PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA

MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LQUIDO

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

CENTRO DE INVESTIGACIONES
MONTERIA CORDOBA
2008

1
A. INFORMACION GENERAL

Ttulo del proyecto Produccin de enzimas amilasa microbiana, mediante

fermentacin en estado lquido

Lder principal
responsable del Eder Durango Ballesteros
proyecto

Miembros e integrantes Alfonso Batista Jimnez

Ibeth Cepeda Jimnez
Hctor Alberto Tobn Guzmn
Unidad acadmica Facultad de Ingeniera Agroindustrial
Empresa donde Universidad Pontificia Bolivariana
realizar el proyecto
Fecha de inicio Junio de 2008
Fecha de finalizacin Junio de 2009
Costo total del proyecto
(incluyendo descargas $ 21.826.281
pago de personal -).
Montos de contrapartida
(Entidad o dependencia $ 9.427.881
que cofinancia).
Lnea de trabajo o rea
del conocimiento en la Desarrollo de nuevos materiales y nuevas
cual se inscribe el aplicaciones
proyecto.

2
 B. RESUMEN

El surgimiento de plantas de alcohol carburante de primera generacin a partir de

almidn, en la regin Caribe, implica la transformacin de la materia prima por
procesos de hidrlisis mediante la accin de un complejo de amilasas capaces de
degradarlo en azucares. La implementacin de hidrlisis enzimtica conlleva
generar altos costos de produccin, factor que genera una problemtica en las
empresas de este gnero y a su vez en buscar soluciones para dicha temtica.
Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicaciones
microbiolgicas y biotecnolgicas para la produccin de un complejo de amilasa
microbial a partir de fermentacin en un estado liquido, con el objeto de buscar
soluciones factibles en cuanto a la problemtica planteada del proceso de
hidrlisis del almidn.

C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

1. Planteamiento del problema:

La tendencia actual y las altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollo

de nuevas tcnicas agroindustriales. Actualmente, en Colombia se plantea un
dficit general en torno a la agroindustria enzimtica a causa de la carencia de
investigacin, infraestructura y poca motivacin para desarrollar empresas que
basen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnologa. Su
desarrollo, as como el de otras reas de la biotecnologa, est afectado por
problemas como la creciente brecha cientfica y tecnolgica con respecto a los
pases industrializados. Segn la firma internacional, Frost & Sullivan, analistas
dedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas esta
seccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad de
estas. Segn el estudio, para el ao 2003 se gener cerca de 142 millones de
dlares solo en la industria alimenticia siendo el sector ms innovador el de la
ingeniera gentica a partir de organismos modificados, OGM. Con un 47.3%, las

3
enzimas destinadas al procesamiento del almidn (amilasas) y los azucares
componen el sector mas amplio en la industria.1

Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzimtico colombiano afecta gran

diversidad de industrias incluso las que estn en va de desarrollo como las de
alcohol carburante de primera generacin cuya materia prima para produccin es
el almidn, ya que para la transformacin de sta se hace necesario catalizar el
polisacrido por medio de un complejo de enzimas amilasas capaces de desdoblar
este compuesto; el uso de este complejo representa el 12% del valor total de
produccin de alcohol a base de esta materia prima. En la costa Caribe el empleo
de estas enzimas esta concretamente en el Ingenio Sicarare (Codazzi-Cesar) y
en la planta piloto de CORPOICA-TURIPANA en Crdoba, lo que les incrementa el
valor por litro de producto dado la necesidad de importacin de este complejo.

Las plantas de alcohol carburante de primera generacin con base en almidn se

ven obligadas a importar complejos de amilasas para la hidrlisis del polisacrido,
lo que implica un aumento significativo en los costos de produccin de las
compaas por el hecho de incurrir en gastos de importacin, aranceles y dems
impuestos. Las enzimas a escala industrial, son importadas de diversos pases de
Europa, Japn, Estados Unidos, Canad y Mxico. 2

En conclusin, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primera

generacin a partir de almidn ha establecido un hecho que evidencia la
necesidad de producir complejos de amilasas para reducir costos de operacin.
Por lo que se plantea esta investigacin para buscar alternativas de produccin de
enzimas amilolticas y su aplicacin en las plantas de alcohol carburante en base
de almidn.
2. Impacto esperado

1
Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=34>. boletn 34 publicado en
junio de 2004 [en lnea]; consultado el 09 de febrero de 2008.
2
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 10.

4
Con este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnolgicas para establecer
un protocolo de produccin de un complejo de enzimas amilasas para catlisis de
almidn. Bajo esta temtica se permitir lograr avances en trminos de
investigacin en el rea enzimtica.

La profundidad de esta investigacin radica en buscar fuentes orgnicas capaces

de producir complejos amilolticos para hidrlisis del almidn con el fin de mejorar
el desarrollo de este proceso.

3. Marco terico y estado del arte:

3.1 Antecedentes

Mundialmente, la produccin de enzimas esta desarrollndose aun ms, bajo el

principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicacin de
esta industria gira en torno a pases industrializados que tienen la capacidad de
investigar y producir a gran escala estas protenas, lo cual margina a pases
menos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrollo
en el campo biotecnolgico. Sin embargo, esta afirmacin no ha sido un
impedimento para que en diversos lugares del mundo se investigue en el rea de
la enzimologa y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reacciones
qumicas.

Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influencia
directa en la degradacin del almidn, uno de los productos alimentarios mas
explotados a nivel mundial.

Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp., aislado de

semillas de lentejas3. Este proyecto se llevo a cabo en Bogot - Colombia y su
objetivo fue aislar microorganismos productores de amilasas para producir
enzimas hidrolticas del almidn. El agente productor detectado fue una cepa del
3
CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIEROS Y. Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus
sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogot
Colombia. www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.

5
genero Aspergillus sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este
microorganismo fue llevado a medio de cultivo en agar YPD bajo parmetros
especficos de incubacin. Luego de 18 das se realizo cambio de sustrato a
salvado de trigo y se llevo a cabo pruebas de Lugol, medicin de actividad
enzimtica y extraccin del complejo enzimtico. Los resultados indican que las
amilasas presentes en el complejo enzimtico obtenido del cultivo de Aspergillus
sp., sobre salvado de trigo, fueron activas en el desdoblamiento de la molcula de
almidn a pH 5.0 y temperatura de 37C demostrando su carcter dbilmente
cido y su proveniencia mesfila. El equivalente de dextrosa como medida
cuantitativa de la hidrlisis del polisacrido fue de 6.5, evidenciando la capacidad
enzimtica amiloltica del complejo enzimtico obtenido. En este trabajo se
confirm teora antes mencionada y la capacidad de hongos del gnero
Aspergillus sp., para la produccin de amilasas.

Produccin de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en

cultivos de aguas de lavado de dos empresas alimentarias 4. El objeto de este
proyecto fue de analizar la produccin de enzimas amilasas por cepas de
Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y crnicas para
determinar la capacidad de produccin de proteasas, amilasa y de depuracin de
medio donde crecen. La metodologa aplicada se baso en la creacin de un medio
de cultivo de aguas de lavado con aplicacin de nutrientes que mejoren la
adaptacin del agente. Se implement pruebas de azucares, niveles de nitrgeno
y fosforo y demanda qumica de oxigeno (DQO). Se analizaron los parmetros de
produccin de enzima, pH, temperatura y concentracin de iones. Los resultaron
indican que los niveles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente
dependientes de la concentracin inicial de almidn en el medio de cultivo. Las
fuentes de nitrgeno (peptona, aminocidos y extracto de levadura) fueron

4
SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by
Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal
of Food Engineering.

6
totalmente influyentes en la produccin de enzimas. El pH ptimo encontrado fue
de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50C.

Produccin de amilasas de levaduras floculantes 5. Este proyecto desarrollado

en Pakistn se destino en la consecucin de seis especies de levaduras
productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de produccin bajo el medio de
cultivo agar almidn y como fuente de carbono se agrego extracto de levadura,
almidn y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio estuvo
contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptacin del
microorganismo incubado a una temperatura de 25C., se realizaron pruebas de
produccin de enzima, degradacin de sustrato, turbidimetra y velocidad de
crecimiento. Del la metodologa ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura
correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabaj con saliva
humana, produciendo 28 U/ml, la cual present una estabilidad en el rango de 25-
60C. Los niveles de las dems cepas fueron muy inferiores al registrado
anteriormente.

Detergente con formulacin enzimtica de amilasa obtenida de Aspergillus

niger. Un estudio comparativo en detergentes comerciales 6. El proyecto
manifiesta una problemtica de la necesidad de compuestos naturales y eficaces
para la industria de detergentes. El presente articulo describe la produccin,
purificacin y parcial caracterizacin de un complejo de amilasa producido por A.
niger y uso potencial en formulacin de detergentes. Se diseo un cultivo con
distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que mejor resultados
otorgar en cuanto a produccin de amilasa se refiere. Se trabajo con medio APM
usando residuos industriales de protena de soy y almidn como fuente de
carbono adems de minerales. Se realizaron ensayos analticos con pruebas de
5
NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pakistan Journal of Biological
Sciences. 2003
6
MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene. Enzymatic detergent
formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent
formulations. Bioresource technology. 19 de agosto de 2005.

7
DNS, iodometra y control de los parmetros de pH y temperatura. El extracto
obtenido del complejo enzimtico fue comparado en tres formulaciones
comerciales de detergentes para determinar su actividad de limpieza en
equipos de hospitales, ciruga y endoscopia. Los resultados indicaron
que el microorganismos con mejor performance en la produccin de
amilasa fue el Aspergillus niger con una produccin de 3.9 U/ml en
medio sumergido y una actividad excelente de degradacin de en el
rango de 50-55C y un pH de 4.0.

3.2 Enzima amilasa: Accin y clasificacin

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan molculas de almidn dando como
productos dextrinas y polmeros compuestos progresivamente por unidades de
glucosa7 Esta familia de enzimas hidrolticas esta compuesta por a protenas
catalticas: alfa-amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran
ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy
importante en la degradacin del almidn en la germinacin de las semillas; en
tejidos animales, cumpliendo una misin digestiva; y en diversas especies de
microorganismos como hongos y bacterias8.

Como bien es conocido las cadenas de almidn estn compuestas por dos
grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por
atacar los enlaces 1,4-alfa-glicosdicos en el centro de la cadena de los
polisacridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa,
maltosa y oligosacridos.

7
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P
950
8
TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind.
apha- amylase of mung bean (vigna radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby
homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry. p. 1623.

8
La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y
pequeos compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de
degradar parcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz de
desdoblar los enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificacin
de la cadena del polisacrido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas
y bacterias, tambin cumple la funcin de degradar los enlaces 1,4-a-glucosdicos
pero comienza su accin por el extremo libre no reductor del almidn, liberando
maltosa al igual que la enzima alfa-amilasa. La hidrlisis se detiene en los puntos
de ramificacin de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina lmite. La
pululanasa o isoamilasa, tambin perteneciente a la esta familia, hidroliza los
enlaces 1,6-alfa-glicosdicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas.
Si existe un acompaamiento general del complejo de las amilasas se puede
lograr efectiva una degradacin total del almidn. 9

En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmente

se reconoce a la comisin enzimologica (E.C.) quien es el encargado de identificar
a todas y cada una de las enzimas existentes. Este instituto reconoce la enzima
alfa-Amilasa como E.C. 3.2.1.1. Su nombre sistemtico es alfa-1,4-glucan-4-
glucanohidrolasa. Otros nombres comunes en el comercio y el mbito cientfico
son glucogenasa y endoamilasa. Estas se caracterizan en llevar a cabo la reaccin
de endohidrlisis que se sita de los enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos en
polisacridos que contienen 3 o ms enlaces 1,4-alfa-D-glucosidicos. Los grupos
reducidos son liberados en una configuracin alfa. Este termino alfa, esta
relacionado con la configuracin anomrica inicial de los grupos de azucares
liberados10.

9
CARRILLO Leonor. Microbiologa Agrcola. 2003.Universidad Nacional de Salta. ISBN 987-9381-16-5
10
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

9
-amilasa bacteriana (EC 3.2.1.1). La -amilasa hidroliza el enlace glucosdicos
interno dando lugar a productos de bajo peso molecular, solubles y menos
viscosos, cuya ruptura est limitada por la presencia de los enlaces glucosdicos
a-1-6 en los puntos de ramificacin de la molcula del almidn nativo
(amilopectina). Los productos de hidrlisis tienen configuracin a en la glucosa del
extremo reductor. Se piensa que la enzima acta por la accin combinada de los
grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las a-amilasas obtenidas de Bacillus
subtilis var amyioliqtedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado por
molcula, que es necesario para la actividad de! enzima y que lo estabiliza en gran
medida frente a! calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de
dos horas a 85 C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilizacin de cido
clorhdrico que produce excesivos compuestos coloreados y la formacin de
productos de reversin. Debido a que los almidones de patata y de cereales
cerosos no pueden tratarse por gelatinizacin, se les somete a un proceso en dos
etapas, en el que se aade una segunda dosis de enzima y se contina et
tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa 11.

La enzima Beta-amilasa es reconocida en la comisin enzimolgica como E.C.

3.2.1.2., su nombre sistemtico corresponde al de 1,4-alfa-D-glucan
maltohidrolasa. Su funcin es actuar en la reaccin de hidrlisis de los enlaces
alfa-1,4-glucosidicos del almidn con inversin en la configuracin del carbono 1
pasndolo de la configuracin alfa a la beta; as como de remover las unidades de
maltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadena
polisacrida. Los grupos sulfihidrilos son esenciales para la actividad, por lo que la
enzima se inactiva por oxidacin, por los metales pesados y sus sales. 12
. Su
producto es beta-maltosa.

11
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985.
p.319

12
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11.

10
Beta-amilasa ha sido descrita como una protena abundante la cual se puede
encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de almacenamiento de almidn y
rganos de plantas13. Muchos Cereales contienen tambin la enzima beta-amilasa
y alfa-amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupa
aproximadamente 30% de contenido total de protenas sintetizadas durante la
germinacin. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el
punto de inactivacin que presentan a un pH determinado. La enzima alfa-amilasa
es inactivada a un pH en el rango de 4.8 - 5.0. Mientras que a este mismo rango la
beta-amilasa es estable. La enzima E.C. 3.2.1.2., es inactivada en un pH alrededor
de 6.0-7.0, y en caso reciproco las alfa-amilasa son estables bajo estas
condiciones14.

Otra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la Glucoamilasa tambin

reconocida como amiloglucosidasa. En la nomenclatura internacional esta
identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemtico es 1,4-alfa-D-glucano
glucohidrolasa. Su funcin es actuar en la reaccin de hidrlisis en cadenas de
polisacridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que estn de manera
residual despus de haberse expuesto la cadena a la accin de alfa y beta
amilasa15. El principal producto final de la accin de la glucoamilasa sobre el
almidn es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas. La
enzima tambin produce pequeas cantidades de oligosacridos. La sacarificacin
del almidn puede alcanzar hasta 96% de dextrosa. La accin de la enzima causa
inversin de la configuracin, produciendo beta-glucosa. Las glucoamilasas son
13
OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz; MAINARDI Janana A.;
PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase expression and starch degradation during banana
ripening. 10 de noviembre de 2005. Posthaverst Biology and Technology. p 41
14
OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative studies on a-amylases from
malted maize (Zea mays),millet (Eleusine coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006.
Carbohyfrates Polymers. P 72.
15
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

11
inactivas sobre almidn nativo. Su actividad es mxima entre pH 4 y 5.5, y
temperatura alrededor de 55-65 0C. La rata de reaccin cae rpidamente a
medida que disminuye el tamao de la molcula de sustrato, siendo mxima sobre
almidones previamente sometidos a licuefaccin 16.

Amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3). Las amiloglucosidasas (glucoamilasa, a-amilasa o

a-1-4 glucohidrolasa) catalizan la etapa de hidrlisis de los enlaces -1-4 del
almidn y los oligosacridos, liberando molculas de -glucosa a partir del
extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados -1-4 tambin se
hidrolizan, pero mucho mas lentamente, formndose un jarabe de glucosa, un
contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosac-
ridos grandes. El enzima es capaz de hidrolizar tambin, aunque lentamente, los
enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para
obtener glucosa pura slida. La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la in-
dustria de procesado del almidn en tanques discontinuos a 55-60 C y pH de 4,5
y con perodos de incubacin de 48-92 horas, para transformar las dextrinas
formadas por la a-amilasa en glucosa. El calcio la estabiliza frente a la desna-
turalizacin por el calor o los lcalis, y la hidrlisis puede llevarse a cabo fcil-
mente aadiendo el enzima soluble al almidn una vez que la a-amilasa ha rea-
lizado del 15 al 30 % de la hidrlisis posible 17.

Una ventaja particular en el uso de enzimas en lugar de HCl para la hidrlisis del
almidn es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las
protenas contaminantes no se hidrolizan hasta aminocidos, que podran dar
lugar a reacciones de pardeamiento. Despus de la sacarificacin con
amiloglucosidasa, el jarabe resultante se filtra para eliminar protenas y grasas y

16
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 11

17
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985. p.320

12
se purifica con columnas de carbn activo seguido de otras con resinas de
intercambio inico.

La glucoamilasa es un enzima extracelular producido por diversas especies de

Aspergillus o Rhizopus. La amilogluosidasa de Rhizopus puede separarse en
isoenzimas con propiedades semejantes a los isoenzimas de A. niger. El enzima
es una glicoprotena que contiene maosa, glucosa, galactosa y cido urnico, y
tiene un pH ptimo de 4,3-4,5. Una de sus desventajas es su relativa falta de
actividad frente a los enlaces -1-6, lo que hace necesario el uso de grandes dosis
o de grandes perodos de incubacin para lograr el grado de hidrlisis deseado.
Por tanto, se ha propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzima
desramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de dextrosa del 1 al 2
%, a pesar de llevar a cabo la reaccin a pH 5,5-6,0, en el que la amiloglucosidasa
es menos activa18.

El resto de la cadena del polisacrido es atacado por la enzima isoamilasa o

pululasa, reconocida oficialmente como E.C. 3.2.1.68. Participa en la reaccin de
hidrlisis de polisacridos especficamente en los enlaces 1,6-alfa-D-glucosidicos;
su nombre sistemtico es glucgeno alfa-1,6-glucoanohidrolasa. Su actuar es
directamente sobre la amilopectina, glucgeno y dextrinas, pero es incapaz de
hidrolizar el pululano y las alfa-dextrinas limite. Su misin en participar en la
reaccin de hidrlisis de ramificacin que contengan enlaces 1,6-alfa-glucosidicos
por lo que tambin se le conoce como enzimas desramificadora. Su nombre
sistemtico es glucgeno 1,6-alfa-D-glucanohidrolasa 19. El nico producto de
reaccin es maltosa. La temperatura ptima est alrededor de 45 0C y el pH entre
4y5

18
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985.
p.320
19
IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea]. <http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>.
[consultado el 10 de febrero de 2008]

13
3.3 Usos y aplicacin de las enzimas

Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos,
a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de
trabajo). Adems, lograr ms material procesado con el mismo equipo y menos
consumo de energa tambin ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria
alimentaria nos ofrece la ventaja de:
Reducir viscosidad (hidrlisis).
Mejorar extracciones (degradacin de pectina).
Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).
Causar separaciones (separacin del suero en queso).
Sustitucin de ingredientes y coadyuvantes en procesos.
Ahorro con procesos ms eficientes obteniendo menos subproductos
indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de
producto.
Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto nico
(jarabe de alta concentracin de fructosa).20

Las enzimas amilasas por su capacidad hidroltica han tenido gran significancia en
las ltimas dcadas en diversas industrias que han visto una mejor manera de
optimizar sus procesos aplicando tcnicas biotecnolgica extensivas basadas en
enzimas. Industrias como la panadera, repostera, alimentaria, textilera,
cervecera, papel, azucarera entre muchas ms han visto en estas protenas una
gran oportunidad de comercio. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el
mercado enzimtico llegando a sustituir completamente procesos de hidrolisis
qumica en la industria del almidn. Esto se debe a una caracterstica esencial
dentro de esta familia de protenas. La termoestabilidad de esta enzima,
industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos
procesos.21
20
MUNDO ALIMENTARIO. Aplicacin de las enzimas en la produccin industrial. Consultado en:
http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.pdf. [consultado:10 de febrero
de 2008]
21
ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-amylase from a moderately
thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Enginnering. P

14
3.4 Procesos industriales que aplican enzimas22

3.4.1 Industria del almidn y del azcar. Dependiendo de las enzimas

utilizadas, a partir del almidn se pueden obtener jarabes de diferente composicin
y propiedades fsicas. Los jarabes se utilizan en una variedad de alimentos tales
como gaseosas, dulces, productos horneados, helados, salsas, alimentos para
bebs, frutas enlatadas, conservas. Hay tres etapas bsicas en la conversin
enzimtica del almidn: licuefaccin, sacarificacin e isomerizacin.

3.4.2 Productos Lcteos. La aplicacin de enzimas en el procesamiento de

leche est bien establecida, por el uso del cuajo (quimosina) en la produccin de
queso, que tal vez representa el empleo ms antiguo de enzimas en alimentos.
Otras enzimas que participan en la produccin de quesos son las lipasas
presentes en la leche, las cuales hidrolizan el componente graso, proporcionando
cambios caractersticos en el sabor. Para algunos quesos se pueden aumentar las
lipasas naturales, aadiendo enzima extra. Por otra parte, tambin se recomienda
agregar enzimas exgenas de tipo proteoltico para acelerar el proceso de
maduracin de algunos quesos.
3.4.3 Molineros y Panadera. El uso de enzimas en estas industrias se debe
principalmente a la deficiencia en el trigo y en la harina, de las enzimas
naturalmente presentes. El contenido de a amilasa de la harina depende de las
condiciones de crecimiento y de cosecha. En climas hmedos la tendencia ser a
tener alta actividad de a amilasa debido a germinacin de los granos, en tanto que
en climas secos el nivel de a amilasa ser bajo debido a escasa germinacin. Esto
conlleva a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes de
harina.

950.
22
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 13

15
3.4.4 Transformacin del almidn. 23Los procesos encaminados a la produccin
de edulcorantes estn basados en la degradacin del almidn y han sido
empleados durante muchos aos, aunque originalmente se llevaba a cabo
mediante hidrlisis catalizada por cidos. Durante el curso del desarrollo y la
expansin de la transformacin industrial del almidn, se ha producido un cambio
de la catlisis acida por el uso de enzimas. La elevada especificidad de estas
reacciones enzimticas, acopladas con la gran actividad de las preparaciones
disponibles, ha permitido directamente el que pueda ser incrementada y adems
la formacin de derivados indeseables se ha minimizado.

De todas las aplicaciones a escala industrial, la ms afortunada es la produccin

de jarabe de maz con fructosa elevada (HFCS). El propsito de este proceso es
obtener un material de poder edulcorante semejante a la sacarosa a partir de una
materia prima de bajo precio (almidn de maz). Esta conversin requiere el uso
secuencial de tres enzimas. En primer lugar, el almidn (un polmero de la D-
glucosa) se degrada parcialmente, empleando alfa-amilasa microbial. Este
material es degradado posteriormente para rendir una solucin donde el
carbohidrato presente est en forma de D-glucosa en una concentracin del 94-96
%. La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentacin y
farmacuticas, pero su uso est restringido debido a su solubilidad limitada a
concentraciones elevadas y a su bajo poder edulcorante comparado al de la
sacarosa. Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una
mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosa
ismerasasa.

3.4.5 Productoras de Jugos de Frutas.24 Las primeras enzimas empleadas en

las industrias de jugos de frutas fueron las enzimas pcticas para la clarificacin

23
GACESA, Peter; HUBBLE, John. Tecnologia de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza-
Espaa. 1990. p.111
24
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

16
del jugo de manzana. Actualmente las enzimas pcticas se usan en el
procesamiento de muchas otras frutas, junto con amilasas y celulasas. Durante el
procesamiento de los jugos cuando se desintegran los tejidos vegetales, parte de
la pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solucin,
parte se satura con el jugo y parte permanece en las paredes celulares. Las
enzimas pcticas se usan para facilitar el prensado, la extraccin del jugo y la
clarificacin ayudando a la separacin del precipitado floculante.

3.4.6 Fermentacin Alcohlica25 El almidn proveniente de maz, patatas,

cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento previo con
hidrolasas, con objeto de producir su licuacin y sacarificacin, antes de hacerlo
fermentar mediante levaduras u otros organismos para obtener alcohol utilizable.
Estas enzimas son y amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse en
forma de malta (cebada germinada), aunque este proceso es caro. La malla no
slo contiene y amilasas sino tambin enzimas que degradan los enlaces -1-
6 de las dextrinas limite. Recientemente se han aadido enzimas bacterianas para
suplementar las enzimas endgenas asociadas con el almidn. Por ejemplo, en
los procesos discontinuos americanos para la produccin de alcohol para bebidas,
la adicin de a-amilasa bacteriana durante la coccin para hidrolizar parcialmente
el almidn gelatinizado representa una ventaja, puesto que reduce la viscosidad
de la mezcla facilitando su agitacin y mezclado. Posteriormente, la mezcla se
enfra y despus se aade a-amilasa bacteriana para continuar la hidrlisis, que se
completa mediante la adicin de amiloglucosidasa. Despus se inoculan en la
mezcla levaduras, de forma que contine la sacarificacin y fermentacin
simultneamente hasta el agotamiento de la dextrosa, y se destila el alcohol. La
produccin comercial de alcohol industrial, destinado a usarse como carburante en
motores de combustin interna se ha incrementado rpidamente en las ltimas
dcadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentacin de !a caa
de azcar o de la yuca. Tambin se ha propuesto el empleo de clulas

25
WISEMAN, John. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza Espaa. 1985. p.
335.

17
inmovilizadas. Se ha obtenido etanol a partir de melazas de caa diluidas, no
estriles, durante medio ao.

3.4.7 Industria Cervecera. La cebada se utiliza tradicionalmente para la

fabricacin de bebidas alcohlicas como la cerveza. En su produccin se deben
considerar dos operaciones distintas: la maltera y la cervecera. La preparacin
de la malta se logra por germinacin de la cebada, durante la cual se incrementa
el contenido de alfa-amilasa. Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmente
presentes en el grano actan sobre el almidn produciendo dextrinas y maltosa,
que sirven como sustratos para la fermentacin posterior. La sacarosa es
hidrolizada por al enzima invertasa la cual queda divida en una molcula de
glucosa y una molcula de fructosa, ambas podran ser asimiladas de forma
glucolitica. Tambin las enzimas cumplen la funcin de transportar la maltosa y la
maltotriosa a las clulas de las levaduras para posteriormente ser convertidas en
glucosa por la maltasa26.

Otra aplicacin patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el uso

de la enzima -acetolactato descarboxilasa, aislada de Enterobacter aerogenes.
Esta protena es capaza de desintegrar o eliminar el -acetolactato y -
acetohidroxibutirato de la cerveza recin fermentada en 24 horas a 10 C para de
este modo conseguir niveles de Diacetilo y 2,3-Pentanodiona por debajo de los
umbrales permitidos para productos de este tipo. Se consigue con ello grandes
ahorros.27

Hay muchas enzimas disponibles comercialmente para el proceso cervecero, pero

todas ellas caen en tres categoras: proteasas, amilasas y glucanasas. La accin

26
CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en lnea] dsiponible en www.revistavirtualpro.com.
consultado 05 de noviembre de 2007.
27
CASTAE,F.X.; DAMM, S.A.. Los tanques cilindro.-conicos y el tiempo de guarda de la cervzeza. Industria
cervecera. [en linea]. Disponible en www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.

18
de estas enzimas durante las primeras etapas consiste en mejorar la licuefaccin
del almidn, regular el contenido de azcar y nitrgeno, mejorar la extraccin,
facilitar la filtracin y controlar la turbidez. En la filtracin del mosto reduccin de
las gomas y de la viscosidad. En la ebullicin, control de la turbidez, eliminacin
final del almidn. En esta etapa se inactivan las enzimas. Durante la fermentacin
y maduracin la adicin de enzimas sirve para controlar la turbidez.

3.4.8 Procesamiento de Carne. Las enzimas importantes para ablandar carne

son proteasas de origen vegetal o de microorganismos (Bacillus subtilis y
Aspergillus oryzae). Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o se
trata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un franco
ablandamiento sin provocar una protelisis importante.

3.4.9 Industrias de Grasas y Aceites.28 El uso de enzimas en las industrias de

aceites y grasas es muy bajo, aunque se encuentran disponibles enzimas que
pueden resolver algunos problemas, por ejemplo minimizar los subproductos
indeseables. Las enzimas tambin se pueden usar para producir aceites y grasas
novedosas. Lipasas especficas, pueden seleccionar los cidos grasos de algunas
posiciones del triglicrido, para incorporar determinados cidos grasos, sin
cambiar los de otras posiciones. De tal manera que es posible modificar por
interesterificacin el contenido de cidos grasos, o por transesterificacin lograr el
reordenamiento de algunos de ellos. Por ejemplo la mantequilla de cacao se
requiere en la produccin de chocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costo
fluctan ampliamente. Sin embargo, aceites como el de palma son baratos y se
encuentra buen abastecimiento. Lo que se plantea es modificar el aceite de palma
por reaccin con cido esterico mediante interesterificacin enzimtica. La grasa
resultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao .

3.5 Produccin y sustrato

28
CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de febrero de 2003. Revista de
biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial. p 14

19
Fuentes de enzimas. Las clulas microbianas son la fuente usual de enzimas
para uso industrial excepto para algunos enzimas provenientes de animales y
plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papana, ficina y
bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina,
empleada en la manufactura del queso. La inmensa mayora de los enzimas
microbianos se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendo
una docena de hongos, pero se ha calculado que slo aproximadamente el 2 ^o
de los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiados como fuente
de enzimas29.

Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (lipasa

pancretica y tripsina) debido a que stas pueden ser reemplazadas por otras
similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos,
aunque catalticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades
que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicacin. Los recientes avances en
este campo han permitido la adaptacin de las tcnicas del ADN recombinante
para posibilitar que ciertos genes de mamferos sean clonados en las bacterias o
levaduras idneas, facilitando as la produccin de enzimas originariamente de
animales por medio de la tecnologa convencional de la fermentacin.

Las plantas tambin han sido fuente tradicional de un cierto nmero de enzimas. A
partir del ltex producido por la papaya, higuera, pia y, en menor grado, otras
especies se ha aislado sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la
ventaja de que su ltex es fcil de obtener, principalmente a partir de los frutos y
utilizando mano de obra no cualificada.

29
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia, Zaragoza - Espaa. 1985.
p.281

20
Las enzimas microbianas son ms tiles que los derivados de las plantas o
animales por la gran variedad de actividades catalticas de que disponen, y porque
usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de forma
regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante cultivo de superficie o
usualmente mediante tcnicas de fermentacin aerbica de cultivos profundos,
tcnica muy utilizada en la produccin de antibiticos. Adems los enzimas
microbianos son en general ms estables que los homlogos de las plantas o
animales, y su proceso de produccin es ms fcil y seguro que el seguido con
plantas y animales. La manipulacin gentica y ambiental para incrementar el
rendimiento, o la actividad enzimtica de las clulas haciendo a ste de inters
constitutivo30. Estas tcnicas son especialmente importantes en el caso de la
actividad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en conversiones
multienzimas, cuando haya que eliminar los controles de regulacin normales en
la sntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la inhibicin
por el substrato o el producto, mecanismo este ltimo para prevenir la
sobreproduccin del producto de una va metablica, o para obtener algunas otras
caractersticas favorables31.

Generalmente el objetivo es maximizar la velocidad de formacin del enzima y la

concentracin de enzima en las clulas o en el caldo de fermentacin para
minimizar los costos de produccin de la enzima. El ideal es combinar de forma
ptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperacin
y fermentacin y el equipo ms apropiado en buenas condiciones de trabajo.
Usualmente, las clulas crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados y
aireados, aunque un nmero significativo de enzimas importantes industrialmente
se obtienen en fermentadores slidos o semislidos, entre los que se incluyen la

30
GACESA, Peter; HUBBLE, John; Tecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza
Espaa. 1990. p.16.
31
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza
Espaa. p.281

21
lactasa, la a-amilasa y una proteasa de A. oryzae, la pectinasa, una proteasa de
A. niger, la a-amilasa de Rhizopus, y el cuajo de Mucor pusius32.

Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas

para usos clnicos e industriales, y acumulan productos de desecho en las
vacuolas. Estos compuestos son frecuentemente inhibidores enzimticos y/o to-
xinas, particularmente cuando se oxidan al contacto con el aire. Estos desechos,
muchos de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la clula, contaminando
y frecuentemente inactivando cualquier enzima extrado.

Las hidrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales. Dentro de

ellas podemos encontrar las enzimas alfa-amilasa, beta-amilasa como las ms
comunes para las sntesis del almidn produciendo productos de bajo peso
molcula. Estas enzimas son producidas, especialmente alfa-amilasa, por gran
diversidad de microorganismos, Producen amilasas muchos hongos del suelo as
como bacterias de los gneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras.

El principal genero que esta siendo tratado para la produccin de dicha enzima es
el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este genero
son el Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus
amyloliquefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos,
textiles, fermentacin, papelera entre otros 33.

Tambin otros gneros han sido reportados en proyectos de investigacin. La

especie Aspergillus produce una amplia variedad de enzimas extracelulares entre

32
WISEMAN, John. Manual de biotecnologia de las enzimas. Editorial acribia, Zaragoza
Espaa. 1985. p.282
33
ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by bacillus subtitulis in complex organic
substrates.20 de diciembre de 2005. Bioresource Technology..p 150.

22
las cuales adems de estar las amilasas se puede identificar las proteasas.
Aspergillus rizhopus esta identificado como un gran productor de enzimas 34.

La induccin de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa-
1,4 glucosdicos, adems de maltosa, dextrina y almidn. La Glucosa, as como es
el producto final de la hidrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la sntesis de
enzima como un mecanismo conocido como represin catabolitica. Sin embargo,
se ha encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienen
como fuente de carbono a los carbohidratos no inducen la produccin de
amilasas35. Este hecho contrasta con los registrados en artculos de investigacin
y compaas dedicadas a la produccin de enzimas donde la fuente de produccin
de las protenas son microorganismos.

La produccin industrial ha desarrollado tcnicas de aprovechamiento de recursos

o residuos de produccin de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimas
utilizando sustratos de bajo costo, as como los desechos agrcolas. En aos
recientes, se ha presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicacin eficiente
del bagazo de caa de azcar como medio de produccin. Este es un subproducto
agroindustrial de extensa cadenas celulsicas. Esta es una importante fuente de
carbono que ha sido empleada en los ltimos aos para la produccin de enzimas
y a su ves la fermentacin de azucares para la elaboracin de etanol. Se ha
identificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio y
sintetizar alfa-amilasa es el Bacillus subtilis36.

34
SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R, Renato. Amylase production by
Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal
of Food Engineering. p 94.

35
NAHAS Ely, WALDEMARIN Mirela M.; Control of amylase production and growth characteristics of
Aspergillus ochraceus . revista latinoamericana de microbiologia. Vol #1. Enero de 2002. p.5
36
RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production from catabolite derepressed
Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource
Techonology. p.2

23
Los medios de cultivo han facilitado para los microorganismos el desarrollo de
enzimas con propiedades fsico-qumicas muy deseables. La produccin de alfa-
amilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientos
de fermentacin. La concentracin de metabolitos para el crecimiento de los
agentes microbiales es importante. Influye directamente la composicin del medio
as como las fuentes de carbono, de nitrgeno y el contenido de sales
inorgnicas37.

En cuanto a trminos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar la

produccin de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se ha
demostrado que la temperatura esta ligada directamente a la velocidad de
reaccin de la enzima, menor viscosidad en el sustrato y disminucin de la
contaminacin microbiana. Los microorganismos apropiados para la produccin de
enzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento,
adaptacin a nutrientes relativamente baratos y sin necesidad de inductores.
Adems, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea fcil
aislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formacin concomitante
de metabolitos txicos o inmunognicos38.

Tambin puede ser una estrategia til la de seleccionar cepas que hiperproduzcan
enzimas a partir de organismos genticamente modificados OMG que no tengan
necesidad de inductores debido a que sus centros represores estn inactivos, a
que tienen una baja represin por los catabolitos, a que sufren retroinhibicin o a
que tienen enzimas relativamente resistentes a la inhibicin por el producto final.
De hecho, a pesar de los enormes avances obtenidos recientemente en el campo
de la ingeniera gentica, las tcnicas clsicas de seleccin de enzimas son
37
DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z. BENNAMOUN L..Application of a
statistical design to the optimization of culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC
16404 grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food Engineering. p 191

38
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza- Espaa. 1985. P.271

24
todava muy productivas, particularmente cuando se estudian ambientes nuevos
y/o exticos, para buscar clulas microbianas que desarrollen enzimas con
propiedades exepcionales. Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos a
partir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nuevo azcar, la
isomatulosa, de forma muy productiva a partir de una bacteria patgena del
ruibarbo. Muy recientemente se han hecho descubrimientos ms excepcionales si
cabe, por ejemplo, los microorganismos que crecen a unos 250 C en fuentes
volcnicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas extremadamente
estables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora la
madera, que es capaz de degradar la celulosa y de fijar el nitrgeno 39.

En resumen, la mayora de los enzimas empleados comnmente en la industria

son de origen microbiano y se producen por fermentacin sumergida aerobia
convencional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento que
la fermentacin en estado slido. Se sabe mucho acerca de la seleccin de cepas
de organismos y condiciones de cultivo, aunque menos sobre la regulacin de la
sntesis, degradacin y secrecin de la enzima por el organismo productor. Estas
enzimas son con frecuencia extracelulares, lo que facilita su aislamiento y
purificacin.

4. Objetivos

4.1 General

Obtener amilasa microbiana por fermentacin lquido para aplicacin en procesos

agroindustriales de alcohol carburante a base de almidones.

4.2 Especficos
39
WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza- Espaa. 1985. P.272

25
 Identificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante tcnicas
de aislamiento microbiolgicas

Determinar la cintica del crecimiento de los microorganismos aislados

mediante fermentacin en estado lquido.

Comparar la actividad del complejo enzimtico obtenido con respecto a la

actividad de una enzima comercial STARGEN 001.

5. Metodologa Propuesta:

5.1 Aislamiento e identificacin de los microorganismos

Los microorganismos sern obtenidos de chips de yuca expuestos a la intemperie

a contaminacin ambiental, por un tiempo de entre 10 a 15 das. Para ello se
realizaran chip con grosores comprendido entre 1 y 15 mm. Y se dispondrn en
bandejas. Una vez obtenido el o los microorganismos que estn ejerciendo un
proceso degradativo de los chips, se pasaran a una solucin con 10% de harina
de yuca, con agitacin constante a 120 rpm, durante 5 das, al cabo del cual se
realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los
microorganismos con mayor capacidad de degradacin, y se sembraran en medio
solido de YPS, para su purificacin e identificacin.

5.2.1 Medio Slido de YPS (Yeast Peptone Soluble starch) . 40. De acuerdo con
distintos microorganismos presentes en la solucin de yuca, se aislarn cada uno
de ellos de manera independiente y se colocaran en cajas de petri esterilizadas
sobre las que se servir medio microbiolgico YPS. Para descartar contaminacin
ambiental, se sembraran 2 blancos con 1 ml de agua destilada estril sobre medio
el mismo cultivo.

40
ABU ,E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase production by mixed culture of
Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of
Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.

26
5.2.2 Medio para fermentacin. Se preparan 700 ml, en un erlenmeyer de 1
Litro, de medio de cultivo YPS lquido. Conteniendo en (g/l): 0.5 de extracto de
levadura; KH2PO4, 10; (NH4)2SO4, 10.5; MgSO4 7H2O, 0.3; CaCl2, 0.5; FeSO4
7H2O, 0.013; MnSO4 7H2O, 0.004; ZnSO4 H2O, 0.004, CoCl 6H2O, 0.0067 y
harina de yuca al 1 10% como fuente de carbono, se Esterilizarn a 110C durante
15 minutos y se colocarn en agitacin orbital a 120 r.p.m por un periodo de 5
das.

El medio de cultivo para fomentacin ser inoculado con un complejo de dos

microorganismos aislados, utilizando 5 ml de solucin del complejo microbial.

5.2.3 Cuantificacin de Biomasa del complejo 41. Se har determinacin por el

mtodo de peso seco y el mtodo de protenas.

Peso Seco. Se tomaran una muestra de 3 ml cada 3 horas durante 5 das.

Las muestra de llevaran hasta peso seco constante en una estufa a 105
grados.

Determinacin de protenas42. Se tomara 3 ml de medio cada 3 horas. El

proceso se llevar a cabo realizando choque trmico y centrifugado de las
muestras durante 10 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante obtenido se le
determinara protenas totales por el mtodo de Biuret. Las muestras se
leern a una longitud de onda de 550 nm. Los datos obtenidos se
compararan con una curva patrn de BSA, para determinar la
concentracin de protenas presentes en la muestra.

41
KONSOULA Zoe, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES Maria. Co-production of a-amylase and b-
galactosidase by Bacillus subtilis in complex organic substrates. Bioresource
Technology. 20 de diciembre de 2005. p. 152
42
SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using Bacillus
licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28 de febrero de 2007.
p. 998

27
5.2.4 Medicin de producto43. Se tomarn 3 ml del medio de cultivo, cada 3
horas durante 5 das y se realizar prueba de azucares reductores con 3,5 acido
dinitrosaliclico, las lecturas se harn a 540 nm, para glucosa y a 520 nm para
maltosa, los datos obtenidos se comparan con curvas patrones de glucosa y
maltosa respectivamente.

5.2.5 Medicin de sustrato44. Se tomaran 3 ml de muestra de la fermentacin

cada 3 horas, a las cuales se le se agregan del reactivo yoduro-yodato y se
realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Los datos
se compararan con la curva estndar preparada con harina de yuca para
determinar la concentracin presente de sustrato en la muestra.

5.2.6 Curva de Calibracin para protena. Se harn determinaciones de

protenas partiendo de una protena conocida (Albmina del suero Bovino o BSA
de Sigma). Para ello se preparara una solucin estndar de BSA al 0,5 % y se
diluirn como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Diluciones para la construccin de la curva de calibracin para Biuret.

Se Tubos
1 2 3 4 5 6
Solucin (ml)
Biuret 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0
Solucin Estndar BSA 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
H2O 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
mezcla bien, y se deja reposar por 30 minutos, para leer en el a una . = 550 nm

43
ASGHER M., JAVAID M. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic
Bacillus subtilis strain for starch processing. Jornal Of Food Engineering. 29 de marzo de
2006. p.951
44
CHERRY H.M.; HOSSAIN Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase from the Isolate
Aspergillus fumigates. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2004. p. 1989.

28
5.2.7 Curva de Calibracin para Maltosa y Glucosa. Se establecer una curva
con D-Maltosa y otra con D-glucosa, para convertir las lecturas de absorbancia de
las muestras de fermentacin a unidades de actividad enzimtica de la amilasa,
es decir, la liberacin de un micromoles de azcar reductor, calculado como
maltosa o glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo (ver Tabla 4).

Tabla 4. Diluciones para la construccin de la curva de calibracin para Maltosa.

Tubos
1 2 3 4 5 6
Solucin (ml)
DNS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Solucin Estndar Maltosa o Glucosa al 0,5% 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
H2O 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

A las solucin de D-maltosa y D-glucosa se les adicionara DNS y se pondrn en

agua hirviendo por 5 minutos, se deja reposar, y se le agrega agua hasta
completar 10 ml segn la tabla, las lecturas se realizaran a = 520 nm para
maltosa y a 540 nm para glucosa

El complejo enzimticos obtenido en cada muestra en los diferentes das, se

leern a la misma longitud de onda que las curvas de calibracin. Para ello se
realizaran 3 repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas,
glucosas y protenas.

5.2.8 Cintica del complejo enzimtico. El comportamiento enzimtico del

complejo obtenido por la fermentacin lquida se comparara con el complejo
comercial de amilasa (stargen 001), determinando los factores que afectan la
accin cataltica del complejo de amilasas, analizndolos bajo un modelo
superficie de respuesta, con diseo compuesto central: 2^3 + principal, de
acuerdo con los niveles y factores mostrados en la tabla 5. Los datos obtenidos se
analizaran con el software estadstico Statgraphics versin 5.1

29
Tabla 5. Factores y niveles para evaluar la actividad enzimtica

Niveles
Factores Unidades
Inferior Superior
Dosis ml de caldo enzimtico/g de pulpa base seca 0.5 1.0
pH Adimensional 4 5.5
Temperatura C 30.0 50

6. Resultados Esperados

La base del estudio, anlisis, desarrollo y aplicacin de este proyecto es producir

un complejo de enzimas amilasas a partir de hongos, con el objeto de determinar
la aplicabilidad de dichas protenas en los procesos agroindustriales del
departamento. Este complejo servir como base para la planeacin de muchos
procedimientos industriales como la hidrlisis del almidn, el cual presenta
elevados costos en las empresas del departamento de Crdoba, especialmente
plantas de biocarburantes.

7. Estrategia Comunicacin:

Los resultados de este proyecto sern editados mediante formatos de informes o

trabajos de investigacin en revistas y ponencias en encuentros de investigacion.
Adems,

8. Estrategias con el medio

A travs de conferencias, foros y/o ponencias institucionales internas y/o externas,

es un medio apto para la promulgacin del objeto, mtodo, resultados y alcance
del estudio de este proyecto. Bajo este concepto, se desea divulgar el propsito de
llevar a cabo este proyecto y a su vez demostrar la realidad de los efectos que
traera consigo aplicarlo en escala industrial.

30
9. Cronograma de actividades

Tiempo Meses
Actividad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Recopilacin de bibliografa
Tajado de chips de yuca y seleccin
de lugar para contaminacin
microbial
Aislamiento e Identificacin de
microorganismos
Preparacin de los medios de
cultivo solido y liquido
Muestreo y anlisis del medio
Estudio de la cintica
Comparacin de cintica con
STARGEN 001
Interpretacin de los resultados
Publicacin de informe final

31
10. Bibliografa

ABU, E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase
production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae
grown on sorghum pomace. En: African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8),
pp. 785-790, August 2005

ASGHER M.; JAVAID M.; RAHMAN S.U; LEGGE R.L.; A thermostable a-

amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch
processing. 29 de marzo de 2006. Journal of Food Engineering.

CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en lnea] dsiponible
en www.revistavirtualpro.com. consultado 05 de noviembre de 2007.

CARRERA, Jorge; produccin y aplicacin de las enzimas industriales. 28 de

febrero de 2003. Revista de biotecnologa en el sector agropecuario y
agroindustrial.

CASTAE,F.X.; DAMM, S.A. Los tanques cilindro-cnicos y el tiempo de

guarda de la cerveza. Industria cervecera. [en linea]. Disponible en
www.revistavirtualpro.com. Consultado el 7 de agosto de 2007.

CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIEROS Y. Obtencin de amilasas

fngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. Consultado
en pagina oficial de Universidad Jorge Tadeo Lozano, Bogot Colombia.
www.utadeo.edu.co. Fecha de consulta:02 de marzo de 2008.

CHERRY H.M.; HOSSAIN, Towhid; ANWAR M.N. Extracellular Glucoamylase

from the Isolate Aspergillus fumigates. Pakistan Journal of Biological Sciences.
2004. p. 1989

DJEKRIF-DAKHMOUCHE S.; GHERIBI-AOULMI Z; MERAIHI Z.

BENNAMOUN L. Application of a statistical design to the optimization of
culture medium for a-amylase production by Aspergillus niger ATCC 16404
grown on orange waste power. 11 de marzo de 2005. Journal of Food
Engineering.

NAHVI, Iraj; EMTIAZI, Giti . Production of " Amylase by Flocculant Yeast.

Pakistan Journal of Biological Sciences. 2003

32
 IUBMB, Enzyme Nomenclature. [en lnea].
<http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/2.html>. [consultado el
10 de febrero de 2008]

MISKEVICH F.; Cochran, B.; Lunday, D. Quantitative Analysis of Amylase

Enzyme Kinetics. Consultado en < http://www.tamu-
commerce.edu/faculty/fmiskevich/>. [consultado:01 de marzo de 2008].

MITIDIERI, Sydnei; SOUZA, Anne; SCHRANK, Augusto, HENNING, Marilene.

Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A
comparative study with commercial detergent formulations. Bioresource
technology. 19 de agosto de 2005.

MUNDO ALIMENTARIO. Aplicacin de las enzimas en la produccin industrial.

Consultado en:
http://www.alimentariaonline.com/apadmin/img/upload/MA002_enzimas4WSF.
pdf. [consultado:10 de febrero de 2008]

OLIVEIRA Joao R; VIEIRA Adair; ZACZUK B. Priscila; CORDENUNSI Beatriz;

MAINARDI Janana A.; PURGATTO Eduardo; LAJOLO Franco. Beta-amylase
expression and starch degradation during banana ripening. 10 de noviembre
de 2005. Posthaverst Biology and Technology

OLUSANJO A. Isaac; NGACHI A. Edith; IHUOMA O. Florence. Comparative

studies on a-amylases from malted maize (Zea mays),millet (Eleusine
coracana) and Sorghum (Sorghum. 5 de mayo de 2006. Carbohyfrates
Polymers

RAJAGOPALAN Gobinath, KRISHNAN Chandraraj; a-Amylase production

from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane
bagasse hydrolysate 01 de junio de 2007. Bioresource Techonology.

RAMACHANDRAN Sumitra; PATEL Anil, MADHAVAN Kesavan; CHANDRAN

Sandhya. Alpha Amylase from a Fungal Culture Grown on Oil Cakes and Its
Properties. Brazilian archives of biology and techonology. Junio de 2004.

SALAS H, Mabel; RODRIGUEZ R, Marilu; PEREZ G., Manuel; PEREZ R,

Renato. Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on
two wastes from food industries. 05 de marzo de 2005. Journal of Food
Engineering.

33
 SHEWALE Satish D.; PANDIT Aniruddha B. Hydrolysis of soluble starch using
Bacillus licheniformis a-amylase immobilized on superporous CELBEADS. 28
de febrero de 2007

TRIPATHI Pallavi; LEGGIO, Leila; MANSFELD, Johanna; ULBRICH-

HOFMANN, Renate; Kayastha, Arvind. Alpha- amylase of mung bean (vigna
radiata) correlation of biochemical properties and terciary structureby
homology modelling. 23 de mayo de 2007. Phytochemistry

WISEMAN, Alan; Manual de biotecnologa de las enzimas. Editorial Acribia

S.A. Zaragoza- Espaa. 1985.

ZOE K, Maria. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by

bacillus subtitulis in complex organic substrates.20 de diciembre de 2005.
Bioresource Technology

11. Usuarios Directos e Indirectos

Entre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentran:

Plantas de alcohol carburante
Grupos y centros de investigaciones

12. Posibles Pares Evaluadores

Nombres y Cargo Institucin Telfono

Apellidos

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D. Presupuesto

Tabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION

FUENTES
RUBROS Facultad de Ingeniera Patrocinador TOTAL
Agroindustrial
PERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400
EQUIPO $ 1.480.000 $ 30.864.040 $ 32.344.040
MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841
VIAJES
BIBLIOGRAFIA *
SOFTWARE
PUBLICACIONES*
SERVICIOS TECNICOS
CONSTRUCCIONES
MANTENIMIENTO
ADMINISTRACION
OTROS*
TOTAL $ 47.196.281

Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS

RUBROS AO 1 AO 2 AO 3 TOTAL
PERSONAL $ 12.398.400 $ 12.398.400
EQUIPO $ 32.344.040 $ 32.344.040
MATERIALES $ 2.453.841 $ 2.453.841
VIAJES
BIBLIOGRAFIA
SOFTWARE
PUBLICACIONES
SERVICIOS TECNICOS
CONSTRUCCIONES
MANTENIMIENTO
ADMINISTRACION
OTROS
TOTAL $ 47.196.281

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 Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL

Participante DEDICACION DEDICACION RECURSOS(en pesos colombianos)

FORMACION FUNCION TOTAL
Nombre HORAS No. MESES FUENTE 1
Eder Durango
Ballesteros
MsC. Biotecnologa Investigador Principal 4. 12 Fac.de Ing. Agroindustrial $ 4.665.600
Alfonso Bautista
Jimnez
MsC. Microbiologa Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000
Esp, Ing. De
Ibeth Cepeda Jimnez
alimentos.
Coinvestigador 2. 5 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 972.000
Hctor Tobn Guzmn Ing. Agroindustrial Auxiliar 6. 12 Fac. de Ing. Agroindustrial $ 5.788.800
TOTAL $ 12.398.400

Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR

RECURSOS
EQUIPO JUSTIFICACION TOTAL
Patrocinador
Plancha de calentamiento marca schott - modelo slk2- con X
Preparacin de muestras y pruebas de anlisis
placa en cermica $ 620.000
Termmetro digital Censar temperatura de las muestras X $ 863.040
Espectrofotmetro Anlisis y determinacin de compuestos en muestra X $ 25.000.000
Nevera-congelador de 9 pies Conservacin de muestras X $ 700.000
Cronometro digital. Cassio modelo hs-3 Control de tiempo en las pruebas X $ 81.000
Agitador magnetico Homogenizacin y preparacin de medios X $ 2.100.000
Refractmetro digital porttil Medicin de alcohol X $ 1.500.000
TOTAL $ 30.864.040

Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR

UNIDAD(ES) A LA Horas de
Valor
EQUIPO JUSTIFICACION CUAL PERTENECE asignacin al Valor total
hora
EL EQUIPO proyecto
Agitador orbital Agitacin de los medios de cultivo Lab. De biotecnologa 8 $ 800.000
Centrfuga eba20 Separacin de slidos Lab. De biotecnologa 2 $ 280.000
pHmetro Medicin de ph de las muestras y soluciones Lab. De biotecnologa 1 $ 150.000
Balanza analitica Pesaje de reactivos para soluciones Lab. De biotecnologa 2 $ 250.000
TOTAL $ 1.480.000
Tabla 6. DESCRIPCIONDE LOS MATERIALES A UTILIZAR

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 RECURSOS
TOTAL
MATERIAL JUSTIFICACION Unidades
Patrocinador
Acadmicas
Erlenmeyer 250 ml Recipiente para cultivos $ 2.900,00 $ 2.900,00
Erlenmeyer 600 ml Recipiente para cultivos $ 4.060,00 $ 4.060,00
Erlenmeyer 1000 ml Recipiente para cultivos $ 348,00 $ 348,00
Transferpipetas de 100 a 1000 Control de muestras tomadas $ 2.320,00 $ 2.320,00
Preparacin de estndares para curvas
$ 389.760 $ 389.760
glucosa anhidra (500g) de calibracin
Preparacin de estndares para curvas
$ 121.800 $ 121.800
maltosa (100g) de calibracin
Preparacin de estndares para curvas
$ 136.787 $ 136.787
BSA (500G) de calibracin
Multiplicacin y aislamiento de
$ 206.480 $ 206.480
agar pda microorganismos
extracto de levadura (500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 215.667 $ 215.667
sulfato acido de potasio(250g) Suplemento para el medio de cultivo $ 275.500 $ 275.500
sulfato de magnesio heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 313.200 $ 313.200
sulfato de manganeso tetrahidratado(100g) Suplemento para el medio de cultivo $ 53.522 $ 53.522
sulfato de zinc monohidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 266.800 $ 266.800
sulfato de hierro heptahidratado(500g) Suplemento para el medio de cultivo $ 232.000 $ 232.000
cloruro de cobalto hexahidratado(125g) Suplemento para el medio de cultivo $ 143.376 $ 143.376
sulfato de amonio(1kg) Suplemento para el medio de cultivo $ 89.320 $ 89.320
TOTAL $ 2.453.841

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