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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA ................................................................... 2


UNIDAD I ASPECTOS ADMINISTRATIVOS Y LEGISLATIVOS RELACIONADOS CON EL LABORATORIO
CLNICO ............................................................................................................................................... 3
PRCTICA NO. 1 .............................................................................................................................. 3
MEDIDAS DE SEGURIDAD Y MANEJO DE RPBI ........................................................................... 3
UNIDAD II ANATOMA Y FISIOLOGA DE LAS BACTERIAS .................................................................. 7
PRCTICA No. 2............................................................................................................................... 8
TINCIONES DE GRAM Y ZIEHL-NEELSEN ..................................................................................... 8
PRCTICA NO. 3 ............................................................................................................................ 15
CLASIFICACIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ...................................................... 15
UNIDAD III INFECCIONES DE LAS VAS RESPIRATORIAS SUPERIORES............................................. 21
PRCTICA No. 4............................................................................................................................. 21
CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO ........................................................................................... 21
PRCTICA No. 5............................................................................................................................. 26
DETECCIN DIRECTA DE ANTGENOS MICROBIANOS. ANTIESTREPTOLISINA O .................... 26
PRCTICA NO. 6 ............................................................................................................................ 31
CULTIVO DE EXUDADO TICO .................................................................................................. 31
UNIDAD IV INFECCIONES DEL OJO ................................................................................................... 36
PRCTICA NO. 7 ............................................................................................................................ 36
CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL ..................................................................................... 36
PRCTICA NO. 8 ............................................................................................................................ 40
DETERMINACIN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS POR INMUNOENSAYO ............................. 40
UNIDAD V INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS INFERIORES............................................... 45
PRCTICA No. 9............................................................................................................................. 46
CULTIVO DE MATERIAL DE VAS REAS INFERIORES, CULTIVO DE EXPECTORACIN ............ 46
PRCTICA NO. 10 .......................................................................................................................... 51
UROCULTIVO ............................................................................................................................. 51
PRCTICA NO. 11 .......................................................................................................................... 54
PRUEBAS BIOQUIMICAS............................................................................................................ 54
PRCTICA NO. 12 .......................................................................................................................... 60
COPROCULTIVO ......................................................................................................................... 60
UNIDAD IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ......................................................... 65
PRCTICA No. 13........................................................................................................................... 65
CULTIVO DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO .............................................................................. 65
PRCTICA No. 14........................................................................................................................... 69
HEMOCULTIVO .......................................................................................................................... 69

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA

1. No se permitir la entrada al laboratorio al alumno que llegue 15 minutos


despus de la hora de inicio.
2. No se permitir la permanencia en el laboratorio si no se trae bata y se
presente debidamente abrochada.
3. Los objetos personales debern permanecer en sitios diferentes a las
mesas de trabajo.
4. El alumno deber estar provisto del material necesario para la prctica
antes del inicio de la misma.
5. Queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO comer, beber, fumar y llevarse
cosas a la boca dentro del laboratorio.
6. Deber evitarse interrumpir el trabajo de laboratorio con conversaciones
que no pertenezcan a la prctica.
7. El material contaminado tal como: algodn, papeles, cerillos, etc., debern
depositarse en los botes de basura para que no permanezcan el tiempo
necesario en las mesas de trabajo.
8. Las mesas antes y despus de la prctica debern limpiarse con solucin
de fenol al 5%
9. Al derramar material probablemente contaminado se debe verter benzal
sobre la zona dejndolo actuar aproximadamente 10 min antes de limpiar.
10. El material que se rompa o extrave deber ser repuesto mximo a la
siguiente prctica.
11. Incubar el material que aplique el tiempo indicado ya que posterior a este
tiempo ser desechado.
12. Almacenar solo el material indicado en el refrigerador.
13. Al finalizar cada prctica, guardar los materiales separando el material sucio
para esterilizar, quitando etiquetas, colocando el material a lavar en otro
sitio; los reactivos debern ser colocados y ordenados de manera
adecuada.
14. No dejar bancos en zonas que provoquen accidentes.
15. Los informes de las prcticas sern terminados en borrador inmediatamente
despus de las mismas siendo revisadas por el profesor.
16. Colocar los microscopios limpios (sobre todo la lente de inmersin) en el
lugar que le corresponde

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UNIDAD I ASPECTOS ADMINISTRATIVOS Y LEGISLATIVOS RELACIONADOS


CON EL LABORATORIO CLNICO
PRCTICA NO. 1
MEDIDAS DE SEGURIDAD Y MANEJO DE RPBI
OBJETIVO:
Que el alumno ponga en prctica las principales medidas de seguridad que
se requieren en un laboratorio de bacteriologa as como el manejo
adecuado de los residuos biolgicos infecciosos, de acuerdo a la
normatividad vigente, desarrollando actitudes de compromiso con la
preservacin de la salud y del medio ambiente.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-007-SSA3-2011, PARA LA


ORGANIZACIN Y FUNCIONAMIENTO
DE LOS LABORATORIOS CLNICOS
1. Qu es el ndice de superficie libre de trabajador y en qu numeral se
menciona?
R= Es la superficie libre por trabajador, para que pueda realizar su trabajo. Debe
de ser de dos metros cuadrados. Numeral: 8.1
2. Numeral que indica el rea para el depsito y almacenamiento de RPBI.
R= Numeral: 5.2.7
3. Con qu documentos debe contar el laboratorio y en qu numeral se
encuentra?
Avisos de funcionamiento y aviso de responsable sanitario numeral:
4.1
Si se utiliza fuentes de radiacin ionizante deber contar con una
licencia sanitaria, y permiso de responsable sanitario y de la operacin
y funcionamiento de establecimientos de diagnstico mdico con rayos
X numeral: 4.2
Registro cronolgico de los estudios de laboratorio realizados
numeral: 4.7
Adems de otros numerales que hacen mencin de dichos documentos
con los que debe de contar el laboratorio: numerales: 5.5 (manuales
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de organizacin, manejo de equipo, de seguridad e higiene, para


RPBI, para toma, identificacin, manejo, conservacin y transporte
de muestras.
4. Numeral que se refiere a la subcontratacin.
R= Numeral: 6.1
5. Numerales que indican los requisitos para el laboratorio de microbiologa.
R= Apndice 2.
6. A quines aplica la presente norma?
R= 1.2 A los laboratorios clnicos, as como a los profesionales que laboran en
ellos.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIN
AMBIENTAL - SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICOINFECCIOSOS - CLASIFICACIN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO
1. En el numeral 6.4 inciso c) nos indica que los recipientes de RPBI se
pueden reciclar?
R= No, por contener RPBI.
2. Define agente biolgico infeccioso y menciona el numeral.
R= Cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando est
presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio
(supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de
entrada numeral: 3.1
3. A qu porcentaje de llenado se deben utilizar las bolsas de RPBI? Y a
qu porcentaje los envases?
R= Al 80 % ambos.
4. De acuerdo a la tabla 2 del numeral 6 Qu tipo de envasado utilizaremos
en el laboratorio de bacteriologa?
R= Bolsas de polietileno, recipientes hermticos.
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5. La facultad deber contar con un programa de contingencias en caso de


derrames, fugas o accidentes, con el manejo de RPBI o queda excenta?
R= S debe contar con dicho programa, ya que de acuerdo al numeral 6.7 somos
establecimiento generador de RPBI.
6. Menciona la clasificacin de los RPBI.
Sangre y sus derivados.
Cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos.
Utensilios desechables usados para el manejo de agentes biolgicoinfecciosos.
Tejidos, rganos y partes que se extirpen durante cirugas o necropsias.
Para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico.
Cadveres y partes de animales.
Recipientes desechables que contengan sangre lquida.
Materiales de curacin.
Materiales que contengan esputos.
Materiales absorbentes.
Objetos punzocortantes.
OBSERVACIONES:
Si se quisiera abrir un laboratorio de Bacteriologa en la facultad, el
responsable inmediato sera la Secretara de Salud Estatal.
El manejo de RPBI implica consideraciones donde se establece la
seguridad de la persona que los maneje, as como el correcto uso de estos
hasta que lleguen a su destino final de eliminacin.
Las presentes normas nos ayudan a saber el reglamento general de los
establecimientos del sector salud, como lo son los laboratorios clnicos, en
los cuales puede que en un futuro entremos a laborar.
CONCLUSIONES:
Se cumpli con el objetivo de la prctica porque se revisaron las normas
que rigen de forma general a los laboratorios clnicos, as como, a los
profesionales que trabajan en ellos. Adems, es importante conocer la
normatividad vigente, puesto que se va actualizando poco a poco.

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El manejo de RPBI en la prctica, como nos percatamos, es de suma


importancia; debido a que, algunas veces olvidamos como depositar o en
qu recipiente va cada tipo de muestra utilizada y los objetos con los cuales
las manipulamos.
BIBLIOGRAFA:
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-007-SSA3-2011, PARA LA ORGANIZACIN
Y FUNCIONAMIENTO DE LOS LABORATORIOS CLNICOS.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIN
AMBIENTAL - SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS
BIOLGICO-INFECCIOSOS - CLASIFICACIN Y ESPECIFICACIONES
DE MANEJO.

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UNIDAD II ANATOMA Y FISIOLOGA DE LAS BACTERIAS


OBJETIVO:
Que el alumno adquiera habilidad en la realizacin de los principales
mtodos de tincin y preparacin de medios de cultivo que se utilizan
para identificar la morfologa y fisiologa de las bacterias.
INTRODUCCIN:
Las cubiertas que rodean la clula bacteriana se han identificado por medio de
tcnicas de tincin en microscopa ptica y electrnica, y tcnicas de aislamiento y
caracterizacin bioqumica de los componentes celulares.
Las principales cubiertas son: cpsulas y limos, la pared celular de las
bacterias Gram-positivas, la pared celular de las bacterias Gram-negativas, la
membrana plasmtica, los mesosomas (invaginacin de la membrana plasmtica).
Tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas poseen una pared
celular de peptidoglicanos que les confieren su forma caracterstica y les provee
de proteccin mecnica.
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la
Tincin de Gram (1884). La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram
positivas o Gram negativas, Figura 1) por esta coloracin es un criterio de
clasificacin importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Unos
pocos organismos son Gram-variables.
Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad
de cristal violeta (CV) e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro
de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la reduccin del tamao de los
poros de la pared resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en
las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano
no impide la extraccin por el solvente del complejo.
Avala lo antedicho el hecho que, si despus de su tincin se tratan con
lisozima bacterias Gram positivas, se ve que los protoplastos siguen teidos, pero
pierden el colorante si se los trata con alcohol. Esto indica que el colorante es
fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas
es la que impide la extraccin del colorante. Corroborando esta suposicin se
observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta
"inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere
su estructura final pasa a ser Gram positiva.
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Figura 1. Pared celular bacteriana (Gram negativa y


Gram positiva).
PRCTICA No. 2
TINCIONES DE GRAM Y ZIEHL-NEELSEN
OBJETIVOS:
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram
negativas de acuerdo a la tincin de Gram.
Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la
caracterizacin e identificacin de las bacterias.

FUNDAMENTO:
Gram, bacterilogo dinamarqus, descubri en 1884, que algunos grmenes
(Gram positivos) contienen ciertos elementos qumicos en gran cantidad,
peptidoglicano, en su membrana dispuestos estructuralmente en forma muy
diferente a la de otros (Gram negativos) y forman con los colorantes derivados de
la rosanilina (violeta de genciana, cristal violeta) ms el yodo, un compuesto que
resiste la accin de decolorantes (alcohol absoluto, alcohol acetona).
Est tincin utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de
Gram, etanol acetona al 95% y safranina. El cristal violeta que es el colorante
inicial tie a todos los microorganismos, a que es un colorante bsico, en segundo
lugar est el yodo que acta como mordiente para aumentar la afinidad entre el
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colorante inicial y la clula. El etanol acta como decolorante sobre el


microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se afn con este.
La safranina es el colorante usado como contraste que teir a los
microorganismos que no se colorean con el cristal violeta.
Los microorganismos que retienen el colorante de cristal violeta despus de la
decoloracin y se ven de color azul-violeta se conocen como microorganismos
Grampositivos. Los Gramnegativos no son capaces de retener el cristal violeta
despus de la decoloracin y se contra tien de rojo con el colorante de safranina.

Figura 2. Membrana de una


Bacteria Gram positiva.

Figura 3. Membrana de una


Bacteria Gram negativa.

TINCIN DE ZHIEL NEELSEN.


La tincin de Ziehl-Neelsen demuestra la capacidad que tienen algunas
bacterias teidas de resistir a la decoloracin por cidos y alcoholes. Esta
propiedad de algunas micobacterias y actinomicetos se correlaciona con el alto
contenido en lpidos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy
hidrfobo. Adems, estos grupos poseen unos lpidos caractersticos llamados
cidos miclicos que aumentan este carcter hidrfobo.
MATERIAL:
TINCIN DE GRAM

Portaobjetos.
Asa bacteriolgica.
Mechero Bunsen.
Microscopio.
Puente de tincin.
Aceite de inmersin.
Desinfectante.
Solucin salina.

Cristal violeta.
Lugol de Gram.
Alcohol-acetona.
Safranina.
Cepa:
Staphylococcus
aureus, muestra de exudado
farngeo.
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INTERPRETACIN
Microorganismos color azul-violeta: Gram positivos.
Microorganismos color rosado: Gram negativos.
TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
Portaobjetos.
Asa bacteriolgica.
Mechero Bunsen o lmpara de
alcohol.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Puente de tincin.

Desinfectante.
Solucin salina.
Fucsina fenicada.
Alcohol-cido.
Azul de metileno.
Muestra: Esputo de paciente.

INTERPRETACIN
Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos cido Alcohol
Resistentes). Esta tincin es utilizada principalmente para identificar el agente
causal de la tuberculosis.
La tincin Ziehl-Neelsen requiere cuatro colorantes:
1.
2.
3.
4.

Mezcla de fucsina-fenol: capaz de teir las clulas en caliente.


El fenol facilita la penetracin de la fucsina en la envoltura celular.
Decolorante orgnico: mezcla de cido y alcohol.
Colorante de contraste: azul de metileno.

Las bacterias cido-alcohol resistentes, tras la unin de la fucsina, resisten el


tratamiento orgnico y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias se
decolorarn y se contrastarn con el azul de metileno.
1. Prepara un frotis con la muestra.
2. Cubrir completamente con carbolfucsina la preparacin.
3. Calentar la preparacin cuidadosamente en un mechero Bunsen (puede ser
a bao mara, o bien en plancha electrica), sin que hierva la muestra
durante 5 min. Tambin puede utilizarse una parrilla electrica, o calentar en
vapores de bao mara.
Nota: aadir ms carbolfucsina conforme sta se evapora; la preparacin no debe
quedar seca en ningn momento.

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4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.


5. Decolorar con la solucin cido-alcohol hasta que la muestra adopte un
color rosa claro (unos 30 seg.).
6. Lavar con agua para detener la decoloracin.
7. Teir con azul de metileno 1 min.
8. Lavar con agua el exceso de colorante.
9. Secar la preparacin.
10. Examinar al microscopio. Anotar las diferencias existentes entre los dos
grupos bacterianos.
TCNICA:
TINCIN DE GRAM

1. Se toma
una asada de
la colonia, o
una pequea
alcuota del
cultivo lquido.

3. Dejar secar
el frotis. Y
fijarlo por calor.

5. Enjuagar al
chorro de agua.

2. Se realiza
una extensin
en un
portaobjetos
limpio y
desengrasado.

4. Colocar en
una varilla de
tincin; y
agregar Cristal
Violeta y dejar
actuar por 1 a 2
minutos.

6. Agregar la
solucin de
Yodo-Lugol. Y
dejar actuar por
30 segundos.

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7. Enjuagar al
chorro de agua.
Decolorar con
alcohol-cetona
durante 30
segundos.

9. Enjuagar al
chorro de agua.

11. Agregar
una gota de
aceite de
inmersin.

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8. Agregar
safranina y
dejar por 30
segundos.

10. Dejar secar


al aire libre, o
colocar el frotis
en un papel
absorbente.

12. Observar
al
microscopio
en objetivo de
100x.

RESULTADOS.
Tincin de Gram.
Cepa: Staphylococcus aureus (paciente desconocido) = Gram positivos.
Muestra: exudado farngeo (paciente Rafael Snchez Barradas) = Sin
presencia de bacterias de inters.
Tincin de Ziehl-Neelsen.
Muestra: Esputo de paciente = No BAAR.

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OBSERVACIONES.

Paciente: Desconocido.
Muestra: Del Lab. De Microbiologa de la
UV, Facultad de QFB Xalapa.
Tincin: Gram.
Visto a: 100 X.
Bacteria: Staphylococcus aureus.
Observaciones: micrococos gram positivos,
agrupados y dispersos.

Paciente: Rafael Snchez Barradas.


Edad: 21 aos.
Sexo: Masculino.
Muestra: Exudado farngeo (frotis).
Tincin:Gram.
Visto a: 100 X.
Observaciones: Restos de comida, clulas
epiteliales y otras cosas desconocidas. Sin
presencia de cocos, bacilos o bacterias de
algn otro tipo.

Paciente: Job Dorantes Montoya.


Edad: 21 aos.
Sexo: Masculino.
Muestra: Esputo.
Tincin: Ziehl-Neelsen.
Visto a: 100 X.
Observaciones: Culas epiteliales,
leucocitos polimorfonucleados y algunos
cocos. No se observan bacilos cido-alcohol
resistentes.

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CONCLUSIN:
Despus de observar macroscpicamente la morfologa colonial es muy
importante realizar las tinciones como tcnica de identificacin y clasificacin de
las bacterias cuando no sabemos qu clase de microorganismo es el que estamos
observando, esto en base a su morfologa y a su diferenciacin con otros agentes
al momento de tomar un color especfico, para luego comparar nuestras
observaciones y la teora para dar un diagnstico acertado.
BIBLIOGRAFA:
Ingraham John, Ingraham Catherine. (1998). Introduccin a la microbiologa.
Editorial Revert.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.

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PRCTICA NO. 3
CLASIFICACIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO:

Identificar los medios de cultivo empleados en el laboratorio de


Bacteriologa y clasificarlos de acuerdo a su contenido y funcin.

FUNDAMENTO:
Un medio de cultivo es una solucin equilibrada de todos los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios para el desarrollo y la multiplicacin de los
microorganismos en el laboratorio. Para promover el desarrollo microbiano, los
medios de cultivo deben reunir ciertos requisitos: contener nutrientes adecuados,
poseer humedad suficiente, tener un pH ajustado y estar estril inicialmente.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales:

Medios enriquecidos no selectivos


Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios especializados

Medios enriquecidos no selectivos: estn diseados para permitir el


crecimiento de la mayor parte de los grmenes que no necesitan unas condiciones
exigentes. Los siguientes medios son algunos de los ms empelados: agar
sangre, agar chocolate, agar Mueller-Hinton, medio de tioglicolato y agar dextrosaSabouraud.
Medios de cultivo selectivos y diferenciales: los medios de cultivo
selectivos se disean para poder recuperar grmenes especficos que pueden
estar presentes en una mezcla de otros grmenes (p. ej., un patgeno entrico en
las heces). Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento
de los grmenes no deseados. Estos medios se hacen diferenciales aadiendo
ingredientes especficos que permiten la identificacin del germen en una mezcla.
Ejemplos: agar MacConkey, agar sal y manitol, agar xilosa-lisina-desoxicolato
(XLD), medio de Lowenstein-Jensen (LJ), CHROMagar, etc.
Medios especializados: se han creado muchos medios de cultivo
especializados distintos para detectar grmenes especficos, que pueden ser
exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros. Ejemplos: agar sitinatelurita, medio de cultivo LIM (lisina-indol-movilidad), etc.
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Ejemplos de tipos de medios de cultivo


Tipo

Medios de cultivo
(ejemplos)
Agar sangre

Agar chocolate

No selectivos

Agar de Mueller-Hinton

Tioglicolato
Agar dextrosaSabouraud

Agar MacConkey

Agar sal y manitol

Selectivos,
diferenciales

Agar xilosa-lisinadesoxicolato
Medio de LowensteinJensen
Agar Middlebrook
CHROMagar

Especializados

Agar de levaduras
inhibidor
Agar extracto de
levadura con carbn
tamponado (BCYE)
Agar cistina-telurita

Objetivo
Recuperacin de
bacterias y hongos.
Recuperacin de
bacterias, incluidas
Neisseria gonorrhoeae y
Haemophilus.
Medio de estudio para la
susceptibilidad
bacteriana.
Medio de
enriquecimiento para las
bacterias anaerobias.
Recuperacin de
hongos.
Selectivo para las
bacterias gramnegativas;
diferencial para las
especies que fermentan
la lactosa.
Selectiva para los
estafilococos; diferencial
para S. aureus.
Agar diferencial selectivo
para Salmonella y
Shigella en cultivos
entricos.
Selectivo de
micobacterias.
Selectivo de
micobacterias.
Selectivo, diferencial
para las levaduras.
Selectivo para los
hongos.
Recuperacin de
Legionella y Nocardia.
Recuperacin de
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Corynebacterium
diphtheriae.
Recuperacin de
Medio de cultivo LIM
Streptococcus
(lisina-indol-movilidad)
agalactiae.
Recuperacin de
Agar sorbitol MacConkey
Escherichia coli O157.
Recuperacin de
Agar Regan Lowe
Bordetella pertussis.
Agar sacarosa sales
Recuperacin de
biliares tiosulfato citrato especies de Vibrio.
(TCBS)
MATERIAL:

Matraces Erlenmeyer de 500 mL.


Probeta graduada de 250 mL.
Cajas Petri.
Tubos c/ tapn de rosca de 13 x 100.
Parrilla de calentamiento.
Gasa.
Algodn.
Mechero Bunsen.
Esptula limpia.

TCNICA:

Preparar los siguientes medios: EMB, AGAR SANGRE, AGAR


CHOCOLATE, AGAR SAL Y MANITOL, CALDO TODD HEWITT y AGAR
BIGGY aproximadamente 90 ml del caldo y 400 ml de cada agar.
1. Consultar las indicaciones del fabricante del medio de cultivo a preparar
para conocer las condiciones en las que se elaborara el medio.
2. Pesar exactamente la cantidad del medio de cultivo calculada por regla de
tres en relacin con la especificada en el envase, para un litro. El medio
deshidratado se debe pesar en papel aluminio o cera, limpio.
3. Al medio de cultivo pesado se le aade aproximadamente la mitad del
agua destilada en el matraz, se agita lo suficiente tratando de hacer una
suspensin homognea, se deja reposar unos minutos y despus se le
adiciona el resto del agua arrastrando el medio que pudo quedar pegado
en las paredes del matraz.
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4. El medio de cultivo se debe calentar para disolverlo. El medio estar listo


cuando al agitar el recipiente no se adhieran a las paredes internas,
partculas del agar. Se hierve durante un minuto. Los medios de cultivo
que no contienen agar son fciles de disolver en el agua fra o con un
ligero calentamiento.
5. Para esterilizar, se coloca un tapn con algodn y gasa para que no entren
partculas al medio de cultivo.
6. La esterilizacin del medio de cultivo se lleva a cabo en autoclave, a 121
C durante 15 minutos. Se recomienda repartir el medio en porciones ms
pequeas por ejemplo, en los tubos donde va a quedar definitivamente,
NO ESTERILIZAR EN LAS CAJAS PETRI.
7. El vertido en placas se debe hacer, cuando el medio se encuentre a una
temperatura de 45 o 50 C, en un ambiente estril, evitando la formacin
de burbujas, si esto ocurre al terminar el vaciado se pasa el mechero
rpidamente por la caja con el medio. El volumen que se le agrega a la
caja es de unos 15 o 20 ml. En los tubos dependiendo del tamao se
adicionara aproximadamente la mitad del tubo cuando son agares, y para
el medio de cultivo lquido (caldos) se le agregara a cada tubo de 2 a 3 ml.
8. Cuando el medio de cultivo este solidificado o fro se empaquetaran y se
rotularn con el nombre del medio, fecha de preparacin, numero de
equipo que lo elabor y se guardarn en el refrigerador en forma invertida.
RESULTADOS:
Se realizaron los clculos para saber cunto se disolvera del medio de
cultivo en agua destilada, tanto para las cajas Petri como para los tubos:
AGAR SANGRE:
40 g 1000 mL
X 400 mL

(40 )(400 )
=
1000

AGAR SAL Y MANITOL


111 g 1000 mL
X 400 mL

(111 )(400 )
= .
1000

AGAR Eosina Azul de Metileno (EMB)


36 g 1000 mL
X 400 mL

(36 )(400 )
= .
1000
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AGAR BIGGY
45 g 1000 mL
X 400 mL

(45 )(400 )
=
1000

(30 )(90 )
= .
1000

CALDO TODD HEWITT


30 g 1000 mL
X 400 mL

A nuestra mesa de trabajo nos toc realizar el agar sangre el cual contiene:
Infusin de msculo de corazn
2.0 g
Digerido pancretico de casena 13.0 g
Extracto de levadura
5.0 g
Cloruro de sodio
5.0 g
Agar bacteriolgico
15.0 g
pH final 7.3 0.2
Mtodo de preparacin: suspender 40 g del medio en un litro de agua
purificada. Calentar con agitacin suave hasta completa disolucin del polvo y
hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lb de presin) durante
15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50C y aadir sangre estril y
desfibrinada al 5%. Homogeneizar y vaciar en placas Petri estriles.
OBSERVACIONES:

Se observa el medio de cultivo en


calentamiento sin la sangre y con
constante movimiento, ya que si no, se
podra quemar y el medio ya no servira
para sembrar microorganismos.

P g i n a 19 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

En lo que se proceda a
esterilizar los medios de cultivo,
se realiz la tcnica de
flebotoma para obtener la
sangre que se agregara al agar
chocolate y al agar sangre. Se
obtuvieron aproximadamente 10
mL para agregar a cada agar.

Al terminar de esterilizar y agregar la


sangre al medio de cultivo, se procedi a
vaciar el medio en las cajas Petri en un
ambiente anaerobio, es decir, cerca del
mechero Bunsen y posteriormente se
empaquetaron y guardaron las cajas con
el medio ya solidificado.

CONCLUSIN:
La preparacin de medios del cultivo es una herramienta fundamental en el
laboratorio de Bacteriologa porque nos ayuda a identificar, aislar y dar un posible
diagnstico sobre enfermedades producidas por microrganismos como bacterias
principalmente y hongos. Debe mencionarse que se necesita saber de otros
conocimientos adquiridos en otras experiencias educativas, por ejemplo, la
flebotoma, ya que para realizar la preparacin del agar sangre y chocolate se
necesita sangre.
BIBLIOGRAFA:
Murray, P. (2009). Microbiologa Mdica. Captulo 15. Cultivo in vitro: principios y
aplicaciones. 6 edicin. ELSEVIER. Espaa. Pp: 161-164.
Negroni, M. (2009). Microbiologa estomatolgica. Fundamentos y gua prctica. 2
edicin. Editorial Mdica Panamericana. Argentina. Pg. 551.

P g i n a 20 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

UNIDAD III INFECCIONES DE LAS VAS RESPIRATORIAS SUPERIORES


PRCTICA No. 4
CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO
OBJETIVO:

Analizar la flora normal y los principales patgenos del tracto respiratorio


superior a partir de una muestra de exudado farngeo.

FUNDAMENTO:
El anlisis del exudado farngeo se basa en la diferenciacin entre las
bacterias patgenas y flora normal del tracto respiratorio superior del paciente,
apoyndose en medios de cultivo selectivos y de enriquecimiento, as como el
anlisis microscpico y macroscpico de las colonias bacterianas. El cultivo
farngeo es el mtodo estndar para documentar la presencia de S. pyogenes en
la faringe, esta prueba alcanza una sensibilidad del 90 a 95%.
Flora habitual y patgenos respiratorios
Posibles patgenos
Flora normal
Patgenos definitivos
respiratorios
Estreptococos betahemolticos
Corynebacterium
Estreptococos del
Haemophilus influenzae
diphtheriae
grupo viridans
Haemophilus
Bordetella pertussis
Estafilococos
parainfluenzae
Micrococos Mycoplasma
coagulasa negativo
Streptococcus
pneumoniae
Corynebacterium sp.
pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Neisseria sp. (no
Neiserias patgenas
patgenas)
Estreptococos beta
Moraxella catarrhalis
Lactobacillus sp.
hemolticos grupos
Enterobacterias
Veillonella sp.
B,C,G,
Fusobacterium sp.
Neisseria gonorrhoeae
Espiroquetas
Bacteroides sp.
Actinomyces sp.
MATERIAL:
Hisopos estriles.
Frasco con benzal.
Colorantes para la tincin de
Gram.
Aceite para inmersin.
Microscopio.

Portaobjetos.
Cajas Petri
Agares: chocolate, sangre,
EMB y sal y manitol.
Caldo de Todd-Hewitt
P g i n a 21 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

TCNICA:
Obtencin de la muestra: exudado farngeo
Condiciones previas del paciente
El paciente no debe haber recibido antibiticos en los ltimos 8 das,
previos a la obtencin de la muestra.
El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio.
Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo.
1. Ubicar al paciente en una posicin cmoda y con buena iluminacin,
deprimir la lengua con el abate lengua, visualizar la fosa amigdalina y
faringe en busca de exudado posterior, presencia de pseudomembrana o
placas.
2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo ah, el cual
sirve para elevar la vula y evitar las nuseas.
3. Introducir el hisopo y frotar enrgicamente ambas amgdalas y la pared
posterior de la faringe con movimientos de barrido.
4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe,
vula, lengua, encas y dientes.
5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la superficie de los
portaobjetos para realizar la tincin de Gram.
6. Estriar sobre los medios de cultivo.
7. Incubar las cajas Petri a 37C
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Agar chocolate: Streptococcus pyogenes


Forma: irregular
Color: gris
Borde: entero
Viraje: sin viraje
Prueba oxidasa: NEGATIVO

Agar chocolate: MUESTRA


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero
Viraje: color verde
Prueba oxidasa: NEGATIVO
P g i n a 22 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Agar EMB: Klebsiella spp.


No hubo crecimiento

Agar sangre: Estreptococo grupo C


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero y ondulado
Viraje: sin viraje
Prueba oxidasa: NEGATIVO

Equipo 1-B

Agar EMB: MUESTRA


No hubo crecimiento

Agar sangre: MUESTRA


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero y ondulado
Viraje: sin viraje
Prueba oxidasa: NEGATIVO

P g i n a 23 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Agar sal y manitol: Staphyloccocus


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero
Viraje: color amarillo
Prueba oxidasa: NEGATIVO

Equipo 1-B

Agar sal y manitol: MUESTRA


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero
Viraje: color amarillo
Prueba oxidasa: NEGATIVO

Tincin de Gram

Se observaron clulas epiteliales y


cmulos de alguna sustancia extraa
que podra ser colorante, tambin se
observaron bacterias pero no se
distinguan bien por las lentes del
microscopio y no se sabe si son
cocos o bacilos, posiblemente son
bacterias Gram negativas.

P g i n a 24 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

CONCLUSIN:
En base a la observacin de la morfologa macroscpica de los medios de
cultivo, como el viraje, borde y color de las colonias, hubo presencia de
Streptococcus tipo C, ya que hubo crecimiento bacteriano en el agar sangre,
chocolate y sal y manitol. Al realizar el frotis, no se pudo observar los cocos
porque la calidad de la imagen fue psima y no se vea con claridad.
BIBLIOGRAFA:
Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramrez, AC, Snchez K, Velasco E. (2008).
Manual prctico de bacteriologa clnica. Universidad de Los Andes. 1
edicin. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 31-46.
Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas
Color. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002.

P g i n a 25 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA No. 5
DETECCIN DIRECTA DE ANTGENOS MICROBIANOS.
ANTIESTREPTOLISINA O
OBJETIVO:
Que el alumno lleve a cabo el mtodo para identificar anticuerpos contra
estreptolisina O, una sustancia producida por las bacterias estreptococos
del grupo A.
FUNDAMENTO:
Las enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas definitivamente
solo por tres formas:
1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente conocido capaz de
provocar la enfermedad, por observacin directa en el material clnico
obtenido del paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro)
2) Deteccin de un producto especfico del agente infeccioso (que no pueda
formarse sin la presencia del agente) en el material clnico obtenido del
paciente
3) Deteccin en el suero del paciente de una respuesta inmunolgica
especfica dirigida contra el agente infeccioso.
Caractersticas de los Anticuerpos:
Mecanismo determinado genticamente.
Dirigidos contra un antgeno o determinante antignico (eptope).
Los microorganismos pueden contener numerosos determinantes
antignicos.
Habr por lo tanto numerosos anticuerpos para cada antgeno.
Muchos determinantes antignicos requieren ser expuestos.
Reacciones de Aglutinacin.
Cuando el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el
complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinacin. El
proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin de puentes
entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antgenos. Los
anticuerpos IgM son ms eficaces para aglutinar (Anticuerpos completos). Los
anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos (Anticuerpos incompletos).

P g i n a 26 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de antgeno o


anticuerpo sin aglutinacin.
Factores que influyen en las reacciones de aglutinacin:

Carga de las partculas.


Tipo de anticuerpo.
Concentracin de electrolitos.
Viscosidad.
Nmero de determinantes antignicos.

Se emplean tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos.


Se pueden hacer de dos maneras: directas o indirectas
El mtodo se fundamenta en una reaccin de aglutinacin de una suspensin
de partculas de ltex poliestireno sensibilizadas con estreptolisina O estabilizada.
La aglutinacin es visible en una concentracin de ASO en suero igual o superior
a 200 UI/mL.
MATERIAL.
Reactivos.
Reactivo 1
Tapn blanco
Reactivo 2
Tapn rojo
Reactivo 3
Tapn azul

Ltex ASO en suspensin


Contiene azida sdica 0.1 %
Control positivo*. Concentracin superior
a 200 UI/mL
Suero humano. Contiene azida sdica 0.1
%
Control negativo*. Concentracin inferior
a 200 UI/mL
Suero humano. Contiene azida sdica 0.1
%

* Los controles son sueros humanos. Aunque no se ha detectado la presencia de antgeno


HBs, ni anticuerpos anti-HIV, deben ser manipulados con la misma precaucin que un
suero muestra.

Muestra.
Utilizar suero. Los sueros, conservados a 2-8C, mantienen su actividad
durante 2 das.
No utilizar sueros hemolizados. No utilizar sueros altamente lipmicos pues
podran dar una aglutinacin no especfica.
P g i n a 27 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

TCNICA:
Mtodo cualitativo
1. Atemperar el reactivo y los controles a temperatura ambiente.
2. Homogeneizar el reactivo 1 ASO-ltex, con agitacin suave.
3. Comprobar la funcionalidad del reactivo mediante los controles positivo y
negativo (ver procedimiento a continuacin).
4. Dosificar 50 mL (1 gota) de suero muestra a analizar en un crculo del porta,
SIN DILUIR.
5. Aadir, aliado de la anterior, una gota de R1 ASO-ltex
6. Mezclar las dos gotas mediante agitacin y extenderlas por todo el crculo.
7. Colocar el porta en el agitador rotatorio (80-100 RPM) Y observar la
aparicin o ausencia de aglutinacin exactamente al cabo de 2 minutos. El
exceso del tiempo de reaccin podra dar lugar a falsos resultados.
Mtodo semicuantitativo
Siguiendo la metdica cualitativa, se proceder con diluciones del suero
muestra con solucin salina (NaCI 9 g/L).

INTERPRETACIN

La presencia de aglutinacin indica un nivel de ASO igual o superior a 200


UI/mL en la muestra.
La ausencia de aglutinacin indica un nivel de ASO inferior a 200 UI/mL en
la muestra.

Valores normales.
Adultos: < 200 UI/mL.
Los valores superiores a 200 UI/mL se encuentran en pacientes con recientes
enfermedades debidas a Streptococcus del grupo A, -hemolticos.
P g i n a 28 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

RESULTADOS:

Prueba Antiestreptolisina O (test de aglutinacin): Negativa.


Paciente: Ivonne Daz Sosa.
Sexo: Femenino.
Edad: 20 aos.

OBSERVACIONES:

Extraccin de sangre de la paciente, para la posterior


obtencin del suero a utilizar en esta prctica.

Se muestra el suero y a los dems controles, observando que el positivo


dio como se esperaba (hubo aglutinacin). Estos son los reactivos
utilizados del kit (inserto) para realizar la prueba de deteccin de antgenos.

P g i n a 29 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Se muestra el suero de la paciente. Esto cuando se estaban aplicando


los reactivos del inserto. Al finalizar de aplicar los reactivos a los tres
grupos (positivo, negativo y suero), obtuvimos un resultado sin
aglutinacin, indicando que el paciente no tiene valores altos de
antiestreptolisina O.

CONCLUSIN.
Los estudios microbiolgicos y/o bacteriolgicos de laboratorio son muy
importantes para llegar a un diagnstico y tratamiento adecuado a una
enfermedad especfica. En este caso el mtodo utilizado de deteccin de
antgenos microbianos, ayuda al mdico a dar un medicamento especfico de
acuerdo al agente patgeno que est causando la enfermedad en el paciente,
puesto que, de alguna manera el anticuerpo ASO (por sus siglas en ingls) se
puede encontrar en la sangre durante semanas o meses despus de que la
infeccin por estreptococos haya desaparecido. Nuestro resultado fue negativo,
siendo as que la paciente no presenta alguna infeccin por estreptococos
reciente.
BIBLIOGRAFA.
Assimeh, S.N., Johnson, P.M. J. (1980). lmmunnol. Methods. EUA: Academic
Press. Pp. 1970-1973.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.

P g i n a 30 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA NO. 6
CULTIVO DE EXUDADO TICO
OBJETIVO:

Realizar el estudio microbiolgico de la flora normal y los principales


patgenos del odo medio a partir de una muestra de exudado tico.

FUNDAMENTO:
La mayor parte de las infecciones del odo afectan el conducto auditivo
externo (otitis externa) o la cavidad media (otitis media) que contiene los
huecesillos y est rodeada por otras estructuras seas y la membrana timpnica.
La otitis es una enfermedad del odo caracterizada por inflamacin de la mucosa
del odo externo, medio o interno (mastoides), perforacin de la membrana
timpnica y otorrea.
La microbiota general del odo externo es similar a la de la piel,
predominando Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del gnero
Corynebacterium. Con menos frecuencia se observan especies de Bacillus,
Micrococcus y Neisseria. En esta localizacin se han aislado tambin otros
microorganismos que colonizan la piel en forma transitoria como Streptococcus
pneumoniae, P. aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre
ellos, los gneros Proteus, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella. Estudios
micolgicos demuestran que los siguientes gneros de hongos pertenecen a la
microbiota normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y Saccharomyces.
Algunos de los agentes etiolgicos ms frecuentes de infecciones ticas se
muestran en la tabla que se muestra a continuacin:
Agentes etiolgicos ms frecuentes de otitis
Cuadro clnico
Agente etiolgico
Pseudomonas aeruginosa.
Proteus.
E. coli.
Otitis externa
S. aureus.
Aspergillus.
Streptococcus pneumoniae.
Otitis media aguda
Estreptococos del grupo B.
Haemophilus influenzae.
< 3 meses de edad
S. aureus.
P. aeruginosa
P g i n a 31 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Bacterias entricas gramnegativas.

> 3 meses de edad

Otitis media crnica

Otitis media serosa

Streptococcus pneumoniae.
Haemophilus influenzae.
Streptococcus pyogenes.
Moraxella catarrhalis.
S. aureus.
P. aeruginosa.
Haemophilus influenzae.
S. aureus.
Proteus.
K. pneumoniae.
Moraxella catarrhalis.
Bacterias anaerobias
grampositivas y gramnegativas.
Igual que la otitis media crnica.

MATERIALES:

Hisopos estriles.
Benzal diluido 10%
Solucin salina fisiolgica estril.
Medios de cultivo: agar sangre, agar EMB, agar Vogel-Johnson, agar
CLED.
Gasas.
Colorantes para tincin de Gram.

TCNICA:
1. Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo impregnado con solucin de
benzal con una gasa.
2. Humedecer varios hisopos estriles con solucin salina igualmente estril y
tomar la muestra del conducto auditivo externo de cada odo.
3. Introducir el hisopo siguiendo una direccin oblicua de atrs hacia delante y
de abajo hacia arriba.
4. Girar el hisopo con cautela unas cinco veces para obtener la muestra.
5. Realizar un examen directo y colorearlo con la tincin de Gram con muestra
proveniente de cada odo, los hisopos se descartan una vez utilizados.

P g i n a 32 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Se observa una clula epitelial


proveniente del frotis tico, al
realizar la tincin de Gram, no se
observaron bacterias.

Agar EMB: MUESTRA


No hubo crecimiento.

Agar EMB: E. coli


Forma: puntiforme
Color: violeta
Borde: entero
Viraje: verde metlico.

Agar sangre: Muestra


Forma: puntiforme
Color: gris
Borde: entero
Viraje: caf

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Agar Vogel Johnson: Muestra


Forma: puntiforme
Color: blanco
Borde: entero
Viraje: rosa
El medio se contamin, ya que el
control tambin se contamin.

Equipo 1-B

Agar sangre: Streptoccocus tipo C


Forma: puntiforme
Color: gris
Borde: entero
Viraje: caf

Agar CLED: Proteus vulgaris


Forma: puntiforme
Color: amarillo
Borde: entero
Viraje: amarillo

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

CONCLUSIN:
Se realiz la siembra de la muestra del exudado tico y no hubo crecimiento
por lo cual, el paciente se encuentra sano. Se cumpli con el objetivo de realizar la
toma de muestra del exudado tico, aunque no hubo crecimiento bacteriano,
adems es importante conocer la metodologa que se realiza para conocer los
posibles agentes infecciosos en el odo para diagnosticar e iniciar un tratamiento lo
antes posible.
BIBLIOGRAFIA:
Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramrez, AC, Snchez K, Velasco E. (2008).
Manual prctico de bacteriologa clnica. Universidad de Los Andes. 1
edicin. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 65-77.
Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. 4 ed.
Espaa: Mosby; 2004.
Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 4 ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.

P g i n a 35 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

UNIDAD IV INFECCIONES DEL OJO


PRCTICA NO. 7
CULTIVO DE EXUDADO CONJUNTIVAL
OBJETIVO:

Realizar el estudio microbiolgico de la flora normal y los principales


patgenos de la conjuntiva del ojo de una muestra de exudado conjuntival.

FUNDAMENTO:
En el saco conjuntival existe una microbiota habitual relativamente escasa.
Entre los microorganismos que se encuentran con mayor frecuencia se citan:
Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus sp. y Corynebacterium sp. Entre 0-30%
de las personas son portadores de S. aureus y Haemophilus influenzae no
tipificables en 0,4-25%. En un pequeo porcentaje de individuos se presentan
Moraxella catarrhalis, algunas Enterobacterias, S. pyogenes, S. pneumoniae, otros
alfa y beta-hemolticos.
La conjuntivitis es una de las causas ms frecuentes de enfermedad ocular.
Se define como un estado inflamatorio de la conjuntiva, con hiperemia conjuntival
(dilatacin de los vasos sanguneos) o con hemorragia subconjuntival. La
conjuntivitis aguda es la presentacin clnica ms comn, segn su etiologa se
clasifica en:

Conjuntivitis no gonoccica: ocasionada frecuentemente por S. aureus,


S. pneumoniae y H. influenzae biogrupo aegyptius, Moraxella lacunata;
stos se adquieren por inoculacin mano-ojo y por fmites.
Conjuntivitis gonoccica: producida por N. gonorrhoeae, afecta
principalmente a los adultos que se contagian por un contacto sexual con
sujetos con gonorrea o por autoinoculacin (genital-mano-ojo).
Conjuntivitis de inclusin: causada por Chlamydia trachomatis serotipos
D hasta la K, se produce en los adultos (por autoinoculacin) y en los
neonatos (durante el paso por el canal de parto infectado).
Conjuntivitis alrgica: producida por una reaccin de hipersensibilidad
tipo I o anafilctica frente a determinados antgenos, como plenes que son
transportados por el aire.
Otras enfermedades comunes del ojo son:

P g i n a 36 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Queratitis: es la inflamacin de la crnea producto de la aplicacin de


medidas quirrgicas con fines curativos o correctivos y del uso
indiscriminado de ciertos medicamentos tipo corticoesteroides o
antibiticos, as mismo estn implicados en un 60-90% las infecciones
bacterianas producidas por: Pseudomonas aeruginosa, S. aureus o
Streptococcus del grupo viridans, tambin levaduras como Candida
albicans.

Blefaritis: es una inflamacin del borde palpebral con hiperemia,


engrosamiento y formacin de escamas o costras o lceras superficiales.
Las de origen infeccioso son producidas principalmente por S. aureus. La
blefaritis crnica es causada por Demodex folliculorum, especies de
Corynebacterium y Staphylococcus sp.

Orzuelo: induracin redondeada y dolorosa localizada en el folculo de la


pestaa o en una o ms glndulas de Zeis, Moll o de Meibomio. El
microorganismo implicado generalmente es S. aureus.

MATERIALES:

Hisopos estriles o asa bacteriolgica nueva.


Solucin salina fisiolgica estril.
Medios de cultivo: agar Vogel-Johnson y agar CLED.
Gasas.
Colorantes para tincin de Gram.

TCNICA:
Condiciones previas del paciente
No aplicarse tratamientos tpicos.
No estar recibiendo tratamientos antimicrobianos.
No lavarse los ojos para el momento de la obtencin de la muestra.
En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendr del ngulo interno del ojo.
1. Con el asa o hisopo rotar suavemente en el ngulo interno del ojo unas 5
veces.
2. Cultivar el exudado de cada ojo por separado en una misma placa.
3. Incubar a 36 C, por 24 h hasta 72 h.
4. Obtener muestras de cada ojo para realizar los preparados directos en
lminas para teir con Gram y Giemsa.
P g i n a 37 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Agar Vogel Johnson: muestra


Forma: circular y puntiforme
Color: amarillo
Borde: entero
Viraje: rosa
El medio se contamin, ya que el
control tambin se contamin.

Agar CLED: muestra


Forma: puntiforme
Color: amarillo
Borde: entero
Viraje: ligeramente amarillo

Agar CLED: control Forma: puntiforme


Color: gris y amarillo
Borde: entero
Viraje: ligeramente amarillo
Este medio est muy enriquecido y
es muy fcil de que se contamine si
no se le da un manejo apropiado.

P g i n a 38 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

CONCLUSIN:
Se realiz la siembra de la muestra del exudado conjuntival y no hubo
crecimiento de patgenos, por lo cual, el paciente se encuentra sano. Aunque los
medios se contaminaron de algn microorganismo ajeno a los cultivos, dndonos
colonias amarillas bien definidas. Se cumpli con el objetivo de realizar la toma de
muestra de exudado conjuntival, aunque no hubo crecimiento bacteriano, adems
es importante conocer la metodologa que se realiza para conocer los posibles
agentes infecciosos en la conjuntiva para diagnosticar e iniciar un tratamiento lo
antes posible.
BIBLIOGRAFIA:
Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramrez, AC, Snchez K, Velasco E. (2008).
Manual prctico de bacteriologa clnica. Universidad de Los Andes. 1
edicin. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 79-89.
Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. 4 ed.
Espaa: Mosby; 2004.
Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 4 ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.

P g i n a 39 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA NO. 8
DETERMINACIN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS POR INMUNOENSAYO
OBJETIVO:
Que el alumno determine de forma cualitativa Chlamydia trachomatis por el
mtodo de inmunoensayo.
FUNDAMENTO:
El examen est basado en la investigacin de Chlamydia trachomatis como
agente patgeno en el raspado conjuntival por lo que se emplea
inmunofluorescencia directa y tincin de Giemsa.
Las clamydias son bacterias INTRACELULARES OBLIGADAS que se
diferencian de otras bacterias por su morfologa y por presentar un ciclo de
desarrollo nico durante el cual se pueden observar dos formas, una adaptada a
vivir extracelularmente llamada CUERPO ELEMENTAL que mide entre 200 y 400
nm de dimetro, es inefectivo, es antignico, resistente a la tripsina y la otra es
llamada CUERPO RETICULAR o CUERPO DE INFUSIN, que mide entre 600 y
1500 nm de dimetro no es inefectivo, es lisado por la tripsina y no es letal para el
ratn.
El gnero chlamydia est constituido por tres especies: C. trachomatis, C.
Psittaci y C. Pneumoniae que pueden diferenciarse en base a su susceptibilidad a
las sulfonamidas a la morfologa de los cuerpos elementales y de los cuerpos
reticulares, a la presencia de glucgeno en las inclusiones, al husped que
infectan, a la homologa de su DNA y a la presencia de DNA plasmdico.
C. trachomatis es un patgeno exclusivo del hombre, se han descritos tres
biovares con 15 serovares, que estn relacionados como enfermedades en el
humano. El biovar linfogranuloma venereum es el agente de linfogranuloma
venreo que es una enfermedad que se transmite por contacto sexual y se
caracteriza por presentar una inflamacin granulomatosa de los cambios linfticos
en las regiones inguinal y rectal.
MATERIAL:
Materiales provedos.
Dispositivo de prueba empacado en una bolsa sellada.
Reactivo de extraccin A (cido) y B (alcalino).
Manual de instruccin.
P g i n a 40 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Materiales requeridos pero no provistos.


Contador de tiempo.
Papel de prueba pH.
Suero de paciente.
Torundas.
Jeringa de 5 mL.
TCNICA:
DEMOSTRACIN DE Chamydia trachomatis POR TINCIN DE GIEMSA
a. Fijar un frotis con metanol durante 5 minutos.
b. Cubrir la preparacin con el colorante de Giemsa y dejarlo actuar durante 60
minutos.
c. Lavar
d. Decolorar con etanol al 95%.
e. Dejar secar.
f. Observar al microscopio.
INTERPRETACIN
La presencia de inclusiones intracelulares en las clulas epiteliales,
preferentemente cerca del ncleo, hace sospechar C. trachomatis.
Nota: No se llev a cabo la tincin de Giemsa, para la demostracin de Chlamydia
trachomatis.

Grupo MexLab
Chlamydia Test
Prueba rpida
Procedimiento de extraccin.
1. Agregue 9 gotas de reactivo A en un tubo limpio.
2. Inserte el hisopo que contenga la muestra dentro del tubo y talle el hisopo
10 veces.
3. Espere 2 minutos y talle el hisopo 10 tiempos. Se requiere un tiempo mayor
si las muestras son muy pegajosas.

P g i n a 41 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

4. Con el hisopo pegado a un lado, agregue 9 gotas de reactivo B al tubo y


talle el hisopo 10 veces. Si la textura es viscosa, agregue otra gota de A
para cambiarlo a claro.
5. Exprima el lquido del hisopo comprimiendo el hisopo y saque el siopo del
tubo. Deseche el hisopo.
Procedimiento de la prueba.
1. Saque el dispositivo de prueba de la bolsa sellada cortando por donde
dice splice, y colquelo sobre una superficie limpia. Deseche el
desecante.
2. Agregue 2 gotas de la muestra extrada del tubo dentro del pozo de
muestra (S) como se muestra en el dibujo.
3. Lea los resultados antes de 10 minutos.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Resultado positivo: Si la banda de prueba (marcada con una T) aparece.
Usualmente la banda T aparece son unos minutos si est positiva. Se presentan
dos bandas.
Resultado negativo: Si no hay lnea de color mostrada dentro de 10 minutos en la
zona T. Se presenta una banda.
Resultado invlido: Si el color de la banda no aparece en la zona de control C, el
resultado de la prueba ser invlido. La muestra pudo haber sido aadido en la
ventana equivocada, o el dispositivo de prueba pudo haber deteriorado. El
espcimen debe ser re-analizado usando un dispositivo nuevo.

P g i n a 42 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Figura 2. As se debe mostrar un


resultado positivo de Chlamydia
trachomatis en el dispositivo de
imunoensayo. Dos bandas.

Equipo 1-B

Figura 3. As se debe mostrar un


resultado negativo de Chlamydia
trachomatis en el dispositivo de
imunoensayo. Una sola banda.

RESULTADOS:

Muestra: de exudado endocervical negativo a Chlamydia trachomatis.

OBSERVACIONES:

Se tomaron las muestras del exudado endocervical


con mucha precaucin de los hisopos que se
observan, despus con una pipeta se tom una
cantidad mnima de muestra para colocarla al
dispositivo de test rpido para la deteccin de
Chlamydia trachomatis.

P g i n a 43 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Se aprecian 5 dispositivos utilizados para la


determinacin de Chlamydia trachomatis, y en
todos dio un resultado negativo.
Observaciones generales.
La muestra se obtuvo por exudado endocervical un da antes de la prueba,
ya que se refriger.
Antes del anlisis se atemper durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se present una banda roja en la zona control.
Se tom la muestra del tubo 3 (en el caso de nuestro equipo).
CONCLUSIONES.

Se cumpli con el objetivo de la prctica que era determinar de forma


cualitativa Chlamydia trachomatis.
El resultado del diagnstico fue negativo para Chlamydia trachomatis.
El inmunoensayo, da a conocer la presencia de algn microorganismo
causante de alguna patologa, de forma rpida y eficaz. Lo anterior, para un
diagnstico que se requiera de manera inmediata.

BIBLIOGRAFA.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.
Grupo MexLab. (2010). Chlamydia Test: Prueba rpida. Mxico: Grupo Industrial
Mexlab S. A. de C. V.

P g i n a 44 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

UNIDAD V INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS INFERIORES


INTRODUCCIN.
Es de todos sabidos que la poblacin infantil es la que se expone a mayores
riesgos con las Infecciones Respiratorias Agudas. De acuerdo con la normatividad
mexicana para la atencin a la salud del nio, lo primero que se debe identificar a
travs de los mtodos de consulta es la presencia de neumona, otitis media,
faringo-amigdalitis u otra alteracin de origen bacteriano que -ya se dijo en las
entregas anteriores- pueden ser complicaciones de un resfriado comn o un
cuadro de gripe o influenza.
Segn las caractersticas manifiestas en el paciente, al realizar el
interrogatorio y la auscultacin completa, estas se clasifican en los siguientes
casos cerca del 30% de las infecciones del paciente son debidas a virus.
Los virus respiratorios suelen tener una relacin muy clara con la estacin del
ao. No siempre son ellos la causa directa de la infeccin. Qu quiere decir esto?
Los virus pueden daar la mucosa bronquial y favorecer as el asentamiento de
bacterias causantes del cuadro infeccioso. El virus es, por una parte, difcil de
diagnosticar, y, por otra, carece de tratamiento especfico.

VIRUS: Virus respiratorio sincitial, Virus influenzae, Virus parainfluenzae,


Coronavirus, Rhinovirus, Adenovirus.
BACTERIAS: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,
Moraxella
catarrhalis,
Pseudomona
aeruginosa,
Enterobacterias,
Staphilococcus aureus, Streptococcus spp., Mycoplasma pneumoniae,
Chlamydia pneumoniae.

El papel de las bacterias ha sido muy estudiado. Por desgracia, tampoco


resulta sencillo su diagnstico. Esto se debe a que como ya hemos comentado
anteriormente, en estos pacientes se produce con mucha frecuencia una
colonizacin de la mucosa por bacterias. La obtencin de esputo para hacer un
anlisis microbiolgico del mismo no es sencilla porque no siempre el paciente
puede expectorar. Adems los resultados pueden ser confusos al obtener en
ocasiones diferentes tipos de bacterias. El examen de la expectoracin se
complica por el hecho de que contiene muchos grmenes potencialmente
patgenos, como comensales en la garganta normal.

P g i n a 45 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA No. 9
CULTIVO DE MATERIAL DE VAS REAS INFERIORES, CULTIVO DE
EXPECTORACIN
OBJETIVO:
El alumno realizar cultivos de muestra de vas areas inferiores,
particularmente de expectoracin para la posible identificacin de bacterias
patgenas de acuerdo a los resultados macroscpicos y microscpicos.
FUNDAMENTO:
A pesar de las crticas de su sensibilidad, especificidad y fiabilidad, la tincin
de Gram y el cultivo del esputo son una herramienta importante en la evaluacin
microbiolgica y/o bacteriolgica no invasiva de la neumona. Los mtodos de
recoleccin de esputo y la contaminacin orofarngea son el principal problema a
resolver para aumentar la fiabilidad. Primero, la obtencin del esputo requiere la
cooperacin del paciente y la supervisin por personal calificado para obtener una
muestra adecuada.
Una proporcin importante de los pacientes con neumona son incapaces de
producir una muestra adecuada. Esta dificultad ha hecho desarrollar tcnicas
especficas para inducir el esputo, que son particularmente tiles y coste-efectivas
en pacientes con SIDA y neumona por Pneumocystis carinii. Adems, el esputo
inducido se ha mostrado til en el diagnstico microbiolgico de infecciones
debidas a organismos distintos a P. carinii.
Cualquiera que sea el mtodo de recogida, el esputo es una mezcla de
secreciones del tracto inferior con una cantidad variable de secrecin orofarngea.
Por tanto, una valoracin y procesamiento adecuados representan un paso
obligado antes del cultivo.
MATERIAL:
Cajas Petri (40 por todo el
grupo).
Equipo de tincin de Gram.
Hisopos.
Asa bacteriolgica.
Microscopio.

Portaobjetos.
Agar Sangre.
Agar Gelosa Chocolate.
Agar McConkey.
Agar Sal y Manitol.
Agar Biggy.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

TCNICA:
Cultivo.
1. Seleccionar la porcin de la muestra ms purulenta o que contenga sangre.
2. Utilizando un hisopo estril o un aplicador de madera inocular la muestra en
un extremo de la superficie de las placas con los medios de cultivo.
3. Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inoculo
de la muestra, realizar la siembra por dispersin agotamiento en cuatro
cuadrantes de la placa, con el propsito de obtener colonias aisladas
4. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 37 C por 24 a 48 horas.
5. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas.
Frotis.
1. Seleccionar la porcin ms purulenta de la muestra que contenga sangre.
2. Suavemente extenderla en la lmina portaobjetos.
3. Dejar secar el frotis al aire, de preferencia dentro de una cabina de flujo
laminar.
4. Fijar con metanol y colorearlo por Gram.
5. Usar bajo aumento (10 X) para examinar el frotis y la determinacin de
polimorfonucleares y clulas escamosas (100 X).
Lectura a las 24 horas.
Si no hubiera crecimiento incubar por 24 horas ms.
1.
2.
3.
4.
5.

6.
7.
8.

Tomar la muestra
Rotar el aza en cada una de las zonas de las placas.
Incubar los cultivos a 37 C durante 24 h.
Fijar el frote y teirlo con el mtodo de Gram. Hacer la observacin
microscpica con el objetivo de l00X.
Al terminar la incubacin de los medios utilizado, observar la morfologa
colonial: microscpica, identificar la flora aislada y si se encuentran
microorganismos flora patgena realizar sensibilidad a lo antibiticos.
Hacer las observaciones correspondientes, del crecimiento de cada una de
las ajas. Dibujar los campos observados en el microscopio.
Identificar las colonias.
Hacer un reporte del resultado del paciente.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

RESULTADOS.
Agar sangre: Sin crecimiento bacteriano o algn tipo de microorganismo
que haya crecido (contaminacin).
Agar gelosa chocolate: Sin crecimiento bacteriano o algn tipo de
microorganismo que haya crecido (contaminacin).
Agar McConkey: Sin crecimiento bacteriano o algn tipo de
microorganismo que haya crecido (contaminacin).
Agar Sal y Manitol: Sin crecimiento bacteriano o algn tipo de
microorganismo que haya crecido (contaminacin).
Agar Biggy: Sin crecimiento bacteriano o algn tipo de microorganismo
que haya crecido (contaminacin).
Nota: Se dejaron incubar 24 horas las cajas y posteriormente, 48 horas ya que no
se presentaba crecimiento alguno.
OBSERVACIONES.

Se puede observar la toma de muestra


de expectoracin, aunque cabe decir
que no tena sangre y se procedi junto
con un hisopo a abrir de alguna forma
la muestra de tal manera que se
agarrara de en medio lo que se deba
de inocular en cada una de las placas.

Como indicaba la tcnica,


la siembra del inculo de la
muestra se realiz por
dispersin por agotamiento
en cuatro cuadrantes de la
placa con los medios de
cultivo a 35-37 C por 24
hrs. y luego a 48 hrs.

P g i n a 48 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Se aprecian los cinco medios


utilizados, en los cuales al pasar
48 hrs., no presentaron
crecimiento alguno no sabemos
porque, pero suponemos que el
paciente no presenta alguna
enfermedad de las vas
respiratorias inferiores.

No se observaron clulas
polimorfonucleares ni escamosas.
Esta imagen representa la tincin
de Gram hecha antes del cultivo
de la muestra de expectoracin.
El paciente es desconocido. Visto
a 10 X.

No se observaron clulas
polimorfonucleares. Pero si se
puede observar una clula
escamosa, la cual est sealada.
Esta imagen es de la tincin de
Gram hecha de la muestra a las
48 hrs. Visto a 100 X.

P g i n a 49 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

CONCLUSIN:
No se tuvo crecimiento bacteriano alguno, por lo que no se pudo observar la
morfologa colonial. Esperbamos que a lo mejor la muestra estuviese
contaminada, pero tampoco lo que nos indica que el procedimiento llevado a cabo
durante la siembra de la muestra fue correcto y realizado con las medidas de
esterilidad adecuadas. Suponemos que el paciente no est enfermo de algn tipo
de agente causal que propicie a que tenga alguna patologa referente a las vas
inferiores areas. Por lo que se concluye que ahora sabemos la importancia de
hacer este tipo de anlisis bacteriolgico para descartar enfermedades
respiratorias. As como, siempre tomar las medidas adecuadas en la elaboracin
de este tipo de prcticas. Las tinciones realizadas tampoco dieron muestra alguna
de presencia de microorganismos patgenos.
BIBLIOGRAFA.
Torres A, Mensa J, Niederman M. (1999). Infecciones respiratorias en UCI.
Barcelona: Springer-Verlag Ibrica. Pg. 241.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.

P g i n a 50 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA NO. 10
UROCULTIVO
OBJETIVO:

Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de


infecciones del trato urinario (ITU).

FUNDAMENTO:
El diagnstico de laboratorio de una ITU se realiza a travs del urocultivo, el
cual consiste en el cultivo bacteriolgico de la orina para determinar la presencia y
cuantificacin de grmenes patgenos. Para la evaluacin de estos grmenes y
de su potencial importancia en un proceso infeccioso de las vas urinarias es
imperativo conocer los siguientes aspectos:

Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior:


Estafilococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patgenas
(difteroides), Enterobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp.,
Enterobacter sp., entre otras. Micobacterias saprofticas, especialmente
Mycobacterium smegmatis, Levaduras y Streptococcus sp. Todos estos
microorganismos pueden contaminar fcilmente las muestras de orina sin
que ello signifique infeccin, por eso se deben seguir estrictamente las
normas que se explican ms adelante, que permiten recolectar y conservar
correctamente las muestras para urocultivo.

Agentes productores de ITU: todo microorganismo puede potencialmente


producir infeccin urinaria; sin embargo, las ms frecuentes son:
Escherichia coli (85% aproximadamente), Proteus sp. (especialmente
Proteus mirabilis), Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp., Enterobacter
sp. Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter generalmente en pacientes
hospitalizados con sondas permanentes o con otra patologa de base.
Levaduras, Staphylococcus saprophyticus (generalmente en mujeres en
edad reproductiva), Haemophilus, principalmente en nios.

MATERIALES:

Guantes de ltex estriles.


Gasa estril.
Jabn.
Agua tibia estril.
Frasco estril de boca ancha
para la muestra de orina.

Asa bacteriolgica.
Mechero Bunsen.
Medios de cultivo: agar sangre
y agar McConkey.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

TCNICA:
Toma de muestra

Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabn, de adelante


hacia atrs, secarse con toalla limpia, orinar separando los labios mayores.
Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco
balanoprepucial con agua y jabn (no usar antispticos). Se elimina el
primer chorro de orina y luego se recolecta en un envase estril la fraccin
siguiente.
Siembra en medios de cultivo

1. Mezclar la orina cuidadosamente.


2. Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del
frasco en el mechero Bunsen.
3. Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estril introducindola y
sacndola del frasco en forma vertical. Tapar el frasco con la muestra.
4. Insertar el asa estril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre
la superficie de la placa desde el centro, formando una lnea y
posteriormente hacer estras sobre la placa cruzando la lnea del inculo
varias veces.
5. Incubar las placas durante 24 horas a 37 C. En caso de tener cultivos
negativos a las 24 horas, se deben incubar 2448 horas ms.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

Imgenes representativas de los medios de cultivo agar sangre y McConkey ya


que no se observaba ningn crecimiento y no se tomaron fotografas
CONCLUSIN:
Al sembrar la muestra de orina, no hubo crecimiento bacteriano a las 24
horas de haber puesto a inocular el medio, por lo cual, se dej otras 24 horas para
que hubiera un crecimiento en los medios pero no hubo crecimiento bacteriano y
adems los medios de cultivo se contaminaron ya que en el control negativo se
observ un crecimiento de hongos.
BIBLIOGRAFIA:
Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramrez, AC, Snchez K, Velasco E. (2008).
Manual prctico de bacteriologa clnica. Universidad de Los Andes. 1
edicin. Editorial Venezolana C.A. Venezuela. Pp. 65-77.
Zorc J, Kiddoo D, Shaw K. Diagnosis and management of pediatric urinary tract
infections. Clin Microbiol Rev 2005, 18(2): 417-422.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA NO. 11
PRUEBAS BIOQUIMICAS
OBJETIVO:

Identificar bacterias en base a su metabolismo utilizando diferentes


sustratos y condiciones de oxgeno.

FUNDAMENTO:
El medio TSI (Triple Sugar Iron/Hierro Triple Azcar) es uno de los medios
ms utilizados para observar la fermentacin de carbohidratos en la familia
Enterobacteriaceae. Para su utilizacin el medio debe estar en forma de pico de
flauta. Se han incorporado a estos medios cuatro derivados proteicos: extracto de
carne, extracto de levadura, peptona y proteosa, que hacen que los medios sean
muy ricos nutricionalmente. La ausencia de inhibidores en el medio permite el
crecimiento de todas las especies bacterianas excepto anaerobios obligados y
otras bacterias exigentes. Por su contenido de sulfato ferroso se puede detectar
cido sulfihdrico. El medio se utiliza en forma de pico de flauta.
En el medio LIA (Lysine Iron Agar/Agar Hierro Lisina) se puede detectar la
produccin de la lisina descarboxilasa, ya que se produce una reaccin coloreada
por un cambio en el pH del medio que contiene como indicador prpura de
bromocresol. Un cambio del color original del medio (prpura) hacia amarillo en el
fondo indica una reaccin cida por la fermentacin de una pequea cantidad de
glucosa en el medio, si el microorganismo produce lisina descarboxilasa la accin
de esta sobre la lisina dar lugar a la cadaverina la cual producir un cambio en el
pH que sobrepasa la acidez debida a la glucosa dando un color prpura, as pues
un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color
prpura que si es producida. LIA al igual que en TSI o KIA se puede detectar la
produccin de sulfuro de hierro. El medio se utiliza en forma de pico de flauta.
El medio de Citrato de Simmons, se basa en la capacidad de un
microorganismo de utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono para
metabolismo y crecimiento. Una prueba positiva est representada por la aparicin
de un color azul oscuro en 24 o 48 horas, en el medio originalmente de color
verde, que indica que el microorganismo ha sido capaz de utilizar el citrato
contenido en el medio, con la produccin de productos alcalinos. La prueba
tambin es considerada positiva si hay crecimiento en la lnea de inoculacin, si se
incube 24 horas ms aparecer el color azul. El medio se utiliza en forma de pico
de flauta.

P g i n a 54 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

El medio MIO (Motilidad Indol Ornitina) es un medio semislido, altamente


nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena.
Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de la
enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el
hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la
enzima ornitina descarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH,
que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo.
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:
movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra
por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea
de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura
del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo
una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo.
Por descarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del
indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptfano por los
microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color
rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un
resultado positivo. Este medio se solidifica en forma vertical.
MATERIALES:

Asa bacteriolgica recta.


Mechero Bunsen.
Medios de cultivo: LIA, MIO, TSI y Citrato.
Cepas de Citrobacter y Enterobacter.
Gradilla.

TCNICA:
1. Marcar los tubos con sus nombres correspondientes y el de la bacteria en
estudio. Acomodarlos en serie de la siguiente manera: Urea, TSI, LIA,
citrato, SIM.
2. Inocular cada tubo de acuerdo como sigue:
- TSI: Picar en el medio sin tocar el fondo del tubo ni las paredes y estriar
la superficie.
- MIO: Picar en el medio sin tocar las paredes ni el fondo del tubo.
- LIA: Picar el fondo del tubo dos veces y estriar la superficie.
- CITRATO: Inocular solo la superficie del medio.
P g i n a 55 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

3. Tapar los tubos verificando que la rosca de los tapones no estn totalmente
cerrados. Incubar a 37 C por 24 horas.
4. Despus de incubarlos, agregar 2 gotas del reactivo de Kovacs al medio
MIO para observar si cambia de color. Si cambia a color rojo es positivo a
indol.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

En la imagen se muestra los medios de cultivo ya inoculados antes


de ser introducidos a la estufa para que se incuben.
El tubo del lado izquierdo de color rojo es el medio MIO.
El tubo de color naranja es el medio TSI.
El tubo de color verde es el medio de Citrato.
El tubo del lado derecho de color caf es el medio LIA.

En esta imagen se observan los resultados de las pruebas


bioqumicas realizadas, ntese el cambio de color en base
a la fotografa superior.
P g i n a 56 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

La imagen izquierda representa al medio MIO donde se nota la movilidad donde


se estri, hubo movilidad en las dos cepas, adems, hubo un ligero cambio de
color de rojo a caf claro. Se les adicion las gotas del reactivo de Kovacs y no
hubo ningn cambio de color por lo que dieron negativo a la prueba de indol. La
imagen del medio amarillo representa al medio TSI donde se observa que vir
de color y adems hubo crecimiento en la parte superior del medio, en las dos
cepas hubo crecimiento y cambio de color. El medio de Citrato de color verde
muestra que no hubo crecimiento en Citrobacter pero en Enterobacter si hubo
un cambio de color a azul. El medio de color caf con lila en la superficie,
representa al LIA y hubo cambio de color solo en la parte superior con
presencia de crecimiento de colonias.
Resultados
Medios
MIO
TSI
Citrato
LIA

Cepas
Citrobacter
Movilidad
+
Indol
Ornitina
Glucosa, lactosa y/o sacarosa
fermentada
-

Enterobacter
Movilidad
+
Indol
Ornitina
Glucosa, lactosa y/o sacarosa
fermentada
+
+ descarboxilacin

P g i n a 57 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Ejemplos de cepas de pruebas bioqumicas

Medio LIA (tomado de Difco &


BBL Manual, 2009)

Medio MIO (tomado de Difco &


BBL Manual, 2009)

Medio TSI (tomado de Difco & BBL


Manual, 2009)

Medio Citrato (tomado de Difco


& BBL Manual, 2009)

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

A nuestra mesa de trabajo le toc preparar el agar TSI


18 tubos x 4 mL= 72 mL de TSI
1000 mL 59.4 g
X 80 mL

(80 )(59.4 )
= .
1000

CONCLUSIN:
Al realizar las pruebas bioqumicas a 2 cepas diferentes de bacterias, se
llega a la conclusin que un gnero y especie corresponde a Enterobacter
aerogenes y la otra cepa no se puede llegar a una identificacin exacta ya que en
la prueba de citrato dio un resultado negativo y es la nica prueba que evita que el
resultado sea Citrobacter freundii. Para obtener mejores resultados, deben
repetirse stas pruebas y agregar ms para obtener resultados ms confiables,
adems de que debe trabajarse en un ambiente estril y que al momento de
incubar, la estufa no est contaminada.
BIBLIOGRAFIA:
Araque MC, Araujo E, Longa A, Ramrez, AC, Snchez K, Velasco E. (2008).
Manual prctico de bacteriologa clnica. Universidad de Los Andes. 1
edicin. Editorial Venezolana C.A. Venezuela.
Medio MIO. Britania Lab. [En lnea] Recuperado el da 21 de mayo de 2014 de:
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/miomedio.htm
Medio TSI. Britania Lab. [En lnea] Recuperado el da 21 de mayo de 2014 de:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm
Medio Citrato. Britania Lab. [En lnea] Recuperado el da 21 de mayo de 2014 en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simmonscitagar.htm
Medio LIA. Britania Lab. [En lnea] Recuperado el da 21 de mayo de 2014 de:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

PRCTICA NO. 12
COPROCULTIVO
OBJETIVOS:

Aislar e identificar los agentes etiolgicos patgenos causantes de


enfermedades gastrointestinales.

FUNDAMENTO:
El coprocultivo es el estudio de la materia fecal para el aislamiento e
identificacin de bacterias productoras de diarrea. Al realizar un coprocultivo es
importante tener presente la flora bacteriana intestinal. En el intestino delgado, el
duodeno es estril, en el yeyuno aparecen enterococos, lactobacilos y difteroides,
en el leon se suman algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae y
anaerobios gramnegativos.En el intestino grueso, la flora habitual constituye el
50% del peso seco de las heces.
Las bacterias anaerobias que se encuentran en mayor proporcin son las
siguientes: Bacteroides 100%, Peptococcus, Fusobacterium, Peptostrepotococcus,
Lactobacillus y Clostridium. Las bacterias anaerobias facultativas o aerobias son
las siguientes: E. coli 100%, Klebsiella y Enterobacter 40 80%, Proteus 5-50%,
Citrobacter sp., Pseudomonas sp., Enterococccus sp. 100%, Staphylococcus 3050%. Esta flora se mantiene en equilibrio por diferentes mecanismos tales como:
produccin de bacteriocinas y sustancias txicas como cidos grasos, entre otras.
Los microorganismos patgenos ms comunes son:

P g i n a 60 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

ECET: Escherichia coli enterotoxignica; ECEP: Escherichia coli enteropatgena; ECEH:


Escherichia coli enterohemorrgica; ECEI: Escherichia coli enteroinvasiva; PMN: Leucocitos
polimorfonucleares; GR: Glbulos rojos. Tomado de: Vizcaya y col, 1999; Romero y Herrera, 2002;
Ryan y Ray, 2004.

Etapas de un coprocultivo

Primer periodo: examen directo. Consiste en realizar el examen


macroscpico y microscpico de las heces fecales. El examen
macroscpico consiste en evaluar la consistencia, color, olor, presencia o
ausencia de moco y/o sangre. En el microscpico se busca detectar la
presencia de leucocitos. Tambin se incluye el aislamiento bacteriano en
las heces.
Segundo periodo: identificacin por pruebas bioqumicas.
Tercer periodo: se realizan las pruebas posteriores a las pruebas
bioqumicas (oxidasa, indol, etc.) y se realiza un antibiograma.

Medios selectivos y selectivos diferenciales: la muestra completa


conservada en Cary Blair se siembra en los medios agar MacConkey (MK), agar
xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), agar salmonella-shigella (SS), agar cefsulodinirgasan-novoviocina (CIN), agar desoxirribonuclico-ampicilina (ADN-AMP), agar
tiosulfato-citaro-sales biliares (TCBS) y agar preston modificado (PM). Todos los
medios a excepcin del CIN y PM, son incubados a 36 C durante 24 horas y
luego a temperatura ambiente por 24 horas ms. Los medios CIN y PM se incuban
durante 48 horas a temperatura ambiente (25 C), 42 C y en microaerofilia,
respectivamente.
P g i n a 61 | 73

Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Medios de enriquecimiento: Se utiliza el caldo selenito (para


enterobacterias) y agua peptonada alcalina (APA) pH 8,4, para Vibrio, los cuales
despus de transcurridos 6-8 horas de incubacin a 36C, del caldo selenito se
toma una muestra con el asa en aro de la parte ms superficial del caldo y se
inoculan los medios agar MK, XLD y SS, y del mismo modo a partir del APA al
agar TCBS, luego estos medios se incuban en las condiciones anteriormente
sealadas. Para la posterior identificacin se realizan pruebas bioqumicas, para
ello se utilizan diferentes medios de cultivo, por ejemplo: Kliger, LIA, MIO, IM,
Urea, Citrato.
MATERIAL:
Primer periodo:

Muestra de heces
Azul de metileno al 1%
Medios de cultivo: Cary Blair, Caldo Selenito, APA, agar MK, XLD, SS,
TCBS, PM, CIN.
Solucin salina fisiolgica (SSF)
Lminas portaobjetos y cubreobjetos
Colorantes para tincin de Gram

Segundo periodo:

Agar Tripticasa Soya (TS) al 3%


Pruebas bioqumicas: Kligler, LIA, MIO, IM, Urea, Citrato.

Tercer periodo:

Reactivo de oxidasa
Agar Mueller Hinton
Reactivo de Kovacs
Patrn de MacFarland
Papel de filtro y palillos de madera
Hisopos estriles
Discos de antibiticos

TCNICA:
Primer periodo:

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

1. Realizar el examen macroscpico y microscpico (leucocitos fecales) de


una muestra de heces y describir lo observado en cada caso.
2. Preparar una suspensin fecal en SSF y sembrar con pipeta Pasteur en los
diferentes medios selectivos-diferenciales, selectivos y de enriquecimiento,
diseminar por agotamiento en las placas de agar e incubar en las
condiciones ya sealadas.
Segundo periodo:
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior, describa las
caractersticas observadas en cada medio y seleccione las colonias de
inters, realizar la purificacin correspondiente en agar TS 3%, inocular las
pruebas bioqumicas segn el caso, incubar a 37 C en aerobiosis durante
12-18 horas.
Tercer periodo:
1. Realizar la prueba de oxidasa de las colonias purificadas y ubicar la
bacteria segn el resultado obtenido.
2. Realizar la lectura de las pruebas bioqumicas montadas en el perodo
anterior e identificar la(s) bacteria(s) presente(s).
3. Realizar las pruebas serolgicas en caso necesario.
4. Realizar el antibiograma si el caso lo amerita, de lo contrario realizar el
reporte.

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Manual de Laboratorio de Bacteriologa

Equipo 1-B

Nota: ESTA PRACTICA NO SE REALIZ


BIBLIOGRAFA:
Vizcaya, L. En Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya
L. Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de
Farmacia, Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y
Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa Clnica.
Murray, P. (2009). Microbiologa Mdica. Captulo 15. Cultivo in vitro: principios y
aplicaciones. 6 edicin. ELSEVIER. Espaa.
Negroni, M. (2009). Microbiologa estomatolgica. Fundamentos y gua prctica. 2
edicin. Editorial Mdica Panamericana. Argentina.

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Equipo 1-B

UNIDAD IX INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL


PRCTICA No. 13
CULTIVO DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO
OBJETIVO:
El alumno realizar el cultivo de una muestra de lquido cefaloraqudeo para
la identificacin del agente causal, Neisseria meningitidis, entre otros como:
Criptococcus neoformans, H. intluenzae, S. pneumoniae, Haemophilus y
Mycobacterium tuberculosis.
GENERALIDADES:
La enfermedad meningoccica (EM) fue reconocida por primera vez en el ao
1805, cuando Vieussex describi una epidemia de fiebre cerebroespinal en
Ginebra Suiza. Desde entonces, la EM ha sido y sigue siendo una causa
importante de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Su potencial epidmico se
evidencia por la aparicin de diversas epidemias, especialmente despus del
comienzo del siglo XX. Durante los perodos epidmicos, la tasa de mortalidad
puede alcanzar hasta un 70% en las formas graves de la enfermedad, y es comn
la presencia de secuelas entre los supervivientes. Por ello, la EM es un grave
problema de salud pblica.
FUNDAMENTO:
En agente causal, Neisseria meningitidis, es un diplococo Gram-negativo
capsulado, que crece en condiciones aerbicas y que presenta una reaccin
positiva a la oxidasa y catalasa. Dado que se trata de un organismo con
metabolismo hetertrofo, su crecimiento requiere de sales minerales, lactato,
aminocidos y cido glutmico como fuente de carbono, Aproximadamente un
10% de las cepas requiere adems de cistina, y algunos pueden utilizar sales de
amonio como fuente de nitrgeno. El medio de cultivo para el aislamiento de
meningococo a partir de muestras biolgicas estriles, como lquido
cefalorraqudeo o sangre, es el agar sangre o el agar chocolate, con base de agar
Meller-Hinton. Para su aislamiento a partir de muestras biolgicas no estriles,
como el frotis naso-farngeo, es necesario utilizar medios selectivos como el
Thayer-Martin modificado (GC agar suplementado con 5% de sangre de caballo y
suplemento VCNT (vancomicina, colistina, niastatina y trimethoprim). Las
condiciones ptimas para el crecimiento de N. meningitidis son a una temperatura
entre 35-37C, atmsfera con un 5% CO2 y 50% de humedad.

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Equipo 1-B

Estructura antignica de N. meningitidis


La membrana externa del meningococo presenta una estructura tpica de las
bacterias Gram negativas. Est rodeado por una membrana citoplasmtica, una
pared de peptidoglicano y una membrana externa constituida por lipopolisacrido
(LPS) y una bicapa fosfolipdica en la cual se insertan las protenas de membrana
externa (OMPs). Adicionalmente, el meningococo puede estar rodeado por una
cpsula externa compuesta de polisacrido.
Cpsula.
La cpsula a del meningococo est compuesta por un polisacrido aninico de
alto peso molecular. Las diferencias inmunoqumicas en la composicin de la
cpsula permiten clasificar el meningococo en hasta 13 serogrupos distintos de los
cuales solamente 6: A, B, C, W135, Y y X, se asocian habitualmente con la
enfermedaD. Se ha sugerido que la funcin de la cpsula es proteger a la bacteria
de la desecacin durante la transmisin de persona a persona, y se ha
demostrado que acta como proteccin contra la actividad de sistema
inmunolgico del husped durante la fase invasiva de la enfermedad.
Membrana externa
La membrana externa del meningococo est formada por componentes
proteicos y glicolpidos.

Estructura de la membrana externa de meningococo.


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En las meningitis purulentas el diagnstico microbiolgico se realiza,


demostrando el agente etiolgico en la muestra del lquido cefalorraqudeo la que
debe ser tomada por el personal mdico.
El lquido cefalorraqudeo se recoge en dos tubos de preferencia con tapn de
hule, uno de ellos contendr citrato de sodio 0.01 g. por cada 5 mI. de la muestra y
de ste se har el estudio citoqumico, mientras que el otro sin anticoagulante se
emplea para hacer pruebas bacteriolgicas.
El diagnstico especfico rpido, cuando se trata de H. influenzae o
pneumoniae, se realiza con las reacciones de Quellung o por las pruebas
contrainmunoeletroforesis de inrnunofluorescencia directa o coaglutinacin.
observacin directa del frotis teido por Gram o Giemsa permite dar
diagnstico presuntivo.

S.
de
La
un

MATERIAL.

Cajas Petri.
Asa bacteriolgica.
Microscopio.
Portaobjetos.
Mechero bunsen.
Agar chocolate.

Agar EMB.
Agar sangre.
Equipo para tincin de Gram.
Equipo para tincin de ZiehINielsen.

TCNICA.
1. El lquido cefaloraquideo (LCR) debe ser manejado en condiciones de e
sterilidad, enviando la porcin correspondiente al laboratorio clnico para el estudio
citoqumico.
2. Centrifugar el LCR a 2500 rpm durante 15 minutos y descartar el sobrenadante.
Hacer tres frotis: uno teirlo por la tcnica de Gram, el segundo por Ziehl
Neelsen y el ltimo por tincin negativa (para investigar la posible presencia de
Criptococcus neoformans encapsulado, observarlos en objetivo de inmersin. El
resultado se debe informar de inmediato.
Realizar las pruebas de coaglutinacin para H. intluenzae y S. pneumoniae (si
se cuenta con el equipo).
Inocular en agar sangre, en agar chocolate enriquecido con los factores V y X
para Haemophilus, en EMB; si hay sospecha clnica o los frotis indican la
presencia de hongos, usar el medio Sabouraud y medio Lowestein-Jensen en
caso de Mycobacterium tuberculosis. Incubar a 48 a 72 horas en atmsfera
parcial de CO2.
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Equipo 1-B

Observar a las 24 horas (y diariamente a partir de entonces) en busca de


crecimiento; si lo hay, hacer tincin de Gram y subcultivar en los medios
apropiados despus de interpretar el frotis. Es importante incluir en estas placas
de sensibilidad a los antibiticos.
Conservar en incubacin los cultivos negativos de 72 a 96 horas antes de
desecharlos.
Inocular en medio de tioglicolato. Los cultivos anaerbicos debern
mantenerse por lo menos de 7 a 10 das.
La identificacin final de los microorganismos aislados se hace empleando las
pruebas bioqumicas o serolgicas indicadas en cada caso.
El lquido cefalorraqudeo normal es estril.
Notas.
La toma de muestra es llevada a cabo por mdico especialista o Q.F.B.
especialista en la columna vertebral (Con anestesia de Xilocana local).
LCR es como agua de roca (transparente y cristalino). Cuando es anormal
puede ser de aspecto: turbio, amarillento, algunas veces con eritrocitos.
No se llev a cabo dicha prctica, considerndose solamente terica.

BIBLIOGRAFA.
Vieusseux, M., Memoire sur la maldie qui a regne a Geneva au printemps de 1805.
J med Chir Pharmacol., 1805. 11: Pg. 163.
Peltola, H., Meningococcal disease: still with us. Rev Infect Dis, 1983. 5(1): Pp. 7175.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.

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Equipo 1-B

PRCTICA No. 14
HEMOCULTIVO
OBJETIVOS:
El alumno llevar a cabo la realizacin de un hemocultivo para as, verificar
si hay bacterias u otros microorganismos en una muestra de sangre.
El hemocultivo o cultivo microbiolgico de la sangre constituye en los casos
de septicemia, el nico examen que permite su confirmacin
En caso de bacteremia permite aislar el agente causal.
FUNDAMENTO:
Las bacterimias y fungemias se diagnostican por hemocultivo, que consiste en
el cultivo de una muestra de sangre en medios adecuados para recuperar las
bacterias y hongos que son capaces de crecer en medios artificiales.
Para realizar un hemocultivo en un adulto se extrae al paciente entre 10 y 20
mL de sangre sin anticoagulante y se inocula en dos frascos con 50 mL de caldo
de cultivo, uno de los cuales tiene atmsfera aerobia y el otro anaerobia para
permitir el crecimiento de los respectivos microorganismos (Figura 1). La
extraccin debe hacerse mediante una tcnica rigurosamente asptica para evitar
contaminaciones.
Tabla 1. Algunos agentes causales de septicemia.

Frecuentes

Sepsis adquirida
en la comunidad

Sepsis de origen intrahospitalario

E. coli y otras
enterobacterias
Neumococo
S. aureus

E. coli y otras enterobacterias


S. epidermidis y otros estafilococos
coagulasa negativa
P. aeruginosa
Acinetobacter baumannii y otros
BGN-NF (bacilos gramnegativos no
fermentadores)
Estreptococo del grupo viridans
Enterococo

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Poco frecuentes

Meningococo
Salmonelas
gastroentricas
Anaerobios
P. aeruginosa
Salmonella entrica
serovar Typhi
Brucella

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Cndida
Bacteroides fragilis y otros
Clostridium perfingens y otros
Corinebacterias

Frascos para hemocultivo.


El hemocultivo complementa urocultivos y cultivos de LCR en la evaluacin de
neonatos con sospecha de sepsis. Uno de los medios ms utilizados es el Medio
Bifsico de Ruiz Castaeda. Las botellas deben observarse macroscpicamente
a diario en busca de evidencia de desarrollo bacteriano por un total de 7 das.
HEMOCULTIVO POSITIVO.
El desarrollo bacteriano se detecta por turbidez del medio de cultivo; colonias
visibles en la capa sedimentada de sangre, o sobre sta. Hemlisis de la sangre,
produccin de gas. Cuando se obtiene un cultivo positivo se debe efectuar una
tincin de Gram, que es particularmente til para distinguir Streptococcus de
Staphylococcus, o detectar la presencia de Bacilos Gram Negativos.
De los subcultivos se debe aislar e identificar la cepa con medios y pruebas
diferenciales. Pruebas diferenciales de Genro y especie, como son la catalasa y
la coagulasa, para cocos Gram Positivos; o Sistema Bioqumico, para
identificacin de Enterobacterias, Prueba de Oxidasa, para diferenciar Bacilos
Gram Negativos, etc.

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Equipo 1-B

ANTIBIOGRAMA.
Subcultivos: una alcuota del caldo con desarrollo se siembra en un medio
slido, con incubacin de 7 hrs ya hay crecimiento suficiente para ser utilizado
como inculo para las pruebas de sensibilidad.
Los organismos aislados de hemocultivos deben guardarse por algunas
semanas en caso que se necesiten mayores estudios diagnsticos.
PRINCIPALES PATGENOS CAUSANTES DE BACTEREMIA
La bacteremia normalmente es causada por: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli.
La Sepsis se presenta principalmente en pacientes hospitalizados, y
comunmente se desarrolla a partir de un sitio de infeccin primaria.
a) CULTIVOS NEGATIVOS.
Si todos los cultivos, subcultivos y frotis teidos por Gram fueran Negativos, el
cultivo de sangre puede informarse as:
No hubo desarrollo, ni aerobio, ni anaerobio, despus de tres das de incubacin.
Informe Final:
No hubo desarrollo despus de 7 a 14 das de incubacin.
b) CULTIVOS POSITIVOS.
Los patgenos encontrados ms comnmente en cultivos de sangre incluyen
los siguientes:
Especies de Bacteroides, Especies de Brucilla, Bacilos Coniformes, Filarias,
Francisella tularensis, Haemophillus influenzae, Especies de Leptospira, Listeria
monocytogenes,
Paludismo,
Meningococo,
Gonococo,
Rickettsias,
Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, Streptococcus
pyogenes, Salmonella especies, Tripanosomas, Bacilos Gram negativos: E. coli,
especies de Enterobacter, especies de Klebsiella, etc.
MATERIAL:

Medio Bifsico de Ruiz Castaeda.


Jeringa De 10 mL.
Gasa estril.
Solucin de yodo.
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Equipo 1-B

Alcohol 70 %.
Placas de selosa Sangre, EMB, agar chocolate, agar sal y manitol.
Material habitual para laboratorio de bacteriologa.
TCNICA:
1. Interrogar al paciente si se encuentra bajo tratamiento con antibiticos.
Consignar esta informacin.
2. Seleccionar la zona que ser puncionada para la extraccin de sangre
(vena palpable).
3. Desinfectar alrededor la zona seleccionada.
4. Lavar cuidadosamente la regin, con agua y jabn (remover el
desinfectante).
5. Aplicar con gasa o algodn, una solucin de yodo sobre el rea
seleccionada en forma concntrica del centro hacia la periferia, y desechar
el algodn o gasa utilizados.
6. Permitir la accin del yodo durante tres a cinco minutos. Remover
completamente la solucin de yodo con gasa o algodn estriles
impregnados en alcohol de 70. Realizar el procedimiento en forma
concntrica descartando siempre la torunda o gasa una vez se llega a la
periferia de la zona de puncin. Repetir este procedimiento cinco veces.
7. No se debe tocar la piel con la mano una vez que el rea ha sido
desinfectada. Antes de hacer la puncin venosa con aguja y jeringa de 10
mL estriles, palpar la vena utilizando guantes desechables y estriles, para
proceder con seguridad.
8. En caso de utilizar recipientes comerciales de hemocultivos, seguir
cuidadosamente las instrucciones de utilizacin del equipo de venoclisis
que usualmente se incluye.
9. Una vez concluida la toma, debe reemplazarse la aguja con la cual se hizo
la puncin, por una aguja nueva estril desechable con la cual se inyectar
la muestra de sangre obtenida en los recipientes. Colocar las cantidades
necesarias de sangre en los recipientes de hemocultivo, previa limpieza y
desinfeccin de la zona de puncin en la tapa de los mismos.
10. Mezclar suavemente los recipientes de hemocultivo. No agitarlos
bruscamente y procurar que la sangre se impregne en todas las superficies
de los medios de cultivo de los frascos.
11. Proceder con actividades propias del estudio (Rotulacin, incubacin 37C,
revisin diaria de cultivos, resiembras, interpretacin de resultados, etc.).

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Equipo 1-B

Nota: No se llev a cabo la realizacin de esta prctica, por lo cual slo es terica.
BIBLIOGRAFA:
Prats, G. (2005). Microbiologa clnica. Espaa: Mdica Panamericana. Pp. 291293.
Ramrez Aguilera, Juana. (2012). Manual de laboratorio de Bacteriologa.
Facultad de Qumica Farmacutica Biolgica.

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