Gentica molecular (I)

EXPERIMENTO DE GRIFFITH
(1928)

Vdeo

En las bacterias virulentas S

muertas haba algo capaz de
transformar a las bacterias R,
inocuas, en bacterias virulentas
S. Ese algo, llamado por Griffith
factor transformante, tena
informacin para producir un
carcter heredable en las
bacterias R, que era la presencia
de la cpsula (responsable
de la virulencia). Se trataba, por
lo tanto del material gentico.

Bacterias con cpsula= cepa S

Bacterias sin cpsula= cepa R
 EXPERIMENTO DE AVERY, MAC LEOD Y MC CARTY (1944)
Avery, Mac Leod y Mc Carty fraccionaron las bacterias S muertas por el calor y probaron
una a una cada fraccin obtenida utilizndolas como factor transformante en bacterias R.
Solo el ADN produjo la transformacin, por lo que quedaba demostrado que era el ADN el
material gentico.

Oswald T.
Avery

MacLeod McCart
y
 EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE. 1952 (I)

Hershey y Chase trabajaban con bacterifagos o

fagos, que son virus que infectan bacterias.
Saban que un fago tenia una capa externa de
protena y un ncleo interno de DNA. Adems, de
las observaciones con el microscopio electrnico,
tambin saban que durante la infeccin el virus
ataca a la bacteria por sus colas e introduce su
material gentico en la bacteria para multiplicarse
utilizando su maquinaria metablica. Conocan los
trabajos de Avery y trataban de determinar cual era
la causa de la transformacin de la bacteria en una
factora de fagos: el ADN o la protena.
Alfred Hershey y Martha Chase
.

Informacin Animacin del experimento de Hershey y Chase

EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE (II) Marcaron radiactivamente dos grupos de
fagos: uno con 32P (que marca solo el
DNA) y otro con 35S (que marca solo las
protenas).

En dos experimentos paralelos, infectaron

bacterias con virus marcados en su DNA y
con virus marcados en sus protenas.

Agitaron los cultivos con una batidora para

separar las partculas vricas de las
cubiertas bacterianas.

Luego realizaron una centrifugacin para

separar los fagos de las bacterias, de
modo que las bacterias, ms grandes y
ms pesadas, quedan en el sedimento,
mientras que los fagos se quedan en el
sobrenadante.

Encontraron que la radiactividad del 35S

apareca en el sobrenadante mientras que
la del 32P apareca en el sedimento, a partir
del cual aparecieron nuevas partculas
vricas marcadas radiactivamente, lo que
demostraba que el ADN era el material
gentico.
 FLUJO DE INFORMACIN GENTICA EN LOS SERES VIVOS

La replicacin del ADN es necesaria para que la informacin gentica de la clula se transmita
a la siguiente generacin. En las clulas, la informacin gentica se utiliza para sintetizar
protenas. La informacin fluye en una direccin: del ADN al ARN, mediante el proceso de
Transcripcin, y del ARN a la protena, mediante el proceso de Traduccin.

Este esquema de flujo de la

informacin gentica fue pronto "Dogma Central de la Biologa Molecular"
modificado, ya que en algunos
virus cuyo material gentico es
ARN, existen enzimas para su
replicacin. Adems, en algunos
casos, la informacin no fluye
del ADN al ARN, sino en sentido
contrario, mediante un proceso
denominado Retrotranscripcin
o transcripcin inversa, que fue
descubierto en los virus de ARN
denominados Retrovirus.
 LA REPLICACIN DEL ADN ES
SEMICONSERVATIVA

Cuando Watson y Crick propusieron el modelo de

estructura en doble hlice del ADN, sugirieron
tambin un posible mecanismo para la replicacin
de esta molcula:
-No se escapa a nuestra comunicacin que el
emparejamiento especfico que hemos postulado
sugiere inmediatamente un mecanismo copiador
para el material gentico. (traduccin de su
artculo en Nature 25-Abril-1953). Cinco semanas
despus de la publicacin de este artculo
publicaron nuevamente en Nature otro artculo
explicando
ese posible mecanismo de replicacin:
Nature, 30-Mayo-1953
Debido a la complementariedad de las cadenas,
cada una de ellas podra servir de molde para la
sntesis de una nueva cadena complementaria.
De esta manera se obtendran dos molculas de
ADN idnticas a la molcula original, cada una de
las cuales contendra una cadena del ADN original
y otra de nueva sntesis.
Este modelo de replicacin es conocido como
Replicacin Semiconservativa, para indicar
que cada molcula hija solo conserva la mitad
(una de las dos cadenas) de la molcula original.
 TRES MODELOS DE REPLICACIN DEL ADN

Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se propusieron otros
posibles modelos de replicacin del ADN: el modelo conservativo y el modelo dispersivo
 MESELSON Y STAHL DISEARON UN EXPERIMENTO PARA
DETERMINAR COMO SE REPLICABA LA MOLCULA DE ADN

Para investigar como se replicaba el ADN,

Meselsohn y Stahl disearon un experimento
basndose en las siguientes premisas:

1-El nitrgeno es uno de los principales

elementos del ADN.

2-El nitrgeno posee dos istopos: el 14N, que

es el ms abundante y el 15N (no es radiactivo)
ms pesado, que puede incorporarse al ADN.

3-La densidad de las molculas de ADN

puede determinarse usando la tcnica de
centrifugacin en gradiente de densidad,lo
que permitira distinguir el DNA ligero, con
14
N del pesado con 15N.

Para obtener el gradiente de densidad sometieron una solucin de cloruro de cesio (Cs Cl) a
una ultracentrifugacin durante varias horas. Se alcanza as un equilibrio entre la difusin y la
fuerza centrfuga de manera que se establece un gradiente de densidad en el tubo con una
concentracin creciente de Cs Cl desde la boca hasta el fondo del tubo. Si se aade ADN se
concentrar y formar una banda en el punto del tubo donde su densidad sea igual a la del
Cs Cl en ese punto. Si hay varios ADN con densidades distintas, formarn varias bandas.
Las bandas se pueden detectar observando los tubos con luz ultravioleta de longitud de onda
de 260 nm, que es absorbida fuertemente por los cidos nucleicos.
 EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL (1958)

Comenzaron su experimento cultivando bacterias E. Coli en un medio con 15N. Despus de

varias generaciones todo el ADN de las bacterias era pesado, ms denso que el normal.
Meselson y Stahl transfirieron las bacterias con ADN pesado a un medio con 14N (ligero) y
observaron la densidad del ADN de las bacterias al cabo de distintas generaciones.
Los resultados obtenidos eran compatibles nicamente con un modelo semiconservativo
de replicacin
 CONCLUSIONES DEL
EXPERIMENTO

-Si la replicacin fuese coservativa

apareceran dos bandas del ADN
de la primera generacin (una de
ADN pesado y otra de ADN ligero).

-Si la replicacin fuese dispersiva

no obtendran una banda de ADN
ligero en la segunda generacin.

-Los resultados obtenidos solo son

compatibles con el modelo de
replicacin semiconservativa.

La replicacin es
semiconservativa

Animacin del experimento

Otra animacin
 COMIENZO DE LA REPLICACIN

La replicacin del ADN es un proceso

muy complejo, en el que participan
muchas enzimas y protenas distintas,
cada una con una funcin especfica,
cuyo conjunto se conoce con el nombre
de Replisoma. El comienzo de la
replicacin requiere el reconocimiento
por protenas iniciadoras de una secuencia
nucleotdica que constituye el origen de
relicacin.

En Procariotas hay un solo origen pero en Eucariotas hay mltiples puntos de origen. Una
vez reconocido el origen se produce la separacin de las dos cadenas en ese punto,
formndose as una burbuja cuyos extremos se denominan horquillas de replicacin.
 LA REPLICACIN ES UN PROCESO BIDIRECCIONAL

La replicacin es un proceso bidireccional, por tanto, las horquillas avanzan en sentidos

opuestos, como dos cremalleras que se abren a partir del mismo punto inicial. En las
bacterias, al ser circular el cromosoma, la replicacin termina cuando se encuentran las
dos horquillas. En los cromosomas eucariotas la replicacin se inicia simultaneamente
en millares de orgenes y termina cuando confluyen los millares de burbujas de
replicacin.

Animacin (procariotas)

Animacin (en eucariotas) Elige

el cromosoma a la derecha
 LA ENZIMA HELICASA SEPARA LAS DOS CADENAS DEL ADN
Y LAS PROTENAS SSB ESTABILIZAN LAS CADENAS SENCILLAS

Las helicasas son las enzimas encargadas de abrir la doble hlice, rompiendo los
puentes de hidrgeno. Para ello utilizan la energa del ATP. Su actuacin crea una
horquilla de replicacin. Como consecuencia, se genera un superenrollamiento por
delante de la horquilla y, por tanto, una tensin que ser aliviada por las topoisomerasas.
Las protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins o protenas de union a
cadena sencilla de ADN) son protenas encargadas de la estabilizacin del ADN
monocatenario generado por la accin de las helicasas, impidiendo as que el
ADN se renaturalice o forme estructuras secundarias, de manera que ste pueda
servir de molde para la replicacin de la doble hlice

HELICASA

SSB
 LAS TOPOISOMERASAS ALIVIAN TENSIONES POR
DELANTE DE LA HORQUILLA DE REPLICACIN

A medida que la enzima helicasa abre la doble hlice, las enzimas topoisomerasas van
disminuyendo la tensin torsional acumulada por el superenrollamiento en el sector no
replicado de la doble hlice. Lo hacen cortando una o las dos hebras por delante de la
horquilla de replicacin, dejando que giren y volviendo a unir.

Accin de las topoisomerasas sobre el ADN

 CARACTERSTICAS DE LAS DNA-POLIMERASAS

Las enzimas que desempean el papel principal en la sntesis de las nuevas cadenas de
ADN son las ADN-polimerasas. Presentan las siguientes caractersticas:

-Necesitan una cadena molde, frente a la cual enlazan nucletidos complementarios.

-Utilizan desoxirribonuclesidos trifosfato (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) cuya hidrlisis

(separacin de pirofosfato) proporciona la energa necesaria para la formacin de los
enlaces fosfodister.

-Sintetizan una cadena complementaria a la molde en direccin 5-3,es decir, catalizan

la formacin de enlaces fosfodister entre el grupo fosfato 5 del nucletido entrante
y el extremo 3OH del nucletido anterior de la hebra en crecimiento.

-No pueden iniciar por s solas la sntesis de una cadena, precisan un extremo 3OH
libre, de un oligonucletido o pequeo fragmento de cadena, al que unir el grupo fosfato
del primer nucletido que colocan y as poder avanzar. Este fragmento se denomina
cebador o primer y, en la replicacin, lo coloca una enzima RNA-pol llamada Primasa.
El cebador ser pues un oligonucletido de ARN que deber ser posteriormente eliminado
y sustitudo por ADN.

-Tienen actividad exonuclesica, es decir, pueden hidrolizar los nucletidos terminales de

cualquier extremo de una cadena de ADN. Esta actividad permitir la correccin de
errores durante la replicacin y la eliminacin de los cebadores de ARN.
Las DNA-polimerasas requieren una

cadena molde de ADN y sintetizan la

cadena complementaria utilizando para

ello los desoxirribonuclesidos trifosfato.

La energa para la formacin de los

enlaces fosfodister la proporciona la

separacin de pirofosfato por cada

nucletido aadido. Estas enzimas no

pueden iniciar la sntesis de una cadena

si no existe previamente un extremo

3OH libre al que enlazar el primer

nucletido que colocan.Trabajan pues

en direccin 5-3. Animacin

La enzima Primasa sintetiza cebadores (oligonucletidos de RNA)
antes de la actuacin de la DNA-polimerasa, proporcionando as
un extremo 3-OH libre que esta enzima pueda alargar
 LA REPLICACIN ES CONTINUA EN UNA CADENA Y DISCONTINUA EN LA OTRA
La DNA-pol sintetiza las nuevas cadenas de ADN en direccin 5-3. Al ser las cadenas
del ADN antiparalelas, una de ellas servir de molde para la sntesis de una nueva cadena
que crecer en sentido 5-3, de forma continua a medida que avanza la horquilla, pero la
otra debera ser sintetizada en sentido 3-5, lo cual no es posible. Aqu, la DNA-pol debe
realizar la copia en direccin contraria al avance de la horquilla de replicacin, por lo que se
sintetiza de forma discontinua, en forma de fragmentos cortos, a partir de sucesivos cebadores
colocados por la Primasa. Estos fragmentos se denominan, en honor a los investigadores
japoneses que los descubrieron, fragmentos de Okazaki. La replicacin se lleva pues a cabo de
forma continua en una de las hebras, denominada hebra lder, conductora o adelantada, y de
forma discontinua en la otra, denominada habra retardada o retrasada.

The Okazakis and Kornbergs.

From left, Reiji and Tsuneko

Okazaki, Alfred and Sylvy

Kornberg. c1975

Animacin
 ELIMINACIN DE CEBADORES
Y UNIN DE FRAGMENTOS

Una DNA-polimerasa con actividad

exonuclesica 5-3, se encarga de

ir eliminando los cebadores de ARN

y sintetizando al mismo tiempo

pequeos fragmentos de ADN

para rellenar los huecos. Finalmente

es una enzima Ligasa la que cataliza

la formacin de los enlaces entre

los fragmentos resultantes.

Animacin
 ESQUEMA GENERAL DE REPLICACIN

Animacin de replicacin Otra animacin Vdeo de replicacin en youtube

PROTENAS Y ENZIMAS FUNCIN EN LA REPLICACIN

Protenas iniciadoras Reconocen el origen de replicacin (secuencia de nucletidos)

Separan las dos hebras de ADN, consumiendo ATP para romper
Helicasas los enlaces de hidrgeno. Se forman as las horquillas
de replicacin
Se fijan a las cadenas separadas impidiendo la renaturalizacin
Protenas SSB del ADN (reasociacin de las cadenas por apareamiento de
bases)
Alivian los estados de superenrollamiento del ADN por delante
Topoisomerasas de la horquilla de replicacin, cortando una o las dos hebras,
permitiendo el giro y volviendo a sellar
Inician la copia de la hebra molde colocando un oligonucletido
RNA-Primasas cebador de ARN
Replican el ADN en direccin 5-3 de forma continua en una de
DNA-Polimerasas las hebras (cadena adelantada) y discontinua en la otra (cadena
retardada) mediante fragmentos de Okazaki. Adems tienen
actividad exonuclesica, lo que permite la correccin de errores.
Una DNA-Pol elimina cebadores y rellena los huecos con
oligonucletidos de ADN.

DNA-Ligasas Unen los fragmentos en la hebra retardada

CORRECCIN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIN

Si durante la replicacin la DNA-pol inserta un

nucletido errneo, puede reconocer su incapacidad

para enlazarse al nucletido complementario de la

hebra molde. Entonces retrocede y elimina por

hidrlisis el nucletido errneo, gracias a su

actividad exonuclesica 3-5. A continuacin

introduce el nucletido correcto. La adicin de cada

nucletido es comprobada a medida que la DNA-pol

se desplaza a lo largo de la cadena molde, lo que

garantiza la fidelidad de la replicacin, que transcurre

con un error no superior a 1 por cada 109 -1010

nucletidos.
LA DNA-POLIMERASA DEBERA TRABAJAR EN DIRECCIONES OPUESTAS
A MEDIDA QUE AVANZA LA HORQUILLA DE REPLICACIN
COORDINACIN DE LA DIRECCIN DE SNTESIS DE AMBAS CADENAS DE ADN
(mediante la formacin de un bucle en el molde de la cadena retardada)

Animacin de coordinacin
ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO DE REPLICACIN
 PROBLEMAS EN LA REPLICACIN DE LOS EXTREMOS DEL ADN EUCARITICO

Las molculas lineales de ADN tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las
ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los
extremos de cada molcula (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que
viene cebado desde atrs, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra
replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto
segmento al final sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de
replicacin
SOLUCIN A LOS PROBLEMAS DE REPLICACIN DE LOS EXTREMOS
DE LOS CROMOSOMAS EUCARITICOS: LA ENZIMA TELOMERASA

Los telmeros eucariticos (extremos de los

cromosomas) contienen una secuencia corta
rica en Guanina repetida cientos de veces.
Esta secuencia es aadida por una enzima
denominada Telomerasa. La telomerasa es
una enzima transcriptasa inversa que lleva
una corta secuencia de ARN que sirve de
molde para sintetizar esa secuencia repetida.

La adicin de estas secuencias

cortas que lleva a cabo la
Telomerasa contrarresta la
tendencia al acortamiento de
los telmeros durante la
replicacin normal.
En las clulas somticas no hay
actividad telomerasa. Esta est
presente en tejidos fetales,
clulas madre y tambin en
clulas tumorales.

Animacin de Telomerasa
 BLACKBURN, GREIDER Y SZOSTAK RECIBIERON EL NOBEL EN 2009
POR SUS TRABAJOS SOBRE LOS TELMEROS Y LA TELOMERASA

Elizabeth Blackburn y Carol Greider

descubrieron en 1984, la enzima
telomerasa, que aislaron un ao
despus. Por este descubrimiento
recibieron, junto a Jack Szostak, el
Premio Nobel de Medicina en 2009.
 LA REPLICACIN DEL ADN EUCARITICO SE ACOMPAA DE
LA REPLICACIN DE LAS HISTONAS PARA FORMAR LA CROMATINA

Durante la replicacin del DNA eucaritico

son necesarias, adems de las enzimas
estudiadas, las enzimas para sintetizar
las histonas que forman parte de los
nucleosomas.

Las histonas que ya estaban presentes

permanecen en la hebra conductora y
las recin sintetizadas forman nuevos
nucleosomas en la cadena retardada.
COMPARACIN DEL PROCESO DE REPLICACIN EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

Procariotas Eucariotas

Un solo origen de replicacin Mltiples orgenes de replicacin

Fragmentos de Okazaki ms Fragmentos de Okazaki ms

grandes (de 1000 a 2000 pequeos (de 100 a 400
nucletidos) nucletidos)

Ms rpido Unas 10 veces ms lento

(500 nucletidos/seg) (50 nucletidos/seg)

DNA sin histonas DNA con histonas

REPLICACIN DE ADN IN VITRO: LA PCR (REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

Es una tcnica desarrollada por Kary Mullis en 1983 (por la que recibi el premio Nobel de
Qumica en 1993) que permite obtener un gran nmero de copias a partir de un fragmento de
ADN, aunque se encuentre en cantidad mnima, en un corto intervalo de tiempo.
Para esta reaccin se necesita disponer, adems de la muestra de ADN que se va a amplificar,
de:

-Iniciadores o cebadores: pequeas molculas de

ADN de cadena sencilla complementarias a cada
uno de los extremos 3 de la regin que se quiere
copiar.
Kary Mullis.
-Una ADN-polimerasa termorresistente, aislada de
la bacteria termfila Thermus aquaticus, llamada
Taq-polimerasa, capaz de resistir las elevadas
temperaturas a las que se somete la mezcla de
reaccin.

-Una mezcla equimolecular de los cuatro nucletidos

trifosfato (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Los tubos de la mezcla de reaccin se introducen en

un aparato llamado termociclador que, de forma
automtica, realiza ciclos de tres pasos. Cada ciclo
dura unos 5 minutos, y con 20 a 30 ciclos se dispone
de suficiente material para el anlisis posterior.
 CICLOS DE LA PCR

EL termociclador realiza ciclos de tres pasos:

1-Desnaturalizacin, elevando la
temperatura a 94C durante aprox. 1 minuto.

2-Apareamiento de los cebadores

con los extremos 3, al bajar la temperatura
hasta 40-60C, durante unos 0,5-2 minutos.

3-Extensin o replicacin, catalizada

por la Taq-pol, aumentando la temperatura a
72C durante 1-2 min.

Animacin de la PCR

Otra animacin
 ALGUNAS APLICACIONES DE LA PCR

1.Secuenciacin: la PCR permite obtener suficiente cantidad de ADN molde para su

secuenciacin.

2.Estudios evolutivos: la PCR permite amplificar genes de organismos ya extinguidos o

de restos antiguos humanos para compararlos con los genes semejantes de organismos
actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. La PCR tambin se ha utilizado para
conseguir el mapa del genoma humano.

3.Huellas genticas. La PCR permite amplificar muestras de ADN para la determinacin

de las huellas genticas . Esta tcnica se aplica en Medicina legal, con el fin de identificar
individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin
se utiliza en las pruebas de paternidad.

4.Deteccin de infecciones vricas, antes de que

causen sntomas o se desarrolle una respuesta
inmunitaria.

5.Diagnstico prenatal de enfermedades genticas.