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DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
MTODOS DE ANLISIS
Prctica (Ciclo 3)
Introduccion
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes
presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una
fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una
fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan
los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin.
Mecanismo de la cromatografa de exclusin Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las
partculas de menor masa molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero.
Pgin 1
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
Objetivos
Utilizar el gel apropiado para eluir protenas de peso molecular conocido y
determinar su volumen de elucin (Ve)
Realizar una grfica que relacione los volmenes de elucin relativos (Ve/Vo),
y el logaritmo de los pesos moleculares de las protenas patrn.
Determinar el peso molecular de una protena problema
Resultdos
A. DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO DE LA COLUMNA.
Pgin 2
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36
-0,1
Volumen de Elucin (mL)
Fig. 1 Perfil de Elucin de Dextrana Azul 2000 para la determinacin del volumen
vaco en la columna cromatografica.
Volumen de Absorbancia
elucin (mL) Albmina Lisozima Hemoglobina Tripsina
(Problema)
3 0,03 -0,014 -0,012 0,007
6 -0,015 -0,039 -0,013 0,034
9 0,114 0,007 -0,015 0,013
12 0,804 0,028 -0,009 0,043
15 0,721 0,039 0,958 -0,015
18 0,202 0,062 1,378 0,128
21 0,041 0,331 0,968 0,049
24 0,101 -0,333 0,558 0,164
27 0,026 0,672 0,27 0,273
30 -0,006 0,995 0,118 0,337
33 0,039 1,186 0,045 0,368
36 -0,01 1,047 0,013 0,203
39 0,089 0,87 0,009 0,282
42 0,052 0,572 -0,002 0,368
45 -0,023 0,298 -0,002 0,481
48 -0,031 0,167 -0,001 0,553
51 0,008 0,034 -0,001 0,251
54 0,024 0,142 0,103
Pgin 3
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
Absorbancia a 405 nm
0,7 1
0,6 0,9
0,5 0,8
0,4 0,7
0,3 0,6
0,2 0,5
0,1 0,4
0
0,3
-0,1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75
-0,2 0,2
-0,3 0,1
-0,4 0
-0,5 -0,1
Volumen de Elucin (mL)
Pgin 4
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
Clculos.
= /
Curva tipo
2,50
Volumen de Elucion Relativo Ve/Vo
2,00
1,50
0,50
0,00
4,10 4,20 4,30 4,40 4,50 4,60 4,70 4,80 4,90
Log PM
Y=mx+b
Ve/Vo= m (logPM) + b
111.33
= 4.78
2.16
Antilog PM (4.78)= 60200 Daltones
Pgin 5
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
protenas migran a travs del gel hacia el electrodo positivo a una velocidad que es
inversamente proporcional a su peso molecular.
Ventajas
-Utiliza materiales comunes para el montaje del sistema cromatografico.
-No utiliza mucha cantidad de muestra.
Desventajas
-No es posible observar el desarrollo cuando la muestra es incolora.
-Para una buena resolucin es necesario mantener todos los parmetros
controlados.
-El tiempo de separacin delas molculas pequeas es mucho mas prolongado.
Discusion
En esta prctica se llev a cabo un mtodo cromatogrfico para determinar el peso
molecular de una protena problema, que en este caso fue Albmina.
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CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION MOLECUALR
Conclusiones
Bibliogrf.
Pgin 7