PROTOCOLO PREPARACIÓN GEL DE AGAROSA.

Preparar cuba de electroforesis y cuna del gel.

A los extremos abiertos de la cuna cubrirlos con cinta de

enmascarar 3M Rocket, cuidando de un trozo a lo largo de la cinta
sobresalga de la base de la cuna (0,5 cm). Frotar la base y el
costado de la cuna en contacto con la cinta para asegurar que toda
la superficie este pegada.

Colocar el peine en la parte superior de la cuna.

Colocar la cuna así preparada dentro de la cuba.

PREPARACIÓN DE LA AGAROSA.

Pesar agarosa suficiente para un volumen de 150 mL y una

concentración de 0,8 %. (unos 1,2 g).

Colocar la agarosa en un erle de 250 mL, agregar los 150 mL de

buffer de corrida 1X (TBE), marcar hasta donde llega el buffer.

Llevar al microondas y fundir la agarosa. Controlar el nivel de

líquido, si está por debajo de la marca realizada, completar hasta
allí con H2O demonizada.

Dejar enfriar. Agregar antes de volcar 75 uL de Bromuro de etidio,

agitar suavemente para mezclar. A partir de aquí la manipulación
del gel debe hacerse con guantes, ya que el BrEt es mutagénico.

Volcar dentro de la cuna y dejar gelificar.

Una vez gelificado, sacar con cuidado las cintas de los bordes.

Llenar la cuba con el buffer de corrida 1X, colocar allí la cuna con el
gel, recién entonces con cuidado sacarle el peine.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Resuspender las muestras de ADN con 50 uL de buffer Tris 0,01M

pH 7,5. pipetear bien sobre las paredes, darles un spin down en la
microcentrifuga.

Preparar un eppendorf nuevo para cada muestra, rotular.

Colocar en el 15 uL de muestra resuspendida, agregar 3 uL de
buffer de carga 6X (15 uL + 3 uL = 18 uL tot.) para que así quede el
buffer 1X de concentración.

Nuevo spin down.

Sembrar en orden los 18 uL de muestra en la última calle sembrar

marcador supercoiled.

Colocar la tapa de la cuba, controlando que los bornes negativo y

positivo coinciden (rojo/rojo y negro/negro).

Conectar la cuba a la fuente de poder.

Voltaje de corrida, se calcula según una formula empírica.
Para evitar que la resistencia del gel eleve la temperatura y termine
fundiendo la agarosa, el límite de voltaje estará dado por la formula:

Voltaje total= 5Volts/cm x distancia lineal entre los bornes de la

cuba.
(por ejemplo, si esa longitud es de 28 cm, entonces el voltaje
máximo será de ~140-150 voltios, esta cifra es indicativa, no debe
correrse a más de ese voltaje, pero puede correrse a voltajes
menores).

Activar la corrida y dejar correr una hora.

Sacar el gel de la cuba llevarlo al transiluminador, colocarlo allí y

prender la luz UV después de bajar la tapa acrílica, identificar las
bandas que pudieran aparecer.