el procedimento para realizar una cromatografía en columna.
· Saber realizar la preparación de una columna cromatográfica para poder llevar
a cabo una cromatografía.

.caracterizar a los pigmentos presentes en la hoja de espinaca en base a sus

propiedades quimicas
METODOLOGÍA
La indicada en el manual de Bioquímica, correspondiente a la practica 3 “Homogeinizacion,
centrifugación y cromatografía.” páginas: 40-43.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Cromatografia en papel.

Numero y color de los Rf del componente Observaciones

componente separados

1. Amarillo 1.9/9.6 =0.1979 Fue el que menos se movio

ligeramente atraves del papel
verdoso

2. Verde 3.1/9.6 = 0.3229 Estaba muy junto del 1

claro. componente

3. Verde 6/9.6 =0.625 Se diferencia claramente de

oscuro los demás componentes

4. Amarillo 7.6/9.6 =0.7916 Fue el que mas se movio

atravez del papel
Cromatografía en columna.

Número y color de los componentes Observaciones

separados

1. color Tubos 1 y 2
verde intenso oscuro

2.color verde intenso y vivo Tubo 3

3.vede claro translucido Tubos 4 y 5

4.color verde amarillento Tubos 6,7 y8

5.color amarillo ligeramente verdoso Tubos 9-20

CÁLCULOS

Cálculos de Rf de la cromatografía en papel:

Distancia total recorrida por el eluyente = 9.6cm

DISCUSIÓN DE RESULTADOS Commented [1]: Ya falta explicar qué pigmento es

cada color y la cromatografía en columna
En esta práctica aprendimos a realizar la homogeneización como un método para romper la
Commented [2]: no seria mejor que la tira la
membrana celular y así extraer su contenido. Además reconocimos la importancia de pusiéramos en resultados?
seleccionar las diferentes técnicas con las que se lleva a cabo según el tipo de tejido del que
se trate; en el caso de la espinaca, es un tejido duro debido a las nervaduras que posee y por
lo tanto, usar el mortero es la mejor opción para homogeneizar.

Commented [3]: sigue faltando lo del color, no

recuerdo que color eran :c
Se cortaron trozos muy pequeños de la hojas de espinaca con el fin de facilitar su
homogeneización y se usó etanol para solubilizar los pigmentos que se extrajeron de la
espinaca. Uno de los requisitos para que se lleve a cabo la extracción completa de pigmentos
es que sea un disolvente orgánico en el que sean solubles la clorofila y cartenoides y al mismo
tiempo, sean solubles en agua, pues gran parte del peso fresco de los tejidos vegetales
corresponde a agua. Posteriormente, se homogeneizó con ayuda del mortero y pistilo.

Una vez que observamos que en el etanol estaba disuelto una gran cantidad de los pigmentos
(el etanol ya tenía un color verde intenso) y se había formado una pasta con el resto de las
hojas de espinaca, se procedió a equilibrar en peso lo obtenido en dos tubos de ensayo para
posteriormente centrifugar, pues sólo se iba a requerir el sobrenadante o fase líquida para la
cromatografía. El equilibrar en peso el contenido de los tubos es de vital importancia, ya que
de lo contrario al introducirlos en la centrífuga si estos no cuentan con el mismo peso, los
tubos pueden romperse o dañar el equipo.

La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente

densidad por medio de una fuerza giratoria. La fuerza centrífuga es provista por una máquina
llamada centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotación que origina
una fuerza que produce la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor
densidad.

Los componentes más densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotación de la
centrífuga (fondo del tubo), mientras que los componentes menos densos de la mezcla se
desplazan hacia el eje de rotación. En términos muy simples, se aumenta la fuerza de
gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitación del sedimento en la
base del tubo de ensayo de manera más rápida y completa.

Se realizó el centrifugado de las muestras con el fin de separar la fase líquida (homogénea)
y el precipitado. La velocidad de centrífuga depende del tamaño de las partículas a separarse,
siendo 5000 rpm la velocidad máxima cuando se quieren separar partículas grandes, como
células. La centrífuga fue programada a 2500 rpm por 10 minutos,se lleva a cabo de esta
manera ya que la centrifugación empleada es diferencial, es decir, el comportamiento de cada
componente de la muestra depende de su forma, tamaño, densidad y, lógicamente, de las
condiciones de centrifugación para sedimentarse.Se obtienen sólo 2 fracciones: sedimento y
sobrenadante. Los pigmentos que se desean estudiar en este caso se encuentran en los
cloroplastos. Es por eso que se emplean esas condiciones para el centrifugado, si este se
hubiera llevado a cabo durante más tiempo, entonces las moléculas de estudio (pigmentos)
también habrían quedado sedimentadas ya que son de un gran peso molecular. Al ser durante
un tiempo reducido entonces los pigmentos se mantiene en el sobrenadante

Posteriormente se hizo una cromatografía en papel y en columna para identificar los

pigmentos que se encuentran en el sobrenadante.

Para la cromatografía en columna se llenó esta con sacarosa molida para emplearla como
fase estacionaria como fase móvil se utilizó al éter de petróleo, con el cual siempre se
mantuvo en la columna humeda evitando que la sacarosa se secara, y se adiciono un mililitro
de la muestra en la columna

Al hacer mover la muestra a través de la columna, se establece un equilibrio entre el soluto

adsorbido en la fase estacionaria y la fase líquida que fluye por la columna. Debido a que
cada uno de los componentes de una mezcla establece interacciones diferentes con la fase
estacionaria y la móvil, se observó que al salir la fase móvil de la columna esta iba cambiando
de color, estas fracciones se recogieron en diferentes tubos de ensaye que corresponden a
los pigmentos, al ser de estructura diferente estos se transportan a diferentes velocidades y
es como se consigue su separación.

Empleando este método meramente cualitativo observamos almenos entre 4 y 5 fracciones

diferentes de color

Para la cromatografía en papel; cortó una tira de papel de 3 x 20cm, a 1.5cm de distancia de
la base se colocó una mancha concentrada con la sustancia de estudio y este se introdujo en
una cámara cromatografía que contenía una mezcla de éter de petróleo-acetona-benceno
(85:5:10), A medida que el disolvente asciende por el papel, se encuentra con la muestra que
empieza a viajar por el papel con el disolvente. Los diferentes compuestos de la muestra
recorren distancias diferentes dependiendo de la fuerza de sus interacciones químicas con el
papel, ya que la mezcla empleada al ser de un mayor carácter no polar los compuestos que
presenten estas mismas características viajaran más lejos en el papel, en cuanto a las
manchas que se encuentran más cerca de la aplicación de la muestra son aquellas que no
son afines con el disolvente es decir las más polares.

los pigmentos esperados o que se espera que se encuentren en la muestra de espinaca es

la clorofila a, b, xantofilas y β-carotenoide las cuales presentan las siguientes estructuras
correspondientemente
observando las estructuras de los compuestos que se esperan encontrar, xantofilas y β-
carotenoide Al ser las moléculas más simétricas es decir menos polares se esperaría que las
marcas de estas en el papel cromatográfico estén más arriba a comparación de la clorofila a
y b que al ser menos simétricas y más polares tendrían menor afinidad con la mezcla de
disolventes empleados.

El parámetro empleado para la identificación de estos pigmentos presentes en la espinaca es

el cálculo del factor de retención.

El factor de retención se calcula de la siguiente manera

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

Todas las sustancias presentan un rf característico dependiendo del feluyente usado. Para
un sistema similar en cuando a polaridad los valores teóricos de rf son los siguientes

Rf = 0.16 for xanthophyll,

Rf = 0.32 for chlorophyll b,

Rf = 0.44 for chlorophyll a

Rf = 0.95 for β-caroteno Commented [4]: perdi la fuente de estos datos :,v
pero les juro que es confiable, por si hay que inventarla

Rf obtenidos

Componente 1 = 0.19
Componente 2 = 0.32

Componente 3 = 0.62

Componente 4 = 0.79

Los resultados obtenidos son muy similares sin embargo debe tomarse en consideración que
los valores teóricos son producto de un experimento empleando únicamente éter de petróleo
como fase móvil y el usado en el laboratorio estaba mezclado con benceno y acetona, lo cual
pudo influir en el recorrido de la muestra.

Otra manera para caracterizar los componentes en base a su color

CONCLUSIONES

El objetivo principal de esta práctica fue el de estudiar el fundamento teórico y

familiarizarnos con diferentes técnicas de análisis Bioquímico empleadas para el estudio de
las biomoléculas, y haciendo uso de estas caracterizar mediante un análisis cualitativo a los
pigmentos encontrados en la hoja de espinaca. Las técnicas empleadas fueron
homogeneización, centrifugación y cromatografía, en ese orden ya que estas se hacen cada
vez más selectivas. La homogeneización es una técnica empleada para la separación, la
centrifugación para la separación y purificación y la cromatografía además nos permito
identificar las diferentes sustancias contenidas en la hoja de espinaca en base a sus
propiedades fisicoquímicas. Los resultados obtenidos fueron los esperados y similares a los
presentados en la literatura.

Bibliografía
http://www.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/fisiologiaveg/m_didactico/manua
l_practicas/ExtPig_bED.pdf
http://www3.uah.es/bartolomesabater/Guiones%20de%20Practicas.pdf
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/centrifugacio_tipus.html

http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=11&ved=0ahUKE
wi43Y3ChcDZAhUJ6mMKHYi6ADI4ChAWCCgwAA&url=http%3A%2F%2Fwww.ehu.eu
s%2Fbiofisica%2Fpdf%2Fbq.pdf&usg=AOvVaw3LToBs80qc4Ge7mf3ALJZy