El estudio de las interacciones de proteínas en células vivas es de particular importancia

porque las interacciones que ocurren en una célula particular dependen del complemento
completo de las proteínas presentes en la célula y de los estímulos externos que influyen en la
célula. El análisis de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) permite la
visualización directa de las interacciones de proteínas en las células vivas. El ensayo BiFC se
basa en la asociación entre dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente
cuando se aproximan entre sí mediante una interacción entre proteínas fusionadas a los
fragmentos.

INTRODUCCIÓN

Muchas proteínas tienen diferentes funciones en diferentes tipos de células y en células que
responden a diferentes señales extracelulares. Los efectos del entorno celular en las funciones
de las proteínas a menudo están mediados por interacciones con diferentes parejas en
diferentes condiciones. Las interacciones con proteínas también integran señales de diferentes
vías de señalización y programas de desarrollo y coordinan mecanismos reguladores en la
célula. Los estudios de las interacciones de proteínas en las células vivas pueden proporcionar
información sobre estas funciones ya que las interacciones con diferentes parejas pueden
ocurrir en diferentes células, en diferentes momentos y en diferentes ubicaciones
subcelulares. La visualización de las interacciones en las células individuales también permite
el análisis de las diferencias entre las diferentes células de la población. Los estudios en células
intactas también evitan la posibilidad de cambios en las interacciones de proteínas como
resultado de la lisis celular y la mezcla de los contenidos de diferentes compartimentos
celulares. En consecuencia, la visualización directa de complejos proteicos en células vivas
proporciona un valioso complemento a otros métodos para el estudio de las interacciones
proteicas.

VISUALIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES PROTEICAS

Varios métodos permiten la visualización de interacciones de proteínas en células vivas. La

mayoría de estos métodos requieren instrumentación elaborada y procesamiento de datos
complejo, o tinción con fluoróforos exógenos o colorantes. El ensayo de complementación de
fluorescencia bimolecular (BiFC) permite la visualización simple y directa de las interacciones
de proteínas en células vivas.

El enfoque BiFC se basa en la formación de un complejo fluorescente cuando dos proteínas

fusionadas a fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente interactúan entre sí
La interacción entre las proteínas de fusión facilita la asociación entre los fragmentos de la
proteína fluorescente. Este enfoque permite la visualización de las ubicaciones subcelulares de
complejos proteicos específicos en el entorno celular normal. El enfoque puede usarse para el
análisis de las interacciones entre muchos tipos de proteínas y no requiere información sobre
las estructuras de los socios de interacción. Se puede realizar usando un microscopio de
epifluorescencia estándar, y no requiere tinción de las células con fluoróforos o colorantes
exógenos.

DISEÑO DE EXPERIMENTOS BIFC

El análisis de BiFC se basa en la mejora de la asociación entre fragmentos de proteínas

fluorescentes por fusión de los fragmentos a proteínas que interactúan entre sí. Esto solo
ocurrirá bajo ciertas condiciones. Por lo tanto, los experimentos que hacen uso del ensayo BiFC
deben diseñarse para tener en cuenta los parámetros que afectan la asociación de los
fragmentos de proteína fluorescente.

Proteins A and B interact and thus bring the fragments of a fluorescent protein to close
proximity (reaction step 1). Fragments complement to a full protein (reaction step 2) which
shows fluorescence after maturation

Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método

sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

BiFC supervisa la interacción y la compartimentación subcelular de los complejos de proteínas.

En este método, una proteína fluororescent se divide en amino-y carboxi-terminal no
fluorescente fragmentos que se fusionan dos proteínas de interés. La interacción de los
resultados de las proteínas en la reconstitución del fluoróforo

Una limitación de BiFC es que una vez que el fluoróforo fragmentada se reconstituye el
complejo es irreversible 3. Esta limitación es una ventaja en la detección de interacciones
transitorias o débil, pero se opone a un análisis cinético de la compleja dinámica. Una
advertencia adicional es que el flourophore reconstituido requiere 30 minutos para madurar y
fluorescentes, una vez más se opone a la observación de las interacciones en tiempo
real 4. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de
fragmentos (PCA), que emplea las proteínas reportero como el verde variantes de la proteína
fluorescente (BiFC), la dihidrofolato reductasa, b-lactamasa, y luciferasa para medir las
proteínas: las interacciones proteína 5,6. Métodos alternativos para el estudio de proteínas: las
interacciones de proteínas en las células incluyen fluorescencia co-localización y transferencia
de energía por resonancia de Förster (FRET) 7. De co-localización, dos proteínas son
etiquetados individualmente, ya sea directamente con un fluoróforo o por
inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, este enfoque lleva a un segundo plano alto de la
no interacción de proteínas por lo que es difícil de interpretar co-localización de los datos.
Además, debido a los límites de la resolución de la microscopía confocal, dos proteínas pueden
aparecer co-localizados sin necesidad de interactuar. Con BiFC, la fluorescencia sólo se observa
cuando las dos proteínas de interés interactúan. FRET es otro método excelente para el
estudio de las proteínas: las interacciones proteína, pero puede ser técnicamente difícil. FRET
experimentos requieren el donante y el receptor a ser un brillo similar y la estequiometría de
la célula. Además, uno debe tener en cuenta para sangrar a través de los donantes en el canal
aceptor y viceversa. A diferencia de FRET, BiFC tiene pocos antecedentes de procesamiento de
fluorescencia, poco después de los datos de imagen, no requiere de la sobreexpresión de alta,
y puede detectar interacciones débiles o transitoria. Bioluminiscencia la transferencia de
energía de resonancia (BRET) es un método similar al FRET salvo que el donante es una enzima
(luciferasa, por ejemplo) que cataliza un sustrato para ser bioluminiscentes lo emocionante
aceptador. BRET carece de los problemas técnicos de la sangre a través de la fluorescencia de
fondo y alto, pero carece de la capacidad de proporcionar la información espacial, debido a la
falta de localización del sustrato a compartimentos específicos 8. En general, BiFC es un
excelente método para visualizar la localización subcelular de los complejos de proteínas para
profundizar en la señalización en compartimientos.

DISCUSSION

BiFC es un excelente método para la visualización de proteínas: las interacciones de proteínas

en células enteras y la determinación de la localización subcelular de estos complejos. Las
ventajas de BiFC es que sólo las proteínas que interactúan son fluorescentes, las interacciones
transitorias se han estabilizado, y post-tratamiento de los datos de imagen es mínima. Dos
desventajas de este método son el tiempo de maduración para el fluoróforo y la
irreversibilidad de la compleja fluoróforo.

La complementación Bimolecular de la fluorescencia (BiFC) es una técnica reciente usada en la

investigación y la visualización directa de las acciones recíprocas de la proteína-proteína (PPIs)
y acción recíproca entre las proteínas y otras macromoléculas que son esenciales para la
supervivencia de células. La Identificación de estas relaciones especifica su trabajo dentro de
las células en resumen. Los Organismos con las redes de PPI incluyen seres humanos, tornillos
sin fin, la levadura, y las instalaciones.

BiFC se utiliza principal en estudios genoma-anchos de PPIs; se determina como técnica

efectiva en la destapadura de nuevas acciones recíprocas de la proteína, y proporcionar a la
información nueva en funciones de la proteína.

Principio de BiFC

El principio de funcionamiento de BiFC se basa en el revelado de un complejo fluorescente,

como resultado de la asociación de dos segmentos de una proteína fluorescente cuando están
en la gran proximidad debido a la acción recíproca de la proteína-proteína en los fragmentos,
es decir, en BiFC, un fluoróforo se divide en extremos terminales amino y carboxilos. Estos
extremos se combinan en dos proteínas. Cuando obran recíprocamente estas dos proteínas,
ambos los segmentos reasocian dando por resultado la reforma del fluoróforo y de la
fluorescencia en los sitios del interfaz.

Conjunto de reglas para diseñar BiFC

Los experimentos de BiFC - mientras que se basa en la acción recíproca entre los segmentos
fluorescentes de la proteína - ocurren solamente en determinadas circunstancias. El análisis de
BiFC implica un análisis se fabrique que de una manera tal que satisfaga todos los parámetros
que afectan a la asociación de los segmentos fluorescentes de la proteína. El procedimiento de
la fabricación del análisis incluye:

Calibración de BiFC

La calibración de BiFC se realiza en cuatro escenarios como sigue:

1. La Selección de fluoróforo apropiado que trabaje fino como síntesis de BiFC partners.
Los Ejemplos de fluorophores son Venus y proteína fluorescente amarilla (YFP).
2. La Etiqueta de las proteínas en las cuales el BiFC divide en segmentos se pega al amino
o a las carboxilo-terminales de la proteína seleccionada.

3. Determinación de las condiciones económicas de la transfección antes de la prueba de

mutantes múltiples.

4. La Determinación de los cambios que ocurren en la localización de las proteínas

debido a la adición de BiFC divide en segmentos.

5. Transfección del Laminado y de la célula

6. En este proceso, las células se chapan inicialmente en una chapa fonda
de cristal y en dos receptores de papel de una placa de 6 receptores de
papel y entonces se permiten establecer durante la noche en la
temperatura ambiente. Entonces la célula DNAs se prepara para el
proceso de la transfección. Tras completar el proceso de la transfección,
la combinación se divide igualmente y después se incuba en la
temperatura ambiente por algunas horas. Después los media de la
transfección se quitan y se incuban de nuevo en la condición del sitio.
7. Preparación de las células para la proyección de imagen
8. En este proceso, las células se analizan inicialmente usando un
microscopio epifluorescent para controlar su fluorescencia. Entonces, la
preparación de células es hecha por la adición del paraformaldehido
después de lo cual se obtiene la imagen.
9. Proyección De Imagen de células
10. La intensidad de la fluorescencia es resuelta para cada célula. El análisis
Selectivo de las señales de BiFC es logrado realizando la transfección
junto con el CFP. La Proyección De Imagen se hace usando un
microscopio confocal.
11. Cuantificación de la Fluorescencia
12. La Medición de la intensidad de la fluorescencia es realizada usando
varios software de la proyección de imagen.
13. Análisis de datos
14. Las eficiencias de la complementación de la fluorescencia son
determinadas por el valor obtenido por la división de las intensidades de
la complementación de la fluorescencia y de las intensidades de la
proteína fluorescente entera en cada célula.
15. Diseño del experimento multicolor de
BiFC
16. El experimento Multicolor de BiFC implica la combinación de socios
sustitutivos y de los segmentos de las proteínas fluorescentes que
rinden pastas con diversas bandas del color. La proyección de imagen
 Secuencial es lograda por la visualización de las pastas que implican
longitudes de onda distintas de la emisión y de la excitación. La
Proyección De Imagen de las pastas se hace alternativamente para
prevenir la re-localización de cualquier pasta basada en el retraso entre
la proyección de imagen de las pastas.
17. Las intensidades de la fluorescencia se deben mantener en la magnitud
constante para prevenir el revelado de la variación en las distribuciones
causadas por la variación en la relación de transformación de los señal-
a-antecedentes. Las dispersiones entre dos fluorophores se pueden
también rectificar por la proyección de imagen las células que
representan solamente un grupo de proteínas.
18. BiFC Multicolor primero fue establecido en células mamíferas en
estudios que las diversas combinaciones usadas de YFP y del CFP.
BiFC idea para examinar las eficiencias relativas de la acción recíproca
de los bFos con el bJun y bATF2.
19. La mejoría de un método multicolor de BiFC para las células de la
instalación ayuda en la investigación del revelado simultáneo de los
complejos alternativos de la cinasa del sensor/de proteína del calcio en
planta.
20. Aplicaciones del análisis de BiFC
21. Las Aplicaciones de BiFC incluyen la proyección de imagen de la
distribución de estado estacionario de las pastas desarrolladas
agrupando de proteínas en diversos tipos de células y de organismos.
También activa la proyección de imagen de acciones recíprocas entre
las proteínas múltiples en una célula además de cambios en las
proteínas covalentes que proporcionan a la información adicional sobre
los procesos biológicos de las pastas de la proteína que se encuentran
recientemente.
22. Es también útil en la identificación de los diversos segmentos de la
proteína que se pueden combinar por la acción recíproca entre las
proteínas que se pegan a los segmentos que incluyen la β-
galactosidasa, el ubiquitin, y la reductasa del dihydrofolate. Los
experimentos de BiFC son también útiles en la determinación de la
topología de las proteínas de la membrana y del alto examen de entrada
de información y del rendimiento de pequeños efectos moleculares
sobre las pastas de la proteína.

esta técnica nos permite saber si dos proteínas (DELLA y la que queremos saber si se le
une) están interaccionando o uniéndose entre sí.