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Capitulo15 PDF
Capitulo15 PDF
con cido morfolino propano sulfnico (MOPS) Antifngicos insolubles en agua (anfotericina B,
0,164 M (ICN, Sigma), ajustado a pH 70,1 y con anidulafungina, itraconazol, ketoconazol,
0,2% de glucosa. posaconazol, ravuconazol, voriconazol)
Componentes: 1. Preparar una solucin, pesando la cantidad sufi-
RPMI 1640 . . . . . . . . . . . . . . 10,40 g
ciente de polvo para obtener una concentracin
Tampn MOPS . . . . . . . . . . . 34,53 g
de 1.600 g/ml (100 veces superior a la concen-
Agua destilada . . . . . . . . . . . 1.000 ml
tracin ms alta de antifngico a ensayar) y
disolverla en dimetil sulfxido (DMSO).
Preparacin: 2. Repartir en alcuotas de 1,1 ml y congelar a
70 C hasta su utilizacin (mximo 6 meses), o
1. Disolver en 900 ml de agua destilada las canti- a 40 C (mximo 2 meses).
dades indicadas, agitando hasta su completa
disolucin.
2. Ajustar el pH a 6,9 - 7,1, utilizando NaOH 1N
10N (medir la cantidad utilizada). Unos consejos...
3. Aadir agua destilada hasta completar 1 litro.
4. Filtrar estrilmente. Es importante seguir estas recomendaciones ya
5. Mantener refrigerado hasta su uso (4-8 C, que concentraciones de antifngico ms elevadas
mximo 6 meses). no se disuelven bien.
Normalmente la solucin madre no necesita esteri-
Observar que...
2007 Revista Iberoamericana de Micologa - ISBN: 978-84-611-8776-8
Al terminar las diluciones todos los tubos contienen 1 ml, excepto el tubo n 11 (2 ml). De este
ltimo se desechar 1 ml.
En los tubos n 2 al n 11 la concentracin del antifngico es 10 veces superior a la concentracin
final deseada.
2 3
0,5 ml 5
l
m
2 ml 1 ml
1
1 ml
m
8
0,
80 g/ml
0,
5
1280 g/ml
m
4 1 ml
l
ml
0,25 ml 6
10 g/ml
0,5
2 ml
1 ml
160 g/ml
40 g/ml 9
0,
25
m
5 ml
l
0,2 1 ml
7 1 ml
0,2 5 g/ml
5m
2 ml l
20 g/ml 10 1 ml 11
2 ml 2 ml
2,5 g/ml 1,25 g/ml
Figura 15a.1. Esquema para las diluciones de antifngicos solubles en agua. Diluyente RPMI 1640.
Observar que...
Las placas de microtiter se rellenan con
100 l de solucin de antifngico siguiendo los
Al terminar las diluciones, todos los tubos
contienen 1 ml excepto el n11 que contiene 2 ml.
siguientes pasos (Figuras 15a.2 y 15a.4):
En los tubos n 2 al n 11 la concentracin del El contenido del tubo n 2 se vierte en una cube-
antifngico es 100 veces superior a la ta o en una placa de Petri estril y con ayuda de
concentracin final deseada. una pipeta multicanal (8 canales) se toman
Los tubos n 2 al n 11 estn diluidos en DMSO. 100 l y se llenan los pocillos de la columna n 2
(2A - 2H).
Mtodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad
15a-5
a los antifngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A)
l 1 ml
m
5
0, 800 g/ml 6
2 4 1 ml
0,25 ml l
m 100 g/ml
5 9
1 ml 0,
0,2
1600 g/ml 5 ml 400 g/ml 7 1 ml
0,25 ml m
l 12,5 g/ml
5
5 1 ml 0,
0,2 50 g/ml 10
2 ml 5m l
l 0,25 m
200 g/ml 8 1 ml
0,2 6,25 g/ml
5m
2 ml l
25 g/ml 11
2007 Revista Iberoamericana de Micologa - ISBN: 978-84-611-8776-8
2 ml
3,12 g/ml
Figura 15a.3. Esquema para las diluciones de antifngicos insolubles en agua. Diluyente dimetil sulfxido (DMSO).
El da del ensayo se sacan las placas del con- Es conveniente hacer un control del inculo
gelador y se dejan a temperatura ambiente hasta su utilizado; para ello se siembran 10 l del pocillo
completa descongelacin. control (n 12) en una placa de CHROMagar y, a las
24 h, se cuentan las UFC. De esta forma se controla
Se inoculan con 100 l de la suspensin de la pureza y densidad del cultivo y se comprueba la
levadura desde el pocillo 2 hasta el 12. identificacin de la cepa.
La columna n 1 (1A - 1H) que contiene
200 l de RPMI, se utiliza para el control de esterili-
dad del medio. Tambin sirve para leer la absorban- 15a.2.8. Incubacin de las placas
cia del medio.
La columna n 12 (12A - 12H) no contiene
antifngico pero debe tener la misma concentracin Las placas se incuban a 35 C. Las inocula-
de disolvente que los pocillos con antifngico. Es el das con especies del gnero Candida durante 48 h y
control de crecimiento. las inoculadas con C. neoformans durante 72 h.
Observar que...
Al inocular las placas, las concentraciones de los pocillos se diluyen 1/2. En consecuencia, la concentracin final de
antifngico en los pocillos ser de 64 g/ml a 0,12 g/ml, en los solubles en agua, y de 16 g/ml a 0,03 g/ml en los
insolubles.
En una placa de antifngico se pueden ensayar hasta 8 cepas diferentes.
Mtodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad
15a-7
a los antifngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A)
Tabla 15a.3. Intervalo de la CMI de los antifngicos para las cepas control de calidad,
obtenidas por el mtodo de microdilucin M27-A3 [2,7-9].
*No sensible.
Mtodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad
15a-9
a los antifngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A)
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
100 l
100 l
1 ml RPMI 0,1 ml RPMI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
CE 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CC
Dil. Aadir 0,9 ml de RPMI (Dil. 1:10)
1:10
0,1 ml RPMI
1 ml 100 l +
RPMI 1% DMSO
Aadir 0,9 ml de RPMI inoculado
CE 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CC
Dil.
1:100
64 - 0,12 g/ml
Concentracin final en los tubos:
16 - 0,03 g/ml
Figura 15a.6. Segundo paso de las diluciones de antifngicos solu- Figura 15a.7. Segundo paso de las diluciones de antifngicos insolu-
bles en agua (mtodo de macrodilucin). bles en agua (mtodo de macrodilucin).
Utilidad de la macrodilucin
El mtodo de macrodilucin se utiliza muy poco, pero a veces puede ser til cuando se requiere un resultado rpido
y no se dispone de medios comerciales o placas preparadas.
Tambin es til en aquellas cepas de C. albicans en las que se duda en establecer la CMI por el mtodo de microdi-
lucin, debido al crecimiento en las concentraciones superiores a la CMI (trailing growth).
Medio de cultivo RPMI 1640, con glutamina, sin bicarbonato sdico y con un indicador de pH
pH 6,9 - 7,1
Tampn cido mofolino propano sulfnico (MOPS) a una concentracin 0,164 moles/litro
Inculo Entre 0,5x103 y 2,5x103 UFC/ml
Incubacin Candida spp., 48 h a 35 C con todos los antifngicos, excepto las equinocandinas que
se incuban durante 24 h
C. neoformans, 72 h a 35 C
NS: no sensible.
15a.4.1. Fundamento
15a.4. Mtodo de difusin en disco
M44-A
Es el mismo que para las bacterias, est basa-
do en el estudio la sensibilidad de las levaduras a los
La utilidad de los mtodos de sensibilidad antifngicos en funcin del halo de inhibicin pro-
basados en la difusin del antifungico a partir de ducido por la difusin del antifngico en un medio de
discos o tabletas ha estado limitada por los proble- cultivo slido. Los pasos a seguir son los mismos que
mas de difusin en agar de los mismos y por su fal- para las bacterias pero con algunas modificaciones.
ta de correlacin con la clnica. Se ha encontra-
do correlacin con fluconazol y voriconazol entre
los halos de inhibicin de discos de 25 g (fluco-
nazol) y 1 g (voriconazol: Becton Dickinson, 15a.4.2. Medio de cultivo
Wheadtridge, Colo.) y las CMI obtenidas por el
mtodo M27-A3. En 2003, el CLSI estandariz el
mtodo de difusin-disco (documento M44-P) y en Mueller Hinton agar (MHA) suplementado
2004 public el documento definitivo (documento con 2% de glucosa y 0,5 g/ml de azul de metileno
M44-A) [3] para Candida spp. con fluconazol y (pH 7,2 - 7,4). Se puede incorporar los suplementos
voriconazol. cuando se prepara el medio o bien incorporar los
suplementos a las placas de MHA ya preparadas.
Mtodos estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad
15a-11
a los antifngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A)
Glucosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 g
Agua destilada . . . . . . . . . . . . 100 ml
1. Preparar el medio de MHA siguiendo las indica- Es mejor preparar las placas el da anterior al
ciones del fabricante y aadir 20 g de glucosa ensayo y dejarlas durante toda la noche en nevera
por litro de medio. con el fin de que haya una absorcin completa.
2. Aadir 100 l de la solucin de azul de metileno
(5 mg/ml) por cada litro de medio.
3. Esterilizar en autoclave.
4. Dejar enfriar el medio a 45-50 C y llenar las
placas a razn de 28-30 ml de medio para placas 15a.4.3. Preparacin del inculo
de 9-10 cm de dimetro y 67-70 ml si son de
15 cm (altura de la capa de agar 4 mm).
5. Dejar enfriar y guardar en nevera. Se prepara tocando con el asa de cultivo 5
colonias 1 mm y de 24 h de crecimiento en placa
Una vez preparadas las placas se pueden de SDA que se resuspenden en un tubo de solucin
almacenar durante 7 das a menos que se tomen pre- salina estril (ClNa 0,85%) como se ha descrito para
cauciones adicionales que eviten el secado de las el mtodo M27-A3. Se agita bien y con ayuda de un
placas (Figura 15a.8). espectrofotmetro (longitud de onda: 530 nm), se
ajusta a una densidad ptica 0,5 McFarland, aadi-
endo la cantidad necesaria de solucin salina. Esta
solucin tiene una concentracin aproximada de
1x106 - 5x106 UFC/ml (Figura 15a.9).
15a.4.6. Lectura
15a.4.5. Temperatura y tiempo de incubacin 15a.4.8. Puntos de corte para Candida spp.
Fluconazol 25 g 22 - 33 28 - 39 26 - 37
Voriconazol 1 g 16 - 25 28 - 37 31 - 42 *
Posaconazol 5 g 23 - 31 25 - 36 24 - 34 23 - 33
Tabla 15a.8. Puntos de corte y equivalencia dimetro-CMI para Candida spp. [1,3,11,15,23].
Fluconazol 25 g 14 15 - 18 19 64 16 - 32 8
Voriconazol 1 g 13 14 - 16 17 4 2 1
Caspofungina 5 g 10* 11 >2* 2
S, sensible. S-DD, sensible dependiendo de la dosis. R, resistente. *No sensible.
Medio de cultivo Mueller Hinton agar + 2% glucosa + 0,5 mg/ml azul de metileno
pH 7,2 7,4
Inculo 0,5 McFarland (1-5 x 106 UFC/ml)
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Medio de cultivo RPMI 1640, con glutamina, sin bicarbonato sdico y con un indicador de pH
pH 6,9 - 7,1
Tampn cido mofolino propano sulfnico (MOPS) a una concentracin 0,164 moles/litro
Inculo Entre 0,4x104 y 5x104 UFC/ml
Incubacin Rhizopus spp., de 21 - 26 h a 35 C
Aspergillus spp. Fusarium spp y S. schenckii de 46 - 50 h a 35 C
P. boydii de 70 - 74 h a 35 C
Las equinocandinas se leen el primer da (Ej. Aspergillus de 21 a 26 h)
Concentraciones a ensayar Anfotericina B, azoles y equinocandinas: 16-0,03 g/ml
Definicin de la CMI Anfotericina B y azoles: la CMI es la concentracin ms baja que produce una inhibicin
del crecimiento de 100%.
Equinocandinas: La CME es la concentracin ms baja que produce un cambio morfol-
gico del crecimiento, de filamentos a microcolonias (ver Figura 15a.11)
1. En las micosis invasoras, en las que conviene conocer si la cepa es resistente al antifngico
puesto que se correlaciona con fracaso teraputico. Lo contrario no siempre se cumple.
2. En las micosis orofarngeas que no responden al tratamiento.
3. Cuando se quiere conocer la prevalencia de cepas resistentes en la institucin.
4. En las micosis producidas por patgenos emergentes.
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Manuel Cuenca-Estrella
Juan Luis Rodrguez-Tudela
nismos homlogos no europeos, como el Clinical las 24 h de incubacin, momento en que se inicia la
Laboratory Standard Institute (CLSI) estadouniden- fase estacionaria. Estas caractersticas cinticas per-
se, antes conocido como NCCLS. miten determinar la CMI a las 24 h de incubacin,
mientras que con el mtodo del CLSI, el crecimien-
La finalidad de los estndares es establecer to a las 24 h es escaso para la mayora de las cepas,
puntos de corte que permitan realizar estudios epi- por lo que los resultados deben obtenerse tras 48 h
demiolgicos, con el propsito de vigilar y controlar de incubacin.
el desarrollo de resistencias a los antimicrobianos.
En 2002, el EUCAST fue reformado para incluir
miembros de cada uno de los pases europeos, reci- 0,9
biendo el apoyo financiero de la Direccin General Mtodo NCCLS
de la Salud y Proteccin de los Consumidores (DG- Mtodo EUCAST
SANCO) de la Unin Europea. 0,6
DO
Entre 1999 y 2002, el AFST-EUCAST reali-
z varios estudios experimentales para desarrollar 0,3
DMSO: Dimetilsulfxido
Mtodo estandarizado por el EUCAST para el estudio de la
15b-3
sensibilidad a los antifngicos (documento 7.1)
15b.4.2. Preparacin de placas de
antifngicos hidrfobos
100 l
Candida spp.
100 l RPMI-2%G &
8 4 2 1 0,5 0,015 CC B
antifngico
100 l
El inculo se prepara de la siguiente forma: Figura 15b.7. Inoculacin de las placas de microdilucin.
En la Figura 15b.8 se incluye una representa- proceso de definicin de los puntos de corte. Para
cin de cmo pueden calcularse las CMIs con los ello, se estn utilizando distribuciones de CMIs de
valores de la lectura espectrofotomtrica. La figura cepas clnicas, obtenidas por la metodologa
muestra las curvas de inhibicin de dos cepas, una EUCAST. Se realizan anlisis epidemiolgicos,
sensible y otra resistente, frente a fluconazol. Las observando como se distribuye la poblacin de
curvas de inhibicin se construyen con los valores cepas de cada una de las especies, para definir qu
de densidad ptica en cada pocillo de la fila inocu- cepas pertenecen a la poblacin salvaje (wild type),
lada con la levadura, tomando en consideracin que es decir, aquellas cepas que no han desarrollado
en cada pocillo hay una concentracin del frmaco mecanismos de resistencia. Los resultados se rela-
en cuestin. La densidad ptica del pocillo control cionan con los parmetros farmacocinticos y far-
de crecimiento (CC) es el 100% del crecimiento, macodinmicos de los antifngicos. Tras ello, si se
siendo el punto de referencia para los clculos. observan cepas con CMIs significativamente ms
elevadas que la mayora de los miembros de su
especie, y esas CMIs se sitan por encima de los
1,2
valores de las variables farmacocinticas crticas de
1,0 100 % cada antifngico, se propondrn los puntos de corte.
0,8 Para una mayor informacin consultar en
DO www.eucast.org.
0,6
CMI cepa sensible 50 %
0,4 CMI cepa resistente Hasta la fecha, el subcomit ha recogido las
0,2 CMIs de ms de 5.000 cepas, ha depurado y tabula-
do los datos, y est analizando las distribuciones
CC 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
poblacionales, por lo que es probable que pronto se
Concentracin de fluconazol (mg/L) propongan puntos de corte.
Figura 15b.8. Clculo de la CMI tras la lectura espectrofotomtrica. En caso de utilizar el mtodo EUCAST, las
La figura representa una cepa de Candida albicans sensible a recomendaciones actuales para interpretar los resul-
fluconazol (en azul) y otra resistente (en rojo). tados son considerar como resistentes in vitro, aque-
DO: Densidad ptica; CC: Control de crecimiento.
llas cepas que muestran una CMI significativamente
ms elevada que los miembros de su especie. As
por ejemplo, CMIs de fluconazol por encima de 16
mg/l o de anfotericina B por encima de 1 mg/l
En la cepa sensible, el valor de densidad podran considerarse como resistentes in vitro.
ptica del CC es de 0,96, por lo que el 50% de inhi-
bicin es 0,48; el primer pocillo en el que se inocul
la cepa con una DO por debajo de ese valor, es el
que corresponde con la concentracin de 0,12 mg/l,
siendo esa la CMI. En el caso de la cepa resistente,
el valor del pocillo CC es de 0,94, por lo que busca-
mos un pocillo por debajo de 0,47, siendo el que
corresponde a la concentracin de 32 mg/l.
Intervalo % cepas
Cepa Antifngico Media Moda Mediana Mnimo Mximo Control dentro del Valores del
geomtrica de Calidad intervalo CLSI
ATCC 22019 5FC 0,25 0,25 0,25 0,12 0,5 0,12 - 0,5 100 0,12 - 0,5
C. parapsilosis FLZ 1,51 2 2 1 4 1-4 100 1-4
ITZ 0,07 0,06 0,06 0,03 0,25 0,03 - 0,12 97 0,12 - 0,5
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