Química y Análisis de los Alimentos

3ª PARTE
ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS Y
DETERMINACIÓN DE COMPONENTES

TEMA 17

DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

Rosa Mª Garcinuño Martínez

rmgarcinuno@ccia.uned.es

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3ª Parte – Análisis de los Alimentos. Tema 17- Determinación de vitaminas

ÍNDICE

1. Introducción 3
2. Análisis de vitaminas 4
2.1. Métodos biológicos 7
2.2. Métodos microbiológicos 9
2.3. Métodos físico-químicos 10

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3ª Parte – Análisis de los Alimentos. Tema 17- Determinación de vitaminas

1. INTRODUCCIÓN

Las vitaminas son sustancias orgánicas, de naturaleza y composición variada, no

relacionadas estructuralmente entre sí, que precisan ser ingeridas en pequeñas
cantidades con la dieta, ya que son esenciales en el metabolismo para el crecimiento y,
en general, para el buen funcionamiento del organismo. Realizan una labor
imprescindible en los procesos metabólicos que tienen lugar en la nutrición de los seres
vivos. No aportan energía, ya que no se utilizan como combustible, pero sin ellas el
organismo no es capaz de aprovechar los elementos constructivos y energéticos
suministrados por la alimentación. Normalmente se utilizan en el interior de las células
como antecesoras de las coenzimas, a partir de las cuales se elaboran los miles de
enzimas que regulan las reacciones químicas de las que viven las células. Su efecto
consiste en ayudar a convertir los alimentos en energía.
Todas las vitaminas tienen funciones muy específicas sobre el organismo y
deben estar contenidas en la alimentación diaria para evitar deficiencias. No hay
alimento mágico que contenga todas las vitaminas, solo la combinación adecuada de los
grupos de alimentos hacen cubrir los requerimientos de todos los nutrientes esenciales
para la vida. Tener una buena alimentación es indispensable para el desarrollo de todas
nuestras habilidades físicas y mentales; además la deficiencia de vitaminas puede llevar
a contraer enfermedades graves que se podrían corregir con una alimentación
equilibrada. Por todo ello, el análisis de vitaminas en los alimentos desempeña un papel
crítico a la hora de determinar las necesidades nutricionales de los animales y los seres
humanos.
El análisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafío para los analistas
dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos problemas han sido
eliminados gracias a los recientes avances en la tecnología y el desarrollo de nuevos
enfoques analíticos. A pesar de ello, no es una tarea fácil analizar vitaminas y se
necesita experiencia y los conocimientos adecuados para garantizar resultados
reproducibles, que sean exactos y válidos.

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2. ANÁLISIS DE VITAMINAS

Los métodos empleados para la determinación de vitaminas se pueden clasificar

en métodos biológicos, involucrando seres humanos y animales, microbiológicos,
haciendo uso de microorganismos y métodos físico-químicos. Los dos primeros
métodos son los que se utilizado originalmente para la determinación de vitaminas,
puesto que la estructura química de las vitaminas se ha descubierto hace relativamente
poco tiempo.
La elección de un método u otro va a depender de una serie de factores tales
como la exactitud y precisión requeridos, el coste y la cantidad de muestras a analizar,
sin olvidar la aplicabilidad del método al tipo de matriz. Debido a la sensibilidad de
algunas vitaminas a las condiciones adversas tales como la luz, el oxígeno, el pH y el
calor, a lo largo de todo el proceso analítico se deben tomar precauciones adecuadas
para evitar cualquier deterioro, independientemente del tipo de ensayo utilizado. Tales
medidas de precaución han de ser tomadas con el material de prueba, en el caso de los
métodos biológicos, durante todo el periodo de alimentación, y en el caso de los
métodos microbiológicos y físico-químicos, durante todas las etapas implicadas en el
proceso analítico.
La determinación de vitaminas va a depender de la naturaleza de la propia
vitamina, su concentración en el alimento y la presencia o ausencia de interferentes.
Con excepción de algunos ensayos biológicos, la mayor parte de los análisis de
vitaminas requieren la extracción de la vitamina de su matriz, con anterioridad al
análisis, que por lo general, se lleva a cabo mediante las siguientes etapas:
- En primer lugar, hay que separar la vitamina del compuesto en el que se
encuentra, mediante una hidrólisis ácida, básica o enzimática.
- Extracción de la vitamina con un disolvente.
- Eliminación de interferentes. Generalmente se realiza por cromatografía en capa
fina.
- Determinación vitamínica. Se aplica el ensayo o método más apropiado en cada
caso.
Tal y como se dijo anteriormente, las vitaminas no pertenecen a un grupo
específico de compuestos, no hay relación química entre ellas y además, su estructura
química es muy compleja. Debido a estas causas se clasifican de acuerdo a su
solubilidad, en hidrosolubles (solubles en agua) y liposolubles (solubles en disolventes

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orgánicos). Esta clasificación es útil porque da idea de los procesos extractivos a

realizar para cada vitamina o grupo de vitaminas.

Extracción de vitaminas liposolubles

En el caso de las vitaminas liposolubles, el procedimiento de extracción requiere
un tratamiento de la muestra con KOH, para saponificar los posibles lípidos presentes
en la muestra. Esta saponificación se puede realizar o bien de un día para otro, o a
temperatura ambiente, mediante reflujo a 70 ºC, dependiendo de la muestra y de la
vitamina. Un segundo paso implica la neutralización de la muestra con HCl, dejando ya
la muestra lista para proceder a la extracción de las vitaminas, que se realiza
generalmente con éter de petróleo. En la fase orgánica del extracto quedarán las
vitaminas. Este extracto se lleva a sequedad y se redisuelve en n-hexano o en cualquier
otro disolvente adecuado para el método de análisis. La Figura 17.1 describe de forma
gráfica el procedimiento general para la extracción global de las vitaminas liposolubles,
que en principio sería adecuado para todo tipo de alimentos. En el caso de tratarse de la
extracción de las vitaminas A, D y E sería adecuado hacer una serie de modificaciones:

- En el caso de la determinación de la vitamina A, sería más adecuado utilizar

como extractante éter etílico en lugar de éter de petróleo.
- Si se trata de la determinación de la vitamina E, se debe adicionar ácido
ascórbico en medio alcohólico.
- En la determinación de las vitaminas E y D se debe usar potasa etanólica para el
proceso de la saponificación.

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Figura 17.1 Procedimiento general para la extracción global de las vitaminas liposolubles.

Extracción de vitaminas hidrosolubles

En el caso de las vitaminas hidrosolubles hay que distinguir entre la extracción
de la vitamina C o ácido ascórbico y la extracción del resto de las vitaminas
hidrosolubles. La extracción del ácido ascórbico se realiza utilizando como extractante
una disolución acuosa de ácido metafosfórico al 0.4%. El extracto se filtra y purifica
mediante un proceso de extracción en fase sólida empleando como C18 como
adsorbente.
En el procedimiento recomendado para la extracción de vitaminas hidrosolubles
de forma global se trata la muestra con con HCl 0.1 M en caliente (30 min, 100 ºC), y se
ajusta el pH a 4.5. Seguidamente la muestra se trata con la con enzimas β-amilasa y
taka-diastasa, durante 12 horas a 37ºC. Después de este periodo, la muestra se filtra y el
extracto se diluye con agua, dejando ya la muestra preparada para la determinación
analítica.

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2.1. MÉTODOS BIOLÓGICOS

Se observan los efectos curativos o fisiológicos de las vitaminas sobre animales

de experimentación. A pesar de que la experimentación animal es muy variable, y
constituyen ensayos muy largos, además del factor ético, estos métodos se siguen
utilizando cuando lo que se quiere determinar es el contenido de vitamina aprovechable
biológicamente y no el contenido total. Entre los métodos biológicos existentes, se
puede decir que para el análisis de vitaminas se emplean el ensayo de crecimiento, el
ensayo de tiempo de reacción, el ensayo de grado de respuesta y el ensayo de todo o
nada. En la Tabla 17.1 se incluyen los ensayos empleados para el análisis de las
diferentes vitaminas.

- Ensayo de crecimiento. En este tipo de ensayo se emplean ratas o pollos. Estos

se alimentan con una dieta adecuada de energía, proteína, minerales y todas las
vitaminas, exceptuando la que se va a determinar, hasta que presentan una
interrupción del crecimiento o síntomas patológicos de deficiencia. En este
momento se les comienza a alimentar con una dieta rica en el material ensayado
o bien cantidades conocidas de la vitamina a estudiar. El crecimiento se compara
con un experimento control, que se realiza de forma paralela.

- Ensayo del tiempo de reacción. Cuando el comienzo en la deficiencia en

vitaminas se puede ver claramente por un cambio patológico observable se
puede llevar a cabo el ensayo de tiempo de reacción. Los animales tests se les
quita una vitamina hasta que aparecen síntomas patológicos. Entonces se le
administra cantidades conocidas de la vitamina en estudio o del alimento a
analizar, hasta que desaparezcan los síntomas patológicos, para volver de nuevo
a la dieta deficiente, y esperar que aparezcan los síntomas. Se mide entonces el
tiempo que transcurre desde el comienzo del tratamiento hasta que vuelven los
síntomas. El tiempo de respuesta del alimento a analizar se compara con los
niveles estándar administrados.

- Ensayo de grado de respuesta. Cuando la gravedad del síntoma está relacionada

con la cantidad de vitamina presente, puede llevarse a cabo el ensayo de grado
de respuesta. Este se realiza de la misma forma que el ensayo de crecimiento.

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Los animales con un síntoma patológico de deficiencia de una vitamina, se les

corrige dicha deficiencia con una dieta basada en el alimento ensayado y una
cantidad estándar de vitaminas. El grado de corrección del síntoma se puede
determinar objetiva o subjetivamente mediante una técnica de tanteo. De una
forma objetiva sería, por ejemplo, determinar el contenido de vitamina D en las
cenizas presentes en el fémur del animal test. La técnica de tanteo requiere una
escala numérica que represente la corrección del síntoma (ej. no hay corrección
hasta 5).

- Ensayo de todo o nada. Este ensayo se lleva a cabo de la misma forma que el
ensayo de grado de respuesta, pero los efectos de la dieta test o de la dieta
estándar, junto con los síntomas se expresen en términos de corrección (+) o no
corrección (-). Este ensayo se emplea cuando es muy costoso cuantificar tanto
objetivamente como subjetivamente el grado de corrección de los síntomas. Se
compara el porcentaje de animales los cuales muestran corrección de síntomas
con diferentes concentraciones de la dieta test.

Tabla 17.1. Ensayos biológicos empleados en el análisis de vitaminas.

Vitamina Animal utilizado Ensayo

A Ratas Crecimiento
Tiempo de reacción
B Ratas, pollos Grado de respuesta
E Ratas Grado de respuesta
Todo o nada.
K Pollos Tiempo de reacción
B1. Tiamina. Antiberibérica Ratas Crecimiento

B2. Riboflavina Pollos Crecimiento

B3. Niacina. Ácido Nicotínico Ratas, pollos Crecimiento
Tiempo de reacción
B5. Ácido Pantoténico. Vitamina W Pollos Crecimiento
B6. Piridoxina Ratas, pollos Crecimiento
B8. Biotina. Vitamina H Pollos Crecimiento
B9. Ácido Fólico Ratas Crecimiento
Grado de respuesta
C. Ácido Ascórbico. Antiescorbútica Cerdos Grado de respuesta

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2.2. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

Los métodos microbiológicos se basan en cultivos de cepas de microorganismos

cuyo desarrollo depende específicamente de una determinada vitamina. El medio de
cultivo donde se realiza la siembra carece de la vitamina en cuestión y ésta es aportada
por extractos del alimento donde se pretende evaluar la vitamina. Paralelamente se hace
un cultivo control donde se siembra el microorganismo sin vitaminas y otro más donde
se siembra el microorganismo en diversos medios con contenido vitamínico diverso,
para poder llevar a cabo un estudio comparativo completo del crecimiento del
microorganismo en los diferentes medios de cultivo. La medida del crecimiento puede
ser estimada en términos de turbidez, producción de ácido láctico, gravimetría o por
medio de la respiración.
Los ensayos microbiológicos están limitados al análisis de vitaminas
hidrosolubles, siendo muy sensibles y específicos para cada vitamina, puesto que no se
dispone de microorganismos adecuados para las vitaminas liposolubles. FIBRA
Los microorganismos empleados para el ensayo dependerán de la vitamina a
determinar, siendo generalmente utilizados bacterias, levaduras o protozoos. La Tabla
17.2 incluye los diferentes microorganismos utilizados para cada una de las vitaminas.

Tabla 17.2. Microorganismos empleados en el análisis de vitaminas.

Vitamina Microorganismo
A, D, E, K No disponible
B1. Tiamina. Antiberibérica Lactobacillus fermenti, Lactoviridescens
B2. Riboflavina Lactobacillus casei, Streptococcus zymogens
B3. Niacina. Ácido Nicotínico Lactobacillus plantarum, Lactobacillus arabinosus
B5. Ácido Pantoténico. Vitamina W Lactobacillus plantarum, Lactobacillus arabinosus,
Lactobacillus casei
B6. Piridoxina Saccharomyces carlsbergensis
B8. Biotina. Vitamina H Lactobacillus plantarum, Lactobacillus arabinosus,
B9. Ácido Fólico Lactobacillus casei
B12. Cobalamina Lactobacillus leichmannii
C. Ácido Ascórbico. Antiescorbútica No disponible

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2.3. MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS

Las técnicas que se pueden utilizar para llevar a cabo el análisis físico-químico
de las vitaminas son las siguientes:
- Valoración
- Absorción UV
- Colorimetría
- Fluorescencia
- HPLC (Cromatografía de líquidos de alta eficacia)
- CG (Cromatografía de gases)

La tabla 17.3 incluye los métodos físico-químicos utilizados para la

determinación de vitaminas. Hay que resaltar que los desarrollos recientes en este
campo tienden a la utilización de la cromatografía de líquidos de alta eficacia y la
cromatografía de gases, mediante las cuales se pueden determinar conjuntamente un
grupo de vitaminas.

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Tabla 17.3. Métodos físico-químicos empleados en el análisis de vitaminas.

Vitamina Método Comentario

- Colorimétrico. Reacción de Carr-Price

Complejo azul intenso  = 500 nm
- Saponificación
A
- Fluorescencia - Purificación con alumina activada o Sephadex
exc=340nm, emi=480 nm

- HPLC- Detección UV-Vis

- Cantidades demasiado pequeñas
D -----
- Cantidades grandes: GC

- Colorimétrico. Reacción Emmerie-Engel

Complejo rojo  = 510-520 nm
E
- GC- Detector ionización de llama

- HPLC- Detección UV-Vis

- Se destruye en medio básico. No saponificación
K - Absorción UV (270 nm)
- Extracción de lípidos con disolventes
- Colorimétrico- Reactivo Sullivan

- Fluorescencia
B1 exc=440nm, emi=565 nm
Requiere tratamiento enzimático con una
proteasa y/o fosfatasa
- Colorimétrico

- HPLC- Fluorescencia

- Fluorescencia
B2 Se encuentra unida a ciertas proteínas. La
exc=450nm, emi=545 nm
separación se consigue con HCl y ↑Tª
- HPLC- Fluorescencia

B3 - Colorimétrico  = 470 nm

- HPLC- Detección UV-Vis

B6 - Colorimétrico  = 470 nm

- HPLC- Fluorescencia

- Valoración redox

C - Colorimétrico  = 525 nm

- Fluorescencia
exc= 365 nm, emi= 450 nm

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