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Manual de Torres PDF
Manual de Torres PDF
BACTERIOLOGA MDICA
por
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografa electrnica de Salmonella typhi en divisin. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibu-
jos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
Por muchos aos fue microbilogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social
(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Acade-
mia de Ciencias Mdicas, Fsicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Aca-
demia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
PRESENTACIN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPTULO 1:
BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiologa. Medidas de Bioseguridad. Mtodos de
Esterilizacin o Desinfeccin. Descontaminacin. Antisepsia. Uso efectivo de
Antispticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilizacin. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Qumicos.
CAPTULO 2:
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA / 29
Cmo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriologa. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriologa. La Coloracin de Gram. Foto: Hans Gram. Frmulas: Reactivos para
la Coloracin de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiolgicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriologa, 2 Asas para Micologa y Micobacterias. Fig. 3 Inoculacin de Medios
Slidos por Estras.
CAPTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriolgica para Coprocultivo.
Interpretacin de Resultados. Fig. 5 Observacin y Sealamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Tcnica para tomar Inculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciacin de las Especies del Gnero
Shigella. Diferenciacin de las Especies del Gnero Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Coleccin
de Muestras Duodenales. La Epidemiologa y Etiologa de la Diarrea. Patgenos
Frecuentemente Identificados en Nios con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Pases en Desarrollo.
CAPTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CLERA / 63
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriolgica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Frmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propsito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretacin de
Resultados. Informe.
CAPTULO 6:
INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori / 75
Propsito. Muestra. Observacin Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propsito. Manifestaciones Clnicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Nios Pequeos. Puncin
Supra-pbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriolgica para Urocultivo. Interpretacin de Resultados. Informe. Deteccin
de Bacteriuria por la Coloracin de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriolgica para Cultivo de
Garganta/Exudado Farngeo. Interpretacin. Foto: Interpretacin de la Prueba de
Bacitracina. Identificacin Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretacin de la Prueba de CAMP. Caractersticas
Fsicas, Hematolgicas y Qumicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clnico.
CAPTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propsito. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretacin de Resultados. Informe. Investigacin de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretacin.
Informe.
CAPTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propsito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretacin del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretacin de Resultados e Informe. Etiologa y
Sintomatologa de Neumona y Bronquitis.
CAPTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propsito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnstico Bacteriolgico. Interpretacin de Resultados. Etiologa y
Sintomatologa de Septicemia. Informe.
CAPTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propsito. Muestra. 1 Piel. Etiologa y Sintomatologa de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Ocular. 3 Odos. Etiologa y Sintomatologa
de Otitis Media. 4 Miscelneos. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciacin de Tres Especies del Gnero
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propsito. Diagnstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciacin de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clnica. Diagnstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnstico Directo de la
Sfilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introduccin. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiolgicos.
CAPTULO 14:
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propsito. Muestra. Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriolgica para Lquido Cefalorraqudeo (LCR).
Interpretacin de Resultados. Informe.
CAPTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e Informe.
CAPTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propsito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriolgica para Antibiograma. Antibiticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gram-
negativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretacin de
Resultados. Interpretacin de los Dimetros de las Zonas de Inhibicin (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretacin de los Dimetros de las
Zonas de Inhibicin (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Lmites
Aceptables de los Halos de Inhibicin (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propsito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretacin de Resultados.
Caractersticas Morfolgicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Mdica. Interpretacin del Cultivo. Morfologa Microscpica. Fig. 12
Diversas Morfologas Bacterianas. Informe.
CAPTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propsito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gstrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloracin de Ziehl-Neelsen. Frmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloracin de Kinyoun. Frmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretacin e Informe de Baciloscopas. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestin y Descontaminacin de
Esputos. Mtodo de Digestin y Descontaminacin con N-acetil-levo-cistena
(NALC). Frmulas. Digestin y Descontaminacin de Esputos por el Mtodo
Convencional de Hidrxido de Sodio. Frmulas. Procedimiento de Digestin/
Descontaminacin para Esputos de Pacientes cuyas muestras estn constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gstricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Farngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretacin del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
Atpicas).
BIBLIOGRAFA / 223
NDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriologa
2 Asas para Micologa
Fig.3 / 40
INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS POR ESTRAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLGICA PARA LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la pgina 111 aparecen 32 fotografas a color y
sus explicaciones correspondientes.
Guatemala, agosto de 1996
PRESENTACIN
Atentamente,
Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por
primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin
embargo, la bacteriologa mdica surgi como tal hacia fines del siglo XIX, con los
geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera
vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propag una bacteria patgena en cultivo
puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no slo estableci sta bacteria
como causa del ntrax en el ganado vacuno, sino inaugur un mtodo de
investigacin de las infecciones, actualmente vigente.
15
Es imperativo hacer mencin del gran aporte que el invento del microscopio
represent para las ciencias biolgicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observ las bacterias. Este personaje longevo, no
slo efectu grandes descubrimientos con sus microscopios de lente de gota,
sino tambin nos leg su ejemplo del valor de la palabra cientfica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en da fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacaras Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
16
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invencin del microscopio, el hombre desconoci la vida microscpica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabric ingeniosos microscopios con pequeos lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observ las bacterias, los protozoos, los glbulos rojos y los espermatozoides.
17
Carta a sus hermanas:
La voluntad es algo grande, pues la accin y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaa del xito.
19
CAPTULO 1
21
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las
bacterias y los hongos son los ms abundantes; prcticamente todos los objetos que
vemos y tocamos estn cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente don-
de hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), est cubierto de
bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice
que forman parte de alguna microbiota. Por microbiota se entiende aquel con-
junto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin
causarle ningn dao. La palabra flora no es correcta, y por lo tanto no debe
utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas colonizan, no
infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama
oportunistas.
Todos los nombres cientficos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema
binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran
grupo, es el gnero y siempre se escribe la primera letra con mayscula. El segundo
nombre es la especie y siempre se escribe con letras minsculas. Casi todos los
nombres cientficos de los microorganismos se derivan del griego o del latn, por
esta razn:
Ejemplos:
Adems del nombre cientfico, en algunos casos existe un nombre de uso co-
mn o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
22
Nombre correcto: Nombre vulgar:
Ejemplos:
Tomado de:
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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Equipo necesario:
1. Campana bacteriolgica
2. Campana de flujo laminar cuando es necesario
3. Lmpara de pie
4. Mechero o incinerador
5. Incubadora bacteriolgica
6. Autoclave
7. Horno esterilizador
8. Agitador de tubos
9. Centrfuga
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Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigacin:
ESTERILIZACIN:
Calor Hmedo (autoclave) 121 C a diferentes intervalos de tiempo
Seco (horno) 171 C por 1 hora; 160 C por 2 horas;
121 C por 16 horas
Gas Oxido de etileno 450-500 mg/litro a 55-60 C
Lquido Glutaraldehido variable
Perxido de hidrgeno 6-30%
Formaldehido 6-8%
Dixido de cloro variable
DESINFECCIN
Calor Hmedo
(incluye pasteurizacin) 75-100 C alta
Lquido glutaraldehido variable alta-media
perxido de hidrgeno 3-6% alta-media
formaldehido 1-8% alta-media
compuestos clorinados 500-5,000 mg de cloro libre/litro intermedia
alcoholes (etanol, isoproplico) 70% intermedia
compuestos fenlicos 0.5-3% media-baja
compuestos yodados 0.1-0.2% media-baja
ANTISEPSIA
alcoholes 70%
yodforos 1-2 mg de yodo libre/litro
hexaclorofeno 1-3%
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DESINFECCIN:
Factores:
DESCONTAMINACIN:
ANTISEPSIA:
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ESTERILIZACIN:
Tipos de esterilizacin:
Calor hmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de xido de etileno
Esterilizantes qumicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA
RESISTENCIADE
DEMICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSAAGERMICIDASGERMICIDASQUMICOS
QUIMICOS(*)
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
27
CAPTULO 2
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola clula muy sim-
ple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentacin y reproduccin.
Son uno de los grupos microbianos ms frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condicio-
nes de laboratorio, debe proporcionrseles todas las sustancias nutritivas que re-
quieren (protenas, azcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
segn cada medio de cultivo.
29
d. Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxgeno y tienen la
facultad de tambin crecer en aerobiosis.
30
A B
31
CMO ORGANIZAR EL REA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGA
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con frmica, con las
siguientes asas de nichrome (aleacin de nquel y cromo), segn se ilustra en la
figura 2 (pg. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de
platino puro en anillo pequeo para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).
Para trabajar Micologa (hongos) debe contarse tambin con asa espatulada, asa en
L y dos agujas de diseccin. Las asas bacteriolgicas deben ponerse rectas y lim-
piarse diariamente. Esto se hace fcilmente hacindolas rodar en el suelo deslizan-
do el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.
Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que
ya est fra.
32
6. Una lmpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de cuello de ganso;
colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuerte-
mente el rea sobre la mesa, pero que la luz no d directamente a los ojos.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tien-
das, con tapadera metlica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras
(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres
microaeroflicos.
33
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA
34
LA COLORACIN DE GRAM
1. Cubrir el frote ya fijado y fro con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparacin de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo sua-
vemente con agua corriente, escurrir bien.
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4. Cubrir el frote con safranina slo por 30 segundos. Enjuagar suavemente
con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a
36 C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire
obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
c) Resultados:
d) Informe:
36
en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en
plural.
1. CRISTAL VIOLETA:
Solucin A:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etlico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solucin B:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloracin.
2. LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos
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Agua destilada ................................................................... 300 ml
3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volmenes iguales de acetona pura (para anlisis) y alcohol etlico
al 95 %.
4. SAFRANINA:
Solucin stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos
Alcohol etlico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solucin de trabajo:
Diluir 1:10 la solucin stock (concentrada), as:
Solucin stock .................................................................... 10 ml
Agua destilada ................................................................... 90 ml
38
Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO
ASAS PARA BACTERIOLOGA:
2. Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificacin, o subcultivo.
39
Fig . 3 INOCULACIN DE MEDIOS
SLIDOS POR ESTRAS
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CAPTULO 3
COPROCULTIVO
PROPSITO:
MUESTRA:
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- material obtenido por proctoscopa
- biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las
heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente est en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los nios, introducir el
hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es ms fcil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y l mismo separndose los
glteos. Los nios deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37 C dentro del intestino, son colecta-
das y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20 C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pier-
dan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn si la mues-
tra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un me-
dio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este prop-
sito colocar con hisopo estril una porcin anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamao del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
42
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapn de rosca y
luego autoclavear a 121C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
PROCEDIMIENTO:
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (con-
tienen inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produ-
ce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia).
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COLOR COLONIAS COLONIAS COLONIAS
MEDIO ANTES DE LACTOSA- LACTOSA- CON CIDO
INOCULAR POSITIVO NEGATIVO SULFHDRICO
rosado
SS ligeramente rojo incoloras negro
amarillento
anaranjado- verde
Hektoen verde claro salmn azuladas negro
1- Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-
tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fra) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular slo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2- Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfra (ver figura 3, pg. 40).
44
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras:
Material de
Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de proctoscopa,
enema salino biospia intestinal
INOCULAR Opcional
Rutina
Medios:
45
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Marcar colonias
sospechosas por
detrs de la caja de Petri
46
2- El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscpico para hacer los
sub-cultivos con asa en aguja o recta as:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio
estereoscpico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y
fras, acostmbrese a usarlas segn se indica a continuacin: apoyndose en
el borde del microscopio con los dedos meique y anular de la mano derecha
(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lpiz y bjela lentamen-
te hasta que aparezca en el campo del microscopio y slo toque la superficie
de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
toc la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)
con el dedo meique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y
luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exacta-
mente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y
luego haga un estriado rpido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear
y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres
veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una
estra en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colo-
nia de igual morfologa). Si no cuenta con microscopio estereoscpico proce-
da as:
47
Fig. 6 TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3- Incube a 36C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qu tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubacin de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxgeno. Las colonias marcadas g (E. coli,
nios menores de un ao) pueden pasar slo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
48
Reaccin ya
Reaccin ya
incubada
incubada Gas (g) cido
A=cido K=alcalino R=rojo N=neutro (-a+++) sulfhdrico
Medio sin (h) (-a+++)
Medio sin
inocular
inocular
TSI no no burbujas
(rojo) Amarillo rojo aplicable aplicable o negro
rupturas
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, segn la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, cido sulfhdrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan as:
49
5- Los tubos de TSI, marcados g y que corresponden a coprocultivos de
nios menores de un ao deben aglutinarse para investigar Escherichia
coli enteropatgena (pools A, B y C) (Segn Dr. Myron Levine, U. de
Maryland VI Congreso C.A. de Microbiologa, comunicacion personal). El
informe final deber reportarse as: Se aisl Escherichia coli enteropatgena
del grupo ___ . Debe hacerse notar que aunque el valor cInico de esta prue-
ba ha sido puesto en duda, ya que tambin existen E. coli invasivas y produc-
toras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la
aglutinacin para demostrar la presencia de serotipos clsicos enteropatgenos
en los nios pequeos. Inocule una asada pequea en caldo tripticasa soya o
caldo BHI (infusin de cerebro y corazn de buey), proceda efectuar la prue-
ba de susceptibilidad antimicrobiana segn el mtodo de Bauer-Kirby, des-
crito ms adelante. Si no se observa ninguna aglutinacin, ni se aisla Shigella o
Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe
redactarse as: Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli
enteropatgena. (Slo para nios menores de un ao). Las claves sugeridas
para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y
aceleran el trabajo.
50
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA
Morganella morganii
K/A, g-(+), h- KR/A, g-, h- +
(antes Proteus morganii)
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
parntesis. Todas las reacciones con reaccin roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clnica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es slo una gua, que debe actualizarse
constantemente.
51
DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SHIGELLA:
Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a semen es caracte-
rstico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la ms
frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni
cido sulfhdrico y tienen un color amarillo canario. La reaccin K (alcalino) de
la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-
miento del TSI sospechoso, o del LIA as:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ryela con crayn graso
por detrs a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos
de aproximadamente un centmetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA
con reaccin sospechosa de Shigella, en orden numrico en una gradilla. En la mis-
ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reaccin sospe-
chosa de Salmonella y los TSI marcados C (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.
Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro
de un cuadrito una gotita de antisuero Shigella grupo B (Shigella flexneri). Aglutine
tomando una porcin pequea del crecimiento en TSI (puede ser tambin del LIA)
con asa en anillo estril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en valo
pequeo sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera
de obtener una suspensin ligeramente lechosa. Observe inmediatamente despus
de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrs la aparicin de
aglutinacin franca y obvia.
52
DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DEL GNERO SALMONELLA:
La taxonoma moderna del gnero Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines
prcticos de diagnstico y de investigacin, se recomienda usar la clasificacin an-
tigua simplificada as:
1- No produce gas.
2- Produce poco cido sulfhdrico (una pequea mancha negra,
a veces difcil de apreciarse en el rea del tubo donde empieza el
inclinado).
3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
4- Es citrato-negativo.
5- Aglutina con el antisuero anti-antgeno Vi.
verde = negativo
azul = positivo
53
Diferencie presuntivamente las especies del gnero Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
54
trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de mltiples pruebas
bioqumicas miniaturizadas, por ejemplo API, segn las condiciones de trabajo.
INFORME:
CLAVE
RESULTADO en libro de trabajo TEXTO (Secretaria)
(tcnico)
55
PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS
(ENTEROTEST)
PARA COLECCIN DE MUESTRAS DUODENALES
Procedimiento:
1- El mdico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una trac-
cin rpida pero suave. Luego cortar con tijeras estriles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga aspticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
3- Despus de la incubacin, inocular por estras una asada del caldo tetra-
tionato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aerbicamente a
36 C.
5- Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antgeno Vi y gru-
po D, segn ya se explic.
Medio de cultivo:
56
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, ca-
lentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45 C y luego agregar: 10 ml de
solucin de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solucin acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estriles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estriles con tapn de rosca. El medio debe quedar verde con pre-
cipitado blanco.
Adaptado de:
World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.
Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology
of Diarrhea. Geneva.
57
Disentera
Los pacientes con disentera causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Ba-
cilo de Shiga), estn a menudo clnicamente muy enfermos. Este sndrome
clnico casi siempre incluye fiebre alta, sntomas txicos y clicos abdomina-
les intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaa de complicaciones graves, como el sndrome hemoltico urmico.
EPIDEMIOLOGA
58
- Usar biberones para alimentar a los nios.
- Guardar alimentos a temperatura ambiente.
- Beber agua contaminada con bacterias fecales.
- No lavarse las manos despus de defecar, despus de desechar las
heces de los nios o de limpiar los paales y antes de preparar o
servir alimentos.
- No desechar higinicamente las heces (incluyendo las de los
lactantes).
Epidemias
En las reas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el ao, au-
menta su frecuencia durante los meses secos y ms fros, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estacin lluviosa y ms clida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrn estacional de la dia-
rrea aguda lquida.
ETIOLOGA
Enteropatgenos importantes:
Virus: Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxignica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum
59
Patgenos frecuentemente identificados en nios con diarrea
aguda, atendidos en centros de tratamiento, en pases en desarrollo
60
Otros patgenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en
nios en los pases en desarrollo es mnima, o no est bien definida. Estos
incluyen:
Virus: agente Norwalk
adenovirus entricos
Virus
Los rotavirus se replican dentro de las clulas epiteliales maduras que
cubren la porcin superior de las vellosidades intestinales, causando destruc-
cin celular y acortamiento de las vellosidades.
Bacterias
Adherencia a la mucosa
Produccin de toxinas que causan secrecin intestinal
Invasin de la mucosa
Protozoos
Adherencia a la mucosa
Invasin de la mucosa
61
Shigella
62
CAPTULO 4
PROPSITO:
63
El diagnstico definitivo de clera se establece slo por la demostracin de V.
cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indi-
cativo de clera, pero no se considera un procedimiento diagnstico exacto.
MUESTRA:
PROCEDIMIENTO:
64
3. Despus del tiempo crtico de incubacin del APA, retirar el tubo cuida-
dosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no ms de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aerbicamente 18 a 24 horas a 36 C.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
3. Aglutinar las colonias tpicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
65
colonias pequeas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es
inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las
colonias son chiclosas, muy adherentes al medio, y no se pueden sus-
pender bien en el antisuero, por lo que la aglutinacin slo es confiable
a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
66
Fig. 7 MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA
AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01
Muestras:
Vibro cholerae
en la superficie
del APA
3. Tomar inculo de la
superficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
APA No agitar 5. Incubar 18-24 horas
o
a 36 C
67
INFORME:
En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una tcnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para aho-
rrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el re-
porte de un cultivo positivo. Se recomienda informar as, lo ms pronto posible, y
al lugar ms indicado:
FRMULAS:
68
2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:
69
CAPTULO 5
PROPSITO:
La infeccin intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vmitos. Puede haber sangre macroscpica en las heces,
especialmente en las muestras peditricas. La infeccin se adquiere por va oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infeccin puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues tambin puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuen-
te en animales domsticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, adems
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis sptica, meningitis y otras
infecciones.
71
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abun-
dantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificacin de C. jejuni.
MUESTRA:
CONDICIONES NECESARIAS:
72
PROCEDIMIENTO:
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
73
4. De otra colonia tpica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar
Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de
agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmsfera microaeroflica a
42 C, segn ya fue descrito.
- El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin cido sulfdrico.
INFORME:
74
CAPTULO 6
PROPSITO:
MUESTRA:
75
OBSERVACIN DIRECTA:
PRUEBA DE UREASA:
H. pylori produce abundante ureasa, enzima que acta sobre el sustrato urea,
con produccin de abundante amonaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba
indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera
presuntiva. Proceder as:
CULTIVO:
76
3. Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin cataltico en la tapadera,
ni indicador de anaerobiosis. Introducir segn las instrucciones del pro-
ductor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el cataltico presen-
te, proporciona una atmsfera microaeroflica adecuada para el cultivo
de H. pylori.
6. Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:
INFORME:
77
CAPTULO 7
UROCULTIVO
PROPSITO:
Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminacin.
79
MANIFESTACIONES CLNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS
CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS
MICROORGANISMOS CONTEO
TIPO DE MANIFESTACIONES
ASOCIADOS CON SIGNIFICATIVO
INFECCIN CLNICAS
LA INFECCIN (UFC/ml)
Tracto urinario Agudo: fiebre, calofros, dolor *Bacilos gram-negativo Mayor o igual a
superior: de cintura posterior, nusea, Staphylococcus aureus 100,000
pielonefritis vmitos, cilindros leucocita- Staphylococcus coagulasa-negativo (criterio de Kass)
rios, invasin tisular Candida spp. (hongo)
Crnico: asintomtico, Mycobacterium spp.
moderado o agudo, lesiones, Mycoplasma hominis
cilindros leucocitarios
Tracto urinario Sintomtico: disuria, *Escherichia coli Mayor o igual a
inferior: frecuencia *Otros bacilos gram-negativo 100,000
80
cistitis Asintomtico Enterococcus spp. (criterio de Kass)
Staphylococcus coagulasa-negativo
Uretritis Disuria, frecuencia *Escherichia coli Mayor o igual a
Chlamydia trachomatis 100
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus saprophyticus
Trichomonas vaginalis (protozoo)
Virus Herpes simplex tipo 2
Candida albicans (hongo)
Prostatitis Agudo: fiebre, calofros, *Bacilos gram-negativo Mayor o igual a
dolor de espalda Ureaplasma urealyticum 100
Chlamydia trachomatis
* Aislamiento comn. Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.
TOMA DE LA MUESTRA:
1. Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estril em-
papada en jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra
gasa estril, empapada en agua estril.
1. Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos ndice y medio de la mano izquierda
debe separarse los labios genitales mayores.
81
2. Con una gasa empapada en jabn antisptico no irritante limpiar bien
toda el rea y luego remover el jabn con otra gasa empapada en agua
estril.
82
- Malformacin anatmica que evite la miccin normal del nio, causan-
do contaminaciones.
- Urocultivo aerobio negativo varias veces, continan los sntomas, el
sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infeccin
urinaria causada por bacterias anaerobios.
Nota importante: Jams introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios
aos que esta tcnica cay en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que estn
colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la prime-
ra orina de la maana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse
un mnimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo
para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta nmeros
significativos dentro del sistema urinario.
PROCEDIMIENTO:
2. Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)
que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador
vortex, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Intro-
ducir verticalmente el asa flameada y fra
en la orina, justamente por debajo de la
superficie.
Agar sangre carnero
3. Inocular primero el agar sangre deslizan-
do el asa una sola vez a lo largo de la caja MacConkey
y pasando por el centro. Flamear e ino-
cular en igual forma el MacConkey. Al-
ternativamente, sembrar una biplaca de
agar sangre de carnero y MacConkey, con Biplaca para urocultivo
83
Fig. 8 MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO
1. Agitar
2. Tomar 0.001 ml
con asa calibrada
de platino,
verticalmente y
justamente por
debajo de la
superficie
ASC
MacConkey
84
0.001 ml en cada mitad segn la foto. Esto permite el ahorro de cajas
de Petri.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
85
No. colonias contadas UFC/ml de orina
25 25,000
78 78,000
100 en adelante ms de 100,000
CLAVE : TEXTO
(en libro de registros) DEL INFORME:
E. coli ms de 100,000
UFC /ml. S/A (sus- Se aisl Escherichia coli, ms de 100,000 UFC /ml. Infeccin uri-
ceptibilidad antimi- naria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
crobiana)
De una colonia tpica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para
confirmar la identificacin presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la
misma colonia y otras idnticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o
antibiograma, segn la tcnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de
E. coli fermentadoras lentas de lactosa y debern identificarse con TSI y LIA, no
presentan diseminacin en cepas en el agar sangre.
CLAVE: TEXTO:
86
hemolticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o gipil
nuevo (telas tpicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para
confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:
CLAVE: TEXTO:
CLAVE: TEXTO:
Proteus sp. ms de 100,000 Se aisl Proteus sp. ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urina-
UFC ml. S/A. ria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
87
Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de dimetro), pueden o no
ser hemolticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloracin
de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar
con dos pruebas especficas descritas en el Captulo 8: coagulasa y manitol-sal.
Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibiticos para gram-positivo
segn la tabla del captulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y
manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar
slo si est presente en cantidad significativa y en cultivo puro.
CLAVE: TEXTO:
INFORME:
88
UFC/ml CRITERIO PARA REPORTAR
50,000 - 100,000 Se aisl _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el nmero
de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).
*30 a 50 por ciento de mujeres con infeccin vesical y/o uretral con disuria,
urgencia y frecuencia (sndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.
En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el lmite para hacer diagnstico
correcto, en asociacin ntima con el mdico tratante. (Segn Jacobo Sabbaj K.,
VI Congreso Centroamericano de Microbiologa, Guatemala, 5-9 de diciembre de
1983).
2. Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrs con un crculo de
crayn graso y colorear cuidadosamente con Gran.
89
6. La presencia de muchas clulas epiteliales (citoplasma grande y claro,
ncleo pequeo) y diferentes tipos de bacterias indican contaminacin
y el examen debe repetirse.
90
CAPTULO 8
CULTIVO DE GARGANTA
PROPSITO
MUESTRA:
91
siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar
preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:
2. Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y
diga aahh.
5. Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado
de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos
(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
92
disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y
Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibitico neomicina,
por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como
el disco de bacitracina (tambin llamado taxo A) se encuentra muy
cerca frecuentemente puede acelerarse la identificacin presutiva.
Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30)
pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (segn:
Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953).
Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cul-
tivos bacteriolgicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por
contener anticoagulantes, anticuerpos o antibiticos, adems del peligro potencial
de la transmisin del virus del SIDA, hepatitis B, etc.
93
Fig. 9 MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO
DE GARGANTA/EXUDADO FARNGEO
1. Muestra: Tomar un
hisopo farngeo con vula
buena luz y baja-
lenguas Amgdala
Farnge
posterior
2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estras, con dos cortadas
de 1 cm, sin flamear entre cada estra
3. Colocar sobre la primera estra, un disco de bacitracina de 0.04 unidades
y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre s
4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C
Cortada 1
Disco de bacitracina
A
N
30
Disco de neomicina
Cortada 2
94
INTERPRETACIN:
95
anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo
inicial. Colocar con pinzas estriles un disco bacitracina en el inicio de la
segunda estra.
* La inhibicin por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier
dimetro de halo de inhibicin se considera significativo. Efectuar simultneamente susceptibili-
dad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibitico, lo que
aumenta la certeza de la identificacin, junto con la prueba de CAMP negativa (tcnica adelante).
96
7. Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infeccio-
nes de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacte-
rias que se citan a continuacin solamente cuando predominan por en-
cima de la microbiota normal. Examinar la ltima estra que presenta
colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay ms
colonias que Streptococcus sp. alfa hemoltico y Neisseria sp., de:
97
Inhibicin por disco de optoquina Informar
Clave Informar
98
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIONES
RESPIRATORIAS SUPERIORES
SIGNOS Y SNTOMAS BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA
Sinusitis/Rinitis: Streptococcus pneumoniae
Cefalea Streptococcus pyogenes (grupo A)
Dolor/eritema en regin malar Staphylococcus aureus
Rayos-X: Consolidacin, nivel Haemophilus influenzae
de lquido, engrosamiento de la
Klebsiella spp. y otras enterobacterias
pared de los senos
Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)
Garganta y faringe: Streptococcus pyogenes (grupo A)
Eritema y edema de mucosas Corynebacterium diphtheriae
Pus en amgdalas Neisseria gonorrhoeae
Pseudomembranas Bordetella pertussis
Edema de la vula
Lengua con cubierta griscea
Linfadenitis cervical
2. Luego con sumo cuidado, hacer una estra con el Streptococccus beta
hemoltico a identificar, perpendicular a la estra de S. aureus pero que
no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeo de
hemlisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.
99
Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP
Strepto. Strepto.
Flecha
Staph. Staph.
100
Tomado de:
101
4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de
sedimentacin 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito dismi-
nuyen con la edad y se elevan cuando el animal est excitado.
Los glbulos rojos ovinos son ms pequeos que los humanos. La mem-
brana celular de los pequeos eritocitos de carnero es muy susceptible a la
accin de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso
de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta caracterstica auna-
da a su fragilidad ligeramente mayor en comparacin a los eritrocitos huma-
nos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemlisis
in vitro.
Tomado de:
102
VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO
EN EL LABORATORIO CLNICO
3
gre de carnero por su bajo contenido de nucletidos de piridina
(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produ-
ce colonias idnticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita
falsos positivos.
103
La sangre de carnero desfibrinada aspticamente, no contiene
5
Se evita manipular volmenes considerables de sangre humana,
por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras
infecciones humanas, durante la preparacin del agar sangre.
Referencia:
104
CAPTULO 9
PROPSITO:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
105
ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las
pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros difteroides
de igual morfologa.
3. Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar
chocolate-telurito de potasio. Incubar aerbicamente a 36 C por 18 a 24
horas.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Proceder as:
106
2. Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y
teirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.
INFORME:
107
2. Si la morfologa microscpica del crecimiento en Loeffler es tpica y hay
colonias negras en chocolate-telurito, reportar:
Se aisl Corynebacterium diphtheriae. Identificacin preliminar,
pendiente de demostrar la produccin de toxina in vitro o in vivo.
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
Proceder as:
2. Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio Thayer-
Martin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.
108
3. Introducir los tubos, con el tapn de rosca ligeramente flojo, dentro
de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24
horas a 36 C.
INTERPRETACIN:
2. Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeo frote Gram
de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negati-
vo en forma de granos de caf, agrupados en parejas.
3. Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta
morfologa microscpica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),
e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.
INFORME:
Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se est seguro que no se trata
de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota nor-
mal de la garganta, informar: Se aisl Neisseria meningitidis.
Si se cuenta con los antisueros de tipificacin, realcela e informe:
Se aisl Neisseria meningitidis del grupo __. (segn el que haya aglutinado)
109
Fotografas
a
Color
111
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19 20
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
116
31 32
FOTOGRAFAS
Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.
Bacilos gram-negativo, regulares, de coloracin slida y bordes redondeados. Esta
morfologa es tpica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,
D.C., E.U.A.
Foto 8. Bacteroides fragilis, coloracin de Gram de cultivo puro. Presenta coloracin rojo
plido (tpica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe
Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.
Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.
Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciacin. Las
colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmn; las lactosa-
117
negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde plido. Las colonias
productoras de cido sulfhdrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la
colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 11. Reacciones tpicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie
alcalina (rojo), fondo cido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta
abundante gas (burbuja y fondo separado) y cido sulfhdrico (negro). El LIA (arriba)
es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilacin del aminocido lisina,
tambin presenta precipitado negro debido al cido sulfhdrico. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 12. Reacciones tpicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina
(rojo), fondo cido (amarillo), no presenta gas ni cido sulfhdrico. El LIA (arriba) es
alcalino/cido (K/A), sin gas ni cido sulfhdrico. En Shigella spp. frecuentemente el
color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel
F. Torres, Guatemala.
Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con
clera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.
Colonias tpicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
118
Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, ms de 100,000 UFC/ml, en agar
MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra
colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cpsula. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, ms de 100,000 UFC/ ml, en agar
MacConkey. Esta imagen es la ms frecuente en urocultivos positivos. Las incontables
colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un
disco de bacitracina. Este cultivo fu incubado en jarro hmedo con candela a 37 grados
centgrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibicin del crecimiento provocada
selectivamente por este antibitico, como un halo rojo (sin destruccin de los eritrocitos
ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa
hemlisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre
de carnero. Las estras verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemlisis
presentan crecimiento blanco. Las estras perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes
son beta hemolticas, pero la hemlisis no se incrementa en forma de flecha donde el
crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina.
El halo de inhibin mayor de 14 mm de dimetro, identifica presuntivamente a
Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con
neumona lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que
poseen cpsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de ste caso. Las colonias
confluentes presentan la tpica hemlisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de
optoquina. Se observa un amplio halo de inhibicin del cultivo por el hidrocloruro de
119
etil cuprena (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan tambin las
reacciones tpicas de inhibicin y alfa hemlisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad segn el
mtodo de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutricin de
Centroamrica y Panam, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:
Leonardo J. Mata, Costa Rica.
Foto 27. Demostracin del mtodo para preparacin de frotes de esputo entre dos porta-
objetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriologa II, Laboratorio de
Microbiologa, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: annima.
Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la tcnica de Ziehl-
Neelsen. Los bacilos alcohol-cido resistentes aparecen teidos de color rojo. La
coloracin de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,
Inglaterra.
Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordn. Las cepas ms virulentas
de M. tuberculsis manifiestan esta caracterstica. Se observa el crecimiento en forma de
cordones sinuosos. Foto: Rubn Mayorga Peralta.
120
CAPTULO 10
CULTIVO DE ESPUTO
PROPSITO:
MUESTRA:
121
micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse
por no ms de tres horas.
Debe ponerse atencin en el color, olor y consistencia del esputo. Las mues-
tras hialinas y completamente lquidas deben rechazarse de inmediato pues no son
esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la
presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero
el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presen-
tes por el paso de la muestra a travs de la boca, donde son muy abundantes. En
caso de sospecharse infeccin pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra
por puncin trans-traqueal.
4. Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor
122
sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con
Ziehl-Neelsen, si as fue solicitado por el mdico.
a. Ms de 10 clulas epiteliales/campo, y
b. Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clnica Mayo, de
Murray y Washington, y de Van Scoy).
123
de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la
neumona.
CULTIVO DE ESPUTO:
El esputo vertido en una caja de Petri estril (para poder seleccionar mejor la
fraccin de la muestra a analizar), debe procesarse as:
124
alfa hemolticas (hemlisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y
con los bordes ligeramente ms elevados), brillantes, transparentes, y
pequeas (menos de un milmetro de dimetro). Algunas veces las colo-
nias de S. pneumoniae no son tpicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm),
convexas y muy mucosas (debido a la cpsula). Siempre presentan la
hemlisis verdosa (alfa) caracterstica.
125
miento slo muy cerca de la estra de S. aureus). El frote Gram del creci-
miento de las pequeas colonias satlites presenta predominio de
cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasa-
positivo.
7. Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtie-
nen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neu-
mona humana, solamente si su crecimiento predomina.
126
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE NEUMONA Y BRONQUITIS
127
CAPTULO 11
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO
PROPSITO:
MUESTRA:
129
1. La cantidad de sangre que se cultiva. En nios debe ser al menos 2.5 ml
y en adultos usualmente 5 ml, aunque sera preferible cultivar 10 ml.
3. Es una buena prctica rutinaria lavar con agua y jabn el brazo del
130
paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un
algodn empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y
luego limpiar el sitio de puncin con un algodn empapado en alcohol,
con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio
de puncin. Despus de esta prepacin no se debe volver a tocar la vena.
131
ilaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el
hemocultivo.
PROCEDIMIENTO:
132
3. En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suave-
mente, limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar
con jeringa y aguja estriles (puede ser de tuberculina) y aspirar una
pequea cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa
sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;
incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres
gotas del hemocultivo, pero slo estriar una. Si no se observa crecimien-
to en las gotas no rayadas y lo hay en las estras, posiblemente se trata
de contaminacin. Simultneamente, dejar secar dos gotas del caldo so-
bre un porta-objetos; colorear con Gram.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS;
133
grupo D, y anti-antgeno Vi. Si hay aglutinacin franca, reportar inme-
diatamente la presencia de Salmonella typhi.
- Salmonella typhi
- Escherichia coli
- Streptococcus pneumoniae
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Pseudomonas aeruginosa
- Haemophilus influenzae
134
INFORME:
135
CAPTULO 12
SECRECIONES DIVERSAS
PROPSITO:
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Streptococcus pneumoniae
MUESTRA:
137
Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote
para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las
bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna
microbiota normal adems de algn patgeno.
1. PIEL:
Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesin intacta y ma-
dura, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el rea de donde se tomar
la muestra para frote Gram y cultivo, con algodn empapado en alcohol y exprimi-
do. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estril o
bistur pequeo, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario
(usar guantes de hule estriles) presionar a los lados de la lesin, hacia el centro,
para exprimir el pus hacia afuera. Tomar una pequea gota de pus con el asa
espatulada estril, punta de aplicador de madera estril (quebrado) o hisopo est-
ril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden:
Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos.
Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la
caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores
del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate,
que no son inhibitorios.
138
2. OJOS:
Tomar la muestra con hisopo estril, as: bajar el prpado inferior, haciendo
presin hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar
guantes de hule estriles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo
hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar san-
gre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.
Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra. Hacer un
frote pequeo sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesiva-
mente.
3. ODOS:
139
den. Con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra y sin frotar mucho, hacer
un pequeo frote sobre porta-objetos limpio.
4. MISCELNEOS:
El material para tomar las muestras debe ser estril. La toma de muestra debe
ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesin
seca y no de un sitio representativo, es completamente intil. El sangrado debe
evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difciles o invasivas,
que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervencin del
microbilogo o del mdico.
140
PROCEDIMIENTO:
141
lonias planas alfa hemolticas (hemlisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar
sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae.
142
tubo es ms sensible y confiable, pero si la reaccin da positiva en lmina es sufi-
ciente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por
ciento de correlacin.
143
gnero por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciacin hasta especie re-
quiere de pruebas ms complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en
agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos
microaeroflicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el
primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de
los eritrocitos.
144
Con fines prcticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo
positivo as:
- Cultivo de ojos, reportar: Se aisl Haemophilus aegyptius.
- Cultivo de cualquier otra secrecin: Se aisl Haemophilus influenzae.
145
CAPTULO 13
SECRECIONES GENITALES
PROPSITO:
DIAGNSTICO DE GONORREA
Muestra:
El agente causal de la
gonorrea es la bacteria Neisseria
gonorrhoeae un diplococo gram-ne-
gativo (rojo). Las neiserias presen-
tan forma arrionada y se agrupan
en pares que semejan granos de Neisseria gonorrhoeae, frote
caf. El diagnstico de laboratorio Gram de pus uretral masculino.
de la gonorrea consiste en la obser-
147
vacin de la morfologa tpica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (slo en
el hombre, no as en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae.
Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se ais-
lan de heces, sangre, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. Los nios que
nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal
vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el
pus de los ojos de estos nios puede observarse y cultivarse la bacteria.
Hombres:
Mujeres:
148
2- Con la punta de algodn de un hisopo estril tomar pus de donde se
localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra.
Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un porta-
objetos de vidrio.
3- Tomar ms pus con otro hisopo estril, e inocular una caja o botellita de
Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.
Procedimiento:
2- Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inculo sobre toda
la superficie de cajas o botellitas.
Interpretacin de resultados:
Cultivo:
149
nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sus-
tancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sus-
tancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general slo crece este microorganismo
en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeas (menos de 1 mm de
dimetro), translcidas, brillantes y de bordes lisos.
Efectuar la prueba con el reactivo lquido as: aplicar unas gotas del reactivo
recin preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias to-
man rpidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es posi-
tiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es
positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia tpica sin reactivo, o una colo-
nia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas
a 36C en jarro hmedo con candela. Despus de incubar, hacer frote Gram al
crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arrionados gram-
negativo.
150
hasta una concentracin de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapn de
rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien
cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo slo unos pocos milmetros
por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapn de rosca e
incubar de 48 a 72 horas a 37 C. Una coloracin amarilla en la superficie del medio
indica reaccin positiva. Interpretar resultados segn esta tabla:
Neisseria gonorrhoeae + - -
Neisseria meningitidis* + + -
* Ver captulo 14
Informe:
151
DIAGNSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE)
Muestra y Procedimiento:
Las lesiones en los genitales son generalmente lceras bien circunscritas do-
lorosas con base necrtica y bordes socavados y blandos. De estas caractersticas se
deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifiltico tpi-
co). Las lesiones rara vez son ms grandes de 2 cm de dimetro, pueden haber
lesiones mltiples por autoinoculacin y en ms de la mitad de los casos, los ganglios
de la ingle estn endurecidos.
152
DIAGNSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS
En la mayora de los casos de sfilis primaria aparece una lesin tpica en los
rganos genitales, llamada chancro. El chancro se caracteriza por ser una lcera
no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una le-
sin muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse
con guantes.
Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colo-
rantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observacin microscpica en
fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no
haya recibido tratamiento con antibiticos especialmente penicilina, que hace des-
aparecer rpidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede
as:
153
o para tubos capilares (de los que vienen en kits de serologa), porta-
objetos, cubre-objetos, solucin salina estril en frasco, gasa estril y al-
godn con alcohol.
4- Con la mano izquierda, tomar la lesin entre los dedos pulgar e ndice y
presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesin un lquido
translcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe
soportar el dolor sin anestesia.
5- Causar leve abrasin con el tubo capilar sin causar sangramiento, rpi-
damente dejar caer en el centro de la lesin una gota de solucin salina
del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesin, dos o tres
veces ms. Debe usarse lo menos posible de solucin salina para no di-
luir la muestra, que debe ser un lquido lechoso ligeramente hemorrgico
que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa
estril si se considera ms fcil de manejar.
154
9- Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el mi-
croscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el
condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de
inmersin de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.
Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir
lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por de-
bajo de la lmina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de
la luz del microscopio al mximo, luego enfocar la muestra con seco
dbil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el
mximo de contraste, es decir los objetos ms brillantes y el campo ms
oscuro.
10- Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de
nuevo con el tornillo micromtrico y la altura del condensador. Una vez
claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura
12) con las siguientes caractersticas:
155
Interpretacin de resultados e informe:
Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difciles de colo-
rear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnacin con sales de plata
para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisa-
dos para la preparacin del presente manual menciona este tipo de coloraciones,
que han cado en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases,
pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se
cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que s
cuente con esta facilidad.
156
AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO
INTRODUCCION
Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el moti-
vo de consulta ms frecuente en las clnicas de Ginecologa. Se manifiestan
clnicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o
sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son
importantes adems de las molestias que causan a la paciente, por las poten-
ciales complicaciones al diseminarse a otros rganos como el tero o las trom-
pas de Falopio y porque representan tambin un riesgo para el feto en la
mujer embarazada.
Segn el rea anatmica afectada por los procesos infecciosos, stos pue-
den clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,
salpingitis, enfermedad plvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ovricos.
Esta clasificacin brinda las bases para el manejo clnico y tambin orienta
sobre la etiologa, epidemiologa y tratamiento de los mismos. Es tambin
importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiolgicas de la
vida de la mujer (niez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se
presentan con mayor o menor frecuencia algn tipo de microorganismos en
particular.
VAGINITIS
157
viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que
permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y
cuando son situaciones fisiolgicas. La vaginitis es definida objetivamente
cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal
y/o sntomas asociados a la presencia de microorganismos patgenos. Los
cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de
amina positiva y presencia de clulas clave.
158
3. Vaginitis en mujeres postmenopusicas
A. Tricomoniasis
B. Candidosis vulvovaginal
159
C. Vaginosis bacteriana
CERVICITIS
160
de planificacin familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las
adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%).
161
CAPTULO 14
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y
FLUIDOS CORPORALES
PROPSITO:
Gram negativo:
- Neisseria meningitidis (causa meningitis meningoccica severa)
- Haemophilus influenzae (especialmente en nios de 6 meses a 4 aos de
edad)
- Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos
y post-craneotoma)
- Pseudomonas aeruginosa
Gram-positivo:
- Streptococcus pneumoniae (muy importante)
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)
- Streptococcus pyogenes
- Listeria monocytogenes (raro)
MUESTRA:
163
Lquido ventricular (lquido cisternal, lquido craneal)
Fluido abdominal (lquido peritoneal o asebico, lquido de parasentesis, l-
quido de dilisis, bilis)
Lquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del trax)
Lquido pericrdico
Lquido sinovial
Mdula sea, sangre (ver captulo de hemocultivo y mielocultivo)
Por lo general estas muestras son obtenidas por el mdico que solicita su an-
lisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibiticos y las debe colec-
tar en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio.
164
PROCEDIMIENTO:
165
Fig. 11 MARCHA BACTERIOLGICA PARA
LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)
GRAM ZIEHL-NEELSEN
sedimento
Tioglicolato Lowenstein-Jensen
agar sangre agar MacConkey NO INCLINAR
de carnero chocolate Sabouraud
4. Incubar en jarro 5. Incubar aerbicamente a 36o C,
con candela Sabouraud a 27o C
166
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
167
Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubacin a 36C. Si no se
observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubacin tam-
poco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar Negativo a
las 48 horas de incubacin a 36C en aero-anaerobiosis. Si se observa algn creci-
miento a las 24 48 horas, comparar con la siguiente tabla:
Crecimiento en
BACTERIA
Agar Sangre Agar Chocolate MacConkey Tioglicolato Sabouraud
N. meningitidis -/+ + - - -
H. influenzae - + - - -
S. pneumoniae + + - +/- +
Enterobacterias
+ + + + +
y pseudomonas
Cryptococcus
- - - - +
neoformans
Anaerobios - - - + -
* Aglutinar con antisueros especficos, los grupos ms frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma
en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.
** Prueba de satelitismo para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).
168
Efectuar la prueba de satelitismo as:
INFORME:
169
CAPTULO 15
TEJIDOS Y BIOPSIAS
PROPSITO:
MUESTRA:
171
muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estril con un poco
de solucin salina estril al laboratorio de microbiologa.
PROCEDIMIENTO:
No es adecuado inocular los medios slo tocando o frotando la pieza con una
asa. Debe hacerse de la siguiente manera:
1- Colocar la pieza con pinzas estriles en una caja de Petri estril. Con
tijeras estriles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de
tejido estril o, si no lo hay, a un pequeo mortero estril.
6- Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.
172
INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME
173
ANUNCIO
ZITHROMAX
175
DOCUMENTO
ZITHROMAX
176
CAPTULO 16
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
(ANTIBIOGRAMA)
PROPSITO
MEDIO DE CULTIVO
177
cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la
caja, concentracin del inculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar
perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre
los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta tcnica slo
sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aerbicas o facultati-
vas de crecimiento rpido:
- Staphylococcus aureus
- Enterobacterias
- Pseudomonas
3- El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con
potencimetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un peque-
o beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,
antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.
4- De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36 C para com-
probar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas
para efectuar antibiograma despus de ser incubadas.
178
Almacenaje de discos con antibiticos
PROCEDIMIENTO:
179
Preparar el estndar 0.5 de MacFarland as: mezclar 0.5 ml de cloruro de
bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en baln de 100 ml, aforar con agua
destilada), ms 99.5 ml de cido sulfrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en
baln de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren
bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo
estndar cada 6 meses.
180
Fig. 12 MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA
1. Tomar 4 5 colonias
de igual morfologa
del cultivo original
o
3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la
turbidez del estndar 0.5 de MacFarland
Agar Mueller-Hinton
5. Sembrar caja
pre-secada en tres
direcciones opuestas
181
ANTIBITICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN
USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS
Enterobacterias:
182
Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la
familia Enterobacteriaceae:
Staphylococcus spp.:
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
183
con una regla por detrs de la caja de Petri, o con patrones especiales.
No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhi-
bicin o crecimiento muy dbil (80% de inhibicin). Sin embargo, si se
observan mltiples colonias dentro del halo de inhibicin, stas deben
sub-cultivarse para descartar contaminacin. En caso de tratarse de la
misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias
que crecen dentro del halo. El velo de crecimiento de Proteus sp. den-
tro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el
mrgen donde se inicia el crecimiento grueso.
184
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIN (mm)
PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae
185
(Continuacin)
Agente Contenido Moderadamente
Resistente Intermedio Susceptible
Antimicrobiano del disco (mcg) susceptible
Ticarcilina-cido
75/10 14 15-19 20
clavulnico
Tobramicina 310 12 13-14 15
Trimetoprim-
1.25/23.75 10 11-15 16
sulfametoxazol
Reportar slo en
urocultivos:
Carbenicilina 100 19 20-22 23
Cinoxacina 100 14 15-18 19
Nitrofurantona 300 14 15-16 17
Norfloxacina 310 12 13-16 17
Ofloxacina 315 12 13-15 16
Sulfisoxazol 250 300 12 13-16 17
Trimetoprim 315 10 11-15 >16
186
(Continuacin)
Agente Contenido Moderadamente
Resistente Intermedio Susceptible
antimicrobiano del disco susceptible
Meticilina 135 mcg 9 10-13 9 14
Ofloxacina 315 mcg 12 12 13-15 16
Oxacilina 311 mcg 10 11-12 10 13
Penicilina G 10 U 28 28 28 29
Rifampicina 315 mcg 16 17-19 16 20
Tetraciclina 330 mcg 14 15-18 314 19
Trimetoprim- 10
1.25/23.75 mcg 10 11-15 16
sulfametoxazol
Vancomicina 330 mcg 39 10-11 39 312
Reportar slo slo
Reportar en uro:
en urocultivos:
Nitrofurantona 300 mcg 14 15-16 14 17
Norfloxacina 310 mcg 12 13-16 12 17
Sulfisoxazol 250 300 mcg 12 13-16 17
Trimetoprim 315 mcg 10 11-15 16
Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor
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Pennsylvania, U.S.A.
CONTROL DE CALIDAD
La susceptibilidad de las dos cepas patrn debe probarse con cada lote nuevo
187
de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos
refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre.
Las zonas de inhibicin de los patrones conocidos sirven para evaluar la pre-
cisin de la prueba. Los halos de inhibicin de las dos cepas control deben estar
entre los rangos de la siguiente tabla:
Trimetoprim-sulfametoxazol 24 - 32 24 - 32
188
16- Mala preparacin o almacenaje del estndar 0.5 de MacFarland.
17- No exprimir el hisopo en las paredes del tubo.
18- Retraso entre la preparacin del inculo y la siembra (aumenta la
concentracin bacteriana).
19- Retraso en la aplicacin de los discos en las cajas ya inoculadas.
10- Exceso de incubacin de las cajas.
11- Uso de jarro con candela o incubacin a otra temperatura que no sea
36 C.
12- Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubacin.
13- Mala medicin de los halos de inhibicin.
14- Cultivos mixto, no puros.
15- Aplicacin de la tcnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento.
16- No usar las cepas control.
17- Errores de transcripcin de resultados.
189
ANUNCIO
UNASYN
(blanco y negro,
cara de nio)
191
DOCUMENTO
UNASYN
(blanco y negro
columna vertical,
debe decir
UNASYN al
principio)
192
CAPTULO 17
ANAEROBIOS
PROPSITO:
MUESTRA:
- Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxgeno del aire. Si los
anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pier-
den muy rpidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cul-
tivo). Por esta razn deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto
para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.
193
13- Tejido necrtico, gangrena o formacin de pseudo-membranas.
14- Gas en tejido o secrecin.
15- Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos.
16- Infeccin asociada con cncer u otros procesos que causan destruccin
de tejidos.
17- Infeccin relacionada con uso de antibiticos aminoglucsidos.
18- Tromboflebitis sptica.
19- Bacteremia con ictericia.
10- Infeccin causada por mordidas humanas o de animales (investigar
Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio).
11- Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo
luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus).
12- Presencia de grnulos de azufre en pus de lesiones en mandbula u
otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii).
13- Signos y sntomas de gangrena gaseosa.
14- Entidades clnicas que generalmente implican anaerobios como aborto
sptico, o ciruga gastrointestinal infectada.
1- Pus aspirado.
2- Tejidos varios (biopsia, ciruga, autopsia).
3- Fluidos corporales (LCR, lquido pleural, paracentsis, pericrdico,
sinovial).
4- Aspirado por puncin trans-traqueal.
5- Aspirado por puncin pulmonar directa.
6- Orina aspirada por puncin supra-pbica.
7- Grnulos de azufre de pacientes con sospecha de actinomicosis.
194
4- Heces, contenido intestinal, hisopo rectal.
5- Hisopo de lesiones superficiales (lceras de decbito, etc.)
6- Material contiguo a mucosas.
7- Orina colectada al vuelo.
8- Hisopos vaginales o cervicales.
195
Si la muestra se aspir con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no que-
den burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapn de hule.
PROCEDIMIENTO:
H2+CO2
3- Introducir rpidamente la caja con el
medio hacia arriba y el tioglicolato en
un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir
un sobrecito indicador de anaerobiosis
Jarro Gas-Pak
y colocarlo dentro del jarro a manera
de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmedia-
tamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hi-
drgeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla),
agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia
arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de
tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metlica que puede
desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio
iridiado que acta como cataltico para combinar el oxgeno dentro del
jarro con el hidrgeno producido por el sobre generador y formar agua.
Con el uso, el cataltico se inactiva, por lo que una vez a la semana de-
ben calentarse los trocitos a 100 C por treinta minutos (en cpsula de
porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secar-
lo peridicamente.
196
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
197
4- Comparar con la siguiente tabla como gua, y correlacionar con el culti-
vo anaerobio.
198
co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hi-
drgeno y CO2.
199
IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE VARIOS
ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MDiCA
Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las Clostridium sp.
cuales no se tien con Gram.
200
Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS
201
7- En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en
agar sangre de carnero y colocar en las primeras estras los siguientes
discos:
Bacteroides fragilis R R R
B. melaninogenicus R R V
B. ureolyticus S R S
Fusobacterium nucleolatum S R S
F. necrophorum S R S
F. mortiferum S R S
F. varium S R S
Fusobacterium sp. S R S
INFORME:
Segn los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura espe-
cializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efecta prueba de sus-
ceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una tcnica sencilla que
pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio.
202
CAPTULO 18
MICOBACTERIAS
PROPSITO:
Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tien con dificultad por el alto
contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teirlas deben usarse coloran-
tes con fenol y/o calor. Una vez teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta caracterstica muy particular se les lla-
ma bacilos alcohol-cido resistentes (abreviado BAAR). No usar el trmino ci-
do-alcohol resistentes.
MUESTRAS
203
El esputo debe colectarse temprano en la maana, inmediatamente al
despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en das
alternos.
Colectar la muestra de esputo as: el esputo, al igual que cualquier otra mues-
tra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que pue-
de inhibir el crecimiento.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua
corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antisptico.
204
En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios
mtodos:
b) Los hisopos farngeos pueden ser usados en estos pacientes para ex-
traer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para
nios pequeos a los cuales no se les puede pedir una muestra adecua-
da.
205
El lavado gstrico debe ser efectuado en la maana, cuando el estmago est
vaco (por lo menos 8 horas despus que el paciente ha comido o tomado
medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la
muestra se obtenga 30 minutos despus de inducir esputo por nebulizacin.
206
- Raspado endometrial/sangre menstrual
- Mdula sea
- Lquido pericrdico
- Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia
- Heces (en ocasiones muy especiales)
Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el mdico en recipien-
tes estriles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adi-
cionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservati-
vos o fijadores.
PROCEDIMIENTO:
207
12- Cubrir el papel filtro con fuchsina carbnica de Ziehl-Neelsen; debe quedar
bien empapado.
14- Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presin).
15- Decolorar el frote con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo
(aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloracin ya que es el
paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloracin,
pero tampoco se debe decolorar excesivamente.
19- Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absor-
bente.
10- Examinar el frote con el lente de inmersin, con cuidado de limpiar el aceite
del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a
otra.
208
Solucin acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml
Preparar solucin de fenol al 5%, as: (Fundir los cristales de fenol en bao de
Mara, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de
100 ml con agua destilada estril.
2- Alcohol-cido (decolorante):
Acido clorhdrico concentrado ......................................... 93 ml
Alcohol etlico al 95% ........................................................ 95 ml
COLORACIN DE KINYOUN:
8- Dejar secar y examinar con el lente de inmersin. En general tomar las mni-
mas precauciones que para la coloracin de Ziehl-Neelsen.
209
REACTIVOS PARA KINYOUN
1- Sin excepcin alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los fro-
tes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la
Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Esta-
dos Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos labora-
torios y orientar adecuadamente al mdico.
210
REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS
NMERO DE BACILOS
REPORTE
ALCOHOL-CIDO RESISTENTE
7- En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote
211
es muy grueso es probable que se desprenda de la lmina durante la coloracin,
por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparacin a otra
por medio de aceite de inmersin, lentes sucios o colorantes.
19- Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por
cultivo, ya que la baciloscopa es menos sensible para detectar micobacterias
que el cultivo.
10- Nunca dejar el azul de metileno por ms tiempo del indicado: 1 2 minutos.
11- A veces es difcil distinguir los artefactos acidfilos (rojos) de verdaderos ba-
cilos alcohol-cido resistentes. La observacin de cuerpos esfricos alcohol-
cido resistentes debe mencionarse como sospechosa. Los grnulos de
Much son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positi-
vo y no alcohol-cido resistentes.
212
DIGESTIN Y DESCONTAMINACIN DE ESPUTOS
La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de
la mucina y adems destruye las bacterias comunes sin daar a las micobacterias.
Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo
cuidado y dentro de una campana bacteriolgica. Descartar todo el material conta-
minado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se produ-
cen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con
alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena).
213
Cantidad a NaOH al 4% Citrato de sodio Polvo de NALC
preparar estril al 2.9% estril (refrigerado)
150 ml 25 ml 25 ml 0.25 g
100 ml 50 ml 50 ml 0.5 g
6- Llenar el tubo con agua destilada estril, hasta que el nivel del lquido quede
12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinacin para mez-
clar bien.
214
18- Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con
desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar conta-
minacin.
19- Con una pipeta serolgica estril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albmina
bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar
aspticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con
Ziehl-Neelsen o Kinyoun.
10- Con pipeta capilar estril, inocular dos gotas del sedimento con albmina en
la superficie de un tubo (dos de preferencia segn disponibilidad), de medio
de cultivo Lowenstein-Jensen.
12- De preferencia colocar a cada tubo un capuchn de cartulina negra para evi-
tar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapn de rosca ligeramente flojo.
215
5- Con pipeta Pasteur estril, adicionar lentamente cido clorhdrico 2N, hasta
obtener un color amarillo definitivo.
7- Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedi-
mento.
3- Agregar solucin salina estril para bajar el peso especfico y diluir el cido.
216
5- Decantar el lquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al
3.5% con 0.004% de rojo fenol.
Si el material es mucoide:
1- Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gstrico.
Si el material es fluido:
217
4- Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.
218
Procedimiento para otros fluidos corporales:
Si el material es muco-purulento:
Si el material es fluido:
Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscpico y buena luz, a los 5
das despus de inoculados, y luego una vez por semana, los das lunes, para ob-
servar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a
36 C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a
las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte.
219
Si se observan colonias eugnicas de color crema formadas por bacilos
alcohol-cido resistentes (las cepas ms virulentas con factor cordn:
forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no
produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tubercu-
losis.
Prueba de niacina:
220
Las colonias eugnicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la
cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se
desarrollan las colonias. Por esta razn, la prueba slo puede hacerse en cultivos
puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubacin.
6- Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solucin salina utili-
zada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo
control negativo.
7- Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de
niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que
la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos
inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeracin.
221
9- Despus de 12 a 15 minutos, pero no despus de 30 minutos, comparar
el color de los extractos.
Grupo I:
Fotocromgenos: producen pigmento slo cuando el cultivo se expone a la luz. En
la obscuridad producen colonias sin pigmentacin, son de crecimiento lento. Ejem-
plos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30C).
Grupo II:
Escotocromgenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son
de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopata
cervical en nios.
Grupo III:
No fotocromgenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo:
Mycobacterium avium-intracelulare.
Grupo IV:
Crecedores rpidos: se caracterizan por crecer antes de 7 das de incubacin. Ejem-
plo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.
222
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Esta publicacin fue impresa en los talleres
grficos de Editorial Serviprensa C.A. de
Guatemala, C.A. en el mes de septiembre
de 1996. Esta edicin consta de 1,000
ejemplares en papel bond 80 gramos.