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Norma Técnica NTC Colombiana 4519
Norma Técnica NTC Colombiana 4519
COLOMBIANA 4519
2009-04-15
I.C.S.: 67.240
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La NTC 4519 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo el 2009-04-15.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN......................................................................................................................1
4. PRINCIPIO....................................................................................................................2
6.4 PIPETAS.......................................................................................................................5
6.7 PH-METRO...................................................................................................................5
Página
9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................6
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................10
ANEXOS
ANEXO A (Informativo)
UTILIZACIÓN DE LA DIFERENCIA CRÍTICA (DC) PARA LA INTERPRETACIÓN
DE LOS RESULTADOS...........................................................................................................9
ANEXO B (Informativo)
CUADRO DE DIFERENCIAS ENTRE LA NTC4519 (Primera actualización) y la
ISO 4833:2003 .......................................................................................................................12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
INTRODUCCIÓN
Dada la gran variedad existente de productos alimenticios destinados al consumo humano y animal
este método horizontal puede no ser directamente aplicable para ciertos productos. En estos casos,
se pueden emplear diferentes métodos, específicos para estos productos, si está absolutamente
justificado por razones técnicas. Sin embargo, se debería intentar aplicar este método horizontal
siempre que sea posible.
Cuando se revise esta norma nacional, se tendrá en cuenta toda la información disponible en ese
momento, sobre la aplicación de este método y las razones que han originado desviaciones para
productos concretos.
La armonización de los métodos de análisis no puede ser inmediata y, para ciertos grupos de
productos pueden existir ya normas internacionales que no se ajusten a este método horizontal. Se
espera que cuando esas normas se revisen, se cambien para que se ajusten a esta norma
nacional y que solo se conserven las divergencias inevitables justificadas por razones técnicas.
Esta norma es una adopción modificada (MOD) por traducción, respecto a su documento de
referencia, la norma ISO 4833:2003. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal
Method for the Enumeration of Microorganisms Colony-Count Technique at 30 Degrees C
Esta norma nacional especifica un método horizontal para el recuento de microorganismos, contando
las colonias que crecen en un medio sólido después de la incubación aeróbica a 30 °C. Esta norma
nacional es aplicable a los productos destinados al consumo humano o animal, aunque sujeta a las
limitaciones expuestas en la introducción.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
Las normas que a continuación se relacionan contienen disposiciones válidas para esta norma
nacional. En el momento de la publicación estaban en vigor las ediciones indicadas. Toda
norma está sujeta a revisión por lo que las partes que basen sus acuerdos en esta norma
nacional deben estudiar la posibilidad de aplicar la edición más reciente de las normas
indicadas a continuación. Los miembros de CEI y de ISO poseen el registro de las normas
internacionales en vigor en cada momento.
NTC 4491-1, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de
las muestras de ensayo, suspensión inicial y las diluciones decimales para examen
microbiológico Parte 1: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de
diluciones decimales
NTC 4092, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Reglas generales
para los exámenes microbiológicos
GTC 78, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Guía para la preparación y
producción de medios de cultivo. Guía general para el aseguramiento de la calidad para la
preparación de los medios de cultivo en el laboratorio.
ISO 8261, Leche y productos lácteos. Directrices generales para la preparación de muestras
para análisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el examen microbiológico.
ISO 4833-2, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Horizontal Method for the
Enumeration of Microorganisms. Surface Colony Count Technique at 30 ºC.
3. TÉRMINO Y DEFINICIÓN
Para los propósitos de esta norma nacional, se aplica el siguiente término y definición.
3.1 Microorganismo. Bacterias, levaduras y mohos que forman colonias contables, producidas
en las condiciones especificadas en esta norma nacional .
4. PRINCIPIO
Se preparan otros pares de cajas en profundidad, bajo las mismas condiciones, empleando
diluciones decimales de la muestra para análisis o de la suspensión inicial.
4.3 El número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra se calcula a partir
del número de colonias obtenidas en cajas seleccionadas (véase el numeral 10).
Para las prácticas habituales de laboratorio, véanse las normas NTC 4092 e ISO/TS 11133-1.
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5.1 DILUYENTES
5.2.1 Composición
Cuando se examinan productos lácteos, añádase 1,0 g de leche en polvo desnatada por litro
de medio de cultivo. La leche en polvo desnatada debe estar libre de sustancias inhibidoras.
5.2.2 Preparación
5.2.2.1 Preparación a partir de medio completo deshidratado comercial. Síganse las instrucciones del
fabricante y añádase, si es necesario, la leche en polvo desnatada (véase el numeral 5.2.1).
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
Se añade el agar y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el agar se
disuelva completamente.
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento
de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se
enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).
1)
Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.
3
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5.2.3 Análisis de rendimiento para la garantía de calidad del medio de cultivo. Para analizar el
rendimiento del medio, véase la GTC 78.
5.3.1 Composición
Agar1) de 12 g a 18 g
Agua 1 000 mI
5.3.2 Preparación
Se añade el agar al agua y se calienta hasta ebullición agitando frecuentemente, hasta que el
agar se disuelva completamente o se pone al vapor durante unos 30 min.
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2
a 25 °C.
Antes de comenzar el examen microbiológico, con el fin de evitar todo retraso en el momento
de verter el medio, antes de su empleo se funde completamente el medio y a continuación se
enfría a una temperatura entre 44 °C y 47 °C en un baño de agua (véase el numeral 6.5).
El material de un solo uso es una alternativa aceptable al material de vidrio reutilizable, si las
especificaciones son similares.
1)
Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar.
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6.4 PIPETAS
Por ejemplo, puede emplearse uno consistente en una base iluminada con un fondo negro,
equipado con una lente de aumento preferiblemente de unos 1,5x y un contador mecánico o
electrónico digital.
6.7 PH-METRO
7. TOMA DE MUESTRAS
Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y
que no haya sufrido daños o cambios durante el transporte o el almacenamiento.
La toma de muestras no constituye una parte del método especificado en esta norma nacional.
Para ello véase la norma internacional específica referente al producto de que se trate. Si no
existe una norma internacional específica, se recomienda que las partes interesadas adopten
un acuerdo sobre este punto.
La muestra para análisis se prepara de acuerdo con la parte concerniente de la NTC 4491-1 y
la norma ISO 8261, y con la norma específica referente al producto de que se trate. Si no existe
una norma internacional especifica, se recomienda que las partes interesadas adopten un
acuerdo sobre este punto.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
9. PROCEDIMIENTO
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante una pipeta estéril
(véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 mI de la muestra para análisis si es
líquida, ó 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos (dilución 10-1).
9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Mediante otra pipeta
estéril (véase el numeral 6.4), se transfieren a cada placa 1 ml de la dilución 10-1 (producto
líquido) o 1 mI de la dilución 10-2 (otros productos).
9.2.3 Si es necesario, se repite el procedimiento con más diluciones, empleando una nueva
pipeta para cada dilución decimal.
9.2.4 Si es adecuado y posible, se seleccionan sólo las secuencias de diluciones criticas (por
lo menos dos diluciones decimales consecutivas) para la siembra de las cajas de Petri que den
recuentos de colonias entre 30 colonias y 300 colonias por placa.
9.2.6 Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio mediante rotación de las cajas de
Petri y se permite solidificar la mezcla dejando reposar las cajas de Petri en una superficie
horizontal lisa.
9.2.8 Las cajas de Petri preparadas se invierten y se sitúan en la incubadora (véase el numeral 6.2) a
30 °C ± 1 °C durante 72 h ± 3 h. No se deben apilar más de seis cajas una encima de la otra. Es
conveniente que las pilas de cajas estén separadas una de otra y de las paredes y parte superior
de la incubadora.
9.3.1 Después del período de incubación especificado (véase el numeral 9.2.8), se cuentan
las colonias de las cajas (véase el numeral 10.1), empleando el equipo de recuento de colonias
(véase el numeral 6.6). Se examinan las cajas de Petri bajo luz tenue. Seria importante que las
colonias en punta de alfiler sean incluidas en el recuento, pero es esencial que la persona que
realiza la lectura evite confundir las partículas no disueltas o precipitadas con colonias en punta
de alfiler. Se examinan con atención los elementos dudosos, empleando una lupa cuando sea
necesario, con el objeto de diferenciar las colonias de partículas extrañas.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
9.3.2 Las colonias invasoras deben ser consideradas como una sola colonia. Si menos de un
cuarto de la placa está invadida por dichas colonias, se cuentan las colonias de la parte no
afectada de la placa y se calcula el número correspondiente a la placa entera. Si está invadido
más de un cuarto de la placa, se desecha el recuento.
10.2 PRECISIÓN
10.2.1 Generalidades
Los datos de precisión han sido calculados para cajas que contienen entre 30 colonias a 300 colonias.
Los datos de precisión dependen de la flora en asociación y de la matriz de la muestra. Los datos
presentados se derivan de estudios en colaboración (véanse las referencias [1], [2] y [3]) Y son
válidos para leche cruda y pasterizada. Pueden utilizarse como estimación en el caso de recuentos
en otros productos. Véase la NTC 4092.
10.2.2 Repetibilidad
NOTA Este límite de repetibilidad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y pasteurizada
(véanse las referencias [1], [2] y [3]) y puede ser aplicado a dichos productos.
10.2.3 Reproducibilidad
NOTA Este límite de reproducibiliIdad proviene de estudios colaborativos realizados sobre leche cruda y
pasteurizada (véanse las referencias [1], [2] Y [3]) Y puede ser aplicado a dichos productos.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
a) Condiciones de repetitibilidad
La diferencia entre el primer y segundo resultado no debería ser superior a 0,25 unidades
log10,
b) Condiciones de reproducibilidad
El Anexo A muestra los cálculos y el empleo de las diferencias críticas (DC) para interpretar los
resultados.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
ANEXO A
(Informativo)
a) Condiciones de reproducibilidad
⎛ 1⎞ r2 0,25 2
CD = R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟ = R2 − = 0,45 − = 0,41
⎝ n⎠ 2 2
en donde
r es el límite de repetitibilidad;
R es el límite de reproducibilidad.
⎛ 1⎞ r2
CDL = 0,84 2 x R 2 − r 2 ⎜1 − ⎟ = 0,84 2 x R2 − = 0,24
⎝ n⎠ 2
Los resultados hasta 105,24 = 174 000 no indican una no conformidad con el límite.
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ANEXO B
(Informativo)
NTC 4519
ISO 4833:2003 Sustentación Técnica
(Primera actualización)
OBJETO: OBJETO: El documento de referencia ISO 4833 de la
Esta norma nacional especifica un Esta norma da directrices NTC 4519 fue actualizado en el año 2003,
método horizontal para el recuento generales para el recuento de modificando la temperatura de 35 °C a 30 °C
de microorganismos, contando las microorganismos presentes en para la técnica, cambio sustentado
colonias que crecen en un medio productos destinados al consumo técnicamente en la necesidad de que el
sólido después de la incubación humano o alimentación animal, método permitiera tener recuentos verídicos
aeróbica a 30 °C. contando las colonias que crecen teniendo en cuenta la posible contaminación
en un medio sólido después de la ambiental del proceso o por mala limpieza en
incubación aeróbica a 35 °C ± el proceso además porque se busca estudiar
2°C. microorganismos mesófilos y psicrófilos y una
parte de los termotolerantes; de esta manera
DEMAS PARTES DEL la temperatura de 30 °C es utilizada para
DEMAS PARTES DEL
determinar el deterioro del alimento y la calidad
DOCUMENTO QUE REFIEREN A DOCUMENTO QUE REFIEREN
del procesamiento de los alimentos. En Colombia
LA TEMPERATURA DE A LA TEMPERATURA DE
INCUBACIÓN el Comité 25- realizó pruebas interlaboratorios
INCUBACIÓN
teniendo en cuenta como comparativo
condiciones de incubación a 30 °C, durante 48 h
a 72 h y a 35 °C de incubación durante 48 h
a 72 h. Al finalizar el tratamiento estadístico en el
país se da validez al sustento ténico internacional
(ISO e Instituto Pasteur) para adoptar la
temperatura a 30 °C. (Acta No.113 2008-07-15).
4.2 Las cajas se incuban 4.2 Incubación aeróbica de las El tiempo de incubación (72 h) se encuentra
aeróbicamente a 30 ±1 °C durante cajas a 35 °C ± 2 °C durante 48 h estandarizado por la ISO, adicionalmente el
72 h ±3 h. consenso del Comité define darle un rango de
± 3 h armonizando de esta forma con las
condiciones de tiempo de incubación
estipuladas en los métodos y documentos
normativos colombianos.
5.2.2.1 Se ajusta el pH, si fuera MEDIO DE CULTIVO ... Se
necesario, de manera que ajusta el pH, si es necesario, de Las unidades de pH se establecen en un rango
después de la esterilización sea tal modo que después de la de ± 0,2. Armonizando las unidades de acuerdo
de 7,0 ± 0,2 a 25 °C. esterilización sea de 7,0 °C a con el documento de referencia ISO 4833.
25 °C.
5.2.2.3 ... Se reparte el medio en 5.2.2.3 ... Se reparte el medio Las metodologías implementadas en el país
tubos de ensayo (véase el en tubos de ensayo (véase el estipulan utilizar volúmenes de medio de 10 ml
numeral 6.8), en cantidades de 10 numeral 6.8), en cantidades de en tubos de ensayo, ya que 10 ml es más
ml a 15 mI por tubo ... 12 ml a 15 mI por tubo ... práctico para medir en material volumétrico
(pipetas etc).
9.2.5...Se vierten aproximadamente 9.2.5...Se vierten aproximadamente
10 ml a 15 mI por tubo 12 ml a 15 mI por tubo
5.2.2.3 ... En caso contrario, se 5.2.2.3 ... En caso contrario, se La temperatura estipulada para estas
almacena en oscuridad a una almacena en oscuridad a una condiciones en la ISO 7218:2008 es de 2 °C a
temperatura de 6 °C ± 2 °C temperatura de 3 °C ± 2 °C 8 °C, con el rango que se define en este
documento se cumple requisito.
5.3.3 ... 6 °C ± 2 °C 5.3.3 ... 3 °C ± 2 °C
6.5 BAÑO DE AGUA 6.5 BAÑO DE AGUA El consenso colombiano define que las
condiciones de operación de estos equipos se
Capaz de operar entre 44 °C y 47 °C O aparato similar, con capacidad encuentra entre estas temperaturas.
de operar 45°C ± 0,5 °C
Continúa...
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
ANEXO B
(Informativo)
(Continuación)
NTC 4519
ISO 4833:2003 Sustentación Técnica
(Primera actualización)
9.2.4 Si es adecuado y posible, se 9.2.4 Si es adecuado y posible, Las normas técnicas colombianas que
seleccionan sólo las secuencias se seleccionan sólo las relacionan estas especificaciones de recuento,
de diluciones criticas (por lo secuencias de diluciones criticas contemplan el recuento entre 30 colonias y
menos dos diluciones decimales (por lo menos dos diluciones 300 colonias
consecutivas) para la siembra de decimales consecutivas) para la
las cajas de Petri que den siembra de las cajas de Petri que
recuentos de colonias entre 30 den recuentos de colonias entre
colonias y 300 colonias por placa. 15 colonias y 300 colonias por
placa.
9.3.1 ... Es necesario aclarar que se pueden utilizar
este tipo de reactivos que son válidos para la
NOTA Si es necesario, se 9.3.1 ... No contempla la nota aplicación de la técnica en el país.
pueden adicionar reactivos que aclaratoria
faciliten la visualización de las
colonias.
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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4519 (Primera actualización)
BIBLIOGRAFÍA
[1] PITON, C., GRAPPIN, R. A Model For Statistical Evaluation Of precision Parameters Of
Microbiological Methods: Application To Dry Rehydratable Film Methods And IDG
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Raw Milk. J AOAC, 74, 1991, pp. 92-103.
[2] SCOTTER, S., ALDRIDGE. M., BACK, J., WOOD, R. Validation of European Community
Methods for Microbiological and Chemical Analysis of Raw and Heat-Treated Milk. J.
Assoc. Publ. Analyst., 29, 1993, pp.I-32.
[3] DAHMS. S., WEISS, H. Estimation of Precision Values for Microbiological Reference
Methods: Standardized Pour Plate Technique. Milchwiss., 53, 1998, pp.555-559.
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