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NOTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L.
González-Herrera
UNIDAD 1
ADN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN
1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADN

El ácido desoxiribunucleico fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich
Miescher, en los núcleos de las células del pus y en esperma de salmón. La llamo
nucleína, observó la presencia de fósforo.
Robert Feulgen, en 1914, describió un método para revelar por tinción el ADN,
basado en el colorante fucsina. Se encontró la presencia de ADN en el núcleo de
todas las células eucariotas, específicamente en los cromosomas.
El bioquimico P.A. Levene en los 20’s analizó los componentes del ADN y
encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas),
adenina y guanina (purinas); el azúcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Fosfato.
La virtud del material genético es su habilidad para especificar una larga variedad
de proteínas. Un error inicial fue el pensar que la estructura del material genético
debería ser tan compleja como la variedad de proteínas producidas, ya que, se
pensaba, que únicamente las proteínas poseían la suficiente diversidad para
especificar otras proteínas, sin embargo, se aclaró esta cuestión cuando se sugirió
que el material genético producía proteínas siguiendo un código basado en la
diversidad de combinaciones que se podían obtener de los nucleótidos, tomados
de tres en tres.
El descubrimiento del principio de transformación en los núcleo celulares por

Griffth (1928), dio la base para pensar que el ácido nucleico era el material
genético.
La bacteria del género Pneumococus provoca la muerte en ratones produciéndoles

neumonía, la virulencia de las bacterias están determinadas por los polisacáridos
capsulares, componentes de la superficie de diferentes tipos de Pneumococos,
estos pueden ser tres diferentes tipos (I, II y III) de polisacáridos capsulares, todos
con apariencia algodonosa (S) en la pared y por lo tanto en la colonias formadas.
La bacteria S, con apariencia lisa, muerta puede transformar a las bacterias vivas
R. A esta capacidad de transformación se le aisló, como un principio de
transformación, en cultivo por Avery y colaboradores en 1944 y demostraron que
era el ácido desoxiribonucleico (ADN), que se encontraba en abundancia en los
núcleos de las células (Figura 1).
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NOTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L. González-Herrera
Figura 1.1 Experimento de transformación de Avery y colaboradores
El papel del ADN luego fue confirmado con el descubrimiento de las enzimas
ADNasas, pues al degradar los ácidos la capacidad transformante se perdía, lo que
no sucedía se empleaba la tripsina que degrada proteínas lo cual no influía en la
transformación, se desechó entonces la idea de que las proteínas poseían la
capacidad de trasmitir la información génica.
1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSAL

Después de demostrar que el principio transformante consistía de ADN, era
necesario probar que este era el material genético en todos los sistemas
biológicos.
Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a células de E. coli, cuando estas se

aplican a la bacteria son absorbidos y 20 minutos mas tarde las bacterias son
lisadas, liberando una gran cantidad de fagos. Hershey y Chase (1952), infectaron
bacterias E. coli, con fagos T2 marcados radiactivamente ya sea con P32 en el ADN
o bien con S35 en las proteínas. Las bacterias infectadas fueron centrifugadas
separándose en dos capas. La capa superficial consistía de las envolturas de los
fagos liberados de la superficie bacteriana y por lo tanto marcados con S35. La otra
fracción consistía de las bacterias infectadas, la mayoría de P32 se presentó en las
bacterias infectadas. La progenie de fagos producidos por la infección contenía un
30% del P32 marcado, y muy poco (1%) de S35 marcado.
Este experimento demuestra que el ADN del fago interno entra a la bacteria y
forma parte de la progenie de fagos, exactamente el patrón de herencia esperado
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del material genético.
Aunque se demostró claramente que el ADN es el material genético, el

experimento de infección con fagos no es tan preciso como la transformación
bacteriana para excluir proteínas contaminantes del ADN.
Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase
Eucariontes: La discusión de los resultados de transmisión de Avery, son

aplicados a un amplio rango de organismos tanto procariontes como eucariontes.
Cuando el ADN es aplicado a poblaciones de células eucarióticas simples crecidos
en cultivos, los ácidos nucleicos entran a la célula y en algunas resulta en la
producción de proteínas nuevas. Al inicio la extracción se realizaba en masa, pero
ahora el ADN se puede purificar para incorporar secuencias que producen una
proteína particular.
Como en el caso de células mutantes (TK-) para la producción de Timidina kinasa

(TK) y que pueden obtener esta capacidad cuando se le aplica una secuencia de
3
ADN que poseea el gen que la sintetiza
Los experimentos de transformación en células eucariotas se denominan como

transfección, sin embargo es similar a la transformación bacteriana. El ADN
introducido se convierte en parte del material genético de la célula que ha sido
transfectada.
Al inicio la técnica se realizaba únicamente en cultivos de células, pero más

recientemente el ADN puede ser introducido en huevos de mamíferos por
microinyecciones. Estos experimentos demuestran no solamente que el ADN es el
material genético, sino que, puede ser transferido entre especies diferentes y
permanecer funcional.
El materia genético de todos los seres vivos y algunos virus es el ADN. Sin
embargo algunos virus poseen ARN como material genético, no obstante aún
siguen siendo los ácidos nucleicos los encargados de dirigir los cambios y
perpetuaciones génicas.
1.3 COMPONENTES DEL ADN

La observación de que las bases están presentes en diferentes cantidades en el
ADN de las diferentes especies dio como conclusión el concepto de que las
secuencias de bases debe ser la forma en que la información genética es
almacenada.
Figura 1.3 Componentes del ADN.
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Figura 1.4 Cada nucleótido contiene un anillo heterocíclico de carbono con átomos
de nitrógeno (base nitrogenada), un azúcar con cinco carbonos en forma de anillo
de pentosa y un grupo fosfato.
Figura 1.5 Las bases nitrogenadas pueden ser pirimidinas: con anillos de seis
miembros. Purinas: con dos anillos formados de cinco y seis miembros cada uno.
Las bases purínicas son: adenina y guanina tanto en moléculas de ADN como en
las moléculas de ARN. Por otro lado, se encuentran 2 pirimidinas en ADN, citosina
5
y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timina

difiere del uracilo por la presencia de un sustituto del metilo en la posición C5.
Las pentosas también son diferentes entre las moléculas de ADN y de ARN, de
donde proviene su nombre: ADN = 2 – desoxyribosa y ARN = ribosa.
Figura 1.6 Esquemas de los azúcares presentes en las moléculas de ARN

(iquierda) y ADN (derecha).
Son diferentes por ausencia o presencia del grupo hidroxil en la posición dos. Las
bases nitrogenadas se unen a la posición uno de pentosa por una unión
glucosidica en la posición N1 de la primidina y en la N9 de las purinas. Una base
ligada a un azúcar es llamado nucleosido y cuando se une a un grupo fosfato se
llama nucleótido.
Los nucleótidos proveen de bloques, los cuales se unen para construir los ácidos
nucleicos. Los nucleótidos se unen en una cadena de polinucleótidos por una
columna que consiste de series alternadas de azúcar y residuos de fosfato.
Los nucleótidos pueden existir en formas en las cuales más de un grupo fosfato se
une a la posición 5’. Son enlaces de alta energía, la cual es proveída para
actividades celulares. NTP – nucleócido trifosfato, NDP – nucleócido difosfato (ver
figura 1.4).
6
Figura 1.7 La posición número 5’ de una pentosa se conecta con la posición 3’ del
siguiente anillo de pentosa, por un grupo fosfato. Por lo que la columna de
fosfodiester–azúcar se dice que consiste en uniones 5’–3’, las bases nitrogenadas
se pegan en la periferia de la columna azúcar – fosfato. 5’ izquierda y 3’ derecha.
1.4 LA DOBLE HÉLICE DEL ADN

Tres puntos claves sirvieron de base para que Watson y Crick propusieran el
modelo de doble hélice del ADN en 1953:
1. Los datos de las fotografías de los rayos X,

que mostraban que el ADN tenía una forma de
hélice regular, dando una vuelta completa
cada 34 Aº (3.4 nm) con un diámetro de 20 Aº
(2 nm) aproximadamente.
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2. La distancia entre nucleótidos adyacentes es 3.4 Aº, 10 nucleótidos por vuelta.

La densidad del ADN sugería que la hélice debería contener dos cadenas de
polinucleótidos. El diámetro constante se explica si las bases de cada cadena se
unen de manera restringida por lo que las purinas siempre son opuestas a las
pirimidinas.
Pirimidina con pirimidina,

muy delgado
Purina con purina, muy

grueso
20 Aº
3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporción G y C es

siempre la misma en el ADN al igual que la proporción A y T. la composición de
cualquier ADN se describe por la proporción G + C que tiene un rango de entre 26
a 74 % para las diferentes especies.
Watson y Crick propusieron que las dos cadenas están unidas no por enlaces
covalentes, sino por uniones de hidrogeno entre las bases nitrogenadas por lo que
G pasa puentes de hidrogeno que la unen con C, y A con T de igual manera estas
reacciones se conocen como bases pareadas. Estas bases pareadas se dice que
son complementarias.
Figura 1.8 Para que se pareen las bases, estas deben de estar en su forma
Tautomerica, es decir NH en lugar de NH2 y COH en lugar de C=O.
El modelo también requiere de que las cadenas corran en direcciones opuestas

antiparalelas. Una cadena corre en dirección 5´- 3´ y su contraparte 3´- 5´.
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La cadena azúcar- fosfato se presenta en la parte exterior por fosfato cargado

negativamente, los cuales in vitro se neutralizan usualmente con Na+ y in vivo
proteínas positivamente cargadas neutralizan estos grupos, los cuales juegan un
papel importante para determinar la organización del ADN en la célula.
Las bases se encuentran en la parte anterior, forman los escalones de la escalera

en hélice (figura 1.7). Estas bases intervienen en la estabilidad termodinámica de la
doble hélice, de dos formas:
a). Puentes de hidrogeno entre las bases

b). Uniones hidrofóbicas, resultando en intervenciones entre los sistemas de
electrones de los pares de bases.
Cada par de bases rota 36º alrededor del eje central relativo al siguiente par, por lo
que 10 pares de bases dan un giro completo de 360º. El giro completo de una
hélice doble con surcos angostos (12 Aº) y surcos amplios (22 Aº), esta es la
forma β del ADN.
1.5 REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA DEL ADN

Un experimento crucial del material genético es que este debe reproducirse de
manera adecuada. Debido a que las fibras de polinucleótidos están unidos
únicamente por puentes de hidrogeno, es posible que se separen.
Figura 1.9 Cada cadena sirve como

templete para la síntesis de la cadena
complementaria. Por lo que la
estructura del ADN lleva la información
necesaria para perpetuar su
secuencia.
Este modo de replicación produce que la cadena doble materna origine dos
cadenas fijas y cada una con una cadena materna y otra hija nueva, por lo tanto la
replicación es SEMICONSERVATIVA.
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Marcas con isótopo (N15) en las bases nitrogenadas de las cadenas de ADN y ser
fácilmente reconocibles en las cadenas, resultado de la replicación, observándose
que en la primera generación se obtienen dos cadenas dobles, con una cadena
original y una nueva cada una, en la segunda generación se obtienen cuatro
cadenas dobles y dos totalmente nuevas.
Menselson y Stahl (1958) realizaron el experimento con 3 generaciones continuas

de E. coli. La disrupción es solamente transitoria y localizada en una pequeña zona
de la cadena doble, por lo que apenas se forme la cadena hija, la cadena original
se acopla a ésta, esta región se denomina “horqueta de replicación”, la cual se
mueve sobre el templete.
Figura 1.10. Experimento de M. Meselson y F. Stahl para demostrar la hipótesis

de la replicación semiconservativa. Cultivos de E. coli en un medio cuya fuente de
nitrógeno era un isótopo pesado, el N15 que se incorporaba al ADN sintetizado. El
cultivo se mantuvo durante varias generaciones para que el N15 formara parte de
todo el ADN. Se extrajo a continuación el ADN marcado y se transfirió a un medio
con N14. Las incubaron el tiempo suficiente para que se dividieran una sola vez. Se
sometió la mezcla aultracentrifugación para distinguir las moléculas que contenían
N15 y N14.
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1.6 CÓDIGO GENÉTICO: TRIPLETES

Debe sintetizarse al menos 20 aminoácidos distintos con la del ADN y debido a que
éste solo posee 4 bases distintas, el código debe de ser de más de una base.
42 = 16 combinaciones posibles
43 = 64 combinaciones posibles
Por lo que algunos tripletes deben ser específicos, mientras que otros aminoácidos
pueden ser originados por más de una combinación de tripletes. Solo una de las
dos cadenas codifica para proteínas, por lo que el código genético es una
secuencia de bases (no de pares de bases ).
Tres nucleótidos = 1 aa trinucleótido = codón
Leído de 5’ – 3’, los nucleótidos que codifican para una proteína comprende a la
secuencia de aminoácidos de la proteína escrita en dirección N hacia terminación
C.
1 Segunda base 3
* U C A G *
U Ph U S
e U T
y U C
y
U
r r s
U e U U U C
Figura 1.11. Cuadro con el
codigo genético “casi
U Le U S
e U A
l U A
A
u r t Tr
universal”. Los cuadros rojos U U U o U p
G
representan los codones que
significan alto en el proceso C C Le C P
r C H
i C A
r
U
de síntesis. El cuadro verde u o s g
C C C C C
con la letra I, representa el
codón de inicio “universal”. C Le C P
r C G
l C A
r
A
u o n g
C C C C G
A A Il A T
h A A
s A S
e
U
e r n r
A A A A C
A Ile A T
h A L
y A A
r
A
r s g
A I A A A G
G G Va G A
l G A
s G G
l
U
l a p y
G G G G C
G Va G A
l G G
l G G
l
A
l a u y
G G G G G
11
El código genético es degenerado: un mismo aminoácido puede estar determinado

por más de un triplete o codón. Debido a que existen 64 tripletes distintos y hay
solamente 20 aminoácidos diferentes. Es un código sin superposición o sin
solapamientos: dos aminoácidos sucesivos no comparten nucleótidos de sus
tripletes.
La lectura del ARN mensajero es continua, sin interrupciones. Cualquier pérdida o

ganancia de un sólo ribonucleótido produce a partir de ese punto una modificación
de la pauta de lectura, cambiando todos los aminoácidos desde el lugar de la
alteración.
El triplete de iniciación suele ser AUG que codifica para Formil-Metionina. También
pueden actuar como tripletes de iniciación GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con
menor eficacia. Existen tres tripletes sin sentido o de terminación que no codifican
para ningún aminoácido: UAA (ocre), UAG (ámbar) y UGA.
Las bases generales del código fueron descubiertas por el análisis genético de
mutantes del fago T4. En 1961 Crick y colaboradores demostraron que el código
debe de leerse en tripletes que no se traslapan a partir de un punto de inicio.
Tres posibles maneras de leerse, lo que se conoce como Región de lectura.

ACG ACG ACG ACG
CGA CGA CGA CGA
GAC GAC GAC GAC
Una mutación cambian el sitio de inicio de la lectura y por lo tanto del aminoácido lo
que produce un cambio en la región de lectura. El colorante Acridina puede
provocar esta mutación.
Cuadro 1.1 Excepciones a la universalidad del código en eucariontes

ORGANISMO CODÓN SIGNIFICADO EN SIGNIFICADO EN
CODIGO CODIGO
NUCLEAR MITOCONDRIAL
Todos UGA FIN Trp
Levadura CUX Leu Thr
Drosophila AGA Arg Ser
Humano, bovino AGA,AGC Arg FIN
Humano, bovino AUA Ile Met (inicio)
Ratón AUU,AUC,AUA Ile Met (inicio)
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1.7 MUTACIONES PUNTUALES CAMBIAN PARES DE BASES SENCILLAS

Todos los organismos sufren de un cierto número de mutaciones como resultado
de las operaciones celulares normales o por interacciones con el ambiente. Este
tipo es llamado ESPONTÁNEO.
El tratamiento con ciertos compuestos pueden aumentar la ocurrencia de

mutaciones, estos compuestos son llamados MUTAGENOS y los cambios
provocados por estos son referidos como MUTACIONES INDUCIDAS.
Cualquier par de base del ADN puede ser mutado. Una mutación que cambia
únicamente un par de bases simples, se conoce como MUTACIÓN PUNTUAL, la
cual se puede deber por:
un mal funcionamiento del sistema celular que se encarga de replicar y reparar el
ADN.
Interferencia química directa con una de las bases en el ADN.
Figura 1.12. Esquema de una mutación, puede deberse a un cambion en una

base, o bien a una adición o a una supresión (corte) de una base.
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TRANSICIÓN: mutación puntual más común, se presenta por una sustitución de

bases del mismo grupo o familia (purina por purina; pirimidina por pirimidina).
Ejemplo: conversión química directa de una base a otra
Figura 1.13. Ejemplo de una transversión, por sustitución de bases, el bromutoacil

se une a Guanina o a Adenina.
TRANSVERSIÓN: esta mutación es menos común, se presenta por sustitución de

bases de familias distintas. Ejemplo: cuando una base anormal se introduce en la
cadena: BrdU (bromouracil) en lugar de T (timina).
Las mutaciones por sustituciones de bases, generalmente poseen algunas

funciones residuales. Luego entonces, se sustituye un aminoácido pero no
necesariamente cambia la función de la proteína.
Figura 1.14. Cuando el colorante naranja de acridina cambia la región de lectura el

cambio provoca una alteración completa de la proteínay en la estructura de la
molecula de ADN.
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1.8 TASAS DE MUTACIÓN

Mutación espontánea que inactivan la función de un gen en una bacteria ocurre
con una tasa de 10-5 a 10-6 eventos por locus por generación. Se estima que la
tasa en eucariontes debe ser similar.
En un gen bacteriano de 1200 pares de bases, que codifica para 400 aminoácidos
la tasa de mutación promedio para un cambio de nucleótidos individuales es de 10-
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a 10-10 por generación. Sin embargo no todas las mutaciones del ADN provocan
cambios observables en el fenotipo.
Las mutaciones silenciosas: no tienen un efecto aparente en el fenotipo. Se puede

deber a: el cambio de bases en el ADN no cambian los aminoácidos presentes en
la proteína, o bien el cambio en los aminoácidos no afectan la función de la
proteína, por lo que se dice que se presentan substituciones neutrales.
Cuadro 1.2 Algunos valores de tasas de mutaciones puntuales en los organismos

ORGANISMO GEN TASA DE MUTACIÓN
POR GENERACIÓN
Bacteriofago Rango de hospederos 2.5 x 10-9
Escherichia coli Resistencia a fagos 2.0 x 10-8
Zea mays Factor de color (R) 2.9 x 10-4
Color de semillas (Y) 2.0 x 10-6
Drosophila melanogaster Letalidad 2.6 x 10-5
Mutación directa: afecta la actividad de un gen, puede ser reversible por otra
mutación llamada MUTACIÓN REVERSA, que posee una probabilidad muy baja
de presentarse en el mismo sitio.
1.9 TOPOLOGÍA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

La cadena de ADN es más que una secuencia de bases ordenadas, posee ciertas
características fisiológicas que son de crucial importancia para su actividad.
El número de pares de bases por cada vuelta en la molécula de ADN no es

necesariamente fijo, sino que puede variar según las circunstancias. La doble
hélice no existe de manera estirada y recta, sino que se enrolla para ocupar un
espacio menor.
Ciertas secuencias tienen la propiedad de adoptar una confirmación alterna de

doble banda diferente a la configuración beta del ADN. Para que el ADN se
replique o se exprese, las bandas de la doble hélice deben separarse.
Este último punto es de mucha importancia, desde la perspectiva de su función en

15
la replicación y expresión como proteína, para lo cual no se rompen los enlaces

covalentes. Es posible que las bandas se separen y se vuelvan a reponer bajo
condiciones fisiológicas y a las tasas (rápidas) necesarias para sostener las
funciones genéticas. La especificidad del proceso se determina por la
complementación de los pares de bases.
Este proceso de separación de las bandas es llamado DESNATURALIZACIÓN.

Este fenómeno ocurre en un rango muy pequeño de temperatura (85–93ºC)
resultando en un cambio amplio de sus propiedades físicas.
La densidad óptica cambia, ya que la absorción de luz del ADN disminuye en un 40
% de lo que se observa en una mezcla de nucleótidos de la misma composición.
EFECTO HIPOCRÓMICO
HIPOCROMICIDAD: se da por desnaturalización.

Tm= es la temperatura de fusión, esta temperatura se ve afectada por la
composición de bases del ADN y las condiciones de desnaturalización. En
condiciones fisiológicas 85 – 95ºC.
El valor exacto de Tm depende de la proporción de pares de bases G – C ya que

estas poseen un triple enlace de H, siendo así, más estable que A – T. Mientras
más pares de base G – C en el ADN más E se necesita para separar las bandas.
Esta relación entre Tm y la composición en pares de bases es lineal.

ADN con 40% G – C (mamíferos) requieren 87ºC.
ADN con 60% G – C (aves) requiere 95ºC en condiciones similares.
La fuerza iónica de la solución tiene también un efecto fuerte en la Tm.
La desnaturalización del ADN es reversible bajo condiciones apropiadas. Esta

habilidad de las bandas separadas de ADN se conoce como
RENATURALIZACIÓN.
Las hebras simples de ADN entran en contacto con su hebra complementaria por
casualidad, si sus secuencias son complementarias se aparean formando regiones
de hélices dobles.
La región de complementación de pares de bases se extiende a lo largo de la

molécula con un efecto similar a la cremallera, formando una molécula doble más
larga. La renaturalización provoca la restauración de las propiedades originales del
ADN.
16
DOBLE HÉLICE
DE ADN
NUCLEOSOMAS
SOLENOIDE
BUCLE
CROMATIDAS ROSETÓN
ESPIRAL DE
ROSETONES CROMOSOMA
Figura 1.15. Grado de empaquetamiento y organización de la molécula de ADN, lo

cual le confiere la topología clásica.
Esta propiedad de los ácidos nucleicos de complementarse entre bandas sencillas

se conoce como HIBRIDACIÓN, cuando los ácidos nucleicos provenientes de
fuentes distintas, o bien ADN y RNA.
El ADN se organiza de tal manera que posee un cierto grado de “arreglo” o

“empaquetamiento”. Con el que se relaciona algunos aspectos de su
funcionamiento.
La cromatina (ADN + proteínas) puede ser dividida en dos tipos:

Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mitótico su radio de
empaquetamiento es aproximadamente de 1000 – 2000 durante la interfase.
Heterocromatina: Muy densa » cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular no

cambian su densidad. En esta forma el ADN no es transcripto. Heterocromatina es
diferente a la Eucromatina solo por el grado de condensación.
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Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas

incluyendo secuencias satélites de ADN
A B
Figura 1.16. Cambio en la topología (a diferentes niveles) de la molécula de ADN,

como respuesta a los procesos celulares. A) Molecula en proceso de replicación,
B) Molecula en proceso de transcripción.
1.10 AISLAMIENTO DE GENES
A)Aislamiento a partir de proteínas

A partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína, podemos deducir la
secuencia del ADN que la codifica, utilizando el código genético (aunque de
manera imperfecta), pues un mismo aminoácido puede ser codificado por más de
un triplete o codón).
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Se sintetiza una cadena de oligonucleotidos con la aproximación de la secuencia

y se marca radiactivamente generando una sonda o detector que mediante una
hibridización nos permite detectar su secuencia complementaria.
Ejemplo: Met-Val-Lys-Gly-Glu-Met-Asn Proteína

AUGGUXAAA(G)GGXGAA(G)AUGAAU(C) ARNm
TACCAXTTT(C)CC(X)CTT(G)TACTTA(G) ADNsonda
Cuando se emplea una sonda, se puede analizar el contenido de las células de

las colonias derivadas de una genoteca, las aplicaciones pueden ser: el diseño
de una sonda con base en la secuencia de un gen de rata para intentar detectar
el gen en humano.
Figura 1.17. Esquema del proceso de aislamiento de un gen bacteriano empleando

una sonda marcada con isotopos radiactivos.
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B) Aislamiento de genes utilizando anticuerpos

En ocasiones las proteínas cuyo gen correspondiente queremos aislar no se
pueden purificar en gran cantidad y los métodos para determinar la secuencia de
aminoácidos de una proteína son bastante laboriosos. El sistema inmunológico nos
permite utilizar otro fenómeno de reconocimiento molecular para localizar genes.
Desde hace muchos años, los investigadores del campo de la inmunología han
utilizado animales de laboratorio para obtener anticuerpos específicos contra
sustancias de interés. Las proteínas, en particular; cuando son extrañas a un
animal, inducen en éste la producción de anticuerpos. Estas moléculas son, a su
vez, proteínas con características muy interesantes.
Los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio de
mezclas complejas, las sustancias específicas que indujeron su producción. Si se
inyecta una proteína en un conejo, a partir del suero sanguíneo del conejo
podemos obtener anticuerpos dirigidos contra dicha proteína. Estos anticuerpos, se
usan de manera análoga a como se usaron los oligonucleótidos o sonda de ADN,
para detectar las clonas que contengan el gen que codifica para la proteína de
interés lo que se conoce también como "inmunobúsqueda“o “inmunodetección”.
C) Aislamiento de genes utilizando sus ARN mensajeros

A finales de los años setenta, los trabajos pioneros de Phillip Sharp y Richard
Roberts sorprendieron a la comunidad científica con un asombroso descubrimiento:
la trasncriptasa reversa.
En los tejidos que presentan una abundante cantidad de una proteína específica,
por lo general poseen abundantes copias del gene en forma de ARN mensajero
(como resultado de la transcripción acelerada). Por ejemplo: si se purifica ARN
mensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparación estará
constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbúmina.
Se hace necesario utilizar un procedimiento que convierta la información de ARN a

ADN. Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera reversa
hacia ADN. Esto es, en principio, posible: la información (codificada en la
secuencia) esta en la molécula de ARN. Lo que se requiere es una enzima que
realice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y nucleótidos para incorporar
a los del ADN. Tal enzima existe en la naturaleza: en los retrovirus. Usando una
preparación que contenga esta enzima, la transcriptasa reversa, sobre el ARN, se
obtiene el llamado ADNc, o ADN complementario. El ADNc puede ser clonado igual
que cualquier otro ADN.
20
Figura 1.18. Esquema que representa la reacción de amplificación de ADNc a

partir de una molecula de ARN.
21
UNIDAD 2
PERPETUACION Y EMPAQUETAMIENTO DEL ADN
2.1 PERPETUACIÓN DEL ADN
2.1.1 Replicón: unidad de replicación

Replicación: La replicación del ADN es necesaria para perpetuar la información
genética y prepara a la célula para una división posterior. Cuando se inicia la
replicación, la división celular ocurre hasta que ésta halla finalizado. Puede
controlarse en la iniciación, una vez que esto ocurre se replica todo lo comprendido
entre origen y termino, la frecuencia de replicación es regulada por ciertas
proteínas. La replicación puede ser Unidireccional o bidireccional, formando un ojo
que crece hasta que se replique el replicón entero. En moléculas de ADN circular,
por lo general, se forma una estructura en forma de letra griega teta (θ).
Replicón: El material genético está organizado en unidades denamonidas

replicones, las cuales se confromoan de un sitio de Origen y un sitio de término,
toda la secuencia de ADN que se encuentre entre estos puntos será replicado una
vez que comience el proceso.
En procarióntes: Todo el genoma se encuentra organizado en un solo replicón, si

poseen plásmido, éstos no son considerados como parte del genoma y cada uno
representa un replicón autónomo. Cada fágo o virus de ADN constituye un replicón.
En eucariontes: El genoma se encuentra organizado en un gran número de

replicones. Cada replicón se activa una sola vez por ciclo celular, aunque no lo
hacen simultáneamente.
2.1.2 Horquilla de replicación

Todas las actividades de replicación son reguladas por un conglomerado de
enzímas y por la topología misma del ADN. Las proteínas que prevén estas
actividades enzimáticas no funcionan de modo independiente, y son contenidos en
una estructura multiprotéica.
Replisoma: Es un conjunto de enzimas y proteínas, que se ensamblan en una sola

unidad antes de la replicación, esta compuesto de:
ADN Polimerasa: Que son enzimas capaces de sintetizar nuevas hebras de ADN a
partir de un templete. Una enzima posee la función de replicación las otras poseen
varios subsidiarios en la replicación o participa en la reparación del ADN. Ninguna
ADN polimerasa puede iniciar una cadena de deoxirribonucleótidos, todas las
enzimas requieren de una cadena previamente iniciada por lo que un paso
esencial, es la presencia de una actividad "primaria" para comenzar la cadena de
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ADN. Esta actividad involucra la síntesis de una secuencia corta de

ribonucleótidos que luego es removido PRIMER (primario).
Creación de la horquilla de replicación en el origen
Se requiere dos tipos de funciones para convertir una cadena doble de ADN a una
cadena sencilla.
I
) Una enzima Helicasa separa las hebras de ADN usando la hidrólisis de ATP para
proveer la energía necesaria.
I
I) Una proteína de unión a hebras.sencillas se une a la hebra sencilla del ADN
previniendo la formación del estado doble.
I
II) Un punto de desenrrollamiento se mueve sobre el ADN lo que marca la
generación de la orquilla de replicaciòn, que continúa moviéndose durante la
elongación.
I
V) El primer nucleótido de la cadena nueva debe ser sintetizado en el “primer”, esta
acción es requerida una vez en la hebra lider pero es repetida al inicio de cada
fragmento de Okasaki en la hebra convicta. Algunos eventos que se requieren para
la iniciaciòn ocurren unicamente en el origen, y otros al inicio de cada fragmento
de Okazaki durante la elongación.
23
Figura 2.1 Esquema de la horquilla de replicación de un eucariota.
En Eucariontes: Existen cinco clases de ADN polimerasas con diferentes

funciones, como se preenta en el siguiente cuadro 2.1.
2.2 Esquema de la replicación del

ADN mitocondrial. Se replica de una
manera particular, ya que es
circular, pero cada cadena de ADN
posee su propio origen de
replicación, pero no se encunatra
situado en sitios cercanos. El origen
(OL) se encuentra en la cadena de
ADN “externa”, y el origen (OH) en
la cadena “interna”, por lo que el
inicio de la replicación acontece a
tiempos diferentes en cada una,
dirigida por la ADN polimerasa γ .
Cuadro 2.1 Enzimas que intervienen en el proceso de replicación del ADN en

eucariontes.
α(1) δ (II) ε(III) β γ
Localización Núcleo Núcleo Núcleo Núcleo Mitocondria
Función Síntesis de Síntesis de Reparación Reparación Replicación

hebra cautiva hebra lider
y priming
Sub- I)Núcleo I) Núcleo I) Núcleo 1.Núcleo 1.Núcleo

unidades catalítico catalitico catalitico catalítico catalítico
2)Primasas I)Desconocid 1.Sin 1.Sin
I)Desconocida Requiere función función
PCNA conocida conocida
Actividad
Exonucleasa No Si Si No Si
3´- 5´
En procariontes: Las enzimas poseen actividad exonucleolítica que procede en

dirección reversa, 3'-5', a partir de la síntesis de ADN ejecuta una función
24
postsintética de prueba de lectura.
Cuadro 2.2 Enzimas implicadas en la relicación del material genético de

procariotas.
ADN polimerasa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III
Función principal Elongación Reparación Replicación
Número/célula 400 Desconocido 10-20
Actividad Elongación5’-3’ Elongación5’-3’ Elongación5’-3’

enzimática Exonucleasa 3’-5’ Exonucleasa 3’-5’ Exonucleasa 3’-5’
Exonucleasa 5’-3’
Subunidades 1) Fragmento α, sintetiza ADN

Klenow (68,000 da) β, sintetiza ADN
δ, Factor I
2) Fragmento γ, Factor II
pequeño (35,000 ε, Exonucleasa 3’-
da) actividad de 5’
exonucleasa 5'-3'
remueve 10 pares,
inicia la replicación
en un corte, "Nick
Traslatión”
Locus Pol A Pol B dna E (Pol C), dna

N, dna x , dna q,
dna t.
Figura 2.3 Horquilla de replicación donde se muestran los componentes que

intervienen en el proceso de incio de la replicación en procariotas.
25
2.1.3 Mecanismo de replicación: eucariotas, procariotas y virus
Replicación en procariotas
El proceso de replicación en procariontes y eucariontes es similar, las diferencias
entre uno y otro son el mayor tamaño del material genético en eucariontes, su
empaquetamiento con histonas, que en los eucariontes se producen muchas
horquillas de replicación al mismo tiempo, y que se conocen menos las proteínas
que intervienen en eucariontes que en procariontes.
Al igual que en eucariontes, los procariontes replican su DNA de forma continua en
la hebra 5' - 3' (conductora) y de forma discontinua en la hebra 3' - 5' (retardada).El
DNA en las bacterias suele ser circular y su replicación ocurre en tres etapas,
empezando por un único punto:
1. Desenrollamiento y apertura de la doble hélice

2. Síntesis de dos nuevas hebras de ADN
3. Corrección de errores
Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice. Intervienen un grupo de enzimas y proteínas, a cuyo

conjunto se denomina replisoma. Primero intervienen las helicasas que facilitan en
desenrrollamiento en el punto ORI o de orígen que es un lugar con gran contenido
de A y T. Después actúan las girasas y topoisomerasas que eliminan la tensión
generada por la torsión en el desenrrollamiento y actúan las proteínas SSB que se
unen a las hebras molde para que no vuelva a enrollarse.
Síntesis de dos nuevas hebras de ADN. Actúan las ADN polimerasas para sintetizar las
nuevas hebras en sentido 5´-3´, ya que la lectura se hace en el sentido 3´-5´. Intervienen las ADN
polimerasas I y III, que se encargan de la replicación y corrección de errores.
La que lleva la mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III. Actúa la ADN polimerasa II,
corrigiendo daños causados por agentes físicos.La cadena 3´-5és leída por la ADN
polimerasa III sin ningún tipo de problemas (cadena conductora). La cadena 5´-3´
no puede ser leída directamente, esto se soluciona leyendo pequeños fragmentos
(fragmentos de Okazaki) que crecen en el sentido 5´-3ý que más tarde se unen. A
esta hebra se le llama retardada porque su síntesis es más lenta.
La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la síntesis por sí sola, para esto
necesita un cebador (ARN) que es sintetizado por una ARN polimerasa (primasa).
Este cebador es eliminado posteriormente. La ARN primasa, va sintetizando a
intervalos los ARN cebadores que van siendo incorporados a la copia como si
fueran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA
cebador del fragmento de Okazaki ya terminado.
La ARN primasa se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejo

llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. Conforme
van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va
sintetizando la cadena discontinua formando los Fragmentos de Okazaki, cada uno
de unos 1000-2000 nucleótidos(en eucariotes es de 100-200). Hace falta un RNA
cebador por cada fragmento de Okazaki.
26
Corrección de errrores. La enzima principal en esta fase es la ADN polimerasa I,

que corrige todos los errores cometidos en la replicación o duplicación. También
intervienen otros enzimas como: endonucleasas que cortan el segmento erróneo;
ADN polimerasa II que rellenan correctamente el hueco y ADN ligasas que unen
los extremos corregidos.
La labor de la ADN polimerasa I es de exonucleasa, puede poner bases como

sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta proteína
encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow.
En E. coli la replicación es bidireccional y se inicia a partir de un solo origen, que

es conocido como Ori C: Sitio en la molécula de ADN en el que se Inicia el ciclo de
replicación, en este sitio se controla la frecuencia de los eventos de iniciación, este
debe segregarse a los cromosomas replicados que se dirigen hacia las células
hijas.
El origen de la replicación contiene muchos sitios de unión de las proteínas, PBS
(por sus siglas en inglés), que son secuencias relativamente cortas de ADN y que
funcionan como un sitio de anclaje para proteínas que regulan el proceso de
replicacón.
Cuando la molécula de ADN que se replica es circular, y la

replicación es bidireccional, los dos ejes de replicación se
mueven alrededor del genoma hasta el punto de
encuentro, el cual por lo general no se ubica en medio, la
región de termino provoca el cese de movimiento, debido
a que en esta zona se adhieren unas proteínas que
detienen el avance de la horquilla de replicación y por lo
tanto el proceso.
Figura 2.4 Replicación bidireccional del genoma circular de E. coli. La horquilla se

mueve a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo, la hélice debe rotar a 50
revoluciones por segundo
27
Las bacterias por lo general poseen dos puntos de unión entre la replicación y el
crecimiento celular. La frecuencia de iniciación de los ciclos de replicación se ajusta
para coincidir y dirigir la tasa de crecimiento celular y por lo tanto la
complementación del ciclo de replicación se conecta con la división de la célula.
En términos de:
C = Replicación del genoma bacteriano entero. El proceso tarda aproximadamente

40 minutos, el movimiento de la horquilla de replicación se da a 50,000 pb por
minuto, esta velocidad es no variable a temperatura constante.
D = Periodo entre la replicación completa y la división celular, es de

aproximadamente 20 min. En este perído se da el ensamblamiénto de los
componentes necesarios para la división.
Replicación en virus
Aunque, el proceso de replicación, como ya se menciono, es similar para
eucariotas y procariotas (incluyendo en éstos a los virus), se describe en este
apartado el modo de replicación de los los virus que poseen su material genético
en forma circular. En el cuadro 2.1 se presentan los diferentes tipos de material
genético que poseen los virus, asi como la forma de su arreglo (cadena simple,
circular, etc.).
Figura 2.5 Mecanismo de replicación del círculo rodante. (a) ADN circular. (b) Una
endonucleasa hace un corte en la cadena positiva (+). (c) La ADN polimerasa
añade nucleótidos en el extremo 3’ de la cadena abierta, de manera que produce
desplazamiento del extremo 5’. (d) El desplazamiento del extremo 5’ se hace más
extenso en la medida que la enzima polimerasa recorre el templado de ADN
circular (cadena negativa). El resultado es la formación de un ADN con longitud
mayor a la normal. Ejemplo: fago l el fago ØXI74.
28
¿Cómo se regula el inicio de la replicación en procariotas?
Una proteína iniciadora puede sintetizarse durante todo el ciclo celular, y cuando la
concentración aumenta se dispara la iniciación. Esta es la hipótesis mas aceptada
en términos de que la síntesis proteica es necesaria para disparar la iniciación. El
gen FtsZ juega un papel importante, una mutación en este gen provoca células
múltinucleadas con filamentos. Este gen es el blanco de otra proteína (Sol A) que
bloquea la división celular bajo ciertas condiciones. Una sobreexpresión de este
gen FtsZ provoca e induce mini-células, que carecen de ADN y son
morfológicamente normales. Por lo tanto la expresión del gen FtsZ determina la
frecuencia de la división, actuando como una proteína iniciadora.
Otra hipótesis relaciona una proteína inhibidora que puede sintetizarse a una velocidad fija, cuando
el volumen celular aumenta, esta se diluye y permite la iniciación.
Replicación en Eucariotas
La síntesis de ADN está ligada con el ciclo celular, el inicio de la replicación y su
coordinación con el ciclo celular parecen estar regulados por acciones de
acelerado y frenado controladas por la producción de diferentes ciclinas en la fase
G1. En levaduras, el tamaño de la célula regula la velocidad a la cual se dará el
inicio de la replicación, quizás esta estrategia sea usada por otras células.
La células que inician G1 siendo anormalmente pequeñas tardarán mas en llegar al punto de inicio
mientras que células anormalmente grandes llegarán a esta etapa más pronto. Los mecanismos por
los cuales los factores ambientales regulan el inicio se relacionan con el efecto que una disminución
de nutrimentos tiene sobre la tasa de producción de ciclinas, las cuales reducen su concentración
en las células y por lo tanto la concentración no es la suficiente para disparar la explosión de
quinasa (Ver figura 2.6)
La síntesis de ADN se lleva al cabo en la fase S del ciclo celular, por lo tanto las células en G2 son
células con una contenido de ADN tetraploide. La mitosis reduce a un número diplóide de ADN en
cada célula hija. En los eucariotes, cada replicón se activa en un momento específico durante el
período S. Puede existir una replicación bidireccional y cuando la horquilla de replicación llega al
punto de término se detiene la replicación.
Cualquier segmento de ADN con un origen puede replicarse, a estas regiones se le conoce como
secuencias de replicación autónoma, ARS (por sus siglas en inglés), conformada por una zona con
secuencia consenso de nucleótidos, que está formada por lo general de 11 pb y rodeada de una
región de ADN rica en los nucleótidos Adenina y Timina. Cada cadena o zona de ADN que se
replique necesita de su propia secuencia de origen.
La velocidad de replicación ADN en células de mamíferos es de 50 nucleótidos por segundo. El

proceso esta regulado por proteínas que actúan rápido y sincronizadamente. El complejo
multienzimático que lleva al cabo este proceso constituye una elaborada “maquina de replicación”.
29
Cuadro 2.3 Tipos de genomas virales.

Virus con ARN ARN de cadena sencilla. Ej. TMV y Poliovirus.
ARN de cadena doble. Ej. Reovirus.
ADN de cadena sencilla Ej. Parvovirus.

Virus con ADN
ADN circular sencillo. Ej. M13 y bacteriófago ÆX174.
ADN de cadena doble. Ej. Bacteriófago t4 y herpesvirus.
ADN circular de cadena doble. Ej. SV40 y polyoma.
ADN de cadena doble con terminaciones asociadas a proteínas

covalentemente. Ej. Adenovirus.
ADN de cadena doble con terminaciones covalentes selladas.

Ej. Poxvirus.
Ciclina
it ti
Factor
Quina
promotor
d
30
Ciclina
Figura 2.6 Control de la replicación-ciclo celular. Esquema de las variación de las

actividades de las ciclinas dependientes de quinasasa (cdc) a lo largo del ciclo
celular en una célula de mamífero. Diferentes ciclinas y diferentes quinasas,
pueden unirse para formar los diferentes complejos, incrementando las opciones
de combinaciones posibles de los complejos de ciclinas dependientes de quinasas
que se forman en el transcurso de un ciclo celular.
ORIGEN
Crecimiento Crecimiento
ORIGEN
Figura 2.7 Esquema del proceso de replicación bidireccional.
Inicio de la
replicación
ADN de nueva Horquilla moviéndose en

síntesis dirección contraria
Figura 2.8 El genoma de los eucariontes está organizado en muchos replicones,

cada uno de los cuales comienza la replicación a diferente tiempo, pero se replican
solo una vez por ciclo celular. La horquilla de replicación se mueve en una o en dos
direcciones hasta llegar al sitio de termino de cada replicón.
31
Síntesis semidiscontinua del ADN
La estructura antiparalela del ADN posee un problema en la replicación, la orquilla

de replicación se mueve en dirección 5´-3´ en una hebra y 3´-5´ en la otra, y los
ácidos nucleicos son sintetizados unicamente en dirección 5´-3´ esto se resuelve
sintetizando la hebra que crece de 3´-5´ en una serie de fragmentos cortos, cada
uno de los cuales realmente son sintetizados de 5´-3´.
La hebra que se sintetiza de 5´-3´ se conoce como hebra lider, la otra es la hebra
convicta o cautiva, cada segmento es sintetizado en una dirección contraria al
movimiento de la horquilla, los fragmentos sin embargo se sintetizan de 5´-3ý
luego son unidos conformando una replicación discontinua.
La iniciación de la síntesis es acompañada por un complejo proteico llamado

Primosoma en E. coli. Las ADN polimerasas de Procariotas y Eucariotas no
pueden iniciar la síntesis de una cadena de ADN a partir de nucleótidos libres. Se
requiere de un "primer" (primario) para proveer de un final libre 3´-OH que pueda
elongarse por la adición de nuevos nucleótidos, esto se da de varias formas:
a) Una secuencia de ARN es sintetizada en el templete, por lo que la cadena de

ARN se extiende por la ADN polimerasa. Comunmente usado en la replicación del
ADN celular y por algunos virus.
b) Unos pares de bases de ARN preformado con el templete, permite que su final
3ÓH pueda ser usado por retrovirus para iniciar una transcripción reversa de
ARN.
c) Un termino inicial es generado por el duplex de ADN, el mecanismo mas común

es la introducción de un corte como el usado en la iniciación de la replicación del
circulo rodante, en este caso la hebra preexistente es desplazada por una nueva
hebra sintetizada (diferente de “Nick Translation” en la cual la hebra es degradada).
d) Una proteína inicia la reacción directamente por la presentación de un nucleótido

para la ADN polimerasa. Esta forma es utilizada por ciertos virus.
32
Figura 2.9 Esquema del avance de una horquilla de replicación, se observa en el

esquema de la derecha la formación del fragmento de Okazaki en la hebra cautiva.
¿Cómo se regula la iniciación de la replicación?

A) Metilación: la replicación ocurre unicamente en un origen metilado, lo cual
sucede en la secuencia palíndroma: GATC/CTAG, y se metìla la posición N6 de la
adenina por una enzima llamada DAM Metilasa.
GAmetT CCT Amet G
La replicación sintetiza cadenas dobles hemimetiladas de ADN:
GAmet TC - MaternaCTAG-NuevaGATC– NuevaCTAmetMaterna
Por lo tanto el complejo de iniciación de la replicación no reconoce el origen.
B) Asociación a la membrana: después que el ciclo de replicación se ha iniciado,

los orígenes de las nuevas cadenas formadas se unen a la membrana previniendo
que se repliquen de nuevo, lo cual puede ser de manera indirecta por que los
orígenes han sido ocupados o bien de manera directa por que algunos
componentes de la membrana inhiben la reacción.
33
2.1.4 Mutaciones: mutágenos

Existen una gran variedad de agentes físicos y químicos que pueden inducir mutaciones. A
continuación se presentan algunos de los principales grupos y su modo de acción.
1.- Mutágenos químicos

Se conocen varios productos químicos que son mutagénicos, clasificándose según su modo de
acción en:
Análogos de bases: Debido a su similitud estructural los análogos de bases como el 5-Bromouracilo
o la 2-Aminopurina se incorporan en el ADN que se replica en lugar de las bases correspondientes
timina y adenina. Cuando uno de estos análogos de bases se incorpora en el ADN, la replicación
puede ocurrir normalmente aunque ocasionalmente ocurren errores de lectura que resultan en la
incorporación de bases erróneas en la copia de ADN. Así por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puede
aparear con guanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transición de AT a GC (la
guanina se aparea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la
transición de AT a GC.
Figura 2.10 Esquema que representa la sustitución de las bases normales por una
molécula de 5-Bromouracilo
Agentes que reaccionan con el DNA: Existen una serie de agentes

químicos que reaccionan directamente sobre el ADN que no se está
replicando ocasionando cambios químicos en las bases lo que provoca
un apareamiento incorrecto.
Acido nitroso (HNO2), desamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las
distintas propiedades de apareamiento de los productos de desaminación (hipoxantina aparea con
citosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT---->GC y/o GC---->AT.
Hidroxilamina (NH2OH), reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un
grupo hidroxilamino. Este derivado de la citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones
GC ----> AT.
Agentes alquilantes: Grupo de productos químicos que afectan al ADN que no se

replica. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagénicos más potentes
para aplicaciones prácticas. Los compuestos utilizados más frecuentemente
incluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato
(DES), diepoxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-
nitroso urea y gas mostaza.
34
La mutagénesis con agentes alquilantes se produce a través de varias vías ya que

originan la formación de un espectro completo de bases alquiladas en el ADN lo
que origina transiciones y delecciones.
El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que ya no se
aparea con la citosina provocando la transición GC ----> AT.
Figura 2.11 Esquema de una mutación de la Guanina provocada por el agente

alquilante etil metano sulfonato (EMS)
El N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancerígeno, es uno de los

mutágenos químicos más efectivos. Se obtienen, en condiciones óptimas, un gran
número de mutantes con una tasa de muerte baja. El mecanismo molecular exacto
de la reacción de la NTG no se conoce todavía.
Agentes intercalantes: Un grupo interesante de sustancias como las acridinas y
bromuro de etidio, son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases
del ADN, separándolas entre sí. Durante la replicación, esta conformación anormal
puede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originando
mutaciones por corrimiento de lectura.
Aunque las acridinas son útiles en investigación, no son muy adecuadas para el aislamiento
rutinario de mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningún efecto mutagénico
en bacterias.
Figura 2.12 Esquema del modo de acción del agente intercalante Acridina.
35
2.- Mutágenos físicos
Luz ultravioleta: Uno de los agentes mutagénicos más efectivos es la

radiación ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda
efectiva para la mutagénesis está comprendida entre los 200 y 300 nm
con un óptimo a 254 nm que es la absorción máxima del ADN. La
radiación a longitudes de onda entre 300 y 400 nm tiene menos efectos
letales y mutagénicos que la luz UV de longitud de onda corta.
Los productos más importantes de la acción de la luz UV son dímeros (timina-

timina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, C)
adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la
replicación del ADN, la ADN polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en tal
posición.
La radiación UV es muy útil en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos.

Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a
la luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad de
supervivencia aumenta y la frecuencia de mutación desciende. Esto se debe a la
activación de un enzima de fotorreactivación que corta los dímeros de timina. En
presencia de luz, el enzima corta los dímeros originando pirimidinas monoméricas.
Figura 2.13 Esquema que representa la formación de dimeros de Timina

provocada por la radiación UV.
Radiación ionizante: La radiación ionizante es una forma de radiación

más potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos
X, rayos cósmicos y rayos gamma. Esta radiación causa la ionización
del agua y de otras sustancias; produciéndose indirectamente efectos
mutagénicos debido a esta ionización.
36
Entre las especies químicas formadas por la radiación ionizante se encuentran radicales libres,
siendo el más importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan con el ADN, y lo
inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las
mutaciones cromosomales.
A bajas dosis de radiación ionizante sólo ocurren unos cuantos impactos sobre el
ADN, pero a mayores dosis ocurren impactos múltiples que conducen a la muerte
de la célula. Al contrario que la radiación UV, la radiación ionizante penetra
fácilmente el vidrio y otros materiales
Figura 2.14 Diferentes tipos de radiacción que se presentan en la naturaleza, se

observa que la radiación ionizante es de longitudes de onda muy pequeñas.
2.1.5 Sistema de protección del ADN
Después de su incorporación, las bases se metilan para marcar segmentos de
ADN. Tanto procariotas como eucariotas contienen enzímas que metílan el ADN
aunque sus funciones de metilación son diferentes.
Procariotas
E. coli posee pequeñas cantidades de 6-metil-adenina y 5-metil-citosina en su
ADN, estas bases se generan por acción de tres metilasas.
a) Sistema hsd: que confiere especificidad del hospedero metilándo la adenina.
b) Sistema dam: que distingue las hebras de ADN de nueva replicación, por
metilación de la adenina (involucrando el control de replicación y marcaje de ADN
para su reparación).
c) Sistema dcm: que metíla citosina, su función es desconocida.
Las bacterias que poseen mutaciones en los tres sistemas carecen de bases
metiladas y siguen siendo viables, por lo que la metilación no es un evento
escencial.
37
Eucariotas
La metilación en este grupo tiene distinta función, es distinguir genes en las
diferentes condiciones funcionales. Los daños al ADN pueden ser minimizados por
un sistema de contención del daño, que reconoce la presencia de un cambio y lo
rectifica. Los sistemas de reparación son similares a los complejos de replicación,
un indicativo de su importancia en la sobrevivencia de la célula.
La tasa de mutación refleja un balance entre el número de eventos dañinos que

ocurren en el ADN y el número que ha sido corregido (o mal corregido).
Un daño al ADN consiste en cualquier cambio que desvíe la usual estructura de

doble hélice, los cambios se pueden dividir en dos grupos.
2.1.6 Reparación del ADN: pre y postreplicativa
Mecanismos de reparación
A) Eliminación directa del daño
• Fotorreactivación
La luz ultravioleta induce la formación de dímeros entre dos pirimidinas adyacentes
(normalmente dímeros de timina). La fotoliasa, mediante el proceso de
fotorreactivación, que es dependiente de luz, revierte la primera reacción y deshace
el dímero.
• Alquiltransferasas
Ciertos mutágenos (nitrosoguanidina, etilmetanosulfonato) añaden grupos alquilos
en la posición O-6 de las guaninas. Las alquiltransferasas eliminan esos grupos
alquilos.
B) Sistemas de reparación dependientes de homología
• Reparación por corte y relleno
Sistema general: El sistema reconoce una base anormal. Rompe puentes
fosfodiéster a una distancia de varias bases a ambos lados de la lesión. Elimina el
fragmento (12-13 nucleótidos en procariotas, 27-29 en eucariotas). El hueco se
rellena con ADN polimerasa I y se sella con ligasa. En E. coli intervienen los genes
uvrABC.
Sistema específico: Una ADN glucosilasa libera la base dañada al romper un

puente N-glucosídico (base-azúcar). Esto da lugar a un sitio apurínico o
apirimidínico (AP). Una AP endonucleasa reconoce el sitio AP y rompe un puente
fosfodiéster en ese sitio.Esto inicia un proceso de reparación por escisión mediado
por una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN.
C) Sistema de reparación directa

Varios tipos de daños son reparados sin la remoción de bases. El ejemplo mas
estudiado es la fotoreactivación directa de los dímeros de pirimidina ciclobutano,
que es una a reacción promovida por la ADN Fotoliasas. Los dímeros de
pirimidinas resultan de una reacción inducida por la luz, y las fotoliasas usan
38
energía derivada de la luz absorbida para revertir este daño. Las Fotoliasas
generalmente contienen dos cofactores que sirven como agentes absorbentes de
luz o cromoforos. Uno de los cromoforos es siempre FADH2. El otro es un folato en
E. coli y levadura.
Figura 2.15 Esquema de reparación directa de un dimero de pirimidina.
D) Reparación de emparejamientos erróneos

El sistema reconoce dos bases mal emparejadas tras la replicación. MutS es la
proteína encargada en E. coli. Determina qué base es la incorrecta, la base
incorrecta es la que se encuentra en la cadena recién sintetizada. La cadena vieja
se distingue porque está metilada en las adeninas que se encuentran dentro de las
secuencias 5'-GATC-3'. Esta metilación es postrreplicativa y la lleva a cabo la
metilasa Dam.
La cadena nueva tarda de 1 a 2 minutos en re-metilarse tras la replicación. MutL y

MutH forman un complejo con MutS. MutH es un endonucleasa que corta la
cadena nueva en el sitio GATC más cercano al emparejamiento erróneo y escinde
la base incorrecta, llevando a cabo la síntesis reparadora. Una exonucleasa elimina
un trozo de la cadena nueva desde el sitio GATC hasta más allá del
emparejamiento erróneo. Proteínas de unión a ADN de cadena simple protegen el
hueco. La ADN polimerasa III rellena el hueco y la ligasa lo sella.
39
REPLICACIÓN
Hebra vieja metilada y

hebra nueva NO
metilada
Las adeninas de la hebra

nueva se metila por
medio de la Dam
metilasa
Figura 2.16 Esquema del proceso de
metilación de las adeninas en la
cadena de ADN recién sintetizada, este
proceso es necesario para que el
sistema de reparación de bases
malparedas reconozca la hebra
materna o vieja.
E) Reparación sin hebra molde: El regulón SOS de E. coli

Sólo se induce en situaciones en que la replicación del ADN está bloqueada por
una lesión y la reparación no es posible por uno de los sistemas antes
mencionados.
Etapas:
1.La ADN polimerasa III se detiene ante una lesión, lo que genera ADN de
cadena simple.
2.Esto atrae a las proteínas de unión a cadena simple (SSB) y a RecA.
3. La presencia de filamentos de RecA es una señal para que la célula
sintetice UmuD y UmuC
4. RecA corta UmuD para dar lugar a UmuD‘.
5. El complejo UmuD' / UmuC permite que la polimerización de ADN
continúe a pesar de la lesión.
El sistema SOS permite continuar la replicación pero introduciendo nucleótidos al

azar. Este es un sistema de reparación propenso a error.
40
Cuadro 2.4 Genes inducidos por el sistema SOS

Nombre del gen
Papel el el sistema de reparación por SOS
PolB (din A) Codifica para la ADN polimerasa II, involucrada en reparar.
uvrA
uvrB Codifican para la ABC exinucleasa.
uvrC
umuC Codifican para proteínas involucradas en la reparación por prueba y

umuD error.
SulA Codifica para proteínas que detienen la división celular.
RecA Codifica para la proteína RecA involucrada en la reparación por

prueba y por recombinación.
PARTICIPACIÓN EN REPARACIÓN POCO CLARA
ssb Proteínas SSB.

uvrD Codifica para Helicasa II.
himA Codifica para subunidad de factor de integración a hospedero.
recN Proteína involucrada en la reparación por recombinación.
dinB FUNCIÓN DESCONOCIDA

dinD
dinF
2.2 EMPAQUETAMIENTO DEL ADN
2.2.1 Genomas y cromosomas

Genoma bacteriano
El genoma bacteriano se encuentra organizado en cuerpos definidos, aunque si
bien no en estructuras morfológicamente distintas como en eucariontes. El genoma
puede verse como un conglomerado que ocupa cerca del 35% del volumen de la
célula . El material genético se condensa en un área conocida como nucleoide.
Las bacterias que han replicado parcialmente su ADN presentan en el nucleoíde

mas de un juego de genomas en ADN. En la división el material se separa en dos
nucleoídes los cuales se particionan entre las células hijas, la segregación
involucra la adhesión del genoma bacteriano a la membrana interna. Mecanismo
similar al de los cromosomas de eucariontes. Un locus específico es conectado a
un sitio en la membrana.
41
Si se rompe una bacteria E.coli las fibras de ADN se liberan en forma de rizos
unidos a la envoltura rota los rizos condensan al ADN gracias a unas proteinas,
muchas proteinas de union con el ADN han sido aisladas de E.coli.
Cuadro 2.5 Proteínas de unión al ADN en E. coli
Proteína Composición Número por célula Equivalentes en
eucariotas
Hu α y β subunidades 9000 d 40,000 dimeros H2B
H 2 sbunidades idénticas 28000 30,000 dimeros H2A

d
H1 10,000 copias Desconocido
Subunidad de 1500 d
HLP1 20,000 copias Desconocido
Monomero de 17000 d
P desconocido protaminas
Subunidad de 3000 d
Genoma viral
Con respecto al empaquetamiento del genoma, existen diferencias entre el genoma
viral y el celular. El genoma viral se ve restringido por dos aspectos: a) la cantidad
de ácido nucleico está predeterminada por el genoma y b) el ácido nucleico debe
empaquetarse en una cápsula de proteína.
El genoma está contenido en una cápsula simétrica o cuasimétrica, ensamblada
por una o mas proteínas. Junto con la cápsula se pueden encontrar otras
estructuras proteicas. El volumen interno de la cápsula pocas veces es mayor que
el volumen de ácidos nucleicos que debe contener. La cápsula es construida con
proteínas codificadas por el virus, por lo que se construye por un tipo simple de
subunidades restringiéndose la forma de la cápsula a dos tipos:
A. Filamentosas o forma de bastón.
B. Pseudoesféricas o simetría icosaedrica
¿ Cómo se construye una cápsula que contenga el ácido nucleico?

1. La cubierta proteica puede ensamblarse alrededor del ácido nucleico,
condensando el ADN o ARN por interacciones ácido proteína durante el
ensamblaje. Un ejemplo es: el MTV, en el cual la cadena sencilla del ARN se ve
cubierta por el ensamblamiento de las proteínas. El ensamble comienza en un
punto determinado del ARN y se dirige hacia ambos extremos de la cadena.
Formándose una estructura cilíndrica gracias a la interacción con la forma helical
del ARN. Estructuras semejantes se observan en cápsulas esfericas ejemplo:
TYMV, la posición del ARN en la cápsula es determinada directamente por su
unión con la proteína de la cubierta.
42
2. La cápsula puede ser construida a partir de sus componentes en forma de una

cubierta vacia,después de lo cual los ácidos nucleicos pueden ser insertados
siendo condensados cuando entran. Ejemplo: en los fagos lambda y T4 , cápsulas
esféricas con ADN . Una cabeza vacía de la cápsula es ensamblada a partir de un
juego pequeño de proteínas, luego el genoma dúplex es insertado en la cabeza,
junto con un cambio estructural de la cápsula.
El ADN insertado a la cabeza vacía de la cápsula tomó una forma concatemérica.
Genomas múltiples unidos final con final. Cada fago posee su propio mecanismo
para reconocer la cantidad apropiada de ADN que debe ser insertada.
Figura 2.17 Esquema de un virus icosahedrico, se observan los componenetes y el

material genético (ADN) en el interior de la cabeza.
Lambda: Los finales del genoma se encuentran marcados por sitios denominados
COS. Este se corta a la izquierda del sitio COS que produce un final libre que es
insertado dentro la cápsula. La inserción de ADN continua hasta que el sitio COS
derecho se libera al cortarse para generar el otro fin. El último final que entra en la
cápsula durante el ensamblaje es el primero en entrar a la célula infectada.
Cualquier ADN contenido entre ambos sitios COS puede ser empaquetado. El
empaquetamiento no resulta si la distancia entre los sitios COS es muy grande o
reducido. Solo un 15 % extra del ADN puede ser empaquetado.
Figura 2.18 Esquema de replicación y recircularización del ADN del fago lambda.
43
Fago T4: La inserción del genoma se inicia en un sitio al azar en el precursor

concatemérico. Continua hasta que un valor del genoma de ADN ha sido insertado
lo que involucra la existencia de algunos mecanismos para medir la cantidad de
ADN (realmente la cantidad de ADN insertado es un poco mayor que el genoma)
creando una redundancia terminal.
Figura 2.19 Esquema de los ciclos reproductivos de los virus, se presenta la forma
de propagación del material genético, y el esamble.
Cromosomas en eucariotas
Los cromosomas eucarioticos individuales solo se observan durante un periodo
corto de tiempo, durante la división celular y pueden observarse como una unidad
compacta con un radio de empaquetamiénto de 10,000. Una cromátida consiste de
una fibra de un diametro de aprox 30 Nm y de apariencia nebulosa.
Durante el ciclo de vida de la célula eucariótica, sin embargo, el material genético

ocupa un área en el núcleo, por lo que los cromosomas individuales no pueden ser
observados.
Cada cromosoma contiene un dúplex de ADN muy largo, por lo que la replicación
de los cromosomas al igual que del ADN es semi-conservativa.
Durante la mitosis las cromátidas hermanas se mueven hacia polos opuestos de la

célula, el movimiento depende de la unión de los cromosomas a los microtúbulos
que se conectan en su otro final con los polos. El lugar al cual se unen los
cromosomas en los microtúbulos se le denomina: Centrómero, que tiene un
significado funcional y estructural, el centromero es escencial para la segregación.
44
El centromero posee una región rica en ADN satélite y por lo tanto contiene una
cantidad considerable de heterocromatina constitutiva. En esta región, puede
observarse una zona obscura fibrosa con un diametro o longitud de 400 nm
aproximadamente. Esta región es conocida como cinetocoro a la cual se unen
directamente los microtubulos. Se asúme que una secuencia específica de ADN
define el sítio en que el cinetocoro se establece.
Figura 2.20 Esquema de la integración del ADN para formar un cromosoma en

mamífero.
Otra estructura importante en los cromosomas es el telómero, que sella el final del
cromosoma, es importante ya que se ha observado que cromosomas rotos sin esta
estructura son inestables y tienden a pegarse a otros cromosomas. Se encuentra al
final del cromosoma o al final de un ADN lineal. Confiere estabilidad a una
molécula lineal. Cada telómero consta de una serie larga de secuencias cortas y
repetitivas.
En la región telomérica se encuentran ciertas discontinuidades, en forma de
bandas simples rotas que previene que la enzima ligasa los selle. La región o
longitud del telómero se encuentra bajo control genético, diferentes cepas de
levaduras presentan diferentes longitudes, algún mecanísmo exíste para prevenir
longitudes muy largas, removiendo algunas repeticiones, por lo cual la secuencia
exácta es irrelevante ya que la región puede crecer al avanzar en las
generaciones.
45
Características necesarias para la existencia de los cromosomas:

i)Telómeros propios para sobrevivir.
ii)Centrómeros: para la segregación.
iii)Origen: inicio de la replicación.
2.2.2 Estructura de la cromatina: histonas y nucleosomas
Histonas
La masa de la cromatina contiene dos veces mas proteína que ADN, las proteínas
pueden ser histonas o no histonas, y el ARN es menos del 10% de la masa de
ADN, éste ARN, está formado por cadenas recién sintetizadas que aún se
encuentran unidas al templete de ADN.
Las histonas conforman aproximadamente la misma cantidad de ADN. Y son las
proteínas mas importantes. En todos los eucariontes se pueden encontrar las
mismas histonas que son las siguientes: H2A Y H2B interactúan directamente con
el ADN son particulas de primer nivel en la cromatina. H1 muestra gran variación
entre tejidos y especies (ausente en levaduras) y una variante es la H5. Células
sanguíneas rojas en aves.
Las no histonas son mas variables entre tejidos y especies, menor masa que las
histonas, muchas mas proteínas, por lo que una proteína se encuentra en menor
cantidad que una histona dada. Las proteínas no histonicas incluyen funciones
relacionadas con la expresión génica. ARN Polimerasa es una no histona de
mucha relevancia.
Proteínas HMG (high mobílity group), son un grupo de proteínas no histónicas bien
definido. Las no histonas tienden a contaminarse con proteínas nucleares.
Cuadro 2.6 Proteínas histonicas presentes en los mamíferos
Nombre de la histona Lisina (%) Arginina (%) Peso molecular y función
H1 29 1 23,000
“Sella” el ADN que se
enrrolla sobre el
nucleosoma.
H2A 11 9 13,960
Interactúa directamente con
el ADN.
H2B 16 6 13,774
el ADN.
H3 10 13 15,342
el ADN.
H4 11 14 11,282
el ADN.
46
Nucleosoma
Contiene aproximadamente 200 pb de ADN asociado a un octámero de histonas.
El octamero es el núcleo del nucleosoma, está conformado por: 2 copias de H2A,
H2B, H3 y H4. Asociada a cada nucleosoma una molécula sencilla de H1, la cual
puede ser removida sin alterar la estructura del nucleosoma.
El nucleosoma siempre posee un núcleo de ADN formado por 146 pb. Cortes
enzimáticos, demuestran que este núcleo permanece sin cortes después de cierto
tiempo, sin embargo, si continúa la digestión se observan longitudes de ADN, la
mayor de las cuales mide 146 pb y la menor, mide menos de 20 pb .
El ADN nucleosomal mide entre el ADN núcleo y el ADN de unión o eslabón entre
80 a 114 pb por nucleosoma.
Los nucleosomas in vitro se observan unidos por ADN libre, pero in vivo, debe
exístir muy poco ADN libre (no asociado), por lo que todo o casi todo el ADN esta
asociado en nucleosomas. Sin embargo, se pueden observar cambios en
diferentes etapas embrionarias.
Figura 2.21 Esquema de un nucleosoma y los

componantes que lo forman. Se observan las
proteínas histónicas disosiadas.
47
La H1 y proteínas no histónicas influyen en la longitud del ADN asociado al

octámero de histonas siendo “proteínas de ensamble“ sin formar parte estructural
del nucleosoma.
La proteína H1 se une en la vecindad de los nucleosomas, en degradaciones con

160- 170 pb.de ADN, se encuentra H1 lo que sugiere que se encuentra en una
región cercana al núcleo del nucleosoma . Cortes de 16 pb no lo presentan.
El nucleosoma es un disco o cilindro plano con un diametro de 11Nm y 6Nm de

altura. Los ≈ 67 Nm (200 Pb) del ADN se encuentran rodeando dos veces al
octámero con un giro de ≈ 34Nm cada una. El ADN entra y sale del octámero en la
misma posición o punto. Realmente el ADN gíra alrededor del nucleosoma dando
1.8 vueltas.
Los octameros del nucleosoma pueden obtenerse por: Extracción de la cromatina.

In vitro: dejando a las histonas en condiciones de alta salinidad.
El ADN que se une al nucleosoma no lo hace al azar, pues un primer paso para la
integración del nucleosoma es la union de proteínas no histónicas en sitios
específicos del ADN. Por lo que se dice que el ADN del nucleosoma se encuentra
“fraseado” es decir siempre reconoce la misma región para unirse al octamero, al
menos en secuencias cortas de ADN.
La cromatina presenta dos tipos de fibras: fibras de 10nm de diámetro y fibras de

30 nm, la diferencia es la estructura y organización de los nucleosomas. 200 Pb =
262,000. Daltons.
Núcleo del nucleosoma

Proteína
ADN de unión no
histónica
Histona
H1
200 pb de
ADN
Figura 2.22 Esquema de una cadena de ADN asociada a nucleosomas
48
2.2.3 Naturaleza de la cromatina

Durante la replicación, cuando la cromatina se duplica, no se observa ninguna
disrupción. La cromatina puede ser dividida en dos tipos :
Eucromatina: Menos densa que en el cromosoma mitótico su radio de

empaquetamiento es aproximadamente de 1000 – 2000 durante la interfase .
Heterocromatina: Muy densa, el grado de empaquetamiento es similar al de los

cromosomas en mitosis, durante el ciclo celular no cambian su densidad. En esta
forma el ADN no se transcribe.
Cromocentro: Varias heterocromatinas agregadas en una región.
La heterocromatina se diferencia de la eucromatina solo por el grado de

condensación.
Heterocromatina constitutiva: Regiones particulares que nunca son expresadas

incluyendo secuencias satélites de ADN .
Figura 2.23 Empaquetamiento

de la cromatina a diferentes
niveles, hasta conformar un
cromosoma en eucariotas.
49
Heterocromatina facultativa: Toma la forma de un cromosoma completo inactivo en

una linea celular pero en otras circunstancias puede ser expresado.
Ej: Cromosoma X en mamiferos, una copia elegida al azar es inactiva en una
hembra dada, lo que compensa la presencia de dos X en hembras.
El cromosma X inactivo se perpetúa como estado heterocromatido. El cromosoma
X activo se perpetúa como estado eucromátido.
Por lo tanto hay correlación entre actividad de transcripción y organización

estructural. La condensación del material genético se asocia con su inactividad,
pero lo contrario no necesariamente es cierto. Los genes activos son contenidos en
la eucromatina, la localización en eucromatina es necesaria para la expresión
génica pero no sufiiente.
In vitro la cromatina en interfase y cromosomas mitóticos poseén grandes rizos de

fibra constitutiva formando regiones o campos independientes, como en los
nucleósidos bacterianos.
El desarrollo de la técnica de bandeo G mostró que cada cromosoma posée una

ultra estructura diferente y reproducible. El teñir los cromosomas después de un
tratamiento, con el colorante giemsa , genera una serie de bandas. Aunque esta
técnica es muy ampliamente empleada aun no se reconoce por que se produce el
bandeo.
50
UNIDAD 3
EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN DEL ADN

3.1 TRANSCRIPCION
Unidad de transcripción: Se extiende del promotor al punto de término de un gen.
La transcripción se divide en tres etapas:

1. Iniciación, en la cual se une el complejo enzimático de transcripción sobre una
secuencia de ADN conocida como promotor, y avanza hasta la secuencia que
significa el punto de inicio, que es donde se une el primer ribonucleótido.
2. Elongación, es el proceso de unión covalente de los ribonucleótidos.
3. Terminación, cuando el complejo enzimático de transcripción llega a una
secuencia que significa el término de la transcripción.
EL DOGMA CENTRAL EXPLICA EL

AD
TRASNCRIPCIÓN
TRASNCRI INVERSA
AR
PROTE
Figura 1 Dogma central del flujo de información en los sistemas vivos.
3.1.1 Unidad de transcripción

ARN polimerasa: enzima encargada de la síntesis de ARN a partir de templado de
ADN. La ARN polimerasa fue descubierta independientemente en 1960 por Samuel
Weiss y Jerard Hurwits.
51
La reacción que cataliza consiste en:
(ARN)n-residuos + NTP ' (ARN)n-residuos + 1 + PPi.
NTP: nucleósido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, el bifosfato

(PPi) se hidroliza
Todas las células contienen a la ARN polimerasa. En procariontes esta enzima

sintetiza todo el ARN excepto el necesario para el cebador en la replicación del
ADN (esta reacción es catalizada por la primasa). Algunos bacteriofagos sintetizan
una ARN polimerasa que solo sintetiza ARN específico del fago. En eucariontes
hay 3 ó 4 ARN polimerasas diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs. La
ARN polimerasa mejor caracterizada es la de E. coli.
Procariotas
Posee una sola enzima ARN polimerasa (encargada de pegar los ribonucleótidos).
Esta enzima sintetiza los tres diferentes tipos de ARN: mensajero, transferencia y
ribosomal. Esta enzima está conromada por varias subunidades, por lo que se le
conoce como holoenzima o complejo enzimático que tiene un tamaño de 48,000
Daltons (Da).
Cuadro 3.1 Componentes de la holoenzima ARN polimerasa de procariotas

Subunidad Locus Número por holoenzima Función
α Rpo A 2 Unión al promotor
β Rpo B 1 Unión de nucleótidos
β′ Rpo C 1 Unión al templete
σ Rpo D 1 Iniciación
El núcleo enzimático de la holoenzima (α,β,β´) puede iniciar el proceso de

transcripción pero no reconoce la secuencia de inicio. El complejo enzimático cubre
60 pares de bases (pb) de la molécula de ADN, sin embargo, sólo desenrolla 17
pb.
La velocidad de la reacción de unión entre nucleótidos es igual a 70 nucleótidos por

segundo a una temperatura media de 37°C.
El proceso de la trasncripción en procariotas puede bloquearse por la acción de

antibióticos, por ejemplo la Rimfacina actúa bloqueando la actividad de la
subunidad β del complejo. La Estreptomicina inhibe el proceso de elongación.
La Heparina es un polianión que bloquea la transcripción in vivo, uniéndose a la

subunidad β.
52
Eucariotas
Este proceso es mas complejo e involucra la actividad de 3 polimerasas de ARN en
el núcleo, cada una con una estructura compleja de subunidades y con una función
diferente.
Cuadro 3.2 Enzimas ARN polimerasas presentes en eucariotas

Nombre Ubicación Función
ARN polimerasa I Nucleolo Transcribe ARNr
ARN polimerasa II Nucleoplasma Transcribe ARNm y ARN nuclear
heterogéneo (ARN)
ARN polimerasa III Nucleoplasma Transcribe ARNt y otras moléculas de
ARN menores
La principal diferencia entre las enzimas eucarioticas es su respuesta al

octapeptido biciclico. α Amanitina, la cual bloquea los ciclos de la ARN polimerasa
II. Uniéndose a ella y no la de ARN polimerasa I.
Cada enzíma se compone de dos subunidades grandes, con untamaño de 200,000
y 140,000 Daltons y varias súbunidades con tamaño de entre 10,000 a 90,0000
Daltons.
No existe especificidad ni entre tejidos ni entre especies en la actividad de la
enzima ARN polimerasa II, in vitro, sin embargo muchos otros factores regulan la
transcripción en condiciones naturales.
ARN polimerasa en mitocondrias y cloroplasto son menos activos y diferentes de
los nucleares y su control parece ser mas simple.
3.1.2 Transcripción en procariotas y eucariotas

Procariotas
El factor sigma (σ) en los procariotas juega un papel muy importante pues asegura
que la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de los promotores y no en otros
sitios, ya que la holoenzima por si misma presenta una alta afinidad por el ADN.
Permite a la holoenzíma reconocer sitios específicos en el ADN y que en ese
momento requieren de ser trasncritos a ARN.
Se forma un complejo terciario ADN-ADN-ARN naciente, cuando se une el primer
ribonucleótido a la secuencia de ADN que se trasncribe, lo que dispara la liberación
del factor sigma de toda la holoenzíma. Este paso es el inicio de la trasncripción
propiamente dicho, cuando ocurre la síntesis del primer enlace fosfodiéster entre
ribonucleótidos.
La proporción entre el factor sigma bacteriano y el núcleo de la holoenzima es de
1:3. Por lo que cuando finaliza la transcripción el tetrámero (holoenzíma) se libera y
debe unirse a otro factor sigma que dirija una nueva transcripción.
Se dan tres etapas en el movimiento de un sitio de unión a otro de la ARN
polimerasa, este movimiento está limitado por la velocidad de difusión en el medio.
53
La afinidad de la holoenzíma hacia el ADN es tan alto como la afinidad del factor σ
hacia la secuencia del promotor. Sin embargo el factor σ solo no se une al ADN,
únicamente se une si forma parte del complejo enzimático.
La iniciación de la transcripción es un punto crítico para controlar la expresión
génica. Los promotores varían en su afinidad hacia la ARN polimerasa.
REGIÓN
HOLOEN
PROMOT
ARN UNIÓN DE LA
POLIMERAS ARN
POLIMERASA
ARN
POLIMERAS
NÚCLEO
INICIO DE LA
Figura 3.2 Esquema del proceso de transcripción en procariotas.
3.1.3 Eventos de la transcripción

La ARN polimerasa comienza a copiar cuando encuentra una secuencia promotora
de ADN, y termina cuando alcanza una señal de terminación. En el caso de los
procariontes el ARN transcrito se une desde el primer momento a proteínas, debido
a que es muy inestable ya que no tiene el 7-metil-guanocina (CAP), ni la poliA, que
estabilizan el ARNm eucariótico.
En la transcripción intervienen factores de naturaleza proteica de tres tipos:
Factores de transcripción: Son diversas proteínas que se unen al ADN promotor,

convirtiéndolo en funcional, lo que atrae a las ARN polimerasas. Hay un factor
especifico para cada tipo de ARN polimerasa. - Factores de iniciación: Es la
subunidad s de la ARN polimerasa y se libera tras la síntesis de los ocho primeros
nucleótidos.
54
Factores de elongación: Se incorpora a la polimerasa tras la liberación del factor de

iniciación. Sirve para la elongación y terminación de la cadena de RNA.
En eucariotas gran parte del ARNm de la célula es producido por un complejo
proceso que empieza en el núcleo con la síntesis y procesamiento de un RNA muy
largo, denominado ARNm precursor, ARN nuclear heterogéneo (ARNhn) o
transcrito primario.
TRANSCRIPCION
Pre ARNm
ESCISIÓN DE INTRONES Y UNIÓN DE EXONES
POLIADENIZACIÓ
ARNm
SALIDA AL CITOSOL PARA SER POR LOS
Figura 3.3 Proceso de maduración del ARN en eucariotas
Este transcrito tiene unos 8,000 nucleótidos (llegando hasta 20,000) y contiene
segmentos que se traducirán como aminoácidos (exones) y segmentos no
codificantes (intrones o secuencias intercaladas) y, además secuencias
reguladoras a las que se unirán las proteínas de regulación génica. A continuación,
este transcrito sufre un proceso de maduración, en el que se cortan y empalman
largas secuencias de ARN (splicing), para eliminar los intrones y dar lugar al ARNm
definitivo que es selectivamente transportado al citoplasma. En este proceso, la
mayor parte del ARNhn (90%) se elimina y degrada en el núcleo.
El transcrito primario de ARN hn es producido por la acción de una ARN

polimerasa II. El ADN promotor contiene una secuencia llamada BLOQUE TATA,
porque consta de secuencias ricas en T y A, esta secuencia está situada a unos 25
nucleótidos por delante del nucleótido de inicio de la transcripción. En eucariotas
(no en procariotas), al transcrito primario se le añaden dos señales, una en cada
extremo:
CAP: Al extremo 5’ del transcrito se le añade un nucleótido especial la 7-metil-

guanosina trifosfatada. Este nucleótido (SELLO) se le añade cuando se llevan
55
sintetizados unos 30 nucleótidos, y sirve para que la subunidad pequeña del

ribosoma reconozca el ARNm y se una a él en la síntesis proteica. Además, evita
que se degrade el ARNm recien creado.
Secuencia poli-A: En el extremo 3’ se añade una cadena de unos 200 residuos

poliadenilados (polinucleótido en forma de poli-A). La cola poli-A desempeña las
siguientes funciones:
a) Interviene en la exportación del ARNm al citoplasma.
b) Contribuye a la estabilidad del ARNm en el citoplasma.
c) Sirve de señal de reconocimiento al ribosoma.
3.2 Control por transcripción de la expresión génica

3.2.1 Interacción ARN polimerasa-promotor
Procariotas
Existen diferentes factores sigma, específicos para cada clase de promotores. En
E. coli, por ejemplo, se ha observado que en condiciones de choque calórico actúa
un factor sigma distinto ya que modifica su patrón de transcripción como efecto del
incremento en la temperatura.
Tanto en procariotas como en eucariotas un aumento en la temperatura resulta en

una reducción de la síntesis proteica. Y un nuevo juego de proteínas son
sintetizadas como resultado de los genes de choque calórico. Probablemente
protegen a la célula contra el estrés ambiental y quizá pueden ser sintetizadas en
otras condiciones.
E. coli se producen 17 proteínas de choque calórico por un cambio en el blanco de

la transcripción, el gen htpr es un regulador necesario para encender la respuesta
al choque calórico, pues produce una proteína de 32,000 Da que funciona como un
factor sigma alternativo.
σ70 .- factor sigma de 70,000 Da en condiciones normales.
σ32 - factor sigma de choque calórico, dirige a la holoenzima hacia el inicio de los
promotores de los genes de choque calórico. Los promotores de los genes de
choque calórico presentan ciertas diferencias en cuanto a la secuencias consenso.
Ligeramente modificada la secuencia –35 y muy diferente la secuencia –10, con
respecto a la secuencia consenso.
σ60 - factor sigma alterno utilizado cuando se presentan condiciones de carencia de

nitrógeno, este factor se activa cuando el amonio falta en el medio, y los genes
necesarios son activados para permitir el uso de fuentes alternas de nitrógeno, este
factor permite a la holoenzima reconocer promotores que presentan secuencias
consenso distintas, con elementos conservados en el sitio –10 y otra secuencia en
el sitio – 20.
56
En Bacilus subtilus se encuentran aún mas factores σ distintos un ejemplo es

cuando esta bacteria es infectada por un virus lítico SPO1 cuyo ciclo infectivo pasa
por tres etapas :
Genes tempranos: inmediatamente después de la infección el genoma viral se

transcribe con la holoenzíma completa del huésped que contiene un σ43 lo cual
indica que su promotor es reconocido por el complejo ARN polimerasa del
huésped. Esto produce la expresión del gen 28 (gp 28) el cual sustituye al factor
σ43 de la holoenzíma que permite reconocer promotores distintos
Genes medios: son expresados después de 4-5 min de la infección como resultado
de la holoenzima unida al factor σgp 28 lo que provoca que se expresen los genes
medios y la holoenzima no reconoce al genoma del hospedero y permite la
transcripción de los genes medios, estos transcriben los genes 33 y 34 dando
como resultado las proteínas GP33 y GP34 que de nuevo sustituyen al GP28 de la
holoenzima.
Genes tardíos: después de 8-12 min. Estos genes son transcritos por la
holoenzima + gp33 y gp34 que únicamente reconocen los promotores de los genes
tardíos. Por lo tanto se observa un patrón de regulación creado por cascada por la
holoenzíma del hospedero que transcribe un gen del fago cuyo producto es
necesario para transcribir los genes medios, cuyo producto de los genes son
necesarios para transcribir los genes tardios.
Gp28= 26,000 Da, Gp33 =13,000 Da y Gp34 = 24,000 Da. Las sustituciones
sucesivas de los factores σ tiene como consecuencia que cada vez que la
subunidad es cambiada la ARN polimerasa es capaz de reconocer una nueva
clave de gen y deja de reconocer la clave previa de genes. Por lo tanto constituye
un cambio global en la utilidad de la ARN polimerasa, el cambio que sufre la
polimerasa es irreversible.
Durante la esporulación de Bacilus subtilus, también entran en juego diferentes
factores σ de la misma célula.
σ43 - Estado vegetativo.

σ37 - Esporulación.- este factor únicamente se une al 10% del núcleo de la
holoenzima. Probablemente σ43 permanece durante la esporulación, el σ43
remanente no se destruye .
σ32 - Esporulación, presente en células vegetativas y activo en etapas tempranas
de esporulación > 1% de la holoenzima se encuentra asociada con este factor
sigma.
σ29 - Después de cuatro horas del inicio de la esporulación, este factor aparece y
permite que se transcriban otros genes, no se encuentra en células vegetativas por
lo tanto es el producto de genes activados por la ARN polimerasa + σ37.
σ28 - Presente en células vegetativas, desaparece en células en esporulación

probablemente expresa genes cuyo producto detecta estrés nutritivo e inician la
respuesta de esporulación.
57
Eucariotas
Promotores para ARN polimerasa II
Para identificar la secuencia de los componentes del promotor, se puede usar
varios criterios:
a) Una secuencia consenso debe estar presente en varios ejemplos del sitio.
b) Las mutaciones en el sitio deben provocar que la función se modifique.
c) Las proteínas involucradas en el uso del sitio pueden marcarse en ellas.
Para definir un promotor se considera su habilidad de iniciar la transcripción, tres

sistemas han sido empleados:
in vitro: Componentes definidos purificados para cada una de las tres ARN
polimerasas. Comparación de las actividades in vitro de las ARN polimerasas de
diferentes tejidos y especies.
Oocitos: Se lleva a cabo una inyección de un templete de ADN en el núcleo del

oocito de Xilopus laevis. El ARN transcripto es aislado y analizado, se observa la
formación de la proteína indicada en el templete inyectado, esta prueba se
desarrolla bajo las condiciones prevalescentes en el Oocito.
In vivo: Células cultivadas que transcriben un templete introducido por transfección.

Utiliza el mismo aparato que se encarga de transferir el genoma de la célula
huésped pero el templete causante de un gen que no se transcribe usualmente en
el huésped.
En cualquiera de los tres sistemas se emplea la misma técnica para caracterizar al

promotor: Cualquier sección de ADN transcripta debe poseer un promotor, y para
localizarlo se reducen los fragmentos a ambos sitios del punto, hasta que este se
inactive.
Promotor
Corte negativo(-)
Corte positivo (+)
ADN
58
La misma longitud corriente arriba debe ser recolocada después de que las
fronteras del promotor han sido encontradas, entonces se puede analizar la
importancia de bases particulares mediante la introducción de mutaciones
puntuales u otro re-arreglo en la secuencia .
Una técnica muy útil para analizar la secuencia necesaria para que el promotor
funcione es llamada: LINKER SCANING. La cual permite introducir mutaciones en
sitios específicos.
De esta manera la secuencia original puede ser monitoreada hasta encontrar un
sitio sensible a la mutación.
En posición corriente arriba, se pueden remover secuencias progresivamente sin
ningún efecto, hasta alcanzar un punto localizado entre –45 y –30 pares de bases
(pb), lo que define la frontera izquierda del promotor, cuando esta es traspasada la
transcripción se reduce en un 20% o más .
Corriente, abajo la frontera derecha del promotor se localiza cerca del punto de
inicio y puede encontrarse después de él a +6 o antes en –10 o –12 pb.
Cuando se corta el punto de inicio, la iniciación ocurre en un punto del templete
localizado a la misma distancia del promotor, al igual que el punto de inicio original,
a excepción de que probablemente se ajuste en una base o dos para hallar una
purina usualmente adenina (A) con la cual iniciar. Al igual que en bacterias, los
promotores presentan regiones homologas cercanas al punto de inicio en tres
regiones:
a) Punto de inicio: homología no extensa, pero con tendencia de la primera base

del ARNm de ser flanqueado a ambos lados de pirimidinas.
b) Secuencia a –25 pb: la mayoria de las proteínas presentan una secuencia

llamada TATA ó caja de Hogness en –19 a –17 pb, hallándose en mamíferos,
aves, anfibios e insectos, para los casos conocidos la secuencia consenso es:
A63 A50
T82 A97 T93 A85 A83
T37 T33
La secuencia consta enteramente de bases A y T y en una minoría de casos reales
el par C-G esta presente. La caja TATA tiende a rodearse de secuencias ricas en
C-G las cuales podrían ser un factor de funcionamiento.La caja Hogness es
equivalente a la Caja Pribnow, sólo difieren en su localización, -25 en lugar de -10
pb. Es una secuencia corta bien definida y localizada cerca del punto de inicio de la
transcripción. Cuando la caja TATA es removida, la transcripción continúa pero el
punto de inicio se corre de su ubicación inicial.
c) Secuencia a -75 pb: cuando esta región es cortada la transcripción inicia en el

punto de inicio usual, pero disminuye en un 2%. Presenta una estructura
multiperiférica localizada en regiones de -50, -70 y -80 a –110 pb, todos necesarios
para una iniciación eficiente.
59
Las regiones entre estas secuencias no parecen involucrarse en la función del

promotor y la distancia que los separa entre sí o de la caja TATA, puede ser flexible
permitiendo un incremento de >15 pb en el primer caso y >30 pb en el segundo.
In vivo los promotores parecen tener dos funciones:

La frecuencia de la iniciación parece estar fuertemente influenciada por las
secuencias medias y distales de la región –75 pb. Su función es la unión de la ARN
polimerasa.
La elección del punto de inicio parece estar influenciada por la secuencia cercana
al punto, caja TATA altamente conservada, su papel es alinear a la ARN
polimerasa para que inicie en el sitio correcto.
¿ Cómo se pone en contacto con regiones tan alejadas dentro del promotor?
Región alejada: muy importante para la unión de ARN polimerasa.
Región cercana: Importante para que se inicie en el punto correcto.
La ARN polimerasa III posee un promotor corriente abajo

El ARNm 5S posee un promotor que encaja dentro del gen a +50 pb. Se descubrió
empleando exonucleasas, 5S ARN seguía siendo transcrito hasta que el corte del
gen dejaba +55 pb. La transcripción se inicia en la purina ubicada a 55 pb corriente
arriba del promotor. ¿Cómo? ARN polimerasa es lo suficientemente grande que
abarca la región a +55Pb.
Factores de transcripción
Son proteínas que reconocen secuencias consenso particulares, pueden ser de
dos tipos:
a) Factores de transcripción que se unen a la ARN polimerasa durante o cuando el

complejo de iniciación se ha formado, sin formar parte de la enzima libre
.Necesarios para iniciar o terminar la transcripción.
b) Factores de transcripción que se unen en secuencias específicas de los
promotores blancos .
En este último caso, se han podido aislar factores de transcripción que reconocen
secuencias determinadas.
Cuadro 3.3 Factores de transcripción en eucariotas

Factor Especie Promotor Sitio de reconocimiento
B Drosophila TATA TATA/Pto de incio
TFIID Hombre Adenosin TATA
CTF Hombre Globin, tk CAAT
USF/MTLF Hombre Tardío GGCCACGTGACC
SP1 Hombre TATA,CAAT,GC GC
HSTF Drosophila Choque calórico Consenso de choque calórico.
60
Algunas estructuras características de los promotores actúan directamente con los

factores mas que con la ARN polimerasa. Los resultados indican que los
promotores deben encontrarse en grupos generales identificados por la presencia
de secuencias concenso y los factores que reconocen tales secuencias son los
responsables de coordinar al reconocimiento de los promotores.
Este reconocimiento por factores múltiples puede ser necesario para que se inicie
la transcripción. Cuando esto sucede, la interacción con los promotores es de
manera cooperativista: la unión de un factor promueve la unión de otro. Sin
embargo, el papel de los factores es únicamente necesario para la transcripción
general sin incluir un papel regulatorio.
Algunos factores pueden actuar como reguladores como es el caso de los genes
de choque calórico. La respuesta al cambio calórico es similar en procariotas como
en eucariotas. Un aumento en la temperatura apaga unos genes y enciende otros,
y probablemente cambia la traducción de los ARN mensajeros.
Los genes de choque calórico en eucariotas poseen una región consenso a -15 pb
del punto de inicio. HTSF es activo en células con choque calórico y se une al sitio
que posee la secuencia consenso, lo que provee un medio para iniciar la
transcripción de los genes específicos. Por lo que se puede decir que los factores
son análogos a los factores σ en procariotas.
Un gen puede ser regulado por una secuencia en el promotor la cual es reconocida
por una proteína específica, ésta
INICIO DE LA funciona como un factor necesario para
que la ARN polimerasa inicie la
transcripción, la proteína se encuentra
disponible únicamente bajo
condiciones en las que el gen necesita
ser expresado, la ausencia, asegura
que el promotor no pueda ser usado.
Probablemente el promotor carece de
ciertas características que le confieren
los factores para poder ser reconocido
por la ARN polimerasa .
Figura 3.4 Esquema que representa

la interacción de las factores de
trasncripción con la ARN polimerasa II,
el factor TFII D se une a la región
TATA y puede interaccionar con el
factor TFIIB, interactuando con los
PROTEÍNA QUINASA factores TFIIH y TFIIE. El factor TFIIF
se une a la ARN polimerasa. Lo cual
prepara el medio para que se inicie el
proceso de la trasncripción.
61
INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN
Cuando un promotor es regulado en mas de una forma, cada evento regulatorio

depende de la unión de su propia proteína a una secuencia particular. Los
promotores para la ARN polimerasa II contienen las secuencias básicas (caja
TATA) involucradas en el funcionamiento general con ARN polimerasa II y una
serie de secuencias específicas que le permiten a la ARN polimerasa II unirse e
iniciar la transcripción bajo condiciones particulares.
Aceleradores
En algunos casos los promotores no funcionan solos, otras secuencias pueden
incrementar enormemente la actividad de los promotores. Estas secuencias son
conocidas como Aceleradores o Aumentadores. La diferencia entre un promotor y
un acelerador es su posición relativa al promotor, la cual puede variar y funciona en
cualquier sentido, pueden asistir a cualquier promotor vecino.
¿Cómo un aumentador estimula la iniciación en un promotor? La razón puede estar

relacionada con la estructura, localización o la unión enzimática.
a) El aumentador (intensificador) puede cambiar la estructura completa del
templete.
b) Si el intensificador provee de un sitio de unión puede ser responsable de mover
al templete a un lugar particular de la célula.
c) Un intensificador puede proveer de un “sitio de entrada” bidireccional, donde la
ARN polimerasa se une con la cromatina
ACELERADOR
AUMENTADOR
Figura 3.5 Esquema que representa la forma de acción de las moléculas

aumentadoras y las regiones aceleradoras.
62
3.2.2 Operones
Las bacterias presentan un mecanismo simple para coordinar la regulación de la expresión de sus
genes. Los genes se encuentran arreglados de manera continua en el cromosoma y se transcriben
simultáneamente. Este arreglo, denominado operón, da origen a un ARNm en donde se encuentran
muchos genes, es decir, es policistrónico. La transcripción de este ARNm está regulada por un
único promotor, que es el sitio de regulación para la expresión de la información codificada en el
operón, no es un gen pues su secuencia es únicamente de reconocimiento.
Figura 3.6 Esquema del operón de lactosa de E. coli
Muchos de los principios de la expresión genética en procariotas, tienen su origen

en el estudio del operón de lactosa (operón lac) de E. coli, bacteria que puede
utilizar a la lactosa (azúcar de la leche), como única fuente de Carbono. En 1960
Francois Jacob y Jacques Monod, publicaron cómo dos genes adyacentes
involucrados en el metabolismo de la lactosa, son coordinados y regulados por un
elemento genético localizado en uno de los extremos de la fila de genes.
El fenómeno que inspiró la idea fué el de la inducción enzimática. Grupos de genes

que codifican para proteínas relacionadas se agrupan en unidades conocidas como
operón. Un operón consiste en: un operador, un promotor, un regulador y un gen
estructural. El gen regulador codifica para una proteína que se pega al operador,
obstruyendo al promotor (y por lo tanto a la transcripción), del gen estructural. El
regulador no tiene que estar adyacente a los otros genes en el operón. Cuando se
remueve la proteína represora, puede producirse la transcripción
63
3.2.3 Control en la terminación: atenuación y antiterminación

Operón trp: atenuación
La regulación de la expresión de ciertos genes que participan en la biosíntesis de
aminoácidos en E. coli en particular del operón trp, da origen a 5 proteínas 3 de
ellas son enzimas que participan en la síntesis del triptofano.
Charles Yanofsky encontró que la expresión de este operón está controlada por el
represor trp, que es un homodímero de 107 aminoácidos por subunidad (trpR
forma un operón independiente). El represor trp une L-triptofano que es el producto
final de la vía. Este complejo se une al operador (trpO) con lo que se reduce 70
veces la velocidad de la transcripción.
Figura 3.7 Esquema que representa el control por atenuación de la síntesis del
triptófano. Un represor inactivo se activa cuando el triptofano se encuentra
presente en el medio.
Operón trp: antiterminación

Existe un control alterno para regular la expresión del operón de triptófano, y se
basa en la velocidad de transcripción.
Cuando por algún motivo se presenta un aporte de triptófano al medio y aún se
está llevando a cabo la síntesis, ésta puede detenerse a pesar de que ya se halla
iniciado el proceso de expresión del operón.
64
En el operón de triptófano se encuentran cuatro regiones que son secuencia

complementaria y pueden reconocerse y pegarse, cambiando la estructura de la
molécula de ARN, y por lo tanto impidiendo el avance de los ribososmas sobre la
molécula y deteniendo la síntesis de triptofano.
Figura 3.8 Esquema del control de la expresión del operón de triptófano por
antiterminación.
3.2.4 Cascada lítica y represión lisogénica

Los Virus consisten en un ácido nucléico (ADN o ARN) envueltos en una cubierta
de proteína (conocida como cápsido). El cápsido puede ser una sola proteína que
se repite una y otra vez, como en el virus del mosaico del tabaco (TMV). También
puede estar formado por varias proteínas, como en los bacteriofagos de la serie T.
Los Retrovirus, como el de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), poseen una

enzima: la transcriptasa reversa amén del ARN viral. La transcriptasa reversa
fabrica ADN de una sola cadena , copiando el ARN viral. El ADN viral
monocatenario se transforma por medio de la ADN polimerasa en bicatenario.
65
Figura 3.9 Esquema que representa los diferentes ciclos de los virus, se observa la
cascada lítica y la represión lisogénica.
El ciclo lítico ocurre cuando el material genético del virus penetra en la célula
huésped (recuerde que los virus son parásitos intracelulares obligados) y comienza
a fabricar nuevos virus. Eventualmente los nuevos virus causan la ruptura o lisis de
la célula y continúan el ciclo infeccioso.
El ciclo lisogénico ocurre cuando el ADN viral es incorporado al ADN del huésped
como profago, y cuando la célula huésped se divide, se duplica como si fuera ADN
del huésped. Algunas veces el profago emerge del cromosoma de la célula
huésped y entra en el ciclo lítico espontáneamente (aproximadamente 1/10,000
divisiones). La luz ultravioleta y los rayos X también pueden producir este
fenómeno.
La transducción es el fenómeno por el cual el ADN es transferido de una célula

huésped a otra por un virus. Algunos bacteriófagos son "temperados" o atenuados
dado que tienden a ser lisogénicos mas que líticos.
66
3.3 Traducción
El proceso de síntesis de proteínas o traducción se divide en tres partes:
Iniciación: reacción que precede a la unión entre los dos primeros aminoácidos. El
ribosoma se encuentra unido al ARNm, este paso es lento.
Elongación: síntesis del primer enlace peptídico entre el primer par de

aminoácidos, este es un paso rápido.
Terminación: movimiento del ribosoma hasta una secuencia de bases necesarias

para completar la cadena peptídica, desensamble del ribosoma del ARNm. Este es
una paso lento.
La síntesis de proteínas en procariotas se da a una velocidad de 15 aminoácidos

por segundo a una temperatura de 37º C. Mientras que en eucariotas este proceso
es mas lento, la velocidad de síntesis es de 2 aminoácidos por segundo a 37 º C.
El ribosoma posee dos: sitio A (ARNt- aminoacil)

sitio P (ARNt- peptidil) polipeptido sintetizado.
Figura 3.10 Esquema que representa las tres etapas del proceso de traducción o
síntesis de proteínas.
67
3.3.1 ARN de transferencia

El ARN de transferencia (ARNt): los diversos ARNt transportan los diferentes aminoácidos hacia los ribosomas
en la síntesis proteica. Constituyen el 15% del ARN celular. Es una molécula de 75-85 bases de longitud, existe
al menos un ARNt por cada aminoácido.
Reconoce a un solo aminoácido al cual se une covalentemente. Cada ARNt

contiene una secuencia de trinucleótidos que es llamada ANTICODON, ya que es
complementario a la secuencia del CODON que se encuentra en el ARNm. La
estructura que presenta se conoce como trebol.
Cuando el ARN se carga con su aminoácido específico, se conoce como ARNt-

aminoacil. El aminoácido se une con una unión éster entre su grupo carboxilo y el
grupo hidroxílo de la ribosa de la última base, la cual es siempre Adenina
Una enzíma específica sintetiza la formación de ARNt-aminoacil, la cual se conoce

como ARN aminoacil sintetasa, la cual reconoce únicamente a un aminoácido, por
lo que al menos existen 20.
Una vez formado el complejo ARNt- aminoacil, el aminoácido no juega un papel en la determinación de la
especificidad, la cual es regulada por el anticodón.
Figura 3.11 Esquema de una molécula de ARN de transferencia, se sençñala la

región del anticondón y los puntos donde se forman puentes de hidrógeno.
68
3.3.2 Ribosomas: fábricas traductoras

El ARN ribosómico (ARNr): conforman a los ribosomas los diversos ARNr, junto con sus proteínas asociadas,
intervienen en la síntesis proteica. Representa el 70% del ARN celular; mientras que sus precursores (45S),
presentes en el núcleo representan el 5% del RNA celular.
PROTE
ARN SUBUNID RIBOSOM
AS
P
R
O
C
A
R
I
O
T
A
E
U
C
A
R
I
O
T
A
Figura 3.12 Esquema de la formación de los ribosomas en procariotas y

eucariotas. Se observa el papel preponderante que las cadenas de ARN tienen
como parte central de las subunidades de los ribosomas.
Los aminoácidos se ensamblan en proteínas por los ribosomas. Los ribosomas son
partículas de ribonucleoproteínas, que consisten de dos subunidades las cuales
constan de varias proteínas asociadas con una molécula larga de ARN conocida
como ARN ribosomal (ARNr).
Todos los ribosomas son idénticos y lo que hacen es descifrar el ARNm que
proporciona el templete. Proveyendo un ambiente adecuado que controla el
reconocimiento del codón del ARNm. Y el anticodón del ARNt
Cada ribosoma se mueve en dirección 5’→ 3’ sobre el templete de ARNm
permitiendo la formación del polipéptido, en ciertos casos, mas de un ribosoma se
encuentra unido al ARNm, lo que se conoce como polirribosoma o polisoma.
69
Figura 3.13 Esquema que representa el ensamble de los ribosomas sobre el

ARNm y su movimiento sobre la molécula, se observan mas de un ribosoma sobre
la cadena de ARN, lo que se conoce como polisoma o poliribosoma.
Se sintetiza un solo polipéptido por acción de un ribosoma en el ARNm. El tamaño

de los poliosomas depende de la longitud del ARNm el cual puede codificar para
varias proteinas.
En bacterias los ribosomas se unen al ARNm aún en formación. Tanto en bacterias

(en donde es rápidamente degradado) como en eucariotas, el ARNm no es
abundante. En eucariotas, puede sobrevivir algunas horas en la célula, aunque
representa únicamente el 3% de la masa nuclear del ARN .
El ribosoma puede ser reconocido como una pequeña fabrica migratoria, la energía
para la síntesis proteica se obtiene de la hidrólisis de GTP (Guanina tri-fosfato).
Los ribosomas son los componentes mayores de las células. En una bacteria en
crecimiento activo, pueden presentarse cerca de 20,000 por genoma. 10% del total
de las proteínas bacterianas y aproximadamente 80% del total de la masa de ARN
celular. En eucariotas estos porcentaje de proteínas son menores.
El número de ribosomas en las células está directamente relacionado con la

actividad sintética de proteínas de éstas. En bacterias se encuentran asociadas en
ARNm naciente mientras que en eucariotas están asociadas con el citoexqueleto o
con estructuras celulares.
70
Cada subunidad contiene un gran componente de ARN y nucleoproteínas

diferentes, la mayoría presentes con una sola copia por unidad. La principal función
del ARN es estructural, ya que las proteínas se unen en sitios específicos del ARN.
Los ribosomas varían en forma y tamaño dependiendo de los organismos.

Tripanosoma posee moléculas de ARNr de menos de 2,000 bases, en mamíferos
se pueden encontrar moléculas hasta de 7000 bases.
El ARNm se une entre las dos subunidades. Las regiones importantes de la

estructura secundaria del ARNr se encuentran conservadas, por lo que se
encuentran tanto en 16S como en 23S ARNr.
El ARNr presenta 4 campos principales con muchas bases pareadas, (menos de 8

nucleótidos) y muchas regiones sin parear. Algunas proteínas in vitro se unen
fuertemente con el ARNr, pero algunas no lo hacen, lo que significa que requieren
de la presencia de otros para la unión.
Cada proteína ribosomica se une a un sitio específico del ARNr. Split Proteínas:
proteínas separadas por centrifugación en CsCl, se separan núcleos de 23S y 42S
a partir de las subunidades 30s y 50s respectivamente.
El reensamble requiere de los siguientes pasos:
1) ARNr 16S + 15 proteína
2) Formación de partículas RI
3) Partículas RI calentadas → RI* (40°C)
4) 6 proteínas + RI* = 30S (Subunidad)

ó
5) 23S + 6 proteínas = 30S (Subunidad)
Paso limitante es la conversión dependiente de la temperatura, que provoca el

dobles en un estructura más compacta.
Los ribosomas presentan sitios activos específicos, divididos en:

1) Campo de Traslación: conforma la tercera parte del ribosoma, centro de peptidil
tranferasa, unión con EF-→ 50S.
2) Campo de Salida: factores de iniciación – ARNti Met 30S, se une a membranas.
71
3.3.3 ARN mensajero: templete

El ARN mensajero (ARNm) son las diferentes secuencias de los nucleótidos que
constituyen los múltiples ARNm de la célula determinan las cadenas polipeptídicas
que se sintetizarán en los ribosomas. La proporción de ARNm varía mucho
dependiendo del tipo de célula que se analice y el momento funcional. Por término
medio representa el 3% del ARN celular y sus precursores (ARNhn) el 7%. Cuando
lleva la información para una sola proteína, se denomina monocistrón, y policistrón,
si lleva información para más.
3.3.4 Línea de ensamble para la síntesis proteica; código genético

Iniciación en procariotas
Ribosoma no se une directamente al ARNm para iniciar la síntesis.
Cada ARNm posee un sitio de unión para el ribosoma (RBS, por sus siglas en
inglés ribosome binding site) el cual es una secuencia corta de bases que precede
a la región codificante.
La subunidad pequeña del ribosoma se une al ARNm para formar un complejo de

iniciación (30S+RBS), posteriormente, se une la subunidad mayor del ribosoma
50S. La unidad pequeña no puede sintetizar sola las proteínas, posee factores de
iniciación (IF) que son proteínas.
Bacterias 3IF: IF1, IF2 e IF3

IF1: Se une a la subunidad 30S para completar el complejo de iniciación, pero su
papel es de estabilización mas que de reconocimiento. Probablemente es un factor
de reciclamiento.
IF2: Reconoce a un iniciador especial del ARNt y lo une a 30S, lo que asegura que
solo el ARNt–iniciador se una en la reacción de iniciación. Permanece como parte
de la subunidad 30S durante esta etapa de iniciación. Activa la hidrólisis de GTPs
indirectamente, motivándola en alguna proteína del ribosoma.
IF3: Necesario para generar más subunidades 30s y debe estar presente en ellas
para que se unan al ARNm. Controlando su estado de asociación con la subunidad
50S , ya que cuando se une a 30S, impide que se formen los complejos 70S.
Existe una molécula de IF3 por cada subunidad y ya que hay pocos IF3 su
disponibilidad determina el número de 30S libres. Absolutamente necesaria para
unir la 30S al ARNm. No se involucra en la selección del sitio. Este factor es
liberado antes de que 50S se una a 30S, por lo tanto 30S no puede tener unión con
IF3 y 50S simultáneamente. Y 30S existe libre unida a IF3 o bien en el complejo
70S.
El número de copias de cada factor es suficiente para unirse únicamente a un

pequeño numero de ribosomas libres, por lo que deben de ser reusados
eficientemente.
72
El complejo de iniciación esta formado por 30S unido a RBS en el ARNm. El codón
de iniciación es AUG universalmente, pero en bacterias puede ser también :GUG y
UUG.
AUG= Metionina, Existen dos tipos de ARNt que pueden transportar este
aminoácidos, un tipo reconoce la iniciación y el otro reconoce los codones AUG
durante la elongación.
Figura 3.14 Esquema del proceso de iniciación de la síntesis de proteínas en

procariotas
73
En bacterias y mitocondrias, el ARNt iniciador acarrea un residuo de metionina que

ha sido modificado en su grupo amino, formando un formaldehido.
ARNt-N-Formilmetionina : ARNtf Met . Bloquea el grupo del aminoácido y previene

su formación en la elongación, actuando únicamente como iniciador de proteínas,
usándose por lo tanto, este ARNt para reconocer las cadenas de iniciación .AUG
(algunas veces GUG; UUG)
ARNtm met reconoce los codones internos.

ARNtf met se une al sitio P originando así la síntesis. Siendo este el único ARNt–
aminoacíl que se vuelve parte del complejo de iniciación, entrando directamente al
sitio P.
En bacterias y mitocondrias el residuo de formol es removido por una enzíma

(deformilasa específica) que genera una terminal NH2 normal.
Si la metionina es el aminoácido terminal N de la proteína este es el único paso,

pero en cerca del 50% de las proteínas, la metionina es removida por una
aminopeptidasa, creando un nuevo termino, cuando esto sucede, ocurre de
manera rápida, cuando la cadena polipeptídica, naciente aún, presenta una
longitud de entre 15 y 30 aminoácidos.
Iniciación en eucariotas
La subunidad pequeña del ribosoma se une al extremo 5´ del ARNm y se mueve
hacia el sitio de iniciación, ahí se le une la subunidad mas grande. Existen al
menos nueve factores de iniciación, estos son llamados de la misma manera que
en bacterias pero con el prefijo e.
eIF2 y eIF3 contienen cadenas múltiples, mientras que los otro presentan
polipéptidos sencillos. La iniciación en eucariotas inicia con la formación de un
complejo terciario :
ARNt;Met - eIF2 y GTP.
Primero se une GTP + eIF2 y después este complejo se una al ARNtiMet . Este
complejo terciario finalmente se une a la subunidad 40S. Esto sucede
independientemente de la presencia de ARNm pero primero se debe formar el
complejo de iniciación para que 40S se una al ARNm.
La unión del complejo terciario (ARNt;Met - eIF2 y GT) + 40S al ARNm depende del
factor eIF3, que participa únicamente en la unión con el ARNm junto con otros
factores.
eIF6: mantiene disociadas a las dos subunidades, actuando sobre la subunidad

mas grande 60S.
74
La unión de 60S con 40S unido al ARN únicamente se presenta cuando eIF2 y
eIF3 han sido liberados del complejo de iniciación, esta acción es realizada por el
eIF5.
eIF4c: determina la unión de 60S

y40S. Es probable que todos los
demás factores sean liberados
cuando el ribosoma 80S ha sido
formado.
Figura 3.15 Esquema del proceso

de ensamblaje del complejo de
iniciación en eucariotas.
75
El factor eIF2 es el punto de control para la síntesis proteica, contiene tres

subunidades, sus propiedades generales son similares en plantas y mamíferos lo
que indica semejanzas en muchos eucariotas.
Cuadro 3.4 Subunidades que componen el factor de iniciación de la traducción

eIF2
Subunidad Función Masa
α Union a GTP. Controlado por fosforilación 35,000. Da.
β Factor de reciclamiento. 38,000. Da.
met
γ Union con ARN 55,000. Da.
Para que el factor EIF2 esté activo, la subunidad α debe acarrear GTP, durante la
iniciación, GTP es hidrolizada a GDP, aquí interviene otro factor el eIF2B necesario
para que se dé la reacción de generar GTP de nuevo y el factor eIF2 se active.
Elongación e procariotas y eucariotas

Una vez completada la formación del ribosoma y que el sitio P se encuentre
ocupado por un peptidíl ARNt, cualquier aminoacil ARNt excepto el iniciador, puede
entrar al sitio A, su entrada es mediada por un factor de elóngación (EF).
Formación de nueva
unión peptídica
Salida del ARNt sin Entrada de aminoacil-

aminoaci ARNt.
Movimiento del
ribosoma
Figura 3.16 Representación del proceso de elongación de la cadena polipeptídica.
76
EF actúa como IF2 en procariota, asociándose con el ribosoma únicamente

mientras el aminoacil– ARNt entra al ribosoma. Cando el aminoácil–ARNt se
encuentra en su sitio, este factor deja el ribosoma, para unirse de nuevo a otro
complejo aminoacil-ARNt.
Este factor de elongación EF esta formado de dos componentes: EF-Tu y EF-Ts,

denominados así por ser T un factor de transferencia, y su nombre representa su
estado cuando es calentado: Tu – inestable en el calentamiento y Ts – estable en
el calentamiento
EF-Tu acarrea un nucleótido de guanina, en su forma activa el factor posee GTP,

el complejo binario EF-Tu+GTP se une al aminoacil-ARNt y forma el complejo
terciario Aminoacil+EF-Tu+GTP, y este complejo se une al sitio A del ribosoma
únicamente cuando el sitio P ya está ocupado por el peptidil-ARNt.
Cuando el aminoacil-ARNt ha sido colocado en el sitio A, el GTP es cortado

(hidrolizado) y el complejo binario EF-Tu+GDP es liberado.
El factor EF-Ts interviene en la regeneración de la formación EF-Tu+GDP a su

forma activa: EF-Ts desplaza el GDP de la forma EF-Tu formando el factor
combinado EF-Tu+EF-Ts (factor T completo).
El factor EF-Ts es desplazado por GTP, formando EF-Tu+GTP. Este factor

activado se une al aminoacil y libera el EF-Ts que es reciclado. La mayor cantidad
de EF-Tu se encuentra en forma de complejo binario o terciario, ya que existe
mucho menos EF-Ts, su cantidad aprovecha el número de ribosomas.
La GTP se necesita presente para que el aminoacil-ARNt se una al sitio A, pero su

hidrólisis no es requerida hasta posteriomente.
Traslocación del Ribosoma

El ribosoma permanece estático, hasta que la cadena de polipéptidos crece por la
transferencia del polipeptidil, unido al ARNt en el sitio P al aminoacil-ARNt del sitio
A. La síntesis del enlace peptídico es catalizada por la peptidil transferasa. Esta
enzima está en función con la subunidad más grande del ribosoma (50S ó 60S),
debe encontrarse en el sitio ribosomico en que las terminaciones del peptidil-ARNt
y el aminoacil-ARNt se encuentran juntos. La actividad de la transferasa se controla
por la subunidad más grande de ribosoma y 23S ARNr.
Etapa de terminación
Determina la conclusión de la síntesis de la proteína cuando el sitio A del ribosoma
es abordado por el codón de terminación del ARNm (UUA, UGA o UAG,
indistintamente). Ello deja al sitio A sin el esperado aminoacil-ARNtaa, aunque
pronto es ocupado por un factor de terminación llamado RF o eRF en eucariotas
(por sus siglas en inglés eucaryotic releasing factor), que sabe reconocer a los tres
codones de terminación.
77
Figura 3.17 Esquema del proceso de terminación de la síntesis de proteínas.
Figura 3.18 Esquema que representa el

termino de la traducción. Cuando un
ribosoma llega a un codón de termino
(UAA, UGA, UAG), los factores de
liberación (RFs) entran al complejo
ribosomal, probablemente en o cerca del
sitio A. En bacterias, RF1 o RF2 primero
reconocen el codón de inicio. RF3-GTP
entonces corta la cadena petidica del tRNA
y libera las dos subunidades ribosomales,
esta reacción requiere de la hidrolisis de
GTP.
78
En síntesis la terminación de la cadena polipeptídica está señalada por el ARNm

mediante un codón que no especifica la incorporación de ningún aminoácido . Ese
codón de terminación puede ser UUA, UGA o UAG, y sobre él no se une ningún
ARNt. En cambio, es reconocido por dos proteínas llamadas factores de liberación
(RF o eRF). Cuando esto sucede, la proteína terminada se libera del último ARNt,
que también se separa del ARNm. Por último también se disocian las subunidades
ribosómicas. Todos estos elementos pueden ser reutilizados en una nueva síntesis.
Código genético
El código genético consiste en 61 codones para aminoácidos y 3 codones de
terminación, que detienen el proceso de traducción. El código genético es por lo
tanto redundante, en el sentido que tiene varios codones para un mismo
aminoácido. Por ejemplo, la glicina es codificada por los codones GGU, GGC,
GGA, y GGG. Si un codón muta por ejemplo de GGU a CGC, se especifica el
mismo aminoácido.
Figura 3.19 Esquema del código genético y la manera de “leerse”, comenzando

con la primera letra del lado izquierdo.
79
UNIDAD 4
TECNICAS DE RECOMBINACIÓN DEL ADN

4.1 ADN COMO MATERIA PRIMA EN LA RECOMBINACIÓN GÉNICA
El requisito inicial y en muchas ocasiones limitante de la manipulación del ADN es
el acceso a cantidades suficientes o al conocimiento de la secuencia del ADN del
gen en estudio. Por tanto, la clonación es el paso inicial para poder utilizar a la
Biología Molecular como una herramienta de investigación. Una clona es una grupo
de células o moléculas de ADN idénticas a una célula o molécula ancestral y clonar
es el proceso mediante el cual obtenemos múltiples copias de una fragmento de
ADN originados a partir de una copia.
El resultado inmediato de clonar un fragmento de ADN es el poder reproducirlo en
grandes cantidades, y además secuenciarlo para determinar el ordenen que están
dispuestas las bases. Así la clonación lleva implícito el cumplir con los requisitos de
la mayor parte de las metodologías en biología molecular: tener acceso a grandes
cantidades del gen y conocer su secuencia. La clonación se basa en la producción
de una molécula recombinante (unión de dos o más moléculas de ADN
provenientes de diferentes especies) entre el gen de interés a clonar (proveniente
de cualquier especie) y un vector de clonación. El ADN recombinante se utiliza
para transformar células (usualmente bacterias), y una vez obtenidas clonas con
ADN recombinante en su interior, el final del proceso de clonación consiste en la
identificación de la bacteria que lleve el gen de interés.
El procedimiento de clonación involucra 4 pasos principales:
1.- Construcción de moléculas de ADN recombinante mediante enlaces covalentes
in vitro (unión o ligamiento) de fragmentos del ADN deseado (ADN blanco) a un
replicon (cualquier secuencia capaz de replicar el ADN de manera independiente).
Este paso se facilita por el corte del ADN blanco y de las moléculas del replicon
con endonucleasas de restricción específicas antes de la unión de fragmentos de
ADN diferentes con la enzima ADN ligasa.
2.- Transformación. Las moléculas de ADN recombinantes son transferidas dentro
de las células huésped (con frecuencia células bacterianas o de levadura) en las
cuales el replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicación del ADN
independientemente de los cromosomas de la célula huésped.
3.- Propagación selectiva de las clonas. Involucra dos etapas. Inicialmente las
células transformadas se siembran en una caja de petri sobre una superficie de
agar para asegurar el crecimiento de colonias de células “bien separadas”. Estas
son las clonas (poblaciones de células idénticas todas descendientes de una sóla
célula). Subsequentemente, las colonias individuales pueden tomarse de la caja de
petri y las células pueden extenderse después en cultivo líquido.
4.- Aislamiento de clonas de ADN recombinante cosechando los cultivos celulares
extendidos y aislando selectivamente el ADN recombinante.
80
4.2 PURIFICACIÓN DEL ADN: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Una consideración importante para obtener el ADN purificado es su enorme
tamaño y la complejidad de las secuencias del ADN (comparada por ejemplo con la
secuencia de proteínas). Las moléculas individuales de ADN nuclear contienen
cientos de millones de nucleótidos. Cuando el ADN es aislado de las células
usando métodos estándar, estas enormes moléculas se fragmentan mediante
fuerzas, generando mezclas complejas de fragmentos de ADN todavía muy largos
(aproximadamente de 50 a 100 Kb de largo).
De acuerdo a lo anterior, ¿Cómo se pueden preparar poblaciones de ADN

relativamente homogéneas a partir de mezclas complejas?. En el caso de ADN de
células humanas y de una amplia variedad de células eucariontes complejas, el
primer acercamiento fue separar las diferentes clases de fragmentos de ADN de
acuerdo a la composición de las bases.
La preparación de ADN fue sometida a ultracentrifugación en equilibrio de

gradientes de densidad (por ejemplo; en gradientes de densidad de CsCl). Cuando
esto se realizó, el ADN se fraccionó en una banda principal y en varias bandas
menores de ADN satélite. Las especies de ADN satélite tienen diferentes
densidades que el volumen principal de ADN debido a que tienen secuencias poco
comunes y su composición de bases es diferente a la mayoría del ADN en las
células (estas propiedades reflejan la participación del ADN satelite en aspectos
específicos de la estructura y función de los cromosomas). Aunque valiosos e
interesantes, los ADN satélite purificados corresponde, sin embargo, a un
componente menor del genoma y no contiene genes.
Para el estudio de los genes, se han desarrollado varios métodos para purificarlos.
Debido a que los genomas de los mamíferos son complejos, cualquier gen
específico o fragmento de ADN de interés representa normalmente solo una
pequeña fracción del ADN total en una célula. Por ejemplo, el gen de la β-globina
comprende únicamente 0.00005% de las 3300 megabases (Mb) del ADN genómico
humano, y aún el gen más grande hasta ahora identificado, el gen de la distrofina
de 2.5 Mb, cuenta con sólo el 0.08% del ADN genómico humano.
Para seleccionar una fuente adecuada de ADN es importante saber el fragmento

del gen que se pretende estudiar. Cuando la finalidad es conocer los mecanismos
de regulación de transcripción del gen en estudio, entonces se desea clonar el
ADN correspondiente a fragmentos no codificantes de un gen, conocidos como
intrones. Cuando se pretende conocer la estructura completa de un gen, el
investigador estará interesado en clonar los fragmentos del gen, tanto codificantes
como no codificantes, es decir los exones y los intrones. Finalmente, cuando se
quiere conocer la estructura primaria de una proteína, se necesita clonar
únicamente los fragmentos codificantes del gen, es decir, los exones. En los dos
primeros casos la fuente apropiada es el ADN genómico (cromosómico) porque
contiene los genes completos. En el tercer caso, lo más apropiado es partir del
ARN mensajero (ARNm) que representa únicamente las secuencias codificantes
(exones).
81
La manera de obtener el ADN genómico es sencillo. Como todas las células de un

individuo contienen el mismo ADN, se parte de células de fácil acceso, como los
leucocitos en el caso del humano, mientras que en animales se parte de tejidos con
alto contenido de ADN, como el hígado. Se realiza un extracto celular del cual,
mediante precipitaciones con diferentes solventes, se separa el ADN genómico del
resto del material celular. El siguiente paso es tratar el ADN genómico con enzimas
de restricción para reducirlo a fragmentos manejables. La enzima más empleada
es Sau 3ª por tener sitio de restricción de cuatro pares de bases, lo que asegura
encontrarlo con frecuencia y por lo tanto, reducirá el ADN genómico en múltiples
fragmentos.
Figura 4.1 Modo de acción de las enzimas de restricción, se representa el

reconocimiento de una secuencia específica y la generación de extremos
“pegajosos”.
La segunda fuente de ADN es un poco más complicada de obtener: la conocemos

como ADN complementario (ADNc) por ser una copia en espejo del ARNm . En
este caso la fuente de ARNm debe ser un tejido o línea celular que se sabe de
antemano que expresa la proteína de interés. El primer paso es aislar el ARN del
tejido o línea celular a partir de un homogeneizado celular mediante extracción con
solventes. Después, se debe separar el ARNm de los otros tipos de ARN
(ribosomal y de transferencia), lo que se logra al tomar ventaja de que toda
molécula de ARNm tiene al final (extremo 3’) una cola de poliadeninas. Al pasar el
ARN total por una columna de cromatografía con oligo-dT (fragmentos de
82
polideoxitiminas unidas a la celulosa), el ARNm se queda “atrapado” en las

columnas debido a que la cola de poliadeninas del ARNm se híbrida con la de
polideoxitiminas del oligo-dT. Ya descartados el ARN ribosomal y el de
transferencia, se separa el ARNm de la columna con una serie de elusiones que
promueven la desnaturalización (separación) de las hebras de ácidos nucleares.
Una manera de obtener las secuencias génicas es mediante el aislamiento del
ARN total, o ARNm poly (A)+ a partir de células disponibles y convertir estas a ADN
complementario (cADN) usando la enzima transcriptasa reversa. En algunos casos,
esto puede resultar en el enriquecimiento profundo de secuencias de ADN
exónicas cuando los genes relevantes se sabe que se expresan a niveles muy
elevados en un tipo celular específico. En la mayoría de los caso, sin embargo, las
secuencias génicas deseadas todavía representan únicamente una pequeña
proporción del ADNc total de la población.
4.3 MANIPULACIÓN DEL ADN PURIFICADO

Gracias al desarrollo de la Ingeniería Genética en los últimos 20 años, el ADN pasó
de ser la molécula más difícil y complicada de estudiar, a ser la más fácil. Mediante
la tecnología del ADN recombinante es posible manipular in vitro el ADN de
manera tal que cada investigador puede estudiar un sinnúmero de aspectos en
relación a su proteína favorita. La manipulación del ADN es el fundamento de las
técnicas utilizadas en un laboratorio de Biología Molecular. Así, las endonucleasas
de restricción son útiles para fragmentar el ADN en sitios específicos y obtener
diversos genes.
La ADN polimerasa sirve para sintetizar ADN in vitro que pueda posteriormente ser
utilizado para clonación o bien secuenciación, con lo que se podrá conocer la
secuencia de bases en el ADN y por lo tanto, la estructura primaria de la proteína.
Con la transcriptasa reversa se puede sintetizar ADN a partir del ARNm, y así
generar lo que se conoce como genoteca del ADN complementario, que representa
el ADN que codifica para proteínas en un tejido o célula particular. Se puede
marcar el ADN o ARN con métodos radioactivos o no radioactivos y generar una
sonda que será útil para detectar ADN o ARN específico tanto en bloques
(Southern y Northern blot) como en el tejido mismo (hibridación in situ). Con la
reacción en cadena de la polimerasa podemos amplificar ciertos fragmentos de
ADN y así, aunque sean muy escasos, poder detectarlos, clonarlos y modificarlos.
Finalmente se puede trasladar el ADN a células extrañas con lo que se consigue
clonar fragmentos de ADN o crear modelos de animales transgénicos.
La tecnología del ADN recombinante comprende un conjunto de técnicas que son
utilizadas en la manipulación del ADN, las más importantes son:
1.- El corte de ADN en sitios específicos mediante nucleasas de restricción, que

facilitan enormemente el aislamiento y manipulación de genes individuales.
2.- La secuenciación rápida de todos los nucleótidos en un fragmento de ADN

purificado, que hacen posible determinar las fronteras de un gen y la secuencia de
aminoácidos que codifica.
83
3.- La hibridación de ácidos nucleícos, que hace posible encontrar una secuencia
específica de ADN o ARN con gran precisión y sensibilidad con base en su
habilidad de unirse a una secuencia de ácidos nucleícos complementaria.
4.- La clonación del ADN, en la cual una sola molécula de ADN puede copiarse
para generar muchos millones de moléculas idénticas.
5.- La Ingeniería genética, mediante la cual secuencias de ADN son alteradas para
crear versiones modificadas de genes, los cuales son reinsertados de nuevo dentro
de las células u organismos.
Las moléculas de ADN recombinante son generalmente construidas usando la

enzima ADN ligasa para unir dos moléculas de ADN con extremos cohesivos
complementarios. Para la producción de una biblioteca de ADN, una de las dos
moléculas de ADN a unirse es el vector, derivado de un plásmido bacteriano o
virus, mientras que la otra es un fragmento de un cromosoma o una molécula de
ADNc.
Una molécula de ADN recombinante puede a su vez servir como un vector para la
clonación adicional de moléculas de ADN, y la repetición sucesiva del
procedimiento de clonación, una serie de fragmentos de ADN pueden ser reunidos
extremo con extremo. De esta manera pueden generarse moléculas nuevas de
ADN, las cuales son diferentes de cualquier molécula que ocurre naturalmente.
4.4 MULTIPLICACIÓN DEL ADN

4.4.1 Introducción de ADN a células
La transformación es el fenómeno por el cual las células bacterianas adquieren
nuevo material génico. Cuando el fenómeno se lleva a cabo en células eucariótica
se denomina transfección. Una vez obtenido el ADN recombinante, el siguiente
paso es introducirlo dentro de una célula huésped que le ofrezca la maquinaria
necesaria para su autorreplicación. En el caso de los bacteriófagos y de los
cósmidos, el proceso es relativamente sencillo: se empaqueta el ADN en fagos
viables in vitro y se exponen a las células para ser infectadas en forma natural.
En el caso de los plásmidos existen algunas estrategias para transformar bacterias.

El procedimiento estándar consiste en mezclar bacterias con plásmidos en una
solución de cloruro de calcio, exponerlas a un choque térmico (42°C) de 30 a 90
segundos de duración, y por razones, aún no claras, las células se vuelven
momentáneamente permeables al ADN. Otra técnica útil por su alta eficiencia es la
electroporación, que consiste en colocar a las células en una solución que contiene
al ADN recombinante, y someterlas a pulsos eléctricos que causan aberturas o
agujeros momentáneos en la membrana celular, permitiendo el paso del ADN
recombinante al citoplasma. Para células eucarióticas existen además otras formas
de transfección, como el uso de liposomas o la microinyección. De esta forma, las
moléculas de ADN recombinante son transferidas dentro de la célula huésped en el
cual un replicon seleccionado puede llevar a cabo la replicación
independientemente de los cromosomas de la célula huésped.
84
4.4.2 Células competentes

La membrana plasmática de las células es permeable selectivamente y
normalmente no admite moléculas grandes como fragmentos de ADN muy largos.
Sin embargo, las células pueden tratarse de ciertas formas ( por ejemplo, por
exposición a ciertas sales altamente iónicas, choques eléctricos, etc), para alterar
las propiedades de permeabilidad de la membrana. Como resultado, una fracción
de las células se vuelven competentes, esto es, son capaces de introducir ADN
extraño del ambiente extracelular. Sólo un pequeño porcentaje de las células
introducirá el ADN extraño, esto es una transformación de ADN. La célula toma
únicamente una molécula de ADN, la cual se puede replicar muchas veces dentro
de la célula. Esta es la base del paso de fraccionamiento crítico en la clonación de
ADN, la población de células transformadas.
Debido a que el ADN circular transforma mucho más eficientemente que el ADN
lineal, la mayoría de la células transformadas contendrán productos circulares en
vez de concatámeros de ADN recombinante lineal y si se hace un esfuerzo en
suprimir la ciclización del vector, por ejemplo por defosforilación, la mayoría de las
transformadas tendrán ADN recombinante. Entonces, las células transformadas se
dejan multiplicar. En el caso de clonación usando vectores plásmidos y de huésped
una célula bacteriana, una solución que contenga las células transformadas se
siembra en la superficie de una caja de petri con agar, lo que resulta en la
formación de colonias de bacterias que consisten en células clonadas. En general,
cada bacteria puede ser transformada con una sola molécula de ADN
recombinante (dos moléculas son tóxicas para la bacteria). Por lo tanto, las
bacterias transformadas con una sola molécula de ADN recombinante empezarán
a crecer y serán seleccionadas gracias a la resistencia al antibiótico que les
confiere el vector. El resultado final es que cada clona de bacterias tendrá en su
interior un tipo específico de ADN recombinante proveniente de una molécula
ancestral.
4.4.3 Selección de recombinantes

La identificación de las células que contienen la molécula del vector requiere la
construcción y selección del vector que contenga un gen marcador cuya expresión
ofrezca un medio para identificar a las células que lo contienen. Los dos sistemas
génicos usados frecuentemente como marcadores se basan en los siguientes:
1) Genes de resistencia a antibióticos. Una cepa celular huésped se selecciona

por su sensibilidad a un antibiótico en particular, con frecuencia a ampicilina,
tetraciclina o cloranfenicol. El vector correspondiente se construye de
manera que contenga un gen que confiera resistencia al antibiótico.
Después de la transformación, las células se siembran en agar que
contenga el antibiótico para recuperar las células transformadas por el
vector.
2) Complementación por el gen de la β-galactosidasa. La célula huésped es
una mutante que contiene un fragmento del gen de la β-galactosidasa pero
no puede producir una β-galactosidasa funcional. El vector se construye de
85
manera que contenga un fragmento diferente del gen la β-galactosidasa.

Después de la transformación por el vector, la complementación funcional
ocurre resultando en una β-galactosidasa activa que puede evaluarse
mediante la acción de una sustancia colorante, al Xgal (5-bromo, 4-cloro, 3-
indolyl β-D-galactopirano), para generar un producto azul.
La identificación de células que contienen ADN recombinante involucra con

frecuencia la inactivación insercional del gen marcador. La molécula vector se
diseña de manera que tenga un sitio de clonación múltiple llamado también
polilinker localizado entre el gen marcador. El número de nucleótidos, en la
secuencia polilinker que contiene los sitios de clonación múltiple, es múltiplo de
tres, de modo que su inserción en el gen marcador no resulta en alguna alteración
en la traducción del marco de lectura. Como resultado de mantener el marco de
lectura, y del pequeño tamaño del polilinker, la actividad del gen marcador se
mantiene a pesar de la inserción del polilinker. Sin embargo, si el vector contiene el
ADN recombinante insertado en medio del polilinker, la inserción resultante causa
pérdida de expresión del gen marcador. En el caso de un gen marcador de la β-
galactosidasa, la inactivación insercional significa que las células que contienen
ADN recombinante no se tiñen o permanecen blancas en presencia de X-gal,
mientras que las células que contienen un vector no-recombinante son azules.
Otro sistema de selección de recombinantes involucra el uso de genes supresores

de tARN, genes mutantes de tARN que pueden reorganizar una señal normal de un
codón de terminación y en respuesta, introducir un aminoácido en la cadena del
polipéptido. Esto es posible debido a que la mutación en los genes tARN (con
frecuencia genes tARNGlu o tARNTyr) resultan en una secuencia anticodón alterada
que es complementaria a uno de los codones de terminación normales: UAA, UAG,
y UGA. En estos sistemas, la célula huésped con frecuencia porta un gen marcador
defectuoso que es diseñado para tener un codón de stop prematuro, resultando en
un fenotipo que puede ser identificado fácilmente. Si el vector porta un gen tARN
supresor que inhiba el efecto del codon de terminación, la actividad del gen
marcador se recuperará y el fenotipo silvestre se restaurará. Sin embargo, si el
gen supresor tARN se inactiva por inactivación insercional, un fenotipo mutante se
producirá de nuevo.
Si ya se tiene una sonda disponible que este muy relacionada al ADN

recombinante deseado, las colonias que contengan el recombinante pueden
detectarse directamente por hibridación.
86
4.5 CLONACIÓN: VEHÍCULOS DE CLONACIÓN PARA E. COLI Y OTROS

ORGANISMOS
Vehículos de clonación
Los vehículos o vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su
desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales del ADN sean
incorporadas en su material genético; se autorreplican utilizando la maquinaria de
las bacterias, y en este proceso, no se mezclan con el ADN genómico de la
bacteria. Existen tres tipos de vectores: los plásmidos que son fragmentos de ADN
circular extracromosómico de las bacterias; los bacteriófagos o virus bacterianos y
los cósmidos que son combinaciones entre plásmidos y bacteriófagos. La desición
de cual utilizar depende principalmente de la longitud del ADN que se pretende
clonar. Los plásmidos aceptan insertos de 0.1 a 6 kilobases (1Kb = 1,000 bases),
los fagos de hasta 20 Kb y los cósmidos de hasta 45 Kb. Por tanto, los plásmidos
sirven cuando se trata de clonar ADNc, mientras que los fagos y los cósmidos se
utilizan más en el caso de ADN genómico. Existen vectores de clonación para
hebras mayores de 50Kb conocidos como cromosomas artificiales de levadura
(YACs del inglés yeast artificial chromosomes). Los tamaños de los fragmentos de
ADN que se pueden obtener con los diferentes vectores de clonación se describen
en la Cuadro 4.1.
Los vectores contienen una región en la cual el ADN foráneo puede insertarse sin
interrumpir ninguna función vital del vector. Esta región se conoce como sitio de
clonación múltiple. La digestión del plásmido con una enzima de restricción, en el
sitio de clonación múltiple, lo convierte en una molécula lineal que puede ligarse
(en presencia de ADN ligasa) con ADN que tenga en los extremos las mismas
terminaciones cohesivas, y así, formar un plásmido quimérico nuevamente circular.
De esta manera, para clonar ADN, se necesita digerir el vector con la enzima de
restricción para la cual los fragmentos de ADN tengan terminaciones cohesivas en
los extremos 5’ y 3’, y después, ligar los fragmentos de ADN en el vector con ADN
ligasa. El ADN recombinante obtenido podrá replicarse indefinidamente en la
bacteria apropiada.
Los vectores tienen además secuencias que les confieren resistencia a uno o dos
antibióticos. Las bacterias transformadas se pueden seleccionar fácilmente de las
no transformadas porque adquieren la capacidad de crecer en presencia del
antibiótico. Además, la inserción de ADN foráneo interrumpe el gen para la β-
galactosidasa y por eso en ausencia de inserción, las bacterias producirán colonias
de color azul en presencia del sustrato galactosa, mientras que en los plásmidos
con ADN foráneo (ADN recombinante), no habrá síntesis de β-galactosidasa y las
clonas serán blancas en presencia de galactosa. Así, no solo es posible distinguir
las bacterias transformadas por su capacidad de crecer en presencia del
antibiótico, sino también, se puede saber por el color si tienen en su interior ADN
recombinante o únicamente plásmidos no quiméricos. Finalmente, una ventaja de
los vectores es que el sitio en donde queda el ADN foráneo está flanqueado por los
promotores para la síntesis de ARN y por las secuencias de iniciadores universales
para la síntesis de ADN. El vector plasmídico típico pUC18 (figura 4.1) posee un
87
tamaño de unas 269 Kb y contiene un origen de replicación que permite la

replicación del ADN del plásmido en un alto número de copias en las bacterias, un
marcador de resistencia a fármacos (resistencia a la ampicilina) para permitir la
selección de las células bacterianas portadoras del ADN del plásmido y sitios que
permiten la inserción de una secuencia de ADNc o ADN genómico.
Cuadro 4.1 Tamaño de ADN que puede clonarse en los distintos vectores
Vector de clonación Tamaño del inserto
Plásmidos con No. De copia alto 0-10 Kb
estándar 0-10 Kb
Bacteriófago λ de inserción 9-23 Kb
Bacteriófago λ de sustitución 30-44 Kb
Cósmidos 70- 100 Kb
Bacteriófago P1 130-150 Kb
PAC (cromosomas artificiales P1) hasta 300 Kb
BAC (cromosomas artificiales bacteriano) 0.2 – 2.0 Mb
YAC (cromosomas artificiales de
levadura)
Figura 4.2 El plásmido pUC18
Uno de los vectores por excelencia para E. Coli es el fago lamda, λ. Para diseñar
vectores de clonación λ apropiados, es necesario construir un sistema donde el
ADN extraño pueda unirse al replicon de λ in vitro y para que el ADN recombinante
resultante sea capaz de transformar células de E. Coli a alta eficiencia. Este último
requerimiento se logra por el desarrollo de un sistema de empaquetamiento in vitro,
que mimetiza la manera en la cual el ADN λ de tipo silvestre se empaqueta en una
cubierta proteíca, resultando en alta eficiencia de infección.
88
La atención en lo que respecta a vectores, también se ha centrado en los que

poseen replicones con bajo número de copias, como el factor-F, que es un
plásmido de fertilidad de E. Coli. El plásmido contiene dos genes, par A y par B,
que mantienen el número de copias del factor F de 1-2 copias por célula de E. Coli.
Los vectores basados en sistemas del factor-F son capaces de aceptar fragmentos
de ADN extraños largos (> 300 Kb). Las recombinantes resultantes pueden
transferirse con eficiencia considerable dentro de las células bacterianas usando
electroporación.
El bacteriófago λ es muy usado como vector de clonación del ADN. Los “brazos”
izquierdo y derecho del fago codifican genes estructurales fágicos y así son
indispensables para la replicación de este. Las secuencias de la región media del
fago son indispensables y pueden eliminarse para permitir la inserción de ADN o
ADNc específicos. Los extremos del fago λ también tienen secuencias cohesivas
de ADN monocatenerio, los sitios COS que se necesitan para envasar el genoma
fágico dentro de la partícula viral. Los fagos envasados se utilizan para infectar E.
Coli y las células infectadas forman placas en una capa bacteriana. Las placas con
fagos pueden ser transferidas a filtros de nitrocelulosa para que estos sean
analizados por medio de sondas de ADN o ARN, (figura 4.4).
Figura 4.3 Fago lambda como vehículo para la clonación de ADN o ADNc.
4.6 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un
instrumento útil para analizar el nivel de expresión génica particularmente cuando
se trata de genes de poca abundancia en donde la baja expresión en el northern
blot complica la detección en los cambios de dicha expresión.
89
El principio de la utilización de PCR se basa en dos posibilidades: la PCR

cuantitativa y la semicuantitativa. En la primera se coamplifica el ARNm del gen de
interés junto con un control interno que pueda medirse con presición y así utilizarse
como guía de referencia para cuantificar el ARN de interés. Este procedimiento es
muy utilizado en la cuantificación del ARN viral en casos de infecciones virales. En
la PCR semi-cuantitativa se coamplifica el ARNm de interés junto con el ARNm de
un gen de expresión constitutiva, como la actina, que permita comparar cuanto del
gen de interés se expresa en relación con el gen control. La detección del producto
amplificado se puede hacer mediante electroforesis o por cuantificación con
centelleo líquido. En ambos casos, la PCR es útil para conocer cambios en la
expresión de genes que estén en bajas cantidades.
La PCR permite la amplificación masiva de secuencias de ADN específicas,

logrando producir en el laboratorio millones de copias de un segmento del gen que
se desea analizar y que se encuentra en muy bajas cantidades en el material
clínico a investigar. La reacción tiene su fundamento en la unión de dos cebadores
o iniciadores cortos, cada uno de ellos complementario a la secuencia de ADN
flanqueante de la región a ser amplificada. Estos cebadores inician la síntesis de
ADN por la acción de una enzima ADN polimerasa termoestable especial
(polimerasa Taq). La nueva molécula de ADN bicatenario, que se compone de una
cadena modelo y otra neosintetizada, es luego desnaturalizada a altas
temperaturas. En este momento los cebadores se unen o alinean nuevamente y
otra vez son alargados para sintetizar la nueva cadena por la ADN polimerasa Taq.
La PCR se realiza en ciclos, cada uno compuesto de tres fases:
Desnaturalización: El ADN se calienta hasta que se separan las cadenas sencillas,

aproximadamente de 93°C a 95°C.
Apareamiento o alineación: Las cadenas se aparean con el par de cebadores, que

son oligonucleótidos sintéticos específicos, de los cuales uno es complementario al
extremo 5’ del gen o fragmento de ADN que se desea amplificar y el otro se aparea
con el extremo 3’ del mismo, pero en la cadena opuesta. La temperatura de
alineación es de 50°C a 70°C dependiendo de la temperatura de fusión (Tm) del
ADN dúplex esperado. Típicamente la temperatura de alineación ocurre
aproximadamente 5°C por debajo de la Tm.
Extensión: Los oligonucleótidos sintéticos actúan como iniciadores para que la

ADN polimerasa termoestable sintetice a partir de los cuatro desoxirribonucleótidos
(dNTP) que usa como sustrato, las dos nuevas cadenas de ADN complementarias
a las cadenas originales. La síntesis de ADN ocurre aproximadamente de 70°C a
75°C.
90
Este ciclo de desnaturalización/apareamiento/extensión se repite de 25 a 40 veces,

lográndose en cada ciclo doblar la cantidad del ADN blanco, lo que causa una
amplificación logarítmica de la secuencia de ADN de interés (figura 6).
El ADN a copiarse (templado) se coloca en un microtubo en presencia de buffer a

pH 8.3; MgCl2 y los cuatro análogos de los nucleótidos que se incorporan al nuevo
ADN (dCTP, dATP, dGTP y dTTP). Se agrega una escasa cantidad de polimerasa
termorresistente Taq (extraída de la bacteria Thermus aquaticus) y las dos
secuencias cortas de ADN (18 a 25 bases) que sirven como cebadores, uno en una
cadena y el otro en la segunda cadena, y que por crecer en sentidos opuestos se
denominan “sentido y antisentido”.
La mezcla de reacción preparada en el tubo, todavía sin reaccionar, se pone en

una máquina de PCR o termociclador, el cual es un aparato que es capaz de
calentar y enfriar rápida y repentinamente, en ciclos, los tubos. Las tres
temperaturas que usa el aparato son generalmente: 96ºC para desnaturalizar el
ADN, 55ºC para alinear y 72ºC para incrementar la longitud del nuevo ADN
Esta capacidad de amplificar una secuencia de ADN mediante PCR tiene su

principal aplicación en la detección de mutaciones de trastornos genéticos
conocidos y en la detección de ADN o ARN viral o bacteriano responsable de
infecciones en muestras clínicas. Así mismo se la está aprovechando cada vez
más en diversas técnicas de clonación molecular y para el análisis de la expresión
de los genes. La PCR también se puede usar para modificar la secuencia precisa
de un fragmento amplificado en otra secuencia a elección. Por ejemplo, si se hace
que los extremos 5’ de los cebadores de la PCR contengan sitios para enzimas de
restricción, entonces el producto final de la PCR estará flanqueado por esos sitios,
lo que facilita enormemente su posterior clonación y manipulación.
4.7 ANÁLISIS DE SECUENCIAS
A finales de los 70s se desarrollaron varios métodos que permiten la secuencia de
nucleótidos de un fragmento de ADN purificado. Estos métodos hicieron posible
determinar la secuencia de ADN completa de miles de genes, incluyendo los que
codifican para proteínas bien conocidas como la insulina, hemoglobina, interferon y
citocromo c. El volumen de la información de la secuencia de ADN ya es tan
grande (muchas decenas de millones de nucleótidos) que deben usarse
computadoras para almacenar y analizar la secuencia.
Los métodos químicos de secuenciación del ADN que se emplearon al principio
usaban una modificación química específica de cada base con el subsiguiente
corte del ADN. Actualmente, la mayoría de los métodos de secuenciación llevan a
cabo un método enzimático: el ADN que se va a secuenciar se transforma a
moléculas de cadena sencilla de donde la ADN polimerasa sintetiza nuevas hebras
de ADN complementario. Las reacciones de secuenciación involucra la síntesis de
ADN usando uno o más nucleótidos marcados y un iniciador de secuenciación
universal que es complementario a la secuencia del vector flanqueando el sitio de
clonación.
91
La síntesis de ADN se lleva a cabo en presencia de dideoxynucleótidos base-

específicos (ddNTPs). Estos son análogos de los dNTPs normales con la diferencia
de que carecen de un grupo OH en la posición del carbono 3 ‘ así como en el
carbono 2’. Un dideoxinucleótido puede incorporarse en la cadena de ADN
creciente mediante la formación de un enlace fosfodiéster entre el carbono 5’ y el
carbono 3’ del nucleótido previamente incorporado. Dado que los ddNTPs carecen
de un grupo OH 3’, cualquier ddNTP que se incorpore a la cadena de ADN
creciente no puede participar en el enlace forfodiéster en su átomo de carbono 3’,
causando así una terminación abrupta de la síntesis de la cadena.
Figura 4.4 Amplificación de ADN por PCR. En el ciclo se duplica el material

genético presente al inicio del mismo, generándose de 25 a 30 ciclos entre 106 a
107 copias de la molécula inicial.
92
Cuatro reacciones paralelas base-específica se llevan a cabo usando una mezcla

de los cuatro dNTPs y también una proporción pequeña de uno de los cuatro
ddNTPs. Al poner la concentración del ddNTP mucho menor que lo normal, la
terminación de la cadena ocurrirá al azar en una de las muchas posiciones que
contienen la base en cuestión. Por lo que cada reacción es una reacción parcial: la
terminación de la cadena ocurre al azar en una de las posibles bases en cualquier
cadena de ADN.
Sin embargo, el ADN a secuenciar en una reacción de secuenciación es una

población de moléculas idénticas. Como resultado, cada una de las cuatro
reacciones específicas de base generará una colección de fragmentos de ADN
marcado de diferente tamaño, con un extremo 5’ común pero extremos 3’ variables
(el extremo 5’ común se define por la secuenciación del iniciador y los extremos 3’
que terminan con el ddNTP seleccionado son variables debido a la inserción del
dideoxinuceótido que ocurre al azar en una de las muchas posiciones diferentes
que aceptará la base específica.
Los fragmentos que son diferentes en tamaño por un solo nucleótido pueden
separarse en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Los fragmentos de
diferente tamaño pueden detectarse incorporando grupos marcados en los
productos de reacción, incorporando nucleótidos marcados, o usando un iniciador
con un grupo marcado. La secuencia puede descifrarse, leyendo la secuencia de
abajo hacia arriba del gel, una dirección que da la secuencia 5’- 3’ dela cadena
complementaria del molde de ADN.
4.7.1 Gel de electroforesis

La longitud y la pureza de las moléculas de ADN puede determinarse
adecuadamente por los mismos métodos de gel de electroforesis que se usan en el
análisis de proteínas, debido a que cada nucleótido en la molécula tiene una carga
negativa. Para fragmentos de ADN de menos de 500 nucleótidos de largo, los
geles de poliacrilamida diseñados especialmente permiten que las moléculas de
diferente longitud, de hasta un solo nucleótido de diferencia, puedan separarse de
cada una.
Los poros en los geles de poliacrilamida, son tan pequeños para permitir el paso de
moléculas de ADN muy grandes, que para separar estas por su tamaño se utilizan
geles con más poros fromados con soluciones diluidas de agarosa.
En los geles de agarosa, los fragmentos de ADN migran con una velocidad
inmersamente proporcional a su tamaño, es decir, que los fragmentos pequeños
corren con mayor rapidez (figura 4.2). Los fragmentos de ADN se mueven en un
campo eléctrico simplemente porque poseen las abundantes cargas negativas de
sus fosfatos, los cuales están colocados regularmente a lo largo de la cadena. El
gel de agarosa, usado en concentraciones entre 0.2 y 3%, produce mallas de
espacios menores cuanto mayor es la concentración.
93
A una concentración dada, los fragmentos de ADN más chicos sortean con más
facilidad las mallas y avanzan más rápidamente hacia el ánodo (polo positivo)
mientras los fragmentos más largos tardan más en atravesar las mallas, debido a
que el ADN es una molécula relativamente rígida y con forma de filamento. De esta
manera, en geles de agarosa es posible separar fragmentos de ADN entre 50,000
nucleótidos y 100-200 nucleótidos. Debido a su gran densidad de cargas negativas,
el ADN corre rápidamente y las electoforesis pueden realizarse en menos de una
hora según el voltaje aplicado.
Figura 4.5 Electroforesis en agarosa

Una variante de gel de electroforesis en agarosa, llamado electroforesis de gel de
campo pulsátil, hace posible separar moléculas de ADN aún más largas. El gel de
electroforesis falla en separar esas moléculas debido a que el campo eléctrico
constante las deforma por lo que viajan al primer extremo a través del gel en
configuraciones de forma como de serpiente a una velocidad independiente de su
longitud. En la electroforesis de campo pulsátil, por el contrario, la dirección del
campo eléctrico se cambia periódicamente, lo que fuerza a las moléculas a
reorientarse antes de continuar su movimiento en forma de serpiente a través del
gel. Esta reorientación toma mucho más tiempo para moléculas más largas, por lo
que se mueven progresivamente más lento. En consecuencia, aún cromosomas
enteros de bacterias o de levadura se separan en bandas discretas en geles de
campo pulsátil y así pueden acomodarse e identificarse con base en su tamaño.
4.7.2 Visualización
Las bandas de ADN en geles de poliacrilamida o agarosa son invisibles hasta que
el ADN sea marcado o teñido por algún método. Un método sensible de tinción de
ADN es exponerlo a un colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que se
observa bajo luz ultravioleta cuando se intercala en el ADN. Un método de
detección más sensible involucra la incorporación de un radioisótopo en las
moléculas de ADN antes de la electroforesis, el fósforo 32 (P32), es el más utilizado
porque puede incorporarse en los grupos fosfato del ADN y emite una partícula
energética β, la cual se detecta fácilmente por autorradiografía.
94
El procedimiento consiste, en que una vez terminada la electroforesis, se baña el

gel en una solución muy diluida del colorante florescente bromuro de etidio, que se
introduce entre las dos hélices del ADN y absorbe intensamente la luz UV a 300
nm, emitiendo una luz anaranjada. El gel teñido con bromuro de etidio y lavado se
coloca sobre una fuente de luz UV (altamente dañina para la vista y la piel no
protegidas) y los lugares donde se encuentran los fragmentos de ADN se
visualizan como bandas anaranjadas que deben ser fotografiadas para conservar
la documentación. Mediante este procedimiento se detecta hasta menos de un
centésimo de µg de ADN, lo que representa entre 1 y 10 ng (nanogramos).
4.7.3 Estimación del tamaño

La electroforesis, el procedimiento por el cual moléculas cargadas migran en un
campo eléctrico, ha tenido amplias aplicaciones en el análisis de ácidos nucleícos.
Debido a que la velocidad de migración en un gel de electroforesis está
determinada por el tamaño de las moléculas y su carga eléctrica, es un
herramienta apropiada para la identificación de muestras diferentes de ADN con el
fin de estimar el tamaño de los fragmentos de interés.
La velocidad de migración de las moléculas de ADN conforme migran a través de

los poros en los geles de agarosa is inversamente proporcional a sus pesos
moleculares. El tamaño de los fragmentos de ADN puede determinarse en la
electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de
peso molecular conocido. Existen patrones de ADN de varios rangos de peso
molecular , se debe aplicar el que comprenda el peso molecular esperado para el
fragmento de ADN que se quiere determinar. Estos marcadores estándar deben
ser tratados de manera similar a la muestra y deben estar en cada gel que se
desee medir el tamaño de los fragmentos de ADN. Un marcador de pesos estándar
de los más usados y conocidos es el ADN del fago λ digerido con la enzima de
restricción Hindi. La secuencia completa del ADN del fago λ está bien conocida así
como los tamaños de los fragmentos del ADN λ están bien determinados bajo la
digestión con varias enzimas de restricción.
4.8 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE EXPRESIÓN

4.8.1 Purificación de ARN
Una alícuota de una cantidad conocida de ARN (habitualmente 5 a 20 mg de ARN
por pocillo) se somete a electroforesis horizontal unidimensional en un gel de
agarosa. El gel se corre por el tiempo necesario de acuerdo al tamaño del mismo,
a bajo voltaje. Simultáneamente con las muestras corridas en el gel de
electroforesis, se corre una muestra que contiene estándares de ARN o ADN de
tamaños conocidos para posteriormente identificar el tamaño de los fragmentos de
ARN obtenidos e hibridizados.
El proceso de transferencia a una membrana de nailon es precedido de un lavado
con una solución altamente concentrada en sales para eliminar el formaldehído y
se procede a la transferencia por capilaridad que puede tener una duración de
varias horas.
95
Una vez transferido el ARN a la membrana de nailon, aquél debe ser fijado a la
misma mediante horneo con altas temperaturas o anclaje con luz ultravioleta.
Luego, se expone la membrana al análisis de Northern blot que incluye la síntesis
de la sonda, la hibridación, los lavados y el revelado de la señal. La utilidad
principal del Northern blot es para conocer cómo diversos estímulos pueden afectar
la expresión de un gen al aumentar o disminuir el ARNm que codifica para este.
La hibridación del ARN de un gen de interés con la sonda puede hacerse más
específica al someter la reacción a la acción de las ARNsas. Este procedimiento
permite no sólo visualizar los fragmentos hibridados sino además cuantificarlos.
Para esto, se construyen sondas de ARN complementario anti-sentido mediante
una reacción de transcripción in vitro. El ARN del tejido de interés se híbrida en una
tubo de ensaye con la sonda marcada con radioactividad. Posteriormente, con la
finalidad de digerir los fragmentos de ARN monocadena y en consecuencia no
hibridados, se agrega a las muestras una solución con ARNsas. Una vez
completado el ensayo de protección de ARNsas o hibridación en solución, las
muestras se precipitan y se cuentifican mediante centelleo líquido o bien son
corridas con electroforesis en un gel. De esta manera, la evidencia por imagen de
que la cantidad de ARNm cambió puede determinarse mediante conteo de
radioactividad con centelleo líquido.
4.8.2 Plásmidos de expresión

Los plásmidos de expresión han sido modificados de tal manera que poseen un
promotor muy activo, lo que provoca una producción inusualmente elevada de
ARNm que producirá la síntesis del polipéptido en las células transformadas.
Los vectores de expresión en E. coli permiten la producción de cantidades
abundantes de proteínas de interés una vez que el ADNc que lo produce ha sido
clonado. Uno de los sistemas de expresión más productivos emplea células
modificadas de E. coli que expresan una gran cantidad de ARN polimerasa T7 en
presencia del análogo de lactosa IPTG (Figura 4.6).
Los vectores de expresión eucarióticos son empleados para producir proteínas que
se modifican post-trasncripcionalmente, por ejemplo por la adición de carbohidratos
o grupos fosfatos. Debido a que E. coli carece de enzimas que catalizen estas
modificaciones, estas proteínas sólo pueden ser producidas en el interior de cálulas
eucariotas.
Los clones de ADNc pueden ser trasncritos y traducidos in vitro, pero la producción
de proteínas por lo general es menor que en los sistemas de expresión in vivo. La
ventaja de la producción de proteínas in vitro es que la proteína de interés puede
ser marcada radioctivamente durante la síntesis.
96
Figura 4.6 Producción de proteínas por medio de un plásmido de expresión.
4.8.3 Despliegue diferencial

Un número importante de funciones celulares están reguladas a nivel
transcripcional en mamíferos. Del conjunto de genes que forman el genoma de
cada célula, una fracción de ellos se están transcribiendo activamente, se están
expresando en unas condiciones fisiológicas concretas, mientras que otros muchos
genes permanecen silentes. Entre los genes activos transcripcionalmente se
encuentran un número importante de genes de expresión ubicua, que llevan a cabo
funciones de mantenimiento celular y que se suelen expresar a niveles bastante
uniformes, de modo constitutivo.
Otro grupo de genes se expresa de manera específica en el tiempo y el espacio,
siendo sus niveles de transcripción variables según el momento del desarrollo, tipo
celular y condiciones fisiológicas. Es este último grupo de genes, inducidos, el más
interesante a la hora de definir en términos moleculares la respuesta celular a
cambios ambientales y por tanto el que ha focalizado la atención de los fisiólogos.
Los niveles de expresión génica se pueden analizar a nivel proteico, midiendo la
cantidad o actividad de producto génico producido, o bien a nivel de ARN
mensajero (ARNm). Los niveles de ARNm de un gen concreto no dependen sólo
del ritmo al que se transcriba, sino también de la vida media de la molécula, el
ritmo a que se degrade.
97
Por otro lado, la interfase ARNm-proteína, la traducción proteica, también puede

estar regulada, haciendo que los niveles de ARNm no sean extrapolables a los
niveles de proteína producida, pero no es lo mas frecuente. La tecnología del ADN
recombinante hace mucho más fácil analizar niveles de ARNm que de proteína, por
lo que se ha generalizado la medición de ARNm como indicador del nivel de
expresión génica. En las últimas décadas se ha profundizado en los mecanismos
de respuesta fisiológica midiendo los niveles de ARNm de uno o varios genes
implicados en el proceso, utilizando herramientas como el “Northern blot”, el
ensayo de protección con ARNasa, la RT-PCR o la hibridación in situ. Pero dada la
complejidad de la célula de mamífero, este tipo de análisis, en serie, de uno o
varios genes candidatos a jugar un papel en la respuesta estudiada conlleva una
simplificación notable del problema.
Por esto es que ha existido gran interés en analizar, en paralelo, respuestas

‘globales’ de los niveles de transcripción de todos los genes a un determinado
cambio ambiental. Este interés en analizar el conjunto de ARNm presentes en la
célula en un momento concreto (su ‘transcriptoma’), ha llevado a desarrollar varias
herramientas para el estudio de la expresión diferencial, para averiguar qué genes
se expresan más o menos en la situación experimental con respecto a la control.
Es así que se han utilizado variantes de procedimientos de hibridación substractiva,

despliegue diferencial (“differential display”), y análisis seriado de expresión génica
(SAGE), que han contribuido notablemente a este conocimiento. Pero ha sido en
los últimos años cuando se han dado dos avances importantes que han facilitado la
generalización del análisis global de la expresión génica. Por un lado, el
conocimiento del genoma humano y de organismos modelo como S. cerevisiae, C.
elegans, D. melanogaster o M. musculus hace que se disponga en la actualidad de
colecciones de sondas moleculares capaces de detectar los niveles de expresión
de cada gen en el genoma. Al mismo tiempo, se ha desarrollado nanotecnología
que posibilita la colocación ordenada de miles de sondas moleculares en una
superficie de uno o varios centímetros cuadrados. Estas micromatrices de sondas
moleculares, conocidas como “DNA-microarrays” o “DNA-chips” se están
fabricando en laboratorios comerciales y académicos.
4.8.4 Purificación y análisis de proteínas: análisis de aloenzimas, Norther

blot, Southern Blot, Western Blot y ELISA
Southern
La hibridación molecular es uno de los pilares de la mayor parte de los
procedimientos que se utilizan en un laboratorio de biología molecular. La
hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de
ácidos nucleícos con secuencias complementarias: se lleva a cabo mediante la
creación de puentes de hidrógeno entre las bases de ambas cadenas lo que
mantiene la inestabilidad del ADN. Con este principio se han desarrollado una serie
de procedimientos en el laboratorio en las que se aprovechan las propiedades de
98
apareamiento de bases de los ácidos nucleícos para hibridar ADN o ARN del tejido
en estudio con un fragmento de ADN o ARN con secuencia conocida (denominado
sonda) y marcado de manera tal que pueda detectarse con algún método
colorimétrico o mediante autorradiografía.
TRATAMIENTO
AISLAMIENTO DE ARNm
RT-PCR CON UN
PRIMER AL AZAR
ANÁLISIS POR GEL

ELECTROFORÉSIS
inducido
Reprimido
RECUPERACIÓN Y CLONACIÓN DE
LA BANDA
Figura 4.7 Esquema del proceso de “despliegue diferencial” de ARNm como

respuesta a un estímulo.
La primera de estas técnicas surgió en 1975 en que Southern describe una manera
de transferir ADN, previamente desnaturalizado o fraccionado según su tamaño en
un gel, a una mebrana de nylon en la que el ADN podía ser hibridado con una
sonda específica y así detectar la secuencia deseada. Debido a que la
transferencia de ADN del gel de agarosa a la membrana de nylon es por
capilaridad, con el mismo principio utilizado por años para limpiar manchas con
papel secante, el proceso es conocido en inglés como blotting; Southern propuso
utilizar el término blot (secado) o blotting para referirse a esta técnica y actualmente
se conoce como Southern blot.
99
Por lo tanto, el southern sirve para detectar secuencias específicas de ADN en una
membrana de nylon. El esquema de los pasos generales para el análisis de ADN
por transferencia de tipo Southern se muestra en la figura 4.5. El ADN digerido con
enzimas de restricción específicas puede ser fraccionado sobre la base del tamaño
de los fragmentos mediante la electroforesis en gen de agarosa.
Los fragmentos de ADN en el gel pueden transferirse a un soporte sólido como la

nitrocelulosa, ya sea electroforéticamente o por medio de la transferencia de soluto
a través del gel hacia la lámina de nitrocelulosa. Luego puede hibridarse el filtro
con una sonda radioactiva que contenga una secuencia de ADN o ARN de interés,
eliminarse la sonda no fijada y localizarse las posiciones de los fragmentos de ADN
en el gel complementarios a la sonda por medio de la autorradiografía sobre
película de rayos X.
Figura 4.8 Análisis de ADN por transferencia tipo Southern
Western
La técnica en la que se utilizan proteínas en una membrana de nailon que se
detectan con anticuerpos se le conoce como western blot. Este método está
diseñado para la investigación sobre la expresión de proteínas usando extractos
celulares que son fraccionados de acuerdo a su tamaño. Esto se logra por análisis
de PAGE-SDS unidimensional, el cual es una forma de electroforesis en gel de
100
poliacrilamida en el cual la mezcla de proteínas extraídas se disuelve primero en

una solución de sodio duodecil sulfato (SDS, un detergente aniónico que rompe
casi todas las interacciones no covalentes en las proteínas nativas).
El Mercaptoetanol o ditiotreitol se agrega también para reducir los enlaces

disulfuro. Después de la electroforesis, las proteínas fraccionadas pueden
visualizarse por tinción con algún colorante (por ejemplo, azul de Comassie) o
tinción con nitrato de plata. Los geles de dos dimensiones también pueden ser
útiles: la primera dimensión incluye la migración isoeléctrica, que es la separación
de acuerdo a un gradiente de pH, y la segunda dimensión, involucra que se
fraccionen las proteínas por su tamaño mediante SDS-PAGE. En este caso, las
proteínas fraccionada son transferidas a un pedazo de nitrocelulosa y luego
expuestas a un anticuerpo específico.
Northern
Esta técnica se basa en el fraccionamiento de los diferentes ARNs de acuerdo a su
tamaño en un gel desnaturalizante de agarosa para posteriormente transferirlo a
una membrana de nitrocelulosa o nailon sobre la cual puede ser hibridado con una
sonda generalmente de ADN complementario (ADNc). Con este método, de entre
todos los ARNs contenidos en la muestra, se puede determinar la presencia
específica de uno de ellos, determinar su concentración y analizar su variación ente
diferentes estímulos.
ELISA
Uno de los métodos más utilizados para la detección de proteína transgénica es el
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay). Como alternativa a este método,
ha aparecido recientemente en el mercado un sistema llamado LFA (Lateral Flow
Strip) cuya diferencia fundamental es el formato ya que la base es la misma:
detección de proteínas usando anticuerpos específicos de la proteína de interés.
Estas técnicas, que permiten cuantificar, están limitadas a alimentos no
procesados, es decir, no sometidos a tratamientos que hayan podido destruir la
mencionada enzima. Los análisis ELISA detectan o miden la concentración de
proteína de interés en una muestra que puede contener numerosas proteínas
distintas. Se utiliza un anticuerpo fijado a un soporte que se une específicamente a
la proteína transgénica. Un segundo anticuerpo conjugado a un enzima genera un
producto cuyo color es visible al añadir un sustrato determinado, y es fácilmente
cuantificable mediante una curva patrónde la proteína de interés.
Frente a la técnica PCR, los análisis ELISA presentan menor sensibilidad, siendo
sin embargo por ello, menos susceptible a “falsos positivos”. Por otra parte, se
necesita desarrollar previamente anticuerpos que reconozcan específicamente la
proteína transgénica que se desee, por lo tanto no puede utilizarse este método
como técnica de “screening”. La única limitación tecnológica para utilizar el método
ELISA como análisis rutinario es que se debe de conocer qué proteína concreta se
ha debido modificar en cada caso, y se deben desarrollar anticuerpos frente a esa
proteína.
101
4.9 BIBLIOTECA DE GENES

4.9.1 Identificación de genes
Por muchos casos, la clonación de ADN se lleva a cabo para lograr simplemente la
amplificación de un ADN integrado para obtener cantidades suficientes por una
variedad de estructuras subsiguientes y estudios funcionales. Sin embargo, hay
muchas circunstancias donde en vez de solo amplificar y propagar el ADN clonado
se desea poder expresar el gen de alguna manera (clonación de expresión). En
esos casos, las señales de expresión apropiadas necesitan estar en el sistema de
clonación. Existe una gran variedad de sistemas de clonación que pueden usarse
de acuerdo a lo siguiente:
1.- Al tipo de producto de expresión. Para algunos propósitos, sería suficiente

poder obtener un producto de ARN. Los ejemplo incluyen la generación de sondas
de ARN antisentido (ribosondas) para el uso en estudios de hibridación in situ, o
generación de ARN antisentido para inhibir o destruir la expresión de genes
específicos, tanto en estudios funcionales como para propósitos terapéuticos.
2.- Al tipo de ambiente. Algunas veces puede ser suficiente expresar el
producto in vitro. Con frecuencia, se desea poder expresar el producto en un
sistema celular particular, que puede ser una línea celular bien definida procarionte
o eucarionte.
3.- Al propósito del sistema de expresión. El sistema de expresión puede
diseñarse simplemente para investigar la expresión. En algunos casos, sin
embargo, el propósito puede ser obtener grandes cantidades de un producto de
expresión, así como la necesidad de generar grandes cantidades de una proteína
específica para subsiguientes estudios de cristalografía o preparar anticuerpos
específicos contra la proteína.
La expresión de proteínas eucarióticas en bacterias puede usarse como un sistema
blanco para tamizar con anticuerpos e identificar genes no caracterizados
previamente. En estos casos, aún cuando no haya información sobre la secuencia
codificante del gen en cuestión, la purificación parcial de un producto protéico
puede permitir generar un anticuerpo específico. Filtros que contengan las colonias
bacterianas individuales pueden tamizarse por exposición al anticuerpo. La bacteria
que reaccione positivamente puede ser propagada para aislar la clona de ADNc, la
cual puede a su vez puede emplearse en una genoteca para identificar genes
relacionados.
Cuando se requiere la producción de grandes cantidades de una proteina (por lo
general extraña al huésped), y la producción a gran escala puede ser letal para el
crecimiento de la bacteria, entonces se diseñan sistemas de expresión con
promotores inducibles. La expresión del gen insertado puede activarse por
exposición a un agente inductor y las células pueden ser cosechadas pronto. Una
aplicación importante de este método es el diseño que permite la construcción de
un anticuerpo especifico para un polipéptido eucariótico donde no se tiene ninguna
información disponible. Entonces, se pretende preparar proteínas de fusión que
consisten de un péptido aminoterminal codificado por una porción de un gen
bacteriano, como el gen LacZ de E. coli, ligado al polipéptido eucariótico deseado.
102
Las propiedades biológicas de muchas proteínas eucarióticas sintetizadas en las

bacterias pueden no ser muy representativas de las moléculas nativas debido al
procesamiento post-traduccional y al desdoblamiento incorrectos e ineficientes de
la proteína. Como resultado, se ha hecho un esfuerzo considerable para expresar
proteínas de mamífero preferentemente en células eucariónticas de mamífero. Los
siguientes son los sistemas de expresión principales:
1.- Los que se diseñan para producir expresión estable del ADN transfectado;
como los sistemas de expresión basados en células COS de mono, que se
construyeron por transformación de células CV-1de riñón de simio con un genoma
del virus SV-40 con un origen de replicación defectuoso.
2.- Los que incluyen el uso de vectores de expresión virales, como los
derivados de los virus SV40, adenovirus, de vaccinia, retrovirus y el baculovirus de
insecto. Este último sistema de expresión es el más usado para la preparación de
una proteína eucarióntica específica.
4.9.2. Localización del gen

Cuando se parte de ADN genómico, o de una genoteca de ADNc, la
transformación celular resulta en miles o millones de clonas con moléculas de ADN
recombinante diferentes. El último paso, es localizar entre esos millones de clonas
aquella o áquellas transformadas con el ADN recombinante del gen a estudiar.
Las clonas se siembran en membranas de nylon o nitrocelulosa, a densidades de

cientos o miles por membrana, sobre cajas de Petri con agar. Ya crecidas las
clonas, se hacen copias en espejo con nuevas membranas que se utilizan para
localizar la presencia y posición de la clona de interés. La forma más fácil y rápida
de localizar una clona entre miles es por homología, o sea, si conocemos al menos
parte de la secuencia. Cuando conocemos parte de la secuencia podemos
sintetizar una sonda (fragmento de ADN o ARN con secuencia complementaria),
marcarla con algún método radiactivo (32P-dCTP) o no radiactivo (digoxigenina-11-
UTP), y utilizarla para localizar a una clona entre miles mediante hibridación del
ADN en las membranas y autorradiografía de estas.
Otra posibilidad es que no se conozca la secuencia de bases o de aminoácidos de

la proteína que le interesa clonar, pero por alguna razón ha podido extraer la
proteína del tejido. En este caso, se generan primero anticuerpos, de preferencia
monoclonales, en contra de la proteína y después, con dichos anticuerpos se
analizan las membranas con las clonas. Se utiliza un vector de expresión, el cual
permite a las bacterias no solo replicar el ADN, sino además traducir su código
genético y sintetizar la proteína. La clona con el epítope apropiado será localizada
por los anticuerpos. El ADNc identificado sirve de molde para sintetizar una sonda
útil para localizar el resto del gen por homología.
103
La tercera posibilidad es cuando no conocemos la secuencia de bases o de

aminoácidos, ni tampoco se tiene aislada a la proteína, pero conocemos con cierto
detalle la función de la proteína. En este caso, nos podemos guiar en la función
para identificar el ADN recombinante que contiene dicho gen. La estrategia es
transfectar células en forma permanente (por ejemplo, células COS) o transitoria
(ovocitos de Xenopus leavis), con ADN recombinante de grupos de clonas y buscar
manifestaciones de su función. Las positivas son las que fueron transfectadas con
ADN recombinante que contiene el mensaje para la proteína de interés. A partir de
ese momento se reduce progresivamente el número de clonas hasta llegar a una
sola con el ADN recombinante que induce la función deseada.
4.9.3 Bibliotecas de ADN complementario

Como la expresión de un gen puede variar en las diferentes células y en las
diferentes etapas del desarrollo, el material inicial para construir bibliotecas de
ADNc es generalmente el ARN total de un tejido específico o etapa de desarrollo
específico de embriogénesis. De aquí, que un ARNm poli(A)+ puede seleccionarse
por unión específica a un oligonucleótido complementario de cadena sencilla o
polinucleótido unido a una matriz sólida. Por ejemplo, columnas de cromatografía
que contienen puentes poli(U) a sefarosa o puentes oligo (dT) a celulosa son de los
más usados: el ARNm poli(A) se une selectivamente al poli (U) o componentes
oligo (dT) y subsiguientemente puede eluirse usando amortiguadores o soluciones
iónicas de alta astringencia para disociar el puente de hidrógeno. El ARNm poli(A)
aislado puede entonces convertirse, con transcriptasa reversa, a una copia de
ADNc de doble cadena. Para fines de clonación, los oligonucleótidos linkers que
tienen un sitio de restricción apropiado se ligan a cada extremo del ADNc.
Las bibliotecas de ADNc tienen dos apreciables ventajas: 1) todos los fragmentos
son copias de genes; 2) son específicas para el tipo de célula del cual se extrae el
ARN de la genoteca. Los ARNm detenidos y purificados, se incuban con
deoxinucleótidos y transcriptasa inversa, MgCl2 y un cebador o primer de
polideoxitimidina con lo cual se copia la información del ARNm en una cadena
complementaria de ADN. Luego de otros procedimientos es posible vehiculizar o
clonar estos ADNc en bacterias, con lo cual se obtiene la genoteca de ADNc. Dado
que cada ADNc es posiblemente idéntico a los exones de un gen, cada inserto de
un plásmido en una genoteca de ADNc podría transcribir un ARNm y finalmente
codificar un polipéptido. Para ello se usan los vectores o plásmidos “de expresión”,
como el pUC19. Finalmente, una genoteca de ADNc es un conjunto de colonias de
E. coli, cada una con un tipo de plásmido que contiene un inserto correspondiente
a un ARNm.
104
4.10 SECUENCIACIÓN DE ADN: POLIMORFISMOS

En la actualidad es posible “secuenciar”, es decir, obtener la secuencia exacta de
las bases de fragmentos cada vez mayores, ya sea manualmente o con
dispositivos automáticos, y por lo general por el método de dideoxinucleótidos.
Varios centenares de bases se pueden secuenciar manualmente en dos días. Al
principio se desarrollaron dos métodos de secuenciación, el químico y el
enzimático. Este último se ha convertido en el método estándar para la
secuenciación del ADN y se basa en la síntesis in vitro del ADN en presencia de
nucleósidos trifosfato de cadena terminal. Para estudios sobre la determinación de
la estructura y función de genes es una prioridad inicial obtener la secuencia
completa de ADNc. Una manera de lograr la secuenciación completa se ADNc es
tamizar diferentes genotecas de ADNc y luego mapear la extensión de las
sobreposiciones entre los insertos de las clonas positivas. Debido a la
enormemente rápida proliferación de secuencias de ADNc en las bases de datos
electrónicas es posible obtener secuencias de ADNc casi completas para un gen
previamente no caracterizado.
La secuenciación por el método de Sanger de terminación de cadenas se vale de

dideoxinucleótidos que pueden ser incorporados en cadenas de ADN en
crecimiento pero que, una vez incorporados, impiden la ulterior prolongación de
esa cadena de ADN. En esta reacción de secuenciado se divide en cuatro la
muestra de ADN a secuenciar y se agrega a cada una un cebador o primer de
oligonucleótidos radiomarcado que es complementario de un extremo de la cadena
de ADN a ser secuenciada.
Luego se alarga el cebador por acción de la ADN polimerasa en presencia de

dNTP pero cada una de las cuatro muestras también contiene uno de los NTP en
la forma didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). En condiciones adecuadas,
esto produce una serie de moléculas de ADN de longitudes variables que pueden
ser separadas en geles de acrilamida contiguos y expuestas a películas de rayos
X. El patrón de las bandas del ADN pueden entonces usarse para determinar la
secuencia del ADN (figura 4.7).
4.10.1 Gel retardado

Esta técnica es alternativamente conocida como ensayo de desviación en la
movilidad electroforética (EMSA, del inglés) y se basa en que la unión de una
proteína a un fragmento de ADN disminuye o retrasa su movilidad en un gel de
electroforesis (gel de retardamiento). Un fragmento de ADN de una clona genómica
o un correspondiente oligonucleótido sintético, que se sospecha contenga
secuencias regulatorias, es marcado en un extremo y luego mezclado con el
extracto de una proteína. La preparación resultante se fracciona en un gel por
PAGE en paralelo con una muestra control en la cual el ADN no está mezclado con
la proteína. Los fragmentos de ADN que están unidos a proteína se identificarán
como bandas de movilidad baja. Dado que el ADN es una molécula altamente
cargada, puede haber la posibilidad para uniones inespecíficas.
105
4.10.2 ADN footprinting

Una modificación del método químico para secuenciación de ADN puede usarse
para determinar la secuencia de nucleótidos reconocidas por uniones de ADN-
proteína. Algunas de estas proteínas participan en la determinación de genes que
están activos en una célula en particular por unión a secuencias de ADN
regulatorias, que generalmente están localizadas fuera de las regiones codifcantes
de un gen.
Para analizar cómo funcionan estas proteínas, es importante identificar las

secuencias específicas a las que se une. Un método usado para este propósito en
el ADN footprinting. Primero, un fragmento de ADN puro marcado en un extremo
con P32 se aísla; esta molécula es luego fraccionada con una nucleasa o por un
procedimiento químico que corte al azar cadenas sencillas en el ADN. Después de
que la molécula del ADN se desnaturaliza para separar sus cadenas, los
subfragmentos resultantes de la cadena marcada se separan en un gel y se
detectan por autoradiografía.
Figura 4.9 Secuenciación por el método de Sanger

106
El patrón de bandas del ADN cortado en presencia de un proteína unida a ADN se

compara con el patrón de bandas de ADN cortado en su ausencia. Cuando la
proteína está presente, cubre los nucleótidos en su sitio de unión y protege sus
enlaces fosfodiéster de ser cortados. Como resultado, los fragmentos marcados
que terminan en el sitio de unión se perderán, dejando una brecha en el patrón del
gel llamada “footprint” o “huella de pisada”.
Cuando una proteína se une específicamente a una secuencia de ADN, solo pocos
nucleótidos del ADN están incluidos en el contacto ADN-proteína. La unión de
proteína encuentra, sin embargo, al segmento de ADN en cuestión relativamente
resistente al corte por deoxyribonucleasa pancreática I (ADNsa I), cuando se
compara con ADN desnudo (Figura 4.8). Fragmentos cortos de ADN clonados (por
lo general de unos cientos de bases de largo) se usan como blanco y se marcan
únicamente en un solo extremo.
Los fragmentos clonados se incuban individualmente en presencia o ausencia de

un extracto de proteína ( por ejemplo, un extracto nuclear de células humanas
HeLa) y luego expuestas brevemente a bajas concentraciones de ADNsa I. Esta
condiciones de digestión parcial aseguran que para cualquier fragmento de ADN,
cada molécula es cortada solo raramente y en una posición al azar si no está unida
a proteína. Los productos de la digestión se fraccionan de acuerdo a su tamaño en
geles largos de poliacrilamiada no desnaturalizante y luego resueltos por
autorradiografía. Las muestras control mostraran una serie de bandas
correspondientes a los fragmentos de ADN de cada longitud posible. Los carriles
que se analizan revelarán brechas donde no se observan fragmentos o footprints,
en los que la ADNsa I no fue capaz de cortar estas posiciones debido a inhibición
estérica por unión a proteína.
107
Figura 4.10 La prueba de footprint con ADNsa I identifican secuencias de ADN

específicas que interaccionan con proteínas.
4.10.3. Genes reporteros

Además del estudio de la expresión génica, también es importante poder estudiar
el control de la expresión génica. Una manera de identificar elementos regulatorios
es usar un sistema de expresión génica artificial. Las células humanas son los
sistemas más apropiados para el estudio de la expresión de genes humanos, pero
esto deja el problema de cómo seguir la expresión de un gen humano tranfectado
en presencia de un homólogo endógeno que puede expresarse en las mismas
células. Por lo que se recomienda clonar las secuencias regulatorias en un vector
que contiene un gen reportero “río abajo” del sitio de clonación.
El gen reportero se diseña deliberadamente de manera que sea el único que no se
encuentre en las células humanas y que pueda evaluarse fácilmente. Los genes
reporteros más ampliamente usados son el gen CAT (cloranfenicol acetil
transferasa,) bacteriano, derivado del transposon Tn9 de E. Coli, el gen β-
galactosidasa y el gen de luciferaza de la libélula. La luciferasa tiene la ventaja de
ser un ensayo muy sensible, porque cataliza la oxidación de liciferina con la
emisión de luz verde-amarilla que puede detectarse fácilmente y a bajos niveles. La
potencia de un promotor génico puede ser analizada mediante la transfección de
“construcciones” informadoras para promotores.
108
La transfección en células eucarióticas de vectores informadores de CAT trae como

consecuencia la expresión del gen de la CAT, la cual puede ser investigada con
facilidad midiendo la conversión de cloranfenicol- 14 C en cloranfenicol acetilado en
presencia de extractos celulares transfectados. Si estos resultados son luego
analizados por medio de cromatografía ascendente en capa delgada, la cantidad
de cloranfenicol acetilado se puede cuantificar por autorradiografía. Los productos
de la acetilación del cloranfenicol migran más rápido en el cromatograma (figura
4.9).
En los sistemas de expresión artificial antes mencionados, el vector se construye
para que la expresión del gen reportero se controle casi totalmente por las
secuencias humanas introducidas “río arriba”. El producto construido gene
reportero-vector se transfecta luego a células blanco cultivadas mediante métodos
convencionales. Si todos los elementos necesarios se presentan por expresión del
gen humano, altos niveles de expresión del gen reportero resultaran cuando el
producto construido sea transfectado en un tipo apropiado de células humanas en
cultivo.
Con frecuencia, el producto construido es simplemente transfectado en células

HeLa, una línea celular bien establecida derivada de un carcinoma cervical
humano. Sin embargo, si se sabe que el gen se expresa predominantemente en un
cierto tipo de células, por ejemplo, hepatocitos, se recomienda usar una línea
celular receptora apropiada, una línea celular de hepatoma en este caso.
La transcripción de un gen es controlada por secuencias de ADN regulatorias que

no son transcritas. Estas secuencias determinan qué células expresarán el gen y
bajo qué condiciones. En eucariontes superiores estas secuencias regulatorias
pueden localizarse muchos miles de pares de bases “río arriba o abajo” de las
secuencias transcritas, y actúan en combinaciones para controlar la transcripción
génica.
Las secuencias regulatorias de ADN pueden identificarse para cualquier gen en

particular mediante una manipulación que involucra sustituir parte de la secuencia
codificante de un gen con una secuencia codificante diferente, llamada secuencia
reportera, seleccionada porque la proteína que codifica puede detectarse
fácilmente por simple tinción citológica o ensayo enzimático. Las secuencias
regulatorias para el gen de interés pueden identificarse uniendo la secuencia
reportera a varios fragmentos o secuencias de ADN tomadas de los sitios “río
arriba o abajo” del gen.
Cuando estas moléculas de ADN recombinante se usan para transfectar células, el

nivel, duración y especificidad celular de la producción de la proteína reportera
reflejará la acción de las secuencias regulatorias que cada ADN recombinante
tiene.
109
Figura 4.11 Prueba del gen reportero de cloranfenicol acetiltransfersa (CAT)
4.10.4 Análisis por delección

Otra forma de estudiar el control de la expresión génica es analizando cómo
diferentes fragmentos delecionados del ADN “río arriba” del gen u ocasionalmente
en el primer intrón, afectan la expresión génica. Una serie de construcciones de
deleción progresiva se puede hacerse usando la enzima exonucleasa III de E. coli
que está inactiva en el ADN de cadena sencilla pero progresivamente corta el
extremo 3’ en el ADN de doble cadena. Esto permite el mapeo de secuencias que
controlan la expresión génica.
Alternativamente, se puede diseñar una serie de productos de amplificación por

PCR, que cubran las regiones de interés y luego clonarlas en un vector de
expresión apropiado. El análisis por deleción arroja sólo una indicación general de
la localización de una secuencia que regula la expresión génica. Debido a que
estas secuencias de control pueden unirse específicamente a proteínas
regulatorias, una manera de identificarlas es el tamizaje de secuencias que se
unen específicamente a proteínas. Esto incluye el uso de oligonucleótidos
sintéticos correspondientes a secuencias de una región que contenga una
secuencia regulatoria.
4.6 BIBLIOTECA DE GENES

Los procesos modernos de clonación de ADN ofrecen la posibilidad de realizar
amplias colecciones de clonas de ADN conocidas como bibliotecas de ADN, de
poblaciones de ADN extremadamente complejas, como por ejemplo, el ADN
110
genómico total humano. Este procedimiento permite que secuencias de ADN que
son muy raras en la población inicial estén representadas en una biblioteca de
clonas de ADN, en cuanto puedan ser aisladas individualmente por selección de
una colonia celular huésped y amplificándola. Dos variedades básicas de este
método son las que se ejecutan comúnmente: la construcción de bibliotecas de
ADN genómico y bibliotecas de ADNc.
Bibliotecas de ADN genómico.

Si el ADN de un organismo es sometido a la acción de una enzima de restricción,
se forman numerosísimos fragmentos con un grado de repetición determinado por
el número de células usado para preparar el ADN. Esos fragmentos pueden ser
ligados a un vector tratado con la misma enzima, de forma tal que se produce una
colección de moléculas de vector que llevan todos los tipos de fragmentos; esta
colección se llama genoteca genómica.
En el caso de eucariontes, como los mamíferos, todas las células nucleadas tienen
esencialmente el mismo contenido de ADN y con frecuencia es conveniente
preparar una biblioteca genómica a partir de células fácilmente accesibles, como
células sanguíneas. El material inicial es ADN genómico que ha sido fragmentado
previamente, por algún método, por lo general digestión con una enzima de
restricción. Típicamente el ADN se digiere con una enzima que corte 4 pb como la
MboI que reconoce la secuencia GATC. Esta secuencia esta presente
aproximadamente cada 275 pb en promedio sobre el ADN genómico humano, así
que habrá pocas secuencias de ADN que carecen del sitio de reconocimiento para
esta enzima.
Claramente, la digestión completa del ADN inicial con esta enzima producirá
fragmentos muy pequeños. Además, el número de cortes puede acortarse bajo
condiciones de restricción parcial (baja concentración de enzima, tiempo corto de
incubación, etc.). El corte ocurrirá solamente en un pequeño número de sitios de
restricción potenciales. Esto tiene el beneficio de que da la capacidad de producir
grandes filamentos para clonación. Importantemente, también permite
fragmentación al azar del ADN. Entonces, para la localización de una secuencia
específica, el patrón de restricción será diferente en copias diferentes de la misma
secuencia de ADN inicial.
La fragmentación al azar asegura que la biblioteca contenga mucha representación

del ADN inicial como sea posible. Adicionalmente, tiene la ventaja de que resulta
en clonas con insertos sobrepuestos. Como resultado, después de la
caracterización del inserto de una clona, se pueden hacer ensayos para llegar a las
clonas de la misma región general, identificando aquellas con insertos que
muestran algunas similitudes a la de la clona original.
Las genotecas genómicas son colecciones de fragmentos de ADN presentes en

colecciones de plásmidos o de fagos, que a su vez están contenidas en cultivos
bacterianos. Materialmente esa genoteca es un conjunto de cajas de Petri (20 o
más) con cultivos, donde cada colonia contiene un fragmento de ADN. La
111
genoteca también puede estar representada por improntas de cada cápsula,

hechas en una membrana, o por un único cultivo donde están mezcladas colonias
de bacterias conteniendo diferentes fragmentos. La cantidad de ADN usada para
crear la genoteca debe ser bastante mayor que un genoma para descontar las
fallas en las distintas etapas. Se considera que con 1/10 de mg de ADN (100 µg) es
factible hacer una genoteca genómica.
4.11 APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE

4.11.1 Medicinas génicas
Figura 4.12 Esquema de un proceso de producción de vacunas recombinantes
a) Obtención de proteinas de mamíferos

Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de
coagulación, etc. tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la
obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de
tejidos o fluidos corporales.
112
En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los

genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su
fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene
a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la
insulina humana.
b) Obtención de anticuerpos monoclonales
Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y
diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomas.
c) Obtención de vacunas recombinantes

El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos
patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como
la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la
mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen
de la proteína correspondiente.
4.11.2 Plantas trasgénicas

Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran
cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas
transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un
tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas
después de haber sido cosechados
a) Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas

Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la
resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen
una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos.
b) Incremento del rendimiento fotosintético

Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más
eficiente.
c) Mejora en la calidad de los productos agrícolas

Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados,
que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes.
d) Síntesis de productos de interés comercial

Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e
incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos
biodegradables
e) Asimilación de nitrógeno atmosférico

Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la
nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría
a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos
nitrogenados.
113
Figura 4.13 Se utiliza a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los

genes que se desean introducir en una célula vegetal, con lo que se transforma
dicha célula, la cual puede regenerar, por micropropagación, una planta entera que
será transgénica.
4.11.3 Animales transgénicos

Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: la
posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación,
manipular de forma específica la expresión génica in vivo, estudiar la función de
genes específicos, poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la
producción de proteinas humanas y la corrección de errores innatos de
metabolismo mediante terapia génica.
a) Transferencia nuclear
Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por
disgregación, se cultivan in vitro, y después se transfieren a ovocitos a los que se
les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo
que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo
éste empezar a funcionar como un zigoto.
b) Introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes (células ES) o
células embrionarias madres (células EM)
Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un
medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las
células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario.
114
Figura 4.14 Cerda Genie, que fabrica en su leche la proteina C humana que
controla la coagulación sanguínea y es necesaria para los hemofílicos.
4.11.4 Microorganismos modificados genéticamente

La introducción de ADN foráneo en un microorganismo da lugar a los
microorganismos transgénicos. La mayoría de microorganimos transgénicos son
bacterias unicelulares o levaduras.
Las bacterias y levaduras transgénicas se usan principalmente en la industria

alimentaría, en la producción de aditivos alimentarios, aminoácidos, péptidos,
ácidos orgánicos, polisacáridos y vitaminas. También se han aplicado en procesos
de bioremediación y, en medicina, se emplean ampliamente para producir
proteínas de interés como por ejemplo, la insulina.
Fabricar un transgénico unicelular es más fácil que producir una planta o animal
transgénico, ya que en éstos hay que asegurar la presencia del nuevo ADN en
todas las células del organismo.
115
Figura 4.15 Introducción de células embrionarias a blastocitos receptores.
Para desarrollar una bacteria transgénica, el gen de interés se incorpora en un

plásmido (ADN circular extracromosómico capaz de autoreplicarse) y se incuba
junto con la bacteria bajo condiciones específicas que favorecen la entrada del
plásmido en el interior de la bacteria. Si la bacteria retiene el plásmido y la proteína
que expresa el gen de interés no resulta tóxica para su desarrollo, se obtiene una
bacteria transgénica, con nuevas características determinadas por el gen
introducido. La bacteria más utilizada es la Escherichia coli. No obstante y a pesar
que su fácil manipulación, las bacterias no son siempre la mejor elección para
producir proteínas humanas. Algunas de éstas no son funcionales si no están
glicosiladas, es decir, si no se añaden azúcares a la cadena de aminoácidos, y este
proceso no lo pueden llevar a cabo las bacterias. En estos casos se utilizan
levaduras transgénicas, que sí son capaces de glicosilar. La producción de
levaduras transgénicas implica también el empleo de plásmidos, siendo la levadura
Saccharomyces cerevisiae la especie más empleada.
116
Aplicaciones de los microorganismos transgénicos

Investigación
Los microorganismos transgénicos son una herramienta de fundamental
importancia en investigación. La introducción en bacterias de plásmidos que
contienen un gen concreto a estudiar se realiza de forma rutinaria en los
laboratorios, ya sea con el objeto de tener un stock de dicho gen (mediante el
crecimiento de colonias que permiten tener gran cantidad de células que lo
contienen) o para expresar una proteína de interés. Estas bacterias transgénicas
ayudan a los científicos a entender mejor algunos procesos bioquímicos, la
regulación de genes y su función.
Producción de proteínas en medicina
Como ya se ha comentado, se han desarrollado bacterias E.coli capaces de
producir insulina humana, imprescindible para pacientes diabéticos. Antes del
empleo de bacterias transgénicas, la insulina se obtenía de vacas y cerdos, pero,
como su estructura difería ligeramente de la variedad humana, en algunos casos
provocaba una reacción alérgica. Las bacterias transgénicas han eliminado este
problema. Asimismo, la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha modificado
genéticamente para obtener insulina humana.
También se han desarrollado bacterias transgénicas para producir la hormona del
crecimiento, que se emplea para tratar a niños con enanismo. Otros usos en
medicina de los microorganismos transgénicos son la producción de vacunas,
anticuerpos, etc
Bioremediación
Existen microorganismos capaces de utilizar como nutrientes compuestos tóxicos o
peligrosos, como hidrocarburos, detergentes, bifenilos policlorados, etc, de forma
que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el medio ambiente. El
empleo de organismos vivos para degradar residuos se conoce como
bioremediación. La mayoría de aplicaciones biotecnológicas aplicadas al medio
ambiente utilizan microorganismos naturales, pero se están desarrollando
microorganismos transgénicos para eliminar materiales difíciles de degradar. Por
ejemplo, bacterias Pseudomonas transgénicas son capaces de degradar
compuestos polihalogenados. La investigación en este campo busca los enzimas
presentes en microorganismos naturales que son eficientes en el tratamiento de
compuestos tóxicos y determinar como pueden mejorarse mediante ingeniería
genética.
Industria alimentaria
Los microorganismos modificados genéticamente se emplean en la industria
alimentaria para producir aditivos alimentarios como edulcorantes artificiales y
aminoácidos con el propósito de incrementar la eficiencia y reducir su coste. Otros
productos de estos microorganismos son enzimas recombinantes que se emplean
en panadería, producción de cerveza, producción de queso (por ejemplo,
quimosina). También se aplican en procesos de fermentación, como por ejemplo el
empleo de levaduras transgénicas para desarrollar el sabor y aroma en la industria
de la cerveza.
117
Solari A.J. Genética Humana. Fundamentos y aplicaciones en Medicina. Editorial

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118

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NOTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L.

ADN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN

1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADN

El descubrimiento del principio de transformación en los núcleo celulares por

La bacteria del género Pneumococus provoca la muerte en ratones produciéndoles

Figura 1.1 Experimento de transformación de Avery y colaboradores

1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSAL

Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a células de E. coli, cuando estas se

del material genético.

Aunque se demostró claramente que el ADN es el material genético, el

Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase

Eucariontes: La discusión de los resultados de transmisión de Avery, son

Como en el caso de células mutantes (TK-) para la producción de Timidina kinasa

ADN que poseea el gen que la sintetiza

Los experimentos de transformación en células eucariotas se denominan como

Al inicio la técnica se realizaba únicamente en cultivos de células, pero más

1.3 COMPONENTES DEL ADN

Figura 1.3 Componentes del ADN.

y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timina

Figura 1.6 Esquemas de los azúcares presentes en las moléculas de ARN

1.4 LA DOBLE HÉLICE DEL ADN

1. Los datos de las fotografías de los rayos X,

2. La distancia entre nucleótidos adyacentes es 3.4 Aº, 10 nucleótidos por vuelta.

Pirimidina con pirimidina,

Purina con purina, muy

3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporción G y C es

El modelo también requiere de que las cadenas corran en direcciones opuestas

La cadena azúcar- fosfato se presenta en la parte exterior por fosfato cargado

Las bases se encuentran en la parte anterior, forman los escalones de la escalera

a). Puentes de hidrogeno entre las bases

1.5 REPLICACIÓN SEMICONSERVATIVA DEL ADN

Figura 1.9 Cada cadena sirve como

Menselson y Stahl (1958) realizaron el experimento con 3 generaciones continuas

Figura 1.10. Experimento de M. Meselson y F. Stahl para demostrar la hipótesis

1.6 CÓDIGO GENÉTICO: TRIPLETES

Tres nucleótidos = 1 aa trinucleótido = codón

El código genético es degenerado: un mismo aminoácido puede estar determinado

La lectura del ARN mensajero es continua, sin interrupciones. Cualquier pérdida o

Tres posibles maneras de leerse, lo que se conoce como Región de lectura.

Cuadro 1.1 Excepciones a la universalidad del código en eucariontes

1.7 MUTACIONES PUNTUALES CAMBIAN PARES DE BASES SENCILLAS

El tratamiento con ciertos compuestos pueden aumentar la ocurrencia de

Figura 1.12. Esquema de una mutación, puede deberse a un cambion en una

TRANSICIÓN: mutación puntual más común, se presenta por una sustitución de

Figura 1.13. Ejemplo de una transversión, por sustitución de bases, el bromutoacil

TRANSVERSIÓN: esta mutación es menos común, se presenta por sustitución de

Las mutaciones por sustituciones de bases, generalmente poseen algunas

Figura 1.14. Cuando el colorante naranja de acridina cambia la región de lectura el

1.8 TASAS DE MUTACIÓN

Las mutaciones silenciosas: no tienen un efecto aparente en el fenotipo. Se puede

Cuadro 1.2 Algunos valores de tasas de mutaciones puntuales en los organismos

Drosophila melanogaster Letalidad 2.6 x 10-5

1.9 TOPOLOGÍA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

El número de pares de bases por cada vuelta en la molécula de ADN no es

Ciertas secuencias tienen la propiedad de adoptar una confirmación alterna de

Este último punto es de mucha importancia, desde la perspectiva de su función en

la replicación y expresión como proteína, para lo cual no se rompen los enlaces

Este proceso de separación de las bandas es llamado DESNATURALIZACIÓN.

HIPOCROMICIDAD: se da por desnaturalización.

El valor exacto de Tm depende de la proporción de pares de bases G – C ya que

Esta relación entre Tm y la composición en pares de bases es lineal.

La fuerza iónica de la solución tiene también un efecto fuerte en la Tm.

La desnaturalización del ADN es reversible bajo condiciones apropiadas. Esta