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GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA
REPRESENTANTE DE CALIDAD DIRECCIÓN
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
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1. OBJETIVO

Establecer una guía de las actividades para la validación de métodos de ensayo

normalizados y empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los
métodos normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede
aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Regular o sistematizar los métodos para la validación de las instrucciones de ensayo y de
calibración.

El objetivo de la validación es probar la aptitud de los métodos, así como la capacidad del
laboratorio. La validación se apoya en los parámetros estadísticos del procedimiento.

Los procedimientos y el alcance de la validación no son siempre los mismos y deben ser
establecidos individualmente.

2. ALCANCE

Esta guía se debe aplicar a todos los métodos de ensayo establecidos en el Laboratorio de
Salud Pública del Meta.

3. DEFINICIONES

• Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se

han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación especifica prevista.
• Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se
han cumplido los requisitos especificados.
• Valor Verdadero Convencional (De una Magnitud): Valor atribuido a una
magnitud particular, y aceptado a veces por convención, porque la representa, con
una incertidumbre apropiada, para un fin dado.
• Mesurando: Magnitud particular sometida a medición.
• Incertidumbre de Medida: Parámetro asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonables atribuidos al
mesurando.
• Exactitud de una Medición: Proximidad entre el resultado de una medición y el
valor verdadero del mesurando.
• Repetibilidad (De los Resultados de las Mediciones): Proximidad entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las
mismas condiciones de medición. (Aplicación de un mismo procedimiento, a un
mismo objeto, por le mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo
equipamiento instrumental, en el mismo lugar).
• Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo
mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de medición.
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• Precisión Intermedia: Magnitud que relaciona la variación en los resultados

observados cuando uno o más factores, tales como tiempo, equipamiento, operador,
varían dentro de un mismo laboratorio.
• Límite de Detección: Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con
cierto nivel de confianza especificado.
Para un resultado analítico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la
duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real
del analito.
La señal del fondo es producida por el blanco y exhibe ruido. El límite de detección
(LD) corresponde a una señal k veces la desviación estándar del ruido del fondo.
Típicamente el valor de k es igual a 3 (LD = 3σF) Los valores por encima del LD
pueden ser atribuidos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son
indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables.
• Límites de Cuantificación: Es la menor cantidad que puede ser determinada
cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza.
Para el análisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que sólo se emplean
valores atribuibles al analito. El límite de cuantificación es entre 3 y 10 veces el LD
(LD = 3σF), según cada caso.

4. RESPONSABLE

La aplicación de este documento es responsabilidad del personal del Laboratorio de las

áreas de Vigilancia del ambiente y atención a las personas en la realización de los ensayos.
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5. DESARROLLO

5.1. GENERALIDADES

5.1.1. CONDICIONES GENERALES

Antes de que un procedimiento pueda proporcionar información analítica útil, es

necesario demostrar que sus resultados son aceptables. La validación consiste en
valorar si la precisión y la exactitud que se obtienen siguiendo el procedimiento son
adecuadas para el problema. Además, la validación garantiza que el procedimiento
escrito es lo suficientemente detallado como para que distintos analistas o
laboratorios obtengan resultados comparables cuando lo utilicen.

La validación es un proceso experimental por el cual se establece mediante estudios

de Laboratorio que las características de diseño del método analítico cumplan los
requerimientos (metodológico y estadístico) para la aplicación analítica propuesta.
Involucra el desarrollo de un protocolo, que incluye la estimación de las medidas de
precisión y exactitud aplicables a cualquier método analítico.

Se valida para asegurar la calidad, reducir costos, aumentar la productividad

cumplir con la normas establecidas, y la validación determina las características de
operación, ventajas, limitaciones, confianza, seguridad en el método analítico y en
la calidad de los resultados obtenidos en el laboratorio de trabajo. Disminuye el
número de fallas y repeticiones.

El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos

normalizados, previo a su uso en ensayos. Cualquier variación en el método
normalizado implica la repetición de dicha confirmación.

Los equipos también deben ser calibrados y/o validados antes de su uso.

5.1.1.1. Tipos de Validación

• PROSPECTIVA: Proceso de validación para metodologías nuevas que se

diseña y comienza a realizarse en el presente, pero los datos se analizan
transcurrido un determinado tiempo, en el futuro.

• RETROSPECTIVA: Proceso de validación para metodologías que actualmente

se están aplicando, el análisis se realiza en el presente, pero con datos del
pasado obtenidos en un momento puntual.
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• REVALIDACIÓN: Repetición total o parcial de una validación, por la

introducción de algún cambio que se espera afecte la bondad de un método
validado.

• TRANSFERENCIA DE VALIDACIÓN: Confrontación de resultados de pruebas

de adecuación y análisis en paralelo, por lo menos, de dos muestras
homogéneas obtenidas por el equipo que realizará la validación y el equipo que
aplicará la técnica validada

5.1.2. PRINCIPIOS DE LA VALIDACIÓN

Cada validación de un procedimiento consiste en tres pasos:

1. Definición de los atributos del método a validar (Por ejemplo: Límite de
detección 1mg/l, intervalo lineal mayor a 2 órdenes de magnitud, incertidumbre
de los resultados < 20% en todo intervalo de trabajo, para el caso de la
validación de un método analítico general.
2. Elaboración del protocolo de validación F-SA-140
3. Determinación de los parámetros estadísticos del procedimiento.
4. Valoración de los resultados de la validación por comparación de los
parámetros estadísticos obtenidos con las condiciones y decisión sobre la
validez del procedimiento para el propósito establecido mediante la ejecución
del protocolo.
5. Elaboración del informe de validación F-SA-141
6. Declaración del método frente a su aptitud frente a las especificaciones y uso
previsto

5.1.2.1. Establecimiento de las Condiciones y Alcance de la

validación

5.1.2.1.1. Establecimiento de las condiciones

Las condiciones de la validación se encuentran definidas por el método en
su documento normativo. De no ser así se deben establecer apoyados en
soportes científicos, métodos similares y/o guías de validación.

5.1.2.1.2. Establecimiento del Alcance de la Validación

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Para definir el alcance de la validación se tendrá en cuenta el tipo de ensayo;

del cual dependerá los atributos y especificidad del protocolo de validación:

1. Método Normalizado: Se trata de un método de ensayo estandarizado,

validado por otro organismo, que ha sido publicado, generalmente
comunidades científicas y que se aplica exactamente como está descrito
en la norma.
2. Método No Normalizado: Se trata de una modificación a un método de
ensayo normalizado, por ejemplo, se hicieron modificaciones a los
métodos descritos en la norma que pueden tener una repercusión sobre
la calidad de los resultados.

Ejemplos: Un método de extracción diferente, otra matriz.

La validación en los casos descritos tiene objetivos distintos y por lo tanto

diferentes puntos esenciales como muestra la tabla 1.

Tabla 1: Objetivos de la validación según el tipo de procedimiento de ensayo.

Método de Ensayo Objetivos de la Validación

Caso 1. Comprobación de que el laboratorio ha

Método normalizado estandarizado el ensayo y lo utiliza correctamente.
Caso 2. Comprobación de que la repetibilidad, la
Modificación de un reproducibilidad, la precisión intermedia y la
método normalizado. exactitud del método original no depende de la
modificación introducida, robustez del ensayo y
que el laboratorio ha estandarizado el ensayo y lo
utiliza correctamente.

Tabla 2: Alcance de la validación según el tipo de procedimiento de prueba.

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Método de Ensayo Objetivos de la Validación

Caso 1. 1.) Comprobación del cumplimiento de los

Método normalizado parámetros estadísticos. Ejemplo: incertidumbre
de los resultados, repetibilidad, exactitud, límite de
detección (Siempre y cuando se indiquen en la
norma).
2.) Elaboración de cartas de control analizando un
material de referencia.
3.) Participación en ensayos interlaboratorios.
Caso 2. Modificación de 4.) Además de lo indicado para el caso 1 de esta
un método normalizado. Tabla, probar parámetros estadísticos
determinados.

El alcance de la validación deberá establecerse en el protocolo de validación F-SA-140 y,

en caso necesario, los principios aplicados deben registrarse en el informe de validación F-
SA-141.

5.1.2.1.3. Parámetros DETERMINADOS

Las guías internacionales sugieren que de acuerdo al método se validen y/o

verifiquen los siguientes atributos:
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Linealidad

El análisis de una muestra genera una señal química o física de una magnitud proporcional
a la cantidad de analito existente en la muestra. La señal puede ser cualquier cosa que
podamos medir; ejemplos habituales son la masa, el volumen y la absorbancia. Para
nuestros fines, es conveniente dividir las técnicas analíticas en dos clases generales, según
que la señal sea proporcional a una cantidad absoluta del analito o que lo sea a una
cantidad relativa. Si una técnica revela la cantidad absoluta del analito existente en la
muestra, la señal proporcionada por el análisis, SA, podrá expresarse como:
− SA = knA ,
− Donde nA son los moles o gramos del analito de la muestra y k es una constante
de proporcionalidad.
− Una segunda clase de técnicas analíticas son las que responden a la cantidad
relativa del analito, así:
− SA = kCA ,
− Donde CA es la concentración del analito en la muestra.
− La linealidad de un método analítico se refiere a la proporcionalidad que existe
entre la concentración del analítico y su repuesta o señal. Además,
conjuntamente se determina el rango lineal, es decir el intervalo comprendido
entre la concentración mínima y máxima del analito para cual el método ha sido
probado. En muchos casos es interesante comparar los resultados de la recta
de regresión obtenida con el analito puro con los correspondientes al analito en
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la matriz. La falta de correspondencia de las rectas nos indica que hay

interferencia por matriz

Precisión

La precisión es la medida de la dispersión de los datos en torno a un valor central y puede

expresarse como rango, desviación estándar o varianza. Por lo general la precisión se
divide en dos categorías: Repetibilidad y precisión intermedia.

Repetibilidad

Es la precisión obtenida cuando todas las mediciones son hechas por el mismo analista
durante un solo período de trabajo analítico, utilizando las mismas soluciones y el mismo
instrumental.

Precisión intermedia

Es la precisión obtenida en cualquier otro conjunto de condiciones, por ejemplo, por

distintos analistas o en distintos días de trabajo de laboratorio por un mismo analista. Como
la precisión intermedia abarca un número mayor de fuentes de variabilidad, nunca puede
ser mejor que la repetibilidad.

Los errores que afectan a la distribución de las mediciones alrededor del valor central se
llaman aleatorios y se caracterizan por variaciones tanto de magnitud como de sentido. Los
errores aleatorios no afectan necesariamente a la exactitud de un análisis. Como se
distribuyen aleatoriamente alrededor del valor central, los errores positivos y negativos
tienden a compensarse, siempre que el número de mediciones sea lo suficientemente
grande. En estas circunstancias, la precisión del análisis solo afecta a la media o a la
mediana.

La precisión es una medida del grado de precisión intermedia y repetibilidad del método
analítico bajo las condiciones normales de operación y está relacionada con el coeficiente
de variación.

Ecuación de Horwitz

Si no se dispone de un método con el cual comparar los parámetros de precisión, los valores
teóricos de repetibilidad (RSDr) y precisión intermedia (RSDR), expresados como CV%,
podrán calcularse aplicando la ecuación de Horwitz.

PRSDR% = 2C -0,1505
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Donde c es la concentración del elemento analizado expresada en ppm ó mg/L y RSDR %

representa la desviación típica relativa calculada a partir de los resultados obtenidos en
condiciones de precisión intermedia [(SR / x) x 100]

Según Horwitz, la precisión del método analítico bajo condiciones de precisión intermedia,
se considera aceptable cuando su coeficiente de variación CV% experimental (RSDR) es
inferior al valor calculado con la ecuación teórica.

En general, los valores tomados de esta curva son indicativos de la precisión alcanzable y
aceptable del método analítico por diferentes laboratorios. Su aplicación proporciona un
medio satisfactorio sencillo de evaluar la aceptabilidad de la precisión del método.

Los valores calculados con la ecuación de Horwitz se consideran límites razonables de

variabilidad que permiten comparar y calificar la precisión de cualquier método analítico en
función de la concentración del analito determinado en una muestra.

Variación de la precisión intermedia estándar relativa (RSDR) en función de la

concentración, c, expresada como tanto por uno.

El cálculo del criterio de aceptabilidad para la imprecisión se realizará acorde a las

especificaciones de la AOAC “Official Methods of Analysis”
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Exactitud

La exactitud es una medida de la proximidad existente entre la medida de la tendencia

central y la verdad o el valor esperado.

La más utilizada es la recuperación. Si bien el valor verdadero de la concentración no se

conoce sino que solo puede estimarse, es posible preparar una muestra por un
procedimiento más exacto que el evaluado (pesada, dilución, etc.) y utilizarla como
referencia.

Los errores que afectan a la exactitud de un análisis se llaman sistemáticos y se

caracterizan por una desviación sistemática en relación con el valor verdadero; es decir,
todas las medidas individuales son demasiado grandes o demasiado pequeñas. Un error
sistemático positivo produce un valor central mayor que el valor verdadero y un error
sistemático negativo da lugar a un valor central menor que el valor verdadero. Tanto los
errores sistemáticos positivos como los negativos pueden afectar el resultado del análisis,
con un efecto acumulativo que conduce a un error sistemático positivo o negativo neto.

Sensibilidad

La capacidad para demostrar que dos muestras tienen distintas cantidades de analito es
una parte esencial de muchos análisis. La sensibilidad de un método es una medida de su
capacidad para establecer que estas diferencias son significativas. A menudo se confunde
la sensibilidad con el límite de detección del método. El límite de detección es la menor
cantidad de analito que puede detectarse con seguridad. Por tanto, el límite de detección
es un parámetro estadístico. La sensibilidad es el cambio de la señal por unidad de cambio
de la cantidad de analito y equivale a la constante de proporcionalidad de las ecuaciones:

SA = knA , y SA = kCA ,

Si Delta SA es el menor incremento de señal que puede medirse, la menor diferencia en

la cantidad de analito que puede detectarse será para cada caso:

Delta nA = Delta SA / k
Delta CA = Delta SA / k

La sensibilidad de un método analítico corresponde a la mínima cantidad de analito que

puede producir un resultado significativo. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos
de sensibilidad: Sensibilidad de calibración: la que corresponde a la pendiente de la curva
de calibración Sensibilidad analítica: la correspondiente al cociente entre la sensibilidad de
calibración y la desviación estándar de la medida. Dos técnicas o la misma técnica
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empleada para diferentes matrices, pueden tener la misma sensibilidad de calibración, pero
diferente sensibilidad analítica debido a factores propios como: necesidad de extracción,
concentración, etc.

Selectividad

Un método analítico es selectivo cuando su señal sólo depende de la cantidad de analito

presente en la muestra. En presencia de una interferencia, las ecuaciones
SA = knA, y SA = kCA,

Pueden ampliarse para incluir un término que corresponda a la contribución de esta

interferencia a la señal SI de tal modo que la señal de la muestra en los dos casos quedará
convertida en:

SMUESTRA = SA + SI = kA nA + kInI y SMUESTRA = SA + SI = kA CA + kICI

Donde SMUESTRA es la señal total debida a los componentes de la muestra y kA y kI son las
sensibilidades para el analito y la interferencia y nI y CI son los moles y la concentración
de la interferencia en la muestra.

La selectividad del método para la interferencia en relación al analito se define como el

coeficiente de selectividad, KA,I y viene dado por la relación :

KA,I = kI / kA

Que puede ser positivo o negativo, dependiendo de si el efecto de la interferencia sobre la

señal es similar o, opuesto al del analito. Un coeficiente de selectividad superior a (+1) o
inferior a (-1) indica que el método es más sensible para la interferencia que para el analito.

La exactitud de un método depende de su selectividad para el analito Sin embargo, incluso

el mejor método puede no estar libre de interferencias que contribuyan a la señal registrada.
Las interferencias potenciales pueden encontrarse en la muestra propiamente dicha, o en
los reactivos que se utilizan durante el análisis. Si no hay interferencia alguna, la totalidad
de la señal medida durante el análisis, SMEDIDA, es la suma de la señal producida por el
analito más la de los reactivos, SREACT.

La ecuación para la señal SMEDIDA = SA + SREACT. = KCA + SREACT, siendo CA la concentración

del analito. Esta ecuación no podrá resolverse si no se dispone de una determinación
independiente de SREACT. La contribución de SREACT se determina midiendo la señal de un
reactivo en un análisis en el que no entra la muestra, que es lo que se denomina el blanco
del método.
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Blanco del método

Muestra que contiene todos los componentes de la matriz excepto el analito.

Robustez y solidez

Para que un método sea útil debe proporcionar resultados fiables. En la realidad, los
métodos están sometidos a distintas interferencias químicas y físicas que contribuyen a la
incertidumbre del análisis. Cuando un método está relativamente libre de interferencias
químicas, puede aplicarse a la determinación de analitos en muestras con una amplia
variedad de matrices. Estos métodos se consideran robustos. Se considera robusto aquel
método que puede aplicarse a los analitos en una amplia variedad de matrices.

Las variaciones aleatorias en las condiciones experimentales también introducen

incertidumbre. Si la sensibilidad de un método depende en gran medida de las condiciones
experimentales, por ejemplo, de la temperatura, de la acidez o del tiempo de reacción, las
pequeñas variaciones de estas condiciones pueden dar lugar a resultados
significativamente distintos. Un método sólido es relativamente insensible a los cambios en
condiciones experimentales. Se considera sólido aquel método que no es sensible a los
cambios de las condiciones experimentales.

Límite de detección

El límite de detección de un método es la menor cantidad o concentración de analito que

puede detectar con seguridad estadística. La International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) define el límite de detección como la menor concentración o cantidad
absoluta de un analito que produce una señal significativamente mayor que la que se
obtiene con el blanco de reactivo. Matemáticamente, la señal del analito en el límite de
detección (SA)LD , es
(SA)LD = S REACT + z(Sigma)REACT

Donde SREACT es la señal del reactivo del blanco, (SigmaREACT es la desviación estándar
conocida para la señal del reactivo del blanco y z es un factor correspondiente al nivel de
confianza deseado. La concentración correspondiente al límite de detección (CA)L D está
dada por la siguiente relación:

(CA)LD = (SA)L D / k

El valor de z depende del nivel de significación deseado con el que se va a informar el límite
de detección. Lo habitual es dar a z un valor de 3 que corresponde a un nivel de significación
de alfa = 0.00135 (tabla de distribución normal de una cola). Por lo tanto, sólo el 0.135 %
de las medidas efectuadas en el blanco darán señales situadas fuera de este rango. Cuando
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se desconoce (Sigma) REACT, el término z(Sigma)REACT pude sustituirse por t (SREACT ) ,

donde t es el valor adecuado de la tabla t de un análisis de una cola.

Al analizar una muestra para determinar la presencia de un analito, se compara la señal de

la muestra con la del blanco. La hipótesis nula es que la muestra no contiene analito, en
cuyo caso (SA) LD y SREACT serán idénticos. La hipótesis alternativa es que si existe analito
y que (SA) LD es > SREACT, si (SA )LD supera a SREACT por un valor de z Sigma ó (ts), se
rechazará la hipótesis nula y se admitirá que hay pruebas de existencia de analito en la
muestra. La probabilidad de que se rechace falsamente una hipótesis nula, es decir, de un
error tipo 1, es la misma que el nivel de significación. Si se selecciona z como 3, la
probabilidad de un error de tipo 1 se reducirá a 0.135 %.

Límite de cuantificación

Es la concentración o cantidad absoluta más pequeña de un analito que puede

determinarse con seguridad y se denomina (LDC).

El Committee on Enviromental Analytical Chemistry of the American Chemical Society

recomienda la siguiente expresión para el límite de cuantificación:

(SA)LDC = SREACT + 10(Sigma)REACT

Test de significación

Un test de significación se crea para determinar si la diferencia entre dos o mas valores es
demasiado grande como para que pueda explicarse por un error aleatorio. Al crear una
prueba de significación, el primer paso consiste en definir el problema experimental como
una cuestión de si o no. Una hipótesis nula y una hipótesis alternativa proporcionan
respuestas a la pregunta. La hipótesis nula, H0 implica que error aleatorio es suficiente para
explicar cualquier diferencia entre los valores que se comparan. La hipótesis alternativa, HA,
es que la diferencia entre los valores es demasiado grande como para que pueda ser
explicada por un error aleatorio y por tanto, debe ser real. La prueba de significación se
lleva a cabo sobre la hipótesis nula que, tras la prueba, se retiene o se rechaza. Si la
hipótesis nula se rechaza, deberá aceptarse la hipótesis alternativa. Cuando la hipótesis
nula no se rechaza, se dice que se retiene, en lugar de decirse que se acepta.

Una vez establecidas la hipótesis nula y alternativa, se elige un nivel de significación para
el análisis. El nivel de significación es el nivel de confianza para la retención de la hipótesis
nula, o, en otras palabras, la probabilidad de que el rechazo de la hipótesis nula sea
incorrecto. En el primer caso, el nivel de significación se expresa como porcentaje (p. ej.;
95 %) y en el segundo se expresa como alfa, definiendo alfa como:
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Alfa = 1 - Nivel de confianza

100

Así para un nivel de confianza del 95%, alfa será igual a 0.05

Test de Significación de dos colas. Test en la que se rechaza la hipótesis nula para los
valores situados a ambos extremos de la distribución normal.

Test de Significación de una cola. Test en la que la hipótesis nula queda rechazada para
los valores situados sólo en un extremo de la distribución normal.

Comparación entre xmedia y (u)

Un enfoque para validar un nuevo método analítico consiste en analizar una muestra patrón
que contiene una cantidad conocida de analito (u). La exactitud del método se juzga
determinando la cantidad media de analito presente en varias muestras, XMEDIA y usando un
test de significación para compararla con (u). La hipótesis nula es que XMEDIA y (u) serán
iguales y que cualquier diferencia entre los dos valores puede explicarse por errores
aleatorios que afectan a la determinación de XMEDIA, la hipótesis alternativa es que la
diferencia entre XMEDIA y (u) es demasiado grande para que pueda explicarse por un error
aleatorio.

Intervalos de confianza de las muestras (limite superior y limite inferior)

En el numeral 3.2 definimos el intervalo de confianza como la forma de expresar el valor

más probable de la media de una población (u), cuando se conoce la desviación estándar
Sigma. Como (s2 ) es un estimador sin sesgo de (Sigma)2 debe ser posible obtener
intervalos de confianza para muestras sustituyendo (s) por (Sigma) en las siguientes
ecuaciones :

Miu (u) = Xi +/- z (Sigma) Y Miu (u) = XMEDIA +/- (z (Sigma)) /

(n)1/2

Los valores de z mostrados en las tablas estadísticas proceden de una curva de

distribución normal, que es una función de (s2) y no se (Sigma)2 .Aunque (Sigma)2 es un
estimador sin sesgo de (s2), estos dos valores pueden diferir significativamente en cualquier
muestra seleccionada aleatoriamente. Para resolver la incertidumbre al calcular (Sigma)2,
se sustituye el valor de z por la variable t, que se define como (t >/= z ) en todos los niveles
de confianza. La segunda ecuación quedará convertida en :

(u) = XMEDIA +/- t s / (n)1/2

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Grados de Libertad

Los denominadores de las siguientes ecuaciones

(Sigma )2 = = SUMATORIA ( Xi - u )i=1 i = N

n
y (s2) = SUMATORIA ( Xi - XMEDIA )i=1 i = N
n–1

Se llaman habitualmente grados de libertad de la población y de la muestra

respectivamente.
En el caso de la población, el grado de libertad siempre es igual al número total de miembros
o sea (n). Sin embargo, en la varianza de la muestra, la sustitución de (u) por (XMEDIA)
elimina un grado de libertad del cálculo.

Estos deben determinarse de acuerdo al método y modificaciones realizadas en el mismo

los cuales son definidos en el protocolo de validación RAN-CD-FOR 024

Cuando los métodos son modificados es de esperarse un posible efecto debido a una
modificación del método de ensayo de acuerdo a lo descrito en la tabla 3:

Tabla 3: Efecto de modificaciones al método de ensayo sobre los parámetros a determinar

Modificación Ejemplos de los Posibles Efectos Sobre:

Método de extracción Porcentaje de recuperación

Matriz de la muestra
Cambios en el pH
Cambio de operador
Detección
Especificidad, porcentaje de recuperación
Robustez
Repetibilidad – Límite de detección – exactitud
(Sesgo)
Intervalo de trabajo / linealidad, eventualmente
especificidad

5.1.3. VALIDACIÓN DE MÉTODOS CLÍNICOS

Para realizar la validación se requiere material de control de calidad interno, muestras de

pacientes, calibradores de concentraciones conocidas y se debe verificar las condiciones
de almacenamiento, temperatura, tiempo y embalajes, garantizando la integridad y
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estabilidad de los especímenes muestreados. Para los métodos cuantitativos se

realizarán las siguientes estimaciones:

5.1.3.1. Evaluación de imprecisión bajo condiciones de

repetibilidad

Realización de varias medidas en las mismas condiciones de medición, mismo

reactivo, mismo evento de calibración, mismo analizador y de medio ambiente por el
mismo operador en un periodo corto de tiempo.

- Duración del estudio: 1 día.

- Número de pruebas a realizar: 10 por cada nivel de control.

- Material requerido: Materiales de control de calidad interno de diferentes niveles

del método a evaluar, reactivos para cada equipo, printer del equipo.

- Procesamiento del material de control: Realizar 10 corridas de cada

concentración del material de control el mismo día en orden diferente evaluando la
prueba en cuestión. Mantener las condiciones de conservación y estabilidad del
material de control, especificadas por el fabricante. Recopilar los datos obtenidos y
realizar la estimación cuantitativa de media, Desviación Estándar (DS) y Coeficiente
de variación (%CV).

- Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variación obtenidos bajo

condiciones de repetibilidad deben ser ≤ 0.25 del error total permitido por el estándar
establecido, sea variabilidad biológica, CLIA, Rhoads, por manufactura o algún otro.

5.1.3.2. Evaluación de imprecisión bajo condiciones de precisión

intermedia

- Duración del estudio: 5 días.

- Número de pruebas a realizar: Mínimo 10.

- Material requerido: Materiales de control de calidad de diferentes

concentraciones, reactivos para cada equipo, printer del equipo.

- Procesamiento del material de control: Procesar 1 muestra de cada nivel del

material de control al arranque y al final de la corrida o AM y PM, durante 5 días o cada
nivel por corrida analítica durante 10 días, Anexar el printer del equipo. Recolectar
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datos y realizar la estimación cuantitativa de media, Desviación Estándar (DS) y

Coeficiente de variación (%CV).

- Criterio de aceptabilidad: Los coeficientes de variación obtenidos bajo

condiciones de reproducibilidad deben ser ≤ 0.33 del error total permitido por el
estándar establecido, sea variabilidad biológica, CLIA, Rhoads, por manufactura o
algún otro.

5.1.3.3. Evaluación de exactitud del método: Comparación de

métodos

- Duración del estudio: 5 días.

- Número de pruebas a realizar: Mínimo 10.

- Material requerido: Muestras de pacientes cuyos resultados cubran el rango

dinámico del método, reactivo de los equipos, formatos de registro y printer del
equipo., muestras de pruebas de evaluación externa ya reportadas

Procesamiento de muestras: Seleccionar 10 muestras de material de control (5 por

duplicado) que cubran el rango dinámico del método y que hayan sido recolectadas y
conservadas en condiciones óptimas para su procesamiento. Esta evaluación puede
realizarse con material de referencia o muestras de pruebas de evaluación externa
previamente analizadas.

− Criterio de aceptabilidad: Recolectar y realizar la estimación cuantitativa de:

−
Herramienta
estadística Criterio de Aceptabilidad Sensibilidad
Error sistemático proporcional: si varían
Pendiente
0,90 - 1,10 de forma proporcional al valor de la
(Slope:B)
magnitud medida.

Lo más cercano a 0, o dos veces Error sistemático constante. Si se trata de

Intercepto (A)
el limite de detección un mismo valor de la magnitud de medida.
R Coeficiente de Intensidad entre la asociación y la relación
0,95 - 1,00
variación de las variables.
Evaluación del error sistemático entre los
Ecuación de la recta y= bx + a
métodos
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SESGO Menor del error total permitido

(BIAS) (Yc-Xc)/Xc*100
Reemplazar en la ecuación de la
Error sistemático en recta X por el nivel de decisión y
Error sistemático en los niveles de
los límites de estimar el valor de Y, luego
decisión
decisión clínico calcular e sesgo en %, este debe
ser menor que el error permitido

Para las pruebas cualitativas no se realiza comparación de métodos se realiza

verificación del cut off

5.1.3.4. Verificación del punto de corte

Se determina usando material de control provisto por la casa comercial (control

de calidad dependiente) o un control independiente cercano al punto de corte
con n de 30, siguiendo las especificaciones de la guía CLSI EP12

Duración: 1 día

Materiales: control positivo, control negativo, diluciones del control positivo

cercanas al punto de corte, y reactivos para la ejecución del ensayo, printer del
equipo

Número de pruebas realizadas: 10 por cada dilución.

Procedimiento:

Obtener muestras cercanas al punto de corte, a partir del control positivo de

concentración conocida y realizar las diluciones hasta obtener el valor C50 +-
20%

Tabla diluciones para evaluación del punto de corte

MUESTRA VOLUMEN DE MR VOLUMEN DILUYENTE

C1 0,1 0,9
C2 0,2 0,8
C3 0,3 0,7
C4 0,4 0,6
C5 0,5 0,5
C6 0,6 0,4
C7 0,7 0,3
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C8 0,8 0,2
C9 0,9 0,1
C10 1 0

Analizar 10 veces cada dilución, el mismo día, en orden diferente, Procesar

control positivo y control negativo al mismo tiempo que se procesan las
diluciones

Imprimir los resultados del equipo (printer del equipo) y realizar el análisis
estadístico: Proporción (%) de resultados positivos y negativos en cada nivel
de dilución
5.1.4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

En el área de microbiología se utilizan dos características de medición: La

investigación de Presencia /Ausencia en un peso determinado de muestra y el
recuento de unidades formadoras de colonias (UFC). Para la construcción de dichos
protocolos se tendrán encuentra las normas ISO 16140 e ISO 11133- 1 Y 2, con la
última versión vigente y la información publicada por el INVIMA.

Los procesos de medición en microbiología presentan características diferentes con

respecto a otros, los recuento se realizan sobre placas que tienen un número
pequeño de UFC, esto plantea problemas importantes sobre todo cuando existe un
número pequeño inferior a 15 ufc, por que la distribución es discreta y no continua,
por ello el modelo de distribución Gaussiano no es aplicable y debe seguirse otro
tipo de distribuciones como Poisson o Binomial Negativa (J.Laso)

5.1.4.1. Etapas definidas en el proceso de validación

• Selección de medios de composición química específica y temperatura de

incubación que permitan seleccionar en función de sus características unos
microorganismos de otros.
• Observación de las características morfológicas y física de los
microorganismos en los medios utilizados
• Realización de pruebas bioquímicas complementarias que diferencia unos
microorganismos de otros

5.1.4.2. Parámetros de validación

Los parámetros dependerán del tipo de método utilizado y definirán aquellas

características que sean útiles para el uso previsto.
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Se definen dos tipos de metodologías cualitativas (Cuyo objetivo es detectar

ausencia o presencia) y métodos cuantitativos (El objeto es detectar un valor
numérico expresados como UFC de microorganismo objetivo, en estos se
incluyen los métodos de Números más probables (NMP) que son
semicuantitativos.

5.1.4.3. Parámetros de metodologías cualitativas

- Limite de Detección
- Falsos positivos
- Falsos negativos
- Sensibilidad
- Especificidad
- Eficiencia

5.1.4.4. Parámetros metodologías cuantitativas

- Exactitud expresada como recuperación

- Precisión expresada como coeficiente de variación
- Limite de detección
- Limite de Cuantificación

Para los procedimientos de validación se incluyen mínimo tres niveles de contaminación

o fortificación de matrices así:

- 100 UFC, 10 UFC y 1 UFC para el límite de cuantificación,

- 0 UFC, 1 UFC, 5 UFC, 10 UFC y 20 UFC para el límite de detección.

Los estudios de inclusividad y exclusividad no aplican para recuentos de mesófilos,

recuento de mohos y levaduras.

5.1.4.5. Tipos de muestras para la validación

Para llevar a cabo los ejercicios de validación de métodos cuantitativos y

cualitativos se utilizan matrices naturalmente contaminados, previamente
analizados en el laboratorio con nivel de contaminación no muy altos. La
selección de las categorías de alimentos utilizados depende del tipo y grupo de
microorganismos y del alcance de la validación de acuerdo a la norma ISO
16140: 2008 Anexo B, en el caso de muestras clínicas se tomaran las muestras
empleadas en el ensayo para el uso previsto por la casa comercial.

5.1.4.6. Número de muestras

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Se establece un n mínimo de 20 muestras, y el número de matrices dependerán

del uso previsto, igualmente se deben incluir muestras negativas mínimo 6

5.1.4.7. Material de referencia certificado

De acuerdo a la metodología a validar se selecciona el detector de interés

(medio o caldo de cultivo) siguiendo el procedimiento técnico oficial o la norma
de referencia del método. Por ejemplo para el recuento de Estafilococo
coagulasa positivo la norma de referencia es “ICMSF Vol I segunda edición
2000 Método 1 páginas 231 a 236” la cual indica en el ítem de Materiales y
métodos la referencia el detector Baird Parker.

Se prepararan las suspensiones bacterianas de la cepa de interés en las

concentraciones 10 UFC, 5 UFC, 1 UFC y 0 UFC, a partir de la dilución de cepa
de interés

Para obtener las concentraciones anteriores se debe aplicar la fórmula de

C1.V1= C2.V2
Donde:
C1: Concentración inicial (100 ufc),
V1: Volumen de la dilución a determinar para preparar la concentración
requerida.
C2: Concentración en ufc a preparar (20 ufc, 10 ufc, 5 ufc. 1 ufc)
V2: Volumen final de la suspensión con la concentración requerida

El volumen a calcular corresponde a la cantidad de suspensión necesaria para

las repeticiones requeridas.

Los inóculos se deben procesar el mismo día de su preparación.

Los resultados obtenidos después de la lectura se registran las hojas de trabajo

y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel

Una vez transcritos los datos se procede hacer el cálculo del límite de detección

5.1.4.8. Repetibilidad y precisión intermedia

Fortificación de las matrices:

Una vez pesadas la muestras se identifican y se fortifican con los inoculo
previamente preparados agregando 1mL de la suspensión correspondiente a la
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matriz pesada, luego se homogeniza cumpliendo el procedimiento técnico a

validar.

Procesamiento de Muestras:

Las matrices elegidas fortificadas se procesan de acuerdo al procedimiento

técnico de la metodología a validar, realizando minino dos repeticiones por
matriz

La repetibilidad será evaluada con los resultados de las repeticiones realizadas

por el analista responsable del ensayo.

La precisión intermedia se evalúa entre los analistas.

Los resultados obtenidos después de la lectura se registran en las hojas de

trabajo y posteriormente se transcriben a la matriz de Excel

Una vez transcritos los datos se procede hacer las estimaciones estadísticas

5.1.4.9. Sensibilidad y especificidad

Para realizar los cálculos de sensibilidad y especificidad la fortificación de las

muestras se realiza igual que para la estimación de la repetibilidad y precisión
intermedia hasta el procesamiento. Con los resultados obtenidos se aplica la
tabla de contingencia de 2 x2.

Dichos resultados se ubican en la tabla asi:

A. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas
deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado positivo.
B. Muestras que son negativos (Sin Fortificar o con ausencia del
microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado
positivo.
C. Muestras que son positivas (Fortificadas con UFC conocidas de cepas
deseadas) y que al aplicarles el test dan un resultado negativo.
D. Muestras que son negativas (Sin Fortificar o con ausencia del
microorganismo target) y que al aplicarles el test dan un resultado
negativo.

A = Verdaderos Positivos
B = Falsos Positivos
C = Falsos Negativos
D = Verdaderos Negativos
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Valor de la Característica
Resultado de la
Prueba con el
Método a Validar PRESENTE AUSENTE Total

Positivo A B A +B

Negativo C D C+D

Total A +C B+D A +B + C+ D

Una vez diligenciada la tabla de 2x2 se aplican las siguientes formulas:

Sensibilidad: A / A+C x 100
Especificidad: D/ B+D x 100

La tabla de contingencia también permite hacer el cálculo de valor predictivo

positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) así como la eficiencia de la
prueba:

VPP: A/ A+B x 100

VPN: D/C+D x 100
Eficiencia: A+D/N x 100
Donde N = A+B+C+D

5.1.5. INFORME DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO

Cada validación debe ir acompañada de un informe:

El mismo debe ser preparado por el profesional de laboratorio / operador / técnico y

revisado por la Dirección Técnica. El contenido del informe se establece en el
formato informe de validación F-SA-141

6. REGSTROS
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Registro Responsable Como Donde Tiempo de Disposición

conservarlo conservarlo conservación final
Según Listado Según Listado Según Listado
F-SA-140 Maestro de Maestro de Maestro de
Director Técnico documentos F- documentos F-MC- documentos F-MC-
Protocolo de MC-04, Según F- 04, Según F-MC-03 - 04, Según F-MC-03
/Profesional de Medio físico y/o
Validación Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de
electrónico
maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla
registros y/o tabla retención documental de retención
de retención documental
documental
F-SA-141 Según Listado Según Listado Según Listado
Informe de Maestro de Maestro de Maestro de
Director Técnico documentos F- documentos F-MC- documentos F-MC-
validación MC-04, Según F- 04, Según F-MC-03 - 04, Según F-MC-03
/Profesional de Medio físico y/o
Laboratorio MC-03 -Listado Listado maestro de -Listado maestro de
electrónico
maestro de registros y/o tabla de registros y/o tabla
registros y/o tabla retención documental de retención
de retención documental
documental

7. ANEXOS

Anexo No.1 Referencias

Guía para la validación de métodos de ensayo. Organismo Argentino para la Acreditación

(OAA).
NTC-ISO/IEC 17025:2005 Requisitos Generales de Competencia de Laboratorios de
Calibración y Ensayo.
Curso sobre Validación de Metodologías Analíticas, Sanidad del Ambiente, INS.
Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, EURACHEM / CITAC, GUIDE CG 4,
THIRD EDITION 2012
ASTM (American Society for Testing and Materials 1992): D3868-79, D1179-93.
J.Laso Sanchez 2005. Situación de la Validación de los ensayos microbiológicos en los
laboratorios.
NCCLS. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods;
Approved Guideline—Second Edition. NCCLS document EP5-A2 (ISBN 1-56238-542-9).
NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087- 1898 USA,
2004.
NCCLS. Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical
Approach; Approved Guideline. NCCLS document EP6-A (ISBN 1-56238-498-8). NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference Testing in Clinical
Chemistry; Approved Guideline—Second Edition. CLSI document EP7-A2 (ISBN 1-56238-
584-4). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400,
Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005.
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NCCLS. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved
Guideline—Second Edition. NCCLS document EP9-A2 (ISBN 1-56238-472-4). NCCLS,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2002.
NCCLS. Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation;
Approved Guideline. NCCLS document EP17-A (ISBN 1-56238-551-8). NCCLS, 940
WestValley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2004.
Garzón González Alba Cecilia. Validación, verificación o evaluación de métodos? Lo
realmente importante es ser una herramienta de seguridad para el paciente. Agosto de
2013

8. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS
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