Manual de Microbiología

TECNICAS DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA AGRICOLA
INTRODUCCION
Un laboratorio de Microbiologa es un lugar habilitado para manejar y estudiar microorganismos. El

trabajo debe realizarse de acuerdo con los estndares tcnicos y de seguridad propios de un
laboratorio de Microbiologa Clnica.
Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos presentes en la muestra
por lo que es preciso extremar las precauciones para evitar contaminaciones que den lugar a
resultados errneos. Todas las muestras deben ser manejadas con precaucin por su potencial
patogenicidad.
Para deshacerse del material contaminado se deben utilizar recipientes adecuados que deben ser
esterilizados posteriormente.
Nunca se puede tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo de la basura comn sin haber sido
esterilizado previamente. El el laboratorio deben existir unas recomendaciones generales de
limpieza y en caso de vertidos:
-Procedimientos de limpieza de superficies externas mediante papel humedecido con
solucin desinfectante (alcohol 70%, desinfectante fenlico diluido, etc.). -Aclarar con
agua los restos de desinfectante.
-En caso de usar soluciones de hipoclorito en zonas metlicas, limpiar posteriormente
para evitar el efecto corrosivo.
IMPORTANCIA
Los microorganismos del suelo presentan inters agropecuario debido al rol que desempean en
numerosos procesos edficos (por ejemplo la descomposicin de rastrojos y la disponibilidad de
nutrientes para los cultivos) que condicionan las caractersticas de un suelo y su productividad. El
anlisis de las caractersticas qumicas y microbiolgicas del suelo y/o rastrojos (hojas, tallos, races
y detritos de cultivos), brinda informacin que permite diagnosticar, predecir y planificar manejos
sustentables, los cuales son luego transferidos al agricultor/productor. Los estudios de suelo y/o
rastrojos incluyen como etapa principal el muestreo y procesamiento de las muestras. (UNC, 2015).
Fuente:
http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/unidades/labv/LabMicro/practica1.html
CONTENIDO
CAPITULO 1. TINCIONES Pag.

Introduccin a las tinciones.. 1.
Tincin de esporas. 1.
Tincin de flagelos. 3.
Tincin de granulos metacromaticos.. 5.
Tincin de Gram 6.
CAPITULO 2. MEDIOS SELECTIVOS

Introduccin a los medios selectivos. 8.
Agar verde brillante 8.
Agar Mac Conckey 9.
Agar Eosina Azul de Metilo.. 10.
Agar Salmonella Shigella 11.
Agar Mueller Hinton.. 12.
Agar Sangre 13.
Agar yema de huevo o medio selectivo B. Cereus. 14.
Agar Sulfito de Bismuto.. 15.
Agar CIN 16.
Agar Manitol. 17.
Agar TSI. 19.
Agar Estafilococo 110. 20.
Agar Mueller Hinton.. 21.
CAPITULO 3. MEDIOS DIFERENCIALES

Introduccin a las pruebas bioquimicas.. 23.
Prueba Indol 23.
Prueba Catalasa 24.
Prueba Oxidasa 25.
Prueba de Citrato de Simmons 26.
Prueba de Nitritos. 27.
Prueba de Voges Proskauer.. 29.
Prueba TSI 31.
Prueba LIA 32.
Prueba de Motilidad 33.
Prueba MIO 33.
Prueba Gelatina.. 34.
Prueba de Aminoacidos de Mller. 35.
Prueba EMB 37.
Prueba Rojo Metilo.. 38.
Prueba Fermentacin de azucares. 39.
Prueba Agar Urea.... 40.
Prueba Hidrlisis del almidn.. 41.
Prueba O-F, Oxido fermentativa de Hugh-Leifson.. 42.
Prueba de Agar Felilalanina.. 43.
Prueba Mac Conkey. 45.
Prueba Hektoen enterico.. 46.
Prueba XLD. 48.
CAPITULO 4. MEDIOS PARA HONGOS

Introduccin a los medios para hongos. 51.
Tincin de hongos. 51.
Tipos de tincin.. 51.
Azul algodn - Lactofenol 52.
Medios de cultivos para hongos. 54.
Caldo de guisantes sacarosados 54.
Agar harina de avena.. 55.
Agar agua.. 56.
Agar PDA 57.
Agar Komada. 58.
Agar Neopeptone - glucose - rose 59.
Agar Rosa de Bangala.. 60.
Agar Diamalt. 61.
Agar BD BRAIN HEART INFUSION (BHI).... 61.
Agar Ogye. 63.
Agar Sabouraud Dextrrosa (SDA). 64.
Agar Sabouraud Maltosa (SMA).. 65.
Agar Extracto de Maltosa (EMA). 66.
Agar Orange Serum (OSA)... 66.
Agar de CZAPEK-DOX (CDA).. 67.
Agar Dichloran Glycerol.... 68.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 70.

TINCIONES
INTRODUCCION
Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa, definida por el
tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada denominadas
cocos, en forma cilndrica, denominadas bacilos y una tercera morfologa como son las que
tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categora puede subclasificarse
con base a diferentes arreglos. Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras
al microscopio. Las clulas no teidas son prcticamente transparentes, pero pueden observarse
al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina y laminilla o con microscopios
especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro. Cuando se dispone de un
microscopio de luz, se pueden teir las bacterias para facilitar su visualizacin. Si se tie una
muestra del cultivo extendida y fijada en una lmina portaobjeto con un colorante dado, las
clulas adquirirn el color del colorante aadido y podr observarse la forma, tamao y el
arreglo de las mismas. Este tipo de coloracin se conoce con el nombre de coloracin simple.
(Benson, 1979)
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares
cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos
de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes
incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula,
usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un
ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo
despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por
s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El
mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar
el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia
son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante
simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan
intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de
bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.
(Clavell & Pedrique de Aulacio, 1992)
TINCIN DE ESPORAS.
Fundamento
Las especies de los gneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de formar Las
endosporas estas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos (T, 2001). Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de
esporas requiere dos colorantes: Verde malaquita capaz de teir las esporas en caliente y
Safranina que es un colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras
la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas
vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.
TECNICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA

UNIVERSIDAD DE CUNDINAMARCA 1
Materiales para la tincin de esporas
Cultivo de Bacillus en medio slido.

Portaobjetos.
Asa de siembra.
Mechero Bunsen.
Papel de filtro.
Verde malaquita (solucin acuosa al 2%).
Safranina.
Microscopio
Procedimiento
1. Preparar los frotis bacterianos
indicados.
2. Teir con verde malaquita. Con unas
pinzas de madera colocar la muestra encima
de la llama del mechero de forma que el
colorante humee durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra hierba. Aadir
ms colorante si ste se evapora; es
importante que la muestra no se seque.
3. Lavar con abundante agua el exceso
de colorante
4. Teir con safranina y dejar 1 minuto
5. Lavar con abundante agua el exceso
de colorante.
6. Secar la preparacin.
7. Observar la preparacin al
microscopio. Anotar la disposicin y la
morfologa de las tres especies del gnero
Bacillus
Interpretacin de resultados
La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter

taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. Por ejemplo, Bacillus
sphaericus posee una endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula
vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene
localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un
abombamiento caracterstico denominado en huso. (Balows, 2007)

TINCIN DE FLAGELOS
Un flagelo es un apndice movible con forma de ltigo presente en muchos organismos
unicelulares y en algunas clulas de organismos pluricelulares. Usualmente los flagelos son
usados para el movimiento, aunque algunos organismos pueden utilizarlos para otras funciones.
Los flagelos proporcionan capacidad de movimiento independiente. Algunas bacterias se
desplazan a lo largo de sus superficies slidas por deslizamiento y otros microorganismos
acuticos son capaces de controlar su posicin en el agua mediante unas estructuras especiales
llamadas vesculas de gas. Tiene su origen en el protoplasma de la clula bacteriana.
Materiales
Fucsina bsica de alcohol metlico
Cloruro de sodio en agua destilada
Acido tnico en agua destilada
Preparar una estufa para poder mezclar las solucion por partes igual. Las soluciones son las
siguientes.

Solucin A
Fuscina
1.2 ml
Etanol
95%
Solucion B
Acido Tanico
3g
Agua destilada
100ml
Solucion C
Clooruro sdico
1.5g
Agua destilada
100 ml
Tabla 1. Preparacion colorante de leifon
Procedimiento
- Hacer un crculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual previamente fue
sumergido en mezcla crmica durante 24 horas, lavado posteriormente con agua
destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo de tela limpio.
- Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.
- Colocar dentro del crculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensin bacteriana e
inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.
- Fijar la preparacin mediante el aire.
- Humedecer la preparacin con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a
temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora.
- Lavar con agua corriente.
- Secar y observar con objetivo de inmersin.
Interpretacion
- Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos
extremadamente delicados
-
Figura x. tincin de flagelos proteus sp

TINCION DE GRANULOS METACROMATICOS
Los grnulos metacromticos o volutina, son inclusiones que representan una reserva de fosfato
inorgnico (poli-fosfato) que es usado por la clula para sintetizar ATP. Esta clase de grnulos
es caracterstica de las Corynebacterium (ej. Corynebacterium diphtheriae, la bacteria que causa
la difteria.) (Tortora, 2007)
Para la tincin de estas estructuras se utilizan varios mtodos. A continuacin, se describe el
procedimiento y la interpretacin del resultado obtenido.
a. Mtodo de Loeffler.
- Extensin de muestra
- Desecacin
- Fijacin al calor
- Teir con Azul de metileno de Loeffler durante 3-5 minutos.
- Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin 100x
Composicin del azul de metileno de Loeffler
- Azul de metileno (C.I. 52015) (0.5 g)
- Solucin al 1% de KOH (1 ml)
- Alcohol 96 (30 ml)
- Agua destilada (100 ml)
Interpretacin
- El granulo en cuestin se tie de un color ms intenso que el resto de la clula.
Figura x. Tincin de grnulos en Corynebacterium con tincin de Loeffer

b. Mtodo de Albert
- Extensin
- Desecacin
- Fijacin por calor
- Tincin por colorante Albert por 5 minutos
- Lavar con agua destilada
- Cubrir la extensin con lugol durante 5 minutos
- Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin 100x

Interpretacin
- Los corpsculos toman un color rojizo, mientras que el resto de la clula se
visualiza verde. En algunos casos puede visualizarse los grnulos negros y el resto
de la clula, gris.
Figura x. Grnulos metacromticos de Corynebacterium con tincin de Albert
TINCION DE GRAM
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su
nombre al bacterilogo dans Christian Gram (1853-1938), que desarroll la tcnica en 1884.
Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para poder realizar
una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose bacterias gram
positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se
visualizan de color rosa, rojo o grosella.
Metodologa
Cristal Yodo de Alcohol Safranina

violeta gram Actico

Tia con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que acte durante 1
minuto.
Lave suavemente con agua.
Agregue yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto.
Decolore con alcohol etlico al 95%. Nota: no sobredecolore, agregue el alcohol gota a
gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
Lave suavemente con agua. 10. Agregue la safranina para la tincin de contraste.
Seque la preparacin. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersin de
aceite.
Interpretacin
En cuanto a la reaccin gram y caractersticas morfolgicas de los microorganismos

visualizados, estas son:
Gram:
Positivo: de violeta fuerte a azul claro.
Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo ser intenso).
Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser
debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas,
dao en la pared celular o por particularidades especiales de la pared celular de
ciertos microorganismos.
Neutro: no toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos
de un ligero gram (-). Los microorganismos pueden ser intracelulares. Esta
reaccin gram ha sido vista en tinciones de muestras clnicas en donde estn
presentes elementos fngicos o algunas especies de micobacterias.

MEDIOS SELECTIVOS
INTRODUCCION
Los medios selectivos son slidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones
fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo componentes qumicos especficos con el fin de inhibir
el crecimiento de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio slo permite el
crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y
aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas (Lpez L; Torres C.).
En medios selectivos podemos encontrar ejemplos como:
AGAR VERDE BRILLANTE:

Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la tcnica del
nmero ms probable.
Composicin
Formula (en gramos por litro)
Pluripeptona 10.0
Extracto de levadura 3.0

Cloruro de sodio 5.0
lactosa 10.0
sacarosa 10.0
Rojo fenol 0.08
Fundamento
Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp. En el medio de
cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y
minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el
indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay produccin de acido a partir de la fermentacin de
azucares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el verde brillante acta como agente
selectivo.
Caractersticas del medio preparado: es incoloro
Ejemplo: klebsiella pneumonae ATCC 13883, las caractersticas de la colonia, es que son colonias
mucoides amarillas a verdes.

UNIVERSIDAD DE CUNDINAMARCA
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klebsiella pneumonae, en agar verde brillante (fotografia Koora Hernandez).
Agar Mac Conkey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas,
de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan el mismo. Mismo
(Britania 2015).
Composicin
peptona 17.0
pluripeptona 3.0
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 1.5
Agar 13.5
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
.pH final 7.1 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los
agentes selectivos que inhibe el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin
de la lactosa, disminuya el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la
precipitacin de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Caractersticas de medio preparas es rojo purpura.
Ejemplo: Proteus mirabilis

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Proteus mirabilis, bacterias incoloras, transparentes
Agar Eosina Azul de Metileno

Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.
Composicin
agar 13.5g
Azul de metileno 0.065g
Eosina Y 0.4g
Fosfato dipotasico 2.0g
lactosa 5.0g
peptonas 10.0g
sacarosa 5.0g
Fundamento
El medio de cultivo EMB agar es selectivo y diferencial para aislamiento de bacilos entericos que
permite una diferencia entre las colonias de organismos fermentadores de lactosa y aquellos que no
fermentan. La presencia de sacarosa permite para ciertos miembros del grupo coliforme, fermentarla
con ms facilidad que la lactosa. Las colonias lactosa positivas son verdes con brillo metlico o
poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras, mientras que aquellas que son negativas
en lactosa o sacarosa son rosa plido translucidas.
Ejemplo: Enterobacter aerogenes ATCC 13048 o Enterobacter cloacae ATCC 13047 su crecimiento
es de colonias grandes con centro oscuro y bordes rosados, generalmente sin brillo metalico.

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Enterobacter aerogenes en Agar EMB.
Agar Salmonella Shigella

Medio de cultivo utilizado para el aislamieto de Salmonella spp. Y de algunas especies de Shigella
spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospecha su presencia.
Composicin
pluripeptoa 5.0
Extracto de carne 5.0
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 8.5
Citrato de sodio 8.5
Tiosulfato de sodio 8.5
Citrato frrico 1.0
Agar 13.5
Verde brillante 0.00033
Rojo neutro 0.025
.pH final 7.0 0.2
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el
verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes
y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencia debido a la fermentacin de la lactosa y la formacin de acido sulfhdrico a partir de
tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de la lactosa capaces de desarrollar,

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acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas
sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio
de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de acido sulfhdrico se evidencia como
colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Caractersticas del medio preparado, de color rojo naranja Ejemplo, Proteus mira bilis H2S , son
colonias transparentes, centro negro
Proteus mira bilis H2S en agar Salmonella Shigella
Agar Mueller Hinton

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos. Adems es til agregado se sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos
nutricional exigentes.
Composicin
Infusin de carne 300.0

Peptona acida de casena 17.5
Almidn 1.5
Agar 15.0
.pH 7.3 0.1
Fundamento
Presenta buena reprducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad
Su contenido de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayora de los
patgenos crece satisfactoriamente. Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para
realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.
Ejemplo: Chromobacterium violaceum

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Agar Sangre
Es un medio para propsitos generales para el aislamiento y cultivo de numerosos
microorganisos. Con la adicion de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de
microorganismos aerobios y anaerobios nuticionalmente exigentes a partir de una gran variedad
de muestras, como para la observacionde reacciones de hemlisis. Sirve de base para preparar
medio agar chocolate.
Composicin
Formula en gramos por litro
Infusion de musculo de corazn 37.0
Peptona 10.0
Agar 15.0
pH final 7.3 0.2
Fundamento
La infusin de musculo de corazn y peptona, le otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite
el crecimiento de una gran variedad de microorganismos aun de aquellos nutricionalmente exigentes .
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en
concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano y permite detectar
hemlisis.
Caractersticas del medio
Medio preparado : Ambar Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza
Ejemplo: Enterococcus faecalis

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Agar Yema de huevo o agar selectivo B.
Cereus
El medio de cultivo selectivo, contiene los nutrientes necesarios para el apropiado desarrollo
bacteriano. Medio diagnstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en
alimentos.
Composicin
Formula en (gramos por litro)
Manitol 10.0
Sulfato de Magnesio 0.1
Fosfato disdico 2.5
Fosfato monopotasico 0.25
Azul de bromotimol 0.12
Piruvato de sodio 10.0
Agar 14.0
pH final 7.2 0.2
Fundamento
Bacterias fermentadoras de manitol, acidifican el medio produciendo el viraje del indicador de pH
rojo de fenol del rojo al amarillo, mientras las bacterias que no lo fermentan, producen colonias del
color del medio.
La adicin de emulsin de yema de huevo, mejora el aislamiento y la esporulacin de esta bacteria,
adems favorece y facilita la visualizacin de las colonias de B. cereus ya que se produce un halo de
precipitacin de la lecitina hidrolizada alrededor de las mismas.

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Caracteristicas
Medio preparado color: Amarillo anaranjado
Ejemplo: Bacilus subtilis
Agar sulfito de bismuto

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella typhi y otros bacilos entricos.
Composicin
Agar 20.0 g
Dextrosa 5.0 g
Extracto de carne 5.0 g
Fosfato de sodio 4.0 g
Peptonas 10.0 g
Sulfato ferroso 0.3 g
Sulfito de bismuto 8.0 g
pH final 7.6 0.2
Fundamento
La presencia se sulfito de bismuto y de verde brillante inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas y de la mayora de las bacterias Gram negativas. La produccin de sulfuro de hidrogeno se
manifiesta en el centro de la colonia por un precipitado negro y un halo negro grisceo con brillo
metlico por la reaccin de los iones bismuto con el sulfuro de hidrogeno.
Caractersticas
Las colonias reflejan un color plateado y negro
Color del medio: verde pardusco.

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Ejemplo: Proteus mirabillis
Agar CIN
El agar Yersinia CIN es un medio de aislamiento selectivo para deteccin e identificacin de
diferentes especies de Yersinia a partir de procultivos.
Varios antibiticos (suplemento slectivo para Yersinia (CIN)) asi como el cristal violeta y el
desoxicolato inhiben ampliamente la flora acompaante perturbante. Por otra parte, una base nutritiva
de alto valor favorece conjuntamente con el piruvato, el crecimiento de las Yersinias.
Composicin
Peptona de casena 10.0
Peptona de carne 10.0
Manitol 20.0
Sulfato de Magnesio 0.01
Piruvato de sodio 2.0
Agar 12.5
Mezcla de sales biliares 1
Rojo neutro 0.03
Crital violeta 0.001

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Fundamento
Las Yersinias degradan el manitol exixtente formando cido, de tal forma, que sus colonias toman un
color rojo debido al viraje del indicador rojo neutro. Las Yersinias crecen como colonia con un centro
rojo oscuro y un halo transparente. El tamao de las colonias, la anchura del borde de las mismas y la
estructura superficial pueden variar dependiendo del serotipo.
Caracteristicas
Color del medio: Rojo fuscia
Ejemplo: Yersinia enterocolitica
Sal manitol
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de
estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras
clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este
medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios
apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 10.0 Suspender 111 g de polvo por
litro de
d-Manitol 10.0 agua destilada. Reposar 5
minutos y
Cloruro de sodio 75.0 mezclar calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos.
Agar 15.0 Distribuir y
Rojo de fenol 0.025 0.025 esterilizar en autoclave a 118-
121 C
durante 15 minutos.
pH final: 7.4 0.2

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Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de
sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto
de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el
manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta
concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol
es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen
cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los
estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas
rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan
como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.
Resultados
MICROORGANISMO CRECIMIENTO CARACTERISTICAS DE LA

COLONIA
Staphylococcus aureus ATCC EXELENTE AMARILLO
25923
Staphylococcus epidermidis BUENO RIJO
ATCC
14990
Escherichia coli ATCC 25922 INHIBIDO INHIBIDO
Klebsiella pneumoniae ATCC INHIBIDO INHIBIDO
700603
Caractersticas del medioMedio preparado: rojo

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TSI
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin
de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Extracto de carne 3 Suspender 62,5 g del polvo por
Pluripeptona 20 litro de agua destilada. Mezclar
Cloruro de sodio 5 bien y calentar con agitacin
Lactosa 10 frecuente, hervir 1 o 2 minutos
Sacarosa 10 hasta disolucin total. Llenar
Glucosa 1 hasta la tercera parte de los
Sulfato de hierro y amonio 0.2 tubos de ensayo. Esterilizar a
Tiosulfato de sodio 0.2 121 C por 15 minutos. Enfriar
Rojo de fenol 0.025 en pico de flauta profundo.
Agar 13
pH final: 7.3 0.2
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el
desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de
hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por
fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de
fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
Resultados

19
Estafilococo 110 Agar
Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin presuntiva de estafilococos, en base a la
produccinde pigmentos, la fermentacin de manitol y la hidrlisis de gelatina, a partir de alimentos y
otras muestras.
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin alimentaria, y para su
aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado
Agar, o Estafilococo Medio 110.
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los nutrientes para el desarrollo
de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los
hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para inhibir
el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp., logrndose as un medio selectivo
para el desarrollo de estos microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la
misma placa, obtener pruebas de identificacin presuntiva de especie como ser: desarrollo de
pigmentos, fermentacin de manitol e hidrlisis de la gelatina.
Resultados
Observar las caractersticas de las colonias y realizar las pruebas de identificacin de
microorganismos.
1-Fermentacin de manitol: agregar unas gotas de prpura de bromocresol a las zonas donde se
encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano.
Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El
medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.

20
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin
inocular.
2-Hidrlisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solucin saturada de sulfato de amonio y
colocar en estufa, a 35-37 C, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Medio preparado: mbar claro, opalescente con precipitado
Mueller Hinton Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes.

21
Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomend su uso en forma rutinaria para la
realizacin del antibiograma en medio slido, debidoa una serie de factores :
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,
su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo,
la mayora de los patgenos crece satisfactoriamente Cuando se suplementa con sangre de carnero al
5%, es til para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de
estreptococos.

Medio preparado: mbar.

22
PRUEBAS BIOQUIMICAS
INTRODUCCIN
Para identificar bacterias es imprescindible poner de manifiesto rasgos especiales de su

metabolismo y fisiologa ya que, la simple observacin de su forma y tamao, ofrece una
informacin muy limitada que apenas permite encuadrarlas en grandes grupos. Incluso las tinciones
diferenciales son una herramienta muy til pero insuficiente para llegar al nivel necesario de
informacin que permita la identificacin de bacterias. (Cuervo, J. (2010)
Prueba Indol
Fundamento
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias
que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano (presente en
el medio) con produccin de indol.
Componentes
Aminocido triptfano, reactivo de Kovac.
Pasos
El cultivo bacteriano puro debe ser sembrado en un caldo con triptofano o peptona estriles o ambos
por 24 a 48 horas antes de realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de
reactivo Kovac, al caldo del cultivo.

23
Lectura
Interpretacin + Interpretacin -
Bacillus subtilis
Citrobacter (Bacteria suelo)
Tomada de :
Tomada de :
www.https://sites.google.com/a/goumh.umh.es
www.https://sites.google.com/a/goumh.umh.es
/practicas-de-
/practicas-de-
microbiologia/indice/identificacion-
microbiologia/indice/identificacion-
bacteriana/produccion-de-indol
bacteriana/produccion-de-indol
Descripcin Descripcin
Si se ha producido indol aparecer un anillo Si no se ha producido indol aparecer un anillo
rosa fucsia en la superficie del caldo de rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.
cultivo.
Prueba Catalasa
Fundamento
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido
de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica
que la prueba es positiva.
Componentes
Portaobjetos. H2O2 de 10 volmenes Cultivos en fase exponencial de bacterias.Asas e hilos de

siembra. Pipetas Pasteur
Pasos
Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur,
Suspender la bacteria, Detectar la formacin de burbujas.

24
Lectura
+ Bacillus subtilis
Tomada de : https://microbitos.wordpress.com
La formacin de burbujas indica que la Si no ocurre la formacin de burbujas indica
bacteria posee la enzima de la catalasa, de tal que la bacteria no posee la enzima de la
forma que descomponen el perxido de catalasa, de tal forma que no logran
hidrgeno en agua y oxgeno. descomponer el perxido de hidrgeno en agua
y oxgeno.
Prueba Oxidasa
Fundamento
Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C oxida al NNN'N',tetrametil,1-

4,fenilendiamina (solucin acuosa al 1% (p/v). La oxidacin se detecta como color azul.
Componentes
Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm) ;Placas de Petri ;Reactivo de oxidasa: Solucin al 1%
de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada. El reactivo de oxidasa es bastante
txico.
Pasos
Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las tapaderas de una placa de Petri. 2-Aadir una gota
del reactivo de oxidasa.
Depositar sobre el reactivo sobre la masa bacteriana (actuar de forma rpida y con un asa de
platino)

25
Lectura
La reaccin positiva la indica un color azul-violeta intenso antes de 10 segundos
Pseudomonas aeruginosa. Escherichia coli

Tomada de : Tomada de :
https://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/ https://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/
pruebas-bioquimicas-primarias/ pruebas-bioquimicas-primarias/
La coloracin en el disco se interpreta como La carencia de color en el disco se interpreta
oxidasa positiva, es decir las bacterias presentan como oxidasa negativa.
citocromo c.
Citrato de Simmons
Fundamento
El fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de

carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio
alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la
consiguiente produccin de alcalinidad.
Componentes
Citrato de sodio 2.0g Sulfato de magnesio 0.2g

Cloruro de sodio 5.0g Azul de bromotimol 0.08g
Fosfato di potsico 1.0g Agar 15.0g
Fosfato monoamonico 1.0g pH final 6.9

26
Pasos
Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y
mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave
a 121C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada.
Lectura
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay
cambio de color.
Tomada de :
http://24.media.tumblr.com/tumblr_m957lefV
xw1rcuee4o1_500.jpg
Descripcin: Descripcin
Crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. El medio permanece de color verde debido a
Se genera un cambio de pH. que no hay desarrollo bacteriano y no hay
cambio de color.
Nitratos
Fundamento
Consiste en identificar si el microorganismo en este medio produce la enzma reductasa y
transforme los nitratos a nitritos o gas nitrgeno libre. La reduccin de nitrato (NO3-) a nitrito

27
(NO2- ) y a nitrgeno gaseoso (N2) por lo comn se produce un microorganismo produce oxgeno
de nitrito.
Componentes
Peptona 10g pH final 7.2
Nacl 5.0g
KnO3 1.0g
Agua destilada 1.0 L
Pasos
Mezclar en 1L de agua destilada la 10g de peptona, 5g de Nacl y 1g de KnO3, esterilizar durante 20
min a 120 grados Centigrados
Lectura
El nitrito reacciona con dos reactivos: cido sulfanlico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La
reaccin de color se debe a la formacin de un compuesto diazonio, p - sulfobenceno-azo- -
naftilamina.
Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir
qumicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto
colorido.
Interpretacin sin zinc Interpretacin con zinc
Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg Si no cambia de color, se agrega directamente
indica prueba completa con resultado positivo. al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de zinc
pursimo, totalmente exento de nitratos o
nitritos, y se observa el cambio de color
durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se
realiza la interpretacin final.

28
Voges Proskauer
Fundamento
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa

con produccin de cido por la va cido mixta o con produccin de un producto final neutro
(acetona) por la va butanodilica.
Componentes
polipeptona 5.0g pH final 6.9
Glucosa 5.0g
Fosfato dipotasico 5.0g
Agua destilada 1.0 L
Pasos
Disuelva los ingredientes en agua destilada, distribuya en tubos y esterilice en autoclave por 15
minutos a 121C. (15 libras de presin). Solucin Indicadora de Rojo de Metilo Se prepara
disolviendo 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol al 95% y diluyendo luego con agua hasta
500 mL
Lectura
Prueba de Voges Proskauer La aparicin de un color rosado constituye una reaccin positiva
indicadora de la presencia de acetona, producto de la fermentacin de la glucosa.
Prueba de Rojo de Metilo Una coloracin roja, indicadora de la presencia de cidos provenientes de
la fermentacin de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloracin amarilla constituye
una reaccin negativa.

29
Tomada de :
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facu
ltad_farmacia/catedraMicro/proskauer.pdf
La aparicin de un color rosado constituye una Producto de la fermentacin de la glucosa.
reaccin positiva indicadora de la presencia de
acetona.
Rojo de metilo
Tomada de :
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facul
tad_farmacia/catedraMicro/proskauer.pdf
Una coloracin roja, indicadora de la presencia de Una coloracin amarilla constituye una reaccin
cidos provenientes de la fermentacin de la negativa.
glucosa, constituye un resultado positivo

30
TSI (Tres azucares-hierro)
Fundamento: El agar TSI es uno de los ms usados para ver la fermentacin de
carbohidratos como la glucosa, lactosa, sacarosa y la produccin de H 2S por parte de la
bacteria sumndole produccin de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del
medio) a amarillo indica fermentacin. Si se fermenta nicamente la glucosa el cambio de
color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos
concentrada que la sacarosa y la lactosa, adems los radicales libres no son suficientes para
hacer virar el medio.
Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo.
La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo indica
presencia de gas como producto final de la fermentacin.
La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color negro debido a

la reduccin de la sal de hierro presente en el medio.
Tcnica: Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio,

incubar a 37C por 24 horas.
Indicador: Rojo fenol
Interpretacin de resultados:
A: Reaccin acida. Color amarillo A/A: Fermentacin 3 azucares

K: Reaccin alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentacin de la glucosa
Burbujas: Produccin de gas K/K: No hay fermentacin de los 3
Precipitado
negro: Formacin H2S

31
LIA (Lisina-hierro)
Fundamento: Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina
descarboxilasa y la lisina desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para
detectar la produccin de H2S por algunos microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea en el fondo del tubo y
se pone de manifiesto por la alcalinizacin del medio produciendo un viraje del indicador
prpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina
primero una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de color del
medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de descarboxilacion que ocurre
despus, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo. La desaminacin
de la lisina que se puede producir por los gneros Proteus y Providencia tiene lugar en la
parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de
hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La produccin de H2S se
evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilizacin de las sales de hierro.
Tcnica: Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del
cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 C.
Revelador: Cloruro de amonio
A: Reaccin acida. Color amarillo

K: Reaccin alcalina. Color violeta
R: Reaccin alcalina: color rojo
K/K: Descarboxilacion lisina
K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacion lisina
R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa

32
MOTILIDAD
Fundamento: Me permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un
microorganismo.
Tcnica: Siembra en picadura con el microorganismo a estudiar, incubar 24 horas a 37 C.
Interpretacin de resultados: Formacin de nata la parte superior de medio indica

viabilidad del microorganismo, desarrollo de turbidez hacia los lados de la estra de
inoculacin indica motilidad positiva.
MIO (Movilidad, indol y ornitina)
Fundamento
Esta prueba permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad, la produccin de Indol y la

descarboxilacin de la ornitina.Son tres pruebas, en esta prueba se evala la produccin de indol, la
descarboxilacin de la lisina por la enzima ornitina descarboxilasa y la movilidad del
microorganismo. La degradacin del tripotofano por la enzima triptofanasa libera indol, acido
pirvico, amoniaco y energa.
Tcnica
Inocular en picada las cepas de microorganismos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a
37C.

33
Indicador: Purpura de bromocresol
Revelador: Reactivo de Kovacs
Produccin de Indol:
Positiva: Formacin de un anillo rojo en la superficie.

Negativa: No hay cambios en el color.
Ornitina descarboxilasa:
Positivo: Color purpura el medio.

Negativo: Color amarillo en el fondo.
Movilidad:
Positiva: Los organismos mviles migran de la line de siembra y se

difunden en el medio provocando turbiedad.
Negativa: Crecimiento acentuado siguiendo la lnea de siembra.
Gelatina.
Fundamento
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de
tipo proteolticas (gelatinasas).

34
Componentes
Sustrato: Gelatina (Proteina)
Indicador: No posee
Revelador: No posee
Pasos
Se prepara un medio de agar nutritivo y se agrega gelatina al 1%. Se funde y luego se esteriliza en
autoclave y se distribuye en placas. Cada placa se siembra con asa en ly se incuba por 48 horas.
Enfriar para comprobar la formacin del gel. Si se hidroliza la gelatina, el tubo permanece lquido
cuando se refrigera.
Lectura
http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.p http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.p
hp?term=Gelatinasa&lang=2 hp?term=Gelatinasa&lang=2
Descripcin Permanece liquido es prueba Descripcin Se solidifica es prueba negativa
positiva para gelatinasa. para gelatinasa.
Aminocidos de Mller.
Fundamento
Medio base, que al ser suplementado con lisna, arginina u ornitina, es til para la diferenciacin de
bacilos Gram negativos, basndose en la produccin de lisina decarboxilasa, argina dehidrolasa y
ornitina decarboxilasa respectivamente.
Componentes
Indicador: Purpura de bromocresol
Sustrato: Aminocido
Revelador: No posee.

35
Pasos
A partir de un cultivo puro de 24 horas, inocular el caldo suplementado con uno de los tres
aminocidos, distribuyendo la siembra a travs del medio (Tubo Prueba). Cada cepa aislada,
adems debe ser sembrada en paralelo, en un tubo de medio basal que no contiene aminocidos
(Tubo Control).
Agregar a todos los tubos, 1 ml de aceite mineral. Incubar los tubos con las tapas flojas a 35-37 C,
en aerobiosis. Examinar, para evaluar crecimiento y reacciones de decarboxilacin, a las 24-48-72 y
96 horas. El medio se torna amarillo inicialmente si la glucosa es fermentada, y luego gradualmente
se torna prpura si la actividad decarboxilasa o dehidrolasa ocurre y se eleva el pH del medio.
Para cada microorganismo en estudio, comparar el color presente en los tubos con medio
conteniendo los respectivos aminocidos (Tubos Prueba), con el color presente en el tubo control.
Lectura
Interpretacin + Interpretacin - Invalida
Tomada de :
http://facultad.bayamon.inter.e
du/iferrer/Presentacion%20pru
ebas%20bioquimicas.pdf
Descripcin Tubo prueba: color Descripcin Tubo prueba y tubo Descripcin: Tubo control
prpura o violeta. control: color amarillo. prpura o violeta
-Tubo control: color amarillo

36
EMB
Fundamento
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos
Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de
todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. La diferenciacin entre organismos capaces de
utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los
indicadores eosina y azul de metileno.
Componentes
Indicador: Eosina y azul de metileno.
Inhibidor: Eosina y azul de metileno.
Pasos
Suspender 36 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar con agitacin
frecuente y llevar a ebullicin hasta su disolucin total. Esterilizar en autoclave 121C durante 15
minutos. Distribuir en placas de Petri estriles. La siembra se realiza en superficie, por estriado
directo a partir de la muestra. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Lectura
http://faculty.mdc.edu/jmorata/TYPES%20OF http://www.microregistrar.com/salmonella
%20AGAR.pdf -sp-2/
Microorganismos fermentadores de lactosa y / o Microorganismos no fermentadores de
sacarosa: colonias de color negro azulado o lactosa y sacarosa: colonias del color del
amarronado. Pueden tener centro oscuro y brillo medio, incoloras. (Salmonella).
metlico

37
ROJO METILO
Fundamento
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa
con produccin de un producto final neutro (acetona) por la va butanodilica.
Componentes
Medio de cultivo: Caldo R.M.V.P.
Indicador: rojo de metilo
Pasos
Disuelva el medio R.M.V.P en agua destilada, distribuya en tubos y esterilice en autoclave por 15
minutos a 121C. (15 libras de presin).
La Solucin Indicadora de Rojo de Metilo Se prepara disolviendo 0,1 g de rojo de metilo en 300
mL de etanol al 95% y diluyendo luego con agua hasta 500 mL.
Inocule con el asa, transfiriendo una porcin de cultivo puro. Incube a 35C por 24 a 48 horas. Para
revelar Transfiera 5 mL del cultivo a un tubo y aada 5 gotas de solucin indicadora de Rojo de
Metilo.
Lectura
Tomada de :
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/fac
ultad_farmacia/catedraMicro/proskauer.pdf Tomada de :
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/fac
ultad_farmacia/catedraMicro/proskauer.pdf
Descripcin: Descripcin:
Una coloracin roja, indicadora de la Una coloracin amarilla constituye una reaccin
presencia de cidos provenientes de la negativa.
fermentacin de la glucosa, constituye un Ejemplo: Ralstonia solanacearum
resultado positivo

38
Fermentacin de azucares
Fundamento
Determinar la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un hidrato de carbono
especifico incorporado den un medio basal y producir acido o acido con gas visible.
Componentes
Medio de cultivo: caldo bsico rojo de fenol
Indicador: rojo fenol y rojo neutro
Pasos
Preparar el medio y esterilizar en autoclavee, agregar el carbohidrato y la campana de durham,
inocular el medio de cultivo. Agitar e incubar a 37 C durante 24 horas. (Lecturas tardas pueden
dar resultados equvocos).
Lectura
Tomada de : atlas de pruebas bioqumicas (2003). Tomada de : atlas de pruebas bioqumicas (2003).
Descripcin: Descripcin:
Rojo de fenol: el medio se observa amarillo por la Rojo de fenol: el medio se observa amarillo
produccin de acidos a partir de la fermentacin Rojo neutro: una coloracin amarilla indica una
Rojo neutro: el medio se observa fucsia indicando un reaccin negativa
resultado positivo
Utilizando ambos indicadores la Presencia de
burbujas en la campanita Durham indica produccin
de gases
Ejemplo: Xanthomonas campestris, positiva para
glucosa.
Ralstonia solanacearum , positiva para lactosa.

39
Agar urea
Fundamento
La hidrlisis de la urea por la enzima ureasa libera dos molculas de amoniaco que alcaliniza el
medio, entonces se vira el indicador de pH
Componentes
Indicador: rojo de fenol
Sustrato: caldo urea
Pasos
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos
microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin. Se recomienda no punzar la capa
profunda para controlar el color.
Lectura
Tomada de: RENALOA (2009). Tcnicas Tomada de: RENALOA (2009). Tcnicas para
para anlisis microbiolgico. anlisis microbiolgico.
El rojo fenol en alcalinidad vira a un color Si el color es amarillo indica una prueba
violeta indicando una prueba POSITIVA. NEGATIVA.
Postitivo: agrobacterium, A. rhizogenes

40
Hidrlisis del Almidn
Fundamento
El almidn es un carbohidrato complejo que es degradado por microorganismos que contienen

amilasas.
Las molculas de yodo estn atrapadas dentro de la hlice no ramificada de unidades de glucosa de
la cadena de amilosa para formar un compuesto de inclusin azul. Si la red se desintegra como
ocurre durante la hidrlisis del almidn y las dextrinas por definicin se produce una mezcla de dos
molculas de polisacridos poliglucosa: amilosa lineal que solo da glucosa con la hidrlisis se
denomina glucosn.
Componentes
Agar Almidn
Sustrato: Almidn (polmero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.
Revelador: Lugol.
Pasos
Ioduro da un color azul con el almidn. Crecimiento de un organismo en una placa que contiene
almidn. Sumergir la placa en ioduro de Gram y buscar las zonas claras alrededor de las colonias.
Incubar a 35+- 2C por 24-25 horas.
Lectura
El lugol con el almidn forman un complejo color caf-prpura que desaparece cuando el almidn
ha sido degradado.

41
Tomada de : Tomada de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/ http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/
U3c_PruebasBioquimicas_17548.PDF U3c_PruebasBioquimicas_17548.PDF
Descripcin: solo las bacterias del genero Descripcin: no hay presencia de almidon se
bacillus producen torno de color amarillento
amilasa.
Prueba O-F, Oxido fermentativa o de Hugh-

Leifson.
Fundamento
Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energtico: respiratorio (O) o fermentador (F). Se
suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulacin de cidos con un indicador cido-
base (azul de bromotimol). La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura ) y se incuba en
condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado),
simultneamente.
Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del medio del tubo abierto.
Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se ver ligeramente amarilla (por la
formacin de cido carbnico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo
cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias fermentadoras producen cidos a partir
de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el
fondo, pero transcurridas 24 horas los cidos pueden difundir por todo el medio virndolo a
amarillo.
Componentes
Parafina estril y Medio de Hugh-Leifson con glucosa (1% )
Pasos
Eliminar el oxgeno del medio (regenerar) de dos tubos para cada bacteria (calentar a 100
oC a bao maria durante 10 minutos y enfriar rpidamente).
Inocular por picadura (con hilo de siembra) dos tubos por cada bacteria.
Aadir a uno de los cultivos parafina estril para aislarlo del aire. Incubar a 37 oC durante
24 horas.

42
Lectura
Descripcin: Se observa coloracin amarilla Descripcin : Se observa de color verde o
cuando fermente y de color verde. azulado, y color amarillo en la superficie.
Fenilalanina Agar
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano.
El aminocido fenilalanina sufre la desaminacin oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina

deaminasa (es una flavoprotena), para producir cido fenilpirvico y amonaco. La presencia del
cido fenilpirvico se demuestra con el agregado de cloruro frrico en medio cido, con el cual se
forma un quelato de color verdoso entre el cido fenil pirvico y los iones Fe3+.
Adems, en este medio se suele poner en evidencia la produccin de pigmentos melnicos, como en
el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, etc.

43
Componentes
Gramo en litros
DL- fenilalanina 2.0
Fosfato disodico 1.0
Agar 2.0
Pasos
Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta disolucin total.
Colocar en tubos y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Solidificar en posicin inclinada para
obtener picos de flauta alargados. A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inculo
denso estriando la superficie del medio.
Incubar de 18 a 24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Luego, se debe realizar el revelado: agregar

unas gotas de una solucin acuosa de cloruro frrico al 10% (cdigo B15-504-61).
Lectura
El anlisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos.
Positivo: desarrollo de color verde plido a intenso en el pico de flauta y en el lquido de

condensacin.
Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro
frrico
Tomada de : Tomada de:

Descripcin: desarrollo de color verde plido Descripcin: sin cambios de color. El medio
a intenso en el pico de flauta y en el lquido permanece amarillo debido al color del reactivo
de condensacin. cloruro frrico.

44
Mac Conkey
Fundamento
Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las bacterias
Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa y el indicador rojo neutro nos ayudan a indicar, las
bacterias capaces de fermentar dicho azcar acidifican el medio, dividiendo en 2 el grupo: bacterias
fermentadoras y no fermentadoras.
Componentes
Peptona de carne...............................................................................1.5.
Peptona de gelatina..........................................................................17.0.
Triptena...............................................................................................1.5.
Lactosa...................................................................................................10.0.
Mezcla de sales biliares N3.........................................................1.5.
Cloruro de sodio................................................................................5.0.
Rojo neutro..........................................................................................0.03.
Cristal violeta......................................................................................0.001
Agar........................................................................................................13.5.
pH final: 7.1 0.2
Pasos
frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver completamente. Distribuir en recipientes
apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
En superficie: inocular directamente la muestra por estra.

En profundidad: inocular una alcuota de la muestra directa o de su dilucin. Verter un volumen
del medio de cultivo fundido y enfriado a 40-45C. Homogeneizar mediante movimientos de vaivn
y rotacin. Dejar solidificar.

45
Lectura
Tomada de: Tomada de:

http://virus.usal.es/web/demo_fundacua/dem http://virus.usal.es/web/demo_fundacua/demo1/f
o1/fotos/entrenamientoplacas_g/ejemplo5.jpg otos/entrenamientoplacas_g/ejemplo5.jpg
Descripcin: (Meloidogyne sp.) Bacterias Descripcin Bacterias no fermentadoras de
fermentadoras de lactosa, tornan a una lactosa, tornan a un color rosa plido casi
coloracin fucsia. Puede observarse halo de incoloro.
precipitacin biliar. El medio se vuelve fucsia
junto con las bacterias.
Hektoen entrico
Fundamento
En el medio de cultivo la proteosa peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para
el desarrollo microbiano. La lactosa, sacarosa y salicina son los hidratos de carbono
fermentables. Las sales biliares inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, de algunos
coliformes y de la mayora de las cepas de Pseudomonas spp.
El azul de bromotimol y la fucsina cida son los indicadores de la fermentacin de hidratos de
carbono, mientras que el citrato de hierro acta como indicador de la formacin de SH2 a
partir del tiosulfato debido a que se forma sulfuro de hierro, compuesto de color negro.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente solidificante.

46
Componentes
Proteosa peptona .......................................................12.0 g

Extracto de levadura..................................................3.0 g
Sales biliares..................................................................9.0 g
Lactosa.............................................................................12.0 g
Sacarosa...........................................................................12.0 g
Salicina..............................................................................2.0 g
Cloruro de sodio............................................................5.0 g
Tiosulfato de sodio.......................................................5.0 g
Citrato de hierro y amonio........................................1.5 g
Azul de bromotimol......................................................0.065 g
Fucsina cida...................................................................0.1 g
Agar.....................................................................................14.0 g
Agua purificada..............................................................1000 ml
pH final: 7.5 0.2
Pasos
frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver completamente.
Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Despus

de la preparacin, las placas deben ser usadas inmediatamente o ser conservadas en bolsas de
plstico a 2-8C durante mximo de una semana.
Inocular las placas directamente con heces, torundas fecales o un subcultivo de un medio de
enriquecimiento adecuado. Rayar hacia afuera para buscar colonias simples.
Incubar las placas aerbicamente durante 18-24 horas a 35-37C.
Es importante que la incubacin, no sea continuada ms de 24 horas porque esto produce reversin
del pH en los microorganismos no patgenos.
Siembra directa, estriando la superficie del medio de cultivo.

47
Interpretacin + Interpretacin - H2 S +
Tomada de:
Tomada de: Tomada de:
http://www.scielo.org.co/scielo
http://www.scielo.org.co/scielo http://www.scielo.org.co/scielo
.php?pid=S0122-
.php?pid=S0122- .php?pid=S0122-
02682011000200015&script=s
02682011000200015&script=s 02682011000200015&script=s
ci_arttext
ci_arttext ci_arttext
Descripcin: Descripcin: Descripcin:
Microorganismos (Bacillus thuringiensis) Microorganismos productores
fermentadores de lactosa, Microorganismos no de H2S.
colonias fermentadores de lactosa, Colonias con centro negro.
colonias del color del medio,
verde-azuladas.
XLD
Fundamento
La degradacin a acido a partir de la Xilosa, lactosa y sacarosa producen un viraje a amarillo

del indicador Rojo de fenol. El tiosulfato y sal de hierro revelan la formacin de H 2S por la
precipitacin del sulfuro de hierro negro en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la
lisina, producen cadaverina, se reconocen por la presencia de un color rojo-purpreo debido al
aumento de pH alrededor de las colonias. El efecto inhibidor es muy dbil.

48
Componentes
Lactosa Monohidrato7.50 g
Extracto Levadura...3.00 g
Sacarosa.7.50 g
Desoxicolato Sdico....2.50 g
Tiosulfato Sdico...6.80 g
Citrato frrico de amonio.0.80 g
Cloruro Sdico....5.00 g
Rojo fenol...0.08 g
L-Lisina5.00 g
Agar Bacteriolgico.13.50 g
Xilosa.3.50 g
Pasos
Agar XLD presentacin 500 gramos, 5, 25, 50 kilos. Catlogo 1080 (Medio deshidratado)
Suspender 55.2 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente.
Dejar hervir durante un minuto o hasta disolucin completa. EVITAR
SOBRECALENTAMIENTO. NO AUTOCLAVAR. Distribuir en recipientes adecuados. Las placas
preparadas deben almacenarse entre 8-15C. El color del medio preparado es rojizo naranja El
medio deshidratado debe ser homogneo, libre de floculos y de color rosado. Si hay algn cambio
fsico no utilizar el medio. La presentacin de Agar XLD placas de 90 mm Caja 20 unidades.
Catlogo 930 (Medio preparado). Listo para su uso Frascos 100 ml Caja 12 unidades. Catlogo
5121. Medio preparado. Listo para su uso (Fundir y dispensar en placas)
Inocular en superficie. Estras paralelas con el asa o hisopo.
Incubar en condiciones aerbicas a 35 2C durante 18-24 horas.
Lectura
Tomada de:
Tomada de : http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facu
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facul ltad_farmacia/catedraMicro/10_Agar_XLD.pd
tad_farmacia/catedraMicro/10_Agar_XLD.pdf f
Descripcin: (Rathayibacter toxicus) Fermentan Descripcin Decarboxila, creando colonias
la lactosa para producir acido, creando colonias irregulares y de tonalidad fucsia. Productoras
amarillas brillantes habitualmente rodeadas de de H2S, se reduce, creando colonias fucsias
zonas nebulosas de precipitacin de sales biliares. con un centro negro.

49
50
MEDIOS PARA HONGOS
INTRODUCCION
Los hongos son organismos heterotrficos, eucariotas capaces de metabolizar gran variedad de
sustratos orgnicos. Los hongos pueden ser de gran beneficio as como tambin perjudiciales al ser
humano. Aquellos que habitan en el suelo ayudan a descomponer plantas y animales muertos,
manteniendo frtil el terreno. Los hongos que llevan a cabo fermentacin son de gran importancia
industrial. La industria de la cerveza, el vino, los quesos, los antibiticos, las enzimas, la repostera,
dependen de los hongos. Algunas actividades detrimentales de los hongos son por ejemplo: el
moho que le d a las frutas , vegetales y granos, el dao a los alimentos en general. Algunas
especies son capaces de producir drogas como toxinas y halucingenos. Algunas especies pueden
causar enfermedades al hombre, ejemplo de stos son las micosis superficiales (en piel, pelo y uas)
y las micosis sistmicas (en pulmones, sistema nervioso, genitales).
La asociacin entre la densidad de hongos y las descargas orgnicas a cuerpos de agua o en el
suelo, sugieren que los hongos pueden ser indicadores de contaminacin. Desafortunadamente no se
han identificado especies o grupos de hongos importantes en este rol. Algunas especies de
levaduras y hongos filamentosos son caractersticos de aguas calientes y pueden ser indicadores
tiles de contaminacin termal.
La identificacin de hongos es dependiente de la morfologa (forma) de las colonias cuando se
crecen en medio slido, as como su crecimiento y morfologa de estructuras reproductivas. Para la
identificacin de las levaduras es importante la actividad fisiolgica en cultivos en el laboratorio.
(Baymon, 2008.)
TINCIN DE HONGOS
Es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al
microscopio.
Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biologa y medicina para
resaltar estructuras en tejidos biolgicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos
de microscopios.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes
cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares
(por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso para resaltar organelas dentro de
clulas individuales.
TIPOS DE TINCIN
Tinciones simples:
En las tinciones simples se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico.
Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y
quedarn teidas del mismo color.

51
La tincin simple mejora la observacin de la clula completa.
Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se
retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada.
Si se utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante
Tinciones diferenciales:
Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos.

La tcnica de tincin diferencial consta de dos etapas: una tincin primaria (siguiendo el
mismo mtodo que en una tincin simple) seguida de una tincin de contraste.
En la tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas
no teidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa.
Por ejemplo, la tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas aplicadas

a bacterias.
Tinciones especficas:
Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares, entre

las que se incluyen las endosporas, los flagelos y las cpsulas.
NOMBRES DE TINCIONES
Safranina
Azul de algodn
Tincin con Eritrocina.
Anaranjado de Acridina
Tincin de Gram
Tcnica de Schiff
Tincin de Giemsa y Wright
Tincin de Gomori-Grocott (Metenamina de plata)
Tincin de Gomori-Grocott
AZUL ALGODN-LACTOFENOL
(COLONIAS DE HONGOS)
La tincin de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos.
Es una tincin simple (un slo colorante) y como tal est basada en la afinidad del
colorante por componentes de las clulas, en este caso por las estructuras fngicas.

52
El azul de lactofenol tiene tres caractersticas que lo hacen especial para observar
dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por
aislamiento.
El fenol destruye la flora acompaante (algunas veces en los cultivos, juntos a los
hongos pueden crecer colonias de bacterias)
El cido lctico conserva las estructuras fngicas al crear, por decirlo de algn
modo, una pelcula que las protege provocado por un cambio de gradiente
osmtico entre el interior y el exterior de dicha estructura.
El azul de algodn tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los
hongos microscpicos
Procedimiento:
1. Sobre un porta limpio y seco depositaremos 2 gotas de azul de lacto fenol

2. Cortaremos un trozo de cinta celo y la pegaremos en el extremo del asa
estril.
3. Con cuidado pasaremos el extremo del celo por el borde exterior de la
colonia.
4. Pegaremos la cinta celo en el portaobjetos que tiene el colorante retirando
con cuidado el asa.
5. Aadiremos una gota de colorante sobre el celo.
6. cubriremos la preparacin con un cubreobjetos.
7. Observaremos al microscopio.

53
MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS
Los medios de cultivo deben permitir el crecimiento del patgeno que se desee aislar. Por ello su
eleccin es fundamental para el xito del aislamiento. Estos pueden ser de dos tipos; selectivos y no
selectivos.
Selectivos; impiden desarrollo de microorganismos no deseados y favorecen el desarrollo de un
microorganismo determinado.
Existen muchos medios de cultivos para hongos y bacterias Fito patgenas. Todos contienen
nutrientes para estimular el crecimiento del patgeno. Que incluyen energa (carbohidratos), una
fuente de nitrgeno (aminocidos) y vitaminas (tiamina, biotina) algunos medios contienen
nutrientes derivados de plantas (papa, maz, tomate) a este tipo de medios se les denomina
complejos.
CALDO DE GUISANTES SACAROSADO
Medio adecuado para estudiar especies de Pythium y Phytophthora, utilizado para el aislamiento,
identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de
levaduras. Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos,
particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo, etc.).
En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH cido,
favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.
Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.
- FRMULA
100gr de guisantes en conserva
5gr de dextrosa
20 gr de agar
Agua destilada
- MTODO DE PREPARACIN
Escurrir el lquido de conserva, poner los guisantes en un mortero y machacarlos. Calentar el
macerado con 300 ml de agua durante 5 min, no dejar ebullir dejar reposar, filtrar el sobrenadante
por muselina. Epetir la operacin dos veces. Agregar los dems ingredientes. Ajustar el ph a 5.5.
Enrasar a 1000 ml con agua destilada
- RESULTADO
NO SE ENCONTR IMGENES

54
AGAR HARINA DE AVENA
Favorece la esporulacin. Recomendable para la identificacin de especies de Acremonium,
Cladosporium, Fusarium, Paecilomyces, Phialophora, Scopulariopsis y para la obtencin de las
formas teleomrficas asociadas.
- FRMULA
40 gr copos de avena
20 gr de agar
Agua destilada
Calentar la avena en 1 lt de agua durante 30-45 min, evitar ebullicin. Filtrar por muselina varias
veces hasta que el lquido aparezca claro. Agregar agua ajustar a pH neutro. Enrasar con agua
destilada hasta 1000 ml. Agitar hasta que el agar se disuelva totalmente.
- RESULTADOS

55
AGAR AGUA
Es un medio pobre en el cual el micelio crece en forma muy rala.

Es especialmente usado para hacer aislamientos de punta de hifa.
De acuerdo a la consistencia que se quiera dar al medio, se puede hacer con mayor o menor
cantidad de agar.
Estimula la formacin de conidios.
Recomendable para hifomicetes de pigmentacin oscura (dematiceos) e incluso para dermatofitos
poco o nada esporulados.
Favorece la esporulacin de hongos saprofitos.
- FRMULA
Agar 15 gr y Agua Destilada 1000 ml.
Disolver el agar en un poco de agua destilada, alentar si es necesario para una total disolucin.
Ajustar el pH neutro. Enrasar a 1000 ml
- RESULTADO

56
PDA
Es un medio utilizado para la estimulacin de la formacin de conidias
La preparacin de inculos de hongos miceliales y en la estimulacin de produccin de pigmentos:

rojo en Trichophyton rubrum, rosa salmn en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum
canis.
Se utiliza con frecuencia en microcultivos para observar las caractersticas morfolgicas.
Tiene la infusin de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de
hongos y levaduras.
- FRMULA
Caldo de coccin de 200 gr de papa

20 gr de dextrosa
15 gr de agar
Agua destilada
Pelar y trocear las papas. Cocerlas en suficiente agua. Filtrar con muselina agregar los dems
ingredientes al filtrado. Ajustar a pH neutro con una solucin 1 N de hidrxido potsico. Enrasar a
1000 ml con agua destilada
- RESULTADO

57
KOMADA
Medio selectivo para especies de Fusarium. Se pueden diferenciar las especies del hongo por el
color de sus colonias en este medio de cultivo. F. oxysporum: salmn, F. solani: rojizo, F. roseum:
rojo fuerte.
- FRMULA
PREPARAR 100 ML DE SOLUCIN A
K2HPO4 1 gr KCL 0.5 gr
MgSO4 0.5 gr
Fe-Na- EDTA 0.01 gr.
INGREDIENTES
2 gr de L-asparagina
20 gr de D.galactosa
20 gr de agar
1 gr de PCNB
0.5 gr de oxgall
1 gr de NA2B407
0.3 gr de sulfato de estreptomicina
12 ml de H3PO4 (sol 10%)
1 mk de tergitol
Coger 10 ml de Sol A y agregarlos a 1 Lt de agua destilada junto con la asparagina, la galactosa, y
el agar. Calentar para disolver el agar. Dejar enfriar hasta 50 C. Aadir los dems ingredientes.
- RESULTADO
Resultado Positivo: Fusarium oxysporum de color salmn

Imagen Tomada de: aprendeenlinea.udea.edu.co

58
AGAR NEOPEPTONE-GLUCOSE-ROSE
Este es un medio de cultivo generalizado para el mantenimiento de una gran gama de especies de
hongos.
- FORMUlA (1Lt)
Agar 20g
Neopeptona 5g
Glucosa 1g
Aadir componentes, exceptuando la tetraciclina, a agua destilada y llevar a un volumen de 995
mL. Mezclar bien en un fuego agradable, luego llevar a hervir. Autoclave durante 15 minutos a
15psi (presin) a 121 C. Enfriar a 45-50 C. Aadir aspticamente 5mL de una solucin estril de
tetraciclina. Mezclar bien, verter la mezcla dentro de placas estriles de Petri.
Neo peptona: se usa como principal fuente de nitrgeno para el medio orgnico.
Glucosa: Favorece el crecimiento de hongos y levaduras.
Solucin de tetraciclina: La tetraciclina se usa como un agente anti-microbiano.
Solucin de Rose bengala: Es tomado por las levaduras y mohos facilitando su reconocimiento
adems suprime el crecimiento de bacterias y restringe el tamao y la altura de las colonias de
mohos de crecimiento rpido. Esta restriccin ayuda en el aislamiento de mohos de crecimiento
lento y pueden crecer las levaduras.
Dextrosa: La dextrosa es la fuente de energa para el crecimiento de microrganismos.
- RESULTADO

59
AGAR ROSA DE BENGALA
Se usa para el aislamiento y recuento de levaduras y mohos a partir de diversas muestras.

Inocular el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones con la muestra de ensayo. Incubar de 5 -
7 das a 20 25C.
- FORMULA (1Lt)
Agar 15.5g
Peptona de soya 5.0g
Cloranfenicol 0.1g
Rosa de bengala 0.05g
Dextrosa 10.0g
Fosfato monopotsico 1.0g
Sulfato de magnesio 0.5g
Rehidratar 32.2 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. NO
SOBREESTERILIZAR. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri estriles.
Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.
- RESULTADO

60
AGAR DIAMALT (LEVADURAS)
El agar diamalt es usado para la isolacion e identificacion de levaduras en muestras de agua de
acuerdo con el APHA (American Public Health Association)
- FORMULA (1Lt)
Diamalt 150.000gr
Agar 20.000gr
Suspender 17 gr en 100mL de agua destilada. Calentar hasta hervir para disolver el medio
completamente. Esterilizar por autoclave a 15lbs de presin en 121C durante 15 minutos. El medio
ser turbio pero no ser necesario filtrarlo. Mezclar bien y verter dentro de placas estriles de Petri
- RESULTADO
BD BRAIN HEART INFUSION (BHI) AGAR
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La

infusin de cerebro de ternera, la infusin de corazn vacuno y la peptona, son la fuente de carbono,
nitrgeno, y vitaminas.

61
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico
y el fosfato disdico otorga capacidad buffer.
El agar cerebro corazn mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de
estreptococos y otras bacterias exigentes.
Con el agregado de 10% de sangre de caballo desfibrinada, fue utilizado para el crecimiento de
Histoplasma capsulatum y de hongos patgenos.
Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observacin
de reacciones de hemlisis.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 g/ml de estreptomicina, se utiliza este medio para el
aislamiento de hongos patgenos.
- FORMULA
-
220 gr infusin de cerebro de ternera
250 gr corazn de vacuno
10 gr peptona
5 gr cloruro de sodio
2 gr glucosa
2.5 gr fosfato disodico
15 gr agar
Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta su

disolucin total. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C
pH final 7.4
- RESULTADO

62
Agar OGYE
Su nombre original es Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura. Este es un medio

selectivo, que permite el crecimiento e identificacin de mohos y levaduras.
Medio de cultivo slido para el recuento total de levaduras

Fundamento
y mohos
Inhibidor(es)
Oxitetraciclina inhibe el crecimiento de bacterias
Revelador(es)
Ninguno
Indicador(es)
Crecimiento del hongo
Especie Importancia agronmica
Aspergillus niger Hongo filamentoso, fitopatogeno. Tambin reconocido por
la produccin de cido ctrico, empleado en la industria.
Ejemplo: Aspergillus niger
Positivo Negativo

63
SABOURAUD DEXTRROSA AGAR (SDA)
Es muy empleado para aislar dermatofitos, levaduras y otros hongos, adems para el mantenimiento
de los mismos en un tubo inclinado, lo que se debe a su composicin. Es ideal para observar
morfologa, pero en el caso del crecimiento no es el indicado. El pH de este medio es cido
(aproximadamente 5,0) por lo cual, inhibe el crecimiento de bacterias, pero permite el crecimiento
de las levaduras y la mayora de los hongos filamentosos.
Ejemplo: Thichoderma viride
Positivo Negativo
Este se compone de un digerido enzimtico de casena,

proveniente de tejidos y animales que proporcionan una
fuente nutritiva de aminocidos y compuestos nitrogenados
Fundamento para el crecimiento de hongos y levaduras.
La dextrosa es el carbohidrato fermentable incorporado en
alta concentracin como fuente de carbono y energa. Las
levaduras se identifican por diversas pruebas bioqumicas.
Antibitico como el cloranfenicol o tetraciclina, son

Inhibidor(es)
antimicrobianos. NO permite esporulacin.
Revelador(es) Crecimiento del hongo
Indicador(es) ninguno

Thichoderma viride Fungicida Biolgico

64
SABOURAUD MALTOSA AGAR (SMA)
Este es una modificacin del anterior, ya que en este se sustituye la dextrosa por maltosa. Este es un
medio selectivo debido a su pH acido. La maltosa es el carbohidrato fermentable proporcionar
carbono y energa. Mezcla de peptona proporciona nitrgeno, vitaminas, minerales y cidos
esenciales para el crecimiento aminocidos.
Un medio cido para el aislamiento de dermatofitos,

Fundamento
levaduras y otros hongos
Inhibidor(es)
El pH acido, cicloheximida y cloranfenicol
Revelador(es)
Indicador(es)
ninguno
Hongo entomatgeno (Control mosca
Verticillium lecanii blanca y pulgn.
Ejemplo: Penicillium chrysogenum
Positivo Negativo

65
EXTRACTO DE MALTOSA AGAR (EMA)
Un medio empleado para la enumeracin de hongos y

Fundamento
levaduras
Inhibidor(es)
ninguno
Revelador(es)
Indicador(es)
ninguno
Gibberella zeae Hongo fitopatgeno (afecta principalmente el maz)
Ejemplo: Aspergillus flavus
Positivo Negativo
ORANGE SERUM AGAR. (OSA)

Medio utilizado para el cultivo y recuento de microorganismos acidricos, particularmente los
asociados con el deterioro de jugos de fruta, especialmente de ctricos. Tambin es til para el
cultivo de hongos saprfitos y patgenos.
66
En el medio de cultivo, la triptena y el extracto de levadura aportan
los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La
Fundamento glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y el suero de naranja le
otorga un ambiente cido, favorable para el desarrollo de
microorganismos tolerantes a condiciones de acidez.
Inhibidor(es)
No es diferencial
Revelador(es)
Ninguno
Indicador(es)
Sacharomyces Levadura, de gran importancia en procesos de fermentacin. El
cerevisiae uso en agricultura a sido en la industria de los biocombustibles.
Ejemplo: Lactobasillus plantarum
Positivo Negativo
AGAR DE CZAPEK-DOX (CDA)

Medio para el cultivo de hongos saprfitos, bacterias del suelo y otros microorganismos a partir de
diversos materiales.

67
Este tiene como fuente de carbono es la sacarosa, pero ademas
Fundamento busca identificar que hongos o bacterias pueden utilizar el
nitrato de sodio como nica fuente de nitrgeno.
Inhibidor(es)
No es diferencial
Revelador(es)
Ninguo
Indicador(es)
Especie Importancia agronomica
Rhizoctonia sp Hongo fitopatogeno
Ejemplo: Candida albicans
Positivo Negativo
DICHLORAN GLYCEROL AGAR

Dicloran glicerol Base medio con cloranfenicol se recomienda para el aislamiento selectivo de
hongos xerfilos de muestras de alimentos.

68
Su composicin lo hace selectivo, por lo que de esta manera
Fundamento
permite para la enumeracin del crecimiento fngico.
Inhibidor(es)
Variacin nutricional
Revelador(es)
Ninguno
Indicador(es)
Sphaeropsis sapinea Hongo patgeno, en plantaciones de pino.
Ejemplo: Penicillium chrysogenum
Positivo Negativo

69
REFERENCIAS
Satambrosio, E. Et al. (2009) Tincin y observacin de microorganismos. Universidad tecnolgica

nacional. Tomado de:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf
Lopez, L. et al. (2014) Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa. Mexico. Tomado
de: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
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