INSTITUTO TECNOLÓGICO DEL VALLE DE

MORELIA

CARRERA: INGENIERIA EN AGRONOMÍA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

TEMA: PREPARACIONES PARA

MICROSCOPIA, TIPOS, TECNICAS Y
PRESERVACIÓN.
 2.2 Preparaciones para
microscopía.
En todos los microscopios, la calidad de imagen depende de tres
factores.

• El aumento es la amplificación de un objeto.

• El contraste es diferencia de la intensidad luminosa.

• Una buena resolución significa ser capaz de percibir dos

puntos adyacentes de una imagen como separados uno del
otro.
• El poder de resolución de un microscopio se puede aumentar
usando lentes de aumento de mayor tamaño, iluminando el
espécimen con una luz de menor longitud de onda, o usando
aceite de inmersión.
• PREPARACION Y TINCION DE LA
MUESTRA
• Aumentar la resolución
• Acentuar características morfológicas
• Conservar la muestra

• PREPARACION (FIJACION)
• En este proceso se fijan en su
posición las estructuras internas y
externas de la célula.
• Mata al microorganismo y se fija al
portaobjetos
• Por calor: Preservar morfología
general pero no las estructuras
internas.
• Química: Proteger la sub-estructura
fina y la morfología de los
microorganismos delicados.
• Las preparaciones en fresco se utilizan para observar
microorganismos vivos.

• La forma más simple de preparar un microorganismo para un

examen microscópico es hacer una preparación en fresco o “in
vivo”.

• Una preparación en fresco simple (entre porta y cubre) consiste en

colocar una gota de líquido con los microorganismos, después
colocar el portaobjetos y el cubreobjetos.

• El inconveniente de la observación en fresco es que no permite

aumentar el contraste de la preparación.
• Preparación en gota pendiente:
Se utiliza para la observación “ in
vivo “.
• Consiste en depositar una gota de la
suspensión microbiana en el
cubreobjetos aprovechando la
tensión superficial del agua, se gira
el cubreobjetos cuidadosamente y
se coloca sobre un portaobjetos
excavado.
• La ventaja de esta última técnica,
es que la preparación no se evapora
y puede ser observada durante un
tiempo más largo.
• Si se desea, puede usarse parafina
o vaselina en el cubreobjetos para
hacer la muestra mas hermética.
• Los frotis.
• En ocasiones, la concentración de células en una
muestra puede ser muy elevada, o por su
naturaleza encontrarse muy aglutinadas.

• Para extenderlas sobre un portaobjetos y

poderlas observar bien se preparan los frotis.

• Para realizar un frotis, ya sea de sangre,

suspensión celular, suspensión de cultivo
bacteriano, etc.
• Técnica de la tinción de Gram.
• Gracias a esta tinción, veremos a las bacterias divididas en dos grupos,
las Gram +, que aparecen con un intenso color morado debido al
colorante violeta de genciana, y las Gram -, que parecen teñidas de un
débil tono rosado debido al colorante safranina.

• Esta diferenciación es debida a que las Gram + quedan teñidas por el

violeta de genciana, sin perder el colorante en la decoloración
alcohólica.

• Por el contrario, las Gram – no han quedado teñidas por el violeta de

genciana y lo pierden en la decoloración.
 2.2.1 Tipos
Un microscopio optico utiliza la luz visible como fuente de
iluminación. Posee dos sistemas de lentes; lente ocular y lente
objetivo.

Los microscopios ópticos compuestos están provistos de varios

objetivos:

Débil seco: 10x

Fuerte seco: 40x
Objetivo de inmersión: 100x

Un microscopio óptico ordinario produce un campo de iluminación

claro que pasa a través del espécimen y se observa de forma
brillante.
• Un microscopio electrónico posee un poder de
resolución mayor al óptico.

• El microscopio electrónico de transmisión

(MET) utiliza un chorro de electrones en lugar de
luz visible para definir el objeto.

• Produce aumentos de 200 000x en comparación

con los 1000x para un microscopio óptico.
• El microscopio electrónico de barrido (MEB)
bombardea la superficie del espécimen con un rayo
de electrones de tal manera que produce imágenes
tridimensionales.

• Las muestras para el MEB deben ser congeladas y

desecadas al vacío y después recubiertas con un
metal pesado.

• El MEB se utiliza generalmente para visualizar

células enteras, pero la criofractura y el criograbado
también permiten observar estructuras internas.
Comparativa de la composición básica de un
microscopio óptico (izquierda), electrónico de
transmisión (centro) y electrónico de barrido (derecha)
 Tipos de microscopía
• Microscopía óptica normal: El
material a observar se colorea
con colorantes específicos que
aumentan el contraste y revelan
detalles.

• Microscopía de campo
brillante: Se observa sin
coloración. La luz pasa
directamente y se aprecian
detalles naturalmente coloreados

• Microscopía de campo
oscuro: Produce una imagen
iluminada del objeto sobre un
fondo oscuro. Se emplea para
observar organismos vivos en
preparaciones sin teñir.
• Microscopia de fluorescencia:
• El contraste se aumenta por medio de la fluorescencia.

• El microscopio debe modificarse con filtros especiales para

iluminar la preparación con luz ultravioleta de longitud de
onda corta.

• (Esta es la propiedad que tienen algunos materiales de

absorber luz de una determinada longitud de onda y
devolverla con una longitud de onda mayor).
• Microscopía en contraste de fase: El contraste se debe
a que los diferentes materiales absorben diferentes
cantidades de luz.

• Se usa principalmente para aumentar el contraste entre

las partes claras y oscuras de las células sin colorear.

• Puede utilizarse con células vivas sin teñir, es una buena

técnica para observar detalles pequeños y estudiar el
movimiento celular.
• Microscopía de Nomarsky; [microscopía
diferencial de contraste de interferencia
(DIC) ] :
• Proporciona contraste por interferencia, como lo
hace el contrate de fases, pero produce una imagen
semejante a las tridimensionales, con más detalle.
• Se usa cuando el espécimen es muy grueso para
usar contraste de fases.
• Utiliza dos rayos de luz polarizada, fue diseñado para
observar relieves de especímenes muy difíciles de
manejar, es muy utilizado en los tratamientos de
fertilización in-vitro.
 2.2.2 Técnicas
• TINCIONES
• Los colorantes son compuestos
químicos utilizados para aumentar
el contraste. La mayoría sólo son
efectivos si los microorganismos
han sido fijados.
• Un mordiente es un compuesto
que recubre la estructura para
hacerla mas visible.

• Colorantes básicos: iones

cargados positivamente

• Colorantes ácidos: iones

cargador negativamente
• Una tinción simple utiliza un solo colorante. Una tinción
diferencial consta de dos etapas, una tinción primaria y una de
contraste.

• La tinción de Gram es diferencial y distingue entre bacterias

Gram positivas y Gram negativas, debido a distintas superficies
externas.

• La tinción de acido-alcohol resistencia- o de Ziehl Neelsen-

es diferencial y tiñe las micobacterias de rojo, mientras que las
otras bacterias son teñidas de azul por el colorante de contraste.

• La tinción de Wirtz- Conklin tiñe las endosporas, estructuras de

reposo de algunas bacterias.

• La tinción de Leifson utiliza colorantes u mordientes para teñir

los flagelos, apéndices filamentosos por la motilidad.

• La tinción negativa se utiliza para observar la cápsula, una

estructura protectora de algunas bacterias.
 2.2.3 Preservación
• Mantenimiento bajo capa de aceite

• Simple y efectiva
• Consiste en cubrir el cultivo (medio sólido) con
una capa de aceite mineral o vaselina.
• Pueden conservarse por periodos de tiempo
largos (varios años) a temperatura ambiente.
• Pueden ocurrir mutaciones, luego de los 3 años
de mantenimiento.
• Desecación:
• La eliminación del agua (deshidratación) es un
método de conservación que reduce drásticamente
el metabolismo.

• No todos los microorganismos sobreviven a estos

métodos de secado, por lo que se hace necesario
añadir agentes protectores (leche descremada,
glutamato sódico al 10%).

• Es importante mantener el producto sellado (tapón

de rosca o ampolla) para evitar el contacto con el
aire ya que son higroscópicos.
Soportes, se suelen utilizar:

• Arena
• Suelo
• Gel de sílica
• Discos o tiras de papel
• Agar
• Discos de gelatina
• Estos deben ser previamente secados y
esterilizados por calentamiento con aire caliente
seco.
• Congelación:
• Bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el
metabolismo drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo con nitrógeno líquido (-
196°C).

La formación de cristales de hielo (pueden romper las células), para evitar esto se deben
utilizar:

• Suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles

• Agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfóxido (DMSO al 10%) que neutralizan
el efecto de las sales.

• Algunos recomiendan una bajada gradual de temperatura (1°C/min) hasta -20°C para luego
enfriar rápidamente. La descongelación debe ser rápida.

Esquema de los eventos físicos ocurridos en el

congelamiento. (hexágonos representan cristales
de hielo de diferente tamaño según la velocidad
de enfriamiento). Adaptado de Ciba, 1977.
 Crioprotectores:

• Glicerol 10%
• Dimetilsulfóxido
• Glucosa
• Dextranos
• Sacarosa
• Lactosa
• Extracto de malta
• Liofilización:
• Es el método más utilizado por las colecciones internacionales
de cultivos de microorganismos.

• Consiste en congelar rápidamente una suspensión de

microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua
directamente del hielo sin pasar por el estado líquido.

El sistema requiere tres componentes:

• Mecanismo de congelación
• Bomba de vacío
• Una trampa de agua.

• Los microorganismos liófilizados se conservan entre 0°y 5°C

durante muchos años.
• Para su recuperación se resuspenden los organismos en el
medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura
adecuada.
 Algas y cianobacterias
• La mayor parte de los cultivos se han mantenido
como subcultivos seriados a temperaturas entre
10°y 15°C.
• Para crecer estos cultivos se necesita luz, ya que
son fotosintéticos.
• Las algas no toleran bien la liofilización ni la
desecación.
• Con relación a la congelación los mejores
resultados se obtienen con nitrógeno líquido.
 Bacterias
• Prácticamente se han usado todos los métodos
conocidos con buenos y malos resultados, aunque
en líneas generales el mejor método es la
liofilización debido a su facilidad de transporte.
 Virus
• Se han utilizado todos los métodos, pero
obteniendo en líneas generales baja estabilidad.
• Se recomienda para su conservación durante
largos períodos de tiempo el nitrógeno líquido.

Hongos
• La mayoría de los hongos pueden conservarse
por desecación en suelo.
 Bibliografía
• INGRAHAM, John L y Catherine, Introducción a la Microbiología, Editorial Reverté, S.A.
Barcelona, España, 1998.

• http://
depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf

• http://
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• http://
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• http://
www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscopia_a_grandes_rasg
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• http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica2PreparacionesYtinciones_20836.pdf

• http://
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• http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/manual_microscopio.pdf