Cromatografa de

Lquidos
Elba Rojas Escudero

ERE
 Ab o Ad ???
 Temario
Fundamentos
Definiciones bsicas
Aspectos tericos
Instrumentacin
Elementos bsicos
Columnas
Inyectores
Detectores y sistemas acoplados
Anlisis
cualitativo y cuantitativo
Cromatografa de lquidos

Mtodo fsico de separacin

La muestra se distribuye entre dos fases

Fase estacionaria: slido o lquido

Fase mvil: lquido o mezcla de lquidos

 Elucin
La muestra se aplica al principio de la
columna como una banda fina
El eluyente tiene menor afinidad por la fase
estacionaria que los solutos
Los solutos avanzan por el sistema a
velocidades diferentes, menores a la de la
fase mvil
Los solutos se separan en bandas que eluyen
al final de la columna
 Cromatografa

Gas Lquido

Columna Plano

CLS CLL CFE CII CE CCF CP

CPG CFG
 Tipos de CL
PM < 2000
Cromatografa de intercambio inico
Adsorcin: lquido-slido
Particin: lquido-lquido
Cromatografia en fase normal
Cromatografia en fase inversa
PM > 2000
Cromatografia de exclusin por tamao
 Requisitos de la muestra

Soluble en la fase mvil

Limpia

No debe reaccionar con ningn componente

del sistema cromatogrfico
HPLC ideal para muestras con:

Presin de vapor baja

Compuestos inicos

Compuestos de peso molecular elevado

Compuestos Termolbiles
 Instrumentacin

Bomba de Gradiente
Fase mvil
alta presin de elucin

Muestra Inyector

Columna
Control de
temperatura
Detector Registrador
 Fase mvil

Disolventes grado cromatogrfico

Agua de 18 m
Baja viscosidad
No vlatil
Miscibilidad
Filtrada
Sin oxgeno disuelto (degasificada)
 Fase mvil

Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por

unidad de tiempo . Se determina a la salida de
la columna a temperatura ambiente (mL/min)
H = f (v)
 Cromatografa

FM
FE

Inyector Detector
 Proceso Cromatogrfico
La fase mvil fluye, arrastrando consigo los
solutos
Los solutos se reparten entre ambas fases

Fase estacionaria Fase mvil

Muestra
Cromatografa de lquidos
Se realiza en columna
Separacin por adsorcin y particin
Diversidad de tcnicas en funcin de
la muestra
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Separaciones analticas y preparativas
Anlisis de mezclas relativamente
complejas
 Fase estacionaria
(columna)
Tubo de acero inoxidable

Dimensiones
Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm
Dimetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm
Tamao de partcula: 3, 5, 10 m
Forma de la partcula: irregular o esfrica
Dimensiones de la
columna

di

dp
 Fase estacionaria
(columna)

Empaque
Slica gel, C8, C18, Ciano, Amino,
Resinas, Polmeros
Carga de Carbn 5-20 % w/w
Intervalo de pH = f (FE)
Lmite de presin de trabajo
Compatible con la fase mvil
Fase estacionaria
Soportes de la FE
Permeacin o exclusin
Cuidados de la columna

Instalacin
Introduccin de muestras limpias
Contaminacin por fase mvil o muestra
Almacenarla y guardarla de forma
adecuada
Lavarla despus de utilizarla con
disoluciones reguladoras de pH
 Precauciones
No exceder la presin de trabajo
Cambios bruscos de presin
Intervalo de pH adecuado
No utilizar H+ y OH- concentrados
Filtrar la muestra y la fase mvil
w de la muestra=f (dimensiones de la
columna)
Cromatografa

Fase Normal
FE polar
FM No-polar
Fase Inversa
FE No-polar
FM polar
 Cromatografa
de fase inversa
FE
Slica qumicamente modificada con
grupos no-polares: hidrocarburos
saturados: C18 octadecil, C8 octil,
C4 tetrametil, C2 dimetl
FM
Mezclas: agua/disolventes orgnicos
H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
 Cromatografa
de fase inversa

Efecto solvofbico fuerte:

Parte apolar de la molcula del soluto es mayor
% C en la FE es mayor
Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
 Fases estacionarias
Fases impregnadas
Cubren uniformemente el soporte
Insolubles en la FM
Compatibles con el detector
El flujo de la FM no debe ser elevado

NO son Estables
 Fases estacionarias
Fases qumicamente unidas (Bonded
phases)
Unidas al soporte por enlaces covalentes
Mayor eficiencia que las Fases impregnadas
Costo elevado
Son estables
 Cromatografa
de fase inversa
Ventajas
Reproducibilidad en las separaciones
Estabilidad de la FE (pH 7)
Mezclas: acuosos/orgnicos H2O
+(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)
Fuerza del eluyente
Viscosidad del eluyente
Polaridad
Polaridad
 Detectores

Indice de refraccin
Ultravioleta-Visible
Fluorescencia
Electroqumico
Radioactividad
Infrarrojo
Espectrmetro de masas
 Instrumentacin

Bomba de Gradiente
Fase mvil
alta presin de elucin

Muestra Inyector

Columna
Control de
temperatura
Detector Registrador
Elucin
Problema general de
la elucin
Gradiente de elucin
Gradiente de elucin
Elucin con alta presin
Elucin
Equipo con gradiente de
elucin
Proceso Cromatogrfico

El lecho cromatogrfico puede ser abierto

(placa) o cerrado (columna)
La fase mvil fluye a lo largo del lecho
cromatogrfico en contacto con la fase
estacionaria
Proceso Cromatogrfico

Las mleculas de soluto en fase estacionaria

se estancan
Las mleculas en fase mvil avanzan con
ella

Mm m m M

m m M
 Proceso Cromatogrfico

La velocidad del soluto vara inversamente con

la afinidad por la fase estacionaria
 Separacin de los solutos

Los componentes con constantes de reparto

diferentes, se separarn

Mm
m M M
M M
m m M M
Separacin de los solutos
H = f (v)
Ensanchamiento de
banda
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FE
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FM
movimiento
Ensanchamiento de la
banda

Transferencia de masa en la FM
estancada
H= f (ensanchamiento de
la banda)
k 2 vt
HL = 2 DM / v HS = 2 a
1+k

HF = 2dp HD = vdp2 / DM

HM = HF + HD

(1- + k)2 dp2v

HSM =
30(1-)(1+k)2DM
H = f (ensanchamiento de
la banda)

H=L/N

H = HL + HS + HM + HSM

H = HS + HM + HSM
 Ventajas

Anlisis de compuestos inicos, de alto

peso molecular
Diversidad de columnas y detectores
Formacin de derivados pre-columna y
post-columna
Separaciones con control de pH
Separaciones preparativas
 Limitantes
Muestras relativamente limpias
Solubilidad de la muestra en la fase mvil
Viscosidad de la fase mvil
Dimensiones de la columna
Presin de trabajo
Intervalo de pH
Utilizar un filtro (pre-columna)
Cromatografa de Lquidos

Formacin de derivados

ERE
 Derivados

Fuera de lnea
En lnea
Pre-columna
Post-columna
Equipo para la formacin
de derivados

FM
FE

Inyector Reactor Detector

FM
FE

Inyector Reactor Detector

Derivados
Derivados
Cromatografa de Lquidos

Aplicaciones

ERE
CCF - CLAE
FE = f (dimetro interno)
Diferente
Cambio de
Aplicacin
Aminas
Aplicacin
Fluorescencia
Polar - No polar
 Qu sucedi ???
Sensibilidad
Sensibilidad
Peso molecular
Propiedades = f (PM)
Oligosacridos
Oligoglucosa
 Ejemplos
Campo Mezclas tpicas
Frmacos Antibiticos, sedantes,
esteroides, analgsicos
Bioqumica Amincidos, protenas,
carbohidratos, lpidos
Alimentos Edulcorantes, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,
fenoles
Qumica Drogas, venenos, alcohol en
forense sangre, narcticos