UNIVERSIDAD DE GUYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS

CARRERA DE OBSTETRICIA

TEMA:

Producción de insulina por medio de

técnica de ADN recombinante

AUTORES:

Cristina Navarrete
Jonathan Velez Morante
Paula Lacano
Naomi Moreno
Fabrizzio Espinoza
Jeny Torres
Melissa Espinoza
Contenido
Introducción ...................................................................................................................... 2
Objetivo General: ....................................................................................................... 3
Objetivos específicos: .................................................................................................. 3
Marco teórico .................................................................................................................... 4
Diabetes Mellitus: tipos, factores de riesgo y sintomatología ................................. 4
Diabetes tipo 1 ............................................................................................................. 4
Factores de riesgo para diabetes tipo 1...................................................................... 5
Tratamiento para diabetes tipo 1 ............................................................................... 7
Diabetes tipo 2 ............................................................................................................. 7
Síntomas de diabetes tipo 2 ....................................................................................... 9
Factores de riesgo para diabetes tipo 2...................................................................... 9
Tratamiento para diabetes tipo 2 ............................................................................. 10
Diabetes gestacional .................................................................................................. 10
Síntomas de la diabetes gestacional ........................................................................ 11
Factores de riesgo para diabetes gestacional ........................................................... 11
Manejo y tratamiento de diabetes gestacional......................................................... 12
El páncreas y la secreción de insulina ..................................................................... 13
Las células Beta ....................................................................................................... 13
Biosíntesis y acciones de la insulina ....................................................................... 13
Producción de insulina humana .............................................................................. 16
Clonación de ADN Y ADN recombinante .............................................................. 16
Enzimas de restricción ............................................................................................ 17
Usos de las enzimas de restricción .......................................................................... 18
Técnica aplicada en la producción de insulina ........................................................ 19
Conclusión ...................................................................................................................... 21
Referencias ..................................................................................................................... 21
 Introducción

La diabetes mellitus es una enfermedad crónica que se caracteriza por la incapacidad

de un individuo para metabolizar glucosa de manera normal lo que se conoce como
hiperglucemia. Esta se da como consecuencia de la escasa insulina producida en las
células beta del páncreas.

Hasta 1983 toda la insulina utilizada para el tratamiento de la diabetes era extraída de
páncreas de porcino y bovino, sin embargo, el uso prolongado de este tipo de insulinas
provocaba, en algunos individuos alergias y su uso a largo plazo una respuesta inmune.
Además, la disponibilidad de páncreas de los animales mencionados era otro punto en
contra ya que era muy limitada, por lo que es necesario la obtención y uso de insulina
humana.

La obtención de insulina por técnica de ADN recombinante fue posible gracias a la

biotecnología junto con la ingeniería genética.

La ingeniería genética también conocida como modificación genética o manipulación

genética es un conjunto de metodologías que permiten el aislamiento, caracterización y
manipulación del material genético de los seres vivos. Esta nos permite introducir un gen
en el genoma de un individuo que carece de este gen en específico o también nos permite
modificarlo en caso de que este gen sea defectuoso, para que por consecuente este
individuo sea dotado de nuevas facultades.

En 1978 se logró la clonación en dónde se produjo una gran cantidad de copias

idénticas de bacterias capaces de producir insulina para que fuese utilizada por las
personas con la enfermedad de la diabetes sin embargo no fue hasta 1982 que se pudo
comenzar la insulina producida por las bacterias.
Objetivo General:

 Investigar sobre esta nueva técnica para producción de insulina y sus

aplicaciones con el objetivo de incluir una nueva forma de tratamiento a los
pacientes con Diabetes.

Objetivos específicos:

 Determinar como es el tratamiento actual de la Diabetes y como esta se

presenta.
 Conocer el proceso de producción de insulina humana para entender porque
existen anomalías en este procedimiento.
 Identificar como se obtiene insulina a partir de la modificación del ADN.

Justificación:

La obtención de insulina por medio de ingeniería genética no es algo inexplorado en las

últimas décadas; sin embargo, hemos notado que en Ecuador la producción de insulina

por medio de ingeniería genética aún no ha sido desarrollada, ya que no existe ningún

laboratorio nacional donde se fabrique, por lo que debe ser importada por industrias

extranjeras.

El desarrollo de esta clase de tecnología en nuestro país podría considerarse como un

avance muy importante ya que abriría las puertas a futuros desarrollos científicos

relacionados con la genética.

Marco teórico

Diabetes Mellitus: tipos, factores de riesgo y sintomatología

La diabetes mellitus se describe como un trastorno metabólico del organismo para

asimilar la glucosa por la falta de insulina. La insulina, una hormona que produce el
páncreas, ayuda a que la glucosa de los alimentos ingrese en las células cuerpo para
posteriormente ser usada como energía. En la diabetes, el cuerpo no produce suficiente o
nada de insulina o no la usa adecuadamente y la glucosa se queda en la sangre por
consecuente no llega a las células por lo que podríamos adjetivar a la diabetes como una
enfermedad que poco a poco va a ir afectando a todo el organismo. La hiperglucemia
crónica de la diabetes se asocia con complicaciones a largo plazo, disfunción y falla de
varios órganos, especialmente de los ojos, riñones, nervios, vasos sanguíneos y corazón.

La diabetes es una enfermedad progresiva que posee tratamiento, pero no cura y la

velocidad con la que esta va a progresar depende de la velocidad de la destrucción de las
células beta que se localizan en los islotes de Langerhans.

La OMS clasifica a la diabetes como: diabetes mellitus insulinodependiente (diabetes

tipo 1) y diabetes mellitus no insulinodependiente (diabetes tipo 2); además se añaden a
la diabetes gestacional, intolerancia a la glucosa y un último grupo denominado “otros
tipos de diabetes”

Diabetes tipo 1
La diabetes tipo 1 se debe a una falta grave de insulina provocada por la destrucción de
células ß-pancreáticas mediada inmunológicamente. Se evoluciona más frecuentemente
en la infancia, se empieza a expresarse en la pubertad y avanza con la edad. La diabetes
tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que la destrucción de los islotes está
ocasionada primordialmente por linfocitos T que reaccionan contra antígenos de las
células ß. Primero describiremos los mecanismos de destrucción de las células ß y
después explicaremos las hipótesis actuales sobre los factores que desatan el ataque
autoinmune contra dichas células .
Esta forma de DM se da de forma hereditaria, carece de evidencia de autoinmunidad
inmunológica.

A pesar que el inicio clínico de la diabetes tipo 1 es violento, esta enfermedad, es el

producto de un ataque autoinmune crónico sobre las células ß que generalmente empieza
muchos años antes de que la enfermedad se muestre. Las manifestaciones clásicas de la
enfermedad: hiperglucemia y cetosis se muestran en etapas avanzadas de su desarrollo,
cuando la destrucción afecta a más del 90% de las células muchos mecanismos aportan
a la destrucción de estas células:

1. Los linfocitos T reaccionan contra los antígenos de las células ß, provocando deterioro
celular. Estas células T comprende CD4+ y CD8+.

2. Producción local de citoquinas que dañan las células ß. Se ha demostrado que todas
estas citoquinas inducen la apoptosis de células ß en cultivos.

3. En la sangre del 70 al 80% de los pacientes también se puede observar autoanticuerpos

contra los islotes celulares y contra la insulina. Estos autoanticuerpos pueden participar
en el desarrollo de la enfermedad o pueden ser el resultado de la lesión celular mediada
por células T y la liberación de antígenos normalmente secuestrados.

Es probable que muchos de estos mecanismos inmunes actúen juntos para producir la
progresiva destrucción de las células ß, conduciendo al desarrollo de diabetes clínica.

Los síntomas de la diabetes tipo 1 son:

 Constante necesidad de orinar

 Sed inusual

 Hambre extrema

 Pérdida inusual de peso

 Fatiga e irritabilidad extremas

Factores de riesgo para diabetes tipo 1

 Susceptibilidad genética

La diabetes tipo 1 tiene un complejo patrón de asociación genética, y se han

establecido supuestos genes de susceptibilidad al menos en 20 localizaciones.
Muchas de estas asociaciones se dan en regiones cromosómicas, y los genes
específicos afectos no se conocen aún. De las múltiples regiones asociadas con la
enfermedad, con diferencia la más importante es el locus MHC clase II (HLA);
de acuerdo con algunas estimaciones, el MHC contribuye aproximadamente en
un 50% de la susceptibilidad genética, y el conjunto de los genes restantes la otra
mitad. Dentro de los genes diferentes al MHC cabe destacar el gen de la insulina,
cuyas repeticiones en tándem en la región promotora se asocian con la
susceptibilidad a la enfermedad. Es posible que el polimorfismo asociado a la
enfermedad haga que la proteína sea menos funcional o estable y, por lo tanto,
comprometa la reserva funcional. Recientemente, otro gen se ha asociado con la
enfermedad, codificando el receptor inhibidor de las células T CTLA-4. Los
pacientes diabéticos muestran un aumento de frecuencia de un transcrito
alternativo que puede alterar la capacidad normal de este receptor para mantener
a los linfocitos T autorreactivos bajo control.

 Factores ambientales

Hay evidencia de que los factores ambientales, especialmente las infecciones,

están involucrados en el desencadenamiento de la autoinmunidad en la diabetes
tipo 1 y en otras enfermedades autoinmunes. Los estudios epidemiológicos
sugieren un papel de los virus, como son el coxsakievirus del grupo B, las paperas,
el sarampión, el citomegalovirus, la rubéola o la mononucleosis infecciosa. Se han
descrito dos posibilidades para mostrar la asociación entre las infecciones y la
diabetes. La primera vía patogénica se basa en que las infecciones inducen lesión
tisular e inflamación, provocando la liberación de antígenos de las células ß y el
reclutamiento y activación de linfocitos y otros leucocitos inflamatorios en los
tejidos. La segunda posibilidad es que los virus produzcan proteínas que se
asemejen a los autoantígenos y la respuesta inmune frente a estas proteínas
ocasione reacciones cruzadas frente a los tejidos propios.
Tratamiento para diabetes tipo 1

El tratamiento de la diabetes se basa en llevar el control de la enfermedad y de las

complicaciones derivadas de ella. En un primer lugar van a ser de mayor importancia
todos aquellos aspectos relacionados con el comportamiento del individuo. Los objetivos
del tratamiento son:

1. Conseguir niveles adecuado de glucosa en sangre.

2. Conseguir niveles óptimos de lípidos.

3. Dieta adecuada en calorías para conseguir un peso razonable, un crecimiento y

desarrollo normales y un embarazo y lactancia adecuados.

4. Evitar sedentarismo y tabaco.

5. Mejorar la salud mediante una nutrición óptima.

En el caso de la diabetes tipo 1 el tratamiento más común es la insulinoterapia. El objetivo

principal es aportar la hormona y conseguir una disminución de la hemoglobina
glicosidada, la cual nos muestra el control metabólico del paciente en periodos de tiempo
de hasta 3 meses. Según el tipo de diabetes, el momento de aparición y la severidad de la
enfermedad, se emplean pautas diferentes en la administración subcutánea de insulina.
En el inicio del tratamiento con insulina es preferible la pauta de 2 dosis al día salvo en
edades avanzadas. La dosis inicial sería de 0,50 U/kg/día, aumentando con prudencia a
2-4 U/día durante al menos 2 días. En la pauta inicial el reparto puede ser de 2/3 de la
dosis antes del desayuno y 1/3 antes de la cena. Es importante saber que en pacientes de
edad avanzada sólo se deberá administrar una dosis.

Diabetes tipo 2
Los dos defectos metabólicos que caracterizan la diabetes tipo 2 son: un descenso de la
capacidad de los tejidos periféricos para responder a la insulina que es resistencia a la
insulina y disfunción de las células ß que se manifiesta por una secreción inadecuada de
insulina en el contexto de resistencia a la insulina e hiperglucemia. En la mayoría de los
casos, la resistencia a la insulina es el primer evento, seguida por grados crecientes de
disfunción de las células ß.

Los factores ambientales, tales como el estilo de vida sedentario y los hábitos dietéticos,
desempeñan claramente un papel importante. Sin embargo, los factores genéticos son
incluso más importantes que en la diabetes tipo 1. A diferencia de la diabetes tipo 1, la
enfermedad no se relaciona con los genes implicados en la tolerancia y regulación
inmunitaria, y no hay evidencia que sugiera una base autoinmune en la diabetes tipo 2.

Resistencia a la insulina: Consiste en la resistencia a los efectos de la insulina sobre la

captación, metabolismo o almacenamiento de la glucosa. Es un hecho característico de la
mayoría de los pacientes con diabetes tipo 2. El papel de la resistencia a la insulina en la
patogenia de la diabetes tipo 2 puede demostrarse por los siguientes hallazgos: 1.- la
resistencia a la insulina se detecta a menudo de 10 a 20 años del inicio de la enfermedad
en pacientes predispuestos y, 2.- Esta resistencia conduce a un descenso en la captación
de glucosa en el músculo y en el tejido adiposo, y a una incapacidad de la hormona para
suprimir la neoglucogénesis hepática. Algunos de los mecanismos probables que
intervienen en este aumento de la resistencia a la insulina son los siguientes:

Obesidad y resistencia a la insulina: Se ha comprobado que en los excesos de grasa existe

una alteración de la señalización de la insulina, incluso en casos de obesidad simple no
acompañada de hiperglucemia. En este aumento de la resistencia a la insulina se han
implicado distintos mecanismos, como son el exceso de ácidos grasos libres y su papel
lipotóxico, diversas proteínas liberadas a la circulación sistémica por el tejido adiposo
adipocinas o el papel del recepto gamma activado por el proliferador peroxisómico y
tiazolidinedionas .

Disfunción de las células ß: Esta disfunción refleja la incapacidad de las células para
adaptarse a las demandas a largo plazo de la resistencia a la insulina periférica y al
incremento de la secreción de insulina. En los estados de insulinorresistencia, la secreción
de insulina es inicialmente mayor para todos los niveles de glucosa que en los controles.
Finalmente, sin embargo, la compensación de las células ß comienza a ser inadecuada, y
se produce la progresión a diabetes. La base subyacente a este fallo de adaptación de las
células ß se desconoce, aunque se especula que diversos mecanismos, incluyendo los
efectos adversos de las altas concentraciones circulantes de ácidos grasos libres o la
hiperglucemia crónica, pueden desempeñar un papel.
Síntomas de diabetes tipo 2

 Cualquiera de los síntomas de la diabetes tipo 1

 Infecciones frecuentes

 Visión borrosa

 Cortes/moretones que tardan en sanar

 Hormigueo o entumecimiento en las manos o los pies

 Infecciones recurrentes de la piel, encías o vejiga

Factores de riesgo para diabetes tipo 2

 Obesidad, sobrepeso y obesidad abdominal.

La obesidad y sobrepeso el riesgo de intolerancia a la glucosa y Diabetes tipo 2

en todas las edades. Actúan induciendo resistencia a la insulina. Más del 80 % de
los casos de DM2 se atribuye a la obesidad, y su reversión también existe menos
el riesgo y mejora el control glucémico en pacientes con DM establecida.

 Sedentarismo

Un estilo de vida sedentario disminuye el gasto de energía y promueve el aumento

de peso, lo que aumenta el riesgo de DM2. Entre las conductas sedentarias, por
ejemplo ver la televisión mucho tiempo induce a el desarrollo de obesidad y DM.
La actividad física de intensidad moderada reduce la incidencia de nuevos casos
de DM2.

 Tabaquismo

El consumo de tabaco se asocia a un mayor riesgo de DM2 dependiente dosis

(cuantos más cigarrillos, mayor riesgo). Dejar de fumar puede reducir el riesgo de
DM. El beneficio es evidente cinco años después del abandono, y se equipara al
de los que nunca fumaron después de 20 años.
  Patrones dietéticos

Se caracteriza por una dieta de un alto consumo de carnes rojas o precocinadas,

productos lácteos altos en grasa, refrescos azucarados, dulces y postres se asocia
con un mayor riesgo de DM2, actividad física, edad o antecedentes familiares.

Tratamiento para diabetes tipo 2

Para pacientes con diabetes tipo 2, la principal opción terapéutica son los
hipoglucemiantes orales. Existen diferentes fármacos con distinta función, cuyo objetivo
final será disminuir los niveles plasmáticos de glucosa. Según la función que busquemos,
podemos emplear los siguientes medicamentos:

1. Sensibilizar cuerpo a insulina: Thiazolidinedionas o bisguanidas.

2. Controlar la producción de glucosa hepática: Thiazolidinedionas o bisguanidas.

3. Estimular al páncreas a producir más insulina: Meglitinidas o sulfonilureas.

4. Retrasar la absorción de carbohidratos: inhibidores a-glicosidasa.

5. Aumentar la captación periférica de glucosa: insulina.

Además, en estos pacientes será necesario una monitorización de los siguientes

parámetros: la presión arterial y los pies en cada visita, y un examen de la microalbúmina,
de los niveles de lípidos y de los ojos una vez al año.

Diabetes gestacional

La diabetes gestacional se refiere a toda intolerancia a los hidratos de carbono de

intensidad variable, de comienzo o primer reconocimiento durante la gestación. La
diabetes gestacional puede causar problemas de salud tanto en la madre como en el bebé.
Es de vital importancia diferenciarla de los casos de mujeres con diabetes previa que se
embarazan, en especial por la evaluación y búsqueda de daños preexistentes a órganos
blancos desde la primera consulta prenatal, así como el seguimiento.

Síntomas de la diabetes gestacional

Se dan una serie de razones para identificar a estas mujeres durante la gestación, entre las
más destacadas se encuentran las siguientes:

 Algunas gestantes presentan una hiperglucemia importante y requieren

tratamiento insulínico de inmediato

 Los fetos tienden a presentar macrosomía, además de alteraciones tales como:

hipoglucemia neonatal, hipocalcemia, policitemia e hiperbilirrubinemia, lo que se
traduce en una mayor morbimortalidad.

 Los recién nacidos tienen tendencia a la obesidad, dislipemia y diabetes en edad

adulta

 Las madres con DMG presentan una mayor incidencia de diabetes en años
posteriores: entre un 25 y un 70 % de ellas serán diabéticas al cabo de 25 años de
seguimiento

Factores de riesgo para diabetes gestacional

Los factores de riesgo para la Diabetes Gestacional están en estrecha relación con el
incremento progresivo de la obesidad y del síndrome metabólico, por tanto enumeramos
los siguientes a tener en cuenta en la evaluación de la paciente embarazada:

 Obesidad o sobrepeso.

 Antecedentes familiares de DM tipo 2.

 Antecedentes personales de DMG: recién nacidos macrosómicos (4 kg o más),

abortos repetidos, mortinatos o recién nacidos fallecidos en la primera semana,
polihidramnios, hipertensión arterial (HTA), dislipidemia hiperinsulinemia,
síndrome de ovario poliquístico (tratado o no), acantosis nigricans.
  Presencia de glucosuria y/o glucemia en ayunas igual o mayor de 92 mg/dL
durante el embarazo actual.

 Uso de fármacos antihiperglucemiantes previamente o en la actualidad.

 Mujeres con etnicidad diferente a los grupos en los cuales se ha descrito

aumento de riesgo, como los hispanos y asiáticos en los Estados Unidos.

Manejo y tratamiento de diabetes gestacional

Para evitar complicaciones fetales, se debe tomar non stress test y perfil biofísico en
gestantes diabéticas cercanas al término o que se encuentren en las últimas semanas de
embarazo. El doopler de arteria umbilical no ha mostrado ser útil en asegurar un bienestar
fetal en la gestante diabética, a menos que curse con pree-clampsia o retardo del
crecimiento intrauterino, pues está claro que la asfixia no es secundaria a insuficiencia
placentaria .El embarazo en la paciente diabética ocasiona mayor resistencia a la insulina,
lo cual incrementa la hiper-glicemia gestacional y hace necesario el manejo con insulina,
para mantener un adecuado control glicémico postprandial y así evitar las complicaciones
fetales como aborto o macrosomía .En las maternas con diabetes mellitus de “novo” se
inicia dieta estricta baja en carbohidratos, en caso de continuar con intolerancia a la
glucosa se adiciona insulina. Las insulinas más utilizadas son las de acción rápida, entre
ellas, la insulina lispro y la aspart. La terapia con hipoglicemiantes orales, ha mostrado
efectividad en la gestante diabética durante el segundo y tercer trimestre, pero no son la
primera opción porque atraviesan la placenta. El más estudiado es la metformina, que no
ha mostrado diferencias en complicaciones perinatales cuando se compara con la insulina.

El tratamiento de la diabetes gestacional se basa en un plan nutricional, el estar

físicamente activos y al compromiso del paciente de realizar monitoreo permanente de
sus glucometrías. Uno de los objetivos del equipo médico es que se mejore el estilo de
vida de la paciente, y para ello se debe estar a la vanguardia de la tecnología, la cual cada
día nos ofrece nuevas formas de manejo y monitoreo como las bombas de insulina.
 El páncreas y la secreción de insulina

El páncreas es una glándula de secreción mixta situada en abdomen superior por detrás
del estómago. Su función exocrina es fundamental en la digestión ya que segrega amilasa
y lipasa, importantes para la descomposición de grasas y proteínas; en su función
endocrina u hormonal, el páncreas desempeña una función esencial en la regulación del
metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas.

La función endocrina del páncreas se realiza en los Islotes de Langerhans los cuales
se componen de cuatro tipos de células fundamentales que son: las células Alfa
productoras de glucagón, las células Beta productora de insulina, las células delta que
producen somatostatina y las células PP productoras de polipéptidos.

Las células Beta

Una característica particular de las células beta es su plasticidad, la cual les permite
adaptarse a cambios en la homeostasis metabólica. La masa celular de las células beta es
regulada por cuatro mecanismos que son: apoptosis, hipo o hiperplasia, división mitótica
y neogenesis.

La insulina en las células beta es fabricada por etapas. La primera etapa consiste en la
producción de una molécula llamada proinsulina formada por una cadena proteínica de
81 aminoácidos, que es precursora de la insulina. Las células Beta del páncreas procesan
la proinsulina convirtiéndola en insulina por la sustracción enzimática del péptido C, que
es una estructura de 30 aminoácidos que conecta las cadenas A y B (Andrew C.
Silverthon)

Biosíntesis y acciones de la insulina

La insulina es sintetizada como una sola cadena polipeptídica en el retículo endoplásmico
rugoso: la preproinsulina. Esta proteína se encierra en microvesículas en las cisternas del
retículo endoplásmico, donde sufre algunas modificaciones en su estructura, con el
plegamiento de la cadena y la formación de puentes disulfuro. Se forma así la molécula
de proinsulina que se transporta al aparato de Golgi, donde se empaqueta en gránulos de
secreción.

Durante la maduración de estos gránulos, la proinsulina es atacada por enzimas

proteolíticas que liberan la molécula de insulina y el péptido C. Estos gránulos que
contienen cantidades equimolares de insulina y péptido C, además de una pequeña
proporción de proinsulina sin modificar, son expulsados por un complejo sistema de
microtúbulos y microfilamentos hacia la periferia de las células β. Cuando se fusiona la

membrana del gránulo con la membrana celular se disuelven ambas en el punto de

contacto y se produce la exocitosis del contenido del gránulo

Las células β de los islotes pancreáticos funcionan como un sensor energético en general
y de la glucemia en particular, lo que les permite integrar simultáneamente señales de
nutrientes y moduladores.

La llegada del alimento al tubo digestivo y su posterior absorción se acompaña de

numerosas señales que son: aumento de los niveles de glucosa y de otros metabolitos en
plasma, secreción de algunas hormonas gastrointestinales, activación de nervios
parasimpáticos, etc. Todas estas señales controlan la secreción de insulina (Fortich
Revollo)

La insulina actúa a nivel celular, uniéndose a su receptor de membrana.

El contenido de receptores de insulina es variable, su número aumenta en células de

respuesta al metabolismo energético: músculo, hígado y tejido adiposo.

En el hígado:

 Incrementa la actividad y estimula la síntesis de la glucocinasa, favoreciendo la

utilización de la glucosa.

 Aumenta la vía de las pentosas que aporta NADPH al estimular a la Glucosa-6-

fosfato deshidrogenasa.

 Aumenta la glucólisis por estimulación de la glucocinasa, fosfofructocinasa I y de

la piruvatocinasa.
  Favorece la síntesis de glucógeno, estimulando la actividad de la glucógeno
sintetasa (GS).

 Reduce la gluconeogénesis, al disminuir principalmente la síntesis de la fosfo-

enol-piruvato-carboxi-cinasa (PEPCK).

 Estimula la síntesis de proteínas.

 Aumenta la síntesis de lípidos, al estimular la actividad de la ATP

 citrato liasa, acetil-CoA-carboxilasa, “enzima málica” y de la hidroximetil-glutaril-

CoA reductasa.

 Inhibe la formación de cuerpos cetónicos.

En el tejido muscular:

 Estimula la entrada de glucosa (por translocación de los GLUT 4 hacia la

membrana).

 Aumenta la glucólisis por estimulación de la fosfofructocinasa I y de la

piruvatocinasa.

 Estimula la síntesis de glucógeno al estimular la actividad de la GS.

 Favorece la entrada de aminoácidos a la célula y su incorporación a las proteínas,

estimula la síntesis e inhibe el catabolismo de proteínas.

 Estimula la captación y utilización de los cuerpos cetónicos.

 La insulina estimula la bomba Na+/K+, lo que favorece la entrada deK+ a las

células.

En el tejido adiposo:

 Estimula la captación (GLUT 4) y utilización de glucosa por el adipocito.

 Aumenta la vía de las pentosas que aporta NADPH al estimular a la glucosa-6-

fosfato deshidrogenasa.
  Favorece la captación de ácidos grasos al estimular a la enzima lipoproteínalipasa
1, que degrada los triglicéridos contenidos en las lipoproteínas.

 Estimula la síntesis de triglicéridos (al promover la glucólisis y la vía de las

pentosas) e inhibe los procesos de lipólisis, por lo que se favorece la acumulación
de éstos en los adipocitos.

(Fortich Revollo, s.f.)

Producción de insulina humana

Clonación de ADN Y ADN recombinante

Clonar significa tener una copia exactamente igual al sujeto original. En el caso del ADN
tendríamos una copia exacta del mismo, es decir, un ADN nuevo con las mismas pares
de bases nitrogenadas ubicadas en el orden del modelo.

Este proceso de clonado no es nuevo, se realiza a diario por la mayoría de células de

nuestros cuerpos durante la replicación (una fase del ciclo celular), en donde el ADN es
duplicado mediante el uso de enzimas que lo dividen en dos hebras y empiezan a formar
la cadena complementaria para cada una.

El ADN recombinante es una cadena artificial de material genético producida por la unión
de genes de dos o más ADN diferentes, mediante ingeniería genética para su ulterior uso.
Se usa esta técnica con varios fines, pero por lo general es para la producción en masa de
algún producto proteico o para terapia génica.

Para la formación de ADN recombinante es requerido un vector de clonación, una

molécula de ADN que se replica en una célula viva. Los vectores generalmente son
derivados de plásmidos o virus, y representan segmentos relativamente pequeños de ADN
que contienen señales genéticas necesarias para la replicación, así como elementos
adicionales de conveniencia para insertar ADN foráneo, identificando células que
contienen ADN recombinante y, cuándo y dónde sea apropiado, siendo capaz de expresar
el ADN foráneo. El tipo de vector que se utilizará para clonación molecular depende en
la elección del organismo huésped, el tamaño de ADN que será clonado y de la manera
en la que el ADN foráneo será expresado.

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se
podría decir que son “tijeras moleculares” las cuales van a cortar el ADN y lo hacen en
una forma específica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del
ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia
específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima
reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno
de esa secuencia.
Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:

•Enzimas que generan “extremos romos” (parejos)

•Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos

“colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena
simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir
los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando

extremos romos o extremos cohesivos.
Los extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la
enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada
recombinante.

El origen de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, conocidas también como endonucleasas, sólo cortan el ADN
si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Estas enzimas fueron
descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran sólo en organismos
procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de
donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restricción que se descubrieron en la
bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que
se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan
letras y números romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco “erre” “uno”). Así, el sitio de
restricción para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustración anterior.
Una vez que la enzima encontró ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y
realiza el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron
cientos de enzimas de restricción distintas y cada una reconoce una región específica.
Estas enzimas fueron descubiertas en la década del ’70 y hasta la fecha existen más de
250 enzimas de restricción. Se cree que la función natural de estas enzimas en las
bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podrían ingresar en sus células. De esta
manera, la bacteria utiliza estas “tijeras moleculares” para cortar en pedacitos el ADN
viral que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene “protegido”
contra sus propias enzimas de restricción.

Usos de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia
en investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología
moderna:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con
varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios
de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.

2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos

después de la actuación de las distintas enzimas de restricción se pueden separar por
tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos.
Por ejemplo: para la técnica de Southern blotting (ver cuaderno Nº 67) o en las usadas
para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos
 3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear
ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y, con el
mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen
con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN
recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que
expresen el gen de interés clonado (si se usó un vector de expresión con el promotor
adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado (“guardado”) ese fragmento
de ADN de interés. Por ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas.

Técnica aplicada en la producción de insulina

La tecnología de ADN recombinante nos ha permitido producir insulina usando bacterias,

para esto se sigue un método que se procederá a detallar en breve.

Para producir la insulina por este medio se extrae el gen que codifica la insulina del ADN
de un humano, mediante enzimas de restricción que cortan el gen especifico sin quitar la
funcionalidad. Luego se sintetizan químicamente las secuencias de ADN correspondiente
a las cadenas polipeptídicas A y B (de la insulina).

El plásmido que se utiliza para esta técnica es el plásmido recombinante pBR322 que
proviene de la bacteria E. coli y es modificada para su uso. Contiene genes para las
enzimas de resistencia a antibióticos: la tetraciclina (gen tetA) y la ampicilina (gen
ampR), así como diferentes endonucleasas de restricción que pueden cortar el plásmido
en lugares de corte específicos.

Las cadenas polipeptídicas poseen dos sitios de corte, mientras que el plasmido posee uno
solo. Los extremos libres de cada cadena encajan perfectamente en el espacio que deja el
sitio de corte que dejó la enzima de restricción que se usó en el plasmido, uniéndose por
completo mediante la adición de ADN ligasas.

Una vez completo el vector, es puesto en una solución en donde hay bacterias de E. coli.
Para que el vector pueda entrar al citoplasma de la bacteria, se procede a dar un choque
térmico o eléctrico que produce poración de la membrana celular temporalmente, y
permite el ingreso del plasmido.
Las bacterias son puestas en campos de cultivos a los que se les añade nutrientes y
antibióticos. De manera que las colonias que puedan formarse, sean solo las bacterias que
han asimilado el vector, ya que este tiene genes que permiten resistir al antibiótico usado.

Sin embargo, existen complicaciones ya que las bacterias que pudieron formar colonias
pudieron o no haber asimilado el plásmido con el gen que codifica la insulina humana,
puesto que no tenemos manera de hacer que el gen sea insertado en el vector en la
dirección correcta, incluso pudo no haberse insertado debido a que los extremos libres del
plásmido se volvieron a conectar.

Para resolver este inconveniente se realizan pruebas para revisar los plásmidos de las
bacterias tales como la PCR y la digestión por enzimas de restricción.

Se separan las colonias que si asimilaron el vector correcto y se procede a hacer un cultivo
más grande. Cuando se alcanza la cantidad requerida de bacterias, se las induce
químicamente para que produzcan la insulina.

Se procede a lisar las bacterias para que liberen toda la proteína que fabricaron y se la
almacena para su posterior purificación. La lisis de las bacterias no solo deja la insulina
producida, sino también muchas otras proteínas y macromoléculas así que hay que
“filtrarla”.

Hay varias técnicas que pueden ser usadas entre ellas la cromatografía por afinidad, la
cual consiste en hacer fluir una mezcla de moléculas extraídas de las bacterias lisadas a
través de una columna, un cilindro que contiene perlas. Las perlas están recubiertas con
un anticuerpo. El anticuerpo de la columna está diseñado para unirse a nuestra proteína
de interés y no a cualquier otra molécula de la mezcla. De esta manera, la columna retiene
la proteína de interés, mientras que las otras moléculas son arrastradas por el flujo.

En la etapa final, la insulina se libera de la columna y se recolecta. Las cadenas resultantes

se unen mediante una reacción que forma puentes de disulfuro y se obtiene insulina
humana pura. El producto final, la insulina humana biosintética, es idéntica en todos los
aspectos a la insulina purificada del páncreas humano.
Conclusión

Melissa Espinoza:
En resumen, la diabetes mellitus es una enfermedad crónica caracterizada por la
incapacidad del individuo para metabolizar glucosa de manera normal, debido a una
deficiencia total o parcial de la hormona insulina, por lo que, en algunos casos, los
pacientes diabéticos pueden ser controlados mediante la aplicación de insulina.
La técnica de ADN recombinante para la producción de insulina consiste en producir por
separado ambas cadenas para, posteriormente, asociarlas químicamente. Por lo tanto, esta
tecnología sería de gran ayuda para el tratamiento de la Diabetes.

Referencias
Andrew C. Silverthon, M. (s.f.). Fisiología humana: un enfoque integrado .
Fortich Revollo, Á. J. (s.f.). Obtenido de https://www.endocrino.org.co/wp-
content/uploads/2015/10/Fisiologia_de_la_Secrecion_de_Insulina_AJ_Fortich.p
df
Ladisch', M. R., & Karen L. Kohlmann. (1992). Recombinant Human Insulin.
Flores, Beatriz . 1994. Producción de insulina humana por técnicas de ADN
recombinante. Ciencias, núm. 34, abril-junio, pp. 61-62. [En línea].