Instituto Politécnico Nacional 
  
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería 
Campus Guanajuato  
 
 
 
 
Laboratorio de Biotecnología Molecular  
 
 Grupo 5BV1 
 
 
Práctica # 4 y 5 
“Extracción de RNA de plantas: Especie ​ Capsicum annuum ​ L.” 
“Cuantificación de RNA por espectrofotometría y visualización en gel de 
agarosa” 
 
  
Equipo 1: 
López Castañeda Mariana 
López Chacón Emma Karen 
Pérez Pérez Karina Daniela 
 
 
 
Docentes: 
Dr. Juan Francisco Sánchez López 
Dr. Karla Lizbeth Macías Sánchez 
Miryam Jhazmin Torres Gómez 
M en C. Silvia díaz Sandoval 
 
 
Semestre Enero­Junio 2015  
 
 
 
Silao, Guanajuato.  19 de Febrero del 2015. 
 
 
I. RESULTADOS 
De acuerdo al protocolo establecido, se llevó a cabo la extracción y purificación de RNA 
de  la  especie  ​
Capsicum  annuum,  comúnmente  conocido  como  chile  serrano,  del  cuál 
se obtuvieron 2  muestras a partir de aproximadamente 1g de pericarpio, descartando la 
placenta  y,  asegurándose  de  remover  el  exocarpio,  es  decir,  la capa  externa de  color 
verde  intenso  que  recubre al  chile,  para  prevenir  contaminaciones  ya  que las  RNAsas 
son liberadas a partir de las células y están presentes en la piel.  
 
Espectrofotometría mediante equipo NanoDrop. 
Terminado  el  proceso  de  extracción  y  purificación   se  llevó  a  cabo  la  cuantificación  y 
visualización  de   RNA  de  Capsicum  annuum  ​ a  través   de  la  espectrofotometría, 
empleando  un  NanoDrop,  el cual  lee  absorbancias a distintas  longitudes  de  onda para 
cuantificar distintos parámetros como la  concentración de RNA  o  la presencia  de otros 
agentes  contaminantes tales como solventes  orgánicos o sales de guanidina. Los datos 
obtenidos a partir del Nanodrop se muestran en la siguiente tabla. 
 
Tabla  1.  ​
Parámetros  de  cuantificación  de  RNA  y  relaciones  de  las  absorbancias  
registradas en  el Nanodrop de la especie ​Capsicum annum​ . 
 

 
De  acuerdo  a  la Tabla 1 se  puede  observar que de acuerdo  a la absorbancia medida  a 
260 nm de la  primera  muestra  de  ​Capsicum annuum ​ es de 2.571 nm la cual indica una 
concentración  de  RNA  de  102.9ng/ μ L,  mientras  que  para  la  segunda  muestra  se 
obtuvo  una  concentración  de  80  ng/ μ L, a  la que le  corresponde  una longitud de  onda 
de 1.999,  pero  mediante  la técnica  de  electroforesis  en  gel de agarosa al 1% se puede 
comprobar la integridad del RNA. 
 
En  la  Figura  1  se  observa  la  gráfica  de  la  absorbancia  contra  la  longitud  de  onda 
registrada  en  el  Nanodrop  para  la  primera  muestra,  en  la  cuál  se  aprecia un  máximo 
entre la absorbancia 260 a 275. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura  1.  ​
Gráfico  de   la  Absorbancia  Vs.  Longitud  de  onda  registrada  en  el  NanoDrop  para  la 
muestra 1 de ​ Capsicum annuum.​   
 
Y por último  en  la figura 2 se observa  la gráfica de la absorbancia contra la longitud de 
onda registrada en el Nanodrop para la segunda muestra de ​ Capsicum annuum​ . 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura  2.  ​
Gráfico  de   la  Absorbancia  Vs.  Longitud  de  onda  registrada  en  el  NanoDrop  para  la 
muestra 2 de ​ Capsicum annuum.​   
 
 
Visualización en gel de agarosa 
Posteriormente  empleando  la  técnica  de  electroforesis  en  gel  de agarosa al  1%, (p/v) 
se  visualizan  las  muestras  ​ Capsicum  annuum,  ​ para  poder  comprobar  si  la 
concentración  que  se  obtuvo  mediante  el  equipo  NanoDrop   es  la  correspondiente  a 
RNA. En la Figura 3, se observan 10 carriles, encontrándose en  el primer y último carril 
el  marcador  de peso molecular HyperLadderTM  1kb  con  sus  14 bandas, debido a que 
al  momento  de  colocar la  muestra del  marcador hubo  deficiencias en la  técnica,  por lo 
que se creyó conveniente  añadir  otra  muestra del  mismo. En  el segundo  y  tercer carril 
se  encuentra  la   muestra  de  interés.  Mientras  que  en  el  carril  4,  5  y  6  las  muestras 
correspondientes  al  equipo  2  y  por  último  en  el  carril  7,8  y  9  se  encuentran  las 
muestras correspondientes al equipo 3. 

 
Figura 3​ .  Visualización de  RNA  de  ​ Capsicum  annuum  corrido en gel de agarosa al 1% 
con  los  respectivos  carriles.  Carril  ​
1  y  10​
:  marcador  de  peso   molecular  HyperLadder 
1kb,  100  Lanes,  Lot  No.  Hi­211k;  ​Carril  ​2  y  3:  muestra  de  equipo  1;  Carril  ​
4,  5  y  6​
: 
muestra de equipo 2; Carril ​ 7, 8 y 9:​  muestra de equipo 3. 
 
  
II.  DISCUSIÓN DE RESULTADOS 
A pesar de  que  el DNA  es  el ácido  nucléico que contiene la información que determina 
la  estructura  de  las  proteínas,  no  puede  actuar  solo,  por  eso  en  los  organismos 
celulares  el  RNA  es  la molécula que  complemente  al DNA ya que se encarga de dirigir 
la  síntesis  de  proteínas  para  el desarrollo  y  actividades  de la célula. (Patiño, 2006) Por 
esa  razón  la  extracción  de  RNA  libre  de  contaminación  con  DNA  o  proteínas  es 
empleada  para  distintos  procedimientos  tales  como  Northern  blot,  Dot  blot, 
transcripción reversa, ensayos de protección de RNAsas, PCR y clonaje molecular. 
 
Según  Jiménez  (2002),  la  absorbancia  de  los  ácidos  nucleicos  es  máxima  a  una 
longitud  de  260  nm.  Por  tal  motivo  para  determinar  la  calidad  del  RNA,  uno  de  los 
parámetros que se  emplean es la  relación  260/280  nm, la cual debe presentar un valor 
de 2 para ser  considerado de buena calidad (Martínez 2000), ya que frecuentemente el 
RNA  viene  mezclado   con  proteínas,  carbohidratos  y  diversas  sales.  Al  observar  este  
parámetro  en  la  Tabla  1  para  las  muestras  1  y  2, se  puede  observar  que  no cumplen 
este  requisito,  ya  que quedan  por  debajo del valor establecido para ser considerado de  
calidad  presentando  valores  de  1.6  y  1.55  respectivamente.  También   se  observa  una 
mayor  concentración  de RNA en  la muestra 1 que en la 2, sin embargo, al observar las 
absorbancias  leídas  a  230  nm  de  ambas   muestras,  se  demuestra  una  clara 
contaminación  por  agentes  orgánicos  como  el  isopropanol,  ya  que  superan  al  valor 
registrado  de  la  absorbancia leída  a  260 nm, siendom  la  contaminación en  la muestra 
1.  
 
A  pesar  de  que  las  lecturas  registradas  en  el  NanoDrop,  demuestran  la  presencia de 
RNA,  el  método  no  puede  decir  si el  RNA se encuentra fragmentado o impuro.  Por lo 
anterior,  se  emplea  la  técnica  de  electroforesis  en  gel  de  agarosa  al  1%,  para  poder 
visualizar el RNA y observar la condición en la que se encuentra. Dicha visualización se 
muestra en la  Figura  1, en la  que los  carriles de  interés son el 2 y 3 con la muestra 1  y  
2 respectivamente. 
 
El  método de  electroforesis, nos permite separar las partículas de acuerdo a su tamaño 
en  función  de  su  carga  neta  al  someterlas  a  un  campo  eléctrico.  La  fuerza  que  se 
encarga  del  movimiento  de  las  partículas  es  el  potencial  eléctrico  (E),  por  lo  que  la 
movilidad electroforética  (μ)  de una  molécula  está dada  por la razón de la velocidad de 
la  partícula (V) al potencial eléctrico, por lo que al aumentar el voltaje, aumenta la carga 
del  compuesto  a   estudiar,  en  este  caso el  RNA.  (Garrido  et  al., 2006) Sin embargo  lo 
que  se  pretende  no  es  que  sea  rápido  el  proceso  de  visualización  en  gel  de 
electroforesis,  sino  conservar  la  integridad  estructural  durante  la  corrida,  razón  por  la 
cuál  se  corrió  el gel  a  un voltaje de 70V, sin embargo el tiempo de exposición al campo 
electroforético  se  considera  que  para  una  mejor  visualización  tuvo  que  haber  sido 
mayor,  ya  que  como  se   observa  en  la  Figura  3  las  muestras  se  encuentran  muy 
pegadas  a  la parte  superior  del  gel y el  marcador de peso  molecular se  encuentra con 
las  14  bandas  muy  poco  espaciadas entre  sí.  Por esta  razón  para  la electroforesis en 
gel  de  agarosa  para  la  separación de  ARN  por  tamaños Hernández  (1994)  propone  el 
uso  de  formaldehído,  un  desnaturalizante  que  favorece  la  separación  del  ARN  por 
tamaños,  pero  en  su  trabajo  a  pesar  de  la  presencia  de  ese  componente 
desnaturalizante  sugiere  el  empleo  de  voltajes  bajos  para  cuidar  la  integridad  de  los 
resultados. 
 
El  Trizol  Reagent es una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina que 
solubiliza  simultáneamente  el  material  biológico  y  desnaturaliza  la  proteína.  Después 
de  la  solubilización, la  adición  de cloroformo  provoca  la separación  de fases, donde  la 
proteína  se  extrajo  a  la  fase  orgánica,  el   ADN  se  resuelve  en  la  interfaz,  y  el  ARN 
permanece  en  la  fase  acuosa.  (Hannon,  2010)  Este  reactivo  listo  para  usar  está 
diseñado  para  aislar  el ARN  total de  alta  calidad,así como ADN y proteínas, a partir de 
muestras de células  y  tejidos de  origen humano,  animal, vegetal, levadura, o de origen 
bacteriano.  Este  reactivo  se  emplea  para  mantener  la  integridad  del  RNA,   ya  que 
durante  la  homogenización  y  lisis  de  la  muestra  inactiva  a  las RNAsas, al  tiempo  que 
rompe las células y disuelve los componentes celulares (McNamara, 2006) 
 
Para  la  visualización  de RNA por el  método  de  electroforesis  en  gel de  agarosa  al 1% 
se empleó  el marcador HyperLadder 1kb, dicho marcador de peso molecular genera un 
patrón  de  14  bandas  con  un  rango de 200 pb ­ 10,037bp como se muestra en la Figura 
4 (HyperLadder,  2015) Además como se observa en la imagen  la banda de 100 bp y la 
banda  de  10,037  bp  tienen la  mayor intensidad para su fácil identificación y orientación 
en  la  cuantificación  de  RNA.  El  marcador  de  peso   molecular  también  nos  ayuda  a 
darnos cuenta  si  el  gel  fue preparado  adecuadamente, ya que si este no se encontrara 
bien hecho el marcador no emigraría por el gel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. ​ Patrón de bandas del marcador HyperLadder​ TM
 1kb corrido  en gel de agarosa 
al 1% visualizado con bromuro de etidio.   
 
Debido  a  que  el  RNA  ribosomal  es  el  más  abundante  en  las  células,  forma   parte  de 
hasta  el  80%  del  RNA  celular  según  Peña  (2004).  El  ARN ribosomal eucariótico  está 
formado  por  una   subunidad  40s,  conformado  por  una  molécula  de  ARNr  18s  y  32 
moléculas  de  proteínas y la  subunidad 60s,  la cual tiene tres  tipos  de ARNr  5s,  5.8s y 
28s,  con  46  proteínas  (Koolman,  2004)  El  ácido  ribonucleico  aproximadamente  de  un 
40%  a un 50% del  ribosoma. (Barioglio, 2001) mientras que el tamaño del  ARNr 28s es 
de 4.6  a  5.2kb su subunidad pequeña mientras que el de 18s va de 1.7 a 1.9kb (Farrell, 
2005).  Es  por  eso  que la  visualización del  RNA de la figura en el gel de agarosa no fue 
la  esperada,  de  acuerdo  a  Martínez,  2000,  se  debe  observar  un  doblete  de  bandas 
característico del RNA, 28S y 18S como se muestra en la Figura 5.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura  5.  Visualización  de  extracción  de  RNA  en  gel  de  agarosa  con  el  doblete  de 
bandas  característico 28S  y 18S presente en todos los carriles, a partir de la corteza de 
cidra.  
 
Dichas bandas  no  se  presentan  en  el  carriles  2  de la figura 3, debido a que el RNA se 
encuentra  degradado.  La degradación  del  RNA  puede ocurrir  por  diversos factores,  ya 
que se degrada  con  mucha  facilidad,  sobre  todo  con  la contaminación de RNAsas. Ya 
que  la  molécula  de  RNA  es  sumamente  lábil,  la  clave  en  la  extracción  es  evitar  su 
degradación por acción de ribonucleasas propias de la célula. Los protocolos existentes 
se  basan  en  una  rápida  inactivación  de  RNAsas  endógenas,  muy  estables  y  que  no 
requieren  de  cofactores  para  funcionar.   Es  muy  importante  tomar  precauciones  para 
evitar  la contaminación con RNAsas  exógenas, por ejemplo, tratar el agua y soluciones 
salinas con inhibidores  de RNAsas, si  es  posible  se  recomienda el  empleo  de  pipetas, 
puntillas  y  soluciones  exclusivas,  puntillas  y  soluciones  exclusivas  para  trabajar  con 
RNA.  El  material  de  vidrio  debe  esterilizarse  por  calor  seco  por  4  horas  a  150°C, 
mientras  que  el  material  plástico debe  ser  nuevo  y  estéril,  o  bien  debe  enjuagarse con 
cloroformo,  ya que la  esterilización por autoclave no inactiva por completo las ARNsas. 
(Armendariz, 2011) 
 
 
Así  mismo,  deben  usarse  guantes  a  lo  largo  de  todo  el  proceso  e  intentar trabajar lo 
más  rápido  posible,  con  el  fin  de  evitar  la  degradación  del  RNA  durante  la 
manipulación.  Con  el fin  de  obtener  los  mejores rendimientos, deben  usarse  muestras 
frescas  como  material  de  partida  (Sandoval,  2010).  Durante  la  experimentación,  se 
trabajó  todo  el   tiempo  con  guantes  para  evitar  la contaminación  por  las RNAsas  de  la 
piel,  por  lo  que se descarta esta  forma  de contaminación, así como el hecho de que se 
trabajó con una  muestra  fresca de Capsicum annuum​ . Sin embargo, la degradación del 
RNA  se  le  puede  atribuir  al  proceso  de  maceración,  ya  que  no  se  realizó  de  forma 
rápida,  este  proceso  se  realiza  con  la  finalidad  de  que  las  células  del  tejido  vegetal 
estén  más  expuestas  a  los  reactivos  y  así  asegurar  la  obtención  de  RNA  de  forma 
rápida,  por  lo   que  al  no  realizar  este  paso  de  forma  rápida  permitió  que  las  RNAsas 
endógenas liberadas se encontraran con el RNA y lo degradara.  
 
En  caso  del  tercer  carril,  de  la  figura  3,  no  se  observan  bandas  ya  sean  borrosas  o 
extendidas, lo  cual se debe  a  una colocación deficiente en el pocillo del gel de agarosa 
o  en  dado  caso  se  debe a  la  pérdida  de  material  genético  en  alguna  de  las etapas de 
extracción  durante  la  decantación  de  la  fase  acuosa,  ya  que  a  partir  de  la  fase  de 
separación, después  de  la  primera centrifugación  se  observó  pérdida  de  la pastilla, sin 
embargo  se  continuó  con  el  procedimiento  hasta  el  final  obteniendo  una  lectura  de 
concentración  de  RNA  de  ​ 80  ng/ μ L,  sin  embargo  se  presentaron  datos  de 
contaminación  por  solventes  orgánicos  y  sales de  guanidina por  lo  que  se  descarta  la 
posibilidad de haber obtenido RNA de la segunda muestra.  
 
 
III. CONCLUSIONES 
A  través  de  la  experimentación  no se logró  el proceso de  extracción  y  purificación  del 
RNA  de  la  especie  ​ Capsicum  annuum​ ,  comúnmente  conocido  como  chile  serrano.  A  
pesar  de que  se registraron concentraciones de RNA de 102.9 ng/μL y 80 ng/μL para la 
muestra 1 y 2 respectivamente, se detectó mediante la relación 230/260 que el RNA se 
encuentra  contaminado  por  agentes  orgánicos;  así  como  la  relación  260/280  no 
alcanzó  el  valor  esperado  de  2,  para  poder  calificar  el  RNA  como  libre  de  sales  o 
agentes orgánicos, por lo que demuestra un mal proceso de purificación.  
 
La  visualización   de  RNA  en gel  de  agarosa al  1%  demostró  que el  RNA  se  encuentra 
fragmentado,  por  lo que fue imposible  observar el  doblete de  bandas característico del 
RNA,  siendo  una  causa  posible  la primera  parte del  proceso de extracción,  ya  que no 
se maceró de forma adecuada, logrando así la fragmentación.  
 
  
 
IV. CUESTIONARIO 
1.­ Sobre el DEPC, en el protocolo de extracción de RNA, investigue: 
a. Nombre IUPAC del compuesto 
Dietil policarbonato, con fórmula molecular lineal O(COOC​H​
2​ )​
5​2 

b. Estructura química 

 
c. Mecanismo de acción 
Es  un  potente  químico  que  Inactiva las  RNAsas por  unión  covalente en  su  sitio activo 
inhibiendo  su actividad  catalítica, a  través  de la  modificación  de  residuos  de histidina y 
tiroxina. (Farrell, 2005) 
 
2.­ Explique cuál es la función de la formamida en el buffer de carga. 
La función  que cumple la formamida es debilitar las uniones de hidrógeno de los duplex 
ADN­ADN y ADNARN, permitiendo  de  esta manera que  se  pueda bajar la temperatura 
de anillamiento al incrementar el nivel de astringencia​ . 
 
3. Explique la función de la RNAsa out. 
Es un inhibidor no competitivo de ribonucleasas pancreáticas, tales como la RNAsa A, 
el cuál es utilizado para evitar la degradación del RNA. 
 
4.­ A partir del siguiente problema, responda los incisos a, b y c: 
Las siguientes imágenes  muestran los  productos de  RNAm de  tejido de  flor de plantas 
de  chile  (carril  2,  3  y  4)  por  un  método  basado  en  perlas  magnéticas  (Dynabeads 
mRNA  Purification  Kit  Dynal  Biotech,  Brown  Deer,  WI),  a  partir  de  RNAt  (carril  8).  El 
panel  A corresponde a una  corrida  después de 2 minutos de iniciada la electroforesis a 
100 V y el panel B a la misma corrida después de 30 minutos. 

 
a) Analice la integridad de las muestras 2, 3 y 4. 
Para  el  caso  de  las  muestras  2  y  3  se  observa  la  presencia  de  ARN  al  estar  más 
alejada de  los pocillos  iniciales, ya  que  el ARN  es  menos  pesado que  el ADN, también 
se puede  observar que  la muestra no  esta 100% pura ya que presenta trazas borrosas 
que  implican  la  contaminación,  con  lo  cual  se  podrían  hacer  más  procesos  de 
purificación para la obtención de ARN únicamente.  
En el  caso de la muestra 4 no se observan ni bandas de ARN o degradación del mismo 
ya que no  se  ve  nada el  carril 4 lo  cual se  podría deber a una inserción de muestra en 
el pocillo o una pérdida de ácidos nucleicos en alguna etapa de la extracción.  
 
b)  Estime  de  modo  visual la  concentración que tendría  la banda  inferior  de  la muestra 
del carril 3. 
Suponiendo  que  el  marcador  es  Hyperladder,  la  concentración  es  de  750  pb, 
considerando que la banda superior del marcador es de 800 pb y la inferior de 600 pb. 
 
c)  ¿Por  qué fue  necesario tomar dos imágenes en diferentes tiempos de corrida para la 
estimación visual de la concentración de RNAm en gel de agarosa? 
Porque  en  la  primera  corrida  debido  al  corto  tiempo  de  contacto  de  voltaje  en  el  gel 
impidió la  migración  de  las bandas  a  una distancia  adecuada  para ver la presencia de 
ARN. 
 
 
V. BIBLIOGRAFÍA 
[1] Armendariz Borunda, Jan Socorro. (2011) Biología Molecular. 2°Edicion. Mexico. Mc 
Graw HILL 
[2]  Brarioglio,  C.  (2001)  “Diccionario  de  producción  animal”  Editorial  Brujas,  Espña. 
P,42. 
[3]Farrell,  R.  (2005)  “RNA  Methodologies:  A  Laboratory  Guide  for  Isolation  and 
Characterization” 3er Edición. Elsevier Academic Press. USA. P, 218 
[4] Garrido, A., et al. (2006) Fundamentos de bioquímica estructural. 2º Edición. Madrid. 
Páginas 444. 
[5]  Hannon,  G.  J,  Nielsen  T.  W.,  Ares  M. (2010)  Purification  of RNA  using TRIzol (TRI 
reagent). PubMed. 
[6]  Hernández  Medina  (1994)  Revista  comparativa  el  estrés  salino  entre  Capsicum 
annuum  var.  glabriusculum  y  Capsicum  annuum  var  annuum:  Análisis  molecular, 
fisiológico y morfométrico.Centro de Investigaciones Biológicas del Noreste. 
TM
[7]  HypperLadder​   1kb,  Bioline  a  Meridian  Life  Science  Company,  1  página. 
Rceuperado  el  7/02/15 
http://www.bioline.com/sg/downloads/dl/file/id/2672/pi­50092_hyperladder_1kb_v2.pdf 
[8]Jiménez,  Horacio  Merchant  Larios.  2002.  Biología  Celular  y  Molecular.  Primera 
edición. Editorial Pearson Educación. Naucalpan de Juárez. Edo de México. Pág: 27­32 
[9]  Koolman,  J.  Klaus­Heinrich,  R.  (2004)  “Bioquímica:  texto  y  atlas”  Editorial  Médica 
Panamericana. Alemania. P, 250. 
[10]  Martínez  Juan­Pablo,  Alvarado  Omar.  (2000)  Comparación  de  Métodos  de 
Extracción  de  RNA  para  la  Detección  del  Viroide  Exocortis  de  los  Cítricos  por 
Electroforesis Secuencial. Sociedad  Mexicana de Fitopatología, A.C. Revista Mexicana 
de Fitopatología, vol. 18, núm. 1, enero­junio, pp. 42­ 49. 
[11] McNamara, P. A. (2006). “Trends in RNA research”. New York, EUA: Nova Science 
Publishers. 
[12]  Patiño  Restrepo  J.F.  2006.  Metabolismo,  Nutrición  y  Shock.  Cuarta  edición. 
Editorial médica panamericana. Colombia. 
[13] Peña, A. (2004). “Bioquímica”. Editorial Limusa. México. P, 166­167. 
[14]  Sandoval  A.  ​ 2010.​
Protocolos  de  Extracción  de  Ácidos  Nucleicos.  Laboratorio  de 
Biotecnología  Molecular.  Universidad  ​ de  La  Frontera.  Facultad  De  Ciencias 
Agropecuarias y Forestales.