UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID

ASIGNATURA: ANLISIS QUMICO

TCNICAS PTICAS DE ANLISIS

SONIA ALONSO ROMN.

JAVIER CALVO GARRIDO.
ANA RIZO MART.

1
 TCNICAS PTICAS DE ANLISIS

PRINCIPIOS BASICOS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA Y

CONCEPTOS FUNDAMENTALES..PAG3

CLASIFICACION DE LOS MTODOS OPTICOS.PAG6

INSTRUMENTACION Y COMPONENTES BASICOS DE LOS

INSTRUMENTOS DE MEDIDA....PAG7

TCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIN DE RADIACIN...PAG9

ABSORCIN DE RADIACIN Y CONCENTRACIN. LEY DE BEER.PAG9

ESPECTROFOTOMETRA DE UV-VIS..........PAG10

ABSORCIN ATMICA..PAG13

TECNICAS BASADAS EN LA EMISION DE RADIACIN.PAG15

FOTOLUMINISCENCIA MOLECULARPAG15

ESPECTROSCOPIA DE EMISIN ATMICA..PAG18

TECNICAS BASADAS EN LA DISPERSION DE RADIACIN..PAG21

TURBIDIMETRIA Y NEFELOMETRIA.PAG21

APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MTODOS

PTICOS DE ANLISISPAG23

BIBLIOGRAFA...PAG24

TECNICAS PTICAS DE ANLISIS:

2
Todas aquellas que implican la medida de la radiacin electromagntica emitida por la
materia o que interacciona con ella.
Los mtodos pticos de anlisis cubren un amplio campo de aplicaciones debido a su
rapidez, a la gran gama de instrumentacin disponible y sus grandes posibilidades de
automatizacin.

PRINCIPIOS BSICOS DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA Y

CONCEPTOS FUNDAMENTALES:

La radiacin electromagntica est constituida por ondas que se propagan en el espacio,

y que estn constituidas por componentes elctricos y magnticos perpendiculares entre
s.

Radiacin electromagntica polarizada en un plano

A diferencia de otros fenmenos ondulatorios, como el sonido, la radiacin

electromagntica no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se
propaga fcilmente a travs del vaco.
En cualquier medio material, la propagacin de la radiacin disminuye a causa de la
interaccin entre el campo electromagntico de la radiacin y los electrones enlazantes
de la materia (la longitud de onda disminuye cuando la radiacin pasa del vaco a algn
otro medio).

Sin embargo, para describir cuantitativamente determinadas interacciones con la materia

(asociadas a la absorcin o emisin de energa radiante), se hace necesario considerarla
como un flujo de partculas o corpsculos, llamados fotones (dualidad onda-
corpsculo).
La energa del fotn es proporcional a la frecuencia de la radiacin (relacin de
Einstein-Planck), de modo que un haz de radiacin puede ser ms o menos intenso en
funcin de la cantidad de fotones por unidad de rea, pero la energa del fotn es
siempre la misma para una determinada frecuencia.

El espectro electromagntico:

El espectro electromagntico abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y de

frecuencias (y as como de energas). De hecho, el intervalo es tan grande que se
necesita una escala logartmica.
Las zonas de separacin entre regiones no estn establecidas de modo rgido.

3
 Regiones del espectro electromagntico

Tambin se denominan mtodos pticos a los mtodos espectroqumicos que utilizan no

slo la radiacin visible, sino tambin las radiaciones ultravioleta e infrarroja, a pesar de
que el ojo humano no es sensible a ellos, debido a las similitudes que se observan en las
interacciones de estos tres tipos de radiacin con la materia. a pesar de que el ojo
humano no es sensible a ellos.

Superposicin de ondas: cuando dos o ms ondas atraviesan la misma regin del

espacio, se produce un desplazamiento igual a la suma de los desplazamientos causados
por las ondas individuales. Por tanto, una onda compleja puede descomponerse en
componentes simples por medio de una operacin matemtica.

Difraccin de la radiacin: proceso por el que un haz paralelo de radiacin se curva

cuando pasa por un obstculo puntiagudo o a travs de una abertura estrecha.

4
Transmisin de la radiacin: La velocidad a la que se propaga la radiacin a travs de
una sustancia es menor que su velocidad en el vaco y depende de los tipos y
concentraciones de tomos, iones o molculas del medio. Sin embargo, dado que no se
observa ningn cambio en la frecuencia, la interaccin no puede implicar una
transferencia permanente de energa, sino que dicha energa provoca la polarizacin de
las especies atmicas y moleculares que constituyen el medio (deformacin transitoria
de las nubes de electrones) slo momentneamente, emitindose de nuevo sin alteracin
cuando la sustancia vuelve a su estado original. Es por eso que la frecuencia de la
radiacin emitida no vara, pero la velocidad de su propagacin disminuye a causa del
tiempo necesario para que se produzca la retencin y la emisin.

Refraccin de la radiacin: se trata de un cambio brusco de direccin de la radiacin

cuando incide con un ngulo en la interfase entre dos medios que tienen densidades
diferentes.

Reflexin de la radiacin: cuando la radiacin atraviesa una interfase entre medios con
diferente ndice de refraccin, se produce siempre una reflexin. La fraccin de
radiacin reflejada es tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre los ndices de
refraccin.

Dispersin de la radiacin: Fraccin de la radiacin momentneamente retenida por

tomos, iones o molculas que es reemitida en todas las direcciones cuando las
partculas vuelven a su estado inicial. La intensidad de esta radiacin dispersada
aumenta con el tamao de partcula.

Dispersin de luz por un prisma

5
Polarizacin de la radiacin: La radiacin ordinaria consiste en un haz de ondas
electromagnticas en el que las vibraciones se distribuyen por igual entre una seria
infinita de planos centrados a lo largo de la trayectoria del haz. Un vector de cualquier
plano puede descomponerse en dos componentes perpendiculares entre s. La
eliminacin de uno de estos dos planos de vibracin, origina un haz que est polarizado
en un plano. El vector elctrico resultante de un haz polarizado en un plano ocupa, por
tanto, un solo plano del espacio.
La polarizacin se produce por el paso de radiacin a travs de medios que absorben,
reflejan o refractan de forma selectiva la radiacin que vibra en un solo plano.

Seccin transversal de Descomposicin en dos componentes

un haz de radiacin perpendiculares de un vector en el plano xy

Interaccin materia-radiacin electromagntica:

Cuando incide radiacin electromagntica sobre una muestra material puede ser
absorbida por ella (generalmente de forma parcial), transformndose, en muchas
ocasiones, en energa trmica. Sin embargo, otras veces, parte de la radiacin puede ser
dispersada o re-emitida, con o sin cambio en la longitud de onda. Incluso es posible que,
como consecuencia de la interaccin, se origine simplemente un cambio en las
propiedades de la radiacin, sin necesidad de producirse absorcin y emisin. Por otra
parte, la muestra puede emitir radiacin electromagntica si se la excita bajo
determinadas situaciones.

Cuando la materia interacciona con energa trmica o electromagntica, los tomos y

molculas pueden pasar a un estado activado en el que permanecen durante un periodo
de tiempo muy corto, regresando su estado fundamental. En este proceso, ceden la
energa previamente absorbida a su entorno en forma de calor, o en forma de fotones, de
la misma longitud de onda o menor.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS PTICOS:

-MTODOS ESPECTROSCPICOS: aquellos en los que existe intercambio de energa

entre la radiacin electromagntica y la materia. En estos mtodos se miden espectros,
siendo stos debidos a transiciones entre distintos niveles energticos.
Tcnicas basadas en la absorcin de radiacin:
-niveles moleculares: UV-visible, microondas
-niveles atmicos: absorcin atmica, rayos x
Tcnicas basadas en la emisin de radiacin:
-niveles moleculares: luminiscencia (fluorescencia, fosforescencia)
-niveles atmicos: espectrometra de emisin, fotometra de llama,
fluorescencia de rayos x, fluorescencia atmica

6
-MTODOS NO ESPECTROSCPICOS: aquellos en los que no hay intercambio de
energa, sino cambios en la direccin o en las propiedades fsicas de la radiacin
electromagntica.
Tcnicas basadas en la dispersin de radiacin: turbidimetra, nefelometra
Tcnicas basadas en la refraccin de radiacin: refractometra, interferometra
Tcnicas basadas en la difraccin de radiacin: rayos x, electrones
Tcnicas basadas en la rotacin ptica: polarimetra, dicrosmo circular

INSTRUMENTACIN:

-Fotmetro: mide la intensidad de radiacin

-Espectrofotmetro: mide la transmitancia o la absorbancia de una muestra en funcin

de la longitud de onda

-Colormetro: compara, usando el ojo humano como detector, el color de la sustancia

problema con el de una disolucin patrn

-Espectroscopio: detecta lneas espectrales a simple vista (lneas de color q emite un

tomo)

-Espectrgrafo: instrumento que registra lneas espectrales sobre una placa fotogrfica

-Espectrmetro: instrumentos que poseen sistemas de deteccin elctricos

COMPONENTES BSICOS DE LOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA:

Los mtodos espectroscpicos pticos se fundamentan en seis fenmenos:

1.- Absorcin
2.- Fluorescencia
3.- Fosforescencia
4.- Dispersin
5.- Emisin
6.- Quimioluminiscencia

Para medir cada fenmeno la mayora de los componentes bsicos de los instrumentos
son muy parecidos, aunque difieren algo en su configuracin. Adems, las propiedades
necesarias de estos componentes son las mismas independientemente de si se aplican a
la regin ultravioleta, visible o infrarroja del espectro.

Los instrumentos espectroscpicos caractersticos incluyen cinco componentes:

1.- Una fuente estable de energa radiante
2.- Un recipiente transparente para contener la muestra
3.- Un dispositivo que asle una regin restringida del espectro para la medida
(seleccin de la longitud de onda)
4.- Un detector de radiacin, que convierta la energa radiante en una seal utilizable (en
general elctrica)

7
5.- Un sistema de procesamiento y lectura de la seal, que visualice la seal detectada
en una escala de medida, en una pantalla de osciloscopio, en un medidor digital o en un
registrador.

Instrumento para espectroscopia ptica de absorcin:

Instrumento para espectroscopia ptica de emisin:

La espectroscopia de emisin no requiere una fuente de radiacin externa, pues la

propia muestra es el emisor.
El receptculo de la muestra es un arco, una chispa o una llama, que a la vez contiene a
la muestra y le hace emitir una radiacin caracterstica.

Instrumento para espectroscopia ptica de dispersin:

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 TCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIN DE RADIACIN

Vamos a abordar en este apartado dos tcnicas como la espectrofotometra de

UV-vis y la espectrofotometra de absorcin atmica, las dos basadas para su
funcionamiento en fenmenos de absorcin de radiacin electromagntica.

La medida de la cantidad de radiacin absorbida con la ayuda de estos mtodos

nos servir en algunos casos aplicando la ley de Lambert-Beer para establecer una
relacin lineal entre la radiacin absorbida y la concentracin de la sustancia en el
medio.

ABSORCIN DE RADIACIN Y CONCENTRACIN. LEY DE BEER

INTRODUCCIN

La ley de Lambert-Beer nos permite establecer una conexin entre la absorcin

de radiacin y la concentracin de la sustancia que absorbe en un medio conocido, fue
descubierta independientemente (y de distintas maneras) Pierre Bougler en 1729 en
1760 por Johann Heinrich Lambert y August Beer en 1852.

La absorcin de radiacin provoca una alteracin en la posicin de ciertos

electrones de las molculas absorbentes llevndolos a niveles de energa superior,
aunque posteriormente lo veremos con ms exactitud.

Las diferentes molculas y de un modo ms exacto y preciso los electrones que

forman parte de stas pueden absorber radiacin electromagntica a diferentes y
nosotros podemos llegar a medir sta y de ese modo conociendo ciertas caractersticas
de la propia sustancia expresar su concentracin.

La relacin de la ley entre concentracin y absorcin de luz est basada en el uso

de espectroscopa para identificar sustancias, eso lo veremos ms adelante.

La ley de Lambert-Beer se basa en la siguiente frmula:

A=cl

A representa la absorbancia.
representa el coeficiente de absorcin de la sustancia analizada(l/mol cm). Su valor
vara dependiendo de los materiales absorbentes y la aplicada en cada caso y se
determina experimentalmente.
C representa la concentracin de la muestra(mol/l).
L representa el espesor de la cubeta(cm).

El modo de trabajo es muy sencillo, irradiando la muestra con luz

monocromtica, que situamos dentro de la cubeta, obtendremos valores de su
absorbancia a diferentes tiempo o diferentes condiciones, aplicando la frmula
anteriormente expuesta podemos conocer que concentracin existente.

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 Existen otra serie de parmetros asociados a la absorbancia, son los siguientes:

Al incidir sobre la muestra utilizamos una radiacin que denominamos Io, la radiacin
que recibimos en el detector del espectrofotmetro de UV-vis por ejemplo que luego
veremos es I.

A = log (Io/I)
Conocida la T(transmitancia) podemos conocer la A(absorbancia).
T = (I/Io) 100

APLICACIONES

La ley tiende a no ser vlida para concentraciones muy elevadas, especialmente

si el material dispersa mucho la luz.

La ley de Beer se cumple para una radiacin monocromtica que atraviesa una
disolucin diluida, cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que
depende de su concentracin, podemos pensar en cualquier cido dbil cuya forma
variar desde HA hasta su forma disociada dependiendo de una situacin concentrada a
una diluida con lo cual no cumplir la ley de Beer.

Existen muchos campos en los que es una herramienta muy usada. En el campo
de la bioqumica nos permite conocer concentracin de sustancias, actividades
enzimticas, al igual que en el de la qumica analtica con el estudio de otros analitos,
etc y tambin en la tecnologa de los alimentos como luego veremos. Esta ley tambin
se aplica para describir la atenuacin de la radiacin solar al pasar a travs de la
atmsfera. En este caso hay dispersin de la radiacin adems de absorcin.

ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE

INTRODUCCIN

La espectrofotometra UV-Visible es una tcnica de medicin basada en la

absorcin de radiacin UV o visible por parte de las molculas muy usada en campos
como la qumica analtica, bioqumica o biologa molecular.

Los electrones en una molcula se establecen formando orbitales atmicos y a su

vez estos forman orbitales moleculares. La absorcin de esta radiacin por parte de las
molculas provoca un fenmeno denominado transicin electrnica en la cual el
electrn se mueve desde un orbital de menor nivel energtico a uno de mayor
La absorcin por parte de la molcula estudiada de un tipo u otra de radiacin
UV o visible(la variacin en la es causa a su vez de una variacin en la energa de la
onda) provoca una transicin electrnica diferente entre estos orbitales(fig.1).

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 Transicin (nm) (L mol4cm-1) Ejemplo
* <200 - Hidrocarburos saturados
* 200500 104 Alquenos, alquinos aromticos
* 160260 102 103 H2O, CH3OH, CH3CL
* 250600 10 103 Carbonilos, nitro, nitrato, carbonilo
Fig.1 Tipos de transiciones electrnicas dependiendo de la incidente con correspondientes ejemplos de cada una.

Aquellas molculas con enlaces sencillos son excitadas por de menores y por
lo tanto de mayor energa. Estas se conocen con el nombre de UV de vaco. Es
necesario el trabajo en vaco ya que el O2 absorbe en estos niveles lo cual invalidara el
experimento. Las mayores solamente son absorbidas por unas estructuras o grupos
funcionales denominadas cromforos los cuales presentan electrones de absorcin
energtica baja. Hay tambin otro grupo denominado auxocromos que refuerzan a los
cromforos.

El estado de excitacin de la molcula es de alrededor de 10-9, emitiendo

entonces esta energa recibida en forma de calor o de otro tipo de radiacin como puede
ser la fosforescencia o fluorescencia de las que posteriormente hablaremos; esto nos
lleva a pensar que podemos conocer ms acerca de una molcula, de sus grupos
funcionales, de su estructura conociendo su espectro de absorcin o de emisin
dependiendo de la tcnica que utilicemos. De este modo podremos realizar el espectro
de emisin y de absorcin de una sustancia, incidiendo sobre ella a diferentes y
viendo su emisin y absorcin.

APLICACIONES

Desde el punto de vista cualitativo podemos llegar a conocer que grupo

funcional tenemos ante nosotros, o que tipo de molcula ya que una caracterstica puede
ser nica en una molcula y llevarnos a su conocimiento y aplicando la ley de Beer
anteriormente expuesta.

En estudios bioqumicos podemos conocer la cantidad de bacterias que presenta

un medio dada su absorbancia dentro de visibles, tambin ver la actuacin de un
enzima sobre un compuesto inicial viendo su transformacin en otro al mismo tiempo
que su desaparicin, uso de colorantes como Biuret para determinar la concentracin
proteica de una suspensin, etc.

Presencia de electrolitos, variacin de pH, disolvente en el que trabajemos son

elementos muy importantes a la hora de establecer un mtodo de trabajo correcto, la
presencia de un disolvente polar o apolar en la medicin de una concentracin proteica
puede provocar un cambio de conformacin tal que aminocidos aromticos que
absorben en cercanas a 280nm cambien su posicin desde el exterior al interior
molecular haciendo variar nuestros resultados; el color del disolvente es otro punto
fundamental.
La eleccin del tipo de material de nuestra cubeta tambin es importante, ya que
no queremos provocar absorcin por parte de esta o que bloquee el paso de la luz, las

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mediciones para cuantificar DNA se realizan en cubetas de cuarzo dada la usada
260nm y 280nm.

El espectrofotmetro de UV-vis funciona de un modo muy simple(fig.2).

Situamos la muestra en una cubeta donde va a ser excitada por un haz de luz
monocromtica a una determinada seleccionada previamente, e incidimos sobre sta.
El espectrofotmetro permite la medicin tanto de la luz incidente como de la
transmitida y de ese modo la absorbida con los siguientes clculos:

Fig. 2. Esquema bsico de incidencia y deteccin de absorbancia

T = I/Io 100

A = log10(Io/I)

Conocida la absorbancia y por la ley de Beer anteriormente expuesta conocer la

concentracin de una sustancia:

pH 5,5 Ph 8

0,7 0,8
0,7
0,6
0,6
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA

0,5
0,5
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2 0,2
0,1 0,1

0 0
0 100 200 300 0 50 100 150 200 250 300
T(SEG) T(SEG)

Fig.3. Variacin de absorbancia diferencial dependiendo del pH de la disolucin. Izquierda pH5.5. Derecha pH 8.

Podemos encontrarnos una sustancia que comienza a decrecer en su absorbancia,

lo cual puede suceder porque la sustancia deja de absorber o porque est desapareciendo
del medio. En este caso la accin continuada de un enzima provoca una disminucin en
la cantidad de reactivo y en consecuencia de la absorbancia de la muestra. Mediante la
aplicacin de la ley de Beer podramos conocer las concentraciones de reactivo que
estn siendo eliminadas en el tiempo. Adems vemos como la variacin de la
absorbancia es diferente en uno y otro pH(fig.3).

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ABSORCIN ATOMICA

INTRODUCCIN

La espectroscopia de absorcin atmica se basa en la absorcin de luz por parte

de tomos en forma gaseosa, de ese modo podemos medir su concentracin, lo cual
representa una diferencia importante en cuanto a la espectroscopia UV-vis que trabaja
en fase lquida o slida. Mediante esta tcnica al igual que antes podemos conocer la
concentracin de analito por la ley de Lambert-Beer conociendo la absorbancia de la
muestra, pero no permite conocer estructuras ya que las rompe. Sin embargo la
preparacin de la muestra o la no-uniformidad de sta pueden darnos valores
cambiantes lo cual nos obliga a interpolar nuestro valor de absorbancia en una curva de
calibracin.

Los instrumentos de medida son mucho ms complejos que en la espectroscopa

de UV-vis. Necesitamos una fuente de luz, los lseres poseen la intensidad necesaria
para generar la excitacin atmica y en consecuencia el cambio hacia un orbital
molecular de mayor energa. En segundo lugar la amplia mayora de las muestras se
encuentran en estado lquido o slido y en esta tcnica la muestra debe encontrarse en
un estado gaseoso. Para su conversin usamos un atomizador, tenemos dos tipos los
cuales explicaremos de un modo sencillo ya que su funcionamiento interno puede
resultar complicado.

FUNCIONAMIENTO DE LOS ATOMIZADORES:

Atomizador de llama: este tipo de atomizador solamente acepta soluciones analticas

por ello la muestra debe ser tratada para formar pequeas gotas. El atomizador de llama
consta de una serie de componentes, son los siguientes:

Fuente de radiacin: este formada por un ctodo hueco fabricado con el mismo
metal a analizar junto con un nodo que en este caso es un hilo de wolframio todo
sellado en un tubo de vidrio con un gas inerte como el argn. Al aplicar una diferencia
de potencial entre el nodo y el ctodo se genera una ionizacin de los tomos del gas
inerte, estos chocan con el ctodo provocando el movimiento de diferentes tomos para
producir una nube atmica que emiten radiacin.

Quemador y un nebulizador(fig.4): el nebulizador transforma la muestra en un

aerosol fino para alimentar el quemador. Este puede ser de flujo laminar si tanto
muestra como combustible y oxidante se mezclan antes de llegar a la llama o de flujo
turbulento donde muestra combustible y oxidante no llegan a la vez a la llama.

Monocromador: que selecciona la necesaria para cada muestra.

Atomizador de horno de grafito o atomizacin electrotrmica: puede aceptar

soluciones lquidas, slidas y una mezcla de ellas, la muestra se aplica directamente
siendo calentado el horno elctricamente. Consta de un cilindro de grafito hueco con
dos ventanas que permiten el paso de luz. Muy usado para muestras orgnicas ya que se

13
requiere menos cantidad de muestra y su sensibilidad es mayor al poder controlar la
temperatura y el tiempo de una mejor manera que en el mtodo anterior.

Podemos tener problemas en las diferentes mediciones debido a la similitud de

absorcin de dos sustancias como pueden ser el V y Al, tambin interferencias qumicas
debido al proceso de atomizacin de la muestra, en este caso son de dos tipos:

1. Aniones que provocan compuestos de baja volatilidad con el elemento a analizar

disminuyendo la velocidad de atomizacin, el problema puede ser resuelto
aumentando la temperatura.
2. Reacciones de asociacin y disociacin el O2.

Fig.4 Esquema bsico de funcionamiento de los espectrofotmetros de absorbancia atmica.

APLICACIONES

Destacamos su gran importancia dentro de la industria alimenticia dada la

capacidad de esta tcnica para detectar la presencia de elementos qumicos como Pb o
Hg entre otros(fig.5).

Fig5. Elementos qumicos en rosa objeto de medicin en esta tcnica.

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TCNICAS BASADAS EN LA EMISIN DE RADIACIN

FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR

Cuando una especie qumica absorbe radiacin pasa a un estado electrnico

excitado. Muchas sustancias disipan el exceso de energa en forma de calor. Sin
embargo, un cierto nmero de especies pierde slo una parte de ese exceso de energa
en forma de calor, y emite la energa remanente en forma de radiacin electromagntica
de distinta frecuencia que la absorbida, a una longitud de onda mayor, y que puede
utilizarse con fines analticos.

X + Calor

X + hv X*

Absorcin X + calor +hv

(espectrofotometrma)
Emisin
(fotoluminiscencia)

La luminiscencia es el trmino aplicado a la reemisin de radiacin que ha sido

previamente absorbida, mientras que la fotoluminiscencia se refiere al caso particular en
el que la excitacin tenga lugar por absorcin de fotones.

La fotoluminiscencia puede clasificarse en: fluorescencia y fosforescencia. Se

diferencian en que las transiciones electrnicas responsables de fluorescencia no
conllevan un cambio en el espn del electrn. Por el contrario, las emisiones de
fosforescencia van acompaadas por un cambio en el spn del electrn.

La medida de la intensidad permite la determinacin cuantitativa de especies

inorgnicas y orgnicas importantes a niveles de trazas.

Estados excitados de singulete/triplete

Un estado molecular en el cual todos los espines de los electrones estn

apareados se llama estado singulete. Cuando uno de los electrones de una molcula es
excitado a un nivel de energa superior, se forma un estado de triplete. En el estado de
singulete excitado, el espn del electrn promocionado contina apareado, con signos
opuestos, con el electrn del estado fundamental, hecho que ocurre en los procesos de
fluorescencia. En cambio, en el estado de triplete los espines de los dos electrones se
han desapareado, y por tanto, estn paralelos; hecho que ocurre en la fosforescencia.

El tiempo de vida de un estado de singulete de excitacin es normalmente de

10-9- 10-6 s.

Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado

electrnico y vibracional fundamental a un estado excitado. Este proceso tiene lugar en
unos 10-15 s cuando se trabaja con una disolucin, el exceso de energa vibracional se

15
pierde rpidamente, como consecuencia de los choques de las molculas excitadas.
Este proceso recibe el nombre de relajacin vibracional. El proceso de fluorescencia
ocurre inmediatamente despus de la excitacin, por lo que no es posible percibir
visualmente la emisin de fluorescencia una vez eliminada la de excitacin.
El proceso de transformacin de un estado singulete a estado triplete se
denomina cruzamiento entre sistemas. Una vez adquirido el estado de triplete, la
molcula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajacin y
posteriormente emitir un fotn para retornar al estado fundamental. Esta emisin se
denomina fosforescencia.

Rendimiento cuntico
El rendimiento cuntico o eficacia cuntica, es la relacin entre el nmero de
molculas que emiten luminiscencia con respecto al nmero total de molculas
excitadas.

Factores que afectan a la fluorescencia:

- Estructura molecular: es imprescindible que la molcula posea una estructura capaz de

absorber radiacin ultravioleta/visible. Los compuestos que contienen dobles enlaces
conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de resonancia son los que
presentan una fluorescencia ms intensa y ms til. Suelen presentar fluorescencia
muchos hidrocarburos aromticos con gran rigidez y estructuras multicclicas.
- Influencia del disolvente y la temperatura: la eficacia cuntica de la fluorescencia
disminuye en la mayora de las molculas al aumentar la temperatura, lo mismo ocurre
con una disminucin de la viscosidad del disolvente. La fluorescencia se reduce en
presencia de disolventes que contiene tomos pesados.
- Influencia de pH: la fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes
cidos o bsicos en el anillo, depende del pH. Tanto la longitud de onda como la
intensidad de emisin son diferentes para las formas ionizadas y no ionizadas del
compuesto.
- Oxgeno disuelto: la presencia de oxgeno reduce la intensidad de la fluorescencia.
- Efecto de la concentracin en la intensidad de fluorescencia: la intensidad, If, es
directamente proporcional a la concentracin, C, de la sustancia absorbente, pero slo a
concentraciones bajas, lo cual puede demostrarse segn la ley de Beer. Para
disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia ser proporcional a la
concentracin.

INSTRUMENTACIN
Nos encontramos con dos diseos: fluormetro y espectrofluormetro. Los
distintos componentes de los instrumento son similares a los que se encuentran en
espectrofotmetros ultravioleta/visible.

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 Componentes de un fluormetro o un espectroflurmetro

Componentes:
- Fuentes: se necesitan fuentes ms intensas que las utilizadas en medidas de
absorcin, por lo que se utiliza para los fluoromtros, una lmpara de arco de
mercurio a baja presin. Y para los espectrofluormetros una lmpara de arco de
xenn. Tambin se utilizan lseres.
- Filtros y monocromadores. Se utilizan tanto los filtros de interferencia como los
de absorcin.
- Detectores:los mas utilizados son los tubos multiplicadores.
- Cubetas.

Aplicaciones en el anlisis de alimentos:

Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse
por fluorescencia se encuentran los aminocidos, las protenas, las coenzimas, las
vitaminas, los cidos nucleicos, los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los
flavonoides y muchos metabolitos.
Indudablemente por su alta sensibilidad y selectividad la espectroscopia de
fluorescencia es una herramienta especialmente valiosa en el anlisis de alimentos,
productos farmacuticos, muestras de laboratorio clnico y productos naturales.
Algunos de los casos concretos de determinaciones en el caso del anlisis de alimentos
son:
- Generalmente aquellas especies que posean anillos aromticos pueden presentar
fluorescencia, mientras que si la especie posee heterociclos aromticos puede presentar
fosforescencia.
- Determinacin de hidrocarburos policclicos aromticos, son compuestos muy txicos.
- Determinacin de vitaminas que son fluorescentes A, C o D.

17
ESPECTROSCOPA DE EMISIN MOLECULAR

Los mtodos atmicos de emisin se basan en la medida De la radiacin emitida de una

muestra, previamente excitados

Muestra (X) + Energa X*

X + hv

La determinacin espectroscpica de especies atmicas slo se puede llevar

acabo dentro de un medio gaseoso, en el cual los tomos individuales estn separados
unos de otros, por lo que el primer paso en todos los procedimientos espectroscpicos es
la atomizacin, un proceso en el cual los tomos de la muestra son excitados a estados
electrnicos superiores.

En la espectroscopia de emisin atmica una parte de la muestra se vaporiza y se

excita trmicamente hasta alcanzar la emisin atmica. La rpida relajacin de las
especies excitadas va acompaada de la produccin de espectros de lneas ultravioleta y
visibles que son tiles para el anlisis de los elementos.

Histricamente, la espectroscopia de emisin atmica requera la atomizacin y

excitacin mediante llama, arco elctrico y chispa elctrica. Sin embargo, hoy en da las
fuentes de plasma se han convertido en las ms importantes y ms ampliamente
utilizadas en estos procesos.

Los espectros de emisin obtenidos utilizando fuentes de plasma, arco o chispa

son muy complejos, estn constituidos por cientos, e incluso, miles de lneas. Esta
cantidad de lneas, es muy ventajosa cuando se busca informacin cualitativa aunque
aumenta la probabilidad de interferencias espectrales en el anlisis cuantitativo.

La espectroscopia atmica se emplea en la determinacin cualitativa y

cuantitativa de muchos elementos. La longitud de onda a la que se efecta la medicin
de intensidad, identifica al elemento, mientras que la intensidad de la radiacin emitida
cuantifica su concentracin.

La anchura de las lneas de emisin atmica aumenta con el incremento de la

temperatura; las lneas son mas anchas cuando los tomos estn ms calientes y ms
estrechas cuando los tomos estn ms fros. La razn de este aumento es que los
tomos se mueven ms rpidamente a temperaturas mayores.

Las tcnicas espectroscpicas atmicas se pueden clasificar en funcin de la

fuente de atomizacin:

- Llama: Espectroscopia de Absorcin atmica. La temperatura de atomizacin alcanza

los 1700-3150 C
- Plasma de Argn acoplado inductivamente: Espectroscopia de plasma acoplado
inductivamente (ICP). La temperatura de atomizacin alcanza los 6000-8000 C.

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- Plasma de Argn de corriente contimua: Espectroscopia de plasma de corriente
contimua (CD). La temperatura que se alcanza es de 6000-10000 C.
- Arco elctrico: Espectroscopia de emisin de fuente de arco, mide emisin a 4000-
5000 C.
-Chispa elctrica: Espectroscopia de emisin de fuente de chispa, mide emisin a 40000
C.

INSTRUMENTACIN

Los componentes bsicos de un espectrofotmetro son los siguientes:

- Fuente de excitacin: proporciona energa a la muestra. La energa

suministrada para la excitacin procede de una descarga elctrica entre dos electrodos.
Uno de ellos, normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma slida, o el
residuo procedente de una disolucin.
- Monocromador: selecciona las diferentes radiaciones emitidas. Para ello, se
emplean prismas y redes.
- Sistema de deteccin: registran la radiacin emitida por la muestra.

Espectroscopia de emisin con fuente de arco y chispa

Las espectroscopias con fuentes de arco y de chispa fueron los primeros mtodos
instrumentales ms utilizados en el anlisis. Estn basados en la obtencin mediante
excitacin del espectro de emisin de elementos por medio de arcos elctricos o chispas
elctricas. Estos espectros permiten la determinacin cualitativa y cuantitativa de
elementos metlicos en varios tipos de muestras, incluyendo metales, aleaciones, suelos,
minerales y roca.

La excitacin de la muestra se produce en el pequeo espacio existente entre un

par de electrodos. El paso de electricidad entre los electrodos a travs de este pequeo
espacio proporciona la energa necesaria para atomizar la muestra y producir tomos o
iones en estado electrnico excitado. Las fuentes de arco y chispa requieren integrar las
seales de emisin durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o ms, para
obtener datos analticos reproducibles.
Actualmente, estos mtodos se aplican principalmente al anlisis de muestras
slidas, ya que las muestras lquidas o gaseosas se manipulan mejor usando una fuente
de plasma.

Fuentes de microsonda lser

En esta fuente se utiliza el lser para vaporizar la muestra en el espacio entre dos
electrodos de grafito, que se utilizan como fuente de excitacin. Cuando un impulso de
lser de elevada potencia se focaliza en una zona de 5 a 50 micrometros sobre la
superficie de la muestra, generalmente slida, se vaporiza una pequea cantidad de
slido. La nube resultante est compuesta por tomos, iones y molculas. En la
microsonda, los componentes de la nube se excitan por medio de una chispa entre un
par de pequeos electrodos situados justo por encima de una superficie de la muestra.
La radiacin resultante se focaliza entonces sobre un sistema detector adecuado. Con
esta tcnica ha sido posible determinar el contenido de elementos traza en clulas
sanguneas aisladas y analizar materiales no conductores.

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Fuentes de emisin de llama

Actualmente, las llamas no se utilizan para obtener espectros de emisin, ya que

la modalidad de absorcin proporciona resultados mejores en cuanto a exactitud,
conveniencia y lmites de deteccin para la mayora de determinaciones de un nico
elemento. Para el anlisis multielemental, las fuentes de plasma son bastantes
superiores. Por ello, la espectroscopia de emisin de llama actualmente tiene poca
utilidad, excepto en la determinacin de metales alcalinos, se excitan a temperaturas
relativamente bajas para dar espectros que son notablemente sencillos y exentos de
interferencias de otras especies.

Espectroscopia de emisin con fuente de plasma

Un plasma es un gas ionizado, una mezcla gaseosa que contiene una

concentracin significativa de cationes y electrones. Normalmente se utiliza argn. Para
originar el plasma es preciso un aporte externo de energa que provoque la ionizacin
del gas y la mantenga estacionaria. En funcin de cmo se aporte esta energa externa,
se han desarrollado tres tipos de fuentes de alimentacin:

- Fuente de corriente continua, consistente en dos electrodos sumergidos en la corriente

del gas argn.
- Campos de microondas
- Radiofrecuencia: se utiliza en la espectroscopia de plasma acoplado inductivamente
(ICP).

Plasma acoplado inductivamente

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Aplicacin al anlisis de alimentos

- Tiene gran importancia para la determinacin de elementos traza en diferentes

alimentos, fundamentalmente de minerales traza
- Tambin se puede utilizar para la determinacin de contaminantes ambientales en
productos vegetales
- Determinacin de algunas vitaminas.

TCNICAS BASADAS EN LA DISPERSIN DE RADIACIN

Existen dos tipos de dispersin:

- Dispersin elstica: se genera cuando la radiacin incidente tiene la misma longitud
de onda que la dispersada.

- Dispersin de partculas pequeas o Rayleigh: se produce cuando el tamao

mximo de las partculas que producen la dispersin es menor al 5% de la longitud de
onda de la radiacin. La intensidad de la luz dispersada se distribuye de manera
simtrica.
- Dispersin de grandes partculas: la distribucin de la luz dispersada
disminuye en sentido retrgrado, debido a las interferencias constructivas y
destructivas.

- Dispersin inelstica: se produce cuando el fotn emitido tiene una longitud de onda
diferente.

TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA

Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de

partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa
turbia La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea
dispersada y absorbida mas que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. La
turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido. Hay dos
mtodos para medir la turbidez de una muestra, la turbidimetra y la nefelometra. Son
dos tcnicas complementarias que se utilizan para el anlisis cuantitativo de
disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas.

La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la

direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en
cualquier ngulo.

En la turbidimetra se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del
que llega a la disolucin. En cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de
luz se hace con un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente. El instrumento
usado en la nefelometra, el nefelmetro se asemeja al fluormetro. En cambio en
turbidimetra se utiliza el turbidemetro que es un fotmetro de filtro.

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Turbidimetra

Es un mtodo en el que se mide la disminucin de la potencia de la radiacin

transmitida debido a la dispersin. Se mide en un espectofotmetro UV/Vis.

Para determinar la concentracin del analito mediante este mtodo aplicamos:

En donde T es la transmitancia medida,It ,es la intensidad de la fuente de radiacin

transmitida, Io es la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida por un blanco.
La relacin entre T y la concentracin de las partculas dispersas es similar a la
proporcionada por la ley de Beer:

- logT = kbC

Siendo C la concentracin de las partculas dispersantes expresada como masa por

unidad de volumen; b es la longitud del camino ptico y k es una constante que depende
de varios factores: tamao, forma de las partculas dispersantes y la longitud de onda.

Nefelometra
Es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en un ngulo de 90 C
con respecto a la fuente. Se mide en un espectrofluormetro.
Para determinar la concentracin de analito en este mtodo aplicamos:

IS = KSIOC

Donde KS es una constante emprica del sistema, IO es la intensidad de la fuente de

radiacin incidente. El valor de KS depende de una curva de calibracin preparada,
usando una serie de patrones de concentracin conocida.

La eleccin entre turbidimetra y nefelometra viene dada por dos factores:

- Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la radiacin

procedente de la fuente. Cuando la concentracin de partculas dispersantes en la
disolucin es pequea, IT ser muy similar a IO. Por lo que la mejor eleccin cuando la
muestra contiene pocas partculas dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es
una buena tcnica para cuando las muestras contienen grandes concentraciones de
partculas dispersantes.

- Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la radiacin

dispersada a 90C es mayor si las partculas son bastante pequeas para que se produzca
una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intesidad de la dispersin
disminuir a 90C. En turbidimetra la seal consiste en la disminucin relativa de la
radiacin transmitida, por lo que el tamao de las partculas dispersantes es menos
importante.

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Aplicaciones en alimentos de la turbidimetra y nefelometra

Generalmente, nefelometra y tubidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad

qumica del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de
tratamiento. Tambin se utilizan para la determinacin de iones sulfato.

APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS DE LOS MTODOS

PTICOS DE ANLISIS:

La espectroscopia UV/vis sirve, sobre todo en forma de fotometra, para hacer

determinaciones cuantitativas de los componentes de los alimentos y sus aditivos. Es de
utilidad para determinar el color extrado de un alimento, para determinar la
concentracin de compuestos orgnicos tales como la cafena, la vitamina A, y el cido
benzoico, los cuales tienen grupos cromforos que absorben fuertemente la luz UV.
Se usa tambin para la determinacin enzimtica de azcares y otros constituyentes de
los alimentos.
Los mtodos para determinar metales traza que involucran la medicin de complejos
coloridos en la regin visible, han sido completamente reemplazados por la
espectrofotometra de absorcin atmica, usndose los procedimientos colorimtricos
en laboratorios pequeos para algunos aniones y cationes principales solamente.

La espectroscopia infrarroja, adems de caracterizar e identificar sustancias

desconocidas y analizar mezclas, se utiliza desde controles sencillos de productos y de
calidad por comparacin de espectros, hasta otros objetos ms complicados, como la
determinacin de simetras moleculares y el clculo de constantes de fuerza y relaciones
de enlace.

La espectrometra de absorcin atmica resulta adecuada para la determinacin

rpida de distintos metales pesados (plomo, mercurio, zinc, cadmio, arsnico...) y de
alcalinotrreos (estroncio...)

La fotometra de emisin de llama se utiliza principalmente para la

determinacin de sodio y potasio.

La polarimetra se aplica sobretodo a la determinacin cuantitativa de

carbohidratos, como sacarosa, azcar invertido y glucosa o almidn.

La refractometra resulta adecuada para identificar y caracterizar grasas y

aceites, para comprobar la pureza de distintos alimentos y para la determinacin
cuantitativa del contenido en agua de la miel o para determinar el extracto de alimento
que est formado principalmente por azcar (sacarosa), como es el caso de confituras,
miel, jarabe de almidn, zumos, etc.

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BIBLIOGRAFA:

L. Hernndez, C. Gonzlez, Introduccin al Anlisis Instrumental. Editorial:

Ariel Ciencia (2002)

D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principios de Anlisis Instrumental 5

edicin. Editorial: Mc Graw Hill (2000)

R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Anlisis de los Alimentos. Editorial

Acribia. S.A.

R.S. Kirk, R. Sawyer, H.Egan, Composicin y Anlisis de Alimentos de Pearson.

Editorial CECSA.

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