Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

Ingeniera Bioqumica Industrial

INGENIERA ENZIMTICA

PROBLEMARIO

Dr. Sergio Huerta Ochoa

NOTA: Los ejercicios presentados en este problemario, son una recopilacin de problemas:
encontrados en internet en pginas de libre acceso y de otras Universidades e Instituciones,
y pretenden ser una herramienta para reforzar conceptos de cintica enzimtica.
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1. ECUACINDE MICHAELIS-MENTEN

Considera una enzima industrial importante, la cual cataliza la conversin de un

sustrato para formar un producto con un valor agregado mayor. La enzima sigue el
siguiente mecanismo:

Un anlisis inicial de las tasas de reaccin para la reaccin en solucin, con E0 = 0.10
M y varias concentraciones de sustrato S0, produce los siguientes parmetros de la
ecuacin de Michaelis-Menten:
Vmax = 0.60 M/s; KM = 80 M.

Un tipo de experimento diferente indica que la constante de la tasa de asociacin, k1,

es

k1 = 2.0 x 106 M-1s-1 (2.0 M-1s-1).

Estima el valor de k2 y k-1.

Solucin:
De la definicin de Vmax tenemos:
Vmax = k 2 [E 0 ]

Vmax 0.6 M/s

k2 = = = 6 s -1
[E0 ] 0.1 M
De la definicin de la constante de Michaelis-Menten, KM, tenemos:
k + k2
K M = 1
k1

( ) ( )
k 1 = K M k1 k 2 = (80 M ) 2 M 1s 1 6 s 1 = 154 s 1
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En experimentos de laboratorio, se utilizaron dos decarboxilasas (A y B) obtenidas de
diferente microorganismo (ver tabla). Decida cual enzima demuestra un mayor
coeficiente de especificidad, (Vmax/ Km), recuerde que entre mayor sea el valor del
coeficiente de especificidad ms especfica es la enzima por el substrato.

Enzima A Enzima B
[S] Velocidad [S] Velocidad
(mM) (M/min) (mM) (M/min)
0.0002 0.3373 0.005 0.3962
0.0002 0.3364 0.005 0.3857
0.0005 0.6945 0.01 0.6163
0.0005 0.6957 0.01 0.6413
0.001 1.0764 0.05 1.5606
0.001 1.1407 0.05 1.5689
0.005 1.9636 0.1 1.9862
0.005 1.7706 0.1 1.7909
0.01 2.0641 0.25 2.2011
0.01 2.0751 0.25 2.2047

Solucin:
3.5000
y = 0.5081x + 0.4224
R = 0.999 Vmax = 2.36719094 (M/min)
3.0000
KM = 1.20279143 (M)
2.5000

2.0000
-1
1.5000 Vmax/KM = 1.968 min

1.0000

0.5000

0.0000
0 2 4 6

3.0000
y = 10.814x + 0.4323
2.5000 R = 0.9967 Vmax = 2.31346294 (M/min)

KM = 25.0185663 (M)
2.0000

1.5000 -1
Vmax/KM = 0.092 min
1.0000

0.5000

0.0000
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
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La Enzima A es ms especfica

Para un experimento de una reaccin catalizada enzimticamente, se utiliz una

concentracin inicial de sustrato 20 M y una concentracin de enzima 5 nM,
obtenindose la siguiente curva de progreso:

Tiempo Sustrato
(min) (M)
0 20.00
2 18.32
4 16.64
6 14.97
8 13.30
10 11.63
12 9.96
14 8.31
16 6.66
18 5.02
20 3.40

Calcula la constante de especificidad, [=] (M min)-1 definida como:

k
= cat
KM
Solucin:

Utilizando la ecuacin

[S ]0 [S ] = K + V t
ln
[S ]0 M max
[S]
ln 0
[S ] [S ]
y transformando los datos para obtener los ejes adecuados
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ln(So/S) x y
0.087685 22.8089171 19.1482267
0.18369012 21.7758032 18.2705913
0.28974888 20.7075863 17.3632081
0.40819718 19.5983716 16.4210948
0.5422881 18.4403825 15.4376837
0.69674291 17.2229954 14.4040112
0.87878828 15.9310272 13.3072822
1.10030511 14.5414212 12.128099
1.38291271 13.0160059 10.8344243
1.77265446 11.2825147 9.36582479

25
(So-S)/[ln(So/S)]

20
15
10 y = 0.8488x - 0.2134
5
0
10 15 20 25
t/[ln(So/S)]

Vmax = 0.8488 M/min

Km = 0.2134 M
Vmax 0.8488M min 1
k cat = = = 169.76 min 1
[E ]t 0.005M
k cat 169.76 min 1
= = = 795.5M 1 min 1
KM 0.2134M

En un experimento se midi la tasa inicial de una reaccin enzimtica, v, a varias

concentraciones de substrato [S]. La concentracin de la enzima es 3 nM. Se grafic
[S]/v versus [S] y se observ una lnea recta en la cual el intercepto-y es 590.6 s y la
pendiente es 0.3684 s M-1. Cul es el valor de KM y el de Vmax para esta reaccin
enzimtica? Cul es el valor de kcat para esta enzima?

Solucin:
Se observa que se utiliz la ecuacin de Hanes-Woolf [S]/v
[S ] = 1 [S ] + K M
v Vmax Vmax
Los datos del problema son: KM/Vmax 1/Vmax
m = 0.3684 s M-1

-KM
[S]
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b = 590.6 s
1
Vmax = = 2.7144 M s 1
0.3684
K M = 590.6 Vmax = 590.6 2.7144 = 1,603.12 M
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
Vmax 2.7144 M s 1
k cat = = = 904.8 s 1
[E ]t 0.003 M

Calcule la concentracin de sustrato necesaria para observar un 75% de la velocidad

mxima de una reaccin enzimtica con una constante de afinidad, KM, 3 M.

Solucin:
Re-arreglando la ecuacin de Michaelis-Menten
v
=
[S ]
Vmax K M + [S ]
despejando [S] tenemos
3 M
[S ] = KM
= = 9 M
1 1
1 1
v / Vmax 0.75
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2. PROBLEMAS DE INHIBICIN

Calcule vi y el grado de inhibicin causado por un inhibidor competitivo bajo las

siguientes condiciones:
a). [S]=2x10-3 M y [I]=2x10-3 M
b). [S]=4x10-4 M y [I]=2x10-3 M
c). [S]=7.5x10-3 M y [I]=1x10-5 M
Asume que KM=2x10-3 M, KI=1.5x10-4 M y Vmax=270 nM/min.

Solucin:
En cada inciso calculamos la velocidad sin (v0) y con (vi) efectos de inhibicin
a).
v0 =
Vmax [S ]
=
(270nM / min ) 2 x10 6 nM( = 135nM / min
)
K M + [S ] 2 x10 6 nM + 2 x10 6 nM

vi =
Vmax [S ]
=
(
(270nM / min ) 2 x10 6 nM )
= 17.61nM / min
[I ]
K M 1 + ( 6
+ [S ] 2x10 nM 1 + )
2x10 6 nM
5
+ 2 x10 nM
6

Ki 1.5x10 nM
v
100 = 1
17.61nM / min
i% = 1 i 100 = 86.96%
v0 135nM / min
b).
Vmax [S ] (270nM / min )(4x10 5 nM )
v0 = = = 45nM / min
K M + [S ] 2x10 6 nM + 4x10 5 nM

vi =
Vmax [S ]
=
(270nM / min )(4x10 5 nM ) = 3.72nM / min
[I ]
+ [S ] (2x10 nM )1 +
2 x10 6 nM
K M 1 + 6
5
+ 4x10 nM
5

K i 1 .5 x10 nM
v 3.72nM / min
i% = 1 i 100 = 1 100 = 91.74%
v0 45nM / min
c).
v0 = =
(
Vmax [S ] (270nM / min ) 7.5x106 nM )
= 213.16nM / min
K M + [S ] 2 x106 nM + 7.5x106 nM

vi =
Vmax [S ]
=
(
(270nM / min ) 7.5x10 6 nM )
= 210.21nM / min
[I ]
K M 1 + ( 6
)
+ [S ] 2x10 nM 1 +
1x10 4 nM
5
+ 7.5x10 nM
6

Ki 1.5x10 nM
v 210.21nM / min
i% = 1 i 100 = 1 100 = 1.38%
v0 213.16nM / min
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(a) Qu concentracin de inhibidor competitivo se requiere para producir 75% de

inhibicin a una concentracin de sustrato de 1.5x10-3 M si KM=2.9x10-4 M y KI=2x10-5
M? (b) A qu concentracin debe incrementarse el sustrato para re-establecer la
velocidad al valor original sin inhibicin?

Solucin:
a). La frmula del grado de inhibicin para inhibicin competitiva es:
100[I ]
i% =

K i 1 +
[S ] + [I ]
K M
Despejando [I]

i% K I 1 +
[S ] (75) 2 x10 5 M 1 + 1.5 x10 3 M
( )
K M 2.9 x10 4 M
= 3.7 x10 4 M
[I ] = =
100 i% (100 75)
b)
v Sin inhibicin Con inhibicin
(Ec. Michaelis) (Inhibidor Competitivo)

v0 vi
v0 = vi

[S]0 [S]i [S]

De la grfica observamos que v0 = vi , igualando las ecuaciones de velocidad tenemos:

Vmax [S ]0 Vmax [S ]i
=
K M + [S ]0 [I ] + [S ]
K M 1 + i
KI
Despejando [S]i tenemos

[S ]i = [S ]0 1 + [I ] = 1.5x10 3 M 1 + 3.7 x105 M = 2.93x10 2 M

4

( )
KI 2 x10 M
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Calcule KI para un inhibidor no-competitivo si una concentracin de inhibidor

[I]=2x10-4 M produce 75% de inhibicin de una reaccin catalizada enzimticamente.

Solucin:
Para un inhibidor no-competitivo el grado de inhibicin est dado por
100[I ]
i% =
K i + [I ]
despejando KI
100
K I = [I ] (
1 = 2x10 4 M )
100
1 = 6.67 x105 M
%i 75

Calcule (a) la velocidad y (b) el grado de inhibicin de una reaccin catalizada

enzimticamente en presencia de 6x10-4 M de sustrato (KM=1x10-3 M) y 2.5x10-4 M de un
inhibidor no-competitivo (KI=3x10-5 M). La Vmax=515 nM/min.

Solucin:
v0 =
Vmax [S ]
=
( )(
5.15x10-7 M / min 6 x104 M )
= 1.93x10-7 M / min
K M + [S ] 1x10-3 M + 6 x10 4 M
5.15x107 M
Vmax
[I ]
[S ]
2.5x10 M 4
(6 x10 4 M )
1 + 1 +
K I 3x105 M
vi = = = 2.07 x108 M / min
K M + [S ] 3
1x10 M + 6 x10 M4

v 2.07x10-8 M / min
i% = 1 i 100 = 1 -7
100 = 89.29%
v0 1.93x10 M / min

Considere una reaccin enzimtica, en presencia de un inhibidor competitivo. La

constante de Michaelis (KM) es 3.5 x 10-4 M, la constante de inhibicin (Ki) es 1.7 x 10-5
M y la concentracin del inhibidor [I] es 7.5 x 10-5 M. Calcule la concentracin de
sustrato a la cual la velocidad observada en presencia del inhibidor es 3/4 de la
velocidad observada sin inhibicin, es decir, una actividad relativa igual a 0.75

Solucin:
Para un inhibidor competitivo la actividad relativa est dada por:
K M + [S ]
a= ; despejando [S]

K M 1 +
[I]
+ [S ]
K i
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[I ]
a K M 1 + K M
[S ] = Ki = 4.28x103 M
(1 a )
En un experimento se midi la tasa inicial de una reaccin enzimtica, v, a varias
concentraciones de substrato [S]. La concentracin de la enzima es 10 nM. Se grafic
1/v versus 1/[S] y se observ una lnea recta en la cual el intercepto-y es 0.005 nM-1 seg
y la pendiente es 200 seg. Cul es el valor de KM y el de Vmax para esta reaccin
enzimtica? Cul es el valor de kcat para esta enzima? Determine el coeficiente de
especificidad? 30 M de un inhibidor, E, es adicionado y se observ que el intercepto-
y es 0.0065 nM-1 seg y la pendiente es 260 seg. Qu tipo de inhibicin se observ?
Cul es el valor de Ki para el inhibidor con esta enzima?

Solucin:
Se observa que se utiliz la ecuacin de Lineweaver-Burk
1 KM 1 1
= +
v Vmax [S ] Vmax
1/v

1/Vmax KM/Vmax

Los datos del problema son:

m = 200 s -1/KM
1/[S]
b = 0.005 s nM-1
1
Vmax = = 200 nM s 1
0.005
K M = 200 Vmax = 200 200 = 40,000 nM
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
V 200 nM s 1
k cat = max = = 20 s 1
[E ]t 10 nM
El coeficiente de especificidad es:
k 20 s 1
= cat = = 0.0005 s 1nM 1
K M 40,000 nM
En presencia del inhibidor tenemos
m = 260 s
b = 0.0065 s nM-1
1
Vmaxapp
= = 153.846 nM s 1
0.0065
K Mapp = 260 Vmax = 260 153.846 = 40,000 nM
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Se observa que: K M = K Mapp , y Vmax > Vmax

app

Por lo tanto se trata de una Inhibicin no competitiva, entonces

Vmax
app
Vmax =

1 +
[I ]
K i

Despejando Ki

Ki =
[I ] =
30,000
= 100,000 nM
V max 200
app
1 1
V max 153.846

Para una reaccin enzimtica en presencia de un inhibidor competitivo, la velocidad

de reaccin observada a una concentracin de sustrato [S]i = 1.5 x 10-3 M es igual a la
velocidad de reaccin sin el inhibidor a una concentracin de sustrato [S]0 = 7.69 x 10-
5
M. Calcule la constante de inhibicin, Ki, del inhibidor si su concentracin [I] = 3.7 x
10-4 M.

Solucin:

Para un inhibidor competitivo la relacin [S]0 a [S]i para observar una misma velocidad es:

[S ]i = [S ]0 1 + [I ]

Ki
Despejando Ki

[I ]
4
3.7 x10 M
= = 2 x10 5 M
Ki
[S ]i 1 = 1.5x10 M3
1
[S ]0 7.69x10 5 M
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Utilice los siguientes datos experimentales para obtener la concentracin de sustrato

[S] en la cual se obtiene un grado de inhibicin del 60 % para una reaccin enzimtica
en presencia de un inhibidor [I].

[S] Velocidad (nM/min)

mM Control [I] = 6 M
0.200 16.67 6.25
0.250 20.00 7.69
0.333 24.98 10.00
0.500 33.33 14.29
1.000 50.00 25.00
2.000 66.67 40.00
2.500 71.40 45.45
3.330 76.92 52.63
4.000 80.00 57.14
5.000 83.33 62.50

Solucin:
Primero se determina qu tipo de inhibicin se tiene, por lo tanto

Analizando los datos cinticos mediante Lineweaver-Burk se tiene que:

Vmax = Vmax
app
= 100nM / min
K M = 999,860 nM < K Mapp = 2,999,900 nM

Por lo tanto es una inhibicin competitiva, y Ki se calcula como:

Ki =
[I ] =
6,000 nM
= 2,999.52 nM
app
K 2,999,900nM
M
1 1
KM 999,860nM
Despejando [S] de:

100[I ]
i% =

K i 1 +
[S ] + [I ]
K M
se tiene:

[S ] = K M [I ] 100 1 1 = 333,500 nM

K i i%
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En un experimento se midi la tasa inicial de una reaccin enzimtica, v, a varias

concentraciones de substrato [S]. La concentracin de la enzima es 3 nM. Se grafic
[S]/v versus [S] y se observ una lnea recta en la cual el intercepto-y es 590.6 s y la
pendiente es 0.3684 s M-1. Cul es el valor de KM y el de Vmax para esta reaccin
enzimtica? Cul es el valor de kcat para esta enzima?

Solucin:
Se observa que se utiliz la ecuacin de Hanes-Woolf
[S ] = 1 [S ] + K M
v Vmax Vmax [S]/v

Los datos del problema son:

m = 0.3684 s M-1 KM/Vmax 1/Vmax
b = 590.6 s

-KM
[S]
1
Vmax = = 2.7144 M s 1
0.3684

K M = 590.6 Vmax = 590.6 2.7144 = 1,603.12 M

Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto

Vmax 2.7144 M s 1
k cat = = = 904.8 s 1
[E ]t 0.003 M

El coeficiente de especificidad es:

kcat 904.8 s 1
= = = 0.564 s 1M 1
K M 1,603.12 M