BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA
Aislamiento de hongos productores de amilasas
a partir de lentejas
Laboratorio de Microbiología Industrial
Dra. Paola Hernández Carranza
Arroyo Barrios Yaremy Guadalupe – Guevara Román Francisco Federico – Hernández Dávila Irma –
Jurado Becerra José Ramón – Merino Espinoza Irving Uriel – Pérez Meza Yazmín

Introducción

Uno de los principales objetivos de la biotecnología y los métodos de selección

utilizados dentro de la misma, cosiste en desarrollar métodos prácticos que permitan el
aislamiento y selección de microorganismos de interés industrial. (Doran, 1998). Las
amilasas, denominadas también ptialina o tialina, son enzimas hidrolasas que tiene la
función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Fue la
primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la
bautizó en un principio con el nombre de diastasa.

Estas son comúnmente halladas en animales y plantas; sin embargo, para fines
industriales, las más utilizadas son aquellas de origen fúngico o bacteriano.
(Whithebust, 2002). Las amilasas fúngicas son producidas principalmente por los
hongos Aspergillus, Penicillum, Thermomyces y Mucor.

Las amilasas están presentes en numerosas aplicaciones, desde la producción de

alimentos, que es el caso de la elaboración de jarabes fructosados, la producción de
biocombustibles, de detergentes, en la industria papelera y también son útiles en la
industria textil. (Silver, S.F.)

En esta práctica se realizaron métodos adecuados para el aislamiento de

microorganismos productores de enzimas amilasas, que se encontraban de forma
natural en las semillas de lentejas.

Objetivo

Aislar hongos del ambiente capaces de producir amilasas.

Desarrollo
Resultados

RESULTADOS

 Aislamiento.
En ninguna de las dos placas de cultivo con medio PD 5% NaCl no hubo crecimiento
de hongo.

 Purificación.
Para poder continuar con la obtención de amilasas se tomó
muestra de un hongo que creció en las placas de otro equipo
de trabajo del laboratorio de Microbiología Industrial.

Después de incubar las placas a 27°C por 7 días se observó

el crecimiento de un hongo de color verde en el centro y con
el rededor en color blanco.

Ilustración 1. Placa de la cual fue tomado el hongo para la purfificación

 Screening de la producción de amilasas.

En las placas de medio al 1% de almidón Ilustración 2.
1.5% agar se sembró el hongo y se observó Crecimiento del
su capacidad de degradar el almidón por la hongo en medio
formación de un halo alrededor del hongo, 1% almidón, se
observa la
este halo nos permite verificar la actividad de formación de un
las amilasas sobre el almidón del medio. Esto halo al rededor del
a los 4 días de incubación a 28°C. hongo.

 Morfología macroscópica
El crecimiento en el medio de agar-salvado triturado en pico de flauta
permitió observa la morfología macroscópica. El hongo tiene un color
verduzco en el centro y con consistencia algodonosa blanquecina
sobre el mismo. La mayoría del medio se cubrió por el hongo sobre
todo por la estructura algodonosa.
Ilustración 3. Crecimiento del hongo en el
medio agar-salvado. Se puede observar como
el hongo presenta una esructura algodonosa
blanquecina.
  Morfología microscópica.
En el microscopio se logró observar la estrutura del hongo desde una visulización
a 40x. Se distingue la estructura de los filamentos del hongo.

La comparación de las
estructuras permite inferir
que el hongo problema
pertenece al género
Chaetomium. Esto es por
la comparación de alos
filamentos que muestran

Ilustración 4a. Microscopia de Chaetomium sp. obtenida por una semejanza de la

el Departamento de Microbiología y Patología de la UNAM forma y de la presencia
Ilustración 4b. Microscopia de un hongo problema obtenido de las esporas en las
en el Laboratio de Microbiología Industrial de la BUAP. Se estructuras filamentosas.
comparan las estructuras para la identificación del hongo
problema. La distribución de las
esporas es similar en
ambas estructuras, la
forma en las que se distribuyen los filamentos también es parecida en las dos
estructuras. Así definimos la posibilidad que el hongo problema pertenezca el género
Chaetomium.

En la observación a 10x podemos observar de cerca las esporas. Su distribución y

forma.

El análisis de las
esporas corrobora la
semejanza entre las
esporas del género
Chaetomium con
esporas del hongo
problema. La
semejanza radica en
Ilustración 5a. Microscopia de esporas de Chaetomium sp por la la forma redondeada
asociación de Higiene y Monitoreo de Servicios en la Industria.
Ilustración 5b Microscopia de las esporas del hongo problema un tanto ovalada de
obtenido en el Laboratorio de Microbiología Industrial de la BUAP. la estructura y
Se comparan las estructuras para la identificación del hongo también en esa
problema.
forma de cuatro
esporas unida. De
esta forma se puntualiza se el hongo problema pertenece al género Chaetomium.

Discusión de resultados

Aislamiento y purificación

Las lentejas usadas para extraer las los hongos provenían de diferentes lugares en
cada equipo, por lo que se esperaba obtener diferentes cepas de hongos, hecho que
no se llevó a cabo debido a que solo 1 de 6 equipos logro obtener crecimiento de
hongos a partir de sus lentejas, esto puede deberse, entre otras causas al uso de
fungicidas para combatir plagas en los cultivos, al desplazamiento de hongos por
interacciones microbianas en la lenteja, baja cantidad de esporas o esporas con baja
viabilidad. La cepa utilizada para esta práctica fue obtenida del equipo que consiguió el
crecimiento del hongo en su medio de cultivo, este presento una coloración verde-
marrón, y textura aterciopelada cuando se tomó del medio PDA 5% NaCl.

Screening

A partir del hongo que se logró aislar y que fue crecido en medio con almidón se pudo
comprobar que efectivamente tenia actividad amilolítica debido a la formación de un
halo muy poco notorio. Este halo significa que el hongo está degradando el almidón
presente en el medio para utilizarlo como fuente de carbono. Esta vez alrededor del
hongo verde-marrón se formó un ligero halo blanquecino muy grueso que sobresalía
del medio y alrededor de este halo pequeño se generó un halo más grande casi
transparente dentro del medio. Esto debido al hidrólisis del almidón en el halo más
grande y a los productos secundarios del consumo de almidón por el hongo en el halo
más pequeño.

Producción de esporas, enzimas y medición de su actividad

Una vez que el hongo aislado se trasladado a un medio con salvado para inducir su
esporulación ya no presento morfología verde-marrón completamente, esta vez la
mayoría del hongo presento una coloración blanquecina y textura aterciopelada debido
a que en distintos ambientes los hongos muestran distintas morfologías (dimorfismo) y
que la producción de estructuras reproductivas (esporangios) modifica su morfología
macroscópica. La producción de esporas fue exitosa pues se lograron observar al
microscopio junto con sus esporangios, que gracias a ellos el hongo pudo clasificarse
como perteneciente al género Chaetomium sp. La producción de enzimas, su
extracción y medición de actividad catalítica no pudieron llevarse a cabo debido a falta
de materiales por lo que no serán reportados.

Conclusión

Mediante la realización de esta práctica se pudo conocer los procedimientos y medios

de cultivo para poder aislar hongos del ambiente con capacidad de producir amilasa,
enzimas que degradan el almidón.

Esta clase de enzimas son producidas por plantas, animales, microorganismos como
bacterias y hongos principalmente por Aspergillus y Penicillium. En esta práctica el
hongo que se aisló de lentejas pertenece al género Chaetomium.

La parte primordial de esta práctica fue el aislado y la purificación del hongo, ya que
fue crucial trabajar con orden y esterilidad para que los medios no se contaminaran y
no se generara el crecimiento de bacterias y así poder obtener solo el crecimiento del
hongo de interés en los medios de cultivo, el cual fue obtenido con éxito, el hongo
aislado sí presentó actividad amiolítica.

El uso industrial de las amilasas es muy amplio abarcando desde conversión de

almidón, producción de detergentes hasta la producción de alcohol como
biocombustible, la industria alimenticia y la del papel.
Cuestionario

1. Muestre imágenes de la práctica realizada.

Crecimiento del hongo en PDA / Crecimiento en tubos de agar con salvado.

Crecimiento en agar almidón con actividad de amilasa / Observación al microscopio.

2. Nombre 5 características de las enzimas α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasa y

enzimas desramificadoras.
- Las enzimas α-amilasa se caracterizan por atacar los enlaces 1,4-α-
glucosídicos, en el centro de la cadena de los polisacáridos, por lo que se le
conoce como endoamilasa, produciendo maltosa, glucosa y oligosacáridos
- La β-amilasa, presente en plantas y bacterias también cumple la función de
degradar los enlaces 1,4-α-glucósidos pero esta comienza su acción en el
extremo libre no reductor del almidón, liberando maltosa igual que la α-
amilasa.
- La glucoamilasa (γ-amilasa), presente en levaduras, es capaz de degradar
enlaces α-1,4 y α-1,6. A diferencia de otras amilasas, esta es eficaz en
medios ácidos y su pH óptimo es de 3.
- Las amilasas son enzimas dependientes de calcio, completamente
afuncionales en ausencia de iones de calcio.
 - Enzima desramificcadora: amilo-1,6-glucosidasa. Enzima que cataliza la
hidrólisis de los puntos de ramificación del glucógeno, es decir, enlaces α-
1,6.

3. Nombre tres microorganismos que producen las enzimas del punto anterior e
indique su importancia biotecnológica.
- Bacillus subtilis, Aspergillus sp, Bacillus megaterium, Schwanniomyces
castelli, Saccharomyces cerevisiae, etc.
- Las enzimas de microorganismos representan aproximadamente el 90% del
total de las enzimas producidas en la industria. De estas el 75% son de
acción hidrolítica y son utilizadas para la despolimerización de sustancias
naturales. Dentro de este mercado, las carbohidrasas ocupan el segundo
lugar en la producción (Godfrey y West, 1996), empleándose
principalmente en la despolimerización del almidón y la celulosa.

4. Explica formas o métodos de generar la inmovilización de enzimas extraídas en

esta práctica.
- Retención física y unión química.
- En el caso de retención física se puede dar de dos maneras, 1)
Atrapamiento, consiste en la retención física de la enzima en las cavidades
interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por
prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida,
colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una
solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un
cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico.
- La siguiente es por inclusión de membrana dividida en dos tipos; uno es
microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de
sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables
pueden ser permanentes
(originadas por
polimerización interfacial) o
no permanentes (generadas
por surfactantes, también
llamadas “micelas
reversas”). Las
microcápsulas obtenidas son
de forma esférica, con
tamaños comprendidos
entre 1 y 100 µm de
diámetro. Mediante este
método se pueden
encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o
biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones
que suceden en múltiples pasos.
- La otra manera en inclusión por membrana es por reactores de membrana:
Estos reactores emplean membranas permeables al producto final,
permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima.
Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa
el reactor. En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la
 adsorción de la enzima sobre la membrana que formará el reactor. Esta
adsorción se puede realizar de dos formas:
1. Mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la
membrana.
2. Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.

- En cuanto a unión química, se puede dar por unión a soportes o reticulado.

- Unión a soportes: Son los métodos de inmovilización más utilizados y de
los que se dispone de una mayor información. La elección del soporte y del
tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del
biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la
afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el
soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de
operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que
pueda ser reutilizado. Pueden ser soportes inorgánicos, p.e. arcillas como
la bentonita, piedra pómez, sílice, etc. O materiales manufacturados (óxidos
de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso,
alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.), sin embargo, también existen
soportes orgánicos,
clasificados en
polímeros naturales
y sintéticos. Las
enzimas se pueden
unir a estos por
adsorción o unión
covalente.
- En el caso del
reticulado, también
denominado
entrecruzamiento o
cross-linking, es
una técnica que ha
sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (7). El
método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que
originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como
reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres,
diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas
con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de
pH y temperatura.
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