Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
1
NDICE
INTRODUCCIN 3
OBJETIVO GENERAL 3
PRCTICA No. 1 9
PRCTICA No. 2 16
PRCTICA No. 3 25
PRCTICA No. 4 36
PRCTICA No. 5 43
PRCTICA No. 6 50
PRCTICA No. 7 57
PRCTICA No. 8 65
ANEXOS 73
A1: EVALUACIN DEL LABORATORIO 74
A2: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 1 79
A3: INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 2 81
A4: INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 4 y 6 82
A5: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 6 y 7 86
A6: INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 8 89
2
INTRODUCCIN
Este material de apoyo didctico ha sido diseado para servir de apoyo tanto para los
alumnos como para los instructores, el proceso de experimentacin en un laboratorio escolar es
fundamental para relacionar y aplicar los conocimientos adquiridos en clase y reforzar el proceso
de enseanza aprendizaje, sin importar la orientacin cientfica por la que se inclinen los
alumnos.
OBJETIVO GENERAL
3
REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIOS
Este reglamento es de observancia obligatoria para cualquier persona que ingrese o visite los
laboratorios de la Escuela de Ciencias de la Salud (ECISALUD).
1. Usar bata blanca de laboratorio con manga larga, abotonada, traje quirrgico
correspondiente, zapato blanco cerrado, cabello recogido.
2. Portar credencial de identificacin visible mientras permanezca dentro del laboratorio. Los
alumnos de primer semestre la portarn hasta que el Centro las proporcione.
3. Esperar afuera del laboratorio hasta que el docente indique la entrada para iniciar sesin.
4. Prohibido: introducir alimentos y/o bebidas, fumar, gritar, correr, jugar, sentarse en las
mesas de trabajo, usar joyera y/o alhajas grandes que pudieran ocasionar accidentes,
lesin o interferencia en el trabajo, usar celulares o sistemas de comunicacin mvil.
5. Mantener sus pertenencias fuera del rea de trabajo o en los espacios asignados por el
docente de laboratorio.
6. Lavarse las manos antes y despus de trabajar en cada sesin.
7. No se podrn realizar prcticas sin la supervisin de un responsable del laboratorio.
8. Mantener limpia, ordenada y/o saneada su rea de trabajo, antes y despus de realizar
la actividad.
9. Usar equipo de proteccin personal (guantes de ltex, lentes de seguridad, mascarilla,
etc.) durante la permanencia dentro del laboratorio, de acuerdo a la actividad a realizar.
10. No distraer a sus compaeros durante la manipulacin de material, equipo y sustancias
qumicas.
11. No presentarse bajo el influjo de bebidas alcohlicas o cualquier otra droga.
12. Respetar horarios de actividades y en caso de no terminar la actividad en su horario,
solicitar acceso al responsable.
13. No mover, sustraer, manipular o hacer uso indebido de equipo sin autorizacin, as como
sistemas de cmputo y/o transmisin de datos.
14. Reportar incidentes o accidentes por leve que sean con o sin lesin, condiciones
inseguras y equipo daado al docente de laboratorio o al responsable del laboratorio.
15. No trate de atender un accidente o contingencia para lo cual no ha sido capacitado.
16. En simulacros o contingencias obedecer las disposiciones de seguridad indicadas por el
docente, coordinador o responsable del evento.
17. Disponer los residuos generados en la prctica en los contenedores correspondientes
bajo supervisin del tcnico acadmico, docente, responsable del laboratorio o por
personal capacitado para ello. Es responsabilidad del docente de laboratorio proporcionar
la informacin pertinente para la correcta disposicin de los residuos.
18. Prohibido verter slidos o sustancias qumicas peligrosas en los lavabos.
19. Mantener las puertas y ventanas cerradas en caso de que la actividad a realizar as lo
requiera.
20. Prohibido visitas no autorizadas. (Los responsables del laboratorio o direccin son los
que autorizan las visitas y debern de advertir a los visitantes sobre los riesgos y medidas
de seguridad del laboratorio).
4
21. El usuario deber de contar con material de limpieza de acuerdo a las actividades
realizadas.
22. Los alumnos que tengan asignada gaveta o rea, mantenerla limpia, en buenas
condiciones y desocuparla en el tiempo establecido por ECISALUD.
23. No se podrn guardar reactivos en las gavetas, a menos que el tcnico acadmico,
docente, investigador o responsable del laboratorio tenga una gaveta exclusiva para ello.
24. Respetar las condiciones de seguridad y funcionalidad del laboratorio.
25. En caso de ruptura o dao del material o equipo de laboratorio, ste deber ser repuesto
o reparado en un lapso no mayor a 15 das.
26. El responsable de la sesin o actividad, deber anotar, las cantidades de reactivos
utilizados en las prcticas, investigaciones o servicios externos; en la bitcora de
consumo de reactivos.
27. Al terminar la sesin de laboratorio, verificar que los servicios de agua, gas, vaco, aire a
presin y/o energa elctrica no se desperdicien.
28. Prohibido introducir mascotas al laboratorio.
29. Se deber notificar al Coordinador o Responsable de laboratorio acerca de las prcticas
que requieran muestras biolgicas. En caso de ser externas, se llenar y firmar el
formato de consentimiento informado. Las muestras slo pueden ser utilizadas con fines
de docencia.
30. No se podrn tomar muestras biolgicas sin la autorizacin y supervisin de un
responsable de laboratorio.
Por lo cual, en caso de incumplimiento parcial o total a estos lineamientos, se harn acreedores
a las sanciones correspondientes indicadas en la reglamentacin universitaria o estipulada en el
contrato colectivo de trabajo segn corresponda.
5
REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR
Los alumnos (as) que se encuentren inscritos en el curso de Biologa celular debern tener
conocimiento del reglamento general de laboratorios de ECISALUD y el reglamento del
laboratorio de biologa celular.
NOTAS:
Los alumnos (as) que no aporten el material que les sea solicitado para
alguna de las prcticas no podrn permanecer en el laboratorio.
En caso de que el material consumible se agote, el alumno ser
6
responsable de traer nuevo material para la realizacin de su prctica.
6. Para las prcticas que involucren el uso del microscopio, queda prohibido el uso de
maquillaje de ojos.
7. Los alumnos debern limpiar con solucin desinfectante el rea de trabajo ANTES de
empezar y al TERMINAR la prctica.
8. Los alumnos se harn cargo de la limpieza e integridad del material y equipo
proporcionado por el instructor al inicio de la prctica. Antes finalizar la sesin, debern
entregar el material proporcionado por el instructor, limpio y seco. De igual manera, el
equipo deber cumplir las condiciones de limpieza.
9. Los alumnos (as) son responsables de que las llaves de agua, gas y vaco, de sus mesas
de trabajo queden debidamente cerradas al finalizar cada prctica.
10. El rea de trabajo deber estar libre de cualquier material que no sea requerido para la
realizacin de prcticas (ej. ropa, bolsas, mochilas, libros, etc.).
11. La calificacin obtenida en cada prctica de laboratorio estar basada parcialmente en
los requisitos que marca la rbrica de evaluacin de bitcora (Anexo 1), la cual precisa
los puntos a seguir para elaborar la bitcora de laboratorio completa.
12. La evaluacin del alumno en sesin de laboratorio incluye, adems de la realizacin de
la bitcora de prctica, mantener una buena conducta, demostrar destreza en el
desarrollo de los experimentos, tener una actitud de compaerismo, trabajo y respeto
basado en valores. Estos aspectos sern considerados para su evaluacin final y se
encuentran detallados en la rbrica de evaluacin (Anexo 1).
7
GUA DE ELABORACIN Y ENTREGA DE BITCORA DE LABORATORIO
El manual de laboratorio tendr una doble funcin como bitcora, ya que cada prctica
contiene los espacios destinados para que el alumno vaci la informacin que se le pide a mano.
La bitcora deber ser llenada y entregada en cada sesin de laboratorio con las siguientes
caractersticas:
Marco terico.
Una extensin mnima de cuartilla y mxima de una.
Utilizar y citar referencias bibliogrficas de mnimo tres libros y un artculo cientfico y
mximo 3 pginas web con dominio .edu de universidades reconocidas por su
calidad.
Citado en prrafo y al final del texto bajo los criterios del formato APA (Manual de la
APA disponible para consulta en la pgina web de Biologa Celular CISALUD,
pestaa Laboratorio).
Resultados e interpretacin.
Realizar lo que indica la prctica para esa seccin con una descripcin detallada.
Cuestionario.
Resolver las preguntas que se les presente en su manual.
Conclusiones.
Concluir en base a los resultados obtenidos y al cumplimiento de competencias. Media
cuartilla de extensin.
8
PRCTICA No. 1
TEMA TERICO AL QUE APOYA: Introduccin al curso de Biologa celular y bases qumicas
de la biologa.
FUNDAMENTO DE LA PRCTICA:
La Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente, define como residuos
peligrosos a todos aquellos residuos que por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas,
txicas, inflamables y biolgico-infecciosas, que representan un peligro para el equilibrio
ecolgico o el ambiente (LEGEEPA, 2010).
La manipulacin de Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos implica un riesgo para la
salud de las personas directamente relacionadas con los residuos pero tambin puede significar
un riesgo potencial para la poblacin en general y el medio ambiente. Por tales motivos, las
personas y empresas que generan y manejan dichos residuos estn obligadas a seguir la
normatividad vigente elaborada con el fin de minimizar riesgos y eficientizar su uso y disposicin.
La normatividad para el manejo de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos responde
a estrictas regulaciones ambientales, las cuales, es necesario actualizar tomando en
consideracin las experiencias y competencias de los sectores involucrados en su cumplimiento,
con el fin de que sus disposiciones sean operativas y adecuadas para proteger el medio ambiente
y la salud de la poblacin en general (Diario Oficial de la Federacin, 2003).
As pues, siguiendo la labor de informacin, se hizo una actualizacin de la Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-1995, resultando la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, publicada
en el Diario Oficial de la Federacin. (Diario Oficial de la Federacin, 2003).
Las empresas que manejan y generan R.P.B.I tiene la responsabilidad de consultar la
Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 para reglamentar cada una de los
procedimientos que se relacionan con estos residuos, as como tener a la mano un plan de
contingencia en caso de que suceda el derrame de algn residuo considerado peligroso (Diario
Oficial de la Federacin, 2003).
Para la identificacin de las reas, recipientes, materiales o procedimientos que impliquen
un riesgo biolgico se utiliza un smbolo universal, el cual se muestra en la imagen de la derecha.
9
MARCO TERICO:
10
MATERIALES Y EQUIPO
METODOLOGA
Cmara de jeringa.
Hisopo con saliva.
Aguja.
Torunda de algodn.
Tubo vacutainer con muestra de sangre.
Gasa.
Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Cubreobjetos con muestra.
Gasa con sangre.
Empaque de la jeringa.
Algodn con sangre.
Guantes.
Cmara de jeringa con sangre.
Algodn impregnado y tirando sangre.
Hisopos.
Sangre.
Portaobjetos con muestra de eritrocitos.
Papel.
Tubos rotos.
Abatelenguas con saliva.
Guantes con sangre o fludos.
Puntas de pipeta contaminadas.
Hoja de bistur contaminada.
11
DIAGRAMA DE FLUJO:
12
RESULTADOS E INTERPRETACIN
13
CUESTIONARIO
1. Por qu es importante el buen manejo de los R.P.B.I. dentro y fuera del laboratorio?
CONCLUSIONES:
Concluye en base a la utilidad de la prctica de laboratorio y la disposicin de estos materiales
para su confinamiento.
14
APLICACIN PRCTICA: El manejo de forma correcta de los R.P.B.I en cualquier laboratorio o
institucin de salud, donde el estudiante contine su formacin como futuro profesionista.
LITERATURA CITADA
1. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental, Salud
Ambiental, Residuos Peligrosos Biolgico infecciosos, Clasificacin y Especificaciones de
Manejo. Diario Oficial de la Federacin, 2003. Extrada de
http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/Academico/Material_de_Estudio/RPBI/links/NO
M_087_ECOL_SSA1_2002.pdf
2. Ley General del Equilibrio Ecolgica y Proteccin al ambiente. Diario Oficial de la
Federacin, 2010. Extrada de http://www.diputados.gob.mx/LeyesBiblio/pdf/148.pdf
15
PRCTICA No. 2
FUNDAMENTO DE LA PRCTICA:
Se pueden clasificar desde un punto de vista muy sencillo en: simples y compuestos. Se le da el
nombre de microscopio simple a todas aquellas lentes con montura o sin ella, de distintos
espesores y dimetros, biconvexas o planoconvexas, que nos permiten amplificar los objetos,
comnmente conocidas como lupas (consultar Anexo 3).
16
MARCO TERICO:
17
MATERIALES Y EQUIPO:
Microscopio ptico
Laminillas con diferentes muestras
Aceite de inmersin
Papel seda (Kimwipes)
Lquido para limpiar oculares y lentes
METODOLOGA:
18
DIAGRAMA DE FLUJO:
19
RESULTADOS:
En los siguientes espacios dibuja lo observado en cada uno de los objetivos utilizados.
Laminilla 1: ______________________________
20
Laminilla 2: _______________________________
21
CUESTIONARIO:
22
2. Indica las ventajas y desventajas del uso y del manejo del microscopio ptico.
Ventajas Desventajas
23
CONCLUSIONES:
Concluye en base a tu experiencia en la sesin utilizando el microscopio ptico, acerca de su
manipulacin, enfoque y mantenimiento; as como la utilidad que tiene en el estudio de las clulas
y su comparacin con otras tcnicas de microscopa.
LITERATURA CITADA:
1. Bernis, M. 1998. Atlas de Microscopia. Mxico D.F. Segunda edicin. Editorial Fernando
Aldape Barrera. Pags. 95-107.
2. Vovides, A. 2000. Microscopia ptica: para las ciencias biolgicas. Chiapas. Universidad
de Ciencias y Artes del Estado de Chiapas. Pags. 14-19.
3. Seplveda, J. 2011. Histologa: Biologa celular y tisular. Instructivo de laboratorio. Quinta
edicin. Editorial Mc Graw-Hill. Pg. 2.
24
PRCTICA No. 3
FROTIS BUCAL
Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Una preparacin temporal es
aquella que es utilizada en el momento de la observacin, ya que requiere que el medio de
montaje no se evapore tan rpidamente y que sea posible que el material biolgico se conserve
por un tiempo en condiciones de ser observado. Las preparaciones permanentes son aquellas
que permanecen intactas por siempre, por lo que se debe hacerse con un material especial
para que el cubreobjetos permanezca perfectamente adherido al portaobjetos durante aos y
muestra no se deteriore.
25
MARCO TERICO:
26
MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS:
Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Gotero.
Papel de seda (Kimwipes)
Hisopos estriles.
Abatelenguas.
Vaso de precipitados.
Azul de metileno.
Agua destilada.
Violeta de genciana.
Lugol.
Safranina.
Alcohol acetona.
Aceite de inmersin.
Microscopio ptico.
MUESTRA BIOLGICA:
Clulas de la mucosa bucal.
METODOLOGA:
CLULAS EUCARIOTAS:
1. Colocarse los guantes.
2. Tomar un portaobjetos y un cubreobjetos bien limpios y secos.
3. Para obtener la muestra, tirar del labio inferior hacia fuera y raspar de forma circular, la
parte interna del mismo con un hisopo estril.
4. Colocar la muestra en el portaobjetos frotando el hisopo en sobre el centro del mismo.
5. Depositar una gota de agua sobre la muestra, en el centro del portaobjetos.
6. Con el extremo contrario del hisopo, extender la mucosa extrada y disprsarla en la gota
de agua.
7. Teir las preparaciones agregando una gota de azul de metileno sobre la muestra.
8. Colocar el cubreobjetos cuidando de no hacer burbujas.
9. Observar al microscopio, enfocando progresivamente con los objetivos de menor a mayor
aumento.
CLULAS PROCARIOTAS:
Preparacin de la muestra:
1. Sujeta la lengua del paciente con el abatelenguas y frota con firmeza la pared
posterior de la garganta con el hisopo de algodn seco y estril (Fig. 1). NOTA:
Se debe tener cuidado de no tocar la epiglotis para no provocar el vmito en el
paciente.
27
Fig. 1. Toma de muestra de exudado farngeo.
2. Frota la muestra de manera circular en un portaobjetos limpio y seco. Deja
secar.
3. Fijar la extensin calentando suavemente a la llama del mechero en 3 series de
3 pases rpidos por la flama, cuidando de que el portaobjetos no se caliente
excesivamente.
Tincin:
1. Cubrir la muestra con colorante de Violeta de Genciana. Esperar 1 minuto.
2. Escurrir el colorante en un vaso de precipitados y sin enjuagar, cubrir con
solucin Gram de Yodo. Esperar 1 minuto.
3. Escurrir el colorante en el mismo vaso de precipitados y sin enjuagar, cubrir
con Alcohol acetona hasta decoloracin.
4. Escurrir el alcohol y sacudir para evaporar el resto del Alcohol acetona.
5. Cubrir el frotis con colorante Safranina. Esperar 1 minuto.
6. Lavar repetidas veces con agua corriente hasta que no haya restos de
colorante.
7. Secar y observar al microscopio.
28
DIAGRAMA DE FLUJO:
29
RESULTADOS:
Descripcin
Descripcin
30
CLULAS EUCARIOTAS (Objetivo 40x) Dibujo
Descripcin
Descripcin
31
CLULAS PROCARIOTAS (Objetivo 4x) Dibujo
Descripcin
Descripcin
32
CLULAS PROCARIOTAS (Objetivo 40x) Dibujo
Descripcin
Descripcin
33
CUESTIONARIO:
1. Se observa algn orgnulo citoplasmtico? Cul?
3. Cules colorantes se utilizan para teir clulas eucariotas, adems del azul de metileno?
CONCLUSIONES:
El alumno indicar el aprendizaje obtenido a partir de la realizacin de la prctica, as como su
comentario final al respecto de las observaciones.
34
APLICACIN PRCTICA: Se utilizan tinciones especficas para observar ciertas caractersticas
celulares como la organizacin de organelos o resaltar de manera especial alguna caracterstica
o componente celular.
LITERATURA CITADA:
1. Karp, G. 2001. Biologa Celular y Molecular. ISBN: 9701016440
2. Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular Biology of the
Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN 0-8153-2045-0
3. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial Panamericana. Pags. 17-18.
35
PRCTICA No. 4
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
La membrana de eritrocito es la ms sencilla de las membranas celulares. Esta consta
de una doble capa lipdica y un esqueleto proteico en su cara citoplasmtica. La morfologa del
eritrocito depende de la osmolaridad del medio en que se encuentra. En condiciones fisiolgicas
(osmolaridad de ~290 mOsm/Kg), el eritrocito tiene forma de disco bicncavo.
En sta prctica se visualizarn al microscopio los cambios morfolgicos del eritrocito en
medios hipertnico, isotnico e hipotnico.
36
MARCO TERICO:
37
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Jeringa.
Torniquete.
Torundas de algodn.
Alcohol etlico.
Tubo vacutainer con anticoagulante (EDTA).
Microtubos o tubos de ensaye.
Soluciones de NaCl al 1.8%, 0.9% y 0.45%
Solucin de sodio-dodecil-sulfato (SDS) al 0.1%
Agua destilada.
Pipetas semiautmaticas y puntas desechables.
Portaobjetos.
Cubreobjetos.
Microscopio ptico.
Papel de seda y lquido para limpieza de lentes de microscopio.
Recipientes para R.P.B.I.
METODOLOGA:
1. Obtener sangre fresca (aprox. 3 ml) de uno de los alumnos del subgrupo, utilizando la
tcnica apropiada de venopuncin (descrita en Anexo 6 de este manual)
2 Transferir la sangre a un tubo vacutainer con EDTA o heparina.
3 Rotular los 4 tubos de ensaye de acuerdo a la solucin que van a contener (1.8%, 0.9%,
0.45% y SDS 0.1% respectivamente).
a. En el tubo # 1, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 0.45 %
b. En el tubo # 2, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 0.9 %.
c. En el tubo # 3, colocar 1.5 ml de solucin NaCl al 1.8 %.
d. En el tubo # 4, colocar 1.5 ml de solucin NaCl 0.9%, agrega 1 gota de SDS al
0.1%.
4. Aadir 1 gota de sangre a cada uno de los 4 tubos de ensaye.
5. Mezclar con cuidado.
6. Rotular 4 portaobjetos limpios de la misma forma que los tubos de ensaye.
7. Realizar 4 preparaciones temporales, colocando 1 gota de cada una de las suspensiones
obtenidas en el portaobjetos correspondiente y cubrir cuidadosamente con un
cubreobjetos.
8. Visualizar la morfologa eritrocitaria al microscopio en el objetivo 40X.
38
DIAGRAMA DE FLUJO:
39
RESULTADOS:
Describir en su bitcora la morfologa observada en cada tipo de solucin de NaCl y con el SDS.
Descripcin
Descripcin
40
Eritrocitos en solucin NaCl 1.8% Dibujo
Descripcin
Descripcin
41
CUESTIONARIO:
CONCLUSIONES:
Anotar las conclusiones relativas a la fragilidad osmtica del eritrocito.
LITERATURA CITADA:
1 Karp, G. 2001. Biologa Celular y Molecular. ISBN: 9701016440
2 Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular Biology of the Cell.
Garland Publishing, Inc. ISBN 0-8153-2045-0
42
PRCTICA No. 5
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
Los organelos celulares varan tanto en funcin como en forma, tamao y peso. Esto
permite, que a travs de medios fsicos, como la centrifugacin diferencial, los organelos puedan
ser separados para ser estudiados individualmente.
43
MARCO TERICO:
44
MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS:
- Microcentrfuga
- Microscopio ptico
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Bistur o tijeras
- Tubos para microcentrfuga
- Pipetas semiautomticas
- Vasos de precipitados
- Mortero con pistilo
- Pipetas transfer
- Hgado de pollo fresco (Responsabilidad del alumno)
- Colorante Verde Janus
- Buffer de homogeneizacin (Tris-HCl 15 mM pH 7.4, sacarosa 0.33 M y EDTA 0.025 mM)
METODOLOGA:
Tincin de mitocondrias:
1. Transferir 50l del homogeneizado del paso 7 a un microtubo nuevo y frio. Adicionar 50l
del colorante Verde de Janus. Esperar 10 minutos en refrigeracin.
2. Realizar una preparacin en fresco con una gota de la mezcla anterior y observar bajo el
objetivo seco fuerte y el de inmersin en aceite del microscopio. Identifique las
mitocondrias.
45
DIAGRAMA DE FLUJO:
46
RESULTADOS: Registro de todas las observaciones realizadas durante el proceso (tanto de
fraccionamiento como de observacin microscpica), debidamente documentadas con
fotografas.
Descripcin
Descripcin
47
CUESTIONARIO:
3. Cules son las ventajas y las desventajas de trabajar con clulas enteras o fraccionadas?
CONCLUSIONES:
Definir los aciertos, errores y anotaciones pertinentes para una buena prctica, finalizando con
una conclusin que aporte acerca de la importancia de sta tcnica en la prctica clnica.
48
LITERATURA CITADA:
1. Callen J. 2003. Biologa celular: de las molculas a los organismos. Mxico, D.F. Segunda
edicin. Editorial Continental. Pgs. 122-125.
2. Cooper, G. 2002. La clula. Segunda edicin. Editorial Marbn. Pgs. 17-24, 81.
4. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial Panamericana. Pgs. 100-112,
82.
49
PRCTICA 6
EXTRACCIN DE ADN
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
50
MARCO TERICO:
51
MATERIALES Y EQUIPO:
Muestra de sangre.
Microtubos.
Pipeta semiautomtica.
Puntas para pipeta.
Gradilla.
Agua destilada.
Tris-HCl 10mM y 20 mM (pH 7.6)
Isopropanol.
EDTA 1mM.
SDS 0.1% p/v.
Acetato de potasio 5M.
cido actico glacial.
Buffer TE.
Etanol absoluto.
MIcrocentrfuga.
METODOLOGA:
Preparacin de la muestra:
Extraccin de ADN:
1. Transferir la muestra a un microtubo conteniendo 600 uL de buffer de lisis celular frio.
Homogeneizar la suspensin en el homogeneizador por 30 a segundos. Nota: el SDS
se precipitar produciendo una solucin turbia. Esta precipitacin no afecta la extraccin
52
de DNA.
2. Permitir que la muestra alcance la temperatura ambiente. Adicione 200 uL de solucin
de acetato de potasio y mezcle el contenido del tubo en el vortex por 20 segundos.
3. Concentrar el complejo protena/SDS precipitado por centrifugacin a mxima
velocidad por 3 minutos a 4 C. NOTA: Un pellet de protenas debe ser visible en el
fondo del microtubo despus de la centrifugacin. De no ser as, incube el lisado por 5
minutos en hielo y repita la centrifugacin.
4. Transfiera el sobrenadante a un microtubo que contenga 600 uL de isopropanol.
Mezclar la solucin y recupera el precipitado de DNA por centrifugacin a mxima
velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Retirar el sobrenadante por aspiracin y adicionar 600uL de etanol al 70%. Mezclar por
inversin. Centrifugar a mxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente.
6. Retirar el sobrenadante cuidadosamente por aspiracin y permita secar el pellet de DNA
por 15 minutos.
7. Disuelva el pellet de DNA en 100uL de buffer TE (pH 7.6). NOTA: La solubilizacion del
pellet de DNA genmico puede ser facilitado por la incubacin de la muestra por 16
horas a temperatura ambiente o 1 hora a 65 C.
53
DIAGRAMA DE FLUJO:
54
RESULTADOS:
OBSERVACIONES
CUESTIONARIO:
Explique la importancia de la extraccin y purificacin de DNA en la investigacin biomdica y
prctica clnica.
55
CONCLUSIONES:
Enriquece y finaliza tus observaciones concluyendo acerca del proceso de extraccin y el
resultado esperado.
LITERATURA CITADA:
1. Karp, G. 2001. Biologa Celular y Molecular. ISBN: 9701016440
2. Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An
3. Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN: 0-8153-
2045-0W.
4. Kulg et al. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. 5 ed. Madrid 1999. pp. 43-45.
5. Curtis, H. 2004. Biologa. Mxico D.F. Sexta edicin. Editorial Panamericana. Pp 249-261.
56
PRCTICA No. 7
FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA:
57
realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un
analizador de imgenes (Posso y Ghneim op cit.).
La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamao
del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamao, el ADN total
(proveniente de una extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a
voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante
con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeos
segmentos de 100pb a 500pb (los microsatlites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos
el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el
ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las muestras.
58
MARCO TERICO:
59
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Pipetas semiautomticas.
Puntas para pipeta.
Probeta.
Matraz Erlenmeyer.
Cmara de electroforesis horizontal con peine y bandeja.
Fuente de poder.
Guantes.
Sybr Green.
Agarosa grado molecular.
Tris base
cido Brico
EDTA
Azul de bromotimol
Glicerol
SDS
Agua Destilada.
METODOLOGIA:
60
6. Una vez cargadas las muestras, coloca el gel en la cmara de electroforesis.
7. Llena el tanque de la cmara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel (2
a 5 mm por arriba del gel) y coloca la tapa de la cmara.
8. Conecta los electrodos de la cmara a la fuente de poder, grada el voltaje deseado y
corre las muestras.
9. Monitorea el avance del azul de bromotimol en el gel y detn el proceso cuando el
colorante haya avanzado del gel.
10. Retira el gel de la cmara y observa en el fotodocumentador Gel doc-it.
61
DIAGRAMA DE FLUJO:
62
RESULTADOS:
Anotar las observaciones de todo el procedimiento.
Observar el bandeo en el gel y anotar el nmero de bandas observadas.
CUESTIONARIO:
1. Mencionar que otros tipos de electroforesis existen y los tipos de geles que se utilizan en
ellos.
63
CONCLUSIONES:
Concluir acerca del procedimiento para la observacin y la presencia de la banda de ADN en la
electroforesis.
LITERATURA CITADA:
1. Karp, G. 2001. Biologa Celular y Molecular. ISBN: 9701016440
2. Alberts et al. 2006. Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular Biology of the
Cell. Garland Publishing, Inc. ISBN: 0-8153-2045-0W.
3. Kulg et al. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. 5a ed. Madrid 1999. pp. 43-45.
64
PRCTICA No. 8
ANLISIS DE CARIOTIPO
INTRODUCCIN:
El cariotipo humano es la imagen del arreglo de sus 46 cromosomas que se hacen visibles
durante la metafase de la mitosis. En las ltimas tres dcadas las tcnicas de tincin han
permitido resolver ambigedades de la identificacin individual de los cromosomas e identificar
dentro de ellos regiones especficas dnde se localizan los genes. El anlisis de los cromosomas
metafsicos con las tcnicas de tincin ha permitido distinguir alrededor de 2000 regiones ricas
en adeninas y timinas (A y T) que facilitan la localizacin de genes especficos (Alberts y
colaboradores, 1994). Cada cromosoma posee un estrechamiento denominado centrmero, de
gran relevancia para los movimientos de los cromosomas durante divisin celular. De acuerdo a
la posicin del centrmero los cromosomas se clasifican en telocntricos, acrocntricos,
submetacntricos y metacntricos. En organismos diploides, como nosotros, las clulas a
excepcin de las gamticas poseen un doble juego de cromosomas (cromosomas homlogos)
que se indica con los caracteres 2n, mientras que las clulas con una sola especie (clulas
haploides) con la letra n (Junqueira y Carneiro, 1997).
65
MARCO TERICO:
66
MATERIALES Y EQUIPOS:
METODOLOGA:
67
DIAGRAMA DE FLUJO:
68
RESULTADOS:
Entregar el cariotipo organizado y clasificado segn lo requerido en la metodologa.
1. Clasificacin y conteo de los cromosomas por la posicin del centrmero y el tamao.
X Y C
Total y tipo de Ch's sexuales
D
69
2. Organizacin del cariotipo: Imagen obtenida del ordenamiento del grupo de cromosomas
proporcionado.
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 23
70
CUESTIONARIO:
2. Cules son las diferencias que podran encontrarse en un cariotipo de una persona
sana y en una persona con alguna enfermedad relacionada con aberraciones
cromosmicas?
71
CONCLUSIONES:
Detallar las conclusiones a las cuales llegaron al finalizar su cariotipo. Perteneca a una
persona sana? Enferma? Hombre? Mujer?
LITERATURA CITADA:
1. Biologa Celular y Molecular: Conceptos y Experimentos. Gerald Karp, 7ma edicin, 2013,
editorial McGraw Hill ISBN: 978-1118-20673-7, ISBN: 978-1118-30179-1
2. Alberts B., D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, 2006.
Essential Cell Biology, An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing,
72
Inc. ISBN: 0-8153-2045-0
3. MedlinePlus http://www.nlm.nih.gov
ANEXOS
73
Anexo 1
EVALUACIN.
RBRICA PARA EVALUAR BITCORA DE LABORATORIO
-La bitcora est escrita -La bitcora est bien - La bitcora no est -La bitcora est
a mano, en limpio y organizada, la limpieza bien organizada, la desorganizada o sucia.
organizada. y cuidado estn limpieza y cuidado
- Hay secuencia lgica ausentes en algunas de estan ausentes en la
PRESENTACIN
de la presentacin de sus partes. mayora de sus partes.
10%
cada rubro a evaluar. No hay secuencia No hay secuencia
lgica de la lgica de la
presentacin de cada presentacin de cada
rubro a evaluar. rubro a evaluar.
74
y 1 electrnica fuente investigacin y 1 La bitcora solo
confiable. electrnica de fuente contiene citas de
confiable. paginas web.
ORTOGRAFA, No comete errores. Errores de frecuencia Errores frecuentes: 4-6 -Errores frecuentes en
GRAMTICA Y -Errores (1-5) en todo el moderada: 1-3 por por pgina. todos los rubros:
SINTAXIS reporte. pgina. Ortografa, gramtica y
5% sintaxis.
75
RBRICA DE TRABAJO EN LABORATORIO
COMPORTAMIEN Su Su Su Su Su
TO comportamiento comportamiento comportamiento comportamien comportamien
Y va de acuerdo al va de acuerdo al va de acuerdo al to va de to no va de
ORGANIZACION reglamento del reglamento del reglamento del acuerdo al acuerdo al
DEL AREA DE laboratorio todo laboratorio la laboratorio reglamento reglamento
TRABAJO (15 el tiempo a mayora del algunas veces del laboratorio del laboratorio
ptos.) partir de que tiempo desde su desde su ingreso pocas veces en ningn
ingresa al ingreso al mismo. al mismo. desde su momento
mismo. (10-12 ptos.) (7-9 ptos.) ingreso al desde su
(13-15 ptos.) mismo. ingreso al
(4-6 ptos.) mismo.
76
(0-3 ptos.)
77
78
Anexo 2
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 1
Tabla No. 1: Identificacin y clasificacin de los R.P.B.I.
79
Tabla No.2: Envasado de R.P.B.I.
Estado
Tipo de residuos Envasado Color
fsico
Cultivos y cepas de
Slidos Bolsas de polietileno Rojo
agentes infecciosos
Recipientes rgidos
Objetos punzocortantes Slidos Rojo
polipropileno
80
Anexo 3
INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 2
81
Anexo 4
INFORMACIN COMPLEMENTARIA PRCTICA No. 4 y 6
EXTRACCIN SANGUINEA
Cuando se extrae sangre del cuerpo y se deja reposar en un recipiente de vidrio por algunos
minutos, sta se coagula, el cual se debe a la precipitacin de una protena plasmtica llamada fibringeno,
que forma hebras de fibrina insoluble. Las clulas de la sangre son atrapadas en una red de fibrina que
gradualmente se contrae y libera un lquido llamado suero. El suero no contiene fibringeno ni algunos
factores de la coagulacin, ya que estos se han consumido durante la formacin del coagulo. El plasma a
diferencia del suero, si contiene factores de coagulacin y se obtiene si el tubo donde se recolecta la
sangre tiene un anticoagulante.
Si se requiere una pequea cantidad de sangre sta puede obtenerse por puncin capilar
(puncionando la piel del dedo o el lbulo de la oreja con un instrumento cortante), para obtenerla primero
se limpia la piel con alcohol y se deja secar. Se inserta una lanceta o aguja estril en la piel a profundidad
de 1 o 2 mm. La primera gota de sangre que sale de la herida se limpia con torunda de algodn. Las gotas
subsecuentes se recogen con un portaobjetos para frotis, o con una pipeta o con algn otro recipiente para
pruebas diversas.
Si se requiere un volumen mayor de 0.5 ml entonces se debe realizar la tcnica de ven puncin o
flebotoma. Esta tcnica consiste en la puncin de la barrera protectora exterior (piel) por va extracutnea;
con un objeto punzocortante (cnula o aguja) para la obtencin de una muestra sangunea que puede ser
perifrica, arterial o venosa. Por lo general se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exmenes y
se procurara obtener una mayor cantidad por si fuese necesario verificar alguna prueba. La flebotoma se
puede realizar por dos mtodos diferentes: utilizando tubos al vaco (sistema Vacutainer) y utilizando aguja
y jeringa convencional. El mtodo de utilizar tubos al vaco es ms rpido, pero se prefiere utilizar aguja y
jeringa cuando se trabaja en venas pequeas y frgiles, para evitar que estas colapsen.
Comnmente se emplea una vena del brazo (fosa antecubital) ya que stas son de fcil acceso,
relativamente largas y fciles de localizar. Se utiliza un torniquete para bloquear la circulacin venosa, se
selecciona alguna vena adecuada por su calibre y prominencia y se limpia la piel con alcohol (utilizando
tcnicas de asepsia y antisepsia ya estandarizadas). Una vez que el alcohol se ha evaporado se introduce
una aguja afilada adaptada a una jeringa de tamao adecuado y estril; enseguida se tira del embolo de
la jeringa para que la sangre penetre en sta. Tan pronto como se haya obtenido una cantidad adecuada
se libera la presin ejercida sobre el brazo y se extrae la aguja. Se aplica una torunda de algodn estril
en el sitio de la puncin y se ejerce presin firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la
sangre en los tejidos circunvecinos. Debe quitarse la aguja de la jeringa antes de distribuir la sangre en los
tubos de ensayo (no as cuando se depositar dentro de un tubo al vaco vacutainer).
Si se requiere suero, la sangre puede ser vertida en el interior de un tubo de ensayo (esterilizado). Si
se necesita sangre total o plasma, deber utilizarse algn anticoagulante, el ms comn para la mayor
parte de anlisis es el cido etilen-diamino-tetra-actico (EDTA). El citrato de sodio al 3% tambin es un
anticoagulante. La heparina es un anticoagulante antitrombnico que se usa en pruebas donde no se desea
la eliminacin de iones calcio. Los tubos del sistema Vacutainer (figura 1) vienen con tapones de diferentes
colores que indican los anticoagulantes o aditivos que contienen:
Tapn rojo: el tubo no contiene anticoagulante y el interior del tubo es estril, la sangre coagular
y liberar suero despus de la centrifugacin. Se utiliza para analizar la qumica del suero.
Tapn rojo y gris/negro: tambin llamado tubo de separador de suero, este tubo contiene un gel
82
que separa permanentemente el suero del coagulo despus de la centrifugacin. Tambin
contiene activador de cogulos.
Tapn lavanda/prpura: este tubo contiene EDTA, se usa si se requiere sangre entera o plasma.
Tubo verde: el tubo contiene heparina, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma.
Tapn azul cielo: el tubo contiene citrato de sodio, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma,
comnmente se usa para determinacin de tiempo de protrombina o tiempo parcial de
tromboplastina.
Tapn gris: el tubo contiene oxalato de potasio, se utiliza si se requiere sangre entera o plasma,
comnmente se usa para la prueba de tolerancia a la glucosa.
Figura 1. Tubos Vacutainer (Imagen extrada de http://www.proveedormedico.com/pmhyl.html).
83
Diagrama de las venas del brazo
1. En algunos pacientes con tendencia a las hemorragias, puede producirse una estribacin local de la
sangre. Aplicando una presin adecuada (torunda) sobre el lugar de puncin se evita la formacin de
hematomas.
2. Despus de una serie de punciones venosas repetidas puede producirse trombosis (Formacin de un
trombo en el interior de un vaso sanguneo). O flebitis (inflamacin de las venas).
Contraindicaciones relativas:
1. Zonas de flexin.
2. Venas muy pequeas
84
2. Preparar el equipo necesario.
3. Identificar al paciente y explicar el procedimiento, esto ayuda a reducir ansiedad.
4. Seleccionar la vena que va a puncionar, teniendo en cuenta el flujo venoso. Iniciar por la
parte distal a la proximal de la extremidad (regin cubital del brazo).
5. Si se utiliza el mtodo con jeringa, abrir el paquete, asegurar la aguja en la jeringa, soltar
el tapn de la aguja (sin retirar hasta que vaya a ser utilizado) y mover el embolo hacia
arriba y abajo.
6. El brazo deber estar extendido en una posicin donde la palma de la mano quede hacia
arriba.
7. Aplicar un torniquete adecuadamente, aproximadamente de 4 a 6 centmetros de
distancia por encima del sitio donde realizara la puncin, esto es para que las venas se
salten.
8. Poner los guantes de ltex.
9. Escoger una vena apropiada para la puncin. Con el dedo ndice, palpar el brazo hasta
encontrar la mejor vena, si no se siente una vena se puede buscar en el otro brazo.
10. Limpiar el sitio con una torunda con alcohol en un movimiento circular comenzando del
sitio de la puncin hacia afuera, o bien con un barrido, evitando pasar el algodn varias
veces por el mismo sitio.
11. Dejar que el alcohol se evapore.
12. Estabilizar la vena colocando el dedo pulgar de la mano no dominante aproximadamente
a 4 cm del sitio de puncin y jalar la piel para tensarla y evitar que la vena se mueva.
13. Insertar la aguja con el bisel hacia arriba, en un movimiento lento y suave con una
angulacin aproximada de 15 a 30 grados. No se requiere empujar mucho la vena ya que
se puede atravesar. Es conveniente mantener la aguja alineada con la vena.
14. Una vez canalizada la vena, se observar en la aguja una gotita de sangre.
15. Si se utiliza el mtodo de aguja y jeringa, mover el mbolo hacia atrs para succionar la
sangre.
16. Retirar el torniquete antes de extraer la aguja, de preferencia en cuanto empiece a llenar
los tubos, es importante no mantener el torniquete por un tiempo prolongado ya que esto
le pudiera afectar en alguno de sus resultados.
17. Retirar la aguja.
18. Colocar una torunda seca o gasa ligeramente humedecida con alcohol sobre el sitio de
puncin aplicando una presin firme, esto ayuda a disminuir el riesgo de formacin de
hematoma.
19. Colocar cinta adhesiva piel o curita redonda (si se cuenta con ella) sobre el sitio de
puncin.
20. Descartar la aguja como un R.P.B.I. (objeto punzocortante) de acuerdo a la legislacin
aplicable.
21. Retirar los guantes y depositar en la bolsa roja para R.P.B.I. no anatmicos.
22. Lavar las manos.
85
Diagrama de la tcnica de ven puncin mediante sistema vacutainer
86
Anexo 5
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICAS No. 6 y 7
EDTA 4.65g
87
E. Buffer de carga de ADN 6X:
F. Buffer TE (1L):
Agregar 60.57 g de Tris base a 0.5L de agua, ajustar pH a 7.5 utilizando HCl
NOTAS:
El EDTA no se solubilizar hasta que alcance el pH de 8.0
Mezcle vigorosamente con agitador magntico y calor moderado.
88
Anexo 6
INFORMACIN COMPLEMETARIA PRCTICA No. 8
Patrn de bandeo
89
Idiograma
90
CARIOTIPO HUMANO DESORDENADO
91
Anexo 6
92