IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS

Martha Murcia Aranguren

INTRODUCCIN
Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de
diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas
enzimas (catalasas, coagulasas, decarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc)
involucradas en el metabolismo bacteriano, pueden ser evidenciadas en medios de cultivo
especiales que contienen los substratos (DNA, hidratos de carbono, aminocidos, etc)
sobre los cuales ellas actan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto
la degradacin del substrato o la presencia de un metabolito especfico (cido frmico,
cido lctico, cido succnico, indol, etc).
Las pruebas bioqumicas tambin evalan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a
frrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de
hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores especiales (protenas sricas), la
produccin o no de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina
botulnica, etc).
IMPORTANCIA CLINICA
Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, stas deben ser
identificadas hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su
actividad bioqumica o metablica. Del microorganismo aislado depender el tipo de
tratamiento que debe ser administrado al paciente. Las enterobacterias son las
responsables del 50% de todos los aislamientos clnicamente significativos, producen el
50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las
infecciones urinarias. Son causa importante de infeccin nosocomial.

OBJETIVOS
1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas tiles en la identificacin
de bacterias bacilares Gram negativas.
2. Determinar gnero y especie de la cepa problema.

MATERIALES

Cepas bacterianas: cepas de bactrias bacilares Gram negativas

Mdios de cultivo: Agar TSI (triple azcar hierro), agar LIA (lisina, hierro, agar)
agar UREA, agar CITRATO DE SIMMONS, caldo MR (rojo metilo), caldo VP
(voges proskauer), caldo FENIL ALANINA-malonato, medio SIM (sulfuro, indol,
movilidad), medio OF GLUCOSA (oxidacin, fermetacin).

Otros: reactivo de oxidasa (dimetil para fenilne diamina o tetrametil para feniline
diamina), aceite mineral, rojo de metilo, reactivo de Erlich, KOH 40%, alfa naftol
5%, cloruro frrico 10%.

MTODOS

Sembrar la cepa problema en toda la batera disponible de acuerdo a la siguiente

instruccin:

1- AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una puncin

tubo y estra en superficie.

central

hasta el fondo del

Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los

hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de
gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se lee un
quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador
(parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al
denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y
la alcalinidad con la letra K (color rojo)
Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:
Fermentacin de la glucosa (K/A).
Fermentacin de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)
No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos
de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio.
Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente
dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo.
Produccin de gas: ruptura del medio.
Produccin de H2S:ennegrecimiento del medio
LECTURAS AGAR TSI

A/A K/A K/K A/A K/A

El agar TSI tiene tres azcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L).
Como indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en presencia
de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad.
Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las
bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual
reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para
que se produzca H2S, se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin
generalmente est limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe
leerse como A (cido), aunque el color amarillo usual est tapado por el color negro
(Tabla 1).
2- AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en
superficie.
Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para atacar el
aminocido LISINA descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, la
produccin o no de gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a
37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al
numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde
al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y
la alcalinidad con la letra K (color prpura).
Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:
a- Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminocido solo fermenta la
glucosa.
b- Descarboxilacin de la lisina: (K/K)
c- Desaminacin de la lisina: R/A) rojo/ amarillo
d- Produccin de gas: ruptura del medio
e- Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio
LECTURAS AGAR LIA

R/A K/K K/K K/A

El indicador del PH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira

al color amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de
Glucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.

Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina, con liberacin
de aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO2. Para que acten las
descarboxilasas se requiere PH cido que se obtiene por la fermentacin de la glucosa
que tiene el medio. La desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que se
manifiesta por la aparicin de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por
fermentacin de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el
TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias puedan producir H2S y como
indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S
produciendo un precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca
H2S se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin generalmente est
limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido),
aunque el color amarillo usual est tapado por color negro. (Tabla 2).
3- AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie.
Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un
microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de
fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico.
Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas s es necesario) a
37C.
Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de
acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio
utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el
citrato como nica fuente de cabono tambin es capaz de utilizar las sales de amonio
como nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH )
con la consiguiente alcalinidad del medio.
El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira
al color azul indicando que la prueba es POSITIVA.
Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA.
Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

LECTURAS AGAR CITRATO

+d -

4- AGAR UREA: Sembrar con asa recta, solamente en superficie.

Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir
UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco.

Lectura. Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C.

Fundamento: El sustrato urea es una diamina del cido carbnico, denominada
carbamida. Todas las amidas (RCO- NH2) son rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de
la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa es una enzima
microbiana importante, relacionada con la descomposicin de los compuestos orgnicos.
Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima
adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando se
encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima constitutiva ya que la
sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea.
El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando
una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.
LECTURAS AGAR REA

+d -

5- AGAR SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo.
Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse
(presencia e flagelos), de producir INDOL y H2S.
Lectura: Se efecta de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de reactivo
de ERLICH.
Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminodico
TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El
indol se puede detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color rojo
despus de agregar el reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba POSITIVA,
debido a que el indol reacciona con el grupo aldehdo del p- dimetilaminobenzaldehido. Si
el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL SIM es un medio semislido sin
hidratos de carbono que inhiban la produccin de H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO
fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de H S, lo que lo hace ms
sensible en la deteccin de H2S por produccin de un precipitado negro de sulfuro ferroso.
La MOVILIDAD BACTERIANA es otra caracterstica importante en la identificacin final de
especie, se realiza en medios semislidos como el SIM, debindose leer antes que la
prueba de indol porque al agregar el reactivo de Erlich sta se puede enmascarar. La
prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscpico del
medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin.

LECTURAS AGAR SIM

I: + I: - I: - I: + I: M:+ M:+ M: - M:+ M:+

H2S:-H2S:+H2S:-H2S:+H2S:-

6- CALDOS MR-VP: sembrar en cada caldo con asa recta.

Principio: En el caldo MRVP se determina por qu va metablica fermenta la glucosa la
bacteria.
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de
ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color rojo indica que la
prueba es positiva para MR, la aparicin de un color amarillo indica que la prueba es
NEGATIVA.
Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar
fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparicin de
un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la aparicin de un color amarillo o caf
indica una prueba de VP NEGATIVA.
Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con
produccin de metabolitos como cido lctico, frmico y succnico, los cuales van a hacer
descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el indicador
de pH ROJO DE METILO, el cual a pH cido vira a un color rojo.
La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con produccin
de productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el 2,3 BUTILEN
GLICOL y el DIACETIL. El producto final ms frecuente es el 2,3 BUTILEN GLICOL, que
es fcilmente oxidado a ACETIL METIL CARBINOL y luego a DI-ACETIL. El VP realmente
es una bsqueda de DI- ACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DI-ACETIL, ya
que las condiciones de la prueba convierten fcilmente los otros dos componentes en diacetil. Las 3 sustancias son neutras con el resultado de que PH del medio no baja
sensiblemente y por lo tanto la bacteria es MR negativa y VP positiva.
La bioqumica de la fermentacin de la glucosa hace muy poco probable encontrar
cultivos MR y VP positivos. Lo s es ms probable es encontrar las 2 pruebas negativas
en el caso de bacterias no fermentadoras.

LECTURAS CALDO MR-VP

LECTURAS

MR

VP

SR

7- CALDO FENIL ALANINA- MALONATO: Sembrar con asa recta.

Principio: En el caldo FENIL ALAININA MALONATO se determina la capacidad que
tiene una bacteria de desaminar la FENILALANINA y de utilizar el MALOTO como nica
fuente de carbono.
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C.
Primero se lee la prueba de malonato si cambia al color azul indica que la PRUEBA es
POSITIVA, si continua de color verde la PRUEBA es NEGATIVA.
Para leer la prueba de la FENIL ALANINA agregar 10 g0tas de CLORURO FERRICO al
10%, MEZCLAR FUERTE. La aparicin de un color verde oscuro indica que la prueba es
FENIL ALANINA POSITIVA. Si el color es amarillo castao la PRUEBA es NEGATIVA.
Fundamento: la bacteria puede utilizar el MALONATO de SODIO como nica fuente de
carbono con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es AZUL DE
BROMOTIMOL que en alcalinidad vira al color azul.
Algunas bacterias tienen la capacidad de desaminar la FENIL ALANINA produciendo
ACIDO FENIL PIRUVICO por su actividad enzimtica, con la consiguiente acidez
resultante. Este cido se visualiza al agregar el cloruro frrico.
8- MEDIO OF GLUCOSA (OXIDACIN FERMENTACIN de HUGH Y LEIFSON) :
sembrar por duplicado con asa recta POR PICADURA CENRAL. A uno de los dos tubos
agregar 1 ml de aceite mineral estril.
Principio: Determinar si una bacteria presenta metabolismo FERMENTATIVO u
OXIDATIVO de un hidrato de carbono.
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C.
Fundamento: Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (produccin
de cido) solo en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido aerbica y
anaerbicamente.

La FERMENTACIN es un proceso ANAERBICO que requiere la fosforilacin inicial de

la glucosa previa a su degradacin, mientras que la OXIDACIN en ausencia de
compuestos inorgnicos como nitrato y sulfatos es un proceso estrictamente AEROBIO,
que comprende la oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada
(inicialmente). La fermentacin produce una acidez ms elevada que la producida por la
oxidacin.
El medio OF contiene una elevada concentracin de hidrato de carbono, con una baja
concentracin de peptona, para obviar la posibilidad de que un organismo aerbico utilice
la peptona, produciendo as una condicin alcalina que neutraliza la ms ligera acidez
producida por una bacteria oxidativa.
La baja concentracin de agar permite observar la movilidad del microorganismo, adems
de la capacidad oxidativa o fermentativa, ya que permite la difusin por todo el tubo de la
acidez.
El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en acidez vira al color amarillo
y en alcalinidad al color azul.
Cuando la bacteria es fermentadora los 2 tubos el tapado (tubo con aceite mineral) y el
destapado van a presentar color amarillo).
Cuando la bacteria es oxidadora el tubo tapado permanece de color verde y la superficie
del medio destapado vira al color amarillo.
Si la bacteria es NO SACAROLITICA (ni oxida ni fermenta) los dos tubos son de color
verde, aunque el tubo destapado en una superficie puede presentar un color azul por
degradacin de peptonas producindose aminas.
9- GLUCOSA, LACTOSA y SACAROSA: sembrar cada tubo de hidrato de carbono con
asa recta.
Principio: Determinar si una bacteria FERMENTA o no stos hidratos de carbono. Con o
sin produccin de gas.
Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se debe observar
cuidadosamente la campana de fermentacin o campana de DURHAM, para precisar si
hay o no produccin de gas por desplazamiento de lquido de la campana.
Fundamento: algunas bacterias pueden metabolizar (fermentar) diversos hidratos de
carbono con produccin de cido, anaerbicamente.
El indicador de PH es el ROJO DE FENOL que en acidez vira al color amarillo y en
alcalinidad al color rojo.
10- PRUEBA DE OXIDASA: coloque sobre las colonias 5 gotas de reactivo de OXIDASA.
Observe la reaccin.
Principio: determinar la presencia de las enzimas OXIDADAS.
Lectura: se efecta despus de 10 a 15 SEGUNDOS despus de agregado el reactivo.
Fundamento: la prueba de la oxidasa est basada en la produccin bacteriana de una
enzima OXIDASA. Esta reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema
CITOCROMOOXIDASA que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno

molecular, el que a su vez acta como aceptor de electrones en la etapa terminal del
sistema de transferencia de electrones. Todas las bacterias aerbicas obtienen su
energa por la respiracin, proceso responsable de la oxidacin de algunos sustratos . El
oxgeno molecular oxida un sustrato con la intervencin del sistema de transporte de
electrones. El oxgeno es el aceptor de hidrgeno final, produciendo a partir del H agua
o perxido de hidrgeno, segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico. El sistema
citocromo slo se encuentra por lo general en los aerobios, lo que los hace capaces de
utilizar el 02 como un aceptor de H2 final para reducir el O2 molecular en H202, el ltimo
enlace de la cadena de la respiracin aerbica.
Los diversos colorantes para la prueba de oxidasa son aceptores de electrones
artificiales. La aparicin de un color violeta a negro indica la POSITIVIDAD de la prueba.
Compare sus resultados con los de sus compaeros, observe las diferentes lecturas en
cada uno de los medios de identificacin.
11Identificacin del microorganismo: identifique el microorganismo que le
correspondi con la ayuda de la tabla.

BIBLIOGRAFIA

Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5. Edicin,

Washington Square: Lippincott Raven Publishers, 1997: 173- 203
Mac Faddin J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia
clnica. Panamericana , 1980
Koneman Elmer W. Enterobacteriaceae en Diagnstico Microbiolgico. Panamerica ,
1.983: 152 185

Tabla 1 REACCIONES DE ENTEROBACTERIAS EN TSI

GENERO Y ESPECIE

TENDIDO

FONDO

GAS

H2S

Escherichia
Shigella
S. typhi
Otras salmonellassi
Arizona
Citrobacter
Edwardsiella
Klebsiella
Enterobacter
Hafnia
Serratia
P. vulgaris
P. mitbilis
Morganella
Providencia
Yersinia. Pestis
Y, pseudotuberculosis
Erwinia
Pectobacterium

A (K)
K
K
K
K (A)
K (A)
K
A
A
KoA
KoA
A (K)
K (A)
K
K
K
K (A)
A
A (K)

A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A

+ (-)
+
+
+
+
++
++
-0 +
+
+
- (+)
+0- (+)

+ (-)
+++ (-)
+++
+++
+++
+++
-

K=

Alcalinidad . A= Acidez ( ) = Reacciones ocasionales

10

Tabla 2 REACCIONES DE ENTEROBACTERIAS EN LIA

GENERO Y ESPECIE

TENDIDO

FONDO

GAS

H S

Escherichia
Shigella
Salmonella
S. typhi
S. paratyphi
Arizona
Citrobacter
Edwardsiella
Klebsiella
Enterobacter cloacae
Enterobacter aergenes
Hafnia
Serratia
P. vulgaris
P. mitbilis
Morganella
Providencia
Yersinia
Erwinia
Pectobacterium

K
K
K
K
K
K
K
K
KoN
KoN
K
K
KoN
R
R
KoR
R
K
K
K

KoN
A
KoN
K
A
KoN
A
K
KoN
A
KoN
KoN
KoN
A
A
A
A
A
A
A

-O +)
+o_
-o+
-o+
+o+o+(-)
_
_

+ (-)
+ o- o+
+ (-)
+o+
- (+)
- (+)
_
_

K=
Alcalinidad
A = Acidez
( ) = Reacciones ocasionales
R = Deaminacin oxidative
N = Neutro

11

12