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Manualdemtodosgeneralesparadeterminacindecarbohidratos 141106162652 Conversion Gate02 PDF
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GENERALES PARA
DETERMINACIN DE
CARBOHIDRATOS
UPTC
2014
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1. INTRODUCCION
Los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son
carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y
numerosas gomas. Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se
encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que
conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Dada la
importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos para su
determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero
todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como
azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos
en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente
en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin
alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los
azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la
que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Dentro de la bromatologia un apartado escencial son las pruebas analiticas las cuales no
son otra cosa que la identificacion y cuantificacion de los diversos carbohidratos
presentes en un alimento, pudiendo aprovechar un carbohidrato con fienes industriales o
para aseguarar la composicion que un producto alimentario pueda tener; la analitica
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permite entre otras cosas el control del estado de las materias primas o los productos
durante todo el proceso de transporte almacenamiento o transformacion.
INDICE
1. INTRODUCCION 2
2. METODOS CUANTITATIVOS 5
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR 5
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)
2.2 DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES TOTALES POR 7
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE ACIDO DINITROSALICILICO DNS)
2.3 DETERMINACION DE AZUCARES POR EL METODO OPTICO DE 10
POLARIMETRIA
2.4 DETERMINACION DE AZUCARES (GLUCOSA, SACAROSA Y FRUCTUOSA) 12
POR HPLC (CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION)
2.5 DETERMINACION DE AZUCARES POR ESPECTROSCOPIA POR 17
INFRARROJO CERCANO
2.6 ANALISIS DE POLISACARIDOS (DETERMINACION DE FIBRA DIETETICA) 20
3. METODOS CUALITATIVOS 22
3.1 PRUEBA DE MOLISCH 22
3.2 PRUEBA DE BENEDICTO 23
3.3 PRUEBA DE LUGOL 24
3.4 PRUEBA DE BIAL 24
3.5 PRUEBA DE SELIWANOFF 26
3.6 PRUEBA DE BARFOED 27
3.7 PRUEBA DE FEHLING 28
3.8 EZQUEMA DE ANALISIS CUALITATIVO PARA CARBOHIDRATOS 28
4. BIBLIOGRAFIA 29
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2. METODOS CUANTITATIVOS
2.1 DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS TOTALES POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV (METODO DE FENOL-SULFURICO)
INTRODUCION
El metodo por espectrofotometria UV hace referencia al uso de la luz para medir las
concentraciones de ciertas sustancias quimicas. Para que este fenomeno pueda llegar a medirse
se debe tener presente la concentracion de las especies abosorbentes dado a que esta es
proporcional a la absorbancia segn la ley de lamber-bee donde:
A=ebc
FUNDAMENTO
Reaccion:
METODOLOGIA
Preparacion de la muestra
concentrado rpidamente a la mezcla. Luego los tubos de ensayo se dejan en reposo durante 10
min, se agitan durante 30 segundos y se colocan durante 20 min en un bao de agua a
temperatura ambiente para el desarrollo de color. El blanco y la solucin patrn se preparan
conforme al procedimiento anteriormente descrito, utilizando el carbohidrato de inters.
Finalmente se lleva a una celda donde se deposita en el espectrofotmetro para programar la
longitud de onda a 490 nm y se procede a leer la absorbancia (M. DuBois, K. Gilles, J. Hamilton, P.
Rebers y F. Smith, 1956).
Se procede a determinar las diferentes concentraciones del carbohidrato partiendo de 0.01 % que
indica 0.1 gramos en 1000 ml de agua. Posteriormente se toman alcuotas de 0.1; 0.2; 0.3 y se
completa a volumen para 1.0 ml con agua destilada. Por ltimo se aade el fenol y el cido
sulfrico siguiendo la metodologa anterior, para ser ledas en el espectrofotmetro (R. Matissek,
F.M. Schnepel y G. Steiner, 1992).
Tabla 1: Preparacion de las soluciones patrones para elaborar una curva patron.
patrn del
N de azcar (0.1 g/ agua fenol 5% H2SO4 Concentracin
tubos 1000 ml) (ml) (ml) (ml) /ml Absorbancia
1 0.1 0.9 1.0 5.0 10 /ml -
2 0.2 0.8 1.0 5.0 - -
3 0.3 0.7 1.0 5.0 - -
4 0.4 0.6 1.0 5.0 - -
5 0.5 0.5 1.0 5.0 - -
6 0.6 0.4 1.0 5.0 - -
7 0.7 0.3 1.0 5.0 - -
8 0.8 0.2 1.0 5.0 - -
blanco 0.9 0.1 1.0 5.0 - -
Fuente: Anlisis de alimentos. 2da edicin, Editorial Acriba S.A Zaragoza Espaa.
0.1 ml X
X = 10ug/ml (as determinamos para cada una de las concentraciones del azcar)
RESULTADOS
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Para leer los resultados de la muestra a analizar, es necesario contruir una curva de calibracion o
curva patron a diferentes concentraciones con el carbohidrato de interes (disacaridos y
monosacaridos) para determinar la absorbancia. Para calibrar el espectrofotometro se procede a
ubicar el blanco que se tiene provisto en la celda, ajustandolo al 100% de transmitancia y 0,000 de
absorbancia. Una vez obtenida la absorvancia de cada concentracion, se grafica sobre excel o una
hoja de papel milimetrado absorvancia vs concentracion de cada solucion preparada. La ecuacion
de linealidad que arroje la grafica de la curva patron se tomara como referencia para hallar
matematicamente la concentracion del azucar presente en la muestra.
Entonces:
teniendo en cuenta los datos de la ecuacion lineal despejamos X (lo tomamos como
concentracion del analito). Como obtenemos la concentracion diluida en ppm se realizan los
calculos necesarios para determinar la concentracion en gramos de la muestra analizada en
determinado alimento. O de igual manera la absorbancia que obtenemos cuando medimos la
muestra se interpola o extrapola en la grafica segn el valor arrojado.
INTRODUCCION
Los azucares reductores poseen poseen un grupo carbonilo libre formando un grupo hemiacetal
que le confiere la caracteristica de poder reaccionar con otros compuestos. El metodo de miller o
DNS (acido dinitrosalicilico como reactivo tiene la capacidad de oxidar los azucares reductores
mostrando un comportamiento diferencial hacia mono y disacaridos, dando resultados
colorimetricos que se puede medir con una longitud de onda de 575 nm.
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FUNDAMENTO
METODOLOGIA
Se implementa el mismo metodo para realizar la curva patron, como se describio en el metodo
fenol-sulfurico. Emplendo una solucion patron de glucosa con una concentracion de 1.0 g/L, para
la cual se disuelve 0.1 gramos de glucosa en 90 ml de agua y se lleva a volumen a 100 ml. Esta
solucion patron se prepara a difentes concentraciones adicionando a cada tubo 1 ml del reactivo
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de DNS con agitacion constante. Posteriormente se lleva a bao maria durante 15 minutos se deja
enfriar y se aade agua destilada hasta completar el volumen respectivo. Se determina la
absorbancia de cada tubo a 575 nm en el espectrofotometro UV.
Preparacion de la muestra
Se toma 1 ml de la solucion acuosa de la muestra, enseguida se adiciona 1ml del reactivo de DNS
y se calienta por 15 minutos en bao maria. Se deja enfriar y se diluyen con 10 ml de agua
destilada. Se procede a leer la absorbancia junto con el blanco a la misma longitud de onda que
las muestras para la curva patron.
RESULTADOS
para realizar la curva patron se grafica concentracion en ppm de la glucosa vs absorbancia de las
muestras diluidas a diferentes concentraciones.
INTRODUCCION
FUNDAMENTO
Se coloca un tubo de muestra que contiene un liquido en solucion, entre dos elementos
polarizantes. El primer elemento (polarizador) polariza la luz antes de que esta pase a traves de la
muestra. El segundo elemento (analizador) puede girarse para contrarrestar cualquier rotacion
por la muestra y por tanto, localiza la posicion angular resultante del plano de la luz, y por tanto la
cantidad de rotacion causada por la muestra, donde se expresa en grados angulares. En la
industria del azucar la rotacion se expresa sobre una escala diferente que se denota como Z. A
continuacion un esquema de polarizacion de una muestra de azucar en solucion.
Fuente: https://es.scribd.com/doc/89862717/Analisis-polarimetrico.
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Cada sustancia opticamente activa tiene su rotacion especifica, determinada por la siguiente
ecuacion:
[] (t,) = (t,) / c I
Donde:
c= concentracion
t= temperatura
=longitud de onda
1 - Entrada de luz de Na
2 - Lente de iluminacin
3 - Filtro de luz
4 - Polarizador
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5 - Placa
7 - Analizador
10 - Lupa
11 - Panel de lectura
METODOLOGIA
RESULTADOS
Se determina la concentracion del azucar segn la ecuacion y el angulo de rotacion, junto con la
temperatura al momento de la lectura con el equipo:
[] (t,) = (t,) / c I
INTRODUCCION
La HPLC o cromatografia liquida de alta resolucion es una tecnica cromatografica usada para
separar componentes de una muestra que se fraccionan entre una fase movil liquida y una fase
estacionaria solida compuesta por particulas muy finas contenidas en una columna, y donde se
utiliza una presion muy elevada para forzar el paso del disolvente a traves de ella, consiguiendo
asi separaciones de gran resolucion, permitiendo su identificacion y cuantificacion. La
cromatografa lquida de alta resolucin tiene ventajas en el anlisis de los azcares debido a su
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FUNDAMENTO
Para la separacion de carbohidratos como sacarosa, glucosa y fructosa se utiliza una columna de
separacion rellena de una resina de intercambio cationico con base calcica, que exhiben
propiedades como intercambio de ligandos y exclusion por tamaos.
MATERIALES Y EQUIPOS
Reactivos
METODOLOGIA
Se preparan 1000 ml de solucin de EDTA (Sal Clcica) de 50 ppm, se filtra por membrana de
0.45 m y se desgasifica.
Preparacion de la muestra
Tres parametros instrumentales que afectan la sensibilidad son: la temperatura del detector,
presion del gas de nebulizacion y la ganancia. La temperatura del detector se estudia a un
intervalo de 40-60 C. una temperatura de 45 es suficiente para permitir la evaporacion completa
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del disolvente y por lo tanto dando un ruido insignificante. Una velocidad de flujo (presin) del
sistema del aire a 3 bar y una ganancia de 5 proporcionaron una buena sensibilidad y una
adecuada relacin seal-ruido (Luciana C. Nogueira 2005).
Clculos
Donde:
Area = Dada por el integrador para el estndar de Calibracin de Sacarosa
Concentracin = Gramos exactos de Sacarosa Pesados
Para hallar el % de sacarosa:
% sacarosa= Area de la muestra a 7. 53 min x 100%
FR x concentracion muestra
Clculo del porcentaje de Glucosa en la muestra
Se procede igual que para el clculo de la Sacarosa, teniendo en cuenta que el tiempo de elucin
de la glucosa es en aproximadamente 9.52 min. Se toma el rea de la Glucosa correspondiente a
un tiempo de elucin de aproximadamente 9.52 minutos y se calcula el Factor de Respuesta (FR).
Donde:
Area = Dada por el integrador para el estndar de Calibracin de Glucosa
Concentracin = Gramos exactos de Glucosa Pesados
Para hallar el % de glucosa:
% glucosa = Area de la muestra a 9.52 min x 100%
FR x concentracion muestra
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Donde:
Imagen 5. Muestra un cromatograma tpico para la separacin de los cinco hidratos de carbono
utilizados en el proceso de optimizacin.
Fuente: Journal of Chromatography A, Volume 1065, Issue 2, 2005, 207 210. (1) La fructosa
(t R 8,76 min), (2) la glucosa (t R 9,71 min), (3) la maltosa (t R 15,45 min), (4) maltotriosa (t R 22,21
min), (5) maltotetraosa (t R 29,41 min). La concentracin de los estndares en la mezcla fue de 2 g
/L
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La figura anterior representa el mtodo estndar externo que se usa generalmente para calibrar el
sistema cromatogrfico para la cuantificacin de hidratos de carbono. Para ello, las soluciones
estndar azcares con diferentes concentraciones (0,05-5,0 g / L para la fructosa, 0,05-5,0 g / L
para la glucosa, 0,05 a 15,0 g / l de maltosa, 0,05 a 10,0 g / L para maltotriosa, y 0.05- Se utilizaron
5,0 g / L para la maltotetraosa), de acuerdo a la concentracin de la muestra en el alimento Y.
(Wei, MI Ding J. Chromatogr. A, 904 (2000))
INTRODUCCION
FUNDAMENTO
Pueden distinguirse dos categoras bsicas de vibraciones: de tensin y de flexin. Las vibraciones
de tensin son cambios en la distancia interatmica a lo largo del eje del enlace entre dos tomos.
Las vibraciones de flexin estn originadas por cambios en el ngulo que forman dos enlaces. En
principio, cada molcula presenta un espectro IR caracterstico (huella dactilar), debido a que
todas las molculas (excepto las especies diatmicas homonucleares como O2 y Br2) tienen
algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorcin de una determinada longitud de onda
en la zona del espectro electromagntico correspondiente al infrarrojo.
En la zona del espectro electromagntico IR con longitudes de onda del infrarrojo medio (entre
4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de absorcin provocadas por las
vibraciones entre nicamente dos tomos de la molcula. Estas vibraciones derivan de grupos
que contienen hidrgeno o de grupos con dobles o triples enlaces aislados. (Nakamoto K., 1997).
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METODOLOGIA
Generalmente las muestras slidas se debe pulverizar hasta que el tamao de sus partculas
sea menor que la longitud de onda de la radiacin (<2 m) para evitar los efectos de la
dispersin de la misma.
Una de las tcnicas ms populares es la formacin de pastillas de KBr (tambin se han usado
otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en fro
(cold flow), por lo que, cuando se somete a la presin adecuada este material finamente
pulverizado, sinteriza y forma una tableta transparente que se asemeja a un cristal. Al usar
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Anlisis cuantitativo
A = -log (I/Io) = a b c
RESULTADOS
Para los compuestos carbonilicos, como aldehdos, cetonas, cidos carboxlicos y sus derivados, el
grupo funcional principal en los carbohidratos es el que absorbe con una alta intensidad en la
regin del infrarrojo en la zona de 1850- 1650 cm-1. Estas vibraciones generalmente por
alargamiento de este grupo especficamente.
Fuente: Mc.Murry J. Qumica Orgnica, quinta edicin .Thomson Editores Mxico 2000).
Los picos que identifican cada banda en el espectro se relaciona a la longitud de onda entre los
enlaces de la molcula. As tenemos enlace C-C, C-H etc.
La fibra diettica se define como los polisacridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los mtodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fraccin de inters con la precipitacin selectiva y despus determinar su
peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere enzimticamente con
alfa-amilasa, amiloglucosida y proteasa para hidrolizar el almidn y la protena. El contenido total
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de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la solucin para precipitar toda
la fibra. La solucin entonces se filtra, se recupera, se seca y se pesa, el residuo se reporta como
fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985)
FUNDAMENTO
METODOLOGIA
Pesar por 1g de muestra (exactitud de 0.1g) en matraces de 500 mL. El peso de las muestras no
debe diferir en ms de 20 mg. Adicionar 50 mL de buffer de fosfatos 0.08M pH 6 0, Medir pH y
ajustar a pH 6 0.2 si es necesario.
Adicionar 0.1 mL de la solucin de amilasa y cubrir el matraz con papel aluminio, colocar el matraz
en un bao a ebullicin durante 15 min. Agitar suavemente cada 5 minutos. Verificar con
termmetro que los matraces mantengan 95-100C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura
ambiente Ajustar a pH 7.5 0.2 adicionando 10 mL de NaOH 0.275N, agregar 5 mg de proteasa
(disolver 50 mg de proteasa en 1mL de buffer de fosfatos. Adicionar 0.1mL de la solucin a cada
matraz). Cubrir el matraz con papel aluminio y colocarlos en un bao a 60C por 30 minutos con
agitacin continua.
Restar el peso del crisol con la celita para conocer el peso del residuo
RESULTADOS
Donde:
- m1 = masa del residuo = promedio de las masas de las muestras determinadas en duplicado
(mg).
Informar el % de fibra al 0,1 %, sobre la base de la muestra original considerando que ha sido
desgrasada en el caso de contener ms de 10 % de grasa.
3. METODOS CUALITATIVOS
3.1 PRUEBA DE MOLISCH
Mtodo: se colocan 1-2 mililitros (ml) de una solucin muestra en un tubo de ensayo, se aaden
dos gotas de reactivo de Molisch (una solucin de -napthol en etanol al 95%). se vierte luego
lentamente por la pared del tubo (Quesada, 2007) 1-2 ml de cido sulfrico concentrado de
(Harpercollege, n.d.).
Cuando un carbohidrato posee en su estructura un grupo carbonilo libre (C=O) esta reducir el
reactivo de Benedicto por oxidacin con los iones cobre en una solucin de pH alcalino y la accin
del calor (Punto de ebullicin); y formara acido carboxlico; al reaccionar se puede denominar
como azcar reductor (Sakuta, n.d.).
Resultados: la reaccin positiva es una coloracin que va desde verde, amarillo, naranja y rojizo, el
grado de coloracin y el tono radica en la concentracin de cobre oxidado (Cu2O); esta reaccin
indica que es un azcar reducido.
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La interaccin del yodo o yodo potsico con el almidn forma coloraciones azules oscuras, debido
a la ocupacin de los espacios libres del glcido, este es un glcido alterado, al cual, sus
propiedades fsicas son modificadas, como la no absorcin lumnica
Esta prueba detecta las pentosas. El reactivo deshidrata las pentosas formando furfural
(derivados de las pentosas). Estos derivados de las pentosas adems reaccionan con orcinol y los
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iones de hierro presentes en el test reactivo, generan productos de color azul (HARPER COLLEGE,
n.d.).
Mtodo: tomar dos ml o 1-2 gotas (Mahesh, Murugesh y Mohana, 2006) de una muestra de
solucin y colocarla en un tubo. Tomar dos ml del reactivo de Bial (solucin de orcinol, HCl y
cloruro frrico) y adicionarlo en el tubo. Entonces calentar la solucin lentamente con un
mechero Bunsen o en bao de Mara (HARPER COLLEGE, n.d.). Se debe calentar a 60 C durante
10 minutos (Daz, Jorrn y Brcena).
Resultados: es positivo si se observa un derivado azulado. Otros colores indican negativo (ver
imagen 13). Las hexosas generalmente producen un resultado de color verde, rojo o caf
(HARPER COLLEGE, n.d.).
Esta prueba detecta cetosas (hexosas). En el test se provoca una reaccin de deshidratacin de
cetohexosas para formar 5 hidroximetilfurfural. La formar 5 hidroximetilfurfural adems
reacciona con el resorcinol presente en el test (HARPER COLLEGE, n.d.).
Metodo. Tomar 1 ml de la solucin y colocarla en un tubo. adicionar 1-3 ml del reactivo de Barfoed
(Danmalam, Et. Al., 2009) (solucin de acetato cprico y cido actico) y adicionarla. Calentar la
solucion al bao de maria durante tres minutos (HARPER COLLEGE, n.d.).
Resultados: la formacion de precipitaciones rojizas dentro de los tres minutos indican un
resultado positivo (HARPER COLLEGE, n.d.).
La prueba hace reduce el cobre (Cu++) por oxidacion con los todos los azucares reductores,
siempre que este en medio alcalino con una presencia de tartrato de sodio y potasio para permitir
la estabilizacion del cobre (De, Dey y Ghosh, 2010); (ver imagen 9).
Metodo: se llevan las dos fracciones del reactivo a un tubo de enzayo; la fraccion A es el sulfato de
cobre 7% disuelto en agua y la fraccion B es el Tartrato de potacio 35% y hidroxido de sodio 10%
diluidos en agua, una vez completado el reactivo (A:1-2ml+B:1-2ml) (UNIVERSIDAD DE LA
LAGUNA, n.d.) se mescla bien y se adicionan 1-5 ml del la muestra al tubo de enzayo y se lleva al
bao de maria por 5 minutos (Danmalam, Et. Al., 2009)
Resultado: la reaccion positiva forma un presipitado de color rojo ladrillo por la oxidacion del
cobre (reduccion).
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