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República Bolivariana de Venezuela

Universidad del Zulia


Facultad de Medicina
Escuela de Bioanálisis
Cátedra: Análisis Instrumental

ENTRIFUGACIóN
Centrifugación
 Es un método por el cual se pueden
separar sólidos de líquidos de
diferente densidad mediante una
centrifugadora, la cual comprime la
mezcla. Un movimiento rotatorio con
una fuerza de mayor intensidad que la
gravedad, provocando la
sedimentación del sólido o de las
partículas de mayor densidad
Principio físico-
químico
 Difusión: La difusión es proceso físico
irreversible, en el que partículas
materiales se introducen en un medio
que inicialmente estaba ausente,
aumentando la entropía del sistema
conjunto formado por las partículas
difundidas o soluto y el medio donde
se difunden o disolvente.
Principio físico-
químico
 Sedimentación: es el transporte
de partículas en un campo de
fuerza de centrifugación: permite
determinar el peso molecular,
densidad y forma de
macromoléculas y organelos
celulares.
Principio físico-
químico
 Principio de Arquímedes: Afirma que todo cuerpo
sumergido en un fluido experimenta una fuerza
hacia arriba igual al peso del volumen del fluido
desplazado por dicho cuerpo. Todo cuerpo
sumergido en un líquido, recibe un empuje de
abajo hacia arriba igual al peso del líquido
desalojado. Esta fuerza se mide en Newtons y su
ecuación se describe como:
 Donde ρf y ρs son respectivamente la densidad
del fluido y del sólido sumergido; V el volumen del
cuerpo sumergido; y g la aceleración de la
gravedad
Principio físico-
 Principio dequímico
Stokes: Algunos de los principios
básicos en la teoría de la sedimentación se
derivan de la Ley de Stokes. Para simplificar el
problema se suele considerar que las partículas a
aislar en Biología son esferas; cuando éstas se
encuentran en un campo gravitacional y alcanzan
una velocidad constante, la fuerza neta sobre
cada esfera es igual a la fuerza de resistencia que
opone el líquido a su movimiento
Principio físico-
químico
 Si las partículas están cayendo verticalmente en un
fluido viscoso debido a su propio peso puede
calcularse su velocidad de caída o sedimentación
igualando la fuerza de fricción con la fuerza de
gravedad.

 Donde:
 Vs es la velocidad de caída de las partículas
 g es la aceleración de la gravedad,
 ρp es la densidad de las partículas y
 ρf es la densidad del fluido.
Fuerzas que
intervienen
 Fuerza en
Centrífuga (FC): Es una elde rotación
fuerza
que expulsa las partículas a moverse del centro
de la rotación a la periferia, está dada por la
siguiente ecuación:
 Fc = w2.r.m
 Donde w = velocidad angular
 R= radio (distancia) m: masa de la partícula
Fuerzas que
intervienen en el
 Fuerza Centrípeta (FT): es la fuerza
encargada de atraer las partículas hacia el
centro de la rotación o centro de gravedad.
Es una fuerza de oposición, tiene las
magnitudes pero en sentido contrario a la
fuerza centrífuga, está dada por la siguiente
ecuación:
 (FT)= w2.r.m
 w= velocidad, r=radio, m= masa del medio
Fuerzas que
intervienen
 Fuerza friccional(FF):
en
se
el
inicia por
desplazamiento de las partículas y su
interacción por las moléculas del medio.
También puede oponerse a la separación de
las partículas. Está dada por la siguiente
ecuación:
 FF= F.V donde F es el cociente de fricción y V=
velocidad del desplazamiento.
 Cabe mencionar que las partículas cuando
alcanzan el equilibrio, la sumatoria de las
fuerzas es igual a 0 Fc + Ft + Ff= 0.
Componentes de la
Centrífuga
Componentes de la
Centrífuga
•Rotor (eje de gravitación o gravitacional):
Es el eje que gira a las aspas de un
abanico. En una barra metálica cilíndrica
que gira en el interior de la centrífuga, en
otras palabras, la parte giratoria de una
centrifuga y dependiendo del tipo de
cabezal se clasifican en:
•Rotores Flotantes
•Rotores de ángulo fijo o angulares
•Rotores verticales
Componentes de la
Centrífuga
Cada tipo de rotor es adecuado para un
tipo determinado de separación:
Componentes de la
Centrífuga
 Motor: es un componente que tiene la finalidad
de aportar velocidad al rotor, es decir, el
dispositivo que impulsa el instrumento.

 Cámara de vacio: espacio donde se gira el


rotor (eje de rotación más cabezal). En las
centrifugas de alta velocidad esta cámara se
cierra al vacio y se le controla la temperatura.
Componentes de la
 Control de Centrífuga
velocidad: viene dado en r.p.m. es
el que mantiene la velocidad del aparato.
Pueden ser un panel de mandos digitales,
cuyo selector de velocidad es regulable en
fracciones de 100rpm, 600rpm, 8000 rpm y
más de acuerdo al rotor.
 Control de tiempo: va a depender del tipo de
centrífuga y el tipo de muestra que es la que
determina el tiempo necesario de
centrifugación.
Componentes de la
 Control de Centrífuga
temperatura: mantiene los niveles
de temperatura deseada dependiendo de la
centrífuga utilizada. La programación de la
temperatura se puede hacer a través de un
termostato digital que puede ir de 0º a 40ºC
con un rango de 1ºC.
Variables que afectan
 Masa:la centrifugación
la masa es proporcional a la velocidad de
centrifugación debido a que se permite separar
las partículas de diferente masa por las altas
velocidades.
 Densidad de la partícula: si la densidad de la
partícula es mayor que la del medio la
centrifugación se realiza en menor tiempo.
 Densidad del medio: al aumentar la densidad
del medio, disminuye la velocidad, realizándose
en mayor tiempo la centrifugación.
Variables que afectan
la centrifugación
 Aceleración de la gravedad: Al aumentar la fuerza
centrípeta aumenta el giro del homogeneizado
cuando la gravedad se acelera o aumenta, la
velocidad se altera, ya que aumenta.
 Coeficiente de difusión: se refiere a la densidad de
corriente de partículas, es decir, al número de
partículas que atraviesan en la unidad de tiempo,
un área unitaria perpendicular a la dirección en la
que tiene lugar la difusión, la densidad de
corriente de partículas es proporcional al
gradiente de concentración.
Variables que afectan
ladepende
 Tiempo: centrifugación
del tipo de centrífuga y de la
composición de la muestra.

 Temperatura: El movimiento de las partículas va a


incrementar la temperatura, es decir, a mayor
movimiento, mayor será la temperatura por lo que
es necesario controlar la acción de centrifugación.
Variables que afectan
la centrifugación
 Velocidad: cada  Presión: depende del
partícula se sedimenta tipo de análisis.
proporcionalmente a la
fuerza centrifuga
aplicada y a la
aceleración a la cual se
somete la muestra en
la centrifugación ya que
al aumentar la fuerza
aumenta la velocidad
de separación.
Tipos de Centrífuga
 Las centrífugas: las centrífugas son instrumentos
que permiten someter a las muestras a intensas
fuerzas que producen la sedimentación en poco
tiempo de las partículas que tienen una densidad
mayor que la del medio que los rodea
 Centrifuga simple, de sobremesa, o clínicas:
Pequeño tamaño
Sin refrigeración
Máxima velocidad 5000r.p.m.
Útil para las partículas grandes. (Células,
precipitaciones de sales insolubles)
Tipos de Centrífuga
 Centrifuga de alta velocidad:
Velocidad de 18000 y 25000 rpm.
Refrigeradas algunas con sistema de vacío
Útiles en la separación de fracciones celulares
Insuficientes para la separación de ribosomas, virus o
macromoléculas.
 Microfugas: variante de las anteriores
Velocidades altas 1000rpm. Y tubos cortos
Volúmenes muy pequeños
Útiles en biología molecular.
Tipos de Centrífuga
 Ultracentrífuga:
Velocidad a partir de 50000rpm.
Presentan sistemas auxiliares: sistemas de
refrigeración, sistema de alto vacío.
2tipos:
Analíticas: obtención de datos precisos de
propiedades de sedimentación.
Preparativas: aislamiento de partículas de bajo
S. (microsomas, virus, macromoléculas).
Tipos de
 Centrifugación analítica: la medición analítica
involucraCentrifugación
la medición de las propiedades físicas de las
partículas sedimentadas como el coeficiente de
sedimentación o peso molecular. Los métodos ópticos
se emplean en la ultra centrifugación analítica. Para
poder aplicar la tecnología de la centrifugación
analítica deben cumplirse una serie de requisitos:
Que se aplica a sustancias lo más puras posibles no a
grandes mezclas.
Que presenten una mayor capacidad de giro, en torno a
las 100.000rpm.
Su principal objetivo es aislar partículas específicas
dentro de la centrifugación preparativa.
Tipos de
 Centrifugación preparativa: diferencial y en
Centrifugación
gradiente de densidad

El objetivo de la centrifugación preparativa es aislar


partículas específicas.
Existen dos métodos de separación en
centrifugación preparativa: Diferencial y En
gradiente de densidad.
Tipos de
 Centrifugación diferencial: Es el método más común
Centrifugación
de separación, y es rara la purificación enzimática
que no lo utiliza. En este método, el tubo de
centrífuga se llena con una mezcla uniforme
problema. Tras la centrifugación se obtienen dos
fracciones: un pellet que contiene el material
sedimentado y un sobrenadante con el material no
sedimentado. El método es bastante inespecífico, y
a priori no se puede saber si la partícula buscada
quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido
entre ambos; sin embargo es una técnica muy útil,
sobre todo para aislamiento de células y orgánulos
subcelulares.
Tipos de
 Centrifugación en gradiente de densidad: Este
Centrifugación
método es algo más complicado que la
centrifugación diferencial, sin embargo presenta
ventajas que compensan el trabajo añadido. La
técnica no solo permite la separación de varios, si
no todos, los componentes de la muestra, sino
que también permite realizar medidas analíticas.
 Existen dos variaciones dentro de la
centrifugación en gradiente de densidad:
Centrifugación zonal
Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica
Tipos de
 Centrifugación zonal: La muestra a analizar se
Centrifugación
deposita en la parte superior de un gradiente de
densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las
partículas comenzarán a sedimentar a través del
gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes
velocidades dependiendo de su masa.
 Centrifugación de equilibrio en gradiente o
isopícnica: Separa las partículas con base en sus
densidades diferentes, la muestra puede ser
cargada directamente sobre un gradiente de
densidad preformado y la centrifugación llevada a
cabo
Importancia de las
centrífugas en la
 Las centrífugas pueden usarse para la separación rápida
de sustancias que en condiciones normales se separarían
lentamente bajo la influencia de la gravedad, por ejemplo,
puede acelerarse el secado de un sólido al centrifugarse.
 La centrifuga es hoy un aparato indispensable en
cualquier laboratorio, como veremos al enumerar las
distintas actividades en las que la centrifuga se nos
ofrece como técnica de separación.
 Separación del suero o plasma, concentración de células,
separar quilomicrones de suero o fraccionar las distintas
lipoproteínas.
Medidas de seguridad
para el manejo de la
 Las centrífugas se deben comprobar por lo menos
una vez al ano por un técnico especializado (para
cada centrifuga debe llevarse un libro de control).
 Las centrifugas deben disponer de una tapa
protectora con cierre de seguridad. El funcionamiento
impecable del cierre debe comprobarse
continuamente por el técnico mecánico.
 La carga máxima y el número de revoluciones por
unidad de tiempo indicadas en la placa de
identificación no se deben sobrepasar.
Medidas de seguridad
para el manejo de la
 Las centrífugas instaladas en locales
especialmente protegidos contra el riesgo de
explosión deben estar provistas de los mismos
elementos de protección (correa de transmisión
conductora de la electricidad). Si se centrifugan
materias combustibles, se debe trabajar bajo
atmósfera de nitrógeno.
 Hasta que la centrífuga no está detenida por
completo, está terminantemente prohibido
vaciarla o limpiarla con paletas u otros utensilios.
Control y
funcionamiento de la
Para un adecuado funcionamiento de la centrifuga
es necesario seguir las siguientes
recomendaciones:
 Utilizar tubos resistentes a la F.R.C. Poner un
amortiguador en el fondo del adaptador como
anti choque y para evitar que el sobrenadante
pueda ser movido. Tener cuidado de que no
sobresalga el tubo del porta tubos, ya que puede
impedir la oscilación en las centrífugas de
cabezal oscilante.
Control y
funcionamiento de la
 Equilibrar correctamente la centrífuga colocando los
tubos, cubetas, etc. De igual peso, forma y tamaño en
posiciones opuestas en el interior de los contenedores,
manteniendo una disposición geométrica simétrica; se
pueden emplear tubos con agua cuando falte alguno.
Esto es necesario, pues la descompensación del rotor
puede causar vibraciones que si son pequeñas pueden
no notarse, produciéndose poco a poco un desgaste de la
centrífuga que aumentará la frecuencia de las roturas de
los tubos y llevará a una peor sedimentación, que puede
resuspenderse cuando la centrifuga desacelera para
parar.
Control y
funcionamiento de la
 Tapar los recipientes para evitar la evaporación que
puede causar el aumento de la temperatura que se
produce en el interior de la cámara debido al
rozamiento, así como para impedir la formación de
aerosoles que pueden ser contaminantes
 No forzar el paro de la centrífuga con el freno de
mano o con alguna maniobra manual, evitando de
este modo la posible mezcla de las dos partes ya
separadas, y además peligro de accidente.
Control y
funcionamiento de la
 Chequeo de la velocidad de centrifugación, por lo
menos cada tres meses mediante un estroboscopio
ligero o un tacómetro externo de conocida exactitud.
 Limpieza periódica, o tras rotura de algún tubo, de la
cámara y los contenedores para impedir en lo posible
la propagación de agentes infecciosos. El temporizador
de la centrífuga debe ser chequeado cada semana
frente a un temporizador de referencia, la temperatura
de una centrifuga refrigerada cada mes; los
conmutadores, cepillos y escobillas del motor, cada tres
meses, y reemplazarlos cuando sea necesario.
Ventajas y desventajas
de su uso
Aplicación de la técnica
en varios tipos de
 Análisis clínicos:
Separación del suero o plasma: éste se separa del
paquete celular, es una de las actividades primordiales
en los laboratorios clínicos
Concentración de células: estos componentes de los
líquidos biológicos se concentran para facilitar el
diagnóstico microscópico del sedimento
Separación de sustancias
Aclarar líquidos orgánicos
Separar quilomicrones del suero o fraccionar las
distintas lipoproteínas
Aplicación de la técnica
en varios tipos de
 Análisis ambientales:
Separación de sustancias sólidas de
suspensiones altamente concentradas.
Separación de aceites con bajo contenido de
unidades de sedimentación presentes en agua
Separación de lodos aceitosos de agua.
Aplicación de la técnica
en varios tipos de
 Análisis alimenticios:
En los alimentos se utiliza para separar la
grasa de la leche del agua, y usar esta grasa
para la producción de nata, mantequillas, entro
otros
Filtrar los zumos de fruta, aceites, cervezas,
desaguar el almidón