Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología

Práctica 12. Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)

Grupo 2LM2 – Equipo #5

Laboratorio de Métodos Cuantitativos

Integrantes:
De la Torre Ramos David Ulises
García Barrera Jorge Luis
Legaspi Salazar Diego
20 de noviembre del 2018

Profesores:
Emma Bolaños Valerio
Alfonso Hernández Muñoz
 Objetivos

➢ Conocer los fundamentos de la cromatografía en HPLC.

➢ Obtener las gráficas de las señales en el equipo de cromatografía.
➢ Trazar experimentalmente la curva de calibración de la altura o área de los picos contra
concentración.
Introducción

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que
contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones
específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC,
de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica
de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular.
Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad,
en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de
estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamaño
y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100
000 pesetas.
La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por
lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más
columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las
partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm.
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan
aplicables universalmente. Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las
propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector
para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de
temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir
el ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en
una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de
refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos.
Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son
propias de la fase móvil. En la Tabla 4.1 se indican los detectores más comunes empleados en
HPLC y algunas de sus propiedades más importantes.
En la separación de aminoácidos y péptidos mediante fase reversa la resina más comúnmente
empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se denomina como C 18.
|SiO2|-(CH2)17-CH3
Puede haber dos tipos de fase:
● Fase Directa: La fase estacionaria es polar y la fase móvil es de baja polaridad.
● Fase Reversa: fase estacionaria es de polaridad baja y fase móvil de polaridad alta.
Parámetros que considerar:
Tiempo de retención (tr, fig 1) El tiempo que un soluto permanece en la columna. Se mide desde el
momento de la inyección hasta la elución del máximo del pico. Es característico del soluto para
condiciones de operación constantes. Auxiliar en la identificación de los solutos.
Tiempo muerto (to, fig 1) El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase
estacionaria. Tiempo que cualquier soluto permanece en fase móvil. Representa el espacio vacío de
la columna.
Tiempo de retención ajustado (t′r, fig 1) Mide el tiempo que el componente permanece en fase
estacionaria. t t ′ = − t r r o
Ancho a la base (wb, fig 1) Es la porción de la línea base interceptada por las tangentes al pico.
Para un pico gaussiano es igual a 4σ. Tradicionalmente usado en el cálculo de la eficiencia del
sistema
Ancho a la mitad de la altura (w½, fig 1) Una medida más reproducible, adecuada para evaluar
manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos).

Figura 1.

Número de platos teóricos (N) Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución
del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de
separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos. se calcula
con cualquiera de las ecuaciones:
Factor de capacidad (k') Se define como la razón de la cantidad de soluto en fase estacionaria
entre la cantidad en fase móvil al equilibrio. Es igual a la relación del tiempo que el soluto permanece
en fase estacionaria respecto al tiempo en fase móvil.

Selectividad (α, fig 2) Mide las diferencias relativas entre la

interacción de dos solutos con la fase estacionaria. Un valor mayor de
α significa una columna más selectiva y mejor separación entre
solutos. Se calcula como el tiempo de retención corregido del soluto
más retenido entre el del menos retenido.

Resolución (Rs, fig 2) Es la medida cuantitativa del grado de separación

entre dos solutos. La resolución mínima aceptable en mezclas
sencillas es 1.0 una resolución de 1.5 representa separación a la línea
base.

Figura.2
El método de adición estándar es una técnica de análisis cuantitativo utilizada para minimizar los
efectos de matriz que interfieran con las señales de medición de analitos.

Las concentraciones del componente desconocido son a menudo dilucidar a través de una gama de
técnicas analíticas, tales como luz espectroscopia y espectrometría de masas electroquímica. Sin
embargo, la medición puede verse afectado por otros componentes de la muestra, llamada la matriz
y causar la reducción inadvertida o realce de la señal, llamado efectos de matriz. Estos efectos
pueden sesgar los resultados y causar errores significativos en el análisis.

El método de adición estándar puede utilizarse para minimizar efectos de matriz en las señales de
medición. Esto se realiza mediante la adición de volúmenes precisa de una solución conocida de
analito a la muestra.

Diagrama de bloques

● Preparación del equipo de HPLC

 ● Lectura de la muestra

Resultados
Figura 3. Curva para 2.5 ml de la disolución

Figura 4 Curva para 3.75 ml de la disolución

 Figura 5. Curva para 5 ml de la disolución

Figura 6. Curva para 7.5 ml de la disolución

Figura 7.
Curva para 8 ml de la disolución
Tabla 1. Alturas y áreas de cada curva
Dilución Área altura
2.5 4936.7 209.31
3.75 7189.7825 307.538
5 8938.444 379.78
7.5 13410.94 573.08
8.75 16958.21 676.685

Tabla 2. Datos de la disolución

mL de mL de g de g de Moles de Moles de
solución Metanol Acrilamida Metanol Acrilamida Metanol
2.5 17.5 2.83 13.86 3.9744E-02 4.3258E-01
3.75 16.25 4.24 12.87 5.9616E-02 4.0169E-01
5 15 5.65 11.88 7.9488E-02 3.7079E-01
7.5 12.5 8.48 9.9 1.1923E-01 3.0899E-01
8.75 11.25 9.89 8.91 1.3910E-01 2.7809E-01
Tabla 2. Concentración en fracción molar
Total de moles Fracción molar del Fracción molar del
soluto solvente
0.47 0.08 0.92
0.46 0.13 0.87
0.45 0.18 0.82
0.43 0.28 0.72
0.42 0.33 0.67

18000
y = 46718x + 926.72
16000 R² = 0.9937

14000

12000

10000
Área

8000

6000

4000

2000

0
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Concentración (Fracción molar)

Figura 8. Curva tipo en función del Área

 800

700
y = 1852.8x + 58.059
R² = 0.999
600

500
Altura

400

300

200

100

0
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Concentración (Fracción molar

Figura 9. Curva tipo en función de la altura

Conclusiones

● Se trazó la curva de calibración para un estándar de HMF.

● Se separó e identifico el HMF en una muestra.
● Se filtró la acrilamida antes de ser inyectada al equipo.
● El HPLC es importante para la determinación de compuestos en el control de calidad de los
alimentos.

Bibliografía

-Harris, D. (1992). Análisis Químico Cuantitativo. Tercera edición. España: Grupo de

Iberoamérica. (p. 320).

-Arriola, R. (2009). Control de calidad de los alimentos. En linkedin, consultado el

25/Octubre/2018. Recuperado de es.slideshare.net/mobile/ricardoarriola/control-de-calidad-de-
los-alimentos