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Clase Intro + Efecto Solvente PDF
Clase Intro + Efecto Solvente PDF
Ana Denicola
DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)
relajación vibracional
S2 conversión interna IC
relajación vibracional
cruce intersistemas ISC
S1 T1
kNR IC
kNR ISC
hυA hυF hυP
S0
fluorescencia fosforescencia
LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado
10-3 s
LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS:
• ABSORCION: ~ 10-15 seg
• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” por
simetría)
• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg
ESTADO EXCITADO
• λmax(ex), λmax(em)
La medida de IF es relativa
a la geometría del equipo
Usar soluciones diluidas A < 0..05
Filtrar la solución
Intensidad de Fluorescencia y concentración
del fluoróforo
IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo
Si Aλ << 1 ⇒ IA = I0 (2.3 ε c l)
• Fluorescencia intrínseca
fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínseca
agrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos
aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano.
Además marcado con sondas fluorescentes (FITC,
DNS). GFP y derivados.
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes
(pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
4.7 ns en solución
(2.3 ns FMN)
0.3-1 ns unido a prot.
0.4 ns en solución
1-5 ns unido a DH
Phe Abundancia: 3.5%
λex = 260 nm, λem= 282 nm
(Q.ε ~ 5)
Insensible al entorno
DNS-Cl sensible a
polaridad del entorno,
fluorescencia polarizada
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto
rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Transferencia de energía
hν Quenching
X X* Transferencia de carga
hν’ Disociación de H+
H = hexano
CH = ciclohexano
T = tolueno
EA = acetato de etilo
Bu = butanol
Efectos del solvente y del entorno
Solvatación de iones
Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
Cambio en la emisión por cambio de solvente
o cambio del entorno (ej. unión a proteína)
N = nativa
U = desplegada “unfolded”
Usos de fluorescencia en bioquímica
• Localización subcelular
• Cambios en la concentración
• Interacciones moleculares
• Cambios conformacionales
• Distancias intra/intermoleculares
• Difusión rotacional
• Caracterización estructural
• Actividad enzimática
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