USP38 Vol1 Combined-Spa

2015
USP 38
NF 33
Volumen 1
FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS DE

AME RICA
FORMULARIO NACIONAL
Autorizados por la Convencion de la Farmacopea de
los Estados Unidos de America. Preparados por el Consejo
de Expertos y sus Comites de Expertos
Oficial desde el 1 de mayo de 2015
La designacion
USP NF 2015 en la cubierta de esta publicacion
es solo
para
fines de identificacion.
La publicacion
contiene dos compendios separados: la
Farmacopea de los Estados Unidos de America, Trigesima Octava Revision,
y el
Formulario Nacional, Trigesima Tercera Edicion.
THE UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION

12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852,
Estados Unidos de America
ii
USP 38
DEL PERIODO DE SEIS MESES
GUIA DE IMPLEMENTACION
La Farmacopea de los Estados Unidos de AmericaFormulario Nacional y sus suplementos son oficiales a los seis meses
despues de su publicacion
al publico.
Los compendios USPNF, publicados el 1 de noviembre de cada a

no, son oficiales
desde el 1 de mayo del siguiente a
no. Se ha adoptado la implementacion
de este plazo de seis meses para que los usuarios
dispongan de mas tiempo para lograr que sus metodos y procedimientos cumplan con los requisitos nuevos y revisados de
USPNF.
La tabla siguiente indica las fechas oficiales de los compendios USPNF y sus suplementos. Los compendios de USP 37NF
32, de 2014 y sus suplementos, Anuncios de Revision Intermedia (IRA, por sus siglas en ingles) y Boletines de Revision (Revision
Bulletins) de la mencionada edicion,
seran oficiales hasta el 1 de mayo de 2015, fecha en la que los compendios de USP
38NF 33 seran oficiales.
Publicacion
USP 38NF 33
Primer Suplemento de
USP 38NF 33
Segundo Suplemento de
USP 38NF 33
USP 39NF 34
Fecha de
Publicacion
1 de noviembre de
2014
1 de febrero de 2015
1 de junio de 2015
1 de noviembre de
2015
Fecha Oficial
1 de mayo de 2015
1 de agosto de 2015
1 de diciembre de
2015
1 de mayo de 2016
Oficial hasta
1 de mayo de 2016 (excepto cuando sean reemplazados
mentos, IRAs y Boletines de Revision)
Segundo Suplemento, IRAs y Boletines de Revision)
Boletines de Revision)
mentos, IRAs y Boletines de Revision)
por suplepor el
por IRAs y
por suple-
La siguiente tabla proporciona detalles de los IRAs que aplicaran a los compendios de USP 38NF 33.
IRA
41(1)
41(2)
41(3)
41(4)
41(5)
41(6)
Fecha de Publicacion
de PF
2 de enero de 2015
3 de marzo de 2015
1 de mayo de 2015
1 de julio de 2015
2 de septiembre de 2015
3 de noviembre de 2015
Fecha de Entrega de
los Comentarios
31 de marzo de 2015
31 de mayo de 2015
31 de julio de 2015
31 de enero de 2016
Fecha de Publicacion
de IRA
30 de mayo de 2015
31 de julio de 2015
30 de enero de 2016
27 de marzo de 2016
Fecha Oficial de IRA

1 de julio de 2015
1 de enero de 2016
1 de marzo de 2016
1 de mayo de 2016
Los Boletines de Revision publicados en el sitio Web de la USP seran oficiales a partir de la fecha especificada en el Boletn de
Revision.
OBSERVACIONES Y ADVERTENCIAS
En relacion con los Derechos de Patentes o Marcas de los EE.UU.La inclusion
en la Farmacopea de los Estados Unidos o en el
Formulario Nacional de una monografa sobre cualquier farmaco respecto al cual puedan existir derechos de patentes o de
marcas no se considerara, ni pretende ser, una garanta de derecho o privilegio protegido por dicha patente o marca, ni una
autoridad para ejercer dicho derecho o privilegio. Tales derechos y privilegios estan adjudicados al propietario de la patente o
marca y ninguna otra persona podra ejercerlos sin permiso expreso, autoridad o licencia otorgados por el propietario de
dicha patente o marca.
Con relacion al Uso de Textos de la USP o del NFSe destaca el hecho de que los derechos de autor de los textos de la USP
y el NF estan debidamente protegidos. Los autores y demas personas que deseen usar partes del texto deberan solicitar
permiso al Secretario de la Junta Directiva de la Convencion
de la USP (USPC).
Copyright 2015 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
ISSN: 1930-2924
ISBN: 978-1-936424-35-1
Impreso en los Estados Unidos de America por United Book Press, Inc., Baltimore, Maryland
USP 38NF 33
Contenido iii
VOLUMEN 1
Artculos Nuevos que Aparecen en USP 38 Ausentes

en USP 37 y sus Suplementos . . . . . . . . . . . . . xl
Mision
y Prefacio . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
vii
Integrantes del Ciclo de Revision
20102015 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
xv
Funcionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv
Junta Directiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv
Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv
Comites de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi
Grupos Asesores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiv
In Memoriam
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiv
Miembros y Delegados de la Convencion

de la Farmacopea de los
Estados Unidos de America,
a partir
del 31 de mayo de 2014 . . . . . . . . . . . xxv
Reconocimiento para los Donantes de
Materiales de Referencia y de
Monografas en 2013 . . . . . . . . . . . . xxxii
Artculos Incluidos en USP 37 Ausentes

en USP 38 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xli
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xlii
Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . 1
Captulos Generales
Ver pagina 52 para detalles del contenido
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . . . 57
Requisitos Generales para Pruebas y
Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Equipos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . . 104
Pruebas Microbiologicas
. . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Pruebas y Valoraciones Biologicas
. . . . . . . . . . 144
Pruebas y Valoraciones Qumicas . . . . . . . . . . . 233
Pruebas y Determinaciones Fsicas . . . . . . . . . . 416
Informacion
General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 752
Acta Constitutiva . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxiv

Gobierno de la USP . . . . . . . . . . . . . . . . xxxv
Estatutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxv
Normas y Procedimientos . . . . . . . . . . . . . . . . xxxv
Polticas de la USP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxv
Suplementos Dieteticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 1917
Reactivos, Indicadores y
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1979
Especificaciones de Reactivos . . . . . . . . . . . . . 1984

Indicadores y Papeles Indicadores de
Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2056
Incorporaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . .
xxxix
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2058
Artculos Incorporados a USP 38 mediante

Suplementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxix
Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 2058
Preliminares
Contenido
Preliminares
iv Contenido
USP 38NF 33
Soluciones Colorimetricas . . . . . . . . . . . . . 2060

Soluciones Reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2060
Soluciones Volumetricas . . . . . . . . . . . . . . . 2069
Indice
Indice Combinado de USP 38 y NF 33 . . . . . . . I-1
Columnas Cromatograficas . . . . . . . . . . . . . . 2078
VOLUMEN 3
Tablas de Referencia
Envases para Dispensar Capsulas y Tabletas . . 2083
Descripcion
y Solubilidad Relativa de Artculos
de la USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2093
Gua para los Captulos Generales . . . .
Solubilidades Aproximadas de Artculos de la

USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2157
Advertencias
Pesos Atomicos
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2166
vii
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi
Masas Atomicas
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2169
Tabla Alcoholimetrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2171
Tabla de Viscosidad Intrnseca . . . . . . . . . . . . 2173
USP 38
Equivalencias de Temperatura . . . . . . . . . . . . 2175
Monografas
Indice
Monografas Oficiales de USP 38, IZ . . . . . . 4207
Indice
VOLUMEN 2
VOLUMEN 4
vii
vii
Advertencias
Advertencias
USP 38
Suplementos Dieteticos
Monografas
Monografas Oficiales de USP 38, AH . . . . . . 2177
Monografas Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6289
USP 38NF 33
Incorporaciones
Artculos Incorporados a NF 33 mediante
Suplementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6954
Artculos Nuevos que Aparecen en NF 33
Ausentes en NF 32 y sus Suplementos . . . . 6954
Artculos Incluidos en NF 32 Ausentes
en NF 33 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6954
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6955
Excipientes
Excipientes USP y NF, Agrupados por
Categora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6957
Monografas
Monografas Oficiales de NF 33 . . . . . . . . . . . 6967
Indice
Preliminares
NF 33
Contenido v
USP 38
Mision y Prefacio vii
Este apartado brinda informacion

sobre la Convencion
de
la Farmacopea de los Estados Unidos de America (USP), as
a
como tambien informacion
general sobre la 38. revision
de
la Farmacopea de los Estados Unidos de America (USP 38) y la
33.a edicion
del Formulario Nacional (NF 33) y sus Suplementos. Los textos de USP 38NF 33 seran oficiales a partir del
1 de mayo de 2015, los textos del Primer Suplemento de
USP 38NF 33 seran oficiales a partir del 1 de agosto de
2015 y los textos del Segundo Suplemento de USP 38NF 33
seran oficiales a partir del 1 de diciembre de 2015, a menos que se indique algo diferente.
DE LA MISION
DECLARACION
Los compendios USPNF se publican en cumplimiento con
la mision
de la USP: Mejorar la salud en todo el mundo a
traves de normas publicas y programas relacionados que ayuden a garantizar la calidad, seguridad y beneficio de los medicamentos y alimentos.
HISTORIA
En la Camara de Senadores del Capitolio de los EE.UU.,
once medicos se reunieron el 1 de enero de 1820 para establecer una farmacopea para los EE.UU. Estos profesionales
buscaban crear un compendio de los mejores medicamentos
que ya estuviesen completamente establecidos, darles nombres utiles
y proporcionar recetas para su preparacion.

Casi
un a
no despues, el 15 de diciembre de 1820, se publico la
primera edicion
de la Farmacopea de los Estados Unidos de
America. Con el tiempo, la naturaleza de la Farmacopea de
los Estados Unidos de America (USP) paso de ser un compendio de recetas a un compendio de normas para identidad y
calidad que por lo general implican el uso de materiales de
referencia como estandares de comparacion
en pruebas y
valoraciones especficas. Con el tiempo, tambien se ha cambiado el cronograma de publicacion
de la USP. Desde 1820
hasta 1942 la USP se publico cada 10 a
nos, mientras que
desde 1942 hasta 2000 cada cinco a
nos, y a partir de 2002
anualmente.
En 1888, la American Pharmaceutical Association (Asociacion
Farmaceutica de los Estados Unidos) publico el primer
Formulario Nacional bajo el ttulo Formulario Nacional de Preparaciones No Oficiales (NF, por sus siglas en ingles). Tanto la
USP como el NF fueron reconocidos en la Ley Federal de
Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos de 1906,
y nuevamente en la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosmeticos de 1938 (Ley FD&C). En 1975 la USP adquirio el Formulario Nacional (NF) que contiene actualmente
normas de excipientes, y que tambien requiere el uso de
materiales de referencia. La USP continua
desarrollando los
compendios USP y NF mediante el trabajo del Consejo de
Expertos, publicando una obra que proporciona normas
para artculos basada en los avances de las ciencias analticas
y metrologicas.
As como evolucionan e stas y las ciencias

afines, lo mismo sucede con la USP y el NF.
CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS USPNF

Los compendios USPNF contienen monografas de sustancias (ingredientes) y productos para artculos oficiales reconocidos en los compendios USPNF. Los terminos sustancia oficial, preparacion oficial y artculo oficial se definen en
las Advertencias y Requisitos Generales (Advertencias Generales). Salvo escasas excepciones, todos los artculos sobre los
que existen monografas en los compendios USPNF se comercializan legalmente en los EE.UU. o estan contenidos en
artculos que se comercializan legalmente. Los compendios
USPNF tambien incluyen monografas para preparaciones
magistrales.
Una monografa de USPNF de una sustancia, producto o
preparacion
oficial puede constar de varios componentes,
incluido el nombre del artculo, la definicion,
las condiciones
de envasado, almacenamiento y otros requisitos, y una especificacion.
La especificacion
consiste en una serie de pruebas universales (descripcion,
identidad/identificacion,
impurezas, valoracion)
y pruebas especficas, uno o mas
procedimientos analticos para cada prueba y criterios de
aceptacion.
Los ingredientes se definen como farmacos o
excipientes. Un excipiente es todo componente, distinto de
la sustancia o las sustancias activas, agregado intencionalmente a la formulacion
de una forma farmaceutica. Los excipientes no son necesariamente inertes. Los farmacos y excipientes pueden ser sinteticos, semisinteticos, obtenidos de
la naturaleza (fuente natural) o fabricados empleando tecnologa recombinante. Los farmacos que consisten en moleculas de mayor tama
no y las mezclas que requieren una
prueba de potencia por lo general se denominan productos
biologicos
o artculos biotecnologicos.
Los captulos generales proporcionan los procedimientos

que se citan con frecuencia, a veces con criterios de aceptacion,
con el fin de compilar en un solo lugar informacion
repetitiva que se aplica a muchas monografas. Las monografas y captulos generales, nuevos, eliminados y revisados
de esta edicion
se indican en el apartado Incorporaciones.
Organizacion
de los Compendios USPNFLos compendios USPNF se publican en cuatro volumenes.
El Volumen 1 incluye secciones de preliminares (Mision y Prefacio,

Integrantes, sitios Web y paginas del Gobierno de la USP e
Incorporaciones/Lista Detallada). Asimismo, incluye Advertencias y Requisitos Generales, Captulos Generales, captulos generales de Suplementos Dieteticos, Reactivos y Tablas de Referencia. El Volumen 2 incluye monografas de la USP
correspondientes a las letras AH y el Volumen 3 incluye monografas de la USP correspondientes a las letras IZ. El Volumen 4 incluye monografas de Suplementos Dieteticos, Incorporaciones del NF/Lista Detallada, Excipientes y monografas
del NF. Para facilitar el uso y referencias convenientes, todos
los cuatro volumenes
incluyen el ndice combinado, as

como las Advertencias y Requisitos Generales y la Gua para
los Captulos Generales. Los captulos generales especficos
para los suplementos dieteticos se incluyen por orden numerico con los demas captulos generales en la USP. Las
monografas de excipientes se presentan por lo general en
el NF, pero pueden tambien aparecer en la USP, con la refe-
Preliminares
Mision
y Prefacio
USP 38NF 33 y sus
Suplementos
Preliminares
viii Mision y Prefacio

rencia cruzada correspondiente cuando tambien son farmacos. El apartado Excipientes (Volumen 4) presenta una tabla
de los excipientes organizados por categora funcional.
Revisiones de USPNFLos compendios USPNF se revisan en forma continua. Las revisiones se presentan anualmente, como Revisiones de Normas en USPNF y en los Suplementos semestrales, y como Revisiones Aceleradas en el
sitio Web de la USP [Fe de Erratas, Anuncios de Revision Intermedia (Interim Revision Announcement (IRA)) y Boletines de
Revision (Revision Bulletins)].
Revisiones de NormasEl proceso de Revision de Normas
de la USP requiere la publicacion
de las propuestas de la
revision
en el Pharmacopeial Forum (PF) durante un perodo
de notificacion
y comentarios de 90 das y, despues de la
aprobacion
del Comite de Expertos pertinente de la USP, se
publica la revision
en los proximos
compendios USPNF o
Suplemento, segun
corresponda.
Revisiones AceleradasSe usa el proceso de Revision Acelerada para oficializar revisiones de USPNF en forma mas
rapida que a traves del proceso de Revision de Normas de la
USP. Las Revisiones Aceleradas, que incluyen la Fe de Erratas,
los Anuncios de Revision Intermedia y los Boletines de Revision,
se publican en el sitio Web de la USP, no siempre requieren
notificacion
ni comentarios y permiten que una revision
se
oficialice antes de la publicacion
de los proximos
compendios USPNF o Suplemento. Ver la USP Guideline on Use of

Accelerated Processes for Revisions to the USPNF (Gua de la
USP sobre el Uso de los Procesos Acelerados para las Revisiones
de USPNF), publicada en el sitio Web de la USP.
Fe de ErratasLas Erratas son contenido erroneamente
publicado en una publicacion

de la USP que no refleja con
exactitud la intencion
de los requisitos oficiales o vigentes
tal como los aprobara el Consejo de Expertos. Por lo general, son cambios que no tienen un impacto amplio sobre las
normas. Las correcciones de las Erratas no estan sujetas a
comentarios publicos
y se comunican a las partes interesadas mediante su publicacion

en la seccion
Official Text
(Texto Oficial) del sitio Web de la USP. Las Erratas ya no se
publican en los compendios impresos USPNF ni en sus Suplementos, sino que se publican en el sitio Web de la USP.
Las correcciones de las Erratas se oficializan el primer da del
mes posterior a su publicacion.
Las correcciones de las Erratas se incorporan en los siguientes compendios USPNF o
Suplemento disponibles y se marcan en el texto impreso
conforme a lo descrito mas adelante.
Anuncios de Revision Intermedia (IRA)Un IRA aparece en
el PF primero como un Anuncio de Revision Intermedia Propuesto (Proposed Interim Revision Announcement) con un periodo de comentarios de 90 das. Cuando no existen comentarios significativos, el IRA se oficializa en la seccion
de
Official Text (Texto Oficial) del sitio Web de la USP, con la
fecha oficial indicada. Los IRA se incorporan en los siguientes
compendios USPNF o Suplemento disponibles.
Boletines de RevisionSi las circunstancias requieren la publicacion
rapida de un texto oficial, puede publicarse una
revision
o aplazamiento a traves de un Boletn de Revision.
Los Boletines de Revision se publican en el sitio Web de la
USP con la fecha oficial indicada. Los Boletines de Revision se
incorporan en los siguientes compendios USPNF o Suplemento disponibles.
Modificacion de Referencias FarmacopeicasEn ocasiones,
la USP y sus Comites de Expertos consideran necesario modificar los ttulos de los captulos generales o de textos similares que pudieran estar referidos en otras normas en los
compendios USP-NF. Cuando esto sucede, el personal de la
USP lleva a cabo un riguroso proceso para identificar y actualizar tales referencias. Dichas actualizaciones pueden realizarse mediante una revision
de rutina, o para casos en los
que una actualizacion
no representa un cambio significativo
en el estandar en cuestion,
mediante una actualizacion
directa de la referencia en dicha norma sin necesidad de aviso
ni periodo de comentarios. En todos los casos, la USP publicara en su sitio Web un aviso en el que se indique el cambio
USP 38
de la fuente, cualquier referencia resultante y si dichas referencias se actualizaran a traves de una revision
de rutina o
una actualizacion
directa.
Actualizacion de la Informacion QumicaLas actualizaciones de la seccion
de Informacion
Qumica al principio de las
monografas se realizan continuamente y no se identifican
con smbolos de revision.
Los nombres qumicos y los pesos
moleculares se actualizan cuando la monografa se somete a
revision
para que correspondan con la fuente oficial, Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas
en ingles). Las estructuras qumicas se actualizan de forma
continua.
Los nombres qumicos por lo general reflejan las convenciones al momento del desarrollo o revision
de la monografa. Si las reglas de nomenclatura de CAS o IUPAC han sufrido cambios importantes, los nombres qumicos pueden
revisarse o agregarse para reflejar dichas reglas. Los pesos
moleculares se derivan de la formula
qumica y se basan en
la tabla de pesos atomicos.
Los pesos atomicos
son los recomendados por IUPAC y reflejan la composicion

isotopica
de
material terrestre normal. Cuando se presenten cambios en
los valores recomendados por IUPAC, se entiende que los
cambios en los pesos moleculares se realizaran dentro del
tiempo esperado.
La representacion
grafica de las estructuras de compuestos qumicos tiene como proposito
ayudar a establecer la
identidad qumica y se entiende que representa una de muchas formas posibles de representar la molecula. Es posible
introducir cambios en la representacion
grafica que resulten
en la misma informacion
qumica, p.ej., una molecula quiral
invertida, se puede agregar fuera del proceso de revision.
Asimismo, se entiende que para el tautomerismo, la molecula representada puede ser uno de los tautomeros,
pero se
entiende que la intencion
es representar todos los isomeros
en equilibrio. Los centros estereogenicos representados con

enlaces sin realce implican mezclas de estereomerosenan
tiomeros,
diastereomeros,
epmeros (anomeros),
entre otros.
Dependiendo del momento de estas actualizaciones, los
usuarios podran notar diferencias en una estructura qumica
entre las publicaciones del PF y de los compendios USPNF,
as como entre la version
impresa y en lnea de los compendios USPNF.
Pharmacopeial Forum (PF)El PF es el vehculo de la USP
para notificacion
publica
y comentarios. Las propuestas de

revision
se incluyen en los apartados Revisiones en Proceso
(In-Process Revisions) o en el Anuncio de Revision Intermedia
Propuesto (Proposed Interim Revision Announcement) (ver
mas arriba) y representan borradores de revisiones que se
espera alcancen la condicion
de oficiales, supeditadas a la
revision
final y aprobacion
del Comite de Expertos pertinente.
El PF esta disponible unicamente
en lnea y sin costo alguno. El acceso gratuito al PF tiene como proposito
facilitar
la participacion
abierta y publica
en el proceso de revision
de los compendios USPNF. El PF incluye los cambios y adiciones propuestos a los compendios USPNF, incluyendo la
Armonizacion en Etapa 4 y los artculos de Estmulos (Stimuli)
para los que la USP busca comentario publico.
Todas las
propuestas, incluidos los IRA, tienen un periodo de comentarios de 90 das.
SuplementosLos Suplementos de USPNF se rigen por
un programa de publicacion
estandar anual: el Primer Suplemento se publica en febrero y se oficializa el 1 de agosto. El
Segundo Suplemento se publica en junio y se oficializa el 1
de diciembre. Los usuarios de los productos impresos de la
USP deben conservar los Suplementos y verificar la seccion
de Official Text (Texto Oficial) del sitio Web de la USP

para contar con el texto oficial actualizado. La version
en
lnea de los compendios USPNF se actualiza con cada Suplemento o con la revision
anual. Cada vez que se publica una
nueva edicion
o Suplemento durante la suscripcion
vigente,
se publica una nueva version
electronica.
El Indice de cada
Suplemento es acumulativo e incluye citas de la revision
anual y, en el caso del Segundo Suplemento, citas del Primer
USP 38
Mision y Prefacio ix
Tipo de Revision
Anuncio de
Revision Intermedia
Boletn de
Revision
Texto eliminado
Smbolo
texto nuevo(IRA 01-jul2014)
texto nuevo (BR 01-ene2014)
(IRA 01-jul-2014) o
1S (USP38)
(USP38)
Texto adoptado
en los
Suplementos
Texto adoptado
en USPNF
Armonizacion
Erratas
Subndice
(IRA 01-jul-2014)*
texto nuevo1S (USP38)
texto nuevo(USP38)
texto nacional remanente o texto no armonizado

texto nuevo (ERR 01-jul-
(BR 01-ene-2014)*
(IRA 01-jul-2014)*
1S (USP38)*
USP38**
1S o 2S (edicion
anual de la USP)*
Edicion
anual de la
USP**
(ERR 01-jul-2014)
2014)
Referencias a captulos
texto nuevo (AF 1-may-
(AF 1-may-2015)
2015)
texto nuevo (Oficial 1-dic-
(Oficial 1-dic-2015)
2015)
* Un numero
o fecha en subndice indica el IRA, el Boletn de Revision o

el Suplemento donde la revision
aparecio por primera vez.
** Un ejemplo de una revision
que se oficializo en los compendios
USPNF sera USP38.
La siguiente tabla presenta los smbolos y fechas oficiales

para los IRA y los Suplementos de los compendios USP 38NF
33.
Fechas Oficiales y Smbolos

Para los Anuncios de Revision Intermedia y los Suplementos de los
Compendios USP 38NF 33
Suplemento
Anuncio de
Revision
Intermedia
Propuesto
41(1)
1
41(2)
41(3)
2
USP
39NF
34
41(4)
41(5)
41(6)
Fecha Oficial
1 de julio de 2015
1 de agosto de 2015
1 de diciembre de 2015
1 de enero de 2016
1 de marzo de 2016
1 de mayo de 2016
Smbolos
y(IRA 01-jul-2015)
y1S (USP38)
y(IRA 01-sep-2015)
y(IRA 01-nov-2015)
y2S (USP38)
y(IRA 01-ene-2016)
y(IRA 01-mar-2016)
y(IRA 01-may-2016)
Asimismo, en la version
en lnea de los compendios
USPNF, las monografas y captulos generales que han sido
revisados, pero que aun
no se han publicado en los compendios USPNF ni sus Suplementos (p.ej., como Revisiones
Aceleradas) incluiran conos vinculados a la pagina en el sitio
Web de la USP donde se puede revisar el nuevo texto oficial. Estos conos tambien estaran vinculados a las Revisiones
Aceleradas [p.ej., Boletines de Revision (Revision Bulletins),
Anuncios de Revision Intermedia (IRAs) y Fe de Erratas] y Armonizacion en Etapa 6 (ver a continuacion
la seccion
Actividades de Armonizacion).
ComentariosPara las revisiones que se publican para su
revision
y comentarios publicos
en el PF, la propuesta puede

oficializarse o, en su defecto, republicarse en el PF para revision
y comentarios adicionales. Si se reciben comentarios
adicionales, estos son considerados e incorporados por el
Comites de Expertos segun
corresponda. Para los casos en
los que las propuestas se oficialicen sin necesidad de republicacion
en el PF, se publica un resumen de los comentarios
recibidos junto con las respuestas pertinentes del Comite de
Expertos en el apartado Comentarios del sitio Web de la USP
al momento de la publicacion
de la revision.
Los Comentarios no forman parte del texto oficial y no

estan destinados para su aplicacion
por parte de autoridades
reglamentarias, sino que explican los fundamentos de las
respuestas del Comite de Expertos a los comentarios publi
cos. En caso de discrepancia entre el contenido de los Comentarios y el texto oficial, el texto oficial prevalecera. En
caso de controversia o cuestionamiento sobre la interpretacion,
prevalecera el lenguaje del texto oficial, de manera
unica
e independiente de los Comentarios.

Presentaciones Impresas y ElectronicasLos
compendios USPNF y sus dos Suplementos se encuentran disponibles en version

impresa, en memoria flash USB y en formato
electronico
en lnea. El formato electronico
en lnea permite
a usuarios individuales registrados acceder a los compendios
USPNF a traves de la Internet. La version
en memoria flash
USB brinda a los usuarios acceso directo a los compendios
USPNF en sus computadoras sin necesitar acceso a la Internet. Los formatos electronicos
se actualizan en forma acumulativa para integrar el contenido de los Suplementos. Las

monografas y los captulos generales en el formato en lnea
de los compendios USPNF se actualizan utilizando conos
vinculados a texto oficial en el sitio Web de la USP [Boletines
de Revision (Revision Bulletins), Anuncios de Revision Intermedia (IRAs), Fe de Erratas y Armonizacion en Etapa 6] que
aun
no han sido publicados en los compendios USPNF o
sus Suplementos.
ORGANOS
DE GOBIERNO, DE ESTABLECIMIENTO DE
NORMAS Y DE ASESORAMIENTO DE LA USP
Los organos
de gobierno, de establecimiento de normas y

de asesoramiento de la USP incluyen la Convencion
de la
Preliminares
Suplemento. Los dos Suplementos se incluyen en la siguiente

edicion
anual, junto con las nuevas revisiones oficiales que
hayan sido adoptadas con posterioridad al Segundo Suplemento de la edicion
previa de los compendios.
Traducciones de USPNFLos compendios USPNF se encuentran disponibles en ediciones en espa
nol, ruso y chino.
El mantenimiento de la edicion
en espa
nol sigue el mismo
enfoque de revision
que la edicion
en ingles; las demas traducciones estan basadas en revisiones anteriores de los compendios USPNF.
Estandares
de Referencia USPEl uso de los Estandares

de Referencia USP promueve la calidad uniforme de los medicamentos y sustenta la fiabilidad y uniformidad para aquellos que llevan a cabo los analisis para el cumplimiento de
las normas y demas usuarios de los compendios USPNF,
incluidos fabricantes, compradores y autoridades reglamentarias. Los Estandares de Referencia USP se citan en procedimientos especficos tanto en monografas como en captulos
generales. La USP oficializa este material a traves de estudios
meticulosos de caracterizacion
y de analisis colaborativos,
seguidos por la revision
y aprobacion
del uso farmacopeico
del material de referencia por parte de los Comites de Expertos del Consejo de Expertos. El Catalogo USP, que lista la
coleccion
de Estandares de Referencia USP, se encuentra disponible en el sitio Web de la USP (www.usp.org). Este programa se beneficia de una amplia contribucion
voluntaria de
materiales adecuados y de datos de prueba pertinentes por
parte de fabricantes de productos farmaceuticos.
Texto Sombreado y SmbolosEl texto sombreado se
usa para identificar el texto que ha sido modificado, agregado o eliminado desde su ultima
publicacion.
Los smbolos
identifican el inicio y el final de cada revision
o de texto no
armonizado. La siguiente tabla resume los tipos de smbolos
y los subndices relacionados que se usan en las publicaciones de la USP:
USP 38
Preliminares
x Mision y Prefacio
Figura 1. Consejo de Expertos de la USP para el periodo 20102015

USP, la Junta Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comites de Expertos, Paneles de Expertos y personal. Otros cuerpos de voluntarios incluyen Foros de Partes Interesadas,
Equipos de Proyecto y Grupos de Asesoramiento, que actuan
en calidad de asesores brindando su opinion

a los or
ganos de gobierno, de establecimiento de normas y de administracion
de la USP.
Convencion
de la USPLa composicion
de la Convencion
de la USP se determina de manera tal que se asegure
una representacion
global de todos los sectores del sistema
de salud, con e nfasis en los profesionales del cuidado de la
salud, dado el legado de los mismos en la USP (ver la seccion
Historia). Los Delegados de las organizaciones miembro
de la Convencion
con derecho a voto eligen al Presidente,
al Tesorero y a otros miembros de la Junta Directiva as
como tambien al Consejo de Expertos. Tambien adoptan las
resoluciones que guan la direccion
estrategica de la USP y
enmiendan los Estatutos de la USP. La Convencion
de la
USP se reune
una vez cada cinco a

nos; la ultima
reunion
se
llevo a cabo en abril de 2010 en Washington, D.C. La seccion
Integrantes incluye un listado actualizado de los Delegados de la Convencion
de la USP con derecho a voto.
Junta DirectivaLa Junta Directiva de la USP es responsable de la gestion
de los asuntos comerciales, las finanzas y
los bienes de la USP. Durante los cinco a
nos que dura su
gestion,
la Junta define la direccion
estrategica de la USP
mediante una planeacion
estrategica y decisiones que atan
en a operaciones y polticas clave. Un listado con los nombres de los miembros de la Junta Directiva del ciclo
20102015 figura en la seccion
Integrantes.
Consejo de Expertos y Comites de ExpertosEl Consejo de Expertos es el organo
que establece las normas de la
USP. A partir de esta publicacion,

e ste se compone de 26
miembros, cada uno de los cuales preside un Comite de
Expertos. Los miembros del Consejo de Expertos son elegidos para periodos de cinco a
nos por la Convencion
de la
USP o, para los Presidentes de Comites de Expertos creados
en medio de un ciclo, son elegidos por el Consejo de Expertos en funciones y rigen hasta completar el ciclo. Estos Presidentes eligen a su vez a los miembros de sus Comites de
Expertos. Los Comites de Expertos son responsables del contenido de las publicaciones oficiales autorizadas de la USP
(ver la Figura 1). El Comite Ejecutivo del Consejo de Expertos incluye a todos los Presidentes de los Comites de Expertos y proporciona directivas generales, constituye un organo
de apelaciones y cumple con otras funciones que respaldan

las operaciones del Consejo de Expertos.
Paneles de ExpertosEl Presidente del Consejo de Expertos puede nombrar Paneles de Expertos para que colaboren con el Consejo de Expertos mediante recomendaciones
a Comites de Expertos especficos en respuesta a un encargo especfico consecuente con el Plan de Trabajo del Comite de Expertos. Los Paneles de Expertos se encuentran en
constante formacion
y sus temas y miembros se presentan
en la seccion
de Integrantes.
Foros de Partes Interesadas y Equipos de ProyectoLa
USP ha formado varios Foros de Partes Interesadas y Equipos
de Proyecto a nivel nacional e internacional para intercambiar informacion
acerca del uso e implementacion
de las
normas de la USP. Los Foros de Partes Interesadas pueden
formar Equipos de Proyecto para trabajar en temas seleccionados. A continuacion
se presenta una lista actualizada de
los Foros de Partes Interesadas de la USP.
USP 38
NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
Documentos RectoresLas normas de los compendios
USPNF gozan de un gran reconocimiento porque son normas autorizadas, tienen fundamento cientfico y se establecen a traves de un proceso transparente y fiable. Ver la seccion
Acta Constitutiva en este libro; los Estatutos y las
Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos estan disponibles en la pagina web de la USP (www.usp.org). Colectivamente, estos documentos sirven como principios rectores
de las actividades referentes al establecimiento de normas
para el personal y los colaboradores voluntarios de la USP.
Conflictos de InteresesLas disposiciones de la USP respecto de los Conflictos de Intereses exigen que todos los
miembros del Consejo de Expertos, sus Comites de Expertos, los Paneles de Expertos, la Junta Directiva y el personal
que trabaje en puestos clave declaren cualquier interes economico
o de otro tipo que pudiera interferir con sus funciones como voluntarios de la USP. A los miembros de la Junta
Directiva, del Consejo de Expertos y de sus Comites de Expertos se les requiere servir a la USP en su capacidad individual de expertos, sin responder a ningun
interes externo y
no se les permite tomar parte en la discusion
final ni votar
en ningun
caso en los que surja un conflicto de intereses o
parezca haberlo. Los miembros de los Paneles de Expertos
unicamente
proveen asesora y pueden discutir y votar sobre

temas que reflejen los puntos de vista de partes interesadas
externas, siempre que se haya revelado todo interes y cualquier conflicto notorio de forma oportuna y adecuada y que
e ste haya sido comunicado al Comite de Expertos pertinente
junto con las recomendaciones del Panel de Expertos.
Confidencialidad y Divulgacion
de DocumentosLos
miembros del Consejo de Expertos, los Comites de Expertos
y Paneles de Expertos firman acuerdos de confidencialidad,
de conformidad con la Poltica de Confidencialidad de la
USP y las disposiciones de confidencialidad de las Normas y
Procedimientos del Consejo de Expertos. La Poltica de Divulgacion
de Documentos de la USP, disponible en el sitio Web
de la USP, contribuye a lograr la transparencia en el proceso
de establecimiento de normas haciendo que la informacion
se encuentre a disposicion
del publico
y a la vez protege a
los fabricantes y a otros que presenten informacion
confidencial ante la USP.
Autoridad de PublicacionLos
compendios USPNF se
publican de conformidad con los Propositos
del Artculo II
de los Estatutos de la USP, el cual indica que El proposito
por el que se forma la Convencion

se establece en el Acta
Constitutiva e incluye el desarrollo y la difusion

de normas
publicas
para medicamentos y otros artculos, as como la

participacion
en programas relacionados con la salud pu
blica.
DE LOS COMPENDIOS USPNF
PROCESO DE REVISION
Participacion
PublicaSi
bien el Consejo de Expertos de

la USP constituye el organo
encargado de tomar decisiones

en ultima
instancia sobre las normas de USPNF, estas normas se desarrollan mediante un proceso excepcional de participacion
publica
e interaccion
sustancial entre la USP y sus
partes interesadas, tanto a nivel nacional como internacional. La participacion
en el proceso de revision
es el resultado del apoyo que brindan muchos individuos y grupos,
as como organizaciones cientficas, tecnicas y comerciales.
Actualizaciones a los Compendios USPNFLa USP
tiene varios mecanismos para actualizar los compendios
USPNF con nuevas monografas o revisiones a monografas
vigentes. Un mecanismo es el modelo de donante, en el
cual la informacion
para una monografa o captulo general
es presentada de forma voluntaria a la USP por fabricantes u
otras partes interesadas. En este caso, el donante presenta la
informacion
mediante una Solicitud de Revision. La USP ha
preparado un documento titulado Pautas para la Presentacion de Monografas a fin de facilitar la presentacion
de monografas [disponible en www.usp.org, buscar en Monograph Submission Guidelines (Pautas para la Presentacion
de
Monografas)]. Asimismo, la USP actualiza las normas a
traves de los procedimientos desarrollados por los laboratorios de la USP. Los laboratorios de la USP pueden desarrollar
procedimientos individuales de identificacion,
valoracion
e
impurezas para su inclusion
en una norma propuesta. La
USP tambien colabora con otras farmacopeas para incorporar normas ya desarrolladas a los compendios USPNF. Todas
las normas independientemente de la fuente, se presentan
en forma de una propuesta en el PF para su revision
y comentario publico.
La Figura 2 muestra el proceso de revision
y comentario publico
y el desarrollo de las normas.

Trabajo Conjunto con la Administracion
de Alimentos
y Medicamentos de los Estados Unidos (Food and Drug
Administration o FDA)Conforme a lo especificado por la
ley de los EE.UU., la USP trabaja con el secretario del Department of Health and Human Services (Secretara de Salud
y Asuntos Sociales), principalmente a traves de la FDA. La
USP trabaja de distintas formas con dicha agencia, pero la
interaccion
principal se da mediante el Programa de Enlaces
de la FDA. El cual permite que representantes de este organismo participen en las reuniones de los Comites de Expertos y de los Paneles de Expertos, con lo que se facilita la
interaccion
entre el personal cientfico de la FDA y los Comites de Expertos. El personal de los Centros de la FDA responsable de revisar las actividades farmacopeicas proporciona oportunidades y vnculos especficos para el
intercambio de comentarios. El Dr. Paul Seo del Center for
Drug Evaluation and Research (Centro de Evaluacion
e Investigacion
de Medicamentos) es el contacto principal para
los temas farmacopeicos entre la FDA y la USP. Entre las
demas actividades que la USP lleva a cabo con la FDA se
incluyen la colaboracion
sobre temas especficos tales como
la modernizacion
de monografas y las actividades de trabajo en el a mbito internacional.
RECONOCIMIENTO LEGAL
Reconocimiento de los compendios USPNFLos compendios USPNF estan reconocidos por la legislacion
y se
usan en muchos pases del mundo. En los EE.UU., la Ley
FD&C (Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosmeticos)
define el termino compendio oficial para referirse a la USP
oficial, al NF oficial, a la Farmacopea Homeopatica de los Estados Unidos de America oficial o a cualquiera de sus suple-
Preliminares
Foros de Partes Interesadas en America del Norte (Estados Unidos de America y Canada)
Prescripcion/No
prescripcion
Excipientes
Ingredientes Alimenticios
Medicamentos Veterinarios
Foros Internacionales de Partes Interesadas
India
Mexico
Brasil
Otros
La USP tambien realiza Simposios Cientficos y sobre Normas en los EE.UU., India, China, America Latina, Medio
Oriente/Africa
del Norte y en otras regiones del mundo.
PersonalLa USP cuenta con una plantilla superior a
800 cientficos, profesionales y empleados administrativos en
su oficina central de Rockville, Maryland, EE.UU. y alrededor
del mundo, incluyendo los laboratorios en Hyderabad, India;
Shangai, China; y San Pablo, Brasil; una oficina de gestion
de cuentas en Basilea, Suiza; un sitio de capacitacion

en
Accra, Ghana; y una oficina de Promocion
de la Calidad de
los Medicamentos [Promoting the Quality of Medicines,
(PQM, por sus siglas en ingles)] en Addis Ababa, Etiopa.
Mision y Prefacio xi
USP 38
Preliminares
xii Mision y Prefacio
Figura 2. Proceso de Revision

Publica
para el Establecimiento de Normas de la USP

mentos. Segun
se indica a continuacion
(y en la seccion
2.30 de las Advertencias Generales), las normas de USPNF

desempe
nan un papel en las disposiciones sobre adulteracion
y rotulacion
incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C
[las cuales se aplican tambien a productos biologicos,
que
constituyen un subconjunto de medicamentos bajo la Public
Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Publica)].
La
USP no desempe
na ningun
papel en la imposicion
del cumplimiento de estas ni otras provisiones que reconozcan las
normas de USPNF, al ser aquella una responsabilidad de la
FDA y demas autoridades gubernamentales en los EE.UU. y
demas pases.
De conformidad con las disposiciones pertinentes de la
Ley FD&C, un medicamento sera considerado como rotulado incorrectamente (misbranded) a menos que porte en la
etiqueta, excluyendo cualquier otro nombre comun,
el nombre establecido, que por lo general es el nombre farmacopeico (ver la seccion
Nomenclatura mas adelante). Un medicamento con un nombre reconocido en USPNF debe
cumplir con los requisitos de identidad/identificacion
de su
monografa o sera considerado adulterado, rotulado incorrectamente, o ambos. Los medicamentos tambien deben
cumplir con las normas farmacopeicas de contenido, calidad
y pureza (valoraciones y pruebas para impurezas), a menos
que declaren todos los aspectos en los que difieren. La FDA
requiere que los nombres de los artculos que no son oficiales se distingan y diferencien claramente de cualquier otro
nombre reconocido en un compendio oficial. Los medicamentos con un nombre reconocido en USPNF tambien se
consideraran rotulados incorrectamente a menos que cumplan con las normas farmacopeicas de envasado y
etiquetado.
MedicamentosEl objetivo de la USP es contar con monografas de farmacos y medicamentos en los compendios
USPNF para todos los medicamentos legalmente comercializados en los EE.UU., incluyendo medicamentos qumicos y
biologicos,
y sus ingredientes. La USP tambien desarrolla

monografas para productos terapeuticos legalmente comercializados no aprobados por la FDA; p.ej., medicamentos an-
teriores a 1938, medicamentos de venta libre comercializados bajo el sistema de Monografas de Medicamentos de
Venta Libre de la FDA (FDA OTC Monograph System), suplementos dieteticos y preparaciones magistrales. Cuando
corresponda, el cumplimiento de lo estipulado en una monografa de USPNF, sera obligatorio en todo momento durante la vida de un artculo, desde su produccion
hasta su
caducidad.
Productos BiologicosEn
los EE.UU., los productos biologicos
se consideran un subconjunto de medicamentos, independientemente de que esten aprobados por la FDA de

conformidad con la Ley FD&C [y se les conceda una solicitud de medicamento nuevo (NDA, por sus siglas en ingles)]
o de conformidad con la Public Health Service Act [la Ley
PHS, por la que reciben una licencia de productos biologi
cos (BLA, por sus siglas en ingles)]. Como resultado, todos
los productos biologicos
considerados por la Ley PHS estan

sujetos a los requisitos reglamentarios para medicamentos
de la Ley FD&C, lo que significa que tienen que cumplir
con las disposiciones sobre adulteracion
y rotulacion
incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C, incluyendo los requisitos farmacopeicos de USPNF. Lo anterior se aplica de la
misma manera a los productos biologicos
aprobados por la
va 351(a)de larga data de la Ley PHS, as como por la
nueva va 351(k) para productos biosimilares agregada
por la reforma de la legislacion
de salud de 2010 [Biologics
Price Competition and Innovation Act, Title VII, Subtitle A of
the Patient Protection and Affordable Care Act, Public Law
111-148 (Ley sobre Innovacion
y Precios Competitivos para
Productos Biologicos,
Ttulo VII, Subttulo A de la Ley de

Proteccion
y Cuidados de la Salud Accesibles para el Paciente, Ley Publica
111-148)].
Dispositivos MedicosEl Artculo 201(h) de la Ley
FD&C define como dispositivo a un instrumento, aparato,
artculo similar, o componente de los mismos, reconocido
en USPNF. La Seccion
502(e) de la Ley FD&C, en ausencia
de una designacion
de la FDA, define el nombre establecido
de un dispositivo como el ttulo oficial en un compendio
oficial. A pesar de estas disposiciones reglamentarias, no se
USP 38
Etiquetado para el ciclo 2010-2015, se formo en 1986 para

crear nombres reconocidos apropiados para las formas farmaceuticas y los productos farmaceuticos combinados, y
para desarrollar polticas de nomenclatura. Hoy en da, el
Comite de Expertos en Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado coordina su trabajo con el Consejo de la USAN y, en la
gran mayora de los casos, conserva el nombre existente
provisto por la USAN o por la FDA. El Comite de Expertos
en Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado tambien establece
la Gua de Pronunciacion,
que utiliza la USAN.
El Consejo de la USAN comenzo en 1961 proporcionando
los nombres de los ingredientes de los medicamentos antes
de su comercializacion.
La USP participa en esta actividad
junto con la American Medical Association (Asociacion
Medica de los Estados Unidos), la American Pharmacists Association (Asociacion
de Farmaceuticos de los Estados Unidos) y
la FDA. Las conclusiones del Consejo se incorporan en el
USP Dictionary of USAN and International Drug Names (ver la
seccion
USP Dictionary mas adelante).
Nombres Qumicos y Numeros
de Registro CASLos
subttulos qumicos que aparecen en las monografas son los
nombres empleados en los ndices del Chemical Abstracts
Service (Servicio de Resumenes
Qumicos; CAS, por sus siglas en ingles) de la American Chemical Society (Sociedad
Qumica de los Estados Unidos). Solo
se incluyen en las monografas cuyos ttulos especifican sustancias que constituyen
entidades qumicas definibles. El primer subttulo es la forma
invertida del nombre qumico sistematico desarrollado por el
CAS para los propositos
del Indice Colectivo (Collective Index o CI). El segundo subttulo, que se presenta en forma
no invertida, es un nombre IUPAC preferido (PIN) sancionado y empleado por la International Union of Pure and
Applied Chemistry (Union
Internacional de Qumica Pura y
Aplicada o IUPAC). Los nombres IUPAC preferidos tambien
son usados por la Organizacion
Mundial de la Salud (OMS).
En ocasiones, se proporciona un tercer subttulo por razones
historicas
o cuando el sinonimo
emplea una convencion

nominal alternativa pero equivalente. Las monografas con subttulos qumicos generalmente incluyen tambien los numeros
de registro CAS. Estos numeros
entre corchetes funcionan

de manera independiente de la nomenclatura como indicadores numericos invariables de sustancias qumicas singulares, no ambiguas, en el registro CAS y, por consiguiente,
son convenientes y gozan de un uso difundido.
ACTIVIDADES DE ARMONIZACION
Grupo de Debate FarmacopeicoLa USP armoniza las
monografas de excipientes y los captulos generales farmacopeicos en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por
sus siglas en ingles). Este grupo incluye representantes de la
Farmacopea Europea, de la Farmacopea Japonesa y de la
Farmacopea de los Estados Unidos de America, as como de
la OMS (como observador). De acuerdo con la definicion
del PDG, un captulo general farmacopeico u otro documento farmacopeico esta armonizado cuando una sustancia
o un producto farmaceutico, que se analiza segun
el procedimiento armonizado del documento, produce los mismos
resultados y se llega a la misma decision
respecto de aceptarlo o rechazarlo. El sitio Web de la USP contiene informacion
sobre el PDG, incluyendo la historia, el procedimiento
de trabajo del PDG, un glosario y una lista de las monografas y captulos generales que han completado las etapas de
16 del proceso de armonizacion
farmacopeica que resulta
en texto aprobado de Armonizacion en Etapa 6 de USP.
Otras Actividades de ArmonizacionLa
USP participa
en diversas actividades de armonizacion
que incluyen a todas las farmacopeas. Estas actividades, actualmente en desarrollo, se enfocan en Buenas Practicas Farmacopeicas y normas publicas
optimas
para todos los medicamentos.
Preliminares
cuenta con un reconocimiento del papel de la USP para

establecer normas farmacopeicas para dispositivos medicos
comparable al que existe para medicamentos y productos
biologicos.
De acuerdo con la Ley de Modernizacion

de la
Administracion
de Alimentos y Medicamentos de 1997, el
Center for Devices and Radiological Health (Centro para Dispositivos y Salud Radiologica)
reconoce normas nacionales e

internacionales, entre las que se incluyen algunas pruebas y
valoraciones de la USP para dispositivos medicos.
Suplementos DieteticosLas enmiendas a la Ley FD&C
de la Ley de Salud y Educacion
sobre Suplementos Dieteticos de 1994 establecen que se puede considerar a un suplemento dietetico rotulado incorrectamente (misbranded) si
dicho suplemento esta cubierto por las especificaciones de
un compendio oficial (es decir, los compendios USPNF), declara cumplir con dichas especificaciones y no cumple con
las mismas. En esto difiere de un producto farmaceutico,
para el cual la conformidad con la norma farmacopeica aplicable es obligatoria sin necesidad de aseverarlo.
Preparaciones MagistralesLa preparacion
magistral
implica la preparacion,
mezclado, ensamblaje, alteracion,
envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo u

otro artculo, derivado de una orden de un profesional de la
salud o como iniciativa a dicha orden, basandose en los
patrones rutinarios de administracion
regularmente observados. La USP proporciona captulos generales y monografas
para preparaciones magistrales. Las monografas para preparaciones magistrales incluyen formulas
(ingredientes y cantidades), instrucciones especficas para preparar correctamente la preparacion

en cuestion,
informacion
de envasado
y almacenamiento, informacion
de etiquetado, pH, fechas
lmites de uso basadas en estudios de estabilidad y valoraciones detalladas (en la mayora de las monografas). Las
normas en los compendios USPNF para preparaciones magistrales pueden hacerse cumplir a nivel estatal (debido a
que, tradicionalmente, la practica farmaceutica/preparacion
magistral esta regulada por los consejos estatales de farmacia), y por la FDA [puesto que las preparaciones magistrales
sujetas a regulacion
por parte de la FDA como medicamentos, se mantienen sujetas a las disposiciones sobre adulteracion
y rotulacion
incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C,
la cual requiere el cumplimiento con las normas de
USPNF].
NomenclaturaLa USP, como miembro del Consejo de
Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus
siglas en ingles), trabaja para determinar los nombres de
farmacos y sustancias biologicas.
La autoridad de la USP
para desarrollar nombres comunes oficiales esta reconocida
en la Seccion
502(e) de la Ley FD&C (vease tambien la poltica de la FDA sobre nombres establecidos estipulada en el
Ttulo 21 del CFR, 299.4). De conformidad con las reglas de
la USP y con la legislacion
federal aplicable, el nombre oficial es el ttulo de un artculo reconocido en los compendios
USP o NF, el cual se determina al momento de publicar una
monografa para el artculo y que incluye el nombre del
artculo en el ttulo de la monografa. La FDA y los tribunales consideran que los nombres comunes aprobados por la
FDA son nombres provisorios que se usan unicamente
hasta
que la USP designa un nombre. En 1962, el Congreso
otorgo a la FDA la autoridad para cambiar un nombre designado por la USP. Si la FDA determina que un nombre
designado por la USP es excesivamente complejo o que carece de utilidad por cualquier otra razon,
dicha agencia
puede llevar a cabo un proceso de reglamentacion
mediante notificacion
y comentarios de conformidad con la
seccion
508 de la Ley FD&C, y designar un nombre oficial
distinto para su uso en los compendios USP y NF. En contraste con el papel de la USP para designar nombres genericos, la designacion
de nombres comerciales patentados o
registrados (marca) es responsabilidad exclusiva de la FDA
en su interaccion
con los solicitantes.
El Comite de Expertos en Nomenclatura de la USP, predecesor del Comite de Expertos en Nomenclatura, Seguridad y
Mision y Prefacio xiii
Preliminares
xiv Mision y Prefacio

OTROS COMPENDIOS DE LA USP
USP Medicines CompendiumEl USP Medicines Compendium (MC) es un compendio en lnea que incluye monografas, captulos generales y materiales de referencia para medicamentos qumicos y biologicos
adecuados y sus
ingredientes, aprobados por las autoridades reglamentarias
nacionales en cualquier pas. El proposito
del MC es ayudar
a garantizar que estos medicamentos sean de buena calidad
mediante el ofrecimiento de normas publicas
y materiales
de referencia pertinentes y actualizados. Las normas del MC
estan disponibles para fabricantes, compradores, autoridades
reglamentarias nacionales y demas interesados, para asegurar el cumplimiento de un medicamento con las normas del
MC mediante analisis. El MC no incluye normas para alimentos o para medicamentos tradicionales/suplementos dieteticos. El MC esta disponible en https://mc.usp.org
USP on Compounding: A Guide for the Compounding
PractitionerEl USP on Compounding es un compendio electronico
que incluye todos los captulos generales que se encuentran en los compendios USPNF relacionados con la
preparacion
magistral, ademas de captulos generales de
sustento a los que se hace referencia en los captulos de
preparacion
magistral y en las Advertencias y Requisitos Generales USPNF. El proposito
de USP on Compounding es proporcionar acceso conveniente a los captulos generales para

los profesionales encargados de la preparacion
magistral.
USP Herbal Medicines CompendiumEl USP Herbal Medicines Compendium (HMC) es un compendio en lnea que
ayudara a garantizar la calidad de los ingredientes botanicos
usados en los medicamentos botanicos. Las monografas del
HMC proporcionan especificaciones de calidadpruebas,
procedimientos y criterios de aceptacioncon
procedimientos analticos validados y materiales de referencia relacionados que facilitan la evaluacion

del cumplimiento. El HMC
puede ayudar a fabricantes de ingredientes, fabricantes de
productos botanicos, agencias reglamentarias y otras partes
interesadas en la evaluacion
del cumplimiento de los ingredientes botanicos medicinales con normas publicas
independientes y para controlar la calidad de artculos que se comercializan internacionalmente. El HMC esta disponible en
https://hmc.usp.org.
USP Dietary Supplements CompendiumEl Dietary Supplements Compendium combina, en dos volumenes,
las normas
USPNF para suplementos dieteticos, normas e informacion
del Food Chemicals Codex, documentos reglamentarios y de
USP 38
la industria, as como otras herramientas y recursos. Se publica cada dos a
nos en una edicion
impresa de tapa dura.
Food Chemicals CodexEl Food Chemicals Codex (FCC) es
un compendio reconocido internacionalmente de normas de
monografas y pruebas de pureza y calidad para ingredientes alimenticios, p.ej. conservantes, saborizantes, colorantes
y nutrientes. El FCC se publica cada dos a
nos, con suplementos cada seis meses, y esta disponible en formato impreso y electronico.
Las revisiones propuestas al FCC estan

disponibles para su revision
y comentario publico
a traves
del FCC Forum, al cual se puede acceder de manera gratuita
en forum.foodchemicalscodex.org.
OTROS RECURSOS DE LA USP
Chromatographic ColumnsEsta exhaustiva publicacion
de referencia, previamente titulada Chromatographic Reagents (Reactivos Cromatograficos), ofrece informacion

detallada necesaria para llevar a cabo los procedimientos cromatograficos incluidos en los compendios USPNF. La
publicacion
Chromatographic Columns lista los nombres comerciales de los reactivos para columna citados en todas las
propuestas de procedimientos analticos nuevos o revisados
para cromatografa de gases o de lquidos publicados en el
PF desde 1980. La publicacion
Chromatographic Columns
tambien ayuda a mantener un registro de los reactivos que
se usaron para validar los procedimientos analticos que se
han oficializado. El listado de reactivos para columna con
sus marcas se actualiza bimestralmente y se publica en el
sitio Web de la USP.
USP DictionaryEl USP Dictionary of USAN and International Drug Names ofrece, en un solo volumen, los Nombres
Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en
ingles) mas actualizados para los farmacos; los nombres
USPNF oficiales; las denominaciones comunes, los nombres
comerciales y qumicos; las formulas
graficas; las formulas
y
los pesos moleculares; los numeros
de registro CAS y las

designaciones por codigo;
los fabricantes de farmacos; y las

categoras farmacologicas
y terapeuticas. El USP Dictionary

ayuda a asegurar la exactitud de los siguientes puntos: etiquetado del producto; informes, artculos y correspondencia; solicitudes reglamentarias de la FDA y prospectos de
productos farmaceuticos. Se publica anualmente. (Ver Nomenclatura.)
USP 38
Integrantes / Comites xv
20102015 Ciclo de
Revision
Funcionarios de la Convencion
de la USP, Junta
Directiva, Consejo de Expertos, Comites de
Expertos, Paneles de Expertos y Grupos Asesores
Funcionarios (20102015)
Timothy R. Franson, B.S. Pharm., M.D.
Presidente
Washington, DC
Rene H. Bravo, M.D., F.A.A.P.
Presidente Saliente
San Luis Obispo, CA
John E. Courtney, Ph.D.
Tesorero
Bethesda, MD
Susan S. de Mars, J.D.
Secretaria
Rockville, MD
Junta Directiva (20102015)

Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Presidente
Representante At-Large
Des Moines, IA
Carolyn H. Asbury, Ph.D., Sc.M.P.H.
Representante del Interes Publico
New York, NY
Robert L. Buchanan, Ph.D.
Representante At Large
College Park, MD
Thomas E. Menighan, B.S. Pharm., M.B.A., Sc.D.,
F.A.Ph.A.
Washington, DC
Robert M. Russell, M.D.
Representante del Sector Medicina
Arlington, MA
Kiran Mazumdar-Shaw
Bangalore, India
Marilyn K. Speedie, Ph.D.
Representante del Sector Farmacia
Minneapolis, MN
Stephen P. Spielberg, M.D., Ph.D.
Representante del Sector Medicina
Upper Gwynedd, PA
Jeffrey L. Sturchio, Ph.D.
New York, NY
Gail R. Wilensky, Ph.D.
Bethesda, MD
Ron T. Piervincenzi, Ph.D.
Director Ejecutivo, Febrero 2014presente
(ex-officio)
Rockville, MD
Consejo de Expertos (20102015)

Roger L. Williams, M.D.
Presidente, Consejo de Expertos, 20002014
Rockville, MD
Ron T. Piervincenzi, Ph.D.
Presidente, Consejo de Expertos, Febrero 2014presente
Rockville, MD
James E. Akers, Ph.D.
Presidente, Captulos GeneralesMicrobiologa
Leawood, KS
Gregory E. Amidon, Ph.D.
Presidente, Captulos GeneralesAnalisis Fsico
Ann Arbor, MI
Lawrence H. Block, Ph.D.
Presidente, MonografasExcipientes
Pittsburgh, PA
Matthew W. Borer, Ph.D.
Presidente, Estandares de Referencia
Indianapolis, IN
Gigi S. Davidson, B.S.Pharm., DICVP
Presidente, Preparacion Magistral
Raleigh, NC
James E. DeMuth, Ph.D.
Presidente, Captulos GeneralesFormas Farmaceuticas
Madison, WI
Andrew G. Ebert, Ph.D.
Presidente, MonografasIngredientes Alimenticios
Sandy Springs, GA
Mary G. Foster, Pharm.D., BFA
Presidente, Captulos GeneralesEnvasado,
Preliminares
Integrantes
Preliminares
xvi Comites / Integrantes

Almacenamiento y Distribucion
Philadelphia, PA
Antony Raj Gomas, Ph.D.
Presidente, USP Medicines CompendiumSur Asia
Hyderabad, India
Dennis K.J. Gorecki, B.S.P., Ph.D.
Presidente, MonografasSuplementos Dieteticos
Saskatoon, SK, Canada
Jean F. Huxsoll, Ph.D.
Presidente, MonografasProductos Biologicos y
Biotecnologa 2
Emeryville, CA
Eugene J. McGonigle, Ph.D.
Presidente, MonografasMoleculas Peque
nas 4
Langhorne, PA
Alla A. Mikhaylova, M.S.
Presidente, USP Medicines CompendiumEstados
Recientemente Independizados
Moscow, Russia
Michael G. Mulkerrin, Ph.D.
Presidente, MonografasProductos Biologicos y
Biotecnologa 1
Redwood City, CA
Bernard A. Olsen, Ph.D.
nas 3
West Lafayette, IN
Robert E. Osterberg, Ph.D.
Presidente, Toxicologa
Vienna, VA
Ernest Parente, Ph.D.
nas 2
Overland Park, KS
Dhananjay Patankar, Ph.D.
Presidente, USP Medicines CompendiumProductos
Biologicos
Bangalore, India
Thomas P. Reinders, Pharm.D.
Presidente, Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado
Richmond, VA
Maria Ines R.M. Santoro, Ph.D.
Presidente, USP Medicines CompendiumAmerica Latina
Sao Paulo, Brazil
Robert R. Singer, M.Sc.
Presidente, Estadstica
Union City, CA
Jiasheng Tu, Ph.D.
Presidente, USP Medicines CompendiumAsia Oriental
Nanjing, Jiangsu, China
Glenn A. Van Buskirk, Ph.D.
nas 1
Basking Ridge, NJ
Wesley E. Workman, Ph.D.
Presidente, Captulos GeneralesAnalisis Biologico
Chesterfield, MO
Timothy J. Wozniak, Ph.D.
Presidente, Captulos GeneralesAnalisis Qumico
Indianapolis, IN
Comites
de Expertos (20102015)
[NotaEl siguiente listado de Comites de Expertos
incluye los Paneles de Expertos que asesoran a Comites
de Expertos especficos. El listado de Paneles de
Expertos y sus miembros representa a aquellos Paneles
formados y aprobados en su totalidad a partir de
septiembre de 2014. Los Paneles de Expertos se forman
y desintegran continuamente durante todo el ciclo de
revision
de la USP, por lo que en un futuro se publicaran
otras listas de miembros.]
USP 38
Paneles de Expertos para el Comite

Ejecutivo del Consejo de Expertos
Panel de Expertos para la Traduccion
al Espa
nol
ENRIQUE FEFER, PH.D., Presidente
Peggy Casanova, M.Sc.; Ofelia Espejo, Ph.D.; Lidiette
Fonseca Gonzalez, M.Sc.; Jose Juarez Eyzaguirre, Ph.D.;
Monica I. Hirschhorn, M.Sc.; Jose Mara Parisi, M.Sc.;
Luisa Fernanda Ponce DLeon
Quiroga, Ph.D.; Oscar
Quattrocchi, M.Sc.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.;
Caroline R. Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
Comites
de Expertos de la Farmacopea
de los Estados Unidos de America
Nomenclatura, Seguridad y Etiquetado
THOMAS P. REINDERS, PHARM.D., Presidente
Mary B. Baker, M.B.A., Pharm.D.; Lawrence H. Block,
Ph.D.; Dawn M. Boothe, D.V.M., Ph.D.; Mrunal S.
Chapekar, Ph.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.;
Steven J. Dentali, Ph.D.; Dennis E. Doherty, M.D.;
Abraham G. Hartzema, Pharm.D., Ph.D., MSPH; William
M. Heath, B.S. Pharm., MBA; William M. Heller, Ph.D.;
Kent T. Johnson, M.S.; Donald S. MacLean, Ph.D.; Joan
C. May, Ph.D.; Ginette A. Pepper, R.N., Ph.D., FAAN;
Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Debora J. Simmons, R.N.,
M.S.N.; R. William Soller, Ph.D.; Kailas Thakker, Ph.D.;
Thomas Tice, Ph.D.; Theodore G. Tong, Pharm.D.;
Jeanne Tuttle, B.S.Pharm.; Ping Wang, M.S.; Anthony
Wong, M.D., Ph.D.
Panel de Expertos en Directrices Modelos para
MedicareCONCLUIDO
DAVID H. CAMPEN, M.D., Presidente
Nancy Jo Braden, M.D.; Chester B. Good, M.D., MPH;
Roy Guharoy, Pharm.D., MBA; Raymond Hohl, M.D.,
Ph.D.; Arthur I. Jacknowitz, Pharm.D.; Ronald P.
Jordan, R.Ph., APhA; Rice C. Leach, M.D., MSHSA;
David B. Lorber, M.D., FCCP; Raymond C. Love,
Pharm.D., FASHP; Philip Marcus, M.D., MPH; Gary
Matzke; Joel S. Mindel, M.D.; Mark Noga, Pharm.D.;
Charles D. Ponte, Pharm.D.; N. Lee Rucker, MSPH;
Melody Ryan, Pharm.D., MPH; Joanne G.
Schwartzberg, M.D.; Brian K. Solow, M.D.; Robert L.
Talbert, Pharm.D.; Dennis P. West, Ph.D.
Panel de Expertos en Etiquetado de Envases de
Medicamentos de Venta Bajo Receta
JOANNE G. SCHWARTZBERG, M.D., Y GERALD MCEVOY, PHARM.
D., Co-Presidentes
Cindy Brach, MPP; Joan E. Kapusnik-Uner, Pharm.D.;
Sandra Leal, Pharm.D.; Linda L. Lloyd, M.Ed.; Melissa
A. Madigan, Pharm.D.; Daniel G. Morrow, Ph.D.;
Ruth M. Parker, M.D.; Thomas P. Reinders, Pharm.D.;
William H. Shrank, M.D.; Patricia E. Sokol, R.N., J.D.;
Darren K. Townzen, MBA; Jeanne Tuttle, Pharm.D.;
Michelle D. Wiest, Pharm.D.; Michael S. Wolf, Ph.D.,
MPH
Panel de Expertos en Pronunciacion
WILLIAM M. HELLER, PH.D., Presidente

Mary B. Baker, Pharm.D.; Stephanie Y. Crawford,
Ph.D.; Kent T. Johnson, M.S.; David F. Long, Ph.D.;
Joan C. May, Ph.D.; Anthony Palmieri, Ph.D.; Thomas
P. Reinders, Pharm.D.
MonografasMoleculas
Peque
nas 1
GLENN A. VAN BUSKIRK, PH.D., Presidente
USP 38
MonografasMoleculas
Peque
nas 2
ERNEST PARENTE, PH.D., Presidente
Mahmoud M. H. Al Omari, Ph.D.; Allan D. Bokser, Ph.D.;
Shrikant N. Dhumal, Ph.D.; Tina M. Engel, Ph.D.; Maria
Ines R.M. Santoro, Ph.D.; Dennis A. Stephens, Ph.D.;
Luciano Virgili, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.; Bo Wen,
Ph.D.; Joseph E. Yakupkovic, Ph.D.; Patrick N. Yat, Ph.D.;
Louis W. Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno
DAVID A. FAY, PH.D., Presidente
Greg J. Davies; Tina M. Engel, Ph.D.; Saulius A. Gylys;
Clifford J. Herman, Ph.D.; Poonam Pall, M.S.; Greg A.
Roberts, M.A.; David H. Rogers, Ph.D.; Gregory K.
Webster, Ph.D.; Kylen W. Whitaker, Ph.D.
MonografasMoleculas
Peque
nas 3
BERNARD A. OLSEN, PH.D., Presidente
Richard A. Blessing, M.S.; Thomas A. Broadbent, Ph.D.;
Nicholas Cappuccino, Ph.D., M.B.A.; Ian Chung, Ph.D.;
John E. Daniels, M.S., M.B.A.; Jeffrey S. Fleitman, Ph.D.;
Yuri Goldberg, Ph.D., D.Sc.; Pauline M. Lacroix, M.Sc.;
Julie K. Lorenz, Ph.D.; Mark G. Papich, D.V.M., M.S.;
Donald M. Parsons, Ph.D.; David G. Reed, M.B.A.;
Thomas W. Rosanske, Ph.D.; Joseph G. Stowell, Ph.D.;
Cathy L. Wood
MonografasMoleculas
Peque
nas 4
EUGENE J. MCGONIGLE, PH.D., Presidente
Lakshmi Prasad Alaparthi, Ph.D.; Mark S. Bailey; Josep M.
de Ciurana; Alain Duguet, Ph.D.; Quanyin Gao, Ph.D.;
Jerome M. Lewis, M.B.A., Ph.D.; Oscar Liu, Ph.D.; Marian
L. Meyer, M.B.A., Ph.D.; Colin Minchom, Ph.D.; Patrick
A. Noland, M.S.; Vijaya Ramesh, B.Pharm.; Hemant
Kumar Sharma, Ph.D.; Michael J. Skibic, M.S.; William J.
Taraszewski, Ph.D.; Michiel M. Van Oort, Ph.D.; Martin J.
Williamson, Ph.D.; Steve S. Zigler, Ph.D.
MonografasProductos Biologicos
y
Biotecnologa 1
MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Parastoo Azadi, Ph.D.; Christopher J.
Burns, Ph.D.; Frederic Carriere, Ph.D.; Charles S. Craik,
Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.; Helene GazzanoSantoro, Ph.D.; Anne Munk Jespersen, Ph.D.; Kristian
Johansen, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Barbara Mulloy,
Ph.D.; Harold N. Rode, Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.;
Yeowon Sohn, Ph.D.
Panel de Expertos en Valoraciones Biologicas
de
Eritropoyetina
CHRISTOPHER J. BURNS, PH.D., Y MICHAEL G. MULKERRIN, PH.D.,
Co-Presidentes
Jan Amstrup, Ph.D.; Evangelos Bakopanos, Ph.D.; Jill
A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Helene Gazzano-Santoro,
Ph.D.; Martin Schiestl, Ph.D.
Panel de Expertos en Glucagon
HAROLD RODE, PH.D., Presidente

Jan Amstrup, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Adrian
F. Bristow, Ph.D.; Anne M. Jespersen, Ph.D.; Elizabeth
Clark Kramer, Ph.D.
Panel de Expertos en Insulina
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Wilfried P. Arz, Ph.D.; Matthew
W. Borer, Ph.D.; Chris J. Burns, Ph.D.; Helene
Gazzano-Santoro, Ph.D.; Morten Hach, M.S.; Anne M.
Jespersen, Ph.D.; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.;

Martin Schiestl, Ph.D.
Panel de Expertos en Heparinas de Bajo Peso
Molecular
ELAINE GRAY, PH.D., Y EDWARD K. CHESS, PH.D., CoPresidentes
Christopher P. Bryant, Ph.D.; Ishan Capila, Ph.D.;
Venkatesan S. Chidambaram, Ph.D.; Soby M. Fennell;
Gyongyi S. Gratzl, Ph.D.; Kristian Johansen, Ph.D.;
Barbara Mulloy, Ph.D.; Anna K.Y. Nordin; Bruna
Parma, M.Sc.; Patrick A. Rousseau, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Christian Viskov, Ph.D.
Panel de Expertos en Preparaciones
Farmaceuticas
Enzimaticas
FREDERIC CARRIERE, PH.D., Presidente

Anisha Akula, Ph.D.; Gregory M. Beck, Ph.D.; Charles
S. Craik, Ph.D.; Luigi Ghidorsi; Andreas Koerner;
Thomas Langdon; Claus Middelberg, Ph.D.; Tibor
Sipos, Ph.D.
Panel de Expertos en Peptidos
Terapeuticos
MICHAEL R. DEFELIPPIS, PH.D., Presidente

Ivo F. Eggen, Ph.D.; Brian P. Gregg, M.B.A.; Marion
King, Ph.D.; Paul Matejtschuk, Ph.D.; Narendra R.
Patel, M.Sc.; Marie-Aimee Plancquaert, Ph.D.; Harold
Rode, Ph.D.; Raimon Rubires, Ph.D.; Firuz Shakoori,
Ph.D.; Ved P. Srivastava, Ph.D.; Aleksander Swietlow,
Ph.D.; Michael S. Verlander, D.Phil.
Panel de Expertos en Heparinas no Fraccionadas
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Edward K. Chess, Ph.D.; Huihong Fan, Ph.D.; Gyongyi
S. Gratzl, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Kristian Johansen,
Ph.D.; Jian Liu, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.; Christian Viskov,
Ph.D.
MonografasProductos Biologicos
y
Biotecnologa 2
JEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Merry L. Bain, M.S.; Barbara E.
Blum, Ph.D., M.P.H.; Pamela Clark, M.D., J.D.; Elaine
Gray, Ph.D.; Deepak Jain, Ph.D.; Christopher Mason,
Ph.D., FRCS; Brian K. Nunnally, Ph.D.; Nicole M. Provost,
Ph.D.; William E. Tente, M.S.; Peter J. Vandeberg, Ph.D.;
Darin J. Weber, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Celulas
CD-34 Positivas
NICOLE M. PROVOST, PH.D., Presidente
Amy R. Cohen, B.S.; Gregory A. Hale, M.D.; Ruud
Hulspas, Ph.D.; Lori A. Jones; Michael D. Rosu-Myles,
Ph.D.; Richard J. Stebbings, Ph.D.; D. Robert
Sutherland, M.Sc.; Lili Wang, Ph.D.; Albertus W.
Wognum, Ph.D.
Panel de Expertos en Analisis
de Protenas
Plasmaticas
TIMOTHY K. HAYES, PH.D., Presidente

Mehrshid Alai, Ph.D.; Joseph Bertolini, Ph.D.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Dorothea
Sesardic, Ph.D.; Derek G. Toth, M.S.; Peter J.
Vandeberg, Ph.D.
Panel de Expertos en Factores de Coagulacion
Derivados de Plasma y Recombinantes

JEAN F. HUXSOLL, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Gretchen A. Elliott, M.S.; Elaine
Gray, Ph.D.; Steven Herring, Ph.D.; Michael Jankowski
Panel de Expertos en Tejidos y Productos
Derivados de Tejidos
DEEPAK JAIN, PH.D., Y WILLIAM E. TENTE, M.S., Co-Presidentes
Preliminares
Jay C. Brumfield, Ph.D.; Elizabeth B. Cariello; David A.

Fay, Ph.D.; Rupa Iyer, M.S.; Amy J. Karren, N.R.C.M.;
Assad J. Kazeminy, Ph.D.; Huiyi Li, Ph.D.; Raphael M.
Ornaf, Ph.D.; Jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; David F. Schuck,
Ph.D.; Nhan L. Tran, Ph.D.; Danny L. Tuck, Ph.D.
Integrantes / Comites xvii
Preliminares
xviii Comites / Integrantes

Merry L. Bain, M.S.; Barbara E. Blum, Ph.D., M.P.H.;
Robert Buehler, Ph.D.; Frederick Cahn, Ph.D.;
Shannon L.M. Dahl, Ph.D.; Steven Goldstein, Ph.D.;
John E. Kemnitzer, Ph.D.; Alyce Linthurst Jones, Ph.D.;
Timothy Neja, M.B.A; Darin J. Weber, Ph.D.; Wesley E.
Workman, Ph.D.
Captulos GeneralesAnalisis
Qumico
TIMOTHY J. WOZNIAK, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Christopher Burgess,
Ph.D.; Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Pei Chen, Ph.D.;
Thomas J. DiFeo, Ph.D.; John W. Dolan, Ph.D.; Edward J.
Fletcher; John P. Hammond, FRSC; John V. Hinshaw,
Ph.D.; Paul R. Keller, Ph.D.; Nancy Lewen; Todd D.
Maloney, Ph.D.; Nuno Matos; Ganapathy Mohan, Ph.D.;
Greg A. Pennyroyal; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Oscar A.
Quattrocchi, M.Sc.; Timothy L. Shelbourn, M.S., M.B.A.;
Teri C. Soli, Ph.D.; Daniel D. Traficante, Ph.D.; Bruno A.R.
Vrebos, Ph.D.
761 Panel de Expertos en Resonancia Magnetica
Nuclear (NMR)CONCLUIDO
DANIEL D. TRAFICANTE, PH.D., Presidente
Andreas Kaerner, Ph.D.; Andrew C. Kolbert, Ph.D., M.
T.M.; Yue Luo, Ph.D.; Joseph Ray, Ph.D.; Susan
Reutzel-Edens, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A.,
M.S.; Christina Szabo, Ph.D.; Fred Xi, Ph.D.
Panel de Expertos en Quimiometra
PEI CHEN, PH.D., Y NUNO MATOS, Co-Presidentes
Chunsheng Cai, Ph.D.; Robert Tom Cambron, Ph.D.;
Thomas N. Feinberg, Ph.D.; Peter de B. Harrington,
Ph.D.; Mark J. Henson, Ph.D.; Yang (Angela) Liu,
Ph.D.; Zhenqi (Pete) Shi, Ph.D.; Yvan C.D. Vander
Heyden, Ph.D.; Stanislav O. Zakharkin, Ph.D.; Lin
Zhang, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas Elementales
NANCY LEWEN, Presidente
Charles Barton, Ph.D., DABT; Courtney M. Callis,
MPH, DABT; Steven J. Dentali, Ph.D.; Anna M. Fan,
Ph.D., DABT; Edward James Fletcher; Bruce A. Fowler,
Ph.D., A.T.S.; Roland Frotschl; Assad J. Kazeminy,
Ph.D.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Melissa M.
Phillips, Ph.D.; Timothy L. Shelbourn, M.B.A., M.S.
Panel de Expertos en Adulteracion
de
con Farmacos
y Analogos
de Farmacos
DENNIS K.J. GORECKI, PH.D., Presidente

Joseph Betz, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Jana B. Hildreth,
B.S.; Ikhlas A. Khan, Ph.D.; Hwee-Ling Koh, Ph.D.;
Cynthia L. Morris-Kukoski, Pharm.D.; James NealKababick, B.S.; Olivier P. Rabin, Ph.D.; John W. Spink,
Ph.D.; Darryl M. Sullivan; Nicole T. Vu, Ph.D.
Panel de Expertos en Espectrometra de Masas
CONCLUIDO
PAUL R. KELLER, PH.D., Presidente
Parastoo Azadi, Ph.D.; Timothy R. Baker, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D., FRSC; Roy Dobson, Ph.D.;
Kenneth D. Greis, Ph.D.; Douglas E. Kiehl, M.S.; Mike
S. Lee, Ph.D.; Jun Wheeler, Ph.D.; Li Zang, Ph.D.
Panel de Expertos en Modernizacion
de Pruebas
de Identificacion
NANCY LEWEN, Presidente

Michelle R. Adamson; Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Jonathan
W. DeVries, Ph.D.; Maryna Dmitriieva, Ph.D.; Michael
Hornig, Ph.D.; Bernard A. Olsen, Ph.D.; Jeffrey S.
Rohrer, Ph.D.; Anne M. Warner, Ph.D.
USP 38
Panel de Expertos en Disolventes Residuales
OSCAR A. QUATTROCCHI, M.SC., Presidente
Coleman C. Chasteen, M.S.; John Connelly, Ph.D.; John
V. Hinshaw, Ph.D.; Elizabeth C. Hoogendoorn, M.S.;
Bruce P. Johnson, Ph.D.; Eric C. Kesslen, Ph.D.; Elizabeth
Kovacs; Paul W. Lockwood, M.S.; Gregory P. Martin,
M.S.; Ganapathy Mohan, Ph.D.; Yuwen Wang, Ph.D.
Panel de Expertos en Atributos del Agua Esteril
EnvasadaCONCLUIDO
ANTHONY C. BEVILACQUA, PH.D., Presidente
Dennis R. Jenke, Ph.D., M.B.A.; Max S. Lazar; Timothy
J. McGovern, Ph.D.; Rostyslaw O. Slabicky; Teri C.
Soli, Ph.D.
Panel de Expertos en Agua para Uso Analtico
TERI C. SOLI, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Nancy Lewen; Bruno Rossi, M.S.
Panel de Expertos en Agua para Uso Farmaceutico
TERI C. SOLI, PH.D., Presidente

Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Rostyslaw O. Slabicky
Panel de Expertos en Espectrometra de
Fluorescencia de Rayos XCONCLUIDO
TIMOTHY L. SHELBOURN, M.B.A., M.S., Presidente
Lora L. Brehm; W. Tim Elam; George J. Havrilla;
Andrew J. Jensen; Riitta Kaijansaari, M.Sc.; John I.H.
Patterson, Ph.D.; Rene E. Van Grieken, Ph.D.; Bruno
A.R. Vrebos, Ph.D.
Fsico
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Presidente
Fahad Al-Jenoobi, Ph.D.; Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.;
Shaukat Ali, Ph.D.; Graham Buckton, Ph.D., D.Sc., FRSC;
David J. Goldfarb, Ph.D.; Bruno C. Hancock, Ph.D.; Ravi
Harapanhalli, Ph.D.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.;
Stephen W. Hoag, Ph.D.; Ronald G. Iacocca, Ph.D.;
Gregory P. Martin, M.S.; Richard Meury; Prabu Nambiar,
M.B.A., Ph.D.; James A. Ponto, M.S.; Sally W. Schwarz,
M.S.; Changquan C. Sun, Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D.;
Allen C. Templeton, Ph.D.; Dale Eric Wurster, Ph.D.;
Geoff G.Z. Zhang, Ph.D.
1059 Panel de Expertos en Desempe
no de
Excipientes
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y ERIC A. SCHMITT, PH.D., CoPresidentes
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Lawrence H. Block, Ph.D.; Patrick Deluca, Ph.D.; Carl
Frey, M.S.; Xiaorong He, Ph.D., M.B.A.; Stephen W.
Hoag, Ph.D.; Michelle A. Long, Ph.D.; Richard C.
Moreton, Ph.D.; Prabu Nambiar, Ph.D., M.B.A.; James
A. Ponto, M.S.; Kent Sternitzke, Ph.D.; Kevin A. Swiss,
Ph.D.; Sean V. Taylor, Ph.D.
Panel de Expertos en 821 Identificacion
y
Valoracion
de Radionucleidos, y 1821 Teora y
Practica
de la Radioactividad y 1823
Medicamentos para Tomografa de Emision
de
Positrones
SALLY W. SCHWARZ, M.S., Presidente
James W. Brodack, Ph.D.; Cathy Sue Cutler, Ph.D.;
Jonathan M. Fitzsimmons, Ph.D.; Paula M. Jacobs,
Ph.D.; Thijs Kroon, Pharm.D.; Jerome M. Lewis, Ph.D.;
Roger Moroney, M.S.; James A. Ponto, M.S.; Duann
V. Thistlethwaite, B.S.; Steven S. Zigler, Ph.D.
Panel de Expertos en Buenas Practicas
de
Documentacion
KIM C. HUYNH-BA, M.S., Presidente
USP 38
Panel de Expertos en Medicamentos para

Tomografa de Emision
de Positrones
Preparacion
MagistralCONCLUIDO
STEVEN S. ZIGLER, PH.D., Presidente
Samuel C. Augustine, Pharm.D., FAPhA; Marc
Berridge, Ph.D.; Joseph C. Hung, Ph.D., BCNP;
Donald R. Kinney; Maxim Kiselev, Ph.D.; Neale Scott
Mason, Ph.D.; Steve Mattmuller, M.S., R.Ph.; Sally W.
Schwarz, M.S.; Jean-Luc Vanderheyden, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas en Productos
Farmaceuticos
PRABU NAMBIAR, PH.D., M.B.A., Presidente

Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Steven W. Baertschi, Ph.D.; Judy P. Boehlert, Ph.D.;
Robert G. Buice, Ph.D.; Greg J. Davies; Xiaorong He,
Ph.D., M.B.A.; Kim C. Huynh-Ba, M.S.; Michael
Koberda, Ph.D.; Robert E. Osterberg, Ph.D.; Ernest
Parente, Ph.D.; David H. Rogers, Ph.D.; Mary W.
Seibel; Kevin A. Swiss, Ph.D.
Panel de Expertos en Microscopa Electronica
de
Barrido
RONALD G. IACOCCA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Marc Mamak, Ph.D.; Richard Meury;
James P. Vitarelli, Ph.D.
Panel de Expertos en Validacion
y Verificacion
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente

Kimber L. Barnett, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.;
Paul D. Curry, Ph.D.; Joachim Ermer, Ph.D.; Gyongyi
S. Gratzl, Ph.D.; John P. Hammond, FRSC; Elizabeth
Kovacs; David J. LeBlond, Ph.D.; Rosario LoBrutto,
Ph.D.; Anne K. McCasland-Keller, Ph.D.; Pauline L.
McGregor, Ph.D.; Phil Nethercote, Ph.D.; Allen C.
Templeton, Ph.D.; David P. Thomas, Ph.D.; M.L. Jane
Weitzel
Panel de Expertos en Pesas y Balanzas
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Dirk Ahlbrecht; Cesar D. Bautista, Jr., Ph.D.; Klaus
Fritsch, Ph.D.; Robert Mielke; David Sebastian
Pattavina, M.S.; Allen C. Templeton, Ph.D.
Biologico

Robert G. Bell, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.;
Gary C. du Moulin, Ph.D.; Barry D. Garfinkle, Ph.D.;
Timothy K. Hayes, Ph.D.; Christopher Jones, Ph.D.;
Kenneth R. Miller, Ph.D.; Anthony R. Mire-Sluis, Ph.D.;
Elizabeth I. Read, M.D.; Anthony A.G. Ridgway, Ph.D.;
John A. Saldanha, Ph.D.; Junzhi Wang, Ph.D.; Teruhide
Yamaguchi, Ph.D.; Lynn C. Yeoman, Ph.D.
1050 Panel de Expertos en Evaluacion
de la
Seguridad Viral en Productos Biotecnologicos
Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano

o Animal
ROBERT G. BELL, PH.D., Presidente
Johannes Bluemel, Ph.D.; Jeri Ann Boose, Ph.D.;
Houman Dehghani, Ph.D.; Yuling L. Li, Ph.D.;
Raymond Nims, Ph.D.; Mark Plavsic, Ph.D.; Michael
Rubino, Ph.D.
11021105 Panel de Expertos en Metodos
de
Pruebas InmunologicasCONCLUIDO
KENNETH R. MILLER, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Yadira Hernandez Rodriguez,

Ph.D.; Rakesh Kakkar, Ph.D.; Kelledy Manson; Hersh
Mehta, Ph.D.; Patrick Niven; Steven J. Swanson, Ph.D.
1240 Panel de Expertos en Pruebas Virales para
Plasma Humano Destinado como Intermediario
de FabricacionCONCLUIDO
JOHN A. SALDANHA, PH.D., Presidente

Albrecht Groener, Ph.D.; Mary Gustafson, Ph.D.;
Douglas C. Lee, Ph.D.; Hannelore M. Willkommen,
Ph.D.
Panel de Expertos en Captulos Generales sobre
Valoraciones Biologicas
ROBERT R. SINGER, M.SC., Presidente

Janice D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini,
Ph.D.; David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond,
Ph.D.; Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield, M.
A.
Panel de Expertos en Crioconservacion
CONCLUIDO
JAMES MOLDENHAUER, M.S., Presidente
Allison Hubel, Ph.D.; Elizabeth I. Read, M.D.; Yvonne
A. Reid, Ph.D.; Glyn Stacey, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Glicoconjugadas
CONCLUIDO
CHRISTOPHER JONES, PH.D., Presidente
Paolo Costantino; Didier A. Giffroy, Ph.D.; Suresh
Karupothula, Ph.D.; Jeremy P. Kunkel, Ph.D.;
SureshBabu Rajan, M.Pharm; Neil Ravenscroft, Ph.D.;
Mary L. Retzlaff, Ph.D.; Marsha Richmond, Ph.D.;
Philippe Talaga, Ph.D.
Panel de Expertos en Analisis
de Glicoprotenas y
Glicanos
Parastoo Azadi, Ph.D.; Michael R. DeFelippis, Ph.D.;
Gary Rogers, Ph.D.; Jeffrey S. Rohrer, Ph.D.; Martin
Schiestl, Ph.D.; Jihong Wang, Ph.D.; Zhuchun Wu,
Ph.D.; Rebecca A. Zangmeister, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicion
de Protena de
Celulas
Hospederas
ANTHONY R. MIRE-SLUIS, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Oliver Anderka, Ph.D.; Svetlana
Bergelson, Ph.D.; Heather A. Boux, Ph.D.; John S.
Ivancic, Ph.D.; Ned Mozier, Ph.D.; Kesh Prakash,
Ph.D.; Martin Vanderlaan, Ph.D.; David C. Wylie,
Ph.D.
Panel de Expertos en Inmunogenicidad
Viswanath Devanarayan, Ph.D.; Boris Gorovits, Ph.D.;
Shalini Gupta, Ph.D.; Eugene Koren, M.D., Ph.D.;
Valerie Quarmby, Ph.D.; Susan Richards, Ph.D.; Gopi
Shankar, Ph.D.; An Song, Ph.D.; Meena
Subramanyam, Ph.D.; Steven J. Swanson, Ph.D.;
Bonnie Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Anticuerpos Monoclonales
Recombinantes de Uso Terapeutico

Michel P. Byrne, Ph.D.; Mary E.M. Cromwell, Ph.D.;
Jill A. Crouse-Zeineddini, Ph.D.; Michael R. DeFelippis,
Ph.D.; Siegfried Giess, Ph.D.; Steffen Gross; Alka
Kamra, Ph.D.; Joseph Kutza, Ph.D.; Kenneth R. Miller,
Ph.D.; Michael G. Mulkerrin, Ph.D.; Martin Schiestl,
Ph.D.; Dieter Schmalzing, Ph.D.; Yeowon Sohn, Ph.D.;
Robin Christopher Thorpe, Ph.D.; David C. Wylie,
Ph.D.
Preliminares
Kathleen V. Brady, B.S.; Frank J. Diana, Ph.D.; Lisa

Ann Fink, MBA; Craig Hamilton, Ph.D.; Judy Lin, M.S.;
Anjan K. Mittal, M.Pharm.; James A. Shea, Ph.D.;
Kevin A. Swiss, Ph.D.
Integrantes / Comites xix
Preliminares
xx Comites / Integrantes
Panel de Expertos en ADN Residual en Productos
Obtenidos por Biotecnologa
Pascal R. Anger; Jon R. Borman; Audrey Chang, Ph.D.;
Thomas E. Haemmerle, Ph.D.; Scott Kuhns, Ph.D.;
Junzhi Wang, Ph.D.; Weihong Wang, Ph.D.; Judith
Zhu-Shimoni, Ph.D.
Panel de Expertos en Medicion
de Protena Total
Methal Albarghouthi, Ph.D.; Matthew W. Borer,
Ph.D.; Olivier C. Germay, Ph.D.; Anne M. Jespersen,
Ph.D.; Lars Nygaard, M.S.; Wendy R. Safell-Clemmer,
M.S.; Martin Schiestl, Ph.D.; William M. Skea, Ph.D.;
Lynn C. Yeoman, Ph.D.
Panel de Expertos en Pruebas para la
Identificacion
por Resonancia Magnetica
Nuclear
(NMR) de Vacunas Polisacaridos

Chitrananda Abeygunawardana, Ph.D.; Yves Aubin,
Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Cristiana Campa, Ph.D.;
Thomas P. Jacques, Ph.D.; Michael T. Jones, Ph.D.;
Jeremy P. Kunkel, Ph.D.; Neil Ravenscroft, Ph.D.;
Philippe Talaga, Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Para Uso Humano
Vacunas Virales
BARRY D. GARFINKLE, PH.D., Presidente
John G. Aunins, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Mark
Galinski; Lucy Gisonni-Lex; John D. Grabenstein,
Ph.D.; Joan C. May, Ph.D.; Brian K. Nunnally, Ph.D.;
Cecile Maria Ponsar, Ph.D.; Silke M. Schepelmann,
Ph.D.; Earl K. Zablackis, Ph.D.
Captulos GeneralesFormas Farmaceuticas
JAMES E. DEMUTH, PH.D., Presidente

Dale S. Aldrich; Paul D. Curry, Jr., Ph.D.; Mario A.
Gonzalez, Ph.D.; Vivian A. Gray; Ralph A. Heasley, Ph.D.;
Anthony J. Hickey, Ph.D., D.Sc.; Michael E. Houghton;
Munir A. Hussain, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.; David
F. Long, Ph.D.; John W. Mauger, Ph.D.; Jolyon P.
Mitchell, Ph.D., FRSC; Beverly Nickerson, Ph.D.; Alan F.
Parr, Pharm.D., Ph.D.; Guirag Poochikian, Ph.D.; Galen
W. Radebaugh, Ph.D., R.Ph.; John G. Shabushnig, Ph.D.;
Raymond D. Skwierczynski, Ph.D.; Jason A. Suggett,
Ph.D., M.B.A.; Kailas Thakker, Ph.D.; Thomas R. Tice,
Ph.D.; Sailesh Varia, Ph.D.; Mehran Yazdanian, Ph.D.
1 Panel de Expertos en InyectablesCONCLUIDO
JOHN G. SHABUSHNIG, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich; Lori Alquier, M.S.; Diane J. Burgess,
Ph.D.; David F. Driscoll, Ph.D.; David F. Long, Ph.D.;
Thomas R. Tice, Ph.D.; Martin Woodle, Ph.D.
771 Panel de Expertos en Preparaciones
Oftalmicas
ASHIM K. MITRA, PH.D., Presidente

Dale S. Aldrich; Cynthia M. Bach, M.S.; Jeffrey S.
Fleitman, Ph.D.; Seshadri Neervannan, Ph.D.; Stacey
M. Platzer; Satish K. Singh, Ph.D.; Thomas R. Tice,
Ph.D.; George W. Tin, Ph.D.
787 Panel de Expertos en Partculas en Inyectables Biofarmaceuticos
DALE S. ALDRICH, Presidente

Mary E.M. Cromwell, Ph.D.; Paul D. Curry, Ph.D.;
Jolyon P. Mitchell, Ph.D., FRSC; Linda O. Narhi, Ph.D.;
Alla Polozova; Dean C. Ripple, Ph.D.; John G.
Shabushnig, Ph.D.; Satish K. Singh, Ph.D.; Lisa A.
Wenzler Savin, Ph.D.
USP 38
788 Panel de Expertos en Partculas en
Inyectables
DALE S. ALDRICH, Presidente
Dan Berdovich; Lew Brown, B.S.; Kevin Dahl, Ph.D.;
Dean Ripple, Ph.D.
Panel de Expertos en Capsulas
Rellenas con
Lquido
VIVIAN A. GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; Jean-Luc Colin, Ph.D.; Joe Fotso,
Ph.D.; Munir A. Hussain, Ph.D.; Vi N. Schmidt, M.S.;
Stephen C. Tindal
Panel de Expertos en Pruebas de Desempe
no de
Formas Farmaceuticas
Semisolidas
KAILAS THAKKER, PH.D., Presidente

Eric Beyssac, Ph.D.; Robert G. Buice, Ph.D.; Bryan
Crist; James E. De Muth, Ph.D.; Geoffrey N. Grove,
Ph.D.; L. Thomas Hall, Ph.D.; John S. Heaney;
Matthew Kersey, Ph.D.; Hans-Juergen Knitter; Patricia
L. Lee, M.S.; Patrick C. Mahn; William M. Rosenthal;
Steve W. Shaw
Panel de Expertos en los Criterios de Solubilidad
para Farmacos
de Uso Veterinario
MARIO A. GONZALEZ, PH.D., Presidente
Mike Apley, DVM, Ph.D.; Bryan Crist; Robert P.
Hunter, M.S., Ph.D.; Mark G. Papich, M.S., D.V.M.;
Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; Jim E. Riviere, DVM,
Ph.D., D.Sc.
Panel de Expertos en el Uso de Enzimas en la
Prueba de Disolucion
de Capsulas
de Gelatina
VIVIAN A. GRAY, Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; Joan M. Dalla Riva Toma, Ph.D.;
Luigi Ghidorsi; Jian-Hwa Guo, Ph.D.; Feixue Han,
Ph.D.; Jian-Hwa Han, Ph.D.; Christopher T. Hosty;
Jianmei D. Kochling, Ph.D.; Johannes Kraemer, Ph.D.;
Thomas Langdon; Steven R. Leinbach; Gregory P.
Martin, M.S.; Steven M. Meyerhoffer, Ph.D.; Richard
C. Moreton, Ph.D.; Krishnaswamy S. Raghavan, Ph.D.;
Edward Shneyvas, Ph.D.; Jason A. Suggett, Ph.D.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala,
M.Pharm.; Hu Wang, M.S.
Panel de Expertos en Inspeccion
Visual de
Parenterales
RUSSELL E. MADSEN, M.S., Presidente
Dale S. Aldrich; John D. Ayres, M.D., J.D.; Roy Cherris;
John G. Shabushnig, Ph.D.; Deborah Shnek, Ph.D.
Captulos GeneralesMicrobiologa
JAMES E. AKERS, PH.D., Presidente
James P. Agalloco, M.S., M.B.A.; Dilip Ashtekar, Ph.D.;
Anthony M. Cundell, Ph.D.; Russell E. Madsen, M.S.;
Karen Z. McCullough, M.S.; Jianghong Meng, Ph.D.;
Leonard W. Mestrandrea, Ph.D.; Rainer F. Newman,
M.S.; Donald C. Singer, M.S.; Scott V.W. Sutton, Ph.D.;
Edward C. Tidswell, Ph.D.
81 Panel de Expertos en Valoracion
MicrobianaAntibioticosCONCLUIDO
THOMAS B. MAY, PH.D., Presidente

David L. Gibbs, Ph.D.; Amy J. Karren, RM/SM; Nilesh
Prabhakar Shinde, M.S.; Brenda Sullivan
Panel de Expertos en Modernizacion
de
Valoraciones Microbiologicas
JAMES E. AKERS, PH.D., Presidente

Mark R. Coleman, Ph.D.; Gerald M. Jensen, Ph.D.;
Ronald G. Lauback; Jeremy Lebel; Fred J. Marsik,
Ph.D.; Edgar L. Mendaros; Elizabeth A. MonnotChase, Ph.D.; Jorn Thyme, D.V.M.; Glenn A. Van
Buskirk, Ph.D.
USP 38
659 Panel de Expertos en Requisitos de

Envasado y Almacenamiento
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Y SHIRLEY ANN FELD, M.SC., CoPresidentes
Eleanor Freeman, B.S.; Kevin E. ODonnell; Devinder
Pal, M.Pharm.; Robert H. Seevers, Ph.D.; Li Xiong,
Ph.D.
671 Panel de Expertos en EnvasesPruebas de
Desempe
no
DAN J. MALINOWSKI, Presidente
Yisheng Chen, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Mary
G. Foster, Pharm.D., BFA; Hugh E. Lockhart, Ph.D.;
Dennis P. OReilly; Frank D. Witulski, M.S.; Li Xiong,
Ph.D.
1118 Panel de Expertos en Dispositivos de
MonitoreoTiempo, Temperatura y Humedad
CONCLUIDO
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Presidente
Thaddeus Prusik, Ph.D.; Robert H. Seevers, Ph.D.;
David A. Ulrich, M.S.; Ismail Uysal, Ph.D.
1207 Panel de Expertos en Envasado de
Productos EsterilesCONCLUIDO
DANA M. GUAZZO, PH.D., Presidente

James P. Agalloco, M.S., M.B.A.; James E. Akers,
Ph.D.; Peter Buus; Shu-chen Chen; Ronald Forster,
Ph.D.; Lee E. Kirsch, Ph.D.; Ronald Mueller; Donald C.
Singer, M.S.; David Walker
1664 Panel de Expertos en Lmites y Buenas
Practicas
de LixiviablesCONCLUIDO
DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente
Michael N. Eakins, Ph.D.; Dennis R. Jenke, Ph.D.,
M.B.A.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; James O. Mullis,
M.S.; Lee M. Nagao, Ph.D.; Diane M. Paskiet; Michael
A. Ruberto, Ph.D.; Cheryl Stults, Ph.D.
Panel de Expertos en Materiales para Ensayos
Clnicos (Buenas Practicas
de Distribucion)
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente

Glaucia K. Braga, Ph.D.; Martin Jeiven, M.S.; Claude
Jolicoeur, B.S.
Panel de Expertos en Buenas Practicas
de
DistribucionCONCLUIDO

Glaucia K. Braga, Ph.D.; Chris Chandler, Pharm.D.;
Michael N. Eakins, Ph.D.; Shirley A. Feld, M.Sc.;
Patricia C. Kienle, R.Ph., M.P.A.; William A. Mixon,
M.S.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Devinder Pal, M.
Pharm.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah M. Skuce
Panel de Expertos en Sistemas Plasticos
Usados en
la Fabricacion
de Medicamentos
DENNIS R. JENKE, PH.D., Presidente
Denise G. Bestwick, B.S.; Weibing Ding, Ph.D.;
Michael N. Eakins, Ph.D.; Jerold (Jerry) M. Martin,
M.Sc.; Daniel L. Norwood, Ph.D.; Cheryl L.M. Stults,
Ph.D.; Ken M. Wong, M.Sc.
Estandares
de Referencia
MATTHEW W. BORER, PH.D., Presidente
Bianca Avramovitch, Ph.D.; Adrian F. Bristow, Ph.D.;
Antony Raj Gomas, Ph.D.; Shaohong Jin; Catherine A.
Rimmer, Ph.D.; Iffaaz M. Salahudeen, Ph.D.; Ma
Shuangcheng, Ph.D.; Ralph E. Sturgeon, Ph.D.; Robert L.
Watters, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel; Xinyue Xiao, M.S.
Estadstica
Bruno Boulanger, Ph.D.; Richard K. Burdick, Ph.D.; David
J. Christopher, M.S.; David J. LeBlond, Ph.D.; Anthony G.
Okinczyc, M.P.H., M.B.A.; Dennis Sandell, Ph.D.;
Timothy Schofield, M.A.; Charles Y. Tan, Ph.D.; Harry
Yang, Ph.D.
Panel de Expertos en Captulos Generales sobre
Valoraciones Biologicas

Janice D. Callahan, Ph.D.; Jill A. Crouse-Zeineddini,
Ph.D.; David M. Lansky, Ph.D.; David J. LeBlond,
Ph.D.; Karen J. Roberts, R.Ph.; Timothy Schofield,
M.A.
Panel de Expertos en Uniformidad de Contenido
con Muestras de Gran Tama
no
DENNIS SANDELL, PH.D., Presidente
James S. Bergum, Ph.D.; Myron B. Diener, M.S.;
Gregory L. Larner, M.S.
Toxicologa
ROBERT E. OSTERBERG, PH.D., Presidente
Charles Barton, Ph.D.; Joseph F. Borzelleca, Ph.D.; John
Doull, Ph.D., M.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Gregory L.
Erexson, Ph.D., DABT; Bruce A. Fowler, Ph.D., ATS; Bo Li,
Ph.D.; Timothy J. McGovern, Ph.D.; Michel Mikhail,
Ph.D.; Jeffrey P. Smith, Ph.D.
Comite de Expertos del Formulario

Nacional
MonografasExcipientes
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente
Kenneth S. Alexander, Ph.D., Ed.Sp.; Fernando A.
Alvarez-Nunez, Ph.D.; Shireesh P. Apte, Ph.D.; Tim D.
Cabelka, Ph.D.; Brian A.C. Carlin, Ph.D.; Richard N.
Cawthorne, Ph.D.; Jian-Hwa Guo, Ph.D.; Felicitas Guth,
Ph.D.; Mary C. Houck, Ph.D.; William J. Lambert, Ph.D.;
Philip H. Merrell, Ph.D.; Richard C. Moreton, Ph.D.; Eric
J. Munson, Ph.D.; Paul B. Myrdal, Ph.D.; Yihong Qiu,
Ph.D.; Venkatramana Rao, Ph.D.; Jiasheng Tu, Ph.D.;
Richard H. Wendt, Ph.D.
1197 Panel de Expertos en Buenas Practicas
de
Distribucion
para Excipientes Farmaceuticos
a
Granel
GREGORY E. AMIDON, PH.D., Y RICHARD C. MORETON, PH.D.,
Co-Presidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; William Dale Carter, M.S.;
Zak T. Chowhan, Ph.D.; Marc Fages; Elizabeth
Ferguson-Brown; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA;
Linda A. Herzog, M.B.A.; Ashok V. Katdare, Ph.D.;
Zakiya Kurdi, Ph.D.; Edward G. Malawer, Ph.D., CQA;
Frank Milek, Ph.D.; Becca Mitchell; Dwight Mutchler;
Garnet E. Peck, Ph.D.; Mike Schultz, R.Ph.; Alexa
Smith, M.S.; Glenn Sokoloski; Kelly Taylor; Jiasheng
Tu, Ph.D.
Panel de Expertos en Glicerina
TIM D. CABELKA, PH.D., Presidente
Lawrence H. Block, Ph.D.; Carlos E. Bortolotto, B.S.;
Frances K. Byrne, M.S.; Balaji V. Kadri, M.Pharm.,
Preliminares
Captulos GeneralesEnvasado, Almacenamiento

y Distribucion

Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Shirley A. Feld, M.Sc.; Dana M. Guazzo, Ph.D.; Dennis R.
Jenke, M.B.A., Ph.D.; Daniel J. Malinowski; Daniel L.
Norwood, M.S.P.H., Ph.D.; Kevin E. ODonnell; Devinder
Pal, M.Pharm.; Diane M. Paskiet; Michael A. Ruberto,
Ph.D.; Marv D. Shepherd, Ph.D.; Sarah Skuce; Kola
Stucker, M.S.; Li Xiong, Ph.D.
Integrantes / Comites xxi
Preliminares
xxii Comites / Integrantes

M.Sc., MBA; Tanja Natterer; Marian J. Rinken, Ph.D.;
Gwen E. Rucker, B.S.; David A. Sharknas, B.S.; Hong
Zhou, Ph.D.
Panel de Expertos en Povidonas
BERNHARD D. FUSSNEGGER, PH.D. Y CARL PERINI, M.S., CoPresidentes
Lawrence H. Block, Ph.D.; Feng Chen, Ph.D.; David J.
Fillar, MBA; Edward G. Malawer, Ph.D.; Syed A.A.
Rizvi, Ph.D.; John W. Spink, Ph.D.; Fan Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Talco
LAWRENCE H. BLOCK, PH.D., Presidente
Detlef Beckers, Ph.D.; Jocelyne Ferret, Ph.D.; Gregory
P. Meeker, M.S.; Aubrey Miller, M.D., M.P.H.; Robert
E. Osterberg, Ph.D.; Dilip M. Patil, M.S.; Julie W. Pier,
M.S.; Steve Riseman, Ph.D.; Martin S. Rutstein, Ph.D.;
Gary P. Tomaino; Drew Van Orden, M.S., M.A.; James
S. Webber, Ph.D.
Comite de Expertos en Informacion
Terapeutica
y
Sustento al Formulario
NANCY JO BRADEN, M.D., Presidente
Marialice S. Bennett, B.S.Pharma, RPh, FAPhA; Andrea
Brassard, Ph.D., FNP-C, FAANP; Judith P. Clark, B.S.;
Babette S. Edgar, Pharm.D., M.B.A.; Chester B. Good,
M.D., MPH, FACP; William M. Heath, B.S. Pharm.,
MBA; Raymond J. Hohl, M.D., Ph.D.; Raymond C.
Love, Pharm.D., BCPP; Robert J. Meyer, M.D.; Seth
M. Powsner, M.D.; Marcus M. Reidenberg, M.D.; N.
Lee Rucker, M.S.P.H.; Melody Ryan, Pharm.D., MPH;
Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Robert L. Talbert, B.S.,
Pharm.D.; J. Russell Teagarden, D.M.H., M.A.
Comite de Expertos de la USP y del

Dietary Supplements Compendium
MonografasSuplementos Dieteticos
y Medicinas
Herbarias
DENNIS K.J. GORECKI, B.S.P., PH.D., Presidente
Marilyn L. Barrett, Ph.D.; Joseph M. Betz, Ph.D.; Michael
S. Bradley, M.S.; Josef A. Brinckmann; James R. Brooks,
Ph.D.; Robert L. Chapman, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.; Bill
J. Gurley, Ph.D.; Sukhdev Swami Handa, Ph.D.; David C.
Hopp, Ph.D.; Scott A. Jordan, Ph.D.; Joy A. Joseph, M.S.;
A. Douglas Kinghorn, Ph.D., D.Sc.; Richard Ko,
Pharm.D., Ph.D.; Raimar Lobenberg, Ph.D.; Tieraona Low
Dog, M.D.; Gail B. Mahady, Ph.D.; Robin J. Marles,
Ph.D.; Guido F. Pauli, M.D., Ph.D.; Zhongzhi Qian, M.S.;
Eike Reich, Ph.D.; Paul L. Schiff, Jr., Ph.D.; Fabio M.B.
Soldati, Ph.D.; Edward H. Waysek, Ph.D.; Wayne R. Wolf,
Ph.D.
Panel de Expertos para la Revision
de Arginina
JAMES R. BROOKS, PH.D., Presidente
Marilyn Barrett, Ph.D.; Louis Cantilena, M.D.; Rebecca
B. Costello, Ph.D.; Johanna T. Dwyer, D.Sc., RD; Mary
L. Hardy, M.D.; Scott A. Jordan, Ph.D.; Robin Marles,
Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.; Robert Osterberg,
Ph.D.; Bruce E. Rodda, Ph.D.; Robert R. Wolfe, Ph.D.;
Jorge Zuniga, Ph.D.
Panel de Expertos para la Revision
de BetaAlanina
RICHARD KO, PHARM.D., PH.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Rebecca B. Costello,
Ph.D.; William J. Evans, Ph.D.; Mary L. Hardy, M.D.;
Scott A. Jordan, Ph.D.; Ronald J. Maughan, Ph.D.;
Janet W. Rankin, Ph.D.; Abbie E. Smith, Ph.D.
USP 38
Panel de Expertos en el Modelado de Seguridad
de Suplementos Dieteticos
MARY L. HARDY, M.D., Presidente

VA Shiva Ayyadurai, Ph.D., SMVS, SMME; Louis
Cantilena, M.D.; Mei Chung, Ph.D.; Mary Avis Fox,
Ph.D., MPH; Scott A. Jordan, Ph.D.; Diane R. Mould,
Ph.D.; Mkaya Mwamburi, M.D., Ph.D, M.A.; Robert E.
Osterberg, Ph.D.; Charles Yoe, Ph.D.
Panel de Expertos en Revisiones Basadas en
Evidencia
TIERAONA LOW DOG, M.D., Presidente
Louis Cantilena, M.D., Ph.D.; Stephanie Chang, M.D.,
M.P.H.; Mei Chung, Ph.D.; Rebecca B. Costello,
Ph.D.; Dennis K.J. Gorecki, Ph.D.; Scott A. Jordan,
Ph.D.
Panel de Expertos en Suplementos Dieteticos
de
Liberacion
Prolongada
JOY A. JOSEPH, M.S., Presidente
Charles Barton, Ph.D.; Joseph F. Borzelleca, Ph.D.;
Michael S. Bradley, M.S.; James R. Brooks, Ph.D.;
Marion Ehrich, Ph.D.; Vivian A. Gray; Carol S.
Johnston, Ph.D.; Raimar Loebenberg, Ph.D.; Alexander
G. Schauss, Ph.D.; Elizabeth A. Yetley, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
CompendiumAsia Oriental
ZHONGZHI QIAN, M.S., Presidente
Kai shun Bi, Ph.D.; ShiLin Chen, Ph.D.; De-an Guo,
Ph.D.; Shen Ji, Ph.D.; Brad WC Lau, M.S., Ph.D.; Clara
Bik San Lau, Ph.D.; Ping Li, Ph.D.; Rui Chao Lin,
Ph.D.; Shangmei Shi, B.S.; Pengfei Tu, Ph.D.; ZhengTao Wang, Ph.D.; Yang-Chang Wu, Ph.D.; Shishan Yu,
Ph.D.; Zhao Zhonzhen, Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
CompendiumSur Asia
SUKHDEV SWAMI HANDA, PH.D., Presidente
Amit Agarwal; C.K. Katiyar, Ph.D.; Rasadah Mat Ali,
Ph.D.; D.G. Naik, Ph.D.; Sankaran Natarajan, Ph.D.;
M.K. Raina, Ph.D.; Neeraj Tandon, Ph.D.
Comite de Expertos del Food Chemicals

Codex
MonografasIngredientes Alimenticios
ANDREW G. EBERT, PH.D., Presidente
Michael H. Auerbach, Ph.D.; Janet L. Balson, M.S.; Hans
K. Biesalski, M.D., Ph.D.; Simon Brooke-Taylor, Ph.D.;
Richard C. Cantrill, Ph.D.; Junshi Chen, M.D.; Grady W.
Chism, Ph.D.; Roger A. Clemens, Dr.P.H.; Jonathan W.
DeVries, Ph.D.; John W. Finley, Ph.D.; Carl Frey, M.S.;
Einat Haleva, Ph.D.; Lori L. Klopf, Ph.D.; Diane B.
McColl, J.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; Joseph A. Scimeca,
Ph.D.; Fereidoon Shahidi, Ph.D.; Karina R. Vega-Villa,
Ph.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Ingredientes Alimenticios
Adulterantes Intencionales
JONATHAN W. DEVRIES, PH.D., Presidente
Paul Brent, Ph.D.; Susan M. Brown, M.E.A.;
Christophe A. Cavin, Ph.D.; Henry Chin, Ph.D.; Robin
Churchill, Ph.D.; Karen Everstine, Ph.D., M.P.H.;
Hazen Frederick Gale, Ph.D.; Shaun Kennedy; Petra
Lutter, Ph.D.; Richard A. Myers, Ph.D.; John Spink,
Ph.D.; Saskia van Ruth, Ph.D.; Carl Winter, Ph.D.;
Yongning Wu, M.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Calidad y Autenticidad de
Aceite de Oliva
RICHARD C. CANTRILL, PH.D., Presidente
USP 38
Comite de Expertos de la USP y del USP

on Compounding
Preparacion
Magistral
GIGI S. DAVIDSON, B.S.PHARM., DICVP, Presidente
Lisa D. Ashworth, R.Ph.; Gus S. Bassani, Pharm.D.;
Edmund J. Elder, Jr., Ph.D.; Maria do Carmo M. Garcez,
B.S.Pharm.; Deborah R. Houston, Pharm.D.; Patricia C.
Kienle, M.P.A.; Keisha D. Lovoi, B.S.Pharm.; Linda F.
McElhiney, Pharm.D.; William A. Mixon, M.S.; David W.
Newton, Ph.D.; Alan F. Parr, Pharm.D., Ph.D.; Regina F.
Peacock, Ph.D.; Robert P. Shrewsbury, Ph.D.; Keith St.
John, M.S.
Panel de Expertos en Preparacion
Magistral con
Farmacos
Peligrosos
PATRICIA C. KIENLE, M.P.A., Presidente
Thomas H. Connor, Ph.D.; Eric Kastango, M.B.A., B.S.
Pharm.; Melissa A. McDiarmid, M.D., MPH; Kenneth
R. Mead, Ph.D.; Martha Polovich, Ph.D.; Lucille A.
Power; James T. Wagner
Panel de Expertos en Preparacion
Magistral
Preparaciones Esteriles
JAMES E. AKERS, PH.D., Y GIGI S. DAVIDSON, B.S. PHARM.,

DICVP, Co-Presidentes
Michael W. Anneken, B.S. Pharm., R.Ph.; Byron
Ashworth; Jeffrey A. Clanton, M.S.; Cynthia T. Culmo,
B.S.; Gordon M. Ely; Brenda S. Jensen, CPhT, M.B.A.;
Patrick A. Lester, B.S. Pharm., DVM, M.S.; Paul N.
Limberis, B.S.; Lisa A. McCartney, BAAS; Elizabeth A.
Monsees, RN, MSN, MBA; Barbara M. Soule, RN,
MPA, B.S.; Matthew Stanton, Pharm.D.; Marc H.
Stranz, Pharm.D.; William A. Stuart, B.S.; Vaiyapuri
Subramaniam, Pharm.D.; Angela W. Yaniv, Pharm.D.
Comites
de Expertos del USP Medicines
Compendium
USP Medicines CompendiumProductos
Biologicos
DHANANJAY PATANKAR, PH.D., Presidente

Sriram V. Akundi, Ph.D.; Mahesh K. Bhalgat, Ph.D.; Jason
B. Bock, Ph.D.; Daniel Silva Guedes, Ph.D.; Gye Mee
Jang, M.S.; Sridevi Khambhampaty, Ph.D.; Jaeok Kim,
M.S.; Young-Phil Lee, Ph.D.; Rustom S. Mody, Ph.D.;
Venkat R. Mukku, Ph.D.; Venkata Ramana, Ph.D.;
Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.; Li Shi, Ph.D.; Dongmei
Su, Ph.D.; Utpal Tatu, Ph.D.; Meenu Wadhwa, Ph.D.
Panel de Expertos en Protenas Terapeuticas
RUSTOM S. MODY, PH.D., Presidente

Sriram V. Akundi, Ph.D.; Sanjay Bandyopadhyay, Ph.D.;
Jaby Jacob, Ph.D.; Dhananjay Patankar, Ph.D.; Venkata
Ramanna, Ph.D.; Alok Sarma, Ph.D.; Gul Raj Soni, Ph.D.;
Meenu Wadhwa, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas
MAHESH K. BHALGAT, PH.D., Presidente
Sunil Gairola, Ph.D.; Gaurav Gupta, Ph.D.; Sunil Gupta,
M.D.; Mei Mei Ho, Ph.D.; Suresh Karupothula, Ph.D.; K.
Anand Kumar, Ph.D.; Y.U.B. Rao, Ph.D.; Anil Sood,
M.Sc.; Ajay Kumar Tahlan, M.D.
USP Medicines CompendiumAsia Oriental
JIASHENG TU, PH.D., Presidente
Ying Chen, B.S.; Zhonggui He, Ph.D.; Fangwen Shuai;

Qiaofeng Tao, Ph.D.; Hao Wang, Ph.D.; Weibing Wang;
Yue-Sheng Wang, Ph.D.; Hongyan Xie; Luo Zhuoya,
Ph.D.
USP Medicines CompendiumAmerica
Latina
MARIA INES R.M. SANTORO, PH.D., Presidente
Maria Alice Bockelmann, Ph.D.; Mauro Cesar de Faria,
B.Sc., MBA; Elizabeth Igne Ferreira, Ph.D.; Jose Aparcio
Brittes Funck, Ph.D.; Ana Mara Gamero Collado, B.Sc.;
Silvia Susana Giarcovich, Ph.D.; Patricia Soledad Carre
no
Gonzalez, M.Sc.; Mara Catalina Daz Gutierrez, B.Sc.;
Oscar Quattrocchi, M.Sc.; Jaime-Humberto Rojas, M.Sc.;
Graciela Aguilar Gil Samaniego, B.Sc.; Silvia Storpirtis,
Ph.D.
USP Medicines CompendiumEstados Recientemente
Independizados (ERI)Rusia
ALLA A. MIKHAYLOVA, M.S., Presidente
Farid Aliyev, Ph.D.; Svetlana O. Chikalova, M.S.;
Konstantin V. Dubinin, Ph.D.; Victoriya Georgiyants,
Ph.D.; Lilit Ghazaryan; Tea Jikia, Ph.D.; Olga Maklakova,
MBA; Siarhei I. Marchanka, Pharm.D.; Olga G. Potanina,
D.Sc.; Andrey Prokhorov, M.D.; Mirzohidjon M. Qodirov,
M.S.; Sergii Sur, M.D., Ph.D.; Anna V. Titova, Ph.D.;
Valiantsina V. Tsimoshyna; Ardak U. Tulegenova, D.Sc.;
Ramenskaya Galina Vladislvovna, Ph.D.
USP Medicines CompendiumSur Asia
ANTONY RAJ GOMAS, PH.D., Presidente
Rajiv Desai, Ph.D.; Manish Gangrade, Ph.D.; Sushil
Gangwal, Ph.D.; Farnaz Malik, Ph.D.; Mangesh Arvind
Mantri, Ph.D., MBA; Petla Naidu, Ph.D.; Sheikh M.
Rahman, Ph.D.; Zahid Saeed, B.Pharm.; Mohammad
Tahir Siddique, M.Sc., MBA; Sukhdev Singh, M.Sc.;
Sukumar Sinha, Ph.D.; Saji Thomas, Ph.D.
Enlaces Gubernamentales ante los

Comites
de Expertos y los Paneles de
Expertos
Enlaces de la Administracion
de Alimentos y
Medicamentos de los EE.UU. (FDA)
Rajiv Agarwal, Ph.D.; Ali Al-Hakim, Ph.D.; Om Anand, Ph.D.;
Howard A. Anderson, Ph.D.; Juan Arciniega, D.Sc.; Jane A.
Axelrad, J.D.; Anamitro Banerjee, Ph.D.; Steven R. Bauer,
Ph.D.; Shastri Bhamidipati, Ph.D.; Jonathan Bray, B.S.;
Michael R. Brent, Ph.D.; Lucinda F. Buhse, Ph.D.; Teresa T.
Cain, Ph.D.; John H. Callahan, Ph.D.; Tura C. Camilli, Ph.D.;
Steven Casper, Ph.D.; Wiley A. Chambers, M.D.; Jane
Chang, Ph.D.; Donna F. Christner, Ph.D.; John F. Cipollo,
Ph.D.; Carolyn Cohran, Ph.D.; Thomas Colatsky, Ph.D.; Jerry
Cott, Ph.D.; Mike Darj, Ph.D.; Mamata De, Ph.D.; Ian F.
DeVeau, Ph.D.; William Doub, Ph.D.; Cory D. Evans, Ph.D.;
Patrick Faustino, Ph.D.; Daniel Folmer, Ph.D.; Rick L.
Friedman, M.S.; Michael Scott Furness, Ph.D.; Zongming
Gao, Ph.D.; Tapash Ghosh, Ph.D.; Devinder S. Gill, Ph.D.;
Lillie D. Golson, Pharm.D.; Dennis Guilfoyle, Ph.D.; Yin Guo,
Ph.D.; Abhay Gupta, Ph.D.; Michael Hadwiger, Ph.D.; Bruce
D. Harris, Ph.D.; William Hess; David Hussong, Ph.D.; Mai
Huynh, M.S.; Robert Iser, M.S.; Joseph E. Jablonski, Ph.D.;
Lauren Jackson, Ph.D.; David S. Kaplan, Ph.D.; John F.
Kauffman, Ph.D., M.B.A.; Michael C. Kennedy, Ph.D.;
Mansoor A. Khan, R.Ph., Ph.D.; Loice C. Kikwai, Ph.D.;
Robert H. King, Ph.D.; Donald N. Klein, Ph.D.; Bogdan
Kurtyka, Ph.D.; Stephen E. Langille, Ph.D.; Sau L. Lee, Ph.D.;
Robin Levis, Ph.D.; Tsai-lien Lin, Ph.D.; Richard Lostritto,
Ph.D.; Ragine Maheswaran, Ph.D.; Ingrid Markovic, Ph.D.;
Ewa Marszal, Ph.D.; Gerald E. Marti, M.D., Ph.D.; Marilyn N.
Martinez Pelsor, Ph.D.; Dorota Matecka, Ph.D.; Jeffrey B.
Medwid, Ph.D.; Randa Melhem, Ph.D.; John Metcalfe, Ph.D.;
Yana Mille, R.Ph.; Tahseen Mirza, Ph.D.; Amit K. Mitra,
Preliminares
Diego Garcia-Gonzalez, Ph.D.; Claudia Guillaume,

M.Sc.; Zohar Kerem, Ph.D.; Paul H. Miller, B.A.;
Agusti J. Romero, Ph.D.; Selina Wang, Ph.D.
Integrantes / Comites xxiii
Preliminares
xxiv Comites / Integrantes

Ph.D.; Sanja Modric, D.V.M., Ph.D.; Magdi M. Mossoba,
Ph.D.; Laxma Nagavelli, Ph.D.; Linda L. Ng, Ph.D.; Mickey
Parish, Ph.D.; Suhas Patankar, Ph.D.; Frank Perrella, Ph.D.;
Kristina E. Peters, Pharm.D.; Vaikunth Prabhu, Ph.D.; CAPT
Kimberly Rains, Pharm.D.; Rahdika Rajagopalan, Ph.D.; Sam
G. Raney, Ph.D.; Rashmi Rawat, Ph.D.; Shanaz Read, Ph.D.;
Brian D. Rogers, Ph.D.; Allen Rudman, Ph.D.; R. Duane
Satzger, Ph.D.; Peter Scholl, Ph.D.; Paul Schwartz, Ph.D.;
Paul Seo, Ph.D.; Rakhi Shah, Ph.D.; Glen Jon Smith, M.S.;
Jannavi Srinivasan, Ph.D.; Ann Stohlman, D.V.M.; Yichun
Sun, Ph.D.; Neeru Takiar, M.S.; Jennifer Thomas, J.D.; Ram
C. Tiwari, Ph.D.; Paula R. Trumbo, Ph.D.; Yiying Tsai, Pharm.
D., M.P.H.; Saleh A. Turujman, Ph.D.; Luis Valerio, Ph.D.;
Willie F. Vann, Ph.D.; Perry Wang, Ph.D.; Mark Weinstein,
Ph.D.; Russell Wesdyk, M.B.A.; Steven Wolfgang, Ph.D.;
Keith Wonnacott, Ph.D.; Jo H. Wyeth, Pharm.D.; Li Xia,
Ph.D.; Betsy Jean Yakes, Ph.D.; Susan Zuk, Ph.D.
Otros Enlaces Gubernamentales
Brazilian Pharmacopeial Commission
Gerson Pianetti, Ph.D.; Monica Soares, Ph.D.
Chinese Pharmacopoeial Commission
Zhongping Guo; Peng Han
Federal Commission for the Protection against
Sanitary Risk (COFEPRIS), Mexico
Gregorio Tecuapetia
Division of State Control of Medical Products,
Russian
Valentina Kosenko, Ph.D.
Health Canada
Matthew Bauder; Jeffrey Skene, M.Sc.
National Institute for Quality Control in Health
(INCQS), Brazil
Filipe Silva, Ph.D.
The Saudi Food and Drug Authority (Saudi FDA),
Saudi Arabia
Ali M. Al Homaidan, Ph.D.
U.S. Centers for Diease Control and Prevention
Melissa Schaefer, M.D.; Nadine Shehab, Pharm.D., MPH
U.S. Centers for Medicare and Medicaid Services
Marie E. Manteuffel, Pharm.D., M.P.H.
U.S. National Institute of Standards and
Technology (NIST)
Val R. Miller, Ph.D.
Grupos Asesores
[NotaEl Director Ejecutivo puede nombrar
organismos asesores para apoyar la labor del Consejo de
USP 38
Expertos y de la Convencion,
y para asesorar al personal
interno en asuntos relacionados con polticas. El
siguiente listado de Grupos Asesores y sus miembros
representa a aquellos Grupos formados y aprobados en
su totalidad a partir de septiembre de 2012. Los Grupos
Asesores se forman y desintegran continuamente
durante todo el ciclo de revision
de la USP, por lo que
en un futuro se publicaran otras listas de miembros.]
Grupo Asesor para Titular MonografasCONCLUIDO
Robert S. Beardsley, R.Ph., Ph.D.; Michael Cohen, R.Ph.;
Marjorie Coppinger; Mary Jo Goolsby, Ed.D., M.S.N., C.A.E.;
Chandraprakash Kasireddy, Ph.D.; Barbara Kochanowski,
Ph.D.; Murray Kopelow, M.D., F.R.C.P.C.; Gary Matzke,
Pharm.D.; Linda F. McElhiney, Pharm.D., R.Ph.; David
Newton, Ph.D.; Annette Perschke, R.N., M.S.N.; Marjorie
Phillips, M.S.; Peter H. Rheinstein, J.D., M.S.; Elliott M.
Sogol, Ph.D., R.Ph.; Vaiyapuri Subramaniam, Pharm.D.,
M.S.; Philip Travis; Mark Wiggins, M.S.
Grupo Asesor de Leche Descremada en Polvo
ROBERT MAGALETTA, PH.D., Presidente
Grant Abernethy, Ph.D.; Marti Bergana, Ph.D.; Sneh
Bhandari, Ph.D.; Jack Cappozzo, M.S.; Kuanglin Chao,
Ph.D.; Jonathan DeVries, Ph.D.; Gerard Downey, Ph.D.;
George Greene; James M. Harnly, Ph.D.; Peter de B.
Harrington, Ph.D.; Steven Holroyd, Ph.D.; William J.
Hurst; Gregory A. Israelson; Moon S. Kim, Ph.D.; Petra
Lutter, Ph.D.; Bill MacLuckie, Ph.D.; Andrew Mackey,
Ph.D.; Carmen Martin-Hernandez; Anitra Payne; Jianwei
Qin; Joseph P. Romano; Roman Romero, Ph.D.;
Catherine Shaw; John Szpylka, Ph.D.; Paul Wehling;
Jinchuan Yang, Ph.D.; Steven Zbylut, Ph.D.; Carol
Zyrbko, Ph.D.
In Memoriam
La USP extiende su reconocimiento a los siguientes

Voluntarios Expertos quienes fallecieron durante el ciclo
20102015:
Robert G. Bursey, Ph.D. (MonografasComite de
Expertos de Ingredientes Alimenticios)
Mark C. Roman, Ph.D. (Comite de Expertos de Captulos
GeneralesAnalisis Qumico)
Ashwani Kumar Sahu, M.Sc. (Panel de Expertos en
Vacunas)
Ranga Velagaleti, Ph.D. (MonografasComite de
Expertos de Ingredientes Alimenticios)
Karen Wheless, M.S. (Comite de Expertos de Captulos
GeneralesAnalisis Qumico)
USP 38
Integrantes / Miembros xxv
Instituciones Academicas
y
Asociaciones Vinculadas
Asociaciones Academicas
American Association of Colleges of Nursing, Ginette A.

Pepper, Ph.D.
American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, Anthony J. Silvagni, D.O., Pharm.D., M.Sc., FACOFP, FAFPE
American Association of Colleges of Pharmacy, Lucinda L.
Maine, Ph.D., R.Ph.
Association of American Medical Colleges, David W.
Nierenberg, M.D.
Association of American Veterinary Medical Colleges, Deborah
T. Kochevar, D.V.M., Ph.D.
Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loebenberg, Ph.D.
y
Universidades y Facultades de
Medicina
Baylor College of Medicine, Stephen B. Greenberg, M.D.
Boston University School of Medicine, Carol T. Walsh, Ph.D.
Brody School of Medicine at East Carolina University, Abdel A.
Abdel-Rahman, Ph.D., FAHA
Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science, Ann K. Snyder, Ph.D.
Columbia University College of Physicians and Surgeons, Rudina Odeh-Ramadan, Pharm.D.
Creighton University School of Medicine, Peter W. Abel, Ph.D.
Dartmouth Medical School, Lionel D. Lewis, M.D.
Duke University School of Medicine, Sharon L. Ellison,
Pharm.D.
East Tennessee State University James H. Quillen College of
Medicine, Kenneth E. Ferslew, Ph.D.
Eastern Virginia Medical School, Thomas T. Lynch, Pharm.D.
Emory University School of Medicine, Frank J. Gordon, Ph.D.
Florida State University College of Medicine, Graham A.
Patrick, Ph.D.
Georgetown University School of Medicine, Thomas G.
Sherman, Ph.D.
Howard University College of Medicine, Robert E. Taylor, M.D.,
Ph.D., FACP
Indiana University School of Medicine, David R. Jones, Ph.D.
Joan C. Edwards School of Medicine Marshall University, Gary

O. Rankin, Ph.D.
Johns Hopkins University School of Medicine, Daniel M. Ashby,
M.S., FASHP
Keck School of Medicine of University of Southern California,
Paul D. Holtom, M.D.
Loma Linda University School of Medicine, John N. Buchholz,
Ph.D.
Louisiana State University School of Medicine, Kurt J. Varner,
Ph.D.
Louisiana State University School of Medicine at Shreveport,
Henry R. McKnight, B.S., M.S., Pharm.D.
Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, Jawed
Fareed, Ph.D.
Mayo Medical School, Peter J. Post, Pharm.D., R.Ph.
Medical University of South Carolina College of Medicine,
Kenneth D. Tew, Ph.D.
Meharry Medical College School of Medicine, Clivel G.
Charlton, Ph.D.
Mercer University School of Medicine, Wayne Glasgow, Ph.D.
Michigan State University College of Human Medicine, Rami B.
Ibrahim, M.Sc., Pharm.D., BCPS, BCOP
Morehouse School of Medicine, Ward Kirlin, Ph.D.
Mount Sinai School of Medicine, Joel S. Mindel, M.D., Ph.D.
New York Medical College, Mario A. Inchiosa, Ph.D.
New York University School of Medicine, Lewis S. Nelson,
M.D.
Northeast Ohio Medical University College of Medicine, Werner
Geldenhuys, Ph.D.
Northwestern University Feinberg School of Medicine, Steven
M. Belknap, M.D.
Ohio State University College of Medicine, Robert J. Weber,
Pharm.D., M.S.
Pennsylvania State University College of Medicine, Kelly D.
Karpa, Ph.D., R.Ph.
Ponce School of Medicine, Leon Ferder, M.D.
Rutgers, the State University of New Jersey, New Jersey Medical
School, Deborah Lazzarino, Ph.D.
Rutgers, the State University of New Jersey, Robert Wood Johnson Medical School, Susan Goodin, Pharm.D., FCCP,
BCOP
Saint Louis University School of Medicine, Heather Macarthur,
Ph.D., B.Sc.
San Juan Bautista School of Medicine, Marielis E. Rivera Ruiz,
Ph.D.
Southern Illinois University School of Medicine, Carl Faingold,
Ph.D.
SUNY at Buffalo School of Medicine and Biomedical Sciences,
Paul J. Kostyniak, Ph.D., DABT
SUNY Downstate Medical Center College of Medicine, Jacob V.
Aranda, M.D., Ph.D., FRCPC
Preliminares
Miembros y Delegados de
la Convencion
de la
Farmacopea de los Estados
Unidos de America
a partir
del 31 de mayo de 2014
Preliminares
xxvi Miembros / Integrantes

SUNY Upstate Medical University, David F. Lehmann, M.D.,
Pharm.D.
Temple University School of Medicine, Alan Cowan, Ph.D.
Texas A&M Health Science Center College of Medicine, D.
Samba Reddy, Ph.D., R.Ph.
Texas Tech University Health Sciences Center School of Medicine, Peter Syapin, Ph.D.
The Warren Alpert Medical School of Brown University, Wayne
D. Bowen, Ph.D.
Thomas Jefferson University Jefferson Medical College, Walter
Kraft, M.D., M.S., FACP
Tufts University School of Medicine, Ross W. Thompson, M.S.,
R.Ph.
Uniformed Services University of the Health Sciences, Louis R.
Cantilena, M.D., Ph.D.
Universidad Central del Caribe School of Medicine, Harry
Mercado, M.D.
University of Alabama at Birmingham School of Medicine,
Richard J. Whitley, M.D.
University of Arizona College of Medicine, Hillary A. Franke,
M.D., M.S.
University of Arkansas for Medical Sciences College of Medicine,
Paul L. Prather, Ph.D., B.S.
University of California Davis School of Medicine, Timothy E.
Albertson, M.D., M.P.H., Ph.D.
University of California San Francisco School of Medicine, Kerry
C. Cho, M.D.
University of Chicago Pritzker School of Medicine, Michael L.
Maitland, M.D., Ph.D
University of Cincinnati College of Medicine, Marianne F. Ivey,
Pharm.D., M.P.H., FASHP
University of Connecticut Health Center School of Medicine,
Kimberly T. Metcalf, Pharm.D.
University of Hawaii John A. Burns School of Medicine, Abby
Collier, Ph.D., B.Sc.
University of Illinois College of Medicine at Chicago, Randal A.
Skidgel, Ph.D.
University of Iowa Carver College of Medicine, Raymond J.
Hohl, M.D., Ph.D.
University of Kansas School of Medicine, Sam J. Enna, Ph.D.
University of Kentucky College of Medicine, Lisa A. Cassis,
Ph.D.
University of Louisville School of Medicine, Peter P. Rowell,
Ph.D.
University of Maryland School of Medicine, Margaret M.
McCarthy, Ph.D.
University of Massachusetts Medical School, Roy Guharoy,
Pharm.D., M.B.A., FCP, FCC, FASHP
University of Miami Miller School of Medicine, Joshua D. Lenchus, D.O., R.Ph., FACP
University of Michigan Medical School, Paul F. Hollenberg,
Ph.D.
University of Mississippi School of Medicine, Deborah S. Minor,
Pharm.D., FAHA
University of MissouriKansas City School of Medicine, James
M. Wooten, Pharm.D.
University of Nebraska College of Medicine, L. Charles Murrin,
Ph.D.
University of Nevada School of Medicine, Iain L. Buxton,
Pharm.D.
University of New Mexico Health Sciences Center School of
Medicine, Arti Prasad, M.D.
University of North Dakota School of Medicine and Health
Sciences, James E. Porter, Ph.D.
University of Oklahoma College of Medicine, Pramod K.
Chetty, M.D.
University of Pennsylvania School of Medicine, Patrick J.
Brennan, M.D.
University of Pittsburgh School of Medicine, Dennis P.
Swanson, M.S.
University of Puerto Rico School of Medicine, Miguel A.
Marrero, M.D.
University of South Alabama College of Medicine, Jack A. DiPalma, B.S., M.D.
USP 38
University of South Carolina School of Medicine, Kenneth B.
Walsh, Ph.D.
University of South Florida Morsani College of Medicine, Shufeng Zhou, M.D., Ph.D.
University of Tennessee, Memphis College of Medicine, Trevor
W. Sweatman, Ph.D.
University of Texas Medical School at Houston, Gary C.
Rosenfeld, Ph.D.
University of Utah School of Medicine, Richard J. Sperry, M.D.,
Ph.D.
University of Virginia School of Medicine, Robert J. Meyer,
M.D.
University of Washington School of Medicine, Ellen Cosgrove,
M.D.
University of Wisconsin School of Medicine and Public Health,
F. Michael Hoffmann, Ph.D.
Vanderbilt University School of Medicine, C. Michael Stein,
M.D.
Virginia Commonwealth University School of Medicine,
Dominic A. Sica, M.D.
Wake Forest University School of Medicine, Kathy P. Bricker,
Pharm.D., BCPS
Washington University School of Medicine in St. Louis, Evan D.
Kharasch, M.D., Ph.D.
Wayne State University School of Medicine, Stephen A. Lerner,
M.D.
West Virginia University School of Medicine, Douglas D.
Glover, M.D.
Wright State University Boonshoft School of Medicine, Khalid
M. Elased, Ph.D., R.Ph.
Yale University School of Medicine, Seth Powsner, M.D.
y
Farmacia
Albany College of Pharmacy and Health Sciences, Mehdi Boroujerdi, Ph.D.
Auburn University Harrison School of Pharmacy, William R. Ravis, Ph.D.
Butler University College of Pharmacy and Health Sciences, Sudip K. Das, Ph.D.
Campbell University School of Pharmacy, Antoine Al-Achi,
M.S.Pharm., Ph.D., M.S.
Chicago State University College of Pharmacy, Duc P. Do,
Ph.D.
Creighton University School of Pharmacy and Health
Professions, J. Christopher Bradberry, Pharm.D.
Drake University College of Pharmacy and Health Sciences,
Abebe E. Mengesha, Ph.D.
Duquesne University Mylan School of Pharmacy, Lawrence H.
Block, Ph.D.
Ernest Mario School of Pharmacy at Rutgers University, Longqin Hu, Ph.D.
Ferris State University College of Pharmacy, Kim E. Hancock,
Ph.D.
Florida A & M University College of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Mandip Sachdeva, Ph.D.
Hampton University School of Pharmacy, Chengan Du, Ph.D.,
M.P.H.
Howard University College of Pharmacy, Nursing and Allied
Health Sciences, Emmanuel O. Akala, Ph.D.
Idaho State University College of Pharmacy, Kevin W.
Cleveland, Pharm.D.
Lake Erie College of Osteopathic Medicine School of Pharmacy,
Sachin S. Devi, B.Pharm., Ph.D.
Loma Linda University School of Pharmacy, W. William
Hughes, Ph.D.
Long Island University Arnold and Marie Schwartz College of
Pharmacy and Health Sciences, David R. Taft, B.S.Pharm.,
Ph.D.
USP 38
University of California San Francisco School of Pharmacy,

Leslie Z. Benet, Ph.D.
University of Cincinnati James L. Winkle College of Pharmacy,
Pankaj B. Desai, Ph.D.
University of Colorado School of Pharmacy, Peter J. Rice,
Pharm.D., Ph.D.
University of Connecticut School of Pharmacy, Peter J. Tyczkowski, R.Ph., M.B.A.
University of Florida College of Pharmacy, Veronika
Butterweck, Ph.D.
University of Georgia College of Pharmacy, Svein Oie, Ph.D.
University of Houston College of Pharmacy, F. Lamar Pritchard,
Ph.D.
University of Illinois at Chicago College of Pharmacy, Jerry L.
Bauman, Pharm.D., FCCP, FACC
University of Kansas School of Pharmacy, Christian Schoneich,
Ph.D.
University of Kentucky College of Pharmacy, Eric J. Munson,
Ph.D.
University of Maryland School of Pharmacy, Natalie D.
Eddington, Ph.D.
University of Michigan College of Pharmacy, James G.
Stevenson, Pharm.D.
University of Minnesota College of Pharmacy, Marilyn K. Speedie, Ph.D.
University of Mississippi School of Pharmacy, Michael A.
Repka, D.D.S., Ph.D.
University of MissouriKansas City School of Pharmacy, Cydney
E. McQueen, Pharm.D.
University of Nebraska Medical Center College of Pharmacy,
Michael F. Powell, B.S. Pharm, M.S.
University of New Mexico College of Pharmacy, Donald A.
Godwin, Ph.D.
University of Oklahoma College of Pharmacy, Loyd V. Allen Jr.,
Ph.D.
University of Pittsburgh School of Pharmacy, Michael A. Zemaitis, Ph.D.
University of Rhode Island College of Pharmacy, David R.
Worthen, Ph.D., J.D.
University of S
ao Paulo College of Pharmacy, Prof. Terezinha
de Jesus Andreoli Pinto
University of Southern California School of Pharmacy, Stan G.
Louie, Pharm.D.
University of Tennessee Health Science Center College of
Pharmacy, Laura A. Thoma, Pharm.D., B.S.
University of the Pacific Thomas J. Long School of Pharmacy
and Health Sciences, Xiaoling Li, Ph.D.
University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia College
of Pharmacy, Daniel A. Hussar, Ph.D.
University of Utah College of Pharmacy, John W. Mauger,
Ph.D.
University of Washington School of Pharmacy, Thomas K. Hazlet, Pharm.D., Dr.P.H.
University of WisconsinMadison School of Pharmacy, Barry E.
Gidal, Pharm.D.
University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence,
Ph.D.
Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia
School of Pharmacy, Phillip M. Gerk, Pharm.D., Ph.D.
Washington State University College of Pharmacy, Danial E.
Baker, Pharm.D., FASHP, FASCP
Wayne State University Eugene Applebaum College of
Pharmacy and Health Sciences, Sheila M. Wilhelm,
Pharm.D.
West Virginia University School of Pharmacy, Arthur I. Jacknowitz, Pharm.D.
Western University of Health Sciences College of Pharmacy, Sunil Prabhu, Pharm.D., R.Ph.
Wilkes University Nesbitt School of Pharmacy, Harvey A.
Jacobs, Ph.D.
Xavier University of Louisiana College of Pharmacy, Tarun K.
Mandal, Ph.D.
Preliminares
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences

Boston, David A. Williams, Ph.D.
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences School
of PharmacyWorcester, Reema R. Zeineldin, Ph.D.
Mercer University College of Pharmacy and Health Sciences, J.
Grady Strom, Ph.D.
Midwestern University Chicago College of Pharmacy, Anna Kabakov, Pharm.D.
Midwestern University College of PharmacyGlendale, Bill J.
Bowman, Ph.D., R.Ph.
North Dakota State University College of Pharmacy, Nursing
and Allied Sciences, Jagdish Singh, Ph.D.
Northeastern University Bouve College of Health Sciences
School of Pharmacy, Mansoor M. Amiji, Ph.D.
NOVA Southeastern University College of Pharmacy, Hamid H.
Omidian, Ph.D., M.Sc., B.Sc.
Ohio Northern University Raabe College of Pharmacy, Jenelle
L. Sobotka, Pharm.D.
Oregon State University College of Pharmacy, J. Mark
Christensen, Ph.D.
Pacific University College of Health Professions School of
Pharmacy, Susan M. Stein, R.Ph., M.S.
Palm Beach Atlantic University Gregory School of Pharmacy,
Adwoa O. Nornoo, B.Pharm., M.S., Ph.D.
Purdue University School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Stephen R. Byrn, Ph.D.
Roseman University of Health Sciences College of Pharmacy,
Mark C. Decerbo, Pharm.D., BCPS, BCNSP
Samford University McWhorter School of Pharmacy, John J.
Arnold, Ph.D., B.S.
Shenandoah University Bernard J. Dunn School of Pharmacy,
Nina Hengen, M.D., Ph.D.
South Carolina College of Pharmacy, Donna S. Harrison,
Pharm.D.
South Dakota State University College of Pharmacy, David L.
Helgeland, B.S.Pharm., M.B.A., Ed.D.
South University School of Pharmacy, S. Craig Dyar, Ph.D.
Southern Illinois University Edwardsville School of Pharmacy,
William M. Kolling, Ph.D.
Southwestern Oklahoma State University School of Pharmacy,
Shelly Stockton, Ph.D.
St. Johns University College of Pharmacy and Allied Health
Professions, Abu Serajuddin, Ph.D.
St. Louis College of Pharmacy, John Pieper, Pharm.D.
SUNY at Buffalo School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Wayne K. Anderson, Ph.D.
Temple University School of Pharmacy, Michael Borenstein,
Ph.D.
Texas Southern University College of Pharmacy and Health
Sciences, Dong Liang, Ph.D.
Texas Tech University Health Sciences Center School of
Pharmacy, Arthur A. Nelson, Ph.D., R.Ph.
The Ohio State University College of Pharmacy, Robert W.
Brueggemeier, Ph.D.
The University of Arizona College of Pharmacy, Michael Mayersohn, Ph.D.
The University of Iowa College of Pharmacy, Mickey L. Wells,
Ph.D.
The University of Louisiana at Monroe College of Pharmacy,
Sami M. Nazzal, Ph.D.
The University of North Carolina at Chapel Hill Eshelman
School of Pharmacy, Dennis M. Williams, Pharm.D.
The University of Texas at Austin College of Pharmacy, Janet C.
Walkow, Ph.D.
The University of Toledo College of Pharmacy, Kenneth S.
Alexander, R.Ph., Ph.D.
Touro University California College of Pharmacy, Alison
McCormick, Ph.D.
University of Arkansas for Medical Sciences College of
Pharmacy, Mark Estes, Pharm.D.
University of California San Diego Skaggs School of Pharmacy
and Pharmaceutical Sciences, Philip O. Anderson,
Pharm.D.
Integrantes / Miembros xxvii
Preliminares
xxviii Miembros / Integrantes
y
Medicina Osteopatica
NOVA Southeastern University College of Osteopathic Medicine,

Nicole Cook, Ph.D., M.P.H.
Organizaciones de Consumidores
y Otras Organizaciones que
Representan el Interes
Publico
Alzheimers Association, William Thies, Ph.D.

American Autoimmune Related Diseases Association, Virginia T.
Ladd, R.T.
American Cancer Society, Mark Clanton, M.D., M.P.H.
American Diabetes Association, Jane L. Chiang, M.D.
American Health Quality Association, Kenneth Mishler, R.Ph.,
Pharm.D.
American Heart Association, Robert Lee Page II, Pharm.D.,
M.S.P.H., FCCP, FAHA, FASHP, FASCP, BCPS, CGP
Arthritis Foundation, John H. Klippel, M.D.
Center for Science in the Public Interest, David G. Schardt,
M.S.
Consumers Union, Lisa L. Gill, B.A.
ECRI Institute, Jeffrey C. Lerner, Ph.D.
Institute for Safe Medication Practices, Louis Martinelli, Ph.D.,
Pharm.D.
National Consumers League, Rebecca Burkholder, J.D.
National Council on Patient Information and Education,
William R. Bullman, M.A.M.
National Organization for Rare Disorders, Diane E. Dorman
National Osteoporosis Foundation, Amy Porter
William J. Clinton Foundation, Rodger W. Stringham, Ph.D.
Organismos, Divisiones y
Asociaciones Gubernamentales
Vinculados
Agency for Healthcare Research and Quality, Scott R. Smith,
Ph.D.
Argentine Pharmacopoeia, Hector A. Giuliani, Pharm.D.
Association of Food and Drug Officials, Cynthia T. Culmo
Brazilian Pharmacopoeia Commission, Gerson A. Pianetti
Brazils National Institute of Quality Control in Health, Filipe
Soares Quirino Silva, Ph.D.
British Pharmacopoeia Commission, James Pound
Centers for Disease Control and Prevention, Cindy P.
Dougherty, Pharm.D.
Centers for Medicare & Medicaid Services, Jeffrey A. Kelman,
M.D.
China National Center for Food Safety Risk Assessment, Junshi
Chen, M.D.
Chinese Pharmacopoeia Commission, Wang Ping
Department of Veterans Affairs Veterans Health Administration,
Timothy J. Stroup, R.Ph.
European Directorate for the Quality of Medicines and
HealthCare, Susanne Keitel
FDA Center for Biologics Evaluation and Research, Christopher
C. Joneckis, Ph.D.
FDA Center for Devices and Radiological Health, Marilyn M.
Lightfoote, M.D., Ph.D.
FDA Center for Drug Evaluation and Research, Pallavi Nithyanandan, Ph.D.
FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition, Daniel E.
Folmer, Ph.D.
FDA Center for Veterinary Medicine, Janis R. Messenheimer,
D.V.M.
USP 38
Federal Service on Surveillance in Healthcare of Russian Federation, Valentina F. Kosenko, Ph.D., Pharm.
Food and Drugs Authority, Ghana, Eric Karikari-Boateng, M.S.
Food, Medicine and Health Care Administration and Control
Authority of Ethiopia, Yehulu Denekew Alamneh, B.Sc.,
M.A.
General Directorate of Medicines, Supplies and Drugs, Laura
Ceron,
Q.F.
Health Canada, Karen Reynolds
Health Canada, Biologics and Genetic Therapies Directorate,
Chantal Cazeault, B.Sc.
Health Canada, Food Directorate, Barbara Lee
Health Canada, Natural Health Products Directorate, Bruce
Randall
Indian Pharmacopoeia Commission, G.N. Singh, Ph.D.,
M.Pharm.
Indonesian Pharmacopoeia Commission, Augustine Zaini, M.S.
Japans Ministry of Health Labour and Welfare,
Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Issei
Takayama
Jordan Food and Drug Administration, Dr. Lubna R. Qusous
Moroccos Directorate of Medicines and Pharmacy, Laila
Hakkou
National Agency for Food and Drug Administration and Control, Dr. Monica H. Eimunjeze
National Association of Boards of Pharmacy, Elizabeth Scott
Russell, B.S.Pharm.
National Center for Quality Control, Ofelia del Rosario Villalva
Rojas, Q.F.
National Centre for Expertise of Drugs, Medical Products and
Medical Equipment, Ardak U. Tulegenova, Ph.D.
National Drug Authority of Uganda, Gordon Katende
Sematiko
National Health Surveillance Agency, Lais Santana Dantas, B.S.
National Institute for Biological Standards and Control, Adrian
F. Bristow, Ph.D.
National Institute of Drug and Food Surveillance, Christian
Moises de la Hoz
National Institute of Metrology, Quality and Technology, Valnei
Smarcaro da Cunha, Ph.D.
National Institute of Standards and Technology, Robert L.
Watters, Ph.D.
National Institutes for Food and Drug Control, Yunlong Li
National Institutes of Health, Robert DeChristoforo, R.Ph.,
M.S., FASHP
Permanent Commission of the Pharmacopoeia of the United
Mexican States, Maria del Carmen Becerril-Martinez
Pharmacopoeia of Chinese Taipei, Jaw-Jou Kang, Ph.D.
Pharmacy Council of India, Bhojraj Suresh, M.Pharm., Ph.D.,
D.Sc.
Philippine Pharmacopeia, Maria Lourdes C. Santiago,
B.S.Pharm., M.S.Pharm.
Saudi Food and Drug Authority, Abdullah S. Alhomoud, M.S.
State Administration of Ukraine on Medicinal Products, Andrii
Shovkovyi
Tanzania Food and Drugs Authority, Yonah H. Mwalwisi
Thai Pharmacopoeia Committee, Sirichai Krabesri,
B.Sc.Pharm., M.Pharm.
The Pharmacy Board of Sierra Leone, Wiltshire C.N. Johnson,
B.Pharm. (Hons) USL., M.Sc (Brad UK), MPSSL,
FPCPharm
Therapeutic Goods Administration of Australia, Vivienne Christ,
B.App.Sc., MASM
Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center for Quality of Medicines, Oleksandr I. Gryzodub, Ph.D.
United States Agency for International Development, Anthony
F. Boni
United States Air ForceOffice of the Surgeon General, Deborah
Myers, R.Ph., M.B.A.
United States Department of Health and Human Services,
Donald Wright, M.D., M.P.H.
United States Food and Drug AdministrationOffice of the
Commissioner, Jingyee Kou, Ph.D.
United States Public Health ServiceOffice of the Surgeon General, Christina H. Lee, Pharm.D.
USP 38
Otras Asociaciones Profesionales

y Cientficas de Profesionales de
la Salud
AACC International, Amy Hope
Academy of Managed Care Pharmacy, Edith A. Rosato, R.Ph.,
IOM
Academy of Nutrition and Dietetics, Kathryn M. Camp, M.S,
RD, CSP, LN
American Academy of Allergy, Asthma and Immunology,
Michael R. Nelson, M.D., Ph.D.
American Academy of Neurology, Henry J. Kaminski, M.D.
American Academy of Nurse Practitioners, Jan Towers, Ph.D.,
NP-C
American Academy of Ophthalmology, Wiley A. Chambers,
M.D.
American Academy of Pediatrics, Hank Farrar, M.D.
American Academy of Physician Assistants, Marie-Michele
Leger, M.P.H., PA-C
American Academy of Veterinary Pharmacology and
Therapeutics, Carol A. Davis, Ph.D.
American Association of Critical-Care Nurses, Denise
Buonocore, R.N., M.S.N., CCRN, APRN-BC
American Association of Pharmaceutical Scientists, John Lisack
Jr., CAE
American Botanical Council, Mark Blumenthal
American Chemical Society, Denise L. Creech
American College of Clinical Pharmacology, Stephen N. Keith,
M.D., M.S.P.H.
American College of Clinical Pharmacy, C. Edwin Webb,
Pharm.D., M.P.H.
American College of Physicians, Brian L. Strom, M.D.
American Dental Association, Helen Ristic, Ph.D.
American Dental Education Association, Vahn A. Lewis,
Pharm.D., Ph.D.
American Geriatrics Society, Todd P. Semla, M.S., Pharm.D.,
BCPS, FCCP, AGSF
American Medical Association, Barry D. Dickinson, Ph.D.
American Nurses Association, Rita Munley Gallagher, Ph.D.,
R.N.
American Optometric Association, Jimmy D. Bartlett, O.D.
American Pharmacists Association, Thomas E. Menighan,
R.Ph., M.B.A., FAPhA
American Public Health Association, Deborah K. Walker, Ed.D.
American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics,
Patricia W. Slattum, Pharm.D., Ph.D.
American Society for Microbiology, Alice S. Weissfeld, Ph.D.
American Society for Nutrition, Robert M. Russell, M.D.
American Society for Parenteral and Enteral Nutrition, Gordon
S. Sacks, Pharm.D., BCNSP, FCCP
American Society for Pharmacology and Experimental
Therapeutics, Jan M. Kitzen, Ph.D.
American Society for Quality, Donald C. Singer, M.S.
American Society of Anesthesiologists, H.A. Tillmann Hein,
M.D., Ph.D.
American Society of Consultant Pharmacists, Thomas R. Clark,
R.Ph., MHS, CGP
American Society of Health-System Pharmacists, Paul W. Abramowitz, Pharm.D., FASHP
American Veterinary Medical Association, Donald C. Sawyer,
D.V.M., Ph.D.
Argentine Association of Industrial Pharmacy and Biochemistry,
Federico Montes de Oca, M.B.A.
Calibration and Validation Group, Herman Lam, Ph.D.
Canadian Pharmacists Association, Perry Eisenschmid, M.B.A.
Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Neal M. Davies,
B.Sc. Pharm., Ph.D., R.Ph.
Drug Information Association, Susan Cantrell
European Federation for Pharmaceutical Sciences, Hendrik J. de
Jong, Ph.D.
Infusion Nurses Society, Mary C. Alexander, C.R.N.I., M.A.,

R.N., CAE, FAAN
Institute of Food Technologists, William Fisher, M.S.
International Academy of Compounding Pharmacists, Matthew
Kopacki, B.S.Pharm.
International Council of Nurses, David C. Benton, RGN, RMN,
BSC, MPhil, FFNF, FRCN
International Society for Cellular Therapy, Joseph C. Laning,
Ph.D.
International Society for Pharmaceutical Engineering, Stephen
M. Tyler, M.S.
National Alliance of State Pharmacy Associations, Rebecca P.
Snead, R.Ph., B.S.Pharm.
National Association of Compounding Pharmacists, Maria do
Carmo Garcez
National Community Pharmacists Association, Carolyn C. Ha,
Pharm.D.
National Pharmaceutical Association, Barry A. Bleidt, Ph.D.,
Pharm.D.
National Pharmacy Technician Association, Michael J.
Johnston, CPhT
New Jersey Pharmaceutical Quality Control Association,
Barbara J. Ferguson, B.A.
Pan American Pharmaceutical Federation, Maria Elena
Girard-Cuesy
Parenteral Drug Association, Inc., Richard M. Johnson, M.Sc.
Regulatory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas,
Ph.D., CAE
Society of Critical Care Medicine, Timothy G. Buchman, Ph.D.,
M.D., FACS, FCCM
Society of Nuclear Medicine, Jeffrey P. Norenberg, Pharm.D.
Western Compendial Discussion Group, Assad J. Kazeminy,
Ph.D.
Asociaciones Profesionales y
Cientficas de Profesionales de la
SaludSociedades Medicas
Estatales de los Estados Unidos de

America
California Medical Association, Charles W. Maas, M.D.,

M.P.H.
Connecticut State Medical Society, Eric B. Einstein, M.D.
Hawaii Medical Association, Jone G. Flanders, D.O.
Illinois State Medical Society, Roy E. Weiss, M.D., Ph.D.
Indiana State Medical Association, Daria Schooler, M.D., R.Ph.
Iowa Medical Society, Harold W. Miller, M.D.
Kansas Medical Society, Tracie Collins, M.D., M.P.H.
Maine Medical Association, Stevan Gressitt, M.D.
Massachusetts Medical Society, Bruce G. Karlin, M.D.
MedChiMaryland State Medical Society, Peter H. Rheinstein,
M.D., J.D., M.S.
Medical Association of the State of Alabama, Allan R.
Goldstein, M.D.
Medical Society of New Jersey, Joseph N. Micale, M.D.
Medical Society of the District of Columbia, Kim A. Bullock,
M.D.
Medical Society of the State of New York, Richard S. Blum,
M.D.
Minnesota Medical Association, Robert K. Meiches, M.D.,
M.B.A.
Missouri State Medical Association, Thomas L. Holloway
Montana Medical Association, Jean Branscum
New Mexico Medical Society, Jerry D. McLaughlin, M.D.
North Dakota Medical Association, Robert (Rob) W. Beattie,
M.D.
Pennsylvania Medical Society, Ralph Schmeltz, M.D., FACP,
FACE
Puerto Rico Medical Association, Rolance G. Chavier-Roper,
M.D.
Rhode Island Medical Society, Peter A. Hollmann, M.D.
Preliminares
Vietnamese Pharmacopoeia Commission, Luc Thi Thu Hang,

Ph.D.
Integrantes / Miembros xxix
Preliminares
xxx Miembros / Integrantes

South Carolina Medical Association, Stephen Imbeau, M.D.,
FACP, FAAAI
South Dakota State Medical Association, Edward P.
Amundson, M.D.
Tennessee Medical Association, John J. Ingram III, M.D.
Texas Medical Association, Kevin H. McKinney, M.D., FACE,
FACP
Utah Medical Association, Michelle S. McOmber, B.S., M.B.A.
West Virginia State Medical Association, Kevin W. Yingling,
M.D., R.Ph., FACP
Wisconsin Medical Society, Thomas M. Derrig, M.D.
Asociaciones Profesionales y
Cientficas de Profesionales de la
SaludAsociaciones
Farmaceuticas
Estatales de los
Estados Unidos de America
Alabama Pharmacy Association, Louise F. Jones

Alaska Pharmacists Association, Amber L. Briggs, Pharm.D.
Arizona Pharmacy Alliance, Kelly Ridgeway
Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D.
California Pharmacists Association, Jon R. Roth, CAE
Colegio de Farmaceuticos de Puerto Rico, Milagros Morales,
R.Ph.
Colorado Pharmacists Society, Val Kalnins, R.Ph.
Connecticut Pharmacists Association, Peter J. Sposato, R.Ph.,
B.C.N.P.
Delaware Pharmacists Society, Kenneth (Kevin) Musto, R.Ph.
Florida Pharmacy Association, Michael A. Mone, J.D., R.Ph.,
FAPhA
Georgia Pharmacy Association, James Jim R. Bracewell
Hawaii Pharmacists Association, Ronald T. Taniguchi,
Pharm.D.
Idaho State Pharmacy Association, Pam Eaton
Illinois Pharmacists Association, Norman A. Hoback,
B.S.Pharm.
Indiana Pharmacists Alliance, Amy Hyduk, Pharm.D., M.B.A.
Iowa Pharmacy Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Kansas Pharmacists Association, Michael Larkin
Kentucky Pharmacists Association, Patricia R. Freeman, Ph.D.
Louisiana Pharmacists Association, Randall Brooks, B.S.
Maine Pharmacy Association, Laurier A. Lamie, R.Ph.
Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Shimoda,
Pharm.D.
Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy,
R.Ph.
Michigan Pharmacists Association, Joseph Ringer, M.B.A.
Minnesota Pharmacists Association, Elizabeth Cinqueonce
Mississippi Pharmacists Association, Kimsey O. Cooper,
Pharm.D.
Missouri Pharmacy Association, Ron L. Fitzwater, CAE, M.B.A.
Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., Pharm.D.
Nebraska Pharmacists Association, Samuel C. Augustine,
Pharm.D., FAPhA
New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A.
Robertson, R.Ph.
New Jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick,
Pharm.D.
New Mexico Pharmacists Association, William G. Troutman,
Pharm.D.
North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel,
Pharm.D., M.H.A.
North Dakota Pharmacists Association, Michael D. Schwab
Ohio Pharmacists Association, Amelia S. Bennett, R.Ph.
Oklahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, J.D.
Oregon State Pharmacy Association, Jennifer L. Davis,
Pharm.D., R.Ph.
Pennsylvania Pharmacists Association, George R. Haynes,
Pharm.D., Ph.D.
Pharmacists Society of the State of New York, Tracy R. Russell,
CAE
USP 38
Pharmacy Society of Wisconsin, Susan M. Kleppin, R.Ph.,
FASHP
Rhode Island Pharmacists Association, John Grossomanides,
Pharm.D.
South Carolina Pharmacy Association, Craig Burridge, M.S.,
CAE
South Dakota Pharmacists Association, Leonard J. Petrik,
Pharm.D.
Tennessee Pharmacists Association, Baeteena M. Black, D.Ph.
Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, MSE, Pharm.D.
Utah Pharmacists Association, Adam W. Jones
Virginia Pharmacists Association, Marianne R. Rollings, R.Ph.
Washington D.C. Pharmaceutical Association, Michael J. Kim,
Pharm.D.
Washington State Pharmacy Association, Jeff Rochon,
Pharm.D.
West Virginia Pharmacists Association, Patty Johnston, B.S.
Wyoming Pharmacy Association, William H. Rathburn, R.Ph.
Asociaciones de Fabricantes,
Comerciales y Afiliadas
American Chemistry Council, Michael P. Walls, Esq.
American Herbal Products Association, Maged H. Sharaf, Ph.D.
American Hospital Association, John R. Combes, M.D.
Animal Health Institute, Richard A. Carnevale, V.M.D.
Association of the European Self-Medication Industry, Christelle
Anquez-Traxler
Biotechnology Industry Organization, Earl S. Dye, Ph.D.
Bulk Drug Manufacturers Association, Airra Krishna Reddy,
B.Sc.
Compressed Gas Association, Michael B. Tiller, B.S., B.A.
Consumer Health Products Canada, Adam C. Kingsley, B.Sc.,
NP, CAE
Consumer Healthcare Products Association, John Punzi, Ph.D.
Council for Responsible Nutrition, Douglas MacKay, N.D.
Egyptian Chamber of Pharmaceutical Industry, Abdulla Molokhia, Ph.D.
European Generic Medicines Association, Julie Marechal-Jamal,
M.S.
Flavor and Extract Manufacturers Association, John H. Cox,
J.D.
Food Marketing Institute, Catherine M. Polley, R.Ph.
Generic Animal Drug Alliance, Stephanie Batliner
Generic Pharmaceutical Association, David R. Gaugh, R.Ph.
Grocery Manufacturers Association, Shannon M. Cole, M.S.,
PMP
Healthcare Distribution Management Association, Karen J.
Ribler
Indian Drug Manufacturers Association, Daara B. Patel,
B.Com., D.I.M.M.
International Federation of Pharmaceutical Manufacturers and
Associations, Odette Morin, Ph.D.
International Food Additives Council, Haley C. Stevens, Ph.D.
International Generic Pharmaceutical Alliance, Nicholas
Cappuccino, Ph.D.
International Pharmaceutical Excipients Council of the
Americas, Priscilla Zawislak
Mexicos National Chamber of the Pharmaceutical Industry,
J. Rivelino Flores, M.Sc.
National Association of Chain Drug Stores, Alex J. Adams,
Pharm.D.
Personal Care Products Council, Halyna Breslawec, Ph.D., B.S.
Pharmaceutical Care Management Association, Greg S.
Johnson, B.A.
Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, Gina
Maria A. Marsee
S
ao Paulo State Pharmaceutical Manufacturers Association, Dr.
Lauro Moretto
The Jordanian Association of Manufacturers of Pharmaceuticals
& Medical Appliances, Hanan J. Sboul, M.B.A., CAE
USP 38
Accreditation Council for Pharmacy Education, Dimitra V. Travlos, Pharm.D., BCPS

American Type Culture Collection, Elizabeth J. Kerrigan, B.A.
AOAC International, E. James Bradford, Ph.D.

Association for the Advancement of Medical Instrumentation,
Joseph Carl Lewelling, B.A., M.A.
Chilean Pharmacopeia Foundation, Caroline R.
Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
Clinical and Laboratory Standards Institute, Luann Ochs, M.S.
Pharmacy Compounding Accreditation Board, Joe Cabaleiro,
R.Ph.
URAC, Kylanne Green, R.N., N.P.
Preliminares
Organismos No Gubernamentales
para el Establecimiento de
Normas y Determinacion
de
Conformidad
Integrantes / Miembros xxxi
Preliminares
xxxii Donantes / Integrantes
USP 38
Reconocimiento para los

Donantes de Materiales de
Referencia y de
Monografas en 2013
La USP reconoce y agradece el apoyo de las empresas que
han participado en el establecimiento de las normas USP
mediante el aporte de informacion
para el desarrollo de
nuevas monografas o la donacion
de candidatos a materiales de referencia. La siguiente lista incluye a las empresas
que aportaron monografas propuestas en 2013 o que donaron candidatos a materiales de referencia establecidos
como Estandares de Referencia USP durante 2013.
3V Inc.
Abbvie
ACS Dobfar
Actavis
Ajinomoto Aminoscience, LLC
Aker BioMarine AS
Alcon Laboratories
Alkaloids Corporation
Almirall S.A.
American Laboratories, Inc.
American Sugar Refining, Inc.
Amersham Biosciences
Amgen, Inc.
Angelini
Apicore, LLC
Apotex, Inc.
Astellas Pharmaceuticals, Inc.
AstraZeneca Pharmaceuticals, Inc.
Aurobindo Pharma, Ltd.
Axellia Pharmaceuticals, Inc.
BASF Corporation
Baxter Healthcare
Bayer Corporation
Bioriginal Food & Science Corporation
Bloomage Freda Biopharm Company
Boehringer Ingelheim
Bristol-Myers Squibb
Cambrex Profarmaco Milano S.r.l.
Cargill, Inc.
CellGenix, GmbH
Chevron Phillips Chemical
Chifeng Pharmaceutical Co., Ltd.
Chrysantis, Inc.
Cipla, Ltd.
Citrique Belge SA
CordenPharma
Covidien/Mallinckrodt
Croda, Inc.
Cyanotech Corporation
Daiichi Sankyo Co., Ltd.
Dionex Corporation
Divis Laboratories, Ltd.
Dow Chemical Company
Dr. Reddys Laboratories Ltd.
DSM Nutritional Products, Inc.
DuPont
Eli Lilly and Company
Erregierre, S.P.A.
Evonik Industries
Excella GmbH
Fabbrica Italiana Sintetici
Farmak, AS
Ferring Pharmaceuticals, Inc.
Formosa Laboratories, Inc.
Fresenius Kabi Oncology, Ltd.
Fuji Chemical Industry Company, Ltd.
Ganeden Biotech, Inc.
Gattefosse Corporation SAS
GE Healthcare, Inc.
Gland Pharma, Ltd.
GlaxoSmithKline
Glenmark Generics, Ltd.
Gnosis, S.p.A.
Harman Finochem, Ltd.
Hayashibara Company, Ltd.
Hetero Drugs, Ltd.
Havione Farmaciencia, S.A.
ICL Performance Products
Icrom, S.p.A.
International Vitamin Corporation
Ipca Laboratories, Ltd.
Jiangsu Hengrui Medicine Company
Johnson & Johnson
Johnson Matthey Pharmaceuticals, Inc.
JRS Pharma LP
Jubilant Life Sciences
KAH Specialty Products, LLC
Kongo Chemical Company, Ltd.
Kremers Urban Pharmaceuticals, Inc.
Lancaster Laboratories, Inc.
Lanxess Corporation
Leo Pharma A/S
Lipoid KG
Lonza Group AG
Lundbeck, Inc.
Lupin Pharmaceuticals, Inc.
Macfarlan Smith, Ltd.
Medichem S.A.
Medicis Pharmaceutical Corporation
Merck & Co., Inc.
Microlabs, Ltd.
Minsheng Group Shaoxing Pharma Company, Ltd.
Mylan Pharmaceuticals, Inc.
Natural Remedies, Pvt. Ltd.
Naturex, Inc.
Neptune Technologies & Bioressources, Inc.
Neuland Laboratories, Ltd.
Novartis Pharmaceuticals Corporation
Novozymes Delta, Ltd.
Nusil Technology, LLC
Nutrition 21
Opocrin, S.p.A.
USP 38
Strides Arcolab, Ltd.

Sun Pharmaceutical, Ltd.
Suven Life Sciences, Ltd.
Suzhou Pharmaceutical Group, Co., Ltd.
Symed Labs, Ltd.
Symrise GMBH & Company, KG
Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.
Teva Pharmaceutical Industries, Inc.
Tianjin Tianfa Pharmaceuticals
TSI Health Sciences, Inc.
Valeant Pharmaceuticals International, Inc.
Virchow Group
Welch, Holme & Clark, Co., Inc.
Wellesley Therapeutics, Inc.
Wilshire Technologies, Inc.
Wockhardt, Ltd.
Wuhan Wuyao Pharmaceutical Company, Inc.
Wuxi Howfond Biopharma Company, Ltd.
Yunnan Hande BioTech Company, Ltd.
Zhejiang Apeloa Jiayuan Pharmaceutical Co., Ltd.
Zhejiang Conba Drug Discovery and Development Company, Ltd.
Zhejiang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical Company, Ltd.
Zhejiang Huahai Pharmaceutical Company, Ltd.
Zydus Cadila Healthcare, Ltd.
Preliminares
Patheon, Inc.
Perrigo
Pfizer
Pharmacosmos A/S
Piramal Healthcare
Polygal AG
POM Wonderful, LLC
Procos, S.p.A.
Quimica Sintetica S.A.
Ranbaxy Pharmaceuticals, Inc.
Reliance Life Sciences
Roche Diagnostics, GmbH
RPG Life Sciences, Ltd.
Safe Foods Corporation
SAI Advantium Pharma, Ltd.
Sandoz, Inc.
Sanofi-Aventis
ScinoPharm Taiwan, Ltd.
Septodont
Shaanxi Hanjiang Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Shanghai Institute of Materia Medica Chinese Academy
of Sciences
Shasun Pharmaceuticals, Ltd.
Sicor S.r.l.
Sifavitor S.r.l.
Sterling S.N.I.F.F. Italia, S.p.A.
Integrantes / Donantes xxxiii
Preliminares
xxxiv Acta Constitutiva
USP 38
Acta Constitutiva
En mayo de 1900 la Convencion
le ordeno a la Junta
Directiva que constituyera la asociacion
de la USP conforme
a la legislacion
del Distrito de Columbia (Estados Unidos de
America). La creacion
de la asociacion
se vio retrasada debido a que la legislacion
del Distrito de Columbia exiga que
la mayora de los funcionarios firmantes del Certificado de
Constitucion
fueran residentes del Distrito, por lo que fue
necesario designar representantes que cumplieran con tal

requisito. No obstante, se procedio a elaborar el Acta Constitutiva, que se firmo e inscribio definitivamente el 11 de
julio de ese mismo a
no. A continuacion
figura el texto del
certificado original:
Certificado de Constitucion
Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayora ciudadanos del
Distrito de Columbia, constituyen una asociacion
que se denominara Convencion
de la Farmacopea de los Estados Unidos de
America (The United States Pharmacopeial Convention), segun
lo dispuesto en los artculos 545 a 552 inclusive, de las Leyes
Revisadas de los Estados Unidos para el Distrito de Columbia y su enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada el da
23 de abril de 1884.
Esta Asociacion
se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve a
nos. Su objeto es promover y fomentar la
ciencia y el arte de la medicina y la farmacia mediante la realizacion
de investigaciones, experimentos y otros procedimientos
adecuados destinados a seleccionar y denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y
farmacos, incluyendo formulas
para su preparacion;
establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la
medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar con exactitud la identidad, el contenido y la
pureza de tales medicamentos y farmacos, y otros propositos
afines y similares; e imprimir y distribuir en general, a intervalos

adecuados, las mencionadas formulas
y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y determinaciones de ndole

similar, entre los miembros de esta Asociacion,
farmaceuticos y medicos generalmente de los Estados Unidos, as como entre
quienes tengan interes en la farmacia y en la medicina.
La administracion
y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociacion
durante su primer a
no de existencia estaran
a cargo de una Junta Directiva, integrada por los siete miembros siguientes:
ALBERT E. EBERT
SAMUEL A.D. SHEPPARD
WILLIAM S. THOMPSON
CHARLES E. DOHME
En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento
WILLIAM S. THOMPSON
[SELLO]
G. LLOYD MAGRUDER
[SELLO]
JOHN T. WINTER
[SELLO]
THOMAS C. SMITH
[SELLO]
GEORGE W. SLOAN
HORATIO C. WOOD
CHARLES RICE
este septimo da del mes de julio del a

no 1900.
MURRAY G. MOTTER
WILLIAM M. MEW
FRANK M. CRISWELL
[SELLO]
[SELLO]
[SELLO]
USP 38
Gobierno de la USP xxxv
Estatutos
Los Estatutos de USP para el perodo 20102015 estan disponibles en el sitio electronico
http://www.usp.org/sites/default/
files/usp_pdf/EN/members/2010-2015-Bylaws.pdf.
Normas y Procedimientos
Las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos para el perodo 20102015 estan disponibles en el sitio electro
nico http://www.usp.org/about-usp/leadership/bylaws.
Polticas de la USP
Las polticas de la USP estan disponibles en el sitio electronico
http://www.usp.org/about-usp/leadership/policies-rules.
Preliminares
Gobierno de la USP
USP 38
FARMACOPEA DE LOS
ESTADOS UNIDOS DE
AME RICA
Oficial desde el 1 de mayo de 2015
TRIGE SIMA OCTAVA REVISION
2015 The United States Pharmacopeial Convention

12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
USP 38
Incorporaciones xxxix
Artculos Incorporados a USP 38 mediante

Suplementos
Primer Suplemento (1 de agosto de 2014)
CAPITULOS GENERALES
5 Medicamentos Nasales y para InhalacionInformaci
on
General y Pruebas de Calidad del Producto

121.1 Procedimientos Analticos Fisicoqumicos
para Insulinas
602 Propelentes
603 Aerosoles Topicos
604 Velocidad de Fuga

787 Partculas Subvisibles en Inyectables de Protenas
Terapeuticas
790 Partculas Visibles en Inyectables
1044 Crioconservacion
de Celulas
1094 CapsulasPruebas de Disolucion

y Atributos de
Calidad Relacionados
1229.4 Esterilizacion
de Lquidos por Filtracion
por Gases
por Calor Seco
por Radiacion
1285 Preparacion
de Muestras Biologicas
para Analisis
Histologico
e Inmunohistoqumico
1285.1 Tincion
con Hematoxilina y Eosina de Cortes de
Tejidos para Examen Microscopico
SUPLEMENTOS DIETE TICOS

L-5-Metiltetrahidrofolato
L-5-Metiltetrahidrofolato
de Calcio, Capsulas
de Calcio, Tabletas
Extracto de Zeaxantina de Cempasuchil
MONOGRAFIAS DE USP
Albuterol, Tabletas de Liberacion
Prolongada
Cladribina, Inyeccion
Efavirenz, Tabletas
Insulina Asparta
Insulina Asparta, Inyeccion
Ketoprofeno, Capsulas
Olanzapina, Tabletas de Desintegracion
Oral
Clorhidrato de Propafenona, Tabletas
Segundo Suplemento (1 de diciembre de 2014)

CAPITULOS GENERALES
124 Valoraciones Biologicas
de Eritropoyetina
126 Pruebas de Identidad Biologica
de Somatropina
en Fase Lquida
1234 Vacunas para Uso HumanoVacunas de Polisacaridos
Preliminares
Incorporaciones
Preliminares
xl Incorporaciones
USP 38
CAPITULOS GENERALES
227 4-Aminofenol en Medicamentos que Contienen

Acetaminofeno
469 Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol en Sustancias
Etoxiladas
705 Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo
Etiquetado Indica Ranurado Funcional
1115 Control de Biocarga de Farmacos y Medicamentos
No Esteriles
y Glicoconjugados
1240 Analisis de Virus en Plasma Humano para Fabricacion
Posterior
1736 Aplicaciones de la Espectrometra de Masas
2250 Deteccion
de Suplementos Dieteticos Irradiados

L-Alanil-L-Glutamina
Aceite de Semilla de Borraja

Ganoderma lucidum, Cuerpo Fructfero
Ganoderma lucidum, Cuerpo Fructfero en Polvo
Glicil-L-Glutamina
Glicil-L-Tirosina
Aceite de Kril
Aceite de Kril, Capsulas
Aceite de Kril, Capsulas de Liberacion
Retardada
Aceite de Semilla de Lino

Aceite de Onagra
Rhodiola rosea
Rhodiola rosea en Polvo
Extracto en Polvo de Rhodiola rosea
Rhodiola rosea, Tintura
Vinpocetina, Capsulas
Vinpocetina, Tabletas
MONOGRAFIAS DE USP
Atenolol, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Atenolol, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral Veterinaria
Clorhidrato de Azelastina
Clorhidrato de Benazepril, Suspension
Oral, Preparacion
Clopidogrel, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Clorhidrato de Dorzolamida y Maleato de Timolol,
Solucion
Oftalmica
Doxiciclina, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Veterinaria
Maleato de Enalapril, Suspension
Oral, Preparacion
Espironolactona, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Clorhidrato de Fenoxibenzamina, Suspension
Oral,
Preparacion
Magistral
Pamoato de Imipramina
Lamotrigina, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Lansoprazol, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Benzoato de Metronidazol, Suspension
Oral,
Preparacion
Magistral
Paroxetina, Tabletas de Liberacion
Prolongada
Piroxicam, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Prednisolona, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Veterinaria
Fosfato Sodico
de Prednisolona, Suspension
Oral,
Preparacion
Magistral
Salmeterol, Polvo para Inhalacion
Fenilbutirato de Sodio
Picosulfato de Sodio
Topiramato, Suspension
Oral, Preparacion
Magistral
Artculos Nuevos que Aparecen en USP 38 Ausentes en USP 37 y sus

Suplementos
[NOTALos artculos que se incluyen en esta lista se marcan en el libro con los siguientes smbolos
tanto a los artculos nuevos como a secciones de artculos existentes que han tenido revisiones.]
USP38
. Esto se aplica
CAPITULOS GENERALES
4 Medicamentos para MucosasPruebas de Calidad
7 Etiquetado
89 Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en la Fabricacion
de Productos Farmaceuticos
857 Espectroscopa Ultravioleta-Visible

1152 Medicamentos Veterinarios Usados en Alimentos para
Animales
1787 Medicion
de Partculas Subvisibles en Inyectables de
Protenas Terapeuticas
USP 38
209
Bajo
697
852
853
854
Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de

Peso Molecular
Contenido en Envases para Inyectables
Espectroscopa de Absorcion
Atomica
Espectroscopa de Fluorescencia
Espectroscopa en el Infrarrojo Medio
1852 Espectroscopa
Practica
1853 Espectroscopa
1854 Espectroscopa
Teora y Practica
1857 Espectroscopa
de Absorcion
AtomicaTeor
a y
de FluorescenciaTeora y Practica
en el Infrarrojo Medio
Ultravioleta-VisibleTeora y Practica

Hojas de Banaba
Hojas de Banaba en Polvo
Extracto Seco de Hojas de Banaba
Romero
Romero en Polvo
Extracto Acuoso Seco de Hojas de Romero
MONOGRAFIAS DE USP
Besilato de Cisatracurio
Besilato de Cisatracurio, Inyeccion
Cosintropina
Desonida
Dutasterida
Fondaparina Sodica
Fondaparina Sodica,
Inyeccion
Clorhidrato de Idarubicina, Inyeccion
Insulina Glargina
Insulina Glargina, Inyeccion
Misoprostol, Dispersion
Clorhidrato de Nicardipino, Inyeccion
Tartrato de Pirantel
Fumarato de Quetiapina
Quetiapina, Tabletas
Tigeciclina
Tigeciclina para Inyeccion
Vigabatrina para Solucion

Oral
Vigabatrina, Tabletas
Artculos Incluidos en USP 37 Ausentes en USP 38

CAPITULOS GENERALES
726 Electroforesis
1081 Consistencia del Gel de Gelatina
MONOGRAFIAS DE USP
Monoxido
de Carbono C 11
Flumazenil C 11, Inyeccion
Mespiperona C 11, Inyeccion
Metionina C 11, Inyeccion
Racloprida C 11, Inyeccion
Acetato de Sodio C 11, Inyeccion
Corticotropina Hidroxido
de Cinc, Suspension
Inyectable
Cloranfenicol, Sulfato de Polimixina B y Acetato de
Hidrocortisona, Unguento Oftalmico
Cloranfenicol y Prednisolona, Unguento Oftalmico
Bromhidrato de Escopolamina, Unguento Oftalmico
Fisostigmina
Sulfato de Fisostigmina
Sulfato de Fisostigmina, Unguento Oftalmico
Fluorodopa F 18, Inyeccion
Isoflurofato
Isoflurofato, Unguento Oftalmico
Sulfato de Neomicina y Acetato de Hidrocortisona,
Unguento Oftalmico
1196 Armonizacion
Farmacopeica
Sulfato de Neomicina y Acetato de Prednisolona,

Unguento Oftalmico
Sulfato de Neomicina y Fosfato Sodico
de Prednisolona,
Unguento Oftalmico
Sulfato de Neomicina, Sulfacetamida Sodica
y Acetato de
Prednisolona, Unguento Oftalmico
Sulfato de Neomicina y Acetonido
de Triamcinolona,
Unguento Oftalmico
Agua O 15, Inyeccion
Oxitocina, Solucion
Nasal
Plicamicina
Plicamicina para Inyeccion
Clorhidrato de Propranolol e Hidroclorotiazida, Capsulas

de Liberacion
Prolongada
Reserpina, Clorhidrato de Hidralazina e Hidroclorotiazida,
Tabletas
Tetracana, Unguento Oftalmico
Vidarabina
Vidarabina, Unguento Oftalmico
Preliminares
CAPITULOS GENERALES
Incorporaciones xli
Preliminares
xlii Lista Detallada
USP 38
LISTA DETALLADA
Advertencias Generales, Monografas, Captulos Generales, Reactivos y

Tablas Afectadas por Cambios que Aparecen en USP 38
Los numeros de pagina se refieren a USP 38. NotaLas siguientes listas indican, entre parentesis, seguido del ttulo de la seccion
o subseccion, si la seccion es nueva o si la subseccion se agrego o elimino de una seccion ya existente. Las entradas que aparecen
sin ninguna designacion de la forma nueva, agregada, o eliminada, tienen cambios en la redaccion que se incluyeron en el
texto oficial existente.
Captulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales
Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones
1 Inyectables, 57
4 Medicamentos para MucosasPruebas de Calidad (nuevo), 82
7 Etiquetado (nuevo), 95
Equipos para Pruebas y Valoraciones
41 Balanzas, 108
Repetibilidad
51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana, 109

89 Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares

en la Fabricacion
de Productos Farmaceuticos
(nuevo), 177
209 Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas de Bajo Peso Molecular (nuevo), 250
Pruebas y Valoraciones Qumicas
231 Metales Pesados (eliminado), 260
251 Plomo, 270
Introduccion, Reactivos Especiales
Pruebas y Determinaciones Fsicas
659 Requisitos de Envasado y Almacenamiento, 472
Introduccion (eliminada), Envases, Definiciones
Generales, Envasado de Inyectables (agregada)
y Condiciones de Almacenamiento
660 EnvasesVidrio, 481
Descripcion, Pruebas Especficas y Funcionalidad
697 Contenido en Envases para Inyectables
(nuevo), 510
852 Espectroscopa de Absorcion
Atomica
(nuevo), 698
853 Espectroscopa de Fluorescencia
(nuevo), 702
854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio
(nuevo), 709
857 Espectroscopa Ultravioleta-Visible
(nuevo), 713
911 ViscosidadMetodos Capilares, 731
912 ViscosidadMetodos Rotatorios, 733
913 ViscosidadMetodo de Bola Rodante, 738
Informacion General
1152 Medicamentos Veterinarios Usados en Alimentos para Animales (nuevo), 1424
1787 Medicion
de Partculas Subvisibles en Inyectables de Protenas Terapeuticas (nuevo), 1840

Atomica
Teora y Practica (nuevo), 1870

1853 Espectroscopa de FluorescenciaTeora y
Practica (nuevo), 1880
1854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio
Teora y Practica (nuevo), 1890
1857 Espectroscopa Ultravioleta-VisibleTeora
y Practica (nuevo), 1900
Reactivos, Indicadores y
Soluciones
Reactivos
Especificaciones de Reactivos
Acetato Cobaltoso, 1984
Acido
Edetico (nuevo), 1988
Alcohol Amlico, 1993
Benzoato de Testosterona, 1999
Bromuro de Miristiltrimetilamonio (nuevo), 2002
Bromuro de Tetradecilamonio (nuevo), 2002
Clorhidrato de Metilamina (nuevo), 2006
Cloruro de Magnesio, 2009
Colestanol (nuevo), 2010
Digerido Pancreatico de Casena, 2013
Digerido Papanico de Harina de Soja, 2013
Digerido Peptico de Tejido Animal, 2013
24,25-Dihidrolanosterol (nuevo), 2014
Extracto de Carne, 2019
Extracto de Levadura, 2019
Hidrocodona Diol (nuevo), 2024
-Nicotinamida Adenina Dinucleotido,
2030
Nitrato de Magnesio, 2031
Solucion
de Terc-Butilhidroperoxido
(nuevo), 2045
Sulfato de Brucina, 2046
Soluciones Reactivo
Solucion
Estandar de Plomo SR, 2067
Solucion
Madre de Nitrato de Plomo SR
(nuevo), 2067
Soluciones Volumetricas
Acido
Perclorico,
Decimo Normal (0,1 N) en Dioxano, 2070

Metoxido
de Litio, Cincuentavo Normal (0,02 N)

en Metanol, 2073
Columnas Cromatograficas
L24, 2078
L81 (nueva), 2080
L83 (nueva), 2080
L84 (nueva), 2080
USP 38
Especificaciones del Envase para Capsulas y

Tabletas
Quetiapina, Tabletas (nueva), 2090
Vigabatrina, Tabletas (nueva), 2092
Descripcion
y Solubilidad Relativa de Artculos de
la USP y del NF
Acetato de Hidrocortisona, 2095
Besilato de Cisatracurio (nueva), 2103
Desonida (nueva), 2119
Dutasterida (nueva), 2121
Fumarato de Quetiapina (nueva), 2127
Lanolina Hidrogenada (nueva), 2133
Pamoato de Imipramina (nueva), 2141
Tigeciclina (nueva), 2152
Monografas (USP 38)

Acetaminofeno, 2187
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada), Lmite de 4-Aminofenol Libre e Impurezas
Organicas
Clorhidrato de Alfentanilo, 2277
QUIMICA
INFORMACION
IDENTIFICACION
Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Alprazolam, Tabletas de Liberacion
Prolongada, 2295
PRUEBAS DE DESEMPENO
Disolucion
Azatioprina, 2540
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba B
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Lmite de Mercaptopurina (eliminada) e Impurezas Organicas (agregada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Acidez o Alcalinidad (eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES
Estandares de Referencia USP
Azitromicina, 2546
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada); Impurezas Organicas, Procedimiento 1; Impurezas Organicas, Procedimiento 2
Azitromicina para Suspension
Oral, 2554
PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinacion de Agua, Metodo I
(eliminada)
Azitromicina, Tabletas, 2555
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Betaxolol, Solucion
Oftalmica, 2644
IDENTIFICACION
Prueba A y Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas (agregada)
Biotina, 2650
DEFINICION
VALORACION
Procedimiento
Brinzolamida, 2675
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada) y Lmite de Compuesto Relacionado A de
Brinzolamida
Brinzolamida, Suspension
Oftalmica, 2676
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Lmite de Compuesto Relacionado A de
Brinzolamida
Clorhidrato de Ciclobenzaprina, Tabletas, 2968
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Envasado y Almacenamiento y Estandares de
Referencia USP
Carbonato de Cinc, 2996
QUIMICA
INFORMACION
IMPUREZAS
Plomo
Cloruro de Cinc, 2997
IMPUREZAS
Plomo
Sulfato de Cinc, 3004
IMPUREZAS
Plomo y Sustancias Alcalinas y Alcalino
Terreas
Sulfato de Cinc, Tabletas, 3007
IDENTIFICACION
Sulfato, Prueba A
VALORACION
Procedimiento
Besilato de Cisatracurio (nueva), 3025
Besilato de Cisatracurio, Inyeccion
(nueva), 3027
Bromhidrato de Citalopram, 3037
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada); Impurezas Organicas, Procedimiento 1; Impurezas Organicas, Procedimiento 2
Claritromicina, Tabletas, 3053
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Cloprostenol Sodico,
3111
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Preliminares
Tablas de Referencia
Lista Detallada xliii
Preliminares
xliv Lista Detallada

Acetato de Clorhexidina, 3142
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Clorhidrato de Clorhexidina, 3144
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Gluconato de Clorhexidina, Solucion,
3146
IMPUREZAS
Impurezas Organicas, Procedimiento 1
Cosintropina (nueva), 3218
Clorhidrato de Desipramina, 3264
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba B e IdentificacionPruebas Generales,
Cloruros, Prueba C
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada), Lmite de Iminodibencilo (eliminada) e Impurezas Organicas (agregada)
Referencia USP
Clorhidrato de Desipramina, Tabletas, 3265
IDENTIFICACION
Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
Disolucion y Uniformidad de Unidades de
Dosificacion
IMPUREZAS
Referencia USP
Desonida (nueva), 3274
Maleato de Dexclorfeniramina, Tabletas, 3298
Disolucion
Dietiltoluamida, 3364
IDENTIFICACION
VALORACION
Procedimiento
Dietiltoluamida, Solucion
Topica,
3365
IDENTIFICACION
Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
Difilina y Guaifenesina, Solucion
Oral, 3379
IDENTIFICACION
Prueba A y Prueba B
VALORACION
Procedimiento
OTROS COMPONENTES
Determinacion de Alcohol, Metodo IIb
USP 38
Duloxetina, Capsulas de Liberacion
Retardada, 3514
IDENTIFICACION
Absorcion en el Infrarrojo, Prueba A
Disolucion
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Etiquetado (agregada)
Dutasterida (nueva), 3518
Tartrato de Ergotamina y Cafena, Tabletas, 3610
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba A y Prueba B (eliminada)
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Lmite de Ergotaminina y Otras Impurezas
Relacionadas de Ergotamina (agregada) y Lmite de Teofilina y Otras Impurezas Relacionadas de Cafena (agregada)
Referencia USP
Famciclovir, 3729
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada); Impurezas Organicas, Procedimiento 1; Impurezas Organicas, Procedimiento 2 (agregada);
Compuesto Relacionado E de Famciclovir y
Compuesto Relacionado F de Famciclovir
(agregada)
Etiquetado (agregada) y Estandares de Referencia USP
Fenitona, Suspension
Oral, 3771
IDENTIFICACION
Prueba A y Prueba B
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Referencia USP
Acetonido
de Fluocinolona, 3906
IDENTIFICACION
Prueba B
VALORACION
Procedimiento e Impurezas Organicas
(agregada)
Flurbiprofeno, Tabletas, 3938
IMPUREZAS
Fondaparina Sodica
(nueva), 3971
Fondaparina Sodica,
Inyeccion
(nueva), 3974
Clorhidrato de Hidroxizina, Inyeccion,
4182
IDENTIFICACION
Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Lmite de 4-Clorobenzofenona
Referencia USP
USP 38
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo I (eliminada) e Impurezas Organicas
Metocarbamol, Tabletas, 4759
IDENTIFICACION
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Referencia USP
Tartrato de Metoprolol, 4774
DEFINICION
IDENTIFICACION
Absorcion en el Infrarrojo, Prueba A y Prueba
B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Misoprostol, Dispersion
(nueva), 4830
Clorhidrato de Nicardipino, Inyeccion
(nueva), 4967
Noretindrona, Tabletas, 5013
Disolucion
Olanzapina, Tabletas, 5039
IDENTIFICACION
Absorcion en el Infrarrojo
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Olanzapina y Fluoxetina, Capsulas, 5043
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Oleovitaminas A y D, 5045
VALORACION
Valoracion de Vitamina A, Prueba A y Valoracion de Vitamina D, Prueba B
Oxaprozina, Tabletas, 5111
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Pimozida, 5279
IDENTIFICACION
Prueba B
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada) e
Impurezas Organicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
Perdida por Secado
Tartrato de Pirantel (nueva), 5312
Prednisona, 5408
QUIMICA
INFORMACION
DEFINICION
PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinacion de Agua, Metodo I
Envasado y Almacenamiento y Etiquetado
(eliminada)
Preliminares
Clorhidrato de Idarubicina, Inyeccion
(nueva), 4214
Insulina Glargina (nueva), 4266
Insulina Glargina, Inyeccion
(nueva), 4268
Bromuro de Ipratropio, 4315
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
pH
Latanoprost, 4428
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Levalbuterol, Solucion
para Inhalacion,
4443
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Levodopa, 4465
IDENTIFICACION
Prueba B
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Lindano, Crema, 4494
VALORACION
Procedimiento
Carbonato de Litio, 4508
IDENTIFICACION
Prueba A
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Calcio, Metales Pesados (eliminada) y Sustancias Insolubles (eliminada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Alcalinidad (eliminada)
Clorhidrato de Loperamida, Solucion
Oral, 4520
IDENTIFICACION
Absorcion en el Infrarrojo, Prueba A
VALORACION
Procedimiento
Oxido
de Magnesio, 4579
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Alcali Libre y Sales Solubles, Lmite de Calcio
y Metales Pesados (eliminada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Perdida por Incineracion
Clorhidrato de Metilfenidato, Tabletas de Liberacion
Prolongada, 4737
Disolucion
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Metimazol, Tabletas, 4751
IDENTIFICACION
Prueba B (eliminada)
VALORACION
Procedimiento
Metocarbamol, 4757
IDENTIFICACION
Prueba B
VALORACION
Procedimiento
Lista Detallada xlv
Preliminares
xlvi Lista Detallada

Prilocana, 5412
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba B (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Lmite de Compuesto Relacionado A de Prilocana e Impurezas Organicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
Intervalo o Temperatura de Fusion, Clase Ia
(eliminada)
Clorhidrato de Prilocana, 5414
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba C (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Maleato de Proclorperazina, 5439
QUIMICA
INFORMACION
DEFINICION
IMPUREZAS
Impurezas Comunes (eliminada) e Impurezas
Organicas (agregada)
Referencia USP
Maleato de Proclorperazina, Tabletas, 5440
DEFINICION
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Referencia USP
Sulfato de Protamina, 5497
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba A (agregada), IdentificacionPruebas
Generales, Sulfatos, Prueba B (agregada), y
Bioidentidad, Prueba C (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Disolventes Residuales (agregada), Pureza
Cromatografica (agregada), Impurezas ElementalesLmites e Impurezas Elementales
Procedimientos (agregada), Hierro (agregada) y Metilmercurio (agregada)
OTROS COMPONENTES
Determinacion de Nitrogeno, Metodo II
(eliminada)
PRUEBAS ESPECIFICAS
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (agregada), pH (agregada) y Absorbancia en el
Ultravioleta
Referencia USP
Sulfato de Protamina,
Inyeccion,
5499
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba A (agregada) y Prueba B
VALORACION
Procedimiento
PRUEBAS ESPECIFICAS
pH (agregada) y Partculas en Inyectables
(agregada)
USP 38
Referencia USP
Sulfato de Protamina para Inyeccion
(eliminada),
5500
Fumarato de Quetiapina (nueva), 5514
Quetiapina, Tabletas (nueva), 5516
Repaglinida, Tabletas, 5566
IDENTIFICACION
Prueba B y Prueba C (agregada)
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Clorhidrato de Ropinirol, 5643
DEFINICION
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada)
Acido
Saliclico, 5664
DEFINICION
IDENTIFICACION
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados (eliminada) e Impurezas
Organicas
PRUEBAS ESPECIFICAS
Intervalo o Temperatura de Fusion
(eliminada)
Bicarbonato de Sodio, 5723
IMPUREZAS
Cloruros y Sulfatos, Cloruros; Cobre; Metales
Pesados, Metodo I (eliminada); Lmite de
Amonaco
Sulbactam Sodico,
5773
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Tacrolimus, Capsulas, 5834
IMPUREZAS
Impurezas Organicas, Procedimiento 1 e Impurezas Organicas, Procedimiento 2
Clorhidrato de Tamsulosina, 5851
DEFINICION
IDENTIFICACION
Prueba C (agregada)
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada) y Pureza Enantiomerica
PRUEBAS ESPECIFICAS
Rotacion Optica,
Rotacion Especfica
(eliminada)
Tigeciclina (nueva), 5970
Tigeciclina para Inyeccion
(nueva), 5972
Tiopental Sodico
para Inyeccion,
5996
IDENTIFICACION
Absorcion en el Infrarrojo, Prueba A (agregada), IdentificacionPruebas Generales, Sodio, Prueba B (agregada), y Prueba C
(eliminada)
VALORACION
Procedimiento
USP 38
Vigabatrina, Tabletas (nueva), 6208

Vinorelbina, Inyeccion,
6217
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Clorhidrato de Ziprasidona, 6275
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo II (eliminada) y Lmite de Impurezas de Elucion Temprana
Tartrato de Zolpidem, Tabletas de Liberacion
Prolongada, 6281
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
Monografas (Suplementos
Dieteticos)
Hojas de Banaba (nueva), 6331
Hojas de Banaba en Polvo (nueva), 6333
Extracto Seco de Hojas de Banaba (nueva), 6335
Romero (nueva), 6633
Romero en Polvo (nueva), 6635
Extracto Acuoso Seco de Hojas de Romero
(nueva), 6636
Preliminares
Clorhidrato de Tramadol, Tabletas de Liberacion
Prolongada, 6058
Disolucion
Travoprost, Solucion
Oftalmica, 6072
VALORACION
Procedimiento
IMPUREZAS
Lmite de Compuesto Relacionado A de Travoprost y Lmite de Productos de Degradacion
Valsartan e Hidroclorotiazida, Tabletas, 6168
Disolucion
Clorhidrato de Venlafaxina, 6184
IMPUREZAS
Metales Pesados, Metodo I o Metodo II (eliminada) e Impurezas Organicas
Venlafaxina, Tabletas, 6192
DEFINICION
VALORACION
Procedimiento
Disolucion
IMPUREZAS
Impurezas Organicas
Vigabatrina para Solucion
Oral (nueva), 6207
Lista Detallada xlvii
USP 38
Advertencias Generales 1
Advertencias y Requisitos
Generales
1. Ttulo y Revision
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
6.70. Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
6.80. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2. Estado Oficial y Reconocimiento

Legal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
7. Resultados de Pruebas . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.10. Texto Oficial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.20. Artculos Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.30. Reconocimiento Legal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
3. Cumplimiento de las Normas . . . . . . . . . . . 4

3.10. Aplicabilidad de las Normas . . . . . . . . . . . . . . . . 4
3.20. Indicacion
de Cumplimiento . . . . . . . . . . . . . . . . 4
4. Monografas y Captulos Generales . . . . . 5

4.10. Monografas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
4.20. Captulos Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
5. Componentes de las Monografas . . . . . . 5

5.10.
5.20.
5.30.
5.40.
5.50.
5.60.
5.70.
5.80.
Formulas
Moleculares . . . . . . . .
Sustancias Agregadas . . . . . . . .
Descripcion
y Solubilidad . . . . .
Identidad . . . . . . . . . . . . . . . .
Valoracion
................
Impurezas y Sustancias Extra
nas
Pruebas de Desempe
no . . . . . .
Estandares de Referencia USP . .
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.5
.5
.6
.6
.6
.6
.7
.7
6. Practicas
y Procedimientos de
Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
6.10. Practicas Seguras de Laboratorio . . . . . . . .
6.20. Procedimientos Automatizados . . . . . . . . .
6.30. Metodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes . . . . . . . . .
6.50. Preparacion
de Soluciones . . . . . . . . . . . .
6.60. Unidades Necesarias para Completar una
Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . .7
. . . . .7
. . . . .7
. . . . .7
. . . . .8
. . . . .8
7.10. Interpretacion
de los Requisitos . . . . . . . . . . . . . . 9
7.20. Reglas para Redondeo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
8. Terminos
y Definiciones . . . . . . . . . . . . . . . . 9
8.10. Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.20. Aproximadamente . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.30. Contenido de Alcohol . . . . . . . . . . . . . . .
8.40. Pesos Atomicos
...................
8.50. Determinaciones con Blancos . . . . . . . . .
8.60. Concomitantemente . . . . . . . . . . . . . . . .
8.70. Desecador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.80. Logaritmos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.90. Cepas Microbianas . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.100. Inapreciable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.110. No menos de (NLT) y No mas de (NMT) .
8.120. Olor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.130. Por ciento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.140. Concentraciones Porcentuales . . . . . . . . .
8.150. Presion
.........................
8.160. Tiempo de Reaccion
................
8.170. Peso Especfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.180. Temperaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.190. Tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.200. Transferir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.210. Vaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.220. Desecador al Vaco . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.230. Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.240. Pesos y Medidas . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
11
9. Prescripcion
y Dispensacion
. . . . . . . . . . . 12
9.10. Uso de Unidades Metricas . . . . . . . . . . . . . . . . 12
9.20. Cambios en Volumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Advertencias
Aplicables a las Normas, Pruebas,

Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopea de los Estados Unidos
2 Advertencias Generales
Advertencias
10. Conservacion,
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
USP 38
10.10. Envasado y Almacenamiento . . . . . . . . . . . . . . 12
10.40. Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
USP 38
ADVERTENCIAS Y
REQUISITOS GENERALES
vertencias Generales. Las revisiones al texto oficial se presentan en los Suplementos, Interim Revision Announcements y Revision Bulletins. Los captulos generales con numeracion
del
1000 al 1999 se consideran explicativos y estan destinados a
definir, describir o informar sobre un tema en particular. No
contienen requisitos obligatorios aplicables a ningun
artculo
oficial a menos que sean referidos por las Advertencias Generales, una monografa o un captulo general con numeracion
inferior a 1000. Los captulos generales con numeracion

superior a 2000 aplican unicamente
a artculos destinados
para su uso como ingredientes dieteticos y suplementos
dieteticos.
2.20. Artculos Oficiales
Un artculo oficial es un artculo reconocido en la USP o el
NF. Se considera que un artculo esta reconocido e incluido
en un compendio cuando se publica su monografa en el
compendio y se le asigna una fecha oficial a la misma en
forma especfica o general.
El ttulo especificado en una monografa es el ttulo oficial
para ese artculo. Los nombres que se consideren sinonimos
de ttulos oficiales no pueden ser utilizados para sustituir a

los nombres oficiales.
Los artculos oficiales incluyen tanto sustancias oficiales
como productos oficiales. Una sustancia oficial es un farmaco,
excipiente, ingrediente dietetico u otro ingrediente, o un
componente de un dispositivo terminado para el cual el ttulo de la monografa no incluye indicacion
alguna sobre la
naturaleza de la forma terminada.
Un producto oficial es un producto farmaceutico, suplemento dietetico, preparacion
magistral, o dispositivo terminado para el cual se provee una monografa.
2.30. Reconocimiento Legal
Los compendios USP y NF estan reconocidos por las legislaciones y reglamentaciones de muchos pases del mundo.
Las autoridades reguladoras pueden hacer cumplir las normas presentadas en la USP y el NF; no obstante, debido a
que el reconocimiento de los compendios USP y NF puede
variar de pas a pas, se recomienda que los usuarios conozcan las legislaciones y reglamentaciones aplicables. En los
Estados Unidos, de acuerdo con la Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y
Cosmeticos o FDCA), tanto la USP como el NF estan reconocidos como compendios oficiales. Un medicamento con un
nombre reconocido en USPNF debe cumplir con las normas
farmacopeicas de identidad o se le considerara adulterado,
rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej.,
la FDCA 501(b) y 502(e)(3)(b); ver tambien las reglamentaciones de la FDA, el Ttulo 21 del CFR 299.5(a&b). Para
evitar que se les considere adulterados, los medicamentos
deben cumplir ademas con las normas farmacopeicas de
contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el
etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento
difiere. Ver, p.ej., FDCA 501(b) y Ttulo 21 del CFR
299.5(c). Asimismo, para evitar que se les considere rotulados incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los
compendios USPNF deben tambien envasarse y etiquetarse
de conformidad con las normas farmacopeicas. Ver la FDCA
502(g).
Un suplemento dietetico que declara cumplir con las especificaciones de USP se considerara como un alimento incorrectamente rotulado (misbranded food) si incumpliera
con las mismas. Ver la FDCA 403(s)(2)(D).
Advertencias
La seccion
de Advertencias y Requisitos Generales (en lo
sucesivo, Advertencias Generales) presenta las suposiciones
basicas, definiciones y condiciones que se usan por defecto
para la interpretacion
y aplicacion
de la Farmacopea de los
Estados Unidos de America (USP, por sus siglas en ingles) y
del Formulario Nacional (NF, por sus siglas en ingles).
Los requisitos establecidos en estas Advertencias Generales
se aplican a todos los artculos reconocidos en la USP y en el
NF (en lo sucesivo, los compendios) y a todos los captulos generales, a menos que se especifique algo diferente.
Cuando los requisitos de una monografa individual sean diferentes a los de las Advertencias Generales o de un captulo
general, los requisitos de la monografa se aplicaran y reemplazaran a los requisitos de las Advertencias Generales o del
captulo general, aunque la monografa no haga mencion
expresa de las diferencias.
1. TITULO Y REVISION
El ttulo completo de esta publicacion
(que consiste en
cuatro volumenes
e incluye sus Suplementos) es: Farmacopea

de los Estados Unidos de America, Trigesima Octava Revision
y Formulario Nacional, Trigesima Tercera Edicion.

Estos ttulos
pueden abreviarse a USP 38, a NF 33, y a USP 38NF 33. La
Farmacopea de los Estados Unidos, Trigesima Octava Revision,
y el Formulario Nacional, Trigesima Tercera Edicion,

reemplazan a todas las revisiones anteriores. Cuando se emplean las
siglas USP, NF o USPNF sin ningun
otro calificativo,
las mismas se refieren unicamente
a USP 38, NF 33, y a sus

Suplementos, durante el tiempo que estos compendios esten
vigentes. Los mismos ttulos, sin ninguna distincion,
se aplican tanto a la presentacion
impresa como a la electronica
de este contenido. Aunque la USP y el NF se publican en

forma conjunta y comparten estas Advertencias Generales,
cada uno de ellos constituye por s mismo un compendio
separado.
Esta revision
es oficial a partir del 1 de mayo de 2015, a
menos que se indique algo diferente mediante un texto
especfico.
Los Suplementos de la USP y el NF se publican
periodicamente.
Los Interim Revision Announcements (Anuncios de Revision
Intermedia) son revisiones de la USP y del NF que se publican en el sitio Web de la USP. Los Interim Revision Announcements contienen revisiones oficiales y sus fechas de entrada
en vigencia. Asimismo, el sitio Web de la USP, en el apartado New Official Text (Nuevo Texto Oficial) incluye
anuncios de disponibilidad de nuevos Estandares de Referencia USP y anuncios de pruebas o procedimientos que se
mantienen en suspenso por falta de los Estandares de Referencia USP requeridos.
Los Revision Bulletins (Boletines de Revision)
son revisiones
del texto oficial o aplazamientos que requieren de publicacion
expedita. Se publican en el sitio Web de la USP y, por
lo general, se oficializan inmediatamente, a menos que se
indique algo distinto en el Boletn de Revision.
La Errata (Fe de Erratas) comprende las correcciones a artculos publicados erroneamente
que no han sido aprobados

por el Consejo de Expertos y que no reflejan los requisitos
oficiales.
2. ESTADO OFICIAL Y RECONOCIMIENTO LEGAL
2.10. Texto Oficial
El Texto Oficial es el texto contenido en la USP y el NF,
incluidas las monografas, los captulos generales y estas Ad-
Advertencias
La ejecucion
de las normas USP es responsabilidad de la
FDA y demas autoridades gubernamentales en los EE.UU. y
demas pases. La USP no desempe
na ningun
papel en la
ejecucion
de las normas.
3. CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS
3.10. Aplicabilidad de las Normas
Las normas para un artculo reconocido en los compendios (USPNF) se expresan en la monografa del artculo, en
los captulos generales aplicables y en las Advertencias Generales. La identidad, contenido, calidad y pureza de un artculo se determinan mediante pruebas, procedimientos y criterios de aceptacion
oficiales, incluidos ya sea en su
monografa, en las Advertencias Generales o en los captulos
generales aplicables, a menos que se exceptue
en alguna
otra parte de los compendios. Esta permitida la adopcion
temprana de las normas revisadas. Cuando las normas revisadas para un artculo existente hayan sido publicadas como
texto oficial aprobado (conforme a lo aprobado en la seccion
2.10) pero aun
no sean oficiales (seis meses despues de
su publicacion,
a menos que se especifique algo distinto; ver
fecha oficial, seccion
2.20), el cumplimiento con la norma
revisada no excluira una determinacion
o indicacion
de
cumplimiento con las normas farmacopeicas, a menos que
la USP especifique algo distinto prohibiendo la adopcion
temprana en una norma en particular.

Las normas en la monografa, captulo(s) general(es) y Advertencias Generales pertinentes son aplicables en todo momento de la vida del artculo, desde su produccion
hasta su
caducidad. Las especificaciones del fabricante y las buenas
practicas de fabricacion
(incluyendo, p.ej., iniciativas de Calidad por Dise
no), por lo general, se desarrollan y siguen para
asegurar que el artculo cumplira con las normas farmacopeicas hasta su fecha de caducidad, siempre que se almacene de acuerdo con las instrucciones dadas al respecto. Por
consiguiente, se espera que todo artculo oficial cumpla con
las normas farmacopeicas en caso de analizarse, y todo artculo oficial analizado segun
se indica en la monografa pertinente debe cumplir con tales normas para demostrar el
cumplimiento.
En ocasiones, las normas farmacopeicas toman el caracter
de procedimientos estadsticos cuando implican unidades
multiples
y, posiblemente, un dise
no de procedimiento secuencial que permite al usuario determinar que el artculo
analizado cumple o no con la norma. La similitud con procedimientos estadsticos podra sugerir un intento de inferencia para algun
grupo de unidades mas grande, pero en
todos los casos, las declaraciones sobre si se ha cumplido
con la norma farmacopeica solo
aplica a las unidades analizadas. Los compendios no indican ni prohben las repeticiones, las mediciones multiples,
el rechazo estadstico de valores aberrantes o las extrapolaciones de los resultados a

poblaciones mas grandes, ni tampoco la necesidad y frecuencia adecuada del analisis de las partidas. La frecuencia
del analisis y el muestreo se deja libre a las preferencias o
instrucciones de aquellos que llevan a cabo los analisis para
determinar el cumplimiento con las normas y a los demas
usuarios de USPNF, incluidos fabricantes, compradores o
autoridades regluladoras.
Los productos oficiales se preparan de acuerdo con los
principios reconocidos de buenas practicas de fabricacion
y
a partir de ingredientes que cumplan con las normas de USP
o NF, siempre que existan normas para dichos ingredientes
(para suplementos dieteticos, ver la seccion
3.10.20).
Las sustancias oficiales se elaboran segun
principios reconocidos de buenas practicas de fabricacion
con ingredientes
que cumplen con las especificaciones establecidas para asegurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisitos de las monografas oficiales.
3.10.10. Aplicabilidad de las Normas a Productos
Farmaceuticos, Farmacos y Excipientes
Las normas correspondientes de los compendios USP o NF
se aplican a cualquier artculo comercializado en los Estados
Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se
destine o etiquete para su uso como medicamento o como
USP 38
ingrediente de un medicamento. Dichos artculos (productos
farmaceuticos, farmacos y excipientes) incluyen medicamentos para humanos (ya sea dispensados con receta, de venta
libre o de otro tipo), as como medicamentos para animales. Las normas correspondientes se aplican a dichos artculos, independientemente de que se agregue o no la denominacion
USP o NF. Las normas se aplican por igual a
los artculos con ttulos oficiales o nombres derivados por
transposiciones de las palabras que componen los ttulos oficiales, o por transposicion
en el orden de los nombres de
dos o mas ingredientes activos en los ttulos oficiales, o
cuando se usen sinonimos
con la intencion
o efecto de sugerir un grado significativo de identidad con el ttulo o
nombre oficial.
3.10.20. Aplicabilidad de las Normas a Dispositivos
Medicos, Suplementos Dieteticos y a sus Componentes e
Ingredientes
Un artculo reconocido en la USP o el NF debe cumplir
con las normas farmacopeicas si el artculo es un dispositivo
medico, componente destinado para un dispositivo medico,
suplemento dietetico, ingrediente dietetico, u otro ingrediente destinado para su incorporacion
en un suplemento
dietetico, y si declara en su etiquetado el cumplimiento con
los compendios USP o NF.
En general, los suplementos dieteticos se elaboran con ingredientes que cumplen con las normas de los compendios
USP, NF, o Food Chemicals Codex. Cuando no existen tales
normas, las sustancias pueden usarse en suplementos dieteticos siempre que hayan mostrado ser de grado alimenticio
de calidad aceptable utilizando otros procedimientos
adecuados.
3.20. Indicacion
de Cumplimiento
Un producto farmaceutico, farmaco o excipiente puede
usar la denominacion
USP o NF junto a su ttulo oficial
o en otra parte de la etiqueta unicamente
cuando: (1) existe

una monografa en el compendio especificado y (2) el artculo cumple con la identidad estipulada en el compendio
correspondiente.
Cuando se determina que un producto farmaceutico, farmaco o excipiente difiere de las normas USP o NF pertinentes de contenido, calidad, o pureza al aplicar las pruebas,
procedimientos y criterios de aceptacion
establecidos en el
compendio correspondiente, estas diferencias deben indicarse de forma clara en la etiqueta.
Cuando un producto farmaceutico, farmaco o excipiente
no cumple con la identidad estipulada en los compendios
USP o NF o se le ha agregado una sustancia que interfiere
con las pruebas y procedimientos establecidos, se le debe
asignar un nombre diferente y totalmente distinto de cualquier otro nombre reconocido en los compendios USP o NF.
Un dispositivo medico, suplemento dietetico o ingrediente
o componente de un dispositivo medico o suplemento dietetico puede usar la denominacion
USP o NF junto a su
ttulo oficial o en otra parte de la etiqueta, unicamente
cuando: (1) existe una monografa en el compendio especificado y (2) el artculo cumple con las normas de la monografa y demas normas aplicables en el compendio
correspondiente.
La denominacion
USP o NF en la etiqueta de un artculo no debe ni puede interpretarse como un aval por parte
de la USP ni tampoco debe interpretarse como una confirmacion
por parte de la USP de que tal artculo cumple con
las normas pertinentes de la USP. La USP puede iniciar una
accion
legal si se declara o presenta un artculo como un
artculo oficial en uno de los compendios de la USP y e sta
determina que tal aseveracion
no fue hecha de buena fe.
La denominacion
USPNF puede usarse en la etiqueta
de un artculo, siempre que dicha etiqueta tambien lleve
una frase tal como Cumple con las normas NF publicadas
por la USP, indicando el compendio particular que corresponde aplicar.
Cuando se usan las siglas USP, NF, o USPNF en la
etiqueta de un artculo para indicar que el artculo cumple
con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer
USP 38
una sustancia presente en un suplemento dietetico sea mayor que el criterio de aceptacion
inferior permitido por la
monografa, el criterio de aceptacion
superior de la monografa puede incrementarse en una cantidad
correspondiente.
Los criterios de aceptacion
especificados en las monografas individuales y en los captulos generales para preparaciones magistrales se basan en los atributos de calidad que se
espera podran caracterizar un artculo preparado magistralmente a partir de farmacos e ingredientes a granel de
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los principios reconocidos de buenas practicas de preparacion
magistral descritos en estos compendios.
4.20. Captulos Generales
A cada captulo general se le asigna un numero
que aparece entre parentesis angulares junto al ttulo (p.ej.: Cromatografa 621). Los captulos generales pueden contener lo
siguiente:
Descripciones de pruebas y procedimientos para su aplicacion
en monografas individuales,
Descripciones y especificaciones de condiciones y practicas de preparacion
magistral,
Informacion
general para la interpretacion
de requisitos
farmacopeicos,
Descripciones de practicas generales de almacenamiento farmaceutico, dispensacion
y envasado, o
Guas generales para fabricantes de sustancias oficiales o
productos oficiales.
Cuando una monografa hace referencia a un captulo general, los criterios de aceptacion
pueden presentarse despues de dos puntos.
Algunos captulos pueden servir como descripciones generales introductorias de una prueba o tecnicas analticas. Ademas, pueden hacer referencia a otros captulos generales
que contengan tecnicas, detalles de los procedimientos y,
en ocasiones, criterios de aceptacion.
5. COMPONENTES DE LAS MONOGRAFIAS

5.10. Formulas
Moleculares
Las formulas
moleculares de los ingredientes activos que

se usan en la definicion
del contenido requerido de un artculo farmacopeico tienen por objeto designar las entidades
qumicas, tal como aparecen en el nombre qumico completo del artculo, con una pureza absoluta (100 por ciento).
5.20. Sustancias Agregadas
Las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para
su inclusion
en un artculo oficial y por lo tanto quedan
prohibidas siempre que: (1) excedan la cantidad mnima requerida para lograr el efecto deseado; (2) su presencia
afecte la biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad del artculo oficial; o (3) interfieran con las pruebas o
valoraciones prescritas para determinar el cumplimiento de
las normas farmacopeicas.
El aire contenido en el envase de un artculo oficial puede
extraerse o reemplazarse por dioxido
de carbono, helio, argon

o nitrogeno,
o una mezcla de estos gases, siempre que

sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el
uso de alguno de dichos gases.
5.20.10. Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes
en Sustancias Oficiales
Las sustancias oficiales pueden contener unicamente
las
sustancias agregadas especficas permitidas por la monografa individual. Si se permite tal adicion,
la etiqueta debe indicar los nombres y las cantidades de las sustancias
agregadas.
5.20.20. Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes
en Productos Oficiales
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, pueden agregarse sustancias y excipientes
adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases farmaceuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes,
conservantes, estabilizantes y vehculos a un producto oficial
para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para facilitar su preparacion.
Advertencias
junto al ttulo oficial del artculo. Las siglas no deberan aparecer dentro de smbolos, como por ejemplo crculos, cuadrados etc., y deberan estar en letras mayusculas.
Si un suplemento dietetico no cumple con todos los requisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene uno o mas
ingredientes dieteticos u otros ingredientes reconocidos en
los compendios USP o NF, se puede indicar que tales ingredientes individuales cumplen con las normas USP o NF o
que son de calidad USP o NF siempre y cuando la denominacion
se limite a los ingredientes individuales y no se insinue
que el suplemento dietetico cumple con las normas en
USP.
4. MONOGRAFIAS Y CAPITULOS GENERALES
4.10. Monografas
Las monografas establecen el nombre, definicion,
especificaciones y demas requisitos relacionados con el envasado,
almacenamiento y etiquetado del artculo. Las especificaciones consisten en pruebas, procedimientos y criterios de
aceptacion
que ayudan a asegurar la identidad, contenido,
calidad y pureza del artculo. Para los requisitos generales
relacionados con secciones especficas de la monografa, ver
la seccion
5, Componentes de las Monografas.
Debido a que, en ocasiones, las monografas no proporcionan normas para todas las caractersticas relevantes, algunas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USP o
NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades no normalizadas que son relevantes para su uso en preparaciones especficas. Para asegurar la intercambiabilidad en esos casos,
se recomienda a los usuarios comprobar la equivalencia funcional o determinar tales caractersticas antes de su uso.
4.10.10. Aplicabilidad de los Procedimientos de Prueba
Una sola monografa puede incluir distintas pruebas, procedimientos y/o criterios de aceptacion
que reflejen atributos de diversos artculos del fabricante. Tales alternativas
pueden presentarse para distintos casos de formas polimorfi
cas, impurezas, hidratos y disoluciones. Las monografas indican las pruebas, procedimientos y/o criterios de aceptacion
que se deben usar, as como el etiquetado requerido.
Una prueba en una monografa puede contener y requerir
procedimientos multiples.
Sin embargo, se pueden incluir

multiples
procedimientos en monografas particulares especficamente con el objetivo de asegurar la disponibilidad de

un procedimiento adecuado para un producto en particular.
En dichos casos, se incluira en la monografa una declaracion
de etiquetado que indique la aplicacion
adecuada de
los procedimientos. No se requiere una declaracion
en el
etiquetado si se usa la Prueba 1.
4.10.11. Pruebas de Disolucion,
Desintegracion
y
Liberacion
de Farmacos
La monografa puede incluir multiples
pruebas de Disolucion,
Desintegracion
o Liberacion
de Farmacos. El orden en
el que se presentan estas pruebas en la monografa se basa
en el orden en el que fueran aprobadas por el Comite de
Expertos pertinente para su inclusion
en la monografa. La
Prueba 1 no es necesariamente la prueba para el producto
innovador o para el producto de referencia. El cumplimiento
con alguna de las pruebas no garantiza la bioequivalencia ni
la biodisponibilidad.
4.10.20. Criterios de Aceptacion
Los criterios de aceptacion

consideran errores analticos y
variaciones inevitables durante la fabricacion
y preparacion
magistral, as como el deterioro hasta un grado considerado

aceptable en condiciones practicas. La existencia de criterios
de aceptacion
farmacopeicos no constituye razon
para aseverar que una sustancia oficial cuya pureza se aproxima al
100 por ciento excede la calidad farmacopeica. De igual
manera, el hecho de que un artculo se haya preparado
usando criterios mas estrictos que los especificados en la
monografa no constituye una razon
valida para aseverar
que el artculo excede los requisitos farmacopeicos.
Un producto oficial debe formularse con la intencion
de
suministrar el 100 por ciento de la cantidad de cada ingrediente declarado en la etiqueta. Cuando debido a requisitos
legales aplicables, se requiera que la cantidad mnima de
Advertencias
Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas exclusivamente para impartir color a los productos oficiales,
excepto para aquellos destinados a la administracion
parenteral u oftalmica, siempre que cumplan con las reglamentaciones de la FDA para el uso de colorantes y que sean adecuadas en todos los otros aspectos. (Ver tambien Sustancias
Agregadas en Inyectables 1).
En la preparacion
de unguentos y supositorios, se pueden
variar las proporciones de las sustancias que constituyen la
base para mantener la consistencia adecuada en diferentes
condiciones climaticas, siempre que no se vare la concentracion
de los ingredientes activos y que no se afecte la
biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad de la
preparacion.
5.20.20.1. En Preparaciones Magistrales

Las preparaciones magistrales para las que se proporciona
una composicion
completa deben contener unicamente
los
ingredientes indicados en las formulas,
a menos que se exceptue

especficamente en este documento o en la monografa individual. Se pueden presentar desviaciones en los
procesos especificados o en los metodos de preparacion
magistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre
que la preparacion
final cumpla con las normas pertinentes
y se prepare siguiendo el proceso especificado.
Cuando la monografa de una preparacion
magistral exige
una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la
sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de
utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del agua u
otras sustancias volatiles presentes en la cantidad utilizada.
Existen formulaciones de alcohol especialmente desnaturalizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamentaciones federales de la Internal Revenue Service, (IRS, por
sus siglas en ingles, Oficina de Recaudacion
de Impuestos
del Gobierno de los Estados Unidos). Una formulacion
apropiada de alcohol especialmente desnaturalizado puede sustituir al Alcohol en la fabricacion
de preparaciones farmacopeicas destinadas para uso interno o para uso topico,
siempre que el desnaturalizante sea volatil y no quede en el

producto terminado. Un producto terminado destinado a
aplicacion
topica
sobre la piel puede contener alcohol especialmente desnaturalizado, siempre que el desnaturalizante
sea un ingrediente normal en la preparacion
o una sustancia
agregada permitida; en ambos casos, el desnaturalizante se
debe identificar en la etiqueta de la preparacion
topica.
Cuando se indique un proceso en la monografa individual,

toda preparacion
elaborada magistralmente con alcohol desnaturalizado debe ser identica a la que se obtiene mediante
el proceso indicado.
5.20.20.2. En Suplementos Dieteticos
Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos
de suplementos dieteticos siempre que tales ingredientes:
(1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y
(2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescritas para determinar el cumplimiento de las normas
farmacopeicas.
5.30. Descripcion
y Solubilidad
Una prueba cuantitativa de solubilidad se considerara
como una prueba de pureza, unicamente
cuando se describe y designa como tal en una monografa.

Una monografa puede incluir informacion
relacionada
con la descripcion
del artculo. La informacion
de descripcion
y solubilidad correspondiente a un artculo tambien
aparece en la tabla de referencia Descripcion y Solubilidad
Relativa de Artculos de la USP y del NF. La tabla de referencia
indica solo
las propiedades de los artculos que cumplen con
las normas de la monografa. La tabla de referencia esta
destinada principalmente para aquellos que usan, elaboran y
dispensan farmacos y/o artculos relacionados. Aunque la informacion
proporcionada en las monografas y la informacion
en la tabla de referencia puede ayudar indirectamente
a la evaluacion
preliminar de un artculo, dicha informacion
no constituye en s misma una norma o prueba de pureza.
USP 38
La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica
se indica mediante uno de los siguientes terminos
descriptivos:
Termino
Descriptivo
Muy soluble
Facilmente soluble
Soluble
Moderadamente soluble
Poco soluble
Muy poco soluble
Practicamente insoluble o
Insoluble
Partes de Disolvente
Requeridas para
1 Parte de Soluto
Menos de 1
De 1 a 10
De 10 a 30
De 30 a 100
De 100 a 1000
De 1000 a 10 000
Mayor que o igual a
10 000
5.40. Identidad
La prueba farmacopeica bajo el ttulo Identidad o Identificacion se proporciona como una ayuda para verificar la
identidad de los artculos segun
se indica, p.ej., en la etiqueta de sus envases, y para establecer si se trata del artculo nombrado en USPNF. La prueba de Identidad o Identificacion para un artculo en particular puede comprender
uno o mas procedimientos. Cuando se lleva a cabo una
prueba farmacopeica de Identidad o Identificacion, se deben
cumplir todos los requisitos de todos los procedimientos especificados para satisfacer los requisitos de la prueba. El incumplimiento de un artculo con los requisitos de una
prueba de Identidad o Identificacion prescrita (es decir, que
no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos
especificados que componen dicha prueba) indica que el
artculo esta rotulado incorrectamente y/o adulterado.
5.50. Valoracion
Las pruebas de valoracion

para preparaciones magistrales
no han sido concebidas para evaluar una preparacion
magistral antes de su dispensacion,
sino como pruebas oficiales
para casos en los que exista duda o controversia acerca de
la conformidad de la preparacion
con las normas oficiales.
5.50.10. Unidades de Potencia (Biologica)
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas completamente por medios qumicos y fsicos, puede ser necesario expresar la actividad en unidades de potencia biologica,
definidas por un estandar de referencia designado como patron

oficial.
Las unidades de potencia biologica
definidas por la Organizacion

Mundial de la Salud (OMS) mediante Estandares
Biologicos
Internacionales y Preparaciones Biologicas
Internacionales de Referencia se denominan Unidades Internacionales (UI). Las monografas se refieren a las unidades definidas mediante Estandares de Referencia USP como Unidades
USP. Para los productos biologicos,
existan o no Unidades
Internacionales o Unidades USP (ver Productos Biologicos
1041), las unidades de potencia se definen mediante los
correspondientes Estandares de los Estados Unidos (U.S.
Standards) establecidos por la FDA.
5.60. Impurezas y Sustancias Extra
nas
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias extra
nas e impurezas se establecen para limitarlas a cantidades
que no sean objetables en las condiciones normales de empleo del artculo (ver tambien Impurezas en Farmacos y Productos Farmaceuticos 1086).
Ademas de las pruebas prescritas en la monografa individual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de aceptacion
adecuados para detectar y controlar impurezas que pudieran resultar de cambios en los metodos de
procesamiento o que provengan de fuentes externas,
cuando su presencia no concuerde con las buenas practicas
de fabricacion
o las buenas practicas farmaceuticas
aplicables.
USP 38
USP o NF indique el uso de un Estandar de Referencia USP,

solo
se consideraran concluyentes los resultados obtenidos
usando el Estandar de Referencia USP especificado. Cuando
un procedimiento exija el uso de un artculo oficial y no de
un Estandar de Referencia USP como material de referencia,
se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos los requerimientos indicados para dicho artculo en la monografa oficial. Si alguna norma nueva de la USP o del NF requiere el
uso de un Estandar de Referencia USP nuevo que aun
no
este disponible, dicha parte de la norma que contiene el
requisito no sera oficial hasta que el material de referencia
USP especificado este disponible.
Salvo que la etiqueta del estandar de referencia indique
una potencia o contenido especficos, se asume que el estandar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la
aplicacion
oficial. A menos que se indique algo diferente en
el procedimiento de la monografa individual o en un captulo general, los Estandares de Referencia USP deben usarse
de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas.
Cambio en la redaccion:
6. PRACTICAS
Y PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
6.10. Practicas Seguras de Laboratorio
Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben seguir
practicas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas
precautorias, equipo de proteccion
y practicas de trabajo
acordes a las sustancias qumicas y procedimientos usados.
Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los
compendios, el analista debera conocer los peligros asociados con las sustancias qumicas y las tecnicas y medios de
proteccion
contra dichos riesgos. Estos compendios no tienen como objetivo describir tales peligros o medidas de
proteccion.
6.20. Procedimientos Automatizados

Los procedimientos automatizados y manuales que emplean los mismos fundamentos qumicos se consideran equivalentes.
6.30. Metodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados
Se pueden usar metodos y/o procedimientos alternativos
que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud,
sensibilidad, precision,
selectividad o adaptabilidad a la automatizacion
o a la reduccion
de datos computarizados o en
otras circunstancias especiales. Dichos metodos y procedimientos alternativos se deben validar segun
se describe en
el captulo general Validacion de Procedimientos Farmacopeicos 1225 y se debe demostrar que proporcionan resultados
equivalentes o mejores. Solamente aquellos resultados obtenidos por los metodos y procedimientos suministrados en
los compendios seran concluyentes.
Se recomienda remitir a la USP los procedimientos alternativos para su evaluacion
como reemplazos potenciales o
para agregarlos a las normas (ver la seccion
4.10.
Monografas).
En ciertos captulos generales se indica que el texto en
cuestion
esta armonizado con el texto correspondiente de la
Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa y que estos
textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de
un requisito de una sustancia o preparacion
fuera determinado usando un metodo intercambiable de una de estas
farmacopeas, tambien debera cumplir los requisitos de la
USP. Sin embargo, si apareciera una diferencia, o en el caso
de controversia, solo
el resultado obtenido mediante el procedimiento y/o metodo dado en la USP sera concluyente.
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes
A menos que se especifique algo diferente, todos los calculos se efectuan
con respecto a la sustancia tal como se

encuentra.
Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas sobre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resultados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada
Advertencias
5.60.10. Otras Impurezas en los Artculos de la USP y el

NF
Cuando una monografa de los compendios USP o NF incluye una valoracion
o prueba de impurezas organicas cromatografica, diferente de una prueba de disolventes residuales, y el procedimiento de la monografa no detecta una
impureza presente en la sustancia, se deben expresar la cantidad e identidad de la impureza, si fueran ambas conocidas, bajo el encabezado Otra(s) Impureza(s) en el etiquetado
(certificado de analisis) de la sustancia oficial.
La presencia en una sustancia oficial de cualquier impureza no declarada en el etiquetado constituye una desviacion
de la norma si el contenido es de 0,1% o mayor. La
suma de las Otras Impurezas combinada con las impurezas
detectadas por los metodos de la monografa no puede exceder del 2,0% (ver Impurezas Comunes 466), a menos
que en la monografa se indique algo diferente.
Las siguientes categoras de farmacos quedan excluidos de
los requisitos de Otras Impurezas:
productos de fermentacion
y derivados semisinteticos
obtenidos a partir de ellos,
radiofarmacos,
productos biologicos,
productos obtenidos por biotecnologa,

peptidos,
productos botanicos y
productos crudos de origen animal o vegetal.
No debe incluirse ninguna sustancia conocida como to
xica en Otras Impurezas.
5.60.20. Disolventes Residuales en los Artculos de la USP
y el NF
Todos los artculos de los compendios USP y NF estan sujetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso
cuando la prueba no este indicada en la monografa individual. Los disolventes que se empleen durante los procesos
de fabricacion
deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se
debe tomar en consideracion
la toxicidad y el nivel residual
de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los
principios definidos y los requisitos especificados en Disolventes Residuales 467, segun
los metodos generales indicados en dicho captulo u otros metodos adecuados.
5.60.30 Impurezas Elementales en Medicamentos y
Suplementos Dieteticos USP
[NOTAEl captulo general 232 se publico el 1 de junio
de 2012 en el Segundo Suplemento de USP 35NF 30 y se
oficializo el 1 de febrero de 2013. El captulo general
2232 se publico el 1 de febrero de 2013 en el Primer
Suplemento de USP 36NF 31 y se oficializo el 1 de agosto
de 2013. No obstante, su fecha de aplicabilidad a los artculos reconocidos en los compendios USPNF es el 1 de diciembre de 2015, fecha de oficializacion
de esta disposicion
de las Advertencias Generales.]

Las impurezas elementales se controlan en los medicamentos oficiales de acuerdo con los principios y requisitos
especificados en el captulo Impurezas ElementalesLmites
232. Ver tambien el captulo 232 para informacion
relacionada con farmacos y excipientes. Los contaminantes elementales se controlan en los suplementos dieteticos oficiales
de acuerdo con los principios y requisitos especificados en
Contaminantes Elementales en Suplementos Dieteticos 2232.
(Oficial a partir del 1 de diciembre de 2015)
5.70. Pruebas de Desempe
no
Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido
se hayan efectuado usando la misma metodologa analtica
especificada en la Valoracion, tomando debida cuenta de las
diferencias en la preparacion
de la muestra, el promedio de
todas las determinaciones individuales de uniformidad de
contenido puede usarse como el resultado de la Valoracion.
5.80. Estandares de Referencia USP
Los Estandares de Referencia USP son materiales autenticos que han sido aprobados como adecuados para su uso
como estandares de comparacion
en las pruebas y valoraciones de la USP o el NF. (Ver Estandares de Referencia USP
11). Cuando una prueba o valoracion
de los compendios
Advertencias
siempre que la monografa indique una prueba para Perdida
por Secado, Determinacion de Agua o Perdida por Incineracion,
respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro
material volatil puede interferir con el procedimiento, la monografa individual especifica que es necesario secar la sustancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
La expresion
exenta de disolventes significa que se deben corregir los calculos por la presencia de disolventes conocidos, segun
se determinan usando los metodos descritos
en Disolventes Residuales 467, a menos que la monografa
proporcione una prueba de lmite de disolventes residuales.
La expresion
previamente secada(o) sin otro calificativo
significa que la sustancia se debe secar segun
se indica en
Perdida por Secado 731 o Determinacion de Agua 921 (determinacion
gravimetrica).
Cuando se indique secar al vaco sobre un desecante, se
debe utilizar un desecador al vaco, una pistola para secado
al vaco u otro instrumento apropiado para secado al vaco.
6.40.10. Incinerar hasta Peso Constante
Incinerar hasta peso constante significa que debera continuarse la incineracion
a 800 25, a menos que se indique
algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la segunda de las cuales se realiza despues de un periodo adicional acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difieran en mas de 0,50 mg por g de sustancia tomada.
6.40.20. Secado hasta Peso Constante
Secado hasta peso constante significa que debera continuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la segunda de las cuales se realiza despues de un periodo adicional de secado acorde con la naturaleza y cantidad del
residuo, no difieran en mas de 0,50 mg por g de sustancia
tomada.
6.50. Preparacion
de Soluciones
6.50.10. Filtracion
Cuando en un procedimiento se indica filtrar sin otro

calificativo, el lquido se debe pasar a traves de un papel de
filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el filtrado sea transparente. Dados los posibles efectos del filtro,
se pueden desechar los volumenes
iniciales del filtrado.

6.50.20. Soluciones
A menos que se especifique de otro modo, todas las soluciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones
para mediciones cuantitativas deben prepararse usando analitos medidos o pesados con exactitud (ver la seccion
8.20.
Aproximadamente).
Una expresion
tal como (1 en 10) significa que 1 parte
en volumen de un lquido debe diluirse con, o que 1 parte
en peso de un solido
debe disolverse en, ERR (01-ago-2014) una

cantidad suficiente de diluyente o disolvente para que el
volumen de la solucion
final sea de 10 partes medidas en
volumen. Expresiones similares a (20:5:2) significan que los
numeros
respectivos de partes, medidas en volumen, de los

lquidos se
nalados deben mezclarse, a menos que se indique
algo diferente.
6.50.20.1. Ajuste de Soluciones
Cuando un procedimiento exige una concentracion
especfica, se puede usar una solucion
con otra normalidad o
molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en
la concentracion
y no se aumente el error de la medicion.
En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantidades

proporcionalmente mayores o menores que los especificados
de las sustancias a analizar y los correspondientes Estandares
de Referencia, siempre y cuando las mediciones resulten con
una exactitud equivalente o mejor.
A menos que se indique algo diferente, las concentraciones de analitos deben prepararse de modo que queden dentro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
particular de que un procedimiento se adapte al intervalo
de trabajo de un instrumento, las concentraciones de las
soluciones pueden diferir del valor indicado en mas de diez
por ciento (10%), realizando los cambios apropiados en los
calculos asociados. Todo cambio realizado debe quedar dentro del intervalo validado del instrumento.
USP 38
Cuando se indica el ajuste del pH mediante un a cido o
base y no se indica la concentracion,
se pueden usar concentraciones apropiadas de dicho a cido o base.
6.50.20.2. Soluciones Reactivo
La informacion
acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se
encuentra en el apartado Soluciones Reactivo en la seccion
Reactivos, Indicadores y Soluciones de los compendios

USPNF. El uso de una Solucion
Reactivo alternativa o cambios en la Solucion
Reactivo utilizada puede requerir de
validacion.
6.50.20.3. Soluciones Indicadoras

Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un
procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL
o 3 gotas de dicha solucion,
a menos que se indique algo
diferente.
6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba
A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar
un numero
suficiente de unidades para asegurar un resultado analtico adecuado.

6.60.10. Tabletas
Cuando en el procedimiento de una monografa de Tabletas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un
cierto numero
de Tabletas, se entiende que se debe pesar y

reducir a polvo un numero
contado de Tabletas. La porcion
tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representativa del total de Tabletas y pesada con exactitud.
6.60.20. Capsulas
Cuando en el procedimiento de una monografa de Capsulas se indique vaciar, tan completamente como sea posible, el contenido de no menos de cierto numero
de Capsulas, se entiende que se debe abrir cuidadosamente un

numero
contado de Capsulas y se debe retirar cuantitativamente, combinar, mezclar y pesar con exactitud el contenido de las mismas. La porcion
tomada del contenido de las
Capsulas debe ser representativo del contenido total de las
Capsulas y pesado con exactitud.
6.70. Reactivos
La ejecucion
adecuada de las pruebas y valoraciones farmacopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen,
en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos
procedimientos. A menos que se especifique algo diferente,
se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en
las especificaciones de la edicion
vigente de Reagent Chemicals publicada por la American Chemical Society (ACS).
Cuando tales especificaciones no existan o cuando por distintas razones la pureza requerida de un reactivo fuera diferente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reactivos de calidad aceptable (ver la seccion
Reactivos,
Indicadores y Soluciones en USPNF). Los reactivos no tratados por ninguna de estas especificaciones deben ser de
grado adecuado para la realizacion
del metodo de valoracion
o prueba en cuestion.
La inclusion
en los compendios de estos reactivos, indicadores y soluciones empleadas como reactivos, no implica
que tales sustancias tengan utilidad terapeutica. Cualquier
referencia a la USP o el NF en sus etiquetados debe incluir
tambien el termino reactivo o grado reactivo. La USP
puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren
comercialmente disponibles.
6.80. Equipo
A menos que se indique algo diferente, la especificacion
de un tama
no o tipo definido de recipiente o de aparato es
solo
una recomendacion.
Es posible usar otras dimensiones
o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido.
6.80.10. Aparatos de Medicion
Cuando se indique el uso de matraces volumetricos u

otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean,
al menos, una exactitud equivalente.
6.80.10.1. Pipeta
Cuando se especifica el uso de una pipeta, e sta se puede
sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso
USP 38
Requisito Farmacopeico
Lmite de valoracion
98,0%
Lmite de valoracion
101,5%
Prueba de lmite 0,02%
Prueba de lmite 3 ppm
El valor de informe, que por lo general se obtiene combinando valores de varias determinaciones individuales, se
compara con los criterios de aceptacion.
El valor de informe
es el resultado final de un procedimiento completo de medicion,
segun
se ha documentado.
Cuando los criterios de aceptacion
se expresan de forma
numerica en estas Advertencias Generales mediante la especificacion
de un lmite superior y/o inferior, los valores permitidos incluyen a los valores especificados, pero no los valores fuera del lmite o lmites. Los criterios de aceptacion
se
consideran significativos hasta el ultimo
dgito se
nalado.
7.10.5. Concentraciones Nominales en Ecuaciones
Cuando se especifica una concentracion
nominal, calcular la concentracion
basandose en la cantidad declarada en
la etiqueta. En los procedimientos de valoracion,
la correccion
por contenido de agua tpicamente se indica en la Definicion
y en la etiqueta del Estandar de Referencia USP. Para
otros procedimientos, la correccion
por contenido y/o potencia valorados se realiza antes de usar la concentracion
en
la ecuacion
provista en la monografa.
7.10.10. Equivalencia en Procedimientos Volumetricos
Las instrucciones de los procedimientos volumetricos concluyen con una declaracion
de equivalencia entre el peso
del analito y cada mL de solucion
volumetrica normalizada.
En tales equivalencias, se entendera que el numero
de cifras
significativas en la concentracion
de la solucion
volumetrica
corresponde al del numero
de cifras significativas en el peso

del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer correcciones en todas las valoraciones volumetricas basandose
en la determinacion
con un blanco (ver Volumetra 541).
7.20. Reglas para Redondeo
Los valores observados o calculados deben redondearse al
mismo numero
de decimales que el expresado para el lmite. No debera efectuarse el redondeo antes de concluir
los calculos correspondientes para obtener el valor de informe. Los calculos intermedios (p.ej., la pendiente de la
curva de linealidad) pueden redondearse para propositos
de
informe, pero si se requiere realizar calculos adicionales se
deben utilizar los valores originales sin redondear. Los criterios de aceptacion
son numeros
fijos y no se redondean.
Cuando se requiere redondear una cifra, se considera solamente el dgito que se encuentra a la derecha del ultimo
lugar decimal en la expresion

del lmite. Si este dgito es
menor de 5, se elimina sin cambiar el dgito que lo precede.
Si este dgito es igual o mayor a 5, se elimina y el dgito
que lo precede se aumenta en 1.
8. TE RMINOS Y DEFINICIONES
8.10. Abreviaturas
ER corresponde a un Estandar de Referencia USP.
SC corresponde a una Solucion
Colorimetrica.
SR se refiere a una Solucion
Reactivo.
SV corresponde a una Solucion
Volumetrica estandarizada de conformidad con las instrucciones provistas en
Ejemplos de Redondeo de Valores Numericos
para Comparacion
con los Requisitos
Valor Sin Redondear
Resultado Redondeado
97,96%
98,0%
97,92%
97,9%
97,95%
98,0%
101,55%
101,6%
101,46%
101,5%
101,45%
101,5%
0,025%
0,03%
0,015%
0,02%
0,027%
0,03%
3,5 ppm
4 ppm
3,4 ppm
3 ppm
2,5 ppm
3 ppm
Cumple
S
No
S
No
S
S
No
S
No
No
S
S
Advertencias
de una pipeta calibrada para contener, e sta se puede sustituir por un matraz volumetrico adecuado.
6.80.10.2. Proteccion
contra la Luz
Cuando se indique el uso de recipientes con proteccion
actnica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes

especialmente tratados para proteger el contenido contra la
luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o
envuelto adecuadamente para volverlos opacos.
6.80.20. Instrumentos
Es posible sustituir el instrumento especificado por otro
instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en
los mismos principios fundamentales de operacion
y tenga
una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales caractersticas se deben calificar como apropiadas. Si se mencionara una marca o un proveedor de un material, un instrumento o una pieza de equipo, o el nombre y la direccion
de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden aparecer como notas al pie de pagina), esta informacion
se
brinda solo
por conveniencia y no implica aprobacion,
aval
o certificacion.
6.80.20.1. Columnas y Tubos Cromatograficos

El termino diametro se refiere al diametro interno (DI).
6.80.20.2. Otros Tipos de Tubos y Tuberas
El termino diametro se refiere al diametro externo (DE).
6.80.20.3. Ba
no de Vapor
Cuando se indique el uso de un ba
no de vapor, se usa
vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una
temperatura equivalente.
6.80.20.4. Ba
no de Agua
A menos que se especifique algo diferente, un ba
no de
agua requiere agua en ebullicion
vigorosa.
6.80.30. Dispositivos de Medicion
de Temperatura
Los dispositivos de medicion
de temperatura adecuados
para las pruebas Farmacopeicas cumplen con especificaciones que son rastreables a un estandar del NIST (Instituto
Nacional de Normas y Tecnologa de los EE.UU.) o equivalente. Los dispositivos de medicion
de temperatura pueden
ser del tipo lquido en vidrio o un tipo de indicador de
temperatura analogo o digital, tal como un dispositivo de
temperatura con resistencia, termistor o termopar. La estandarizacion
de termometros
se lleva a cabo en una frecuencia

de analisis establecida con una temperatura estandar rastreable al NIST. Por ejemplo, se puede consultar la edicion
vigente de las normas E1 de la ASTM para termometros
de
lquido en vidrio.
7. RESULTADOS DE PRUEBAS
7.10. Interpretacion
de los Requisitos
Los resultados analticos observados en el laboratorio (o
los calculados a traves de determinaciones experimentales)
se comparan con los criterios de aceptacion
especificados
para determinar si el artculo cumple con los requisitos
farmacopeicos.
Advertencias
la monografa individual o en la seccion
Reactivos, Indicadores y Soluciones de USPNF.
8.20. Aproximadamente
El termino aproximadamente indica una cantidad que
puede variar dentro del 10%.
Si se especifica una medicion
como medida con exactitud o pesada con exactitud se deben seguir las especificaciones de los captulos generales Aparatos Volumetricos
31 y Balanzas 41, respectivamente.
8.30. Contenido de Alcohol
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Contenido de Alcohol, son porcentajes en volumen de C2H5OH a
15,56. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etlico o
etanol en una formula,
prueba o valoracion,
se debe usar el
artculo de la monografa Alcohol de la USP. Cuando se hace
referencia a C2H5OH, significa etanol absoluto (100 por
ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidratado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el
artculo de la monografa Alcohol Deshidratado de la USP.
8.40. Pesos Atomicos
Los pesos atomicos
usados para calcular pesos moleculares y los factores en las valoraciones y en otras partes
donde e stos aparezcan, son los establecidos por la Commission on Atomic Weights and Isotopic Abundances de la IUPAC (Comision
de Pesos Atomicos
y Abundancias Isotopicas
de la Union
Internacional de Qumica Pura y Aplicada).
8.50. Determinaciones con Blancos
Cuando se indique realizar cualquier correccion
necesaria por medio de una determinacion
con un blanco, tal
determinacion
debe efectuarse usando las mismas cantidades de los mismos reactivos tratados de la misma manera
que la solucion
o mezcla que contiene la porcion
de sustancia en analisis, pero omitiendo dicha sustancia.
8.60. Concomitantemente
El termino concomitantemente indica que las determinaciones o mediciones deben efectuarse en sucesion
inmediata.
8.70. Desecador
La instruccion
en un desecador indica el uso de un recipiente cerrado hermeticamente, de tama
no y dise
no adecuados, que mantiene una atmosfera
de bajo contenido de
humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo,
cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pento
xido de fosforo
o gel de slice. Ver tambien la seccion

8.220.
Desecador al Vaco.
8.80. Logaritmos
Los logaritmos empleados son logaritmos en base 10.
8.90. Cepas Microbianas
Cuando se cita e identifica una cepa microbiana por el
numero
de catalogo ATCC, la cepa especfica debe emplearse directamente o, si se hacen cultivos sucesivos, no
deben usarse mas de cinco pasajes a partir de la cepa
original.
8.100. Inapreciable
El termino inapreciable indica una cantidad que no excede de 0,50 mg.
8.110. No menos de (NLT) y No mas de (NMT)
Las siglas en ingles NLT (not less than) significan y se
traducen como no menos de. Las siglas en ingles NMT
(not more than) significan y se traducen como no mas
de.
8.120. Olor
Los terminos inodoro, practicamente inodoro, con
un debil olor caracterstico y expresiones semejantes, indican la evaluacion
de una cantidad adecuada de material recientemente abierto despues de la exposicion
al aire durante
15 minutos. La asignacion
de un olor es solo
descriptiva y
no debera considerarse como una norma de pureza para un
lote particular de un artculo.
8.130. Por ciento
La expresion
por ciento usada sin otros calificativos
significa:
USP 38
Porcentaje peso en peso, para mezclas de solidos
y
semisolidos;
Porcentaje peso en volumen, para soluciones o suspensiones de solidos
en lquidos;
Porcentaje volumen en volumen, para soluciones de lquidos en lquidos; y
Porcentaje peso en volumen, para soluciones de gases
en lquidos.
Por ejemplo, una solucion
al 1 por ciento se prepara disolviendo 1 g de un solido
o semisolido,
o 1 mL de un lquido,
en disolvente suficiente para obtener 100 mL de solucion.
8.140. Concentraciones Porcentuales

Las concentraciones porcentuales se expresan segun
se indica a continuacion:
Porcentaje Peso en Peso (p/p) se define como el numero
de g de un soluto en 100 g de solucion.
Porcentaje Peso en Volumen (p/v) se define como el nu

mero de g de un soluto en 100 mL de solucion.
Porcentaje Volumen en Volumen (v/v) se define como el

numero
de mL de un soluto en 100 mL de solucion.
8.150. Presion
La presion
se determina usando un manometro
o baro
metro adecuado, calibrado en terminos de la presion
ejercida por una columna de mercurio de la altura indicada.
8.160. Tiempo de Reaccion
El tiempo de reaccion
es de 5 minutos a menos que se
especifique algo diferente.
8.170. Peso Especfico
El Peso especfico es el peso de una sustancia en aire a
25 dividido por el peso de un volumen igual de agua a la
misma temperatura.
8.180. Temperaturas
A menos que se indique algo diferente, las temperaturas
se expresan en grados centgrados (Celsius) y todas las mediciones se hacen a 25. Cuando se especifica calor moderado, se indica toda temperatura no mayor de 45 (113 F).
8.190. Tiempo
A menos que se especifique algo diferente, las reglas para
redondeo, segun
se describen en la seccion
7.20. Reglas
para Redondeo, se aplican a todos los tiempos especificados.
8.200. Transferir
El termino transferir indica una manipulacion
cuantitativa.
8.210. Vaco
El termino al vaco especifica la exposicion
a una presion
menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas), a menos
que se indique algo diferente.
8.220. Desecador al Vaco
Un desecador al vaco es un desecador que mantiene
una atmosfera
de baja humedad a una presion

reducida de
no mas de 20 mm de mercurio (2,67 kPas) o a la presion
indicada en la monografa individual.

8.230. Agua
8.230.10. Agua como Ingrediente de un Producto Oficial
Cuando aparece como un ingrediente en un producto oficial, el agua cumple con los requisitos de la monografa de
agua adecuada en la USP o el NF.
8.230.20. Agua en la Fabricacion
de Sustancias Oficiales
En la fabricacion
de sustancias oficiales, se puede usar
agua que cumpla con los requisitos para agua potable
(drinking water) establecidos en las reglamentaciones de la
U.S. Environmental Protection Agency (Agencia de Proteccion
Ambiental de los Estados Unidos).
8.230.30. Agua en un Procedimiento Farmacopeico
Cuando se exige agua en un procedimiento farmacopeico, se entiende que debe emplearse el artculo Agua Purificada de la USP, a menos que se especifique algo diferente.
Las definiciones de Agua de Alta Pureza y Agua Exenta de
Dioxido de Carbono se encuentran en EnvasesVidrio 660.
Las definiciones de otros tipos de agua se encuentran en
Agua para Uso Farmaceutico 1231.
USP 38
Unidades
Smbolo
metro
centmetro
milmetro
m
cm
mm
micrometro
nanometro
Angstr
om
nm
A
kilogramo
gramo
miligramo
kg
g
mg
Unidades
decilitro
Smbolo
dL
mililitro
microlitro
mL
L
Celsius
Cantidad
de Sustancia
mol
milimol
micromol
femtomol
mol
mmol
mol
fmol
Longitud
Anteriormente referido
como micron
Anteriormente se usaba
el smbolo m (para
milimicron)
Igual a 0,1 nm
equivalente
miliequivalente
Masa
microgramo
nanogramo
picogramo
g
ng
pg
dalton
kilodalton
Da
kDa
segundo
minuto
hora
s
min
h
Tambien referido como

peso equivalente en
gramos. Se usa en el
calculo de concentracion
de sustancia en
unidades de normalidad. Esta unidad actualmente ya no
representa la de uso
preferido en qumica
analtica o metrologa.
mEq
osmol
miliosmol
Osmol
mOsmol
pascal
kilopascal
libras por
pulgada
cuadrada
milmetro
de mercurio
Pa
kPa
psi
Presion
osmotica
de
una solucion,
relacionada con la concentracion
de una
sustancia
Igual a 133,322 Pa
mmHg
Unidades
electricas
amperio
voltio
milivoltio
hercio
kilohercio
megahercio
electronvoltio
kiloelectronvoltio
megaelectronvoltio
Tambien referido como

la unidad de masa
atomica
unificada y es
igual a 1/12 veces la
masa de un a tomo no
enlazado de carbono12.
A
V
mV
Hz
kHz
MHz
Unidad de frecuencia
eV
keV
MeV
Radiacion
Volumen
Eq
Historicamente
referido
como peso molecular
en gramos o peso
atomico
en gramos
Presion
Tiempo
litro
1 mL es igual a 1 cm3,
en ocasiones se denomina cc.
Temperatura
Comentarios
El smbolo g se usa en
la USP y el NF para representar microgramos, pero los
microgramos se pueden representar como
mcg para proposi
tos de etiquetado y
prescripcion.
El termino gamma, simbolizado por la letra
griega , se usa con
frecuencia para designar al microgramo en
la literatura de bioqumica.
Comentarios
1 L es igual a 1000
cm3 (centmetros cu
bicos).
becquerelio
kilobecquerelio
Bq
kBq
Unidad del SI para la

actividad de radionucleidos
Advertencias
8.240. Pesos y Medidas

En general, se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI) para pesos y medidas, de acuerdo con lo establecido y revisado por la Conference generale des poids et mesures (Conferencia General de Pesos y Medidas). A los fines de
los compendios, el termino peso se considera como sino
nimo de masa.
La molalidad se representa por medio del smbolo m precedido por un numero
que es el numero
de moles de soluto
contenidos en 1 kilogramo de disolvente.
La molaridad se representa por medio del smbolo M precedido por un numero
que es el numero
de moles de soluto
contenidos en una cantidad de disolvente suficiente para
preparar 1 litro de solucion.
La normalidad se representa por medio del smbolo N

precedido por un numero
que es el numero
de equivalentes
de soluto contenidos en una cantidad de disolvente suficiente para preparar 1 litro de solucion
Listado de Smbolos y Prefijos comunmente
usados para
unidades metricas del SI y otras unidades:
Advertencias
Unidades
megabecquerelio
gigabecquerelio
curio
milicurio
microcurio
nanocurio
USP 38
Smbolo
Comentarios
MBq
GBq
Ci
mCi
Ci
nCi
Unidad para la actividad de radionucleidos

que no forma parte
del SI.
Otros
aceleracion
debida a
la gravedad
revoluciones por
minuto
gn
rpm
Usada para expresar la

velocidad de centrifugacion.
Usada para expresar la

velocidad de centrifugacion.
Prefijos Seleccionados del SI

Nombre
giga
mega
kilo
deci
centi
mili
micro
nano
pico
femto
Smbolo
G
M
k
d
c
m
n
p
f
Factor
109
106
103
101
102
103
106
109
1012
1015
Y DISPENSACION
9. PRESCRIPCION
9.10 Uso de Unidades Metricas
Las prescripciones de artculos farmacopeicos se escribiran
usando unidades metricas para indicar la cantidad y/o contenido deseados, a menos que se indique algo diferente en
la monografa individual (ver tambien la seccion
5.50.10.
Unidades de Potencia [Biologica]). Si la prescripcion
de una
cantidad se hace en otro sistema de medidas, se debe dispensar solo
una cantidad equivalente a la prescrita usando
el sistema metrico. No se deben usar unidades del sistema
apotecario en el etiquetado.
9.20 Cambios en Volumen
En la dispensacion
de medicaciones prescritas, pueden obviarse los peque
nos cambios de volumen que se producen
debido a variaciones en la temperatura ambiente.
10. CONSERVACION,
ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y
ETIQUETADO
[NOTASe han omitido las disposiciones relacionadas con
el almacenamiento y envasado previamente tratadas en las
Advertencias Generales, excepto la breve disposicion
propuesta a continuacion
en el apartado 10.10; para componentes de envasado y condiciones de almacenamiento, ver
el nuevo captulo general 659. De manera similar, las disposiciones relacionadas con el etiquetado tambien estan
siendo trasladadas a un nuevo captulo general 7 y se omitiran en un futuro.]
10.10. Envasado y Almacenamiento
Todos los artculos en los compendios USP o NF estan
sujetos a los requisitos de envasado y almacenamiento especificados en el captulo general Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659, a menos que se provean requisitos distintos en una monografa especfica.
10.40. Etiquetado
El termino etiquetado se refiere a todas las etiquetas o
marbetes y demas materiales escritos, impresos o graficos
que aparezcan directamente sobre el envase primario de un

artculo, sobre o dentro del empaque o envoltorio, secundario, con excepcion
de los embalajes externos destinados
para el transporte. El termino etiqueta designa la parte del
etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
Los embalajes para el transporte que contengan un solo
artculo se etiquetan por lo menos con la identificacion
del
producto (excepto los artculos controlados), el numero
de
lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento y distribucion,
salvo que dicho envase sea tambien
el envase primario o la parte exterior del empaque destinado al consumidor.
Ademas de los requisitos de etiquetado establecidos en
estos compendios, los artculos estan sujetos al cumplimiento de otras normas de etiquetado que puedan promulgar entidades gubernamentales.
10.40.10. Cantidad de Ingrediente por Unidad de Dosificacion
El contenido de un producto farmaceutico se expresa en

la etiqueta del envase en terminos de porcentaje, microgramos, miligramos o gramos del farmaco, o de su parte terapeuticamente activa, de acuerdo con la forma usada en el
ttulo del artculo, a menos que se indique algo diferente en
la monografa individual. En el etiquetado se indican los
nombres y cantidades equivalentes tanto del farmaco como
de su parte activa.
Los artculos oficiales en capsulas, tabletas u otras unidades de dosificacion
deberan etiquetarse de forma tal que
expresen la cantidad de cada ingrediente activo o nutriente
reconocido contenido en cada unidad; excepto cuando se
trate de soluciones o suspensiones orales envasadas en dosis
unicas,
ya sea que e stas se suministren como preparaciones

lquidas o preparaciones lquidas reconstituidas a partir de
solidos,
por la adicion
de un volumen dado de un diluyente
especfico, cuyas etiquetas indicaran la cantidad de cada ingrediente activo o nutriente reconocido extrable en las condiciones indicadas en Volumen de Entrega 698. Para los
productos farmaceuticos oficiales que no se presentan en
unidades de dosificacion
se debe expresar en el etiquetado
la cantidad de ingrediente activo por mililitro o por gramo,
o el porcentaje de cada ingrediente (ver 8.140. Concentraciones Porcentuales), excepto en el caso de los lquidos orales, o los solidos
que se reconstituyan para producir lquidos

orales, que se pueden etiquetar alternativamente en terminos de la cantidad de ingrediente activo por 5 mL del lquido o del preparado reconstituido. A menos que se especifique algo diferente en una monografa o en un captulo,
tales indicaciones de contenido o cantidad deberan declararse solo
en unidades metricas. Ver tambien 5.50.10. Unidades de Potencia (Biologica).
10.40.20. Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una
Cantidad
Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la
dispensacion
y administracion
de medicamentos, cuando la
cantidad de ingrediente activo se exprese en numeros
enteros, se debe indicar sin coma decimal seguida de ceros (por

ejemplo, indicar 4 mg [no 4,0 mg]). La cantidad de ingrediente activo que sea un numero
decimal menor de 1 se
escribira con un cero antes de la coma decimal (por ejemplo: 0,2 mg [no ,2 mg]).
10.40.30. Etiquetado de Sales de Farmacos
Es un principio establecido que los artculos oficiales deben tener un unico
ttulo oficial. Con el objeto de ahorrar

espacio en las etiquetas, y dado que los smbolos qumicos
de las sales inorganicas mas comunes son conocidos por los
profesionales de la salud como sinonimos
de sus formas escritas, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de artculos oficiales que son sales: HCl para clorhidrato; HBr para bromhidrato; Na para sodio y K para
potasio. Los smbolos Na y K se usan para abreviar el nombre de las sales de a cidos organicos; sin embargo, estos smbolos no deben usarse cuando se emplea la preposicion
de en el ttulo oficial, es decir cuando se denominan oficialmente de sodio o de potasio (con el metal al co-
USP 38
cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosificacion

y que se mantengan estables durante un perodo de no
menos de 3 a
nos, siempre que se almacenen en las condiciones prescritas.
En el caso de artculos oficiales que deban exhibir una
fecha de caducidad, tales artculos deben dispensarse en un
envase, o a partir de un envase, etiquetado con fecha de
caducidad, y la fecha de dispensacion
del producto debe ser
anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de caducidad identifica el perodo durante el cual se estima que
el artculo cumple con los requisitos de la monografa oficial,
siempre que se conserve en las condiciones de almacenamiento prescritas. La fecha de caducidad limita el tiempo
durante el cual un artculo puede ser dispensado o usado.
En los casos en que se indica solo
el mes y el a
no de caducidad, se entiende que la fecha se refiere al ultimo
da del
mes indicado. La fecha lmite de uso es la fecha despues de
la cual no se debe utilizar un artculo. Basandose en la informacion
provista por el fabricante y las Advertencias Generales, el dispensador debe colocar una fecha lmite de uso
adecuada en la etiqueta del envase del artculo recetado
para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La
fecha lmite de uso colocada en la etiqueta no debe ser
posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante.
Para los artculos que requieran ser reconstituidos antes de
su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha lmite de
uso apropiada para el producto reconstituido.
Para todas las otras formas farmaceuticas en las que se
deba determinar el perodo posterior a la dispensacion
durante el cual es prudente que un paciente conserve un medicamento prescrito, el dispensador debe tener en consideracion,
ademas de cualquier otro factor relevante: la
naturaleza del medicamento; el envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de caducidad; las caractersticas del envase para el paciente, si el artculo se reenvasa
para su dispensacion;
las condiciones de almacenamiento
esperadas o inusuales a las que el artculo puede ser expuesto y el perodo estimado para la duracion
del tratamiento. Considerando todo lo anterior, el dispensador debe
colocar en la etiqueta de un envase de unidades multiples
una fecha lmite de uso adecuada, a fin de limitar la utilizacion

del artculo por parte del paciente. A menos que se
especifique algo diferente en la monografa individual, o en
ausencia de datos de estabilidad, esa fecha lmite de uso no
podra ser posterior a: (a) la fecha de caducidad indicada en
el envase del fabricante, o (b) un a
no a partir del momento
en que se dispense el medicamento, lo que represente un
perodo menor. Para formas farmaceuticas lquidas y solidas
no esteriles que estan envasadas en envases unitarios y de

dosis unica,
la fecha lmite de uso debe ser de 1 a

no a partir
de la fecha de envasado del medicamento en envases unitarios o de dosis unica,
o la fecha de caducidad indicada en el

envase del fabricante, lo que represente un perodo menor,
a menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del
fabricante indiquen algo diferente.
El dispensador debe mantener las instalaciones donde se
envasan y almacenan las formas farmaceuticas a una temperatura cinetica media no mayor de 25. El material de plastico usado para envasar debe brindar una mejor proteccion
que la que ofrece el cloruro de polivinilo, que no brinda una

adecuada proteccion
contra la permeacion
de la humedad.
Se deben guardar registros de la temperatura del lugar
donde se almacenan las formas farmaceuticas y de los materiales plasticos usados en el envasado.
10.40.100.1. Preparaciones Magistrales
La etiqueta del envase o empaque que contiene una preparacion
magistral oficial debe llevar una fecha lmite de
uso. La fecha lmite de uso es la fecha despues de la cual no
debe usarse la preparacion
magistral. Debido a que las preparaciones magistrales estan destinadas a administrarse inmediatamente o luego de un perodo de almacenamiento
corto, las fechas lmite de uso pueden determinarse basandose en criterios distintos a los utilizados para determinar las
Advertencias
mienzo de la denominacion
oficial en ingles), (p.ej., Fenobarbital Sodico,
que se denomina Phenobarbital Sodium en

ingles, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se debera escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el cual se denomina Sodium Salicylate en ingles).
10.40.40. Etiquetado de los Productos con Vitaminas
La etiqueta de los productos farmaceuticos oficiales debe
indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades
metricas por unidad de dosificacion.
Los contenidos de vitamina A, D y E tambien se pueden expresar en Unidades
USP. Las cantidades de vitamina A expresadas en unidades
metricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de
retinol (alcohol de vitamina A). La etiqueta de los suplementos nutricionales debe incluir un numero
identificatorio de
lote, de control o de partida.
10.40.50. Etiquetado de los Productos Botanicos
La etiqueta de una hierba u otro producto botanico destinado para uso como suplemento dietetico contiene la leyenda Si esta embarazada o en perodo de lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este
producto.
10.40.60. Etiquetado de Preparaciones Parenterales y
Topicas
La etiqueta de una preparacion

para uso parenteral o to
pico debe especificar el nombre de todas las sustancias
agregadas (ver 5.20. Sustancias Agregadas y ver Etiquetado
en Inyectables 1) y, en caso de preparaciones para uso parenteral, tambien debe especificar sus cantidades o proporciones, excepto en el caso de sustancias agregadas solo
para
ajustar el pH o para lograr isotonicidad, para las cuales
puede mencionarse simplemente su presencia y la razon
por
la cual se agregan.
10.40.70. Etiquetado de Electrolitos
La concentracion
y dosificacion
de electrolitos
para terapias de reemplazo (p.ej., cloruro de sodio o cloruro de potasio), debe especificarse en la etiqueta en miliequivalentes
(mEq). Asimismo, la etiqueta del producto debe indicar la
cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en terminos de peso o concentracion
porcentual.
10.40.80. Etiquetado de Alcohol
El contenido de alcohol en una preparacion
lquida debe
especificarse en la etiqueta como porcentaje (v/v) de
C2H5OH.
10.40.90. Capsulas y Tabletas Especiales
La etiqueta de cualquier Capsula o Tableta destinada para
una administracion
que no sea la ingestion
oral de la unidad
entera, debe llevar una indicacion
bien visible sobre el modo
de uso.
10.40.100. Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso
(N. del T. Las expresiones fecha de caducidad, fecha
de expiracion
y fecha de vencimiento son equivalentes.)

La etiqueta de un producto farmaceutico oficial, o de un
suplemento nutricional o dietetico oficial, debe llevar una
fecha de caducidad. Todos los productos deben exhibir la
fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leda por
una persona comun
en las condiciones normales de compra
y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma prominente, contrastando claramente con el fondo, o grabada
en relieve con nitidez, y debe ser facilmente comprendida
(p.ej., EXP 6/08, Exp. Junio de 2008, o Caduca el 6/
08). [NOTAPara obtener informacion
adicional, consultar
los Voluntary Codes and Guidelines of the Self-Medication Industry de la Consumer Healthcare Products Association.]
Las monografas para ciertas preparaciones especifican
como
se debe determinar la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta. En ausencia de un requisito especfico
en las monografas individuales de un producto farmaceutico o un suplemento nutricional, la etiqueta debe llevar una
fecha de caducidad asignada para dicha formulacion
y empaque en particular del artculo, con la siguiente excepcion:
no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de

productos farmaceuticos o suplementos nutricionales envasados en envases destinados a la venta sin receta medica, en
Advertencias
fechas de caducidad de los productos farmaceuticos fabricados en forma industrial.

La monografa de una preparacion
magistral oficial incluye, por lo general, un requisito de lmite de uso que especifica el perodo desde la fecha de preparacion
durante el
cual, en condiciones de almacenamiento adecuadas, se
puede usar la preparacion.
En caso de que no haya datos de
estabilidad aplicables a un farmaco y preparacion
especfi-
USP 38
cos, se han desarrollado recomendaciones de fecha lmite de
uso maxima para preparaciones magistrales no esteriles envasadas en envases impermeables y resistentes a la luz, almacenadas a temperatura ambiente controlada, a menos
que se especifique algo diferente (ver Criterios de Estabilidad
y Determinacion de la Fecha Lmite de Uso en Estabilidad de
Preparaciones Magistrales en el captulo de pruebas generales
Preparacion MagistralPreparaciones No Esteriles 795).
USP 38
Gua de los Captulos Generales / Diagrama de Captulos 15
Diagrama de Captulos
1 Esta tabla y los Diagramas 113 que se presentan a continuacin tienen la finalidad de ser una gua de los captulos en esta publicacin. Es probable que no
incluyan la informacin completa y no pretenden cumplir con las expectativas de los artculos o limitar la aplicacin de las pruebas a cualquier artculo en USP
NF.
Captulos
Gua de DiagramasCaptulos Generales USP1

Artculos Oficiales
Frmacos Activos No ComplejosPruebas Universales: Ver Diagrama 1a
Frmacos Activos No ComplejosPruebas Especficas: Ver Diagrama 1b
Sustancias Obtenidas por Biotecnologa: Ver Diagrama 2
ExcipientesPruebas Universales: Ver Diagrama 3a
ExcipientesPruebas Especficas: Ver Diagrama 3b
Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Universales: Ver Diagrama 4a
Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Especficas: Ver Diagrama 4b
Medicamentos de Sustancias Obtenidas por Biotecnologa: Ver Diagrama 5
Vacunas: Ver Diagrama 6
Sangre y Hemoderivados: Ver Diagrama 7
Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos: Ver Diagrama 8
Ingredientes de Suplementos Dietticos: Ver Diagrama 11
Productos de Suplementos Dietticos: Ver Diagrama 12
Preparacin Magistral: Ver Diagrama 13
Dispositivos Mdicos
691 Algodn
861 SuturasDimetro
871 SuturasSujecin de Agujas
Generalmente Aplicables
Elementos Bsicos
1058 Calificacin de Instrumentos Analticos
1097 Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel
1151 Formas Farmacuticas
1196 Armonizacin Farmacopeica
1224 Transferencia de Procedimientos Analticos
1225 Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
1226 Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos
Distribucin de Medicamentos: Ver Diagrama 9
MicrobiologaProductos No Estriles: Ver Diagrama 10a
MicrobiologaProductos Estriles: Ver Diagrama 10b
16 Diagrama de Captulos / Gua de los Captulos Generales
USP 38
Diagrama 1a. Frmacos Activos No ComplejosPruebas Universales

Diagrama 1a. Frmacos Activos No ComplejosPruebas Universales
Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
Valoracin
11 Estndares de Referencia USP
81 AntibiticosValoraciones Microbiolgicas
181 IdentificacinBases Orgnicas Nitrogenadas
Orgnicas
Disolventes
Residuales
191 IdentificacinPruebas Generales
193 IdentificacinTetraciclinas
197 Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica
201 Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada
206 Aluminio
211 Arsnico
221 Cloruros y Sulfatos
223 Dimetilanilina
Captulos
Inorgnicas
231 Metales Pesados
232 Impurezas ElementalesLmites
233 Impurezas ElementalesProcedimientos
241 Hierro
251 Plomo
261 Mercurio
281 Residuo de Incineracin
291 Selenio
351 Valoracin de Esteroides
361 Valoracin de Barbitricos
391 Valoracin de Epinefrina
401 Grasas y Aceites Fijos
425 AntibiticosValoracin Yodomtrica
451 Volumetra con Nitrito
461 Determinacin de Nitrgeno
466 Impurezas Comunes
467 Disolventes Residuales
471 Combustin en Matraz con Oxgeno
511 Valoracin de un Esteroide Aislado
541 Volumetra
616 Densidad Aparente y Densidad por

Asentamiento de los Polvos
621 Cromatografa
659 Requisitos de Envasado y Almacenamiento
730 Espectroqumica de Plasma

731 Prdida por Secado
733 Prdida por Incineracin
735 Espectrometra de Fluorescencia de

Rayos X
736 Espectrometra de Masas
761 Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear
781 Rotacin ptica
USP 38
Diagrama 1a. Frmacos Activos No ComplejosPruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
801 Polarografa
851 Espectrofotometra y Dispersin de
Luz
941 Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin de Rayos X sobre Polvo (DRXP)
Valoracin
Orgnicas
1086 Impurezas en Frmacos y Productos Farmacuticos
Inorgnicas
Disolventes
Residuales
1119 Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano
1120 Espectroscopa Raman
1761 Aplicaciones de la Espectroscopa

de Resonancia Magntica Nuclear
Diagrama 1b. Frmacos Activos No ComplejosPruebas Especficas

Captulo
Caracterizacin
Fisicoqumica
Equipamiento
31 Aparatos Volumtricos
41 Balanzas
268 Porosidad Mediante Adsorcin-Desorcin de

Nitrgeno
301 Capacidad Neutralizante de cido
429 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz
541 Volumetra
616 Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos
631 Color y Acromatismo
641 Totalidad de la Disolucin
651 Temperatura de Solidificacin
695 Cristalinidad
699 Densidad de Slidos
721 Intervalo de Destilacin
735 Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X
741 Intervalo o Temperatura de Fusin
761 Espectroscopa de Resonancia Magntica

Nuclear
776 Microscopa ptica
781 Rotacin ptica
785 Osmolalidad y Osmolaridad
786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de

Partcula por Tamizado Analtico
791 pH
811 Finura de Polvos
821 Radioactividad
831 ndice de Refraccin
841 Peso Especfico
846 rea Superficial Especfica
881 Resistencia a la Tensin
891 Anlisis Trmico

911 ViscosidadMtodos Capilares
Captulos
21 Termmetros
Contenido
de Agua
USP 38
Diagrama 1b. Frmacos Activos No ComplejosPruebas Especficas (Continuacin)

Caracterizacin
Fisicoqumica
Captulo
912 ViscosidadMtodos Rotatorios
913 ViscosidadMtodo de Bola Rodante
Contenido
de Agua
Equipamiento
921 Determinacin de Agua
941 Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin de Rayos X

sobre Polvo (DRXP)
1051 Limpieza de Material de Vidrio
1120 Espectroscopa Raman
1171 Anlisis por Solubilidad de Fases
1251 Pesada en una Balanza Analtica
1761 Aplicaciones de la Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear
1911 Reometra
Captulos
Diagrama 2. Sustancias Obtenidas por Biotecnologa
Captulo
11 Estndares de Referencia
USP
Descripcin
Identificacin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Equipamiento
21 Termmetros
41 Balanzas
61 Examen Microbiolgico de
Productos No Estriles: Pruebas
de Recuento Microbiano
62 Examen Microbiolgico de
Productos No Estriles: Pruebas
de Microorganismos Especficos
63 Pruebas para Micoplasmas
71 Pruebas de Esterilidad
Relacionadas con el
Producto
Caracterizacin
81 AntibiticosValoraciones
Microbiolgicas
85 Prueba de Endotoxinas Bacterianas
87 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro
88 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo
111 Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas
121 Valoracin de Insulina
121.1 Procedimientos Analticos Fisicoqumicos para Insulinas
130 Atributos de Calidad de la

Protena A
191 IdentificacinPruebas
Generales
197 Pruebas de Identificacin

Espectrofotomtricas
208 Valoracin de Anti-Factor

Xa y Anti-Factor IIa para Heparinas No Fraccionadas y Heparinas de Bajo Peso Molecular
Impurezas
Relacionadas con el
Proceso
USP 38
Diagrama 2. Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Continuacin)
Captulo
Descripcin
Identificacin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Equipamiento
Impurezas
Relacionadas con el
Proceso
231 Metales Pesados
232 Impurezas Elementales

Lmites

Procedimientos
503 cido Actico en Pptidos
Relacionadas con el
Producto
Caracterizacin
541 Volumetra
621 Cromatografa
695 Cristalinidad
726 Electroforesis
781 Rotacin ptica
786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula

por Tamizado Analtico
851 Espectrofotometra y Dispersin de Luz
1030 Captulos de Valoraciones BiolgicasInformacin

General y Glosario
1032 Diseo y Desarrollo de

Valoraciones Biolgicas
1033 Validacin de Valoraciones Biolgicas
1034 Anlisis de Valoraciones

Biolgicas
1041 Productos Biolgicos
1044 Crioconservacin de Clulas

1045 Artculos Obtenidos por
Biotecnologa
1048 Calidad de Productos

Biotecnolgicos: Anlisis de la
Construccin Expresable en Clulas Usadas para la Produccin
de Productos Protenicos Obtenidos con ADN Recombinante

BiotecnologaAnlisis de Aminocidos
1053 Electroforesis Capilar

BiotecnologaIsoelectroenfoque
Captulos
USP 38
Captulo
Descripcin
Identificacin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Equipamiento
Relacionadas con el
Producto
Caracterizacin

BiotecnologaMapeo de Pptidos

BiotecnologaElectroforesis en
Gel de Poliacrilamida

BiotecnologaValoracin de
Protenas Totales
1065 Cromatografa Inica
1084 Anlisis de Glicoprotenas

y GlicanosConsideraciones
Generales
Captulos
Impurezas
Relacionadas con el
Proceso
1102 Mtodos de Pruebas InmunolgicasConsideraciones

Generales
1103 Mtodos de Pruebas InmunolgicasEnsayo por Inmunoadsorcin Ligado a Enzimas (ELISA)
1104 Mtodos de Pruebas InmunolgicasAnlisis por Inmunotransferencia
1105 Mtodos de Pruebas InmunolgicasResonancia de

Plasmn Superficial
1113 Caracterizacin, Identificacin y Tipificacin de Cepas

Microbianas
1121 Nomenclatura
1125 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosGeneralidades
1126 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosExtraccin, Deteccin y Secuenciacin
1127 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosAmplificacin
1128 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosMicromatrices
1129 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosGenotipificacin
1130 Tcnicas Basadas en cidos NucleicosEnfoques para

Detectar Trazas de cidos Nucleicos (Anlisis de ADN Residual)
1180 Plasma Humano
1181 Microscopa Electrnica

de Barrido
1211 Esterilizacin y Garanta

de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
1229 Esterilizacin de Artculos

Farmacopeicos
1229.4 Esterilizacin de Lquidos por Filtracin
1251 Pesada en una Balanza

Analtica
USP 38
Captulo
Descripcin
Identificacin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Equipamiento
Impurezas
Relacionadas con el
Proceso
Relacionadas con el
Producto
Caracterizacin
Diagrama 3a. ExcipientesPruebas Universales

Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
181 IdentificacinBases Orgnicas Nitrogenadas
191 IdentificacinPruebas Generales
197 Pruebas de Identificacin Espectrofotomtricas
201 Prueba de Identificacin por

Cromatografa en Capa Delgada
Valoracin
Orgnicas
Inorgnicas
211 Arsnico
221 Cloruros y Sulfatos
226 4-Epianhidrotetraciclina
228 xido de Etileno y Dioxano
231 Metales Pesados
241 Hierro
251 Plomo
261 Mercurio
291 Selenio
311 Valoracin de Alginatos
345 Valoracin de cido Ctrico/

Citrato y Fosfato
425 AntibiticosValoracin Yodomtrica
431 Determinacin de Grupos Metoxilo
471 Combustin en Matraz con

Oxgeno
541 Volumetra
621 Cromatografa

781 Rotacin ptica
Captulos
206 Aluminio
Disolventes
Residuales
USP 38
Diagrama 3a. ExcipientesPruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Orgnicas
801 Polarografa
941 Caracterizacin de Slidos

Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin de Rayos X sobre Polvo (DRXP)
1086 Impurezas en Frmacos y

Productos Farmacuticos
Inorgnicas
Disolventes
Residuales
1091 Etiquetado de Ingredientes

Inactivos
Diagrama 3b. ExcipientesPruebas Especficas
Captulos
Captulo
Caracterizacin
Fisicoqumica
Equipamiento
21 Termmetros
41 Balanzas
268 Porosidad Mediante

Adsorcin-Desorcin de Nitrgeno
Agua para Uso

Farmacutico1

429 Medicin del Tamao
de Partcula por Difraccin
de Luz
541 Volumetra
616 Densidad Aparente y

Densidad por Asentamiento
de los Polvos
641 Totalidad de la Disolucin
643 Carbono Orgnico Total
645 Conductividad del

Agua
651 Temperatura de Solidificacin
695 Cristalinidad
699 Densidad de Slidos
721 Intervalo de Destilacin
741 Intervalo o Temperatura de Fusin
781 Rotacin ptica
Ver Microbiologa (Diagrama 10).
Funcionalidad/
Seguridad/BPF
USP 38
Diagrama 3b. ExcipientesPruebas Especficas (Continuacin)

Captulo
Caracterizacin
Fisicoqumica
786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico
791 pH
Equipamiento
Agua para Uso

Farmacutico1
Funcionalidad/
Seguridad/BPF
801 Polarografa
811 Finura de Polvos
821 Radioactividad
841 Peso Especfico
846 rea Superficial Especfica
881 Resistencia a la Tensin
891 Anlisis Trmico
912 ViscosidadMtodos
Rotatorios
913 ViscosidadMtodo de
Bola Rodante
Captulos
911 ViscosidadMtodos
Capilar
941 Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin

de Rayos X sobre Polvo
(DRXP)
1045 Artculos Obtenidos

por Biotecnologa
1051 Limpieza de Material

de Vidrio
1059 Desempeo de Excipientes
1074 Guas para la Evaluacin de la Seguridad Biolgica de los Excipientes
1078 Buenas Prcticas de

Fabricacin para Excipientes
Farmacuticos a Granel
1080 Excipientes Farmacuticos a GranelCertificado

de Anlisis
1081 Consistencia del Gel

de Gelatina
1097 Procedimientos para

el Muestreo de Polvos a Granel
1119 Espectroscopa en el
Infrarrojo Cercano
1174 Fluidez de Polvos
1195 Gua sobre Cambios

Significativos en Excipientes
Farmacuticos a Granel
1197 Procedimientos para

el Muestreo de Polvos a Granel
1230 Agua para Uso en Hemodilisis

1
USP 38
Diagrama 3b. ExcipientesPruebas Especficas (Continuacin)

Captulo
Caracterizacin
Fisicoqumica
Equipamiento
Agua para Uso

Farmacutico1
1231 Agua para Uso Farmacutico
1644 Teora y Prctica de

Mediciones de Conductividad Elctrica de Soluciones
1761 Aplicaciones de la Espectroscopa de Resonancia

Magntica Nuclear
1911 Reometra
Funcionalidad/
Seguridad/BPF
Diagrama 4a. Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Universales

Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
Captulos
81 AntibiticosValoraciones
Microbiolgicas
Valoracin
Orgnicas
Inorgnicas
Generales
197 Pruebas de Identificacin

Espectrofotomtricas
201 Prueba de Identificacin

por Cromatografa en Capa
Delgada

Lmites

Procedimientos
341 Agentes AntimicrobianosContenido
351 Valoracin de Esteroides
361 Valoracin de Barbitricos
391 Valoracin de Epinefrina
413 Anlisis de Impurezas en

Gases Medicinales
415 Valoracin de Gases Medicinales

501 Sales de Bases Orgnicas
Nitrogenadas
541 Volumetra
611 Determinacin de Alcohol
621 Cromatografa
781 Rotacin ptica
Disolventes
Residuales
USP 38
Diagrama 4a. Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Universales (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Orgnicas
801 Polarografa
Inorgnicas
Disolventes
Residuales
1086 Impurezas en Frmacos y

Productos Farmacuticos
1121 Nomenclatura
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Especficas

Pruebas de Desempeo
Captulo
Equipamiento
Contenido
de Agua
Mucosa
Oftlmica1
Nasal
1 Inyectables
Parenteral
Oral
5 Medicamentos Nasales y
para InhalacinInformacin General y Pruebas de
Calidad del Producto
21 Termmetros
41 Balanzas
85 Prueba de Endotoxinas
Bacterianas
87 Pruebas de Reactividad
Biolgica, In Vitro
88 Pruebas de Reactividad
Biolgica, In Vivo
151 Prueba de Pirgenos
381 Tapones Elastomricos

para Inyectables
601 Medicamentos Nasales

y para Inhalacin: Pruebas
de Calidad de Desempeo
de Aerosoles, Atomizadores
y Polvos
602 Propelentes
603 Aerosoles Tpicos
604 Velocidad de Fuga
701 Desintegracin
711 Disolucin
724 Liberacin de Frmacos
729 Distribucin del Tamao de Glbulos en Emulsiones Inyectables de Lpidos

1
Captulos
3 Medicamentos Tpicos y
TransdrmicosPruebas de
Calidad del Producto
Inhalatoria
2 Medicamentos Orales
Pruebas de Calidad de Productos
541 Volumetra
Tpica
USP 38
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Especficas (Continuacin)

Pruebas de Desempeo
Captulo
Equipamiento
Contenido
de Agua
Mucosa
Oftlmica1
751 Partculas Metlicas en

Ungentos Oftlmicos
771 Ungentos Oftlmicos
Nasal
787 Partculas Subvisibles

en Inyectables de Protenas
Teraputicas
788 Partculas en Inyectables
789 Partculas en Soluciones Oftlmicas
891 Anlisis Trmico
905 Uniformidad de Unidades de Dosificacin
921 Determinacin de
Agua
1005 Emisin Acstica
1087 Disolucin Intrnseca

AparenteProcedimientos
de Pruebas de Disolucin
para Disco Rotatorio y Disco
Estacionario
1088 Evaluacin In Vivo e

In Vitro de Formas Farmacuticas
1090 Evaluacin de Desempeo del Producto FarmacuticoBiodisponibilidad,

Bioequivalencia y Disolucin
1092 Procedimiento de Disolucin: Desarrollo y Validacin
1094 CpsulasPruebas
de Disolucin y Atributos de
1113 Caracterizacin,
Identificacin y Tipificacin
de Cepas Microbianas
1216 Friabilidad de las Tabletas
1217 Fuerza de Ruptura de

las Tabletas
1229 Esterilizacin de Artculos Farmacopeicos
1229.2 Esterilizacin con

Calor Hmedo de Lquidos
Acuosos
1229.3 Monitoreo de la
Biocarga
1229.4 Esterilizacin de Lquidos por Filtracin
Tpica
Inhalatoria
791 pH

de Vidrio
Oral
790 Partculas Visibles en

Inyectables
Captulos
Parenteral
USP 38
Diagrama 4b. Medicamentos Activos No ComplejosPruebas Especficas (Continuacin)

Pruebas de Desempeo
Equipamiento
Captulo
Contenido
de Agua
Mucosa
Oftlmica1
Nasal
Parenteral
Oral
Tpica
Inhalatoria
1601 Productos para NebulizacinPruebas de Caracterizacin
1724 Medicamentos SemislidosPruebas de Desempeo
1788 Mtodos para la Determinacin de Partculas en

Inyectables y Soluciones Oftlmicas
1
Diagrama 5. Medicamentos de Sustancias Obtenidas por Biotecnologa

Impurezas
Caracterizacin
Equipamiento
1 Inyectables
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
21 Termmetros
41 Balanzas
61 Examen Microbiolgico de Productos

No Estriles: Pruebas

de Microorganismos
Especficos
90 Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
111 Diseo y Anlisis

de Valoraciones Biolgicas
121 Valoracin de Insulina
Relacionadas con el
Producto
Captulos
Captulo
Identificacin
Relacionadas
con el
Proceso
USP 38
Diagrama 5. Medicamentos de Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Continuacin)

Impurezas
Identificacin
Caracterizacin
121.1 Procedimientos
Analticos Fisicoqumicos para Insulinas
123 Pruebas de Identidad Biolgica de

Glucagn
Captulo
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Relacionadas
con el
Proceso
Relacionadas con el
Producto
130 Atributos de Calidad de la Protena A
Captulos
191 Identificacin
Pruebas Generales
208 Valoracin de
Anti-Factor Xa y Anti-Factor IIa para Heparinas No Fraccionadas
y Heparinas de Bajo
Peso Molecular
231 Metales Pesados
503 cido Actico en

Pptidos
541 Volumetra
621 Cromatografa
660 EnvasesVidrio
661 EnvasesPlsticos
671 EnvasesPruebas de Desempeo
695 Cristalinidad
726 Electroforesis
730 Espectroqumica
de Plasma
736 Espectrometra
de Masas
761 Espectroscopa
781 Rotacin ptica

785 Osmolalidad y
Osmolaridad
USP 38

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
786 Estimacin de la
Distribucin del Tamao de Partcula por
Tamizado Analtico
791 pH
921 Determinacin
de Agua
1024 Suero Bovino
1032 Diseo y Desarrollo de Valoraciones

Biolgicas
1033 Validacin de
1034 Anlisis de Valoraciones Biolgicas
Captulos
1030 Captulos de
Valoraciones BiolgicasInformacin General y Glosario

1045 Artculos Obtenidos por Biotecnologa
Relacionadas con el
Producto

Luz
Fisicoqumica
Relacionadas
con el
Proceso
1050 Evaluacin de
la Seguridad Viral en
Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal
1052 Artculos Obtenidos por BiotecnologaAnlisis de Aminocidos
1053 Electroforesis
Capilar
1054 Artculos Obtenidos por BiotecnologaIsoelectroenfoque
1055 Artculos Obtenidos por BiotecnologaMapeo de Pptidos
1056 Artculos Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en

USP 38

Impurezas
Captulo
1057 Artculos Obtenidos por BiotecnologaValoracin de
Protenas Totales
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Relacionadas
con el
Proceso
1065 Cromatografa
Inica
1084 Anlisis de Glicoprotenas y GlicanosConsideraciones

Generales
Captulos
Relacionadas con el
Producto
1102 Mtodos de
Pruebas InmunolgicasConsideraciones
Generales
1103 Mtodos de
Pruebas InmunolgicasEnsayo por Inmunoadsorcin Ligado a Enzimas (ELISA)
1104 Mtodos de
Pruebas InmunolgicasAnlisis por Inmunotransferencia
1105 Mtodos de
Pruebas InmunolgicasResonancia de
Plasmn Superficial
1106 Ensayos de InmunogenicidadDiseo y Validacin de

Inmunoensayos para
Detectar Anticuerpos
Antifrmacos

No Estriles: Criterios
de Aceptacin para
Preparaciones Farmacuticas y Sustancias
de Uso Farmacutico
1113 Caracterizacin, Identificacin y

Tipificacin de Cepas
Microbianas
1121 Nomenclatura
USP 38

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Fisicoqumica

Detectar Trazas de
cidos Nucleicos
(Anlisis de ADN Residual)
Relacionadas con el
Producto
1181 Microscopa
Electrnica de Barrido
1229 Esterilizacin de
Artculos Farmacopeicos
1229.4 Esterilizacin
de Lquidos por Filtracin
1251 Pesada en una

Balanza Analtica
Captulos
1211 Esterilizacin y
Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
1761 Aplicaciones de
la Espectroscopa de
Resonancia Magntica Nuclear
Valoracin
Relacionadas
con el
Proceso
Fisicoqumica
Relacionadas
con el
Proceso
Diagrama 6. Vacunas
Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
1 Inyectables
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
21 Termmetros
41 Balanzas
90 Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
Relacionadas con el
Producto
USP 38
Diagrama 6. Vacunas (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Identificacin
111 Diseo y Anlisis

Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
660 EnvasesVidrio
661 EnvasesPlsticos
726 Electroforesis
Valoracin
Fisicoqumica
621 Cromatografa
Captulos
Caracterizacin
Relacionadas
con el
Proceso
Relacionadas con el
Producto
736 Espectrometra
de Masas
761 Espectroscopa
786 Estimacin de la
Distribucin del Tamao de Partcula por
Tamizado Analtico
787 Partculas Subvisibles en Inyectables

de Protenas Teraputicas
791 pH

Luz
921 Determinacin
de Agua
1024 Suero Bovino
1030 Captulos de

Biolgicas
1033 Validacin de

USP 38

Impurezas
Fisicoqumica
1053 Electroforesis
Capilar


Protenas Totales
Identificacin
Caracterizacin
Captulo
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
1065 Cromatografa
Inica
Relacionadas con el
Producto
Captulos
Valoracin
Relacionadas
con el
Proceso
1084 Anlisis de Glicoprotenas y GlicanosConsideraciones

Generales
1102 Mtodos de
Generales
1103 Mtodos de
1104 Mtodos de
1105 Mtodos de
Plasmn Superficial

Microbianas
1121 Nomenclatura
USP 38

Impurezas
Identificacin
Caracterizacin
Captulo
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Captulos
1237 Mtodos de
Pruebas Virolgicas
1238 Vacunas para
Uso HumanoVacunas Bacterianas
Seguridad
Valoracin
Fisicoqumica
Relacionadas
con el
Proceso
Relacionadas con el
Producto
1251 Pesada en una

Balanza Analtica
1660 Envases de VidrioEvaluacin de la

Durabilidad de la Superficie Interna
la Espectroscopa de
Relacionadas con el
Producto

Detectar Trazas de
cidos Nucleicos
1235 Vacunas para

Uso HumanoConsideraciones Generales
Relacionadas
con el
Proceso
Diagrama 7. Sangre y Hemoderivados

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
1 Inyectables
Pruebas
Misc.
Descripcin
21 Termmetros
41 Balanzas
USP 38
Diagrama 7. Sangre y Hemoderivados (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad


de Microorganismos
Especficos
111 Diseo y Anlisis

208 Valoracin de
Anti-Factor Xa y Anti-Factor IIa para Heparinas No Fraccionadas
y Heparinas de Bajo
Peso Molecular
660 EnvasesVidrio
661 EnvasesPlsticos
695 Cristalinidad
726 Electroforesis
Relacionadas con el
Producto
191 Identificacin
Pruebas Generales
621 Cromatografa
Fisicoqumica
Captulos
51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana
Valoracin
Relacionadas
con el
Proceso
736 Espectrometra
de Masas
761 Espectroscopa
USP 38

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
Valoracin
785 Osmolalidad y
Osmolaridad
787 Partculas Subvisibles en Inyectables

de Protenas Teraputicas
791 pH
Luz
Fisicoqumica
921 Determinacin
de Agua
Captulos
Relacionadas
con el
Proceso
1030 Captulos de

Biolgicas
1033 Validacin de
1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin
1053 Electroforesis
Capilar

Relacionadas con el
Producto
USP 38

Impurezas
Descripcin
Seguridad
Fisicoqumica
Relacionadas con el
Producto

Protenas Totales
1065 Cromatografa
Inica
1102 Mtodos de
Generales
1103 Mtodos de
1104 Mtodos de

No Estriles: Criterios
de Aceptacin para
Preparaciones Farmacuticas y Sustancias
de Uso Farmacutico

Microbianas
1116 Control Microbiolgico y Monitoreo

de Ambientes de Procesamiento Asptico
1121 Nomenclatura

Detectar Trazas de
cidos Nucleicos
1180 Plasma Humano
Captulos
Caracterizacin
1105 Mtodos de
Plasmn Superficial
Pruebas
Misc.
Valoracin
Identificacin
Captulo
Equipamiento
Relacionadas
con el
Proceso
USP 38

Impurezas
Captulo
Identificacin
Caracterizacin
Equipamiento
Pruebas
Misc.
Descripcin
Seguridad
1237 Mtodos de
Pruebas Virolgicas
1251 Pesada en una

Balanza Analtica
Fisicoqumica
Relacionadas con el
Producto

la Espectroscopa de
Valoracin
Relacionadas
con el
Proceso
Captulos
Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos

Pruebas Especficas1,2
Pruebas Universales
Captulo
Identificacin
Valoracin
Biocompatibilidad
Cuestiones Microbiolgicas y de
Esterilidad
1 Inyectables
Cuestiones
de
Produccin
Cuestiones del
Producto
Equipamiento
21 Termmetros
41 Balanzas
61 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
62 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos
90 Suero Fetal Bovino

Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad
1
2
Para la prueba de Funcionalidad, ver 861 Resistencia a la Tensin.

Para la prueba de Agua, ver 1231 Agua para Uso Farmacutico.
Caracterizacin
USP 38
Diagrama 8. Productos Derivados de Clulas, Genes y Tejidos (Continuacin)

Pruebas Universales
Captulo
Identificacin
Valoracin
Biocompatibilidad
Esterilidad
92 Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la Fabricacin de

Productos de Terapia Celular
Cuestiones
de
Produccin
Cuestiones del
Producto
Equipamiento
Caracterizacin
111 Diseo y Anlisis de

161 Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos Similares
381 Tapones Elastomricos para Inyectables
726 Electroforesis
787 Partculas Subvisibles en Inyectables de

Protenas Teraputicas
791 pH
797 Preparacin MagistralPreparaciones Estriles
905 Uniformidad de
Unidades de Dosificacin
911 ViscosidadMtodos Capilares
912 ViscosidadMtodos Rotatorios
913 ViscosidadMtodo de Bola Rodante
1024 Suero Bovino
1027 Citometra de Flujo

1030 Captulos de Valoraciones BiolgicasInformacin General y Glosario
1031 Biocompatibilidad
de los Materiales Usados
en Envases de Medicamentos, Dispositivos Mdicos e Implantes
1032 Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas
1033 Validacin de Valoraciones Biolgicas
1
2

Captulos
621 Cromatografa
USP 38

Pruebas Universales
Captulo
Valoracin
Biocompatibilidad
Cuestiones
de
Produccin
1043 Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Gnicos y de Ingeniera Tisular
Cuestiones del
Producto
Equipamiento
Caracterizacin
1044 Crioconservacin
de Clulas
Captulos
Identificacin
Esterilidad
1046 Productos Derivados de Clulas y Tejidos
1047 Productos de Terapia Gnica
1048 Calidad de Productos Biotecnolgicos:

Anlisis de la Construccin Expresable en Clulas Usadas para la Produccin de Productos
Protenicos Obtenidos
con ADN Recombinante
1049 Calidad de Productos Biotecnolgicos:

Pruebas de Estabilidad
de Productos Biotecnolgicos o Biolgicos
1050 Evaluacin de la
Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos
Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal
1051 Limpieza de Material de Vidrio

Anlisis de Aminocidos

Isoelectroenfoque

Mapeo de Pptidos

Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida

Valoracin de Protenas
Totales
1
2

USP 38

Pruebas Universales
Captulo
Identificacin
Valoracin
Biocompatibilidad
Esterilidad
1074 Guas para la Evaluacin de la Seguridad

Biolgica de los Excipientes
Cuestiones
de
Produccin
Cuestiones del
Producto
Equipamiento
Caracterizacin
1084 Anlisis de Glicoprotenas y Glicanos

Consideraciones Generales
1103 Mtodos de Pruebas InmunolgicasEnsayo por Inmunoadsorcin Ligado a Enzimas

(ELISA)
1104 Mtodos de Pruebas Inmunolgicas

Anlisis por Inmunotransferencia
Identificacin y Tipificacin de Cepas Microbianas
1116 Control Microbiolgico y Monitoreo de

Ambientes de Procesamiento Asptico
1121 Nomenclatura
1126 Tcnicas Basadas

en cidos NucleicosExtraccin, Deteccin y Secuenciacin

en cidos Nucleicos
Amplificacin

en cidos NucleicosMicromatrices

en cidos Nucleicos
Genotipificacin

en cidos NucleicosEnfoques para Detectar
Trazas de cidos Nucleicos (Anlisis de ADN Residual)

1184 Pruebas de Sensibilizacin
1
2

Captulos
1102 Mtodos de Pruebas Inmunolgicas

USP 38

Pruebas Universales
Captulos
Captulo
Identificacin
Valoracin
Biocompatibilidad
Esterilidad
1208 Pruebas de EsterilidadValidacin de Sistemas Aisladores
Garanta de Esterilidad
de Artculos Farmacopeicos
1227 Validacin de Recuperacin Microbiana

en Artculos Farmacopeicos
Biocarga
1229.4 Esterilizacin de
Lquidos por Filtracin
1237 Mtodos de Pruebas Virolgicas
Cuestiones
de
Produccin
Cuestiones del
Producto
Equipamiento
Caracterizacin
1285 Preparacin de
Muestras Biolgicas para
Anlisis Histolgico e Inmunohistoqumico
1285.1 Tincin con Hematoxilina y Eosina de

Cortes de Tejidos para
Examen Microscpico
1
2

Diagrama 9. Distribucin de Medicamentos

Captulo
Fabricante
Transportista
Mayorista
Distribucin
de Muestras
Reenvasador
17 Etiquetado de Envases de
Medicamentos de Venta Bajo
Receta Mdica
Farmacia
381 Tapones Elastomricos para Inyectables
659 Requisitos de Envasado y

Almacenamiento
660 EnvasesVidrio
661 EnvasesPlsticos
670 EnvasesComponentes
Auxiliares
698 Volumen de Entrega
Mdico
USP 38
Diagrama 9. Distribucin de Medicamentos (Continuacin)

Captulo
Fabricante
755 Llenado Mnimo
Transportista
Distribucin
de Muestras
Mayorista
Reenvasador
Farmacia
Mdico
1066 Ambientes Fsicos que

Promueven el Uso Seguro de los
Medicamentos
1079 Buenas Prcticas de Almacenamiento y Distribucin
para Medicamentos
1118 Dispositivos de MonitoreoTiempo, Temperatura y

Humedad
1136 Envasado y ReenvasadoEnvases Unitarios
1177 Buenas Prcticas de Envasado
1178 Buenas Prcticas de

Reenvasado
1265 Informacin Escrita de los

Medicamentos Recetados
Guas
1660 Envases de VidrioEvaluacin de la Durabilidad de la
Superficie Interna
Diagrama 10a. MicrobiologaProductos No Estriles

Captulo
Recuento Microbiano
61 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
Ausencia de Microorganismos
Objetables
62 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos
610 Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estriles
1111 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles:

Criterios de Aceptacin para Preparaciones Farmacuticas y
Sustancias de Uso Farmacutico
1113 Caracterizacin, Identificacin y Tipificacin de Cepas Microbianas
2021 Pruebas de Recuento MicrobianoSuplementos Nutricionales y Dietticos
2022 Procedimientos Microbiolgicos para Comprobar la

Ausencia de Microorganismos EspecficosSuplementos
Nutricionales y Dietticos
2023 Atributos Microbiolgicos de los Suplementos Nutricionales y Dietticos No Estriles
Diagrama 10b. MicrobiologaProductos Estriles1
Captulo
Pruebas de
Esterilidad
Micoplasma
Procesamiento
Asptico
Montaje2
Filtracin
Montaje
Otros
Esterilizacin Final
Esterilizacin
Final
55 Indicadores BiolgicosPruebas de Resistencia

1
2
Para los lmites de endotoxinas, ver 85 Prueba de Endotoxinas Bacterianas.

Para BFS, FFS y SFS, ver 1116 Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico.
Calor
Hmedo
Calor
Seco
Radiacin
xido
de Etileno
Captulos
1191 Consideraciones sobre

Estabilidad en la Prctica de
Dispensacin
USP 38
Diagrama 10b. MicrobiologaProductos Estriles1 (Continuacin)
Captulo
Pruebas de
Esterilidad

Micoplasma
Procesamiento
Asptico
Montaje2
Filtracin
Montaje
Otros
Esterilizacin Final
Esterilizacin
Final
1112 Determinacin de
Actividad de Agua en Productos Farmacuticos No
Estriles
Captulos
1116 Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento

Asptico
1117 ptimas Prcticas

de Laboratorio Microbiolgico
1207 Envasado de Productos EstrilesEvaluacin de Integridad
1209 EsterilizacinIndicadores e Integradores

Qumicos y Fisicoqumicos
1222 Productos Farmacuticos con Esterilizacin

TerminalLiberacin Paramtrica

Vapor de Agua por Contacto Directo

Calor Hmedo de Lquidos
Acuosos
Biocarga
1229.7 Esterilizacin por

Gases
1
2
1223 Validacin de Mtodos Microbiolgicos Alternativos

1229 Esterilizacin de Artculos Farmacopeicos
xido
de Etileno
1072 Desinfectantes y Antispticos
1211 Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
Radiacin
1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin
1208 Pruebas de EsterilidadValidacin de Sistemas Aisladores
Calor
Seco
Identificacin y Tipificacin
de Cepas Microbianas
Calor
Hmedo

USP 38
Diagrama 10b. MicrobiologaProductos Estriles1 (Continuacin)
Captulo
Pruebas de
Esterilidad
Micoplasma
Procesamiento
Asptico
Montaje2
Filtracin
Montaje
Otros
Esterilizacin Final
Esterilizacin
Final
Calor
Hmedo
Calor
Seco

Calor Seco
xido
de Etileno

Radiacin
1
2
Radiacin

Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos Dietticos

No
Botnicos1,2
Botnicos
Captulo
Descripcin
Identificacin
Contenido
Seguridad/
Pureza
Caracterizacin
Fisicoqumica
Otro
Valoracin de
Vitaminas3
171 Valoracin de Actividad de Vitamina B12
201 Prueba de Identificacin por

211 Arsnico
231 Metales Pesados
251 Plomo
261 Mercurio
Captulos
91 Valoracin de Pantotenato de
Calcio
411 Valoracin de cido Flico
441 Valoracin de Niacina o Niacinamida
531 Valoracin de Tiamina
541 Volumetra
551 Valoracin de Vitamina E
561 Artculos de Origen Botnico
563 Identificacin de Artculos de

Origen Botnico
565 Extractos Botnicos
571 Valoracin de Vitamina A
581 Valoracin de Vitamina D
591 Determinacin de Cinc
611 Determinacin de Alcohol
621 Cromatografa
735 Espectrometra de Fluorescencia

de Rayos X
761 Espectroscopa de Resonancia

Magntica Nuclear

1
2
3
Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Diagrama 2).

Para Minerales, Aminocidos y Metabolitos no complejos, ver Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
Ver tambin Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
USP 38
Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos Dietticos (Continuacin)

No
Botnicos1,2
Botnicos
Captulo
Descripcin
Identificacin
Contenido
851 Espectrofotometra y Dispersin

de Luz
Seguridad/
Pureza
Caracterizacin
Fisicoqumica
1113 Caracterizacin, Identificacin

y Tipificacin de Cepas Microbianas
1181 Microscopa Electrnica de Barrido
2021 Pruebas de Recuento MicrobianoSuplementos Nutricionales y

Dietticos
2022 Procedimientos Microbiolgicos para Comprobar la Ausencia de

Microorganismos EspecficosSuplementos Nutricionales y Dietticos
2023 Atributos Microbiolgicos de

los Suplementos Nutricionales y Dietticos No Estriles
2030 Informacin Complementaria

para Artculos de Origen Botnico
2232 Contaminantes Elementales

en Suplementos Dietticos
1
2
3
Valoracin de
Vitaminas3
Captulos
Otro
Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnologa (Diagrama 2).

Para Minerales, Aminocidos y Metabolitos no complejos, ver Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
Ver tambin Frmacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietticos

Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
Valoracin/
Contenido
Orgnicas
Inorgnicas
21 Termmetros
Disolventes Residuales
Equipamiento
Pruebas
de Desempeo
Seguridad/
Pureza
41 Balanzas
91 Valoracin de Pantotenato de Calcio
171 Valoracin de Actividad

de Vitamina B12
Generales
201 Prueba de Identificacin por Cromatografa en

Capa Delgada
211 Arsnico
231 Metales Pesados
251 Plomo
261 Mercurio

411 Valoracin de cido Flico
USP 38
Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietticos (Continuacin)

Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Impurezas
Captulo
Descripcin
Identificacin
441 Valoracin de Niacina

o Niacinamida
Valoracin/
Contenido
Orgnicas
Inorgnicas
Equipamiento
Pruebas
de Desempeo
531 Valoracin de Tiamina
541 Volumetra
551 Valoracin de Vitamina

E
561 Artculos de Origen Botnico
563 Identificacin de Artculos de Origen Botnico
565 Extractos Botnicos

D
621 Cromatografa
730 Espectroqumica de
Plasma
Captulos

A
781 Rotacin ptica
801 Polarografa
851 Espectrofotometra y
Dispersin de Luz

de Vidrio
1094 CpsulasPruebas de
Disolucin y Atributos de
1113 Caracterizacin, Identificacin y Tipificacin de

Cepas Microbianas
1216 Friabilidad de las Tabletas

2021 Pruebas de Recuento
MicrobianoSuplementos
Seguridad/
Pureza
USP 38
Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietticos (Continuacin)

Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Impurezas
Descripcin
Captulos
Captulo
Valoracin/
Contenido
Identificacin
Orgnicas
Inorgnicas
Equipamiento
Pruebas
de Desempeo
Seguridad/
Pureza
2022 Procedimientos Microbiolgicos para Comprobar

la Ausencia de Microorganismos EspecficosSuplementos Nutricionales y Dietticos
2023 Atributos Microbiolgicos de los Suplementos

No Estriles
2030 Informacin Complementaria para Artculos de

Origen Botnico
2040 Desintegracin y Disolucin de Suplementos

Dietticos
2091 Variacin de Peso de

Suplementos Dietticos
2232 Contaminantes Elementales en Suplementos

Dietticos
2750 Prcticas de Fabricacin para Suplementos Dietticos
Diagrama 13. Preparacin Magistral

Impurezas
Captulo
Global
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Envasado
Caracterizacin Fisicoqumica
Seguridad
Equipamiento
21 Termmetros
41 Balanzas
61 Examen Microbiolgico de Productos No

Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
62 Examen Microbiolgico de Productos No

Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos
Relacionadas
con el
Proceso
Relacionadas
con el
Producto
USP 38
Diagrama 13. Preparacin Magistral (Continuacin)

Impurezas
Captulo
Global
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Envasado
Seguridad
Equipamiento
111 Diseo y Anlisis

191 Identificacin
Pruebas Generales
201 Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada
Relacionadas
con el
Proceso
Relacionadas
con el
Producto
231 Metales Pesados
541 Volumetra
621 Cromatografa
660 EnvasesVidrio
661 EnvasesPlsticos
671 EnvasesPruebas
de Desempeo
726 Electroforesis
Captulos
730 Espectroqumica de
Plasma
736 Espectrometra de
Masas
761 Espectroscopa de
Resonancia Magntica
Nuclear
781 Rotacin ptica
786 Estimacin de la
Distribucin del Tamao
de Partcula por Tamizado Analtico
795 Preparacin MagistralPreparaciones No

Estriles
797 Preparacin MagistralPreparaciones Estriles
823 Frmacos para Tomografa de Emisin de

Positrones para Uso en
Preparaciones Magistrales, Investigacin Clnica
y Estudios Cientficos

851 Espectrofotometra
y Dispersin de Luz
921 Determinacin de
Agua
1015 Aparatos Automatizados de Sntesis
Radioqumica
USP 38

Impurezas
Equipamiento
Relacionadas
con el
Proceso

Anlisis de Aminocidos

Isoelectroenfoque

Mapeo de Pptidos

Electroforesis en Gel de
Poliacrilamida

Valoracin de Protenas
Totales
Captulo
Global
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Envasado
Captulos
1031 Biocompatibilidad
de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos
Mdicos e Implantes
Seguridad
1066 Ambientes Fsicos

que Promueven el Uso
Seguro de los Medicamentos
Identificacin y Tipificacin de Cepas Microbianas
1121 Nomenclatura
1136 Envasado y ReenvasadoEnvases Unitarios
1160 Clculos Farmacuticos en la Preparacin Magistral de Prescripciones
1163 Garanta de Calidad en la Preparacin

Magistral
1176 Balanzas y Aparatos Volumtricos para

Prescripciones
1191 Consideraciones
sobre Estabilidad en la
Prctica de Dispensacin
Relacionadas
con el
Producto
USP 38

Impurezas
Captulo
Global
Descripcin
Identificacin
Valoracin
Envasado
Seguridad
con Calor Hmedo de
Lquidos Acuosos
Biocarga
por Gases
por Calor Seco
por Radiacin
1231 Agua para Uso

Farmacutico

1761 Aplicaciones de la
Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear
1251 Pesada en una

Balanza Analtica
1265 Informacin Escrita de los Medicamentos
RecetadosGuas
Relacionadas
con el
Producto
Captulos
Equipamiento
Relacionadas
con el
Proceso
52 Gua para los Captulos Generales
USP 38
Gua para los Captulos

Generales
(Para obtener la lista alfabetica completa de los captulos generales de esta Farmacopea, consulte Captulos Generales en el
ndice.)
Captulos
PRUEBAS Y VALORACIONES GENERALES

Requisitos Generales para
Pruebas y Valoraciones
1 Inyectables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2 Medicamentos OralesPruebas de Calidad de
Productos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3 Medicamentos Topicos
y TransdermicosPruebas de
Calidad del Producto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4 Medicamentos para MucosasPruebas de Calidad . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5 Medicamentos Nasales y para Inhalacion
Informacion
General y Pruebas de Calidad del
Producto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
7 Etiquetado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
11 Estandares de Referencia USP . . . . . . . . . . . . . . 101

17 Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta
Bajo Receta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
21 Termometros
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
31 Aparatos Volumetricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
41 Balanzas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana . . . . . . . . . . 109

55 Indicadores BiologicosPruebas
de Resistencia . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
61 Examen Microbiologico
de Productos No Esteriles:
Pruebas de Recuento Microbiano . . . . . . . . . . 115
de Productos No Esteriles:
Pruebas de Microorganismos Especficos . . . . . 122
63 Pruebas para Micoplasmas . . . . . . . . . . . . . . . . 130
71 Pruebas de Esterilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
81
85
87
88
89
AntibioticosValoraciones
Microbiologicas
. . . . 144
Prueba de Endotoxinas Bacterianas . . . . . . . . . . 163
Pruebas de Reactividad Biologica,
In Vitro . . . . . 169
Pruebas de Reactividad Biologica,
In Vivo . . . . . 171
Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en
la Fabricacion
de Productos Farmaceuticos . . . . 177
90 Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad . . . . . . . . . . . . . . . . 180
91 Valoracion
de Pantotenato de Calcio . . . . . . . . . 184
92 Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la
Fabricacion
de Productos de Terapia Celular . . . 186
111 Dise
no y Analisis de Valoraciones Biologicas
.
115 Valoracion
de Dexpantenol . . . . . . . . . . . . .
121 Valoracion
de Insulina . . . . . . . . . . . . . . . .
121.1 Procedimientos Analticos Fisicoqumicos
para Insulinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
de Glucagon
124 Valoraciones Biologicas
de Eritropoyetina . . .
de Somatropina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
130 Atributos de Calidad de la Protena A . . . . .
151 Prueba de Pirogenos
.................
161 Equipos para Transfusion
e Infusion
y
Dispositivos Medicos Similares . . . . . . . . .
171 Valoracion
de Actividad de Vitamina B12 . . .
. . 190
. . 207
. . 208
. . 211
. . 213
. . 216
. . 218
. . 220
. . 228
. . 229
. . 230

Pruebas de Identificacion
181 IdentificacionBases
Organicas Nitrogenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
191 IdentificacionPruebas
Generales . . . . . . . . . .
193 IdentificacionTetraciclinas
..............
197 Pruebas de Identificacion
Espectrofotometrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
201 Prueba de Identificacion
por Cromatografa en
Capa Delgada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
233
233
237
237
239
Pruebas de Lmite
206 Aluminio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
207 Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de
Enoxaparina Sodica
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
208 Valoracion
de Actividad Anti-Factor Xa y Anti-Factor
IIa para Heparinas No Fraccionadas y de Bajo
Peso Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
209 Determinaciones de Peso Molecular de
Heparinas de Bajo Peso Molecular . . . . . . . . . 250
211 Arsenico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
221 Cloruros y Sulfatos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
223 Dimetilanilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
226 4-Epianhidrotetraciclina . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
227 4-Aminofenol en Medicamentos que Contienen
Acetaminofeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
228 Oxido
de Etileno y Dioxano . . . . . . . . . . . . . . 257
231 Metales Pesados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260
232 Impurezas ElementalesLmites . . . . . . . . . . . 262
233 Impurezas ElementalesProcedimientos . . . . . 265
241 Hierro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
251 Plomo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
261 Mercurio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
267 Porosimetra por Intrusion
de Mercurio . . . . . . 274
USP 38
Gua para los Captulos Generales 53
268 Porosidad Mediante Adsorcion-Desorci
on
de Nitrogeno
...................
271 Prueba para Sustancias Facilmente Carbonizables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
281 Residuo de Incineracion
.............
291 Selenio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 277
. . . . 281
. . . . 281
. . . . 282
Otras Pruebas y Valoraciones

301
311
341
345
351
361
371
381
391
401
411
413
415
425
429
471
481
501
503
511
525
531
541
551
561
563
565
571
581
591

601 Medicamentos Nasales y para Inhalacion:
Pruebas de Calidad de Desempe

no
de Aerosoles, Atomizadores y Polvos . . . .
602 Propelentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
603 Aerosoles Topicos
..................
604 Velocidad de Fuga . . . . . . . . . . . . . . . . . .
610 Metodos de Muestreo Microbiologico
Alternativos para Productos Nasales

e Inhaladores No Esteriles . . . . . . . . . . . .
611 Determinacion
de Alcohol . . . . . . . . . . . .
616 Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los Polvos . . . . . . . . . . . . . . .
621 Cromatografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
631 Color y Acromatismo . . . . . . . . . . . . . . . .
641 Totalidad de la Disolucion
............
643 Carbono Organico Total . . . . . . . . . . . . . .
645 Conductividad del Agua . . . . . . . . . . . . . .
651 Temperatura de Solidificacion
..........
660 EnvasesVidrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
661 EnvasesPlasticos . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
416
442
444
445
. . . 445
. . . 447
.
.
.
.
.
.
.
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
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.
449
453
464
465
466
467
471
472
481
487
697
698
699
701
705
711
721
724
729
730
731
733
735
736
741
751
755
761
771
776
781
785
786
787
788
789
790
791
795
797
801
811
821
823
831
841
846
851
852
853
854
857
861
871
881
891
905
911
912
913
921
941
EnvasesComponentes Auxiliares . . . . . . . . . . 494

EnvasesPruebas de Desempe
no . . . . . . . . . . 497
Algodon
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
Cristalinidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507
Caracterizacion
de Solidos
Cristalinos por Microcalorimetra y Calorimetra de Disolucion

. . . . 507
Contenido en Envases para Inyectables . . . . . . 510
Volumen de Entrega . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 511
Densidad de Solidos
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
Desintegracion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516
Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo
Etiquetado Indica Ranurado Funcional . . . . . . 519
Disolucion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 520
Intervalo de Destilacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . 531
Liberacion
de Farmacos . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Distribucion
del Tama
no de Globulos
en Emulsiones Inyectables de Lpidos . . . . . . . . . . . . 538

Espectroqumica de Plasma . . . . . . . . . . . . . . 541
Perdida por Secado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549
Perdida por Incineracion
. . . . . . . . . . . . . . . . 549
Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X . . 550
Espectrometra de Masas . . . . . . . . . . . . . . . . 555
Intervalo o Temperatura de Fusion
. . . . . . . . . 561
Partculas Metalicas en Unguentos
Oftalmicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
Llenado Mnimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
Espectroscopa de Resonancia Magnetica
Nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 565
Unguentos Oftalmicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575
Microscopa Optica
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575
Rotacion
Optica
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 578
Osmolalidad y Osmolaridad . . . . . . . . . . . . . . 579
Estimacion
de la Distribucion
del Tama
no de
Partcula por Tamizado Analtico . . . . . . . . . . 582
Partculas Subvisibles en Inyectables de
Protenas Terapeuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . 586
Partculas en Inyectables . . . . . . . . . . . . . . . . 589
Partculas en Soluciones Oftalmicas . . . . . . . . . 593
Partculas Visibles en Inyectables . . . . . . . . . . . 594
pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595
Preparacion
MagistralPreparaciones No
Esteriles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 599
Preparacion
MagistralPreparaciones
Esteriles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608
Polarografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 657
Finura de Polvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 661
Radioactividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 662
Farmacos para Tomografa de Emision
de Positrones para Uso en Preparaciones Magistrales,
Investigacion
Clnica y Estudios Cientficos . . . 674
Indice de Refraccion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 684
Peso Especfico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 685
Area
Superficial Especfica . . . . . . . . . . . . . . . . 686
Espectrofotometra y Dispersion
de Luz . . . . . . 690
Espectroscopa de Absorcion
Atomica
. . . . . . . 698
Espectroscopa de Fluorescencia . . . . . . . . . . . 702
Espectroscopa en el Infrarrojo Medio . . . . . . . 709
Espectroscopa Ultravioleta-Visible . . . . . . . . . . 713
SuturasDiametro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 720
SuturasSujecion
de Agujas . . . . . . . . . . . . . . 721
Resistencia a la Tension
. . . . . . . . . . . . . . . . . 722
Analisis Termico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723
Uniformidad de Unidades de Dosificacion
. . . . 727
ViscosidadMetodos Capilares . . . . . . . . . . . . 731
ViscosidadMetodos Rotatorios . . . . . . . . . . . 733
ViscosidadMetodo de Bola Rodante . . . . . . . 738
Determinacion
de Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . 740
Caracterizacion
de Solidos
Cristalinos
y Parcialmente Cristalinos por Difraccion
de Rayos X sobre Polvo (DRXP) . . . . . . . . . . . 744
GENERAL
INFORMACION
1005 Emision
Acustica
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 752
Captulos
431
441
451
461
466
467
469
Capacidad Neutralizante de Acido

. . . . . . . . . 282
Valoracion
de Alginatos . . . . . . . . . . . . . . . . . 284
Agentes AntimicrobianosContenido . . . . . . . 285
Valoracion
de Acido
Ctrico/Citrato y Fosfato . . 288
Valoracion
de Esteroides . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
Valoracion
de Barbituricos
. . . . . . . . . . . . . . . 289
Valoracion
de Cobalamina con Marcador
Radioactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Tapones Elastomericos para Inyectables . . . . . . 291
Valoracion
de Epinefrina . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
Grasas y Aceites Fijos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
Valoracion
de Acido
Folico
. . . . . . . . . . . . . . . 313
Analisis de Impurezas en Gases Medicinales . . . 313
Valoracion
de Gases Medicinales . . . . . . . . . . . 314
AntibioticosValoraci
on
Yodometrica . . . . . . . 317
Medicion
del Tama
no de Partcula por Difraccion
de Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
Determinacion
de Grupos Metoxilo . . . . . . . . 323
Valoracion
de Niacina o Niacinamida . . . . . . . 325
Volumetra con Nitrito . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330
Determinacion
de Nitrogeno
. . . . . . . . . . . . . 330
Impurezas Comunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
Disolventes Residuales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol
en Sustancias Etoxiladas . . . . . . . . . . . . . . . . 348
Combustion
en Matraz con Oxgeno . . . . . . . 350
Valoracion
de Riboflavina . . . . . . . . . . . . . . . . 350
Sales de Bases Organicas Nitrogenadas . . . . . . 351
Acido
Acetico en Peptidos . . . . . . . . . . . . . . . 352
Valoracion
de un Esteroide Aislado . . . . . . . . . 352
Dioxido
de Azufre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353
Valoracion
de Tiamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358
Volumetra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
Valoracion
de Vitamina E . . . . . . . . . . . . . . . . 362
Artculos de Origen Botanico . . . . . . . . . . . . . 370
Identificacion
de Artculos de Origen
Botanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
Extractos Botanicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397
Valoracion
de Vitamina A . . . . . . . . . . . . . . . . 400
Valoracion
de Vitamina D . . . . . . . . . . . . . . . . 405
Determinacion
de Cinc . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
670
671
691
695
696
Captulos
54 Gua para los Captulos Generales

1010 Datos AnalticosInterpretacion
y Tratamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 756
1015 Aparatos Automatizados de Sntesis
Radioqumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 772
1024 Suero Bovino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 774
1027 Citometra de Flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 788
1030 Captulos de Valoraciones BiologicasInfor
macion
General y Glosario . . . . . . . . . . . . . 806
1031 Biocompatibilidad de los Materiales Usados en
Envases de Medicamentos, Dispositivos
Medicos e Implantes . . . . . . . . . . . . . . . . . 818
1032 Dise
no y Desarrollo de Valoraciones Biolo
gicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 829
1033 Validacion
de Valoraciones Biologicas
. . . . . . 849
1034 Analisis de Valoraciones Biologicas
. . . . . . . . . 866
1035 Indicadores Biologicos
para Esterilizacion
. . . . 880
1041 Productos Biologicos
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 885
1043 Materiales Auxiliares para Productos Celulares,
Genicos y de Ingeniera Tisular . . . . . . . . . . 886
1044 Crioconservacion
de Celulas . . . . . . . . . . . . . 895
1045 Artculos Obtenidos por Biotecnologa . . . . . . 909
1046 Productos Derivados de Celulas y Tejidos . . . . 925
1047 Productos de Terapia Genica . . . . . . . . . . . . 958
1048 Calidad de Productos Biotecnologicos:
Analisis de
la Construccion
Expresable en Celulas Usadas
para la Produccion
de Productos Protenicos
Obtenidos con ADN Recombinante . . . . . . . 990
1049 Calidad de Productos Biotecnologicos:
Pruebas
de Estabilidad de Productos Biotecnologicos
o Biologicos
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 993
1050 Evaluacion
de la Seguridad Viral en Productos
Biotecnologicos
Obtenidos de Lneas
Celulares de Origen Humano o Animal . . . . 998
1051 Limpieza de Material de Vidrio . . . . . . . . . . 1012
Analisis de Aminoacidos . . . . . . . . . . . . . . 1012
1053 Electroforesis Capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . 1026
Isoelectroenfoque . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1034
Mapeo de Peptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . 1037
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida . . . . 1043
Valoracion
de Protenas Totales . . . . . . . . . 1050
1058 Calificacion
de Instrumentos Analticos . . . . 1055
1059 Desempe
no de Excipientes . . . . . . . . . . . . . 1061
1061 ColorMedicion
Instrumental . . . . . . . . . . 1083
1065 Cromatografa Ionica
. . . . . . . . . . . . . . . . . 1086
1066 Ambientes Fsicos que Promueven el Uso Seguro
de los Medicamentos . . . . . . . . . . . . . . . . 1089
1072 Desinfectantes y Antisepticos . . . . . . . . . . . 1097
1074 Guas para la Evaluacion
de la Seguridad
Biologica
de los Excipientes . . . . . . . . . . . . 1103

1078 Buenas Practicas de Fabricacion
para Excipientes
Farmaceuticos a Granel . . . . . . . . . . . . . . . 1107
1079 Buenas Practicas de Almacenamiento y
Distribucion
para Medicamentos . . . . . . . 1125
1080 Excipientes Farmaceuticos a Granel
Certificado de Analisis . . . . . . . . . . . . . . . . 1136
1084 Analisis de Glicoprotenas y Glicanos
Consideraciones Generales . . . . . . . . . . . . 1144
1086 Impurezas en Farmacos y Productos
Farmaceuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1155
1087 Disolucion
Intrnseca AparenteProcedimientos de Pruebas de Disolucion
para
Disco Rotatorio y Disco Estacionario . . . . . 1158
1088 Evaluacion
In Vivo e In Vitro de Formas
Farmaceuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1163
1090 Evaluacion
de Desempe
no del Producto FarmaceuticoBiodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolucion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1175
1091 Etiquetado de Ingredientes Inactivos . . . . . . 1184
1092 Procedimiento de Disolucion:
Desarrollo
y Validacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1184
USP 38
1094 CapsulasPruebas de Disolucion
y
Atributos de Calidad Relacionados . . . . . . . 1193
1097 Procedimientos para el Muestreo de Polvos
a Granel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1202
1102 Metodos de Pruebas Inmunologicas
Consideraciones Generales . . . . . . . . . . . . 1216

Ensayo por Inmunoadsorcion

Ligado a
Enzimas (ELISA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1225
Analisis por Inmunotransferencia . . . . . . . . 1236

Resonancia de Plasmon
Superficial . . . . . . . 1249
1106 Ensayos de InmunogenicidadDise
no y
Validacion
de Inmunoensayos para Detectar
Anticuerpos Antifarmacos . . . . . . . . . . . . . 1266
de Productos No
Esteriles: Criterios de Aceptacion
para
Preparaciones Farmaceuticas y Sustancias
de Uso Farmaceutico . . . . . . . . . . . . . . . . 1284
1112 Determinacion
de Actividad de Agua en
Productos Farmaceuticos No Esteriles . . . . . 1285
1113 Caracterizacion,
Identificacion
y
Tipificacion
de Cepas Microbianas . . . . . . . 1288
1115 Control de Biocarga de Farmacos y Medicamentos No Esteriles . . . . . . . . . . . . . . . . 1293
1116 Control Microbiologico
y Monitoreo de
Ambientes de Procesamiento Aseptico . . . . 1300
1117 Optimas
Practicas de Laboratorio Microbiolo
gico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1314
1118 Dispositivos de MonitoreoTiempo, Temperatura y Humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1321
1119 Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano . . . . 1328
1120 Espectroscopa Raman . . . . . . . . . . . . . . . . 1335
1121 Nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1343
1125 Tecnicas Basadas en Acidos

Nucleicos
Generalidades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1346

Nucleicos
Extraccion,
Deteccion
y Secuenciacion
. . . . . 1352

Nucleicos
Amplificacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1362

Nucleicos
Micromatrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1373

Nucleicos
Genotipificacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1380

Nucleicos
Enfoques para Detectar Trazas de Acidos

Nucleicos (Analisis de ADN Residual) . . . . . 1385
1136 Envasado y ReenvasadoEnvases
Unitarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1388
1151 Formas Farmaceuticas . . . . . . . . . . . . . . . . 1398
1152 Medicamentos Veterinarios Usados en
Alimentos para Animales . . . . . . . . . . . . . . 1424
1160 Calculos Farmaceuticos en la Preparacion
Magistral de Prescripciones . . . . . . . . . . . . 1426

1163 Garanta de Calidad en la Preparacion
Magistral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1441
1171 Analisis por Solubilidad de Fases . . . . . . . . . 1447
1174 Fluidez de Polvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1450
1176 Balanzas y Aparatos Volumetricos para Prescripciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1454
1177 Buenas Practicas de Envasado . . . . . . . . . . . 1456
1178 Buenas Practicas de Reenvasado . . . . . . . . . 1459
1180 Plasma Humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1462
1181 Microscopa Electronica
de Barrido . . . . . . . 1487
1184 Pruebas de Sensibilizacion
. . . . . . . . . . . . . 1497
1191 Consideraciones sobre Estabilidad en la Practica
de Dispensacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1509
1195 Gua sobre Cambios Significativos en Excipientes
Farmaceuticos a Granel . . . . . . . . . . . . . . . 1514
1197 Buenas Practicas de Distribucion
para Excipientes Farmaceuticos a Granel . . . . . . . . . 1526
1207 Envasado de Productos EsterilesEvaluacion
de Integridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1551
USP 38
1601 Productos para NebulizacionPruebas
de
Caracterizacion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1765
1644 Teora y Practica de Mediciones de
Conductividad Electrica de Soluciones . . . . 1768
1660 Envases de VidrioEvaluacion
de la
Durabilidad de la Superficie Interna . . . . . . 1776
1724 Medicamentos SemisolidosPruebas
de
Desempe
no . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1781
1736 Aplicaciones de la Espectrometra de
Masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1795
1761 Aplicaciones de la Espectroscopa de
Resonancia Magnetica Nuclear . . . . . . . . . 1818
1787 Medicion
de Partculas Subvisibles en
Inyectables de Protenas Terapeuticas . . . . . 1840
1788 Metodos para la Determinacion
de Partculas
en Inyectables y Soluciones Oftalmicas . . . . 1855
AtomicaTeor
a
y Practica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1870
1853 Espectroscopa de FluorescenciaTeora
y Practica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1880
1854 Espectroscopa en el Infrarrojo MedioTeora
y Practica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1890
1857 Espectroscopa Ultravioleta-VisibleTeora
y Practica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1900
1911 Reometra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1910

2021 Pruebas de Recuento MicrobianoSuplementos
Nutricionales y Dieteticos . . . . . . . . . . . . . 1917
2022 Procedimientos Microbiologicos
para Comprobar
la Ausencia de Microorganismos Especficos
Suplementos Nutricionales y Dieteticos . . . 1922
2023 Atributos Microbiologicos
de los Suplementos
Nutricionales y Dieteticos No Esteriles . . . . 1929
2030 Informacion
Complementaria para Artculos de
Origen Botanico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1932
2040 Desintegracion
y Disolucion
de Suplementos
Dieteticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1942
2091 Variacion
de Peso de Suplementos
Dieteticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1950
2232 Contaminantes Elementales en Suplementos
Dieteticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1951
2250 Deteccion
de Suplementos Dieteticos
Irradiados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1955
2750 Practicas de Fabricacion
para Suplementos
Dieteticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1958
Captulos
1208 Pruebas de EsterilidadValidacion

de Sistemas
Aisladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1553
1209 EsterilizacionIndicadores
e Integradores
Qumicos y Fisicoqumicos . . . . . . . . . . . . 1558
1211 Esterilizacion
y Garanta de Esterilidad de
Artculos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . . 1561
1216 Friabilidad de las Tabletas . . . . . . . . . . . . . . 1566
1217 Fuerza de Ruptura de las Tabletas . . . . . . . . 1567
1222 Productos Farmaceuticos con Esterilizacion
TerminalLiberacion
Parametrica . . . . . . . 1571
1223 Validacion
de Metodos Microbiologicos
Alternativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1575
1224 Transferencia de Procedimientos Analticos . . 1579
1225 Validacion
de Procedimientos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1581
1226 Verificacion
de Procedimientos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1587
1227 Validacion
de Recuperacion
Microbiana en
Artculos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . . 1588
1229 Esterilizacion
de Artculos Farmacopeicos . . . 1593
con Vapor de Agua por
Contacto Directo . . . . . . . . . . . . . . . . . 1598
con Calor Humedo
de
Lquidos Acuosos . . . . . . . . . . . . . . . . . 1602
1229.3 Monitoreo de la Biocarga . . . . . . . . . . . . 1607
de Lquidos por Filtracion
. . . 1610
en Fase Lquida . . . . . . . . . . 1618
por Gases . . . . . . . . . . . . . . 1621
por Calor Seco . . . . . . . . . . 1624
por Radiacion
. . . . . . . . . . 1626
1230 Agua para Uso en Hemodialisis . . . . . . . . . . 1631
1231 Agua para Uso Farmaceutico . . . . . . . . . . . 1632
1234 Vacunas para Uso HumanoVacunas
de Polisacaridos y Glicoconjugados . . . . . . 1662
1235 Vacunas para Uso HumanoConsideraciones
Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1680
1237 Metodos de Pruebas Virologicas
. . . . . . . . . 1698
1238 Vacunas para Uso HumanoVacunas Bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1720
1240 Analisis de Virus en Plasma Humano para
Fabricacion
Posterior . . . . . . . . . . . . . . . . 1734
1241 Interacciones AguaSolido
en Sistemas
Farmaceuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1745
1251 Pesada en una Balanza Analtica . . . . . . . . . 1750
1265 Informacion
Escrita de los Medicamentos
RecetadosGuas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1755
1285 Preparacion
de Muestras Biologicas
para
Analisis Histologico
e Inmunohistoqumico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1757
1285.1 Tincion
con Hematoxilina y Eosina de Cortes
de Tejidos para Examen Microscopico
. . 1762
Gua para los Captulos Generales 55
Requisitos Generales / 1 Medicamentos Inyectables 57
USP 38
Captulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales
Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones
Cambio en la redaccin:
1 MEDICAMENTOS INYECTABLES Y EN IMPLANTES

(PARENTERALES)PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO
INTRODUCCIN
Los medicamentos parenterales incluyen inyectables e implantes que se inyectan a travs de la piel u otro tejido de barrera
externo, o que se implantan dentro del cuerpo para permitir la administracin directa del frmaco activo en los vasos sanguneos, rganos, tejidos o lesiones. Los inyectables se pueden presentar como formas farmacuticas de liberacin inmediata o
prolongada. Los medicamentos parenterales en implantes son formas farmacuticas de accin prolongada que proveen una
liberacin continua de los frmacos activos durante periodos que van de meses a aos. Para la liberacin sistmica, se pueden
implantar por va subcutnea, mientras que para la administracin local, se pueden implantar en una parte especfica del cuerpo. Los medicamentos parenterales se pueden administrar por va intravenosa, intraventricular, intraarterial, intraarticular, subcutnea, intramuscular, intratecal, intracisternal e intraocular.
Las formas farmacuticas parenterales se pueden presentar como soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos estriles para
soluciones y suspensiones (incluyendo liposomas), implantes (incluyendo micropartculas) y productos que consten de un frmaco y un dispositivo, tales como los estents para elucin de frmacos. Para descripciones adicionales de formas farmacuticas
que caen dentro de la categora general de medicamentos parenterales dirigirse a las secciones posteriores de este captulo y al
captulo Formas Farmacuticas 11511 . El captulo Nomenclatura 11211 provee informacin para establecer los nombres y
ttulos de monografas USP de medicamentos parenterales.
El captulo 1 provee las directrices generales para la revisin y el desarrollo de monografas individuales y no pretende
reemplazar a stas ltimas. El captulo 1 provee listas de pruebas de calidad del producto comnmente requeridas de una
manera concisa y coherente. El captulo se divide en cuatro secciones principales: (1) pruebas universales de calidad del producto que son aplicables a formas farmacuticas parenterales; (2) pruebas especficas de calidad del producto que deben tenerse en cuenta adems de las pruebas universales; (3) pruebas de calidad del producto para formas farmacuticas especficas
donde se citan todas las pruebas aplicables (universales y especficas) para la forma farmacutica especfica; y (4) pruebas de
desempeo del producto.
Siempre que existan, las monografas harn referencia al captulo 1 o a partes especficas del mismo. Si no se cuenta con
una monografa especfica para un medicamento (monografa inexistente), los captulos generales proveen las pruebas de calidad que pueden ser usadas por los fabricantes hasta que la USP desarrolle la monografa de la forma farmacutica.
Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estriles para uso parenteral pueden no ser aplicables a algunos productos
biolgicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biolgicos 10411). No obstante,
algunos medicamentos biolgicos terminados cuyas monografas contienen el trminoInyeccin en el ttulo deben cumplir
con los requisitos del captulo 1 o las secciones del mismo que se especifiquen en la monografa.
1 Todos los captulos con nmeros superiores a <1000> son nicamente para fines informativos. Dichos captulos pueden resultar tiles, aunque no son obligatorios.
Captulos
(El captulo se oficializar el 1 de mayo de 2016)

(El nombre actual del captulo es 1 Inyectables)
58 1 Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales
USP 38
Pruebas de Calidad y de Desempeo del Medicamento

Los procedimientos y criterios de aceptacin para las pruebas de medicamentos parenterales se dividen en dos categoras:
(1) aqullos que evalan los atributos de calidad del producto, p.ej., identificacin, esterilidad y partculas, y estn incluidas en
este captulo y (2) aqullos que evalan el desempeo del producto, p.ej., liberacin in vitro del frmaco desde el medicamento. Mientras que las pruebas de calidad evalan la integridad de la forma farmacutica, las pruebas de desempeo evalan el
desempeo (biodisponibilidad) que tendra el producto luego de administrarlo al paciente. Una prueba de desempeo del
producto, es decir, una prueba de liberacin de frmacos para suspensiones, emulsiones, polvo para suspensin (incluyendo
micropartculas y liposomas) y estents para elucin de frmacos, debe llevarse a cabo usando procedimientos apropiados.
PRUEBAS COMUNES DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACUTICAS

PARENTERALES
Captulos
PRUEBAS UNIVERSALES
A continuacin se citan las pruebas universales que son aplicables a las formas farmacuticas parenterales.
Descripcin: Se debe proveer una descripcin cualitativa de la forma farmacutica. Los criterios de aceptacin deben incluir
la apariencia final aceptable. Si el color cambia durante el almacenamiento, puede resultar apropiado realizar un procedimiento cuantitativo o semicuantitativo para evaluar el color. Esta seccin especifica el contenido o la cantidad declarada del artculo
(ver Etiquetado 7). El captulo 11211 ofrece informacin adicional sobre trminos y definiciones de uso comn.
Identificacin: Las pruebas de identificacin se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.40. Las pruebas de identificacin deben establecer la identidad de los frmacos presentes en el artculo y deben distinguirlo de compuestos con estructura
estrechamente relacionada que podran estar presentes. La prueba de identidad ms concluyente es el espectro de absorcin
IR (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851 y Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica 197). Cuando no es posible
obtener un espectro IR adecuado, se pueden usar otros mtodos analticos. Los mtodos espectrofotomtricos Raman o de
infrarrojo cercano tambin podran ser aceptables como nica prueba para la identificacin de los constituyentes en el medicamento formulado (para mayor informacin ver Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano 11191 y Espectroscopa Raman 11201).
La identificacin realizada nicamente mediante un solo tiempo de retencin cromatogrfico no se considera especfica. Sin
embargo, puede ser aceptable el uso de dos procedimientos cromatogrficos en los que la separacin se basa en principios
diferentes o en una combinacin de pruebas en un solo procedimiento (ver Cromatografa 621 y Prueba de Identificacin por
Cromatografa en Capa Delgada 201). Los captulos IdentificacinPruebas Generales 191 y Espectrometra de Masas 736
ofrecen informacin adicional con respecto a las pruebas de identificacin.
Valoracin: Se debe usar una prueba especfica e indicadora de estabilidad para determinar la concentracin (contenido) del
medicamento. Para los casos en los que se justifique el uso de una valoracin no especfica, se deben usar otros procedimientos analticos complementarios para lograr la especificidad. Se debe usar un procedimiento especfico cuando exista evidencia
de la interferencia de los excipientes con la valoracin no especfica.
Impurezas: Las pruebas para Impurezas se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.60. Todos los artculos deben ser
analizados para asegurar que cumplen con los requisitos.
Materia extraa y partculas: Los artculos destinados para administracin parenteral deben prepararse de una manera diseada para excluir partculas conforme a lo definido en Partculas Subvisibles en Inyectables de Protenas Teraputicas 787, Partculas en Inyectables 788 y Partculas en Soluciones Oftlmicas 789, as como para excluir otras partculas segn resulte apropiado para la forma farmacutica. Se debe inspeccionar cada uno de los envases finales de todas las preparaciones parenterales
en la medida de lo posible para detectar la presencia de materia extraa y partculas observables (en lo sucesivo denominadas
partculas visibles) en su contenido. El proceso de inspeccin debe estar diseado y calificado para asegurar que todos los lotes
de todas las preparaciones parenterales estn esencialmente exentos de partculas visibles, conforme a lo definido en Partculas
Visibles en Inyectables 790. La calificacin del proceso de inspeccin debe realizarse en referencia a las partculas en el rango
visible y a aquellas partculas que puedan surgir del proceso de fabricacin o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo contenido presente indicios de partculas visibles. La inspeccin para detectar partculas visibles puede realizarse al momento de
examinar otros defectos crticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un
producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema envasecierre del envase permita solamente una inspeccin limitada del
contenido total, la inspeccin del 100% de un lote debe complementarse con la inspeccin de contenidos reconstituidos
(p.ej., liofilizados) o contenidos extrados (p.ej., de un envase mbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Las inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis, las inyecciones de pequeo volumen y los empaques a granel
para farmacias (PBP, por sus siglas en ingls) estn sujetos a los procedimientos microscpicos o de obstruccin de luz y a los
lmites de partculas subvisibles especificados en el captulo 788, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Un artculo envasado como inyeccin, ya sea de gran volumen o de pequeo volumen, cumple con los requisitos
establecidos para inyecciones de pequeo volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos. Cumple con los requisitos establecidos para inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase
indica que contiene ms de 100 mL.
USP 38
Esterilidad: La esterilidad de todos los medicamentos destinados para administracin parenteral debe confirmarse usando los
mtodos descritos en Pruebas de Esterilidad 71 o por un mtodo alternativo aprobado.
Endotoxinas bacterianas: Todos los artculos destinados para administracin parenteral deben prepararse de forma tal que
se limiten las endotoxinas bacterianas conforme a lo definido en Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 o Prueba de Pirgenos
151.
Contenido del envase: Se debe determinar el contenido del envase cuando resulte apropiado (ver el captulo propuesto de
pruebas generales Contenido en Envases para Inyectables 697).
Sustancias lixiviables y extrables: El sistema de envasado no debe interactuar fsica o qumicamente con la preparacin de
forma que se altere su contenido, calidad o pureza ms all de los requisitos oficiales o establecidos. El sistema de envase debe
cumplir con los requisitos de Tapones Elastomricos para Inyectables 381, Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659, EnvasesVidrio 660, EnvasesPlsticos 661, Materiales Plsticos de Construccin 661.1 y Sistemas de Envasado de Plstico para
Uso Farmacutico 661.2. Se puede encontrar informacin adicional con respecto al anlisis de sistemas de envasado en Anlisis de Sustancias Extrables Asociadas con Sistemas Farmacuticos de Envasado/Administracin 1663 y Anlisis de Sustancias Lixiviables Asociadas con Sistemas Farmacuticos de Envasado/Administracin 1664.
Integridad del cierre del envase: El sistema de envasado debe cerrarse o sellarse de modo tal que prevenga la contaminacin o la prdida de contenido. La validacin de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminacin por
penetracin de microorganismos o la adquisicin o prdida de cualquier parmetro fsico o qumico que se considere necesario para proteger el producto (ver Envasado de Productos EstrilesEvaluacin de Integridad 1207).
Etiquetado: Todos los artculos destinados para administracin parenteral deben cumplir con los requisitos de etiquetado definidos en el captulo 7.
Adems de las pruebas universales citadas anteriormente, se pueden considerar las siguientes pruebas especficas para cada
caso y, cuando resulte apropiado, se hace referencia a las mismas en la monografa USPNF.
Propiedades fisicoqumicas: stas incluyen propiedades como Osmolalidad y Osmolaridad 785, pH 791, Peso Especfico
841 y ViscosidadMtodos Capilares 911.
Uniformidad de unidades de dosificacin: Esta prueba es aplicable a medicamentos parenterales y formas farmacuticas
envasadas en envases unitarios. Incluye tanto la masa de la forma farmacutica como el contenido de la sustancia activa en la
misma (ver Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905).
Vehculos y sustancias agregadas: Existen otros vehculos, acuosos y no acuosos, aparte de los tratados a continuacin. Todos los vehculos deben ser adecuados para el uso que se les pretende dar y no deben impactar la calidad del medicamento.
Vehculos acuososLos vehculos acuosos deben cumplir con los requisitos del captulo 151 o del 85, segn se especifique
en la monografa. El vehculo de uso ms general es el Agua para Inyeccin. Se puede agregar cloruro de sodio o dextrosa para
isotonizar la solucin resultante; y la Inyeccin de Cloruro de Sodio, o la Solucin de Ringer Inyectable pueden reemplazar
parcial o totalmente al Agua para Inyeccin.
Vehculos no acuososLos aceites fijos son una clase de Vehculos no acuosos. Los aceites fijos empleados como vehculos son de
origen vegetal e inodoros. Cumplen con los requisitos de la prueba de Parafina Slida en la monografa de Aceite Mineral con
el bao de enfriamiento mantenido a 10.
Asimismo, cumplen con los requisitos de las siguientes pruebas:
ndice de Saponificacin (ver el captulo Grasas y Aceites Fijos 401): Entre 185 y 200
ndice de Yodo (ver el captulo 401): Entre 79 y 141
Materia Insaponificable (ver el captulo 401): No ms de 1,5%
ndice de Acidez (ver el captulo 401): No ms de 0,2
ndice de Perxido (ver el captulo 401): No ms de 5,0
Agua, Mtodo Ic (del captulo Determinacin de Agua 921): No ms de 0,1%
Lmite de Cobre, Hierro, Plomo y Nquel: [NOTALa prueba para nquel no se requiere si el aceite no ha sido sometido a
hidrogenacin, o si no se ha usado un catalizador de nquel durante el procesamiento.] Proceder segn se indica en el
captulo 401, Trazas de Metales o Impurezas ElementalesProcedimientos 233. Cumplen con los requisitos en Impurezas
ElementalesLmites 232.
Los monoglicridos o diglicridos sintticos de cidos grasos se pueden emplear como vehculos, siempre que sean lquidos, se
mantengan transparentes cuando se enfran a 10 y presenten un ndice de Yodo no mayor de 140.
Sustancias AgregadasSe pueden agregar sustancias adecuadas a preparaciones para incrementar la estabilidad o la utilidad, a
menos que se prohban en la monografa. No se pueden agregar colorantes a una preparacin con el nico propsito de conferir color a la preparacin terminada (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20 y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51).
Debe tenerse especial cuidado en la eleccin y uso de sustancias agregadas en preparaciones con volmenes superiores a 5
mL. Los siguientes lmites prevalecen a menos que se indique de otro modo:
Mercurio y agentes catinicos tensoactivos: No ms de 0,01%
Clorobutanol, cresol, fenol y sustancias similares: No ms de 0,5%
Dixido de azufre o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito o metabisulfito de potasio o sodio: No ms de 0,2%
Captulos
Pruebas Especficas
Captulos
USP 38
Conservante antimicrobiano: Se deben agregar agentes antimicrobianos a las preparaciones destinadas para inyeccin en
envases multidosis, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) existen instrucciones diferentes en la monografa individual; (2) la sustancia contiene un radio istopo con una vida media fsica menor que 24 horas; o (3) los ingredientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias deben cumplir con los requisitos del captulo 51 y Agentes Antimicrobianos
Contenido 341.
Contenido de agua: El contenido de agua en productos liofilizados debe determinarse siempre que sea apropiado (ver el
captulo 921).
Reactividad biolgica: Los medicamentos en implante y las combinaciones frmaco/dispositivo que contienen un material
polimrico deben cumplir con los requisitos de Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88.
Distribucin de tamao de glbulos: La emulsiones deben cumplir con los requisitos de Distribucin del Tamao de Glbulos
en Emulsiones Inyectables de Lpidos 729.
Contenido de Aluminio: 25 mg/L para parenterales de gran volumen usados en terapia de nutricin parenteral total (TPN,
por sus siglas en ingls). Los parenterales de pequeo volumen y los empaques a granel para farmacias usados para preparar la
terapia de nutricin parenteral total deben declarar en la etiqueta del envase inmediato el nivel mximo de aluminio en la fecha de caducidad si el nivel mximo excede de 25 mg/L.
Totalidad y transparencia de soluciones: Las siguientes pruebas se llevan a cabo para demostrar la aptitud de las soluciones
reconstituidas que se preparan antes de su administracin. Reconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante:
El slido se disuelve completamente, sin dejar ninguna materia sin disolver.
La solucin reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar. Las soluciones de protena pueden presentar una
opalescencia inherente.
La solucin reconstituida est exenta de partculas que se puedan observar durante la inspeccin visual (ver el captulo
790).
PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACUTICAS PARENTERALES

ESPECFICAS
A continuacin se citan las pruebas de calidad del producto para las formas farmacuticas especficas. Los captulos especficos referidos para la prueba pueden encontrarse en las secciones Pruebas Universales y Pruebas Especficas. Cuando no est disponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptacin.
Soluciones
Una solucin es una forma farmacutica lquida transparente y homognea que contiene una o ms sustancias qumicas
(p.ej., frmacos o excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre s.
Las soluciones destinadas para administracin parenteral (p.ej., mediante inyeccin o para irrigacin) deben ser estriles y biocompatibles con el sitio de administracin al que estn destinadas. Esto incluye considerar factores tales como tonicidad, pH,
pirogenicidad, partculas extraas y compatibilidad fisicoqumica, entre otros.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para soluciones para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: Peso Especfico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad
Conservantes Antimicrobianos
Polvos Estriles para Solucin

Los polvos estriles para solucin (tambin referidos como polvos estriles para inyeccin) estn formados por frmacos y
otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad qumica y fsica de la presentacin dentro de un envase para uso final. Se puede proveer un diluyente estril acompaante o compartimentos de diluyente
para facilitar la reconstitucin al volumen final deseado.
El artculo estril para inyeccin se presenta en diversas formas: polvo liofilizado destinado para solucin final, slidos pulverizados destinados para solucin final, o slidos secos que al reconstituirlos forman lquidos viscosos.
La descripcin debe incluir una seccin que describa la facilidad de dispersin y la reconstitucin. La forma farmacutica es
un slido homogneo que se reconstituye fcilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersin se completa agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estriles para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: Peso Especfico, Viscosidad, pH, Osmolaridad y Osmolalidad
USP 38
Suspensiones
Las suspensiones parenterales son formas farmacuticas lquidas que contienen partculas slidas en un estado de dispersin
uniforme. Las suspensiones para administracin parenteral deben ser estriles y compatibles con el sitio de administracin. Se
debe tomar en cuenta el pH y la pirogenicidad, adems de que se deben identificar lmites apropiados. Las evaluaciones de
estabilidad fsica de las suspensiones parenterales deben incluir evaluaciones para confirmar que el intervalo del tamao de
partcula de la materia suspendida no cambie con el tiempo y para confirmar que los slidos en la preparacin se pueden resuspender con facilidad para obtener una preparacin uniforme.
Para las suspensiones inyectables se requiere el cumplimiento con las pruebas para soluciones inyectables adems de las siguientes pruebas, a menos que se justifique algo diferente:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: pH
Uniformidad de Unidades de Dosificacin
Liposomas
Los liposomas son medicamentos singulares con propiedades nicas que pueden estar en forma de solucin o suspensin.
Los liposomas son dispersiones acuosas de lpidos anfiflicos y tienen baja solubilidad en agua. Se organizan como una lmina
de dos capas que encierra un compartimiento acuoso interno y se conocen como vesculas de bicapa lipdica. Los liposomas
pueden tener una sola bicapa lipdica (vescula unilaminar) o pueden tener una estructura multicapa parecida a una cebolla
(vescula multilaminar). Los lpidos anfiflicos comprenden una cabeza compuesta por un grupo hidratado en la interfase de
agua de la bicapa unido a un grupo hidrfobo que forma el interior de la bicapa mediante la asociacin con el grupo hidrfobo de lpidos de la lmina opuesta de la bicapa. Las propiedades fsicas del liposoma y su bicapa pueden variar ampliamente
dependiendo de la composicin lipdica, la composicin acuosa y la temperatura con respecto a los puntos de transicin de
fase de los componentes acilo. Debido al compartimiento acuoso central, una prueba simple para determinar la presencia de
liposomas en una dispersin de lpidos sirve para determinar la presencia de una fase acuosa atrapada.
Un medicamento liposmico consta del frmaco, los componentes del liposoma y otros ingredientes inactivos pero crticos
tales como una dispersin acuosa, a menos que el contenido sea un producto liofilizado.
Captulos
Lo siguiente se aplica a soluciones reconstituidas:

Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905: Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad
en una partida debe contener una cantidad de frmaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho.
Las unidades de dosificacin se definen como formas farmacuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis
de frmaco en cada unidad. Para formas farmacuticas lquidas, los analistas deben realizar la valoracin usando una cantidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar
los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptacin.
Prdida por Secado 731: El procedimiento establecido en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cualquier tipo expelida en las condiciones especificadas.
Determinacin de Agua 921: El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitucin y la estabilidad. Para los artculos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben
llevar a cabo uno de los mtodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado.
Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variacin de la unidad para los siguientes parmetros:
Color del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
Presencia de Material Extrao: Se deben rechazar todas las unidades con material extrao.
Tamao y Distribucin de Partcula (Polvo Seco): La evaluacin de la forma apropiada y cristalinidad de los slidos en
polvo es una medida del control y uniformidad del proceso.
Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico 786: Este captulo se puede usar para polvos
sueltos.
Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad
cuando ste se indique en la monografa individual de un frmaco.
Microscopa ptica 776: La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopa de luz polarizada para evaluacin
cualitativa del tamao, la forma y la cristalinidad de slidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografa
individual, los analistas deben montar una muestra slida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cubreobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partculas presentan birrefringencia (colores derivados de la interferencia) y posiciones de extincin cuando se gira la platina del microscopio.
Vehculos y diluyentes: Las pautas para reconstitucin y suspensin de polvos secos se encuentran en las monografas especficas. Cuando existe un diluyente especfico envasado para su uso con un producto en particular el cual no est incluido en
una monografa, entonces el artculo final se prepara con dicho diluyente.
USP 38
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para liposomas:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: pH
Composicin de Lpidos y cidos Grasos, incluyendo el grado de insaturacin y la especificidad de la posicin en las
cadenas laterales acilo y productos de degradacin crticos tales como lisolpidos2
Tamao de Partcula2
Distribucin del Tamao de Partcula de Vesculas Liposomales2
Laminalidad2
Composicin de Fosfolpidos2
Porcentaje de Lpidos Libres vs. Porcentaje de Lpidos Encapsulados2
Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado
Fuerza Inica y Fuerza Osmtica2
Captulos
Polvos Estriles para Suspensin

Los polvos estriles para suspensiones estn formados por frmacos y otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad qumica y fsica de la presentacin dentro de un envase para uso final. Se puede
proveer un diluyente estril acompaante o compartimentos de diluyente para facilitar la reconstitucin al volumen final deseado.
El artculo estril inyectable se puede presentar de diversas formas: polvo liofilizado destinado a suspensin final, slidos pulverizados destinados a suspensin final o micropartculas que mantienen su integridad y que se administran en forma de suspensin estril. La descripcin debe incluir una seccin que describa la facilidad de dispersin y la reconstitucin. La forma
farmacutica es un slido homogneo que se reconstituye fcilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersin se completa agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estriles para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Endotoxinas Bacterianas
Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad
Lo siguiente se aplica a suspensiones reconstituidas:
Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905: Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad
en una partida debe contener una cantidad de frmaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho.
Las unidades de dosificacin se definen como formas farmacuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis
de frmaco en cada unidad. Para formas farmacuticas lquidas, los analistas deben realizar la valoracin usando una cantidad de material reconstituido bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar
los resultados como dosis entregada y calcular el valor de aceptacin.
Prdida por Secado 731: El procedimiento establecido en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cualquier tipo expelida en las condiciones especificadas.
Determinacin de Agua 921: El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitucin y la estabilidad. Para los artculos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben
llevar a cabo uno de los mtodos siguientes o reemplazarlo por uno que resulte adecuado.
Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variacin de la unidad para los siguientes parmetros:
Color del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
Textura y Homogeneidad del Aglomerado: Vara dentro de los parmetros esperados.
Presencia de Material Extrao: Se deben rechazar todas las unidades con material extrao.
Tamao y Distribucin de Partcula (Polvo Seco): La evaluacin de la forma apropiada y cristalinidad apropiada de los
slidos en polvo es una medida de control y uniformidad del proceso.
Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico 786: Este captulo se puede usar para polvos
sueltos.
Cristalinidad: Se puede caracterizar la cristalinidad de un material para determinar si cumple con el requisito de cristalinidad
cuando ste se indique en la monografa individual de un frmaco.
Microscopa ptica 776: La cristalinidad se puede caracterizar mediante microscopa de luz polarizada para evaluacin
cualitativa del tamao, la forma y la cristalinidad de slidos. A menos que se especifique de otro modo en la monografa
individual, los analistas deben montar una muestra slida en aceite mineral sobre un portamuestras de vidrio limpio o cubreobjetos y deben examinar la mezcla usando un microscopio polarizante: Las partculas presentan birrefringencia (colores derivados de la interferencia) y posiciones de extincin cuando se gira la platina del microscopio.
Cuando no est disponible una prueba farmacopeica, se debe usar un procedimiento validado con criterios de aceptacin.
USP 38
Vehculos y diluyentes: Las pautas para reconstitucin y suspensin de polvos secos se encuentran en las monografas especficas. Cuando existe un diluyente especfico envasado para su uso con un producto en particular el cual no est incluido en
una monografa, entonces el artculo final se prepara con dicho diluyente.
Micropartculas: Algunas micropartculas se proveen como polvos estriles que deben reconstituirse en forma de suspensin
antes de la inyeccin. Las principales preparaciones de micropartculas deben reconstituirse en forma de suspensin inyectable.
Para los requisitos de las pruebas de calidad, consultar la seccin Implantes.
Emulsiones
Implantes
Los implantes para liberacin prolongada estn compuestos por una matriz de frmaco y excipiente polimrico que puede o
no tener una membrana externa de control de velocidad. El excipiente polimrico debe ser biocompatible pero puede o no ser
biorreabsorbible. Algunos implantes se fabrican con metal de grado mdico con una bomba osmtica en su interior que produce la liberacin prolongada del frmaco. Los implantes deben ser estriles y, por lo general, en forma de cilindro, aunque
tambin se usan otras formas. Los disolventes usados para disolver la formulacin pueden conducir a la esterilizacin, por lo
que el mtodo de prueba de esterilidad interno debe demostrar que la preparacin de la muestra no provoca la esterilizacin
de la muestra de prueba.
Los implantes en forma de cilindro para administracin sistmica por lo general se proveen en un dispositivo de insercin
para administracin subcutnea o local, tal como administracin ocular local. Asimismo, los implantes se pueden implantar
quirrgicamente para administracin local, p.ej., administracin ocular.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para implantes:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas:
Contenido de Agua
Geles in situ: Los geles estriles in situ son preparaciones lquidas que estn destinadas para inyectarse en sitios teraputicos
especficos. Por lo regular, estn compuestos por polmeros en disolventes orgnicos y, al momento de su inyeccin, los disolventes emigran del sitio, dejando una masa gelificada. Las preparaciones se pueden inyectar tal como se encuentran, al momento de su reconstitucin, a partir de la formacin in situ, o a partir de catlisis iniciada qumicamente que resulta en la forma final.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para geles in situ:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: Viscosidad
Contenido y Actividad del Iniciador Catalizador2
Monmero Residual2
Tiempo de Formacin del Gel2
Micropartculas: Micropartculas reabsorbibles inyectables para liberacin prolongada con un dimetro generalmente de 20
a 100 mm. Estn compuestas por frmacos incluidos dentro de un excipiente polimrico biocompatible y biorreabsorbible,
p.ej., excipientes de polister. Las micropartculas se proveen como polvos estriles en un vial o jeringa.
Justo antes de su administracin intramuscular o subcutnea, el polvo de micropartculas debe suspenderse en un vehculo
acuoso para inyeccin (diluyente). El vehculo para inyeccin por lo regular est formado por Agua para Inyeccin, agente tensoactivo y mejorador de viscosidad, y puede contener un compuesto que ajuste la osmolalidad, p.ej., un azcar con o sin un
Captulos
Las emulsiones para formas farmacuticas parenterales son preparaciones lquidas de frmacos disueltos o dispersados en un
medio de emulsin adecuado. Las emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite por lo regular atrapan al frmaco.
Las emulsiones por lo general son formas farmacuticas lquidas homogneas, turbias y de color blanco que contienen una o
ms sustancias qumicas (p.ej., frmacos y excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre s. Las emulsiones destinadas para administracin intravenosa deben ser estriles y compatibles con el
sitio de administracin al que est destinado.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para emulsiones inyectables:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolaridad y Osmolalidad
Distribucin del Tamao de Glbulos
Cantidad de Glbulos de Grasa (lpidos)2
Porcentaje de Lpidos Libres vs. Porcentaje de Lpidos Encapsulados2
Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado
USP 38
compuesto que controle el pH, p.ej., un cido. El vehculo para inyeccin debe ser estril y debe analizarse de acuerdo a los
requisitos para soluciones destinadas para administracin parenteral.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para micropartculas para inyeccin:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Contenido de Agua
Dependiendo del medicamento, pueden ser necesarias las siguientes pruebas:
Distribucin del Tamao de Partcula
Propiedades Fisicoqumicas: pH, Osmolalidad y Osmolaridad
Captulos
Estents para Elucin de Frmacos

Los estents para elucin de frmacos son estents, metales diminutos o estructuras de polmero que se usan para mantener
las arterias abiertas despus de una intervencin mdica, en los cuales se incorpora un frmaco en el interior o sobre la plataforma del estent. Los estents para elucin de frmacos por lo regular tienen dos componentes de anlisis: (1) pruebas funcionales que por lo general son mtodos de la American Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense para Ensayos
y Materiales o ASTM) que estn fuera del alcance de este captulo y (2) pruebas analticas.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para estents para elucin de frmacos:
Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Uniformidad de Unidades de Dosificacin. El contenido de la sustancia activa en la forma farmacutica es aplicable
para estents para elucin de frmacos envasados en envases unitarios. La prueba se puede realizar mediante uniformidad de contenido o variacin de peso (ver el captulo 905). Siempre que se justifique adecuadamente, el nmero
de estents requerido para esta prueba puede ser menor que el recomendado en el captulo 905.
Reactividad Biolgica
Partculas
Espesor(es) del Recubrimiento2
Robustez del Recubrimiento y Susceptibilidad a la Ruptura o Expansin2
Frmaco Libre vs. Frmaco Encapsulado2
Morfologa (superficie y seccin cruzada)2
Polidispersin2
Cociente de Copolmero2
Punto de Transicin Vtrea2
Adhesin del Recubrimiento a la Superficie del estent2
Prueba de Reaccin del Tejido2
Peso Molecular del Polmero2
PRUEBAS DE DESEMPEO DEL PRODUCTO

Una prueba de desempeo para inyectables y productos implantados debe tener la capacidad de medir la liberacin de frmacos a partir de las formas farmacuticas fabricadas. Asimismo, debe ser reproducible y confiable, y, aunque no se trata de
una medicin de biodisponibilidad, la prueba de desempeo debe ser capaz de detectar cambios en las caractersticas de liberacin del frmaco del producto terminado. Estos cambios tienen el potencial de alterar el desempeo biolgico del frmaco
en la forma farmacutica, y pueden estar relacionados con ingredientes activos o inactivos/inertes en la formulacin, con atributos fsicos o qumicos de la formulacin terminada, con variables de fabricacin, con los efectos de transporte y almacenamiento, con efectos de envejecimiento y con otros factores de formulacin crticos para las caractersticas de calidad del medicamento terminado.
Favor de consultar el captulo Procedimiento de Disolucin: Desarrollo y Validacin 1092 al desarrollar la prueba de liberacin
de frmacos, al seleccionar el medio de liberacin de frmacos, el aparato o el procedimiento y el mtodo analtico. Las pruebas de desempeo del producto pueden servir para una gran variedad de propsitos en el desarrollo del producto y en el monitoreo del medicamento posterior a la aprobacin. Asimismo, proveen garanta sobre el desempeo equivalente para productos que han sufrido cambios en las materias primas, reubicacin o cambios en el sitio de fabricacin y dems cambios posteriores a la aprobacin conforme a lo detallado en las Pautas para la Industria SUPAC de la FDA (SUPAC-IR, SUPAC-MR y SUPAC-SS; disponibles en www.fda.gov/cder/guidance). En este captulo, se debe considerar una prueba de desempeo de la USP
para productos inyectables e implantados a fin de sustentar la liberacin de partidas.USP38
Requisitos Generales / 1 Inyectables 65
USP 38
1 INYECTABLES
(Este captulo ser oficial hasta el 30 de abril de 2016)
Ver 1 Medicamentos Inyectables y en Implantes (Parenterales)Pruebas de Calidad del Producto
INTRODUCCIN
Los artculos parenterales son preparaciones destinadas a la inyeccin a travs de la piel u otro tejido externo, en lugar de la
va alimentaria, administrando las sustancias activas que contienen directamente en un vaso sanguneo, rgano, tejido o lesin,
usando la fuerza de la gravedad u otra fuerza. Los artculos parenterales se preparan meticulosamente mediante mtodos diseados para garantizar el cumplimiento de los requisitos establecidos por la Farmacopea en lo referente a esterilidad, pirgenos,
partculas y otros contaminantes. Cuando corresponde, contienen inhibidores del crecimiento de microorganismos. Una inyeccin es una preparacin destinada para la administracin parenteral, y/o para reconstituir o diluir un artculo antes de su administracin parenteral.
NOMENCLATURA Y DEFINICIONES
Nomenclatura1
Definiciones
PRODUCTOS BIOLGICOS
Las definiciones Farmacopeicas de preparaciones estriles para uso parenteral no se aplican generalmente en el caso de productos biolgicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biolgicos 1041).
INGREDIENTES
Vehculos y Sustancias Agregadas
Vehculos AcuososLos vehculos para Inyecciones acuosas cumplen con los requisitos de la Prueba de Pirgenos 151 o
de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85, segn corresponda. El Agua para Inyeccin se emplea generalmente como vehculo, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. El cloruro de sodio se puede agregar en cantidades
suficientes para convertir la solucin resultante en isotnica; y la Inyeccin de Cloruro de Sodio, o la Solucin de Ringer Inyectable,
1 El Comit de Nomenclatura de Frmacos de la USP ha adoptado esta nomenclatura para implementarla mediante revisiones suplementarias de USP 34NF 29.
Para los ttulos de las monografas oficiales vigentes de la forma [FRMACO] Estril que no hayan sido revisados todava, la siguiente nomenclatura contina en uso
en esta Farmacopea: (1) los frmacos, o sus soluciones o emulsiones, aptas para inyeccin, llevan ttulos de la forma [FRMACO], Inyeccin; (2) los slidos secos o
lquidos concentrados que no contengan amortiguadores del pH, diluyentes ni otras sustancias agregadas y que, al aadir los disolventes adecuados, constituyen
soluciones que cumplen con los requisitos para Inyecciones en todos los aspectos, y que se distinguen mediante ttulos de la forma [FRMACO] Estril; (3) las
mismas preparaciones descritas en (2) excepto que stas contienen uno o ms amortiguadores del pH, diluyentes, u otras sustancias agregadas, y que se
identifican por ttulos de la forma [FRMACO] para Inyeccin; (4) slidos suspendidos en un medio lquido adecuado y que no son para inyeccin por va
intravenosa o intratecal, se identifican por ttulos de la forma [FRMACO], Suspensin Estril; y (5) slidos secos que, al agregarles vehculos adecuados, forman
preparaciones que cumplen con todos los requisitos para las Suspensiones Estriles y se distinguen por ttulos de la forma [FRMACO] Estril para Suspensin.
Captulos
La siguiente nomenclatura corresponde a cinco tipos generales de preparaciones apropiadas y destinadas para la administracin parenteral. Pueden contener amortiguadores del pH, conservantes y otras sustancias agregadas.
1. Inyeccin de [FRMACO]Preparaciones lquidas que son frmacos o sus soluciones. [NOTAEn los ttulos de las monografas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre aparece en forma invertida, como [FRMACO],
Inyeccin.]
2. [FRMACO] para InyeccinSlidos secos que al agregarles vehculos adecuados constituyen soluciones que cumplen con
todos los requisitos para Inyecciones.
3. Emulsin Inyectable de [FRMACO]Preparaciones lquidas de frmacos disueltos o dispersos en un medio emulsionante
adecuado. [NOTAEn los ttulos de las monografas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre
aparece en forma invertida, como [FRMACO], Emulsin Inyectable.]
4. Suspensin Inyectable de [FRMACO]Preparaciones lquidas de slidos suspendidos en un medio lquido adecuado.
[NOTAEn los ttulos de las monografas y para facilitar el ordenamiento del libro y su indexacin, este nombre aparece
en forma invertida como [FRMACO], Suspensin Inyectable.]
5. [FRMACO] para Suspensin InyectableSlidos secos que al aadirles vehculos adecuados constituyen preparaciones que
cumplen con todos los requisitos para Suspensiones Inyectables.
Captulos
66 1 Inyectables / Requisitos Generales
USP 38
pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyeccin, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Para condiciones aplicables a otros adyuvantes, ver Sustancias Agregadas en este captulo.
Otros VehculosLos aceites fijos empleados como vehculos para Inyecciones no acuosas son de origen vegetal, son inodoros o prcticamente inodoros, y no tienen ningn olor que sugiera rancidez. Cumplen con los requisitos de la prueba para
Parafina Slida en Aceite Mineral, mantenindose el bao fro a 10, tienen un ndice de Saponificacin entre 185 y 200 (ver
Grasas y Aceites Fijos 401), tienen un ndice de Yodo entre 79 y 141 (ver Grasas y Aceites Fijos 401), y cumplen con los requisitos de las pruebas siguientes.
Materia Insaponificable (ver Grasas y Aceites Fijos 401): No ms de 1,5%
ndice de Acidez (ver Grasas y Aceites Fijos 401): No ms de 0,2
ndice de Perxido (ver Grasas y Aceites Fijos 401): No ms de 5,0
Determinacin de Agua, Mtodo Ic 921: No ms de 0,1%
Lmite de Cobre, Hierro, Plomo y Nquel[NOTALa prueba para nquel se requiere nicamente si el aceite ha sido sometido
a hidrogenacin o si se ha usado un catalizador de nquel durante el procesamiento.] Proceder segn se indica en la seccin
Trazas de Metales en Grasas y Aceites Fijos 401. No se encuentra ms de 1 ppm de cobre; no se encuentra ms de 1 ppm de
hierro; no se encuentra ms de 1 ppm de plomo; y no se encuentra ms de 1 ppm de nquel.
Los monoglicridos o diglicridos sintticos de cidos grasos se pueden emplear como vehculos, siempre que sean lquidos,
se mantengan transparentes cuando se enfran a 10 y presenten un ndice de Yodo no mayor de 140 (ver Grasas y Aceites Fijos
401).
Se pueden emplear estos y otros vehculos no acuosos, siempre que sean seguros, en el volumen de la Inyeccin administrada y siempre que no interfieran con la eficacia teraputica de la preparacin o con su respuesta a las valoraciones y pruebas
especificadas.
Sustancias AgregadasSe pueden agregar sustancias adecuadas para aumentar la estabilidad o la utilidad de las inyecciones, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, siempre que sean inocuas en las cantidades administradas y no interfieran con la eficacia teraputica o con las respuestas a las valoraciones o pruebas especificadas. No se pueden agregar colorantes a una solucin destinada a la administracin parenteral con el nico propsito de conferir color a la
preparacin terminada (ver adems Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51).
Debe tenerse especial cuidado en la eleccin y empleo de sustancias agregadas en las preparaciones para inyeccin que se
administran en un volumen superior a 5 mL. A menos que se especifique algo diferente, prevalecen los siguientes lmites mximos: 0,01% para agentes que contengan mercurio y para compuestos tensoactivos catinicos; 0,5% para clorobutanol, cresol,
fenol y sustancias de tipo similar; y 0,2% para dixido de azufre, o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito, o metabisulfito de potasio o de sodio.
A las preparaciones destinadas para inyeccin que se presenten en envases multidosis, independientemente del mtodo de
esterilizacin empleado, se les debe agregar una sustancia o una mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento
de microorganismos, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) hay instrucciones diferentes en la monografa individual; (2) la sustancia contiene un radionucleido con una vida media fsica de menos de 24 horas; o (3) los ingredientes activos son antimicrobianos. Tales sustancias se emplean en concentraciones que impidan el crecimiento o la existencia
de los microorganismos en las preparaciones para inyeccin. Tales sustancias cumplen adems con los requisitos de Pruebas de
Eficacia Antimicrobiana 51 y Agentes AntimicrobianosContenido 341. Los procesos de esterilizacin han de ser usados aunque se empleen dichas sustancias (ver adems Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211). Se puede extraer el aire del envase, o desplazarlo con un gas qumicamente inerte. Cuando as se especifique en una monografa, el
etiquetado debe incluir informacin sobre la sensibilidad al oxgeno del artculo.
ETIQUETAS Y ETIQUETADO
Etiquetado
NOTAVer las definiciones de etiqueta y etiquetado en la seccin 10.40, Etiquetado del apartado 10. Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales.
La etiqueta indica el nombre de la preparacin; en el caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de frmaco o
la cantidad de un frmaco en un volumen especificado; en el caso de una preparacin seca, la cantidad de ingrediente activo;
la va de administracin; una declaracin de las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad; el nombre y el domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor; y un nmero de lote identificativo. El nmero de lote puede proporcionar todo el historial de fabricacin del envase especfico, incluyendo todas las operaciones de fabricacin, llenado, esterilizacin y etiquetado.
Cuando una monografa individual permita variar las concentraciones de los ingredientes activos en la preparacin parenteral de gran volumen, se indica la concentracin de cada ingrediente nombrado en el ttulo oficial como si fuera parte del ttulo
oficial, es decir, Dextrosa 5%, Inyeccin; o Dextrosa (5%) y Cloruro de Sodio (0,2%), Inyeccin.
El etiquetado incluye la siguiente informacin si no se especifica la frmula completa en la monografa individual: (1) En el
caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de cada ingrediente o la cantidad de cada ingrediente en un volumen especificado, salvo que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para hacer isotnica la solucin se puedan
declarar por el nombre y una indicacin acerca de su efecto; y (2) en el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la
USP 38
que se va a agregar un diluyente antes de utilizarla, la cantidad de cada ingrediente, la composicin del diluyente o diluyentes
recomendados [slo el nombre o nombres, si la frmula se especifica en la monografa individual], la cantidad que se va a
emplear para alcanzar una concentracin especfica de ingrediente activo y el volumen final de la solucin as obtenida, una
breve descripcin del aspecto fsico de la solucin reconstituida, instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solucin
reconstituida y una fecha de caducidad que limite el perodo durante el cual se espera que la solucin reconstituida tenga la
potencia requerida o declarada si se ha almacenado segn se indica.
Los envases de Inyecciones destinadas a dilisis, hemofiltracin o soluciones de irrigacin y que contienen un volumen de
ms de 1 L declaran que el contenido no est destinado para infusin intravenosa.
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario declaran ese fin.
El envase se etiqueta de modo que una superficie suficiente del envase quede sin cubrir en toda su longitud o circunferencia
para permitir la inspeccin del contenido.
CONTENIDO DE SUSTANCIA ACTIVA Y VOLUMEN TOTAL DE PRODUCTOS FARMACUTICOS INYECTABLES MONODOSIS Y
MULTIDOSIS
Aluminio en Preparaciones Parenterales de Gran Volumen (PPGV), Preparaciones Parenterales de

Pequeo Volumen (PPPV) y Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de
Nutricin Parenteral Total (NPT)
(a) El contenido de aluminio de las PPGV usadas en terapia de NPT no debe exceder de 25 mg por L (mg/L).
(b) El prospecto del envase de las PPGV usadas en terapia de NPT debe declarar que el producto farmacutico no contiene
ms de 25 mg de aluminio por L. Esta informacin debe incluirse en la seccin Precauciones del etiquetado de todas las
PPGV usadas en terapia de NPT.
(c) Si la cantidad mxima de aluminio en las PPPV y en los EGF es 25 mg por L (mg/L) o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta de aluminio que contiene cada uno, tal como en el prrafo (d), la etiqueta del envase primario de las PPPV y
los EGF usados en la preparacin de preparaciones parenterales de NPT (con las excepciones que se indican ms adelante)
pueden declarar: No contiene ms de 25 mg/L de aluminio. Si la PPPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del
envase primario puede declarar lo siguiente: Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentracin de aluminio no ser ms de 25 mg/L.
(d) El nivel mximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todas las PPPV
y los EGF usados en la preparacin de artculos parenterales para NPT y emulsiones inyectables. El contenido de aluminio
debe declararse de la siguiente manera: No contiene ms de __ mg/L de aluminio. La etiqueta del envase primario de
todas las PPPV y los EGF que son polvos liofilizados usados en la preparacin de soluciones de NPT deben declarar lo siguiente: Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentracin de aluminio
no ser ms de __ mg/L. Este contenido mximo de aluminio debe declararse como el ms alto entre los tres niveles siguientes:
(1) El nivel ms alto de las partidas producidas durante los ltimos tres aos.
(2) El nivel ms alto de las ltimas cinco partidas.
(3) El nivel mximo con respecto a los niveles histricos, pero slo hasta completar la produccin de las primeras cinco
partidas despus del 26 de julio de 2004.
Captulos
Para productos farmacuticos inyectables monodosis y multidosis, el contenido de sustancia activa por el volumen total debe ser la expresin principal y prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida inmediatamente por el contenido de
sustancia activa por mL entre parntesis. Para envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido de sustancia activa por fraccin de mL debe ser la nica expresin de contenido. El contenido por mL debe expresarse como mg/mL, y
no como mg/1 mL.
Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de ms de 1 mL:
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 500 mg/10 mL
Contenido de sustancia activa/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total de sustancia activa/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido de sustancia activa/mL: 5000 Unidades/mL
El siguiente formato es aceptable para contenidos de menos de 1 mL: 12,5 mg/0,625 mL
Existen, no obstante, algunas excepciones para la expresin del contenido de sustancia activa por volumen total. En algunos
casos, la expresin principal y prominente del contenido total de un frmaco por envase puede no ser efectiva en la prevencin de errores en la administracin y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Un ejemplo de ello es el uso de la lidocana u
otros medicamentos similares empleados como anestsicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje (p.ej., 1%, 2%), o un anestsico local en combinacin con epinefrina que se expresa como una relacin (p.ej.,
1:100 000). En tales casos, se debe expresar el contenido total de sustancia activa: por ejemplo, 1% (100 mg/10 mL). Los slidos secos, los cuales deben ser reconstituidos, deben tambin seguir este formato, con la excepcin de que slo se debe indicar el contenido total del frmaco y no el contenido de sustancia activa/volumen total o el contenido de sustancia activa/mL.
USP 38
El prospecto adjunto en los envases de todas las PPGV, PPPV y los EGF usados en la preparacin de productos para NPT
debe contener una declaracin de advertencia. Esta advertencia debe estar incluida en la seccin Advertencias del etiquetado y debe declarar lo siguiente: ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser txico. El aluminio puede
alcanzar niveles txicos con la administracin parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en
particular tienen mayor riesgo debido a la inmadurez de sus riones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de
calcio y fosfato que contienen aluminio. Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos
prematuros, que reciben niveles de aluminio por va parenteral mayores de 4 mg a 5 mg por kg por da, acumulan aluminio a
niveles asociados con la toxicidad sea y del sistema nervioso central. La acumulacin en los tejidos puede ocurrir incluso con
niveles ms bajos de administracin de productos para NPT.
ENVASADO
Captulos
Envases para Inyecciones

Los envases, incluyendo los cierres, para preparaciones para inyecciones no deben ejercer sobre el contenido ninguna accin
fsica o qumica que pueda alterar de alguna manera la concentracin, calidad o pureza ms all de los requisitos oficiales en
condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Los envases deben estar hechos de un
material que permita la inspeccin del contenido. Por lo general, el tipo de vidrio preferible para cada preparacin parenteral
se indica en la monografa individual. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se pueden emplear envases plsticos para envasar las inyecciones (ver EnvasesPlsticos 661).
Para definiciones de envases monodosis y multidosis, ver las secciones 10.20.70 y 10.20.110, respectivamente, en las Advertencias y Requisitos Generales. Los envases cumplen con los requisitos establecidos en EnvasesVidrio 660 y EnvasesPlsticos
661.
Los envases deben estar cerrados o sellados de tal modo que impidan la contaminacin o la prdida del contenido. La validacin de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminacin por penetracin de microorganismos o de
impurezas qumicas o fsicas. Adems, el envase debe ser capaz de mantener las cantidades totales y relativas o concentraciones especificadas de solutos y del vehculo cuando se expone a condiciones extremas previstas en la fabricacin y procesamiento, almacenamiento, transporte y distribucin. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extraccin del contenido sin quitar o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetracin de una aguja y el cerramiento de inmediato luego de
retirarla, protegiendo el envase de la contaminacin. La validacin de la integridad del envase multidosis debe incluir una verificacin de que un envase de ese tipo impide la contaminacin microbiana o la prdida del contenido del producto en las
condiciones previstas de mltiples entradas y usos.
Los envases para venoclisis en tndem (piggyback containers) son por lo general envases de infusin intravenosa empleados
para administrar una segunda infusin a travs de un conector de algn tipo o a travs de un inyector en el equipo de administracin del primer lquido, evitndose as la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en
tndem son tambin conocidos como envases de infusin secundaria.
Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin

El uso de un sistema de cierre negro en un vial [p.ej., una tapa negra de fcil desprendimiento adherida al casquillo (tapa
flip-off) y un casquillo negro para sostener el cierre elastomrico] o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre
el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin y est
prohibido su uso en cualquier otra inyeccin.
Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaracin de advertencia impresa en los casquillos o en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaracin: Advertencia: Agente Paralizante o Agente Paralizante (dependiendo del tamao del sistema de cierre). Alternativamente, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripcin, de manera que permita la visualizacin
de la declaracin de advertencia sobre el casquillo de cierre.
Envases para Slidos Estriles

Los envases, incluyendo los cierres, para slidos secos destinados para uso parenteral no deben ejercer sobre el contenido
ninguna accin fsica o qumica que altere de alguna manera el contenido, la calidad o la pureza ms all de los requisitos
oficiales, en condiciones normales o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso.
Un envase para un slido estril debe permitir la adicin de un disolvente adecuado y la extraccin de porciones de la solucin o suspensin resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto.
USP 38
Cuando la Valoracin en una monografa indica un procedimiento para la Solucin muestra, donde se deba tomar el contenido total extrable de un envase monodosis con una jeringa y aguja hipodrmica, se extraer ese contenido en la forma ms
completa posible con una jeringa hipodrmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y provista con una aguja nmero 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaucin de expeler cualquier burbuja de aire, y se descargar en un recipiente para dilucin y valoracin.
Contenido del Envase

Cada envase de inyeccin debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de frmaco. Dicha extraccin se debe realizar de acuerdo a las instrucciones del etiquetado, si fueran provistas.
DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE INYECCIN EN LOS ENVASES
Etiquetado en los Casquillos y las Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fcilmente las indicaciones del etiquetado que comunican mensajes de seguridad importantes crticos para evitar situaciones de amenaza de muerte inminente
y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser sencillas, concisas y desprovistas de toda informacin no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no deben incluir ninguna
informacin para que aqullos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr este propsito se requiere un enfoque sistemtico para el etiquetado de los productos inyectables, tal que asegure que los casquillos y tapas de sobre-
Captulos
Esta seccin est armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a esta seccin armonizada. Una porcin del presente texto (ver ms adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; est marcada con
smbolos () para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las preparaciones viscosas y aceitosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosamente justo antes de extraer el contenido. El contenido seguidamente se enfra a una temperatura de 2025C antes de medir
el volumen. Las formulaciones de slidos estriles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de
retirar su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, segn sea apropiado.
Envases MonodosisSeleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 10 mL o ms, 3 envases si el volumen nominal es
ms de 3 mL y menos de 10 mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido
total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y
provista con una aguja nmero 21 de longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada para
contener ms que para verter los volmenes marcados) de un tamao tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% de su volumen graduado. Alternativamente, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la masa, en
g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad suficiente
de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medicin, siempre que, para cada envase, se emplee
un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 10 mL o ms se puede determinar abrindolos
y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volmenes nominales de los envases que se
toman colectivamente.
Envases MultidosisPara Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un nmero especfico de dosis de un volumen determinado, seleccionar 1 envase y proceder segn se indica para los envases monodosis, empleando el mismo nmero
de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos
de la dosis indicada.
Inyecciones en Cartuchos o Jeringas PrellenadasSeleccionar 1 envase si el volumen es 10 mL o ms, 3 envases si el
volumen nominal es ms de 3 mL y menos de 10 mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario,
equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, mbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados
tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el mbolo en forma lenta y continua. Determinar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.
Soluciones Intravenosas de Gran VolumenPara soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a
una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen
nominal de la probeta. Medir el volumen transferido.
El volumen no es menor que el volumen nominal.
USP 38
selloun rea de estos productos debe ser de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de estos medicamentossean reservados para comunicar mensajes crticos de seguridad. En consecuencia:
1. Slo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (crculo) del casquillo y/o la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicacin precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en la tapa, si el casquillo de sobresello es transparente y la indicacin precautoria
debajo de la tapa es fcilmente legible. Una indicacin precautoria es aqulla destinada a prevenir una situacin de amenaza de muerte inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si fuera necesario.
Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias son los siguientes, entre otros: AdvertenciaAgente Paralizante y
Diluir Antes de Usar. El texto de la indicacin precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea fcilmente
visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicacin precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
3. Otras declaraciones o caractersticas que incluyen, entre otros, nmeros o letras de identificacin, como por ejemplo nmeros de cdigos, nmeros de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (crculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o caractersticas en la falda del casquillo no deben distraer o interferir con la indicacin precautoria de la superficie superior.
Captulos
El volumen de inyeccin en envases monodosis proporciona la cantidad especificada para administracin parenteral de una
vez y en ningn caso es ms que el volumen suficiente para permitir la extraccin y administracin de 1 L.
Las preparaciones destinadas para administracin intrarraqudea, intracisternal o peridural se envasan slo en envases monodosis.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, un envase multidosis contiene un volumen de Inyeccin suficiente para permitir la extraccin de no ms de 30 mL.
Las siguientes inyecciones estn exentas de la restriccin de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado:
1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigacin o dilisis peritoneal.
2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutricin parenteral o como lquido de reemplazo o sustitucin para
ser administrado en forma continua durante una hemofiltracin.
Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como lquido durante una hemodilisis u otros procesos de reemplazo mediante administracin intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restriccin de 1 L a menos
que se trate de una excepcin mencionada anteriormente.
Cuando se declara que las inyecciones estn destinadas para uso veterinario, stas estn exentas de los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para envases monodosis y de las limitaciones de volumen para los envases multidosis.
MATERIA EXTRAA Y PARTCULAS

Los artculos destinados a la administracin parenteral deben prepararse de una manera diseada para excluir partculas, segn se define en Partculas en Inyectables 788, y otras materias extraas, segn corresponda para la forma farmacutica. Cada
envase final de todas las preparaciones parenterales debe inspeccionarse en la medida de lo posible para detectar la presencia
de materia extraa y partculas observables (de ahora en adelante denominadas partculas visibles) en su contenido. El proceso de inspeccin debe estar diseado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las preparaciones parenterales
estn prcticamente exentos de partculas visibles. La calificacin del proceso de inspeccin debe realizarse en referencia a las
partculas en el rango visible de un tipo que puede surgir del proceso de fabricacin o llenado. Debe desecharse todo envase
cuyo contenido presente indicios de partculas visibles. La inspeccin para detectar partculas visibles puede realizarse cuando
se lleva a cabo la inspeccin para detectar otros defectos crticos, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema de cierre del envase permite solamente una inspeccin limitada del contenido total, la inspeccin del 100% de un lote debe completarse con la inspeccin de contenidos reconstituidos (p.ej., secos) o
contenidos extrados (p.ej., de un envase mbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Todas las Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis y las Inyecciones de pequeo volumen estn sujetas a los
procedimientos microscpicos o de oscurecimiento de luz y a los lmites de partculas subvisibles especificados en Partculas en
Inyectables 788, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Un artculo envasado como Inyeccin, ya sea de gran volumen o de pequeo volumen, cumple con los requisitos expuestos para Inyecciones de pequeo volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos, si la monografa individual incluye una prueba para
Partculas en Inyectables 788; cumple con los requisitos expuestos en Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis
cuando la etiqueta del envase indica que contiene ms de 100 mL.
USP 38
Requisitos Generales / 2 Medicamentos Orales 71
ESTERILIDAD
Pruebas de EsterilidadLas preparaciones para inyeccin cumplen con los requisitos en Pruebas de Esterilidad 71.
SOLUCIONES RECONSTITUIDAS
Los slidos secos cuyas soluciones reconstituidas se preparan para inyeccin llevan ttulos de la forma [FRMACO] para Inyeccin. Ya que estas formas farmacuticas se reconstituyen en el momento en el que las usar el profesional de salud interviniente, no se incluyen las pruebas y normas para la solucin reconstituida para su administracin en las monografas individuales
para slidos secos o lquidos concentrados estriles. Sin embargo, a los efectos de garantizar la calidad de las preparaciones
inyectables en el momento de ser administradas, se proporcionan las siguientes pruebas no destructivas para demostrar la aptitud de las soluciones reconstituidas cuando se preparan inmediatamente antes de usar.
Totalidad y Transparencia de la SolucinReconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministrado por el
fabricante para la forma farmacutica seca estril.
A: El slido se disuelve completamente, sin dejar ningn residuo visible como materia no disuelta.
B: La solucin reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua
Purificada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar.
PartculasReconstituir la solucin segn se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacutica seca estril: la solucin est esencialmente libre de partculas extraas que se puedan observar en una inspeccin visual.
INTRODUCCIN
La administracin oral es la va de administracin ms comn para medicamentos. Todos los medicamentos orales conllevan
a la accin local y/o sistmica en la cavidad oral y/o en el tracto gastrointestinal. Los medicamentos orales se dividen en dos
categoras principales: slidos y lquidos. Los medicamentos orales slidos incluyen, entre otros, cpsulas, tabletas, grnulos y
polvos. De manera similar, los medicamentos orales lquidos incluyen, entre otros, soluciones, suspensiones y emulsiones. Las
definiciones y descripciones de estas formas farmacuticas, as como informacin abreviada sobre su composicin y procesos
de fabricacin se encuentran en el captulo Formas Famacuticas 1151.1
El presente captulo general 2 se centra en las pruebas de calidad de productos que generalmente son necesarias para medicamentos orales para una sola molcula o una combinacin de molculas pequeas de ingredientes activos. Este captulo no
contempla los productos biolgicos en formas farmacuticas slidas. En este captulo, los trminos frmaco e ingrediente
activo se usan de manera intercambiable. El contenido de este captulo no necesariamente se aplica a medicamentos destinados para un uso distinto a la administracin oral. Por ejemplo, el captulo no trata las formas farmacuticas oromucosas. Algunas de las pruebas indicadas en este captulo se pueden llevar a cabo durante el proceso u omitirse como pruebas de rutina
basndose en la validacin del proceso. Sin embargo, una vez que el producto est en el mercado, ste debe cumplir con los
requisitos farmacopeicos de la USP al momento del muestreo y anlisis.
El captulo 2 provee un marco de sustento para nuevas monografas individuales; stas se consideran documentos de
avance y no pretenden apartarse de las monografas individuales (no reemplazan a las monografas individuales). Adems, el
captulo 2 provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas de manera coherente y
concisa. Cuando exista una monografa, sta contendr todas las pruebas requeridas para la forma farmacutica. Cuando no
exista la monografa de un medicamento especfico, el captulo general proveer las pruebas de calidad especficas disponibles
como recurso para los fabricantes hasta que la USP desarrolle las monografas particulares requeridas para la forma farmacutica. Cuando est disponible un procedimiento de prueba validado para el medicamento especfico, ste se identifica en un captulo general con un nmero inferior a 1000. Para aqullos casos en los que no sea posible recomendar un procedimiento
validado pero se cuente con informacin para la prueba de calidad y/o de desempeo del producto, dicha informacin estar
descrita en un captulo informativo con un nmero superior a 1000.
Pruebas de Calidad y de Desempeo de Medicamentos

Las pruebas, los procedimientos analticos y los criterios de aceptacin de una monografa para medicamentos orales se dividen en dos categoras: (1) aqullas que evalan los atributos generales de calidad del producto y (2) aqullas que evalan el
1 [NOTATodas las referencias a los captulos a partir del 1000 son nicamente para propsitos informativos y para su uso como recurso til. Estos captulos no
son obligatorios a menos que su aplicacin se indique explcitamente.]
Captulos
2 MEDICAMENTOS ORALESPRUEBAS DE CALIDAD DE

PRODUCTOS
72 2 Medicamentos Orales / Requisitos Generales
USP 38
desempeo del producto, el cual es un atributo especfico de calidad generalmente vinculado a los estudios de biodisponibilidad y de bioequivalencia (ver el captulo Evaluacin de Desempeo del Producto FarmacuticoBiodisponibilidad, Bioequivalencia
y Disolucin 1090).1 Las pruebas de calidad del medicamento pretenden evaluar atributos tales como identificacin, contenido (valoracin), impurezas (pruebas universales), uniformidad del contenido de la dosis, pH, llenado mnimo, contenido de
alcohol, contenido voltil y contenido microbiano (pruebas especficas). Las pruebas de desempeo de medicamentos estn
diseadas para evaluar la liberacin de frmacos in vitro a partir de las formas farmacuticas, p.ej., Disolucin 711 y Liberacin
de Frmacos 724. Para medicamentos orales lquidos en solucin, el desempeo se considera ptimo, por lo que no se incluye una prueba de desempeo en la monografa.
Cada uno de estos atributos es importante para adquirir un entendimiento primario de la calidad y desempeo de un medicamento. Por ende, constituyen los cimientos para la monografa. Un producto oficial debe cumplir con todas las pruebas de
calidad de medicamentos y las pruebas de desempeo de medicamentos incluidas en su monografa correspondiente.
[NOTALas pruebas de disolucin, especficamente la similitud del perfil de disolucin entre contenidos mayores y contenidos menores de un producto de un fabricante dado y el perfil de similitud entre el producto genrico y el producto de referencia, se emplean para el otorgamiento de bioexenciones. Ver el captulo 1090.1]
PRUEBAS DE CALIDAD DE PRODUCTOS PARA MEDICAMENTOS ORALES
Captulos
Las pruebas de calidad para medicamentos orales se dividen en dos categoras: (1) pruebas universales que se aplican a todos los medicamentos orales y que se deben incluir en la monografa, y (2) pruebas especficas cuya inclusin debe considerarse para tipos especficos de productos orales.
PRUEBAS UNIVERSALES
Los atributos de calidad del producto para formas farmacuticas orales son importantes para asegurar que los productos comercializados cumplan con los requisitos mnimos de calidad. Las pruebas universales deben aplicarse a todas las formas farmacuticas orales y deben incluir Descripcin, Identificacin, Contenido (prueba de valoracin) e Impurezas (orgnicas, inorgnicas y disolventes residuales).
DESCRIPCIN
La descripcin tiene un carcter general y no constituye una norma por s misma. sta comunica la aparicin de un artculo
que cumple con los estndares de la monografa.
IDENTIFICACIN
La prueba de identificacin se define en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40 y se incluye en una monografa para
ayudar a confirmar que el artculo contiene el frmaco declarado en la etiqueta mediante una identificacin positiva del frmaco o de las sustancias en un medicamento.
Un mtodo para confirmar la identidad consiste en comparar el tiempo de retencin de la muestra con el obtenido en inyecciones estndar en un procedimiento cromatogrfico de valoracin. Otros mtodos que a menudo se usan para confirmar
ortogonalmente la identidad del ingrediente activo son: Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada 201, Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica 197, Resonancia Magntica Nuclear 761, Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano
11191 y Espectroscopa Raman 1120,1 entre otros. El procedimiento analtico debe ser capaz de distinguir entre el ingrediente activo y todos los excipientes que estn presentes o de los productos de degradacin potenciales que pudieran estar presentes. Se debe tener cuidado de asegurar que el sistema cromatogrfico separa el artculo de otros frmacos, impurezas y aditivos estrechamente relacionados. La absorcin en el infrarrojo y en el ultravioleta tambin se pueden usar para la identificacin
(ver el captulo 197), cuando se haya demostrado que el procedimiento es selectivo para el frmaco mediante un estudio de
validacin o verificacin apropiado. Los resultados de la prueba de identificacin deben compararse con los resultados obtenidos de un estndar de referencia adecuado preparado de manera similar.
VALORACIN
La valoracin es una prueba especfica e indicadora de la estabilidad para determinar la potencia (contenido) del medicamento. Cuando se justifica una valoracin no especfica (p.ej., volumetra), se debe asegurar mediante otros procedimientos
analticos de sustento la capacidad de detectar cualquier especie interferente. En general, la aceptacin a priori de una variacin de 10% en los lmites de un atributo de calidad (p.ej., valoracin) a partir de la cantidad declarada esperada (100%) en
la mayora de los casos pretende tomar en cuenta la variabilidad de la fabricacin y la estabilidad durante la vida til, y se basa
principalmente en la nocin de que tal variacin en un atributo de calidad tiene una menor probabilidad de ocasionar un impacto adverso perceptible en el resultado clnico deseado. Los criterios de aceptacin de 95,0%105,0% se usan con justifica-
USP 38
cin (p.ej., para medicamentos con un ndice teraputico estrecho). Tambin se aceptan las valoraciones de actividad y las
valoraciones de contenido absoluto siempre que se justifique.
IMPUREZAS
El frmaco y los excipientes usados en la fabricacin del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproductos sintticos y otras impurezas inorgnicas y orgnicas. Los lmites de dichas impurezas estn indicados en las monografas del
frmaco y de los excipientes. Existe la posibilidad de que ocurra degradacin durante la fabricacin del producto y durante su
vida til, la cual, entre otros factores, puede resultar de la degradacin del frmaco o de interacciones entre el frmaco y los
excipientes. Los procedimientos y criterios de aceptacin deben limitar especficamente los materiales txicos. Ver los requisitos especficos en las Advertencias Generales de la USP, 5.60 Impurezas y Sustancias Extraas. [NOTAPara informacin adicional, consultar el captulo Impurezas en Frmacos y Productos Farmacuticos 1086.1]
PRUEBAS ESPECFICAS PARA TABLETAS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para tabletas, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.
CONTENIDO VOLTIL
DESINTEGRACIN
La desintegracin es un atributo esencial de los slidos orales, excepto para aqullos destinados a ser masticados antes de
tragarlos y para los productos de liberacin retardada o prolongada. Esta prueba mide el tiempo que tarda en desintegrarse la
unidad de dosificacin en un medio acuoso y se describe en detalle en el captulo 701. Para algunas formas farmacuticas,
p.ej., tabletas efervescentes, tabletas de desintegracin, tabletas solubles, entre otros, la Farmacopea Europea describe en gran
detalle la prueba de desintegracin. La prueba de desintegracin para algunas de las formas farmacuticas de este captulo se
incluye para proveer informacin de integridad. Para informacin sobre procedimientos detallados, consultar el captulo 701
o la Farmacopea Europea. Siempre que se incluye, la prueba de desintegracin se usa nicamente como una prueba de control
de calidad y no como una prueba de desempeo del producto, y debe cumplir con las especificaciones de la monografa. Una
prueba de desintegracin podr usarse como una prueba de desempeo del producto nicamente cuando la desintegracin
se haya correlacionado con la disolucin de una forma farmacutica (Pauta Q6A de la ICH, disponible en www.ich.org). Para
todos los dems casos, se deber considerar una prueba de disolucin como una prueba de desempeo del producto.
FRIABILIDAD DE LAS TABLETAS

El procedimiento de prueba se aplica a la mayora de las tabletas comprimidas sin cubierta. La friabilidad determina la capacidad de las tabletas para soportar las tensiones mecnicas y su resistencia a la formacin de astillas y a la abrasin en la superficie. [NOTAPara informacin adicional, consultar el captulo Friabilidad de las Tabletas 1216.1]
FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS

La fuerza de ruptura de las tabletas mide la integridad mecnica de las tabletas, que es la fuerza requerida para provocar que
fallen (es decir, que se rompan) en un plano especfico. [NOTAPara informacin adicional, ver el captulo Fuerza de Ruptura de
las Tabletas 1217.1]
UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

La uniformidad de unidades de dosificacin debe demostrarse mediante uniformidad de contenido o variacin de peso. La
uniformidad de contenido se basa en la valoracin del contenido individual de frmacos en un nmero de unidades de dosificacin para determinar si los contenidos individuales son lo suficientemente cercanos a la cantidad declarada. La variacin de
Captulos
La prueba y el mtodo especfico dependen de la naturaleza del artculo. Se debe tener consideracin especial a las formas
farmacuticas cuyo contenido de agua pudiera ser un potencial atributo de calidad y a los productos en los que se emplean
disolventes para la fabricacin del medicamento.
Cuando la presencia de humedad u otro material voltil pueda tornarse crtica, los analistas deben determinar la cantidad de
disolventes voltiles no unidos o de materia voltil de cualquier tipo separado mediante Prdida por Secado 731 u otra tcnica
adecuada (p.ej., actividad del agua). Para sustancias que parecen contener agua como el nico componente voltil, el procedimiento provisto en el captulo Determinacin de Agua 921 puede ser apropiado. Para los medicamentos, los analistas tambin
deben consultar el captulo Disolventes Residuales 467.
USP 38
peso se puede usar como alternativa para estimar la uniformidad del contenido ante ciertas condiciones (ver el captulo Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905).
Captulos
TABLETAS SIN CUBIERTA

Las tabletas sin cubierta incluyen tabletas de una sola capa que resultan de una sola compresin de partculas y tabletas de
capas mltiples que constan de capas concntricas o paralelas obtenidas mediante compresin sucesiva de partculas de composicin diferente. Los excipientes usados generalmente no tienen el propsito especfico de modificar la liberacin del frmaco en los fluidos digestivos. Las tabletas sin cubierta incluyen, entre otras, las siguientes: tabletas efervescentes, tabletas bucales, tabletas sublinguales, tabletas masticables, tabletas de desintegracin, tabletas de desintegracin oral, bolos, tabletas solubles, tabletas para solucin oral y tabletas para suspensin oral. Los bolos, que son tabletas grandes y alargadas destinadas
para administrarse en animales, deben considerarse tabletas sin cubierta y deben cumplir con los requisitos de calidad del producto. Para las tabletas sin cubierta, la desintegracin debe analizarse segn lo indicado en el captulo 701.
TABLETAS BUCALES, SUBLINGUALES Y DE DESINTEGRACIN ORAL (DE DISPERSIN ORAL)
Estas formas farmacuticas se estudiarn en el nuevo captulo Medicamentos para MucosasPruebas de Calidad de Productos
4, el cual se publicar en un futuro. Se citan en este captulo slo para propsitos informativos y para proveer informacin
completa.
TABLETAS MASTICABLES
Las tabletas masticables no requieren cumplir con la prueba de desintegracin. Las tabletas masticables (intactas) deben someterse a la prueba de disolucin, como una prueba de desempeo del producto (cuando se cite en la monografa), debido a
que podran ser tragadas por un paciente sin haberlas masticado apropiadamente. En general, las condiciones de la prueba de
disolucin para tabletas masticables deben ser las mismas que para las tabletas no masticables de la misma fraccin o ingrediente activo.
TABLETAS DE DESINTEGRACIN O DE DISPERSIN
Se trata de tabletas destinadas para ser dispersadas en agua antes de su administracin para proporcionar una dispersin
homognea.
Finura de la dispersin: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersin sin grumos que pasa a travs de un tamiz N 25 (710 mm).
TABLETAS PARA SOLUCIN ORAL Y TABLETAS PARA SUSPENSIN ORAL
Finura de la dispersin: Colocar 2 tabletas en 100 mL de agua y mezclar hasta que se dispersen por completo. Se obtiene una
dispersin sin grumos que pasa a travs de un tamiz N 25 (710 mm).
TABLETAS RECUBIERTAS
Las tabletas recubiertas son tabletas cubiertas con una o ms capas de mezclas de varias sustancias tales como resinas sintticas o naturales, gomas, gelatinas, diluyentes inactivos e insolubles, azcares, plastificantes, polioles, ceras, materia colorante
autorizada por la autoridad competente y, en ocasiones, sustancias saborizantes y sustancias activas. Las tabletas recubiertas
con azcar o pelcula incluyen, entre otras: tabletas con cubierta simple, tabletas de liberacin prolongada y tabletas de liberacin retardada. Cuando sea aplicable, se debe realizar una prueba de desintegracin segn lo descrito en el captulo 701.
No existen pruebas de calidad adicionales especficas para tabletas de liberacin prolongada ni para tabletas de liberacin
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA CPSULAS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para cpsulas, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.
Las pruebas de calidad del producto que se consideran especficas al tipo de cpsula incluyen aqullas para contenido voltil
(captulos 731 y 921). Las cpsulas de una pieza a menudo se usan para administrar un frmaco como solucin o suspensin. Las cpsulas de dos piezas constan de dos piezas telescpicas de tapa y cuerpo de diversos tamaos estndar y se usan
para administrar material slido como polvo, grnulos o tabletas pequeas. Las cpsulas de liberacin modificada incluyen,
entre otras: cpsulas de liberacin retardada y cpsulas de liberacin prolongada.
Desintegracin: Proceder segn se indica en el captulo 701, Cpsulas de Gelatina Blanda para cpsulas de una pieza y Cpsulas de Gelatina Dura para cpsulas de dos piezas. La desintegracin para cpsulas de liberacin modificada se describe en
sumo detalle en la Farmacopea Europea.
No existen pruebas de calidad adicionales especficas para cpsulas de liberacin prolongada ni para cpsulas de liberacin
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.
USP 38
PRUEBAS ESPECFICAS PARA GRNULOS

Adems de las pruebas universales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para grnulos, dependiendo de la naturaleza del frmaco y de la formulacin.
Los grnulos son formas farmacuticas slidas que estn compuestas de aglomeraciones de partculas ms pequeas. Los
grnulos incluyen, entre otros: grnulos efervescentes, grnulos recubiertos, grnulos de liberacin prolongada y grnulos de
liberacin retardada.
Las pruebas que se consideran especficas para el tipo de grnulos incluyen contenido voltil (captulos 731 y 921). La
desintegracin para grnulos efervescentes se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. Basndose en la naturaleza
del artculo y en criterios cientficos, podran ser aplicables pruebas adicionales, incluida la finura de polvos, entre otras.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA POLVOS

Los polvos orales deben indicar lo siguiente: Slo para Uso Oral. Las pruebas que se consideran especficas para el tipo de
polvo incluyen: Llenado Mnimo 755 y contenido voltil (captulos 731 y 921).
El captulo Llenado Mnimo 755 presenta especificaciones aplicables a los polvos orales.
Basndose en la naturaleza del artculo y en criterios cientficos, podran ser aplicables pruebas adicionales, incluidos el pH en
soluciones acuosas, la finura de polvos, los lmites microbanos, entre otros.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA LQUIDOS
VOLUMEN DE ENTREGA
Cuando la formulacin lquida se envasa en un envase multidosis, se debe cumplir con el captulo Volumen de Entrega 698.
DETERMINACIN DE ALCOHOL
Si la formulacin lquida contiene una cantidad de alcohol, se debe incluir el captulo Determinacin de Alcohol 611. Los
lmites pueden ser una concentracin absoluta, en porcentaje, o relativos a un contenido declarado.
PH
Los productos orales lquidos generalmente son formulaciones acuosas que son susceptibles a cambios en el pH derivados de
la exposicin al CO2 atmosfrico. El ingreso de CO2 atmosfrico y el cambio en el pH de los productos orales lquidos nicamente es relevante para los productos acuosos. Aunque es menos crtico que para las preparaciones oftlmicas, el pH de una
formulacin lquida puede afectar el sabor y la estabilidad. El intervalo de pH conforme a lo descrito en el captulo pH 791 se
indica en la monografa.
CONTENIDO MICROBIANO
La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estriles tiene el potencial de reducir o incluso inactivar la actividad teraputica del producto, y tiene el potencial de afectar adversamente la salud del paciente. Algunos productos orales
lquidos pueden estar sujetos a un control microbiolgico extremo, mientras que otros no requieren control alguno. La necesidad de especificaciones microbianas para un producto oral lquido dado depende de su formulacin y uso y se indica en la
monografa.
[NOTAPara informacin adicional, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Criterios de Aceptacin para Preparaciones Farmacuticas y Sustancias de Uso Farmacutico 1111.1]
ANTIOXIDANTE
Se debe realizar una prueba de liberacin. La prueba para vida til podra no ser necesaria cuando los datos de desarrollo y
estabilidad as lo justifiquen (Pauta Q6A de la ICH).
Captulos
Las pruebas de calidad del producto recomendadas para un medicamento lquido incluyen las pruebas universales descritas
anteriormente y las pruebas especficas incluidas ms adelante. La mayora de las pruebas de calidad para lquidos requieren la
evaluacin de productos monodosis para estimar el atributo de calidad. Las instrucciones especficas para realizar las pruebas
de calidad para productos monodosis o multidosis se proveen en la monografa o en el captulo general. Por ejemplo, la variacin de peso se puede usar cuando se controla adecuadamente la aptitud de mezclado para las sustancias activas y los excipientes en la mezcla para asegurar su distribucin uniforme, como en el caso de las soluciones.
USP 38
SUSTANCIAS EXTRABLES
Cuando los datos de estabilidad y desarrollo no presentan evidencia significativa de productos extrables, se puede proponer
la eliminacin de esta prueba. Cuando los datos demuestren la necesidad de criterios de aceptacin para soluciones orales
tapn de goma, recubrimiento interno de la tapa, frasco de plsticose deben recopilar datos tan pronto como sea posible
durante el proceso de desarrollo (Pauta Q6A de la ICH).
TIPOS DE FORMAS FARMACUTICAS LQUIDAS
Captulos
Las pruebas de calidad especficas para estas formas farmacuticas se proveen en sus respectivas monografas.
SOLUCIONES ORALES Y POLVOS Y GRNULOS PARA SOLUCIN
Las pruebas para formulaciones para Solucin se llevan a cabo en una solucin bien mezclada del medicamento reconstituido segn se indica en el etiquetado.
EMULSIONES, SUSPENSIONES Y POLVOS Y GRNULOS PARA SUSPENSIN
Las pruebas para formulaciones para Suspensin se llevan a cabo en una suspensin bien mezclada del medicamento reconstituido segn se indica en el etiquetado. Las pruebas de calidad del producto para suspensiones debe incluir al menos una
prueba de capacidad de suspensin.
POLVOS Y GRNULOS PARA JARABES Y POLVOS PARA GOTAS ORALES
Despus de su disolucin o suspensin, cumplen con los requisitos de la monografa para la forma farmacutica final. El contenido voltil (captulos 731 y 921) puede ser una prueba de calidad adicional para polvos y grnulos para reconstitucin.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA FORMAS FARMACUTICAS ORALES MISCELNEAS

PRODUCTOS ORALES LIOFILIZADOS
Determinacin de Agua 921, Mtodo Ia: Los productos orales liofilizados cumplen con la prueba. Los lmites se aprueban
segn lo indicado en la monografa especfica.
3 MEDICAMENTOS TPICOS Y TRANSDRMICOSPRUEBAS DE

CALIDAD DEL PRODUCTO
INTRODUCCIN
Los medicamentos de aplicacin tpica se dividen en dos categoras generales: medicamentos que se aplican para generar
una accin localizada y los que se aplican para conseguir efectos sistmicos despus de su absorcin a travs de la piel en el
torrente sanguneo. La accin localizada puede presentarse en la superficie del sitio de aplicacin (p.ej., estrato crneo, epitelio
ocular), en los tejidos subyacentes (p.ej., epidermis y/o dermis) y en tejidos subcutneos (p.ej., msculo o articulacin).
Los medicamentos de aplicacin tpica incluyen, entre otros, cremas, geles, ungentos, pastas, suspensiones, lociones, espumas, atomizadores, aerosoles, soluciones y sistemas transdrmicos de liberacin de frmacos (STD, tambin conocidos como parches). Las definiciones y descripciones de estas formas farmacuticas, as como una breve informacin sobre su composicin y/o proceso de fabricacin, se encuentran disponibles en el captulo Formas Farmacuticas 1151.
Los procedimientos y criterios de aceptacin aceptables para analizar los medicamentos de aplicacin tpica se pueden dividir en dos clases: aqullos que evalan los atributos generales de calidad del producto y aqullos que evalan el desempeo
del producto. Los atributos de calidad del producto incluyen: descripcin, identificacin, valoracin (contenido), impurezas,
propiedades fisicoqumicas, uniformidad de unidades de dosificacin, contenido de agua, pH, viscosidad aparente, lmites microbianos, contenido de conservantes antimicrobianos, contenido de antioxidantes, esterilidad (cuando corresponda), as como otras pruebas especficas para cada producto. Las pruebas de desempeo del producto evalan la liberacin de frmacos y
dems atributos que afectan la liberacin de los frmacos de la forma farmacutica terminada.
Aunque la mayora de los productos de aplicacin tpica son semislidos, lquidos o suspensiones, los STD son dispositivos
que se aplican sobre la piel y varan en su composicin y mtodo de fabricacin. Los STD liberan sus ingredientes activos mediante diversos mecanismos, los cuales pueden ser pasivos o activos. Este captulo abarca nicamente las pruebas relacionadas
con STD pasivos.
USP 38
Requisitos Generales / 3 Medicamentos Tpicos y Transdrmicos 77
PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA MEDICAMENTOS DE APLICACIN TPICA

Pruebas Universales
Pruebas Especficas
Adems de las pruebas universales citadas anteriormente, se deben considerar las siguientes pruebas especficas para cada
caso en particular.
Uniformidad de unidades de dosificacin: Esta prueba se aplica a los STD y a las formas farmacuticas en envases unitarios (ver Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905).
Contenido de agua: Cuando resulte apropiado, se debe incluir una prueba de contenido de agua (ver Determinacin de
Agua 921). Esta prueba por lo general depende de la formulacin. Por lo tanto, no se incluye en la monografa oficial del
medicamento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el mismo.
Lmites microbiolgicos: El examen microbiolgico para medicamentos no estriles se realiza en conformidad con los
mtodos provistos en los captulos generales Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
61 y Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos 62, a menos que se haya demostrado que la formulacin posee por s misma propiedades antimicrobianas. Los criterios de aceptacin para medicamentos no
estriles basados en el recuento total de microorganismos aerobios (TAMC, por sus siglas en ingls) y en el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (TYMC, por sus siglas en ingls) se proporcionan en el captulo Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Criterios de Aceptacin para Preparaciones Farmacuticas y Sustancias de Uso Farmacutico 1111.
Contenido de conservantes antimicrobianos: Se deben establecer criterios de aceptacin para el contenido de conservantes antimicrobianos en productos multidosis. Dichos criterios deben basarse en los niveles de conservante antimicrobiano
necesarios para mantener la calidad microbiolgica del producto durante todas las etapas de su uso y vida til propuestos (ver
Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51).
Contenido de antioxidantes: Si el medicamento contiene antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar su
contenido, a menos que se pueda detectar su degradacin por oxidacin empleando otro mtodo de prueba, como por ejemplo, una prueba de impurezas. Se deben establecer criterios de aceptacin para el contenido de antioxidantes. Dichos criterios
deben basarse en los niveles de antioxidante necesarios para mantener la estabilidad del producto durante todas las etapas de
su uso y vida til propuestos.
Esterilidad: Dependiendo del uso de la forma farmacutica (p.ej., preparaciones oftlmicas, productos que se aplicarn a
heridas abiertas o reas con quemaduras), se deber demostrar la esterilidad del producto segn corresponda (ver Pruebas de
Esterilidad 71).
pH: Cuando corresponda, el pH de los medicamentos de aplicacin tpica deber analizarse al momento de la liberacin
de la partida y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas. Algunos medicamentos
de aplicacin tpica contienen cantidades muy limitadas de agua o fase acuosa, por lo que no siempre se requiere la medicin
Captulos
Las pruebas universales (ver Gua Q6A de la ICHSpecifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances [Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptacin para
Nuevos Frmacos y Nuevos Medicamentos: Sustancias Qumicas], disponible en www.ich.org) se listan a continuacin y se
aplican a todos los medicamentos de aplicacin tpica.
Descripcin: Se debe proporcionar una descripcin cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptacin deben incluir
el aspecto final aceptable de la forma farmacutica terminada y del envase. El examen visual debe identificar los cambios de
color, migracin adhesiva (es decir, flujo fro) para STD, separaciones, cristalizacin, entre otros, que sean especficos del medicamento. La descripcin debe especificar el contenido o la cantidad declarada en la etiqueta del artculo. sta ltima no es una
prueba farmacopeica, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el medicamento.
Identificacin: Las pruebas de identificacin se discuten en las Advertencias y Requisitos Generales, 5.40. Las pruebas de
identificacin deben establecer la identidad del o de los frmacos presentes en el artculo y deben distinguir entre compuestos
con estructuras estrechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identidad deben ser especficas para
el o los frmacos (p.ej., espectroscopa en el infrarrojo). Los mtodos de espectrofotometra en el Infrarrojo Cercano (NIR, por
sus siglas en ingls) o Raman tambin podran ser aceptables para la identificacin del producto farmacutico (ver Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano 1119 y Espectroscopa Raman 1120). La identificacin mediante un tiempo de retencin cromatogrfico nico no es especfica.
Valoracin: Se debe usar una prueba especfica e indicadora de la estabilidad para determinar el contenido del medicamento. Para los casos en los que se justifica el uso de una valoracin no especfica, (p.ej., Volumetra 541), se deben usar
otros procedimientos analticos de respaldo para conseguir la especificidad general.
Impurezas: El frmaco y los excipientes usados en la fabricacin del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproductos sintticos, impurezas asociadas con el adhesivo (p.ej., monmeros residuales), disolventes residuales (ver Disolventes Residuales 467), metales pesados (ver Metales Pesados 231), entre otras impurezas inorgnicas y orgnicas, las cuales deben ser evaluadas y controladas. Asimismo, se deben evaluar y controlar las impurezas producidas por la degradacin del
frmaco, as como aqullas producidas durante el proceso de fabricacin del medicamento.
78 3 Medicamentos Tpicos y Transdrmicos / Requisitos Generales
USP 38
de su pH. Esta prueba por lo general depende de la formulacin. Por lo tanto, no se incluye en la monografa oficial del medicamento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el mismo.
Tamao de partcula: Por lo general, la determinacin y el control del tamao de partcula de los frmacos activos en
medicamentos de aplicacin tpica se llevan a cabo en la etapa de desarrollo de la formulacin. No obstante, los medicamentos de aplicacin tpica deben ser examinados para detectar cualquier alteracin del tamao de partcula (es decir, apariencia
de las partculas, cambios de forma, tamao, hbito o agregacin de las partculas) del frmaco que pudiera ocurrir durante el
procesamiento y almacenamiento del producto. Dichos exmenes se deben realizar al momento de la liberacin de la partida
y en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para el monitoreo entre partidas, debido a que los cambios visiblemente observables (macro y microscpicamente) podran comprometer la integridad y/o el desempeo del medicamento. Estos tipos de pruebas por lo general dependen de la formulacin, por lo que no se incluyen en las monografas oficiales pero
forman parte de la especificacin del fabricante para el mismo.
Captulos
PRUEBAS ESPECFICAS PARA MEDICAMENTOS OFTLMICOS

Las formas farmacuticas oftlmicas deben cumplir con los requisitos del captulo Pruebas de Esterilidad 71. Si los ingredientes especficos usados en la formulacin no son susceptibles a las tcnicas de esterilizacin de rutina, se pueden usar ingredientes que cumplan con los requisitos de esterilidad descritos en 71, junto con una fabricacin asptica. Cada preparacin oftlmica para usos mltiples debe contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para destruir o impedir la proliferacin
de los microorganismos accidentalmente introducidos al usar el producto (ver Sustancias Agregadas en Ungentos Oftlmicos
771), a menos que se indique algo distinto en la monografa individual o a menos que la frmula misma sea bacteriosttica
y/o el sistema de administracin promueva la bacteriostasis. La preparacin oftlmica terminada debe estar exenta de partculas grandes y debe cumplir con los requisitos de Prdida y Partculas Metlicas 771. Los envases primarios para preparaciones
oftlmicas deben ser estriles al momento de llenarlos y cerrarlos. Es obligatorio sellar los envases primarios para preparaciones
oftlmicas con un cierre que evidencie la alteracin intencional para asegurar la esterilidad al momento del primer uso.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA MEDICAMENTOS SEMISLIDOS DE APLICACIN TPICA

Viscosidad Aparente
La viscosidad es una medida de la resistencia de la formulacin al flujo, adems de una evaluacin de las propiedades reolgicas de la forma farmacutica (p.ej., formas farmacuticas semislidas). Debido a que nicamente los fluidos newtonianos poseen una viscosidad medible que no depende de la velocidad de cizallamiento, las formas farmacuticas semislidas que no
son newtonianas presentan una vicosidad aparente.
La viscosidad aparente de los medicamentos semislidos se debe analizar al momento de la liberacin de la partida e, inicialmente, en los tiempos de muestreo de estabilidad designados para establecer las especificaciones para el monitoreo entre partidas y de vida til. Se deben desarrollar procedimientos de medicin de acuerdo a lo indicado en ViscosidadMtodos Capilares 911 (AF 01-may-2015). Para semislidos tixotrpicos y/o que presentan cambios irreversibles en la viscosidad despus del cizallamiento, se debe prestar especial atencin a los procedimientos de preparacin de la muestra para minimizar la variabilidad
en las mediciones de viscocidad aparente ocasionadas por el historial variable de cizallamiento (p.ej., velocidad y temperatura
de mezclado, operacin de llenado, manipulacin de las muestras). Adems, en el caso de algunos productos, puede ser necesario contar con especificaciones de viscosidad aparente para ms de un conjunto de condiciones (p.ej., etapa de proceso a
granel, producto final envasado, velocidades altas y bajas de cizallamiento, diferentes temperaturas).
Se deben establecer especificaciones de viscosidad aparente basadas en datos obtenidos durante el desarrollo del producto y
el anlisis de la vida til, para la liberacin de la partida y durante toda la vida til propuesta.
La prueba de viscosidad aparente depende de la formulacin y/o del proceso. Por lo tanto, no se incluye en la monografa
oficial del medicamento, pero forma parte de la especificacin del fabricante para el medicamento. Asimismo, las especificaciones de viscosidad aparente para formas farmacuticas semislidas pueden variar al momento de la liberacin de la partida y
durante la prueba de estabilidad. Aunque la viscosidad aparente del medicamento terminado al momento de la liberacin de
la partida debe cumplir con las especificaciones de desarrollo del mismo, para la prueba de estabilidad, las especificaciones de
viscosidad aparente para el medicamento deben basarse en la evaluacin estadstica del producto durante su vida til.
Uniformidad en los Envases

Los medicamentos semislidos de aplicacin tpica pueden presentar una separacin fsica durante los procesos de fabricacin y durante la vida til. Para asegurar la integridad del medicamento, es fundamental evaluar la uniformidad del producto
terminado al momento de la liberacin de la partida y durante la vida til.
USP 38

PRODUCTOS ENVASADOS EN TUBOS
PRODUCTOS ENVASADOS EN ENVASES DIFERENTES A LOS TUBOS
Para los productos semislidos que se envasan en envases diferentes a los tubos, para los que no se pueda usar el mtodo de
muestreo anteriormente presentado, se pueden aceptar otros mtodos como el descrito a continuacin para un tarro.
1. Seleccionar una jeringa adecuada cuya longitud sea suficiente para alcanzar el fondo del recipiente.
2. Retirar y colocar aparte el mbolo de la jeringa, y cortar la parte inferior del cuerpo de la jeringa. El muestreo se debe
llevar a cabo desde un punto a la izquierda/derecha de una lnea media en la superficie del tarro a fin de conservar una
regin intacta en el otro lado para cualquier investigacin adicional (Ver la Figura 1).
Captulos
La uniformidad de contenido dentro de los tubos puede evaluarse de la siguiente manera.

Retirar o cortar con cuidado el sello de la parte inferior del tubo y realizar un corte vertical desde la parte inferior hasta la
parte superior del tubo. Cortar con cuidado alrededor del borde superior del tubo, abrir las dos solapas y sujetarlas de modo
que el producto quede expuesto.
Inspeccionar el producto visualmente para determinar si hay separacin de fases, cambios en la apariencia fsica y la textura,
as como otras propiedades descritas en la prueba de Descripcin. Si no se observa separacin de fases o cambios en la apariencia fsica y la textura, y si el producto cumple con los criterios de aceptacin de Descripcin, proceder segn se indica en las
siguientes secciones. Si el producto presenta una separacin de fases y/o cambios en la apariencia fsica o la textura, el producto no cumple con la prueba de uniformidad de contenido del tubo.
Los procedimientos descritos a continuacin se pueden modificar dependiendo de la sensibilidad del procedimiento cuantitativo usado para determinar la cantidad de frmacos presentes en la formulacin.
Para productos multidosis que contienen 5 g o ms
Procedimiento 1
1. Usando un solo tubo, despus de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de
las partes superior, media e inferior del tubo. El tamao de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una
determinacin cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porcin
del producto usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando
los Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar tres tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Procedimiento 2
1. Usando dos tubos, despus de inspeccionar visualmente el producto, retirar una cantidad apropiada de producto de las
partes superior, media e inferior de cada tubo. El tamao de las muestras debe ser tal que permita realizar al menos una
determinacin cuantitativa de los ingredientes activos. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porcin
del tubo usando cualquier procedimiento cuantitativo apropiado validado y evaluar los resultados de prueba usando los
Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los 12 resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Para productos multidosis que contienen menos de 5 g de producto
1. Analizar porciones de las partes superior e inferior de dos tubos usando el Procedimiento 1 o el Procedimiento 2 descritos
anteriormente. Evaluar los resultados de prueba usando los Criterios de aceptacin A.
2. Si el producto no cumple con los Criterios de aceptacin A, analizar dos tubos adicionales de la misma partida siguiendo el
paso 1 descrito anteriormente y evaluar los ocho resultados de prueba obtenidos usando los Criterios de aceptacin B.
Criterios de aceptacin para la prueba de uniformidad de contenido del tubo (envase): Al determinar la desviacin
estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) de mltiples tubos, determinar primero la varianza a partir de las tres mediciones de cada tubo y promediar todos los tubos. La RSD se calcula usando esta varianza promedio.
Criterios de aceptacin ATodos los resultados estn dentro del intervalo de valoracin del producto y la RSD es no ms de
6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografa oficial. Si la RSD es mayor de 6%, usar los Criterios de
aceptacin B.
Criterios de aceptacin BTodos los resultados estn dentro del intervalo de valoracin del producto y la RSD de los 12 resultados es no ms de 6% o la indicada en las especificaciones del producto o en la monografa oficial.
USP 38
Captulos
Figura 1. Muestreo de un tarro.

3. Presionar lentamente el cuerpo de la jeringa hacia el interior del envase hasta alcanzar el fondo. Luego, hacer girar el cuerpo de la jeringa que contiene el ncleo de la muestra y retirar la jeringa del envase.
4. Insertar el mbolo de la jeringa en el cuerpo y extrudir cuidadosamente el ncleo de la muestra sobre una superficie limpia en tres porciones iguales que representen a las partes superior, media e inferior del envase.
5. Retirar una muestra apropiada, que sea representativa de la porcin media de las partes superior, media e inferior de las
muestras del envase, y analizar de acuerdo con las instrucciones citadas en Productos Envasados en Tubos.
PRUEBAS ESPECFICAS PARA SISTEMAS TRANSDRMICOS DE LIBERACIN DE FRMACOS

Los STD o parches se formulan con una capa de adhesivo para asegurar el contacto ntimo con la piel y para permitir la
administracin de la dosis deseada de frmaco. El adhesivo de los STD debe permitir el fcil desprendimiento de la capa protectora antes de su uso, se debe adherir adecuadamente a la piel humana durante la aplicacin, debe mantener su adhesin a
la piel durante el periodo de uso prescrito y debe permitir el fcil retiro del STD al final de su uso sin dejar residuo u ocasionar
daos a la piel u otros efectos indeseados. Asimismo, los adhesivos deben ser capaces de mantener el desempeo del STD
durante toda la vida til del medicamento.
Por lo general, se emplean tres tipos de pruebas de desprendimiento para STD: prueba de desprendimiento (a partir de un
sustrato estndar), prueba de desprendimiento de la capa protectora y prueba de adherencia.
Los criterios de aceptacin son especficos para cada producto y se definen para asegurar que las propiedades de adhesin
de cada partida de STD estn dentro del intervalo definido por el diseo del producto y que sean uniformes entre partidas,
basndose en las especificaciones de desarrollo del producto o en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto
durante la vida til del mismo.
Prueba de Desprendimiento
Esta prueba mide la fuerza requerida para retirar (desprender) un STD adherido a una superficie de un sustrato estndar
(p.ej., acero inoxidable pulido). El STD se aplica al sustrato usando las tcnicas especificadas para aplicacin y se acondiciona a
una temperatura y tiempo especficos. Luego, el STD se desprende del sustrato con un instrumento que permite controlar el
ngulo de desprendimiento (p.ej., 90 180 grados) y la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/minuto), mientras se
registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El
producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento est fuera del intervalo aceptable, determinado
durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida
til del mismo.
Prueba de Desprendimiento de la Capa Protectora

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la capa protectora de la capa de adhesivo del STD. La prueba se lleva a
cabo con una muestra de producto terminado. La muestra de prueba se acondiciona usando procedimientos especficos (temperatura y tiempo). Luego, la capa protectora se desprende del STD con un instrumento que permite controlar el ngulo de
desprendimiento (p.ej., 90 180 grados) y la velocidad de desprendimiento, mientras se registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si
la fuerza promedio de desprendimiento est fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o
basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida til del mismo.
USP 38
Prueba de Adherencia
Se han desarrollado diversos mtodos para analizar la adherencia, los cuales incluyen, por ejemplo el Mtodo de Adherencia a
Sonda y el Mtodo de Bola Rodante. Queda a criterio del fabricante de STD decidir qu mtodo es el ms adecuado para cada
medicamento.
MTODO DE ADHERENCIA A SONDA
Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la punta de la sonda de prueba de la capa de adhesivo del STD. Esta prueba emplea un instrumento diseado para crear una unin entre la punta de una sonda de prueba de acero inoxidable (con
una geometra definida) y el STD, usando una fuerza controlada (ligera presin) y condiciones de prueba especficas (es decir,
velocidad, tiempo de contacto, presin de contacto, temperatura). Luego, mientras se controla la velocidad de desprendimiento de la sonda, la prueba mide el perfil de la fuerza requerida para separar la punta de la sonda del STD y la fuerza mxima requerida para romper la unin (adherencia). Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si el resultado de prueba promedio (perfiles de fuerza y/o adherencia) est fuera
del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples
partidas de producto durante la vida til del mismo.
MTODO DE BOLA RODANTE
Prueba de Fugas
Esta prueba se aplica nicamente a STD de tipo moldeado-llenado-sellado (en reservorios o bolsas). El STD de tipo moldeado-llenado-sellado se debe fabricar manteniendo un enfoque de cero tolerancia para fugas, debido al potencial de prdida de
dosis ante la presencia de las mismas.
Es necesario implementar mtodos de control durante el proceso para examinar los STD en bsqueda de elementos que
pudieran ocasionar fugas, los cuales requieren un desarrollo importante por parte de los fabricantes de STD.
ANLISIS DURANTE EL PROCESO
Durante el proceso de fabricacin, se debe examinar el STD para detectar la presencia de fugas (o el potencial de fugas) por
perforacin, cortadura o sello defectuoso generado por fallas tales como burbujas de aire, salpicaduras del gel o mala alineacin de la capa posterior y de la capa protectora. A menos que se implemente una tecnologa analtica automatizada de proceso, se debe llevar a cabo un anlisis durante el proceso para identificar estos defectos usando los siguientes procedimientos de
prueba:
Inspeccin visual
1. Examinar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de la partida.
2. Inspeccionar cada STD muestreado visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. El producto no cumple con la prueba si alguno de los STD examinados presenta una fuga.
Integridad del sello: Los sellos de los sistemas transdrmicos deben someterse a pruebas de estrs para asegurar que la
presin aplicada no fuerce la apertura del sello, lo cual generara una fuga.
1. Examinar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de la partida.
2. Inspeccionar cada STD muestreado, visualmente y de manera minuciosa, para detectar fugas.
3. Colocar cada STD muestreado sobre una superficie rgida y plana, y colocar encima un peso de 13,6 kg. Dejar que el peso
descanse encima del STD durante 2 minutos. Una vez retirado el peso, inspeccionar visualmente el STD para detectar fugas.
4. El producto no cumple con la prueba si el nmero de STD que presentan fugas es mayor que el lmite aceptable establecido por el fabricante.
Prueba del producto envasado: Los STD pueden presentar fugas despus de haber sido envasados en sus envases primarios debido a la operacin misma de envasado o debido a la apertura del envase por parte del usuario. En consecuencia, los
STD deben ser analizados para detectar fugas despus de su fabricacin y de su envasado en el material de envasado primario.
Captulos
Esta prueba mide la distancia recorrida por una bola definida sobre la capa de adhesivo del STD usando condiciones definidas, como parmetro que depende de las propiedades adherentes de la capa de adhesivo. Esta prueba emplea una configuracin diseada para rodar una bola (de material, peso, tamao y superficie definidos) desde una rampa (con un ngulo y longitud definidos) sobre la capa de adhesivo (con orientacin definida) en condiciones de prueba especficas (temperatura) (ver la
ASTM D3121 para ms detalles). La distancia recorrida por la bola sobre la capa de adhesivo se mide usando un dispositivo de
medicin adecuado. Este procedimiento se repite usando un mnimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la distancia promedio recorrida est fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del
producto y/o basado en la evaluacin estadstica de mltiples partidas de producto durante la vida til del mismo.
USP 38
1. Analizar aleatoriamente un nmero especfico de STD, el cual se define basndose en el tamao de partida, despus de
colocarlos en su material de envasado primario.
2. Retirar los STD muestreados de su envase e inspeccionarlos visualmente y de manera minuciosa para detectar fugas.
3. Luego, limpiar cada STD muestreado uniformemente con un hisopo humedecido con un disolvente. Es necesario limpiar
tanto el lado posterior como el lado de la capa protectora del STD. Asimismo, se debe limpiar la superficie interna de la
bolsa. Luego, retirar el hisopo y valorar el contenido de frmaco.
4. El producto no cumple con la prueba si la cantidad total de frmaco del STD, y su bolsa correspondiente, excede el lmite
aceptable establecido por el fabricante.
Agregar lo siguiente:
4 MEDICAMENTOS PARA MUCOSASPRUEBAS DE CALIDAD
Captulos
INTRODUCCIN
Para los propsitos de distincin taxonmica de formas farmacuticas por va de administracin, la va mucosa de administracin de medicamentos se subdivide en siete superficies de membrana, las cuales se caracterizan como ticas, oftlmicas,
nasales, orofarngeas, uretrales, vaginales y rectales. Dicha clasificacin no incluye la va mucosa pulmonar, tratada en el captulo Medicamentos Nasales y para InhalacinInformacin General y Pruebas de Calidad del Producto 5. Un medicamento se
administra en cualquiera de estas siete superficies mucosas para producir una accin local o una absorcin sistmica. La accin
local ocurre en el rea prxima a la de aplicacin. Cuando se pretende generar una accin local, por lo regular no se desea la
absorcin sistmica la cual adems es innecesaria para el efecto teraputico. No obstante, en algunos casos se usa la administracin de un medicamento por va mucosa para absorcin sistmica debido a que evita el metabolismo de primer paso, provee una administracin sistmica ms rpida, o representa una alternativa cuando la administracin oral no es posible (en el
tracto gastrointestinal) debido a una enfermedad. Muchas de las formas farmacuticas citadas en el captulo Formas Farmacuticas 11511 pueden administrarse a travs de las diversas superficies de las membranas en la categora de mucosas.
Los procedimientos analticos y criterios de aceptacin para las pruebas de medicamentos se dividen en dos categoras:
aqullas que evalan los atributos generales de calidad del producto y aqullas que evalan el desempeo del producto. Las
pruebas de calidad de los productos evalan atributos tales como identificacin, valoracin (contenido), impurezas y uniformidad de contenido de la dosis, y, por lo general, forman parte de la monografa oficial. Las pruebas de desempeo del producto
incluyen la prueba de disolucin para una forma farmacutica oral slida (ver Disolucin 711) y la prueba de liberacin de
frmacos (ver Liberacin de Frmacos 724). En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeo aseguran la identidad, contenido, calidad y pureza de un medicamento para mucosas.
Asimismo, este captulo provee listas de pruebas comunes y consolidadas de calidad del producto y algunas pruebas especficas basadas en los requisitos de la va de administracin del medicamento. Las monografas existentes contienen todas las
pruebas requeridas para el artculo. En el caso de monografas nuevas para medicamentos especficos o en los casos en los que
no se cuente con una monografa, el captulo provee pruebas de calidad especficas como un recurso para los fabricantes hasta
que la USP desarrolle las monografas particulares del producto especfico.
PRUEBAS DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS

Este captulo provee pruebas de calidad generalmente necesarias, pruebas aplicables a productos especficos y pruebas aplicables a una o ms de las vas mucosas especficas. Se espera que cualquier forma farmacutica que se administre por una va
mucosa especfica se analice mediante las pruebas de calidad que en este captulo se citan bajo el encabezado correspondiente
a dicha va especfica.
Pruebas Generalmente Necesarias

Los atributos de calidad de las formas farmacuticas para mucosas deben reflejar requisitos aceptables para los productos
que se hallan en el mercado. Las siguientes pruebas deben aplicarse de manera general a todas las formas farmacuticas destinadas para administracin por mucosas. Las pruebas que son generalmente necesarias para todos los artculos incluyen: Definicin, Identificacin, Valoracin e Impurezas (orgnicas, inorgnicas y disolventes residuales). Por lo regular, la monografa de un
producto USP incluye la referencia a la prueba del captulo Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905.
1 Todas las referencias a captulos con nmero superiores a 1000 tienen nicamente propsitos informativos como recursos tiles. Dichos captulos no son obligatorios a menos que se indique explcitamente su aplicacin.
USP 38
Requisitos Generales / 4 Medicamentos para Mucosas 83
DEFINICIN
La seccin Definicin (ver Advertencias y Requisitos Generales 4.10) de una monografa USP describe el medicamento y especifica el intervalo aceptable para el contenido de los frmacos presentes en la forma farmacutica segn se obtiene en la valoracin. Para ciertos productos, la Definicin incluye toda la informacin adicional pertinente, como por ejemplo, la presencia o
ausencia de otros componentes, excipientes o coadyuvantes y declaraciones precautorias sobre toxicidad y estabilidad. La informacin sobre la apariencia se usa en registros reglamentarios para ayudar a la identificacin del producto. Debido a que los
atributos descriptivos tales como tamao, forma, color, entre otros, son especficos de cada producto individual en el mercado, por lo general no se requiere una descripcin cualitativa como parte de una monografa USP (ver el captulo 1151).
IDENTIFICACIN
La Identificacin se incluye en una monografa como una ayuda para verificar la identidad del artculo y para proveer una
identificacin positiva del frmaco o frmacos en un medicamento (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.40).
VALORACIN
IMPUREZAS
Las impurezas de proceso incluyen aqullas que surgen de los materiales de partida, subproductos de sntesis, as como otras
impurezas orgnicas e inorgnicas que pueden estar presentes en el frmaco y en los excipientes usados en la fabricacin del
medicamento. Estas impurezas se controlan usando la prueba apropiada, segn se especifica en las monografas del frmaco y
de los excipientes. Las impurezas en el medicamento tambin pueden resultar de la degradacin del frmaco o de los excipientes, de las interacciones entre el frmaco y un excipiente o de las interacciones entre el frmaco y los componentes del
envase. Los procedimientos y criterios de aceptacin deben limitar especficamente los productos de degradacin txicos as
como los productos de degradacin que pongan en peligro la calidad del artculo si estos exceden ciertos niveles. Se deben
proveer lmites para las impurezas del proceso cuya presencia se determine durante la prueba de productos de degradacin. El
captulo Impurezas en Frmacos y Medicamentos 10861 y el documento ICH Q3B Impurities in New Drug Products (Impurezas
en Nuevos Medicamentos)2 proveen una discusin ms completa sobre este tema.
UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

El captulo 905 se usa para asegurar que la uniformidad del contenido del frmaco en las unidades de dosificacin se encuentre dentro de un intervalo estrecho cercano a la cantidad declarada. La prueba se aplica slo a formas farmacuticas que
contienen una sola dosis o una parte de una dosis del frmaco en cada unidad. La uniformidad de unidades de dosificacin se
puede demostrar mediante uno de dos mtodos: uniformidad de contenido o variacin de peso. La uniformidad de contenido
se basa en las valoraciones de un nmero de unidades de dosificacin individuales. La variacin de peso se puede usar para
estimar la uniformidad de contenido en ciertas condiciones.
Formas Farmacuticas por Vas Mucosas Especficas y Pruebas Especficas

Adems de las pruebas de calidad generalmente necesarias previamente discutidas, la forma farmacutica puede requerir
pruebas de calidad especficas que son comunes a diversas vas de administracin. El captulo Inyectables 1 provee requisitos
comunes para productos inyectables e implantes. El captulo Medicamentos OralesPruebas de Calidad de Productos 2 provee
requisitos de anlisis para tabletas y tabletas de disolucin bucal. El captulo Medicamentos Tpicos y TransdrmicosPruebas de
Calidad del Producto 3 provee requisitos de anlisis comunes para semislidos (cremas, ungentos y geles). El captulo 5
presenta requisitos de anlisis para atomizadores y aerosoles. Para los casos en los que este captulo no presenta una prueba
2 ICH Q3B (R2) Impurities in New Drug Products, 2006, http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q3B_R2/Step4/

Q3B_R2_Guideline.pdf, Consultado el 6 de mayo de 2014.
Captulos
La valoracin se usa para determinar la concentracin del frmaco (o su contenido) en el medicamento. Por lo regular, la
valoracin es especfica e indicadora de estabilidad. Cuando se justifique una valoracin inespecfica, otros procedimientos
analticos complementarios deberan asegurar la deteccin y limitacin de cualquier especie interferente. Los resultados de la
valoracin a menudo se informan como porcentaje de la cantidad declarada, con criterios de aceptacin que por lo general
estn en el intervalo de 90,0% a 110,0%. Para algunos productos antibiticos, el intervalo puede ser ms amplio. La amplitud
de estos lmites tiene como propsito dejar margen a la variabilidad de la fabricacin, incluyendo cambios en la estabilidad, as
como variacin analtica. El intervalo de aceptacin ms estrecho de 95,0%105,0% se usa con menos frecuencia y requiere
justificacin.
84 4 Medicamentos para Mucosas / Requisitos Generales
USP 38
especfica para una forma farmacutica, no se requieren pruebas adicionales a menos que se incluyan en la especificacin de la
monografa individual.
VA TICA
La va tica se caracteriza por la administracin de una preparacin en o a travs del odo. No siempre se requiere demostrar
la esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad 71) para productos administrados en el odo. Por lo regular, la esterilidad se requiere
cuando el producto se administra en el odo interno o cuando el tmpano se encuentra daado. Para casos en los que no se
requiere la esterilidad, puede ser necesario el recuento cuantitativo de bacterias mesfilas y hongos que crecen en condiciones
anaerbicas, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61, o la determinacin de la ausencia o presencia limitada de organismos especficos, ver el captulo Examen Microbiolgico de Productos No
Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos 62.
Si se usa un conservante antimicrobiano, puede ser necesario cumplir con los requisitos de los captulos Pruebas de Eficacia
Antimicrobiana 51 y Agentes AntimicrobianosContenido 341.
Las formas farmacuticas administradas por la va tica incluyen lquidos, soluciones y suspensiones.
Captulos
VA OFTLMICA
La va oftlmica se refiere a la administracin en el ojo. Adems de las pruebas generalmente necesarias, se deben considerar
las siguientes pruebas especficas para medicamentos oftlmicos (ver la Tabla 1). Para productos que se inyectan o implantan
en el ojo, ver el captulo 1. A continuacin se citan algunas de las pruebas importantes de calidad del producto para productos administrados por la va oftlmica. Ver Ungentos Oftlmicos 771 para detalles y dems informacin sobre calidad de productos.
Materia Extraa y Partculas
Esterilidad
Tamao de Partcula y Distribucin del Tamao de Partcula
Tabla 1. Medicamentos Administrados por la Va Oftlmica, Pruebas Especficas
Va Oftlmica
Forma Farmacutica
Pruebas Especficas
Llenado Mnimo 755
Geles
Medicamentos Tpicos y TransdrmicosPruebas de Calidad del Producto 3

Osmolalidad y Osmolaridad 785
pH 791
Tensin superficial
ViscosidadMtodos Capilares 911
ViscosidadMtodos Rotatorios 912
Emulsiones
Potencial zeta
Insertos
Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85

Llenado Mnimo 755
Ungentos

Partculas en Soluciones Oftlmicas 789
pH 791
ViscosidadMtodo de Bola Rodante 913
Soluciones
Tiras
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las monografas)
pH 791
Tamao de partcula y distribucin del tamao de partcula
Suspensiones
ViscosidadMtodo de Bola Rodante 913
Requisitos Generales / 4 Medicamentos para Mucosas 85
USP 38
VA NASAL
La va nasal se refiere a la administracin en o a travs de la nariz para efecto local o sistmico (ver la Tabla 2).
Tabla 2. Medicamentos Administrados por la Va Nasal, Pruebas Especficas
Va Nasal
Forma Farmacutica
Pruebas Especficas del Producto

Medicamentos Nasales y para InhalacinInformacin General y Pruebas de Calidad del Producto 5
Aerosoles
Llenado Mnimo 755

Geles (Jalea)
Llenado Mnimo 755

Ungentos
Atomizadores
Soluciones
VA OROFARNGEA
Tabla 3. Medicamentos Administrados por la Va Orofarngea, Pruebas Especficas

Va Orofarngea
Forma Farmacutica
Pruebas Especficas
Parches Bucales
Ver el captulo Medicamentos Tpicos y TransdrmicosPruebas de Calidad del Producto 3 para requisitos
de prueba comunes para parches.
Pelculas
En la actualidad no existen pruebas especficas (pueden aplicarse requisitos adicionales especficos de las
monografas)
Llenado Mnimo 755
Geles
Gomas
monografas)
Tabletas de Disolucin Bucal
monografas)
Ungentos
Llenado Mnimo 755
Soluciones (Enjuagues)
monografas)
Atomizadores
Tabletas
Medicamentos OralesPruebas de Calidad de Productos 2
VA URETRAL
La va uretral se refiere a la administracin dentro de la uretra, por lo regular para accin local, aunque tambin es posible la
distribucin sistmica. El captulo 61 y el captulo 62 pueden ser aplicables. Los medicamentos en esta categora incluyen
insertos uretrales.
VA VAGINAL
La va vaginal se refiere a la administracin dentro de la vagina, por lo regular para accin local, aunque tambin es posible
la distribucin sistmica. El captulo 61 y el captulo 62 pueden ser aplicables (ver la Tabla 4).
Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa
del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas = m/e.
Volumen de expansin de espumas: Estimar el volumen de expansin de espumas a 25 usando una bureta graduada y un
envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta.
Captulos
La va orofarngea se refiere a la administracin en la cavidad oral y/o la regin farngea. La va orofarngea se subclasifica por
superficies intra-orales especficas, tales como bucal o sublingual. La administracin bucal y sublingual por lo general estn
destinadas a promover la absorcin sistmica mediante la permeacin a travs de la mucosa respectiva. Sin embargo, en este
contexto, la administracin oral puede referirse a la aplicacin tpica para accin local (ver la Tabla 3). Las pruebas de calidad
para productos administrados en superficies orofarngeas a menudo se ajustan a aqullas para administracin oral en el tracto
gastrointestinal (ver el captulo 2).
86 4 Medicamentos para Mucosas / Requisitos Generales
USP 38
Tabla 4. Medicamentos Administrados por la Va Vaginal, Pruebas Especficas del Producto

Va Vaginal
Forma Farmacutica
Pruebas Especficas
Llenado Mnimo 755
Cremas
Llenado Mnimo 755

Aspecto fsico (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas
Volumen de expansin de espumas

Llenado Mnimo 755
Geles
Insertos
monografas)
Captulos
VA RECTAL
La va rectal se refiere a la administracin en el recto. Los productos que se administran en el recto pueden producir efectos
locales o liberacin en la circulacin sistmica.
Determinacin de tiempo de ablandamiento de supositorios lipoflicos: La prueba pretende determinar, en las condiciones definidas, el tiempo que transcurre hasta que un supositorio mantenido en agua a 37 0,5 se ablanda hasta el grado en
que ya no ofrece resistencia al aplicarle un peso definido (ver la Tabla 5).
Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa
del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas = m/e.
Volumen de expansin de espumas: Estimar el volumen de expansin de espumas a 25 usando una bureta graduada y un
envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bureta.
Tabla 5. Medicamentos Administrados por la Va Rectal, Pruebas Especficas
Va Rectal
Forma Farmacutica
Pruebas Especficas
Llenado Mnimo 755
Apariencia fsica (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas
Volumen de expansin de espumas

Llenado Mnimo 755
Ungentos
Supositorios
Tiempo de ablandamiento de supositorios lipoflicos
Soluciones
monografas)
Suspensiones
monografas)
USP38
5 MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACININFORMACIN

GENERAL Y PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO
I. INTRODUCCIN
Los medicamentos para inhalacin entregan un frmaco a los pulmones mediante inhalacin oral e incluyen las siguientes
formas farmacuticas: aerosoles para inhalacin, polvos para inhalacin, atomizadores para inhalacin, soluciones para inhalacin, suspensiones para inhalacin, concentrados para preparar soluciones inhalables y frmacos para preparar solucin inhalable. Los medicamentos nasales entregan frmacos en la cavidad nasal e incluyen las siguientes formas farmacuticas: aerosoles
nasales, atomizadores nasales, soluciones nasales y polvos nasales. En este captulo no se discuten los medicamentos nasales en
forma de geles ni ungentos. La Tabla 1 provee una lista de nombres establecidos y definiciones para estas formas farmacuticas. Asimismo, en el captulo general Formas Farmacuticas 1151 se proveen definiciones, breve informacin acerca de los
mtodos de fabricacin y un glosario de nombres de estas formas farmacuticas.
Requisitos Generales / 5 Medicamentos Nasales y para Inhalacin 87
USP 38
Tabla 1. Nombres Establecidos y Definiciones

Nombre
Establecido
Definicin
Polvo para Inhalacin
Medicamento en polvo para inhalacin oral que se usa con un dispositivo que lo transforma en aerosol y libera una cantidad exactamente medida de los ingredientes teraputicamente activos. Los Polvos para Inhalacin se conocen comnmente como inhaladores de polvo seco.
Atomizador para Inhalacin
Forma farmacutica lquida de un medicamento para inhalacin oral, en un envase no presurizado, que libera una cantidad exactamente medida de la formulacin en forma de niebla o roco.
Solucin para Inhalacin
Medicamento en solucin para inhalacin oral que se emplea con un sistema de nebulizacin.
Suspensin para Inhalacin
Medicamento en suspensin para inhalacin oral que se emplea con un sistema de nebulizacin.
Concentrado para Solucin Inhalable
Solucin de un frmaco para inhalacin oral que se debe diluir antes de su administracin con un sistema de
nebulizacin.
[Frmaco] para Solucin Inhalable
Medicamento en polvo que, al agregarle un vehculo adecuado, genera una solucin que cumple con todos
los aspectos de una Solucin para Inhalacin.
Aerosol Nasal
Medicamento para aplicacin local en las fosas nasales que se envasa a presin y entrega una cantidad especfica de ingredientes teraputicamente activos al activar un sistema de vlvula de dosis exactamente medida.
Atomizador Nasal
Forma farmacutica lquida de un medicamento para aplicacin local en las fosas nasales en un envase no
presurizado que, al activarlo, libera una cantidad exactamente medida de la formulacin en forma de niebla
o roco.
Solucin Nasal
Forma farmacutica lquida de un medicamento no presurizado para aplicacin local en las fosas nasales.
Polvo Nasal
Medicamento en polvo para aplicacin local en las fosas nasales que emplea un dispositivo que libera y transforma en aerosol una cantidad exactamente medida de los ingredientes teraputicamente activos.
Este captulo general 5 provee los lineamientos generales para sustentar nuevas monografas individuales. ste es un documento de avance y no pretende reemplazar el desarrollo necesario de monografas individuales. Este captulo provee listas
de pruebas de calidad del producto que se requieren tpicamente, consolidadas de manera concisa y coherente. Cuando exista
una monografa, sta deber contener todas las pruebas requeridas para la forma farmacutica en particular. Cuando no se
dispone de una monografa para un medicamento especfico (inexistente), el captulo general provee pruebas de calidad que
se pueden usar hasta que la monografa especfica para la forma farmacutica aparezca en el compendio USPNF. Cuando se
dispone de un procedimiento de prueba de desempeo validado para el medicamento especfico, ste se identifica en un captulo general con un nmero menor a 1000. Toda la informacin adicional o la informacin sobre tecnologas venideras que
an no han sido validadas en su totalidad, puede estar disponible en los captulos informativos con nmeros superiores a
1000.1
Pruebas Generales de Calidad y Pruebas de Calidad de Desempeo para Medicamentos

Una monografa de medicamento de la USP contiene pruebas, procedimientos analticos y criterios de aceptacin. Las pruebas de medicamentos se dividen en dos categoras: (1) pruebas que evalan los atributos generales de calidad y (2) pruebas de
calidad que evalan el desempeo del producto, p.ej., uniformidad de dosis liberada y sus caractersticas fsicas tales como
distribucin del tamao aerodinmico de partcula. Las pruebas generales de calidad evalan la integridad de la forma farmacutica, mientras que las pruebas de calidad del desempeo evalan la liberacin del frmaco y otros atributos que pueden
relacionarse con el desempeo in vivo del medicamento.
En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeo garantizan la identidad, contenido, calidad y pureza de los medicamentos para inhalacin y nasales.
Las dos secciones siguientes de este captulo listan atributos de calidad del producto para medicamentos para inhalacin y
para medicamentos nasales, respectivamente. La seccin final describe en mayor detalle las pruebas de calidad para medicamentos para inhalacin y nasales. El captulo general Medicamentos Nasales y para Inhalacin: Pruebas de Calidad de Desempeo
de Aerosoles, Atomizadores y Polvos 601 contiene pruebas de desempeo del producto para medicamentos nasales y para inhalacin, y se debe usar junto con este captulo 5.
1 Todas las referencias a los captulos superiores a 1000 son slo para fines informativos y para su uso como un recurso til. Estos captulos no son obligatorios a
menos que se instruya explcitamente su aplicacin.
Captulos
Aerosol para Inhalacin
Medicamento para inhalacin oral que se envasa a presin y entrega una cantidad especfica de ingredientes
teraputicamente activos al activar un sistema de vlvula que entrega una dosis exactamente medida. Los
aerosoles para inhalacin se conocen comnmente como inhaladores de dosis fija.
88 5 Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Requisitos Generales
USP 38
II. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS PARA INHALACIN

Aerosol para Inhalacin
Captulos
DESCRIPCIN
El trmino aerosol en este contexto es una forma farmacutica que consiste en una preparacin slida o lquida envasada a
presin y destinada para su administracin en forma de niebla fina. El trmino descriptivo aerosol tambin se refiere a la niebla
fina de diminutas gotitas o partculas slidas que se emiten desde el dispositivo que contiene al medicamento. Los aerosoles
para inhalacin, tambin conocidos como inhaladores de dosis fija, son preparaciones que se caracterizan por dispersar el ingrediente farmacutico activo en las vas respiratorias durante la aspiracin oral para lograr un efecto local o sistmico, mientras que los aerosoles nasales, que tambin se conocen como inhaladores de dosis fija nasales, se caracterizan por depositar los
ingredientes farmacuticos activos en la cavidad nasal para lograr un efecto local o sistmico.
Una formulacin en aerosol por lo regular contiene frmacos disueltos o suspendidos en propelentes o una mezcla de propelentes y codisolventes y posiblemente otros excipientes adecuados. Un medicamento en aerosol para inhalacin, comnmente conocido como inhalador de dosis fija, libera una cantidad especfica de ingredientes teraputicamente activos con un
calidad definida al activar un sistema de vlvula que entrega una dosis exactamente medida. Las pruebas generales de calidad
para medicamentos en aerosoles para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo
para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Impurezas y Productos de Degradacin
Contenido de Agua
Partculas Extraas
Sustancias Lixiviables
Patrn de Roco
Lmite Microbiano
Contenido de Alcohol (si estuviera presente)
Peso de Llenado Neto
Velocidad de Fuga
Para pruebas de calidad de desempeo, referirse al captulo 601.
Solucin para Inhalacin

DESCRIPCIN
Los medicamentos en solucin para inhalacin por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles. Estn
diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin con un nebulizador externo especfico. Dichas preparaciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y la luz.
La nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos/elctricos
apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen el frmaco en solucin, y su contnua administracin al paciente. Las pruebas generales de calidad para soluciones para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante
en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
Valoracin de Conservante Antimicrobiano y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
Esterilidad
Partculas Extraas
pH
Osmolalidad
Prdida de Peso
USP 38
Suspensin para Inhalacin

DESCRIPCIN
Los medicamentos en suspensin para inhalacin por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles. Estn
diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin con un nebulizador externo especfico. Dichas preparaciones de medicamentos por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque
protector para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y
la luz. La nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulacin y su continua administracin al
paciente. Las pruebas generales de calidad para suspensiones para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms
adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Distribucin del tamao de partcula de la formulacin en el envase inmediato.
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos de la Solucin para Inhalacin anteriormente
indicados.
Concentrado para Solucin Inhalable

DESCRIPCIN
Frmacos para Solucin Inhalable

DESCRIPCIN (POLVO)
Un frmaco para solucin inhalable es un medicamento en polvo (con un colorante especfico) que al agregarle un vehculo
adecuado, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehculo para dilucin,
forma una solucin que cumple con todos los aspectos de los requisitos para la Solucin para Inhalacin. Las pruebas generales
de calidad de frmacos para soluciones inhalables deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo
para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Contenido de agua
Transparencia, color y totalidad de la solucin dentro del tiempo especificado, luego de la reconstitucin
indicados luego de reconstituir el medicamento.
Atomizador para Inhalacin

DESCRIPCIN
Los medicamentos en atomizadores para inhalacin por lo general son formulaciones lquidas con base acuosa envasadas en
un sistema de envase y cierre compacto que contiene una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla descarga
una cantidad exactamente medida de una niebla fina de gotitas de la formulacin. La niebla puede generarse por diversos
medios tales como accin mecnica, electricidad, o energa derivada de la aspiracin por parte del paciente. Los mecanismos a
travs de los cuales se generan las gotitas difieren entre los varios tipos de atomizadores para inhalacin. Estos medicamentos
pueden proveerse en presentaciones de dosis nica o multidosis. Los medicamentos en atomizadores para inhalacin pueden
presentar un diseo para dosis previamente medida o con dispositivos de dosis fija. Una unidad para dosis previamente medidas contiene una cantidad de formulacin lquida previamente medida en un envase individual (p.ej., un blster) que el paciente inserta en el dispositivo antes de usar. Un producto con dispositivo de dosis fija contiene una cantidad de la formulacin
Captulos
Los medicamentos concentrados para solucin inhalable por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estriles.
Al diluirlos, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehculo para dilucin,
estn diseados para ser transportados a los pulmones mediante nebulizacin usando un nebulizador externo. Dichas preparaciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen adems un empaque protector
para minimizar el ingreso de contaminantes extraos voltiles, la prdida de disolvente y la exposicin al oxgeno y la luz. La
nebulizacin implica la generacin mediante energa ultrasnica, efecto de Venturi u otros medios mecnicos/elctricos apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulacin y su continua administracin al
paciente. Las pruebas generales de calidad para concentrados para solucin inhalable deben incluir lo siguiente (ver la seccin
IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Transparencia y color de la solucin luego de la dilucin de acuerdo con las instrucciones del etiquetado.
Para todos los dems atributos generales de calidad, referirse a los atributos anteriormente indicados en Solucin para Inhalacin.
USP 38
lquida en un depsito que resulta suficiente para un nmero preestablecido de dosis, y el dispositivo descarga cada dosis como un roco fijo exacto durante la vida til de la unidad. Las pruebas generales de calidad para atomizadores para inhalacin
deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Geometra de la Nube
indicados.
Polvo para Inhalacin
Captulos
DESCRIPCIN
Los medicamentos en polvo para inhalacin, comnmente conocidos como inhaladores de polvo seco, dispensan polvos para inhalacin mediante un dispositivo que los transforma en aerosol liberando una dosis exacta del ingrediente activo solo o
con los excipientes adecuados con caractersticas fsicas uniformes. Los diseos actuales incluyen inhaladores de polvo seco
con dosis previamente medidas y con dispositivos de dosis fija, los cuales dependen de diversas fuentes de energa para crear y
dispersar el aerosol durante la aspiracin por parte del paciente.
Los inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas contienen cantidades discretas de formulacin en envases individuales (p.ej., cpsulas o blsters) que se insertan en el dispositivo antes de usar. Los inhaladores de polvo seco con dosis
previamente medidas tambin pueden contener las unidades de dosificacin ordenadas en forma de cargadores multidosis en
el sistema de liberacin. Los inhaladores de polvo seco con dispositivos de dosis fija tienen un depsito interno que contiene
una cantidad de formulacin suficiente para entregar mltiples dosis mediante el accionamiento del dispositivo por parte del
paciente. Las pruebas generales de calidad para polvos para inhalacin deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Contenido de Agua
Partculas Extraas
Lmite Microbiano
Contenido Neto (dispositivos de dosis fija)
Sustancias Lixiviables Voltiles y Semivoltiles
III. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD EN MEDICAMENTOS NASALES

Aerosol Nasal
Referirse a los atributos del Aerosol para Inhalacin anteriormente indicados.
Atomizador Nasal
DESCRIPCIN
Los medicamentos en atomizador nasal por lo general son formulaciones lquidas con base acuosa que se aplican a la cavidad nasal para lograr efectos locales y/o sistmicos. Contienen ingredientes teraputicamente activos disueltos o suspendidos
en una solucin o en mezclas de excipientes en un sistema de envase y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y
cierre incluye una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla libera un roco que contiene una cantidad exactamente medida de niebla fina de gotitas de la formulacin. La dispersin de la formulacin en forma de roco por lo general se
logra forzando el paso de la formulacin a travs del accionador del dispositivo nasal y su orificio. A menudo, dichos productos
vienen en presentaciones multidosis con dispositivos de dosis fija (ver Atomizador para Inhalacin) en las que la bomba atomizadora determina la dosis. Los medicamentos en atomizadores nasales tambin se pueden presentar en un diseo de dosis
previamente medidas. Las pruebas generales de calidad para atomizadores nasales deben incluir lo siguiente (ver la seccin IV
ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Valoracin de Excipientes Conservantes y Estabilizadores (si estuvieran presentes)
USP 38

Distribucin del Tamao de Partcula (para suspensiones)
Partculas Extraas
Patrn de Roco
Lmite Microbiano
pH
Osmolalidad
Viscosidad
Esterilidad (dosis previamente medidas)
Polvo Nasal
Referirse a los atributos de calidad del Polvo para Inhalacin anteriormente indicados.
Solucin Nasal
DESCRIPCIN
IV. DESCRIPCIN DE LAS PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

A continuacin se listan pruebas de calidad del producto que deben aplicarse a los medicamentos nasales y para inhalacin
y a los productos para nebulizacin. Las pruebas de calidad especficas del producto se tratan en las monografas de los productos.
Descripcin
Ver las formas farmacuticas previas correspondientes y las etiquetas pertinentes para la monografa de un medicamento.
Contenido de Alcohol (si estuviera presente)

Si se usa alcohol en la formulacin de un medicamento, se debe incluir una valoracin especfica con criterios de aceptacin
apropiados.
Valoracin (contenido y uniformidad de contenido)

Las valoraciones de frmacos en medicamentos de la USP se realizan mediante procedimientos indicadores de estabilidad
validados siguiendo el captulo general Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225. La prueba de Valoracin debe medir
Captulos
Por lo general, las soluciones nasales medicinales son formulaciones lquidas en base acuosa que se aplican a la cavidad nasal
para lograr un efecto local. Pueden contener soluciones de frmacos solos o mezclados con excipientes en un sistema de envase y cierre compacto no presurizado. El sistema de envase y cierre incluye un sistema de descarga que administra cantidades
no medidas de la formulacin en forma de gotitas en una niebla fina. Por lo regular, dichos productos vienen en presentaciones multidosis. Las pruebas generales de calidad para medicamentos en solucin nasal deben incluir lo siguiente (ver la seccin
IV ms adelante en este captulo para un anlisis ms detallado de cada prueba):
Identificacin
Valoracin
Valoracin de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
Partculas Extraas
Lmite Microbiano
pH
Osmolalidad
Viscosidad
USP 38
el frmaco disponible y su estabilidad, incluyendo la adherencia del frmaco a los componentes del envase y del cierre. Contar
con criterios de aceptacin apropiados puede proveer una mayor garanta sobre la reproducibilidad de la fabricacin y puede
asegurar un mejor cumplimiento con otros atributos de desempeo (p.ej., uniformidad de dosis liberada).
Si un medicamento declara contener un solo enantimero de un frmaco quiral, los analistas pueden usar una valoracin
quiral o una combinacin de valoracin no quiral y un procedimiento validado para controlar la presencia del enantimero no
deseado como una impureza.
Valoracin de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)

Por lo general, se debe valorar cualquier conservante (p.ej., un antimicrobiano) o excipiente estabilizador (p.ej., un antioxidante, un agente que se agrega especficamente para minimizar o prevenir la degradacin) en envases multidosis siguiendo un
procedimiento indicador de la estabilidad validado de acuerdo con los lineamientos de la gua ICH Q2 vigente. Los criterios de
aceptacin correspondientes normalmente se basan en la efectividad apropiada del conservante, la cual se demuestra mediante una prueba de desafo microbiano.
Uniformidad de Contenido para Formas Farmacuticas Previamente Medidas

Ver el captulo 905.
Captulos
Transparencia y Color de la Solucin Luego de la Dilucin

Las formas farmacuticas de concentrados para solucin inhalable y frmacos para solucin inhalable deben diluirse y reconstituirse de acuerdo con las instrucciones del etiquetado antes de su administracin por nebulizacin. El tipo y la cantidad
de vehculo usado para la dilucin y la reconstitucin deben especificarse en el etiquetado. Se deben llevar a cabo estudios
apropiados para evaluar la transparencia, el color de la solucin luego de la dilucin o reconstitucin. Los estudios tambin
deben incluir anlisis de estabilidad fsica y qumica apropiados y sobre las caractersticas de desempeo.
Partculas Extraas
Las partculas extraas en estos medicamentos se deben controlar de manera adecuada. Las partculas en medicamentos nasales y para inhalacin pueden originarse durante la fabricacin y a partir de los componentes de la formulacin y del envase y
cierre. Para la evaluacin toxicolgica, se debe determinar el tipo, el origen, la cantidad y el tamao de las partculas extraas,
incluyendo partculas finas (p.ej., menos de 10 mm) a lo largo del periodo de almacenamiento durante el estudio de estabilidad.
Identificacin
Se utiliza una o varias pruebas de identificacin especficas para verificar la identidad del frmaco en el medicamento. Si se
emplea un mtodo no especfico para la identificacin, se lo debe combinar con un segundo mtodo independiente y complementario. Asimismo, se debe llevar a cabo una prueba de identificacin especfica para formas polimrficas. Adems, si el frmaco es una sal, se debe incluir una prueba de identificacin apropiada para el contrain.

Se deben usar procedimientos analticos indicadores de estabilidad validados de acuerdo con el captulo general vigente
1225 de la USP para determinar los niveles de impurezas y productos de degradacin en un medicamento. Por lo regular, se
establecen criterios de aceptacin para impurezas y productos de degradacin individuales, totales no especificados, y totales,
siguiendo la gua vigente ICH Q3B. Para umbrales de informe, identificacin y calificacin y dems informacin relevante, se
deben seguir las pautas vigentes de la ICH Q3B.
Los medicamentos nasales y para inhalacin se deben evaluar para determinar la presencia de compuestos que podran lixiviarse a partir de los componentes elastomricos, plsticos o del recubrimiento del sistema de envase y cierre que estn en
contacto directo con la formulacin. Adems, el medicamento puede inadvertidamente contener otros contaminantes residuales derivados de la fabricacin y el procesamiento. Las sustancias lixiviables pueden incluir sustancias aromticas polinucleares,
nitrosaminas, monmeros, plastificantes, aceleradores, antioxidantes y vulcanizadores. Los contaminantes del procesamiento
pueden incluir agentes de tratamiento de las superficies, o sustancias de procesamiento que se pueden disolver, asociar qumicamente o suspender en la formulacin.
USP 38
Por ende, durante todo el periodo de vida til hasta la fecha de caducidad, el medicamento debe someterse a una evaluacin de los compuestos que puedan migrar a la formulacin desde diversas fuentes. El anlisis a realizar depende del tipo de
formulacin, por ejemplo si es un polvo o un lquido y de la composicin del sistema de envase y cierre; p.ej., un medicamento envasado en un envase semipermeable se debe evaluar para determinar el ingreso de sustancias lixiviables voltiles. Se deben aplicar especificaciones apropiadas para identificar, monitorear y cuantificar los lixiviables en el medicamento usando procedimientos analticos validados con niveles de cuantificacin mnimos apropiados. Se deben establecer y justificar los criterios
de aceptacin correspondientes desde la perspectiva toxicolgica y de seguridad.
Velocidad de Fuga
Los estudios de velocidad de fuga en aerosoles medicinales nasales y para inhalacin se pueden realizar durante la caracterizacin y desarrollo del medicamento para justificar la seleccin de componentes apropiados del sistema de envase y cierre
(p.ej., vlvula y envase) y de parmetros apropiados de fabricacin del medicamento, incluyendo el proceso de precintado de
la vlvula. Las especificaciones para los estudios de la prueba de Velocidad de Fuga de la USP se pueden basar en la determinacin de la diferencia en peso con el paso del tiempo a una temperatura especificada sobre mltiples unidades de cada partida.
Ver Velocidad de Fuga 604 para informacin adicional.
Lmites Microbianos

Se deben establecer pruebas y criterios de aceptacin para evaluar y controlar el peso neto total de la formulacin dentro
del envase.
Osmolalidad
Para controlar la tonicidad de la formulacin de formas farmacuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en
Medicamentos para Inhalacin, se debe analizar la osmolalidad del producto con especificaciones apropiadas conforme a lo
descrito en Osmolalidad y Osmolaridad 785.
pH
Se debe establecer una especificacin apropiada para el pH de la formulacin de las formas farmacuticas cuando se indique
en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales conforme a los descrito en el captulo pH 791.
Distribucin del Tamao de Partcula

Para medicamentos en suspensin para inhalacin y en suspensin para atomizador nasal, se pueden usar mtodos apropiados y criterios de aceptacin correspondientes para la determinacin de la distribucin del tamao de partcula del frmaco en
la formulacin dentro del envase.
Geometra de la Nube
Debido a que diversos factores pueden afectar las caractersticas de la nube de roco en aerosoles para inhalacin, atomizadores para inhalacin, aerosoles nasales, o en atomizadores nasales, su caracterizacin completa es importante para evaluar el
desempeo del sistema de liberacin. La geometra de la nube se puede determinar mediante una variedad de procedimientos
usando mtodos validados apropiadamente. La geometra de la nube tambin se puede controlar mediante criterios de aceptacin apropiados que midan las caractersticas del patrn de roco, incluyendo la forma y el tamao de la nube de roco en
condiciones experimentales e instrumentales definidas para la prueba.
Captulos
La calidad microbiana de las formas farmacuticas cuando se indica en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para
Inhalacin y Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales por lo regular se controla mediante pruebas y criterios de
aceptacin validados y apropiados para el recuento total de microorganismos aerobios, el recuento total de hongos filamentosos y levaduras, y la demostracin de la ausencia de patgenos indicadores especificados. Los criterios de aceptacin se pueden expresar en microorganismos por envase. Para mayor informacin, consultar los captulos Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61 y Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estriles 610.
USP 38
Reconstitucin y Tiempo de Reconstitucin (polvos)

Las formas farmacuticas de frmacos para solucin inhalable deben reconstituirse antes de su administracin. Por consiguiente, se deben realizar estudios de compatibilidad apropiados para evaluar el tipo y la cantidad de los disolventes, as como
el tiempo de reconstitucin necesario para la preparacin de la solucin final antes de su administracin al paciente. Los estudios de compatibilidad tambin deben incluir anlisis de estabilidad fsica y qumica apropiados de la solucin reconstituida,
adems de incluir la caracterizacin del desempeo.
Se deben usar pruebas adecuadas y validadas para determinar los niveles de cualquier disolvente en el medicamento. Ver
Disolventes Residuales 467 para informacin adicional.
Captulos
Patrn de Roco
Debido a que diversos factores pueden afectar el patrn de roco de medicamentos en aerosol para inhalacin, en aerosol
nasal o en atomizador nasal, la caracterizacin completa del patrn de roco es importante para evaluar el desempeo de la
vlvula especfica y del accionador o la bomba. El patrn de roco se puede determinar usando mtodos validados apropiadamente y criterios de aceptacin correspondientes que midan la forma, la densidad y el tamao del mismo. El procedimiento de
prueba para patrones de roco normalmente es especfico para el medicamento y puede incluir, entre otros aspectos, la distancia entre la boquilla y el plano de medicin o la superficie de recoleccin, el nmero mnimo de accionamientos por patrn de
roco para permitir la discriminacin, la orientacin de la superficie de recoleccin con respecto a la boquilla y los procedimientos de visualizacin.
Esterilidad
Todas las formas farmacuticas para inhalacin con base acuosa son preparaciones estriles y deben cumplir con los requisitos en Pruebas de Esterilidad 71.
Viscosidad
Se debe incluir una prueba de viscosidad con criterios de aceptacin apropiados para formas farmacuticas cuando as se
indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos
Nasales segn corresponda (ver ViscosidadMtodos Capilares 911 (AF 01-may-2015)).
Contenido de Agua
Se debe establecer una especificacin apropiada para el contenido de agua de las formas farmacuticas cuando as se indique en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalacin y en Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales para asegurar la estabilidad continua del medicamento y el desempeo aceptable del mismo. Se deben usar procedimientos analticos validados conforme a lo descrito en Determinacin de Agua 921. Proceder segn se indica en el captulo 921,
con las siguientes modificaciones: equipar el vaso de un sistema cerrado para volumetra con una abertura a travs de la cual
pasa un tubo de dispersin de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestras.
Prdida de Peso
Los medicamentos deben evaluarse para determinar la prdida de peso, p.ej., los medicamentos envasados en envases semipermeables se deben evaluar para determinar las propiedades de todo el sistema de envase y cierre que protegen contra la
prdida de humedad.
Requisitos Generales / 7 Etiquetado 95
USP 38
7 ETIQUETADO
Oficial el 1 de mayo de 2016
DEFINICIN
El trmino etiquetado se refiere a todas las etiquetas y dems materiales escritos, impresos o grficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artculo, o sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio secundario, con excepcin
de los embalajes externos destinados para el transporte. El trmino etiqueta designa la parte del etiquetado que se encuentra
sobre el envase primario.
Los embalajes para el transporte que contengan un solo artculo se etiquetan por lo menos con la identificacin del producto (excepto los artculos controlados), el nmero de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento y distribucin, salvo que dicho envase sea tambin el envase primario o la parte exterior del empaque destinado al consumidor.
ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS EXPRESADOS COMO LA PARTE ACTIVA

EN EL NOMBRE Y EL CONTENIDO
ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS INYECTABLES

Las etiquetas1 y el etiquetado indican la siguiente informacin:
Nombre de la preparacin
En el caso de una preparacin lquida, la cantidad o proporcin de cada parte activa y/o frmaco en un volumen especificado
En el caso de una preparacin magistral estril, los nombres y las cantidades o concentraciones de parte activa y/o frmaco en el envase inmediato (ver Preparacin MagistralPreparaciones Estriles 797, Responsabilidad del Personal de Preparacin Magistral)
En el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la cantidad o proporcin de cada parte activa y/o frmaco, el volumen final de solucin o suspensin, las instrucciones para el
almacenamiento adecuado de la solucin reconstituida y una fecha de caducidad o fecha lmite de uso (ver la seccin
Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso)
Vas de administracin
Nombre y proporcin de todos los ingredientes inactivos, excepto que los ingredientes agregados para ajustar el pH o
para hacer isotnico el medicamento, se pueden declarar por sus nombres con una indicacin acerca de su efecto
Indicacin de las condiciones de almacenamiento
Nombre y domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor
Nmero de lote identificativo y fecha de caducidad
Venta slo con prescripcin mdica
La dosis recomendada o comn.
El envase deber etiquetarse de modo que una superficie suficiente de ste quede descubierta en toda su longitud o circunferencia para permitir la inspeccin del contenido.
El nmero de lote debe proporcionar todo el historial de fabricacin del envase especfico, incluyendo todas las operaciones
de fabricacin, llenado, esterilizacin y etiquetado. Cuando la monografa individual permita variar las concentraciones de la
parte activa y/o el frmaco en una inyeccin de gran volumen, se indica la concentracin de cada parte activa y/o frmaco
1
Para limitaciones de espacio, ver el CFR 201.10(i) y el Ttulo 21 del CFR 610.60.
Captulos
Los nombres y contenidos de medicamentos y preparaciones magistrales debern expresarse en trminos de la parte activa
y su contenido correspondiente en la etiqueta (ver Nomenclatura 1121, Poltica para la Denominacin de Monografas de Medicamentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Frmacos).
Excepciones: Se puede considerar una excepcin a esta Poltica, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina
especfica de la parte activa en el nombre suministra informacin vital desde una perspectiva clnica. En tales casos, cuando el
ttulo de la monografa contiene la forma salina especfica de la parte activa, el contenido del producto o preparacin tambin
se expresa en trminos de la forma salina especfica.
Etiquetado: Las etiquetas y el etiquetado deben indicar claramente la forma salina especfica de la parte activa que est presente en el producto o preparacin, debido a que esta informacin puede ser til para profesionales de la salud y pacientes. Se
proveen en el etiquetado los nombres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina especfica (cuando
corresponde).
96 7 Etiquetado / Requisitos Generales
USP 38
nombrado en el ttulo oficial como si fuera parte del ttulo oficial (p.ej., Dextrosa 5%, Inyeccin o Dextrosa 5% y Cloruro de Sodio
0,2%, Inyeccin).
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario slo deben etiquetarse para ese fin.
El etiquetado de vacunas no se incluye en este captulo general.
Captulos
Concentracin y Volumen Total para Medicamentos Inyectables Monodosis y Multidosis

Para medicamentos inyectables monodosis y multidosis, el contenido por volumen total debe ser la expresin principal y
prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida en proximidad cercana por el contenido/mL entre parntesis. Para
envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido por fraccin de mL debe ser la nica expresin de concentracin. El contenido en un mL debe expresarse como mg/mL, y no como mg/1 mL. Los siguientes formatos son aceptables para contenidos de ms de 1 mL:
Contenido total/volumen total: 500 mg/10 mL
Contenido/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido/mL: 5000 Unidades/mL.
El siguiente formato es aceptable para medicamentos que contienen menos de 1 mL:
12,5 mg/0,625 mL
Existen algunas excepciones para la expresin del contenido por volumen total. En algunos casos, la expresin principal y
prominente del contenido total de un frmaco por envase puede no ser efectiva en la prevencin de errores en la administracin y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Otro ejemplo de ello es el uso de la lidocana (u otros frmacos similares empleados como anestsicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje, (p.ej., 1% o 2%). En tales
casos, se debera expresar el contenido total de la siguiente manera: por ejemplo, 1% se puede expresar como
(100 mg/10 mL) o
(10 mg/mL).
Los slidos secos que deben ser reconstituidos, deben tambin seguir este formato, con la excepcin de que slo se debe indicar el contenido total del frmaco y no la concentracin en forma de contenido/volumen total o el contenido/mL.
Expresin de la Relacin de Contenido

Los medicamentos que contienen un solo frmaco que tambin se expresan como una relacin, tal como la epinefrina, debern etiquetarse nicamente en trminos de concentracin, es decir contenido/mL. Un formato de expresin de una relacin
tal como 1:1000 es inaceptable para medicamentos con un solo frmaco.
Ejemplos:
Epinefrina, Inyeccin, USP, 1:1000 deber expresarse como 1 mg/mL
Epinefrina, Inyeccin, USP, 1:10 000 deber expresarse como 0,1 mg/mL
Clorhidrato de Isoproterenol, Inyeccin, USP, 1:5000 deber expresarse como 0,2 mg/mL
Metilsulfato de Neostigmina, Inyeccin, 1:1000 deber expresarse como 1 mg/mL
Cuando se combina con un anestsico local, la concentracin de epinefrina se expresar en forma de relacin.
Ejemplos:
Clorhidrato de Lidocana 1% y Epinefrina 1:100 000, Inyeccin, USP
Clorhidrato de Bupivacana 0,25% y Epinefrina 1:200 000, Inyeccin, USP
Envases a Granel para Farmacias

Cuando un envase se ofrece como un Envase a Granel para Farmacias, la etiqueta deber: (a) indicar de manera prominente
Envase a Granel para FarmaciasNo para infusin directa; (b) contener o referir a informacin sobre tcnicas adecuadas para garantizar el uso seguro del producto; y (c) portar una declaracin que limite el intervalo de tiempo en el que el envase
puede usarse una vez que ha sido perforado, siempre que se mantenga en las condiciones de almacenamiento declaradas (ver
Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659).
Casquillos y Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fcilmente las indicaciones del etiquetado que comunican mensajes de seguridad importantes crticos para evitar situaciones en donde se ponga en riesgo la
vida de forma inminente y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser
simples, concisas y desprovistas de toda informacin no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no
deben incluir ninguna informacin para que aqullos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr
este propsito se requiere un enfoque sistemtico para el etiquetado de los productos inyectables que asegure que los casqui-
USP 38
llos y tapas de sobreselloun rea de estos productos de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de
estos medicamentossean reservados para comunicar mensajes crticos de seguridad. En consecuencia:
1. Slo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (crculo) del casquillo y la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicacin precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en el casquillo, si la tapa de sobresello es transparente y la indicacin precautoria
debajo de la misma es fcilmente legible. Una indicacin precautoria es aqulla destinada a prevenir una situacin que
ponga en riesgo la vida de forma inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si
fuera necesario. Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias incluyen, entre otros: AdvertenciaAgente Paralizante y Diluir Antes de Usar. El texto de la indicacin precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea
fcilmente visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicacin precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
3. Otras declaraciones o caractersticas que incluyen, entre otros, nmeros o letras de identificacin, como por ejemplo nmeros de cdigos, nmeros de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (crculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o caractersticas en la falda del casquillo no deben distraer o interferir con la indicacin precautoria de la superficie superior.
Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin
Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaracin de advertencia impresa en los casquillos y en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaracin: Advertencia: Agente Paralizante o Agente Paralizante (dependiendo del tamao del sistema de cierre). Como alternativa, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripcin, de manera que permita la visualizacin
de la indicacin precautoria sobre el casquillo de cierre.
Aluminio en Inyectables de Gran Volumen (IGV), Inyectables de Pequeo Volumen (IPV) y

Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutricin Parenteral Total (NPT)
1. El contenido de aluminio de los IGV usados en terapia de nutricin parenteral total (NPT) no debe exceder de 25 mcg/L.
2. El prospecto del envase de los IGV usados en terapia de NPT debe declarar que el medicamento no contiene ms de 25
mcg de aluminio por L. Esta informacin debe incluirse en la seccin Precauciones del etiquetado de todos los IGV usados
en terapia de NPT.
3. Si la cantidad mxima de aluminio en los IPV y en los EGF es 25 mcg/L o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta
de aluminio que contiene cada uno, tal como en el prrafo (4), la etiqueta del envase primario de los IPV y los EGF usados
en la preparacin de mezclas o formulaciones para NPT (con las excepciones que se indican a continuacin) pueden declarar: No contiene ms de 25 mcg/L de aluminio. Si el IPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del envase primario puede declarar lo siguiente: Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la
concentracin de aluminio no ser ms de 25 mcg/L.
4. El nivel mximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todos los IPV y
los EGF usados en la preparacin de formulaciones y mezclas para NPT. El contenido de aluminio debe declararse de la
siguiente manera: No contiene ms de ___ mcg/L de aluminio. La etiqueta del envase primario de todos los IPV y los
EGF que son polvos liofilizados usados en la preparacin de soluciones para NPT deben declarar lo siguiente: Cuando se
reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentracin de aluminio no ser ms de ___
mcg/L. Este contenido mximo de aluminio debe declararse como el ms alto entre los tres niveles siguientes:
El nivel ms alto de las partidas producidas durante los ltimos tres aos
El nivel ms alto de las ltimas cinco partidas
El nivel mximo con respecto a los niveles histricos, pero slo hasta completar la produccin de las primeras cinco
partidas.
El prospecto adjunto en los envases de todos los IGV, los IPV y los EGF usados en la preparacin de mezclas y formulaciones
para NPT debe contener la siguiente declaracin en la seccin de Advertencias del etiquetado:
ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser txico. El aluminio puede alcanzar niveles txicos con la
administracin parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen mayor
Captulos
El uso de un sistema de cierre negro en un vial (p.ej., una tapa de sobresello negra y un casquillo negro para sostener el
cierre elastomrico) o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se
reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin (ver el captulo 659).
USP 38
riesgo debido a la inmadurez de sus riones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de calcio y fosfato que
contienen aluminio.
Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos prematuros, que reciben niveles de
aluminio por va parenteral mayores de 45 mcg/kg/da, acumulan aluminio a niveles asociados con la toxicidad sea y
del sistema nervioso central. La acumulacin en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles ms bajos de administracin.
ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS Y OTRAS CATEGORAS
Captulos
Las etiquetas y etiquetados deben incluir la siguiente informacin:

1. En el caso de una preparacin lquida, el contenido porcentual de cada parte activa y/o frmaco o la cantidad de cada
parte activa y/o frmaco en un volumen especificado, excepto que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado
o para hacer isotnica la solucin se puedan declarar por el nombre y una indicacin acerca de su efecto.
2. En el caso de una preparacin magistral, el etiquetado debe indicar: Este medicamento es una preparacin magistral
(ver Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795, Proceso de Preparacin Magistral, Criterios para la Elaboracin
de Una Preparacin Magistral para Cada Frmaco).
3. En el caso de una preparacin seca u otra preparacin a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la cantidad de cada parte activa y/o frmaco, la composicin de los diluyentes recomendados [slo el o los nombres si la frmula
se especifica en la monografa individual], la cantidad que se usar para lograr una concentracin especfica de la parte
activa o el frmaco, el volumen final de solucin, las instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solucin reconstituida y una fecha de caducidad o fecha lmite de uso (ver la seccin Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso).
Cantidad de Parte Activa y/o Frmaco por Unidad de Dosificacin

La concentracin de un medicamento se expresa en la etiqueta del envase en trminos de la parte teraputicamente activa o
del frmaco en microgramos, miligramos, gramos o porcentaje, independientemente de la forma que se use en el ttulo, a
menos que se indique de otro modo en una monografa individual. Los nombres de la parte activa y del frmaco, as como sus
cantidades equivalentes se proveen en la etiqueta del envase y en el etiquetado (ver el captulo 1121, Poltica para la Denominacin de Monografas de Medicamentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Frmacos).
Los artculos oficiales en cpsulas, tabletas u otras formas farmacuticas debern etiquetarse indicando la cantidad de cada
parte activa y/o frmaco o el nutriente reconocido que est contenido en cada unidad. Las soluciones o suspensiones orales de
dosis nica (independientemente de si se proveen como preparaciones lquidas o preparaciones lquidas que se reconstitutyen
a partir de slidos con la adicin de un volumen designado de un diluyente especfico) debern etiquetarse expresando la cantidad de cada parte activa y/o frmaco o nutriente reconocido administrado en las condiciones descritas en el captulo Volumen de Entrega 698. Los medicamentos oficiales que no se envasan como dosis nicas debern etiquetarse indicando la cantidad de cada parte activa y/o frmaco en cada mililitro o gramo, o expresando el porcentaje de cada uno de estos ingredientes
(ver Advertencias y Requisitos Generales 8.140, Concentraciones Porcentuales). Una excepcin son los lquidos o slidos orales
destinados para su reconstitucin para producir lquidos orales que, alternativamente, pueden etiquetarse en trminos de cada
porcin de 5 mL de lquido o del lquido resultante. A menos que se especifique de otro modo en una monografa o un captulo, las concentraciones o cantidades debern declararse solamente en unidades mtricas [ver tambin Advertencias y Requisitos
Generales 5.50.10, Unidades de Potencia (Biolgica)].
Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso

La etiqueta de un medicamento o suplemento nutricional o diettico oficial debe llevar una fecha de caducidad. Todos los
productos deben exhibir la fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leda por una persona comn en las condiciones
normales de compra y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma prominente, contrastando claramente con el fondo, o grabada en relieve con nitidez, y debe ser fcilmente comprendida (p.ej., CAD, VENC o EXP 6/13, Cad, Venc o Exp
13 de junio o Caducidad, Vencimiento o Expiracin 6/2013). [NOTAPara obtener informacin adicional, consultar los
Voluntary Codes and Guidelines of the Consumer Healthcare Products Industry de la Consumer Healthcare Products Association.]
Las monografas para ciertas preparaciones especifican cmo se debe determinar la fecha de caducidad que aparece en la
etiqueta. En ausencia de un requisito especfico en la monografa individual de un medicamento o un suplemento nutricional,
la etiqueta debe llevar una fecha de caducidad asignada para dicha formulacin y empaque del artculo, con la siguiente excepcin: no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de medicamentos o suplementos nutricionales envasados en
envases destinados a la venta sin receta mdica, en cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosificacin y que se
mantengan estables durante un perodo de no menos de 3 aos, siempre que se almacenen en las condiciones prescritas.
En el caso de artculos oficiales que deban exhibir una fecha de caducidad, tales artculos debern dispensarse nicamente
en un envase, o a partir de un envase, etiquetado con fecha de caducidad, y la fecha de dispensacin del producto deber ser
anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de caducidad identifica el perodo durante el cual se estima que el artculo
cumple con los requisitos de la monografa oficial, siempre que se conserve en las condiciones de almacenamiento prescritas.
USP 38
Preparaciones Magistrales
La etiqueta del envase o empaque que contiene una preparacin magistral oficial debe llevar una fecha lmite de uso. La
fecha lmite de uso es la fecha despus de la cual no debe usarse la preparacin magistral. La fecha lmite de uso se determina
basndose en criterios distintos a los utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados en
forma industrial.
La etiqueta en el empaque del envase de una preparacin magistral oficial debe incluir las palabras preparacin magistral
despus del nombre del medicamento (p.ej., Baclofeno, Solucin Oral, Preparacin Magistral). Adems, las preparaciones magistrales oficiales USP para pacientes animales incluirn la palabra veterinario(a) despus de la denominacin oficial (p.ej.,
Atenolol, Suspensin, Preparacin Magistral Veterinaria).
Irrigacin, Hemofiltracin y Dilisis

Los envases flexibles para inyecciones destinadas a dilisis, hemofiltracin o soluciones de irrigacin y que contienen un volumen de ms de 1 L, debern etiquetarse indicando que el contenido no est destinado para infusin intravenosa.
Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una Cantidad

Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la dispensacin y administracin de medicamentos, cuando la cantidad
de parte activa y/o frmaco se exprese en nmeros enteros, se debe indicar sin coma decimal seguida de ceros (p. ej., indicar
4 mg, no 4,0 mg). Cuando la cantidad de parte activa y/o frmaco se exprese en un nmero decimal menor a 1, se debe
indicar con un cero antes de la coma decimal (p.ej., indicar 0,2 mg; no ,2 mg).
Alcohol
El contenido de alcohol en una preparacin lquida debe especificarse en la etiqueta como un porcentaje (v/v) de C2H5OH.
Productos Botnicos
La etiqueta de una planta u otro producto botnico destinado para uso como suplemento diettico deber incluir la leyenda
Si est embarazada o en perodo de lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este producto.
Captulos
La fecha de caducidad limita el tiempo durante el cual un artculo puede ser dispensado o usado. En los casos en que se indica
slo el mes y el ao de caducidad, se entiende que la fecha se refiere al ltimo da del mes indicado.
La fecha lmite de uso es la fecha despus de la cual no se debe utilizar un producto. Basndose en la informacin provista
por el fabricante o en esta subseccin, el dispensador deber colocar una fecha lmite de uso adecuada en la etiqueta del envase del artculo recetado para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La fecha lmite de uso colocada en la etiqueta no
debe ser posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante. Ver tambin la seccin Preparaciones Magistrales ms adelante.
Para los artculos que requieran ser reconstituidos antes de su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha lmite de uso
apropiada para el producto reconstituido.
Para todas las otras formas farmacuticas, al determinar la fecha lmite de uso, el dispensador debe tomar en cuenta, adems
de cualquier otro factor relevante lo siguiente:
La naturaleza del medicamento
El envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de caducidad
Las caractersticas del envase para el paciente, si el artculo se reenvasa para su dispensacin
Las condiciones de almacenamiento esperadas a las que el artculo puede ser expuesto
Las condiciones de almacenamiento inusuales a las que el artculo puede ser expuesto
El perodo estimado para la duracin del tratamiento.
Despus de tomar en cuenta dichos factores, el dispensador deber colocar una fecha lmite de uso adecuada en la etiqueta
del envase del artculo para limitar el uso del mismo por parte del paciente. A menos que se especifique algo diferente en la
monografa individual, o en ausencia de datos de estabilidad, esa fecha lmite de uso no podr ser posterior a: (a) la fecha de
caducidad indicada en el envase del fabricante, o (b) 1 ao a partir de la fecha en que se dispense el medicamento, lo que
represente un perodo menor. Para formas farmacuticas lquidas y slidas no estriles que estn envasadas en envases unitarios y de dosis nica, la fecha lmite de uso debe ser de 1 ao a partir de la fecha de envasado del medicamento en envases
unitarios o de dosis nica, o la fecha de caducidad indicada en el envase del fabricante, lo que represente un perodo menor, a
menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del fabricante indiquen algo diferente.
USP 38
Electrlitos
La concentracin de electrlitos para terapias de reemplazo (p.ej., sodio, potasio, cloruro), deber especificarse en la etiqueta en miliequivalentes (mEq)/volumen. [NOTAEl contenido de fsforo en inyectables deber expresarse en miliMoles (p.ej.,
mMol/volumen). Asimismo, la etiqueta del producto deber indicar la cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en
trminos de peso o concentracin porcentual.]
Productos No Orales
Un producto destinado para inyeccin o uso tpico deber indicar los nombres de todas las sustancias agregadas (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20, Sustancias Agregadas).
Captulos
Sales de Frmacos
Es un principio establecido que los artculos oficiales deben tener un nico ttulo oficial (ver Advertencias y Requisitos Generales 2.20 y los requisitos farmacopeicos de nomenclatura en el captulo 1121). Con el objeto de ahorrar espacio en las etiquetas, y dado que los smbolos qumicos de las sales inorgnicas ms comunes son bien conocidos por los profesionales de la
salud, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de artculos oficiales que son sales: HCl para clorhidrato; HBr
para bromhidrato; Na para sodio; y K para potasio. Los smbolos Na y K se usan para abreviar el nombre de las sales de cidos
orgnicos; sin embargo, estos smbolos no deben usarse cuando se emplea la preposicin de en el ttulo oficial, es decir cuando se denominan oficialmente de sodio o de potasio (con el metal al comienzo de la denominacin oficial en ingls), (p.ej.,
Fenobarbital Sdico, que se denomina Phenobarbital Sodium en ingls, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se deber escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el cual se denomina Sodium Salicylate en ingls).
Cpsulas y Tabletas Especiales

La etiqueta de cualquier Cpsula o Tableta destinada para una administracin que no sea la ingestin oral de la unidad entera, deber llevar una indicacin bien visible sobre el modo de uso (ver Nomenclatura Farmacopeica, Pautas de Nomenclatura en
el sitio Web de la USP en www.usp.org).
Productos con Vitaminas

La etiqueta de los medicamentos oficiales debe indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades mtricas por unidad de dosificacin. Las cantidades de vitamina A, D y E tambin se pueden expresar en Unidades USP. Las cantidades de
vitamina A expresadas en unidades mtricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de retinol (alcohol de vitamina A).
La etiqueta de los suplementos nutricionales debe incluir un nmero identificatorio de lote, de control o de partida.
Temperatura Ambiente Controlada

Los artculos pueden etiquetarse indicando su almacenamiento a temperatura ambiente controlada o a una temperatura
de hasta 25, u otra indicacin basada en la misma temperatura cintica media (ver el captulo
659).
Envase Resistente a la Luz

Cuando se use una cubierta opaca para proveer proteccin de la luz para un producto sensible a la luz envasado en un envase transparente o incoloro o translcido, la etiqueta del envase deber indicar que la cubierta opaca es necesaria hasta el momento de uso o administracin del contenido (ver EnvasesPruebas de Desempeo 671, Prueba de Transmisin de Luz y el
captulo 659).
Envase Unitario
Todos los envases unitarios debern etiquetarse indicando la identidad, cantidad y/o concentracin, el nombre del fabricante, el nmero de lote y la fecha de caducidad del artculo (ver el captulo 659).
Envase Monodosis
Un envase monodosis deber etiquetarse como tal y, cuando el espacio lo permita, la etiqueta deber incluir instrucciones
apropiadas para su desecho (ver el captulo 659).
USP 38
Requisitos Generales / 11 Estndares de Referencia USP 101
Envase de Unidad de Uso

Un envase de unidad de uso deber etiquetarse como tal, sin ninguna modificacin adicional excepto la adicin del etiquetado apropiado (ver el captulo 659).
Proteccin de la Congelacin
El envase deber incluir una indicacin apropiada para proteger el artculo de la congelacin si estuviera sujeto a la prdida
de contenido o potencia, o a la alteracin destructiva de sus caractersticas (ver el captulo 659).
Etiquetado de Envases de Venta bajo Receta Mdica

Como mnimo, un envase de venta bajo receta mdica deber etiquetarse tomando en cuenta al paciente. La etiqueta deber contener informacin esencial que sea importante para el uso seguro y efectivo del medicamento por parte del paciente. Las
etiquetas deben tener un diseo y formato que optimice la legibilidad y el entendimiento (ver Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta 17).
ETIQUETADO GENERAL
11 ESTNDARES DE REFERENCIA USP

Los Estndares de Referencia provistos por la Convencin de la Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (Estndares de
Referencia USP o ER) son muestras bien caracterizadas de frmacos y alimentos especficos (frmacos, productos biolgicos,
excipientes, suplementos dietticos, ingredientes alimenticios, impurezas, productos de degradacin, reactivos y estndares de
verificacin de desempeo). Cuando los ER USP se aprueban como aptos para su uso como estndares de comparacin en las
pruebas o valoraciones documentales (es decir, como componentes de las monografas) en la Farmacopea de los Estados Unidos
(USP) o en el Formulario Nacional (NF), tambin adquieren estatus oficial y reconocimiento legal en los Estados Unidos de Amrica. Es responsibilidad del usuario evaluar la aptitud de los ER para su uso en otras aplicaciones. Los ER USP oficiales son los
estndares primarios en jurisdicciones que los reconocen como tales y, cuando corresponda, se calibran con respecto a materiales de referencia internacionales tales como los provistos por la Organizacin Mundial de la Salud. Los ER USP no estn destinados para uso teraputico. Los ER USP se ofrecen para propsitos de metrologa legal y pueden ayudar a asegurar la comparabilidad de los resultados y la trazabilidad a las unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI) independientemente del
estado de certificacin. Los ER USP son Materiales de Referencia conforme a lo definido en el Vocabulario Internacional de MetrologaConceptos Bsicos y Generales y Trminos Asociados (VIM): 3ra edicin, 2007.
TIPOS DE ESTNDARES DE REFERENCIA

Estndares de Referencia para Artculos USP o NF
Los Estndares de Referencia para los artculos oficiales en USP o NF se ofrecen como materiales puros o como mezclas de
sustancias qumicas que constituyen un reflejo de los frmacos o excipientes correspondientes. El uso de estos materiales se
especifica en la monografa del artculo. Por lo general, estos materiales son necesarios para la Valoracin y/o las pruebas de
Identificacin. La evaluacin de la aptitud de un ER USP para usos distintos a los especificados en una monografa es responsabilidad del usuario. El valor de propiedad o el valor de clculo del Estndar de Referencia se declara en la etiqueta y se debe
incluir en los clculos usados en la monografa y en los captulos generales aplicables. Para los Estndares de Referencia que no
cuentan con un valor de propiedad o un valor de clculo declarado en la etiqueta o en la documentacin adjunta, se debe
asumir que el Estndar de Referencia es 100,0% puro para las aplicaciones cuantitativas farmacopeicas.
Captulos
Se recuerda a los usuarios referirse siempre a las Advertencias y Requisitos Generales para la evaluacin o aplicacin de cualquier norma farmacopeica. Las Advertencias y Requisitos Generales tratan diversos aspectos relacionados con el etiquetado, entre los que se incluyen 3.20, Indicacin de Cumplimiento (cuando un artculo puede etiquetarse con la denominacin USP, NF o
USPNF, y requisitos relacionados con las diferencias en identidad, denominacin, contenido, calidad o pureza); 5.20.10, Sustancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes en Sustancias Oficiales; 6.70, Reactivos; y 8.240, Pesos y Medidas (p.ej., el microgramo puede expresarse como mg o mcg. Para propsitos de etiquetado o prescripcin, se prefiere mcg).USP38
102 11 Estndares de Referencia USP / Requisitos Generales
USP 38
Estndares de Referencia de Impurezas
Captulos
Los Estndares de Referencia de impurezas pueden incluir lo siguiente:

Impurezas orgnicas que pueden surgir durante los procesos de fabricacin o durante la vida til de un artculo y pueden
incluir materiales iniciales, productos intermedios, subproductos, reactivos, catalizadores y/o productos de degradacin.
Impurezas inorgnicas que normalmente resultan de un proceso de sntesis y que pueden incluir reactivos, catalizadores,
metales pesados o sales inorgnicas
Disolventes residuales que pueden ser lquidos orgnicos o inorgnicos que se usan para preparar soluciones o suspensiones durante la sntesis de un artculo
Los Estndares de Referencia de Impurezas pueden presentarse como materiales purificados de un solo componente o como
mezclas de ms de una impureza. Otras opciones para controlar impurezas pueden incluir la presentacin del artculo oficial
con un contenido de impurezas declarado, el uso de tiempos de retencin y factores de respuesta cromatogrfica relativos, o
la provisin de valores tericos tales como las absortividades UV a longitudes de onda seleccionadas.
En ediciones anteriores de la farmacopea, las impurezas se designaban por sus nombres qumicos. Para facilitar la bsqueda
y el orden en el ndice, los nombres qumicos de las impurezas se han reemplazado gradualmente por la denominacin ER
Compuesto Relacionado Y de X, donde X es el nombre del artculo oficial e Y es una letra secuencial del alfabeto. La designacin de esta letra no concuerda necesariamente con los esquemas de denominacin usados por otras farmacopeas. Asimismo,
los Estndares de Referencia de mezclas de impurezas se pueden designar segn el uso al que estn destinados, como por
ejemplo ER Aptitud del Sistema de X. Los nombres convencionales y los nombres qumicos se reproducen en el catlogo y
en la etiqueta del ER.
Materiales de Referencia Certificados

Los Materiales de Referencia Certificados de USP (MRC) son Estndares de Referencia que proporcionan valores de propiedades certificados con incertidumbres asociadas y trazabilidad metrolgica, de conformidad con las Guas 3035 de la International Organization for Standardization (ISO). El uso correcto de estos MRC respalda la trazabilidad de los resultados a las unidades del SI y la capacidad de comparabilidad de los procedimientos.
Estndares de Referencia USP para Productos Biolgicos

La USP ofrece ER para productos biolgicos y materiales auxiliares. Por diversas razones, que incluyen razones histricas, y
conforme se indica en la Seccin 5.50.10 Unidades de Potencia (Biolgica) en las Advertencias y Requisitos Generales, los ER USP
para productos biolgicos pueden diferir en la cantidad de unidades de potencia, por definicin, o en otros aspectos de los
dems estndares reconocidos internacionalmente. A menos que as se indique en la monografa, los estndares de referencia
internacionales generalmente no son intercambiables y se requieren ER USP para las pruebas y valoraciones de USPNF.
Estndares de Referencia NF
Se pretende designar y etiquetar como Estndares de Referencia USP a los Estndares de Referencia actualmente etiquetados como Estndares de Referencia NF, conforme a la consolidacin de la USP y el NF dentro de la USP a partir del 2 de
Enero de 1975. Cuando sea necesario un Estndar de Referencia USP, se puede usar la sustancia correspondiente etiquetada
como un Estndar de Referencia NF.
Transicin de Sustancias Autnticas a Estndares de Referencia USP

En el pasado, la USP desarrollaba a manera de servicio materiales de referencia altamente caracterizados no requeridos para
su uso en monografas o captulos generales de USPNF, los cuales se distribuan como Sustancias Autnticas (SA). Las SA son
sustancias qumicas altamente caracterizadas que se analizan mediante estudios en colaboracin y se ponen a disposicin como un servicio primariamente para los laboratorios analticos, clnicos, farmacuticos y de investigacin. Estos materiales pueden usarse en la identificacin, el desarrollo de mtodos, la evaluacin del desempeo de mtodos, u otras aplicaciones que
sean adecuadas y estn validadas por el usuario. La USP dejar de lanzar materiales etiquetados como Sustancias Autnticas.
Todos los materiales de referencia liberados al mercado, independientemente que se requiera o no su uso en una monografa
o captulo general de USPNF, sern Estndares de Referencia USP.
Referencias Visuales Autnticas

Las Referencias Visuales Autnticas son Estndares de Referencia USP, pero a diferencia de los materiales de referencia qumicos, las Referencias Visuales Autnticas (RVA) no se usan en anlisis qumicos. Las RVA son imgenes visuales usadas por los
analistas para comparar ciertos artculos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos farmacopeicos. Las RVA se incorporan por referencia en la monografa.
USP 38
Requisitos Generales / 11 Estndares de Referencia USP 103
Estndares de las Pruebas de Verificacin de Desempeo USP

Estos materiales se proporcionan para analizar y, cuando fuese adecuado, facilitar el ajuste de la operacin de un instrumento para asegurar que los resultados obtenidos son exactos y/o precisos o que proporcionan resultados aceptables. El uso de
estos Estndares de Referencia se describe generalmente en los captulos de pruebas generales asociados y en la informacin
relacionada.
APLICACIONES DE LOS ESTNDARES DE REFERENCIA USP

Las aplicaciones oficiales de los ER USP se especifican en las monografas y captulos generales de USPNF. Incluyen lo siguiente:
usos cuantitativos en valoraciones de frmacos y formulaciones, pruebas de lmite, o blancos y controles
usos cualitativos, (p.ej., pruebas de identificacin, pruebas de aptitud del sistema, o marcadores de picos cromatogrficos)
usos especficos del mtodo, (p.ej., estndares de verificacin de desempeo, RVA, estndares de punto de fusin y el set
de conteo de partculas)
Segn se describi con anterioridad, la USP tambin ofrece Sustancias Autnticas que no se especifican para su uso en una
monografa o captulo general de USP, las cuales se usan a criterio del usuario.
ENVASADO
ETIQUETADO
El texto de la etiqueta proporciona toda la informacin requerida para el almacenamiento y uso correctos de los ER USP en
las aplicaciones de las monografas. La etiqueta incluye instrucciones de uso, advertencias de seguridad, informacin requerida
para las sustancias controladas y un valor de propiedad o un valor de clculo para los estndares con aplicaciones cuantitativas.
Para los estndares de verificacin de desempeo, se proveen intervalos de aceptacin. Cuando resulta necesario, los ER USP
estn acompaados de documentacin adicional, como por ejemplo Hojas de Datos Tcnicos o Cromatogramas Tpicos.
A menos que se indique algo distinto en el procedimiento de la monografa individual o en un captulo general, los ER USP
se deben usar de acuerdo con las instrucciones en la etiqueta del Estndar de Referencia. Las Hojas de Datos de Seguridad de
los Materiales para todos los materiales de referencia USP estn disponibles en el sitio Web de la USP.
Aunque los ER USP se vuelven a analizar de acuerdo con un programa predefinido para determinar la aptitud continua de
uso, los ER USP no presentan una fecha de caducidad en la etiqueta. Un lote de ER USP puede usarse en sus aplicaciones oficiales siempre que se publique como Current Lot (Lote Vigente) en la versin vigente del USP Reference Standards Catalog
(Catlogo de Estndares de Referencia USP) o que no haya alcanzado su Fecha de Uso Vlida. Al agotarse, se designa a este
lote en el catlogo como Previous Lot (Lote Anterior) y se le asigna una Valid Use Date (Fecha de Uso Vlida). La USP
publica bimestralmente el Catlogo de Estndares de Referencia. Se puede encontrar la versin vigente del catlogo en el sitio
Web de la USP: www.usp.org. Es responsabilidad del usuario constatar antes de su uso que el lote del Estndar de Referencia
USP en cuestin tiene un estatus oficial como Current Lot (Lote Vigente) o como Previous Lot (Lote Anterior) dentro de la
Fecha de Uso Vlida.
USO ADECUADO
Muchas pruebas y valoraciones farmacopeicas estn basadas en la comparacin de una muestra de prueba con un ER USP.
En estos casos, las mediciones se realizan en preparaciones de la muestra de prueba y del Estndar de Referencia. Cuando se
indica que se debe preparar en diluciones sucesivas, o de otro modo, una Solucin estndar o una Preparacin estndar para
realizar una determinacin cuantitativa, est previsto que la sustancia del Estndar de Referencia se pese con exactitud (ver
Pesas y Balanzas 41 y Aparatos Volumtricos 31). Tambin se deben tomar en cuenta los errores potenciales asociados con el
pesaje de masas pequeas (ver tambin la Seccin 6.50.20.1 Ajuste de Soluciones en las Advertencias y Requisitos Generales).
Segn se indic anteriormente, los Estndares de Referencia que se definen basndose en el contenido por envase son una
excepcin.
Las instrucciones de uso de los ER USP incluyen lo siguiente:
Captulos
La cantidad de material por envase individual de ER USP depende de la aplicacin farmacopeica del estndar y es, por lo
general, suficiente para varias determinaciones. Algunos estndares (principalmente materiales con requisitos importantes de
manipulacin o materiales que estn disponibles nicamente en pequeas cantidades) se proporcionan en envases de un solo
uso. Dichos productos de un solo uso por lo general son liofilizados y su contenido se declara en unidades de masa o actividad
por envase. Cuando as se declara, el contenido del envase debe reconstituirse en su totalidad sin la necesidad de pesarlo nuevamente. Las instrucciones de reconstitucin se proveen en la etiqueta o en las monografas en que se usa el estndar.
104 11 Estndares de Referencia USP / Requisitos Generales
USP 38
Tal Como se Encuentra (As Is): Usar sin tratamiento previo ni correccin por sustancias voltiles. sta es la opcin de
preferencia y se escoge siempre que los datos validados indiquen que el contenido de sustancias voltiles es constante
con el transcurrir del tiempo.
Secar Antes de Usar (Dry Before Use): Usar inmediatamente despus de secar en las condiciones indicadas. El secado no
debe realizarse en el envase original. Se debe transferir una porcin del material a un recipiente de secado distinto.
Determinar Volumtricamente el Contenido de Agua al Momento de su Uso (Determine Water Content Titrimetrically At Time of Use): Usar con una correccin por el contenido de agua o la prdida por secado determinada en una
porcin separada del material. Cuando se requiere de una determinacin volumtrica de agua al momento de usar el Estndar de Referencia, proceder segn se indica en el Mtodo I en Determinacin de Agua 921. Para ello se aceptan mtodos instrumentales o microanalticos. Cuando se usen cantidades habituales (aproximadamente 50 mg del Estndar de
Referencia), valorar volumtricamente con una solucin del reactivo diluida de 2 a 5 veces. Cuando requiera la determinacin de la prdida por secado de una porcin separada del ER USP, proceder segn se indica en la etiqueta. Se pueden
usar tamaos de muestra ms pequeos que los requeridos en el captulo de pruebas generales Prdida por Secado 731
para un ER USP, siempre que el usuario pueda obtener un resultado suficientemente exacto.
Siempre que las instrucciones de uso declaradas requieran de secado o de una correccin por sustancias voltiles, se lo debe
realizar al momento del uso. Se deben controlar los detalles experimentales adicionales mediante los Procedimientos Operativos Estndares del usuario y las buenas prcticas de laboratorio.
Captulos
ALMACENAMIENTO
Los ER USP deben almacenarse en la configuracin de envasado provista por la USP (p.ej., viales que se envasan en bolsas
selladas hermticamente). Cuando se especifiquen condiciones de almacenamiento especiales, se deben seguir las instrucciones de la etiqueta. Los viales sin abrir se deben almacenar segn se indica en la etiqueta. Es responsabilidad del usuario asegurar que el contenido de los viales abiertos contine siendo adecuado para el uso provisto y que se mantenga tanto la asignacin de valores como la informacin de incertidumbre.

17 ETIQUETADO DE ENVASES DE MEDICAMENTOS DE VENTA BAJO
RECETA
INTRODUCCIN
El uso errneo de medicamentos ocasiona ms de un milln de eventos adversos por ao en los Estados Unidos. En lo que
respecta a medicamentos recetados, la mejor (y generalmente la nica) fuente de informacin para los pacientes es la etiqueta
del envase del medicamento de venta bajo receta y, aunque en ocasiones el paciente dispone de otra informacin escrita y
asesoramiento verbal, la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe satisfacer las obligaciones profesionales del mdico que receta y del farmacutico. Estas obligaciones incluyen proveer al paciente aquella informacin que resulte
esencial y necesaria para entender la forma segura y apropiada de uso del medicamento y el apego al esquema prescrito de
medicacin.
El entendimiento inadecuado de las instrucciones de uso del medicamento recetado y de la informacin auxiliar en los envases dispensados se ha generalizado. Diversos estudios han descubierto que el 46% de los pacientes no entienden una o ms
instrucciones de posologa, mientras que el 56% malinterpreta una o ms de las advertencias auxiliares. El problema se acenta en pacientes con un bajo nivel de alfabetismo o semi analfabetos, as como en pacientes que reciben varios medicamentos
con esquemas de administracin innecesariamente complejos o no estandarizados. Un estudio demostr que los pacientes con
bajo nivel de alfabetismo son 34 veces ms propensos a malinterpretar las advertencias en las etiquetas de los medicamentos
recetados. Sin embargo, incluso los pacientes con un nivel adecuado de alfabetismo a menudo malinterpretan las instrucciones
y advertencias comunes de los medicamentos recetados. Asimismo, existen grandes discrepancias entre las advertencias auxiliares y las instrucciones adicionales indicadas por cada mdico para el mismo medicamento recetado. A menudo, la evidencia
especfica para sustentar una declaracin auxiliar es poco clara y los pacientes en muchas ocasiones ignoran dicha informacin.
Sin embargo, an se requieren mayores estudios con respecto a la necesidad esencial y al beneficio que proporciona la infor-
USP 38
Aparato / 17 Etiquetado de Envases de Medicamentos 105
macin auxiliar en la etiqueta (tanto texto como conos) para mejorar el entendimiento del paciente sobre el uso seguro y
apropiado de sus medicamentos en comparacin con el uso de un lenguaje simplificado y explcito nicamente.
La falta de normas universales para el etiquetado de envases de medicamentos de venta bajo receta que se dispensan es una
causa importante por la que el paciente malinterpreta las instrucciones, no las sigue de manera adecuada y comete errores de
medicacin. El 18 de mayo de 2007, el Comit de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos de la USP estableci un Panel
Asesor con los siguientes objetivos: 1) determinar el contenido y formato ptimos de las etiquetas de los medicamentos de
venta bajo receta para promover el uso seguro de medicamentos mediante la revisin crtica de factores que promueven u
ocasionan que el paciente no entienda las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta y 2) crear normas universales para etiquetas de medicamentos de venta bajo receta con respecto al formato/apariencia y el contenido/lenguaje.
En noviembre de 2009, el Panel Asesor en Alfabetizacin en Salud y Etiquetado de Envases de Medicamentos Recetados present sus recomendaciones al Comit de Expertos en Uso Seguro de Medicamentos, el cual a su vez solicit a la USP desarrollar normas para etiquetas centradas en el paciente en lo referente a formato, apariencia, contenido y lenguaje de las instrucciones en los medicamentos de venta bajo receta a fin de promover el entendimiento por parte de los pacientes. Dichas recomendaciones conforman el fundamento de este captulo general.
NotaEstas normas no se aplican cuando personal autorizado, que acta dentro del marco de su profesin, administra un
medicamento de venta bajo receta a un paciente.
NORMAS PARA ETIQUETAR ENVASES DE MEDICAMENTOS RECETADOS QUE PROMUEVAN EL

ENTENDIMIENTO EN LOS PACIENTES
Captulos
Organizar la etiqueta del medicamento de venta bajo receta de una manera centrada en el paciente: La informacin
debe organizarse de la manera que mejor refleje la forma en que la mayora de los pacientes buscan y entienden las instrucciones de uso de los medicamentos. El etiquetado del envase de los medicamentos de venta bajo receta debe presentar al paciente nicamente la informacin ms importante requerida para entender el uso seguro y efectivo.
Se deben enfatizar las instrucciones y dems informacin importante para los pacientes: Presentar de manera prominente la informacin crtica para los pacientes sobre el uso seguro y efectivo del medicamento. En la parte superior de la etiqueta, se debe especificar el nombre del paciente, el nombre del medicamento (especificar el nombre genrico y comercial
completos) y la dosis, adems de instrucciones de uso explcitas y claras en lenguaje sencillo.
Las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta deben seguir un formato estndar de modo que el paciente
pueda estar seguro de que cada elemento se encontrar en un orden reglamentado cada vez que reciba un medicamento recetado.
Otra informacin menos crtica aunque importante (p.ej., nombre y nmero telefnico de la farmacia, nombre del mdico
que receta, fecha de llenado, fecha de rellenado, fecha de caducidad, nmero de receta mdica, cantidad de medicamento,
descripcin fsica e informacin auxiliar basada en evidencia) no debe predominar sobre la informacin crtica para el paciente.
Esta informacin menos crtica se debe colocar lejos de las instrucciones de dosificacin (p.ej., en la parte inferior de la etiqueta
o en otra ubicacin menos prominente) puesto que distrae a los pacientes e interfiere con su reconocimiento y entendimiento.
Lenguaje simplificado: El lenguaje de la etiqueta debe ser claro, conciso y familiar, y se debe usar de forma estandarizada.
Se deben usar nicamente trminos y clusulas comunes. No se deben usar palabras poco familiares (incluyendo trminos en
latn) ni jerga mdica.
No se recomienda el uso de frmulas o software de legibilidad para simplificar extractos de texto como los presentados en
las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta. En su lugar, se deben usar clusulas simplificadas y estandarizadas,
redactadas de tal forma que aseguren el fcil y correcto entendimiento de las instrucciones (mediante retroalimentacin obtenida de muestras de diversos consumidores).
Proveer instrucciones explcitas: Las instrucciones de uso (es decir, la SIG o signatura) deben separar claramente la dosis
misma del esquema de administracin de cada dosis a fin de transmitir explcitamente el nmero de unidades de dosificacin
y el momento en que deben administrarse (p.ej., periodos (partes) especficos del da, tales como la maana, el medio da, la
tarde y antes de acostarse). Las instrucciones deben incluir detalles especficos sobre los periodos de administracin. No se deben usar caracteres alfabticos en lugar de nmeros. Por ejemplo, se debe escribir Tomar 2 tabletas por la maana y 2 tabletas por la tarde en lugar de Tomar dos tabletas dos veces al da).
Siempre que sea posible, se deben usar instrucciones estandarizadas (p.ej., se debe escribir Tomar 1 tableta por la maana
y 1 tableta por la tarde si la prescripcin indica b.i.d.). Por lo general, se deben evitar instrucciones ambiguas basadas en
intervalos de dosificacin tales como dos veces al da o 3 veces al da, o en intervalos por horas tales como cada 12 horas,
puesto que dichas instrucciones se consideran implcitas ms que explcitas, pueden requerir destreza con los nmeros y la
interpretacin del paciente puede ser distinta de la intencin del mdico que expidi la receta. Aunque puede parecer que las
instrucciones expresadas en horas especficas (p.ej., 8 a.m. y 10 p.m.) se entienden con ms facilidad que las instrucciones
ambiguas e implcitas, en realidad son menos fciles de entender y pueden presentar mayores problemas de seguimiento debido a los patrones de vida de cada individuo, tales como el horario de trabajo, que los intervalos de tiempo ms generales como por la maana, por la tarde, despus del desayuno, con el almuerzo, o antes de dormir. El uso uniforme de la misma terminologa ayudar a evitar confusiones en los pacientes.
Se deben evitar instrucciones ambiguas tales como tomar segn lo indicado a menos que se proporcionen instrucciones
complementarias claras y asesoramiento (p.ej., instrucciones de uso que no quepan en la etiqueta del envase del medicamento
Captulos
106 17 Etiquetado de Envases de Medicamentos / Aparato
USP 38
de venta bajo receta). La etiqueta del envase debe incluir una indicacin clara que refiera al paciente a dichos materiales complementarios.
Incluir el propsito de uso: Si el propsito del medicamento se incluye en la receta mdica, tambin debe incluirse en la
etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta, a menos que el paciente prefiera la omisin del mismo. Se debe
preguntar a los pacientes cules son sus preferencias al momento de remitir las recetas mdicas para dispensar. Los factores de
confidencialidad y el uso aprobado por la FDA (p.ej. uso declarado en la etiqueta frente a uso alternativo) pueden restringir la
inclusin del propsito en las etiquetas. La evidencia actual respalda la inclusin del propsito de uso en un lenguaje claro y
simple (p.ej., para la presin sangunea alta en lugar de para la hipertensin).
Limitar la informacin auxiliar: La informacin auxiliar que aparezca en la etiqueta del envase del medicamento de venta
bajo receta debe basarse en evidencia cientfica y redactarse en lenguaje explcito minimizado para evitar distraer a los pacientes con informacin innecesaria. La mayora de los pacientes, en particular aquellos con un nivel bajo de alfabetismo, prestan
poca atencin a la informacin auxiliar. La informacin debe presentarse de manera estandarizada y debe ser crtica para que
el paciente entienda y use el medicamento de forma segura (p.ej., advertencias y alertas crticas para la administracin). Con
frecuencia, los pacientes malinterpretan los conos. Asimismo, los conos que ofrecen imgenes abstractas para transmitir mensajes que sean difciles de descifrar pueden ser poco efectivos para promover el entendimiento en comparacin con el uso exclusivo de texto simplificado. Deben usarse nicamente aquellos conos que, basndose en estudios con consumidores, mejoren el entendimiento del paciente sobre su uso correcto. La informacin auxiliar basada en evidencia, tanto texto como conos,
debe estandarizarse de modo que pueda aplicarse de manera uniforme y que no dependa de la preferencia individual del mdico que receta.
Tener en cuenta el dominio limitado del ingls: Cuando sea posible, las instrucciones de uso en la etiqueta del envase del
medicamento de venta bajo receta deben proveerse en el idioma preferido del paciente; de otro modo, existira el riesgo de
que los pacientes con un dominio limitado del ingls malinterpretaran las instrucciones, lo cual podra llevar a errores de medicacin y resultados adversos para la salud. Adems, siempre que sea posible, las instrucciones de uso deben proporcionarse
tambin en ingls a fin de facilitar el asesoramiento; el nombre del medicamento debe estar en ingls para que el personal de
emergencia y dems intermediarios tengan rpido acceso a la informacin.
Las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta deben traducirse usando procesos de traduccin de alta calidad. A
continuacin se proporciona un ejemplo de proceso de traduccin de alta calidad:
La traduccin es realizada por un traductor capacitado cuya lengua materna es el idioma de destino
La revisin de la traduccin es realizada por un segundo traductor capacitado quien resuelve cualquier diferencia con el
primer traductor
La revisin de la traduccin es revisada por un farmacutico cuya lengua materna es el idioma de destino quien resuelve
las diferencias con los traductores previos
Se prueba la comprensin con la audiencia a la que est destinada
Cuando no es posible contar con un proceso de traduccin de alta calidad, las etiquetas deben imprimirse en ingls y se deben usar los servicios de un intrprete capacitado siempre que sea posible para asegurar la comprensin del paciente. El uso de
traducciones generadas por computadora debe limitarse a programas de calidad demostrada debido a que las instrucciones de
dosificacin pueden carecer de uniformidad y representar riesgos potenciales. La estandarizacin de las instrucciones traducidas y los avances tecnolgicos son necesarios para asegurar la exactitud y seguridad del etiquetado de los envases de medicamentos de venta bajo receta para pacientes con un dominio limitado del ingls.
Mejorar la legibilidad: Las etiquetas deben contar con un diseo y formato que permita su fcil lectura. En la actualidad, no
existe evidencia firme que sustente la superioridad en cuanto a legibilidad de los tipos de letra serif frente a los tipos de letra
sans serif, por lo que se pueden usar tipos de letra no estrecha de cualquier tipo.
Se debe optimizar la tipografa usando las siguientes tcnicas:
Impresin en alto contraste (p.ej., impresin en negro sobre fondo blanco).
Tipos de letra familiares, simples y no estrechas con suficiente espacio dentro y entre caracteres (p.ej., Times Roman o
Arial).
Uso de maysculas (es decir, siguiendo las reglas del ingls: primera letra en mayscula seguida de palabras en minsculas, con excepcin de nombres propios).
Tipo de letra grande (p.ej, Times Roman de mnimo 12 puntos o Arial de 11 puntos) para informacin crtica. Tomar en
cuenta que el tamao de punto no representa el tamao de letra real, por lo que 2 tipos de letra con el mismo tamao
nominal de punto pueden tener en realidad tamaos de letra distintos. La altura x, que es la altura de la x minscula del
tipo de letra, se ha utilizado como un indicador ms exacto del tamao aparente en lugar del tamao de punto. Por
ejemplo, para un tamao de punto dado, la altura x y el tamao aparente de Arial son en realidad mayores que las de
Times Roman. No usar tipografa menor que Times Roman de 10 puntos o el tamao de letra equivalente de otra fuente.
Los adultos de mayor edad, particularmente, tienen dificultades para leer impresiones pequeas.
Usar un espacio en blanco adecuado entre lneas de texto (25%30% del tamao de punto).
Usar espacios en blanco para distinguir entre secciones de la etiqueta, tales como instrucciones de uso frente a informacin de la farmacia.
Usar slo texto orientado horizontalmente.
Existen otras medidas que tambin pueden mejorar la legibilidad:
De ser posible, minimizar la necesidad de girar el envase para leer lneas de texto.
Aparatos / 31 Aparatos Volumtricos 107
USP 38
Nunca truncar o abreviar la informacin crtica.

El uso de resaltado, negrillas y otras marcas tipogrficas deben mantener la legibilidad (p.ej., impresin en alto contraste y
color claro para el resaltado) y deben enfatizar la informacin central para el paciente o aquella informacin que facilite el
seguimiento (p.ej., nmero de dispensaciones adicionales).
Limitar el nmero de colores usados para el resaltado (p.ej., no ms de uno o dos).
Usar renglones separados para distinguir los tiempos de dosificacin.
Tener en cuenta los impedimentos visuales:
Ofrecer un acceso alternativo para pacientes con impedimentos visuales (p.ej., sistemas tctiles, auditivos o visuales mejorados que puedan emplear tecnologas de asistencia avanzadas).
21 TERMMETROS
31 APARATOS VOLUMTRICOS
La mayora de los aparatos volumtricos disponibles en los Estados Unidos estn calibrados a 20, a pesar de que la temperatura que predomina en general en los laboratorios se aproxima ms a los 25. Para minimizar el error volumtrico, la temperatura debera ser la misma para los aparatos volumtricos, el material que se est preparando, los disolventes que se utilizan
para preparar las soluciones volumtricas, el rea en la cual se preparan y el ajuste de volumen final.
UsoPara lograr el grado de precisin requerido en muchas valoraciones farmacopeicas que incluyen mediciones volumtricas e indican que una cantidad sea medida con exactitud, los aparatos deben elegirse y usarse con cuidado. El tamao de
una bureta debe ser tal que el volumen de la solucin volumtrica no represente menos del 30% del volumen nominal. Cuando se deben medir menos de 10 mL de solucin volumtrica, en general se requiere una bureta de 10 mL o una microbureta.
El diseo de los aparatos volumtricos es un factor importante para asegurar la exactitud. Por ejemplo, la longitud de la porcin graduada de las probetas graduadas no debe ser menor a cinco veces el dimetro interno y los picos de las buretas y de
las pipetas deberan restringir la velocidad del flujo de salida a no ms de 500 mL por segundo.
Estndares de ExactitudLas tolerancias de capacidad para los matraces volumtricos, las pipetas de transferencia y las
buretas son las mismas aceptadas por el Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (National Institute of Standards and Technology) (Clase A),1 segn se indica en las tablas adjuntas. Usar aparatos volumtricos de Clase A a menos que se especifique
algo diferente en la monografa individual. Para aparatos volumtricos de plstico las tolerancias de capacidad aceptadas son
Clase B.2
1
2
Ver ASTM 288-06, ASTM E287-02, ASTM E1189-00 y ASTM E969-02.

Ver ASTM E 288, Fed. Spec. NNN-F-289 y Estndar ISO 384.
Captulos
Los dispositivos para medir la temperatura adecuados para las pruebas de la Farmacopea deben ser rastreables y cumplir con
las especificaciones de las normas del NIST. Pueden ser de dos tipos: dispositivos de vidrio de columna lquida o dispositivos
con indicador de temperatura digital o analgico, como por ejemplo un dispositivo de resistencia, un termistor o un termopar.
Los indicadores de temperatura analgicos o digitales constan de una sonda de temperatura que contiene un sensor. La sonda est conectada a un medidor que convierte la seal en ohmios o milivoltios en un lectura de temperatura. En este tipo de
indicadores, la parte de la sonda de temperatura que se sumerge en el medio para medir su temperatura est fabricada de un
material inerte. La calibracin de los indicadores de temperatura analgicos y digitales se realiza con un estndar de temperatura rastreable a las normas NIST, con una frecuencia de ensayo predeterminada. Es sumamente importante seleccionar el dispositivo de medicin de temperatura segn las condiciones en las que se va a utilizar.
Los termmetros de vidrio de columna lquida pueden calibrarse por inmersin total, parcial o completa y, en la medida de
lo posible, cada termmetro se debera emplear segn las condiciones de inmersin en las que se calibr. La calibracin de los
termmetros se realiza segn una frecuencia predeterminada con un estndar de temperatura rastreable a las normas NIST.
Ver la versin vigente de la norma E1 de la ASTM (Asociacin Estadounidense de Ensayos y Materiales). La calibracin de los
termmetros de vidrio de columna lquida por inmersin total implica la inmersin del termmetro hasta el extremo superior
de la columna lquida dejando el resto de la columna y la cmara de expansin superior expuestas a la temperatura ambiente.
La calibracin de los termmetros por inmersin parcial implica la inmersin hasta la lnea de inmersin indicada en el frente
del termmetro dejando el resto de la columna expuesta a la temperatura ambiente. La calibracin por inmersin completa
implica la inmersin de todo el termmetro sin que quede ninguna parte de la columna expuesta a la temperatura ambiente.
Si se utilizan otras condiciones de inmersin, es necesario realizar una correccin por columna emergente a fin de obtener lecturas de temperatura correctas.
108 31 Aparatos Volumtricos / Aparatos
USP 38
Las tolerancias de capacidad para las pipetas de medicin (es decir, graduadas) de hasta 10 mL inclusive, son algo mayores
que las tolerancias para las pipetas de transferencia de los mismos tamaos, es decir, 10 mL, 20 mL y 30 mL para las pipetas de 2
mL, 5 mL y 10 mL, respectivamente.
Las pipetas calibradas para verter, graduadas y de transferencia, se deben escurrir en posicin vertical y luego apoyar las
puntas contra la pared del recipiente receptor para escurrirlas por completo. Las lecturas de volumen en las buretas deberan
estimarse con una exactitud de 0,01 mL para buretas de 25 mL y 50 mL, y con una exactitud de 0,005 mL para buretas de 5
mL y 10 mL. Las pipetas calibradas para contener se utilizan en casos especiales, generalmente para medir lquidos viscosos,
como jarabes; sin embargo, se puede usar un matraz volumtrico en lugar de una pipeta para contener. En tales casos, la
pipeta o el matraz deberan lavarse despus del vaciado y los lavados agregarse a la porcin medida.
Matraces Volumtricos
Volumen nominal, mL
10
25
50
100
250
500
1000
Lmite de error, mL
0,02
0,03
0,05
0,08
0,12
0,20
0,30
Lmite de error, %
0,20
0,12
0,10
0,08
0,05
0,04
0,03
10
25
50
100
Lmite de error, mL
0,006
0,006
0,01
0,02
0,03
0,05
0,08
Lmite de error, %
0,60
0,30
0,20
0,20
0,12
0,10
0,08
Pipetas de Transferencia
Volumen nominal, mL
Buretas
Volumen nominal, mL
Captulos
10 (tipo micro)
25
50
Subdivisiones, mL
0,02
0,1
0,1
Lmite de error, mL
0,02
0,03
0,05
41 BALANZAS
Este captulo establece los requisitos para balanzas que se usan para materiales que deben ser pesados con exactitud (ver
Advertencias y Requisitos Generales, 8.20). A menos que se especifique algo diferente, cuando las sustancias deban ser pesadas
con exactitud, la pesada se debe realizar usando una balanza que est calibrada dentro de su intervalo operativo y que cumpla con los requisitos de repetibilidad y exactitud definidos. Para balanzas que se usan en otras aplicaciones, su repetibilidad y
exactitud deben valorarse junto con los requisitos para su uso.
Con respecto a los principios tericos de estos requisitos, ver Pesada en una Balanza Analtica 1251, ya que puede ser una
fuente til, aunque no obligatoria.
REPETIBILIDAD
La repetibilidad se evala pesando una pesa de prueba no menos de 10 veces. [NOTALa pesa de prueba debe estar dentro
del intervalo operativo de la balanza, pero no es necesario que la pesa est calibrada. Debido a que, dentro de la capacidad de
la balanza la desviacin estndar (IRA 01-jul-2014) es prcticamente independiente de la masa de muestra, no se requiere usar un
peso de prueba pequeo, ya que ste podra resultar difcil de manejar.]
La repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviacin estndar del valor pesado dividido por el peso neto ms pequeo deseado (es decir, el peso neto ms pequeo que los usuarios planean usar en esa balanza) (IRA 01-jul-2014) no excede de
0,10%. Si la desviacin estndar obtenida es menos de 0,41d, donde d es el menor intervalo de la escala, reemplazar la desviacin estndar con 0,41d. En este caso, la repetibilidad es satisfactoria si 2 0,41d, dividido por el peso neto ms pequeo
deseado, (IRA 01-jul-2014) no excede de 0,10%.
EXACTITUD
La exactitud de una balanza es satisfactoria si su valor de pesada, cuando se prueba con pesas adecuadas, est dentro del
0,10% del valor del peso de prueba.
Una pesa de prueba es adecuada cuando tiene una masa entre 5% y 100% de la capacidad de la balanza. El error mximo
permisible de la pesa de prueba (emp), o alternativamente, la incertidumbre en la calibracin de la pesa no debe ser ms de
un tercio del lmite de exactitud para la prueba. [NOTALas siguientes normas son aplicables: ASTM E617 (disponible en
http://www.astm.org) y OIML R 111 (disponible en http://www.oiml.org).]
Pruebas Microbiolgicas / 51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 109
USP 38
Pruebas Microbiolgicas
51 PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA
INTRODUCCIN
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Este captulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregados. Estos conservantes antimicrobianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptacin para la eficacia
se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla 1 para categoras
de productos). Esta prueba no tiene que realizarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que puedan interaccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana.
Procedimiento de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuperacin

CONSIDERACIONES GENERALES
Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafo en presencia de un producto a
examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a confirmarse si se produce algn cambio en
los materiales o mtodos, el producto o los materiales que estn en contacto directo con el producto y que pueda alterar los
resultados de la prueba.
Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento.
Captulos
Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacuticos acuosos. Las formas farmacuticas no
estriles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertidamente durante o despus del proceso de fabricacin. En el caso de artculos estriles envasados en envases multidosis, los conservantes antimicrobianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extraccin
reiterada de dosis individuales. En todas las unidades multidosis estriles se espera encontrar uno o ms conservantes antimicrobianos.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prcticas de fabricacin, solamente para reducir la poblacin microbiana viable de un producto no estril, o para controlar la biocarga antes de la esterilizacin de formulaciones multidosis durante la fabricacin. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacuticas farmacopeicas cumplen
con los requisitos en 5.20 Sustancias Agregadas de las Advertencias y Requisitos Generales.
Todos los agentes antimicrobianos tiles son sustancias txicas. Para la mxima proteccin de los pacientes, la concentracin del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar
txico para los seres humanos, basndose en la dosis recomendada del producto medicinal.
La concentracin de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mnimo si los ingredientes activos de la
formulacin poseen actividad antimicrobiana intrnseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adicin de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases multidosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
para formas farmacuticas de base acuosa, multidosis tpicas y orales, y para otras formas farmacuticas, como por ejemplo
oftlmicas, ticas, nasales, de irrigacin y lquidos de dilisis (ver Formas Farmacuticas 1151). Para los propsitos de la prueba, "acuoso" se define como una actividad de agua de ms de 0,6 (ver Determinacin de Actividad de Agua en Productos Farmacuticos No Estriles 1112).
Los organismos de desafo se basan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacutico, teniendo en
cuenta los atributos fsicos, la formulacin y el uso previsto del mismo. La serie de organismos de desafo estndar descrita en
esta prueba no necesita prevenir la inclusin de otras especies, si se considera til para medir la actividad biolgica de los conservantes de un producto especfico. Estos organismos de desafo suplementarios no se discuten en este captulo, pero se pueden aadir a los organismos de prueba descritos.
110 51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
Captulos
PREPARACIN DE CEPAS DE PRUEBA
Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar segn se indica a continuacin. Las tcnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por separado
cada cepa bacteriana y fngica de prueba (ver la Tabla 2).
Usar los cultivos de los siguientes microorganismos:1 Candida albicans (ATCC N 10231), Aspergillus brasiliensis (ATCC N
16404), Escherichia coli (ATCC N 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC N 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC N 6538).
Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej.,
en fase logartmica de crecimiento) a excepcin de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el
inculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Casena y Soja o Medio de Agar Sabouraud Dextrosa.
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina SR estril, lavar la superficie de crecimiento y
recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin salina SR estril que contenga
0,05% de polisorbato 80. La suspensin de esporas debe tratarse aspticamente (p.ej., filtracin a travs de lana de vidrio estril) para eliminar hifas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado de
medio de crecimiento residual del inculo (p.ej., centrifugacin seguida de resuspensin en un lquido de suspensin estril
apropiado).
Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio lquido adecuado (es decir, Caldo Digerido
de Casena y Soja o Caldo Sabouraud Dextrosa) y las clulas se pueden cosechar mediante centrifugacin, luego lavar y resuspender en lquido de suspensin estril apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustarse para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 108 ufc/mL. Usar las suspensiones bacterianas y de levaduras
dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan entre 2 y 8. Se puede preparar una suspensin de esporas
estable y mantenerla a 28 hasta 7 das. [NOTEEl clculo estimado de la concentracin del inculo se puede obtener mediante procedimientos turbidimtricos para los microorganismos de desafo y luego confirmarse mediante un recuento en placa.]
PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS
Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida de
medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos.
Para medios slidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inculo estandarizado.
Para un inculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Mtodo de Recuento en Presencia del Producto

Preparar una dilucin 101 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solucin salina u otro diluyente neutralizante. Continuar este patrn de dilucin hasta niveles de dilucin 102 y 103. Agregar un nmero apropiado de organismos
de desafo a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilucin para obtener
menos de 250 ufc/placa para bacterias y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) o menos de 80 ufc/placa para A. brasiliensis
(idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mnimo por duplicado (aunque un nmero mayor
de repeticiones puede ser til para minimizar la variabilidad en la estimacin del recuento en placa). Se realiza un control positivo de este procedimiento al introducir los mismos inculos en solucin salina y transferir volmenes similares de solucin salina a placas de agar. Un patrn de recuperacin adecuado es aqul que proporciona al menos 50% del recuento de esta solucin salina de control (promediado).
Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizs deban incorporarse neutralizadores especficos a los diluyentes o a los medios de recuperacin. Para ms informacin, ver Validacin de Recuperacin Microbiana en Artculos Farmacopeicos 1227.
La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida si la aptitud del mtodo requiere una dilucin significativa (102 103), ya que esto afectar la recuperacin medida (p.ej., puede ser difcil medir
una reduccin logartmica de 3 unidades para un inculo de 105106). Si no se encuentra un agente neutralizador o mtodo
adecuado y la aptitud del mtodo requiere una dilucin significativa, se puede usar un nivel ms alto de inculo (p.ej., 107
108) de manera que se pueda medir una reduccin logartmica de 3 unidades. El promedio de la recuperacin informada no
puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilucin de
102).
La filtracin por membrana se puede usar para filtrar volmenes ms grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad
o para asistir en la neutralizacin de las propiedades antimicrobianas.
Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
Pruebas Microbiolgicas / 51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 111
USP 38
Anlisis del Producto

CATEGORAS DE PRODUCTOS
Para los fines de anlisis, los artculos farmacopeicos se dividen en cuatro categoras (ver la Tabla 1). Los criterios de eficacia
antimicrobiana para estos productos se establecen en funcin de la ruta de administracin. Es de esperar que las formulaciones
que contienen conservantes cumplan con los estndares mnimos de eficacia, si estn envasados en envases multidosis o en
envases unitarios.
Tabla 1. Categoras de Productos Farmacopeicos
Categora
Descripcin del Producto
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos ticos, productos nasales estriles y productos
oftlmicos preparados con bases o vehculos acuosos
Productos empleados de manera tpica preparados con bases o vehculos acuosos, productos nasales no estriles y emulsiones, incluyendo aqullos que se aplican a membranas mucosas
Productos orales a excepcin de anticidos, preparados con bases o vehculos acuosos
Anticidos preparados con una base acuosa
PROCEDIMIENTO
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparacin de Inculos

Tiempo de
Incubacin de
Recuperacin
Microbiana
Medio Apropiado
Temperatura
de Incubacin
Tiempo
de Incubacin
del Inculo
Escherichia coli
(ATCC N 8739)
Caldo Digerido de Casena y

Soja;
Agar Digerido de Casena y
Soja
32,5 2,5
1824 horas
35 das
Pseudomonas aeruginosa
(ATCC N 9027)

Soja;
Soja
32,5 2,5
1824 horas
35 das
Staphylococcus aureus
(ATCC N 6538)

Soja;
Soja
32,5 2,5
1824 horas
35 das
Candida albicans
(ATCC N 10231)
Medio de Agar Sabouraud

Dextrosa;
Caldo Sabouraud Dextrosa
22,5 2,5
4452 horas
35 das
Organismo
Captulos
El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en
cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado aspticamente (es decir, aguja y jeringa a travs de un tapn de
goma elastomrico), o en cinco recipientes bacteriolgicos estriles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobianos] de tamao adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada envase o recipiente,
segn corresponda, con uno de los inculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspensin del inculo empleado est entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentracin de microorganismos de prueba agregados al producto (Categora 1; 2 3) es tal que la concentracin final de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 105 y 1 106 ufc/mL del producto. En los productos de
la Categora 4 (anticidos), la concentracin final de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 103 y 1 104 ufc/mL del producto.
La concentracin inicial de microorganismos viables en cada preparacin de prueba se calcula a partir de la concentracin
de microorganismos en cada inculo normalizado determinada mediante el mtodo de recuento en placa. Incubar los envases
o recipientes inoculados a 22,5 2,5. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la
Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de
recuento en placa el nmero de ufc presentes en cada preparacin de prueba en los intervalos correspondientes (ver Procedimientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano 61). El recuento en placa se realizar usando un mnimo de placas por
duplicado, con el nmero de ufc promediado antes de la determinacin de ufc/mL deducido. Si se usa filtracin por membrana, usar filtros de membrana por duplicado para cada estimacin. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL presentes
al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log10 de la concentracin de ufc/mL para cada microorganismo en los intervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentracin en trminos de reducciones logartmicas. La reduccin logartmica se define como la diferencia entre el valor de la concentracin inicial de ufc/mL en la suspensin, en unidades
log10, y el valor de ufc/mL, en unidades log10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.
112 51 Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparacin de Inculos (Continuacin)
Organismo
Aspergillus brasiliens
(ATCC N 16404)
Medio Apropiado
Temperatura
de Incubacin
Tiempo
de Incubacin
del Inculo
Agar Sabouraud Dextrosa;

22,5 2,5
610 das
Tiempo de
Incubacin de
Recuperacin
Microbiana
37 das
Criterios de Eficacia Antimicrobiana

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Resultados de
Pruebas en Advertencias Generales). La expresin ningn incremento en los recuentos se define como no ms de 0,5 unidades log10 por encima del valor con el que se compara.
Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados
En productos de la Categora 1
A los 7 das, una reduccin logartmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial calculado; a los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 3,0 del recuento inicial; y a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das.
Bacterias
Ningn incremento a los 7, 14 y 28 das con respecto al recuento inicial
Levaduras y Hongos
Filamentosos
Captulos
A los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y
a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das
Bacterias
Levaduras y Hongos
Filamentosos
Ningn incremento a los 14 y 28 das con respecto al recuento inicial

A los 14 das, una reduccin logartmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial; y
a los 28 das ningn incremento con respecto al recuento de los 14 das
Bacterias
Levaduras y Hongos
Filamentosos

Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos
USP38
55 INDICADORES BIOLGICOSPRUEBAS DE RESISTENCIA

RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES
Para indicadores biolgicos en portador de papel, retirar tres muestras del indicador biolgico pertinente de sus envases individuales originales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en
un vaso estril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada, y mezclando durante el tiempo que se considere adecuado para obtener una suspensin homognea. No es inusual que se requieran tiempos de mezclado de 15 minutos o ms para obtener una recuperacin ptima. Transferir a un tubo estril de 16 mm x
125 mm con tapa de rosca una alcuota de 10 mL de la suspensin. Si se trata de un Indicador Biolgico para Esterilizacin por
Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de agua de 95 a 100 durante 15 minutos
(choque trmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza los 95. Si se trata de un Indicador Biolgico
para Esterilizacin por Calor Seco, Portador de Papel y de un Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de
Papel, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de agua de 80 a 85 durante 10 minutos, comenzando a medir
el tiempo cuando la temperatura de la suspensin de esporas alcance los 80. Enfriar rpidamente en un bao de hieloagua
de 0 a 4. Transferir a tubos adecuados dos alcuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada estril;
las diluciones se seleccionan por medio de clculos de manera que se obtengan preferentemente entre 30 y 300 colonias, pero
no menos de 6, en cada una de las placas del par cuando se tratan segn se describe a continuacin. Cuando el indicador
biolgico tiene una concentracin baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar ms placas en
cada dilucin. Preparar una serie independiente de placas para cada alcuota. Colocar 1,0 mL de cada dilucin seleccionada en
cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de
Medio Agar con Digerido de Casena y Soja que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45 y 50. Agitar por rotacin suave para obtener una suspensin homognea y dejar solidificar. Incubar las placas en posicin invertida a una tempera-
USP 38
Pruebas Microbiolgicas / 55 Indicadores Biolgicos 113
DETERMINACIN DEL VALOR D

Efectuar todas las pruebas descritas en esta seccin bajo condiciones aspticas, usando equipo estril para microorganismos
no termoflicos. La determinacin del Valor D para G. stearothermophilus y B. coagulans se puede realizar en un ambiente controlado pero no clasificado.
Aparatos
El equipo de prueba para la determinacin de la resistencia microbiana se describe en detalle en la norma ISO 18472, Sterilization of Health Care ProductsBiological and Chemical IndicatorsTest Equipment (Esterilizacin de Productos para el Cuidado de
la SaludIndicadores Biolgicos y QumicosEquipo de Prueba).1 Los detalles de los Resistmetros para Evaluacin de Indicadores Biolgicos (BIER, por sus siglas en ingls) individuales varan segn su diseo y el proceso de esterilizacin particular con el
que se usan conjuntamente. Siempre y cuando el desempeo del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposicin del indicador biolgico, se aceptan diferencias en el diseo.
1 ANSI/AAMI/ISO 18472:2006, Sterilization of Health Care ProductsBiological and Chemical IndicatorsTest Equipment (Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la SaludIndicadores Biolgicos y QumicosEquipo de Prueba). Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 1110 N. Glebe Road,
Suite 220, Arlington, VA 22201-4795
Captulos
tura entre 55 y 60 para el Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Portador de Papel, y a una temperatura entre 30 y
35 para el Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de Papel y para el Indicador Biolgico para Esterilizacin por Calor Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperacin ptima especificada por el fabricante. Examinar las
placas despus de transcurridas 24 y 48 horas, registrando el nmero de colonias para cada placa, y usar el nmero de colonias observado despus de 48 horas para calcular los resultados. Calcular el nmero promedio de esporas por muestra a partir
de los resultados, usando el factor de dilucin apropiado. La prueba es vlida si el logaritmo del nmero de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del nmero despus de 24 horas en cada caso. Para Indicador Biolgico
para Esterilizacin por Vapor, Autocontenido, extraer aspticamente los tres portadores del envase y proceder segn se indica en
Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Portador de Papel.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, retirar aspticamente los tres portadores de su empaque o envase original. Colocar cada portador en un recipiente estril apropiado que
contenga 100 mL de Agua Purificada enfriada y someter a ultrasonido o agitar en un agitador de vaivn durante un tiempo
apropiado. Para una recuperacin ptima se pueden requerir 15 minutos o ms. Se debe llevar a cabo un estudio previo que
garantice que el mtodo de recuperacin produzca como resultado una recuperacin de por lo menos 50% a 300% del recuento viable de esporas declarado. Transferir a un tubo estril de 16 mm 125 mm con tapa de rosca una alcuota de 10 mL
de la suspensin. Calentar los tubos que contienen suspensiones de Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans entre 80 y 85 durante 10 minutos. Calentar los tubos que contienen una suspensin de Geobacillus stearothermophilus entre 95
y 100 durante 15 minutos. Comenzar a medir el tiempo cuando se alcance la temperatura ms baja de los intervalos indicados. Enfriar rpidamente en un bao de hieloagua de 0 a 4. Transferir dos alcuotas de 1 mL a tubos adecuados y hacer
diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada. Las diluciones seleccionadas deben ser aquellas que preferiblemente rindan
entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada par de placas cuando se traten segn se describe a continuacin. Cuando el indicador biolgico tiene una concentracin baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar
ms placas en cada dilucin. Preparar una serie independiente de placas para cada alcuota. Colocar 1,0 mL de cada dilucin
seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar la alcuota
a cada placa conteniendo 20 mL de agar que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45 y 50. Agitar por rotacin suave para obtener una suspensin homognea.
Para G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans, usar Medio de Agar Digerido de Casena y Soja, e incubar
las placas aerbicamente en posicin invertida a las siguientes temperaturas respectivas para cada microorganismo: de 55 a
60, de 30 a 35 y de 48 a 52, o a la temperatura ptima especificada por el fabricante del indicador biolgico. Examinar las
placas despus de transcurridas 24 y 48 horas. Registrar el nmero de colonias observado en cada placa. Calcular el nmero
promedio de esporas por portador a partir de los resultados, usando el factor de dilucin apropiado. La prueba es vlida si el
logaritmo del nmero de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del nmero despus de 24
horas en cada caso.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas, usando
G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans como indicadores biolgicos, preparar una dilucin seriada apropiada de la suspensin original de esporas en Agua Purificada enfriada contenida en un tubo estril de 16 mm 125 mm con
tapa de rosca y efectuar los procedimientos de recuentos de esporas viables especificados en Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel.
114 55 Indicadores Biolgicos / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
Captulos
Procedimiento
Realizar las pruebas del valor D para cada set de condiciones de esterilizacin aplicable segn indique la etiqueta del indicador biolgico envasado en anlisis. Tomar un nmero suficiente de grupos de muestras de indicadores biolgicos en sus envases individuales originales, constando cada grupo de no menos de 5 muestras. El nmero de grupos proporciona un intervalo
de observaciones desde no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia declarado, hasta no menos
de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar cada grupo en portamuestras separados adecuados que permitan exponer cada muestra a la condicin de esterilizacin indicada en una ubicacin especfica en la cmara
de esterilizacin del BIER. Controlar los parmetros de funcionamiento del aparato BIER, usando portamuestras sin muestras.
Seleccionar una serie de tiempos de esterilizacin en incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Las
diferencias en los tiempos de esterilizacin a lo largo de las series son tan constantes como sea posible y la diferencia entre los
tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado.
Los procedimientos de prueba para el uso de resistmetros BIER en la evaluacin de la resistencia microbiana se definen en
una serie de normas ISO bajo la serie 11138.2, 3, 4, 5 Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biolgico. Los mtodos
de prueba y los portadores usados con el BIER se pueden adaptar a las caractersticas especficas del indicador biolgico. El
mtodo y aparatos usados para portadores de papel pueden diferir de los de otros portadores y sern sustancialmente diferentes de los usados para suspensiones de indicadores biolgicos.
Las condiciones de exposicin para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador biolgico con mltiples mtodos de esterilizacin, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrn que ser proporcionados por el fabricante para cada mtodo de esterilizacin. Es posible que los indicadores biolgicos
inoculados en portadores distintos de los de papel se usen para mtodos de esterilizacin y descontaminacin por gas o vapor
tales como dixido de cloro y perxido de hidrgeno en fase de vapor.
Las condiciones fsicas estndar para la evaluacin de indicadores biolgicos para uso con dixido de cloro o perxido de
hidrgeno en fase de vapor no han sido definidos. En el caso de dixido de cloro, la concentracin del gas, la humedad relativa y la temperatura son condiciones crticas del control del proceso que se pueden medir con exactitud. El fabricante de los
indicadores biolgicos comercializados para uso con dixido de cloro debera declarar las condiciones bajo las cuales se llev a
cabo la determinacin del valor D en forma tal que el usuario pueda, cuando menos, discernir la resistencia de un lote de
indicadores biolgicos en comparacin con sus propias condiciones de uso anticipadas. La situacin con el perxido de hidrgeno en fase de vapor es ms compleja. Diversos fabricantes de equipos han propuesto diferentes condiciones de descontaminacin o esterilizacin. Por esa razn, no existe un proceso estndar para efectuar la descontaminacin o esterilizacin de superficie con perxido de hidrgeno en fase de vapor. Como consecuencia, no existen mtodos industriales estndar de evaluacin de indicadores biolgicos para perxido de hidrgeno en fase de vapor y se ha informado que podra no haber una correlacin directa entre la concentracin de vapor y la velocidad o incluso la eficacia de inactivacin del indicador biolgico. Adicionalmente, resulta difcil evaluar con exactitud la humedad relativa, que a menudo se define como un parmetro crtico para
el proceso, en presencia de perxido de hidrgeno en forma de vapor. Por estas razones es preferible considerar la resistencia
de los indicadores biolgicos como una medida relativa o comparativa del fabricante, ms que como un verdadero valor D.
Por lo tanto, dependiendo del equipo y de los procesos empleados, podra ser imposible para un usuario final duplicar las
pruebas de resistencia del indicador biolgico efectuadas por el fabricante.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas efectuar
las determinaciones del valor D para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensin lquida de
esporas. La prueba se efecta usando diluciones seriadas apropiadas basadas en el ttulo declarado de esporas de la suspensin
en Agua Purificada en un tubo estril.
Cuando la suspensin se coloca sobre o en un sustrato como un tapn elastomrico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. La diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biolgicos y
las medidas apropiadas hechas antes del uso en actividades de validacin de la esterilizacin.
Recuperacin
Despus de completar el procedimiento de esterilizacin para el Indicador Biolgico para Esterilizacin por Calor Seco, Portador
de Papel, el Indicador Biolgico para Esterilizacin con xido de Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biolgico para Esterilizacin
2 ANSI/AAMI/ISO 11138-1:2006, Sterilization of Health Care ProductsBiological IndicatorsPart 1: General requirements, 2nd ed. (Esterilizacin de Productos de
SaludIndicadores BiolgicosParte 1: Requisitos generales, 2 ED.). Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 1110 N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
3 ANSI/AAMI/ISO 11138-2:2006, Sterilization of Health Care ProductsBiological IndicatorsPart 2: Biological Indicators for Ethylene Oxide Sterilization Processes, 3rd ed. (Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la SaludIndicadores BiolgicosParte 2: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin con xido de
Etileno, 3 Ed.) Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 1110 N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
4 ANSI/AAMI/ISO 11138-3:2006, Sterilization of Health Care ProductsBiological IndicatorsPart 3: Biological Indicators for Moist Heat Sterilization Processes.
(Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la SaludIndicadores BiolgicosParte 3: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin por Calor Hmedo.) Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 1110 N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
5 ANSI/AAMI/ISO 11138-4:2006, Sterilization of Health Care ProductsBiological IndicatorsPart 4: Biological Indicators for Dry Heat Sterilization Processes.
(Esterilizacin de Productos para el Cuidado de la SaludIndicadores BiolgicosParte 4: Indicadores Biolgicos para Procesos de Esterilizacin por Calor Seco.) Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 1110 N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
USP 38
Pruebas Microbiolgicas / 61 Examen Microbiolgico 115
por Vapor, Portador de Papel, segn corresponda y dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar aspticamente cada tira y agregarla a un medio apropiado (ver Medios en Pruebas de Esterilidad 71) para sumergir el indicador biolgico por completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Autocontenido,
se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido segn las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas. Incubar cada tubo a la temperatura ptima de recuperacin especificada por el fabricante. Observar
cada tubo con medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 das despus de la inoculacin. (Cuando se observa crecimiento en cualquier momento de la observacin en particular, se puede suspender la incubacin de dicha muestra.)
Tomar nota del nmero de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningn momento.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, la recuperacin de esporas de los portadores de indicador biolgico seguir los procedimientos de recuperacin descritos en Recuento Total de Esporas Viables. Los mtodos de determinacin del valor D para indicadores biolgicos en portador de papel se pueden
usar para calcular el valor D de portadores diferentes al papel. Las condiciones de incubacin para los microorganismos que se
pueden usar para indicadores biolgicos en portadores diferentes al papel se describen en la seccin Recuento Total de Esporas
Viables.
Para Indicadores Biolgicos para Esterilizacin por Calor Hmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Lquidas de Esporas, los mtodos de recuperacin despus de la exposicin a las condiciones de esterilizacin son aquellos descritos en la seccin Recuento
Total de Esporas Viables para suspensiones lquidas y cuando se hace una determinacin del valor D por calor seco a partir de
suspensiones de B. atrophaeus, se siguen los mismos procedimientos de recuperacin descritos en Indicador Biolgico para Esterilizacin por Vapor, Portador de Papel.
Cuando se usa C. sporogenes como indicador biolgico, los mtodos para la preparacin e inoculacin, as como los mtodos y medios de recuperacin, deben adaptarse al uso de este formador de esporas anaerbico.
La determinacin de los valores D de los indicadores biolgicos se puede efectuar usando el Mtodo de Spearman-Karber
Limitado, el Mtodo de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran.6, 7, 8 Para determinar los
valores D, es preferible usar el mismo mtodo definido por el fabricante del indicador biolgico. El uso de un mtodo distinto
puede producir diferencias que son ms un artefacto del mtodo que una variacin en el desempeo del indicador biolgico.
Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte

Tomar dos grupos, cada uno integrado por 10 muestras del indicador biolgico pertinente, en sus envases individuales originales. Colocar las muestras de un grupo en un portamuestras adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones
de esterilizacin en una ubicacin especfica en la cmara BIER.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cmara y retirar los portamuestras con las
10 muestras. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurri un tiempo sustancial, para someter el segundo portamuestras con 10 muestras a condiciones similares a las primeras pero durante el tiempo de muerte requerido.
El Tiempo de supervivencia y el tiempo de muerte para todos los indicadores biolgicos con monografias se describe en la correspondiente monografa oficial bajo el encabezamiento de cada uno.
61 EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO
INTRODUCCIN
Las pruebas que se describen en este captulo permitirn el recuento cuantitativo de bacterias mesfilas y hongos que pueden desarrollarse en condiciones aerbicas.
Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con una especificacin establecida de calidad microbiolgica. Si se emplean con tales propsitos, seguir las instrucciones que se indican a continuacin, incluyendo el nmero de muestras a tomar, e interpretar los resultados segn se indica ms abajo.
6 Pflug, I.J. Syllabus for an Introductory Course in the Microbiology and Engineering of Sterilization Processes, 4th ed. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services,
1980.
7 Pflug, I.J., and G.M. Smith. The Use of Biological Indicators for Monitoring Wet-Heat Sterilization Processes, in Sterilization of Medical Products, ed. E.R.L. Gaughran and K. Kereluk. New Brunswick, NJ: Johnson and Johnson, 1977, 193230.
8 Holcomb, R.G., and I.J. Pflug. The Spearman-Karber Method of Analyzing Quantal Assay Microbial Destruction Data, in Microbiology and Engineering Sterilization
Processes, ed. I.J. Pflug. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services, 1979.
Captulos
Clculos
116 61 Examen Microbiolgico / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
Los mtodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos.
Pueden utilizarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluidos los mtodos automatizados, siempre que se haya
demostrado su equivalencia con el mtodo Farmacopeico.
Realizar la determinacin en condiciones diseadas para evitar la contaminacin microbiana extrnseca del producto a examinar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminacin deben ser tales que no afecten a ningn microorganismo que
deba detectarse en la prueba.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, sta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si
se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparacin de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.
Captulos
MTODOS DE RECUENTO
Usar, segn se indica, el mtodo de Filtracin por Membrana o uno de los Mtodos de Recuento en Placa. El Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) es generalmente el mtodo de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos
de productos con biocarga muy baja, puede resultar el mtodo ms apropiado.
La eleccin de un mtodo se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el lmite de microorganismos requerido. El mtodo seleccionado debe permitir el anlisis de un tamao de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
especificacin. Se debe establecer la aptitud del mtodo seleccionado.
PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MTODO DE RECUENTO Y

CONTROLES NEGATIVOS
Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar.
Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realizacin de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados del anlisis.
Preparacin de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar segn se indica ms abajo. Las tcnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado,
cada cepa bacteriana y fngica de prueba segn se indica en la Tabla 1.
Tabla 1. Preparacin y Uso de Microorganismos de Prueba
Promocin del Crecimiento
Recuento Total
de Hongos Filamentosos y Levaduras
Aptitud del Mtodo de Recuento en

Presencia del Producto
Recuento Total de
Microorganismos Aerobios
Agar Digerido de Casena y Soja o Caldo Digerido de Casena y

Soja 3035
1824 horas
Agar Digerido de Casena

y Soja y Caldo Digerido
de Casena y Soja 100
ufc
3035 3 das
Agar Digerido de Casena y Soja/NMP Caldo

Digerido de Casena y
Soja 100 ufc
3035 3 das
Agar Digerido de Casepor ejemplo ATCC 9027,
na y Soja o Caldo DiNCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Casena y
o NBRC 13275
Soja 3035
1824 horas

ufc
3035 3 das

Soja 100 ufc
3035 3 das
Bacillus subtilis por ejemplo ATCC 6633, NCIMB

8054, CIP 52.62 o NBRC
3134

ufc
3035 3 das

Soja 100 ufc
3035 3 das
Microorganismo
Staphylococcus aureus por
ejemplo ATCC 6538,
NCIMB 9518, CIP 4.83 o
NBRC 13276
Agar Digerido de Casena y Soja o Caldo Digerido de Casena y

Soja 3035
1824 horas
Recuento Total de
Microorganismos
Aerobios
Recuento Total de Hongos

Filamentosos y
Levaduras
USP 38
Tabla 1. Preparacin y Uso de Microorganismos de Prueba (Continuacin)

Promocin del Crecimiento
Microorganismo
Recuento Total de
Microorganismos Aerobios
Recuento Total
de Hongos Filamentosos y Levaduras
Aptitud del Mtodo de Recuento en

Presencia del Producto
Recuento Total de
Microorganismos
Aerobios
Recuento Total de Hongos

Filamentosos y
Levaduras
Candida albicans por ejem- Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Casena
plo ATCC 10231, NCPF
sa o Caldo Sabouraud
y Soja 100 ufc
3179, IP 48.72 o NBRC
Dextrosa 2025 23
3035 5 das
1594
das
Agar Sabouraud
Dextrosa 100
ufc 2025 5
das
Agar Digerido de Casena y Soja 100 ufc

3035 5 das NMP:
no aplica
Agar Sabouraud
Dextrosa 100
ufc 2025 5
das
Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Casena

y Soja 100 ufc
sa o Agar Papa Dextro3035 5 das
sa 2025
57 das o hasta alcanzar una buena esporulacin
Agar Sabouraud
Dextrosa 100
ufc 2025 5
das
Agar Digerido de Casena y Soja 100 ufc

3035 5 das NMP:
no aplica
Agar Sabouraud
Dextrosa 100
ufc 2025 5
das
Aspergillus brasiliensis por

ejemplo ATCC 16404,
IMI 149007, IP 1431.83
o NBRC 9455
Control Negativo
Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la preparacin de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos segn se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Promocin del Crecimiento de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes indicados.
Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Casena y Soja y Agar Digerido de Casena y Soja con un nmero pequeo (no
ms de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 1, empleando una porcin/placa individual de medio para cada
uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 1, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas
en la Tabla 1.
Para medios slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un
inculo estandarizado. Para un inculo recin preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios lquidos son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Mtodo de Recuento en Presencia del Producto

PREPARACIN DE LA MUESTRA
El mtodo para preparar la muestra depende de las caractersticas fsicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedimientos que se describen a continuacin resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado.
Productos Solubles en AguaDisolver o diluir (por lo general se prepara una dilucin 1 en 10) del producto a examinar
en Solucin Amortiguada de Cloruro de SodioPeptona de pH 7,0, en Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Digerido de Casena y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si
fuera necesario.
Productos No Grasos Insolubles en AguaSuspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilucin 1 en
10) en Solucin Amortiguada de Cloruro de SodioPeptona de pH 7,0, en Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo
Digerido de Casena y Soja. Se puede aadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la
suspensin de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el
mismo diluyente, si fuera necesario.
Captulos
Usar Solucin Amortiguada de Cloruro de SodioPeptona de pH 7,0 o Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar
las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede aadir 0,05% de polisorbato 80 a la solucin
amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura
entre 2 y 8. Como alternativa para la preparacin y posterior dilucin de una suspensin fresca de las clulas vegetativas de
A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensin estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensin de
esporas para la inoculacin de prueba. La suspensin estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2 a 8 durante un perodo validado.
USP 38
Productos GrasosDisolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtracin o mezclarlo con la
cantidad mnima necesaria de polisorbato 80 estril u otro reactivo tensoactivo estril no inhibitorio que se calienta, si fuera
necesario, a no ms de 40 o, en casos excepcionales, a no ms de 45. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mantener la temperatura en un bao de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener
una dilucin 1 en 10 del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo
necesario para la formacin de una emulsin. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el
diluyente seleccionado que contenga una concentracin adecuada de polisorbato 80 estril u otro reactivo tensoactivo estril
no inhibitorio.
Lquidos o Slidos en Forma de AerosolTransferir el producto aspticamente a un aparato con filtro de membrana o un
recipiente estril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
Parches TransdrmicosRetirar las lminas protectoras (cubiertas de proteccin) de los parches transdrmicos y colocarlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plstico estriles. Cubrir la superficie adhesiva con un material
poroso estril adecuado (p.ej., gasa estril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen
adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparacin
vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.
Captulos
INOCULACIN Y DILUCIN
Agregar a la muestra, preparada segn las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen
suficiente de suspensin microbiana para obtener un inculo de no ms de 100 ufc. El volumen de la suspensin del inculo
no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.
Para demostrar una recuperacin microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilucin ms bajo posible de
la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben
desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibicin del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra
manera, la alcuota de suspensin microbiana puede agregarse despus de la neutralizacin, la dilucin o la filtracin.
NEUTRALIZACIN/ELIMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Comparar el nmero de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida segn se indica en Inoculacin y Dilucin e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperacin de Microorganismos en Presencia del Producto,
con el nmero de microorganismos recuperados a partir de la preparacin de control.
Si se inhibe el crecimiento (reduccin en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento particular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificacin del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
(1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo;
(2) Incorporacin de agentes neutralizantes generales o especficos en el diluyente;
(3) Filtracin por membrana; o
(4) Una combinacin de todas las medidas anteriores.
Agentes NeutralizantesLos agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicrobianos (ver la Tabla 2). Pueden aadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilizacin. Si se
usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto.
Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Mtodos para
Sustancias de Interferencia
Agentes Neutralizantes
Potenciales/Mtodo
Sustancia de Interferencia
Glutaraldehdo, mercuriales
Sulfito cido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenlicos, alcohol, aldehdos, sorbato
Dilucin
Aldehdos
Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas
Lecitina
CAC, yodo, parabenos
Polisorbato
Mercuriales
Tioglicolato
Mercuriales, halgenos, aldehdos
Tiosulfato
EDTA (edetato)
Iones de Mg o Ca
Si no se encuentra un mtodo de neutralizacin adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganismo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta informacin permite deducir que no es probable que
el artculo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba solamente algunos microorganismos especificados en este captulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prue-
USP 38
ba o aquellos para los cules stas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilucin ms alto
compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptacin especfico.
RECUPERACIN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO
Tabla 3. Valores del Nmero Ms Probable de Microorganismos

Combinaciones Observadas de Nmeros de
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada
Juego
NMP por g o
por mL de
Producto
Lmites
de Confianza
de 95%
Nmero de g o mL de Producto por Tubo

0,1
0,01
0,001
0
<3
09,4
0,19,5
0,110
6,1
1,217
6,2
1,217
9,4
3,535
Captulos
Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar slo los microorganismos de la cepa
de prueba agregada.
Filtracin por MembranaUsar filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45 mm. Escoger el
tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retencin de bacterias no se vea afectada por los componentes de
la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada segn se indica en Preparacin de la Muestra, Inoculacin y Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se
espera un gran nmero de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volumen adecuado de diluyente.
Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del
Agar Digerido de Casena y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL),
transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas segn se indica en la Tabla 1. Realizar el
recuento.
Mtodos de Recuento en PlacaAplicar los mtodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y
usar el recuento medio del resultado.
Mtodo de Vertido en PlacaPara placas de Petri de 9 cm de dimetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada
segn se indica en Preparacin de la Muestra, Inoculacin y Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana y
de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Casena y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a
no ms de 45. Si se emplean placas de Petri ms grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1.
Incubar las placas segn se indica en la Tabla 1. Tomar la media aritmtica de los recuentos obtenidos en cada medio y
calcular el nmero de ufc en el inculo original.
Mtodo de Extensin en SuperficieAgregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Casena y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a
cada placa de Petri de 9 cm de dimetro, aproximadamente a 45, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri ms grandes, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar
o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1. Esparcir un
volumen medido de no menos de 0,1 mL de la muestra, preparada segn se indica en Preparacin de la Muestra, Inoculacin y
Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento
segn se indica en Mtodo de Vertido en Placa.
Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP)La precisin y exactitud del Mtodo del NMP son menores que las del mtodo de Filtracin por Membrana o el Mtodo de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para
el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Mtodo del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no
haya otro mtodo disponible. Si se justifica el empleo del mtodo, proceder de la siguiente manera:
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto segn se indica en Preparacin de la Muestra,
Inoculacin y Dilucin y Neutralizacin/Eliminacin de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilucin, usar tres alcuotas de 1 g o 1 mL para inocular tres tubos con 9 a 10 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja. Si fuera necesario, se puede
agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos. Por lo tanto, si
se preparan tres niveles de dilucin, inocular nueve tubos.
Incubar todos los tubos a una temperatura de 30 a 35 durante no ms de 3 das. Si la lectura de los resultados resulta
difcil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Casena y Soja
durante un perodo de 1 a 2 das a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el nmero
ms probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.
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Tabla 3. Valores del Nmero Ms Probable de Microorganismos (Continuacin)

Combinaciones Observadas de Nmeros de
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada
Juego
NMP por g o
por mL de
Producto
Lmites
de Confianza
de 95%
Captulos
Nmero de g o mL de Producto por Tubo

0,1
0,01
0,001
3,6
0,217
7,2
1,217
11
435
7,4
1,320
11
435
11
435
15
538
16
538
9,2
1,535
14
435
20
538
15
438
20
538
27
994
21
540
28
994
35
994
29
994
36
994
23
594
38
9104
64
16181
43
9181
75
17199
120
30360
160
30380
93
18360
150
30380
210
30400
290
90990
240
40990
460
901980
2004000
1100
>1100
RESULTADOS E INTERPRETACIN
Al verificar la aptitud del mtodo de Filtracin por Membrana o del Mtodo de Recuento en Placa, se debe obtener un recuento
medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en Inoculacin y Dilucin en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Mtodo del NMP, el valor calculado a partir del inculo
debe estar dentro de los lmites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.
Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o ms de los microorganismos analizados con
cualquiera de los mtodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el mtodo y las condiciones de prueba ms
cercanas a esos criterios.
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PRUEBA DE PRODUCTOS
Cantidad Usada para la Prueba
A menos que se indique algo diferente, usar 10 g o 10 mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencionadas anteriormente. Para lquidos o slidos en forma de aerosol, muestrear 10 envases. Para parches transdrmicos, muestrear 10 parches.
Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad
por unidad de dosificacin (por ej., tableta, cpsula, inyeccin) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para preparaciones que no se presentan en unidades de dosificacin) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a analizar no es menor que la cantidad presente en 10 unidades de dosificacin o 10 g o 10 mL del producto.
Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamao de la partida es extremadamente pequeo (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a
menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor.
Para productos cuyo nmero total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos
clnicos), el tamao de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamao es menor de 100.
Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparacin. Para
obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un nmero suficiente de envases para proporcionar la muestra.
Examen del Producto
Usar un aparato de filtracin diseado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un
mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se indica en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el procedimiento que haya demostrado su aptitud.
Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Casena y Soja.
Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar
Digerido de Casena y Soja a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 3 a 5 das y la placa de Agar Sabouraud
Dextrosa a una temperatura de 20 a 25 durante un perodo de 5 a 7 das. Calcular el nmero de ufc por g o por mL del
producto.
Al examinar los parches transdrmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparacin descrita en Preparacin de la
Muestra a travs de cada una de las dos membranas de filtracin estriles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Casena
y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL.
MTODOS DE RECUENTO EN PLACA
Mtodo de Vertido en PlacaPreparar la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se describe en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada
medio por cada nivel de dilucin. Incubar las placas de Agar Digerido de Casena y Soja a una temperatura entre 30 y 35
durante un perodo de 3 a 5 das y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura entre 20 y 25 durante un perodo de 5 a 7 das. Escoger las placas correspondientes a una dilucin determinada y que muestren el mayor nmero de colonias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmtica de los recuentos por medio de cultivo y
calcular el nmero de ufc por g o por mL del producto.
Mtodo de Extensin en SuperficiePreparar la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn
se describe en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para
cada medio y cada nivel de dilucin. Para la incubacin y clculo del nmero de ufc, proceder segn se indica en el Mtodo de
Vertido en Placa.
MTODO DEL NMERO MS PROBABLE
Preparar y diluir la muestra empleando un mtodo cuya aptitud se haya demostrado segn se describe en Prueba de Promocin del Crecimiento y Aptitud del Mtodo de Recuento. Incubar todos los tubos durante un perodo de 3 a 5 das a una temperatura de 30 a 35. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para
cada nivel de dilucin el nmero de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el nmero
ms probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.
Captulos
FILTRACIN POR MEMBRANA
USP 38
Interpretacin de los Resultados

El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al nmero de ufc encontrado usando Agar
Digerido de Casena-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total
combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al nmero de ufc encontrado empleando
Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espera que el RTCHL exceda el criterio de aceptacin debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que
contenga antibiticos. Si se realiza el recuento mediante el Mtodo del MNP, el valor calculado es RTMA.
Cuando se indica un criterio de aceptacin para la calidad microbiolgica, ste se interpreta de la siguiente manera:
101 ufc: recuento mximo aceptable = 20;
y as sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Especficos 62.
Captulos
62 EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECFICOS
INTRODUCCIN
Las pruebas que se describen en este captulo permitirn determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos
especficos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con alguna especificacin establecida de calidad microbiolgica. Si se emplean con tales propsitos, seguir las instrucciones que se indican a continuacin, incluyendo el nmero de muestras a tomar, e interpretar los resultados segn se indica ms abajo.
Pueden utilizarse procedimientos microbiolgicos alternativos, incluyendo mtodos automatizados, siempre que se haya demostrado su equivalencia con el mtodo farmacopeico.
La preparacin de muestras se realiza segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento
Microbiano 61.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, sta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible
segn se describe en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparacin de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, segn se describe en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61.
PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS,

APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS
Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe
confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecucin de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados.

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba segn se indica ms abajo. Las tcnicas de mantenimiento de
cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.
MICROORGANISMOS AEROBIOS
Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Casena y Soja o Agar
Digerido de Casena y Soja a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa
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de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20 a 25 durante un perodo de 2 a 3 das.
Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC

13275
Escherichia coli
Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC

3972
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa,
Por ejemplo ATCC 14028
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida albicans
Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594
Usar Solucin Amortiguada de Cloruro de SodioPeptona de pH 7,0 o Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura de 2 a 8.
CLOSTRIDIOS
Control Negativo
Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la preparacin de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos segn se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Propiedades de Promocin del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de los medios pertinentes segn se indica en la Tabla 1.
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promocin del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Prueba/Medio
Propiedad
Cepas de Prueba
Prueba para bacterias Gram-negativas tolerantes a la bilis

Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias
Promocin del crecimiento
E. coli
P. aeruginosa
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa
Inhibitoria
S. aureus
Promocin del crecimiento + Indicadora
E. coli
P. aeruginosa
Prueba de Escherichia coli

Caldo MacConkey
Agar MacConkey
E. coli
Inhibitoria
S. aureus
E. coli
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o
Prueba de Salmonella
Caldo RappaportVassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Inhibitoria
S. aureus
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o

Prueba de Pseudomonas aeruginosa

Agar Cetrimida
P. aeruginosa
Captulos
Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404
(NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaerbicas en Medio Reforzado para Clostridios a
una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Como alternativa para la preparacin y posterior dilucin
de una suspensin fresca de las clulas vegetativas de Cl. sporogenes, se emplea una suspensin estable de esporas para la inoculacin de prueba. La suspensin estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2 a 8 durante un perodo
validado.
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Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promocin del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios (Continuacin)
Prueba/Medio
Propiedad
Cepas de Prueba
Inhibitoria
E. coli
Prueba de Staphylococcus aureus

Agar Manitol Salado
S. aureus
Inhibitoria
E. coli
Medio Reforzado para Clostridios
Cl. sporogenes
Agar Columbia
Cl. sporogenes
Prueba de Clostridios
Captulos
Prueba de Candida albicans

C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa
C. albicans
Prueba de las Propiedades de Promocin del Crecimiento, Medios LquidosInocular una porcin del medio apropiado con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el perodo menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades de Promocin del Crecimiento, Medios SlidosUsar el Mtodo de Extensin en Superficie
(ver Mtodos de Recuento en Placa en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61), inoculando cada una de las placas con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la
temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el perodo menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Slidos o LquidosInocular el medio apropiado con al menos 100 ufc
del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del perodo mayor indicado en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba.
Prueba de las Propiedades IndicadorasUsar el Mtodo de Extensin en Superficie (ver Mtodos de Recuento en Placa en
Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61), inoculando cada una de las placas con
un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
perodo que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indicadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Mtodo de Prueba

Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparacin de la muestra segn se indica en el prrafo pertinente en
Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular
individualmente las cepas de prueba. Usar un nmero de microorganismos equivalente a no ms de 100 ufc en la preparacin
de prueba inoculada.
Realizar la prueba segn se indica en el prrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el perodo ms corto de incubacin indicado.
Se deben detectar los microorganismos especficos con las reacciones indicadoras segn se describe en Pruebas de Productos.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificacin del procedimiento de la prueba (ver Neutralizacin/Eliminacin de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prueba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estar presente en el producto.
PRUEBAS DE PRODUCTOS
Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis
Preparacin de la Muestra e Incubacin PreviaPreparar una muestra empleando una dilucin 1 en 10 de no menos de
1 g del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano
61, excepto que se debe usar Caldo Digerido de Casena y Soja como diluyente de eleccin, mezclar e incubar a una temperatura de 20 a 25 durante un perodo suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicacin de los organismos (por lo general 2 horas pero no ms de 5 horas).
Prueba de AusenciaA menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, segn
se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias.
Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis
Glucosa. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
USP 38
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.

Prueba Cuantitativa
Seleccin y SubcultivoInocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la preparacin segn se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectivamente 0,1 g; 0,01 g y 0,001 g ( 0,1 mL; 0,01 mL y 0,001 mL) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30 a
35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa.
Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que produce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacterias a partir de la Tabla 2.
Tabla 2. Interpretacin de Resultados
Resultados para Cada Cantidad
del Producto
Cantidad Probable de Bacterias por

g o mL del Producto
0,1 g o 0,1 mL
0,01 g o 0,01 mL
0,001 g o 0,001 mL
ms de 103
menos de 103 y ms de 102
menos de 102 y ms de 10
menos de 10
Escherichia coli
Salmonella
Preparacin de la Muestra e Incubacin PreviaPreparar el producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61 y usar una cantidad correspondiente a no menos de 10 g 10
mL, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se describe en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido
de Casena y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y SubcultivoTransferir 0,1 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja a 10 mL de Caldo RappaportVassiliadis para
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 24 horas. Subcultivar en
placas de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 48 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible presencia de Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificacin confirmatorias son negativos.
Preparacin de la Muestra e Incubacin PreviaPreparar una muestra usando una dilucin 1 en 10 de no menos de 1 g
del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61
y usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g 1 mL, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se describe en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja y mezclar. Al analizar parches transdrmicos, filtrar el
volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparacin (ver Parches Transdrmicos en Preparacin de la Muestra en
Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61) a travs de un filtro de membrana estril
y colocar en 100 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a
24 horas.
Captulos
y usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 mL, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se describe en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30 a 35
durante un perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y SubcultivoAgitar el recipiente, transferir 1 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja a 100 mL de Caldo MacConkey e incubar a una temperatura de 42 a 44 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar
MacConkey a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 72 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de
identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificacin son negativos.
USP 38
Seleccin y SubcultivoSubcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un
perodo de 18 a 72 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas
de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificacin confirmatorias son negativos.
Captulos
y usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g 1 mL, para inocular una cantidad adecuada (determinada segn se describe en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Caldo Digerido de Casena y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdrmicos, filtrar el volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparacin (ver Parches Transdrmicos en Preparacin de la
Muestra en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61) a travs de un filtro de membrana estril y colocar en 100 mL de Caldo Digerido de Casena y Soja. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un
perodo de 18 a 24 horas.
Seleccin y SubcultivoSubcultivar en una placa de Agar Manitol Salado e incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 18 a 72 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificacin confirmatorias son negativos.
Clostridios
Preparacin de la Muestra y Tratamiento TrmicoPreparar una muestra usando una dilucin 1 en 10 (con un volumen
total mnimo de 20 mL) de no menos de 2 g o 2 mL del producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61. Dividir la muestra en dos porciones de al menos 10 mL. Calentar una
porcin a 80 durante 10 minutos y enfriar rpidamente. No calentar la otra porcin.
Seleccin y SubcultivoUsar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 mL del producto a analizar de ambas porciones para inocular cantidades adecuadas (determinadas segn se indica en Aptitud del Mtodo de Prueba) de Medio Reforzado
para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaerbicas a una temperatura de 30 a 35 durante 48 horas. Despus de la incubacin, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaerbicas a una temperatura de 30 a 35 durante 48 a 72 horas.
InterpretacinEl crecimiento anaerbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reaccin de catalasa negativa
indica la presencia de Clostridios.
Esto se confirma mediante pruebas de identificacin. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de
identificacin confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.
Candida albicans
Preparacin de la Muestra e Incubacin PreviaPreparar el producto a analizar segn se indica en Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano 61 y usar 10 mL o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g
1 mL, para inocular 100 mL de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 3 a 5 das.
Seleccin y SubcultivoSubcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30 a 35
durante un perodo de 24 a 48 horas.
InterpretacinEl crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante
pruebas de identificacin.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificacin confirmatorias resultan
negativas.
SOLUCIONES RECOMENDADAS Y
MEDIOS DE CULTIVO
NOTAEsta seccin se proporciona como informacin.
Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en la prueba de contaminacin microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda
demostrar su aptitud.
USP 38
Solucin Amortiguadora MadreTransferir 34 g de fosfato monobsico de potasio a un matraz volumtrico de 1000 mL,
disolver en 500 mL de Agua Purificada, ajustar con hidrxido de sodio a un pH de 7,2 0,2, agregar Agua Purificada a volumen
y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2 a 8.
Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solucin Amortiguadora Madre
(800:1 v/v) y esterilizar.
Solucin Amortiguada de Cloruro de SodioPeptona
de pH 7,0
Fosfato Monobsico de Potasio
3,6 g
Fosfato Dibsico de Sodio Dihidrato
7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Cloruro de Sodio
4,3 g
Peptona (de carne o casena)
1,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Caldo Digerido de Casena y Soja
Digerido Pancretico de Casena
17,0 g
Digerido Papanico de Soja
3,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Fosfato Dibsico de Potasio
2,5 g
2,5 g
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Agar Digerido de Casena y Soja
15,0 g
Digerido Papanico de Soja
5,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Agar
15,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Agar Sabouraud Dextrosa
Dextrosa
40,0 g
Mezcla de Digerido Pptico de Tejido Animal y Digerido Pancretico de Casena (1:1)
10,0 g
Agar
15,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Agar Papa Dextrosa
Infusin de papas
200 g
Dextrosa
20,0 g
Agar
15,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Dextrosa
20,0 g
Mezcla de Digerido Pptico de Tejido Animal y Digerido Pancretico de Casena (1:1)
10,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Captulos
Glucosa Monohidrato
USP 38
Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido Pancretico de Gelatina
10,0 g
Glucosa Monohidrato
5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada
20,0 g
2,0 g
Fosfato Dibsico de Sodio Dihidrato
8,0 g
Verde Brillante
15 mg
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,2 0,2 a 25. Calentar a 100 durante 30 minutos y enfriar inmediatamente.
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa
Extracto de Levadura
3,0 g
7,0 g
Sales Biliares
1,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Glucosa Monohidrato
10,0 g
Agar
15,0 g
Captulos
Rojo Neutro
30 mg
Cristal Violeta
2 mg
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,4 0,2 a 25. Calentar hasta el punto de ebullicin; no calentar
en autoclave.
Caldo MacConkey
20,0 g
Lactosa Monohidrato
10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada
5,0 g
Prpura de Bromocresol
10 mg
Agua Purificada
1000 mL
Agar MacConkey
17,0 g
Peptonas (de carne y casena)
3,0 g
Lactosa Monohidrato
10,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Sales Biliares
1,5 g
Agar
13,5 g
Rojo Neutro
30,0 mg
Cristal Violeta
1 mg
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,1 0,2 a 25. Calentar a ebullicin durante 1 minuto, agitando
constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
Caldo RappaportVassiliadis para Enriquecimiento de
Salmonella
Peptona de Soja
Cloruro de Magnesio Hexahidrato
4,5 g
29,0 g
Cloruro de Sodio
8,0 g
0,4 g
0,6 g
Verde de Malaquita
0,036 g
Agua Purificada
1000 mL
USP 38
Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda
de 115. El pH debe ser de 5,2 0,2 a 25 luego del calentamiento y esterilizacin en autoclave.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
Xilosa
3,5 g
L-Lisina
5,0 g
Lactosa Monohidrato
7,5 g
Sacarosa
7,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
3,0 g
Rojo de Fenol
80 mg
Agar
13,5 g
Desoxicolato de Sodio
2,5 g
Tiosulfato de Sodio
6,8 g
Citrato Frrico Amnico
0,8 g
Agua Purificada
1000 mL
Ajustar el pH para que despus del calentamiento sea de 7,4 0,2 a 25. Calentar a ebullicin, enfriar a 50 y verter en
placas de Petri. No calentar en un autoclave.
Agar Cetrimida
20,0 g
Cloruro de Magnesio
1,4 g
Sulfato de Potasio
10,0 g
Cetrimida
0,3 g
Agar
13,6 g
Agua Purificada
1000 mL
Glicerol
10,0 mL
Calentar a ebullicin durante 1 minuto con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,2 0,2 a
25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Agar Manitol Salado
5,0 g
Digerido Pptico de Tejido Animal
5,0 g
Extracto de Carne
1,0 g
D-Manitol
10,0 g
Cloruro de Sodio
75,0 g
Agar
15,0 g
Rojo de Fenol
0,025 g
Agua Purificada
1000 mL
Calentar a ebullicin durante 1 minuto con agitacin. Ajustar el pH para que despus de la esterilizacin sea de 7,4 0,2 a
25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Medio Reforzado para Clostridios
Extracto de Carne
10,0 g
Peptona
10,0 g
3,0 g
Almidn Soluble
1,0 g
Glucosa Monohidrato
5,0 g
Clorhidrato de Cistena
0,5 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Acetato de Sodio
3,0 g
Agar
Agua Purificada
0,5 g
1000 mL
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que despus de la esterilizacin sea de 6,8 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Captulos
USP 38
Agar Columbia
10,0 g
Digerido Pptico de Carne
5,0 g
Digerido Pancretico de Corazn
3,0 g
5,0 g
Almidn de Maz
1,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de gelificacin
10,015,0 g
Agua Purificada
1000 mL
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullicin y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que despus de la esterilizacin sea de 7,3 0,2 a 25. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a
una temperatura de 45 a 50, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamicina base y verter en placas de Petri.
Captulos
63 PRUEBAS PARA MICOPLASMAS

INTRODUCCIN
El gnero micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este gnero comprende ms
de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes ms pequeos. Las clulas varan en tamao y morfologa y
no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar slido se pueden colorear con azul de metileno o una tincin equivalente. Los micoplasmas son parsitos y comensales, y algunos pueden ser patgenos para una gran
variedad de huspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parsitos de superficie que colonizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminacin
seria en los cultivos de clulas y/o tejidos usados para producir artculos farmacopeicos. Tambin pueden causar contaminacin en el caldo de digestin de casena de soja filtrado y esterilizado. Una infeccin en un cultivo celular puede persistir por
un periodo prolongado sin causar un dao celular aparente. La infeccin de las clulas en un cultivo puede afectar prcticamente todas las vas del metabolismo celular, alterando incluso las caractersticas fenotpicas de las clulas y su crecimiento
normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos
o una alteracin visible de las clulas.
La prueba para deteccin de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confiable la pureza de los productos biotecnolgicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este captulo
de pruebas generales describe dos mtodos requeridos para detectar la contaminacin por micoplasma en los artculos de
prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artculos, caldos de digestin o cualquier otro material en el que se sospeche contaminacin por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el
procedimiento en cultivo de clulas indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa tcnica asptica y condiciones de laboratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretacin de los resultados sean apropiadas, el personal
debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una tcnica validada de amplificacin de cidos nucleicos (NAT, por sus siglas en ingls) o un mtodo basado en la actividad enzimtica, siempre que el
mtodo usado demuestre ser comparable con ambos mtodos (A) y (B). Los mtodos alternativos se deben validar apropiadamente. Los requisitos de validacin para los mtodos alternativos no se tratarn en este captulo.
MTODO DE CULTIVO
Eleccin de los Medios de Cultivo
La prueba se efecta usando un nmero suficiente de medios de cultivo tanto slidos como lquidos para garantizar el crecimiento en las condiciones de incubacin elegidas de pequeas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades
formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artculo o material de prueba. Los medios de cultivo lquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha demostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad (a continuacin). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo
se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir
en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para
Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o
Pruebas Microbiolgicas / 63 Pruebas para Micoplasmas 131
USP 38
una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. orale o una especie y cepa equivalente). Solo al examinar lneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., S. citri ATCC 29747,
S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco ms exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubacin ms bajas (al igual que las lneas celulares de insectos).
Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad
Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba
Organismo de Prueba
Nmero NCTC
Nmero CIP
Nmero ATCC
ATCC 23206
A. laidlawii
NCTC 10116
CIP 75,27
M. gallisepticum
NCTC 10115
CIP 104967
ATCC 19610
M. fermentans
NCTC 10117
CIP 105680
ATCC 19989
M. hyorhinis
NCTC 10130
CIP 104968
ATCC 17981
M. orale
NCTC 10112
CIP 104969
ATCC 23714
M. pneumoniae
NCTC 10119
CIP 103766
ATCC 15531
M. synoviae
NCTC 10124
CIP 104970
ATCC 25204
Condiciones de Incubacin
Incubar los medios de cultivo lquidos en recipientes hermticamente tapados a 36 1. Incubar los medios de cultivo slidos en condiciones microaeroflicas (atmsfera de hidrgeno que contenga < 0,5% de oxgeno y/o nitrgeno que contenga
5% a 10% de dixido de carbono en nitrgeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecacin de la superficie del agar a 36 1.
Propiedades Nutritivas
Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegido con los microorganismos de prueba apropiados; no usar ms de 100 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio
de cultivo slido y por recipiente de 100 mL de medio de cultivo lquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada especie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio lquido en medio slido a
los intervalos especificados (ver a continuacin en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artculo de Prueba). El medio slido
cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logartmicas de la cantidad inoculada
para cada microorganismo de prueba. El medio lquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar
subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio
con un aumento de 100 o mayor puede ser til.
Sustancias Inhibidoras
La prueba de sustancias inhibidoras se efecta una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cambio en el mtodo de produccin que pueda afectar la deteccin de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias
inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artculo o material de prueba. Si el
crecimiento de un microorganismo de prueba en ms de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artculo o material de prueba
antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inocu-
Captulos
Los cultivos de controles positivos no deben tener ms de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplasmas aptas para el uso se enumeran a continuacin:
Acholeplasma laidlawii (vacunas y/o materiales derivados de clulas o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha
usado un antibitico durante la produccin)
M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna o el cultivo celular estn
destinados al uso en aves de corral)
M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares)
M. orale (vacunas para uso humano y veterinario)
M. pneumoniae (vacunas o bancos de clulas para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de D-glucosa como M. fermentans
M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la produccin o cuando la vacuna o el banco de clulas est destinado al uso en aves de corral)
Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un nmero limitado de subcultivos (no ms de 15), se
almacenan congeladas (20 o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por comparacin con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 1.
132 63 Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
ladas con el artculo o material de prueba no estn dentro del intervalo de 0,5 unidades logartmicas del nmero de colonias
de aquellas inoculadas sin el artculo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o
contrarrestar su efecto por un mtodo apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilucin en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilucin, se pueden usar volmenes mayores de medio o
se puede dividir el volumen del inculo en varios matraces de 100 mL. La eficacia de la neutralizacin o de otros procesos se
controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras despus de la neutralizacin.
Captulos
Prueba para Micoplasmas en el Artculo o Material de Prueba

Inocular no menos de 10 mL del artculo o material de prueba por 100 mL de cada medio lquido. Si ocurre un cambio de
pH significativo despus de la adicin del artculo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de
cultivo por medio de la adicin de una solucin estril de hidrxido de sodio o de cido clorhdrico. Inocular 0,2 mL del artculo o material de prueba en cada placa de medio slido. Incubar el medio lquido durante 20 a 21 das. Incubar el medio slido
durante no menos de 14 das, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 das, las cuales se incuban durante 7 das. Simultneamente, incubar una porcin de 100 mL, sin inculo, de cada medio lquido y placa de agar,
como control negativo. En los das 2 a 4 despus de la inoculacin, subcultivar cada medio lquido por inoculacin de 0,2 mL
al menos en 1 placa de cada medio slido. Repetir el procedimiento entre los das 6 y 8, de nuevo entre los das 13 y 15 y una
vez ms entre los das 19 y 21 de la prueba. Observar el medio lquido cada 2 3 das y si se presenta un cambio de color,
subcultivar. Si un medio lquido muestra contaminacin bacteriana o fngica, la prueba es invlida. La prueba es vlida si se
puede leer al menos 1 placa por medio y por da de inoculacin. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inoculacin de no ms de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la
prueba de deteccin de micoplasmas peridicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotacin peridica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Eleccin de los Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos
y las placas en una atmsfera humidificada con condiciones microaeroflicas (5% a 10% de CO2).

Al finalizar el periodo de incubacin prescrito, examinar todos los medios slidos inoculados en busca de la presencia de
colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias tpicas de micoplasmas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias tpicas de micoplasmas en cualquiera de
los medios slidos. La prueba es invlida si 1 o ms de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al menos en 1 placa de subcultivo. La prueba es invlida si 1 o ms de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas.
Si se observan colonias sospechosas, usar un mtodo validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.
Soluciones y Medios Recomendados para el Mtodo de Cultivo

NOTAEsta
seccin se proporciona como informacin.

SOLUCIONES
Caldo de infusin de Corazn Vacuno
Corazn vacuno (para preparar la infusin)
500 g
Peptona
10 g
Cloruro de sodio
5g
Agua destilada
hasta 1000 mL
Vitaminas Esenciales
Biotina
100 mg
Pantotenato de calcio
100 mg
Cloruro de colina
100 mg
cido flico
100 mg
i-Inositol
200 mg
Nicotinamida
100 mg
Clorhidrato de piridoxal
100 mg
Riboflavina
10 mg
Clorhidrato de tiamina
100 mg
Agua destilada
hasta 1000 mL
USP 38
Agar, Purificado
Un agar altamente refinado para usar en microbiologa e inmunologa, preparado por un procedimiento de intercambio inico que da como resultado
un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes:
Agua
12,2%
Cenizas
1,5%
Cenizas insolubles en cido
0,2%
Cloro
Fosfato (calculado como P2O5)
0,3%
Nitrgeno total
0,3%
Cobre
8 ppm
Hierro
170 ppm
Calcio
0,28%
Magnesio
0,32%
Solucin Salina Balanceada de Hanks (modificada)
Cloruro de sodio
6,4 g
Cloruro de potasio
0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato
0,08 g
0,08 g
Cloruro de calcio anhidro
0,112 g
Fosfato cido disdico dihidrato
0,0596 g
Fosfato dicido de potasio anhidro
0,048 g
Agua destilada
hasta 800 mL
Infusin de Cerebro-Corazn
Infusin de cerebro de ternero
200 g
Infusin de corazn vacuno
250 g
Proteosa peptona
10 g
Glucosa monohidrato
2g
Cloruro de sodio
5g
Fosfato cido disdico anhidro
2,5 g
Agua destilada
hasta 1000 mL
Caldo PPLO
Infusin de corazn vacuno
50 g
Peptona
10 g
Cloruro de sodio
5g
Agua destilada
hasta 1000 mL
MEDIOS
Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las secciones Eleccin de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubacin, Propiedades Nutritivas y Sustancias Inhibidoras.
Medios de Hayflick
(recomendado para la deteccin general de micoplasmas)
Medio Lquido
Caldo de infusin de corazn vacuno
90,0 mL
Suero de caballo (sin calentar)
20,0 mL
Extracto de levadura (250 g/L) (se recomienda extracto de levadura fresca)
10,0 mL
Rojo de fenol (solucin de 0,6 g/L)
5,0 mL
Penicilina (20 000 UI/mL)
0,25 mL
cido desoxirribonucleico (solucin de 2 g/L)
1,2 mL
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Slido
Preparar como se describi anteriormente, reemplazando el caldo de infusin de corazn vacuno por agar de infusin de corazn vacuno que contenga 15 g/L de agar.
Captulos
Cloruro de magnesio hexahidrato
134 63 Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
Medios de Frey
(recomendado para la deteccin de M. synoviae)
Medio Lquido
90,0 mL
Vitaminas esenciales
0,025 mL
Glucosa monohidrato (solucin de 500 g/L)
2,0 mL
Suero de cerdo (inactivado a 56 durante 30 min)
12,0 mL
b -Nicotinamida adenina dinucletido (solucin de 10 g/L)
1,0 mL
Clorhidrato de cistena (solucin de 10 g/L)
1,0 mL
5,0 mL
0,25 mL
Mezclar las soluciones de b -nicotinamida adenina dinucletido y clorhidrato de cistena y despus de 10 minutos agregar a los dems ingredientes.
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Slido
90,0 mL
Agar, purificado
1,4 g
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y luego agregar:
Captulos
Vitaminas esenciales
0,025 mL
Glucosa monohidrato (solucin de 500 g/L)
2,0 mL
Suero de cerdo (sin calentar)
12,0 mL
b -Nicotinamida adenina dinucletido (solucin de 10 g/L)
1,0 mL
Clorhidrato de cistena (solucin de 10 g/L)
1,0 mL
5,0 mL
0,25 mL
Medios de Friis
(recomendado para la deteccin de micoplasmas no aviares)
Medio Lquido
Solucin salina balanceada de Hanks (modificada)
800 mL
Agua destilada
67 mL
Infusin de cerebro-corazn
135 mL
Caldo PPLO
248 mL
Extracto de levadura (170 g/L)
60 mL
Bacitracina
250 mg
Meticilina
250 mg
Rojo de fenol (5 g/L)
4,5 mL
Suero de caballo
165 mL
Suero de cerdo
165 mL
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45

Medio Slido
Solucin salina balanceada de Hanks (modificada)
200 mL
DEAE-dextrano
200 mg
Agar, purificado
15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100. Agregar a 1740 mL de Medio Lquido como se describi anteriormente.
MTODO DE CULTIVO DE CLULAS INDICADORAS

Los cultivos celulares se tien con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrn
de fluorescencia filamentoso o particulado caracterstico sobre la superficie celular y, si la contaminacin es abundante, en las
reas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teir pero se distinguen fcilmente de los micoplasmas. Para suspensiones virales, si la interpretacin de los resultados se ve afectada por efectos citopticos marcados, neutralizar el virus
usando un antisuero especfico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular
que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con
controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.
USP 38
Verificacin del Sustrato

Usar clulas Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la lnea de clulas de produccin) que tenga una eficacia
equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las clulas que se van a usar aplicando el procedimiento descripto
a continuacin e inoculando no ms de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y
M. orale. Las clulas son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las clulas indicadoras se deben subcultivar sin
antibiticos antes de usarlas en la prueba.
Mtodo de Prueba
NOTALo
siguiente se proporciona como informacin.

SOLUCIONES
MTODO
1. Sembrar el cultivo de clulas indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 104 a 2 105 clulas/mL, 4 103 a
2,5 104 clulas/cm2) que lleven a la confluencia despus de 3 das de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a examinar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36 1.
2. Despus de 3 das de incubacin como mnimo, cuando las clulas hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo
sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cmara para
cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las clulas con baja densidad, de forma que puedan alcanzar
una confluencia del 50% despus de 3 a 5 das de incubacin. La confluencia completa impide la visualizacin de micoplasmas despus de la tincin y debe evitarse.
3. Retirar el medio y enjuagar las clulas indicadoras con solucin salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una
solucin fijadora adecuada (una mezcla recin preparada de 1 volumen de cido actico glacial SR y 3 volmenes de metanol se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tincin).
4. Retirar la solucin fijadora y lavar las clulas con Agua Purificada estril. Secar los portaobjetos completamente si se van a
colorear ms de 1 hora despus (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las lminas despus del secado
debido a los artefactos que se podran producir).
5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solucin de trabajo de bisbenzimida y un tiempo de reposo de 10 minutos se consideran adecuados).
6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada.
7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volmenes iguales de glicerol y Solucin Amortiguadora
de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloracin con bisbenzimida resulta apropiado usar un filtro de excitacin de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un aumento de 400 o mayor.
8. Comparar la apariencia microscpica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando
fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la clula indicadora.
Tambin pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante
la validacin, se examinan mltiples campos microscpicos.

El producto a examinar cumple con la prueba si no est presente la fluorescencia tpica de los micoplasmas. La prueba es
invlida si los controles positivos no presentan la fluorescencia tpica de los micoplasmas. La prueba es invlida si los controles
negativos presentan la fluorescencia tpica de los micoplasmas.
Captulos
Solucin Salina Amortiguada con Fosfato

Fosfato Monobsico de Potasio 2,0 MDisolver 13,61 g de fosfato monobsico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 MDisolver 17,42 g de fosfato dibsico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Solucin Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobsico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de
Fosfato Dibsico de Potasio 2,0 M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario.
Solucin Madre de BisbenzimidaDisolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 mL.
Almacenar en la oscuridad.
Solucin de Trabajo de BisbenzimidaInmediatamente antes de usar, diluir 100 mL de Solucin Madre de Bisbenzimida
con Solucin Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4) hasta 100 mL.
Solucin Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5Mezclar 56,85 mL de una solucin de 28,4 g/L de fosfato cido
disdico anhidro y 43,15 mL de una solucin de 21 g/L de cido ctrico.
136 71 Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiolgicas
USP 38
71 PRUEBAS DE ESTERILIDAD
Algunas partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea
y/o la Farmacopea Japonesa. Las partes no armonizadas estn marcadas con los smbolos () para indicar esta situacin.
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseado para garantizar que una partida de un producto es estril o ha sido
esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente mediante la validacin del proceso de esterilizacin o de los procedimientos del procesamiento asptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artculos cuya esterilidad es requerida por la Farmacopea. Sin embargo, un resultado satisfactorio nicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las
condiciones de la prueba.
PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIN MICROBIANA
Captulos
La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones aspticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la
prueba debe adaptarse a la manera en que sta se realice. Las precauciones para evitar la contaminacin se deben tomar de
modo tal que no se afecte a ningn microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las
que se efectan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del rea de trabajo y la realizacin
de controles apropiados.
MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIN

Los medios para la prueba se pueden preparar segn se indica a continuacin o se pueden usar medios equivalentes disponibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promocin del Crecimiento de Organismos
Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Lquido de Tioglicolato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, tambin detecta bacterias aerobias. El Medio de
Digerido de Casena y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias.
Medio Lquido de Tioglicolato
L-Cistina
Cloruro de Sodio
Dextrosa Monohidrato/Anhidra
Agar
Extracto de Levadura (soluble en agua)
Tioglicolato de Sodio
o cido Tiogliclico
Solucin de Resazurina Sdica (1 en 1000), recin preparada
Agua Purificada
0,5 g
2,5 g
5,5/5,0 g
0,75 g
5,0 g
15,0 g
0,5 g
0,3 mL
1,0 mL
1000 mL
El pH despus de la esterilizacin es de 7,1 0,2.

Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancretico de casena con
el agua purificada y calentar hasta su disolucin. Disolver el tioglicolato de sodio o el cido tiogliclico en la solucin y, de ser
necesario, agregar hidrxido de sodio 1 N de modo que, despus de la esterilizacin, la solucin tenga un pH de 7,1 0,2. Si
se requiere filtracin, calentar nuevamente la solucin sin llegar a ebullicin y filtrar mientras est caliente a travs de un papel
de filtro humedecido. Agregar la solucin de resazurina sdica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma
que la relacin entre superficie y profundidad sea tal que no ms de la mitad superior del medio haya experimentado un cambio de color indicativo de la captacin de oxgeno al final del perodo de incubacin. Esterilizar usando un proceso validado. Si
el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2 y 25 en un envase estril y hermtico. Si una porcin mayor
que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes
en un bao de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rpidamente tratando de evitar la
entrada de aire no estril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento ms largo que el que ha sido
validado.
El Medio Lquido de Tioglicolato debe incubarse a 3035. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se
pueden analizar mediante el mtodo de filtracin por membrana, se puede utilizar Medio Lquido de Tioglicolato incubado a
2025 en lugar de Medio de Digerido de Casena y Soja, siempre y cuando haya sido validado segn se indica en Prueba de
Promocin del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato
alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composicin que
la del Medio Lquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solucin de resazurina sdica. Esterilizar segn se indica ante-
Pruebas Microbiolgicas / 71 Pruebas de Esterilidad 137
USP 38
riormente. El pH despus de la esterilizacin es 7,1 0,2. Calentar en un bao de agua antes de usar e incubar a 3035 bajo
condiciones anaerbicas.
Medio de Digerido de Casena y Soja
17,0 g
Digerido Papanico de Harina de Soja
3,0 g
Cloruro de Sodio
5,0 g
2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra
2,5/2,3 g
Agua Purificada
1000 mL
El pH despus de la esterilizacin es de 7,3 0,2.

Disolver los slidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolucin. Enfriar la solucin a temperatura
ambiente y ajustar el pH con hidrxido de sodio 1 N de modo que, despus de la esterilizacin, se obtenga un pH de 7,3
0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solucin transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar
usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2 y 25 en un recipiente estril y bien cerrado, a menos
que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento ms largo que el que ha sido validado.
El Medio de Digerido de Casena y Soja debe incubarse a 22,5 2,5.
Medios para Penicilinas o Cefalosporinas
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promocin del Crecimiento y en la
Prueba de Aptitud del Mtodo
Bacterias Aerobias
ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis
ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa1
ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia
Clostridium sporogenes2
ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293
Hongos
Candida albicans
ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (Aspergillus Niger)
ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
1
2
Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophila (Micrococcus luteus) ATCC 9341.

Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vulgatus (ATCC 8482).
Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el producto a examinar.
Esterilidad
Incubar porciones del medio durante 14 das. No se produce crecimiento de ningn organismo.
Prueba de Promocin del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos

Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mezclando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 1.
Inocular porciones de Medio Lquido de Tioglicolato con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de los microorganismos
siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aerugino-
Captulos
Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el mtodo de Inoculacin Directa del Medio de Cultivo que se indica
en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparacin del Medio Lquido de Tioglicolato y del Medio de Digerido de Casena y Soja segn se indica a continuacin. Transferir aspticamente a los recipientes de cada medio una cantidad de
b -lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibitico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de
b -lactamasa requerida para inactivar el antibitico empleando una preparacin de b -lactamasa cuyo poder inactivante de penicilinas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTALos medios complementados con b -lactamasa tambin
pueden usarse en la prueba de filtracin por membrana.]
Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incorpora una cantidad adecuada de b -lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos mtodos indicados en Prueba de
Aptitud del Mtodo, usando como desafo menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ver
Tabla 1). Debe observarse un crecimiento microbiano tpico del cultivo inoculado como confirmacin de que la concentracin
de b -lactamasa es adecuada.
USP 38
sa y Staphylococcus aureus. Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un nmero pequeo (no ms de 100
ufc) de Clostridium sporogenes. Inocular porciones de Medio de Digerido de Casena y Soja con un nmero pequeo (no ms de
100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacillus subtilis y Candida albicans. Incubar durante no ms de 3 das en el caso de bacterias y durante no ms de 5
das en el caso de hongos. Las tcnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
para que los microorganismos viables empleados para la inoculacin correspondan a no ms de cinco pasajes desde el lote de
siembra maestro original.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.
LQUIDOS DE DILUCIN Y LAVADO PARA FILTRACIN POR MEMBRANA
Lquido A
PREPARACIN
Disolver 1 g de digerido pptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera
necesario, y ajustar a un pH de 7,1 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.
Captulos
PREPARACIN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS
Agregar aspticamente a la Preparacin anterior, si fuera necesario, una cantidad de b -lactamasa estril suficiente para inactivar cualquier actividad residual de antibiticos en las membranas despus de haber filtrado la solucin de la muestra de prueba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).
Lquido D
Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Lquido A, y ajustar a un pH de 7,1 0,2. Transferir a envases y esterilizar
empleando un proceso validado. Usar este lquido para artculos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiquetados para administracin estril.
Lquido K
Disolver 5,0 g de digerido pptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua
para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, despus de la esterilizacin, un pH de 6,9 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.
PRUEBA DE APTITUD DEL MTODO

Llevar a cabo una prueba segn se describe ms adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exactamente los mismos mtodos, a excepcin de las modificaciones siguientes.
Filtracin por Membrana

Despus de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inculo de un nmero pequeo de microorganismos viables (no ms de 100 ufc) en la porcin final del diluyente estril usado para enjuagar el filtro.
Inoculacin Directa
Despus de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de
sutura quirrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inculo de un nmero pequeo de microorganismos viables (no ms de 100 ufc).
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promocin del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promocin del crecimiento como control positivo.
Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no ms de 5 das.
Si despus de la incubacin se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con
el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de
los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente
USP 38
en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba
de Aptitud del Mtodo.
Esta prueba de aptitud del mtodo se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto
nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del mtodo
podr llevarse a cabo simultneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.
PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR

Nmero de Artculos a Evaluar
A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este captulo o en la monografa individual, evaluar el nmero de
artculos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artculo est en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede dividir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTARealizar las pruebas de
esterilidad empleando dos o ms de los medios especificados.] Si cada artculo no contiene las cantidades suficientes para cada
medio, usar el doble del nmero de artculos indicado en la Tabla 3.
Tabla 2. Cantidad Mnima a Usar para cada Medio
Cantidad Mnima a Usar
(a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Cantidad por Envase

Lquidos
El contenido total de cada envase

La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 mL
Ms de 40 mL y no ms de 100 mL
20 mL
Ms de 100 mL
10% del contenido del envase, pero no menos de 20 mL
Lquidos antibiticos
1 mL
Preparaciones insolubles, cremas y ungentos que deben suspenderse o emulsionarse
Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
Slidos
Menos de 50 mg
El contenido total de cada envase
50 mg o ms, pero menos de 300 mg
La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg5 g
150 mg
Ms de 5 g
500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario
3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
Apsito
100 mg por envase
quirrgico/algodn/gasa (en envases)
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo
te
Otros dispositivos mdicos
El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado
Tabla 3. Nmero Mnimo de Artculos a Evaluar en Relacin con el Nmero de Artculos en la Partida
Nmero de Artculos en la Partida*
Nmero Mnimo de Artculos a Analizar para cada Medio

(a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Preparaciones parenterales
No ms de 100 envases
10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Ms de 100 pero no ms de 500 envases
10 envases
Ms de 500 envases
2% o 20 envases, lo que resulte menor
Para
2% o 10 envases, lo que resulte menor
preparaciones parenterales de gran volumen
Antibiticos slidos
Envases a granel para farmacias (<5 g)
20 envases
Envases a granel para farmacias (5 g)
6 envases
Graneles y mezclas
Ver Productos slidos a granel
Preparaciones oftlmicas y otras preparaciones no inyectables

No ms de 200 envases
Ms de 200 envases
10 envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el

esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parenteral.
* Si no se conoce el tamao de la partida, usar el nmero mximo de artculos prescritos.
** Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el nmero de envases necesarios para los dos medios juntos.
Captulos
Menos de 1 mL
140 mL
USP 38
Tabla 3. Nmero Mnimo de Artculos a Evaluar en Relacin con el Nmero de Artculos en la Partida (Continuacin)
Nmero Mnimo de Artculos a Analizar para cada Medio
(a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Nmero de Artculos en la Partida*

Catgut y otros materiales de sutura quirrgica para uso veterinario
2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total mximo de 20 envases
No
10% o 4 artculos, lo que resulte mayor
ms de 100 artculos
Ms de 100, pero no ms de 500 artculos
10 artculos
Ms de 500 artculos
2% o 20 artculos, lo que resulte menor
Productos slidos a granel

Hasta 4 envases
Cada envase
Ms de 4 envases, pero no ms de 50 envases
Ms de 50 envases
* Si no se conoce el tamao de la partida, usar el nmero mximo de artculos prescritos.

** Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el nmero de envases necesarios para los dos medios juntos.
Captulos
La prueba puede llevarse a cabo mediante la tcnica de Filtracin por Membrana o por Inoculacin Directa del Medio de Cultivo
con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La tcnica de filtracin por membrana se usa cuando
la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohlicas o aceitosas
y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean
un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.
Filtracin por Membrana

Usar filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45 mm, cuya eficacia para retener microorganismos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohlico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohlico. Es posible que para ciertos productos (p.ej., antibiticos) se necesiten filtros especialmente adaptados.
La tcnica descrita ms adelante supone que se usarn membranas de aproximadamente 50 mm de dimetro. Si se usan
filtros de un dimetro diferente, los volmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse segn corresponda. El aparato de
filtracin y la membrana se esterilizan usando tcnicas adecuadas. El aparato se disea de tal modo que la solucin a examinar
se pueda introducir y filtrar en condiciones aspticas: permite retirar aspticamente la membrana para transferirla al medio de
cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubacin dentro del aparato mismo despus de agregarle el medio.
SOLUCIONES ACUOSAS
Si corresponde, transferir una pequea cantidad de un diluyente estril adecuado, como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana), a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener
sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibiticos.
Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, despus de diluirlo
hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Mtodo con el diluyente estril elegido, pero usando no menos de las cantidades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimicrobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estril elegido usado
en la Prueba de Aptitud del Mtodo. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, incluso si durante la prueba de aptitud del mtodo se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicrobiana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla aspticamente en dos partes iguales y transferir cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Mtodo. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 das.
SLIDOS SOLUBLES
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecuado, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparacin, Agua Estril para Inyeccin, solucin salina estril o una
solucin estril adecuada como por ejemplo Lquido A (Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana), y proceder
con la prueba segn lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una membrana adecuada para el disolvente
elegido.
ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas
de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilucin a travs de una membrana seca. Los aceites viscosos se pue-
USP 38
den diluir segn sea necesario con un diluyente estril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demostrado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su propio peso y, a continuacin, filtrar, aplicando presin o succin gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando
cada vez aproximadamente 100 mL de una solucin estril adecuada, como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y
Lavado para Filtracin por Membrana), que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentracin que haya demostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Mtodo, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentracin de 10 g por
L (Lquido K). Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, segn lo descrito anteriormente para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.
UNGENTOS Y CREMAS
Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungentos en base grasa y
las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1% en miristato de isopropilo segn lo descrito anteriormente, calentando si fuera necesario a no ms de 40. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no ms de 44.
Filtrar tan rpidamente como sea posible y proceder segn lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas.
JERINGAS PRELLENADAS
SLIDOS PARA INYECCIN DISTINTOS DE ANTIBITICOS
Reconstituir los artculos de prueba segn las instrucciones de la etiqueta y proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTASi fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso
para facilitar la reconstitucin y filtracin del artculo de prueba reconstituido.]
ANTIBITICOS SLIDOS PARA INYECCIN
Envases a Granel para Farmacias, <5 gTomar una cantidad aproximada a 300 mg de slido de cada uno de 20 envases,
transferir aspticamente a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A (ver
Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir segn lo indicado en la etiqueta,
cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de lquido o suspensin que equivalga aproximadamente a 300 mg de slido
a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar. Proceder segn lo
indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, 5 gTomar aproximadamente 1 g de slido de cada uno de 6 envases, transferir aspticamente a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar; o bien,
reconstituir segn lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de lquido que equivalga aproximadamente a 1 g de slido a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y
mezclar. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas.
ANTIBITICOS SLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS
Retirar aspticamente una cantidad suficiente de slido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta obtener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de slido y transferir a un matraz Erlenmeyer estril de 500 mL. Disolver en aproximadamente 200 mL de Lquido A y mezclar. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas.
PRODUCTOS ESTRILES EN AEROSOL
Para productos lquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo
menos a 20 durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir aspticamente el
envase y transferir el contenido a un recipiente de combinacin estril. Agregar 100 mL de Lquido D al recipiente de combinacin y mezclar suavemente. Proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, segn corresponda.
Captulos
Para jeringas prellenadas sin agujas estriles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para
filtracin por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estril, expulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder segn lo descrito para Soluciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculacin Directa que se indica en Prueba de
Aptitud del Mtodo.
USP 38
DISPOSITIVOS CON GUAS QUE DECLARAN SER ESTRILES
Pasar aspticamente un volumen de Lquido D no inferior a 10 veces el volumen de las guas a travs de cada dispositivo
analizado. Recoger los lquidos en un recipiente estril adecuado y proceder segn lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites
y Soluciones Oleosas, segn corresponda.
En el caso de jeringas vacas estriles, extraer diluyente estril hacia el mbolo a travs de la aguja estril, si est acoplada, o
a travs de una aguja estril acoplada para el propsito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinacin
estril. Proceder segn lo indicado anteriormente.
Inoculacin Directa del Medio de Cultivo

Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparacin a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de
modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba despus de neutralizar esta actividad con una
sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilucin en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario
usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal
modo que se tenga en cuenta la dilucin subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podr agregarse directamente al producto en su envase.
Captulos
LQUIDOS OLEOSOS
Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentracin que haya demostrado
ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Mtodo, por ejemplo polisorbato 80 a una concentracin de 10 g por L.
UNGENTOS Y CREMAS
Realizar una dilucin de aproximadamente 1 en 10, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estril adecuado,
como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana). Transferir el producto diluido
a un medio que no contenga agente emulsionante.
Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 das. Observar los cultivos varias veces durante el perodo de incubacin. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los das. Sin embargo, cuando se use Medio Lquido de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mnimamente con el fin de mantener las condiciones anaerobias.
CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRRGICA PARA USO VETERINARIO
Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado teniendo en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prueba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar
hebras completas de envases recin abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar suficiente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL).
SLIDOS
Transferir una cantidad de producto en forma de slido seco (o preparar una suspensin del producto agregando diluyente
estril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material as
obtenido a 200 mL de Medio Lquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de
Medio de Digerido de Casena y Soja y mezclar. Proceder segn lo indicado anteriormente.
ALGODN PURIFICADO, GASA, APSITOS QUIRRGICOS Y ARTCULOS RELACIONADOS
De cada envase de algodn, vendas de gasa enrollada o apsitos quirrgicos grandes que se deba evaluar, extraer aspticamente dos o ms porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte ms interna de la muestra. Para materiales de un solo uso
envasados individualmente, extraer aspticamente todo el artculo. Sumergir las porciones o el artculo en cada medio y proceder segn lo indicado anteriormente.
DISPOSITIVOS ESTRILES
Los artculos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo tambin estn en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir
USP 38
completamente el dispositivo y proceder segn lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumergir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para
lograr la inmersin completa de esas porciones.
Para catteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que
el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta.
OBSERVACIN E INTERPRETACIN DE RESULTADOS
APLICACIN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTLMICAS Y OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
Al usar la tcnica de filtracin por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solucin
estril adecuada, como por ejemplo el Lquido A (ver Lquidos de Dilucin y Lavado para Filtracin por Membrana).
Al usar la tcnica de inoculacin directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifique y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del producto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un nico envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usar
el contenido de dos o ms envases para inocular los distintos medios.
NMERO MNIMO DE ARTCULOS A ANALIZAR

En la Tabla 3 se indica el nmero mnimo de artculos a analizar en relacin con el tamao de la partida.
Captulos
A intervalos durante el perodo de incubacin, y al momento de su finalizacin, examinar los medios en busca de evidencias
macroscpicas de crecimiento microbiano. Si el material que se est evaluando enturbia el medio de modo que no puede determinarse fcilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de medio (no menores de 1 mL cada una) 14 das despus de comenzada la incubacin, a recipientes nuevos con el mismo medio y,
a continuacin, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 das.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba result invlida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba puede considerarse invlida slo si se cumplen una o ms de las siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba en cuestin revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o especies) puede atribuirse de manera inequvoca a errores con respecto al material o a la tcnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.
Si la prueba se declara invlida, se repetir con el mismo nmero de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
144 81 AntibiticosValoraciones Microbiolgicas / Pruebas Biolgicas
USP 38
Pruebas y Valoraciones Biolgicas

81 ANTIBITICOSVALORACIONES MICROBIOLGICAS
Introduccin e Informacin General
En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reduccin en la actividad microbiana puede ser difcil de demostrar por mtodos qumicos. Este captulo
resume los procedimientos para antibiticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoracin microbiolgica es el mtodo analtico estndar.
Se utilizan dos tcnicas generales: la valoracin en cilindro-placa (o en placa) y la valoracin turbidimtrica (o en tubo). La
Tabla 1 lista todos los antibiticos que incluyen valoraciones microbiolgicas y especifica el tipo de valoracin (cilindro-placa o
turbidimtrica).
Tabla 1
Captulos
Antibitico
Tipo de Valoracin
Amfotericina B
Cilindro-placa
Bacitracina
Cilindro-placa
Bleomicina
Cilindro-placa
Capreomicina
Turbidimtrica
Carbenicilina
Cilindro-placa
Cloranfenicol
Turbidimtrica
Clortetraciclina
Turbidimtrica
Cloxacilina
Cilindro-placa
Colistimetato
Cilindro-placa
Colistina
Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina
Turbidimtrica
Eritromicina
Cilindro-placa
Gentamicina
Cilindro-placa
Gramicidina
Turbidimtrica
Nafcilina
Cilindro-placa
Natamicina
Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina
Turbidimtrica
Novobiocina
Cilindro-placa
Nistatina
Cilindro-placa
Oxitetraciclina
Turbidimtrica
Paromomicina
Cilindro-placa
Penicilina G
Cilindro-placa
Polimixina B
Cilindro-placa
Sisomicina
Cilindro-placa
Tetraciclina
Turbidimtrica
Tioestreptona
Turbidimtrica
Troleandomicina
Turbidimtrica
Tilosina
Turbidimtrica
Vancomicina
Cilindro-placa
[NOTARealizar todos los procedimientos descritos en las monografas aspticamente. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los frmacos y a que se usan cultivos vivos de organismos en los procedimientos]
USP 38
Pruebas Biolgicas / 81 AntibiticosValoraciones Microbiolgicas 145
Captulos
Valoracin en cilindro-placa: La valoracin en cilindro-placa se basa en la difusin del antibitico desde un cilindro vertical a
travs de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo especfico inoculado en
el agar resulta inhibido en un rea circular o zona en torno al cilindro que contiene la solucin del antibitico.
Valoracin turbidimtrica: La valoracin turbidimtrica se basa en la inhibicin del crecimiento de un microorganismo en
una solucin uniforme del antibitico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibitico.
Unidades y Estndares de Referencia: La potencia de los antibiticos se designa en unidades (U) o en mg de actividad. En
ambos casos, la unidad o mg de actividad del antibitico se establece originalmente contra un Estndar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibitico en cuestin. El Estndar de Referencia USP correspondiente se calibra en trminos del estndar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibitico seleccionado como estndar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad qumica y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 mg/mg. En muchos de estos casos, a medida
que los mtodos de fabricacin y purificacin para ciertos antibiticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibiticos con ms de 1000 mg de actividad/mg. Tales antibiticos tenan una actividad equivalente a un nmero determinado de
mg del estndar de referencia original. No obstante, la mayora de las veces, los mg de actividad son, numricamente, exactamente equivalentes a los mg (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuacin, los mg de actividad definidos en trminos del estndar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibitico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los mg de actividad han sido definidos en trminos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibitica consta de un nmero de componentes que son qumicamente similares pero que difieren
en actividad antibitica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibiticos se expresan en trminos de un estndar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por s mismo heterogneo.
No se debe asumir que los mg de actividad corresponden a los mg (peso) de la sustancia antibitica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser estril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoracin (ver Limpieza de Material de Vidrio 1051). Usar un mtodo de esterilizacin validado tal como calor seco, vapor o irradiacin; o usar material de laboratorio estril y desechable.
Control de temperatura: Se requiere control termosttico en varias etapas de una valoracin microbiolgica: durante el cultivo de un microorganismo y la preparacin de su inculo, as como durante la incubacin en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos especficos de temperatura provistos ms adelante para cada tipo de valoracin.
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibitico se lista en la Tabla 3 para la valoracin en cilindroplaca y en la Tabla 8 para la valoracin turbidimtrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su nmero de identificacin en la American Type Culture Collection (Coleccin de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC).
Para asegurar el desempeo aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento especficas durante la validacin o verificacin del mtodo.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las caractersticas del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solucin
de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%15% en caldo tripticasa de
soja (caldo digerido de casena y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de 60 o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a 20.
Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamiento prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2 8, y desechar despus de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo primario para preparar los cultivos de trabajo por un mximo de siete das nicamente.
Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios slidos apropiados para obtener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio para la preparacin de los inculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada da de anlisis.
Crecimiento o desempeo no caractersticos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeo no caractersticos.
Diseos de valoracin: Los diseos experimentales adecuados son clave para incrementar la precisin y minimizar el sesgo.
Controlar los parmetros de incubacin, la distribucin de temperaturas y el tiempo es crtico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, segn se indica en cada valoracin.
Valoracin en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del dimetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variacin entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan basndose en el tamao relativo de la zona del estndar comparado con el tamao medio de la zona del estndar en todas las
placas.
Valoracin turbidimtrica: Para evitar un sesgo sistemtico, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separadas de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propsito de esta configuracin es minimizar la influencia de la distribucin de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoracin turbidimtrica, debido a la
configuracin de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
Captulos
USP 38
la influencia de la variacin de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la conveccin de calor adecuados durante la incubacin. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentracin muestra y estndar (un conjunto completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez observados dentro de las gradillas.
Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseo de valoracin recomendado
emplea una curva estndar de cinco concentraciones y una sola concentracin de cada preparacin muestra.
Para la valoracin en cilindro-placa, cada placa incluye nicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estndar, es decir, S3) y una de las otras cuatro concentraciones del estndar (S1, S2, S4 y S5) o la muestra (U3).
La concentracin de la muestra es una estimacin basada en la concentracin deseada. La muestra se debe diluir para proporcionar una concentracin nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentracin de referencia del estndar
(S3). El propsito de diluir a la mediana de la concentracin de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caer
dentro de la porcin lineal de la curva estndar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en funcin de la curva estndar. La muestra (U3) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilucin.
Una valoracin debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al
125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentracin de la muestra supuesta durante la preparacin de la solucin madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situacin, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basndose en el valor de potencia preliminar y repetir la valoracin. De otro modo, la potencia se derivar de una porcin de la curva
donde las respuestas del estndar y la muestra probablemente no sern paralelas.
Las determinaciones microbiolgicas de potencia estn sujetas a variables intervaloracin e intravaloracin, de modo tal que
se requieren dos o ms valoraciones independientes para obtener una estimacin confiable de la potencia de una muestra determinada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estndar como de la muestra, preparadas por separdo, llevar a cabo otro da valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resultados de todas las valoraciones independientes vlidas. El nmero de valoraciones requerido para lograr una estimacin de potencia confiable depende de la variabilidad de la valoracin y de la incertidumbre mxima requerida para la estimacin de potencia. sta ltima se evala mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Clculos, Lmites de confianza y combinaciones
de clculos de valoracin). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes ms pequeas a lo largo de
varios das es una estimacin de potencia ms confiable que la obtenida de una sola valoracin grande con el mismo nmero
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificacin ms estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el lmite
de confianza requerido con menos valoraciones.
Mtodo de Cilindro-Placa
Control de temperatura: Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura
especificados en la Tabla 3.
Aparato
Placas: Placas de Petri de plstico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 100 mm) con tapas
Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8 0,1 mm de dimetro externo; de 6 0,1 mm de dimetro interno; de 10 0,1 mm de altura. [NOTALimpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario
limpiar ocasionalmente en un bao cido, por ejemplo, con cido ntrico aproximadamente 2 N o con cido crmico (ver
Limpieza de Aparatos de Vidrio 1051).]
Soluciones estndar: Para preparar una solucin madre, disolver una cantidad adecuada del Estndar de Referencia USP de
un determinado antibitico o todo el contenido de un vial de Estndar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentracin especificada. Almacenar a 28 y usar dentro del periodo indicado. En
el da de la valoracin, preparar a partir de la solucin madre cinco o ms diluciones de prueba, con un aumento de concentracin entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporcin de 1:1,25. Usar el diluyente final especificado de tal manera que la mediana tenga la concentracin sugerida en la Tabla 2.
Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el da de la valoracin,
preparar una solucin madre de la misma manera que se especifica para el Estndar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solucin madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentracin nominal igual a la mediana de la
concentracin del estndar (S3).
USP 38
Tabla 2
Solucin Madre
Dilucin de Prueba
Disolvente
Inicial
Concentracin
Inicial
Diluyente
Adicional
Concentracin
Final
Usar
dentro de
Diluyente
Final
Mediana
de la
Concentracin
(S3)a,b
Anfotericina Bc,d
Dimetil sulfxido
1 mg/mL
El mismo da
B.10e
1 mg/mL
Bacitracinaf
cido clorhdrico
0,01 N
100 U/mL
El mismo da
B.1e
1 U/mL
Bleomicina
B.16e
2 U/mL
14 das
B.16e
0,04 U/mL
Carbenicilina
B.1e
1 mg/mL
14 das
B.1e
20 mg/mL
Cloxacilina
B.1e
1 mg/mL
7 das
B.1e
5 mg/mL
1 mg/mL
1 mg/mL
Antibitico
Agua
10 mg/mL
B.6e
1 mg/mL
El mismo da
B.6e
Colistina
Agua
10 mg/mL
B.6e
1 mg/mL
14 das
B.6e
Dihidrostreptomicinag
B.3e
1 mg/mL
30 das
B.3e
1 mg/mL
Eritromicina
Methanol
10 mg/mL
B.3e
1 mg/mL
14 das
B.3e
1 mg/mL
Gentamicina
B.3e
1 mg/mL
30 das
B.3e
0.1 mg/mL
Nafcilina
B.1e
1 mg/mL
2 das
B.1e
2 mg/mL
Natamicina
Dimetil sulfxido
1 mg/mL
El mismo da
B.10e
5 mg/mL
Neomicinag
B.3e
1 mg/mL
14 das
B.3e
1 mg/mL
0,5 mg/mL
alcohol
10 mg/mL
B.3e
1 mg/mL
5 das
B.6e
Dimetilformamida
1000 U/mL
El mismo da
B.6e
20 U/mL
Paromomicina
B.3e
1 mg/mL
21 das
B.3e
1 mg/mL
Penicilina G
B.1e
1000 U/mL
4 das
B.1e
1 U/mL
Polimixina Bi
Agua
B.6e
10 000
U/mL
14 das
B.6e
10 U/mL
Sisomicina
B.3e
1 mg/mL
14 das
B.3e
0,1 mg/mL
7 das
B.4e
10 mg/mL
Novobiocina
Nistatinac,h
Vancomicina
Agua
1 mg/mL
a
b
c
d
Se puede ajustar la mediana de la concentracin para optimizar los tamaos de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
mg en esta columna se refiere a mg de actividad.
Preparar el Estndar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
Diluir adicionalmente la solucin madre con dimetil sulfxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 mg/mL antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfxido que las diluciones de prueba del Estndar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora listada en esta tabla.
f Cada una de las diluciones de prueba del estndar debe contener la misma cantidad de cido clorhdrico que la dilucin de prueba de la muestra.
g Se puede usar la valoracin turbidimtrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solucin madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las diluciones de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estndar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilucin de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estndar. Usar material de vidrio con proteccin actnica.
i Preparar la solucin madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estndar de Referencia USP.
Inculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 mL de solucin
salina SR estril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensin. Esparcir la suspensin salina sobre la superficie de
dos o ms placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 mL del medio especificado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
Despus de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 mL de solucin salina SR
estril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la seccin Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ngulo estril o perlas de vidrio estriles. Pipetear y transferir la suspensin a un frasco de vidrio
estril. sta es la suspensin de recoleccin.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensin de recoleccin con solucin salina SR estril. Usando el espectrofotmetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensin de recoleccin agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificacin del mtodo, comenzando con los volmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensin madre que se habrn de agregar al medio de inculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibicin de aproximadamente 1416 mm de dimetro para la mediana de la concentracin del estndar (S3). [NOTALos tamaos de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoracin.] Si el porcentaje de transmitancia de la dilucin est por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adicin de microorganismos a la capa de siembra. El factor de normalizacin se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de transmitancia obtenido de la dilucin. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inculo para
Captulos
Colistemetatoc
USP 38
obtener el volumen (mL) de suspensin de recoleccin que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de
inculo diariamente, si fuera necesario, para obtener una relacin de concentracinrespuesta ptima.
Alternativamente, determinar durante la verificacin del mtodo la proporcin de suspensin de recoleccin que se habr
de incorporar al inculo, comenzando con los volmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcacin satisfactoria de las zonas de inhibicin de aproximadamente 1416 mm de dimetro para la mediana de la concentracin del estndar
(S3) y que produzcan una relacin de concentracinrespuesta reproducible. Preparar el inculo agregando una porcin de
suspensin madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 4550. Agitar la mezcla por
rotacin suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensin homognea.
Tabla 3
Antibitico
Organismo de Prueba
Amfotericina B
Mediob
Temperatura
()
Tiempo
Mediob
Cantidad
(mL/100 mL)
1,0
Saccharomyces cerevisiae
9763
19
2931
48 h
19
Bacitracina
Micrococcus luteus
10240
3235
24 h
0,3
Bleomicina
Mycobacterium smegmatis
607
36
3637,5
48 h
35
1,0
Carbenicilinac
Cloxacilina
Captulos
Nmeroa
ATCC
Composicin
Sugerida del Inculo
25619
36-37,5
24 h
10
0,5
29737
3235
24 h
0,1
Colistimetato
Bordetella bronchiseptica
4617
3235
24 h
10
0,1
Colistina
4617
3235
24 h
10
0,1
Bacillus subtilis
6633
32
3235
5 das
Segn se requiera
Eritromicina
Micrococcus luteus
9341
3235
24 h
11
1,5
Gentamicina
Staphylococcus epidermidis
12228
3235
24 h
11
0,03
Nafcilina
29737
3235
24 h
0,3
Neomicina
12228
3235
24 h
11
0,4
Novobiocina
12228
3235
24 h
4,0
Nistatina
Saccharomyces cerevisiae
2601
19
2931
48 h
19
1,0
12228
3235
24 h
11
2,0
Penicilina G
29737
3235
24 h
1,0
Polimixina B
4617
3235
24 h
10
0,1
12228
3235
24 h
11
0,03
Segn se requiera
Paromomicina
Sisomicina
Vancomicina
a
b
c
Bacillus subtilis
6633
32
3235
5 das
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
Ver Medios y Soluciones, Medios.
Usar 0,5 mL de una dilucin 1:25 de la suspensin madre/100 mL de Medio 10.
Anlisis: Preparar la capa base para el nmero requerido de placas de Petri para la valoracin, usando el medio y el volumen
mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad
apropiada de inculo para la capa de siembra (Tabla 5), segn se indica para el antibitico correspondiente (Tabla 3), realizando los ajustes necesarios basndose en el anlisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrs y hacia adelante para
esparcir el inculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
Tabla 4 (capa base)
Antibitico
Medioa
Volumen
Objetivo
(mL)
Amfotericina Bb
Bleomicina
35
10
Carbenicilina
21
Colistimetato
21
Colistina
21
21
Eritromicina
11
21
Gentamicina
11
21
a
b

No se usa capa base.
[NOTALa capa base se puede entibiar para facilitar la formacin de una capa uniforme.]
USP 38
Tabla 4 (capa base) (Continuacin)
Medioa
Volumen
Objetivo
(mL)
Neomicina
11
21
Nistatinab
Paromomicina
11
21
Polimixina B
21
Sisomicina
11
21
Vancomicina
10
Todos los dems
21
Antibitico
a
b

No se usa capa base.
[NOTALa capa base se puede entibiar para facilitar la formacin de una capa uniforme.]
Tabla 5 (capa de siembra)
Antibitico
Amfotericina B
Medioa
Volumen
Objetivo
(mL)
Referirse a la Tabla 3
8
6
Nistatina
Todos los dems
Dejar caer seis cilindros de valoracin sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una gua mecnica u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contaminacin. Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibitico que contengan los niveles de prueba (S1S5 y U3) especificados en el prrafo siguiente. Incubar las placas segn se especifica en la Tabla 6 durante 1618 horas y retirar los cilindros.
Medir y registrar el dimetro de cada zona de inhibicin del crecimiento con una aproximacin de 0,1 mm.
Tabla 6
Antibitico
Amfotericina B
Temperatura de Incubacin ()
29-31
Carbenicilina
3637,5
Colistimetato
3637,5
Colistina
3637,5
3637,5
Gentamicina
3637,5
Neomicina
3637,5
Novobiocina
Nistatina
34-36
29-31
Paromomicina
3637,5
Polimixina B
3637,5
Sisomicina
3637,5
Vancomicina
3637,5
Todos los dems
32-35
Se usarn durante la valoracin los estndares (S1S5) y un solo nivel de prueba de la muestra (U3) correspondiente a S3 de la
curva estndar, segn se definen en Soluciones estndar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estndar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilucin correspondiente a la mediana de la dilucin de prueba (S3) del estndar y cada uno de
los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estndar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estndar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilucin correspondiente a la
mediana de la dilucin de prueba (S3) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilucin de prueba correspondiente (U3)
de la muestra.
Captulos
Bleomicina
USP 38
Captulos
Mtodo Turbidimtrico
Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura especificados en la Tabla 8. [NOTAEl control de la temperatura se puede lograr con circulacin de aire o agua. La mayor
capacidad trmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
Espectrofotmetro: La medicin de la absorbancia o transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requiere un espectrofotmetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530
nm. Como alternativa, se puede usar un espectrofotmetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de
580 nm o 530 nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubacin (ver Aparato a continuacin).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rpido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un anlisis de flujo continuo.
Ajustar automticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado segn las especificaciones de cada antibitico, incluyendo la misma cantidad de dilucin de prueba (incluyendo formaldehdo si se especifica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparacin de los inculos se puede medir tanto la absorbancia como la transmitancia.
Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plstico, p.ej., de 16 125 mm o de 18 150 mm. [NOTAUsar tubos que tengan
una longitud, dimetro y espesor relativamente uniformes y que estn exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el
espectrofotmetro, usar tubos idnticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar todos los residuos de antibitico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.]
Soluciones estndar: Para preparar una solucin madre, disolver una cantidad del Estndar de Referencia USP de un antibitico determinado o todo el contenido de un vial de Estndar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentracin requerida. Almacenar a 28 y usar dentro del periodo indicado. En el da de
la valoracin, preparar a partir de la solucin madre cinco o ms diluciones de prueba, con un aumento de concentracin entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporcin de 1:1,25. [NOTAPuede ser necesario usar relaciones ms pequeas para diluciones sucesivas de la solucin madre para la valoracin turbidimtrica.] Usar el diluyente final especificado de
manera tal que la mediana de los niveles del estndar (S3) tenga la concentracin sugerida en la Tabla 7.
Soluciones muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el da de
la valoracin, preparar una solucin madre de la misma manera que se especifica para el Estndar de Referencia USP (Tabla 7).
Diluir la solucin madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentracin nominal igual a la mediana de la
concentracin del estndar (S3) segn se especifica en la Tabla 7.
Tabla 7
Solucin Madre
Antibitico
Disolvente
Inicial
Concentracin
Inicial
Dilucin de Prueba
Diluyente
Adicional
Concentracin
Madre Final
Usar
Dentro
de
Diluyente
Final
Mediana de la
Concentracin
(S3)a
100 mg/mL
Capreomicina
Agua
1 mg/mL
7 das
Agua
Cloranfenicol
Alcohol
10 mg/mL
Agua
1 mg/mL
30 das
Agua
2,5 mg/mL
cido clorhdrico 0,01 N
1 mg/mL
4 das
Agua
0,06 mg/mL
Clortetraciclina
Dihidroestreptomicinab
Gramicidina
Agua
1 mg/mL
30 das
Agua
30 mg/mL
Alcohol
1 mg/mL
30 das
Alcohol
0,04 mg/mL
Neomicinab,d
B.3c
100 mg/mL
14 das
B.3c
1,0 mg/mL
Oxitetraciclina
1 mg/mL
4 das
Agua
0,24 mg/mL
Tetraciclina
1 mg/mL
1 da
Agua
0,24 mg/mL
1 U/mL
El mismo
da
Dimetil
sulfxido
0,80 U/mL
1 mg/mL
El mismo
da
Agua
25 mg/mL
Tioestreptona
Dimetil sulfxido
Troleandomicina
a
b
c
Alcohol isoproplico y agua

(4:1)

Se puede usar la valoracin en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora listada en esta tabla.
d Diluir la solucin madre de 100 mg/mL con Solucin amortiguadora B.3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 mg/mL de neomicina. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 mL de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 mL. Agregar 5,0 mL de cido clorhdrico 0,01 N a cada
matraz, diluir con Solucin amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 mg/mL de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta estndar.
USP 38
Tabla 7 (Continuacin)
Solucin Madre
Antibitico
Disolvente
Inicial
Concentracin
Inicial
Metanol
10 mg/mL
Tilosina
Dilucin de Prueba
Diluyente
Adicional
Concentracin
Madre Final
Usar
Dentro
de
B.16c
1 mg/mL
30 das
Diluyente
Final
Metanol y
B.3c (1:1)
Mediana de la
Concentracin
(S3)a
4 mg/mL
a
b
c

Se puede usar la valoracin en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora listada en esta tabla.
d Diluir la solucin madre de 100 mg/mL con Solucin amortiguadora B.3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 mg/mL de neomicina. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 mL de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 mL. Agregar 5,0 mL de cido clorhdrico 0,01 N a cada
matraz, diluir con Solucin amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 mg/mL de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta estndar.
Tabla 8
Composicin
Sugerida del Inculo
Antibitico
Mediob
Temperatura
()
Tiempo
Mediob
Cantidad
(mL/100 mL)
Capreomicina
Klebsiella pneumoniae
10031
3637,5
1624 h
0,05
Cloranfenicol
Escherichia coli
10536
32-35
24 h
0,7
29737
32-35
24 h
0,1
Clortetraciclina
Gramicidina
10031
3637,5
1624 h
0,1
Enterococcus hirae
10541
3637,5
1618 h
1,0
Neomicina
10031
3637,5
1624 h
39
Oxitetraciclina
29737
32-35
24 h
0,1
Tetraciclina
29737
32-35
24 h
0,1
Enterococcus hirae
10541
40
3637,5
1824 h
41
0,2
Troleandomicina
10031
3637,5
1624 h
0,1
Tilosina
9144
35-39
1618 h
39
2-3
Tioestreptona
a
b
Organismo de prueba
Nmero
ATCCa
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
Tabla 9
Antibitico
Absorbancia,
No menos de (u.a.)
Capreomicina
0,4
Clortetraciclina
0,35
Gramicidina
0,35
Tetraciclina
0,35
Todos los dems
0,3
Captulos
Inculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 mL de solucin
salina SR estril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensin. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y Staphylococcus
aureus (ATCC 9144) se cultivan en un medio lquido, no en agar. Esparcir la suspensin salina sobre la superficie de dos o ms
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 mL del medio especificado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea
evidente.
Despus de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 mL de solucin salina SR
estril, usando una varilla de vidrio doblada en ngulo estril o perlas de vidrio estriles. Pipetear y transferir la suspensin a un
frasco de vidrio estril. sta es la suspensin de recoleccin.
Determinar durante la verificacin del mtodo la cantidad de suspensin de recoleccin que se usar como el inculo, comenzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar tambin una S3 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 11. Ajustar la cantidad de inculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relacin de concentracin-respuesta ptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoracin. Una vez
completados los periodos de incubacin especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentracin del estndar
deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duracin exacta de la incubacin, observando el crecimiento en la concentracin de referencia (mediana de la concentracin) del estndar (S3).
USP 38
Anlisis: En el da de la valoracin, preparar la concentracin necesaria de antibitico, diluyendo soluciones madre del estndar y de cada una de las muestras, segn se especifica en Soluciones estndar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de
prueba, cada uno por triplicado, del estndar (S1S5) y un solo nivel de prueba (U3), tambin por triplicado, de hasta 20 muestras correspondientes a S3 (mediana de la concentracin) del estndar.
Tabla 10
Volumen de
Dilucin de
Prueba
(mL)
Antibitico
Volumen de
Inculo
(mL)
Gramicidina
0,10
9,0
Tioestreptona
0,10
10,0
Tilosina
0,10
9,0
Todos los dems
1,0
9,0
Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 12 tubos de control que contengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibitico. Agregar los volmenes de las diluciones de prueba
del estndar y de la muestra, segn se indica en la Tabla 10. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los controles, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inculo especificado en la Tabla 10 a cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un bao de agua mantenidos a 36,0-37,5
ERR (01-abr-2014) durante el tiempo especificado en la Tabla 11.
Captulos
Tabla 11
Tiempo de Incubacin
(h)
Antibitico
Capreomicina
3-4
Cloranfenicol
3-4
Cicloserina
3-4
3-4
Estreptomicina
3-4
Troleandomicina
3-4
Tilosina
3-5
Todos los dems
4-5
Despus de la incubacin, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 mL de formaldehdo diluido
a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un bao de agua a 8090 durante 26 minutos o en
un bao de vapor durante 510 minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 580
nm, analizando una gradilla cada vez.
Medios y Soluciones
Los medios requeridos para la preparacin de los inculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes
listados en esta seccin. Se permiten pequeas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar medios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equivalentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estndar similar.
Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidrxido de sodio 1 N o cido clorhdrico 1 N, segn se requiera, de modo que, despus de la esterilizacin con vapor, el pH sea el especificado.
Medio 1
Peptona
6,0 g
Digerido pancretico de casena
4,0 g
Extracto de levadura
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
pH despus de la esterilizacin
6,6 0,1
Medio 2
Peptona
6,0 g
3,0 g
USP 38

Medio 2 (Continuacin)
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
6,6 0,1
Medio 3
Peptona
5,0 g
1,5 g
Extracto de carne
1,5 g
Cloruro de sodio
3,5 g
Dextrosa
1,0 g
3,68 g
Fosfato monobsico de potasio
1,32 g
Agua
1000 mL
7,0 0,05
Medio 4
6,0 g
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
6,6 0,1
Medio 5
Peptona
6,0 g
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
7,9 0,1
Medio 8
Peptona
6,0 g
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
5,9 0,1
Medio 9
17,0 g
Digerido papanico de soja
3,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Fosfato dibsico de potasio
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Agar
20,0 g
Agua
1000 mL
7,2 0,1
Medio 10
17,0 g
3,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Fosfato dibsico de potasio
2,5 g
Dextrosa
2,5 g
Captulos
Peptona
USP 38
Medio 10 (Continuacin)
Agar
12,0 g
Agua
1000 mL
Polisorbato 80 (agregado despus de calentar a ebullicin el medio para disolver el agar)

10 mL
7,2 0,1
Medio 11
Peptona
6,0 g
4,0 g
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
8,3 0,1
Captulos
Medio 13
Peptona
10,0 g
Dextrosa
20,0 g
Agua
1000 mL
5,6 0,1
Medio 19
Peptona
9,4 g
4,7 g
Extracto de carne
2,4 g
Cloruro de sodio
10,0 g
Dextrosa
10,0 g
Agar
23,5 g
Agua
1000 mL
6,1 0,1
Medio 32
Peptona
6,0 g
4,0 g
3,0 g
Extracto de carne
1,5 g
Sulfato de manganeso
0,3 g
Dextrosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
6,6 0,1
Medio 34
Glicerol
10,0 g
Peptona
10,0 g
Extracto de carne
10,0 g
Cloruro de sodio
3,0 g
Agua
1000 mL
7,0 0,1
USP 38
Medio 35
Glicerol
10,0 g
Peptona
10,0 g
Extracto de carne
10,0 g
Cloruro de sodio
3,0 g
Agar
17,0 g
Agua
1000 mL
7,0 0,1
Medio 36
15,0 g
5,0 g
Cloruro de sodio
5,0 g
Agar
15,0 g
Agua
1000 mL
7,3 0,1
5,0 g
1,5 g
Extracto de carne
1,5 g
Cloruro de sodio
3,5 g
Dextrosa
1,0 g
3,68 g
1,32 g
Agua
1000 mL
7,9 0,1
Medio 40
20,0 g
Polipeptona
5,0 g
Dextrosa
10,0 g
2,0 g
Polisorbato 80
0,1 g
Agar
10,0 g
Agua
1000 mL
6,7 0,2
Medio 41
9,0 g
Dextrosa
20,0 g
5,0 g
Citrato de sodio
10,0 g
1,0 g
1,0 g
Agua
1000 mL
6,8 0,1
Soluciones
Soluciones amortiguadoras: Preparar segn se indica en la Tabla 12 o por otros medios adecuados. Las soluciones amortiguadoras se esterilizan despus de su preparacin; el pH especificado en cada caso es el pH despus de la esterilizacin.
Captulos
Medio 39
Peptona
USP 38
Tabla 12. Soluciones amortiguadoras
Solucin amortiguadora
Solucin amortiguadora B.1 (1%, pH 6,0)
Concentracin de
Fosfato
Dibsico
de Potasio
(g/L)
Concentracin de
Fosfato
Monobsico
de Potasio
(g/L)
Volumen de
Hidrxido de
Potasio 10 N
(mL)
pH despus de la
Esterilizacina
6,0 0,05
Solucin amortiguadora B.3 (0,1 M, pH 8,0)
16,73
0,523
8,0 0,1
13,61
4,5 0,05
Solucin amortiguadora B.6 (10%, pH 6,0)
20
80
6,0 0,05
35
10,5 0,1
13,6
7,0 0,2
Ajustar el pH con cido fosfrico 18 N o hidrxido de potasio 10 N.
Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.

Agua: Usar Agua Purificada.
Solucin salina: Usar Solucin salina SR.
Formaldehdo diluido: Solucin de formaldehdo y agua (1:3)
Captulos
Clculos
Introduccin: La potencia del antibitico se calcula mediante la interpolacin de una recta estndar o patrn obtenida por
transformacin logartmica y ajustada por cuadrados mnimos (ver los detalles sobre los clculos a continuacin). El analista
debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibitico:
1. Las relaciones biolgicas de concentracinrespuesta por lo general no son lineales. El mtodo de potencia del antibitico
permite ajustar los datos a una lnea recta, evaluando un intervalo de concentracin estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoracin se considerarn vlidos nicamente si la potencia calculada es
80%125% de la potencia asumida al preparar la solucin madre de la muestra. Cuando la potencia calculada est fuera
del intervalo de 80%125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentracin estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra segn corresponda
y repetir la valoracin para obtener un resultado vlido.
2. El medio ms efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geomtrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoracin. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes ms pequeas realizadas a lo largo de varios das es una estimacin de potencia ms
confiable que la obtenida de una sola valoracin grande con el mismo nmero total placas o tubos. Se requieren tres o
ms valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibiticos.
3. El nmero de valoraciones requeridas para obtener una estimacin confiable de potencia del antibitico depende del intervalo de especificacin requerido y de la variabilidad de la valoracin. El clculo del lmite de confianza descrito a continuacin se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisin. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no ser posible tomar una decisin
til con respecto a si la potencia cumple con su especificacin.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estndar un valor mximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor mximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la validacin o la verificacin. Si el intervalo de confianza calculado excede este lmite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del lmite. Se debe tomar en cuenta que la decisin de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino nicamente de la incertidumbre en dicha estimacin, segn lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoracin tiene un impacto mayor en
el lmite de confianza calculado que el nmero de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los clculos para determinar la potencia de los antibiticos, as como la realizacin del
clculo de lmite de confianza. Asimismo, se presentan mtodos para calcular el error estndar con el propsito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoracin. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logartmica. El Apndice 1 proporciona frmulas para clculos manuales cuando las concentraciones estn equitativamente espaciadas en la escala
logartmica. Se pueden usar mtodos estadsticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.
Valoracin en cilindro-placa: Esta seccin detalla el anlisis de datos de muestra y la determinacin de la potencia de una
muestra desconocida, usando la valoracin en cilindro-placa.
Datos de muestra: La Tabla 13 presenta los datos de una valoracin que se usarn a manera de ejemplo a lo largo de esta
seccin. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentracin de referencia y las otras tres zonas
son para una de las otras cuatro concentraciones, segn se indican. Las otras columnas son necesarias para los clculos y se
explican ms adelante.
Paso 1: Realizar los clculos iniciales y la verificacin de aptitud de variabilidad.
USP 38
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estndar.
Ejemplo (ver la Tabla 13)
15,867 = X(16,1; 15,6; ; 15,8)
14,167 = X(14,6; 14,1; ; 14,8)
Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviacin estndar de los nueve valores de referencia y de la desviacin estndar de los nueve valores estndar. Para cada desviacin estndar, determinar la desviacin estndar relativa correspondiente.
Ejemplo: (ver la Tabla 13)
0,200 = s(16,1, , 15,8)
1,3% = (0,200/15,867) 100
0,324 = s(14,6, , 14,1)
2,3% = (0,324/14,167) 100
XC = XS (XR P)
XC = media corregida del estndar
XS = media original del estndar
XR = media de la referencia
P = punto de correccin
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 13 (S1), la correccin es:
14,022 = 14,167 (15,867 15,722) = 14,167 0,145
Paso 3: Determinar la lnea de la curva estndar.
Generar la lnea de la curva estndar, graficando las mediciones corregidas de la zona en funcin del logaritmo de los valores
de concentracin estndar. Calcular la ecuacin de la lnea de la curva estndar, realizando una regresin lineal no ponderada
estndar sobre estos valores, usando software adecuado o los clculos manuales del Apndice 1. [NOTAUsar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10 para graficar la curva estndar y determinar la ecuacin de regresin; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mnimo del coeficiente de determinacin (%R2)
para una regresin aceptable. La regresin es aceptable slo si la %R2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTAEl
lmite sugerido para el coeficiente porcentual de determinacin es no menos de 95%.]
Captulos
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor mximo aceptable para la desviacin estndar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estndar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estndar) sobrepasan este mximo predeterminado, los datos de la valoracin no sern adecuados y deben desecharse. [NOTAEl lmite sugerido para la desviacin estndar relativa es no ms de 10%.]
Paso 2: Realizar una correccin de variacin entre placas.
Esta correccin se aplica para convertir la medicin de zona promedio obtenida para cada concentracin al valor que se obtendra si la medicin de la concentracin de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de correccin:
4,00
6,25
7,8125
desconocida
S2
S4
S5
U3
15,7
15,9
15,5
1
3
15,9
15,6
16,1
15,6
3
1
15,6
15,8
1
2
15,7
15,7
2
3
15,7
3
15,8
16,0
2
1
16,1
Zona 1
(mm)
Repeticin
de Placa
15,8
15,7
15,8
15,8
15,7
15,6
15,7
15,6
15,8
15,4
15,5
15,6
15,7
15,9
15,6
Zona 3
(mm)
15,3
15,7
15,7
15,8
15,5
15,5
15,8
15,7
16,0
15,3
15,6
15,5
15,8
16,2
15,8
Zona 5
(mm)
15,678
15,722a
15,667
15,789
15,567
15,867
Media
(mm)
Referencia (S3)
0,179
0,141
0,169
0,158
0,200
SD
ste es el valor de la media de referencia general, referida ms adelante como el punto de correccin.
3,20
S1
Concentracin
Estndar
(U/mL)
1,1
0,9
1,1
1,0
1,3
%RSD
15,2
15,8
15,3
17,3
17,3
17,3
16,9
16,6
16,6
14,8
14,7
14,7
14,0
14,5
14,6
Zona
2
(mm)
15,1
15,8
15,8
17,3
17,4
17,0
16,5
16,5
16,8
15,0
14,9
15,1
14,2
14,1
14,1
Zona 4
(mm)
Tabla 13. Datos de Muestra (Valoracin en Cilindro-Placa)
Captulos
15,1
15,5
15,7
16,7
17,2
17,0
16,8
16,2
16,3
14,3
15,2
14,8
14,1
14,4
13,5
Zona 6
(mm)
Media
15,478
17,167
16,578
14,833
14,167
Media
(mm)
SD
0,307
0,224
0,233
0,265
0,324
2,0
1,3
1,4
1,8
2,3
%RSD
15,522
17,222
16,511
14,989
14,022
Media
de la Muestra
Corregida
(mm)

USP 38
USP 38
Ejemplo:
La Tabla 14 resume la porcin de la Tabla 13 requerida para esta parte del clculo.
Tabla 14
Mediciones de la
Zona Corregida
(mm)
Conjunto de
Estndares
Concentracin
(U/mL)
S1
14,022
3,2
S2
14,989
4,0
Referencia (S3)
15,722
S4
16,511
6,25
S5
17,222
7,8125
Resultados de la regresin lineal

Lnea de la curva estndar:
Z = [3,551 ln(C)] + 9,978
LU = (U a)/b
a = interseccin de la lnea de regresin
b = pendiente de la lnea de regresin
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de LU y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilucin aplicable. Este valor tambin se puede expresar como porcentaje del valor de la concentracin de referencia.
Ejemplo: Medicin corregida de la zona de la muestra (Tabla 13) = 15,522
Logaritmo natural de la concentracin de la muestra:
LU = (15,522 9,978)/3,551 = 1,561
Concentracin de la muestra:
CU = e1,561 = 4,765
Porcentaje de concentracin de referencia:
Resultado = (4,765/5,000) 100 = 95,3%
Valoracin turbidimtrica: Esta seccin detalla el anlisis de los datos de muestra y la determinacin de la potencia de una
muestra desconocida usando la valoracin turbidimtrica. El mtodo asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria
dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de temperatura que no es uniforme, se prefiere un diseo en bloques aleatorizados. En dicho diseo, la gradilla se divide en reas (bloques) de temperatura relativamente uniforme y en cada rea se coloca al menos un tubo de cada concentracin del Estndar y
de cada muestra desconocida. El anlisis de datos del diseo en bloques aleatorizados es diferente del siguiente.
Datos de muestra: La Tabla 15 presenta los datos de una valoracin que se usarn como ejemplo a lo largo de esta seccin. Se requieren otras columnas para los clculos, las cuales se explican a continuacin.
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoracin Turbidimtrica)
Estndar
S1
S2
Concentracin
(mg/mL)
64
80
Repeticin
Absorbancia
(u.a.)
0,8545
0,8422
0,8495
0,8142
0,8273
0,8392
Promedio
(u.a.)
Desviacin
Estndar
0,8487
0,0062
0,8269
0,0125
Captulos
Z = medicin de zona corregida

C = concentracin
%R2 = 99,7
Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las mediciones de la zona del estndar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variacin entre
placas, usando el punto de correccin determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desconocida, U. [NOTAUn mtodo alternativo aceptable al uso del punto de correccin consiste en corregir usando el valor en la
lnea de regresin estimada correspondiente al logaritmo de la concentracin de S3.] Usar la medicin de zona promedio corregida en la ecuacin de la lnea de la curva estndar para determinar el logaritmo de la concentracin de la muestra, LU,
mediante:
USP 38
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoracin Turbidimtrica) (Continuacin)

Concentracin
(mg/mL)
Estndar
S3
100
S4
125
S5
156
Captulos
U3
desconocida
Absorbancia
(u.a.)
Repeticin
1
0,6284
0,6947
0,7563
0,6933
0,6850
0,6699
0,5299
0,5779
0,5316
0,7130
0,7960
0,7201
Promedio
(u.a.)
Desviacin
Estndar
0,6931
0,0640
0,6827
0,0119
0,5465
0,0272
0,7430
0,0460
Paso 1: Realizar los clculos iniciales y la verificacin de aptitud de variabilidad.

Para cada concentracin (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver S1 en la Tabla 15.
0,8487 = X(0,8545; 0,8422; 0,8495)
Para cada concentracin, determinar la desviacin estndar de las tres lecturas y una desviacin estndar combinada para todas las concentraciones.
Ejemplo: Ver S1 en la Tabla 15.
0,0125 = SD(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125)2 + (0,0640)2 + (0,0119)2 + (0,0272)2]/5}1/2
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviacin estndar combinada mxima aceptable. Si la desviacin estndar combinada excede este mximo predeterminado, los datos de valoracin no son adecuados y
se deben descartar. [NOTAEl lmite sugerido para la desviacin estndar combinada es no ms de 10% del valor de absorbancia promedio a travs de las cinco concentraciones.] Si el nmero de determinaciones repetidas por concentracin es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviacin estndar relativa para cada concentracin despus de verificar valores
atpicos y comparar con una desviacin estndar relativa mxima aceptable. [NOTAEl lmite sugerido para la desviacin estndar relativa es no ms de 10%.]
Paso 2: Determinar la lnea de la curva estndar.
Generar la lnea de la curva estndar, graficando los valores de absorbancia promedio en funcin del logaritmo de los valores de concentracin del estndar. Calcular la ecuacin de la lnea de la curva estndar, realizando una regresin lineal no ponderada sobre estos valores usando software apropiado o los clculos manuales del Apndice 1. [NOTAUsar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10 para graficar la curva estndar y determinar la ecuacin de regresin; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mnimo del coeficiente porcentual de determinacin (%R2) para una regresin aceptable. La regresin es aceptable nicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor predeterminado. [NOTAEl lmite sugerido para el coeficiente porcentual de determinacin es no menos de 90%.]
Ejemplo: La Tabla 16 resume la porcin de la Tabla 15 requerida para esta parte del clculo.
Tabla 16
Conjunto de
Estndares
Valores Promedio de
Absorbancia
(u.a.)
Concentracin
(mg/mL)
64
S1
0,8487
S2
0,8269
80
S3
0,6931
100
S4
0,6827
125
S5
0,5465
156
USP 38
Resultados de la regresin lineal
Lnea de la curva estndar:
Absorbancia = 2,2665 [0,7735 log10(concentracin)]

%R2 = 93,0%
Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres mediciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, U. Usar esta medicin promedio en la ecuacin
de la lnea de la curva estndar para determinar el logaritmo de la concentracin de la muestra desconocida, LU, mediante:
LU = (U a)/b
a = interseccin de la lnea de regresin
b = pendiente de la lnea de regresin
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de LU y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilucin aplicable. Este valor tambin se puede expresar como porcentaje del valor de la concentracin de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 15) = 0,7430.
log10(CU) = (0,7430 2,2665)/( 0,7735) = 1,9696
CU = 101,9696 = 93,2
Porcentaje de concentracin de referencia = (93,2/100,0) 100 = 93,2%
antilog[M t(0,05, N 1) SD/N], antilog[M + t(0,05, N 1) SD /N]

M = promedio
SD = desviacin estndar
N = nmero de valoraciones
t(0,05, N1) = el punto del 5% de dos colas de una distribucin t de Student con N1 grados de libertad
NOTAEl valor t est disponible en hojas de clculos, textos estadsticos y software estadstico.
W = antilog{[t(0,05, N 1) SD/N]}
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor mximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el lmite de aceptacin, continuar con valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logartmica natural de
1,561; 1,444; 1,517 y 1,535. Entonces:
N=4
M = X(1,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514
SD = s(1,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050
t = 3,182
El intervalo de confianza en la escala logartmica es
1,514 (3,182 0,050/4) = (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es
e1,514 = 4,546
con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1,434, e1,594 = (4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptacin es el cociente 4,924/4,546 =
1,083.
Captulos
CU = concentracin de la muestra
Lmites de confianza y combinacin de los clculos de las valoraciones: Debido a la variabilidad entre valoraciones, se
requieren tres o ms determinaciones independientes para una estimacin confiable de la potencia de la muestra. Para cada
determinacin independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estndar como de la muestra,
preparadas por separado, y repetir la valoracin de una muestra determinada otro da.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el mtodo del Apndice 2 para verificar valores atpicos. Esta determinacin debe realizarse en la escala logartmica.
Para obtener una estimacin combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviacin estndar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTAUsar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, segn se indica a continuacin:
USP 38
Apndice 1. Frmulas para Clculos Manuales de Regresin y Concentracin de la Muestra

Cuando las concentraciones estn igualmente espaciadas en la escala logartmica, los clculos se pueden realizar usando la
siguiente frmula. Donde:
Sk = media de la medicin de zona corregida (valoracin en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoracin
turbidimtrica) para el conjunto estndar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
S = media de los cinco valores Sk
Lk = logaritmo de la concentracin k correspondiente. [NOTAUsar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10.] La
pendiente de la lnea de regresin se calcula mediante:
b = (Yalta Ybaja)/(Xalta Xbaja)
Yalta = 1/5 (3S5 + 2S4 + S3 S1)
Ybaja = 1/5 (3S1 + 2S2 + S3 S5)
Xalta = L5
Xbaja = L1
Combinar y simplificar a:
b = (4S5 + 2S4 2S2 4S1)/[5(L5 L1)]
Captulos
El logaritmo de la concentracin de la muestra se halla usando:

LU = Lreferencia + [(U S)/b]
Por ejemplo, usando los datos para la valoracin en cilindro-placa en la Tabla 13 y logaritmos naturales:
b = [(4 17,222) + (2 16,511) (2 14,989) (4 14,020)]/{5[ln(7,81)] ln(3,2)} = 3,551
S = (14,020 + 14,989 + 15,722 + 16,511 + 17,222)/5 = 15,693
Logaritmo natural de la concentracin de la muestra = ln(5) + [(15,522 15,693)/3,551] = 1,561
Concentracin de la muestra = e1,561 = 4,765
Apndice 2: Procedimiento para Verificar Valores Atpicos; Rechazo de Mediciones

Atpicas o Aberrantes
Toda medicin que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoracin deber ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medicin o tabulacin. El rechazo o la retencin arbitrarios de una
medicin aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que
se basa nicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medicin de potencia sospechada, o atpica, se puede analizar en funcin del criterio siguiente, el cual se basa en la
variacin dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribucin normal. En promedio, el criterio rechazar una observacin vlida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de y1 a yN, donde y1 es el posible valor atpico, y N es el nmero de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha (gap) relativa usando la Tabla A2-1, Prueba para Detectar Mediciones Atpicas y las frmulas siguientes:
Cuando N = 3 a 7:
G1 = (y2 y1)/(yN y1)
Cuando N = 8 a 10:
G2 = (y2 y1)/(yN 1 y1)
Cuando N = 11 a 13:
G3 = (y3 y1)/(yN 1 y1)
Si G1, G2, o G3, segn corresponda, excede el valor crtico en la Tabla A2-1, Prueba para Detectar Mediciones Atpicas, para la
N observada, existe una base estadstica para omitir la(s) medicin(es) atpica(s).
Pruebas Biolgicas / 85 Prueba de Endotoxinas Bacterianas 163
USP 38
Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atpicas

En las muestras de una poblacin normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P
= 0,01, cuando las mediciones atpicas pueden ocurrir nicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando stas pueden ocurrir en cualquiera de los
extremos.
N
G1
0,987
0,889
0,781
0,698
0,637
10
G2
0,681
0,634
0,597
11
12
13
G3
0,674
0,643
0,617
Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logartmica = 1,561; 1,444; 1,517; 1,535
Verificar la potencia ms baja para la medicin atpica:
G1 = (1,517 1,444)/(1,561 1,444) = 0,624 < 0,889
Por lo tanto, 1,444 no es una medicin atpica.
Verificar la potencia ms alta para la medicin atpica:
Por lo tanto, 1,561 no es una medicin atpica.

Las potencias atpicas deben marcarse como valores atpicos y deben excluirse de los clculos de la valoracin. No se puede
excluir ms de una potencia como medicin atpica.
85 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la
Farmacopea Japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas estn marcadas con los smbolos () para especificar dicha
situacin.
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus).
Hay tres tcnicas para esta prueba: la tcnica de coagulacin (gel-clot), la cual est basada en la formacin de gel; la tcnica
turbidimtrica, basada en la produccin de turbidez despus de la ruptura de uniones de un sustrato endgeno; y la tcnica
cromognica que se basa en el desarrollo de color despus de la ruptura de un complejo sinttico pptido-cromgeno. Efectuar la prueba con cualquiera de las tres tcnicas. En caso de duda o controversia, la decisin final se toma basndose en la
prueba de lmite de coagulacin, a menos que se indique algo diferente en la monografa del producto en anlisis. La prueba
se efecta de forma tal que se evite la contaminacin por endotoxinas.
APARATOS
Eliminar los pirgenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante
un proceso validado.1 Habitualmente se usan 30 minutos a 250 como tiempo y temperatura mnimos. Si se emplean materiales de plstico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automticos, usar los que han demostrado
estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTAEn este captulo, el trmino tubo incluye cualquier otro receptculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulacin.]
REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA

Lisado de AmebocitosUn producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere slo a un producto fabricado de conformidad con
las reglamentaciones de la autoridad competente. [NOTAEl Lisado de Amebocitos reacciona con algunos b -glucanos adems
de reaccionar con las endotoxinas. Existen preparaciones de Lisado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se pre1
Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilizacin por Calor Seco en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos
Farmacopeicos 1211. Usar un Lisado SR con una sensibilidad no menor de 0,15 Unidades de Endotoxina por mL.
Captulos
G1 = (1,561 1,535)/(1,561 1,444) = 0,222 < 0,889
164 85 Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biolgicas
USP 38
paran retirando del Lisado de Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reaccin del
factor G del Lisado de Amebocitos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)Usar Agua para Inyeccin o agua producida por otros procedimientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el lmite de deteccin del reactivo.
Lisado SRDisolver con agitacin suave el Lisado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por
el fabricante del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Captulos
PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES

Solucin Madre del Estndar de EndotoxinaPreparar una Solucin Madre del Estndar de Endotoxina a partir de un Estndar de Referencia de Endotoxina USP que haya sido calibrado con el Estndar Internacional para Endotoxinas vigente de la
OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto del empaque y en la etiqueta para la preparacin y almacenamiento de la
Solucin Madre del Estndar de Endotoxina. El contenido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA
Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]
Soluciones Estndar de EndotoxinaDespus de mezclar vigorosamente la Solucin Madre del Estndar de Endotoxina,
preparar las diluciones seriales apropiadas de la Solucin Estndar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan
pronto como sea posible para evitar la prdida de actividad por adsorcin.
Soluciones MuestraPreparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB.
Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario,
ajustar el pH de la solucin (o de la dilucin) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solucin Muestra se
encuentre dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,08,0. El pH se puede
ajustar con un cido, una base o una solucin amortiguadora adecuada segn lo recomiende el fabricante del lisado. Los cidos y las bases se pueden preparar a partir de concentrados o slidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas
detectables. Las soluciones amortiguadoras se deben validar para garantizar que estn exentas de endotoxinas y otros factores
de interferencia detectables.
DETERMINACIN DE LA MXIMA DILUCIN VLIDA (MDV)

La mxima dilucin vlida es la dilucin mxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el lmite de
endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuacin:
MDV = (lmite de endotoxina x concentracin de la Solucin Muestra)/(l)
Lmite de EndotoxinaEl lmite de endotoxina para medicamentos de administracin parenteral, definido segn la dosis,
es igual a K/M2, donde K es la dosis pirognica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y M es igual a la dosis mxima
recomendada del producto, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o
por infusin continua, M es la dosis mxima total administrada durante un periodo de una hora. El lmite de endotoxinas para
los medicamentos de administracin parenteral se especifica en la monografa individual en unidades como UE/mL, UE/mg,
UE/Unidad de actividad biolgica, etc.
Concentracin de la Solucin Muestra
mg/mL: en el caso del lmite de endotoxina especificado por peso (UE/mg);
Unidades/mL: en el caso del lmite de endotoxina especificado por unidad de actividad biolgica (UE/Unidad);
mL/mL: cuando el lmite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL).
l: la sensibilidad declarada en la Tcnica de Coagulacin (UE/mL) o la concentracin ms baja usada en la curva estndar
para la Tcnica Turbidimtrica o la Tcnica Cromognica.
TCNICA DE COAGULACIN
La tcnica de coagulacin se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basndose en la coagulacin del lisado empleado
como reactivo en presencia de endotoxina. La concentracin mnima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coagule en las condiciones estndar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la precisin como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar
factores de interferencia segn se describe en Pruebas Preparatorias.
K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier va de administracin distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
productos radiofarmacuticos que no se administren por va intratecal, el lmite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde V es la dosis mxima recomendada en mL. En el caso de radiofrmacos administrados por va intratecal, el lmite de endotoxina se obtiene mediante la frmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo
general productos oncolgicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la frmula es K/M, donde K = 100 UE/m2 y M es la dosis
mxima/m2.
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Pruebas Preparatorias
Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del LisadoConfirmar en cuatro determinaciones repetidas la sensibilidad declarada, l, expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo en la prueba. La prueba de confirmacin de sensibilidad
del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de lisado o cuando hay algn cambio en las condiciones de la
prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estndar con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2l, l,
0,5l y 0,25l, diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB.
Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alcuotas de 0,1 mL) de una de las Soluciones
Estndar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisado liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reaccin durante un perodo
constante segn las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 1 durante 60 2 minutos), evitando vibraciones. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un nico movimiento
suave, invertirlos aproximadamente a 180. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar despus de invertir los
tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera vlida cuando la concentracin ms baja de las soluciones estndar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas.
El punto final es la concentracin ms baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estndar que coagula
el lisado. Determinar la media geomtrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el
punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, segn se indica en
la siguiente frmula:
media geomtrica de la concentracin en el punto final = antilogaritmo (Se/f)
Tabla 1. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Inhibicin/Potenciacin para Tcnicas de Coagulacin
Solucin
Aa
Ninguna/Solucin Muestra
Bb
2l/Solucin Muestra
Cc
Dd
a
b
c
d
Concentracin de Endotoxina/
Solucin a la que se Agrega
Endotoxina
2l/Agua para PEB
Ninguna/Agua para PEB
Diluyente
Factor de
Dilucin
2l
1l
0,5l
0,25l
2l
1l
0,5l
0,25l
Solucin Muestra
Agua para PEB
Concentracin
de Endotoxina
Nmero de
Repeticiones
Solucin A: Una Solucin Muestra de la preparacin en anlisis que est exenta de endotoxinas detectables.
Solucin B: Prueba de interferencia.
Solucin C: Control para sensibilidad declarada del lisado.
Solucin D: Control negativo de Agua para PEB
Esta prueba se considera vlida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y D no muestran ninguna
reaccin y el resultado de la Solucin C confirma la sensibilidad declarada.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solucin B no es menor de 0,5l y no es mayor de 2l, la Solucin
Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solucin Muestra a
examinar interfiere con la prueba.
Si la muestra en anlisis no cumple con la prueba a una dilucin menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando
una dilucin mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilucin mayor de la muestra a examinar y esto puede contribuir a la eliminacin de la interferencia.
Captulos
donde Se es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y f es el
nmero de tubos de ensayo repetidos. La media geomtrica de la concentracin en el punto final es la sensibilidad medida del
lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,5l y no es mayor de 2l, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas
realizadas con este lisado.
Prueba de Factores de InterferenciaPor lo general, preparar soluciones (AD) como se muestra en la Tabla 1, y efectuar
la prueba de inhibicin o potenciacin en las Soluciones Muestra con una dilucin menor que la mxima dilucin vlida (MDV),
que no contenga endotoxinas detectables, procediendo segn se describe en Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado. La media geomtrica de las concentraciones en el punto final de las Soluciones B y C se determina usando la
frmula descrita en la Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado. La prueba de factores de interferencia deber repetirse siempre que se presenten cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prueba.
USP 38
La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtracin, neutralizacin, dilisis o calentamiento. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valoracin descrita anteriormente, utilizando la preparacin a examinar, a la que se ha agregado Estndar de Endotoxina y se ha
sometido al tratamiento seleccionado.
Prueba de Lmite
ProcedimientoPreparar las Soluciones A, B, C y D segn se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas soluciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado en
Pruebas Preparatorias.
Tabla 2. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Lmite de Coagulacin
Solucin a la que se Agrega
Endotoxina
Solucin*
Nmero de Repeticiones
Ninguna/Solucin Muestra Diluida
2l/Solucin Muestra Diluida
2l/Agua para PEB
Captulos
* Preparar la Solucin A y la Solucin B de control positivo del producto utilizando una dilucin no mayor que la MDV y tratamientos segn se indica en la Prueba
de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones B y C de control positivo contienen la Solucin Estndar de Endotoxina a una concentracin que
corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solucin D de control negativo consiste en Agua para PEB.
InterpretacinLa prueba se considera vlida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones B y C son positivas y las de la Solucin D son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la
Solucin A, la preparacin en anlisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinaciones repetidas de la Solucin A, la preparacin en anlisis no cumple con la prueba.
Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solucin A y un resultado negativo para la
otra, repetir la prueba. En la repeticin, la preparacin en anlisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en
ambas determinaciones repetidas de la Solucin A. La preparacin no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo
para una o ambas determinaciones repetidas de la Solucin A. Sin embargo, si la preparacin no cumple con la prueba a una
dilucin menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilucin mayor que no exceda la MDV.
Prueba Cuantitativa
ProcedimientoLa prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoracin volumtrica hasta
un punto final. Preparar Soluciones A, B, C y D segn se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba
de Confirmacin de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Preparatorias.
Tabla 3. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Coagulacin
Solucin
Aa
Ninguna/Solucin Muestra
Bb
2l/Solucin Muestra
Cc
2l/Agua para PEB
Dd
a
Solucin a la cual se Agrega
Endotoxina
Diluyente
Agua para PEB
Agua para PEB
Factor
de
Dilucin
Concentracin
de Endotoxina
Nmero de
Repeticiones
2l
2l
1l
0,5l
0,25l
Solucin A: Solucin Muestra en anlisis a la dilucin, que no debe exceder la MDV, con la cual se complet la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones
subsiguientes de la Solucin Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la
Solucin Muestra en anlisis a concentraciones de 1, 1/2 , 1/4 , y 1/8 con respecto a la concentracin usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar
otras diluciones hasta la MDV, segn sea necesario.
b Solucin B: Solucin A que contenga endotoxina estndar a una concentracin de 2l (control positivo del producto).
c Solucin C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estndar a una concentracin de 2l, l, 0,5l, y 0,25l, respectivamente.
d Solucin D: Agua para PEB (control negativo).
USP 38
Clculo e InterpretacinLa prueba se considera vlida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas determinaciones repetidas de la Solucin D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solucin
B de control positivo del producto son positivas; y (3) la media geomtrica de la concentracin en el punto final de la Solucin
C est comprendida en el intervalo de 0,5l a 2l.
Para determinar la concentracin de endotoxinas de la Solucin A, calcular la concentracin en el punto final para cada repeticin multiplicando cada factor de dilucin del punto final por l. La concentracin de endotoxinas en la Solucin Muestra es la
concentracin en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solucin Muestra diluida, calcular la concentracin de endotoxinas en la Solucin Muestra original multiplicando por el factor de dilucin. Si ninguna de las diluciones de la
Solucin Muestra es positiva en un ensayo vlido, informar la concentracin de endotoxina como menor que l (si se analiz la
muestra diluida, informar como menor que l multiplicado por el factor de dilucin ms bajo de la muestra). Si todas las diluciones son positivas, la concentracin de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilucin mayor por l
(p.ej., el factor de dilucin inicial multiplicado por 8 y por l en la Tabla 3).
La preparacin cumple con los requisitos de la prueba si la concentracin de endotoxinas en ambas determinaciones repetidas es menor que la especificada en la monografa individual.
TCNICAS FOTOMTRICAS CUANTITATIVAS

Tcnica Turbidimtrica
Tcnica Cromognica
Esta tcnica es una valoracin para medir el cromforo liberado de un pptido cromognico adecuado por la reaccin de las
endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoracin, esta tcnica se puede clasificar como valoracin cromognica de punto final o valoracin cromognica cintica. La valoracin cromognica de punto final se basa en la
relacin cuantitativa entre la concentracin de endotoxinas y la liberacin del cromforo al trmino de un perodo de incubacin. La valoracin cromognica cintica es un mtodo para medir el tiempo (tiempo de iniciacin) necesario para alcanzar
una absorbancia predeterminada de la mezcla de reaccin o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efecta a la temperatura de incubacin recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 1).
Pruebas Preparatorias
Con el fin de garantizar la precisin o validez de las tcnicas turbidimtricas y cromognicas, se realizan las pruebas preparatorias para verificar que los criterios para la curva estndar son vlidos y que la solucin muestra no interfiere con la prueba.
Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validacin del mtodo de
prueba.
Garanta de los Criterios para la Curva EstndarLa prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como
reactivo. Utilizando la Solucin Estndar de Endotoxina, preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del
intervalo indicado por el fabricante del lisado para generar la curva estndar. Realizar la valoracin usando por lo menos tres
determinaciones repetidas de cada concentracin de endotoxina estndar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado
(con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubacin, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los mtodos
cinticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir estndares adicionales para que cada aumento logartmico est comprendido en el intervalo de la curva estndar. El valor absoluto del coeficiente de correlacin, r, debe ser mayor o igual a 0,980
para el intervalo establecido de concentraciones de endotoxina.
Prueba para Factores de InterferenciaSeleccionar una concentracin de endotoxina en o cerca del centro de la curva
estndar de endotoxina. Preparar las Soluciones A, B, C y D segn se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Soluciones A, B, C y D al menos por duplicado, de acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta
al volumen entre la Solucin Muestra y el Lisado SR, la relacin de volumen de la Solucin Muestra y el Lisado SR, el tiempo de
incubacin, etc.
Captulos
Esta tcnica es una valoracin fotomtrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio
empleado en la valoracin, esta tcnica se puede clasificar como valoracin turbidimtrica de punto final o valoracin turbidimtrica cintica. La valoracin turbidimtrica de punto final se basa en la relacin cuantitativa entre la concentracin de endotoxinas y la turbidez (absorbancia o transmisin) de la mezcla de reaccin al trmino de un perodo de incubacin. La valoracin turbidimtrica cintica es un mtodo para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisin predeterminada de la mezcla de reaccin (tiempo de iniciacin) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efecta a la
temperatura de incubacin recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 1).
USP 38
Tabla 4. Preparacin de Soluciones para la Prueba de Inhibicin/Potenciacin para Tcnicas Fotomtricas

Solucin
Solucin a la cual se Agrega

Endotoxina
Concentracin de Endotoxina
Nmero de Repeticiones
Aa
Ninguna
Solucin Muestra
No menos de 2
Bb
Concentracin central de la curva estndar
Solucin Muestra
No menos de 2
Cc
Al menos 3 concentraciones (la concentracin ms baja se

denomina l)
Agua para PEB
No menos de 2 para cada una
Dd
Ninguna
Agua para PEB
No menos de 2
a
b
Captulos
Solucin A: Solucin Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV.

Solucin B: La preparacin en anlisis a la misma dilucin que la Solucin A, que contenga endotoxina agregada a una concentracin igual o cercana a la
concentracin central de la curva estndar.
c Solucin C: La endotoxina estndar a las concentraciones usadas en la validacin del mtodo descrito para Garanta de Criterios para la Curva Estndar en
Pruebas Preparatorias (controles positivos).
d Solucin D: Agua para PEB (control negativo).
La prueba se considera vlida cuando se cumplen las condiciones siguientes.

1. El valor absoluto del coeficiente de correlacin de la curva estndar generada usando la Solucin C es mayor o igual a
0,980.
2. El resultado de la Solucin D no excede el lmite del valor del blanco requerido en la descripcin del lisado empleado como reactivo o es menor que el lmite de deteccin de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Calcular la recuperacin media de la endotoxina agregada restando la concentracin media de endotoxina en la solucin, si
la hubiera (Solucin A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solucin B, Tabla 4). Para considerar que no presenta factores que interfieran con la valoracin en las condiciones de la prueba, la concentracin medida de endotoxina agregada a la Solucin Muestra debe estar entre 50%200% de la concentracin conocida de endotoxina agregada despus de
restar la endotoxina detectada en la solucin sin endotoxina agregada.
Cuando la recuperacin de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solucin Muestra en anlisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilucin mayor que no exceda la MDV.
Adems, la interferencia de la Solucin Muestra o de la Solucin Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar mediante un tratamiento validado apropiado, como filtracin, neutralizacin, dilisis o calentamiento. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin prdida de endotoxinas, realizar la valoracin descrita anteriormente
utilizando la preparacin a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estndar y se ha sometido posteriormente al tratamiento seleccionado.
Procedimiento de Prueba
Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.
Clculo
Calcular la concentracin de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solucin A usando la curva estndar generada con la Solucin C de control positivo. La prueba se considera vlida cuando se cumplen las tres condiciones
siguientes.
1. Los resultados de la Solucin C de control cumplen con los requisitos de validacin definidos en Garanta de Criterios para
la Curva Estndar, en Pruebas Preparatorias.
2. La recuperacin de endotoxina, calculada a partir de la concentracin encontrada en la Solucin B despus de restar la
concentracin de endotoxina encontrada en la Solucin A est dentro del intervalo de 50%200%.
3. El resultado de la Solucin D de control negativo no excede el lmite del valor del blanco requerido en la descripcin del
lisado empleado o es menor que el lmite de deteccin de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Interpretacin
En las valoraciones fotomtricas, la preparacin en anlisis cumple con la prueba si la concentracin media de endotoxinas
de las determinaciones repetidas de la Solucin A, despus de la correccin por dilucin y concentracin, es menor que el lmite de endotoxina para el producto.
USP 38
Pruebas Biolgicas / 87 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 169
87 PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLGICA, IN VITRO
1 Para ms detalles, consulte las siguientes publicaciones de la American Society for Testing and Materials, 1916 Race St., Philadelphia, PA 19103: Standard Test
Method for Agar Diffusion Cell Culture Screening for Cytotoxicity, designacin de ASTM F 895-84; Standard Practice for Direct Contact Cell Culture Evaluation
of Materials for Medical Devices, designacin de ASTM F 813-83.
Captulos
Las pruebas que se describen a continuacin han sido diseadas para determinar la reactividad biolgica de cultivos de clulas de mamferos despus de entrar en contacto con plsticos elastomricos y otros materiales polimricos que, a su vez, estn
en contacto directo o indirecto con el paciente, o de extractos especficos preparados a partir de los materiales en anlisis. Es
esencial que las pruebas se realicen en la superficie especificada. Cuando sta no se puede determinar, utilizar 0,1 g de elastmero o 0,2 g de plstico u otro material por cada mL de lquido de extraccin. Tomar precauciones en la preparacin de los
materiales para evitar la contaminacin con microorganismos y otra materia extraa.
Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusin en Agar, la Prueba de Contacto Directo y la Prueba de Elucin).1 La
decisin acerca del tipo de prueba o el nmero de pruebas a realizar para la evaluacin de la posible respuesta biolgica de
una muestra o extracto especficos depende del material, el producto final y el uso previsto. Otros factores que tambin pueden afectar la aptitud de la muestra para un uso especfico son: la composicin polimrica, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorcin, la adsorcin y la permeabilidad de los conservantes, y las condiciones de almacenamiento. La evaluacin de tales factores se debe realizar con pruebas especficas adicionales adecuadas antes de determinar si un producto fabricado a partir de un material especfico es apto para el uso previsto. Los
materiales que no cumplen con las pruebas in vitro son candidatos para las pruebas in vivo descritas en Pruebas de Reactividad
Biolgica, In Vivo 88.
Estndares de Referencia USP 11ER Polietileno de Alta Densidad USP. ER Biorreaccin Positiva USP.
Preparacin del Cultivo de ClulasPreparar mltiples cultivos de clulas de fibroblastos de mamfero L-929 (ATCC lnea
celular CCL 1, NCTC clon 929; pueden usarse lneas celulares alternativas obtenidas de un repositorio de estndares siempre
que se sometan a una validacin adecuada) en un medio de cultivo esencial mnimo suplementado con suero, con una densidad de siembra de aproximadamente 105 clulas por mL. Incubar los cultivos a 37 1 en una incubadora humidificada durante no menos de 24 horas en una atmsfera de 5 1% de dixido de carbono hasta obtener una monocapa con una confluencia superior al 80%. Observar al microscopio los cultivos preparados para asegurar que las monocapas sean uniformes y
tiendan a la confluencia. [NOTALa reproducibilidad de las Pruebas de Reactividad Biolgica In Vitro depende de la obtencin
de una densidad uniforme del cultivo celular.]
Disolventes de ExtraccinInyeccin de Cloruro de Sodio (ver monografausar una Inyeccin de Cloruro de Sodio que
contenga NaCl al 0,9%). De modo alternativo, se pueden usar medios de cultivo de clulas de mamfero sin suero o medios de
cultivo de clulas de mamfero suplementados con suero. Se usa el suplemento de suero cuando la extraccin se realiza a 37
durante 24 horas.
Aparato
AutoclaveEmplear un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 2 equipado con un termmetro, un manmetro, una llave de ventilacin, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel del
agua y un sistema de refrigeracin de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente 20, pero no
por debajo de 20, inmediatamente despus del ciclo de calentamiento.
EstufaUsar una estufa, preferentemente un modelo de conveccin mecnica, que mantenga las temperaturas de funcionamiento en un intervalo de 5070 2.
IncubadoraUsar una incubadora capaz de mantener una temperatura de 37 1 y una atmsfera humidificada de 5 1%
de dixido de carbono en el aire.
Recipientes de ExtraccinUtilizar nicamente recipientes de vidrio Tipo I, como por ejemplo, ampollas o tubos de ensayo
de cultivo con tapa de rosca, o equivalentes. En caso de utilizar tubos de ensayo para cultivo, o equivalentes, deben cerrarse
con una tapa de rosca que tenga un revestimiento elastomrico adecuado. La superficie expuesta del revestimiento elastomrico est completamente protegida con un disco slido inerte con un espesor de 5075 mm. Se puede fabricar un disco adecuado de tefln.
Preparacin del AparatoLimpiar minuciosamente todo el material de vidrio con una mezcla limpiadora de cido crmico y,
si fuera necesario, con cido ntrico caliente y luego enjuagar con Agua Estril para Inyeccin durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar mediante un proceso adecuado los recipientes y dispositivos usados para la extraccin, transferencia o administracin del material de prueba. Si se usa xido de etileno como agente esterilizante, dejar que pasen no menos de 48 horas
para la desgasificacin total.
Procedimiento
Preparacin de la Muestra para ExtractosPreparar segn se indica en Procedimiento, en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88.
Preparacin de ExtractosPreparar segn se indica para la Preparacin de Extractos, en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88 y usar la Inyeccin de Cloruro de Sodio (NaCl al 0,9%) o el medio de cultivo de clulas de mamfero sin suero como
Disolventes de Extraccin. [NOTASi la extraccin se realiza a 37 durante 24 horas en una incubadora, usar medio de cultivo
170 87 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro / Pruebas Biolgicas
USP 38
de clulas suplementado con suero. Las condiciones de extraccin no deben causar en ningn caso cambios fsicos como la
fusin o el ablandamiento de los trozos de material, excepto una ligera adherencia.]
Captulos
Prueba de Difusin en Agar

Esta prueba est diseada para cierres elastomricos de diferentes formas. La capa de agar acta como protector de las clulas y evita daos mecnicos mientras permite la difusin de las sustancias qumicas lixiviables de las muestras polimricas. Los
extractos de los materiales que se van a analizar se aplican a una pieza de papel de filtro.
Preparacin de MuestraUsar extractos preparados segn se indica o usar porciones de las muestras de prueba que tengan
superficies planas con un rea de no menos de 100 mm2.
Preparacin de Control PositivoProceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
Preparacin de Control NegativoProceder segn se indica para la Preparacin de Muestra.
ProcedimientoUsando 7 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo de Clulas,
preparar las monocapas en placas de 60 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y reemplazarlo con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no ms de 2% de agar. [NOTALa calidad
del agar debe ser adecuada para mantener el crecimiento celular. La capa de agar debe ser lo suficientemente delgada para
permitir la difusin de las sustancias qumicas lixiviables.] Colocar las superficies planas de la Preparacin de Muestra, Preparacin de Control Negativo y Preparacin de Control Positivo o sus extractos en un medio de extraccin adecuado, en cultivos duplicados, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no ms de tres muestras por placa preparada. Incubar todos
los cultivos durante no menos de 24 horas a 37 1, preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 1%
de dixido de carbono. Observar al microscopio, cada cultivo alrededor de cada Muestra, Control Negativo y Control Positivo
usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de los ResultadosLa reactividad biolgica (degeneracin y malformacin celular) se describe y clasifica en
una escala de 04 (ver la Tabla 1). Determinar las respuestas de los cultivos de clulas de la Preparacin de Muestra, la Preparacin de Control Negativo y la Preparacin de Control Positivo. El sistema de prueba de cultivos de clulas es adecuado si la respuesta observada de la Preparacin de Control Negativo es grado 0 (no reactiva) y la de la Preparacin de Control Positivo es al
menos grado 3 (moderada). La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Tabla 1. Grados de Reactividad en la Prueba de Difusin en Agar y la Prueba de Contacto Directo
Grado
Reactividad
Ninguna
Escasa
Leve
Moderada
Grave
Descripcin de la Zona de Reactividad

No se detecta zona reactiva alrededor, ni debajo de la muestra
Algunas clulas malformadas o degeneradas debajo de la muestra
Zona limitada al rea debajo de la muestra y menos de 0,45 cm alrededor de la muestra
Zona reactiva que se extiende de 0,45 cm a 1,0 cm alrededor de la muestra
Zona reactiva que se extiende ms de 1,0 cm alrededor de la muestra
Prueba de Contacto Directo

Esta prueba est diseada para materiales de diferentes formas. Este procedimiento permite la extraccin y el anlisis simultneos de sustancias qumicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero. El procedimiento no es adecuado para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daos mecnicos a las clulas.
Preparacin de MuestraUsar porciones de la muestra de prueba que tenga superficies planas con un rea de no menos de
100 mm2.
ProcedimientoUsando 2 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo de Clulas,
preparar las monocapas en placas de 35 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de los cultivos
y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recin preparado. Colocar una nica Preparacin de Muestra, una Preparacin
de Control Negativo y una Preparacin de Control Positivo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos los cultivos durante no menos de 24 horas a 37 1 en una incubadora humidificada que contenga 5 1% de dixido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparacin de Muestra, Preparacin de Control Negativo y Preparacin de Control Positivo, usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de los ResultadosProceder segn se indica para la Interpretacin de los Resultados en Prueba de Difusin en
Agar. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no es mayor que grado 2
(levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Pruebas Biolgicas / 88 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 171
USP 38
Prueba de Elucin
Tabla 2. Grados de Reactividad en la Prueba de Elucin

Grado
Reactividad
Ninguna
Escasa
Leve
Moderada
Grave
Condiciones de todos los Cultivos

Grnulos intracitoplasmticos diferenciados sin lisis celular
El 20% o menos de las clulas son redondas, levemente adheridas, sin grnulos intracitoplasmticos; hay algunas clulas lisadas
Ms del 20% pero menos o hasta el 50% de las clulas son redondas y desprovistas de grnulos intracitoplasmticos; no hay lisis celular extensiva ni reas vacas entre clulas
Ms del 50% pero menos del 70% de las capas celulares contienen clulas redondas o lisadas
Destruccin casi total de las capas celulares
88 PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLGICA, IN VIVO

Las siguientes pruebas estn diseadas para determinar la respuesta biolgica de animales a materiales elastomricos, plsticos y otros materiales polimricos en contacto directo o indirecto con el paciente, o mediante la inyeccin de extractos especficos preparados a partir del material en anlisis. Es esencial conocer el rea especfica para la extraccin. Cuando sta no se
puede determinar, utilizar 0,1 g de elastmero o 0,2 g de plstico u otro material por cada mL de lquido de extraccin. Tambin es fundamental tomar las precauciones necesarias en la preparacin de los materiales que se van a inyectar o instilar para
evitar la contaminacin con microorganismos y otra materia extraa. Se describen tres pruebas. La Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba Intracutnea se utilizan para materiales elastomricos, especialmente para cierres elastomricos para los que las
Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 correspondientes han indicado una reactividad biolgica significativa. Estas dos
pruebas se utilizan para plsticos y otros polmeros adems de una tercera prueba, la Prueba de Implantacin, para probar la
aptitud de estos materiales destinados a la fabricacin de envases y accesorios, para uso en preparaciones parenterales y en
dispositivos mdicos, implantes y otros sistemas.
Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos mdicos, cuando existe la necesidad de clasificar los plsticos y otros
polmeros basndose en las pruebas de reactividad biolgica in vivo.
A los efectos de este captulo, se aplicarn las siguientes definiciones: la Muestra es la muestra en anlisis o un extracto preparado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio de extraccin usado para extraer
la muestra en anlisis, tratado de la misma manera que el medio de extraccin que contiene dicha muestra. Un Control Negativo1 es una muestra que no produce ninguna reaccin en las condiciones de prueba.
1
ER Polietileno de Alta Densidad USP.
Captulos
Esta prueba est diseada para la evaluacin de extractos de materiales polimricos. El procedimiento permite la extraccin
de muestras a temperaturas fisiolgicas o no fisiolgicas para distintos intervalos de tiempo. Es adecuada para materiales de
alta densidad y para evaluaciones de respuesta a la dosis.
Preparacin de MuestraPreparar segn se indica en la Preparacin de Extractos, usando una Inyeccin de Cloruro de Sodio
(NaCl al 0,9%) o un medio de cultivo de clulas de mamfero sin suero como Disolventes de Extraccin. Si el tamao de la
Muestra no se puede determinar inmediatamente, usar no menos de 0,1 g de material elastomrico o 0,2 g de material plstico o polimrico por mL de medio de extraccin. De modo alternativo, usar un medio de cultivo de clulas de mamfero suplementado con suero como medio de extraccin para simular mejor las condiciones fisiolgicas. Preparar los extractos calentando la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5 1% de dixido de carbono. Mantener la temperatura de
extraccin a 37 1, ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las protenas sricas.
ProcedimientoUsando 2 mL de suspensin de clulas preparada segn se indica en la Preparacin del Cultivo Celular, preparar las monocapas en placas de 35 mm de dimetro. Despus de la incubacin, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y
reemplazarlo con extractos de la Preparacin de Muestra, Preparacin de Control Negativo o Preparacin de Control Positivo. Los
extractos de los medios de cultivo de clulas suplementados con suero y sin suero se analizan por duplicado sin dilucin
(100%). El extracto con Inyeccin de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de clulas suplementado con suero y
se analiza por duplicado a una concentracin del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos durante 48 horas a 37 1,
preferentemente en una incubadora humidificada que contenga 5 1% de dixido de carbono. Observar al microscopio cada
cultivo a las 48 horas, usando una tincin adecuada, si se desea.
Interpretacin de los ResultadosProceder segn se indica para la Interpretacin de los Resultados en Prueba de Difusin en
Agar, pero usando la Tabla 2. La Muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparacin de Muestra no
es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para realizar evaluaciones de la respuesta a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
172 88 Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo / Pruebas Biolgicas
USP 38
CLASIFICACIN DE PLSTICOS
Se definen seis Clases de Plsticos (ver la Tabla 1). Esta clasificacin se basa en las respuestas a una serie de pruebas in vivo
para las que se especifican extractos, materiales y vas de administracin. Estas pruebas estn directamente relacionadas con el
uso final al que estn destinados los artculos de plstico. La eleccin de extractantes es representativa de los vehculos en preparaciones con las que es probable que los plsticos entren en contacto. La clasificacin de la Tabla 1 facilita la comunicacin
entre proveedores, usuarios y fabricantes de plsticos ya que resume las pruebas a las que deben someterse los envases de
inyectables y dispositivos mdicos cuando es necesaria su clasificacin.
Tabla 1. Clasificacin de Plsticos
Clases de Plsticoa
Pruebas por Realizar
II
III
IV
VI
Captulos
Material de Prueba
Extracto de Muestra en Inyeccin de Cloruro de Sodio
Extracto de Muestra en Solucin 1 en 20
de Alcohol en Inyeccin de Cloruro de Sodio
Extracto de Muestra en Polietilenglicol
400
Extracto de Muestra en Aceite Vegetal
Tiras de implante de Muestra
Implante de Muestra
Dosis
Procedimientob
Ratn
50 mL/kg
A(IV)
Conejo o Cobayo
0,2 mL/animal en cada

uno de 10 6 sitios
B(IC)
Ratn
50 mL/kg
A(IP)
Conejo o Cobayo

uno de 10 6 sitios
B (IC)
Ratn
10 g/kg
A (IP)
Conejo o Cobayo

uno de 10 6 sitios
B(IC)
Ratn
50 mL/kg
A (IP)
Conejo o Cobayo

uno de 10 6 sitios
B(IC)
Conejo
4 tiras/animal
Rata
2 Muestras/animal
Animal
a
b
Las pruebas requeridas para cada clase de plstico se indican con una x en las columnas correspondientes.
Leyenda: A (IP)Prueba de Inyeccin Sistmica (intraperitoneal); A (IV)Prueba de Inyeccin Sistmica (intravenosa); B (IC)Prueba Intracutnea (intracutnea); CPrueba de Implantacin (implantacin intramuscular o subcutnea).
Con excepcin de la Prueba de Implantacin, los procedimientos se basan en el uso de extractos que, segn la resistencia
trmica del material, se preparan a una de las tres temperaturas estndar: 50, 70 y 121. Por lo tanto, la designacin del tipo
de plstico debe estar acompaada por una indicacin de la temperatura de extraccin (p.ej., IV-121, que representa un plstico clase IV extrado a 121 o I-50, que representa un plstico clase I extrado a 50).
Los plsticos pueden clasificarse como Clases de Plstico USP IVI nicamente sobre la base de los criterios de respuesta prescritos en la Tabla 1.
Esta clasificacin no es vlida para plsticos destinados al uso como envases de productos orales o tpicos o que pudieran
utilizarse como una parte integral de la formulacin de un medicamento. La Tabla 1 no es vlida para elastmeros naturales,
los cuales deben analizarse con Inyeccin de Cloruro de Sodio y aceites vegetales nicamente.
La Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba Intracutnea estn diseadas para determinar las respuestas biolgicas sistmica
y local, respectivamente, de animales a plsticos y otros polmeros mediante la inyeccin monodosis de extractos especficos
preparados a partir de una Muestra. La Prueba de Implantacin est diseada para evaluar la reaccin del tejido vivo al plstico
y a otros polmeros mediante la implantacin de la Muestra propiamente dicha en el tejido animal. Para la realizacin de la
Prueba de Implantacin, son importantes la preparacin y la colocacin adecuadas de las muestras en condiciones aspticas.
Estas pruebas estn diseadas para la aplicacin de plsticos y otros polmeros en la condicin en la que se utilizan. Si el
material va a exponerse a cualquier proceso de limpieza o esterilizacin antes de su uso final, las pruebas deben realizarse con
una Muestra preparada a partir de una muestra preacondicionada mediante el mismo procesamiento.
Ciertos factores, como por ejemplo la composicin del material, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el contacto con los medios, tintas, adhesivos, absorcin, adsorcin y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacenamiento tambin pueden afectar la aptitud de un material para un uso especfico. Para determinar la aptitud de un material
para su uso indicado, deben evaluarse estos factores mediante pruebas especficas adicionales.
Estndares de Referencia USP 11ER Polietileno de Alta Densidad USP.
Medios de Extraccin
INYECCIN DE CLORURO DE SODIO (ver la monografa). Usar Inyeccin de Cloruro de Sodio que contenga NaCl al 0,9%.
SOLUCIN 1 EN 20 DE ALCOHOL EN INYECCIN DE CLORURO DE SODIO
(ver la monografa).
Aceite de Ssamo recin refinado (ver la monografa) o Aceite de Semilla de Algodn (ver la monografa) u otros aceites vegetales adecuados.
VEHCULO DEL PRODUCTO FARMACUTICO (donde corresponda).
AGUA PARA INYECCIN (ver la monografa).
POLIETILENGLICOL 400
ACEITE VEGETALUsar
USP 38
NOTAEl Aceite de Ssamo o el Aceite de Semilla de Algodn u otros aceites vegetales cumplen con los siguientes requisitos
adicionales. Obtener, si es posible, aceite recientemente refinado. Usar tres animales debidamente preparados e inyectar el
aceite por va intracutnea en una dosis de 0,2 mL en 10 sitios por animal y observar los animales a las 24, 48 y 72 horas
despus de la inyeccin. Calificar las observaciones en cada sitio con la escala numrica indicada en la Tabla 2. Para los 3 conejos o cobayos (30 18 sitios de inyeccin), en cualquier momento de observacin, la respuesta promedio para eritema no es
mayor de 0,5 y para edema no es mayor de 1,0; y ningn sitio muestra una reaccin tisular de ms de 10 mm de dimetro
general. El residuo de aceite en el lugar de la inyeccin no debe confundirse con edema. El tejido edematoso se blanquea al
presionarlo suavemente.
Tabla 2. Evaluacin de las Reacciones Cutneasa
Eritema y Formacin de Escaras
Puntaje
Ausencia de eritema
Eritema muy leve (apenas perceptible)
Eritema bien definido
Eritema de moderado a grave
Eritema grave (rojo intenso) a leve formacin de escaras (lesiones profundas)
Formacin de Edemab
Puntaje
Ausencia de edema
Edema muy leve (apenas perceptible)
1
2
3
Edema grave (ms de 1 mm de elevacin y extendido ms all del rea de exposicin)
Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J
Pharmacol Exp Ther 1944;82:377390.
b Excluye edemas no inflamatorios (mecnicos) del blanco o lquido de extraccin.
AparatosLos aparatos requeridos para las pruebas incluyen los siguientes.

AUTOCLAVEUsar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 2,0, equipado con un termmetro, un medidor de presin, una llave de ventilacin, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel
del agua y un sistema enfriador de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente, pero no por
debajo de 20 inmediatamente despus del ciclo de calentamiento.
ESTUFAUsar una estufa, preferentemente un modelo de circulacin forzada, que mantenga las temperaturas de funcionamiento de 50 o 70 2.
RECIPIENTES DE EXTRACCINUsar nicamente recipientes, como ampollas o tubos de ensayo para cultivo de vidrio Tipo I con
tapa de rosca. En caso de usarse, los tubos de ensayo para cultivo deben cerrarse con tapas de rosca que tengan revestimientos elastomricos adecuados. La superficie expuesta del revestimiento elastomrico est completamente protegida con un disco slido inerte con un espesor de 0,050,075 mm. Puede fabricarse un disco adecuado a partir de una resina de tefln.
Preparacin del AparatoLimpiar minuciosamente todos los elementos de vidrio con mezcla limpiadora de cido crmico
o, si fuera necesario, con cido ntrico caliente y luego enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Limpiar los utensilios para cortar con un mtodo adecuado (por ejemplo, limpieza sucesiva con acetona y cloruro de metileno) antes de utilizarlos para subdividir una muestra. Limpiar todos los dems equipos cepillndolos minuciosamente con un detergente adecuado
y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para la extraccin, transferencia y administracin de material de prueba
con un proceso adecuado. [NOTASi se usa xido de etileno como agente esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente
para la desgasificacin total.]
Procedimiento
PREPARACIN DE LA MUESTRATanto la Prueba de Inyeccin Sistmica como la Prueba Intracutnea pueden realizarse utilizando
el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos diferentes para cada prueba. Seleccionar y subdividir en porciones una Muestra del tamao indicado en la Tabla 3. Eliminar las partculas, como pelusas y partculas sueltas, tratando cada
Muestra subdividida o Control Negativo del siguiente modo. Colocar la Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL
con tapn de vidrio Tipo I y agregar aproximadamente 70 mL de Agua para Inyeccin. Agitar aproximadamente 30 segundos y
escurrir el agua. Repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extraccin con Aceite Vegetal en una estufa a una temperatura mxima de 50. [NOTANo limpiar la Muestra con un pao seco o hmedo ni enjuagando o lavando con un disolvente orgnico, agente tensoactivo, etc.]
Captulos
Edema leve (los bordes estn bien definidos con una elevacin clara)
Edema moderado (aproximadamente 1 mm de elevacin)
USP 38
Tabla 3. Superficie de la Muestra a Utilizara

Forma del Material
Pelcula o lmina
Espesor
Cantidad de Muestra por cada 20 mL de Medio de

Extraccin
Subdividida en
<0,5 mm
Equivalente a 120 cm2 de superficie total (ambos lados

combinados)
Tiras de aprox. 5
0,3 cm
0,51 mm
Equivalente a 60 cm2 de superficie total (ambos lados

combinados)
<0,5 mm (pared)
Longitud (en cm) = 120 cm2 /(suma de las circunferencias

del DI y DE)
0,51 mm (pared)
Longitud (en cm) = 60 cm2 /(suma de circunferencias del

DI y DE)
Placas, tubos y elementos moldeados
>1 mm
Equivalente a 60 cm2 de superficie total (todas las superficies expuestas combinadas)
Piezas hasta aprox. 5

0,3 cm
>1 mm
Equivalente a 25 cm2 de superficie total (todas las superficies expuestas combinadas)
No subdividirb
Elastmeros
Tubos
Secciones de aprox.
5 0,3 cm
Captulos
Cuando la superficie no se puede determinar debido a la configuracin de la muestra, usar 0,1 g de elastmero o 0,2 g de plstico u otros polmeros por cada
mL de lquido de extraccin.
b Los cierres elastomricos moldeados se prueban intactos.
PREPARACIN DE EXTRACTOSColocar una Muestra debidamente preparada para su anlisis en un recipiente de extraccin y
agregar 20 mL del medio de extraccin adecuado. Repetir estas indicaciones para cada medio de extraccin requerido para la
prueba. Preparar tambin un blanco de 20 mL de cada medio para inyecciones paralelas y comparaciones. Extraer calentando
en un autoclave a 121 durante 60 minutos, en una estufa a 70 durante 24 horas o a 50 durante 72 horas. Dejar transcurrir
suficiente tiempo para que el lquido que se encuentra dentro del recipiente alcance la temperatura de extraccin. [NOTALas
condiciones de extraccin no deberan en ningn caso causar cambios fsicos, como fusin o ablandamiento de los trozos de
Muestra, lo cual provocara una reduccin de la superficie disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Agregar siempre las piezas limpias al medio de extraccin en forma individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones en
autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma adecuada con cinta sensible a la presin.]
Enfriar hasta una temperatura cercana a la ambiente pero no inferior a 20, agitar vigorosamente durante varios minutos y
decantar cada extracto de inmediato en un recipiente seco estril, tomando las precauciones aspticas pertinentes. Almacenar
los extractos a una temperatura de 2030 y no utilizar para las pruebas despus de transcurridas 24 horas. Es importante el
contacto del medio de extraccin con la superficie disponible del plstico y el tiempo y la temperatura durante la extraccin, el
enfriamiento adecuado, la agitacin y el proceso de decantacin, as como la manipulacin y almacenamiento asptico de los
extractos despus de la extraccin.
PRUEBA DE INYECCIN SISTMICA

Esta prueba est diseada para evaluar respuestas sistmicas a los extractos de materiales en anlisis despus de su inyeccin
en ratones. Pueden usarse vas alternativas de inyeccin, si se justifican.
Animales de PruebaUtilizar ratones albinos sanos que pesen de 1723 g y que no hayan sido utilizados previamente.
Para cada grupo de prueba, utilizar nicamente ratones del mismo origen. Suministrar agua y comida ad lbitum, del tipo normalmente utilizado para animales de laboratorio y de composicin conocida.
Procedimiento[NOTAAgitar cada extracto vigorosamente antes de retirar las dosis de inyeccin para asegurar la distribucin uniforme de la materia extrada.] Inyectar a cada uno de los cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco
segn se indica en la Tabla 4, excepto que se debe diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y
el Blanco correspondiente con 4,1 volmenes de Inyeccin de Cloruro de Sodio para obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 200 mg de polietilenglicol por mL.
Tabla 4. Procedimiento de InyeccinPrueba de Inyeccin Sistmica
Extracto o Blanco
Dosis por kg
Vaa
Inyeccin de Cloruro de Sodio
50 mL
IV
Solucin 1 en 20 de Alcohol en Inyeccin de Cloruro de Sodio
50 mL
IV
Polietilenglicol 400
10 g
IP
Vehculo del producto farmacutico (cuando corresponda)
50 mL
IV
50 mL
IP
Aceite Vegetal
50 mL
IP
IV = intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleaginosa y blanco).
Observar a los animales de inmediato despus de la inyeccin, nuevamente 4 horas despus de la inyeccin y luego a las 24,
48 y 72 horas como mnimo. Si durante el perodo de observacin ninguno de los animales tratados con el extracto de la
Muestra evidencia una reactividad biolgica significativamente mayor que los animales tratados con el Blanco, la Muestra cumple con los requisitos de esta prueba. Si dos o ms ratones mueren, o si se produce una conducta anormal, como por ejemplo
USP 38
convulsiones o postracin, en dos o ms ratones, o si se registra una prdida de peso de ms de 2 g en tres o ms ratones, la
Muestra no cumple con los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con la Muestra slo presenta signos
leves de reactividad biolgica y no ms de un (1) animal presenta sntomas de marcada reactividad biolgica o muere, repetir
la prueba utilizando grupos de 10 ratones. Al repetir la prueba, los 10 animales tratados con la Muestra no presentan reactividad biolgica significativa superior a la de los animales tratados con el Blanco durante el perodo de observacin.
PRUEBA INTRACUTNEA
Tabla 5. Prueba Intracutnea

Nmero de Sitios
(por animal)
Dosis
(mL por sitio)
Muestra
200
Blanco
200
Extracto o Blanco
Examinar los sitios de inyeccin en busca de evidencia de cualquier reaccin del tejido, como por ejemplo eritema, edema y
necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los
sitios de inyeccin. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas despus de la inyeccin. Calificar las observaciones en una
escala numrica para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Volver a esquilar el pelaje segn sea necesario durante el perodo de observacin. Se determinan los puntajes promedio de eritema y edema para los sitios de la Muestra
y el Blanco en cada periodo de observacin (24, 48 y 72 horas) para cada conejo o cobayo. Despus del puntaje de las 72
horas, todos los puntajes de eritema ms los puntajes de edema se suman por separado para cada Muestra y Blanco. Dividir
cada uno de los totales por 12 (2 animales 3 perodos de observacin 2 categoras de puntaje) para determinar el puntaje
medio de cada Muestra frente al de cada Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre
el puntaje medio de la Muestra y del Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier perodo de observacin, la reaccin promedio a
la Muestra es cuestionablemente mayor que la reaccin promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres conejos o cobayos
adicionales. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el puntaje medio de la Muestra y el Blanco es de 1,0 o
menos.
PRUEBA DE IMPLANTACIN
La prueba de implantacin est diseada para la evaluacin de materiales plsticos y otros materiales polimricos que estn
en contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparacin adecuada de las tiras de implante y su adecuada implantacin en condiciones aspticas. Se requieren conejos adultos saludables de Nueva Zelanda para la prueba de implantacin intramuscular. Las muestras de prueba se colocan dentro de agujas para ser implantadas. Aunque la mayora de los materiales se
ajustan fcilmente a este mtodo, existen algunos materiales que son inadecuados para la implantacin intramuscular. El modelo de implantacin subcutnea en ratas es una alternativa factible para materiales cuyas caractersticas fsicas son inadecuadas para la implantacin intramuscular de rutina.
Implantacin Intramuscular en Conejos

Preparar para implantacin 8 tiras de la Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira debe medir no
menos de 10 mm 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecnicos
adicionales durante la implantacin. Las tiras del tamao mnimo especificado se implantan con una aguja hipodrmica (calibre 1519) con una punta intravenosa y un trocar estril. Utilizar agujas previamente esterilizadas dentro de las cuales se insertan aspticamente las tiras de plstico estriles o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cnula y conector hayan sido pro-
Captulos
Esta prueba est diseada para evaluar las respuestas locales a los extractos de materiales en anlisis despus de su inyeccin
intracutnea en conejos o cobayos.
Animales de PruebaSeleccionar conejos o cobayos sanos que puedan esquilarse bien y cuya piel est libre de irritacin o
traumatismos mecnicos. Al manipular los animales, evitar tocar los sitios de la inyeccin durante los perodos de observacin,
salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite.
Procedimiento[NOTAAntes de retirar las dosis de inyeccin, agitar cada extracto vigorosamente para asegurar la distribucin uniforme de la materia extrada.] El da de la prueba, esquilar bien el lomo del animal a ambos lados de la columna
vertebral sobre un rea de prueba suficientemente grande. Evitar la irritacin y los traumatismos mecnicos. Eliminar los pelos
sueltos mediante aspiracin. Si fuera necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar
antes de aplicar la inyeccin. Puede utilizarse ms de un extracto de un determinado material por conejo o cobayo, siempre y
cuando se haya determinado que los resultados de la prueba no se vern afectados. Para cada Muestra utilizar dos animales e
inyectar a cada uno por va intracutnea, utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el Blanco, segn se
indica en la Tabla 5. [NOTADiluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspondiente, con 7,4 volmenes de Inyeccin de Cloruro de Sodio para obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 120 mg de polietilenglicol por mL.]
Captulos
USP 38
tegidos con una cubierta adecuada y sometidos posteriomente al proceso de esterilizacin adecuado. [NOTAPermitir la desgasificacin adecuada si se usan agentes como xido de etileno.]
Animales de PruebaSeleccionar conejos adultos sanos con un peso de al menos 2,5 kg y cuyos msculos paravertebrales
sean lo suficientemente grandes para permitir la implantacin de las tiras de prueba. No utilizar ningn tejido muscular que no
sea el sitio paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente anestsico de uso comn hasta un grado suficiente
como para evitar los movimientos musculares, como espasmos. Ver las pautas de la Asociacin Internacional para la Evaluacin
y Acreditacin del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en ingls).
ProcedimientoRealizar la prueba en un rea limpia. El da de la prueba, o hasta 20 horas antes del anlisis, esquilar a los
animales a ambos lados de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiracin. Frotar la piel ligeramente con
un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyeccin.
Implantar cuatro tiras de la Muestra en el msculo paravertebral a un lado de la columna de cada uno de dos conejos, 2,55
cm respecto a la lnea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una separacin de aproximadamente 2,5 cm
entre s. De manera similar, implantar dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el msculo opuesto de cada animal.
Insertar un estilete estril en la aguja para sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja. En caso de observar sangrado excesivo despus de implantar una tira, colocar una tira duplicada en otro lugar.
Mantener los animales durante 120 horas como mnimo y luego sacrificarlos al final del perodo de observacin, administrndoles una sobredosis de un agente anestsico u otros agentes adecuados. Dejar transcurrir suficiente tiempo para cortar el
tejido sin que se presente sangrado. Examinar macroscpicamente el rea del tejido que rodea la porcin central de cada tira
de implante. Utilizar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
encapsulacin, si la hubiera, registrando el ancho de la cpsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control
o Muestra hasta la periferia de la cpsula) redondeado a la dcima de mm. Calificar la encapsulacin segn se indica en la
Tabla 6.
Tabla 6. Evaluacin de la Encapsulacin en la Prueba de Implantacin
Ancho de la Cpsula
Puntaje
Ninguna
Hasta 0,5 mm
0,61,0 mm
1,12,0 mm
Ms de 2,0 mm
Calcular las diferencias entre puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia no es mayor de 1,0, o si la diferencia entre los puntajes medios de la Muestra y el Control para ms de uno
de los cuatro sitios de implantacin no es mayor de 1 en cualquiera de los animales implantados.
Prueba de Implantacin Subcutnea en Ratas

Preparar para implantacin 10 muestras de prueba y 10 muestras control. El tamao y la forma de las muestras control deben ser lo ms parecido posible a los de las muestras de prueba. Por ejemplo, las muestras preparadas en lminas deben tener
un dimetro de 1012 mm y un espesor de 0,31 mm. Los bordes de las muestras deben ser tan lisos como sea posible para
evitar traumatismos mecnicos adicionales durante la implantacin.
Animales de PruebaSeleccionar ratas albinas saludables con un peso entre 225350 g al momento de la implantacin.
ProcedimientoRealizar la prueba en un rea limpia. Anestesiar (ver las pautas de la AAALAC) al animal hasta lograr un
plano quirrgico. Esquilar el pelaje de los animales en ambos lados de la columna vertebral. Retirar los pelos sueltos mediante
aspiracin. Limpiar el rea esquilada con solucin de yodopovidona. Usando una tcnica asptica, realizar dos incisiones en la
lnea media (de aproximadamente 1,0 cm de largo) a travs de la piel en las regiones craneal y caudal sobre la superficie dorsal. Mediante diseccin roma, separar la fascia que conecta la piel con el msculo para formar una bolsa debajo de la piel lateral a cada costado de la incisin (la base de la bolsa es de aproximadamente 20 mm a partir de la lnea del implante). Insertar
una muestra estril en cada bolsa y cerrar la incisin mediante sutura o ganchos quirrgicos. Implantar dos muestras de prueba y dos muestras control en cada una de cinco ratas. Mantener a los animales durante un periodo de al menos siete das y
sacrificarlos al final del periodo de observacin mediante hipoxia inducida por CO2 o administrando una sobredosis de un
agente anestsico. Dejar transcurrir un tiempo suficiente para que el tejido pueda cortarse sin que sangre. Cortar longitudinalmente la piel (superficie dorsal) y levantarla. Examinar macroscpicamente y con cuidado el rea del tejido que rodea el implante. Cortar la muestra por la mitad y retirarla para examinar de cerca el tejido que est en contacto directo con la muestra.
Usar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar, si fuera apropiado. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control en busca de hemorragias, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulacin,
si la hubiera, registrando el ancho de la cpsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta
la periferia de la cpsula) redondeando a la dcima de mm. Registrar el puntaje de la encapsulacin de acuerdo con la Tabla 6.
Calcular las diferencias entre los puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se
cumplen si la diferencia no excede de 1,0.
Pruebas Biolgicas / 89 Enzimas 177
USP 38
PRUEBAS DE SEGURIDADPRODUCTOS BIOLGICOS

La prueba de seguridad aqu descrita est diseada para detectar cualquier reactividad biolgica imprevista e inaceptable en
un artculo. Esta prueba in vivo es para la evaluacin de la seguridad de los productos obtenidos por biotecnologa.
Prueba de Seguridad
89 ENZIMAS USADAS COMO MATERIALES AUXILIARES EN LA FABRICACIN DE

PRODUCTOS FARMACUTICOS
INTRODUCCIN
El propsito de este captulo es describir los atributos de calidad y las pruebas relacionadas con los criterios de aceptacin para
preparaciones enzimticas usadas en la fabricacin de productos biofarmacuticos. La calidad de los materiales auxiliares,
incluyendo enzimas, usados en la fabricacin de productos biofarmacuticos puede tener un impacto sobre los productos
teraputicos. Se usan diversas enzimas en este tipo de procesamiento celular. Los ejemplos incluyen tripsina, colagenasa,
pepsina y papana. Este captulo no trata las aplicaciones de dichas enzimas, sino que se enfoca en las pruebas para evaluar
su calidad como materiales del proceso.
Tripsina Recombinante
C1020H1597N287O321S14
23 463 (para b -Tripsina)
[9002-07-7].
DEFINICIN
La tripsina recombinante, una materia prima clave para la fabricacin de productos biofarmacuticos, es una serina proteasa
que rompe cadenas de pptidos principalmente en el extremo carboxlico de los aminocidos arginina y lisina. La secuencia
de aminocidos de la tripsina recombinante es idntica a la de la tripsina de pncreas porcino y la tripsina recombinante se
produce usando mtodos basados en tecnologa de ADN recombinante en la levadura Pichia pastoris. Por lo tanto, las especificaciones descritas en este captulo aplican nicamente a la tripsina porcina recombinante producida en levadura. Debido
al proceso de produccin recombinante, la tripsina recombinante est exenta de quimotripsina. Se conocen dos formas activas de tripsina: b -tripsina (23 463 daltones) y a-tripsina (23 481 daltones). La autlisis de la b -tripsina en el enlace peptdico entre Arg99 y Val100, Lys125 y Ser126 o Lys139 y Ala140 resulta en tres isoformas posibles de a-tripsina. Todas las isoformas se
mantienen unidas mediante puentes disulfuro y se conservan correctamente dobladas. Como consecuencia de la hidrlisis
de un enlace peptdico, el peso molecular de a-tripsina es mayor que el de b -tripsina por 18 daltones. El rea del pico de b tripsina es no menos de 70% y el rea del pico de a-tripsina es no ms de 20%, segn se determinan en el procedimiento
Captulos
Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente para pruebas y que pesen de 1723 g, a menos
que se indique algo diferente en la monografa individual correspondiente o en otra parte de este captulo, mantenidos con
una dieta equilibrada adecuada. Preparar una solucin de prueba segn las indicaciones de la monografa individual correspondiente. A menos que se indique lo contrario en la monografa individual o en otra parte de este captulo, inyectar una dosis
de 0,5 mL de la solucin de prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja de calibre 26 de la longitud adecuada o de
la longitud especificada a continuacin, segn corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas posteriores a la inyeccin. Si al cabo de las 48 horas todos los animales sobreviven y no ms de uno de los animales presenta sntomas externos
de una reaccin inesperada debido al nivel de toxicidad relacionado con el artculo, se cumplen los requisitos de esta prueba.
Si uno o ms animales mueren o si ms de uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida del artculo
en anlisis, repetir la prueba utilizando al menos otros 10 ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con un
peso de 20 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los animales sobreviven durante 48 horas y no presentan sntomas de
una reaccin indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del artculo, se cumplen los requisitos de la prueba. Deben obtenerse los pesos corporales de los ratones antes de la prueba y al finalizarse para detectar cualquier efecto inapropiado.
Los animales que presenten signos de toxicidad debern someterse a una necropsia completa y a estudios de histopatologa, si
fuera necesario.
Para los productos biolgicos, realizar la prueba segn los procedimientos que se describen en el Cdigo de Reglamentos Federales, Seccin 610.11.
178 89 Enzimas / Pruebas Biolgicas
USP 38
de HPLC descrito en la prueba de Pureza. La actividad especfica es no menos de 180 Unidades/mg de protena usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato descrito en la Valoracin.
[NOTAUna Unidad de actividad de tripsina usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato corresponde a 21 Unidades USP de Tripsina. Una Unidad USP de Tripsina es la actividad que causa un cambio en la absorbancia de 0,003 por minuto en las condiciones especificadas en la Valoracin de la monografa de Tripsina Cristalizada usando clorhidrato del ster etlico de N-benzoil-L-arginina como sustrato. Por ende, la actividad especfica de 180 Unidades/mg
de protena usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como sustrato para tripsina recombinante corresponde a 3800 Unidades USP de Tripsina/mg de protena.]
Captulos
IDENTIFICACIN
A. Cumple con los requisitos de la Valoracin.
B. El tiempo de retencin del pico principal de b -tripsina en la Solucin muestra corresponde al de la Solucin estndar, segn se obtienen en la prueba de Pureza.
VALORACIN
PROCEDIMIENTO
Solucin amortiguadora: Disolver 1,21 g de tris(hidroximetil)aminometano y 0,29 g de cloruro de calcio dihidrato en 100
mL de agua, y ajustar con cido clorhdrico 2 N a un pH de 8,0 (a 25 1).
Solucin madre de sustrato: Disolver 20 mg de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida1, pesado con
exactitud, en 3,0 mL de agua. [NOTAUsar nicamente una solucin recientemente preparada.]
Solucin de sustrato: Preparar una solucin mezclando 28 mL de Solucin amortiguadora y 2,8 mL de Solucin madre de
sustrato. [NOTAUsar nicamente una solucin recientemente preparada.]
Soluciones estndar: Enfriar previamente el ER Tripsina Porcina Recombinante USP y el agua hasta aproximadamente 4.
Comenzar a preparar las Soluciones estndar inmediatamente cuando la temperatura haya alcanzado 4. Preparar cada Solucin estndar diluyendo ER Tripsina Porcina Recombinante USP con agua hasta obtener una dilucin 1:68 921. Preparar al
menos cinco Soluciones estndar en paralelo. Valorar cada Solucin estndar por duplicado. [NOTAUsar una micropipeta
ajustable para cada medicin y dilucin. Usar tubos de ensayo de poliestireno para preparar las Soluciones estndar y las
Soluciones muestra, y usar puntas de pipeta de poliestireno que contengan filtros de polietileno para transferir las muestras.
La punta de pipeta no debe mojarse antes de la transferencia y cada punta debe usarse slo para transferir una muestra.]
[NOTASe puede lograr una dilucin 1:68 921 mediante tres etapas de dilucin sucesivas en las que cada etapa tiene una
dilucin 1:41 (1:41/1:41/1:41). Por ejemplo, para la dilucin inicial, extraer 0,1 mL de ER Tripsina Porcina Recombinante
USP usando una micropipeta con punta de poliestireno que contenga filtros de polietileno, limpiar la parte externa de la
punta para eliminar cualquier residuo de solucin y agregar el Estndar de Referencia a un tubo de ensayo de poliestireno
que contenga 4,0 mL de agua previamente enfriada, enjuagar la punta pipeteando la solucin hacia arriba y hacia abajo 2
3 veces, desechar la punta y mezclar la solucin en un mezclador de vrtice durante aproximadamente 2 segundos a mxima velocidad. Para la segunda y tercera etapa de dilucin, proceder segn se describe para la dilucin inicial, excepto que
se debe transferir 0,1 mL de solucin de la etapa de dilucin previa.]
Soluciones muestra: Preparar al menos cinco Soluciones muestra de tripsina recombinante en paralelo segn se indica en
Soluciones estndar para obtener una concentracin final de al menos 0,16 Unidades/mL usando agua previamente enfriada como diluyente. Cada Solucin muestra se valora por duplicado.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851.)
Modo: UV
Longitud de onda analtica: 405 nm
Longitud de paso: 1 cm
Temperatura: 25
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar y Soluciones muestra
Transferir 1,10 mL de Solucin de sustrato a una semi-microcubeta de poliestireno, dejar que la temperatura se estabilice,
verificar la temperatura especificada en la cubeta y esperar durante 10 minutos. Comenzar la reaccin agregando 0,020
mL de Solucin estndar o Solucin muestra. Registrar la absorbancia durante al menos 5 minutos y determinar el cambio
en la absorbancia (DA/min) a partir del intervalo lineal de la reaccin.
Calcular la actividad de tripsina recombinante en Unidades/mL:
Resultado = [VT/(e V B)] (DA/min) D
VT
e
V
B
= volumen de la mezcla de reaccin, 1,12 mL

= coeficiente de extincin para 405 nm, 10,4 (mmol1 1 cm1)
= volumen de la Solucin estndar o la Solucin muestra, 0,020 mL
= longitud de paso de absorcin, 1 cm
1 Un acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida adecuado es Chromozym TRY de Roche Applied Science (N de catlogo 10378496103) o equivalente.
Pruebas Biolgicas / 89 Enzimas 179
USP 38
D
= factor de dilucin
[NOTAUna unidad liberar el equivalente a 1 mmol de 4-nitril anilina a partir de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida por minuto en las condiciones de la Valoracin.]
Calcular la actividad especfica de tripsina recombinante en Unidades/mg de protena:
Resultado = Actividad/C
C
= concentracin de protena en la tripsina recombinante (mg/mL)
Aptitud del sistema
Muestras: Soluciones estndar y Soluciones muestra
Requisitos de aptitud: DA/min debe ser 0,030,07 para las Soluciones estndar y las Soluciones muestra. La actividad promedio calculada para las Soluciones estndar es de 90%110% del valor en la etiqueta.
Criterios de aceptacin
Actividad especfica: No menos de 180 Unidades/mg de protena
Desviacin estndar relativa: No ms de 5% para las actividades determinadas a partir de 5 determinaciones repetidas
PUREZA
PROCEDIMIENTO
Solucin A: Diluir 1 mL de cido fosfrico (85%) con agua hasta 1000 mL.
Solucin B: Diluir 1 mL de cido fosfrico (85%) con acetonitrilo hasta 1000 mL.
Fase mvil: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Solucin A
(%)
Solucin B
(%)
75
25
25
55
45
30
10
90
34
10
90
35
75
25
45
75
25
Solucin estndar: Descongelar 100 mL de ER Tripsina Porcina Recombinante USP a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentracin deseada de la protena debe ser 70 10
mg/mL.
Solucin muestra: Descongelar 100 mL de tripsina recombinante a temperatura ambiente durante 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentracin deseada de la protena debe ser 70 10 mg/mL.
[NOTAMantener la Solucin estndar y la Solucin muestra a 28 si no estn listas para ser inyectadas inmediatamente despus de su preparacin.]
Sistema cromatogrfico
(Ver Cromatografa 621, Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm 25 cm; relleno L1 de 3 mm con un tamao de poro de 200
Temperatura de la columna: 40
Velocidad de flujo: 1,0 mL/min
Volumen de inyeccin: 1 mL
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar
[NOTAEl tiempo de retencin del pico principal de tripsina recombinante es 1217 minutos.]
Requisitos de aptitud
Resolucin: No menos de 1 entre los picos de a-tripsina y b -tripsina
Anlisis
Muestra: Solucin muestra
Registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos. Evaluar la pureza de la tripsina usando el mtodo de rea-%. El
tiempo de integracin es de 25 minutos. El blanco debe considerarse para la integracin. Los picos que no se separan
completamente y eluyen antes del pico de a-tripsina se integran mediante una lnea perpendicular nicamente si se forma un mnimo. Los picos que no se separan completamente y eluyen luego del pico de b -tripsina se integran tangencialmente nicamente si se forma un mnimo.
Criterios de aceptacin: No menos de 70% para el rea del pico de b -tripsina y no ms de 20% para el rea del pico de
a-tripsina
Captulos
Tiempo
(min)
180 89 Enzimas / Pruebas Biolgicas
USP 38
Captulos
PRUEBAS ESPECFICAS
CONTENIDO DE PROTENA
Solucin de cido clorhdrico 4 N: Mezclar 10,4 mL de cido clorhdrico al 25% con 9,6 mL de agua.
Solucin amortiguadora de almacenamiento: Disolver 2,9 g de cloruro de calcio dihidrato en agua, agregar 2,5 mL de
Solucin de cido clorhdrico 4 N y diluir con agua hasta un volumen final de 1000 mL. Ajustar con Solucin de cido clorhdrico 4 N a un pH de 2,0 0,2, si fuera necesario.
Soluciones muestra: Agregar 0,025 mL de tripsina recombinante a 3 mL de Solucin amortiguadora de almacenamiento.
Preparar al menos por triplicado.
Solucin blanco: Solucin amortiguadora de almacenamiento, 3 mL
Modo: UV
Aptitud del sistema
Muestra: Soluciones muestra
Requisitos de aptitud: DA (segn se define a continuacin) est en el intervalo de 0,131,8.
Anlisis
Muestras: Soluciones muestra y Solucin blanco
Calcular la concentracin de protena en mg/mL:
DA = AU AB
AU
AB
F
= absorbancia de la Solucin muestra

= absorbancia de la Solucin blanco
= factor de conversin de 1% a mg/mL, 10
= coeficiente de extincin para tripsina, 13,6
D
= factor de dilucin
PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO 61: El recuento total bacteriano no excede de 100 ufc/mL, realizando la prueba en 1
mL de tripsina recombinante por duplicado.
ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a 15 a 25.
ETIQUETADO: El etiquetado indica que el material es de origen de ADN recombinante, junto con el nmero de producto y el
nmero de lote, las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad.
ESTNDARES DE REFERENCIA USP 11
ER Tripsina Porcina Recombinante USP
USP38
90 SUERO FETAL BOVINOATRIBUTOS DE CALIDAD Y PRUEBAS DE

FUNCIONALIDAD
PROCESAMIENTO
El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en ingls) es la fraccin lquida de color marrn claro de la sangre bovina fetal
coagulada de la que se ha eliminado clulas, fibrina y factores de coagulacin. Aunque no se ha definido la composicin completa del FBS, ste contiene altos niveles de factores de crecimiento y bajos niveles de inmunoglobulinas. Adems, contiene
otros ingredientes claves que son esenciales para sustentar la proliferacin de clulas en cultivos. Este producto se usa tanto en
la investigacin bsica de las ciencias biolgicas como en la fabricacin industrial. El FBS es un subproducto de la industria de
la carne y se recolecta a partir de fetos bovinos extrados del ganado que se encuentra preado al momento de su faena. El
FBS se recolecta en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del pas de origen. La recoleccin y el procesamiento deben ser llevados a cabo por personal capacitado siguiendo procedimientos escritos y aprobados. La sangre se recolecta en un sistema cerrado en un rea dedicada dentro de la instalacin y se procesa rpidamente para evitar la hemlisis.
USP 38
Pruebas Biolgicas / 90 Suero Fetal Bovino 181
Posteriormente, se permite que la sangre coagule y luego, por lo general, se centrifuga en una centrfuga refrigerada para separar el suero de los dems componentes. Por lo regular, el suero se extrae del cogulo, se transfiere a envases etiquetados, y
se congela. Todos los fabricantes emplean filtracin estril antes del envasado final. Adems, la radiacin gamma proporciona
la garanta ms alta de ausencia de actividad viral. Las dosis de radiacin gamma de 2540 kGy proporcionan una reduccin
logartmica significativa de agentes virales y de otros agentes adventicios, al tiempo que preservan el desempeo para el crecimiento celular.
La deteccin de contaminacin viral en el FBS se logra usando todas las pruebas aplicables descritas en el Code of Federal
Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales) Ttulo 9 CFR 113.53 (conocido como el anlisis completo del Ttulo 9 del
CFR). Los ensayos para micoplasmas se realizan segn se indica en Pruebas para Micoplasmas 63.
ATRIBUTOS DE CALIDAD DEL SUERO FETAL BOVINO
Captulos
Envasado y Almacenamiento: Almacenar en envases sellados a una temperatura de 10 o menor.

Etiquetado: Etiquetar indicando que contiene Suero Fetal Bovino e indicar el nmero de lote, la fecha de caducidad y las
condiciones de almacenamiento. Asimismo, indicar el pas de origen en el etiquetado del producto.
Estndares de Referencia USP 11
ER Endotoxina USP
ER Suero Fetal Bovino USP
pH 791: 7,008,00 en muestras de suero sin diluir
Osmolalidad 785: 280360 mOsmol/kg
Endotoxinas Bacterianas 85: Contiene no ms de 10 Unidades USP de Endotoxina/mL de suero.
Contenido de Protenas Totales 1057: 3045 mg/mL
Pruebas de Esterilidad 71: Cumple con los requisitos
IdentificacinInmunodifusin Radial
Reactivos
Muestras de prueba de FBS
Suero de caballo, muestras de control negativo
Calibrador de IgG bovina (500 mg/L)
Diluyente de albmina ovina (albmina ovina al 1%, EDTA al 0,18%, NaCl al 1,75% y Tris/HCl de pH 7,4 al 1,21%).
Materiales/Aparato: Calibrar el dispositivo de medicin de anillos (halos) en incrementos de 0,1 mm. Las placas de inmunodifusin radial (IDR) estn disponibles comercialmente y contienen antisuero anti-IgG bovina en un gel de agarosa al
1,5%, solucin amortiguadora de fosfato 0,1 M de pH 7,0, azida de sodio al 0,1% como agente bacteriosttico y 1 mg/mL de
anfotericina B como agente antifngico. Almacenar a una temperatura de 28. Usar placas de IDR que puedan medir IgG
bovina en el intervalo de 50500 mg/L.
Curva estndar: Usar los calibradores de IgG bovina para la aptitud del sistema y para generar una curva de calibracin.
Preparar dos diluciones a partir de una solucin madre de IgG bovina de 500mg/mL. Diluir 120 mL de la solucin madre de
500 mg/L con 80 mL de diluyente (dilucin media) y 25 mL de la solucin madre de 500 mg/L con 225 mL de diluyente (dilucin baja). Etiquetar cada dilucin respectivamente como calibradores de 300 mg/L y de 50 mg/L. Usar las soluciones de 500
mg/L, 300 mg/L y 50 mg/L para generar la curva estndar. [NOTAPreparar y analizar las soluciones calibradoras de IgG bovina por duplicado.] Cargar 5 mL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa. A las 72 horas de la incubacin, medir
los dimetros de los anillos con una aproximacin de 0,1 mm usando un dispositivo de medicin de anillos apropiado. Registrar los resultados y generar una curva estndar.
El dimetro del anillo debe desarrollarse completamente a temperatura ambiente durante 72 horas. Usando el resultado de
cada punto de la curva estndar, generar una grfica de linealidad en la que y es el dimetro cuadrado (mm2) del anillo de
precipitina alrededor del pocillo y x es la concentracin de IgG bovina (mg/L). Calcular la curva de regresin lineal por cuadrados mnimos de la forma y = m(x) + b con ayuda de un software adecuado y determinar los valores para la pendiente (m), la
ordenada al origen y (b) y el coeficiente de determinacin (R2). La curva estndar para el mtodo es lineal si R2 es 0,98.
Anlisis: Las muestras congeladas sin diluir de FBS se descongelan y analizan dentro de las 24 horas si se almacenan a 4.
El anlisis de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP se realiza por triplicado. Preparar placas de IDR que
contengan anti-IgG bovina para el anlisis de varios tipos de suero. Dejar que las placas y los reactivos se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso dejando las placas abiertas durante 1015 minutos a temperatura ambiente para permitir que se
evapore cualquier condensacin de humedad en los pocillos o en la superficie del gel. Las muestras no se deben aplicar a los
pocillos en los que se observe humedad. Preparar diluciones en serie, si fuera necesario, de las muestras de prueba de FBS y de
ER Suero Fetal Bovino USP en diluyente. Diluir el suero de caballo para control negativo en diluyente. Cargar 5 mL de cada
muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 72 horas. [NOTALas muestras de
prueba y el control negativo se cargan en la misma placa.]
Clculo: Despus de 72 horas, medir los dimetros de los anillos usando el dispositivo de medicin de anillos y registrar
los resultados. Usando la ecuacin de regresin desarrollada para la desviacin de la curva estndar, calcular la concentracin
de IgG bovina en las muestras de FBS. La concentracin se expresa en mg/L.
Criterios de aceptacin: El suero de caballo es negativo (no debe presentar un anillo de precipitacin). Las muestras de
prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP son positivas y deben contener no ms de 500 mg/L de IgG.
182 90 Suero Fetal Bovino / Pruebas Biolgicas
USP 38
Contenido de hemoglobina:
Preparacin de la muestra: Las muestras de FBS se descongelan, se almacenan a 4 y se analizan dentro del mismo da.
Anlisis: Determinar la absorbancia de la muestra de suero usando una celda espectrofotomtrica con una longitud de
paso de 1 cm a las longitudes de onda de absorbancia de 576, 623 y 700 nm y usando agua como blanco. Calcular la concentracin de hemoglobina en mg/dL por la frmula:
(Abs576 115) (Abs623 102) (Abs700 39,1)
Criterios de aceptacin:
No ms de 30 mg/dL
Captulos
PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD DEL FBS

En caso de no existir un ensayo de funcionalidad definido por el usuario, las siguientes pruebas son adecuadas para determinar la funcionalidad de lotes especficos de FBS y para ayudar en la optimizacin de las condiciones de crecimiento de cultivos
de clulas mamferas en presencia de FBS. Para una confirmacin vlida de la funcionalidad, independiente de las aplicaciones
especficas del usuario, las pruebas se realizan en las lneas celulares especificadas. Para la validacin interna de aplicaciones
especializadas de cultivos celulares, se deben usar y caracterizar lneas celulares especficas para tales aplicaciones. Usar frascos
de cultivo de tejidos apropiados. Las dos pruebas descritas en este captulo son la Curva de Promocin de Crecimiento y el Ensayo Clonal. La decisin sobre el tipo de prueba o el nmero de pruebas que se van a realizar para evaluar la aptitud de un lote
especfico de FBS depende del tipo de lnea celular usada. Para lneas celulares adherentes, el nmero de colonias al final del
periodo de cultivo representa una buena evaluacin de la capacidad de estas clulas, a baja concentracin, para crecer en presencia de un lote especfico de FBS. Para lneas celulares que crecen en cultivos en suspensin, la cintica ptima de crecimiento se mide contando las clulas viables despus de 7 das de cultivo.
Lneas celulares: Se recomiendan cinco lneas celulares:
(1) HFL1 (ATCC CCL-153) fibroblasto de pulmn normal
(2) Mv1 Lu (ATCC CCL-64) epitelio de pulmn de visn
(3) HL-60 (ATCC CCL-240) promieloblasto de sangre perifrica, suspensin
(4) VERO (ATCC CCL-81) fibroblasto de rin de mono
(5) CHO (CCL-61) ovario de hmster chino
Las pruebas de funcionalidad descritas se deben realizar en tres lneas celulares, dos de las cuales corresponden a la lista de las
cinco lneas celulares recomendadas, mientras que la tercera es la lnea celular pertinente a la aplicacin del usuario. Las lneas
celulares se cultivan con medios especficos segn lo recomendado por la ATCC.
Materiales
Frasco/recipiente de crecimiento adecuado
Cabina de Seguridad Biolgica Clase II, Tipo A
Contador de clulas/hemacitmetro
Microscopio invertido con accesorio para cmara digital
Frascos de cultivo de tejidos: T25 cm2
Preparacin de clulas para ensayos: Descongelar rpidamente un vial en un bao de agua a 37 y determinar el recuento y la viabilidad celular. Preparar mltiples cultivos a partir de cada lnea celular en un medio de crecimiento suplementado con suero. Incubar los cultivos a 37 siguiendo las instrucciones provistas por la ATCC para cada una de las lneas celulares
usadas para la prueba. Examinar los cultivos celulares en un microscopio para asegurarse de la existencia de monocapas uniformes casi confluentes o suspensiones uniformes. Expandir las clulas hasta que se tengan suficientes para el ensayo (aproximadamente 1 107 clulas totales; >90% viabilidad)
Recoleccin de cultivos
1. Retirar y desechar el medio de crecimiento y luego enjuagar cada cultivo con medio sin FBS.
2. Para las clulas adherentes, agregar 1 mL de Tripsina/EDTA durante unos pocos minutos para que las clulas se dispersen.
Incubar a 37, si fuera necesario. Neutralizar con 1 mL de medio de cultivo que contenga por lo menos 10% de FBS.
3. Centrifugar brevemente (spin down) las clulas en una centrfuga. Aspirar el medio de lavado y resuspender las clulas en
un volumen apropiado para siembra.
Siembra de clulas
1. En el da 0: Para las tres lneas celulares que se van a analizar, preparar cultivos mltiples usando densidades de siembra
que abarquen el intervalo entre 2 103 y 2 104 clulas viables/mL. (En un inicio, se seleccionan inculos diferentes para
determinar las condiciones de crecimiento ptimas. Una vez que se ha seleccionado el inculo apropiado, dicha condicin se usa para propagar las clulas). A continuacin se presentan las densidades de siembra recomendadas:
Densidad de siembra baja: 2 103 clulas viables/mL
Densidad de siembra media: 6 103 clulas viables/mL
Densidad de siembra alta: 2 104 clulas viables/mL
2. Preparar cultivos por triplicado para al menos cinco puntos de tiempo (en das u horas de acuerdo con la lnea celular),
para determinar la densidad de siembra que producir condiciones de crecimiento ptimo para cada lnea celular usada.
3. Incubar los cultivos a 37 en una incubadora humidificada saturada con CO2 al 5%.
Pruebas Biolgicas / 90 Suero Fetal Bovino 183
USP 38
4. Para cada punto de tiempo de medicin (das 0, 1, 2, 3, 4 y 7), tomar una fotografa de cada cultivo, por triplicado, tanto
para el material de prueba de FBS como del ER Suero Fetal Bovino USP a cada una de las tres concentraciones para cada
lnea celular y registrar el porcentaje de confluencia para cada una de las condiciones. [NOTARealizar esta etapa antes de
la tripsinizacin y del conteo celular.]
5. Recolectar las clulas de los tres cultivos de diferente densidad de siembra para cada punto de tiempo especfico. Para
cultivos adherentes, recolectar las clulas segn se describi anteriormente.
6. Realizar y registrar el recuento de clulas totales y la viabilidad para cada uno de los nueve cultivos de la muestra de FBS y
de ER Suero Fetal Bovino USP para cada lnea celular usando un contador de clulas o hemacitmetro apropiado.
[NOTASEs posible que tenga que cambiarse el programa de recuento para lneas celulares de crecimiento rpido o clulas grandes que confluyan antes del da 7 y/o para lneas celulares de lento crecimiento que requieran estar en cultivo 8
10 das antes de alcanzar una meseta. Algunas lneas celulares adherentes nunca lograran la confluencia.]
Curva de Promocin de Crecimiento
Ensayo Clonal
Este ensayo est diseado para evaluar el crecimiento ptimo de las lneas celulares adherentes. La eficiencia del plaqueo o
formacin de colonias a baja densidad celular es un mtodo preferido para analizar la capacidad de proliferacin y la supervivencia de clulas individuales en condiciones ptimas de crecimiento. Esta es una prueba muy sensible y a menudo se usa para
evaluar la calidad de los lotes de suero. Esta tcnica revela diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de la poblacin
celular y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamao de colonias) y la supervivencia de las
clulas (nmero de colonias). Debido a la heterogeneidad de la poblacin celular de algunos cultivos celulares, cabe recordar
que las clulas crecen de manera diferente como colonias aisladas a bajas densidades. Por consiguiente, pocas clulas sobreviven incluso en condiciones ideales debido a la prdida de toda interaccin celular. La clonacin es un ensayo de supervivencia
que se usa tambin para optimizar las condiciones de crecimiento (seleccin de medio y suero). Si es posible confirmar que
una colonia individual surgi de una sola clula, entonces se puede determinar la eficiencia de la clonacin.
Reactivos
Medio de crecimiento + 10% de FBS (suero de prueba)Medio esencial mnimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en ingls) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga 1,5 g/L de carbonato de sodio, aminocidos no
esenciales 0,1 mM y piruvato de sodio conteniendo 100 U/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina ms 10% de
FBS.
Captulos
Las mediciones de las velocidades de proliferacin celular a menudo se usan para determinar la respuesta de las clulas a
estmulos exgenos. La evaluacin cuantitativa de las condiciones de crecimiento celular es un factor importante para monitorear la constancia de las condiciones de cultivo. El intervalo de concentracin celular ptimo para subcultivos, el inculo ptimo y el tiempo de duplicacin son parmetros que se pueden cuantificar y para los que se pueden establecer tendencias. La
informacin acerca de la cintica del crecimiento de un cultivo es crtica para el diseo de experimentos celulares. Los cultivos
varan significativamente en sus propiedades de crecimiento en la fase de latencia, la fase de crecimiento exponencial o logartmica y la fase estacionaria. Documentar las caractersticas de crecimiento del cultivo durante las tres etapas de crecimiento
para determinar el tiempo de duplicacin de la poblacin y el tiempo del ciclo celular. Las clulas que han entrado en la fase
estacionaria pueden demostrar un potencial de crecimiento reducido y cambios en la morfologa. Las clulas se pueden volver
polarizadas y pueden segregar ms matriz extracelular, lo que las vuelve difciles de retirar del sustrato. Al final de la fase de
crecimiento exponencial las clulas presentan su mayor rendimiento y su ms alta reproductibilidad.
Reactivos
Medios de crecimiento sin FBS
Muestras de prueba de FBS
Medio de crecimiento + 10% de FBS
Solucin de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en Solucin Salina Balanceada de Hank (HBSS)
Anlisis: Una vez que las clulas hayan alcanzado el final de la fase logartmica, subcultivar las clulas para la prueba. Seguir el procedimiento descrito en Siembra de Clulas y preparar mltiples cultivos para el ER Suero Fetal Bovino USP y analizar
el FBS para diferentes lneas celulares a tres densidades de siembra para las que al menos una curva de crecimiento presenta
una fase de latencia, una fase logartmica y una fase estacionaria, y para la cual la fase logartmica es lineal en tres o ms puntos de tiempo.
Los recuentos de clulas viables se determinan en los das 0, 1, 2, 3, 4 y 7.
Clculo y Anlisis de Datos: Calcular el recuento promedio de clulas viables [clulas/cm2 (adherentes) o clulas/mL (en
suspensin)] y la viabilidad media porcentual para cada punto. Graficar los datos en una grfica de escala semilogartmica con
el recuento de clulas viables sobre la escala logartmica en el eje y y los das (u horas) en cultivo sobre una escala aritmtica en
el eje x. Estimar el tiempo de duplicacin usando una curva de crecimiento que sea lineal sobre tres o ms puntos.
Criterios de aceptacin: El valor R2 de la curva debe ser igual o mayor que 0,98 a fin de respaldar el clculo de un tiempo
de duplicacin vlido. El tiempo de duplicacin correspondiente a la muestra de prueba debe ser no menos de 90% del tiempo de duplicacin correspondiente a ER Suero Fetal Bovino USP.
Captulos
184 90 Suero Fetal Bovino / Pruebas Biolgicas
USP 38
Solucin de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en HBSS.

Solucin Salina Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio.
Solucin de Carbol FucsinaAzul de MetilenoMezclar 20 g de carbol fucsina en 2 L de metanol y mezclar durante 10
minutos (carbol fucsina al 1%). Mezclar 50 g de azul de metileno en 5 L de metanol y mezclar durante 10 minutos (azul
de metileno al 1%). Preparar una solucin de trabajo de Carbol FuscinaAzul de Metileno mezclando azul de metileno al
1%, metanol y carbol fucsina al 1% en una proporcin de 3:2:1. Mezclar durante 20 minutos y filtrar a travs de cuatro
pliegues de gasa (cheesecloth) en un embudo. Preparar alcuotas y almacenar en frascos de vidrio marrn a una temperatura de 15 a 25.
Muestra: Se usan mltiples lotes de FBS para este ensayo. Por cada lote de suero a analizar, agregar 20 mL de FBS a 180
mL de EMEM y usar la misma muestra para toda la prueba. Esterilizar usando filtros de baja unin a protenas de 0,22 mm.
Almacenar el medio de crecimiento a 4 hasta el momento de su uso.
Preparacin de las clulas: Esta prueba es nicamente para cultivos adherentes y se realiza con las lneas celulares adherentes descritas en Lneas Celulares (HFL1 y Mv 1 Lu). Una semana antes de analizar el suero, expandir las lneas celulares segn
se indica en Siembra de Clulas, cambiar el medio cada 23 das, y subcultivar las clulas cuando presenten una confluencia
aproximada de 90%. Determinar el recuento y la viabilidad celular (la viabilidad debe ser
>90%) antes de realizar el ensayo. Recolectar las clulas segn se indica en Recoleccin de Clulas, lavar dos veces, y resuspender las clulas en EMEM basal.
Anlisis: El procedimiento implica el plaqueo de una suspensin unicelular en densidades bajas (250 clulas/cm2) a partir
de la cual se formarn colonias discretas. Al final del ensayo, se debe fijar, teir, y contar el nmero de colonias segn se indica
a continuacin.
1. Para cada lnea celular, etiquetar 10 placas de cultivo de tejidos de 60 mm 15 mm por cada lote de suero a analizar.
Etiquetar el costado de la mitad inferior de cada plato, incluyendo los controles.
2. Transferir 5 mL de medio que contenga 10% del suero de prueba correspondiente (10 rplicas). Agregar 400 clulas por
placa de cultivo (se busca una concentracin celular de aproximadamente 800 clulas/mL).
3. Incubar durante 1014 das a 37 en una incubadora humidificada, saturada con CO2 al 5%.
4. Retirar el sobrenadante y agregar suficiente Solucin de Carbol FucsinaAzul de Metileno para cubrir cada una de las placas de cultivo durante 10 minutos.
5. Retirar la solucin colorante; enjuagar las placas de cultivo con varios enjuagues de agua destilada; invertir los platos en
toallas de papel; y dejar que se sequen.
6. Contar y registrar (1) el nmero de colonias y (2) la superficie total de colonias teidas (mm2). Calcular las medias y desviaciones estndar.
Criterios de aceptacin: La eficiencia de plaqueo porcentual se expresa contando el nmero de colonias en un rea definida, dividido por el nmero de clulas sembradas y multiplicado por 100. Comparar los resultados entre los lotes de FBS y
seleccionar un lote de suero que sea apropiado para varios tipos de clulas y ptimo para una aplicacin de cultivo celular
especfica.
91 VALORACIN DE PANTOTENATO DE CALCIO

Estndares de Referencia USP 11ER Pantotenato de Calcio USP.
Solucin Madre del Estndar de Pantotenato de CalcioEn un matraz volumtrico de 1000 mL, disolver, en aproximadamente 500 mL de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP, previamente secado y almacenado en un lugar oscuro
sobre pentxido de fsforo, y pesado con exactitud evitando la absorcin de humedad durante la pesada. Agregar 10 mL de
cido actico 0,2 N y 100 mL de solucin de acetato de sodio (1 en 60) y diluir a volumen con agua. Cada mL contiene 50 mg
de ER Pantotenato de Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Preparacin EstndarDiluir, el mismo da de la valoracin, un volumen medido de Solucin Madre del Estndar de Pantotenato de Calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01 mg y 0,04 mg de pantotenato de calcio por mL,
cuya concentracin exacta sea tal que las respuestas obtenidas segn se indica en el Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0 mL de
la Preparacin Estndar, se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en funcin del logaritmo de la concentracin.
Preparacin de ValoracinProceder segn se indica en la monografa individual y preparar una solucin que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentracin de pantotenato de calcio en la Preparacin Estndar.
Solucin Madre de Medio Basal
Solucin de Hidrolizado cido de Casena
Solucin de CistinaTriptfano
Solucin de Polisorbato 80
Dextrosa, Anhidra
Acetato de Sodio, Anhidro
25 mL
25 mL
0,25 mL
10 g
5g
USP 38
Pruebas Biolgicas / 91 Valoracin de Pantotenato de Calcio 185
Solucin de AdeninaGuaninaUracilo
5 mL
Solucin de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina
5 mL
Solucin de cido ParaaminobenzoicoNiacinaClorhidrato de Piridoxina
5 mL
Solucin Salina A
5 mL
Solucin Salina B
5 mL
* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) N 8014 es apropiada. Esta cepa se conoca anteriormente como Lactobacillus arabinosus 17-5.
Captulos
Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas y ajustar con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 mL y mezclar.
Solucin de Hidrolizado cido de CasenaMezclar 100 g de casena sin vitaminas con 500 mL de cido clorhdrico 6 N
y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el cido clorhdrico de la mezcla mediante destilacin bajo presin
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua, ajustar la solucin con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 3,5 0,1 y agregar agua para obtener 1000 mL. Agregar 20 g de carbn activado, revolver durante 1 hora y
filtrar. Repetir el tratamiento con carbn activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a
10. Filtrar la solucin si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solucin de CistinaTriptfanoSuspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptfano (o 2,0 g de D,L-triptfano) en un
volumen de agua entre 700 y 800 mL, calentar hasta entre 70 y 80 y agregar, gota a gota y agitando, cido clorhdrico
diluido (1 en 2), hasta que los slidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 mL. Almacenar bajo tolueno en
un refrigerador a una temperatura no inferior a 10.
Solucin de AdeninaGuaninaUraciloDisolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 10 mL de cido clorhdrico 4 N, enfriar y agregar agua para obtener 200 mL. Almacenar
bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de Polisorbato 80Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 mL.
Solucin de RiboflavinaClorhidrato de TiaminaBiotinaDisolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en cido
actico 0,02 N para obtener una solucin que contenga 20 mg de riboflavina, 10 mg de clorhidrato de tiamina y 0,04 mg de
biotina por mL. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de cido ParaaminobenzoicoNiacinaClorhidrato de PiridoxinaPreparar una solucin en alcohol al 25 por
ciento neutralizado para obtener las siguientes concentraciones: 10 mg de cido paraaminobenzoico, 50 mg de niacina y 40 mg
de clorhidrato de piridoxina por mL. Almacenar en un refrigerador.
Solucin Salina ADisolver 25 g de fosfato monobsico de potasio y 25 g de fosfato dibsico de potasio en agua para obtener 500 mL. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin Salina BDisolver en agua 10 g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 mL. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Cultivo Madre de Lactobacillus plantarumDisolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 mL de agua, agregar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar agitando en un bao de
vapor hasta que el agar se disuelva. Verter porciones de aproximadamente 10 mL de la solucin caliente en tubos de ensayo,
tapar o cubrir adecuadamente, esterilizar a 121 y dejar que se enfren en posicin vertical. Preparar cultivos en cua en tres o
ms de los tubos, usando un cultivo puro de Lactobacillus plantarum*, incubar durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30 y 37 pero mantenerla constante con una aproximacin de 0,5 y luego almacenar en un refrigerador.
Preparar un cultivo madre en cua nuevo una vez por semana y no usar para inoculacin si el cultivo tiene ms de 1 semana.
Medio de CultivoPreparar una serie de tubos de ensayo con 5,0 mL de Solucin Madre de Medio Basal y agregar 5,0 mL
de agua con 0,2 mg de pantotenato de calcio a cada tubo. Tapar los tubos con algodn, esterilizar en un autoclave a 121 y
enfriar.
InculoTransferir clulas del cultivo madre de Lactobacillus plantarum a un tubo estril que contenga 10 mL de medio de
cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30 y 37 pero mantenerla constante
con una aproximacin de 0,5. La suspensin de clulas as obtenida es el inculo.
ProcedimientoAgregar a tubos de ensayo similares, por duplicado, 1,0 mL y/o 1,5 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL y 5,0 mL,
respectivamente, de la Preparacin Estndar. A cada tubo y a 4 tubos similares sin Preparacin Estndar agregar 5,0 mL de
Solucin Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 10 mL.
Agregar, por duplicado, a tubos de ensayo similares los volmenes de Preparacin de Valoracin correspondientes a tres o
ms de los niveles especificados anteriormente para la Preparacin Estndar, incluidos los niveles de 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0 mL.
Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solucin Madre de Medio Basal y agua suficiente para obtener 10 mL. Colocar un conjunto
completo de tubos de Estndar y Muestra juntos en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra
seccin de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos de ambas series para prevenir la contaminacin y colocar en un autoclave a 121 durante 5 minutos. Enfriar, agregar 1 gota de inculo a cada uno de los tubos, excepto a dos de los cuatro tubos que no contengan Preparacin
Estndar (para que sirvan como blancos no inoculados) y mezclar. Incubar los tubos a una temperatura entre 30 y 37 mantenida con variaciones permitidas de 0,5 hasta que, una vez incubados durante un perodo entre 16 y 24 horas, no haya habido un aumento sustancial de la turbidez en los tubos que contienen el nivel ms alto de estndar durante un perodo de 2
horas.
186 91 Valoracin de Pantotenato de Calcio / Pruebas Biolgicas
USP 38
Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera: Mezclar el contenido de cada tubo y transferir a un recipiente apto para la lectura ptica si fuera necesario. Colocar el recipiente en un espectrofotmetro ajustado a una longitud de
onda especfica entre 540 nm y 660 nm y tomar la lectura de la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este
estado estacionario se observa unos pocos segundos despus de agitar cuando la lectura del galvanmetro permanece constante durante 30 segundos o ms. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Si hay evidencia de contaminacin con un microorganismo extrao, descartar el resultado de la valoracin.
ClculosPreparar una curva estndar de concentracin-respuesta del siguiente modo. Para cada nivel del estndar, calcular la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de transmitancia como la diferencia y = 2,00 S (de transmitancia). Graficar la respuesta en la ordenada de un papel cuadriculado contra el logaritmo del volumen de Preparacin Estndar en
cada tubo, en mL, en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmtica o logartmica (eligiendo entre estas dos la que
ms se aproxime a una recta). Trazar la lnea recta o la curva continua que mejor se ajuste los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparacin de Valoracin. Leer, a partir de la
curva estndar, el logaritmo del volumen de la Preparacin Estndar correspondiente a cada uno de los valores de y que estn
dentro del intervalo entre los puntos mximos y mnimos graficados para el estndar. Restar de cada logaritmo as obtenido el
logaritmo del volumen, en mL, de la Preparacin de Valoracin para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificacin. Promediar los valores de x para cada uno de tres o ms niveles de dosificacin para obtener x = M, el logaritmo de la potencia
relativa de la Preparacin de Valoracin. Determinar la cantidad, en mg, de ER Pantotenato de Calcio USP correspondiente al
pantotenato de calcio en la porcin del material tomada para el ensayo como antilog:
Captulos
M = antilog (M + log R)
en donde R es el nmero de mg de pantotenato de calcio que se supuso que estaban presentes por mg (o cpsula o tableta)
del material tomado para valoracin.
RepeticinRepetir toda la determinacin al menos una vez, usando Preparaciones de Valoracin preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08, su promedio, M, es el logaritmo de la potencia del material de prueba analizado (ver Intervalo de Confianza y Lmites de Potencia 111). Si las dos determinaciones difieren
en ms de 0,08, realizar una o ms determinaciones adicionales. Del promedio de dos o ms valores de M que no difieren en
ms de 0,15, calcular la potencia media de la preparacin objeto de la valoracin.
92 FACTORES DE CRECIMIENTO Y CITOKINAS USADOS EN LA FABRICACIN DE

PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR
INTRODUCCIN
La calificacin de reactivos, de materiales de origen y el control de los procesos de fabricacin son elementos claves que aseguran la calidad y seguridad de las terapias celulares. Los factores de crecimiento y las citokinas son importantes para el mantenimiento, crecimiento, seleccin y purificacin de cultivos de productos de terapia celular. Este captulo describe las pruebas,
procedimientos y criterios de aceptacin aceptados para factores de crecimiento y citokinas que pueden estar implicados en
la fabricacin de productos de terapia celular.
INTERLEUKINA RECOMBINANTE HUMANA 4 (rhIL-4, por sus siglas en ingls)
MHKCDITLQE
IIKTLNSLTE
QKTLCTELTV
TDIFAASKNT
TEKETFCRAA
TVLRQFYSHH
EKDTRCLGAT
AQQFHRHKQL
IRFLKRLDRN
LWGLAGLNSC
PVKEANQSTL
ENFLERLKTI
MREKYSKCSS
C658H1071N193O197S8
15 096 Da
La rhIL-4 es un polipptido de cadena simple de 130 residuos de aminocido expresados en Escherichia coli. Se produce como
un polvo liofilizado y contiene no menos de 0,5 107 Unidades USP de IL-4/mg de protena total. Las impurezas de ADN de
la clula anfitriona especficas del proceso en IL-4 con lmites de menos de 1 ng/mg se determinan segn se indica en Tcnicas Basadas en cidos NucleicosEnfoques para Detectar Trazas de cidos Nucleicos (Anlisis de ADN Residual) 1130. La IL-4
que se usa como material auxiliar durante la fabricacin no requiere licencia de fabricacin ni aprobacin comercial. A continuacin se presentan los atributos de calidad tpicos de la IL-4.
IDENTIFICACIN
A. El anlisis de la secuencia amino-terminal de al menos ocho aminocidos se realiza con un secuenciador automtico, segn se indica en Artculos Obtenidos por Biotecnologa 1045. Los feniltiohidanton-aminocidos liberados en etapas se identifican mediante cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa en lnea, basndose en sus tiempos de elucin.
B. Usar el mtodo de electroforesis seguido del anlisis por Western blot para visualizar la protena IL-4. El mtodo es electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), descrito en la prueba de Pureza.
USP 38
Pruebas Biolgicas / 92 Factores de Crecimiento 187
VALORACIN
PUREZA: [NOTALa pureza se determina sobre la materia prima.] Se lleva a cabo una SDS-PAGE segn se indica en Artculos
Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida 1056 en condiciones reductoras y no reductoras.
Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular adecuado que contenga bandas de protenas entre
10 y 200 kDa.
Solucin salina amortiguada con fosfatos: Cloruro de potasio 2,67 mM, fosfato de potasio (KH2PO4) 1,47 mM, cloruro
de sodio 137,93 mM y fosfato dibsico de sodio 8,06 mM en agua. Ajustar a un pH de 7,07,3.
Solucin amortiguadora de Laemmli, no reductora: TRIS-HCl 100 mM, pH 6,8, 50% de glicerol, 0,25% de indicador de
azul de bromofenol y 10% de lauril sulfato de sodio en agua
Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora: Agregar 2,5 mL mercaptoetanol a 50 mL de Solucin amortiguadora de
Laemmli, no reductora.
Solucin madre de la muestra: 400 mg/mL de IL-4 a granel en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin muestra 1: Combinar 20 mL de Solucin madre de la muestra y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin muestra 2: Combinar 20 mL de Solucin madre de la muestra y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solucin madre de control A: 4 mg/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra en Solucin salina amortiguada con
fosfatos. [NOTALas soluciones de control A se corren por triplicado tanto en condiciones reductoras como en no reductoras.]
Solucin 1 de control A: Combinar 20 mL de Solucin madre de control A y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin 2 de control A: Combinar 20 mL de Solucin madre de control A y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Solucin madre de control B: 12 mg/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. [NOTALas soluciones de control B se corren por duplicado tanto en condiciones reductoras como en no reductoras.]
Solucin 1 de control B: Combinar 20 mL de Solucin madre de control B y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin 2 de control B: Combinar 20 mL de Solucin madre de control B y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli,
reductora.
1
2
Un anticuerpo anti-IL-4 adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Dianova Inc.).
Un sistema de deteccin adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Pierce/Perbio Science).
Captulos
Solucin salina amortiguada con fosfatos; Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora; y Solucin amortiguadora
de Laemmli, no reductora: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza en la Valoracin.
Solucin madre del estndar: 50 mg/mL de ER rInterleukina 4 Humana USP reconstituida en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. [NOTANo agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Solucin estndar: 20 mg/mL de IL-4, a partir de Solucin madre del estndar, en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin estndar, reductora: Combinar 20 mL de Solucin estndar y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solucin estndar, no reductora: Combinar 20 mL de Solucin estndar y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solucin madre de la muestra: 50 mg/mL de IL-4 reconstituida en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTANo
agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Solucin muestra: 20 mg/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra, en Solucin salina amortiguada con fosfatos
Solucin muestra, reductora: Combinar 20 mL de Solucin muestra y 5 mL de Solucin amortiguadora de Laemmli, reductora.
Solucin muestra, no reductora: Combinar 20 mL de Solucin muestra y 5 mL de Solucin amortiguadora de muestra de
Laemmli, no reductora.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar, reductora; Solucin estndar, no reductora; Solucin muestra, reductora; y Solucin muestra, no
reductora
Western blot: Despus de la electroforesis, las protenas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) usando procedimientos estndares. Incubar la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con Solucin salina amortiguada con fosfatos que contenga 0,1% de polisorbato 20 y 5% de leche en polvo descremada. Posteriormente, la
membrana se incuba con un anticuerpo anti-IL-41 (diluido apropiadamente en Solucin salina amortiguada con fosfatos), y
luego con un anticuerpo secundario, a temperatura ambiente y agitacin suave, durante 1 hora para cada uno de los anticuerpos. La banda de la protena IL-4 se identifica desarrollando la membrana usando un sistema de deteccin adecuado.2
Criterios de aceptacin: El Western blot desarrollado debe proporcionar una seal positiva equivalente al ER rInterleukina
4 Humana USP.
188 92 Factores de Crecimiento / Pruebas Biolgicas
USP 38
Condiciones electroforticas
(Ver Artculos Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida 1056.)
Modo: Gel para PAGE discontinuo
Gel concentrador: Acrilamida al 4%
Gel de resolucin: Acrilamida al 12%
Condiciones de corrida: 10 minutos a 100 V; luego 30 minutos a 200 V
Deteccin de protenas: Tincin con plata
Anlisis
Muestras: Solucin muestra 1, Solucin muestra 2, Solucin 1 de control A, Solucin 2 de control A, Solucin 1 de control B y
Solucin 2 de control B
Incubar 25 mL de Solucin muestra y de Solucin control en condiciones no reductoras durante 5 minutos a 60 y cargar en
el gel. Incubar 20 mL de Solucin muestra y de Solucin control en condiciones reductoras durante 5 minutos a 60, y
cargar en el gel. Despus de la tincin con plata y de barrer todo el gel, determinar la intensidad de todas las bandas de
protena detectables por densitometra y calcular el porcentaje de cada banda de protena detectable en la Solucin
muestra dos veces comparando la intensidad de los pixeles de cada banda contaminante con el valor promedio de las
Soluciones de Control A y B, respectivamente, por las frmulas:
Resultado = (A100) 1/(A1); y
Captulos
Resultado = (A100) 3/(A3)

A100
= intensidad de una banda contaminante de la Solucin muestra
A1
= intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solucin de control A
A3
= intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solucin de control B
El anlisis de las soluciones de control de IL-4 debe producir una banda detectable con un peso molecular aparente de
aproximadamente 15 kDa. Si los valores calculados mediante la Solucin de control A son diferentes de los que se obtienen por comparacin con la Solucin de control B, se debe tomar el valor correspondiente a la cantidad ms alta de impureza. Si la intensidad de una de las bandas contaminantes es menor que el valor de la Solucin de control A (correspondiente a 1%), el valor de esta contaminacin se ajusta a 1%. La pureza de la solucin muestra se calcula de la siguiente
manera:
Resultado = 100 S Cn
C
= porcentaje de cada contaminacin provista en nmeros enteros redondeados
n
= nmero de contaminantes de IL-4 de la Solucin muestra
Criterios de aceptacin: La pureza de IL-4 es no menos de 97%, segn se determina mediante SDS-PAGE.
CONTENIDO DE PROTENAS: [NOTAEl contenido de protenas se determina basndose en el producto envasado.]
Solucin salina amortiguada con fosfatos: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza.
Solucin muestra: 50 mg/mL de IL-4 en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTANo agitar mientras se mezcla;
mezclar suavemente por rotacin.]
Blanco: Solucin salina amortiguada con fosfatos
Condiciones espectromtricas
Modo: UV
Anlisis
Muestras: Solucin muestra y Blanco
Calcular la concentracin de protenas:
C = A280/0,63
C
A280
= concentracin de IL-4 de la Solucin muestra (mg/mL)

= absorbancia a 280 nm
PRUEBAS ESPECFICAS
IDENTIDAD BIOLGICA: [NOTALa medicin de la actividad biolgica se determina basndose en el producto envasado.]
Medio RPMI 1640 con L-glutamina: Preparar una mezcla de los ingredientes en las cantidades que se presentan en la siguiente tabla en suficiente agua para obtener 1 L de medio y esterilizar mediante filtracin:
Material
Cantidad
Nitrato de calcio (Ca(NO3)4H2O)
100 mg
Sulfato de magnesio (MgSO47H2O)
100 mg
Cloruro de potasio
400 mg
Pruebas Biolgicas / 92 Factores de Crecimiento 189
USP 38
Material
Cantidad
Cloruro de sodio
6000 mg
Fosfato dibsico de sodio anhidro
800 mg
Bicarbonato de sodio
2000 mg
Glicina
10 mg
L-Arginina
200 mg
L-Asparagina
50 mg
cido L-asprtico
20 mg
Diclorhidrato de L-cistina
20 mg
cido L-glutmico
20 mg
L-Glutamina
300 mg
L-Histidina
15 mg
L-Hidroxiprolina
20 mg
L-Isoleucina
50 mg
L-Leucina
50 mg
Clorhidrato de L-lisina
40 mg
L-Metionina
15 mg
L-Fenilalanina
15 mg
20 mg
L-Serina
30 mg
L-Treonina
20 mg
L-Triptfano
5 mg
Sal disdica de L-tirosina dihidrato
20 mg
L-Valina
20 mg
Biotina
0,2 mg
Cloruro de colina
D-Pantotenato
3 mg
de calcio
0,25 mg
cido flico
1 mg
i-Inositol
35 mg
Niacinamida
1 mg
cido para-aminobenzoico
1 mg
Clorhidrato de piridoxina
1 mg
Riboflavina
0,2 mg
Clorhidrato de tiamina
1 mg
Vitamina B12
0,005 mg
D-Glucosa
2000 mg
(dextrosa)
Glutationa (reducida)
1 mg
Rojo de fenol
5 mg
Medio de crecimiento: Usando procedimientos aspticos, preparar el siguiente medio de cultivo de tejidos:
RPMI-1640 con L-glutamina
500 mL
Piruvato de sodio 100 mM
5 mL
Suero fetal bovino
50 mL
rFEC-GM humanoa
3 104 Unidades Internacionales
El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrfagos (FEC-GM) se agrega de manera extempornea.
Esterilizar mediante filtracin y almacenar a una temperatura entre 2 y 8. Usar dentro del periodo de 1 mes. Agregar el
FEC-GM inmediatamente antes de su uso.
Medio de valoracin: Usar Medio de crecimiento que no contenga FEC-GM.
Solucin salina amortiguada con fosfatos: Proceder segn se indica en la prueba de Pureza en la Valoracin.
Solucin de resazurina : 11 mg de resazurina en 100 mL de Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTAEsterilizar
mediante filtracin y almacenar la solucin protegida de la luz a 4. La Solucin de resazurina es estable durante al menos 6
meses si se trata en condiciones estriles.]
[NOTAPara todas las Soluciones estndar y Soluciones muestra, la concentracin de IL-4 se determina mediante fotometra
a 280 nm usando un coeficiente de extincin (e) de 0,63 mg1cm1.]
Captulos
L-Prolina
Captulos
190 92 Factores de Crecimiento / Pruebas Biolgicas
USP 38
Solucin madre del estndar: 50 mg/mL de ER rInterleukina 4 Humana USP en Solucin salina amortiguada con fosfatos.
[NOTANo agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Soluciones estndar: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0,15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solucin madre del estndar en Medio de valoracin
Solucin madre de la muestra: 50 mg/mL de IL-4 en Solucin salina amortiguada con fosfatos. [NOTANo agitar mientras
se mezcla; mezclar suavemente por rotacin.]
Soluciones muestra: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0,15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solucin madre de la muestra en Medio de valoracin
Solucin control: Usar el Medio de valoracin.
Preparacin del cultivo celular: Preparar cultivos celulares de la lnea celular TF-1 dependiente del factor humano (ATCC
N CRL-2003), siguiendo el protocolo descrito en la hoja de informacin de ATCC. Realizar transferencias de los cultivos
cada 23 das, usando subcultivos 1:3 de las clulas durante un mximo de 1 mes. La densidad de siembra debe ser de 0,5
106 clulas/mL y la densidad mxima debe ser de 3 106 clulas/mL. La viabilidad de las clulas debe ser >90%. El nmero mximo de pasajes es 24 y el tiempo de cultivo mximo a partir de la descongelacin es 28 das. Despus de 28 das,
iniciar un nuevo cultivo. Las clulas se propagan usando Medio de cultivo a 37, suplementado con aire y dixido de carbono al 5%.
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar, Soluciones muestra y Solucin control
La actividad de la Solucin muestra se determina por duplicado. Lavar las clulas tres veces en Solucin salina amortiguada
con fosfatos. Colocar en una placa 2 104 clulas TF-1 resuspendidas en 100 mL de Medio de valoracin por pocillo en
microplacas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar durante 72 horas a 37 y en una atmsfera de CO2 al 5% en un
incubador humidificado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Solucin estndar, Solucin muestra o
Solucin control agregando 100 mL de la solucin correspondiente a cada pocillo. Agregar 30 mL de Solucin de resazurina
a cada pocillo e incubar durante 24 horas ms. Determinar la intensidad de la fluorescencia por pocillo leyendo la placa
con un lector de microplaca usando 544 nm (excitacin) y 590 nm (emisin). Convertir la intensidad de fluorescencia
en cada pocillo a un porcentaje de intensidad de fluorescencia mxima. Para la Solucin muestra y la Solucin estndar,
graficar el porcentaje de la intensidad de fluorescencia en funcin de la concentracin de la solucin pertinente. Usando
el mtodo de cuadrados mnimos del anlisis de regresin, calcular el ED50 en ng/mL de la Solucin muestra y la Solucin
estndar. El coeficiente de determinacin para la curva de regresin debe ser 0,98. Calcular la potencia en Unidades
USP de Interleukina 4/mg:
Resultado = A ES/EU
A
= actividad de ER rInterleukina 4 Humana USP (unidades USP/mg)
ES
= ED50 determinado de la Solucin estndar (ng/mL)
EU
= ED50 determinado de la Solucin muestra (ng/mL)
Criterios de aceptacin: No menos de 0,5 107 Unidades USP de IL-4/mg
PRUEBAS DE ESTERILIDAD 71: Cumple con los requisitos
PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS 85: Contiene no ms de 50 Unidades USP de Endotoxina/mg
ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Conservar en envases impermeables y almacenar a 80.
ETIQUETADO: El material se origina de ADN recombinante.
ER Endotoxina USP
ER rInterleukina 4 Humana USP
111 DISEO Y ANLISIS DE VALORACIONES BIOLGICAS

Informacin General
La potencia de varios medicamentos farmacopeicos debe determinarse mediante valoraciones biolgicas. Un factor a controlar en el diseo y en los anlisis de las valoraciones es la variabilidad del sistema de pruebas biolgicas, cuya respuesta media puede variar de un laboratorio a otro y, ocasionalmente, dentro de un mismo laboratorio. Para controlar este tipo de variacin, la respuesta a un medicamento farmacopeico se compara con un Estndar de Referencia USP u otro estndar apropiado.
Por conveniencia, se denominar a cada una de estas preparaciones Estndar y a cada preparacin que se est valorando, o
Muestra, la Incgnita, y se designarn respectivamente con las letras S y U. (A veces se denomina preparacin de prueba a
la Muestra.)
Pruebas Biolgicas / 111 Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 191
USP 38
Despus de eliminar las variables extraas de la comparacin entre el Estndar y la Incgnita, se calcular la varianza del
error a partir de la variacin restante que, a pesar de que no se puede controlar, se puede medir. Se necesita la varianza del
error para calcular el intervalo de confianza de la potencia valorada. El intervalo de confianza se calcula de modo tal que se
espera que los lmites inferior y superior de este intervalo cubran la potencia verdadera de la Incgnita en 19 de cada 20 valoraciones. Muchas valoraciones fijan la amplitud aceptable del intervalo de confianza y puede que se necesiten dos o ms valoraciones independientes para cumplir el lmite especificado. Los lmites de confianza de las valoraciones de los componentes
individuales generalmente se superponen.
El objetivo de este captulo es presentar un resumen conciso de los procedimientos biomtricos para las valoraciones biolgicas de la USP. Las diferentes secciones estn interrelacionadas. Aunque los procedimientos se disean fundamentalmente para
la valoracin de una nica Incgnita, las ecuaciones para la valoracin conjunta de varias Incgnitas se ofrecen en contexto a
lo largo del captulo y aparecen en forma de resumen en el ltimo apartado. La prueba de que una potencia valorada cumple
con los requisitos necesarios respecto a los lmites de confianza tambin puede basarse en otros mtodos biomtricos reconocidos que tengan una precisin equivalente a los mtodos que se describen en este documento.
Al final de este captulo se incluye un glosario de los trminos utilizados en las ecuaciones.
Pasos Previos al Clculo de la Potencia
Tabla 1
Prueba para detectar valores aberrantes. En muestras tomadas de una poblacin normal, los intervalos iguales o mayores que los
siguientes valores de G1, G2 y G3 suceden con una probabilidad de P = 0,02 en donde los valores aberrantes pueden suceder slo
en uno de los extremos o con una probabilidad de P = 0,04 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos extremos.
N
G1
0,976
0,846
0,729
0,644
0,586
10
11
12
13
G2
0,780
0,725
0,678
0,638
0,605
0,578
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
G3
0,602
0,579
0,559
0,542
0,527
0,514
0,502
0,491
0,481
0,472
0,464
Captulos
Diseos para Minimizar la Varianza del ErrorLa variacin en la respuesta se reduce tanto como es posible mediante los
lmites impuestos con respecto al peso corporal, la edad, la manipulacin previa, el entorno y otros factores similares. En algunas valoraciones, las diferentes dosis del Estndar y de la Incgnita se asignan de manera aleatoria a los animales de prueba o
sus equivalentes, pero dividindolos en grupos con igual nmero de individuos. Esto implica un proceso objetivo de seleccin
al azar, como por ejemplo tirar los dados, barajar las cartas o utilizar una tabla con nmeros aleatorios. Al asignar el mismo
nmero de individuos a cada tratamiento, los clculos se simplifican sustancialmente y, por lo general, tambin da lugar al
menor intervalo de confianza para un nmero dado de observaciones.
En algunas valoraciones, las respuestas potenciales pueden reunirse en conjuntos homogneos antes del tratamiento. Las diferencias entre los conjuntos se pueden separar posteriormente, de manera que no afecten adversamente ni a la potencia calculada ni a su intervalo de confianza. Cada tratamiento se adjudica a una unidad seleccionada aleatoriamente dentro de cada
conjunto. Ejemplos de conjuntos aleatorios son las zonas transparentes en una placa individual en la valoracin de un antibitico o cuatro lecturas pareadas sucesivas en la misma rata en la valoracin de la Inyeccin de Vasopresina. Se presentan conjuntos de dos cuando cada animal de prueba se emplea dos veces, como en las valoraciones de Inyeccin de Cloruro de Tubocurarina y de Inyeccin de Insulina. En estos casos, ni las diferencias promedio entre individuos ni el orden de los tratamientos
pueden influir de manera parcial en la potencia o en la precisin. En las valoraciones microbiolgicas de actividad de vitamina
B12 y de pantotenato de calcio, las rplicas, en sus respectivos tubos, se asignan a dos o ms conjuntos separados y completos,
preferentemente distribuyendo los tubos al azar dentro de cada conjunto. Esto restringe la variacin causada por la posicin u
orden dentro de un conjunto a las diferencias dentro de cada rplica completa.
Rechazo de Observaciones Aberrantes o ErrticasUna respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el procedimiento durante el curso de una valoracin es rechazada. Otros valores aberrantes pueden descubrirse slo despus de tabular las respuestas, pero entonces pueden relacionarse con irregularidades en la valoracin que justifiquen su omisin. El rechazo arbitrario o la conservacin arbitraria de un resultado aparentemente aberrante pueden ser una importante fuente de parcialidad. Por lo general, el rechazo de observaciones que se basa nicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que
debe usarse con poca frecuencia. Cuando esto sea inevitable, cada respuesta que se sospecha es aberrante o anmala deber
analizarse conforme a uno de los criterios siguientes:
1. El primer criterio se basa en la variacin dentro de un grupo nico de respuestas supuestamente equivalentes. En promedio se rechazar una observacin vlida una vez cada 25 o una vez cada 50 pruebas siempre que pocas o ninguna de las respuestas en el grupo sean idnticas. Empezando con el valor supuestamente aberrante o errtico, se deben designar las respuestas en orden de magnitud de y1 a yN, en donde N representa el nmero de observaciones en el grupo. Calcular el intervalo relativo G1 = (y2 y1)/(yN y1) cuando N = 3 a 7, G2 = (y3 y1)/(yN1 y1) cuando N = 8 a 13, o G3 = (y3 y1)/(yN2 y1)
cuando N = 14 a 24. Si G1, G2 o G3 exceden el valor crtico que aparece en la Tabla 1 para el valor de N observado, existe una
base estadstica para omitir el valor aberrante.
192 111 Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas / Pruebas Biolgicas
USP 38
Este criterio tambin se aplica a las valoraciones microbiolgicas, en las que cada tratamiento se representa mediante una
transmitancia en cada uno de dos conjuntos completos separados. El valor de cada transmitancia en el primer conjunto se
resta de su valor pareado en el segundo conjunto y se registra cada diferencia con su signo, ya sea positivo o negativo. Comenzando con la diferencia ms divergente, se designan las N diferencias en orden de magnitud de y1 a yN y se calcula el
intervalo relativo G1, G2 o G3. Si esta diferencia excede su valor crtico que aparece en la Tabla 1, una de las dos transmitancias
que producen la diferencia aberrante es sospechosa y puede identificarse por inspeccin o por comparacin con su valor esperado (ver la siguiente columna). Se repite el proceso con las diferencias restantes si se sospechara un valor aberrante en un
segundo par.
2. El segundo criterio compara los intervalos de una serie de k = 2 o ms grupos. Grupos diferentes pueden recibir tratamientos diferentes pero todas las respuestas f dentro del mismo grupo representan el mismo tratamiento. Calcular el intervalo
de cada grupo restando la respuesta menor de la respuesta mayor dentro de cada uno de los k grupos. Dividir el mayor de los
k intervalos entre la suma de todos los intervalos en la serie. Consultar este cociente R* en la Tabla 2. Si k no es mayor de 10,
usar los valores tabulados que figuran en la parte superior de la Tabla 2; si k es mayor de 10, multiplicar R* por (k + 2) e interpolar, si fuera necesario, entre los valores tabulados en la parte inferior de la Tabla 2. Si R* excede el valor interpolado o tabulado, el grupo con el intervalo mayor es sospechoso y la inspeccin de sus componentes generalmente permitir identificar la
observacin que luego se asumir que es aberrante o anmala. Se puede repetir el proceso con los intervalos restantes si se
sospechara un valor aberrante en un segundo grupo.
Tabla 2
Captulos
Prueba para grupos que contienen valores aberrantes. Calcular el intervalo de las f observaciones en cada uno de los k grupos,
cuando todos los grupos de la serie son de igual tamao. El cociente R* observado entre el intervalo mayor y la suma de los k
intervalos deber exceder o ser igual a los siguientes valores crticos con una probabilidad de P = 0,05.
R* Crtico para Intervalos de f Observaciones Cada Uno
N de
Intervalos k
10
0,962
0,862
0,803
0,764
0,736
0,717
0,702
0,691
0,682
,813
,667
,601
,563
,539
,521
,507
,498
,489
,681
,538
,479
,446
,425
,410
,398
,389
,382
,581
,451
,398
,369
,351
,338
,328
,320
,314
0,267
0,508
0,389
0,342
0,316
0,300
0,288
0,280
0,273
,451
,342
,300
,278
,263
,253
,245
,239
,234
,407
,305
,267
,248
,234
,225
,218
,213
,208
,369
,276
,241
,224
,211
,203
,197
,192
,188
10
,339
,253
,220
,204
,193
,185
,179
,174
,172
N de
Intervalos k
10
10
4,06
3,04
2,65
2,44
2,30
2,21
2,14
2,09
2,05
R*(k + 2) Crtico para Intervalos de f Observaciones Cada Uno
12
4,06
3,03
2,63
2,42
2,29
2,20
2,13
2,07
2,04
15
4,06
3,02
2,62
2,41
2,28
2,18
2,12
2,06
2,02
20
4,13
3,03
2,62
2,41
2,28
2,18
2,11
2,05
2,01
50
4,26
3,11
2,67
2,44
2,29
2,19
2,11
2,06
2,01
Reemplazo de Valores FaltantesTal como se indica en las monografas y en este apartado, el clculo de la potencia y su
intervalo de confianza a partir de la respuesta total para cada dosis de cada preparacin requiere el mismo nmero de observaciones en cada total. Cuando se pierden observaciones o se han obtenido respuestas adicionales con el Estndar, el equilibrio
se puede restablecer mediante uno de los siguientes procedimientos a fin de que se puedan emplear las ecuaciones usuales.
1. Reducir el nmero de observaciones en los grupos ms grandes hasta que el nmero de respuestas sea el mismo para
cada tratamiento. Si se han asignado animales aleatoriamente a cada grupo de tratamiento se puede omitir una o ms respuestas, seleccionadas aleatoriamente, de cada grupo ms grande o se puede restar la media de cada grupo ms grande de su
total inicial, cuantas veces sea necesario. Se prefiere esta ltima tcnica cuando se han asignado deliberadamente animales adicionales para el Estndar. Cuando la valoracin consiste en conjuntos aleatorios, deben retenerse slo los conjuntos completos.
2. Alternativamente, un grupo ms pequeo ocasional puede llevarse al tamao adecuado cuando el nmero de respuestas
faltantes no sea ms de una en cualquier tratamiento, o no represente ms del 10% de la totalidad de la valoracin. Estimar el
valor de reemplazo para cada valor faltante ya sea por el Mtodo a o el Mtodo b. Se pierde un grado de libertad (n) de la
varianza del error s2 por cada reemplazo realizado mediante cualquiera de los dos mtodos, excepto en las valoraciones microbiolgicas en donde cada respuesta est basada en la suma de dos o ms transmitancias y slo se reemplaza una transmitancia.
(a) Si los animales han sido asignados aleatoriamente a los tratamientos, sumar la media de las respuestas restantes del grupo incompleto a su total. En una valoracin microbiana, cuando para un tratamiento dado falte una de dos transmitancias,
USP 38
para obtener el reemplazo sumar a la transmitancia restante la diferencia media entre conjuntos, calculada a partir de todos los
pares completos.
(b) Si la valoracin consiste en grupos tomados al azar, reemplazar el valor faltante mediante:
donde f es el nmero de conjuntos, k es el nmero de tratamientos o dosis y Tr, Tt y T son los totales incompletos para el
conjunto aleatorio, el tratamiento y la valoracin a los que les falta una observacin.
Si la valoracin consiste en n cuadrados latinos con k filas en comn, reemplazar un valor faltante mediante:
en donde n es el nmero de cuadrados latinos con k filas en comn, k es el nmero de tratamientos o dosis y Tc, Tr, Tt y T
son respectivamente los totales incompletos para la columna, fila, tratamiento y valoracin a los que les falta una observacin.
Si falta ms de un valor, sustituir temporalmente los lugares vacos, excepto uno, con la media del tratamiento y calcular y
para el otro mediante la Ecuacin 1. Reemplazar a su vez cada una de las sustituciones iniciales mediante la Ecuacin 1 y repetir
el proceso en aproximaciones sucesivas hasta obtener una y estable para cada observacin faltante.
Clculo de la Potencia a partir de una Valoracin nica
M = M + log R
(2)
o
Potencia = P* = antilog M = (antilog M)R
Valoraciones a partir de Determinaciones Directas de la Dosis UmbralLa Inyeccin de Cloruro de Tubocurarina y el
Yoduro de Metocurarina se valoran a partir de la dosis umbral mnima que produce una respuesta biolgica caracterstica. El
cociente entre la dosis umbral media para el Estndar y la dosis umbral media para la Incgnita proporciona directamente la
potencia. La dosis umbral se determina dos veces en cada animal, una vez con el Estndar y una vez con la Incgnita. Cada
dosis se convierte en su logaritmo, se determina la diferencia (x) entre los dos logaritmos de las dosis para cada animal y se
calcula la potencia a partir del promedio de estas diferencias.
En la Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85, el punto final de la dilucin de la media geomtrica para la Incgnita que corresponde al punto final de la dilucin de la media geomtrica del Estndar (multiplicado por un factor de dilucin, si fuera
aplicable) proporciona la concentracin de endotoxinas en el material en anlisis.
En estas valoraciones, el intervalo de confianza depende de la variabilidad en la dosis umbral.
Valoraciones Indirectas a partir de la Relacin entre el Logaritmo de la Dosis y la RespuestaPor lo general, la dosis
umbral no puede medirse directamente; por lo tanto, la potencia se determinar indirectamente por comparacin de las respuestas a dosis conocidas del Estndar con las respuestas despus de una o varias dosis similares de la Incgnita. Dentro de un
intervalo de dosificacin restringido, generalmente se puede graficar una medida adecuada de la respuesta como una lnea
recta frente al logaritmo de la dosis, lo que simplifica el clculo de la potencia y su intervalo de confianza. En cada valoracin
se determinan tanto la pendiente como la posicin de la relacin de la respuesta en funcin del logaritmo de la dosis usando
dos o ms niveles del Estndar o, preferentemente, del Estndar y de la Incgnita.
En la valoracin de la Heparina Sdica, el intervalo entre la dosis con la que ocurre la coagulacin y la dosis que no produce
coagulacin es tan pequeo que la curva dosis-respuesta no se determina explcitamente. En su lugar, se usan promedios mviles para interpolar el logaritmo de la dosis correspondiente al 50% de coagulacin, tanto para el Estndar como para la Incgnita, que llevan al logaritmo de la potencia (ver Clculos en Heparina Sdica). La precisin de la potencia se estima a partir
de la concordancia entre valoraciones independientes de la misma Incgnita.
En el caso de un frmaco al que se le realiza una valoracin biolgica, la respuesta debe graficarse como una lnea recta
frente al logaritmo de la dosis a lo largo de un intervalo adecuado de dosis. Cuando se requiere una prueba preliminar o la
Captulos
En las monografas individuales se dan instrucciones para calcular la potencia a partir de los datos de una valoracin nica.
En aquellas valoraciones que especifican una interpolacin grfica de curvas de dosis- respuesta pero que cumplen las condiciones para la validez de la valoracin que se establecen en este documento, la potencia se puede calcular alternativamente
por el mtodo apropiado de este apartado.
La planificacin de la valoracin implica asignar una potencia supuesta a la Incgnita, para poder administrarla en dosificaciones equivalentes a las del Estndar. Mientras ms aproximada sea la concordancia entre esta suposicin inicial y el resultado
de la valoracin, ms precisa ser la potencia calculada. El cociente entre una dosis dada del Estndar, en mg o Unidades USP y
la dosis correspondiente de la Incgnita, medido como se especifica en la monografa, se designa de manera uniforme como
R. El logaritmo de la potencia relativa en cantidades que inicialmente se supone que son iguales a las del Estndar, se designa
como M.
Idealmente, M no debiera diferir significativamente de cero. El logaritmo de la potencia es ecuacin 2
USP 38
valoracin depende de la interpolacin a partir de una curva de dosis mltiples del Estndar, se graficar en papel milimetrado
la respuesta media del Estndar a cada nivel de dosis en el eje de las ordenadas frente al logaritmo de la dosis x en el eje de las
abscisas. Si la representacin muestra una tendencia bsicamente lineal a lo largo del intervalo de dosis requerido, la unidad de
respuesta inicial se puede usar directamente como y; si por el contrario la tendencia es visiblemente curvilnea, una transformacin adecuada de cada lectura inicial podr conferir linealidad.
Una posibilidad para ello es la trasformacin en logaritmos; otra transformacin, en el caso de las valoraciones microbiolgicas en tubos de ensayo, en donde y = (100 % de transmitancia) no se representa grficamente en forma lineal en funcin del
logaritmo de la dosis x, es la trasformacin en probitas. En este caso, si la absorbancia no se puede leer directamente, en primer lugar el porcentaje de transmitancia para cada tubo o solucin de prueba se debe convertir en la absorbancia A= 2
log(% de transmitancia). Cada valor de absorbancia, a su vez se convierte en un % de reduccin del crecimiento bacteriano
como lo expresa la frmula:
% de reduccin = 100(AC A)/AC
en donde Ac es la densidad media para los tubos control (sin antibiticos o con exceso de vitamina) en el mismo conjunto o
gradilla de tubos. La reduccin porcentual se transforma luego en probitas (ver Tabla 3) a fin de obtener una nueva y para
clculos posteriores. La transformacin en probitas ofrece la ventaja de ampliar el intervalo de trabajo de linealidad an cuando
una porcin de la relacin dosis-respuesta no sea lineal en las unidades originales de porcentaje de transmitancia, siempre que
el perodo de incubacin no se extienda mas all de la fase logartmica de crecimiento de los tubos de control.
Tabla 3
Captulos
Probitas (desviacin normal + 5) correspondientes a los porcentajes que figuran en los mrgenes.
0
2,67
2,95
3,12
3,25
3,36
3,45
3,52
3,59
3,66
10
3,72
3,77
3,82
3,87
3,92
3,96
4,01
4,05
4,08
4,12
20
4,16
4,19
4,23
4,26
4,29
4,33
4,36
4,39
4,42
4,45
30
4,48
4,50
4,53
4,56
4,59
4,61
4,64
4,67
4,69
4,72
40
4,75
4,77
4,80
4,82
4,85
4,87
4,90
4,92
4,95
4,97
50
5,00
5,03
5,05
5,08
5,10
5,13
5,15
5,18
5,20
5,23
60
5,25
5,28
5,31
5,33
5,36
5,39
5,41
5,44
5,47
5,50
70
5,52
5,55
5,58
5,61
5,64
5,67
5,71
5,74
5,77
5,81
80
5,84
5,88
5,92
5,95
5,99
6,04
6,08
6,13
6,18
6,23
90
6,28
6,34
6,41
6,48
6,55
6,64
6,75
6,88
7,05
7,33
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
99
7,33
7,37
7,41
7,46
7,51
7,58
7,65
7,75
7,88
8,09
La DL50 en la prueba de Seguridad para Hierro Dextrn, Inyeccin se calcula con logaritmos de dosis y probitas. Las cuatro
dosis de la Inyeccin, en mg de hierro por kg de peso corporal se transforman en x1 = 2,574, x2 = 2,699, x3 = 2,875 y x4 =
3,000. Las probitas correspondientes al nmero de muertes observadas en cada grupo de 10 ratones se designan respectivamente como y1, y2, y3 e y4 y figuran en la Tabla 3 para mortalidades de 10 a 90 por ciento. Para las muertes observadas de 0 y
10 adyacentes a las dosis que proporcionan una mortalidad intermedia, emplear las probitas aproximadas de 3,02 y 6,98 respectivamente; omitir el valor final (a x1 o x4) si no es adyacente a una mortalidad intermedia. Puesto que la informacin en una
probita vara con su valor esperado, se debe asignar a cada probita una ponderacin relativa aproximada w para calcular la
DL50 de la Inyeccin, como se muestra en la siguiente tabla.
N de Muertes
0 10
19
2u8
37
4a6
Ponderacin, w
0,3
0,7
1,0
1,2
1,3
Calcular las medias ponderadas

x = S(wx)/Sw
y
(2a)
y = S(wy)/Sw
a partir de la suma de las ponderaciones, Sw, de las cuatro (o tres) respuestas aceptables y la sumas ponderadas correspondientes de los logaritmos de las dosis, S(wx) y de las probitas, S(wy). A partir de las sumas de los productos ponderados,
S(wxy), y de los cuadrados ponderados, S(wx2), calcular la pendiente b de la lnea de logaritmo de dosis-probita, por la frmula:
b = [S(wxy) xS(wy)]/[S(wx2) xS(wx)]
(2b)
La DL50 para esta prueba de seguridad, en mg de hierro por kg de peso corporal, se calcula como:
USP 38
DL50 = antilog[x + (5 y)/b]
(2c)
En las valoraciones cuantales, que no estn incluidas en esta Farmacopea, como por ejemplo la valoracin de insulina en ratones, los clculos con probitas involucran otros ajustes que se omiten en este documento.
Cuando la respuesta media yt para cada dosis del Estndar se grafica linealmente frente al logaritmo de la dosis y las k dosis
se espacian a intervalos iguales en la escala logartmica, las respuestas esperadas (YL e YH) en los extremos de la lnea que mejor
se ajuste pueden calcularse directamente usando los coeficientes x* que figuran en la Tabla 4, que corresponden a los sucesivos
k logaritmos de dosis, como:
YL = S(x*yt)/divisor
y
(3)
YH = S(x*yt)/divisor
en donde S representa de manera uniforme la suma de los valores que le siguen. Cuando YL e YH se representan grficamente en funcin del logaritmo de las dosis bajas y altas, XL y XH, respectivamente, pueden conectarse mediante una lnea recta
con la pendiente:
b = (YH YL)/(XH XL)
(4)
A cualquier logaritmo de dosis x seleccionado del Estndar, la respuesta esperada es:

Y = y + b(x x)
(5)
Tabla 4
Coeficientes x* para calcular las respuestas YL e YH pronosticadas mediante los cuadrados mnimos para el valor inferior y superior de k logaritmos de dosis cuando estos se encuentran espaciados a intervalos iguales.
Coeficiente x* para Respuesta Media yt al Logaritmo de Dosis
N de
Dosis
Extremo Pronosticado Y
YL
YH
4
5
6
Divisor
YL
YH
10
YL
YH
YL
11
21
YH
11
21
10
5
5
Cuando la relacin de la respuesta en funcin del logaritmo de la dosis es lineal, pero las k dosis (expresadas en mL) estn
espaciadas sustancialmente en una secuencia aritmtica como en la Tabla 5 (que se refiere a las valoraciones microbiolgicas
que se establecen en AntibiticosValoraciones Microbiolgicas 81), la pendiente b de la lnea recta que mejor se ajusta se
puede calcular con los trminos que figuran en la Tabla 5 y la respuesta media a cada dosis yt, o Tt = fyt en donde el nmero (f)
de las y es constante a cada dosis, se puede calcular como:
b = S(x1yt)/ebi = S(x1Tt)/febi
(6)
Los coeficientes x1 son mltiplos convenientes de las diferencias (x x) respecto de la media del logaritmo de dosis x y ebi es
el mltiplo correspondiente de S(x x)2. La respuesta prevista y a un logaritmo de dosis x se puede calcular mediante la sustitucin de la pendiente b de la valoracin en la Ecuacin 5 y de la media y o bien de todas las respuestas del Estndar en la
totalidad de la valoracin o de las correspondientes para cada conjunto por separado.
Tabla 5
Coeficientes x1 para calcular la pendiente b de una curva de logaritmo de dosis-respuesta cuando las dosis estn espaciadas como se muestra en la escala aritmtica.
Coeficientes x1 para Calcular b a partir de las Respuestas y a Dosis, en mL,
de:
N de Dosis
1,5
Divisor ebi
Media del Logaritmo de Dosis x
29
12
12
29
14,4663
0,38908
34
15
23
24,7827
0,41584
20
11
11
18
13,3249
0,45105
Captulos
en donde x = Sx/k e y = (YL + YH)/2 o para predicciones comprendidas dentro de un conjunto, y es la respuesta media para el
Estndar dentro del conjunto.
USP 38
Coeficientes x1 para calcular la pendiente b de una curva de logaritmo de dosis-respuesta cuando las dosis estn espaciadas como se muestra en la escala aritmtica.
Coeficientes x1 para Calcular b a partir de las Respuestas y a Dosis, en mL,
de:
N de Dosis
1,5
Divisor ebi
Media del Logaritmo de Dosis x
15
13
14,1017
0,37588
POTENCIAS INTERPOLADAS A PARTIR DE UNA CURVA ESTNDARCuando la curva de respuesta del logaritmo de la dosis del Estndar
en una valoracin dada es curvilnea y se ajusta grficamente a los puntos trazados, la cantidad del Estndar que se esperara
que produzca cada respuesta y observada de una Incgnita se calcula por interpolacin a partir de la curva y luego se ajusta
teniendo en cuenta la concentracin conocida de su solucin de prueba.
Cuando la respuesta frente al Estndar puede graficarse linealmente en funcin del logaritmo de la dosis, se ajusta numricamente mediante una lnea recta, como se describi en la seccin precedente. Para determinaciones en conjuntos aleatorios, la
curva del estndar se calcula con b para la valoracin e y para cada conjunto y la respuesta yU en cada tubo de una Incgnita
dada en ese conjunto se convierte a un logaritmo de la potencia relativa estimada,
Captulos
X = (yU YS)/b
(7)
donde YS es la respuesta prevista por la curva estndar al logaritmo de dosis x supuesto de la Incgnita. El promedio de las
estimaciones separadas obtenidas a partir de cada uno de los f conjuntos, M = SX/f, es el logaritmo de la potencia relativa
valorada de la Incgnita.
Valoraciones Factoriales a Partir de la Respuesta a Cada TratamientoCuando alguna funcin de la respuesta se puede
representar grficamente en forma lineal en funcin del logaritmo de la dosis, la potencia valorada se calcula a partir de la
respuesta total para cada tratamiento y su precisin se mide en trminos de intervalos de confianza. Esto requiere (1) que en
las unidades adecuadas, la respuesta (y) dependa linealmente del logaritmo de la dosis dentro del intervalo de dosificacin de
la valoracin y (2) que el nmero (f) de respuestas sea el mismo para cada nivel de dosificacin, tanto del Estndar como de la
Incgnita. Las y se suman en cada nivel de dosis de cada preparacin. En diferentes combinaciones, estos totales Tt, llevan
directamente al logaritmo de la potencia relativa y a las pruebas de validez de la valoracin. Los coeficientes factoriales en las
Tablas 6, 7 y 8 determinan cmo se deben combinar. En una fila dada, cada Tt se multiplica por el coeficiente correspondiente
y los productos se suman para obtener Ti. Los Ti que figuran en las filas sucesivas tienen el mismo significado en todas las valoraciones.
Tabla 6
Coeficientes factoriales x1 para analizar una valoracin biolgica balanceada, en la que los sucesivos logaritmos de dosis del Estndar (Si) y de la Incgnita (Ui) estn espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo nmero (f) de respuestas que suman un total de Tt.
Coeficientes Factoriales x1 para Cada Dosis
Diseo
Fila
U1
U2
2,2
Ta
Tb
ab
Tab
3,3
4,4
S1
S2
S3
S4
U3
U4
ei
Ti
Ta
Tb
ab
Tab
12
Tq
aq
12
Taq
Ta
40
Tb
ab
40
Tab
Tq
aq
Taq
Valor de la Constante para el Diseo

Para Calcular
N de Ecuacin
Constante
2,2
3,3
4,4
8, 10
4/3
26, 29
8/3
USP 38
Ta en la primera fila mide las diferencias en la respuesta promedio para el Estndar y para la Incgnita. Tb en la segunda fila
lleva directamente a la pendiente combinada de las curvas de dosis-respuesta para el Estndar y la Incgnita. Las filas tercera a
quinta (ab, q y aq) ofrecen pruebas de la validez de una valoracin, tal como se describe en un apartado posterior. A partir de
los totales Ta y Tb, calcular el logaritmo de la potencia relativa de la Incgnita, antes de ajustar en funcin de su potencia supuesta, como:
M = ciTa/Tb
(8)
en donde i es el intervalo en los logaritmos entre los sucesivos logaritmos de dosis del Estndar y de la Incgnita y la constante
c se proporciona por separado al final de cada tabla. Cada M se corrige hasta su logaritmo de potencia M segn la Ecuacin 2.
Cuando las dosis no estn espaciadas a intervalos iguales en la escala logartmica, como en la Tabla 8, usar en su lugar la
constante ci que figura al final de la tabla.
Tabla 7
Coeficientes factoriales x1 para analizar una valoracin parcialmente balanceada, en la que los sucesivos logaritmos de dosis del
Estndar (Si) y de la Incgnita (Ui) estn espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo nmero (f) de respuestas que
suman un total de Tt. Si el nmero de las dosis sucesivas de la Incgnita excede en uno el nmero del Estndar, intercambiar Si y
Ui en el encabezado e invertir el signo en todas las filas a, ab y aq.
Coeficientes Factoriales x1 para Cada Dosis
Diseo
Fila
S1
S2
2,1
Ta
Tb
4,3
S4
U1
U2
U3
ei
Ti
30
Ta
10
Tb
ab
10
Tab
Tq
84
Ta
28
Tb
ab
70
Tab
60
Tq
aq
10
Taq

Para Calcular
N de Ecuacin
Constante
2,1
3,2
8, 10
1/2
5/6
4,3
7/6
26, 29
3/4
25/12
49/12
Tabla 8
Coeficientes factoriales x1 para analizar valoraciones con una secuencia de 3 4 dosis de 1,5; 2,0; 3,0 y 4,0 donde cada dosis
tiene el mismo nmero (f) de respuestas.
Dosis del Estndar
Dosis de la Incgnita
Diseo
Fila
1,5
2,0
3,0
4,0
1,5
2,0
3,0
4,0
ei
4,4
Ta
29
12
12
29
29
12
12
29
3940
Tb
ab
29
12
12
29
29
12
12
29
3940
Tab
Tq
aq
Taq
3,3
3,3
Ti
Ta
25
28
25
28
2836
Tb
ab
25
28
25
28
2836
Tab
31
53
22
31
53
22
8508
Tq
aq
31
53
22
31
53
22
8508
Taq
Ta
28
25
28
25
2836
Tb
Tab
ab
28
25
28
25
2836
22
53
31
22
53
31
8508
Tq
aq
22
53
31
22
53
31
8508
Taq
Captulos
3,2
S3
USP 38

Para Calcular
N de Ecuacin
Constante
4,4
3,3
8, 10
ci
7,2332
5,3695
26, 29
ci2
0,10623
0,06100
En una valoracin completamente balanceada, tal como la valoracin de corticotropina, calcular M con los coeficientes que
figuran en la Tabla 6. Si una preparacin tiene una diferencia de menos de una dosis respecto de la otra pero los sucesivos
intervalos de los logaritmos de dosis del Estndar y de la Incgnita difieren en un intervalo constante i, usar los coeficientes
factoriales que aparecen en la Tabla 7, corrigiendo en funcin de la diferencia existente entre la media de los logaritmos de
dosis observada, xS y xU, calculando:
M = xS xU + M
(9)
En las valoraciones donde las dosis sucesivas no estn espaciadas a intervalos logartmicos iguales, se puede calcular el log de la
potencia relativa de una nica Incgnita segn la Ecuacin 8 con los coeficientes factoriales y ci que aparecen en la Tabla 8.
En una valoracin de dos o ms Incgnitas comparadas con un Estndar en comn, todas con lneas de dosis-respuesta paralelas dentro del error experimental, se puede calcular cada logaritmo de la potencia relativa con la misma pendiente de la
valoracin de la siguiente manera. Para cada preparacin, determinar el factor de la pendiente Tb = S(x1Tt) o S(x1y), en donde
los valores de x1 son los coeficientes factoriales para el Estndar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. El logaritmo de la
potencia relativa de cada Incgnita es:
Captulos
M = cihTa/2STb
(10)
en donde h es el nmero de valores de Tb sumados en el denominador.

Valoraciones a Partir de las Diferencias en las RespuestasCuando las dosis del Estndar y de la Incgnita se establecen
en pares y se calcula la diferencia de las respuestas para cada par, estas diferencias no se ven afectadas por las variaciones en la
sensibilidad promedio de las lecturas pareadas. La valoracin de insulina realizada usando la valoracin pareada de dos dosis
corresponde al primer diseo de la Tabla 6 y requiere cuatro grupos iguales de conejos, cada uno inyectado dos veces (ver
Valoraciones de Insulina 121). La diferencia (y) de la respuesta de azcar en sangre de cada conejo en los dos tratamientos
lleva al logaritmo de la potencia relativa M (ver los dos primeros prrafos de la seccin Clculo de la Potencia a Partir de una
Valoracin nica). La valoracin de la Inyeccin de Vasopresina sigue un diseo similar, en el que en lugar de los cuatro grupos
de tratamiento de conejos en la valoracin de insulina se usan dos o ms conjuntos aleatorios de cuatro pares sucesivos de
inyecciones en ratas.
La valoracin de la Inyeccin de Oxitocina se realiza a partir de los cambios en la presin sangunea producidos en un solo
animal de prueba alternando inyecciones de una dosis nica del Estndar y de una de las dos dosis de la Incgnita. El clculo
de la potencia obtenida a partir de las diferencias entre las respuestas de la Incgnita y el promedio de las dos respuestas adyacentes del Estndar es equivalente al primer diseo de la Tabla 7 con S y U invertidos, en donde i es el logaritmo del intervalo
entre los dos niveles de dosificacin de la Incgnita.
Error Experimental y Pruebas de Validez de la Valoracin

En este documento, el trmino error experimental se refiere a la variacin residual en la respuesta de los indicadores biolgicos y no a un error en el procedimiento o a valores aberrantes que necesiten ser reemplazados. Se mide en trminos de la
varianza del error de una respuesta individual u otra unidad, la cual se designa uniformemente como s2, a pesar de las diferencias en la definicin de la unidad. Se requiere en las pruebas de validez de la valoracin y para el clculo del intervalo de confianza.
Varianza del Error de una Dosis UmbralEn algunas valoraciones la dosis umbral individual se mide directamente. En la
valoracin de Digital, se designa cada dosis umbral individual con el smbolo z, el nmero o frecuencia de z con f y el total de
los valores de z para cada preparacin con T, con los subndices S y U para indicar el Estndar y la Incgnita, respectivamente.
Calcular la varianza del error de z como:
s2 = [Sz2 TS2/fS TU2/fU]/n
(11)
con n = fS + fU 2 grados de libertad. En la valoracin de la Inyeccin de Cloruro de Tubocurarina, cada logaritmo de la dosis
umbral de la Incgnita se resta del logaritmo de la dosis correspondiente del Estndar en el mismo conejo, para obtener una
diferencia individual x. Dado que cada x puede tener valor positivo o negativo (+ o ), es esencial transportar el signo correcto
en todas las sumas. Designar el total de valores x para los animales inyectados con el Estndar el primer da como T1 y para
aquellos inyectados con el Estndar el segundo da como T2. Calcular la varianza del error de x con n = N 2 grados de libertad como:
s2 = {Sx2 (T12 + T22)/f}/n
(12)
USP 38
en donde N es el nmero total de conejos que completan la valoracin, excluyendo cualquier reemplazo de un valor faltante
para igualar el tamao de los dos grupos.
Varianza del Error de una Respuesta IndividualEn las valoraciones farmacopeicas, se supone que las diferencias en las
dosis que modifican la respuesta media no afectan la variabilidad de la respuesta. El clculo de la varianza del error depende
del diseo de la valoracin y de la manera en que se realicen los ajustes para cualquier valor faltante. Cada respuesta se convierte primero en la unidad y que se emplea para calcular la potencia. Se debe determinar una sola varianza del error a partir
de las desviaciones combinadas de y con respecto a sus respectivas medias para cada nivel de dosis, sumadas para todos los
niveles. Se pueden analizar los valores dudosos de y como se lo describi anteriormente en Rechazo de Observaciones Aberrantes o Errticas y los valores aberrantes comprobados se pueden reemplazar como valores faltantes (ver Reemplazo de Valores
Faltantes).
En el diseo ms sencillo, las unidades de respuesta se asignan aleatoriamente a cada nivel de dosificacin, como ocurre en
la valoracin de corticotropina. Si se reemplaza un valor faltante sumando la media de los valores de y restantes a cualquier
nivel de dosificacin dado a su total, los grados de libertad (n) en la varianza del error se reducen en uno por cada reemplazo
pero no es necesario hacer ningn otro cambio en el clculo. Suponiendo que f es entonces igual para todos los grupos o
dosis, calcular la varianza del error a partir de la variacin dentro de las dosis de todos los valores de y como:
s2 = {Sy2 STt2/f}/n
(13)
en donde Tt es el total en cada dosis de los valores f de y; hay k totales Tt y los grados de libertad n = Sf k, donde Sf disminuye en 1 con cada reemplazo.
Si las variaciones en f se ajustan restando una media de grupo del total del grupo, calcular la varianza del error a partir de los
valores de y observados y de los totales Tt no ajustados como:
(14)
donde n = Sf k.
Cuando se calcula el resultado de una valoracin usando los coeficientes de la Tabla 6 u 8, s2 se puede calcular a partir de la
respuesta y para cada una de las h preparaciones, incluyendo las h Incgnitas y los correspondientes niveles de dosificacin
del Estndar. Para cada preparacin, calcular T = Sy y el factor de pendiente Tb = S(x1y) en donde los valores de x1 son los
coeficientes factoriales para el Estndar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. La varianza del error para la valoracin es
s2 = {Sy2 ST2/k 2(STb)2/hebf}/n
(15)
en donde los grados de libertad n = h(k 1) 1; y eb es el ei de la misma tabla y fila que los coeficientes x1.
La Varianza del Error en Diseos con RestriccionesEn algunas valoraciones, las respuestas individuales suceden en conjuntos aleatorios de tres o ms. Ejemplos de estos conjuntos son los animales de una misma camada en la valoracin de vitamina D, las reas transparentes en cada placa en una valoracin de antibiticos y las respuestas a cuatro pares sucesivos de inyecciones en la valoracin de vasopresina. Disponer los valores individuales de y de estas valoraciones en una tabla de dos vas, en
la que cada columna representa un tratamiento o dosis diferente y cada fila, un conjunto aleatorio. Las prdidas pueden reemplazarse tal como se describe en Reemplazo de Valores Faltantes. Los k totales de columna son los Tt necesarios para el anlisis
de diseos equilibrados. Los f totales de las filas (Tr) representan una fuente de variacin que no afecta la potencia estimada y,
por ello, se excluyen del error de la valoracin. Calcular la varianza del error aproximada a partir de los cuadrados de los valores de y individuales y de los totales marginales como:
s2 = {Sy2 STr2/k STt2/f + T2/N}/n
(16)
en donde T = STr = STt; y los n = (k 1)(f 1) grados de libertad se deben disminuir en 1 por cada espacio en blanco en la
tabla original que se complete mediante clculo.
Cuando el orden de tratamiento representa una potencial fuente de variacin adicional, su efecto puede corregirse mediante
un rgimen de dosis para una serie de n cuadrados latinos con k filas en comn, como por ejemplo los dos cuadrados latinos
en los regmenes de dosis 1 a 4 y 5 a 8 en la valoracin de Glucagn para Inyeccin. Listar en una columna separada las respuestas y observadas de cada animal de prueba conforme al orden de dosificacin. Las respuestas a cada una de las k dosis
suceden con igual frecuencia en cada una de las k filas y de las nk columnas, en donde n es el nmero de cuadrados latinos.
Sumar las respuestas y en cada fila (Tr) en cada columna (Tc) y en una lista separada, para cada dosis o tratamiento (Tt). Las
prdidas ocasionales se pueden reemplazar mediante la Ecuacin 1a tal como se describe en Reemplazo de Valores Faltantes.
Calcular la varianza del error a partir de los cuadrados de los valores y individuales y de los totales marginales y de tratamiento
como:
s2 = {Sy2 STr2/nk STc2/k STt2/nk + 2T2/N}/n
(16a)
en donde T = Sy = STr = STc = STt, N = nk2 y los n = (k 1)(nk 2) grados de libertad se deben disminuir en uno por cada
espacio en blanco en la tabla original que se complete mediante clculo.
En las valoraciones donde las reacciones suceden en pares, las diferencias entre los animales de prueba o entre las reacciones
pareadas se separan automticamente calculando la valoracin usando como respuesta la diferencia dentro de un par. Con la
insulina, la respuesta es la diferencia y en los valores del azcar en sangre en un nico conejo despus de dos inyecciones (ver
Captulos
s2 = {Sy2 S(Tt2/f)}/n
USP 38
Valoracin de Insulina 121). Despus de realizar ajustes en funcin de los conejos que se pierden durante la valoracin, calcular la varianza del error de y a partir de las respuestas en los cuatro grupos y a partir de los totales de los grupos Ti = T1 a T4
como:
s2 = {Sy2 STi2/f}/n
(17)
en donde el nmero de conejos f es el mismo en cada grupo y los grados de libertad, n = 4(f 1), se reducen en uno por cada
reemplazo realizado por conejo perdido durante la valoracin. En la valoracin de Inyeccin de Oxitocina, cada y representa la
diferencia entre la respuesta medida de la presin sangunea frente a una dosis de la Incgnita y al promedio de las dos dosis
adyacentes del Estndar. Calcular la varianza del error de y como:
s2 = {Sy2 (T12 + T22)/f}/n
(18)
con n= 2(f 1) grados de libertad, en donde T1 es el total de y para la dosis baja de la Incgnita y T2 es el total para la dosis
alta.
En una valoracin microbiolgica calculada por interpolacin a partir de una curva estndar, convertir cada diferencia entre
dos respuestas pareadas a unidades de logaritmo de dosis x usando la Ecuacin 7. Con cada diferencia x como la unidad, se
calcula un s2 compuesto a partir de la variacin en los valores f de x para cada Incgnita, sumando su total sobre las h Incgnitas en la valoracin, como:
Captulos
s2 = {SX2 S(Tx2/f)}/n
(19)
en donde Tx = Sx para una nica Incgnita y los grados de libertad n = Sf h.

Pruebas de la Validez de la ValoracinAdems de los requisitos especficos que figuran en cada monografa y de la curva combinada de logaritmo de dosis-respuesta con una pendiente significativa (ver la estadstica C en el siguiente apartado),
dos condiciones determinan la validez de una valoracin factorial individual: (1) la curva de logaritmo de dosis-respuesta para
la Incgnita debe ser paralela a la del Estndar dentro del error experimental y (2) ninguna de las curvas debe apartarse significativamente de una lnea recta. Cuando la valoracin ha sido totalmente aleatoria o est constituida por conjuntos aleatorios,
las pruebas de validez necesarias se calculan con los coeficientes factoriales para ab, q y aq de las Tablas 6 a 8 y los totales de
tratamiento Tt. Sumar los productos de los coeficientes en cada fila por los Tt correspondientes para obtener el total del producto Ti, en donde el subndice i representa a su vez ab, q y aq, respectivamente. Cada uno de los tres cocientes, Ti2/eif, se
calcula con el valor correspondiente de ei de la tabla y con f igual al nmero de valores de y en cada Tt. El que est en la fila ab
analiza si las lneas de dosis-respuesta son paralelas y es la nica prueba disponible en una valoracin de dos dosis. Con tres o
ms dosis de ambas preparaciones, el que est en la fila q es una prueba de curvatura combinada en la misma direccin y en la
fila aq es una prueba de curvaturas separadas en direcciones opuestas. Si algn cociente en una valoracin de 3 4 dosis excede s2 en ms del triple, calcular:
F3 = S(Ti2/eif)/3s2
(20)
En cambio, para una valoracin de dos dosis calcular:

F1 = Tab2/eabfs2
(21)
y para una valoracin 3,2 (Tabla 7) determinar:

F2 = S(Ti2/eif)/2s2
(22)
Para que la valoracin sea vlida, F1, F2, o F3 no exceder los valores que se proporcionan en la Tabla 9 (con probabilidad de 1
en 20) para los n grados de libertad en s2.
Tabla 9
Valores de t, t2, Fi y c2 para los n grados de libertad diferentes que se excedern con una probabilidad de P = 0,05 ( 0,95 para
intervalos de confianza).
c2
t2 = F1
12,706
161,45
3,84
19
2,093
4,381
3,52
3,13
30,1
4,303
18,51
19,00
19,16
5,99
20
2,086
4,351
3,49
3,10
31,4
F2
F3
t2 = F1
c2
F2
F3
3,182
10,128
9,55
9,28
7,82
21
2,080
4,325
3,47
3,07
32,7
2,776
7,709
6,94
6,59
9,49
22
2,074
4,301
3,44
3,05
33,9
2,571
6,608
5,79
5,41
11,07
23
2,069
4,279
3,42
3,03
35,2
2,447
5,987
5,14
4,76
12,59
24
2,064
4,260
3,40
3,01
36,4
2,365
5,591
4,74
4,35
14,07
25
2,060
4,242
3,38
2,99
37,7
2,306
5,318
4,46
4,07
15,51
26
2,056
4,225
3,37
2,98
38,9
2,262
5,117
4,26
3,86
16,92
27
2,052
4,210
3,35
2,96
40,1
Adaptado de partes de las Tablas III a V de las Tablas de Estadstica Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medical Research, de R. A. Fisher y F.
Yates, publicadas por Oliver and Boyd, Ltd., Edimburgo.
USP 38
Valores de t, t2, Fi y c2 para los n grados de libertad diferentes que se excedern con una probabilidad de P = 0,05 ( 0,95 para
intervalos de confianza).
n
t2 = F1
F2
F3
c2
t2 = F1
F2
F3
c2
10
2,228
4,965
4,10
3,71
18,31
28
2,048
4,196
3,34
2,95
41,3
11
2,201
4,844
3,98
3,59
19,68
29
2,045
4,183
3,33
2,93
42,6
12
2,179
4,747
3,89
3,49
21,03
30
2,042
4,171
3,32
2,92
43,8
13
2,160
4,667
3,81
3,41
22,36
40
2,021
4,085
3,23
2,84
55,8
14
2,145
4,600
3,74
3,34
23,68
60
2,000
4,001
3,15
2,76
79,1
146,6
15
2,131
4,543
3,68
3,29
25,00
120
1,980
3,920
3,07
2,68
16
2,120
4,494
3,63
3,24
26,30
1,960
3,841
3,00
2,60
17
2,110
4,451
3,59
3,20
27,59
18
2,101
4,414
3,55
3,16
28,87
Adaptado de partes de las Tablas III a V de las Tablas de Estadstica Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medical Research, de R. A. Fisher y F.
Yates, publicadas por Oliver and Boyd, Ltd., Edimburgo.
Tb2/eb > 100Tq2/eq

o
(STb)2/eb > 100(STq)2/eq
(23)
en donde cada Tb y Tq se calculan con los valores de Tt (o de y) para una nica preparacin multiplicados por los coeficientes
para el Estndar en las filas b y q, respectivamente. Si Ta y Tab son ambos significativos en una valoracin de dos dosis, un Tt
puede estar fuera de la zona lineal. En algunas ocasiones puede calcularse de manera preliminar o contribuyente una estimacin de la potencia a partir de los tres valores de Tt restantes y el primer diseo en la Tabla 7. En las valoraciones de insulina o
de otros frmacos cuyas respuestas son pareadas, la prueba del paralelismo es tan poco sensible que se omite. Si en una valoracin microbiolgica los tubos se ordenan en cada conjunto sistemticamente, en lugar de aleatoriamente, las pruebas de
validez pueden estar sujetas a un desvo por parcialidad por efectos de posicin.
El Intervalo de Confianza y los Lmites de la Potencia

Una valoracin biolgica proporciona una estimacin de la potencia verdadera de una Incgnita. El valor de esta estimacin
cae dentro de un intervalo de confianza, que se calcula de manera tal que la probabilidad de que la verdadera potencia exceda
el lmite superior del intervalo de confianza o que sea menor que el lmite inferior de ste no sea mayor de 1 en 20 (P = 0,05).
Como este intervalo est determinado por un nmero de factores que pueden influenciar la estimacin de la potencia, la precisin requerida para la mayora de las valoraciones biolgicas se proporciona en las respectivas monografas en trminos del
intervalo de confianza, relacionado con la potencia directamente o con su logaritmo.
Clculos GeneralesLas valoraciones biolgicas, a pesar de la diversidad de sus formas, estn comprendidas en dos categoras generales: (1) las que el logaritmo de la potencia se calcula directamente a partir de una media o de una diferencia
media y (2) las que se calculan a partir del cociente de dos estadsticas.
(1) Cuando el logaritmo de la potencia de una valoracin se calcula como la media de varias estimaciones del logaritmo de
potencias que son aproximadamente iguales en precisin, el logaritmo del intervalo de confianza es:
L = 2st / k
(24)
Captulos
Una valoracin puede no pasar la prueba de validez y an as puede contribuir proporcionando un estimado de la potencia
que se puede combinar provechosamente con el resultado de una segunda valoracin de la misma Incgnita, tal como se describe ms adelante en otro apartado. El nivel de dosis final ya sea para el Estndar o la Incgnita o para ambos puede proporcionar resultados que se hallen fuera de la zona lineal. Con tres o ms niveles de dosis y valores de Ta, Tab y Taq relativamente
grandes, el valor de la respuesta total Tt a una dosis final de una preparacin puede estar cerca de un lmite superior o inferior
y ser responsable de los valores elevados de Tab y Taq. Este Tt se puede omitir y la valoracin se puede volver a calcular con el
diseo adecuado de la Tabla 7. Si entonces la valoracin cumple con la prueba en las Ecuaciones 20 22 la potencia resultante,
M, se puede combinar con la de una segunda valoracin para calcular el logaritmo de la potencia de la Incgnita (ver en
Combinacin de Valoraciones Independientes). Si Ta no es significativo pero Tq muestra una curvatura combinada significativa, la
dosis mayor (o menor) de ambas preparaciones puede ser excesivamente grande (o excesivamente pequea). Su omisin puede conducir a una valoracin vlida con los coeficientes factoriales para el diseo menor que le sigue en la Tabla 6 u 8. Se
puede descartar un Tq o STq estadsticamente significativo y se pueden retener todos los niveles de dosificacin sin ocasionar
desvos de ms de 5% en el logaritmo de la potencia M calculado y su intervalo de confianza cuando la siguiente desigualdad
es verdadera:
USP 38
en donde s es la desviacin estndar de una estimacin nica del logaritmo de la potencia, t se lee de la Tabla 9 con los n
grados de libertad en s; y k es el nmero de estimaciones que se han promediado. La misma ecuacin se usa cuando el logaritmo de la potencia se calcula como la x media de k diferencias de x, donde s es la desviacin estndar de una nica x. En
cualquiera de los casos, la estimacin del logaritmo de la potencia M est en el centro de su intervalo de confianza, de manera
que los lmites de confianza son:
XM = M + 1/2 L y M 1/2 L, o XM = M 1/2 L
(25)
Los lmites superior e inferior se convierten en sus antilogaritmos para obtener los lmites como potencias explcitas.
(2) Con mayor frecuencia, el logaritmo de la potencia o la potencia en s se calcula a partir de un cociente y en estos casos la
amplitud del intervalo de confianza est caracterizada por el logaritmo del intervalo en la ecuacin:
en donde M es el logaritmo de la potencia relativa segn se ha definido anteriormente (ver Clculo de la Potencia a Partir de
una Valoracin nica), i es el logaritmo del intervalo entre dosis sucesivas y c es una constante caracterstica del procedimiento
de la valoracin. El trmino restante, C, depende de la precisin con que se haya determinado la pendiente de la curva dosisrespuesta. (Algunas veces se expresa como g = (C 1)/C). En las valoraciones factoriales, se calcula como:
Captulos
C = Tb2/(Tb2 ebfs2t2)
(27)
en donde s2 es la varianza del error de una observacin individual; t2 se lee de la Tabla 9 con los grados de libertad en s2; f es el
nmero de respuestas en cada Tt empleadas para calcular Tb; y Tb y eb se calculan con los coeficientes factoriales para la fila b
en las Tablas 6 a 8. La s2 en la Ecuacin 26 depende del diseo de la valoracin, segn se indica para cada frmaco en la seccin siguiente. En una valoracin vlida, C es un nmero positivo.
En una valoracin de dos o ms Incgnitas frente a un Estndar en comn, todas con curvas de dosis-respuesta paralelas
dentro del error experimental, se puede calcular C con la varianza del error s2 para la valoracin y con la pendiente de la valoracin como:
C = (STb)2/{(STb)2 ebfhs2t2/2}
(28)
El factor de pendiente Tb = S(x1Tt) o S(x1y) para cada una de las h preparaciones, incluyendo el Estndar, se calcula con los
coeficientes factoriales x1 para el Estndar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. Si un total de tratamiento Tt incluye uno o
ms reemplazos para una respuesta faltante, reemplazar ebf en la Ecuacin 27, o ebfh/2 en la Ecuacin 28 por f2S(x12/f), en
donde cada x1 es un coeficiente factorial de la fila b de las Tablas 6 a 8 que aparecen en este captulo y f es el nmero de
respuestas en el Tt correspondiente antes de sumar el reemplazo. Con esta C calcular el intervalo de confianza como:
En valoraciones calculadas a partir de un cociente, el logaritmo de la potencia M ms probable no se encuentra en el centro

exacto del intervalo de confianza. Los lmites de confianza superior e inferior en logaritmos son:
XM = log R + CM + 1/2 L y log R + CM 1/2 L
(30)
en donde con frecuencia C es muy poco mayor que la unidad y cuando ms precisa es la valoracin, ms se acerca C a un
valor exacto de 1. R = zS/zU es el cociente entre las dosis correspondientes del Estndar y de la Incgnita o la potencia supuesta
de la Incgnita. Los lmites de confianza superior e inferior en los logaritmos de potencias se convierten separadamente en sus
antilogaritmos para obtener las correspondientes potencias.
Intervalos de Confianza para Valoraciones IndividualesDado que el intervalo de confianza puede diferir en algn detalle de los modelos generales mencionados anteriormente, calcular estos intervalos para cada valoracin mediante las indicaciones especiales que se proporcionan bajo el nombre de la sustancia en los siguientes prrafos.
Valoraciones de AntibiticosEl intervalo de confianza se puede calcular mediante las Ecuaciones 24 y 25.
Pantotenato de CalcioPara los logaritmos de las potencias obtenidos por interpolacin a partir de una Curva estndar, el
intervalo de confianza se puede calcular con las Ecuaciones 19 y 24. Para los logaritmos de potencias calculadas con la Ecuacin
8 10, s2 se puede calcular con la Ecuacin 15, C con la Ecuacin 27 28 y el intervalo de confianza L con la Ecuacin 26 29.
Corticotropina, InyeccinCalcular el logaritmo del intervalo de confianza segn las Ecuaciones 26 y 27, con los coeficientes
y constantes de la Tabla 6 para una valoracin de 3 dosis y s2 segn se determina mediante la Ecuacin 13 14.
DigitalCalcular el intervalo de confianza como:
en donde fU y fS son el nmero de observaciones para la Incgnita y para el Estndar y

C = zU2/(zU2 s2t2/fU)
(32)
USP 38
se determina con s2 a partir de la Ecuacin 11. Entonces, los lmites de confianza para la potencia en Unidades USP son:
XP* = R{C(zS/zU) 1/2 L}
(33)
en donde R es el definido en el Glosario de Smbolos.

Glucagn para InyeccinCalcular la varianza del error s2 mediante la Ecuacin 15a, C mediante la Ecuacin 27 con ebf =
16n y el logaritmo del intervalo de confianza L mediante la Ecuacin 26 con ci2 = 0,09062.
Gonadotropina CorinicaProceder segn se indica en Corticotropina, Inyeccin.
Heparina SdicaSi dos determinaciones independientes del logaritmo de la potencia M difieren en ms de 0,05 se realizarn valoraciones adicionales y se calcula la varianza del error entre los N valores de M como:
s2 = {SM2 (SM)2/N}/n
(34)
con n = N 1 grados de libertad. Dado este valor, determinar el intervalo de confianza en los logaritmos (L) segn la Ecuacin
24.
Insulina, InyeccinCalcular la varianza del error (s2) de y segn la Ecuacin 16 y C como:
C = Tb2/(Tb2 s2t2N)
(35)
en donde t2 de la Tabla 9 depende de n = 4(f 1) grados de libertad en s2 y N = 4f es el nmero total de diferencias en los
cuatro grupos. Mediante la Ecuacin 26, calcular el intervalo de confianza L en los logaritmos, en donde ci2 = 0,09062. Los
lmites de confianza superior e inferior en Unidades USP de insulina estn dados por los antilogaritmos de XM de la Ecuacin 30.
Oxitocina, InyeccinCalcular el logaritmo del intervalo de confianza aproximado mediante la Ecuacin 26
(36)
en donde s2 se define segn la Ecuacin 18 y

c = (4f 1)/8(f + 1)
(37)
Cloruro de Tubocurarina, InyeccinCalcular la varianza del error mediante la Ecuacin 12 y el intervalo de confianza mediante la Ecuacin 24.
Vasopresina, InyeccinCalcular la varianza del error s2 mediante la Ecuacin 16; C mediante la Ecuacin 35; y el logaritmo
del intervalo de confianza mediante la Ecuacin 26, en donde c = 1 e i es el logaritmo del intervalo que separa los dos niveles
de dosificacin.
Actividad de Vitamina B12Proceder segn se indica en Pantotenato de Calcio.
Combinacin de Valoraciones Independientes

Cuando el mtodo lo permita se pueden agregar animales adicionales en aquellas valoraciones que no fueran lo suficientemente precisas hasta que los resultados combinados reduzcan el intervalo de confianza y ste quede comprendido dentro de
los lmites especificados en la monografa. Cuando se requieren 2 o ms valoraciones independientes y cada una de ellas conduce a un logaritmo de la potencia M, los valores M se combinan para determinar la potencia media ponderada de la Incgnita.
Excepto en la prueba de la Heparina Sdica, en la cual los logaritmos de las potencias se ponderan por igual, la precisin relativa de dos o ms valores de M determina la ponderacin asignada a cada valor para calcular su media y su intervalo de confianza.
Antes de combinar dos o ms estimaciones separadas de M, analizar su coherencia mutua. Si los M son coherentes, sus intervalos de confianza respectivos se superpondrn. Cuando los intervalos de confianza no se superponen o cuando la superposicin es pequea, calcular un cM2 aproximado. Asignar a cada una de las h valoraciones individuales una ponderacin w, definida como:
w = 4t2/L2
(38)
en donde la amplitud del intervalo de confianza L se calcula con la ecuacin apropiada de la seccin precedente y t2 se lee de
la Tabla 9 para los n grados de libertad en la varianza del error de la valoracin. Sumar las ponderaciones individuales para
obtener Sw. Luego determinar un c2 aproximado con h 1 grados de libertad como:
Aprox. cM2 = S(wM2) {S(wM)}2/Sw
(39)
Para dos valoraciones con logaritmos de potencia M1 y M2 y las ponderaciones w1 y w2, la Ecuacin 35 se reduce a:
Aprox. cM2 = w1w2(M1 M2)2/w1 + w2
(40)
con un grado de libertad. Si el cM2 aproximado est bien por debajo del valor crtico para c2 en la Tabla 9, usar las ponderaciones w para calcular la media del logaritmo de la potencia M y su intervalo de confianza, L. Si cM2 supera o se acerca a su valor
crtico, emplear en su lugar semiponderaciones w (Ecuacin 47) cuando se calcula M.
Calcular la media del logaritmo de la potencia M de dos o ms valoraciones mutuamente coherentes como:
Captulos
C = (T2 T1)2/{(T2 T1)2 4(f + 1)s2t2/3}

M = S(wM)/Sw
USP 38
(41)
Este es el valor individual ms probable en un intervalo de confianza combinado de amplitud Lc, definido como la raz cuadrada de:
Lc2 = 4tL2/Sw {1 + (4/S2w)S(w(Sw w)/n}
(42)
en donde cada n = n 4(h 2)/(h 1) y tL2 se interpola a partir de la Tabla 9 con los grados de libertad:
nL = S2w/S(w2/n)
Para dos valoraciones (h = 2) con logaritmos de potencias M1 y M2 y ponderaciones w1 y w2, respectivamente, la ecuacin
anterior se puede reformular nuevamente como:
Lc2 = 4tL2/Sw {1 + [1/n1 + 1/n2]4w1w2/S2w}
(43)
en donde Sw = w1 + w2. Cuando Lc, el intervalo de confianza para una estimacin combinada, no excede los requisitos establecidos en una monografa, los lmites de confianza superior e inferior se toman 1/2 Lc por encima y por debajo de M, para obtener aproximadamente un intervalo de confianza del 95%.
Cuando la variacin en la potencia valorada entre h determinaciones independientes, segn se analiza mediante cM2, excede
o se acerca a P = 0,05, se les asignan semiponderaciones w a las distintas estimaciones. A partir de la ponderacin w, calcular
la varianza de cada M como:
Captulos
V = 1/w = L2/4t2
(44)
Calcular la varianza de la heterogeneidad entre las valoraciones como:

v = SM2 (SM2/h)/(h 1) Sv/h
(45)
o si h = 2,
v = (M1 M2)2/2 (V1 + V2)/2
(46)
Cuando V variara demasiado de manera que la v calculada previamente fuese un nmero negativo, calcular en su lugar una v
aproximada omitiendo el trmino que sigue al signo menos en las Ecuaciones 45 y 46. Una semiponderacin se define como:
w = 1/(V + v)
(47)
Usar w y Sw en lugar de w y Sw en la Ecuacin 41 para obtener la media semiponderada M. Este valor se aproxima al valor
medio de un intervalo de confianza de una amplitud aproximada Lc, en donde:
Lc2 = 4t2/Sw
(48)
y t2 de la Tabla 9 tiene SN grados de libertad.

Cuando cM2 en la Ecuacin 39, de h = 4 o ms estimaciones de M, excede el nivel crtico que figura en la Tabla 9 en ms de
un 50%, y las ponderaciones w difieren en menos de un 30%, las h estimaciones de M se pueden verificar para determinar si
se sospechara que hay valores aberrantes en la Tabla 1. Si fueran significativos, los valores aberrantes de M se pueden omitir al
calcular M con w.
Cuando la potencia de un frmaco se determina repetidamente en un laboratorio dado mediante el mismo mtodo de valoracin biolgica, las determinaciones sucesivas tanto de la pendiente b como de la varianza del error s2 se pueden dispersar
aleatoriamente dentro del error de muestreo con respecto a un valor comn para cada parmetro. Las estimaciones obtenidas
de valoraciones sucesivas se pueden representar en una grfica de control de calidad para cada estadstica y as se pueden
calcular los valores medios y los lmites de control que definen la variacin aleatoria permitida para controlar en forma continua la coherencia de una tcnica de valoracin. Cuando las estimaciones de b y s2 estn comprendidas dentro de los lmites de
control, ambos valores se pueden reemplazar por sus promedios de laboratorio. Rechazar cualquier valoracin en la que estas
estadsticas no estn comprendidas dentro de los lmites de control, o aceptarlas slo despus de que un riguroso anlisis de su
validez justifique su aceptacin.
Valoracin Conjunta de Varias Preparaciones

Cada monografa describe el ensayo de una Incgnita individual comparada con el Estndar. Aunque no se proporcionan
explcitamente, con frecuencia se incluyen diferentes Incgnitas en la misma valoracin y cada una de ellas se compara individualmente con las mismas respuestas del Estndar. Este hecho puede garantizar el incremento del nmero de observaciones
con el Estndar. Dadas f observaciones a cada nivel de dosificacin de las h distintas Incgnitas, el nmero de observaciones a
cada nivel de dosificacin del Estndar se puede incrementar ventajosamente, si h tiene un valor grande hasta:
fh
USP 38
Esta regla slo puede aplicarse aproximadamente cuando las diferencias entre camadas o sus equivalentes deben separarse y,
en cualquier caso, su aplicacin es solamente una sugerencia.
Si todos los ensayos realizados concurrentemente cumplen con los requisitos de validez y presentan curvas de logaritmo de
dosis-respuesta lineales con la misma b y con la misma varianza de error s2 respecto de esas lneas, ambas estadsticas se consideran como caractersticas de la valoracin. La combinacin de toda evidencia obtenida de la misma valoracin en un valor
nico de la pendiente de la valoracin da como resultado una estimacin ms estable y confiable de b que si se analiza cada
Incgnita en forma independiente. Los grados de libertad y la confiabilidad de la varianza del error s2 se pueden incrementar
de manera similar. Los intervalos de confianza calculados con estos valores compuestos para b y s2 son menores en promedio
que si se los calcula basndose slo en parte de los datos pertinentes. Para calcular o aplicar tales estimaciones de valoraciones,
ver las Ecuaciones 10; 15; 16; 19; 28 y 29. La potencia estimada con una pendiente calculada a partir de un Estndar y una
nica Incgnita concuerda dentro de una fraccin del intervalo de confianza con la calculada a partir de la pendiente combinada de la valoracin total. Dado que sta ltima est basada en ms evidencia, se la considera como la mejor estimacin.
GLOSARIO
Glosario de Smbolos
A
absorbancia para calcular el % de reduccin en el crecimiento bacteriano a partir de lecturas turbidimtricas.
pendiente de la lnea recta que relaciona la respuesta (y) con el logaritmo de la dosis (x) [Ecuaciones 2b; 4; 5; 6].
constante para calcular M con las Ecuaciones 8 y 10.

constante para calcular L con las Ecuaciones 26 y 29.
ci
constante para calcular M cuando las dosis estn espaciadas como en la Tabla 8.
ci2
C
c2
cM2
constante para calcular L cuando las dosis estn espaciadas como en la Tabla 8.
trmino que mide la precisin de la pendiente en un intervalo de confianza [Ecuaciones 27; 28; 35; 36].
constante estadstica para analizar la significancia de una discrepancia [Tabla 9].
c2 para analizar la discordancia entre distintas estimaciones del logaritmo de la potencia [Ecuaciones 39; 40].
eb
ei de fila b en las Tablas 6 a 8.
ebi
mltiplo de S(x x)2 [Tabla 5; Ecuacin 6].
ei
suma de los cuadrados de los coeficientes factoriales en cada fila de las Tablas 6 a 8.
eq
ei de la fila q en las Tablas 6 a 8.
nmero de respuestas a cada nivel de dosificacin de una preparacin; nmero de repeticiones o conjuntos.
fS
nmero de observaciones en el Estndar.
fU
F1 a F3
G1, G2 y G3
h
nmero de observaciones en la Incgnita.

cociente de las varianzas observadas con 1 a 3 grados de libertad en el numerador [Tabla 9].
intervalo relativo en una prueba para determinar valores aberrantes [Tabla 1].
nmero de Incgnitas en una valoracin mltiple.
nmero de preparaciones en una valoracin mltiple, incluyendo el Estndar y h Incgnitas; es decir, h = h + 1.
intervalo logartmico entre logaritmos de dosis sucesivos; lo mismo para el Estndar y la Incgnita.
nmero de logaritmos de potencias estimadas en un promedio [Ecuacin 24]; nmero de tratamientos o dosis
[Tabla 4; Ecuaciones 1; 13; 15; 16]; nmero de intervalos o grupos en una serie [Tabla 2]; nmero de filas, columnas y dosis en un nico cuadrado latino [Ecuaciones 1a, 16a].
amplitud del intervalo de confianza en logaritmos [Ecuaciones 24; 26; 29; 38], o en trminos de una proporcin
de la potencia relativa de las diluciones comparadas [Ecuaciones 31, 33].
Lc
amplitud de un intervalo de confianza combinado [Ecuaciones 42; 43].
L c
amplitud de un intervalo de confianza para una media semiponderada M [Ecuacin 48].
DL50
dosis letal que se espera mate un 50% de los animales sometidos a prueba [Ecuacin 2c].
logaritmo de la potencia [Ecuacin 2].
logaritmo de la potencia de una Incgnita con respecto a su potencia supuesta.
media de las potencias logartmicas.
grados de libertad en una varianza s2 estimada o en la estadstica T o c2.
nmero de cuadrados latinos con filas en comn [Ecuaciones 1a, 16a].
nmero; por ejemplo, de observaciones en una prueba de intervalo [Tabla 1], o de respuestas y en una valoracin [Ecuacin 16].
probabilidad de observar un resultado dado o el valor tabular de una estadstica, generalmente P = 0,05 0,95
para intervalos de confianza [Tablas 1, 2, 9].
P*
potencia, P* = antilog M o calculada directamente.
cociente de una dosis dada del Estndar frente a la dosis correspondiente de la Incgnita, o potencia supuesta
de la Incgnita [Ecuaciones 2; 30; 33].
Captulos
USP 38
Glosario de Smbolos (Continuacin)

R*
s = s2
Captulos
s2
cociente del mayor de los k intervalos en una serie con respecto a su suma [Tabla 2].
desviacin estndar de una unidad de respuesta, tambin de un nico logaritmo de potencia estimada en una
valoracin directa [Ecuacin 24].
varianza del error de una unidad de respuesta.
Si
un logaritmo de dosis del Estndar [Tablas 6, 7].
la sumatoria de.
T de Student para n grados de libertad y una probabilidad P = 0,05 [Tabla 9].
total de las respuestas y en una valoracin [Ecuacin 16].
total incompleto para una valoracin en conjuntos aleatorios con una observacin faltante [Ecuacin 1].
T1
S(y) para los animales inyectados con el Estndar en el primer da [Ecuaciones 18; 36].
T2
S(y) para los animales inyectados con el Estndar en el segundo da [Ecuaciones 18; 36].
Ta
Ti para la diferencia entre las respuestas del Estndar y de la Incgnita [Tablas 6 a 8].
Tab
Ti para analizar la diferencia entre la pendiente del Estndar y de la Incgnita [Tablas 6 a 8].
Taq
Ti para analizar curvaturas opuestas en las curvas para el Estndar y la Incgnita [Tablas 6 a 8].
Tb
Ti para la pendiente combinada de las curvas de dosis-respuesta para el Estndar y la Incgnita [Tablas 6 a 8].
Tb
S(x1Tt) o S(x1y) para calcular la pendiente del logaritmo de la curva dosis-respuesta [Ecuaciones 10; 23; 28].
Ti
la suma de los productos de Tt multiplicado por los coeficientes factoriales correspondientes en cada fila de las
Tablas 6 a 8.
Tq
Ti para analizar curvaturas similares en las curvas para el Estndar y la Incgnita [Tablas 6 a 8].
Tr
fila o total fijado en una valoracin en conjuntos aleatorios [Ecuacin 16].
Tr
total incompleto para una valoracin en conjuntos aleatorios con una observacin faltante en la Ecuacin 1.
Tt
total de f respuestas y para una dosis dada de una preparacin [Tablas 6 a 8; Ecuaciones 6, 13, 14, 16].
Tt
total incompleto para el tratamiento con una observacin faltante en la Ecuacin 1.
Ui
un logaritmo de dosis de la Incgnita [Tablas 6 a 8].
varianza para la heterogeneidad entre valoraciones [Ecuacin 45].
V = 1/w
varianza de una M individual [Ecuaciones 44 a 47].
ponderacin asignada a M para una valoracin individual [Ecuacin 38], o a una probita para calcular una DL50
[Ecuaciones 2a, 2b].
semiponderacin de cada M en una serie de valoraciones [Ecuaciones 47; 48].
un logaritmo de la dosis de un frmaco en una valoracin biolgica [Ecuacin 5]; tambin la diferencia entre dos
logaritmos de dosis umbral en el mismo animal [Ecuacin 12].
x*
coeficientes para calcular las respuestas esperadas superior e inferior YL e YH en una curva de logaritmo de dosis-respuesta [Tabla 4; Ecuacin 3].
x1
un coeficiente factorial que es un mltiplo de (x x) para calcular la pendiente de una lnea recta [Tabla 5;
Ecuacin 6].
media del logaritmo de dosis [Ecuacin 5].
xS
media del logaritmo de dosis del Estndar [Ecuacin 9].
xU
media del logaritmo de dosis de la Incgnita [Ecuacin 9].
logaritmo de la potencia obtenida de una respuesta individual, interpolada a partir de una curva estndar [Ecuaciones 7a, 7b, 19].
XM
lmites de confianza para un logaritmo de la potencia M estimada [Ecuaciones 25; 30].
XP*
lmites de confianza para una potencia P* estimada directamente (ver valoracin de Digital) [Ecuacin 33].
y1yN
una respuesta individual observada para una dosis de un frmaco en las unidades usadas en el clculo de la potencia y la varianza del error [Ecuaciones 13 a 16]; una unidad de diferencia entre respuestas pareadas en las
valoraciones de 2 dosis [Ecuaciones 17; 18].
respuestas observadas que se listan en orden de magnitud, para calcular G1, G2 o G3 en la Tabla 1.
reemplazo de un valor faltante [Ecuacin 1].
respuesta media en un grupo o valoracin [Ecuacin 5].
yt
respuesta media a un tratamiento dado [Ecuaciones 3; 6].
una respuesta esperada a partir de la relacin dosis-respuesta, frecuentemente con subndices calificativos [Ecuaciones 3 a 5].
dosis umbral obtenida directamente por volumetra (ver valoracin de Digital) [Ecuacin 11].
dosis umbral promedio en un conjunto (ver valoracin de Digital) [Ecuaciones 31; 32; 33].
Pruebas Biolgicas / 115 Valoracin de Dexpantenol 207
USP 38
115 VALORACIN DE DEXPANTENOL

Este procedimiento se utiliza para realizar la valoracin de dexpantenol cuando se presenta como ingrediente de preparaciones multivitamnicas. Se aplica tambin para determinar el componente dextrgiro del pantenol racmico y de otras mezclas
que contengan pantenol dextrgiro.
Pueden usarse medios preparados segn se indica a continuacin o mezclas deshidratadas que proporcionen formulaciones
similares, siempre y cuando, una vez reconstituidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del distruidor, posean
propiedades de promocin del crecimiento equivalentes o superiores a las obtenidas con las frmulas incluidas en este captulo.
Estndares de Referencia USP 11ER Dexpantenol USP.
Solucin Madre del Estndar de DexpantenolDisolver en agua una cantidad pesada con exactitud de ER Dexpantenol
USP, diluir cuantitativamente con agua para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 800
mg por mL y mezclar. Almacenar en un refrigerador, al resguardo de la luz, y usar dentro de los 30 das de preparada.
Preparacin EstndarEl da de la valoracin, preparar una dilucin de la Solucin Madre del Estndar de Dexpantenol en
agua para obtener una concentracin de 1,2 mg de dexpantenol por mL.
Preparacin de ValoracinProceder segn se indica en la monografa individual y preparar una solucin que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentracin de dexpantenol en la Preparacin Estndar.
Medio de Pantotenato Modificado
Dextrosa, Anhidra
25 mL
25 mL
0,25 mL
10 g
5g
Solucin de AdeninaGuaninaUracilo
5 mL
Solucin de RiboflavinaClorhidrato de TiaminaBiotina
5 mL
Solucin de cido ParaaminobenzoicoNiacinaClorhidrato de Piridoxina
5 mL
Solucin Salina A
5 mL
Solucin Salina B
5 mL
Solucin de Pantotenato de CalcioPiridoxal
5 mL
Solucin de Polisorbato 40cido Oleico
5 mL
Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcladas; ajustar con hidrxido de sodio
1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 mL y mezclar.
Medio de Pantotenato Modificado de Doble ConcentracinPreparar segn se indica en Medio de Pantotenato Modificado, pero hacer que la dilucin final sea de 125 mL en vez de 250 mL. Preparar a diario.
Solucin de Hidrolizado cido de CasenaMezclar 100 g de casena sin vitaminas con 500 mL de cido clorhdrico 6 N
y someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el cido clorhdrico de la mezcla mediante destilacin bajo presin
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en aproximadamente 500 mL de agua, ajustar la
solucin con hidrxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 0,1 y agregar agua para obtener 1000 mL. Agregar 20 g de carbn
activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbn activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 10. Filtrar la solucin si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solucin de CistinaTriptfanoSuspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptfano (o 2,0 g de D,L-triptfano) en un
volumen de agua entre 700 y 800 mL, calentar a 75 5 y agregar, gota a gota y agitando, cido clorhdrico diluido (1 en 2)
hasta que los slidos se disuelvan. Enfriar, agregar agua para obtener 1000 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 10.
Solucin de AdeninaGuaninaUraciloDisolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 10 mL de cido clorhdrico 4 N, enfriar, agregar agua para obtener 200 mL y mezclar.
Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de Polisorbato 80Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 mL y mezclar.
Solucin de RiboflavinaClorhidrato de TiaminaBiotinaDisolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en cido
actico 0,02 N para obtener una solucin que contenga 20 mg de riboflavina, 10 mg de clorhidrato de tiamina y 0,04 mg de
biotina por mL. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de cido ParaaminobenzoicoNiacinaClorhidrato de PiridoxinaPreparar una solucin con alcohol neutralizado al 25 por ciento para obtener las siguientes concentraciones: 10 mg de cido paraaminobenzoico, 50 mg de niacina y 40
mg clorhidrato de piridoxina por mL. Almacenar en un refrigerador.
Solucin Salina ADisolver 25 g de fosfato monobsico de potasio y 25 g de fosfato dibsico de potasio en agua para obtener 500 mL. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Captulos
Solucin de CistinaTriptfano
Captulos
208 115 Valoracin de Dexpantenol / Pruebas Biolgicas
USP 38
Solucin Salina BDisolver en agua 10 g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 mL. Agregar 5 gotas de cido clorhdrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solucin de PiridoxalPantotenato de CalcioDisolver 40 mg de clorhidrato de piridoxal y 375 mg de pantotenato de
calcio en alcohol al 10 por ciento para obtener 2000 mL y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 das
de preparada.
Solucin de Polisorbato 40cido OleicoDisolver 25 g de polisorbato 40 y 0,25 g de cido oleico en alcohol al 20 por
ciento para obtener 500 mL y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 das de preparada.
Cultivo Madre de Pediococcus acidilacticiDisolver con ayuda de calor 6,0 g de peptona, 4,0 g de digerido pancretico
de casena, 3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en aproximadamente 800 mL de agua. Ajustar con hidrxido de sodio 0,1 N o cido clorhdrico 0,1 N a un pH entre 6,5 y 6,6, agregar agua
hasta 1000 mL y mezclar. Agregar porciones de aproximadamente 10 mL de la solucin a tubos de cultivo, tapar y esterilizar a
121 durante 15 minutos. Enfriar en pendiente y almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre de Pediococcus acidilactici* en un tubo conteniendo una cua de este medio. Incubar a 35 durante 20 a 24 horas y almacenar en un refrigerador.
Mantener el cultivo madre realizando transferencias mensuales en tubos con medio en cua nuevos.
InculoInocular tres porciones de 250 mL de Medio de Pantotenato Modificado de una pendiente de cultivo madre e incubar a 35 durante 20 a 24 horas. Centrifugar la suspensin de las porciones combinadas y lavar las clulas con Medio de Pantotenato Modificado. Resuspender las clulas en suficiente Medio modificado de pantotenato de manera que una dilucin 1:50,
cuando se analiza en un tubo de ensayo de 13 mm de dimetro, proporciona una transmisin de luz de 80% a 530 nm. Transferir porciones de 1,2 mL de esta suspensin madre a ampollas de vidrio, sellar, congelar en nitrgeno lquido y almacenar en
un congelador. El da de la valoracin, dejar que las ampollas alcancen temperatura ambiente, mezclar el contenido y diluir 1
mL del cultivo descongelado con solucin salina estril SR hasta 150 mL. [NOTAEsta dilucin se puede modificar, cuando sea
necesario, para obtener la respuesta deseada.]
ProcedimientoPreparar por triplicado series de ocho tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los
tubos de una serie: 5,0 mL, 4,5 mL, 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 0,0 mL. A estos mismos tubos y en ese mismo
orden agregar 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL y 5,0 mL de la Preparacin estndar.
Preparar por duplicado una serie de cinco tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una
serie: 4,0 mL, 3,5 mL, 3,0 mL, 2,0 mL y 1,0 mL. A estos mismos tubos y en ese mismo orden, agregar 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL,
3,0 mL y 4,0 mL de la Preparacin de Valoracin.
Agregar 5,0 mL de Medio de Pantotenato Modificado de Doble Concentracin a cada tubo y mezclar. Cubrir los tubos con
tapas metlicas y esterilizar en autoclave a 121 durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente en un bao de agua fra e
inocular cada tubo con 0,5 mL del Inculo. Dejar incubando a 37 durante 16 horas. Detener el crecimiento calentando a una
temperatura no inferior a 80, por ejemplo mediante la aplicacin de vapor a presin atmosfrica en un esterilizador adecuado
durante 5 a 10 minutos. Enfriar y determinar concomitantemente el porcentaje de transmitancia de la suspensin, en celdas
de igual paso ptico, en un espectrofotmetro adecuado, a 530 nm.
ClculoDibujar una curva de dosis-respuesta en papel para grficos aritmticos trazando la respuesta promedio, en porcentaje de transmitancia, para cada conjunto de tubos de la curva estndar en funcin de las concentraciones del estndar. La
curva se traza uniendo cada par adyacente de puntos con una lnea recta. A partir de esta curva estndar, determinar la potencia por interpolacin, en funcin del dexpantenol, de cada tubo que contiene porciones de la Preparacin de Valoracin. Dividir
la potencia de cada tubo por la cantidad de Preparacin de Valoracin agregada para obtener las respuestas individuales. Calcular la respuesta media realizando el promedio de las respuestas individuales que varan de su media en no ms de un 15%,
utilizando no menos de la mitad del nmero total de tubos. Calcular la potencia de la porcin de material tomada para la
valoracin, en funcin del dexpantenol, multiplicando la respuesta promedio por el factor de dilucin adecuado.
121 VALORACIN DE INSULINA

La manifestacin ms importante de la accin de la insulina, un brusco descenso de la glucosa en sangre, sirvi de base para
valoraciones biolgicas desde sus primeros usos clnicos. El procedimiento, si bien es relativamente complejo, tiene el gran mrito de reflejar con exactitud el efecto en el paciente diabtico. La aparicin de mtodos fisicoqumicos prcticos pero sofisticados (por ejemplo la cromatografa lquida) para medir cuantitativamente la potencia de la insulina ha dado lugar a pruebas
farmacopeicas ms precisas y exactas para la insulina y los productos derivados de la insulina. Sin embargo, no se puede determinar la identidad biolgica de la insulina y de sus productos por estos mtodos. Por esta razn, se incluye en este captulo
una prueba cualitativa en conejos y su uso se especifica en las monografas correspondientes.
El Mtodo de Determinacin de Glucosa en Sangre de ConejosCuantitativo se usa para determinar la potencia de los Estndares de Referencia de la Insulina, para la validacin de la estabilidad de nuevas preparaciones de insulina y para determinar las
actividades especficas de los anlogos de la insulina.
* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) No. 8042 es adecuada.
Pruebas Biolgicas / 121 Valoracin de Insulina 209
USP 38
MTODO DE LA GLUCEMIA EN CONEJOSCUANTITATIVO
Tabla 1
Grupo
Primera Inyeccin
Segunda Inyeccin
Solucin Estndar 2
Solucin de Valoracin 1
Solucin Estndar 1
Solucin Estndar 1
Solucin Estndar 2
Muestras de SangreA 1 hora 5 minutos y 21/2 horas 5 minutos despus de la inyeccin, extraer de cada conejo una
muestra de sangre adecuada de una vena marginal de la oreja. La sangre tambin se puede extraer eficazmente de la arteria
auricular central.
Determinacin de DextrosaDeterminar el contenido de dextrosa en las muestras de sangre mediante un procedimiento
adecuado que se adapte a un anlisis automatizado. Se puede utilizar el siguiente procedimiento.
Solucin AnticoagulanteDisolver 1 g de edetato sdico y 200 mg de fluoruro de sodio en 1 L de agua y mezclar.
Preparaciones Estndar de DextrosaTransferir concentraciones conocidas de ER Dextrosa USP a recipientes adecuados y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con Solucin Anti-coagulante (1:9) para obtener una serie de Preparaciones Estndar de Dextrosa que contengan entre 20 mg y 100 mg por 100 mL con concentraciones conocidas similares a las concentraciones de las muestras de sangre de los conejos.
Preparaciones de PruebaPipetear y transferir a distintos recipientes adecuados 0,1 mL de cada Muestra de Sangre y 0,9 mL
de Solucin Anticoagulante.
ProcedimientoSometer a dilisis las Preparaciones de Prueba a travs de una membrana semipermeable durante un tiempo
suficiente de modo que la dextrosa pase a travs de la membrana a una solucin salina SR que contenga oxidasa de glucosa,
peroxidasa de rbano, clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona SR y N,N-dimetilanilina. Las absorbancias de las
Preparaciones de Prueba se determinan a 600 nm en un colormetro con registrador. Las absorbancias de las Preparaciones Estndar de Dextrosa se determinan de manera similar al comienzo y al final de cada corrida.
ClculosCalcular la respuesta de cada conejo a cada inyeccin como la suma de los dos valores de glucemia. Calcular las
diferencias individuales, y, restando las respuestas como se indica en la Tabla 2, sin importar el orden cronolgico.
Captulos
Estndares de Referencia USP 11ER Dextrosa USP. ER Insulina USP. ER Insulina (Bovina) USP. ER Insulina Humana USP.
ER Insulina (Porcina) USP.
DiluyentePreparar una solucin acuosa que contenga de 0,1% a 0,25% (p/v) de cresol o de fenol, de 1,4% a 1,8% (p/v)
de glicerina y suficiente cido clorhdrico para obtener un pH de entre 2,5 y 3,5 a menos que se especifique algo diferente en
la monografa individual.
Solucin Madre del EstndarDisolver ya sea una cantidad adecuada de ER Insulina USP pesada con exactitud o un vial
de ER Insulina USP liofilizada de la especie correspondiente en Diluyente para preparar una Solucin Madre del Estndar que
contenga 40 Unidades USP de Insulina por mL y que tenga un pH entre 2,5 y 3,5 a menos que se indique algo diferente en la
monografa individual. Almacenar en un lugar fro, proteger contra la congelacin y usarla dentro de un perodo de 6 meses.
Soluciones EstndaresDiluir porciones de la Solucin Madre del Estndar con Diluyente para obtener dos soluciones, una
que contenga 1,0 Unidad USP de Insulina por mL (Solucin Estndar 1), y otra que contenga 2,0 Unidades USP de Insulina por
mL (Solucin Estndar 2).
Solucin Madre de ValoracinProceder segn se indica en Solucin Madre del Estndar excepto que se debe usar una
cantidad adecuada de la preparacin en anlisis en lugar de ER Insulina USP. La Solucin Madre de Valoracin contiene aproximadamente 40 Unidades USP de Insulina por mL.
Soluciones de ValoracinDiluir porciones de la Solucin Madre de Valoracin con Diluyente para hacer dos diluciones de
la preparacin en anlisis, una de las cuales se puede esperar que contenga 1,0 Unidad USP de Insulina por mL (Solucin de
Valoracin 1), basndose en la potencia supuesta y la otra que contenga 2,0 Unidades USP de Insulina por mL (Solucin de
Valoracin 2). En el caso de una inyeccin de insulina neutra, ajustar a un pH de 2,5 a 3,5 antes de realizar las diluciones.
Dosis de las Soluciones a InyectarSeleccionar la dosis de las diluciones a inyectar, basndose en pruebas o experiencias
anteriores, cuyo volumen generalmente est entre 0,30 mL y 0,50 mL. Para cada animal, el volumen de la Solucin Estndar es
el mismo que el de la Solucin de Valoracin.
Preparacin de los AnimalesSeleccionar conejos adecuados y sanos que no pesen menos de 1,8 kg cada uno. Mantener
los conejos en el laboratorio durante no menos de 1 semana antes de utilizarlos en la valoracin y alimentarlos con una dieta
uniforme satisfactoria, con acceso libre al agua en todo momento.
ProcedimientoDividir los conejos en cuatro grupos iguales, preferentemente de no menos de seis conejos cada uno. El
da anterior al procedimiento, aproximadamente 20 horas antes de la valoracin, suministrar a cada conejo alimento suficiente
para que se consuma en 6 horas. Seguir este mismo programa de alimentacin antes de cada da de prueba. Durante la valoracin, no suministrar alimentos hasta no haber extrado la ltima muestra de sangre. Manipular los conejos con cuidado para
evitar una excitacin indebida e inyectar subcutneamente las dosis indicadas en el siguiente diseo (ver la Tabla 1); la segunda inyeccin se debe administrar el da posterior a la primera inyeccin o no ms de 1 semana despus. El tiempo entre la
primera y la segunda inyeccin es el mismo para todos los conejos.
210 121 Valoracin de Insulina / Pruebas Biolgicas
USP 38
Cuando falten datos de uno o ms conejos en una valoracin, no usar las frmulas de intervalo de confianza que se brindan
en la presente valoracin, sino usar un procedimiento estadstico adecuado. Los datos an pueden analizarse con un anlisis
adecuado de varianza.
Cuando el nmero de conejos, f, usado en la valoracin sea igual en cada grupo, determinar la suma de y para cada grupo y
calcular Ta = T1 + T2 + T3 T4 y Tb = T1 + T2 + T3 + T4. El logaritmo de la potencia relativa de las diluciones de prueba es M =
0,301Ta/Tb. La potencia de la inyeccin en Unidades USP por mg es igual al antilogaritmo (log R + M), donde R = vS/vU, en
donde vS es el nmero de Unidades USP por mL de la Solucin estndar y vU es la cantidad de mg de insulina por mL de la
Solucin de valoracin correspondiente.
Determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa con una confianza del 95% usando el Teorema de
Fieller (ver Apndice y Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111). Si el intervalo de confianza es mayor de 0,082, que
corresponde, a P = 0,95, a lmites de confianza de aproximadamente 10% de la potencia calculada, repetir la valoracin
hasta que los datos combinados de dos o ms valoraciones, redeterminadas segn se describe en Combinacin de Valoraciones
Independientes en Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111, cumplan con este lmite aceptable.
Tabla 2
Captulos
Grupo
Diferencias
Respuesta
Individual (y)
Respuesta
Total (T)
Desviaciones
Estndar de las
Diferencias (S)
S1
Solucin Estndar 2Solucin de Valoracin 1
y1
T1
Solucin de Valoracin 2Solucin Estndar 1
y2
T2
S2
Solucin de Valoracin 2Solucin Estndar 1
y3
T3
S3
Solucin Estndar 2Solucin de Valoracin 1
y4
T4
S4
PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLGICA

Proceder segn se indica en el Mtodo de Determinacin del Contenido de Glucosa en Sangre de ConejosCuantitativo con las
siguientes modificaciones:
ProcedimientoDividir los conejos en 4 grupos iguales de 2 conejos cada uno.
ClculoProceder segn se indica para Clculos en Mtodo de Determinacin de Contenido de Glucosa en Sangre de ConejosCuantitativo, pero no determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa, M.
InterpretacinSi el valor de la potencia obtenido no es menor de 15 Unidades USP por mg, se cumple el requisito de la
Prueba de Bioidentidad. Si el valor de la potencia es menor de 15 Unidades USP por mg, repetir la prueba usando ocho conejos
ms. Si la potencia promedio de los 2 conjuntos de pruebas no es menor de 15 Unidades USP por mg, se cumple el requisito
de la prueba.
ApndiceTeorema de Fieller para Determinar el Intervalo de Confianza para un Cociente

Esta versin del Teorema de Fieller es para el caso en el cual el numerador y el denominador no estn correlacionados. La
ecuacin asume que el numerador y el denominador estn normalmente distribuidos y que los grupos de conejos son del mismo tamao.
Luego, el intervalo de 95% de confianza para el cociente es:
donde f (grados de libertad en los errores estndar) = 4(k1), donde k es la cantidad de conejos en un grupo, t es el percentil
superior de 97,5 de la distribucin t con grados f de libertad, y
Si g 1, el denominador no es significativamente diferente a 0 y la frmula no funciona.
Pruebas Biolgicas / 121.1 Procedimientos para Insulinas 211
USP 38
121.1 PROCEDIMIENTOS ANALTICOS FISICOQUMICOS PARA INSULINAS

INTRODUCCIN
Existen diversos procedimientos fisicoqumicos que se utilizan para la evaluacin de los atributos de calidad de la Insulina Humana y de diversos anlogos de insulina, en lo sucesivo referidos como insulinas. De stos, el mapeo de pptidos y la determinacin de protenas de alto peso molecular tienen caractersticas similares para el anlisis de los diversos frmacos y medicamentos basados en insulina. Este captulo describe las pruebas para mapeo de pptidos y para el anlisis cuantitativo de
protenas de alto peso molecular que se pueden usar para las diversas insulinas.
Las instrucciones especficas que difieran de los procedimientos generales aqu descritos se proporcionan en las monografas
correspondientes de frmacos o medicamentos para las diferentes insulinas.
MAPEO DE PPTIDOS
La digestin de insulina se lleva a cabo usando proteasa de la cepa V8 de Staphylococcus aureus (S. aureus V8), una serin-endoproteineasa que escinde desde el lado C-terminal a nivel de los residuos glutamilo y aspartilo en solucin amortiguadora de
fosfato de pH 7,8. Esta proteasa es especfica para la digestin de Glu-C en bicarbonato de amonio y otras soluciones amortiguadoras de pH 7,8 que no contienen fosfato. La presencia de prolina en el lado carboxi de la unin peptdica inhibe la
escicin. El sistema amortiguador usado debe escindir todas las uniones glutamilo de la insulina sin escindir las uniones aspartilo. En general, usando el sistema amortiguador descrito en la Solucin muestra siguiente, la insulina se digiere en cuatro
pptidos.
A continuacin se muestran las diferencias de aminocidos entre los anlogos de la insulina y la Insulina Humana, y las diferencias in silico en los fragmentos obtenidos luego de la digestin con S. aureus V8.
La Figura 1 presenta los cuatro fragmentos de Insulina Humana despus de la digestin con proteasa V8 de S. aureus.
Captulos
Figura 1. Insulina Humana: Fragmentos de digerido con proteasa V8 de S. aureus.

La Tabla 1 presenta las diferencias de aminocidos entre los anlogos de insulina e Insulina Humana.
Tabla 1. Diferencias de Aminocidos entre los Anlogos de Insulina e Insulina Humana
Anlogo de Insulina
Insulina asparta
Diferencias de Aminocidos con la Insulina Humana

B28 Asp
Insulina glargina
A21 Gly, dos Arg agregadas al C-terminal de la cadena B
Insulina glulisina
B3 Lys, B29 Glu
Insulina lispro
B28 Lys, B29 Pro
La Tabla 2 presenta los fragmentos especficos del digerido de proteasa V8 de S. aureus de los anlogos de insulina. Se resaltan
las diferencias de aminocidos en comparacin con la Insulina Humana.
Tabla 2. Diferencias de Aminocidos: Insulina Humana y Anlogos (Las Diferencias con Insulina Humana Se Presentan en Negrilla)
Diferencias de Aminocidos en Comparacin con la Insulina Humanaa
Anlogo de Insulina
Insulina asparta
Insulina glargina
Insulina glulisina
Insulina lispro
a
Fragmento III
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr (B30)
Fragmento II
(A18) Asn-Tyr-Cys-Gly (A21)
Fragmento III
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg (B32)
Fragmento I
(B1) Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu (B11)
Fragmento III
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr (B30)
Fragmento III
(B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (B30)
Las letras A y B indican las cadenas A y B de insulina, respectivamente; los nmeros indican la posicin del aminocido en la cadena.
PROCEDIMIENTO PARA MAPEO DE PPTIDOS

El siguiente procedimiento se aplica a la preparacin de mapas peptdicos de Insulina Humana y anlogos de insulina.
Solucin amortiguadora de HEPES: Disolver 2,38 g de HEPES (cido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfnico) en
aproximadamente 90 mL de agua en un matraz volumtrico de 100 mL. Ajustar con hidrxido de sodio 5 M a un pH de
7,5, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solucin amortiguadora de sulfato: Sulfato de amonio 2,0 M y cido sulfrico 0,5 M (1:1). Mezclar y filtrar.
212 121.1 Procedimientos para Insulinas / Pruebas Biolgicas
USP 38
DIGESTIN DE INSULINA
El siguiente procedimiento provee una escisin eficiente de las uniones a nivel del glutamilo de la insulina. [NOTASe pueden
usar volmenes hasta 20 veces mayores siempre que la proporcin de las soluciones siga siendo la misma. Si al correr un
digerido de la enzima sola se obtienen subproductos de autolisis interferentes en el cromatograma, la relacin enzima:insulina deber reducirse y se deber aumentar el tiempo de digestin.]
Solucin enzimtica: Preparar una solucin de proteasa V8 de S. aureus (aproximadamente 500 unidades/mg) de 1
mg/mL en agua.
Solucin muestra: Preparar una solucin de la insulina a examinar de 2,0 mg/mL en cido clorhdrico 0,01 N. Agregar a
un vial limpio 25 mL de la solucin de insulina de 2,0 mg/mL, 100 mL de Solucin amortiguadora de HEPES y 20 mL de
Solucin enzimtica (relacin final 25:100:20). Tapar el vial e incubar a 25 durante 6 horas. Detener la reaccin agregando un volumen igual de Solucin amortiguadora de sulfato. Puede ser necesario aumentar los tiempos de incubacin para
los anlogos de baja solubilidad a un pH de 7,5.
Solucin estndar: Preparar al mismo tiempo y de la misma manera una solucin del Estndar de Referencia de Insulina
USP correspondiente, segn se indica en la Solucin muestra.
DETERMINACIN DE FRAGMENTOS PEPTDICOS
Determinar los fragmentos peptdicos usando el siguiente procedimiento de mapeo de pptidos (ver Artculos Obtenidos Por
BiotecnologaMapeo de Pptidos 1055).
Solucin A: Acetonitrilo, agua y Solucin amortiguadora de sulfato (100:700:200). Filtrar y desgasificar.
Solucin B: Acetonitrilo, agua y Solucin amortiguadora de sulfato (400:400:200). Filtrar y desgasificar.
Captulos
Tabla 3
Tiempo
(min)
Solucin A
(%)
Solucin B
(%)
95
95
30
41
59
35
20
80
40
95
50
95
Modo: HPLC
Detector: UV 214 nm
Columna: 4,6 mm 10 cm; relleno L1 de 5 mm
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Aptitud del sistema
Comparabilidad de los cromatogramas: En el cromatograma obtenido a partir de la Solucin estndar, identificar los
picos debidos a los fragmentos de digestin I, II, III y IV. El cromatograma de la Solucin estndar corresponde al cromatograma tpico provisto con el Estndar de Referencia de Insulina USP correspondiente.
Factor de asimetra: No ms de 1,5
Resolucin: Debe existir separacin completa de los picos debidos a los fragmentos II y III. La resolucin se define en la
monografa de la insulina correspondiente.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra
Acondicionar el Sistema cromatogrfico mediante una corrida en condiciones iniciales, t = 0 minutos, durante al menos
15 minutos. Correr un programa de gradientes blanco antes de inyectar los digeridos. Inyectar por separado volmenes iguales de la Solucin estndar y la Solucin muestra, y registrar las respuestas de cada pico.
Criterios de aceptacin: El perfil cromatogrfico de la Solucin muestra corresponde al de la Solucin estndar.
LMITE DE PROTENAS DE ALTO PESO MOLECULAR
PROCEDIMIENTO
Solucin A: 1 mg/mL de L-arginina en agua
Fase mvil: Solucin A, acetonitrilo y cido actico glacial (65:20:15). Filtrar y desgasificar.
Solucin de resolucin: Almacenar una cantidad adecuada de frmaco basado en insulina a temperatura ambiente durante un periodo suficiente (510 das, o segn sea necesario) para obtener insulina con ms de 0,4% de protenas de
alto peso molecular. Preparar una solucin de 4 mg/mL en cido clorhdrico 0,01 N. Almacenar la solucin en un refrige-
USP 38
Pruebas Biolgicas / 123 Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn 213
Resultado = 100 SrH/(SrH + rM)

SrH
= suma de las respuestas de todos los picos con tiempos de retencin menores que el del monmero de insulina
rM
= respuesta del pico del monmero de insulina
Criterios de aceptacin: Segn se indica en la monografa de insulina correspondiente.
ER Insulina Humana de Alto Peso Molecular USP (uso alternativo u opcional)
123 PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLGICA DE GLUCAGN

DEFINICIN
El Glucagn es una hormona polipeptdica que posee la propiedad de incrementar la concentracin de glucosa en la sangre
mediante su liberacin a partir de la reserva de glucgeno del hgado y que se usa en la prctica clnica para tratar la hipoglucemia. El glucagn humano, porcino y bovino comparten la misma secuencia de 29 aminocidos. Anteriormente, el glucagn disponible comercialmente se purificaba a partir de glndulas pancreticas bovinas y porcinas. En la actualidad, el
glucagn humano es producido recombinantemente (por ADNr) (rGlucagn) con diversos sistemas de fermentacin microbiana usando la secuencia de aminocidos humana. La monografa de los compendios USPNF, Glucagn para Inyeccin, define las pruebas de identificacin para glucagn. La identidad biolgica del glucagn se debe determinar usando un mtodo
de valoracin biolgica validado, aprobado por una autoridad competente. La valoracin biolgica debe demostrar que el
proceso de fabricacin produce Glucagn con una actividad biolgica de no menos de 0,80 Unidades USP/mg de glucagn.
Este captulo describe una prueba de identidad biolgica validada que mide la glucosa liberada a partir de clulas de hgado
(hepatocitos) de rata preparadas recientemente, estimuladas in vitro con Glucagn.
VALORACIN
VALORACIN CON CLULAS HEPTICAS PRIMARIAS
[NOTATodas las soluciones amortiguadoras deben estar oxigenadas, preparadas con Agua Estril para Inyeccin o Agua Estril para Irrigacin, entibiadas a 37 y ajustadas a un pH final de 7,4, a menos que se indique algo distinto. Se deben realizar
por lo menos dos valoraciones independientes (determinaciones repetidas) utilizando dos hgados de rata para cada lote
de Glucagn. La Figura 1 demuestra el proceso usado para generar un valor repetido. Se debe combinar como mnimo dos
determinaciones repetidas de acuerdo con la seccin Clculos. Los intervalos de concentracin de las Preparaciones estndar
y las Preparaciones de valoracin se pueden modificar para que caigan dentro del intervalo lineal de la Valoracin; asimismo,
los clculos se pueden ajustar de manera correspondiente. Como alternativa, se puede emplear un anlisis de curva com-
Captulos
rador y usar dentro de los 7 das. Como alternativa, disolver aproximadamente 4 mg de ER Insulina Humana de Alto Peso
Molecular USP en 1 mL de cido clorhdrico 0,01 N.
Solucin muestra: En un vial pequeo, preparar una solucin de insulina de 4 mg/mL en cido clorhdrico 0,01 N y mezclar hasta disolver. Almacenar en un refrigerador y usar dentro de los 7 das.
Modo: HPLC
Detector: UV 276 nm
Columna: 7,8 mm 30 cm; relleno L20 de 5 a 10 mm
Temperaturas
Columna: Ambiente
Muestreador automtico: Se recomienda usar un muestreador automtico refrigerado.
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de resolucin
Tiempos de retencin: Entre 13 y 17 minutos para los complejos de insulina polimrica, aproximadamente 17,5 minutos para el dmero covalente de insulina, y entre 18 y 22 minutos para el monmero de insulina, con sales que eluyen despus del monmero de insulina.
Cociente entre el pico y el valle: El cociente entre la altura del pico del dmero covalente de insulina y la altura del
valle entre el pico del dmero covalente de insulina y el pico del monmero de insulina es no menos de 2,0.
Anlisis
No tomar en cuenta los picos que tengan tiempos de retencin mayores que el del monmero de insulina.
Calcular el porcentaje de protenas de alto peso molecular en la porcin de Insulina tomada:
214 123 Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn / Pruebas Biolgicas
USP 38
Captulos
pleta usando mtodos estadsticos no lineales validados, siempre y cuando se demuestre la similitud cuando los analistas
comparen las respuestas de las Preparaciones estndar y las Preparaciones de valoracin.]
Figura 1. Diagrama de flujo del mtodo de valoracin de hepatocitos de rata (ER = Estndar de Referencia).
Preparacin de Hepatocitos
Solucin amortiguadora para perfusin sin calcio con dextrosa: Preparar una solucin que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 1,80 g/L de dextrosa, 0,19 g/L de cido edtico (EDTA) y 2,38 g/L de cido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfnico (HEPES). Oxigenar antes de su uso.
Solucin amortiguadora de colagenasa: Preparar una solucin que contenga 3,62 g/L de cloruro de sodio, 23,83
g/L de HEPES, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,52 g/L de cloruro de calcio y 1,8 g/L de dextrosa. Ajustar a un pH de 7,6.
Inmediatamente antes de la perfusin, disolver en esta solucin una cantidad de colagenasa para obtener una concentracin de 0,02%0,05%. La concentracin exacta de colagenasa se determina empricamente para cada lote nuevo de enzima y es la cantidad que puede disociar el tejido uniformemente dentro de los 10 minutos del ingreso de la solucin amortiguadora y producir una concentracin celular viable de no menos de 3 106 clulas/mL.
Solucin amortiguadora para lavado: Preparar una solucin que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de
cloruro de potasio, 0,19 g/L de EDTA, 2,38 g/L de HEPES, 0,11 g/L de cloruro de calcio y 0,06 g/L de sulfato de magnesio.
Solucin amortiguadora para incubacin: Preparar una solucin que contenga 6,19 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L
de cloruro de potasio, 0,22 g/L de cloruro de calcio, 0,12 g/L de sulfato de magnesio, 0,16 g/L de fosfato monobsico de
potasio, 11,915 g/L de HEPES y 10 g/L de albmina srica bovina (BSA al 1%). Ajustar a un pH de 7,5.
Animales de prueba: Mantener ratas macho Sprague-Dawley con una dieta estndar de alimento para rata, con agua a
voluntad y permitir que se ajusten a su nuevo ambiente antes del anlisis. En la maana de la prueba, seleccionar una rata
sana con un peso aproximado de 300400 g y administrar 100 Unidades de Heparina Sdica por va subcutnea.
Procedimiento: [NOTAEfectuar este procedimiento por la maana para asegurarse de que la rata tenga un nivel ptimo
de glucgeno en el hgado y que el procedimiento pueda completarse en un solo da.] Anestesiar a la rata con un anestsico adecuado. Abrir la cavidad abdominal y aislar la vena porta. Introducir un angiocatter en la vena porta y ligarlo en la
ubicacin general de la rama esplnica. Luego conectarlo a una bomba de perfusin. Comenzar la perfusin (25 mL/min)
in situ con la Solucin amortiguadora para perfusin sin calcio con dextrosa previamente entibiada y oxigenada. Mientras el
hgado aumenta de tamao, cortar la vena cava inferior para permitir que la presin se equilibre. [NOTASe requieren
aproximadamente 300 mL del lquido de perfusin para limpiar el hgado de glbulos rojos a una velocidad de flujo de
2560 mL/min.] Despus, hacer que circule Solucin amortiguadora de colagenasa a una velocidad de flujo apropiada de
manera que el hgado empiece a drenar el lquido de perfusin de los lbulos en aproximadamente 10 minutos (por lo
general 2560 mL/min). Cuando el hgado aumente significativamente de tamao, cambie de color y consistencia, y comience a drenar el lquido de perfusin de los lbulos, cambiar el sistema a la Solucin amortiguadora para lavado previamente entibiada y oxigenada. Se requieren aproximadamente 100 mL de Solucin amortiguadora para lavado para lavar el
hgado de colagenasa a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Retirar quirrgicamente el hgado del animal y colocarlo en
una cpsula de Petri previamente entibiada que contenga una pequea cantidad de Solucin amortiguadora para lavado
USP 38
Pruebas Biolgicas / 123 Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn 215
Captulos
oxigenada (37). Peinar suavemente el hgado con un peine de dientes finos de acero inoxidable para liberar los hepatocitos. Filtrar y lavar los hepatocitos con Solucin amortiguadora para lavado a travs de gasa (con un grosor de 3 capas, o a
travs de una red de polietileno con un tamao de malla de 150 mm), previamente humedecida, en un vaso de precipitados. Transferir las clulas a dos tubos de centrfuga y centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 600 rpm. Desechar el sobrenadante y volver a suspender los dos pellets en Solucin amortiguadora para incubacin. Combinar los dos
pellets en un recipiente adecuado y agregar suficiente Solucin amortiguadora para incubacin para obtener 150 mL.
Aptitud del sistema de la preparacin de las clulas: La concentracin de las clulas puede variar debido a la actividad
de colagenasa y a la viabilidad de los hepatocitos. Para verificar la viabilidad de las clulas y determinar la concentracin
de clulas viables, diluir una alcuota de 100 mL de la suspensin celular con 400 mL de Solucin amortiguadora para lavado
y 500 mL de solucin isotnica de azul de tripn al 0,4%. Cargar alcuotas de la suspensin celular en las dos cmaras de
un hemocitmetro y contar los ocho cuadrantes. Para cumplir con la aptitud del sistema del mtodo de preparacin de
las clulas, se debe obtener una concentracin de clulas viables de 3 106 clulas/mL (un intervalo aceptable es de 2,5
106 a 3,4 106 clulas/mL) a fin de proseguir con la valoracin biolgica. Si la concentracin de clulas viables excede el
lmite superior, se puede agregar a las clulas un volumen adicional de Solucin amortiguadora para incubacin para ajustar la concentracin a 3 106 clulas/mL. En este caso, se realiza un nuevo recuento de las clulas en un hemocitmetro,
segn se indic anteriormente para verificar la concentracin. [NOTALas clulas viables son aqullas que excluyen el azul
de tripn.]
Determinacin de Glucosa
Solucin de control negativo: Preparar una solucin que contenga BSA al 0,5% usando Agua Estril para Inyeccin o
Agua Estril para Irrigacin.
Matraces para incubacin: Usar matraces Erlenmeyer de 25 mL especialmente preparados, cuyos fondos se hayan calentado y empujado hacia adentro para formar un centro elevado cnicamente o matraces similares que permitan un mezclado suficiente al agitar por rotacin suave. Colocar los Matraces para incubacin en un bao de agua con agitador orbital a 35.
Preparaciones estndar: En el da de la valoracin, disolver dos viales de ER rGlucagn USP, medidos con exactitud, en
cido clorhdrico 0,01 N u otro diluyente adecuado (el volumen se basa en la potencia del lote del Estndar de Referencia)
para obtener dos soluciones que contengan 1 Unidad USP de rGlucagn/mL cada una. Todas las diluciones posteriores se
realizan con Solucin de control negativo. Diluir con exactitud volmenes medidos de cada solucin con Solucin de control
negativo para obtener una concentracin intermedia de 400 mU/mL y luego diluir la concentracin intermedia para producir cinco concentraciones: 200; 100; 50; 25 y 12,5 mU/mL (Preparaciones estndar). Pipetear y transferir 0,1 mL de cada
una de las Preparaciones estndar a distintos Matraces para incubacin. Pipetear y transferir 0,1 mL de Solucin de control
negativo a cada uno de dos matraces (Soluciones de control negativo 1 y 2).
Preparaciones de valoracin: Usando cantidades pesadas con exactitud de muestras de Glucagn, proceder segn se
indica en Preparaciones estndar o, si se est analizando Glucagn para Inyeccin, reconstituir 10 viales agregando lentamente el contenido de las jeringas prellenadas adjuntas que contienen un diluyente apropiado para glucagn. Mezclar
suavemente cada vial hasta que se disuelva el glucagn. Con las mismas jeringas, extraer el contenido de cinco viales y
colocar las soluciones en un matraz volumtrico de 25 mL. Repetir la operacin para los cinco viales remanentes, transfiriendo el contenido a un segundo matraz volumtrico de 25 mL. Diluir cada matraz con cido clorhdrico 0,01 N a volumen. Diluir una cantidad exacta de cada solucin con BSA al 0,5% hasta obtener una concentracin de 400 mU/mL y
diluir la concentracin intermedia hasta producir cinco concentraciones de Preparacin de valoracin: 200; 100; 50; 25 y
12,5 mU/mL. Luego, proceder segn se indica en Preparaciones estndar.
Solucin madre de referencia: Secar ER Dextrosa USP y luego transferir 1,0 g, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 100 mL. Disolver y diluir con solucin saturada de cido benzoico a volumen.
Soluciones de referencia: Transferir cantidades adecuadas de Solucin madre de referencia a cuatro matraces y diluir con
solucin saturada de cido benzoico hasta obtener Soluciones de referencia con concentraciones de 100; 500; 1000 y 1500
mg/L.
Solucin de ferrocianuro de potasio: Disolver 1,25 g de ferrocianuro de potasio trihidrato en 125 mL de Agua Estril
para Inyeccin o usar una fuente comercial apropiada.
Aptitud del sistema: Analizar la Solucin de ferrocianuro de potasio, las Soluciones de referencia y cinco determinaciones
repetidas adicionales de la Solucin de referencia de 500 1000 mg/L en un analizador de glucosa adecuado. [NOTALas
Soluciones de ferrocianuro de potasio son estndares apropiados nicamente para analizadores de glucosa que miden actividad de glucosa oxidasa. El procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas.] Preparar una curva estndar usando las Soluciones de referencia segn se indica en Preparaciones estndar. La raz cuadrada del error cuadrtico medio residual, a partir de la regresin, dividida por el promedio de la respuesta multiplicada por 100% (desviacin estndar relativa porcentual [%RSD] de la lnea) debe ser no ms de 2,0%. Asimismo, la respuesta de la Solucin de
ferrocianuro de potasio debe ser no ms de 30 mg/L y la desviacin estndar relativa debe ser no ms de 2,0% en los
anlisis repetidos de la Solucin de referencia media.
Procedimiento: Dispensar 5 mL de Preparacin de Hepatocitos en los Matraces para incubacin en secuencia desde la concentracin ms alta de glucagn hasta la concentracin ms baja de glucagn, alternando las Preparaciones estndar con
las Preparaciones de valoracin. Agitar los matraces por rotacin suave en un bao de agua giratorio a 125 rpm a una temperatura de 3035 durante aproximadamente 30 minutos. Despus de la incubacin, extraer alcuotas de 1,0 mL de
Captulos
216 123 Pruebas de Identidad Biolgica de Glucagn / Pruebas Biolgicas
USP 38
cada Matraz para incubacin, transferir a tubos de microcentrfuga rotulados y centrifugar a 13 000 rpm durante 15 segundos. Colocar cada fraccin sobrenadante en un tubo de muestreo rotulado para analizador de glucosa y determinar la
concentracin de glucosa (mg/L) de cada una de las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin. Medir la lectura
de fondo de las Soluciones de control negativo 1 y 2, y calcular el promedio de las dos respuestas.
Para cumplir con el intervalo lineal del instrumento que se est usando, puede ser necesario que los analistas ajusten cada
una de las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin mediante dilucin. Se debe usar un analizador de glucosa
que haya demostrado una especificidad, exactitud, precisin y respuesta lineal apropiadas para el intervalo de las concentraciones que se estn determinando. Determinar el incremento en la concentracin de glucosa para cada una de las
Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin en comparacin con el valor promedio de la Solucin de control negativo.
Clculos
Calcular la potencia relativa de las muestras de Glucagn usando mtodos estadsticos para valoraciones de lneas paralelas,
comparando la curva del Estndar de Referencia (a partir de las Preparaciones estndar) con la curva de la muestra de Glucagn (a partir de las Preparaciones de valoracin). No puede presentarse ninguna inversin de dosisrespuesta dentro de
una corrida para las Preparaciones estndar y Preparaciones de valoracin de 25; 50 100 mU/mL. [NOTASe puede excluir
el nivel bajo o alto de dosis, pero no ambos, del clculo para cumplir con los requisitos de linealidad.] Debido a que se
requiere un mnimo de dos valoraciones vlidas (ratas), las potencias estimadas se combinan usando los procedimientos
del captulo general Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111, Combinacin de Valoraciones Independientes; asimismo, se calcula la amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo estimado de la potencia relativa. Los
resultados son vlidos si L es no ms de 0,1938. Si L es >0,1938, se pueden realizar valoraciones adicionales y combinarlas
hasta obtener un trmino L vlido, y posteriormente se calcula la potencia relativa a partir de todas las corridas independientes vlidas. Calcular la potencia de las muestras de Glucagn en Unidades USP de rGlucagn/mg, multiplicando el
resultado de la potencia relativa por la potencia del ER rGlucagn USP. Cumple con el requisito de identidad biolgica si
la potencia es no menos de 0,80 Unidades USP de rGlucagn/mg.
ER Dextrosa USP
ER rGlucagn USP
124 VALORACIONES BIOLGICAS DE ERITROPOYETINA

INTRODUCCIN
Este captulo provee pautas sobre el uso de valoraciones biolgicas para medir la actividad biolgica de eritropoyetina (EPO,
por sus siglas en ingls). Basndose en uno de los enfoques de potencia relativa descritos en el captulo general Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032, la actividad biolgica de una preparacin de EPO desconocida por lo general se determina mediante comparacin con la actividad biolgica de un Estndar de Referencia (ER). Para este propsito, se ha desarrollado un ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP. Las valoraciones descritas en el captulo no son aplicables a formas
de EPO modificadas por ingeniera para prolongar su vida media.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP se ha calibrado contra el Estndar Internacional para EPO de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) usando el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico y el mtodo de valoracin biolgica con ratn policitmico exhipxico. Por consiguiente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP tiene
una medida en unidades asignada en trminos de Unidades Internacionales (IU) de EPO conforme a lo definido por la OMS.
De estas dos valoraciones biolgicas in vivo, el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico es menos complicado y se usa ampliamente para la determinacin de la potencia de EPO. La valoracin se basa en la medicin de la maduracin
de los reticulocitos estimulados por EPO. Debido a que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP se ha calibrado
contra el Estndar Internacional para EPO de la OMS mediante una valoracin biolgica in vivo, se puede usar directamente en
el mtodo de valoracin biolgica con ratn normocitmico para la calibracin de cualquier preparacin de EPO especfica del
proceso.
Sin embargo, si la intencin es usar una valoracin biolgica in vitro validada para transferir la medida en unidades del ER
Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP a una preparacin de EPO especfica del proceso, entonces es necesario demostrar que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP y la preparacin de EPO especfica del proceso presentan
una relacin equivalente entre la potencia in vitro e in vivo. Esto se debe a que la actividad biolgica de la EPO presenta una
relacin compleja entre la estructura y la funcin. En particular, la relacin entre la actividad in vitro e in vivo est inversamente
correlacionada con el tipo y el grado de sialilacin terminal. Los productos que presentan una alta sialilacin tienen un mayor
nivel de actividad in vivo; por ende, tienen una relacin entre actividad in vitro e in vivo relativamente ms baja. Debido a las
diferencias en los procesos de fabricacin usados en la preparacin de EPO, el tipo y el grado de sialilacin terminal puede
USP 38
Pruebas Biolgicas / 124 Valoraciones Biolgicas de Eritropoyetina 217
variar entre preparaciones de EPO, incluyendo las preparaciones de EPO que se usan como Estndares de Referencia. Como
resultado, el uso de una valoracin in vitro para medir la actividad biolgica de una preparacin de EPO requiere conocer muy
bien la relacin entre la actividad in vivo e in vitro de la EPO. La mejor manera de lograr dicho conocimiento es comparar la
preparacin de prueba de EPO con el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP en la valoracin in vivo y en una valoracin in vitro especfica.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP tiene asignada una medida en unidades que representa su actividad en
valoraciones in vivo e in vitro. Si las relaciones entre la potencia in vitro e in vivo para el material que se est analizando y el ER
Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP son equivalentes, entonces se puede usar el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP directamente en la valoracin in vitro para calibrar el material que se est analizando. No obstante, si las
relaciones no son equivalentes, el material que se est analizando y el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP tendrn una relacin de potencia in vitro e in vivo diferente. Por este motivo el estndar no podr usarse con su potencia designada en la valoracin in vitro. En su lugar, se debe usar esta relacin determinada para el material que se est analizando para
asignar al ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP una medida en unidades especfica para el proceso de valoracin
in vitro. Posteriormente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP, con sus unidades ajustadas para valoracin in
vitro, se podr usar en la valoracin in vitro para transferir la medida en unidades del ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP al material que se est analizando.
VALORACIN CON RATN NORMOCITMICO
ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP
Captulos
Soluciones
Solucin A: Disolver 10,75 g de fosfato dibsico de sodio dodecahidrato, 7,6 g de cloruro de sodio y 10 g de albmina bovina en 1000 mL de agua. Inmediatamente antes de su uso, ajustar con solucin de hidrxido de sodio o de cido fosfrico a un
pH de 7,2.
Solucin estndar 1: Disolver ER Eritropoyetina para Valoraciones Biolgicas USP en Solucin A hasta una concentracin de
80 UI/mL.
Solucin estndar 2: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin estndar 1.
Solucin estndar 3: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin estndar 2.
Solucin muestra 1: Preparar la muestra a analizar en Solucin A a una concentracin de 80 UI/mL.
Solucin muestra 2: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin muestra 1.
Solucin muestra 3: Mezclar volmenes iguales de Solucin A y Solucin muestra 2.
Las concentraciones exactas de cada Solucin estndar y Solucin muestra pueden requerir ajustes basndose en el intervalo
de respuesta en los animales usados.
Preparacin de los animales: Al inicio del procedimiento de valoracin, distribuir de forma aleatoria en seis jaulas ratones de
edad y cepa adecuadas (los ratones B6D2F1 de 8 semanas de vida son adecuados). Se recomienda un mnimo de ocho ratones
por jaula. Inyectar cada animal por va subcutnea con 0,5 mL del tratamiento apropiado (una solucin por jaula) y colocar al
animal en una nueva jaula. Combinar los ratones de tal manera que cada jaula aloje un ratn representativo de cada uno de
los seis tratamientos diferentes (cada una de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestras; seis ratones por jaula).
Anlisis: Cuatro das despus de las inyecciones, recolectar muestras de sangre de los animales y determinar el nmero de
reticulocitos usando un procedimiento adecuado. Se puede emplear el siguiente mtodo.
Puede ser necesario modificar el volumen de sangre, el procedimiento de dilucin y el reactivo fluorescente para asegurar el
mximo desarrollo y estabilidad de la fluorescencia.
Para solucin colorante concentrada, usar una solucin de anaranjado de tiazol adecuada para la determinacin de reticulocitos. Preparar a una concentracin que sea el doble de la necesaria para el anlisis.
Proceder con los siguientes pasos de dilucin. Diluir sangre entera 500 veces en la solucin amortiguadora usada para preparar la solucin colorante. Diluir esta solucin a la mitad en la solucin colorante concentrada. Despus de teir durante 310
minutos, determinar el recuento de reticulocitos por microfluorometra en un citmetro de flujo. El porcentaje de reticulocitos
se determina usando un histograma biparamtrico: nmero de clulas/fluorescencia roja (620 nm).
Calcular la potencia usando mtodos estadsticos convencionales para valoracin de lneas paralelas. Para informacin adicional, consultar el captulo general Anlisis de Valoraciones Biolgicas 1034.
Criterios de aceptacin: La actividad de cada Solucin muestra se compara con la del ER Eritropoyetina para Valoraciones
Biolgicas USP y se expresa en UI. Los lmites de confianza de la potencia estimada (P = 0,95) son no menos de 64% y no ms
de 156% de la potencia, segn se determin mediante el mtodo provisto anteriormente. La potencia estimada es no menos
de 80% y no ms de 125% de la potencia declarada.
218 126 Pruebas de Identidad / Pruebas Biolgicas
USP 38
126 PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLGICA DE SOMATROPINA
Captulos
La Somatropina es una hormona proteica que contiene la misma secuencia de aminocidos que la hormona de crecimiento
humana producida por la glndula pituitaria. Se usa un procedimiento cromatogrfico fisicoqumico, robusto y preciso en la
Valoracin para asignar potencia en trminos de masa. Ya que la determinacin de la identidad biolgica sigue siendo necesaria, se presentan a continuacin dos procedimientos diferentes: un procedimiento de valoracin biolgica in vivo basado
en el aumento de peso corporal en ratas inducido por somatropina y un enfoque ms preciso basado en una lnea celular de
rata que mide la produccin de ATP como un indicador directo del crecimiento celular. [NOTALa prueba de identidad biolgica de somatropina puede realizarse en el frmaco a granel o en el producto farmacutico.]
PROCEDIMIENTO
PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLGICA IN VIVO
Solucin amortiguadora: Bicarbonato de amonio 0,1 M. Ajustar con hidrxido de sodio a un pH de 8,0.
Soluciones estndar: 10100 mg/mL de ER Somatropina USP en Solucin amortiguadora
Soluciones muestra: 10100 mg/mL de Somatropina en Solucin amortiguadora. [NOTANo agitar mientras se mezcla;
agitar por rotacin suave.]
Control: Solucin amortiguadora
Animales de prueba: Seleccionar un nmero apropiado de ratas Sprague Dawley que sean slo machos o slo hembras y
que hayan sido hipofisectomizadas a los 2530 das de vida. Despus de la hipofisectoma, alimentar las ratas con alimento
para ratas y solucin de dextrosa al 5% en agua durante al menos 72 horas. Despus de 72 horas, alimentar las ratas con
alimento para ratas y agua filtrada y desionizada ajustada con cido clorhdrico 1 N a un pH de 3,0 0,25. Pesar las ratas
cuando tengan 3744 das de vida y conservar nicamente las que estn sanas. Volver a pesar las ratas escogidas 7 das
despus y utilizar slo aquellas que estn sanas y cuyo peso no haya aumentado o disminuido ms del 10% durante los 7
das anteriores.
Anlisis: Dividir aleatoriamente las ratas en grupos de control, grupos estndar y grupos de prueba, cada grupo debe contener aproximadamente 10 ratas. Cada da durante 10 das, inyectar por va subcutnea 0,1 mL de Control, Soluciones estndar y Soluciones muestra a los grupos de control, estndar y de prueba, respectivamente. Registrar el peso corporal de
cada animal al inico de la prueba y aproximadamente 18 horas despus de la 10a inyeccin.
Clculos: Determinar el cambio en el peso corporal de cada rata durante los 10 das y calcular la potencia de la Solucin
muestra con respecto a la de la Solucin estndar usando un anlisis estadstico apropiado. Calcular la potencia media en
Unidades USP de Somatropina/mg y, usando mtodos estadsticos apropiados, calcular la amplitud, L, de un intervalo de
confianza de 95% para el logaritmo en base 10 estimado de la potencia relativa. Si L es ms de 0,40, repetir la prueba
hasta que los resultados de dos o ms pruebas, combinados por mtodos estadsticos apropiados, produzcan un valor L de
no ms de 0,40, correspondiente a lmites de confianza del 63%158% de la potencia calculada.
Criterios de aceptacin: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg, cuando L es no ms de 0,40.
PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLGICA IN VITRO BASADA EN CLULAS
Medio A: Medio de Fischer1 que contenga suero fetal bovino al 10% inactivado por calor2, suero de caballo al 10% inactivado por calor3, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Esterilizar por filtracin. [NOTAAlmacenar durante un mximo de 2 semanas a 28.]
Medio B: Medio de Fischer que contenga suero de caballo al 1%, bicarbonato de sodio al 1% y 2-mercaptoetanol 0,05
mM. Esterilizar por filtracin. [NOTAAlmacenar durante un mximo de 2 semanas a 28.]
Solucin salina amortiguada con fosfatos:4 Solucin salina amortiguada con fosfatos exenta de calcio y magnesio que
contenga fosfato monobsico de potasio 1,5 mM, cloruro de sodio 155 mM y fosfato dibsico de sodio 3 mM, de pH 7,2
7,4.
Preparacin del cultivo celular: Preparar cultivos de clulas Nb2-115 en suspensin en Medio A en una incubadora humidificada a 37 que contenga dixido de carbono al 5%. Las clulas deben someterse a pasajes dos veces por semana y
volver a sembrarse en Medio A con una densidad de 1 105 clulas/mL durante 2 das, 2 104 clulas/mL durante 3 das y
1 104 clulas/mL durante 4 das. [NOTAPuede ser necesario adaptar las densidades de siembra cuando los analistas califiquen lotes nuevos de suero fetal bovino y suero de caballo.] En el da de la valoracin, recolectar las clulas de los matraces y centrifugarlas durante 7 minutos a aproximadamente 218 g para formar un pellet. Desechar el sobrenadante y lavar
las clulas dos veces con Solucin salina amortiguada con fosfatos, y luego centrifugar. Resuspender las clulas en Medio B,
contarlas y ajustar la concentracin de clulas a 1 105 clulas/mL con Medio B. A exepcin de los pocillos de la primera
columna, transferir 50 mL de suspensin de clulas a cada pocillo de una placa negra para cultivo de tejidos de 96 pocillos
con fondo transparente.6 Pipetear y transferir 50 mL de Medio B a cada pocillo de la primera columna de la placa. [NOTA
Cubrir la placa e incubar a 37 durante un mximo de 1 hora mientras se preparan las Soluciones estndar y las Soluciones
de prueba.]
1
2
3
4
5
6
Quality Biological, N de catlogo 112-032-101 o equivalente.

Gibco, N de catlogo 10082-147 o equivalente.
Gibco, N de catlogo 26050-088 o equivalente.
Amimed, N de catlogo 8-05F29I; Gibco, N de catlogo 20012-019 o equivalente.
HPA Culture Collections o Sigma-Aldrich HPA Culture Collection N de catlogo #97041101 o equivalente.
Costar, N de catlogo 3904 o equivalente.
Pruebas Biolgicas / 126 Pruebas de Identidad 219
USP 38
Tabla 1. Representacon Esquemtica de la Placa de Valoracin Final

1
10
11
12
BL
A,#1
St,#1
B,#1
A,#1
St,#1
B,#1
A,#1
St,#1
B,#1
NEG
POS
BL
A,#2
St,#2
B,#2
A,#2
St,#2
B,#2
A,#2
St,#2
B,#2
NEG
POS
BL
A,#3
St,#3
B,#3
A,#3
St,#3
B,#3
A,#3
St,#3
B,#3
NEG
POS
BL
A,#4
St,#4
B,#4
A,#4
St,#4
B,#4
A,#4
St,#4
B,#4
NEG
POS
BL
A,#5
St,#5
B,#5
A,#5
St,#5
B,#5
A,#5
St,#5
B,#5
NEG
POS
BL
A,#6
St,#6
B,#6
A,#6
St,#6
B,#6
A,#6
St,#6
B,#6
NEG
POS
BL
A,#7
St,#7
B,#7
A,#7
St,#7
B,#7
A,#7
St,#7
B,#7
NEG
POS
BL
A,#8
St,#8
B,#8
A,#8
St,#8
B,#8
A,#8
St,#8
B,#8
NEG
POS
LEYENDA:
BL = Blanco: sin somatropina, sin clulas.
A = Serie de diluciones de la Solucin de prueba A (Concentracin inicial de 1,0 ng/mL).
St = Serie de diluciones de la Solucin estndar (Concentracin inicial de 1,0 ng/mL).
B = Serie de diluciones de la Solucin de prueba B (Concentracin inicial de 1,0 ng/mL).
NEG = Control negativo: sin somatropina, con clulas.
POS = Solucin de control positivo: concentracin mxima de somatropina (10 ng/mL).
Clculos: Debe usarse un mnimo de dos preparaciones de Solucin de prueba independientes para cada muestra de prueba. Las Soluciones de prueba y las Soluciones estndar se normalizan por el contenido proteico antes de calcular la potencia
7
8
Placa Greiner N 650 160 o equivalente.

CellTiterGlo Luminescence Kit, p.ej., Promega N G7573 o equivalente.
Captulos
Soluciones estndar: Reconstituir ER Somatropina USP en 1 mL de Solucin salina amortiguada con fosfatos y luego diluir
adicionalmente este material con Medio B hasta una concentracin de 2,0 ng/mL. [NOTAUsar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere aproximadamente 1 mL de esta solucin para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volmenes menores de 40 mL.]
Soluciones de prueba: Deben obtenerse dos resultados por cada solucin de prueba usando dos preparaciones de somatropina independientes. Reconstitutir dos preparaciones de somatropina independientes en Agua para Inyeccin hasta una
concentracin de 5 mg/mL. Preparar las soluciones de prueba diluyendo adicionalmente este material con Medio B hasta
una concentracin de 2,0 ng/mL. [NOTAUsar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere
aproximadamente 1 mL de esta solucin para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volmenes menores de 40 mL.] Una preparacin es la Solucin de prueba A y la otra es la Solucin de prueba B.
Solucin de control positivo: Comenzando con una concentracin madre de 5 mg/mL de ER Somatropina USP reconstituida en Agua para Inyeccin, diluir con Medio B hasta una concentracin de 20 ng/mL. [NOTAUsar tubos de ensayo de
polipropileno para realizar las diluciones. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volmenes
menores de 40 mL.]
Procedimiento: Dispensar 100 mL de Medio B en cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de fondo redondo,7
a exepcin de los pocillos de la columna 12 (pocillos A12H12 = control positivo) y los pocillos A2A10. [NOTAPor cada
placa negra de cultivo de tejidos sembrada con clulas segn se describe en Preparacin del cultivo celular, se usa una placa
con pocillos de fondo redondo diferente para preparar las diluciones de la Solucin estndar y la Solucin de prueba.] Luego,
dispensar 200 mL de Solucin estndar de 2,0 ng/mL en los pocillos A3, A6 y A9 de la placa de dilucin. Dispensar 200 mL
de Solucin de prueba A de 2,0 ng/mL en los pocillos A2, A5 y A8 de la placa de dilucin. Dispensar 200 mL de Solucin de
prueba B de 2,0 ng/mL en los pocillos A4, A7 y A10 de la placa de dilucin. Dispensar 100 mL de Solucin de control positivo
de 20 ng/mL en la ltima columna de la placa de dilucin (pocillos A12H12). Usando una pipeta de 12 canales, realizar
en la placa diluciones en serie al medio, aspirando 100 mL de la primera hilera (A2A10), transferir a la segunda hilera y
mezclar tres veces. Luego, aspirar 100 mL de la segunda hilera, transferir a la tercera y mezclar tres veces, etc. Repetir este
procedimineto a lo largo de toda la placa hasta la hilera H. Desechar los 100 mL aspirados de la ltima hilera. [NOTALos
pocillos de la columna 11 (pocillos A11H11) son controles negativos que contienen 100 mL de Medio B; los pocillos de la
columna 1 (pocillos A1H1) son blancos.]
Comenzando con la concentracin ms baja y usando una pipeta de 12 canales, transferir 50 mL de cada solucin en la
placa de dilucin al pocillo respectivo de la placa negra de cultivo que contiene las clulas. [NOTADurante la transferencia, sumergir las puntas de la pipeta en la suspensin celular. Esta transferencia produce una dilucin adicional 1:2 de
somatropina, o una concentracin final de 1,0 ng/mL para la dosis ms alta agregada a las clulas y 10 ng/mL para la
Solucin de control positivo. La Tabla 1 muestra el diagrama (layout) de la placa.] Despus de realizar todas las transferencias, agitar suavemente la placa negra durante 30 segundos y luego incubarla en una incubadora humidificada a 37 que
contenga dixido de carbono al 5% durante 30 2 horas. Luego, agregar 100 mL de solucin reconstituida de sustrato
luminiscente8 a todos los pocillos. Incubar las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan suavemente en un agitador para placas apropiado protegidas de la luz. Incubar las placas sin agitacin durante 15 minutos
adicionales a temperatura ambiente protegidas de la luz. Leer la luminiscencia de los pocillos de las placas en un lector de
placas adecuado con modo de deteccin de luminiscencia.
220 126 Pruebas de Identidad / Pruebas Biolgicas
USP 38
relativa. [NOTAUn mg de somatropina anhidra equivale a 3,0 Unidades USP de Somatropina.] Se omiten los valores aberrantes debidos a la tcnica (pero no ms de 4/curva) y luego se usa el mismo nmero de respuestas a la dosis de la Solucin estndar y la Solucin de prueba, incluyendo la respuesta al 50% (EC50) del estndar y la muestra dentro de este intervalo, para calcular la potencia relativa de cada muestra de somatropina usando mtodos estadsticos de anlisis de lneas
paralelas. Para cada Solucin de prueba individual comparada con la Solucin estndar, los resultados de las pruebas estadsticas de linealidad, pendiente y paralelismo deben pasar al nivel de 95%. El lmite de confianza de cada potencia relativa
calculada debe estar dentro del 75%133%. La potencia relativa de una Solucin de prueba debe estar dentro del intervalo
validado para la valoracin (potencia relativa de 50%200%) de las Soluciones estndar. El logaritmo de la potencia relativa
media no ponderada se calcula a partir de muestras individuales vlidas y posteriormente se calcula la potencia en Unidades USP/mg relativas a ER Somatropina USP.
Criterios de aptitud del sistema: La relacin seal-ruido entre la seal de quimioluminiscencia media de la Solucin de
control positivo y la seal de quimioluminiscencia media de los pocillos de control negativo debe ser no menos de 3. No se
pueden omitir ms de 4 valores aberrantes debidos a la tcnica por curva estndar. Debe rechazarse toda placa que no
cumpla con uno o ms de estos criterios y el procedimiento deber repetirse.
Criterios de aceptacin: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg
ER Somatropina USP
Captulos
130 ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LA PROTENA A

Introduccin
La Protena A se acopla a un soporte de resina con el fin de crear medios cromatogrficos de afinidad con la protena A,
usados comnmente en la fabricacin de anticuerpos monoclonales teraputicos recombinantes. La protena A natural se obtiene del Staphylococcus aureus y contiene cinco regiones homlogas de unin a anticuerpos y una regin C-terminal de unin
a la pared celular. Adems de la protena A de origen natural, existe en el mercado protena A recombinante producida en
Escherichia coli, as como varias versiones de la protena modificadas por ingeniera, tambin fabricadas en forma recombinante. Cuando se inmoviliza sobre una columna, la protena A proporciona un mtodo altamente eficiente y robusto para purificar
anticuerpos en diversas escalas. Sin embargo, la protena A inmovilizada en la columna (ligando de protena A) puede tambin
coeluir con el anticuerpo durante la purificacin, un efecto conocido a menudo como leaching de la protena A. Esta tendencia
aumenta a medida que envejece el medio cromatogrfico. Las versiones de la protena A modificadas por ingeniera podran
mejorar la tolerancia del medio al pH, pero no eliminan el leaching. La expectativa reglamentaria actual se centra en que la
protena A coeluida se elimine durante la purificacin de los anticuerpos para uso humano y los procesos de fabricacin se
validen de acuerdo con ello. Generalmente, durante el desarrollo y validacin del proceso se utiliza un Enzimoinmunoensayo
(ELISA) para asegurar la eliminacin eficiente de la protena A residual durante las etapas del proceso posteriores a la cromatografa de afinidad con la protena A. Adicionalmente, el fabricante deber poseer un claro conocimiento y documentacin sobre la calidad de la resina y el ligando, mediante la calificacin de las materias primas y estudios de vida til de la columna.
El Captulo General 130 describe los atributos de calidad de los ligandos de protena A que se usan en los medios cromatogrficos para la fabricacin de anticuerpos monoclonales teraputicos: Protena A; rProtena A; rProtena A, C-Cys; rProtena A,
B4, C-Cys.
Protena A
C1995H3163N597O697S3
46 760
Secuencia N-terminal AQHDEA
Secuencia C-terminal IAADNK
La Protena A se obtiene del Staphylococcus aureus. La estructura se compone de una nica cadena de polipptidos que contiene cuatro dominios de unin a IgG. Con excepcin de IgG3, todas las dems IgG humanas se unen a la protena A. Cada
molcula de Protena A es capaz de unirse a dos molculas de IgG. Se fabrica como una solucin a granel con una concentracin mayor de 20 mg de protena A por mL y una potencia de unin a IgG mayor de 95%. Dado que la Protena A se usa
como un material auxiliar en la fabricacin de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los
de productos farmacuticos teraputicos.
Envasado y almacenamientoAlmacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
EtiquetadoConservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de 20 o menor.
Estndares de Referencia USP 11ER Endotoxina USP. ER Protena A USP.
Pruebas Biolgicas / 130 Atributos de Calidad de la Protena A 221
USP 38
Identificacin
A: SDS-PAGECumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER Protena A USP.
B: Unin a IgGCumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER Protena A USP.
Pruebas de recuento microbiano 61 y Pruebas de microorganismos especficos 62El recuento total de microorganismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 10 ufc por mL.
Endotoxinas bacterianas 85No contiene ms de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de protena total. [NOTALa
prueba de Endotoxinas bacterianas para Protena A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas inyectables en las cuales se usa la
Protena A.]
Protena total (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851)Preparar muestras por triplicado para anlisis diluyendo
Protena A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de corregirla
usando Agua para Inyeccin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
Concentracin de protena (mg por mL) = (A275/0,149)
rPROTENA A, C-CYS
C1478H2320N432O503S4
34317,5 Da
Secuencia N-terminal AQHDEAQQNA
Se puede obtener un kit de enzimoinmunoensayo adecuado de TECRA International Pty Ltd., Australia (N SETVIA96).
Captulos
en donde A es la absorbancia de Protena A a la longitud de onda de 275 nm y 0,149 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es 5%.
Lmite de protena contaminante habitual y valoracin correspondiente
Enterotoxina BLa enterotoxina B se determina con un kit de enzimoinmunoensayo en microplaca disponible comercialmente.1 Los pocillos de las microplacas estn recubiertos con anticuerpos de oveja anti enterotoxina B. Las curvas estndar se
realizan utilizando el kit control de ELISA. Los controles negativos son pocillos recubiertos con suero de oveja no inmunizada. El
nivel de enterotoxina se determina a partir de la curva estndar. La especificacin para el nivel de la enterotoxina B es 1 ng
por mg de protena total.
Pureza cromatogrfica[NOTALa prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la Protena A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase mvilPreparar una solucin de fosfato dicido de sodio 50 mM de pH 6,5 de la siguiente manera. Agregar 6,9 0,1
g de fosfato dicido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de
sodio 5 M a un pH de 6,50 0,05. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir con agua a volumen.
Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,22 mm.
Solucin regeneradora de columnaPreparar una solucin de fosfato dicido de sodio 0,1 M de pH 3,0 de la siguiente manera. Agregar 13,8 0,1 g de fosfato dicido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua hasta obtener 900
mL y ajustar con cido clorhdrico a un pH de 3,0 0,1. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a
volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,22 mm.
Solucin de almacenamiento de la columnaMezclar 100 mL de metanol con 900 mL de agua.
Solucin de pruebaDiluir Protena A hasta aproximadamente 1 mg por mL con Fase mvil.
Estndares de calibracinUsando Fase mvil, preparar por separado soluciones de 1 mg por mL de cada una de las siguientes protenas: tiroglobulina (670 kD), IgG (150 kD), beta lactoglobulina (36 kD) y lisozima (14 kD).
Solucin estndarPreparar una solucin que contenga 1 mg por mL de ER Protena A USP en Fase mvil.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 280 nm y una
columna de 7,8 mm 30 cm rellena con material L33. Equilibrar la columna durante aproximadamente 30 minutos a 0,5 mL
de Fase mvil por minuto o hasta que se consiga una lnea base estable.
ProcedimientoInyectar por separado 100 mL de cada muestra y correrlas en la siguiente secuencia: Estndares de calibracin, tiroglobulina, IgG, beta lactoglobulina y lisozima; la Solucin estndar; y la Solucin de prueba. Correr la secuencia tres
veces isocrticamente usando Fase mvil a 0,5 mL por minuto durante 30 minutos. La absorbancia se detecta a 280 nm. Analizar los datos de los picos a 280 nm y seleccionar el tiempo de retencin (TR) con el rea de pico ms grande. Usando los datos
de los Estndares de calibracin, graficar la media del TR en funcin del logaritmo del peso molecular para obtener la curva
estndar. La pureza debe ser 95% en el pico principal. Utilizar la frmula de la curva estndar para obtener los logaritmos de
los pesos moleculares de las Soluciones de prueba. Convertir los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba
y de las Soluciones estndar a pesos moleculares reales. El peso molecular aparente de la protena A a partir de la Solucin estndar est entre 156 y 205 kDa; y el de la Protena A a partir de la Solucin de prueba est dentro del mismo intervalo.
Limpieza y almacenamiento de la columnaEnjuagar la columna con 100 mL de Solucin regeneradora de columna y almacenar lavando con 100 mL de Solucin de almacenamiento de la columna.
Captulos
222 130 Atributos de Calidad de la Protena A / Pruebas Biolgicas
USP 38
La rProtena A, C-Cys es una Protena A recombinante que carece de la parte C-terminal de unin a la membrana; en cambio, se le ha introducido una cistena C-terminal para permitir una inmovilizacin dirigida. Tiene cinco dominios homlogos de
unin a IgG idnticos a los de la Protena A nativa y se produce usando Escherichia coli como clula anfitriona, seguido de purificacin por cromatografa convencional. La rProtena A, C-Cys se fabrica como una solucin a granel con una potencia de
unin a IgG mayor de 95%. Dado que la rProtena A, C-Cys se usa como material auxiliar en la fabricacin de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
Estndares de Referencia USP 11ER Endotoxina USP. ER rProtena A, C-Cys USP.
Identificacin
A: SDS-PAGECumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, C-Cys USP.
B: Unin a IgGCumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, C-Cys USP.
de 10 ufc por mL.
prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba
no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas inyectables en las cuales
se usa la rProtena A, C-Cys.]
rProtena A, C-Cys hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de
corregirla usando Agua para Inyeccin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
en donde A es la absorbancia de rProtena A, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar. Promediar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es 2,5%.
Pureza cromatogrfica[NOTALa prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A,
C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase mvilPreparar una solucin de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio 0,15 M, de la siguiente manera. Agregar 0,96 0,02 g de fosfato monobsico de sodio hidrato, 2,32 0,02 g de fosfato dibsico de sodio
dihidrato y 8,76 g 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 0,05. Transferir esta solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm.
Solucin de EDTAPreparar una solucin de cido etilendiaminotetractico (EDTA) 20 mM, disolviendo 0,74 0,02 g de
EDTA en 100 mL de Fase mvil.
Solucin de DTTPreparar una solucin de DL-ditiotreitol (DTT) 100 mM, disolviendo 1,54 0,02 g de DTT en 100 mL de
Fase mvil.
Solucin de pretratamientoPreparar una solucin que contenga una mezcla de Solucin de EDTA y Solucin de DTT (1:1,
v/v). [NOTAPreparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de pruebaDiluir rProtena A, C-Cys 1 a 5 en Solucin de pretratamiento, y mezclar suavemente. Incubar la muestra
a 40 durante 60 minutos.
columna de 10 mm 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volmenes de columna de
Fase mvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
ProcedimientoInyectar 100 mL de Solucin de pretratamiento y dejar que la cromatografa contine durante por lo menos
dos volmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 mL de la Solucin de prueba. La absorbancia se detecta a
214 nm. Integrar el pico principal de la corrida a partir de la Solucin de prueba y todos los dems picos que no estn presentes
en las corridas de la Solucin de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porcin de la rProtena A, C-Cys tomada, por la frmula:
100(ri/rs)
en donde ri es la respuesta del pico de cada impureza; y rs es la suma de las respuestas de todos los picos: la suma de todas las
impurezas no es ms de 5%; y la Solucin de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 35 minutos.
rPROTENA A
C1917H3039N565O658S3
46 618
Secuencia N-terminal FLRPVE
La Protena A es un componente de la pared celular del Staphylococcus aureus. La Protena A recombinante (rProtena A)
consta de cinco dominios homlogos de unin (E, D, A, B, C) a la inmunoglobulina (IgG) seguidos de una secuencia parcial
USP 38
Tabla 1
Calle
2
3
4
Muestra
Volumen
de Carga
(mL)
Cantidad
de Carga
(mg)
Solucin amortiguadora de la muestra 1X
10
N/D
MWM
20
N/D
Preparacin de prueba #1
10
Solucin combinada #1
10
4 (total)
La Solucin amortiguadora de la muestra 4X NuPAGE LDS se puede obtener de Invitogen (N NP0007).

La Solucin Amortiguadora de Corrida 20X NuPAGE MOPS SDS se puede obtener de Invitrogen (N NP0001).
El gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10% se puede obtener de Invitrogen (N NP0301).
Captulos
del dominio X. Se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de un proceso de cromatografa en columna. Las columnas de IgG no se usan en el proceso de purificacin. Se fabrica como una solucin a granel con una potencia de unin a IgG
mayor de 95%. Los mtodos de pruebas para su liberacin y las especificaciones se describen a continuacin. Dado que la
rProtena A se usa como un material auxiliar en la fabricacin de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
EtiquetadoEl etiquetado indica que el material proviene de ADN recombinante, as como el nmero de lote, las condiciones de almacenamiento y la leyenda Formulado en Agua para Inyeccin.
Estndares de Referencia USP 11ER Endotoxina USP. ER rProtena A USP.
Identificacin
A: SDS-PAGE
Marcador de peso molecularUsar un marcador de peso molecular (MWM, por sus siglas en ingls) apropiado, que contenga bandas de protenas entre 20 y 200 kD.
Solucin de PBSPreparar una solucin que contenga 8065,0 mg de cloruro de sodio y 200,0 mg de cloruro de potasio por
L de solucin amortiguadora de fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4.
Solucin amortiguadora de la muestra 4X2 Disolver 0,666 g de tris-clorhdrico, 0,682 g de tris base, 0,800 g de dodecil
sulfato de litio (LDS, por sus siglas en ingls), 0,006 g de cido etilendinitrilotetractico (EDTA) y 4 g de glicerol en 8 mL de
agua; agregar 0,75 mL de solucin de azul brillante de Coomassie G-250 al 1% (ver Azul de Coomassie G-250 en Reactivos en
Reactivos, Indicadores y Soluciones) y 0,25 mL de solucin de rojo de fenol al 1%. Mezclar bien y ajustar el volumen con agua a
10 mL.
Solucin amortiguadora de la muestra 2XPreparar una mezcla de Solucin amortiguadora de la muestra 4X y agua (1:1).
Solucin amortiguadora de la muestra 1XPreparar una mezcla de Solucin amortiguadora de la muestra 2X y agua (1:1).
Solucin de ditiotreitol 1 MDisolver 0,154 g de DL-ditiotreitol (DTT) en 1 mL de agua.
Solucin amortiguadora reductora de la muestra 2XMezclar 180 mL de Solucin amortiguadora de la muestra 2X y 20 mL de
Solucin de ditiotreitol 1 M.
Solucin amortiguadora de corrida 20X3Disolver 104,6 g de cido 3-(N-morfolino)propanosulfnico (MOPS, por sus siglas
en ingls), 60,6 g de tris base, 10 g de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en ingls) y 3,0 g de EDTA en 400 mL de
agua. Mezclar bien y ajustar con agua hasta 500 mL.
Solucin amortiguadora de corrida 1XPreparar una solucin de agua y Solucin amortiguadora de corrida 20X (19:1).
Solucin de tincin del gelPreparar una solucin de azul brillante de Coomassie R-250 (ver Azul Brillante de Coomassie
R-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) que contenga una concentracin de 0,5 g por L en una mezcla de
agua, isopropanol y cido actico (6,5:2,5:1,0). Filtrar y almacenar a temperatura ambiente. No se recomienda la tincin con
plata.
Solucin decoloranteMezclar 100 mL de cido actico con 900 mL de agua.
Preparacin estndarDiluir ER rProtena A USP hasta 0,4 mg por mL con Solucin de PBS. Diluir adicionalmente esta solucin 1:1 con Solucin amortiguadora reductora de la muestra 2X e incubar en un tubo cerrado durante 5 minutos a 90. Mezclar
y centrifugar brevemente (quick spin) antes de cargar.
Preparacin de pruebaDiluir rProtena A con Solucin de PBS hasta 0,4 mg por mL. Proceder segn se indica en Preparacin
estndar, comenzando donde dice Diluir adicionalmente.
Solucin combinadaDiluir rProtena A y ER rProtena A USP con Solucin de PBS hasta 0,8 mg por mL. Esta solucin contiene 0,4 mg por mL de cada protena. Proceder segn se indica en Preparacin estndar, comenzando donde dice Diluir adicionalmente.
Montaje del aparato y gel de SDS-PAGEMontar el aparato para el gel segn las instrucciones del fabricante. Asegurar en su
lugar la cua de presin del gel y llenar la cmara interna con aproximadamente 200 mL de Solucin amortiguadora de corrida
1X. Si no se verifican prdidas de lquido, verter 600 mL de Solucin amortiguadora de corrida 1X en la cmara externa. Sacar
cuidadosamente el peine del gel para sumergir los pocillos (wells) en la Solucin amortiguadora de corrida 1X. Cargar 10 mL de
cada preparacin segn se indica a continuacin en Carga del gel en un gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10%.4
Carga del gelUsar el siguiente esquema de carga del gel al correr una Preparacin de prueba (ver la Tabla 1). Cada Preparacin de prueba se corre sola y como parte de la Solucin combinada que contiene la rProtena A y la ER rProtena A USP.
USP 38
Captulos
Calle
Volumen
de Carga
(mL)
Muestra
Cantidad
de Carga
(mg)
Preparacin de prueba #1
10
Solucin amortiguadora de la muestra 1X
10
N/D
Preparacin estndar
10
MWM
20
N/D
10
Corrida del gelFijar el voltaje en 125 volts y correr a un voltaje constante. Correr los geles hasta que la banda de azul de
bromofenol quede aproximadamente a 5 mm del borde inferior del gel (aproximadamente de 120 a 140 minutos).
Tincin del gelVerter aproximadamente 100 mL de Solucin de tincin del gel dentro del recipiente de tincin. Colocar el
gel dentro del recipiente de tincin y dejar que la solucin colorante cubra el gel por completo. Calentar en un horno de microondas durante 30 segundos. Colocar el recipiente de tincin en un agitador orbital y teir el gel durante 1 hora, agitando
suavemente.
DecoloracinEscurrir la Solucin de tincin del gel y agregar suficiente Solucin decolorante al recipiente hasta cubrir el gel.
Colocar el recipiente en un agitador orbital y agitar a baja velocidad. Cambiar la Solucin decolorante segn sea necesario hasta
obtener un fondo transparente. Despus de decolorar, enjuagar bien el gel con agua y dejarlo en agua durante 10 minutos
antes del escaneo.
Escaneo del gelColocar un poco de agua en la placa de vidrio del escner y colocar los geles sobre una placa de vidrio
humedecida. Eliminar las burbujas. Escanear los geles realizando los ajustes apropiados.
Anlisis de los datosEscoger una banda entre las bandas de 20 kD y 30 kD del MWM para calcular el porcentaje del factor
de retencin. Trazar una lnea en una calle (la calle que contiene la Solucin amortiguadora de muestra 1X) desde el pocillo
hasta el pice (regin de mayor intensidad) de la banda escogida.
La longitud de esta lnea se designa como la distancia total (DT). En las calles que contienen muestras, trazar una lnea desde
el pocillo hasta el pice de cada banda. Para cada banda, la longitud de esta distancia es la distancia de migracin (DM) en
mm. Registrar la DT y la DM en la hoja de informe para cada pico o banda. La distancia total debe ser la misma para cada calle
en un gel. Calcular el porcentaje del factor de retencin (RF) de cada pico o banda principal y documentar en la hoja de informe, usando la siguiente ecuacin:
%RF = DM/DT 100
Tambin para cada gel, registrar el nmero de bandas y el peso molecular aproximado de cada banda en cada muestra.
Aptitud del sistemaTodas las bandas entre 20 kD y 70 kD estn presentes. La calle que contiene la Solucin amortiguadora
de la muestra 1X no contiene ninguna banda.
EspecificidadLa rProtena A tiene una banda principal y un peso molecular similar que corresponden a los de la ER rProtena A USP. La Solucin combinada presenta tambin una nica banda principal.
B: Unin a IgG[NOTAEl ensayo de unin a IgG es un mtodo funcional para determinar el porcentaje de rProtena A
capaz de unirse a inmunoglobulina policlonal humana inmovilizada. Dado que el porcentaje de rProtena A funcional en cada
lote no es menor de 95%, el ensayo mide la protena no unida en funcin de la protena total inyectada. Esto se realiza mediante la comparacin entre la absorbancia del flujo que atraviesa la columna y la absorbancia de una inyeccin desviada de la
misma.]
Pretratamiento de la muestra (desalinizacin)Con el fin de eliminar cualquier componente de la solucin amortiguadora
que pudiera contribuir a la absorbancia en la fraccin no unida a IgG en la columna, las muestras se desalinizan con Solucin
A. La desalinizacin se puede llevar a cabo usando una columna de desalinizacin adecuada5, dependiendo de los volmenes
requeridos.
Columna IgGPara este ensayo se requiere una columna Sepharose6 de 1 mL con IgG policlonal humana inmovilizada
(hIgG, por sus siglas en ingls). [NOTALa columna de IgG requiere lavado cuando es nueva, cuando se han efectuado varios
ciclos de anlisis o despus de una falla de la aptitud del sistema. No es necesario efectuar el procedimiento de lavado de la
columna para cada inyeccin de muestra.]
Solucin A para lavado de la columnaPreparar una solucin de cido actico 0,5 M de pH 3,4, agregando 28,6 mL de cido actico a un vaso de precipitados de 1000 mL, diluyendo a 900 mL con agua y ajustando a pH 3,4 con acetato de amonio.
Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro
de membrana de 0,45 mm.
Solucin B para lavado de la columnaPreparar una solucin de Tris 50 mM de pH 7,6; cloruro de sodio 150 mM y Tween
20 al 0,05% por el siguiente procedimiento. Agregar 6,06 0,01 g de Tris y 8,77 0,01 g de cloruro de sodio a un vaso de
precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de sodio 0,5 M a un pH de 7,60 0,05. Transferir
5
6
Las columnas Zeba se pueden obtener de Pierce; las columnas Nap-10 se pueden obtener de GE Healthcare.
La columna HiTrap IgG Sepharose 6 FF se puede obtener de GE Healthcare (N 90-1003-97).
USP 38
la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm (solucin amortiguadora). Agregar 0,5 mL de Tween 20 a 1 L de la solucin amortiguadora y mezclar bien.
Solucin APreparar una solucin de fosfato monobsico de sodio 20 mM y cloruro de sodio 150 mM de pH 7,6 por el
siguiente procedimiento. Agregar 2,76 0,01 g de fosfato monobsico de sodio hidrato y 8,77 0,01 g de cloruro de sodio a
un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de sodio 5 M a un pH de 7,60 0,05.
Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro
de membrana de 0,45 mm.
Solucin BPreparar una solucin de cido fosfrico 100 mM de pH 2,8 por el siguiente procedimiento. Agregar 6,8 mL de
cido fosfrico a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de potasio 2 M a un
pH de 2,80 0,05. Transferir la solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.
Fase mvilUsar mezclas variables de Solucin A y de Solucin B, segn se indica en el Sistema cromatogrfico. Hacer ajustes
si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografa 621).
Preparacin estndarDescongelar el ER rProtena A USP y usarlo directamente.
Preparacin de pruebaPreparar una solucin de 4,0 a 6,0 mg por mL de rProtena A en Solucin A.
Sistema cromatogrficoEquipar el cromatgrafo de lquidos con un detector a 280 nm y una columna de 1 mL con hIgG
inmovilizada. Equipar un cromatgrafo con una vlvula que permita desviar el flujo de la columna. Cada anlisis consta de una
serie de dos inyecciones, una donde la muestra se inyecta en la columna y otra donde la muestra se desva de la columna y
fluye directamente al detector. Efectuar tres anlisis repetidos. Programar el cromatgrafo (ver la Tabla 2) del siguiente modo.
Tabla 2
Velocidad de flujo
(mL por minuto)
Tiempo
(minutos)
Solucin A
(%)
Solucin B
(%)
Posicin de la
Vlvula
Elucin
06
100
columna
reequilibrio
1,0
612
1000
0100
columna
reequilibrio
1,0
1222
100
columna
equilibrio
0,4
2225
100
columna
equilibrio
0,4 (muestra
inyectada)
2535
100
columna
isocrtica
1,0
3549
1000
0100
columna
regeneracin
1,0
4963
0100
1000
columna
reequilibrio
6365
100
desvo
equilibrio
0,4
6568
100
desvo
equilibrio
0,4 (muestra
inyectada)
6875
100
desvo
isocrtica
Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin estndar, registrar el cromatograma y calcular el porcentaje de unin a hIgG segn
se indica en el Procedimiento: el porcentaje de unin a hIgG es 95% y la desviacin estndar relativa para el anlisis repetido
no es ms de 1%.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo un volumen (aproximadamente 100 mL) de la Preparacin de prueba. Registrar
el cromatograma y medir las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de actividad de unin a la hIgG, por la siguiente
frmula:
100 100(rC/rB)
en donde rC es la respuesta del pico del material no unido obtenido a partir de la inyeccin de la columna y rB es la respuesta
del pico obtenido a partir de la inyeccin desviada de la columna. La unin a hIgG no es menor de 95% en cada anlisis repetido de la Preparacin de prueba. Informar el valor promedio de los tres anlisis repetidos.
de 10 ufc por mL.
Endotoxinas bacterianas 85No contiene ms de 0,5 Unidades USP de Endotoxinas por mg de protena total. [NOTA
La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta prueba no
define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas inyectables en las cuales se
usa la rProtena A.]
rProtena A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyeccin. Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm despus de corregirla usando Agua para Inyeccin como blanco. Determinar la concentracin de protena con la siguiente ecuacin:
en donde A es la absorbancia de rProtena A a la longitud de onda de 275 nm y 0,165 es la absortividad molar. Promediar los
resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es 5%.
Captulos
1,0
Captulos
USP 38
Anlisis espectral UVDiluir rProtena A a 1 mg por mL en Agua para Inyeccin. Usar un espectrofotmetro de barrido UV
con Agua para Inyeccin como blanco, obtener los barridos espectrales en el intervalo de 240 a 360 nm. De los datos resultantes, calcular el valor de la absorbancia a 270 nm y el cociente de absorbancias a 270 y a 250 nm (es decir, E270/E250): la
absorbancia a 270 nm de una solucin de 1 mg por mL de rProtena A en Agua para Inyeccin est dentro del intervalo 0,14
0,20.
Pureza cromatogrfica[NOTALa prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A
de los contaminantes de alto peso molecular.]
Fase mvilPreparar una solucin de fosfato de sodio 0,3 M de pH 7, mezclando soluciones de fosfato monobsico y dibsico de la siguiente manera. Pesar 21,3 0,1 g de fosfato dibsico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solucin de fosfato dibsico de sodio 0,3 M (Solucin 1). En otro recipiente, pesar 18,0 0,1 g de fosfato monobsico
de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solucin de fosfato monobsico de sodio 0,3 M (Solucin 2).
Calibrar un medidor de pH usando calibradores de pH 7 y 10. Agregar 400 mL de Solucin 1 a un vaso de precipitados de 1 L.
Transferir la sonda de pH al vaso de precipitados. Agregar lentamente la Solucin 2 hasta que el pH sea 7,0 0,1. Pasar la
solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm.
Solucin estndarDiluir ER rProtena A USP hasta 1 mg por mL en Fase mvil.
Solucin de pruebaDiluir rProtena A hasta 1 mg por mL en Fase mvil.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y a 280
nm, y una columna de 9,4 mm 25 cm rellena con material L35. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar
la Solucin estndar segn se indica en el Procedimiento: la rProtena A presenta un nico pico principal aproximadamente a los
9 minutos y el porcentaje de rea es 98% a 214 nm y 95% a 280 nm.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo 100 mL de la Solucin de prueba, correr isocrticamente durante 15 minutos y
registrar el cromatograma. Los valores para la rProtena A a partir de la Solucin de prueba corresponden a las especificaciones
del ER rProtena A USP a partir de la Solucin estndar.
Isoformas
Solucin estndarDescongelar ER rProtena A USP y usarlo directamente.
Solucin de pruebaDiluir rProtena A a 4 mg por mL en Agua para Inyeccin.
Marcadores de pIUsar un set de marcadores adecuado que contenga marcadores entre 3 y 10.7
Gel de IEF (isoelectroenfoque)Usar un gel adecuado con intervalo de pH 310 y un tamao de 100 x 125 mm.8
ProcedimientoAplicar alcuotas de 5 mL de los Marcadores de pI de la Solucin de prueba y de la Solucin estndar al gel de
IEF y correrlas a 1W de potencia durante aproximadamente 10 minutos. Retirar la mscara de aplicacin de la muestra y suministrar potencia, con enfriamiento simultneo entre 5 y 10 de la cmara de enfoque, durante 40 minutos a 1000V, 20 mA y
25W. Fijar el gel de IEF durante 1 hora en cido tricloroactico al 20%, luego teirlo con una tincin adecuada para geles de
IEF.9 Por ltimo, lavar y secar el gel: el coeficiente de correlacin para la lnea de mejor ajuste para los Marcadores de pI en
funcin de su migracin en cm es 0,990, y la rProtena A a partir de la Solucin estndar presenta una nica banda principal
dentro del intervalo de pI de 4,6 a 5,2. En la Solucin de prueba se observa una nica banda que corresponde al intervalo de pI
de la Solucin estndar.
Lmite de Triton X-100
Fase mvilPreparar una mezcla filtrada y desgasificada de agua y acetonitrilo (60:40).
Solucin de pruebaDiluir rProtena A a 5 mg por mL en Agua para Inyeccin.
Solucin de Triton X-100 con una cantidad conocida agregadaCombinar 5 mg por mL de ER rProtena A USP y Triton X-100
al 0,15% (9:1) para obtener una solucin con una concentracin conocida de rProtena A y Triton X-100 al 0,015%.
Sistema cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 214 nm y 280
nm y una columna de 4,6 mm 25 cm rellena con material L11 de 5 mm. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar la Solucin de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada segn se indica en el Procedimiento: el Triton X-100
tiene un nico pico principal aproximadamente a los 9 minutos y la rProtena A presenta un pico menor o indetectable con el
mismo tiempo de retencin.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 100 mL de la Solucin de prueba, correr isocrticamente durante 35 minutos y registrar el cromatograma. La absorbancia se detecta a 223 nm: el pico de Triton X-100 no es mayor de
0,015% (equivalente a la Solucin de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada).
rPROTENA A, B4, C-CYS

C1177H1854N326O384S1
26747,6 Da
Secuencia N-terminal AQGTVDAKFD
La rProtena A, B4, C-Cys es una protena recombinante derivada del dominio B de la Protena A. El dominio de la Protena A
ha sido estabilizado al lcali por mutagnesis sitio-especfica y multimerizado en un tetrmero con una cistena C-terminal para
permitir una inmovilizacin dirigida. La rProtena A, B4, C-Cys se produce usando Escherichia coli como clula anfitriona, segui7
8
9
Los marcadores de pI en el intervalo 310 se pueden obtener de BioRad (N 161-0310).

Los geles de IEF en el intervalo 310 se pueden obtener de Cambrex (N 56015).
ISS Pro-Blue se puede obtener de Integrated Separation Systems.
USP 38

en donde A es la absorbancia de rProtena A, B4, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar.
Promediar los resultados triplicados y determinar el coeficiente de variacin (CV): el CV es 2,5%.
Pureza cromatogrfica[NOTALa prueba de pureza por cromatografa de exclusin por tamao resuelve la rProtena A,
B4, C-Cys de los contaminantes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase mvilPreparar una solucin de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio 0,15 M, de la siguiente manera. Agregar 0,96 0,02 g de fosfato monobsico de sodio hidrato, 2,32 0,02 g de fosfato dibsico de sodio
dihidrato, y 8,76 g 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con
hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 0,05. Transferir esta solucin a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen
con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm.
Solucin de EDTAPreparar una solucin de EDTA 20 mM, disolviendo 0,74 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase mvil.
Solucin de DTTPreparar una solucin de DL-ditiotreitol (DTT) 100 mM, disolviendo 1,54 0,02 g de DTT en 100 mL de
Fase mvil.
Solucin de pretratamientoPreparar una solucin que contenga una mezcla de Solucin de EDTA y Solucin de DTT (1:1,
v/v). [NOTAPreparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de pruebaDiluir rProtena A, B4, C-Cys 1 a 5 en Solucin de pretratamiento y mezclar suavemente. Incubar la muestra a 40 durante 60 minutos.
columna de 10 mm 30 cm rellena con material L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volmenes de columnna de
la Fase mvil a una velocidad de flujo de 0,4 mL por minuto.
ProcedimientoInyectar 100 mL de Solucin de pretratamiento, y dejar que la cromatografa contine durante por lo menos
dos volmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 mL de la Solucin de prueba. La absorbancia se detecta a
los 214 nm. Integrar el pico principal a partir de la corrida de la Solucin de prueba y todos los dems picos que no estn presentes en las corridas de la Solucin de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porcin de rProtena A, B4, CCys, por la frmula:
100(ri/rs)
en donde ri es la respuesta del pico de cada impureza; y rs es la suma de todas las respuestas de todos los picos: la suma de
todas las impurezas no es ms de 5%; y la Solucin de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 37 minutos.
Captulos
do de purificacin por cromatografa convencional. La rProtena A, B4, C-Cys se fabrica como una solucin a granel con una
potencia de unin a IgG mayor de 95%. Dado que la rProtena A, B4, C-Cys se usa como un material auxiliar en la fabricacin
de frmacos teraputicos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacuticos teraputicos.
Estndares de Referencia USP 11ER Endotoxina USP. ER rProtena A, B4, C-Cys USP.
Identificacin
A: SDS-PAGECumple con los requisitos de la prueba A de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, B4, C-Cys
USP.
B: Unin a IgGCumple con los requisitos de la prueba B de Identificacin en rProtena A usando ER rProtena A, B4, C-Cys
USP.
de 10 ufc por mL.
prueba de Endotoxinas bacterianas para rProtena A, B4, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta
prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparacin de las formas farmacuticas inyectables en las
cuales se usa la rProtena A, B4, C-Cys.]
Protena total (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851)
Solucin amortiguadora de formulacinPreparar una solucin de fosfato de potasio 0,02 M de pH 7,0, que contenga cloruro de potasio 0,15 M y cido etilendiaminotetractico (EDTA) 2 mM de la siguiente manera. Agregar 2,72 0,01 g de fosfato
monobsico de potasio anhidro, 11,18 g 0,22 g de cloruro de potasio y 0,744 0,02 g de EDTA en un vaso de precipitados
de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidrxido de sodio 1 M a un pH de 7,00 0,05. Transferir la solucin a un
matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro de membrana de 0,45 mm.
Preparacin de pruebaDiluir la rProtena A, B4, C-Cys a 3,0 mg por mL con Solucin amortiguadora de formulacin.
ProcedimientoPreparar muestras por triplicado para anlisis. Medir la absorbancia de cada Preparacin de prueba a 275 nm
despus de corregirla usando Solucin amortiguadora de formulacin como blanco. Determinar la concentracin de protena
con la siguiente ecuacin:
228 151 Prueba de Pirgenos / Pruebas Biolgicas
USP 38
151 PRUEBA DE PIRGENOS

La prueba de pirgenos est diseada para limitar a un nivel aceptable el riesgo de reaccin febril en pacientes a los que se
inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la temperatura corporal en conejos a los que se inyecta una
solucin de prueba por va intravenosa. Este ensayo est diseado para productos que pueden ser tolerados por conejos en
una dosis que no exceda de 10 mL por kg del peso del conejo, inyectados por va intravenosa durante un perodo de no ms
de 10 minutos. En el caso de productos que requieren una preparacin preliminar o que estn sujetos a condiciones especiales
de administracin, se deben seguir las indicaciones adicionales establecidas en la monografa individual o, en el caso de antibiticos o de productos biolgicos, seguir las indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones federales (ver Productos Biolgicos 1041).
APARATOS Y DILUYENTES
Captulos
Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calentamiento a 250 durante no menos de 30 minutos o utilizando
otro mtodo adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y enjuague de los dispositivos o sistemas de inyeccin
parenteral, se deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de pirgenos. Se deben realizar peridicamente pruebas de control de pirgenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para lavado y enjuague de los aparatos. Cuando se especifique el uso de Inyeccin de Cloruro de Sodio como diluyente, emplear una
Inyeccin que contenga 0,9 por ciento de NaCl.
REGISTRO DE LA TEMPERATURA
Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como termmetros clnicos, sondas termomtricas u otra clase
de sonda calibrada, que aseguren una exactitud de 0,1 y que faciliten la lectura mxima en menos de 5 minutos. Insertar la
sonda sensora de temperatura en el recto del conejo, a una profundidad de no menos de 7,5 cm y, durante un perodo no
menor que el previamente estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del animal de prueba.
ANIMALES DE PRUEBA
Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente en un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a
una temperatura uniforme entre 20 y 23, con una variacin mxima de 3 respecto de la temperatura seleccionada. Antes
de emplear por primera vez un conejo en una prueba de pirgenos, se lo debe acondicionar durante un perodo de no ms de
7 das, realizando un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el Procedimiento, pero omitiendo la inyeccin.
No utilizar el mismo conejo para pruebas de pirgenos ms de una vez cada 48 horas, ni antes de que hayan transcurrido dos
semanas despus de una elevacin de la temperatura corporal de 0,6 o ms, mientras es sometido a la prueba de pirgenos o
despus de administrarle una sustancia considerada pirognica.
PROCEDIMIENTO
El ensayo se debe llevar a cabo en un rea destinada exclusivamente a la prueba de pirgenos, con condiciones ambientales
similares a las del espacio donde estn alojados los conejos y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el perodo de prueba se les suspender todo alimento. El acceso al agua est permitido en todo momento pero podr restringirse durante la prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal debe dejarse insertado durante el perodo de prueba, sujetar los conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les permita adoptar una postura natural de
descanso. Determinar la temperatura control de cada conejo no ms de 30 minutos antes de la inyeccin de la dosis de
prueba: sta es la temperatura base para determinar si existe aumento provocado por la inyeccin de una solucin de prueba.
En cada uno de los grupos de conejos de prueba, emplear solamente aquellos cuya temperatura control no vare ms de 1
respecto de los dems. Descartar los conejos cuya temperatura corporal exceda de 39,8.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una
vena de la oreja, 10 mL de la solucin de prueba por kg de peso, completndose cada inyeccin dentro de los 10 minutos
desde el inicio de su administracin. La solucin de prueba es o bien el producto, reconstituido de acuerdo con las especificaciones de la etiqueta, o bien el material en anlisis, tratado segn se indica en la monografa individual e inyectado en la dosis
especificada en la misma. Para la prueba de pirgenos de dispositivos mdicos o sistemas de inyeccin, lavar o enjuagar las
superficies del dispositivo o sistema que entran en contacto con el material administrado en forma parenteral, o con el sitio de
inyeccin, o con los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las soluciones de prueba estn protegidas de la
contaminacin. Administrar la inyeccin despus de entibiar la solucin de prueba a una temperatura de 37 2. Registrar la
temperatura a intervalos de 30 minutos durante el perodo de 1 a 3 horas posteriores a la inyeccin.
USP 38
Pruebas Biolgicas / 161 Equipos para Transfusin e Infusin 229
INTERPRETACIN Y CONTINUACIN DE LA PRUEBA

Considerar cualquier disminucin de la temperatura como elevacin cero. El producto cumple con los requisitos de la prueba para determinar la ausencia de pirgenos si ningn conejo muestra un aumento de 0,5 o ms por encima de su temperatura de control respectiva. Si algn conejo muestra un aumento de 0,5 o ms, continuar la prueba empleando otros cinco
conejos. El material en anlisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de pirgenos cuando no ms de tres de
los ocho conejos tienen un aumento de temperatura de 0,5 o ms y si la suma del aumento mximo de las temperaturas
individuales de los ocho conejos no excede de 3,3.
PRODUCTOS FARMACUTICOS RADIOACTIVOS

Dosis de Prueba para Productos Preformulados, Listos para Usar Marcados con Radioactividad
ALBMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN PARTCULAS
Para la prueba de pirgenos en conejos, diluir el producto con Inyeccin de Cloruro de Sodio a no menos de 100 mCi por
mL e inyectar a cada conejo una dosis de 3 mL por kg de peso corporal.
OTROS PRODUCTOS
Dosis de Prueba para Componentes de Productos Farmacuticos o Reactivos a Ser Marcados

Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por
agregado directo de soluciones radioactivas tales como Inyeccin de Pertecnetato de Sodio Tc 99 m, por ejemplo: equipos
fros.
Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no radioactivo se inyectar a una persona de 70 kg o que se
inyectar el 1/70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo con un volumen medido de Inyeccin de
Cloruro de Sodio.
Para la prueba de pirgenos en conejos, inyectar (1/7) del contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La
dosis mxima por conejo ser igual al contenido completo de un solo vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser
de menos de 1 mL ni de ms de 10 mL de solucin.
161 EQUIPOS PARA TRANSFUSIN E INFUSIN Y DISPOSITIVOS

MDICOS SIMILARES
Los requisitos se aplican a dispositivos o equipos apirgenos y estriles que entran en contacto, directo o indirecto, con el
sistema cardiovascular, el sistema linftico o el lquido cefalorraqudeo. Estos incluyen los siguientes, sin limitarse a estos: equipos de administracin de soluciones, de extensin, de transferencia, de administracin de sangre, catteres intravenosos, implantes, tuberas y accesorios de oxigenadores extracorpreos, dializadores y tubos y accesorios para dilisis, vlvulas cardacas,
injertos vasculares, catteres de administracin intramuscular de frmacos, y equipos de transfusin e infusin. Estos requisitos
no se aplican a productos ortopdicos, guantes de ltex o apsitos para heridas.
EsterilidadProceder segn se indica para Dispositivos Esterilizados en Pruebas de Esterilidad 71.
Endotoxinas BacterianasProceder segn se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85.
Captulos
Cuando la Vida Media Fsica de los Radionucleidos Es de Ms de Un DaCalcular el volumen mximo del producto
que puede inyectarse a una persona. Este clculo debe tener en cuenta la dosis radioactiva mxima recomendada del producto, en mCi, y la valoracin de la radioactividad, en mCi por mL, del producto a la hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta
informacin, se calcula el volumen de la dosis mxima por kg en una persona de 70 kg.
Para la prueba de pirgenos en conejos, inyectar a cada conejo un mnimo de 10 veces esta dosis por kg de peso corporal.
Si fuera necesario, diluir la dosis con Inyeccin de Cloruro de Sodio. El volumen total inyectado por conejo no debe ser menor
de 1 mL ni mayor de 10 mL de solucin.
Cuando la Vida Media Fsica de los Radionucleidos Es de Menos de Un DaPara productos cuya etiqueta indica que
contienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 da, los clculos de dosificacin son idnticos a los descritos en el
primer prrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribucin de estos productos antes de terminar la prueba de pirgenos en conejos, pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la autorizacin a ms tardar.
230 161 Equipos para Transfusin e Infusin / Pruebas Biolgicas
USP 38
El lmite de endotoxinas para los dispositivos mdicos no es ms de 20,0 Unidades USP de Endotoxinas por dispositivo, salvo
para los dispositivos mdicos que entran en contacto con el lquido cefalorraqudeo, cuyo lmite es no ms de 2,15 Unidades
USP de Endotoxinas por dispositivo.
Efectuar una segunda prueba de Endotoxinas Bacterianas solamente con todo dispositivo que no cumpla con la primera
prueba efectuada. Efectuar la Prueba de Pirgenos 151 con todos los dispositivos a los que no se les puede efectuar la Prueba
de Endotoxinas Bacterianas 85 por aumento o inhibicin no eliminable.
Preparacin de los EquiposEscoger no menos de 3 y no ms de 10 equipos. Enjuagarlos o remojarlos en Agua Reactiva LAL.
Ajustar el volumen de la solucin de extraccin o de enjuague segn el tamao y la configuracin del equipo.
Purgar las lneas de recorrido del lquido de los equipos etiquetados como recorrido de lquido apirgeno con lquido de
extraccin calentado a 37 1,0 y mantener el lquido de extraccin en contacto con el recorrido que corresponda durante no
menos de 1 hora a temperatura ambiente controlada. Combinar los extractos si corresponde. Calcular el lmite de endotoxinas
de la solucin de extraccin o de enjuague por la frmula:
Captulos
(K N)/(V)
en donde K es la cantidad de endotoxinas permitida por equipo, N es el nmero de equipos que se analizan y V es el volumen
total del extracto o del lquido de enjuague. Si la solucin de enjuague o de extraccin sin diluir no es adecuada para efectuar
la Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85, repetir la prueba de aumento o inhibicin despus de neutralizar y eliminar las sustancias interferentes o despus de diluir la solucin en un factor que no exceda el de la Dilucin Mxima Vlida. La Dilucin
Mxima Vlida para dispositivos se calcula dividiendo el lmite de endotoxinas por la sensibilidad l declarada en la etiqueta del
reactivo LAL utilizado.
PirgenosEfectuar la Prueba de Pirgenos 151 con las muestras a las que no se puede efectuar la Prueba de Endotoxinas
Bacterianas por aumento o inhibicin no eliminable de la prueba. Escoger 10 dispositivos y obtener un efluente combinado,
empleando mtodos de preparacin adecuados al equipo, segn se indica en Endotoxinas Bacterianas, pero utilizando volmenes de lquido de extraccin o de enjuague que no excedan de 40 mL de solucin salina estril SR por equipo. Se cumple con
los requisitos de la Prueba de Pirgenos 151.
Otros RequisitosLas partes de los dispositivos mdicos que estn fabricadas de plsticos u otros polmeros cumplen con
los requisitos especificados para Pruebas BiolgicasPlsticos y Otros Polmeros en EnvasesPlsticos 661; las fabricadas de
elastmeros cumplen con los requisitos establecidos en Cierres Elastomricos para Inyectables 381. Si fuera necesario establecer una designacin de clases para elastmeros, plsticos u otros polmeros, realizar las pruebas in vivo correspondientes, segn se indica en el captulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88.
171 VALORACIN DE ACTIVIDAD DE VITAMINA B
12
Estndares de referencia USP 11ER Cianocobalamina USP.

Preparacin de ValoracinColocar una cantidad adecuada del material a valorar, previamente reducida a polvo fino si
fuera necesario y medida o pesada con exactitud, en un recipiente apropiado que contenga, por cada g o mL del material
tomado, 25 mL de una solucin acuosa para extraccin preparad a justo antes de usar, en donde, cada 100 mL contienen
1,29 g de fosfato disdico, 1,1 g de cido ctrico anhidro y 1,0 g de metabisulfito de sodio. Colocar la mezcla en autoclave a
121 durante 10 minutos. Dejar sedimentar las partculas no disueltas del extracto y filtrar o centrifugar si fuera necesario. Diluir una alcuota de la solucin transparente con agua, de manera que la solucin de prueba final contenga una actividad de
vitamina B12 que equivalga aproximadamente a la actividad de la Solucin Estndar de Cianocobalamina que se agrega a los
tubos de valoracin.
Solucin Madre del Estndar de CianocobalaminaA una cantidad adecuada de ER Cianocobalamina USP, pesada con
exactitud, agregar suficiente alcohol al 25 por ciento para obtener una solucin con una concentracin conocida de 1,0 mg de
cianocobalamina por mL. Almacenar en un refrigerador.
Solucin de Cianocobalamina EstndarDiluir un volumen adecuado de Solucin Madre del Estndar de Cianocobalamina
con agua hasta un volumen medido tal que despus del perodo de incubacin segn se indica en el Procedimiento, la diferencia en la transmitancia entre el blanco inoculado y el nivel de 5,0 mL de la Solucin de Cianocobalamina Estndar no sea menor
de aquella correspondiente a la diferencia de 1,25 mg en peso seco de las clulas. Generalmente, esta concentracin est entre 0,01 ng y 0,04 ng por mL de Solucin de Cianocobalamina Estndar. Preparar una solucin estndar nueva para cada valoracin.
Solucin Madre de Medio BasalPreparar el medio de acuerdo con la frmula y las instrucciones que aparecen a continuacin. Puede usarse una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida segn se indica en la etiqueta, proporcione un medio comparable al obtenido a partir de la frmula que aparece en este procedimiento.
Agregar los ingredientes en el orden indicado, disolviendo con cuidado la cistina y el triptfano en el cido clorhdrico antes
de agregar las ocho soluciones siguientes a la solucin resultante. Agregar 100 mL de agua, mezclar y disolver la dextrosa, el
USP 38
Pruebas Biolgicas / 171 Valoracin de Actividad de Vitamina B12 231
acetato de sodio y el cido ascrbico. Filtrar, si fuera necesario, agregar la solucin de polisorbato 80, ajustar la solucin a un
pH entre 5,5 y 6,0 con hidrxido de sodio 1 N y agregar agua purificada hasta obtener 250 mL.
L-Cistina
L-Triptfano
cido Clorhdrico 1 N
0,1 g
0,05 g
10 mL
Solucin de Adenina-Guanina-Uracilo
5 mL
Solucin de Xantina
5 mL
Solucin Vitamnica I
10 mL
Solucin Vitamnica II
10 mL
Solucin Salina A
5 mL
Solucin Salina B
5 mL
Solucin de Asparagina
5 mL
25 mL
Dextrosa Anhidra
10 g
5g
cido Ascrbico
1g
5 mL
* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus leichmannii, Nmero 7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110.
Captulos
Solucin de Hidrolizado cido de CasenaPreparar segn se indica en Valoracin de Pantotenato de Calcio 91.
Solucin de AsparaginaDisolver 2,0 g de L-asparagina en agua hasta obtener 200 mL. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin de AdeninaGuaninaUraciloPreparar segn se indica en Valoracin de Pantotenato de Calcio 91.
Solucin de XantinaSuspender 0,20 g de xantina en 30 mL a 40 mL de agua, calentar a una temperatura de aproximadamente 70, agregar 6,0 mL de hidrxido de amonio 6 N y mezclar hasta que el slido se disuelva. Enfriar y agregar agua para
obtener 200 mL. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solucin Salina ADisolver 10 g de fosfato monobsico de potasio y 10 g de fosfato dibsico de potasio en agua para obtener 200 mL. Agregar 2 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin Salina BDisolver 4,0 g de sulfato de magnesio, 0,20 g de cloruro de sodio, 0,20 g de sulfato ferroso y 0,20 g de
sulfato de manganeso en agua para obtener 200 mL. Agregar 2 gotas de cido clorhdrico y almacenar bajo tolueno.
Solucin de Polisorbato 80Disolver 20 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 200 mL. Almacenar en un refrigerador.
Solucin Vitamnica IDisolver 10 mg de riboflavina, 10 mg de clorhidrato de tiamina, 100 mg de biotina y 20 mg de niacina en cido actico glacial 0,02 N para obtener 400 mL. Almacenar, bajo tolueno protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Solucin Vitamnica IIDisolver 20 mg de cido paraaminobenzoico, 10 mg de pantotenato de calcio, 40 mg de clorhidrato
de piridoxina, 40 mg de clorhidrato de piridoxal, 8 mg de diclorhidrato de piridoxamina y 2 mg de cido flico en alcohol
neutralizado diluido (1 en 4) para obtener 400 mL. Almacenar, protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Preparacin de Jugo de TomateCentrifugar jugo de tomate enlatado comercial para extraer la mayor parte de la pulpa.
Suspender aproximadamente 5 g por L de coadyuvante de filtracin analtico en el sobrenadante y filtrar, con ayuda de presin reducida, a travs de una capa de coadyuvante de filtracin. Repetir la filtracin, si fuera necesario, hasta obtener un filtrado transparente, color amarillo claro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Medio de Cultivo[NOTASe puede usar una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que,
una vez reconstituida segn las indicaciones del etiquetado, proporcione un medio equivalente al obtenido a partir de la frmula descrita en este procedimiento.] Disolver 0,75 g de extracto de levadura hidrosoluble, 0,75 g de peptona seca, 1,0 g de
dextrosa anhidra y 0,20 g de bifosfato de potasio en 60 mL a 70 mL de agua. Agregar 10 mL de Preparacin de Jugo de Tomate
y 1 mL de Solucin de Polisorbato 80. Ajustar la solucin con hidrxido de sodio 1 N hasta un pH de 6,8 y agregar agua para
obtener 100 mL. Colocar porciones de 10 mL de la solucin en tubos de ensayo y tapar con algodn. Esterilizar los tubos y su
contenido en autoclave a 121 durante 15 minutos. Enfriar con la mayor prontitud posible para evitar formacin de colores
que resultan del sobrecalentamiento del medio.
Medio de SuspensinDiluir un volumen medido de la Solucin Madre de Medio Basal con un volumen igual de agua.
Colocar porciones de 10 mL del medio diluido en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar segn se ha indicado en Medio de Cultivo.
Cultivo Madre de Lactobacillus leichmanniiAgregar 1,0 g a 1,5 g de agar a 100 mL de Medio de Cultivo y calentar la
mezcla en un bao de vapor, con agitacin, hasta que el agar se disuelva. Colocar porciones de aproximadamente 10 mL de la
solucin caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos a 121 durante 15 minutos en autoclave (temperatura de la salida) y dejar que los tubos se enfren en posicin vertical. Inocular tres o ms de los tubos, por transferencias en
cua de un cultivo puro de Lactobacillus leichmannii.* (Antes de usar un cultivo nuevo por primera vez en esta valoracin, hacer
no menos de 10 transferencias sucesivas del cultivo en un perodo de 2 semanas.) Incubar durante 16 a 24 horas, a cualquier
Captulos
232 171 Valoracin de Actividad de Vitamina B12 / Pruebas Biolgicas
USP 38
temperatura seleccionada entre 30 y 40, pero mantenida termostticamente dentro de 0,5 y finalmente almacenar en un
refrigerador.
Preparar cultivos nuevos en cua al menos tres veces por semana y no usarlos para preparar el inculo si tienen ms de 4
das. La actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transferencias del cultivo en cua realizadas a diario o dos
veces al da, hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el inculo lquido 2 a 4 horas despus de la
inoculacin. Un cultivo de crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta adecuada y puede conducir a resultados irregulares.
Inculo[NOTAUna suspensin congelada de Lactobacillus leichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que
proporcione un inculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir las clulas del Cultivo Madre de Lactobacillus leichmannii a 2
tubos estriles que contengan 10 mL de Medio de Cultivo cada uno. Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cualquier
temperatura seleccionada entre 30 y 40, pero mantenida termostticamente dentro de 0,5. En condiciones aspticas, centrifugar los cultivos y decantar el sobrenadante. Suspender las clulas de cultivo en 5 mL de Medio de Suspensin estril y mezclar. Usando Medio de Suspensin estril, ajustar el volumen para que una dilucin 1 en 20 en solucin salina SR produzca
transmitancia de 70% cuando se lee en un espectrofotmetro apropiado a una longitud de onda ajustada a 530 nm, equipado
con una celda de 10 mm y se lee contra solucin salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Preparar una dilucin 1 en
400 de la suspensin ajustada usando Solucin Madre de Medio Basal y usarla para el inculo de prueba. (Esta dilucin puede
alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.)
Calibracin del EspectrofotmetroComprobar la longitud de onda del espectrofotmetro peridicamente, usando una
celda de longitud de onda estndar u otro dispositivo apropiado. Previamente a la lectura de las soluciones, calibrar el espectrofotmetro con agua para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de 530 nm.
ProcedimientoLimpiar meticulosamente, por medios apropiados, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm 150
mm de tamao aproximado y otro material de vidrio necesario, preferentemente seguido de un calentamiento a 250 durante
2 horas, debido a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de cantidades diminutas de vitamina B12 y a trazas
de muchos agentes de limpieza.
Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 mL; 1,5 mL; 2,0 mL; 3,0 mL; 4,0 mL y 5,0 mL, respectivamente, de la
Solucin de Cianocobalamina Estndar. A cada uno de estos tubos y a cuatro tubos vacos similares, agregar 5,0 mL de Solucin
Madre de Medio Basal y agua para completar 10 mL.
En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectivamente, 1,0 mL; 1,5 mL; 2,0 mL; 3,0 mL y 4,0 mL de la
Preparacin de Valoracin. Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solucin Madre de Medio Basal y agua para completar 10 mL. Colocar
juntos un juego completo de tubos del estndar y de la valoracin en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda
gradilla o en otra seccin de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminacin bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un autoclave a 121 durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en no ms de 10 minutos, precalentando el autoclave si fuera necesario. Enfriar tan rpidamente como sea posible para evitar formacin de color como resultado del sobrecalentamiento del medio. Tomar precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de esterilizacin y enfriamiento durante toda la valoracin ya que si los tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave podra variar la velocidad de calentamiento.
Agregar aspticamente 0,5 mL de Inculo a cada tubo as preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan Solucin
de Cianocobalamina Estndar (los blancos no inoculados). Incubar los tubos a una temperatura entre 30 y 40, mantenida termostticamente dentro de 0,5, durante 16 a 24 horas.
Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80 durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Despus de agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotmetro que se ha fijado a una longitud de onda de 530 nm
y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos despus de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o ms. Emplear aproximadamente el mismo
intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia es
mayor de 5% o si hay evidencia de contaminacin con un microorganismo extrao, descartar los resultados de la valoracin.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes.
Descartar los resultados de la valoracin si la pendiente de la curva estndar indica un problema de sensibilidad.
ClculosPreparar una curva estndar de concentracin-respuesta segn el siguiente procedimiento. Examinar los resultados para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia aberrante. Para cada nivel del estndar, calcular la respuesta a
partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias (S) como la diferencia, y = 2,00 S. Graficar esta respuesta en
la ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los mL de Solucin de Cianocobalamina Estndar por tubo en la
abscisa, usando para la ordenada una escala aritmtica o logartmica, la que produzca una mejor aproximacin a una lnea
recta. Trazar la lnea recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparacin de Valoracin. Leer de la curva
estndar el logaritmo del volumen de la Preparacin Estndar correspondiente a cada uno de esos valores de y que estn comprendidos en el intervalo entre el punto ms bajo y ms alto graficados para el estndar. Restar de cada logaritmo as obtenido
el logaritmo del volumen, en mL, de la Preparacin de Valoracin para obtener la diferencia, x, de cada nivel de dosificacin.
Promediar los valores de x para cada uno de tres o ms niveles de dosis para obtener x = M, el logaritmo de la potencia relativa de la Preparacin de Valoracin. Determinar la cantidad, en mg, de ER Cianocobalamina USP correspondiente a la cianocoba-
USP 38
Pruebas Qumicas / 191 IdentificacinPruebas Generales 233
lamina en la porcin de material tomada para la valoracin con la ecuacin antilog M = antilog (M + log R), en donde R es el
nmero de mg de cianocobalamina que se supone presente en cada mg (o cpsula o tableta) del material tomado para la valoracin.
RepeticinRepetir toda la determinacin al menos una vez, usando Preparaciones de Valoracin preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08; su promedio, M, es el logaritmo de la potencia resultado de la valoracin del material de prueba (ver Valoracin de la Actividad de la Vitamina B12 en Diseo y Anlisis de
Valoraciones Biolgicas 111). Si las dos determinaciones difieren en ms de 0,08 hay que realizar una o ms determinaciones
adicionales. Del promedio de dos o ms valores de M que no difieren en ms de 0,15 calcular la potencia media de la preparacin valorada.

PRUEBAS DE IDENTIFICACIN
INTRODUCCIN
El propsito de esta prueba es identificar los compuestos de aminas terciarias. Esta prueba espectroscpica tiene un grado limitado de especificidad y, por lo tanto, se debe cumplir con todas las pruebas de identificacin adicionales listadas en una
monografa particular para asegurar la identidad de la muestra en anlisis.
VALORACIN
PROCEDIMIENTO
Solucin estndar: Disolver en un separador 50 mg del Estndar de Referencia USP correspondiente en 25 mL de cido
clorhdrico 0,01 N.
Solucin muestra: Dependiendo de la naturaleza de la muestra, disolver 50 mg de la sustancia a granel en anlisis en 25
mL de cido clorhdrico 0,01 N, o agitar una cantidad de tabletas reducidas a polvo o el contenido de las cpsulas, equivalente a 50 mg de la sustancia, con 25 mL de cido clorhdrico 0,01 N durante 10 minutos. Transferir el lquido a un separador, filtrando si fuera necesario y lavando el filtro y el residuo con varias porciones pequeas de agua.
Modo: IR
Intervalo de longitud de onda: 715 mm (1430 cm-1 a 650 cm-1)
Celda: 1 mm
Blanco: Disulfuro de carbono
Anlisis
Tratar cada solucin segn se indica a continuacin: Agregar 2 mL de hidrxido de sodio 1 N y 4 mL de disulfuro de carbono, y agitar durante 2 minutos. Si fuera necesario, centrifugar hasta que la fase inferior se torne transparente y pasarla a
travs de un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matraz pequeo con tapn de vidrio. Determinar inmediatamente el
espectro de absorcin de la Solucin estndar y la Solucin muestra filtradas.
Criterios de aceptacin: El espectro de la Solucin muestra debe presentar todas las bandas de absorcin significativas presentes en el espectro de la Solucin estndar.
191 IDENTIFICACINPRUEBAS GENERALES

Bajo este encabezado se describen las pruebas que se mencionan con frecuencia para identificar los artculos oficiales en la
Farmacopea. Antes de usar cualquier cido o base para modificar el pH de la solucin muestra, asegurarse de que la sustancia
agregada no interferir con los resultados de la prueba. [NOTAEstas pruebas no estn destinadas a mezclas de sustancias, a
menos que se indique especficamente.]
Captulos
181 IDENTIFICACINBASES ORGNICAS NITROGENADAS
Captulos
234 191 IdentificacinPruebas Generales / Pruebas Qumicas
USP 38
AcetatosDisolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solucin prescrita. Ajustar el pH de la solucin con hidrxido de sodio hasta alcalinizar levemente. Agregar 0,25 mL de nitrato de lantano
SR. Si se produce un precipitado blanco, filtrar la solucin. Agregar sucesivamente 0,1 mL de yodo y yoduro de potasio SR 3 y
0,1 mL de amonaco SR 2 a la solucin. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente hasta ebullicin. En presencia
de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se produce un precipitado azul. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro
frrico SR produce un color rojo que se elimina con la adicin de cidos minerales.
AluminioCon hidrxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado blanco gelatinoso
que es insoluble en un exceso de hidrxido de amonio 6 N. El hidrxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR producen el
mismo precipitado, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los reactivos mencionados.
AmonioAgregar 0,2 g de xido de magnesio a la solucin en anlisis. Pasar una corriente de aire a travs de la mezcla y
dirigir el gas que escapa apenas por debajo de la superficie de una solucin indicadora, preparada mezclando 1 mL de cido
clorhdrico 0,1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solucin indicadora cambia a amarillo. Despus de dirigir el gas hacia el interior de la solucin indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la solucin
indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR preparado recientemente. Con la adicin de cobaltinitrito de sodio SR se produce un precipitado amarillo en presencia de amonio.
AntimonioCon el sulfuro de hidrgeno, las soluciones de compuestos de antimonio (III) fuertemente acidificadas con cido clorhdrico producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidrxido de amonio
6 N, pero que es soluble en sulfuro de amonio SR.
BarioLas soluciones de sales de bario forman un precipitado blanco con cido sulfrico 2 N. Este precipitado es insoluble
en cido clorhdrico y en cido ntrico. Las sales de bario confieren un color verde amarillento a una llama no luminosa, que
parece de color azul cuando se la mira a travs de un vidrio verde.
BenzoatoEn soluciones neutras, los benzoatos forman un precipitado de color salmn con cloruro frrico SR. En soluciones moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de cido benzoico al acidificarse con cido sulfrico 2 N. Este precipitado es fcilmente soluble en ter etlico.
BicarbonatoVer Carbonatos.
BismutosCuando se disuelven en un ligero exceso de cido ntrico o cido clorhdrico, las sales de bismuto proporcionan
un precipitado blanco al diluirse con agua. Este precipitado se torna de color marrn en presencia de sulfuro de hidrgeno y el
compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de cido ntrico y agua.
BisulfitosVer Sulfitos.
BoratosAgregar 3 4 gotas de yodo SR y 3 4 gotas de solucin de alcohol polivinlico (1 in 50) a 1 mL de una solucin
de borato, acidificada con cido clorhdrico al tornasol: se produce un color azul intenso. Cuando a un borato se le trata con
cido sulfrico, se le agrega metanol y se incinera la mezcla, arde con una llama de borde verde.
BromurosLas soluciones de bromuros, con la adicin gota a gota de cloro SR, liberan bromo que se disuelve en cloroformo por agitacin y colorean el cloroformo de un color rojo a marrn rojizo. El nitrato de plata SR en soluciones de bromuro
produce un precipitado blancoamarillento que es insoluble en cido ntrico y poco soluble en hidrxido de amonio 6 N.
CalcioLas soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar
2 gotas de rojo de metilo SR a una solucin de sal de calcio (1 en 20) y neutralizar con hidrxido de amonio 6 N. Agregar,
gota a gota, cido clorhdrico 3 N hasta que la solucin sea cida frente al indicador. Las soluciones de sales de calcio forman
un precipitado blanco al agregar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en cido actico 6 N pero se disuelve en
cido clorhdrico. Las sales de calcio humedecidas con cido clorhdrico proporcionan un color rojo amarillento transitorio a
una llama no luminosa.
CarbonatosLos carbonatos y bicarbonatos son efervescentes en cidos, y desprenden un gas incoloro que, cuando se hace pasar por hidrxido de calcio SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco. Una solucin fra (1 en 20) de
un carbonato soluble se colorea de rojo con fenolftalena SR, mientras que una solucin similar de bicarbonato no se modifica
o slo se colorea ligeramente.
CincEn presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc forman un precipitado blanco con sulfuro de hidrgeno. Este precipitado es insoluble en cido actico, pero se disuelve con cido clorhdrico 3 N. El sulfuro de amonio SR produce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas. Con ferrocianuro de potasio SR, las sales de cinc en solucin forman
un precipitado blanco que es insoluble en cido clorhdrico 3 N.
CitratosAgregar algunos mg de sal de citrato disueltos o suspendidos en 1 mL de agua, a 15 mL de piridina, y agitar.
Agregar 5 mL de anhdrido actico a esta mezcla y agitar: se produce un color rojo claro.
CloratosLas soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adicin de cido sulfuroso a
esta mezcla produce un precipitado blanco que es insoluble en cido ntrico, pero que es soluble en hidrxido de amonio 6 N.
Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes. Cuando se agrega cido sulfrico a un clorato seco, ste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. [PrecaucinEmplear slo una pequea cantidad de clorato para esta prueba y extremar las precauciones para realizarla.]
ClorurosCon nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado blanco, grumoso, que es insoluble
en cido ntrico pero soluble en un ligero exceso de hidrxido de amonio 6 N. Cuando se analizan clorhidratos de aminas (incluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de cido ntrico diluido y 0,5 mL de nitrato de
plata SR a una solucin de la sustancia que est siendo examinada que contenga, a menos que se indique algo diferente en la
monografa, aproximadamente 2 mg de in cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, grumoso. Centrifugar la mezcla
USP 38
Pruebas Qumicas / 191 IdentificacinPruebas Generales 235
Captulos
sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solucin de cido ntrico (1 en
100) y desechar los lavados. Agregar amonaco SR gota a gota a este precipitado. Se disuelve rpidamente. Cuando una monografa especifica que un artculo responde a la prueba para cloruros secos, mezclar el slido que se va a analizar con un peso
igual de dixido de manganeso, humedecer con cido sulfrico y calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es
reconocible por la produccin de un color azul con papel de yoduroalmidn humedecido.
CobaltoLas soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en cido clorhdrico 3 N producen un precipitado rojo cuando la
mezcla se calienta en un bao de vapor, con un volumen igual de una solucin caliente, recin preparada, de 1-nitroso-2naftol (1 en 10) en cido actico 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan
con nitrito de potasio y cido actico, producen un precipitado amarillo.
CobreLas soluciones de compuestos cpricos acidificadas con cido clorhdrico, depositan una pelcula roja de cobre metlico sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de hidrxido de amonio 6 N, agregado a una solucin
de una sal cprica, produce al principio un precipitado azulado y posteriormente una solucin de color azul intenso. Las soluciones de sales cpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de color marrn rojizo insoluble en cidos
diluidos.
Fosfatos[NOTACuando la monografa especifica la prueba de identificacin de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofosfatos, a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar
el producto antes de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en cido ntrico 2 N y en hidrxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR, las soluciones
acidificadas de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en hidrxido de amonio 6 N. Este precipitado
puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineracin producen un precipitado blanco
que es soluble en cido ntrico 2 N y en hidrxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado amarillo que es soluble en hidrxido de amonio 6 N.
HierroLos compuestos frricos y ferrosos en solucin producen un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este precipitado se disuelve en presencia de cido clorhdrico 3 N fro con desprendimiento de sulfuro de hidrgeno.
Sales FrricasLas soluciones cidas de sales frricas producen un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR.
Con un exceso de hidrxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrn rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones
de sales frricas producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de cidos minerales diluidos.
Sales FerrosasLas soluciones de sales ferrosas producen un precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este precipitado es insoluble en cido clorhdrico 3 N pero se descompone con hidrxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas
con hidrxido de sodio 1 N producen un precipitado blancoverdoso que cambia de color rpidamente a verde y luego, cuando se agita, se torna marrn.
HipofosfitosCuando se los calienta enrgicamente, los hipofosfitos desprenden fosfina que es espontneamente inflamable. Los hipofosfitos en solucin producen un precipitado blanco con cloruro mercrico SR. Este precipitado se torna gris ante
la presencia de un exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con cido sulfrico y calentadas con sulfato cprico SR, producen un precipitado rojo.
LactatosCuando las soluciones de lactatos se acidifican con cido sulfrico, se les agrega permanganato de potasio SR y
se calienta la mezcla, desprenden acetaldehdo. ste se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un
papel de filtro humedecido con una mezcla recin preparada de volmenes iguales de solucin acuosa de morfolina al 20% y
de nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul.
LitioCon carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidrxido de sodio, producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullicin. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las
sales de litio humedecidas con cido clorhdrico proporcionan un color carmes intenso a una llama no luminosa. Las soluciones de sales de litio no precipitan en cido sulfrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia del estroncio).
MagnesioLas soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio producen solamente un precipitado
ligeramente turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adicin posterior de fosfato dibsico de
sodio SR producen un precipitado blanco cristalino, insoluble en hidrxido de amonio 6 N.
ManganesoCon sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales manganosas producen un precipitado color salmn que se
disuelve en cido actico.
MercurioCuando se aplican sobre una lmina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exceso de cido ntrico, producen un precipitado que, al frotarlo, adquiere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de hidrgeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR
y en cido ntrico 2 N en ebullicin.
Sales MercricasLas soluciones de sales mercricas producen un precipitado amarillo con hidrxido de sodio 1 N. En soluciones neutras con yoduro de potasio SR, tambin producen un precipitado escarlata que es muy soluble en un exceso de
reactivo.
Sales MercuriosasLos compuestos mercuriosos se descomponen en hidrxido de sodio 1 N y producen un color negro.
Con cido clorhdrico, las soluciones de sales mercuriosas producen un precipitado blanco que se ennegrece con hidrxido de
amonio 6 N. Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al quedar en reposo, puede tornarse verde.
NitratosCuando una solucin de nitrato se mezcla con un volumen igual de cido sulfrico, se enfra la mezcla y se superpone una solucin de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrn en la unin de los dos lquidos. Cuando se calienta un
Captulos
236 191 IdentificacinPruebas Generales / Pruebas Qumicas
USP 38
nitrato con cido sulfrico y cobre metlico, se desprenden humos de color rojo amarronado. Los nitratos no decoloran el permanganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
NitritosCuando se los trata con cidos minerales diluidos o con cido actico 6 N, los nitritos desprenden humos de color
rojoamarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidn-yoduro.
OxalatosLas soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este precipitado es insoluble en cido actico 6 N pero se disuelve con cido clorhdrico. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calientes decoloran el permanganato de potasio SR.
PermanganatosLas soluciones de permanganatos acidificadas con cido sulfrico se decoloran con perxido de hidrgeno SR y con bisulfito de sodio SR en fro y con cido oxlico SR en solucin caliente.
PerxidosLas soluciones de perxidos acidificadas ligeramente con cido sulfrico proporcionan un color azul intenso
con la adicin de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen igual de ter etlico y se deja que se separen
los lquidos, el color azul se encuentra en la capa de ter etlico.
PlataCon cido clorhdrico, las soluciones de sales de plata producen un precipitado grumoso, blanco, que es insoluble
en cido ntrico pero fcilmente soluble en hidrxido de amonio 6 N. Una solucin de una sal de plata a la que se le agrega
hidrxido de amonio 6 N y una pequea cantidad de formaldehdo SR, al entibiarla, deposita un espejo de plata metlica en
las paredes del recipiente.
PlomoLas soluciones de sales de plomo con cido sulfrico 2 N producen un precipitado blanco que es insoluble en cido clorhdrico 3 N o en cido ntrico 2 N, pero que es soluble en hidrxido de sodio 1 N tibio y en acetato de amonio SR. Con
cromato de potasio SR, las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas de cidos minerales, producen un precipitado
amarillo que es insoluble en cido actico 6 N pero que es soluble en hidrxido de sodio 1 N.
PotasioLos compuestos de potasio confieren un color violeta a una llama no luminosa, pero la presencia de pequeas
cantidades de sodio enmascara el color a menos que el color amarillo producido por el sodio se elimine con un filtro azul que
bloquee la emisin a 589 nm (sodio) pero que sea transparente a la emisin a 404 nm (potasio). Tradicionalmente se ha usado
vidrio cobalto, pero tambin hay otros filtros satisfactorios que estn disponibles comercialmente. En soluciones neutras, concentradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad y del contenido de potasio), el
bitartrato de sodio SR produce un precipitado blanco cristalino que es soluble en hidrxido de amonio 6 N y en soluciones de
hidrxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formacin del precipitado, que usualmente es lenta, se acelera al agitar o frotar
el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adicin de una pequea cantidad de cido actico glacial o alcohol
tambin favorece la precipitacin.
SalicilatosEn soluciones moderadamente diluidas de salicilatos, el cloruro frrico SR produce un color violeta. La adicin
de cidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado blanco cristalino de cido saliclico,
que se funde entre 158 y 161.
SodioA menos que se especifique algo diferente en una monografa individual, preparar una solucin que contenga 0,1 g
del compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullicin. No se
forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullicin. Dejar que se enfre en agua
helada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso. Los
compuestos de sodio confieren un intenso color amarillo a una llama no luminosa.
SulfatosLas soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR producen un precipitado blanco que es insoluble en cido clorhdrico y en cido ntrico. Con acetato de plomo SR, las soluciones neutras de sulfatos forman un precipitado blanco que es
soluble en acetato de amonio SR. El cido clorhdrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a
diferencia de los tiosulfatos).
SulfitosCuando se los trata con cido clorhdrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dixido de azufre que ennegrece
el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR.
TartratosDisolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solucin de metaperyodato de sodio (1 en 20). Agregar
1 gota de cido sulfrico 1 N y despus de 5 minutos, agregar algunas gotas de cido sulfuroso seguido de algunas gotas de
cido sulfurosofucsina SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos.
TiocianatosCon cloruro frrico SR, las soluciones de tiocianato producen un color rojo que no se elimina con cidos minerales moderadamente concentrados.
TiosulfatosCon cido clorhdrico, las soluciones de tiosulfatos producen un precipitado de color blanco que se torna
amarillo rpidamente y dixido de azufre, que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. La adicin
de cloruro frrico SR a las soluciones de tiosulfatos produce un color violeta oscuro que desaparece rpidamente.
YodurosLas soluciones de yoduros, con la adicin de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solucin de amarillo a rojo. Si esta solucin se agita con cloroformo, ste se torna de color violeta. El yodo as liberado proporciona un color azul
con almidn SR. El nitrato de plata SR, en soluciones de yoduros, produce un precipitado amarillo grumoso, que es insoluble
en cido ntrico y en hidrxido de amonio 6 N.
USP 38
Pruebas Qumicas / 197 Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica 237
193 IDENTIFICACINTETRACICLINAS
Los procedimientos cromatogrficos descritos a continuacin se suministran para confirmar la identidad de los frmacos de
la Farmacopea que son del tipo tetraciclina, como por ejemplo la doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina, y para confirmar la
identidad de dichos compuestos en sus respectivas formas farmacuticas de la Farmacopea. Se describen dos procedimientos,
uno basado en cromatografa en papel (Mtodo I) y otro en cromatografa en capa delgada (Mtodo II). Utilizar el Mtodo I a
menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Solucin EstndarA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, disolver el Estndar de Referencia USP del frmaco que se quiere identificar en el mismo disolvente y con la misma concentracin que los utilizados para la
Solucin de Prueba.
Solucin de PruebaPreparar segn se indica en la monografa individual correspondiente.
MTODO I
MTODO II
Solucin de ResolucinA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, preparar una solucin en
metanol que contenga 0,5 mg de ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP, 0,5 mg de ER Hiclato de Doxiciclina USP, 0,5 mg de
ER Oxitetraciclina USP y 0,5 mg de ER Clorhidrato de Tetraciclina USP por mL.
Fase MvilPreparar una mezcla de cido oxlico 0,5 M, previamente ajustado con hidrxido de amonio a un pH de 2,0,
acetonitrilo y metanol (80:20:20).
Placa CromatogrficaUtilizar una placa para cromatografa en capa delgada adecuada (ver Cromatografa en Capa Delgada en Cromatografa 621) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de slice octilsilanizada para cromatografa.
Activar la placa calentndola a 130 durante 20 minutos, dejar que se enfre y utilizarla mientras an est tibia.
ProcedimientoAplicar por separado 1 mL de la Solucin Estndar, 1 mL de la Solucin de Prueba y 1 mL de la Solucin de
Resolucin a la Placa para Cromatografa. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase Mvil
hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de
la cmara de desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores de
amonaco durante 5 minutos y localizar rpidamente las manchas en la placa observndola bajo luz UV de longitud de onda
larga: el cromatograma de la Solucin de Resolucin presenta manchas bien separadas y el valor RF, la intensidad y el aspecto de
la mancha principal obtenida de la Solucin de Prueba se corresponden con los de la mancha obtenida de la Solucin Estndar.
197 PRUEBAS DE IDENTIFICACIN ESPECTROFOTOMTRICA

Las pruebas espectrofotomtricas son las de mayor importancia en la identificacin de muchas de las sustancias qumicas del
compendio. Los procedimientos de prueba que se indican a continuacin se aplican a sustancias que absorben radiacin infrarroja (IR) y/o ultravioleta (UV) (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851).
El espectro de absorcin IR de una sustancia, en comparacin con el que se obtuvo concomitantemente para el Estndar de
Referencia USP correspondiente, proporciona quiz la evidencia ms concluyente de la identidad de la sustancia, que puede
Captulos
Solucin amortiguadora de pH 3,5 Disolver 13,4 g de cido ctrico anhidro y 16,3 g de fosfato dibsico de sodio en
1000 mL de agua y mezclar.
Fase MvilEl da de la prueba, mezclar 10 volmenes de cloroformo, 20 volmenes de nitrometano y 3 volmenes de
piridina.
Solucin de Prueba MezcladaMezclar volmenes iguales de la Solucin Estndar y de la Solucin de Prueba.
Hoja CromatogrficaTrazar una lnea de aplicacin a 2,5 cm de uno de los bordes de una hoja de papel de filtro, (Whatman No. 1, o equivalente) de 20 cm 20 cm. Impregnar la hoja pasndola a travs de una cuba con Solucin amortiguadora
de pH 3,5, eliminar el exceso de disolvente presionando con firmeza la hoja entre papeles secantes no fluorescentes.
ProcedimientoEn una cmara cromatogrfica adecuada preparada para cromatografa ascendente (ver Cromatografa
621), colocar Fase Mvil hasta una altura de 0,6 cm. Aplicar 2 mL de la Solucin Estndar, 2 mL de la Solucin de Prueba y 2 mL
de la Solucin de Prueba Mezclada a intervalos de 1,5 cm sobre la lnea de aplicacin de la Hoja Cromatogrfica. Dejar que la
hoja se seque parcialmente y, mientras an est hmeda, colocarla en la cmara cromatogrfica con el borde inferior en contacto con la Fase Mvil. Cuando el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente 10 cm, retirar la hoja de la cmara
y exponerla a vapores de amonaco. Examinar el cromatograma bajo luz UV de longitud de onda larga. Registrar las posiciones
de las manchas amarillas fluorescentes principales: el valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la Solucin de Prueba
y de la Solucin de Prueba Mezclada se corresponde con el de la mancha obtenida de la Solucin Estndar.
238 197 Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica / Pruebas Qumicas
USP 38
obtenerse en una sola prueba. El espectro de absorcin UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad. La conformidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorcin IR como con la absorcin UV, segn se indica
en una gran proporcin de monografas oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra
que se est examinando.
Captulos
ABSORCIN EN EL INFRARROJO
Se indican siete mtodos para la preparacin de muestras de prueba y Estndares de Referencia previamente secados para el
anlisis. La referencia 197K en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se mezcla ntimamente con
bromuro de potasio. La referencia 197M en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se muele finamente y se dispersa en aceite mineral. La referencia 197F en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se suspende pura entre placas adecuadas (por ejemplo, de cloruro de sodio o bromuro de potasio). La referencia 197S
significa que se prepara una solucin de concentracin especificada en el disolvente especificado en la monografa individual, y
que la solucin se examina en celdas de 0,1 mm, a menos que se especifique una longitud de paso diferente para las celdas en
la monografa individual. La referencia 197A significa que la sustancia que se est examinando est en contacto ntimo con
un elemento de reflexin interna para el anlisis de reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en ingls). La referencia
197E significa que la sustancia que se est analizando se presiona como una muestra muy delgada contra una placa adecuada para el microanlisis IR. La referencia 197D en una monografa significa que la sustancia que se est examinando se mezcla ntimamente con un material transparente para IR y se transfiere a un recipiente de muestra para anlisis por reflexin difusa
(DR, por sus siglas en ingls). Las tcnicas ATR 197A y 197E pueden usarse como mtodos alternativos para 197K,
197M, 197F y 197S cuando la prueba se realiza cualitativamente y los espectros del Estndar de Referencia se obtienen de
manera similar.
Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estndar de Referencia USP en el intervalo de aproximadamente 2,6 mm a 15 mm (3800 cm1 a 650 cm1) a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. El
espectro de absorcin IR de la preparacin obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las condiciones
especificadas para el Estndar de Referencia correspondiente, a menos que se especifique algo diferente, o que el Estndar de
Referencia se emplee sin secar, presenta mximos slo a las mismas longitudes de onda que el de una preparacin similar del
Estndar de Referencia USP correspondiente.
Las diferencias que pueden observarse en los espectros as obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo
cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851). Por lo tanto, a menos que se
especifique algo diferente en la monografa individual, continuar del siguiente modo. Si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estndar, disolver porciones iguales de la muestra de prueba y del Estndar de Referencia en volmenes
iguales de un disolvente apropiado, evaporar la solucin hasta sequedad en envases similares, bajo condiciones idnticas, y
repetir la prueba con los residuos.
ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA
La referencia 197U en una monografa significa que una solucin de prueba y una Solucin estndar se examinan espectrofotomtricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Disolver una porcin de la sustancia que se est examinando en el Medio especificado para obtener una solucin de prueba
que tenga la concentracin especificada en la monografa para Solucin. En forma similar, preparar una Solucin Estndar que
contenga el Estndar de Referencia USP correspondiente.
Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solucin de prueba y la Solucin Estndar. Calcular
los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios estn incluidos en una monografa individual. A menos que se
especifique algo diferente, las absorbancias indicadas para estos clculos son aquellas medidas a la absorbancia mxima, aproximadamente a la longitud de onda especificada en la monografa individual. Cuando la absorbancia se deba medir aproximadamente a la longitud de onda especificada en lugar de la mxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para
indicar un mnimo y un hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorcin. Los requisitos se cumplen si los
espectros de absorcin UV de la solucin de prueba y de la Solucin Estndar presentan mximos y mnimos a las mismas
longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o absorbancia estn dentro de los lmites especificados.
USP 38
Pruebas Qumicas / 201 Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada 239
201 PRUEBA DE IDENTIFICACIN POR CROMATOGRAFA EN CAPA

DELGADA
PROCEDIMIENTO GENERAL
El procedimiento descrito a continuacin tiene como fin verificar la identificacin de muchos frmacos farmacopeicos y de
sus formas farmacuticas correspondientes.
Preparar una solucin de prueba segn las indicaciones de la monografa individual correspondiente. En una placa para cromatografa en capa delgada adecuada, recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 0,25 mm (ver
Cromatografa 621), aplicar, en una lnea paralela al borde y aproximadamente a 2 cm, 10 mL de esta solucin y 10 mL de una
Solucin estndar; preparada a partir del Estndar de Referencia USP del frmaco que se quiere identificar, en el mismo disolvente y a la misma concentracin que para la solucin de prueba, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase mvil constituida por una mezcla
de cloroformo, metanol y agua (180:15:1), a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, hasta que el
frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cmara de
desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que el disolvente se evapore. A menos que se especifique algo diferente en
la monografa individual, localizar las manchas de la placa examinndolas bajo luz UV de longitud de onda corta. El valor RF de
la mancha principal obtenida a partir de la solucin de prueba se corresponde con el obtenido a partir de la Solucin estndar.
El procedimiento de cromatografa en capa delgada descrito a continuacin tiene como fin verificar la identificacin de los
ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina B y en sus formas farmacuticas cuando se encuentran presentes de
forma aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia 201BNP en una monografa indica que ste es el procedimiento a seguir.
Preparar una Solucin de Prueba segn se indica a continuacin, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual.
Solucin de Prueba
PARA FRMACOSDisolver una porcin de Bacitracina, Bacitracina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina B en
cido clorhdrico 0,1 N para obtener una solucin que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de neomicina (base) por mL, o 10 000 Unidades USP de Polimixina B por mL.
PARA SOLUCIONESSi la Solucin contiene neomicina y polimixina B, diluir una porcin de solucin con cido clorhdrico 0,1
N para obtener una solucin que contenga, aproximadamente, la cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL.
Si la Solucin contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una porcin de solucin con cido clorhdrico 0,1 N para obtener una solucin que contenga aproximadamente 10 000 Unidades USP de Polimixina B por mL.
PARA CREMAS, LOCIONES Y UNGENTOSSi la Crema, la Locin o el Ungento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, transferir
una porcin que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de Bacitracina a un tubo de centrfuga de 15 mL. Si la Crema, la Locin o el Ungento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni Bacitracina Cinc, transferir una porcin que
equivalga aproximadamente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrfuga de 15 mL. Agregar 4 mL de cloroformo al tubo de centrfuga y agitar bien para dispersar la Crema, la Locin o el Ungento. Agregar 1 mL de cido clorhdrico
0,1 N, mezclar en un mezclador por vrtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadante transparente.
NOTAEn el Procedimiento Modificado se puede usar la Solucin de Prueba Modificada preparada segn se indica a continuacin en lugar de la Solucin de Prueba.
Solucin de Bacitracina EstndarDisolver una porcin de ER Bacitracina Cinc USP en cido clorhdrico 0,1 N para obtener una solucin que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL.
Solucin de Neomicina EstndarDisolver una porcin de ER Sulfato de Neomicina USP en cido clorhdrico 0,1 N para
obtener una solucin que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL.
Solucin de Polimixina B EstndarDisolver una porcin de ER Sulfato de Polimixina B USP en cido clorhdrico 0,1 N
para obtener una solucin que contenga 10 000 Unidades USP de Polimixina B por mL. Si el artculo en anlisis tambin contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porcin de ER Sulfato de Polimixina B USP en cido clorhdrico 0,1N para
obtener una solucin que contenga 500J Unidades USP de Polimixina B por mL, donde J es el cociente entre las cantidades de
Unidades USP de Polimixina B y de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la etiqueta por g de Crema, Locin o Ungento.
Fase MvilPreparar una mezcla de metanol, alcohol isoproplico, cloruro de metileno, hidrxido de amonio y agua
(4:2:2:2:1,5).
ProcedimientoAplicar 10 mL de Solucin de prueba y 10 mL de cada una de las Soluciones Estndar que corresponda a una
placa para cromatografa en capa delgada adecuada (ver Cromatografa 621), recubierta con una capa de gel de slice para
cromatografa de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cmara cromatogrfica presaturada y desarrollar los cromato-
Captulos
PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, NEOMICINA Y POLIMIXINA B
240 201 Prueba de Identificacin por Cromatografa en Capa Delgada / Pruebas Qumicas
USP 38
gramas con la Fase Mvil hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la
placa. Retirar la placa de la cmara y secar a 105 durante 10 minutos. Rociar la placa con una solucin al 0,2% de ninhidrina
en alcohol butlico y calentarla a 105 durante 5 minutos. El valor RF de cada mancha principal en el cromatograma de la
Solucin de Prueba se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solucin Estndar que corresponda segn el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el cromatograma de la Solucin de Prueba
presenta demasiadas bandas, proceder segn se indica en el Procedimiento Modificado.
Procedimiento ModificadoTransferir la Solucin de Prueba a un tubo de centrfuga de 15 mL, agregar 10 mL de solucin
acuosa de cido pcrico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por vrtice durante 1 minuto, centrifugar durante 10
minutos y desechar el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL hasta que no se observe color amarillo
en el lavado. Desechar los lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrgeno a 50. Disolver el residuo en 1 mL de
acetona, agregar 1 mL de una solucin de cido sulfrico en acetona (1 en 100) recin preparada, agitar, centrifugar durante
5 minutos y desechar el sobrenadante. Enjuagar el residuo con 1 mL de acetona, centrifugar brevemente y desechar el lavado.
Repetir el lavado hasta que no se observe color amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitrgeno a 50. Disolver el
residuo en 0,5 mL de cido clorhdrico 0,1 N (Solucin de Prueba Modificada). Repetir el Procedimiento utilizando esta Solucin
de Prueba Modificada en lugar de la Solucin de Prueba. El valor RF de cada mancha principal en el cromatograma de la Solucin
de Prueba Modificada se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solucin
Estndar que corresponda segn el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta.
Captulos
PRUEBAS DE LMITE
206 ALUMINIO
El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido de aluminio (Al) no excede el lmite establecido en la monografa individual de una sustancia cuya etiqueta indica que est destinada a ser usada en hemodilisis. [NOTALas Preparaciones Estndar y la Preparacin de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario, para obtener soluciones de concentraciones
adecuadas adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.]
Diluyente de cido NtricoTransferir 40 mL de cido ntrico a un matraz volumtrico de 1000 mL y diluir a volumen con
agua.
Preparaciones EstndarTratar un alambre de aluminio con cido clorhdrico 6 N a 80 durante algunos minutos. Disolver aproximadamente 100 mg del alambre tratado, pesados con exactitud, en una mezcla de 10 mL de cido clorhdrico y 2
mL de cido ntrico calentando aproximadamente a 80 durante aproximadamente 30 minutos. Continuar el calentamiento
hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 4 mL. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 4 mL de agua. Evaporar
hasta aproximadamente 2 mL calentando. Enfriar y transferir esta solucin, con ayuda de agua, a un matraz volumtrico de
100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 10,0 mL de esta solucin a un segundo matraz volumtrico de 100
mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un tercer matraz volumtrico de 100 mL, diluir a
volumen con agua y mezclar. La concentracin de aluminio en esta Preparacin Estndar es aproximadamente 1,0 mg por mL.
Si se requiere una Preparacin Estndar ms diluida, transferir porciones de 1,0; 2,0 y 4,0 mL de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 100 mL, diluir a volumen con Diluyente de cido Ntrico y mezclar. Estas soluciones contienen 0,01 mg;
0,02 mg y 0,04 mg de Al por mL, respectivamente.
Preparacin de PruebaA menos que se indique algo diferente en la monografa correspondiente, transferir una cantidad
de la sustancia de prueba pesada con exactitud (en g), segn se indica en la monografa, a un matraz volumtrico de plstico
de 100 mL, agregar 50 mL de agua y someter a ultrasonido durante 30 minutos. Agregar 4 mL de cido ntrico, diluir a volumen con agua y mezclar.
ProcedimientoDeterminar las absorbancias de las Preparaciones Estndar y de la Preparacin de Prueba en la lnea de emisin del aluminio a 309,3 nm, con un espectrofotmetro de absorcin atmica adecuado (ver Espectrofotometra y Dispersin
de Luz 851), equipado con una lmpara de aluminio de ctodo hueco y un horno elctrico sin llama, empleando Diluyente de
cido Ntrico como blanco. Graficar las absorbancias de las Preparaciones Estndar en funcin del contenido de Al, en mg por
mL y trazar la lnea recta que mejor se ajuste a los tres puntos graficados. A partir del grfico as obtenido, determinar la cantidad, en mg, de Al en cada mL de la Preparacin de Prueba. Calcular la cantidad de Al en la muestra tomada, en mg por g,
multiplicando este valor por 100/W, donde W es el peso, en g, de la sustancia tomada para preparar la Preparacin de Prueba.
USP 38
Pruebas Qumicas / 207 Prueba para el derivado 1,6-anhidro 241
207 PRUEBA PARA EL DERIVADO 1,6-ANHIDRO DE ENOXAPARINA

SDICA
El siguiente procedimiento se usa para determinar los niveles de las formas 1,6-anhidro en la enoxaparina sdica. [NOTALa
prueba para el derivado 1,6-anhidro slo se realiza cuando se especifica en la monografa individual.]
INTRODUCCIN
Los disacridos especificados en este captulo general se listan por nombre y estructura en el Apndice 1; los oligosacridos se
listan en el Apndice 2.
La despolimerizacin de la heparina hasta enoxaparina sdica produce una conversin parcial pero caracterstica de glucosaminas en las terminales reductoras de las cadenas de oligosacridos con glucosamina 6-O sulfato terminal, produciendo derivados 1,6-anhidro (ver Figura 1).
Captulos
Figura 1. Estructura de la enoxaparina sdica que contiene un derivado 1,6-anhidro en el extremo reductor de la cadena.
El porcentaje de cadenas de oligosacridos que se encuentran cclicos en un anillo 1,6-anhidro es una caracterstica de la
enoxaparina sdica.
DESPOLIMERIZACIN DE ENOXAPARINA SDICA POR LAS HEPARINASAS Y

OLIGOSACRIDOS RESULTANTES
La valoracin involucra un anlisis de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls) de una solucin de enoxaparina sdica despolimerizada por una mezcla de heparinasas. Despus de la despolimerizacin enzimtica, los
residuos 1,6-anhidro principales de la enoxaparina sdica observados son el 1,6-anhidro DIIS, el 1,6-anhidro DIISepi, el 1,6-anhidro DIS y el 1,6-anhidro DISISepi (ver Apndice 2).
Las heparinasas no escinden completamente el tetrasacrido 1,6-anhidro DISISepi (forma de manosamina 2-O-sulfatada). Los
dos disacridos (el 1,6-anhidro DIIS y el 1,6-anhidro DIISepi), que generalmente coeluyen, tienen mala resolucin comparados
con DIIA (ver Apndice 1), especialmente porque este ltimo se presenta como dos anmeros: a y b . Para poder cuantificar el
1,6-anhidro DIIS y el 1,6-anhidro DIISepi, la muestra de enoxaparina sdica ya despolimerizada por las heparinasas se reduce
con borohidruro de sodio (ver Figura 2).
Figura 2. Reduccin de oligosacridos con borohidruro de sodio

La reduccin con borohidruro de sodio elimina el efecto anomrico
al abrir el anillo del oligosacrido terminal. Los
cuatro derivados 1,6-anhidro (ver Apndice 2) no se reducen con el borohidruro de sodio porque el puente 1,6-anhidro bloquea la apertura del anillo. La reduccin de los oligosacridos disminuye su tiempo de retencin, mientras que el tiempo de
retencin de los derivados 1,6-anhidro permanece inmutable. Por esa razn, es posible separar los dos compuestos, el 1,6anhidro DIIS y el 1,6-anhidro DIISepi, del pico del disacrido DIIA reducido. [NOTAEl 1,6-anhidro DIIS y el 1,6-anhidro DIISepi
eluyen como dos picos sin resolver y se cuantifican juntos como un solo compuesto, el 1,6-anhidro DIIS. Por lo tanto, con el
objeto de simplificar, la forma epimrica no se menciona en adelante.]
242 207 Prueba para el derivado 1,6-anhidro / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
PROCEDIMIENTO
Estndares de Referencia USP 11ER Enoxaparina Sdica USP.
Soluciones
Solucin ADisolver 0,280 g de fosfato monobsico de sodio en 950 mL de agua, ajustar con cido fosfrico a un pH de
3,0 y diluir con agua a 1000 mL.
Solucin BDisolver 140 g de perclorato de sodio en 950 mL de Solucin A, ajustar con cido fosfrico a un pH de 3,0 y
diluir con Solucin A a 1000 mL.
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A y Solucin B, filtradas y desgasificadas, segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0Disolver 10 mg de albmina srica bovina y 32 mg de acetato de calcio en
60 mL de agua. Agregar 580 mL de cido actico glacial y ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,0. Transferir a un
matraz volumtrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro con un tamao de poro de
0,45 mm o 0,22 mm.
Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0Disolver 68 mg de fosfato monobsico de potasio y 10 mg de albmina srica bovina en 30 mL de agua en un matraz volumtrico de 50 mL. Ajustar con hidrxido de potasio, si fuera necesario,
a un pH de 7,0 y diluir a volumen con agua. Pasar la solucin a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,45 mm o 0,22
mm.
Solucin de Borohidruro de SodioDisolver 12 mg de borohidruro de sodio en 400 mL de agua y mezclar en un mezclador
por vrtice. [NOTAPreparar inmediatamente antes de usar.]
Solucin de Heparinasa 1Disolver heparinasa 1 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [referencia: heparina liasa I, EC 4.2.2.7] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solucin con
una actividad de 0,4 UI por mL. Almacenar la solucin a 20 hasta el momento de su uso. [NOTALas soluciones de heparinasa se pueden almacenar durante 3 meses a 20.]
Solucin de Heparinasa 2Disolver heparinasa 2 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones [sin
nmero EC] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solucin con una actividad de 0,4 UI
por mL. Almacenar la solucin a 20 hasta el momento de su uso.
Solucin de Heparinasa 3Disolver heparinasa 3 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) [referencia: heparitinasa I, EC 4.2.2.8] en Solucin Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solucin con una
actividad de 0,4 UI por mL. Almacenar la solucin a 20 hasta el momento de su uso.
Solucin de Heparinasas 1, 2 y 3Preparar una mezcla 1:1:1 (v:v:v) de Solucin de Heparinasa 1, Solucin de Heparinasa 2 y
Solucin de Heparinasa 3.
Soluciones para Identificacin de los Picos[NOTALas soluciones de prueba y las Soluciones estndar despolimerizadas
se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones de prueba despolimerizadas son estables durante 1 mes a 20. Igualmente, las soluciones de prueba y las Soluciones estndar reducidas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones reducidas
tambin son estables durante 1 mes a 20.]
Soluciones de DisacridosPreparar por separado una solucin con 0,25 mg por mL de cada disacrido1 DIA, DIIA, DIIIA,
DIVA, DIS, DIIS, DIIIS, DIVS (ver Apndice 1). Inyectar en el cromatgrafo cada solucin de disacrido y registrar el cromatograma.
Soluciones de Disacridos ReducidosA 60 mL de cada Solucin de Disacrido, agregar 10 mL de Solucin de Borohidruro de
Sodio recin preparada. Mezclar en un mezclador por vrtice y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4
horas. Inyectar en el cromatgrafo cada solucin y registrar el cromatograma.
Solucin BlancoPreparar una mezcla de 20 mL de agua, 70 mL de Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 mL
de la Solucin de Heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversin y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un
bao de agua a 25. Preparar una mezcla de 60 mL de esta solucin despolimerizada con 10 mL de Solucin de Borohidruro de
Sodio recin preparada. Homogeneizar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. Inyectar en el
cromatgrafo la solucin resultante y registrar el cromatograma.
Solucin de Prueba 1Preparar dos soluciones, cada una con 20 mg de enoxaparina sdica en 1 mL de agua.
Solucin Estndar 1Preparar una solucin que contenga 20 mg de ER Enoxaparina Sdica USP en 1 mL de agua.
Solucin de Prueba 2Para cada solucin, preparar una mezcla de 20 mL de Solucin de Prueba 1, 70 mL de Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de pH 7,0 y 100 mL de la Solucin de Heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversin y dejar en
reposo durante al menos 48 horas en un bao de agua a 25. Despus de 48 horas de despolimerizacin, inyectar en el cromatgrafo la solucin y registrar el cromatograma.
Solucin Estndar 2 Preparar una mezcla de 20 mL de Solucin Estndar 1, 70 mL de Solucin de Acetato de Calcio y Sodio de
pH 7,0 y 100 mL de la Solucin de Heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente y dejar en reposo durante al menos 48 horas en un
bao de agua a 25. Despus de 48 horas de despolimerizacin, inyectar en el cromatgrafo la solucin y registrar el cromatograma.
1 Se pueden obtener disacridos adecuados de Grampian Enzymes (GE-H1001, GE-G1002, GE-H1003, GE-H1004, GE-H1005, GE-H1006, GE-H1007, GE-H1008),
Nisthouse, Harray, Orkney, KW17 2LQ, Reino Unido, Tel: 01856 771771, Scottish Local Authority: Orkney Islands.
USP 38
Solucin de Prueba 3Para cada solucin de prueba despolimerizada, preparar una mezcla de 60 mL de Solucin de Prueba 2
y 10 mL de Solucin de Borohidruro de Sodio recin preparada. Homogeneizar y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatgrafo. La Solucin de Prueba 3 es estable durante 48
horas a temperatura ambiente.
Solucin Estndar 3Preparar una mezcla de 60 mL de Solucin Estndar 2 y 10 mL de Solucin de Borohidruro de Sodio recin
preparada. Homogeneizar, mezclar en un mezclador por vrtice y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatura ambiente
durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatgrafo. La Solucin Estndar 3 es estable durante 48 horas a temperatura ambiente.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar el cromatgrafo de lquidos con un detector a 234 nm y una
columna de 3 mm 25 cm rellena con material L14 de 5 mm de. Se debe usar tambin una guarda columna rellena con el
mismo material. La velocidad de flujo es de 0,45 mL por minuto, la temperatura de la columna se mantiene a 50 y el volumen
de inyeccin es 10 mL. Programar el cromatgrafo del siguiente modo.
Tiempo
(minutos)
Solucin A (%)
Solucin B (%)
Elucin
020
9765
335
gradiente lineal
2050
650
35100
gradiente lineal
5060
100
6061
097
1003
6179
97
isocrtica
gradiente lineal para reequilibrio
isocrtica para reequilibrio
% 1,6-anhidro i (p/p) = (100 MWi Ai)/ S(MWx Ax)

en donde MWi y Ai son el peso molecular y el rea del pico i del 1,6-anhidro, respectivamente; y MWx y Ax son el peso molecular y el rea, respectivamente, del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retencin. [NOTAUna vez establecido
el mtodo, los picos pertenecientes a los diferentes disacridos y tetrasacridos se pueden identificar fcilmente por medio del
cromatograma del ER Enoxaparina Sdica USP. Por lo tanto, el uso de los Estndares de disacridos slo es necesario durante la
etapa de implementacin del mtodo.]
Calcular el porcentaje molar de los componentes que contienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su
cadena en la muestra de prueba de enoxaparina sdica de acuerdo con la siguiente frmula:
en donde MW es el peso molecular promedio en peso (ver prueba de Identificacin D en Enoxaparina Sdica); MWx y reax son
el peso molecular y el rea, respectivamente, del pico X o del intervalo X, especificados por su tiempo de retencin. El porcentaje molar de los componentes que tienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su cadena est entre 15% y
25%. En la Tabla 1 se proporcionan los tiempos de retencin y las masas moleculares tpicos atribuidos a las diferentes estructuras de oligosacridos.
Captulos
Inyectar en el cromatgrafo la Solucin de Prueba 3 reducida y la Solucin Estndar 3 reducida y registrar el cromatograma segn se indica en el Procedimiento.
Prueba de Aptitud de la DespolimerizacinEl cociente de rea entre los picos de 1,6-anhidro-DIS-IS y 1,6-anhidro DIS no es
mayor de 1,15 para la Solucin Estndar 2 despolimerizada.
Prueba de Aptitud del Desempeo de la ColumnaIdentificar los picos correspondientes al DIA reducido y al 1,6-anhidro-DIS
para la Solucin Estndar 3: el tiempo de retencin del DIS reducido est entre 27 y 33 minutos para la Solucin Estndar 3
despolimerizada y reducida; y la resolucin, R, entre el D1A reducido y el 1,6-anhidro-DIS no es menor de 1,5.
Prueba de Aptitud de la ReduccinEl cociente de rea entre los picos de disacrido DIS y DIS reducido en la Solucin Estndar 3 despolimerizada y reducida y la Solucin de Prueba 3 no es ms de 0,02%.
Procedimiento y ClculosInyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales de la Solucin de Prueba 3 reducida y
de la Solucin Estndar 3 reducida. Usar el mtodo de porcentaje de rea normalizada para el clculo. Los picos se integran
desde el pico de volumen muerto hasta el ltimo pico detectado. Medir el rea del pico de cada analito excluyendo los picos
de los disolventes al comienzo del cromatograma y en la Solucin Blanco. Usando los cromatogramas de las Soluciones de Disacridos Reducidos obtenidos previamente, identificar los picos pertenecientes a los ocho disacridos reducidos en los cromatogramas de la Solucin de Prueba 3 y la Solucin Estndar 3. Los picos pertenecientes al 1,6-Anhidro DIS, 1,6-Anhidro DIIS y 1,6-Anhidro DIS-ISepi se identifican a partir de los tiempos de retencin relativos proporcionados en la Tabla 1 y del Cromatograma
de referencia proporcionado con el ER Enoxaparina Sdica USP. Una vez identificados los picos, utilizar los valores en la Tabla 1
para calcular el porcentaje (p/p) de los tres principales derivados 1,6anhidro, obtenidos despus de la despolimerizacin de la
enoxaparina sdica, usando la siguiente frmula:
USP 38
Tabla 1. Tiempos de Retencin Relativos (tRR) y Masas Moleculares Tpicos Atribuidos a los Diferentes Compuestos*
Compuesto
DIVA reducido
DIVS reducido
DIIA reducido
1,6-Anhidro DIIS
DIIIA reducido
DIIS reducido
DIIIS reducido
Captulos
DIA reducido
1,6-Anhidro DIS
DIIA-IVSglu reducido
DIS reducido
Masa
Molecular
(daltones)
tRR
< 0,25
741
0,25
401
0,25 <tRR < 0,51
741
0,51
461
0,51 < tRR < 0,55
483
0,55
503
0,55 < tRR < 0,59
503
0,59
443
0,59 < tRR < 0,64
503
0,64
503
0,64 < tRR < 0,72
533
0,72
563
0,72 < tRR < 0,80
563
0,80
563
0,80 < tRR < 0,88
583
0,88
605
0,88 < tRR < 0,90
635
0,90
545
0,90 < tRR < 0,98
635
0,98
1066
0,98< tRR < 1,00
635
1,00
665
665
1,00< tRR < 1,04
DIS
1,04
665
1,04< tRR < 1,10
1228
DIIA-IISglu reducido
1,6-Anhidro DIS-IS
1,10
1168
1,10< tRR < 1,27
1228
1,27
1210
tRR > 1,27
1228
* Los tiempos de retencin relativos se obtuvieron con una partida de enoxaparina sdica despolimerizada y reducida. Se expresan con respecto al tiempo de
retencin del pico principal correspondiente al DIS reducido. Se debe tener en cuenta que los tiempos de retencin relativos pueden variar un poco, dependiendo de la calidad de la columna.
APNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACRIDOS ESTNDARES

DIVA
DUA-(14)a-GlcNAc
DIVS
DUA-(14)a-GlcN(NS)
USP 38
APNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACRIDOS ESTNDARES (Continuacin)

DUA-(14)a-GlcNAc(6S)
DIIIA
DUA-2S-(14)a-GlcNAc
DIIS
DUA-(14)a-GlcN (NS,6S)
DIIIS
DUA-2S-(14)a-GlcN (NS)
DIA
DUA-2S-(14)a-GlcNAc(6S)
DIS
UA-2S-(14)a-GlcN (NS,6S)
APNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACRIDOS

1,6-Anhidro DIS o
1,6-Anhidro DIS glucosa
1,6-Anhidro DIIS o
1,6-Anhidro DIIS glucosa
Captulos
DIIA
USP 38
APNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACRIDOS (Continuacin)

1,6-Anhidro DIIS epi o
1,6-Anhidro DIIS manosa
DIIA-IVSglu
Captulos
DIIA-IISglu
1,6-Anhidro DIS-IS epi

o
1,6-Anhidro DIS-IS manosa
208 VALORACIN DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR

IIa PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Y DE BAJO PESO
MOLECULAR
Este captulo provee informacin y procedimientos para determinar la actividad inhibitoria del factor Xa y la actividad inhibitoria del factor IIa (trombina) de las heparinas no fraccionadas (HNF) y heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIN
Las heparinas no fraccionadas y las heparinas de bajo peso molecular ejercen su efecto anticoagulante mediante la potenciacin de la actividad de los inhibidores de coagulacin del plasma. De todos los glicosaminoglicanos comnmente conocidos,
slo las HNF, las HBPM y el heparn sulfato (referidos en lo sucesivo como heparina) contienen una secuencia de pentasacridos especfica que puede unirse al inhibidor de coagulacin del plasma, la antitrombina (AT). Por lo tanto, se desarrollan valoraciones que dependen de la AT para asegurar la especificidad de los mtodos para medir la actividad anticoagulante de la
heparina. La unin de la heparina con la AT provoca un cambio de conformacin en la molcula de AT. Este cambio de conformacin incrementa la unin del complejo ATheparina con los factores activados de coagulacin, principalmente el factor IIa
(trombina) y el factor Xa, causando su inhibicin. Una vez que la AT ha sido activada por la secuencia de pentasacridos de la
heparina, sta interacta con los factores Xa y IIa mediante su bucle central reactivo. Para conseguir una inhibicin eficiente de
trombina, la molcula de heparina tambin debe unirse a la antritombina y al factor IIa. Dicha interaccin requiere un segmento extra de aproximadamente 13 monosacridos, acoplados al extremo no reductor de la secuencia de pentasacridos de la
heparina, que se une a la AT. Este segmento mnimo de la molcula de heparina necesario para inhibir la trombina con AT,
conocido como dominio C, tiene un peso molecular aproximado de 5400 Da. Aunque la potenciacin de la capacidad de la
antitrombina para inactivar el factor Xa tambin depende del peso molecular, las unidades adicionales de sacridos del dominio C no son esenciales, y una heparina con un peso molecular menor de 5400 Da puede potenciar la capacidad de la antitrombina para inactivar el factor Xa. Por convencin, el cociente de potencia entre el anti-factor Xa y el anti-factor IIa para
HNF es 1. La HNF es heterognea y polidispersa, pero contiene poco o ningn material con un peso molecular menor de 5400
USP 38
Pruebas Qumicas / 208 Valoracin de Actividad Anti-Factor 247
Da. Los pesos moleculares promedio de los productos de HBPM son menores que aqullos de las HNF, y contienen una proporcin mayor de material de peso molecular menor de 5400 Da. El cociente entre las potencias de anti-factor Xa y anti-factor
IIa para HBPM es mayor que 1,5. Este captulo describe procedimientos de valoracin para medir la actividad anti-factor Xa y
anti-factor IIa de las HBPM en presencia de AT.
En el sistema de prueba, la heparina se une a la AT, y el factor IIa o el factor Xa agregado a la mezcla se une al complejo de
heparinaAT. El factor IIa o factor Xa residual no inhibido por el complejo de heparinaAT se cuantifica mediante un sustrato
cromognico que es especfico para el factor IIa o el factor Xa y se agrega en la etapa final. Los analistas observan una relacin
inversa en la que una mayor cantidad de enzima residual produce ms color, lo cual equivale a una menor actividad de heparina.
Al igual que con cualquier valoracin enzimtica, la temperatura y el tiempo de la reaccin, el manejo adecuado de los reactivos y su orden de adicin representan aspectos crticos para el desempeo ptimo de la valoracin.
VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR IIa PARA HEPARINAS NO

FRACCIONADAS
Actividad Anti-Factor Xa para HNF
Captulos
El siguiente procedimiento se usar siempre que se especifique en las monografas individuales. Esta valoracin se puede llevar a cabo manualmente en tubos de plstico usando un bloque termosttico o un bao de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulacin con un lector y un coagulmetro automtico pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimiento.
Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver cantidades de tris(hidroximetil)aminometano, cido edtico o edetato sdico y cloruro de sodio en agua que contenga 0,1% de polietilenglicol 6000 para obtener soluciones con concentraciones 0,050
M, 0,0075 M y 0,175 M, respectivamente. Ajustar, si fuera necesario, con cido clorhdrico o solucin de hidrxido de sodio a
un pH de 8,4.
Solucin de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de
Reactivos) segn lo indicado por el fabricante y diluir esta solucin con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una
solucin con una concentracin de 1,0 UI de Antitrombina/mL.
Solucin de factor Xa: Reconstituir factor Xa bovino segn lo indicado por el fabricante (ver Factor Xa en Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solucin
que proporcione un valor de absorbancia de 0,651,25 a 405 nm cuando se valora segn se indica a continuacin, pero usando 30 mL de Solucin amortiguadora de pH 8,4 en lugar de 30 mL de las Soluciones estndar o de las Soluciones muestra. [NOTA
La Solucin de factor Xa contiene aproximadamente 3 unidades nanocatalticas/mL, pero puede variar dependiendo del fabricante del factor Xa o del sustrato usado.]
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para la prueba amidoltica (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) especfico para factor Xa en agua para obtener una
concentracin 1 mM.
Solucin de detencin: Solucin de cido actico al 20% (v/v)
Soluciones estndar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sdica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos 5 diluciones en el intervalo de concentracin de
0,030,375 Unidades USP de Heparina/mL.
Soluciones muestra: Disolver o diluir una cantidad medida con exactitud de Heparina Sdica en Solucin amortiguadora
de pH 8,4 y diluir con la misma solucin amortiguadora hasta obtener soluciones con actividades aproximadamente iguales a
las de las Soluciones estndar.
Anlisis: [NOTAEl procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas. Realizar la prueba con cada
Solucin estndar y Solucin muestra por duplicado.]
Transferir 120 mL de Solucin amortiguadora de pH 8,4 a cada una de las series de tubos de plstico adecuados colocados en
un bao de agua ajustado a 37. Luego, transferir por separado 30 mL de las diferentes diluciones de las Soluciones estndar o
de las Soluciones muestra a los tubos. Agregar 150 mL de Solucin de antitrombina, entibiada previamente a 37 durante 15
minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 mL de Solucin de factor Xa, entibiada previamente a
37 durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 mL de Solucin de sustrato cromognico, entibiada previamente a 37 durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante exactamente 2 minutos. Agregar
150 mL de Solucin de detencin a cada tubo y mezclar. Preparar un blanco para ajustar a cero el espectrofotmetro, agregando
los reactivos en el orden inverso, comenzando con la Solucin de detencin y finalizando con la adicin de 150 mL de Solucin
amortiguadora de pH 8,4, y omitiendo las Soluciones estndar o las Soluciones muestra. Registrar la absorbancia a 405 nm contra
el blanco. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoracin, siempre que las
proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Clculos: Graficar el logaritmo de los valores de absorbancia de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestra en funcin de las concentraciones de heparina, en Unidades USP. Calcular la actividad de heparina sdica, en Unidades USP/mg,
usando mtodos estadsticos para anlisis de razn de pendientes. Calcular la actividad antifactor Xa de la heparina sdica:
248 208 Valoracin de Actividad Anti-Factor / Pruebas Qumicas
USP 38
A (ST/SS)
A = potencia del ER Heparina Sdica para Valoraciones USP
ST = pendiente de la recta de las Soluciones muestra
SS = pendiente de la recta de las Soluciones estndar
Expresar la actividad anti-factor Xa de la Solucin muestra como Unidades USP de Heparina/mg, calculada con respecto a la
sustancia seca. Calcular el cociente de la actividad anti-factor Xa en funcin de la potencia anti-factor IIa (ver la Valoracin a
continuacin):
actividad anti-factor Xa/potencia anti-factor IIa
Criterios de aceptacin: 0,91,1
Captulos
Actividad Anti-Factor IIa para Heparinas No Fraccionadas

Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver 6,10 g de tris(hidroximetil)aminometano, 10,20 g de cloruro de sodio, 2,80
g de edetato sdico y, si fuera adecuado, 010,00 g de polietilenglicol 6000 y/o 2,00 g de albmina srica bovina en 800 mL
de agua. [NOTASe pueden usar 2,00 g de albmina humana en lugar de 2,00 g albmina srica bovina.] Ajustar con cido
clorhdrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 1000 mL.
Solucin de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de
Reactivos) en agua para obtener una solucin de 5 UI de Antitirombina/mL. Diluir esta solucin con Solucin amortiguadora de
pH 8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de 0,125 UI de Antitrombina/mL.
Solucin de trombina humana: Reconstituir trombina humana (factor IIa) (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solucin de 20 UI de Trombina/mL y diluir con Solucin amortiguadora de pH
8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de 5 UI de Trombina/mL. [NOTALa trombina debe tener una actividad especfica de no menos de 750 UI/mg.]
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico de trombina adecuado para prueba amidoltica (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) en agua para obtener una concentracin
1,25 mM.
Solucin de detencin: Solucin de cido actico al 20% (v/v)
Soluciones estndar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sdica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentracin
de 0,0050,03 Unidades USP de Heparina/mL.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de Heparina Sdica
similares a las obtenidas para las Soluciones estndar.
Anlisis: [NOTAEl procedimiento tambin se puede realizar usando plataformas alternativas.] Para cada una de las diluciones de las Soluciones estndar y de las Soluciones muestra, se deben analizar al menos muestras por duplicado. Etiquetar un
nmero adecuado de tubos dependiendo del nmero de determinaciones repetidas a analizar. Por ejemplo, si se van a usar
cinco blancos: B1, B2, B3, B4 y B5 para los blancos; T1, T2, T3 y T4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y S1, S2, S3 y S4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones estndar. Distribuir
los blancos sobre las series de manera que representen exactamente el comportamiento de los reactivos durante los experimentos. [NOTATratar los tubos en el siguiente orden: B1, S1, S2, S3, S4, B2, T1, T2, T3, T4, B3, T1, T2, T3, T4, B4, S1, S2,
S3, S4, B5.] Cabe destacar que despus de cada adicin de un reactivo, la mezcla de incubacin se debe mezclar evitando la
formacin de burbujas. Agregar el doble del volumen (100200 mL) de Solucin de antitrombina a cada tubo que contenga un
volumen (50100 mL) de Solucin amortiguadora de pH 8,4 o de una dilucin apropiada de las Soluciones muestra o de las
Soluciones estndar. Mezclar evitando la formacin de burbujas. Incubar a 37 durante al menos 1 minuto. Agregar a cada tubo 2550 mL de Solucin de trombina humana e incubar durante al menos 1 minuto. Agregar 50100 mL de Solucin de sustrato
cromognico. Es importante destacar que todos los reactivos, Soluciones estndar y Soluciones muestra deben entibiarse previamente a 37 justo antes de su uso. Se puede aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la
valoracin, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Se pueden registrar dos tipos de mediciones diferentes:
1. Medicin del Punto Final: Detener la reaccin despus de al menos 1 minuto con 50100 mL de Solucin de detencin.
Medir la absorbancia de cada solucin a 405 nm usando un espectrofotmetro adecuado (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851). La desviacin estndar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
2. Medicin Cintica: Seguir el cambio en la absorbancia para cada solucin durante 1 minuto a 405 nm usando un espectrofotmetro adecuado (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851). Calcular el cambio en la absorbancia/min (DOD/
min). Los blancos para la medicin cintica tambin se expresan en DOD/min y deben proporcionar los valores ms altos
debido a que se realizan en ausencia de heparina. La desviacin estndar relativa es menos de 10% para las lecturas del
blanco.
Clculos: Se pueden usar los modelos estadsticos de Mtodo de razn de pendientes o Mtodo de lneas paralelas dependiendo de qu modelo describa mejor la correlacin entre concentracin y respuesta.
USP 38
Pruebas Qumicas / 208 Valoracin de Actividad Anti-Factor 249
Mtodo de razn de pendientes: Para cada una de las series, calcular la regresin del logaritmo de absorbancia o el logaritmo del cambio en la absorbancia/minuto en funcin de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones
estndar, y calcular la potencia de heparina sdica en Unidades USP/mL, usando mtodos estadsticos para los mtodos de
razn de pendientes. Expresar la potencia de heparina sdica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Mtodo de lneas paralelas: Para cada una de las series, calcular la regresin de la absorbancia o el cambio en la absorbancia/minuto en funcin del logaritmo de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estndar, y calcular
la potencia de heparina sdica, en Unidades USP/mL, usando mtodos estadsticos para mtodos de lneas paralelas. Expresar
la potencia de heparina sdica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Criterios de aceptacin: La potencia de heparina sdica, calculada con respecto a la sustancia seca, es no menos de 180
Unidades USP de Heparina en cada mg.
Estndares de Referencia USP 11: ER Heparina Sdica para Valoraciones USP
VALORACIONES DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR IIa PARA HEPARINAS DE

BAJO PESO MOLECULAR
El siguiente procedimiento se usar siempre que se especifique en las monografas individuales. Esta valoracin se puede llevar a cabo manualmente en tubos de plstico usando un bloque termosttico o un bao de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulacin con un lector y un coagulmetro automtico pueden mejorar la reproducibilidad y el rendimiento. Se usa solucin de cido actico (solucin de detencin) para la valoracin manual y en placa de microtitulacin. Los coagulmetros automticos miden la velocidad cintica inicial y, por consiguiente, no es necesario detener la reaccin.
Solucin de cido actico: cido actico glacial y agua (42:58)

Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g
de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Agregar 1,0 g de polietilenglicol 6000 10,0 g de albmina srica bovina, ajustar con
cido clorhdrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 mL.
Solucin amortiguadora de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en
500 mL de agua. Ajustar con cido clorhdrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 mL.
Solucin amortiguadora de pH 8,4: Disolver 3,03 g de tris(hidroximetil)aminometano, 5,12 g de cloruro de sodio y 1,40
g de edetato sdico en 250 mL de agua. Ajustar con cido clorhdrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 500 mL.
Solucin de antitrombina humana: Reconstituir un vial de antitrombina humana (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solucin que contenga 5 Unidades de Antitrombina por mL. Diluir
esta solucin con Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin con una concentracin
de 1,0 Unidad de Antitrombina/mL.
Solucin de factor Xa: Reconstituir una cantidad pesada con exactitud de factor Xa bovino (ver Reactivos, Indicadores y
SolucionesEspecificaciones de Reactivos) segn se indica en las instrucciones del fabricante. Diluir esta solucin madre con Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin que proporcione un incremento en el valor
de absorbancia a 405 nm de no ms de 0,20 unidades de absorbancia/min o 0,8 unidades de absorbancia despus de 4 minutos de incubacin con el sustrato cromognico cuando se valora segn se describe a continuacin, pero usando como un volumen apropiado, V, el volumen, en mL, de Solucin amortiguadora de pH 7,4 en lugar de V mL de la solucin estndar o la solucin muestra.
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para prueba amidoltica (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) para factor Xa en agua para obtener una concentracin
aproximadamente 3 mM. Diluir con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de
0,5 mM. [NOTACalentar previamente los reactivos a 37 1 15 minutos antes de su uso.]
Soluciones estndar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biolgicas USP con agua destilada y luego diluir con Solucin amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al menos
cuatro diluciones en el intervalo de concentracin de 0,0250,2 Unidades USP de anti-factor Xa/mL.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estndar.
Anlisis
Muestras: Soluciones estndar, Soluciones muestra, Solucin de antitrombina humana, Solucin amortiguadora de pH 7,4, Solucin de factor Xa, Solucin de sustrato cromognico y Solucin de cido actico
Etiquetar 18 tubos adecuados: B1 y B2 para los blancos; T1, T2, T3 y T4 cada uno por duplicado para las diluciones de las
Soluciones muestra; y S1, S2, S3 y S4 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones estndar. [NOTATratar los
tubos en el orden siguiente: B1, S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4, T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4, B2.] Agregar a cada tubo 50 mL
de Solucin de antitrombina humana y un volumen igual, V, de la Solucin amortiguadora de pH 7,4 (Blanco) o de una dilucin
apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estndar. Mezclar evitando la formacin de burbujas. Incubar a 37 durante al menos 1,0 minuto. Agregar a cada tubo 100 mL de Solucin de factor Xa e incubar durante 1,0 minuto. Agregar 250 mL
de Solucin de sustrato cromognico. Detener la reaccin despus de aproximadamente 4,0 minutos con 250 mL de Solucin de
Captulos
Actividad Anti-Factor Xa para Heparinas de Bajo Peso Molecular
250 208 Valoracin de Actividad Anti-Factor / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
cido actico. Medir la absorbancia de cada solucin a 405 nm usando un espectrofotmetro adecuado (ver Espectrofotometra
y Dispersin de Luz 851). Usar cubetas de cuarzo o de poliestireno desechables. Se puede aumentar o reducir el volumen de
los reactantes para ajustarse al formato de la valoracin, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la
muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Aptitud del sistema: La valoracin es vlida si se cumplen los siguientes requisitos:
1. Una solucin blanco proporciona un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no ms de 0,20 unidades de
absorbancia/min (o un total de 0,8 unidades de absorbancia) cuando se valora usando un volumen apropiado (50 mL) de
Solucin amortiguadora de pH 7,4 en lugar de 50 mL de la Solucin estndar o de la Solucin muestra.
2. La lectura del blanco B2 no difiere en ms de 0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco B1.
Clculos: Para esta valoracin biolgica, se pueden aplicar anlisis de lneas paralelas o de razn de pendientes.
Calcular la potencia de la muestra de prueba, en Unidades USP de anti-factor Xa/mL, usando un modelo estadstico para
lneas paralelas, graficando la absorbancia en funcin de las concentraciones logartmicas de las Soluciones muestra y de las
Soluciones estndar. En algunos casos, la transformacin logartmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad para las curvas de dosisrespuesta. La valoracin es vlida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptacin
para regresin, linealidad y paralelismo, conforme a lo requerido para el mtodo de lneas paralelas. Para el anlisis de razn de
pendientes, graficar la absorbancia en funcin de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estndar. En
algunos casos, la transformacin logartmica de la absorbancia puede ser necesaria para obtener la linealidad de las curvas de
dosisrespuesta. La valoracin es vlida cuando los datos cumplen con los criterios de aceptacin para regresin, linealidad y
ordenada al origen comn, conforme a lo requerido para el mtodo de razn de pendientes (ver Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111 y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 1034).
Expresar la actividad anti-factor Xa de la muestra/mg, calculada con respecto a la sustancia seca:
Unidades USP de Anti-factor Xa/mg = [potencia del estndar
(Unidades USP/mL) cociente de potencia]/[concentracin de la muestra (mg/mL)]
Actividad Anti-Factor IIa para Heparinas de Bajo Peso Molecular

Solucin de cido actico, Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4, Solucin amortiguadora de pH
7,4, Solucin amortiguadora de pH 8,4 y Solucin de antitrombina humana: Proceder segn se indica en Actividad AntiFactor Xa, excepto que la concentracin de la Solucin de antitrombina humana es 0,5 Unidades de Antitrombina/mL.
Solucin de trombina humana: Reconstituir trombina (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) en agua y diluir con Solucin amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solucin con una concentracin de 5 Unidades de Trombina/mL. Usar la Solucin de trombina humana inmediatamente despus de su preparacin.
Solucin de sustrato cromognico: Preparar una solucin de un sustrato cromognico adecuado para la prueba amidoltica (ver Reactivos, Indicadores y SolucionesEspecificaciones de Reactivos) para trombina en agua para obtener una concentracin aproximadamente 3 mM. Diluir inmediatamente antes de su uso con Solucin amortiguadora de pH 8,4 hasta 0,5 mM.
Soluciones estndar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biolgicas USP con agua destilada y diluir con Solucin amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al menos cuatro
diluciones en el intervalo de concentracin de 0,0150,075 Unidades USP de actividad de anti-factor IIa/mL.
Soluciones muestra: Proceder segn se indica en Soluciones estndar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estndar.
Procedimiento: Proceder segn se indica en Actividad Anti-Factor Xa, pero usar Solucin de trombina humana en lugar de
Solucin de factor Xa y usar la Solucin de antitrombina humana segn se describi anteriormente.
Aptitud del sistema: La valoracin es vlida si se cumple el siguiente requisito:
1. La lectura del blanco B2 no difiere en ms de 0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco B1.
Clculos: Proceder segn se indica en el clculo de Actividad Anti-Factor Xa.
Estndares de Referencia USP 11: ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biolgicas USP
209 DETERMINACIONES DE PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO
MOLECULAR
Este captulo provee procedimientos usados para determinar la distribucin del peso molecular (PM) y el peso molecular promedio en peso para heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIN
Las heparinas de bajo peso molecular se preparan a partir de Heparina Sdica USP mediante despolimerizacin parcial. Las
heparinas de bajo peso molecular son polidispersas, es decir, estn compuestas por cadenas de polisacrido con una variedad de pesos moleculares. La distribucin del peso molecular es una caracterstica definitoria para cada producto de heparinas de bajo peso molecular. La USP contiene monografas especficas para productos de heparinas de bajo peso molecular,
incluyendo lmites sobre los parmetros de distribucin del peso molecular.
USP 38
Pruebas Biolgicas / 209 Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas 251
La mayora de las tcnicas para la determinacin de la distribucin del peso molecular de heparinas de bajo peso molecular
utilizan cromatografa de permeacin en gel (GPC, por sus siglas en ingls), en ocasiones referida como cromatografa de
exclusin por tamao (SEC, por sus siglas en ingls). Para derivar la distribucin del peso molecular de una muestra de heparina de bajo peso molecular a partir de un cromatograma, es necesario conocer la relacin entre el tiempo de retencin y el
peso molecular. Este captulo describe un mtodo de GPC en el cual la calibracin se llev a cabo usando el Estndar de
Referencia (ER) Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP. Esta preparacin es un Estndar individual polidisperso cuya distribucin de pesos moleculares se describe en forma de una Tabla Estndar de Amplio Rango
(Broad Standard Table) (ver el Certificado USP para el ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular
USP) que lista el logaritmo del peso molecular (log PM) de varios puntos de referencia y las fracciones porcentuales correspondientes en peso del calibrador superiores o inferiores a estos puntos de referencia. La Tabla Estndar de Amplio Rango se
usa junto con un cromatograma del calibrador para ajustar una funcin adecuada, en este caso, un polinomio de tercer orden, a la relacin entre el log PM y el tiempo de retencin, con lo que se genera una curva de calibracin para el sistema
cromatogrfico. Con esta curva de calibracin, el analista calcula el peso molecular promedio en peso y los parmetros de
distribucin a partir del cromatograma de una muestra de heparina de bajo peso molecular.
Todos los clculos descritos en este captulo se pueden realizar usando un programa de hoja de clculo, aunque dicho mtodo
no se recomienda debido a que es laborioso y est abierto a error humano. El software patentado capaz de automatizar la
calibracin y los clculos de peso molecular se puede obtener de diversos fabricantes de sistemas cromatogrficos.
1 El mtodo fue validado usando una guarda columna TSK SWXL de 6 mm 4 cm; 7 mm en serie con dos columnas analticas: TSK G3000 SWXL de 7,8-mm 30
cm; 5 mm en serie con una columna TSK G2000 SWXL de 7,8 mm 30 cm; 5 mm.
Captulos
PROCEDIMIENTO
MEDICIONES DEL PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR MEDIANTE CROMATOGRAFA DE PERMEACIN EN
GEL
El siguiente procedimiento, con cualquier variacin necesaria, se usa cuando as se especifique en las monografas individuales.
Solucin madre de acetato de amonio: Acetato de amonio 1 M en agua
Solucin de azida sdica: Azida sdica al 1% (p/v) en agua
Fase mvil: Transferir 100 mL de Solucin madre de acetato de amonio a un matraz volumtrico de 1 L, agregar 20 mL de
Solucin de azida sdica y diluir con agua a volumen. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamao de poro de
0,45 mm antes de su uso.
Solucin de calibracin: Agregar 2 mL de Fase mvil a un vial que contenga ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamao de poro de 0,45 mm antes de su uso.
Solucin muestra: 5 mg/mL de muestra de heparina de bajo peso molecular en Fase mvil. Filtrar usando una membrana
de nailon con un tamao de poro de 0,45 mm.
Solucin de aptitud del sistema: 5 mg/mL de ER Dalteparina Sdica USP en Fase mvil. Filtrar usando una membrana de
nailon con un tamao de poro de 0,45 mm.
[NOTASe debe ajustar la temperatura del detector de ndice de refraccin a la misma temperatura que la Temperatura de la
columna.]
Modo: HPLC
Detector: ndice de refraccin
Columnas
Guarda columna: 6 mm 4 cm; relleno L59 de 7 mm
Analtica: 7,8 mm 30 cm; relleno L59 de 5 mm en serie con una columna de 7,8 mm 30 cm; relleno L59 de 5 mm1
Equilibracin de las columnas: 0,5 mL/min durante al menos 2 horas
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de aptitud del sistema
Resolucin: Existe una resolucin en la lnea base entre el ltimo pico del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP y el pico de sal, o picos de intercambio negativos.
Curva de calibracin: El coeficiente de determinacin de la curva de calibracin ajustado a los valores de la Tabla Estndar de Amplio Rango deben ser no menos de 0,990, cuando se usa una ecuacin polinmica de tercer orden.
Peso molecular promedio en peso (Mw): Tomar la media del Mw calculado mediante inyecciones por duplicado de la
Solucin de aptitud del sistema y redondear con una aproximacin de 50 Da. El sistema cromatogrfico es adecuado si el
Mw del ER Dalteparina Sdica USP est dentro de 150 Da del valor declarado segn lo indicado en el Certificado USP del
ER Dalteparina Sdica USP.
Anlisis
252 209 Determinaciones de Peso Molecular de Heparinas / Pruebas Biolgicas
USP 38
Muestras: Inyectar 20 mL de la Solucin de calibracin (una sola inyeccin), la Solucin de aptitud del sistema (por duplicado) y la Solucin muestra (por duplicado), y registrar los cromatogramas durante el tiempo necesario para asegurar la elucin completa, incluyendo los picos de sal y disolvente (aproximadamente 50 minutos).
[NOTAEl calibrador, el Estndar o la muestra de heparina de bajo peso molecular presentar un pico ancho a un tiempo entre
aproximadamente 25 y 45 minutos, seguido por un pico agudo de sal de elucin tarda, segn se ilustra en el Certificado
USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP.]
Clculos: Calcular el rea total bajo el pico de heparina de bajo peso molecular a partir de la Solucin de calibracin y el
rea acumulativa en cada punto debajo del pico como porcentaje del total. No incluir el pico de sal. Usando la Tabla Estndar de Amplio Rango provista en el Certificado USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso
Molecular USP, identificar aquellos puntos en el cromatograma para los que el rea acumulativa porcentual sea la ms
cercana a las fracciones porcentuales listadas en la Tabla Estndar de Amplio Rango y asignar el peso molecular (MW, por
sus siglas en ingls) en esta Tabla al tiempo de retencin correspondiente (RT, por sus siglas en ingls) en el cromatograma. Para el conjunto de tiempos de retencin y pesos moleculares identificados, ajustar el log(PM) en funcin del tiempo
de retencin (TR) a una funcin polinmica de tercer orden usando un software adecuado para cromatografa de permeacin en gel o encontrar los valores de a, b, c y d de modo que log PM = a + (b TR) + [c (TR)2] + [d (TR)3].
Usando el mismo software para GPC, para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solucin de aptitud del sistema
y de la Solucin muestra, y con la funcin de calibracin obtenida segn se describi anteriormente, calcular Mw:
Captulos
Mw = S(RIi Mi)/SRIi
RIi = respuesta del detector en cada punto
Mi = PM en cada punto
Redondear el valor de la media de Mw con una aproximacin de 50 Da. Usando el mismo software para GPC, determinar
para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solucin muestra el porcentaje de producto con peso molecular
segn lo indicado en la monografa del producto.
Criterios de aceptacin: Segn se indican en la monografa.
ER Dalteparina Sdica USP
ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP
USP38
211 ARSNICO
Este procedimiento est diseado para determinar la presencia de trazas de arsnico (As) convirtiendo el arsnico en las sustancias en anlisis en arsina, la cual se pasa luego a travs de una solucin de dietilditiocarbamato de plata y forma un complejo de color rojo. El color rojo producido de esta manera se compara, en forma visual o espectrofotomtrica, con el color producido de manera similar en un control que contiene una cantidad de arsnico que equivale al lmite especificado en la monografa individual. Los lmites se establecen en trminos de arsnico (As). El contenido de arsnico no debe exceder el lmite
indicado en la monografa individual.
Existen 2 mtodos que slo difieren en el tratamiento preliminar de la sustancia de prueba y del estndar. Por lo general, el
Mtodo I se usa para materiales inorgnicos en tanto que el Mtodo II se utiliza para los materiales orgnicos.
Aparato
El aparato (ver la Ilustracin) consta de un generador de arsina (a) equipado con una unidad depuradora (c) y un tubo de
absorcin (e) con juntas cnicas estndar o juntas de rtula esfrica de vidrio esmerilado (b y d) entre las unidades. No obstante, se puede usar cualquier otro aparato adecuado cuyo principio de funcionamiento sea el mismo que el del aparato descrito
e ilustrado.
Solucin Madre de Trixido de ArsnicoDisolver 132,0 mg de trixido de arsnico, previamente secados a 105 durante una hora y pesados con exactitud, en 5 mL de solucin de hidrxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumtrico de 1000
mL. Neutralizar la solucin con cido sulfrico 2 N, agregar 10 mL ms de cido sulfrico 2 N y luego llevar a volumen con
agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Solucin Estndar de ArsnicoTransferir 10,0 mL de la Solucin Madre de Trixido de Arsnico a un matraz volumtrico
de 1000 mL, agregar 10 mL de cido sulfrico 2 N, llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Cada mL de la Solucin Estndar de Arsnico contiene el equivalente a 1 mg de arsnico (As). Conservar esta solucin en un
recipiente que sea totalmente de vidrio y usarla durante los tres das posteriores a su preparacin.
Pruebas Qumicas / 211 Arsnico 253
USP 38
Aparato para la Prueba de Arsnico
Preparacin EstndarPipetear 3,0 mL de la Solucin Estndar de Arsnico y transferir a un matraz generador. Diluir con
agua hasta obtener un volumen de 35 mL.
Preparacin de PruebaExcepto que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir al matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada, por la frmula:
3,0/L
en donde L es el lmite de arsnico en ppm; disolver en agua y diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 mL.
ProcedimientoTratar la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba de la misma manera, tal como se describe a continuacin. Agregar 20 mL de cido sulfrico 7 N, 2 mL de yoduro de potasio SR y 0,5 mL de solucin cida de cloruro estannoso
concentrada SR y 1 mL de alcohol isoproplico, y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Rellenar el tubo depurador (c) con dos trozos de algodn previamente impregnados con solucin saturada de acetato de plomo,
exprimidos para eliminar el exceso de solucin y secados al vaco a temperatura ambiente, dejando un pequeo espacio de 2
mm entre los dos trozos de algodn. Lubricar las juntas (b y d) con una grasa adecuada para llaves de paso, apropiada para
usarse con disolventes orgnicos y conectar la unidad depuradora al tubo de absorcin (e). Transferir 3,0 mL de dietilditiocarbamato de plata SR al tubo de absorcin. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla N 20) a la mezcla del matraz y conectar
inmediatamente la unidad depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrgeno y el desarrollo de color a temperatura ambiente durante 45 minutos, agitando el matraz por rotacin moderada cada 10 minutos. Desconectar el tubo de
absorcin de la unidad depuradora y del matraz generador y transferir la solucin absorbente a celdas de absorcin de 1 cm.
La coloracin roja producida por la Preparacin de Prueba no exceder la producida por la Preparacin Estndar. Si fuera necesario o conveniente, determinar la absorbancia a la longitud de onda de mxima absorcin entre 535 nm y 540 nm con un
espectrofotmetro o colormetro adecuado, usando dietilditiocarbamato de plata SR como blanco.
Sustancias Qumicas InterferentesLos metales o las sales de metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno, nquel, paladio y plata, pueden interferir con la formacin de arsina. El antimonio, que forma estibina, produce una interferencia positiva en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR. Cuando se sospecha la presencia de antimonio, el color rojo que se produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede compararse a la longitud de
onda de mxima absorcin entre 535 nm y 540 nm con un colormetro apropiado, ya que a esta longitud de onda la interferencia debida a la estibina es inapreciable.
MTODO II
NOTAS
(1) PrecaucinAlgunas sustancias pueden reaccionar en forma de explosiones violentas cuando se digieren con perxido de hidrgeno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento.
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halgenos, calentar las muestras con cido sulfrico a una temperatura ms
baja evitando que la mezcla entre en ebullicin y agregar cuidadosamente el perxido de hidrgeno antes de que tenga lugar
la carbonizacin para prevenir la prdida de arsnico trivalente.
Captulos
MTODO I
254 211 Arsnico / Pruebas Qumicas
USP 38
(3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y comienza a carbonizarse con 5 mL de cido sulfrico antes
de calentarse, se deber usar en su lugar 10 mL de cido sulfrico diluido fro (1 en 2) y agregar algunas gotas de perxido de
hidrgeno antes de calentar.
Preparacin EstndarPipetear 3,0 mL de Solucin Estndar de Arsnico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de
cido sulfrico, mezclar y agregar la cantidad total de perxido de hidrgeno al 30 por ciento empleado en la Preparacin de
Prueba. Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se enfre, agregar cuidadosamente 10 mL de agua
y volver a calentar hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este procedimiento con otros 10 mL de agua para
eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Enfriar y diluir con agua hasta obtener 35 mL.
Preparacin de PruebaExcepto que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir un matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la frmula:
Captulos
3,0/L
en donde L es el lmite de arsnico en ppm. Agregar 5 mL de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campana de extraccin, preferentemente en una placa de calentamiento, y a una temperatura de no ms de 120, hasta que se inicie
la carbonizacin. (Agregar ms cido sulfrico si fuera necesario para humedecer completamente algunas muestras pero teniendo en cuenta que el volumen total agregado no puede exceder de 10 mL.) Agregar cuidadosamente, gota a gota, perxido de hidrgeno al 30%, y dejar que la reaccin disminuya y calentar nuevamente entre una y otra gota. Agregar las primeras
gotas muy lentamente mezclando lo suficiente para evitar una reaccin rpida. Interrumpir el calentamiento si se produce excesiva espuma. Cuando la reaccin ha terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasionalmente para evitar que
algunas porciones de la muestra queden adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de calentamiento. Mantener
las condiciones de oxidacin en todo momento durante la digestin agregando pequeas cantidades de la solucin de perxido de
hidrgeno cada vez que la mezcla se torne de color marrn o se oscurezca. Continuar la digestin hasta que la materia orgnica se
destruya, aumentando gradualmente la temperatura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante humo
de trixido de azufre y la solucin se vuelva incolora o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar cuidadosamente 10 mL de agua, mezclar y volver a evaporar hasta que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento para
eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Enfriar, agregar cuidadosamente 10 mL de agua, lavar las paredes del matraz con algunos mL de agua y diluir con agua a 35 mL.
ProcedimientoProceder segn se indica en el Procedimiento en el Mtodo I.
Sustancias Qumicas InterferentesVer Sustancias Qumicas Interferentes en Mtodo I.
221 CLORUROS Y SULFATOS

Las siguientes pruebas de lmites se utilizan como procedimientos generales en aquellos casos en que se especifican los lmites de cloruros y sulfatos en las monografas individuales.
Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que tengan el mismo dimetro y sean tan semejantes en las
restantes caractersticas como sea posible (ver Comparacin Visual en Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851). Emplear las
mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solucin en anlisis como para la solucin control que contiene el
volumen especificado de cloruro o sulfato. Si, despus de la acidificacin, la solucin no queda totalmente transparente, filtrarla a travs de un papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante, nitrato de plata SR o cloruro de bario SR,
segn sea necesario, a la solucin de prueba y a la solucin de control en secuencia inmediata.
En aquellos casos en que la monografa individual indique la realizacin de la prueba sobre un volumen especfico de una
solucin de la sustancia y el lmite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20 mL o menos de cido clorhdrico 0,020 N o de
cido sulfrico 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solucin sin dilucin adicional. En tales casos, mantener las
mismas relaciones de volumen para la solucin de control y para la solucin en anlisis. Cuando se realiza la prueba a sales de
metales pesados, que muestran normalmente una reaccin cida, omitir la acidificacin y no neutralizar la solucin. Disolver
las sales de bismuto en unos pocos mL de agua y 2 mL de cido ntrico antes del tratamiento con el agente precipitante.
ClorurosDisolver la cantidad especificada de la sustancia en anlisis en 30 mL a 40 mL de agua o, si la sustancia ya est
en solucin, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solucin al
tornasol con cido ntrico. Agregar 1 mL de cido ntrico y 1 mL de nitrato de plata SR y agua suficiente para obtener 50 mL.
Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se especifique algo diferente en la
monografa correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solucin que contenga el volumen
de cido clorhdrico 0,020 N especificado en la monografa.
SulfatosDisolver la cantidad especificada de la sustancia en anlisis en 30 mL a 40 mL de agua, o, si la sustancia ya est
en solucin, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solucin al
tornasol con cido clorhdrico. Agregar 1 mL de cido clorhdrico 3 N, 3 mL de cloruro de bario SR y agua suficiente para obtener 50 mL. Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos. A menos que se especifique algo diferente en la monografa correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solucin que contenga el volumen de cido sulfrico
0,020 N especificado en la monografa.
USP 38
Pruebas Qumicas / 226 4-Epianhidrotetraciclina 255
223 DIMETILANILINA
226 4-EPIANHIDROTETRACICLINA
Este procedimiento cromatogrfico se utiliza para demostrar que el contenido de 4-epianhidrotetraciclina, un producto de
degradacin de la tetraciclina, no excede el lmite indicado en la monografa individual.
Solucin Amortiguadora de EDTADisolver 37,2 g de edetato disdico en 800 mL de agua, ajustar con hidrxido de
amonio hasta un pH de 7,8, diluir con agua a 1000 mL y mezclar.
Fase de SoporteAgregar 5 mL de Solucin Amortiguadora de EDTA a 10 g de tierra silcea cromatogrfica lavada con cido
para cromatografa en columna y mezclar hasta que la tierra silcea se humedezca uniformemente.
Solucin de PruebaPreparar segn se indica en la monografa individual correspondiente.
ProcedimientoPreparar un tubo cromatogrfico de 15 mm 170 mm con una salida de 4 mm 50 mm rellenndolo
con Fase de Soporte, en porciones, apisonando firmemente cada porcin, hasta que el tubo se llene hasta una altura de aproximadamente 10 cm. En un vaso de precipitados preparar una mezcla de 1 g de tierra silcea cromatogrfica lavada con cido
para cromatografa en columna y 1 mL de Solucin de Prueba. Transferir la mezcla a la parte superior de la columna. Lavar en
seco el vaso de precipitados con Fase de Soporte y transferir a la columna para proporcionar una capa adicional de 1 cm en la
parte superior de la mezcla que contiene la Solucin de Prueba. Dentro de los 30 minutos, pasar cloroformo a travs de la columna y recolectar fracciones sucesivas de 5,0 mL, 5,0 mL, 10,0 mL, 10,0 mL y 5,0 mL. Observar la columna durante la elucin
y prestar atencin a la aparicin de dos bandas amarillas separadas. La fraccin o fracciones correspondientes a la primera banda amarilla contienen las anhidrotetraciclinas. Descartar estas fracciones. Las fracciones que aparecen despus de la primera
banda amarilla contienen la 4-epianhidrotetraciclina. Determinar la absorbancia de cada fraccin de 4-epianhidrotetraciclina a
la longitud de onda de mxima absorcin, aproximadamente a 438 nm, con un espectrofotmetro apropiado, diluyendo cada
fraccin, si fuera necesario, con cloroformo y empleando cloroformo como blanco. Calcular la cantidad, en mg, de 4-epianhidrotetraciclina en cada fraccin, por la frmula:
AVD/20,08
Captulos
La siguiente prueba de lmite se utiliza como un procedimiento general para la determinacin de trazas de dimetilanilina en
artculos farmacopeicos utilizando cromatografa de gases, cuando esta determinacin se especifica en la monografa individual
correspondiente. La dimetilanilina es un depurador del cido clorhdrico que puede haber sido arrastrado durante el proceso.
Solucin de Estndar InternoA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, preparar una solucin de naftaleno en ciclohexano que contenga aproximadamente 50 mg por mL.
Preparacin EstndarA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir 50,0 mg de N,Ndimetilanilina a un matraz volumtrico de 50 mL, agregar 25 mL de cido clorhdrico 1 N, agitar por rotacin suave hasta disolver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de la solucin resultante a un matraz volumtrico de 250 mL,
diluir a volumen con agua y mezclar. En un tubo de centrfuga adecuado agregar 1,0 mL de esta solucin, 5,0 mL de hidrxido de sodio 1 N y 1,0 mL de Solucin de Estndar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el
sobrenadante transparente como Preparacin Estndar.
Preparacin de PruebaA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir 1,0 g de la sustancia a analizar a un tubo de centrfuga adecuado, agregar 5 mL de hidrxido de sodio 1 N, agitar por rotacin suave hasta
disolver la muestra, agregar 1,0 mL de Solucin de Estndar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Emplear el sobrenadante transparente como Preparacin de Prueba.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)
Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama, mantenido aproximadamente a 250 y una columna capilar de slice fundida, de 0,53 mm 30 m, unida con una pelcula de fase G42 de 1,0 mm. El gas transportador es helio,
con una velocidad lineal de aproximadamente 30 cm por segundo y una relacin de particin de 10 : 1. Mantener la temperatura de la columna a 110 durante los primeros 4 minutos despus de inyectar, luego aumentar de 110 a 200 a 8 por minuto, y mantener a 200 durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 250. Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin Estndar y registrar las respuestas segn se indica en el Procedimiento: identificar los picos de dimetilanilina y naftaleno
segn sus tiempos de retencin relativos, que son 1,0 y 1,3, respectivamente. La relacin seal-ruido para el pico de dimetilanilina es no menor de 10.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 1 mL) de la Preparacin Estndar y de la
Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos principales. El cociente entre la respuesta de
cualquier pico de dimetilanilina y la respuesta del pico de naftaleno obtenido a partir de la Preparacin de Prueba no es mayor
que el que se obtiene a partir de la Preparacin Estndar (0,002%).
256 226 4-Epianhidrotetraciclina / Pruebas Qumicas
USP 38
en donde A es la absorbancia, V es el volumen, en mL, de la fraccin tomada, D es el factor de dilucin, si la fraccin se diluy
y 20,08 es la absortividad de la 4-epianhidrotetraciclina a 438 nm. A partir de la suma de las cantidades de 4-epianhidrotetraciclina encontrada en las diferentes fracciones, calcular el porcentaje de 4-epianhidrotetraciclina en relacin con el equivalente
de clorhidrato de tetraciclina contenido en la Solucin de Prueba.
Captulos
227 4-AMINOFENOL EN MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN ACETAMINOFENO

INTRODUCCIN
Este captulo de pruebas generales provee un procedimiento y un criterio de aceptacin (lmite) para controlar el producto de
degradacin principal de acetaminofeno, el 4-aminofenol, una impureza que se puede formar por la hidrlisis del acetaminofeno.
PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES
Todas las soluciones que contienen acetaminofeno o 4-aminofenol deben protegerse de la luz y deben almacenarse slo durante el tiempo que se pueda sustentar mediante datos de estabilidad de las soluciones adquiridos durante la verificacin en
las condiciones reales de uso.
Solucin amortiguadora: 4,0 g/L de citrato de sodio dihidrato y 1,5 g/L de cido ctrico anhidro, en agua.
Diluyente: Solucin amortiguadora y acetonitrilo (9:1)
Solucin A: Solucin amortiguadora de fosfato 10 mM, que se prepara agregando 0,60 g de fosfato monobsico de potasio y 0,82 g de fosfato dibsico de sodio a un matraz volumtrico de 1 L, disolviendo y diluyendo con agua a volumen a un
pH de 7,0.
Solucin B: Agua
Solucin C: Acetonitrilo
Tabla 1
Tiempo
(min)
Solucin A
(%)
Solucin B
(%)
Solucin C
(%)
5
90
90
10
10
80
7,1
90
10
90
Solucin madre del estndar: 25 mg/mL de ER 4-Aminofenol USP en Diluyente. Preparar en el momento de su uso junto
con las otras soluciones descritas a continuacin. Desechar despus de 4 horas o conforme a los datos de estabilidad de las
soluciones. [NOTAVer Ajustes Cromatogrficos, estabilidad de la solucin, a continuacin.]
Solucin de aptitud del sistema: 2,5 mg/mL de ER 4-Aminofenol USP, a partir de Solucin madre del estndar en Diluyente
Solucin madre de la muestra: Nominalmente 10 mg/mL de acetaminofeno, a partir de una cantidad adecuada de medicamento en Diluyente. [NOTASe puede incorporar primero cualquiera de los componentes del Diluyente al medicamento,
seguido por la adicin del otro componente manteniendo las proporciones de Solucin amortiguadora y acetonitrilo, y obteniendo el volumen final apropiado definido para el Diluyente.] [NOTASe recomienda preparar de manera simultnea la
Solucin muestra y la Solucin estndar dentro de un lapso de tiempo corto (p.ej., 30 minutos) para cada muestra de medicamento.]
Solucin estndar: Agregar 25,0 mL de Solucin madre de la muestra y 15,0 mL de Solucin madre del estndar a un matraz volumtrico de 50 mL y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a travs de un filtro adecuado con un tamao de poro de
0,45 mm, desechando los primeros 3 mL del filtrado.
Solucin muestra: Agregar 25,0 mL de Solucin madre de la muestra a un matraz volumtrico de 50 mL y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a travs de un filtro adecuado con un tamao de poro de 0,45 mm, desechando los primeros 3 mL
del filtrado.
MTODO CROMATOGRFICO
Modo: HPLC
Detector: UV 300 nm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar
[NOTAEl tiempo de retencin tpico de 4-aminofenol es aproximadamente 4,25,3 minutos.]
Pruebas Qumicas / 228 xido de Etileno y Dioxano 257
USP 38
Resolucin: No menos de 1,0 entre 4-aminofenol y el pico ms cercano, Solucin estndar
Factor de asimetra: No ms de 1,5 para el pico de 4-aminofenol, Solucin estndar
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0%, Solucin estndar
Relacin seal-ruido: No menos de 20 para el pico de 4-aminofenol, Solucin de aptitud del sistema
ANLISIS
Inyectar la Solucin muestra y la Solucin estndar para cada muestra de medicamento de manera secuencial, es decir, una tras
otra.
Calcular el porcentaje de 4-aminofenol (C6H7NO) con respecto a acetaminofeno en la porcin de medicamento tomada:
Resultado = [rU/(rS rU)] (WS/WU) 100
Tabla 2
Cambio de Condicin
Aumento en la concentracin orgnica (Solucin C)
Cambio en la Retencin del

4-Aminofenol
Reduce la retencin del 4-aminofenol
Reduccin del pH (Solucin A)
Aumenta la retencin del 4-aminofenol
Aumento en la concentracin inica (Solucin B)
Reduce la retencin del 4-aminofenol
Aumento en la temperatura
de la columna
Aumenta la retencin del 4-aminofenol
Los ajustes al procedimiento cromatogrfico pueden requerir de verificacin o validacin. Ver los captulos Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225 y Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226 para orientacin. Las condiciones cromatogrficas ajustadas deben cumplir con todos los requisitos de aptitud del sistema.
La estabilidad de la solucin debe verificarse en condiciones reales de uso para asegurar que el 4-aminofenol permanece estable en la Solucin muestra y en la Solucin estndar segn se demuestra por un cambio de no ms de 10% en las reas de
los picos de 4-aminofenol.
228 xido de Etileno y Dioxano

El siguiente procedimiento se usa para determinar el contenido de xido de etileno y dioxano residuales en los productos que
se preparan a partir de xido de etileno. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el
Mtodo I.
Mtodo I
[PRECAUCINEl xido de etileno es txico e inflamable. Preparar estas soluciones en una campana bien ventilada con mucho
cuidado. Proteger manos y rostro usando guantes protectores de polietileno y una mscara adecuada. Almacenar todas las
soluciones en recipientes hermticos y refrigerar a una temperatura entre 4 y 8.]
[NOTAAntes de usar el polietilenglicol 200 en esta prueba, eliminar cualquier componente voltil colocando 500 mL de polietilenglicol 200 en un matraz de fondo redondo de 1000 mL y acoplando el matraz a un evaporador rotatorio mantenido a
60 y bajo un vaco de 1020 mm Hg durante 6 horas.]
Solucin de acetaldehdo: 10 mg/mL de acetaldehdo. [NOTAPreparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin madre de xido de etileno: 2,5 mg/g de xido de etileno.
Preparar segn se indica a continuacin: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio, agregar 50 mL de polietilenglicol
200, y volver a pesar el matraz. Transferir 5 mL del xido de etileno lquido a un vaso de precipitados de 100 mL enfriado
en una mezcla de cloruro de sodio y hielo (1:3). Transferir 300 mL (correspondientes a 250 mg) de xido de etileno lquido al polietilenglicol 200 y agitar por rotacin suave hasta mezclar. Colocar de nuevo el tapn, volver a pesar el matraz, y
determinar la cantidad de xido de etileno absorbido por diferencia de peso. Ajustar el peso de la mezcla con polietilen-
Captulos
rU = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solucin muestra

rS = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solucin estndar
WS = cantidad de ER 4-Aminofenol USP agregada a la Solucin estndar (mg)
WU = cantidad de acetaminofeno en la Solucin muestra (mg)
Criterios de aceptacin: (a menos que se especifique de otro modo en la monografa): No ms de 0,15% de 4-aminofenol con respecto a acetaminofeno
AJUSTES CROMATOGRFICOS
Se puede ajustar el tiempo de retencin de 4-aminofenol para conseguir la especificidad para una matriz de producto determinada. Esta posibilidad de ajuste reemplaza a las disposiciones del captulo Cromatografa 621 para el ajuste de condiciones
cromatogrficas y tiene el propsito de proporcionar una medida de flexibilidad cuando as se requiera. La Tabla 2 proporciona sugerencias para cambiar la retencin del 4-aminofenol. El uso de un sistema ternario de fase mvil permite cambios
fciles en la concentracin inica (agua de la Solucin B) y en la concentracin orgnica (acetonitrilo de la Solucin C), pero
ste puede simplificarse a un sistema binario de fase mvil.
Captulos
258 228 xido de Etileno y Dioxano / Pruebas Qumicas
USP 38
glicol 200 a 100,0 g, colocar de nuevo el tapn, y agitar por rotacin suave hasta mezclar. [NOTALlenar con xido de
etileno lquido un frasco resistente a la presin enfriado y almacenar en un congelador cuando no se use. Usar un trozo
pequeo de pelcula de polietileno para proteger el lquido del contacto con la junta de caucho. Usar un aparato enfriado
adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar esta solucin madre inmediatamente antes de su uso y almacenar en un
refrigerador despus de su preparacin.]
Solucin de xido de etileno: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio y enfriarlo en un refrigerador. Agregar 35
mL de polietilenglicol 200 y volver a pesar el matraz. Transferir 1 g de Solucin madre de xido de etileno enfriada al matraz
Erlenmeyer tarado. Ajustar el peso de la solucin con polietilenglicol 200 a 50,0 g, colocar de nuevo el tapn, y agitar por
rotacin suave hasta mezclar. Transferir 10 g de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 mL. Agregar 30 mL de agua y
mezclar. Diluir con agua a volumen y mezclar para obtener una solucin que contenga 10 mg/mL de xido de etileno.
[NOTAUsar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de dioxano: 500 mg/mL de dioxano
Solucin estndar A: Transferir 0,1 mL de Solucin de xido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL.
[NOTASe pueden usar otros tamaos de vial para muestreo de fase gaseosa, como por ejemplo de 22 mL, dependiendo
de las condiciones operativas; sin embargo, se debe usar el mismo tamao para la Solucin estndar A, la Solucin estndar
B y la Solucin muestra.] Agregar 0,1 mL de Solucin de acetaldehdo y 0,1 mL de Solucin de dioxano, sellar el vial, y mezclar.
Solucin estndar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL y agregar 0,1 mL de Solucin de xido de etileno, 0,1 mL de Solucin de dioxano y 1,0 mL de N,N-dimetilacetamida. Sellar el vial y
mezclar.
Solucin muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un a vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL y agregar
1,0 mL de N,N-dimetilacetamida y 0,2 mL de agua. Sellar el vial y mezclar.
Modo: Cromatografa de Gases con muestreador de cmara gaseosa (Headspace GC)
Detector: Ionizacin a la llama
Columna: Capilar de vidrio o cuarzo, de 0,32 mm 30 m, con una capa de fase G1 de 1,0 mm
Temperatura
Inyector: 150
Detector: 250
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.
Temperatura
Inicial ()
Rampa de Temperatura
(/min)
Temperatura
Final ()
Tiempo de Espera (Hold Time)

a la Temperatura
Final (min)
50
50
50
180
180
30
230
Gas transportador: Helio

Velocidad lineal: 20 cm/s
Volumen de inyeccin: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyeccin: Relacin de particin 20:1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 45 min
Temperatura de equilibrio
70 para la Solucin estndar A
90 para la Solucin estndar B
90 para la Solucin muestra
Temperatura de la lnea de transferencia: 150
Tiempo de presurizacin: 1 min
Tiempo de inyeccin: 12 s
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar A
[NOTALos tiempos de retencin relativos para acetaldehdo y xido de etileno son 0,94 y 1,0, respectivamente.]
Resolucin: No menos de 2,0 entre acetaldehdo y xido de etileno
Relacin seal-ruido: No menos de 5, determinado a partir del pico de dioxano
Desviacin estndar relativa: No ms de 15%
Anlisis
Muestras: Solucin estndar B y Solucin muestra
[NOTALos tiempos de retencin relativos para xido de etileno y dioxano son 1,0 y 2,5, respectivamente.]
Pruebas Qumicas / 228 xido de Etileno y Dioxano 259
USP 38
Calcular el contenido de xido de etileno, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:

Resultado = AE rU/[(rS WU) (rU WS)]
AE
= cantidad de xido de etileno agregado a la Solucin estndar B (mg)
rU
= respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin muestra
rS
= respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin estndar B
WU
= peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin muestra (g)
WS
= peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solucin estndar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = AD rU/[(rS WU) (rU WS)]
Temperatura
Inicial ()
Rampa de Temperatura
(/min)
Temperatura
Final ()

a la Temperatura
Final (min)
70
10
250

Volumen de inyeccin: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyeccin: Relacin de particin 3,5 : 1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 30 min
Temperatura de equilibrio: 80
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de resolucin
[NOTALos tiempos de retencin relativos para acetaldehdo y xido de etileno son 0,9 y 1,0, respectivamente.]
1
Esta es una solucin disponible comercialmente.
Captulos
AD
= cantidad de dioxano agregado a la Solucin estndar B (mg)
rU
= respuesta del pico de dioxano de la Solucin muestra
rS
= respuesta del pico de dioxano de la Solucin estndar B
WU
WS
Mtodo II
Solucin estndar de xido de etileno: Diluir 0,5 mL de xido de etileno en cloruro de metileno (50 mg/mL)1 con agua
hasta 50,0 mL. [NOTALa solucin es estable durante 3 meses si se almacena en viales con tapas precintadas de membrana de silicona recubiertas con politetrafluoroetileno (polytef) a 20.] Dejar que alcance la temperatura ambiente. Diluir 1,0
mL con agua hasta 250,0 mL para obtener una solucin con una concentracin de 2 mg/mL de xido de etileno. [NOTA
Usar esta solucin inmediatamente despus de su preparacin.]
Solucin estndar de dioxano: 0,05 mL/mL de dioxano
Solucin estndar de acetaldehdo: 10 mg/mL de acetaldehdo. [NOTAPreparar inmediatamente antes de su uso.]
Solucin de resolucin: Agregar 2,0 mL de Solucin estndar de acetaldehdo y 2,0 mL de Solucin estndar de xido de
etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL. Sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona
recubierta con tefln y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solucin estndar A: 0,48 mg/mL de xido de etileno, a partir de Solucin estndar de xido de etileno y 0,005 mL/mL de
dioxano, a partir de Solucin estndar de dioxano, en agua
Solucin estndar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL. Agregar
2,0 mL de Solucin estndar A, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con tefln y una tapa
de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solucin muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 10 mL. Agregar
2,0 mL de agua, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con tefln y una tapa de aluminio,
y mezclar cuidadosamente.
Modo: Cromatografa de Gases con muestreador de cmara gaseosa (Headspace GC)
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,53 mm 50 m, con una capa de fase G27 de 5,0 mm
Temperatura
Inyector: 85
Detector: 250
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.
260 228 xido de Etileno y Dioxano / Pruebas Qumicas
USP 38
Resolucin: No menos de 2,0 entre acetaldehdo y xido de etileno
Anlisis
Muestras: Solucin estndar B y Solucin muestra
[NOTALos tiempos de retencin relativos para xido de etileno y dioxano son 1,0 y 1,9, respectivamente.]
Calcular el contenido de xido de etileno, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = CE V rU/[(rS WU) (rU WS)]
CE
= concentracin de xido de etileno en la Solucin estndar A (mg/mL)
V
= volumen de Solucin estndar A agregada a la Solucin estndar B (2,0 mL)
rU
= respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin muestra
rS
= respuesta del pico de xido de etileno de la Solucin estndar B
WU
WS
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = CD V r F rU/[(rS WU) (rU WS)]
Captulos
CD
V
r
F
rU
rS
WU
WS
= concentracin de dioxano en la Solucin estndar A (mL/mL)

= volumen de la Solucin estndar A agregada a la Solucin estndar B (2,0 mL)
= densidad de dioxano (1,03 g/mL = 1,03 mg/mL)
= factor de conversin (1000 mg/mg)
= respuesta del pico de dioxano de la Solucin muestra
= respuesta del pico de dioxano de la Solucin estndar B
Eliminar lo siguiente:
231 METALES PESADOS
Esta prueba se proporciona para demostrar que el contenido de impurezas metlicas coloreadas por el in sulfuro, en las
condiciones de prueba especificadas, no excede el lmite de Metales pesados especificado en la monografa individual correspondiente al porcentaje (en peso) de plomo en la sustancia en anlisis, segn se determina mediante comparacin visual concomitante (ver Comparacin Visual en la seccin Procedimiento en Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851) con un control
preparado a partir de una Solucin Estndar de Plomo. [NOTALas sustancias que generalmente respondern a esta prueba son:
plomo, mercurio, bismuto, arsnico, antimonio, estao, cadmio, plata, cobre y molibdeno.]
Determinar la cantidad de metales pesados por el Mtodo I, a menos que se especifique algo diferente en la monografa
individual. El Mtodo I se emplea para sustancias que producen preparaciones transparentes e incoloras en las condiciones de
prueba especificadas. El Mtodo II se emplea para sustancias que no producen preparaciones transparentes e incoloras en las
condiciones de prueba especificadas para el Mtodo I, o para sustancias que por su naturaleza compleja interfieren con la precipitacin de metales mediante el in sulfuro, o para aceites fijos y voltiles. El Mtodo III es un mtodo de digestin hmeda
que se usa slo cuando no se puede usar ni el Mtodo I ni el Mtodo II.
Reactivos Especiales
Solucin Madre de Nitrato de PlomoDisolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 mL de agua a la que se le ha agregado 1 mL de cido ntrico, luego diluir con agua hasta 1000 mL. Preparar y almacenar esta solucin en recipientes de vidrio
libres de sales de plomo solubles.
Solucin Estndar de PlomoEn el da de uso, diluir con agua 10,0 mL de Solucin Madre de Nitrato de Plomo hasta 100,0
mL. Cada mL de la Solucin Estndar de Plomo contiene el equivalente a 10 mg de plomo. Una solucin de comparacin preparada sobre la base de 100 mL de Solucin Estndar de Plomo por g de sustancia en anlisis contiene el equivalente a 1 parte de
plomo por milln de partes de la sustancia en anlisis.
Pruebas Qumicas / 231 Metales Pesados 261
USP 38
Mtodo I
Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5Disolver 25,0 g de acetato de amonio en 25 mL de agua y agregar 38,0
mL de cido clorhdrico 6 N. Ajustar, si fuera necesario, con hidrxido de amonio 6 N o cido clorhdrico 6 N hasta un pH de
3,5; diluir con agua hasta 100 mL y mezclar.
Preparacin EstndarPipetear 2 mL de la Solucin Estndar de Plomo (20 mg de Pb), transferir a un tubo de comparacin
de color de 50 mL y diluir con agua hasta 25 mL. Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto
como indicador externo, ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua
hasta 40 mL y mezclar.
Preparacin de PruebaEn un tubo de comparacin de color de 50 mL, colocar 25 mL de la solucin preparada para la
prueba segn se indica en la monografa individual; o usando el volumen de cido indicado, cuando se especifica en la monografa individual, disolver y diluir con agua hasta 25 mL la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, segn se calcula, por la
frmula:
2,0/(1000L)
Mtodo II
NOTAEste mtodo no recupera mercurio.
Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5Preparar segn se indica en el Mtodo I.
Preparacin EstndarPreparar segn se indica en el Mtodo I.
Preparacin de PruebaUsar una cantidad, en g, de la sustancia a analizar calculada por la frmula:
2,0/(1000L)
en donde L es el lmite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Transferir la cantidad pesada de la sustancia a un crisol
adecuado, agregar suficiente cido sulfrico para humedecerla e incinerar cuidadosamente a baja temperatura hasta que se
carbonice por completo. (El crisol puede estar cubierto con una tapa adecuada no ajustada durante la carbonizacin). Agregar
2 mL de cido ntrico y 5 gotas de cido sulfrico a la masa carbonizada y calentar con cuidado hasta que ya no se produzcan
humos blancos. Incinerar preferiblemente en una mufla, a una temperatura de 500 a 600 hasta que el carbn se haya quemado completamente. Enfriar, agregar 4 mL de cido clorhdrico 6 N, cubrir y digerir en un bao de vapor durante 15 minutos, remover la tapa y evaporar lentamente hasta sequedad en un bao de vapor. Humedecer el residuo con 1 gota de cido
clorhdrico, agregar 10 mL de agua caliente y digerir durante 2 minutos. Agregar, gota a gota, hidrxido de amonio 6 N hasta
que la solucin sea alcalina al papel tornasol, diluir con agua a 25 mL y ajustar con cido actico 1 N a un pH entre 3,0 y 4,0,
empleando un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Filtrar si fuera necesario, enjuagar el crisol y
el filtro con 10 mL de agua, combinar el filtrado y el enjuague en un tubo de comparacin de color de 50 mL, diluir con agua
a 40 mL y mezclar.
ProcedimientoA cada uno de los tubos que contengan la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba, agregar 2 mL
de la Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 mL de tioacetamidaglicerina bsica SR, diluir con agua
hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca*: el color de la
solucin de la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la solucin de la Preparacin Estndar.
Mtodo III
Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5Preparar segn se indica en el Mtodo I.
* En aquellos pases o jurisdicciones en los que no se pueda usar tioacetamida, agregar a cada uno de los tubos 10 mL de sulfuro de hidrgeno SR recin preparado, mezclar, dejar en reposo durante 5 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca.
Captulos
en donde L es el lmite de Metales pesados, expresado como porcentaje. Usando un medidor de pH o un papel indicador de
pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N hasta un pH entre 3,0
y 4,0, diluir con agua hasta 40 mL y mezclar.
Preparacin ControlEn un tercer tubo de comparacin de color de 50 mL, colocar 25 mL de una solucin preparada
segn se indica en la Preparacin de Prueba y agregar 2,0 mL de la Solucin Estndar de Plomo. Usando un medidor de pH o un
papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N
hasta un pH entre 3,0 y 4,0; diluir con agua hasta 40 mL y mezclar.
ProcedimientoA cada uno de los tres tubos que contengan la Preparacin Estndar, la Preparacin de Prueba y la Preparacin Control, agregar 2 mL de la Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5; luego agregar 1,2 mL de tioacetamidaglicerina
bsica SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie
blanca*: el color de la solucin de la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la solucin de la Preparacin Estndar y
el color de la solucin de la Preparacin Control es igual o ms oscuro que el color de la solucin de la Preparacin Estndar.
[NOTASi el color de la Preparacin Control es ms claro que el de la Preparacin Estndar, usar el Mtodo II en lugar del Mtodo I para la sustancia en anlisis.]
262 231 Metales Pesados / Pruebas Qumicas
USP 38
Preparacin EstndarTransferir a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio y seco, una mezcla de 8 mL de cido sulfrico y
10 mL de cido ntrico, y agregar otro volumen de cido ntrico igual al volumen extra de cido ntrico agregado a la Preparacin de Prueba. Calentar la solucin hasta que se produzcan humos blancos densos; enfriar; agregar cuidadosamente 10 mL de
agua; y si se us perxido de hidrgeno para tratar la Preparacin de Prueba, agregar un volumen de perxido de hidrgeno al
30 por ciento, igual al que se us para la sustancia en anlisis. Calentar a ebullicin moderada hasta que se produzcan humos
blancos densos. Volver a enfriar, agregar cuidadosamente 5 mL de agua, mezclar y calentar a ebullicin moderada hasta que
se produzcan humos blancos densos y hasta obtener un volumen de 2 a 3 mL. Enfriar, diluir cuidadosamente con unos pocos
mL de agua, agregar 2,0 mL de la Solucin Estndar de Plomo (20 mg de Pb) y mezclar. Transferir a un tubo de comparacin de
color de 50 mL, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un volumen de 25 mL y mezclar.
Preparacin de PruebaA menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar una cantidad, en g, de la
sustancia a analizar calculada por la frmula:
Captulos
2,0/(1000L)
en donde L es el lmite de Metales pesados, expresado como porcentaje.
Si la sustancia es un slidoTransferir la cantidad pesada de la sustancia en anlisis a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio y
seco. [NOTASe puede usar un matraz de 300 mL si la reaccin produce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en un
ngulo de 45 y agregar una cantidad suficiente de una mezcla de 8 mL de cido sulfrico y 10 mL de cido ntrico para humedecer bien la sustancia. Entibiar suavemente hasta que se inicie la reaccin, dejar que la reaccin disminuya y agregar porciones de la misma mezcla de cidos, calentando despus de cada adicin, hasta que se haya agregado un total de 18 mL de
la mezcla de cidos. Aumentar el calor y calentar a ebullicin moderada hasta que la solucin se oscurezca. Enfriar, agregar 2
mL de cido ntrico y volver a calentar hasta que la solucin se oscurezca. Continuar el calentamiento y agregar luego cido
ntrico hasta que no se observe ms oscurecimiento, luego calentar intensamente hasta que se produzcan humos blancos densos. Enfriar, agregar cuidadosamente 5 mL de agua, calentar a ebullicin moderada hasta que se produzcan humos blancos
densos y continuar el calentamiento hasta que el volumen se reduzca a unos pocos mL. Enfriar, agregar cuidadosamente 5 mL
de agua y examinar el color de la solucin. Si es amarilla, agregar cuidadosamente 1 mL de perxido de hidrgeno al 30 por
ciento y evaporar nuevamente hasta que se produzcan humos blancos densos y hasta un volumen de 2 a 3 mL. Si la solucin
an est amarilla, repetir la adicin de 5 mL de agua y el tratamiento con perxido. Enfriar, diluir cuidadosamente con unos
pocos mL de agua, enjuagar y recoger en un tubo de comparacin de color de 50 mL, teniendo cuidado de que el volumen
combinado no exceda de 25 mL.
Si la sustancia es un lquidoTransferir la cantidad pesada de la sustancia en anlisis a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio
y seco. [NOTASe puede usar un matraz de 300 mL si la reaccin produce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en
un ngulo de 45 y agregar cuidadosamente unos pocos mL de una mezcla de 8 mL de cido sulfrico y 10 mL de cido
ntrico. Entibiar suavemente hasta que se inicie la reaccin, dejar que la reaccin disminuya y proceder segn se indica en Si la
sustancia es un slido, comenzando donde dice agregar porciones de la misma mezcla de cidos.
Preparacin ControlProceder con la digestin, usando la misma cantidad de muestra y el mismo procedimiento, segn
se indica en el prrafo Si la sustancia es un slido en la seccin Preparacin de Prueba, hasta el paso Enfriar, diluir cuidadosamente con unos pocos mL de agua. Agregar 2,0 mL de la Solucin Estndar de Plomo (20 mg de plomo) y mezclar. Transferir a
un tubo de comparacin de color de 50 mL, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un
volumen de 25 mL y mezclar.
ProcedimientoTratar la Preparacin de Prueba, la Preparacin Estndar y la Preparacin Control del siguiente modo. Usando un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, ajustar la solucin a un pH entre
3,0 y 4,0 con hidrxido de amonio (se puede usar una solucin de amonaco diluida, si se desea, a medida que se acerca al pH
especificado), diluir con agua hasta 40 mL y mezclar.
Agregar a cada tubo 2 mL de la Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5, luego agregar 1,2 mL de tioacetamidaglicerina bsica SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie blanca*: el color de la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la Preparacin Estndar, y el color de la Preparacin Control es igual o ms oscuro que el de la Preparacin Estndar.
Oficial: 1 de diciembre de 2015
USP38
232 IMPUREZAS ELEMENTALESLMITES

INTRODUCCIN
Este captulo general especifica lmites para la cantidad de impurezas elementales en productos farmacuticos. Las impurezas
elementales incluyen catalizadores y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en frmacos, excipientes o medicamentos. Estas impurezas pueden presentarse de manera natural, agregarse intencionalmente o introducirse inadvertidamen-
Pruebas Qumicas / 232 Impurezas ElementalesLmites 263
USP 38
te (p.ej. mediante interacciones con el equipo de procesamiento). Cuando se conoce la presencia de impurezas elementales,
cuando se han agregado o cuando se pueden introducir potencialmente, es necesario asegurar el cumplimiento con los lmites
especificados. Una estrategia de control basada en riesgos puede ser adecuada cuando los analistas determinan la forma en
que se va a asegurar el cumplimiento de esta norma. La estrategia de control basada en riesgos debe considerar (como mnimo) al As, Cd, Pb y Hg debido a su naturaleza ubicua. Independientemente de la metodologa empleada, todos los medicamentos deben cumplir con los lmites especificados.
Los lmites presentados en este captulo no se aplican a excipientes ni frmacos, excepto cuando se especifique en este captulo o en las monografas individuales. Sin embargo, es necesario conocer e informar los niveles de impurezas elementales presentes en frmacos y excipientes.
Los artculos destinados nicamente para uso veterinario y vacunas convencionales no estn obligados a cumplir con los lmites indicados en este captulo. Los suplementos dietticos y sus ingredientes se tratan en el captulo Contaminantes Elementales en Suplementos Dietticos 2232.
CLASIFICACIN DE ESPECIES
VAS DE EXPOSICIN
La toxicidad de una impureza elemental se relaciona con su grado de exposicin (biodisponibilidad). Se ha determinado el
grado de exposicin para cada una de las impurezas elementales para las tres vas de administracin: oral, parenteral e inhalatoria. Estos lmites se basan en la exposicin crnica. Las otras dos vas de administracin, mucosa y tpica, se consideran iguales a la va oral para los propsitos de esta norma, mientras que las exposiciones diarias permitidas (EDP) descritas en la Tabla 1
se aplicaran a estos productos. [NOTALas vas de administracin de medicamentos se definen en el captulo general Formas
Farmacuticas 1151.]
MEDICAMENTOS
Los lmites descritos en la segunda, tercera y cuarta columnas de la Tabla 1 son las EDP en la dosis diaria base de las impurezas elementales de inters para un medicamento tomado por el paciente de acuerdo con las vas de administracin indicadas.
Los parenterales con una dosis mxima esperada mayor de 10 mL pero no mayor de 100 mL deben usar la Opcin de Sumatoria descrita ms adelante.
Parenterales de Gran Volumen (PGV)

Cuando la dosis diaria de un inyectable es mayor de 100 mL [parenteral de gran volumen (PGV)], la cantidad de impurezas
elementales presentes en el medicamento debe controlarse a travs de los componentes individuales usados para producir el
producto. Las cantidades de impurezas elementales presentes en cada componente usado en un producto parenteral de gran
volumen deben ser inferiores a los valores indicados en la quinta columna de la Tabla 1.
Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos
Elemento
Cadmio
a
b
c
EDP
para Dosis
Diaria
Orala
(mg/da)
EDP
para Dosis
Diaria
Parenteral
(mg/da)
EDP
para Dosis
Diaria
de Inhalacin
(mg/da)
Lmite de
Componente
de PGV
(mg/g)
25
2,5
1,5
0,25
EDP = Exposicin diaria permitida basndose en una persona con un peso de 50 kg.
Ver la seccin Clasificacin de Especies.
No representa un riesgo de seguridad.
Captulos
La determinacin del estado de oxidacin, complejo orgnico o combinacin recibe el nombre de clasificacin de especies.
Cada una de las impurezas elementales tiene el potencial de estar presente en diferentes estados de oxidacin o de formacin
de complejos. No obstante, el arsnico y el mercurio son de especial cuidado debido a las diferentes toxicidades de sus formas
inorgnicas y orgnicas complejas.
Los lmites de arsnico se basan en la forma inorgnica (la ms txica). El arsnico se puede medir usando un procedimiento
para arsnico total asumiendo que todo el arsnico contenido en el material en anlisis se encuentra en la forma inorgnica.
Cuando el lmite se excede usando el procedimiento para arsnico total, puede ser posible demostrarlo mediante un procedimiento que cuantifique las diferentes formas en que la forma inorgnica cumple con la especificacin.
Los lmites de mercurio se basan en el estado de oxidacin (2+) inorgnico. El metilmercurio (la forma ms txica de mercurio) no es un problema comn para la industria farmacutica. Por consiguiente, el lmite se estableci asumiendo la forma inorgnica ms comn (mercrica). Los lmites para artculos que tienen el potencial de contener metilmercurio (p.ej., productos
obtenidos a partir de peces) se proporcionan en las monografas correspondientes.
264 232 Impurezas ElementalesLmites / Pruebas Qumicas
USP 38
Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos (Continuacin)
Elemento
Plomo
EDP
para Dosis
Diaria
Parenteral
(mg/da)
EDP
para Dosis
Diaria
de Inhalacin
(mg/da)
Lmite de
Componente
de PGV
(mg/g)
0,5
1,5
1,5
1,5
0,15
Mercurio inorgnicob
15
1,5
1,5
0,15
Iridio
100
10
1,5
1,0
Osmio
100
10
1,5
1,0
Paladio
100
10
1,5
1,0
Platino
100
10
1,5
1,0
Rodio
100
10
1,5
1,0
Rutenio
100
10
1,5
1,0
Cromo
25
Molibdeno
100
10
10
1,0
Nquel
500
50
1,5
5,0
Vanadio
100
10
30
1,0
Cobre
1000
100
100
10
Arsnico inorgnicob
Captulos
EDP
para Dosis
Diaria
Orala
(mg/da)
a
b
c
EDP = Exposicin diaria permitida basndose en una persona con un peso de 50 kg.
Ver la seccin Clasificacin de Especies.
Opciones para Demostrar el Cumplimiento

OPCIN DE ANLISIS DEL MEDICAMENTO
Los resultados obtenidos a partir del anlisis de una unidad de dosificacin tpica, multiplicados por la dosis diaria mxima,
se comparan con la EDP por Dosis Diaria.
EDP por Dosis Diaria valor medido (mg/g) dosis diaria mxima (g/da)
La cantidad medida de cada impureza no es mayor que la EDP por Dosis Diaria, a menos que se indique de otro modo en la
monografa individual.
OPCIN DE SUMATORIA
Sumar por separado las cantidades de cada impureza elemental (en mg/g) presente en cada uno de los componentes del
medicamento usando la siguiente ecuacin:
EDP por Dosis Diaria [SM1(CM WM)] DD
M = cada ingrediente usado para fabricar una unidad de dosificacin
CM = concentracin de elemento en el componente (frmaco o excipiente) (mg/g)
WM = peso del componente en una unidad de dosificacin (g/unidad de dosificacin)
DD = nmero de unidades en la dosis diaria mxima (unidad/da)
El resultado de la sumatoria de cada impureza no es mayor que la EDP para Dosis Diaria, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual. Antes de que se puedan evaluar los productos con esta opcin, el fabricante debe asegurar
que no se hayan agregado impurezas elementales adicionales de manera inadvertida durante el proceso de fabricacin.
FRMACOS Y EXCIPIENTES
Se debe controlar e informar la presencia de impurezas elementales en frmacos y excipientes. Los niveles aceptables para
estas impurezas dependen del uso final previsto del material. Por consiguiente, los fabricantes de medicamentos deben determinar el nivel aceptable de impurezas elementales en los frmacos y excipientes usados para producir sus productos.
Los valores provistos en la Tabla 2 representan los lmites de concentracin para componentes (frmacos y excipientes) de
medicamentos dosificados a una dosis diaria mxima de 10 g/da. Estos valores funcionan como lmites de concentracin
predeterminados para facilitar las discusiones entre los fabricantes de medicamentos y los proveedores de los componentes
para sus medicamentos. [NOTAPuede ser necesario limitar los componentes individuales a niveles distintos de los presentados en la tabla, dependiendo de los factores mitigantes especficos de la monografa.]
Pruebas Qumicas / 233 Impurezas ElementalesProcedimientos 265
USP 38
Tabla 2. Lmites de Concentracin Predeterminados para Frmacos y Excipientes

Lmites de Concentracin
(mg/g) para Medicamentos
Parenterales con una Dosis
Diaria Mxima de 10 g/da
de Inhalacin con una Dosis
Diaria Mxima de 10 g/da
Cadmio
2,5
0,25
0,15
Plomo
0,5
0,5
0,5
Arsnico inorgnico
0,15
0,15
0,15
Mercurio inorgnico
1,5
0,15
0,15
Iridio
10
1,0
0,15
Osmio
10
1,0
0,15
Paladio
10
1,0
0,15
Platino
10
1,0
0,15
Rodio
10
1,0
0,15
Rutenio
10
1,0
0,15
Cromo
2,5
Molibdeno
10
1,0
1,0
Nquel
50
5,0
0,15
Vanadio
10
1,0
3,0
Cobre
100
10
10
Elemento
PRUEBAS ANALTICAS
Cuando los fabricantes pueden demostrar la ausencia de impurezas mediante la vigilancia del proceso y control en la cadena
de abastecimiento, no es necesario aplicar pruebas adicionales. Cuando las pruebas se realizan para demostrar el cumplimiento, se debe proceder segn se indica en el captulo general Impurezas ElementalesProcedimientos 233 y la evaluacin de
Elementos Diana debe incluir como mnimo As, Cd, Pb y Hg.
233 IMPUREZAS ELEMENTALESPROCEDIMIENTOS

INTRODUCCIN
Este captulo describe dos procedimientos analticos (Procedimientos 1 y 2) para la evaluacin de los niveles de impurezas
elementales. Asimismo, el captulo describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los procedimientos alternativos que cumplen con los requisitos de validacin descritos en este captulo pueden considerarse equivalentes a los Procedimientos 1 y 2 para los propsitos de esta prueba. Asimismo, en el da del anlisis, se deben realizar una estandarizacin y una evaluacin de la aptitud del sistema usando materiales de referencia pertinentes. El requisito para una prueba de impurezas elementales se especifica en las Advertencias y Requisitos Generales o en la monografa individual. Los analistas confirmarn mediante estudios de verificacin que los procedimientos analticos aqu descritos, as como los procedimientos analticos alternativos, sean adecuados para su uso en el material especfico.
Clasificacin de Especies
La determinacin del estado de oxidacin, complejo orgnico o combinacin recibe el nombre de clasificacin de especies.
Los procedimientos analticos para determinacin de especies no se incluyen en este captulo, pero se pueden encontrar ejemplos en diversas partes de los compendios USPNF y en la literatura.
Definiciones
cido Concentrado: Los cidos ntrico, sulfrico, clorhdrico o fluorhdrico concentrados ultrapuros o el Agua Regia.
Agua Regia: El agua regia es una mezcla de cidos clorhdrico y ntrico concentrados, por lo general en proporciones de 3:1
4:1, respectivamente.
Captulos
Orales con una Dosis Diaria
Mxima de 10 g/da
Captulos
266 233 Impurezas ElementalesProcedimientos / Pruebas Qumicas
USP 38
Matriz Equiparada: Son soluciones que tienen la misma composicin de disolvente que la Solucin muestra. En el caso de
una solucin acuosa, la Matriz Equiparada indicara que se estn usando los mismos cidos, concentraciones cidas y estabilizador de mercurio en ambas preparaciones.
Elementos Diana: Elementos que potencialmente estaran presentes en el material en anlisis. Cuando el anlisis se lleva a
cabo para demostrar el cumplimiento, la evaluacin de elementos diana incluye As, Cd, Pb y Hg. Los elementos diana tambin
deben incluir cualquier elemento que pudiera agregarse a travs del procesamiento o almacenamiento del material, as como
cualquier elemento cuya presencia pudiera interferir con la operacin de los procedimientos analticos.
Lmite Diana o Concentracin Diana: Valor de aceptacin para la impureza elemental que se est evaluando. Un exceso en
el lmite diana indica que un material en anlisis excede el valor aceptable. La determinacin del cumplimiento se trata en
otros captulos. [NOTACuando este captulo se aplica a los captulos Impurezas ElementalesLmites 232 y Contaminantes
Elementales en Suplementos Dietticos 2232, es posible obtener una aproximacin de los Lmites Diana dividiendo las Exposiciones Diarias Permitidas (EDP) para Dosis Diaria por la dosis diaria mxima para la Opcin de Anlisis del Medicamento del captulo
232 o la EDP por Racin Diaria dividida por el tamao de racin diaria mximo del captulo 2232.]
J: La concentracin (p/p) de los elementos de inters en el Lmite Diana se diluye apropiadamente hasta el intervalo de trabajo del instrumento. Por ejemplo, si los elementos diana son Pb y As para un anlisis de un medicamento slido oral, con una
dosis diaria de 10 g/da, usando espectrometra de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), el lmite diana para
estos elementos sera 0,5 mg/g y 0,15 mg/g (ver la Tabla 2 en 232). No obstante, en este caso, se sabe que el intervalo dinmico lineal de la ICP-MS se extiende desde 0,01 ng/mL hasta 0,1 mg/mL para estos elementos. Por consiguiente, se requiere
un factor de dilucin de al menos 1:10 para asegurar que el anlisis se realice en el intervalo dinmico lineal del instrumento. J
sera, en consecuencia, igual a 0,05 mg/mL y 0,015 mg/mL para Pb y As, respectivamente, cuando se suma el factor de dilucin.
Materiales de Referencia Apropiados: Cuando se especifiquen Materiales de Referencia Apropiados en el captulo, se deben
usar materiales de referencia certificados (CRM) de un instituto nacional de metrologa, o materiales de referencia que sean
rastreables al material de referencia certificado de un instituto nacional de metrologa. Un ejemplo de un instituto nacional de
metrologa en los Estados Unidos es el National Institute of Standards and Technology.
PROCEDIMIENTOS FARMACOPEICOS 1 Y 2
Procedimiento y Tcnica de Deteccin
El Procedimiento 1 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fciles de detectar mediante espectroscopa de emisin (ptica) atmica de plasma inductivamente acoplado (ICPAES o ICPOES). El Procedimiento 2 se puede usar
para impurezas elementales que por lo general son fciles de detectar mediante ICPMS. Antes del uso inicial, el analista debe
verificar que el procedimiento sea apropiado para el instrumento y la muestra usados (verificacin del procedimiento) mediante el cumplimiento de los requisitos de Validacin de Procedimiento Alternativo siguientes.
Preparacin de la Muestra
Las formas para la preparacin de la muestra incluyen: Sin diluir, Solucin Acuosa Directa, Solucin Orgnica Directa y Solucin
Indirecta. La seleccin de la forma apropiada de preparacin de la muestra depende del material en anlisis y es responsabilidad del analista. Cuando no se indica una forma de preparacin de la muestra en la monografa, el analista puede usar cualquiera de los siguientes procedimientos de preparacin adecuadamente verificados. Para casos en los que sea necesario agregar cantidades conocidas (spiking) a un material en anlisis a fin de proporcionar una seal de intensidad aceptable, el blanco
tambin debe ser adicionado con los mismos Elementos Diana y, cuando sea posible, con la misma solucin usada para adicionar la muestra. Las soluciones estndar pueden contener mltiples Elementos Diana. [NOTASe deben pesar todas las muestras
lquidas.]
Sin diluir: Se usa para lquidos o procedimientos alternativos que permiten examinar muestras sin disolventes.
Solucin Acuosa Directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente acuoso.
Solucin Orgnica Directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente orgnico.
Solucin Indirecta: Se usa cuando un material no es directamente soluble en disolventes acuosos u orgnicos. La muestra
debe digerirse usando un procedimiento con vaso de digestin cerrado, similar al procedimiento que se presenta a continuacin. El esquema de preparacin de la muestra debe proveer una cantidad suficiente de muestra para cuantificar cada elemento en el lmite especificado en la monografa o captulo correspondiente.
Vaso de Digestin Cerrado: El procedimiento de preparacin de la muestra se disea para muestras que deben digerirse en
un cido Concentrado usando un aparato de vaso de digestin cerrado. El vaso de digestin cerrado minimiza la prdida de
impurezas voltiles. La seleccin de un cido Concentrado depende de la matriz de la muestra. Puede ser apropiado el uso de
cualquiera de los cidos Concentrados, pero cada uno implica riesgos de seguridad inherentes. Por consiguiente, se deben tomar precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. [NOTALos pesos y volmenes provistos se pueden ajustar para
cumplir con los requisitos del aparato de digestin usado.]
Un procedimiento ilustrativo que ha demostrado una amplia aplicabilidad es el siguiente. Deshidratar y predigerir 0,5 g de
muestra primaria en 5 mL de cido Concentrado recientemente preparado. Dejar en reposo con la tapa sin ajustar durante 30
USP 38
Pruebas Qumicas / 233 Impurezas ElementalesProcedimientos 267
minutos en una campana de extraccin. Agregar 10 mL adicionales de cido Concentrado y digerir, usando una tcnica de
vaso cerrado, hasta completar la digestin o la extraccin. Repetir, si fuera necesario, agregando 5 mL adicionales de cido
Concentrado. [NOTACuando se requiera una digestin en vaso cerrado, seguir los procedimientos recomendados por el fabricante para garantizar el uso seguro.]
Reactivos: Todos los reactivos usados para la preparacin de las soluciones estndar y muestra deben estar exentos de impurezas elementales, de conformidad con el captulo Espectroqumica de Plasma 730.
Procedimiento 1: ICP-AES
Procedimiento 2: ICP-MS
Solucin de estandarizacin 1: 2J de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin de estandarizacin 2: 0,5J de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin madre de la muestra: Proceder segn se indica anteriormente en Preparacin de la Muestra. Si fuera necesario, dejar que la muestra se enfre. Para la determinacin de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solucin muestra: Diluir la Solucin madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentracin final
de los Elementos Diana de no ms de 2J.
Blanco: Matriz Equiparada
(Ver Espectroqumica de Plasma 730.)
Modo: ICP-MS. [NOTASe recomienda un instrumento con una cmara de roco enfriada. (Una celda de colisin o una
celda de reaccin tambin puede ofrecer beneficios.)]
Detector: Espectrmetro de masas
Enjuague: El diluyente usado
Estandarizacin: Solucin de estandarizacin 1, Solucin de estandarizacin 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de estandarizacin 1
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solucin de estandarizacin 1 antes y despus del anlisis de las Soluciones
muestra.
Criterios de aptitud: Deriva no ms de 20% para cada Elemento Diana. [NOTASi las muestras tienen un alto contenido
mineral, enjuagar bien el sistema (durante 60 segundos) antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Anlisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y a m/z. Calcular e informar los
resultados basndose en el tamao de la muestra original. [NOTASe deben tomar medidas apropiadas para corregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., interferencia de cloruro de argn en determinaciones de arsnico).]
Captulos
Solucin de estandarizacin 1: 2J de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada

Solucin de estandarizacin 2: 0,5J de los Elementos Diana en una Matriz Equiparada
Solucin madre de la muestra: Proceder segn se indica anteriormente en Preparacin de la Muestra. Si fuera necesario, dejar que la muestra se enfre. Para la determinacin de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solucin muestra: Diluir la Solucin madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentracin final
de los Elementos Diana de no ms de 2J.
Blanco: Matriz Equiparada
(Ver Espectroqumica de Plasma 730.)
Modo: ICP-AES
Detector: Sistema de deteccin ptica
Enjuague: El diluyente usado
Estandarizacin: Solucin de estandarizacin 1, Solucin de estandarizacin 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin de estandarizacin 1
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solucin de estandarizacin 1 antes y despus del anlisis de las Soluciones
muestra.
Criterios de aptitud: No ms de 20% para cada Elemento Diana. [NOTASi las muestras tienen un alto contenido mineral, enjuagar bien el sistema (durante 60 segundos) antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Anlisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y la longitud de onda. Calcular e
informar los resultados basndose en el tamao de la muestra original. [NOTASe deben tomar medidas apropiadas para corregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., superposiciones de longitud de onda).]
268 233 Impurezas ElementalesProcedimientos / Pruebas Qumicas
USP 38
VALIDACIN DE PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS

Cuando un procedimiento farmacopeico especificado no cumple con los requisitos de una aplicacin especfica, es posible
utilizar un procedimiento alternativo (ver las Advertencias Generales 6.30). Los procedimientos alternativos deben validarse y
aprobarse y, por lo tanto, deben ser equivalentes a los procedimientos farmacopeicos para los propsitos de la prueba. Los
principios de validacin se proporcionan en el captulo general Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225. El nivel de
validacin necesario para asegurar que un procedimiento alternativo es aceptable depende de si se requiere realizar una prueba de lmite o una determinacin cuantitativa. A continuacin se describen los requisitos para la validacin de un procedimiento de impurezas elementales para cualquier tipo de determinacin. Cuando dicha informacin difiera de la presentada en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225, tendrn prioridad los parmetros y criterios de aceptacin presentados en este
captulo. Cualquier procedimiento alternativo que haya sido validado y que cumpla con los criterios de aceptacin siguientes
se considerar equivalente a los procedimientos farmacopeicos para los propsitos de esta prueba.
Captulos
PROCEDIMIENTOS DE LMITE
La siguiente seccin define los parmetros de validacin que se deben cumplir para que los procedimientos alternativos de
lmite sean aceptables. El cumplimiento con estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedimiento de aptitud del sistema y un material de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico como un procedimiento de lmite para el Elemento Diana.
La aptitud del mtodo se debe determinar mediante estudios que empleen los materiales o mezclas en anlisis adicionados
con concentraciones conocidas de cada Elemento Diana de inters a la concentracin del lmite de aceptacin apropiada. Las
cantidades conocidas deben agregarse al material o mezcla en anlisis antes de llevar a cabo las etapas de preparacin de la
muestra.
Capacidad de Deteccin
Solucin estndar: Una preparacin de materiales de referencia para los Elementos Diana a las Concentraciones Diana
Solucin muestra adicionada 1: Preparar una solucin de la muestra en anlisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentracin Diana, solubilizada o digerida segn se
indica en Preparacin de la Muestra.
Solucin muestra adicionada 2: Preparar una solucin de la muestra en anlisis, a la que se le agregan cantidades conocidas
de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al 80% de la Concentracin Diana, solubilizada o digerida
segn se indica en Preparacin de la Muestra.
Solucin muestra no adicionada: Una muestra del material en anlisis, solubilizado o digerido de la misma manera que las
Soluciones muestra
Procedimientos no instrumentales: La Solucin muestra adicionada 1 proporciona una seal o intensidad equivalente o
mayor que la de la Solucin estndar. La Solucin muestra adicionada 2 debe proporcionar una seal o intensidad menor que la
de la Solucin muestra adicionada 1. [NOTALa seal de cada Solucin muestra adicionada no es menor que la determinacin
de la Solucin muestra no adicionada.]
Procedimientos instrumentales: El valor promedio de las tres mediciones repetidas de la Solucin muestra adicionada 1
est dentro de (15%) del valor promedio obtenido para las mediciones repetidas de la Solucin estndar. El valor promedio de
las mediciones repetidas de la Solucin muestra adicionada 2 debe proveer una intensidad o valor de seal menor que los de la
Solucin estndar. [NOTACorregir los valores obtenidos para cada una de las soluciones adicionadas usando la Solucin muestra no adicionada.]
Precisin para Mtodos Instrumentales (Repetibilidad)

[NOTALa precisin no instrumental se demuestra cumpliendo con el requisito de Capacidad de Deteccin anterior.]
Soluciones muestra: Seis muestras independientes del material en anlisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de
materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentracin Diana.
Desviacin estndar relativa: No ms de 20% para cada Elemento Diana
Especificidad
El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequvoca (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225)
cada Elemento Diana ante la presencia de los componentes esperados, incluyendo otros Elementos Diana y componentes de la
matriz.
Pruebas Qumicas / 241 Hierro 269
USP 38
PROCEDIMIENTOS CUANTITATIVOS
La siguiente seccin define los parmetros de validacin que se deben cumplir para que los procedimientos cuantitativos
alternativos sean aceptables. El cumplimiento de estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedimiento de aptitud del sistema y materiales de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico con el propsito de cuantificar los Elementos Diana.
Exactitud
Soluciones estndar: Preparar soluciones que contengan los Elementos Diana a concentraciones en el intervalo de 50% a
150% de J, usando materiales de referencia apropiados.
Muestras de prueba: Preparar muestras del material en anlisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de materiales
de referencia apropiados antes de cualquier etapa de preparacin de la muestra (digestin o solubilizacin), a concentraciones
que caigan dentro del intervalo de 50% a 150% de J para cada Elemento Diana.
Recuperacin de cantidades conocidas agregadas: 70%150% para la media de tres preparaciones repetidas a cada
concentracin
Precisin
REPETIBILIDAD
TOLERANCIA
Realizar el anlisis de Repetibilidad durante tres eventos independientes usando los siguientes elementos o una combinacin
de los mismos:
1. en das distintos o
2. con instrumental distinto o
3. con analistas distintos.
Especificidad
El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequvoca (ver Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225)
cada Elemento Diana en presencia de aquellos componentes que se espera estn presentes, incluyendo otros Elementos Diana y
componentes de la matriz.
Lmite de Cuantificacin, Intervalo y Linealidad

Se demuestra cumpliendo con el requisito de Exactitud.
241 HIERRO
Esta prueba de lmite se suministra para demostrar que el contenido de hierro, en forma frrica o ferrosa, no excede el lmite
de hierro especificado en la monografa individual. La determinacin se realiza mediante la comparacin visual concomitante
con un control preparado a partir de una solucin de hierro estndar.
SOLUCIN DE HIERRO ESTNDARDisolver 863,4 mg de sulfato frrico amnico [FeNH4(SO4)2 12H2O] en agua, agregar 10 mL
de cido sulfrico 2 N y diluir con agua hasta 100,0 mL. Pipetear 10 mL de esta solucin y transferirlos a un matraz volumtrico de 1000 mL, agregar 10 mL de cido sulfrico 2 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Esta solucin contiene el equivalente a 0,01 mg (10 mg) de hierro por mL.
Captulos
Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material en anlisis (tomadas del mismo lote) con materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al nivel indicado.
270 241 Hierro / Pruebas Qumicas
USP 38
SOLUCIN DE TIOCIANATO DE AMONIODisolver
30 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 mL.

Preparacin EstndarPipetear 1 mL de Solucin Estndar de Hierro (10 mg de Fe) y transferirlos a un tubo para comparacin de color de 50 mL, diluir con agua hasta 45 mL, agregar 2 mL de cido clorhdrico y mezclar.
Preparacin de PruebaColocar en un tubo para comparacin de color de 50 mL la solucin preparada para la prueba
segn se indica en la monografa individual y, si fuera necesario, diluir con agua hasta 45 mL; o disolver en agua y diluir con
agua hasta 45 mL la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, segn se calcula por la frmula:
1,0/(1000L)
en donde L es el lmite de Hierro expresado como porcentaje. Agregar 2 mL de cido clorhdrico y mezclar.
ProcedimientoA cada uno de los tubos que contienen la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba agregar 50 mg
de cristales de peroxidisulfato de amonio y 3 mL de Solucin de Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solucin obtenida con la Preparacin de Prueba no es ms oscuro que el de la solucin de la Preparacin Estndar.
251 PLOMO
Captulos
La imposicin de lmites estrictos para las cantidades de plomo que pueden estar presentes en los productos farmacuticos
ha dado como resultado la utilizacin de dos mtodos. El que se presenta en este captulo se basa en la extraccin de plomo
mediante soluciones de ditizona. USP38
Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que tengan un contenido de plomo lo ms bajo posible y almacenar todas las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar minuciosamente todos los materiales de vidrio con cido ntrico diluido (1 en 2) tibio y luego con agua.
Reactivos especiales
Solucin de cianuro y amonaco: Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 mL de hidrxido de amonio y diluir con agua
hasta 100 mL.
Solucin de citrato de amonio: Disolver 40 g de cido ctrico en 90 mL de agua. Agregar 2 3 gotas de rojo fenol SR, luego
agregar cuidadosamente hidrxido de amonio hasta que la solucin adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo que pueda estar presente extrayendo la solucin con porciones de 20 mL de Solucin de extraccin de ditizona (ver a continuacin),
hasta que la solucin de ditizona retenga su color verde anaranjado.
Solucin de plomo estndar diluida: Diluir un volumen medido con exactitud de solucin estndar de plomo SRUSP38
(que contenga 10 mg de plomo por mL) con 9 volmenes de cido ntrico diluido (1 en 100) para obtener una solucin que
contenga 1 mg de plomo por mL.
Solucin de extraccin de ditizona: Disolver 30 mg de ditizona en 1000 mL de cloroformo y agregar 5 mL de alcohol. Almacenar la solucin en un refrigerador.
Antes de usar, agitar un volumen adecuado de la solucin de extraccin de ditizona con aproximadamente la mitad de su
volumen de cido ntrico diluido (1 en 100), desechando el cido ntrico.
Solucin de clorhidrato de hidroxilamina: Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener
aproximadamente 65 mL. Transferir a un separador, agregar 5 gotas de azul de timol SR, luego agregar hidrxido de amonio
hasta que la solucin adquiera un color amarillo. Agregar 10 mL de solucin de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Extraer esta solucin con porciones sucesivas de 10 a 15 mL de cloroformo hasta que
una porcin de 5 mL del extracto clorofrmico no presente color amarillo al agitarla con sulfato cprico SR. Agregar cido
clorhdrico 3 N hasta que la solucin adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar 1 2 gotas adicionales de azul de
timol SR), luego diluir con agua hasta 100 mL.
Solucin de cianuro de potasio: Disolver 50 g de cianuro de potasio en suficiente agua para obtener 100 mL. Eliminar el
plomo de esta solucin extrayendo con porciones sucesivas de Solucin de extraccin de ditizona, segn se describe en Solucin
de citrato de amonio, luego extraer cualquier ditizona remanente en la solucin de cianuro agitando con cloroformo. Finalmente diluir la solucin de cianuro con suficiente agua para que cada porcin de 100 mL contenga 10 g de cianuro de potasio.
Solucin de ditizona estndar: Disolver 10 mg de ditizona en 1000 mL de cloroformo. Mantener la solucin en un frasco
exento de plomo con tapn de vidrio, envuelto adecuadamente para protegerlo de la luz, y almacenar en un refrigerador.
Pruebas Qumicas / 261 Mercurio 271
USP 38
Procedimiento
261 MERCURIO
Mtodo I
NOTAEl ditizonato mercrico es fotosensible. Realizar esta prueba en un lugar con luz tenue.
Reactivos
SOLUCIN MADRE DE DITIZONADisolver 40 mg de ditizona en 1000 mL de cloroformo.
SOLUCIN VOLUMTRICA DE DITIZONADiluir 30,0 mL de Solucin Madre de Ditizona con cloroformo hasta 100,0 mL. Esta solucin contiene aproximadamente 12 mg de ditizona por litro.
SOLUCIN MADRE DE MERCURIOTransferir 135,4 mg de cloruro mercrico a un matraz volumtrico de 100 mL y diluir a volumen con cido sulfrico 1 N. Esta solucin contiene la cantidad equivalente a 100 mg de Hg en 100 mL.
SOLUCIN DE MERCURIO PARA ESTANDARIZAR LA SOLUCIN VOLUMTRICA DE DITIZONATransferir 2,0 mL de Solucin Madre de Mercurio a un matraz volumtrico de 100 mL y diluir a volumen con cido sulfrico 1 N. Cada mL de esta solucin contiene el
equivalente a 20 mg de Hg.
Las siguientes soluciones son necesarias en la prueba de lmite para mercurio que se especifica en las monografas de Fumarato Ferroso, Sulfato Ferroso y Sulfato Ferroso Seco.
SOLUCIN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINAPreparar segn se indica en la prueba para Plomo 251.
SOLUCIN ESTNDAR DE MERCURIOEn el da de uso, diluir cuantitativamente 1,0 mL de la Solucin Madre de Mercurio con
cido sulfrico 1 N hasta 1000 mL. Cada mL de la solucin resultante contiene el equivalente a 1 mg de mercurio.
SOLUCIN DE EXTRACCIN CON DITIZONAPreparar segn se indica en la prueba para Plomo 251.
SOLUCIN DE EXTRACCIN CON DITIZONA DILUIDAInmediatamente antes de usar, diluir 5 mL de la Solucin de Extraccin con
Ditizona con 25 mL de cloroformo.
Captulos
Preparacin de prueba o Solucin muestra

[NOTASi en la siguiente preparacin, la sustancia en anlisis reacciona con demasiada rapidez y empieza a carbonizarse
con 5 mL de cido sulfrico antes del calentamiento, usar en su lugar 10 mL de cido sulfrico diluido (1 en 2) enfriado y
agregar unas pocas gotas de perxido de hidrgeno antes del calentamiento.]
Cuando la monografa no especifique la preparacin de una solucin, preparar una Preparacin de prueba o Solucin muestra,
segn se indica a continuacin. [PrecaucinTomar precauciones de seguridad en este procedimiento, ya que algunas sustancias
pueden reaccionar con violencia explosiva al digerirlas con perxido de hidrgeno.]
Transferir 1,0 g de la sustancia en anlisis a un matraz adecuado, agregar 5 mL de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio, y
digerir sobre una placa de calentamiento en una campana hasta que comience la carbonizacin. Se pueden usar otros medios
de calentamiento adecuados. (Agregar cido sulfrico adicional, si fuera necesario, para humedecer la sustancia completamente, pero no agregar ms de un total de 10 mL.) Agregar, gota a gota y con cuidado, perxido de hidrgeno al 30%, permitiendo que la reaccin disminuya y calentar despus de agregar cada gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente, mezclar con cuidado para evitar una reaccin rpida y suspender el calentamiento si se produce espuma en exceso. Agitar por
rotacin suave la solucin en el matraz para evitar que la sustancia sin reaccionar se aglutine a las paredes del matraz. [NOTA
Agregar perxido cuando la mezcla se torne de color marrn o se oscurezca.] Continuar la digestin hasta que la sustancia se
destruya por completo, se desprendan humos de trixido de azufre abundantes y la solucin se torne incolora. Enfriar y agregar cuidadosamente 10 mL de agua. Evaporar hasta que se genere trixido de azufre nuevamente y enfriar. Repetir este procedimiento con otros 10 mL de agua para eliminar cualquier traza de perxido de hidrgeno. Diluir cuidadosamente con 10 mL
de agua y enfriar.
Anlisis: Transferir a un separador la Preparacin de prueba o la Solucin muestra, enjuagando con 10 mL de agua o con el
volumen de la muestra preparada especificado en la monografa y, a menos que se indique algo diferente en la monografa,
agregar 6 mL de Solucin de citrato de amonio y 2 mL de Solucin de clorhidrato de hidroxilamina. (Para la determinacin de
plomo en sales de hierro, usar 10 mL de Solucin de citrato de amonio.) Agregar 2 gotas de rojo fenol SR y alcalinizar la solucin
(slo hasta color rojo) agregando hidrxido de amonio. Enfriar la solucin, si fuera necesario, y agregar 2 mL de Solucin de
cianuro de potasio. Extraer de inmediato la solucin con porciones de 5 mL de Solucin de extraccin de ditizona, vaciando cada
extracto en otro separador, hasta que la solucin de ditizona retenga su color verde. Agitar las soluciones de ditizona combinadas durante 30 segundos con 20 mL de cido ntrico diluido (1 en 100) y desechar la capa clorofrmica. Agregar 5,0 mL de
Solucin de ditizona estndar y 4 mL de Solucin de cianuro y amonaco a la solucin cida y agitar durante 30 segundos.
Criterios de aceptacin: El color de la capa clorofrmica no tiene un tono violeta ms intenso que el de un control preparado con un volumen de Solucin de plomo estndar diluida, equivalente a la cantidad de plomo permitida en la muestra en anlisis, y usando las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma manera que en la prueba con la muestra.
272 261 Mercurio / Pruebas Qumicas
USP 38
Estardarizacin de la Solucin Volumtrica de DitizonaTransferir 1,0 mL de la Solucin de Mercurio para Estandarizar la

Solucin Volumtrica de Ditizona a un separador de 250 mL y agregar 100 mL de cido sulfrico 1 N, 90 mL de agua, 1 mL de
cido actico glacial y 10 mL de solucin de clorhidrato de hidroxilamina (1 en 5). Valorar la solucin con la Solucin Volumtrica de Ditizona transferida desde una microbureta de 10 mL, agitando la mezcla 20 veces despus de cada adicin y dejando
que la capa clorofrmica se separe, y luego desechar la capa clorofrmica. Continuar hasta que una ltima adicin de la Solucin Volumtrica de Ditizona haga que la solucin tome una coloracin verde despus de agitarla. Calcular la cantidad, en mg,
de Hg equivalente a cada mL de la Solucin Volumtrica de Ditizona, por la frmula:
20/V
Captulos
en donde V es el volumen, en mL, de la Solucin Volumtrica de Ditizona agregada.

Preparacin de PruebaTransferir aproximadamente 2 g de la sustancia en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
Erlenmeyer de 250 mL con tapn de vidrio, agregar 20 mL de una mezcla de volmenes iguales de cido ntrico y cido sulfrico, acoplar un condensador adecuado, someter la mezcla a reflujo durante 1 hora, enfriar, diluir cuidadosamente con agua y
calentar a ebullicin hasta que no se perciban vapores de cido nitroso. Enfriar la solucin, diluir cuidadosamente con agua,
transferir a un matraz volumtrico de 200 mL, diluir a volumen con agua, mezclar y filtrar.
ProcedimientoTransferir 50,0 mL de la Preparacin de Prueba a un separador de 250 mL y extraer con pequeas porciones sucesivas de cloroformo hasta que el ltimo extracto clorofrmico permanezca incoloro. Desechar el extracto clorofrmico
y agregar 50 mL de cido sulfrico 1 N, 90 mL de agua, 1 mL de cido actico glacial y 10 mL de solucin de clorhidrato de
hidroxilamina (1 en 5) a la Preparacin de Prueba extrada. Proceder segn se indica en Estandarizacin de la Solucin Volumtrica de Ditizona, comenzando donde dice Valorar la solucin. Calcular la cantidad de mercurio.
Mtodo IIa y Mtodo IIb

Instrumento de Deteccin de MercurioUsar cualquier espectrofotmetro de absorcin atmica adecuado equipado con
un registrador de respuesta rpida y capaz de medir la radiacin absorbida por los vapores de mercurio en la lnea de resonancia del mercurio a 253,6 nm. [NOTALavar todo el material de vidrio asociado a la prueba con cido ntrico y enjuagar bien
con agua antes de usar.]
Aparato de AireacinEl aparato (ver el diagrama adjunto) consiste en un caudalmetro capaz de medir velocidades de
flujo entre 500 y 1000 mL por minuto, conectado a travs de una llave de paso de tres vas equipada con un tapn de tefln a
un vaso de aireacin (frasco de lavado de gases de 250 mL), seguido de una trampa, un tubo de secado relleno con perclorato
de magnesio, una celda de flujo de 10 cm 25 mm con ventanas de cuarzo y, por ltimo, un orificio de ventilacin a una
campana de extraccin.
Aparato de Aireacin de Mercurio

Reactivos
Solucin de Permanganato de PotasioDisolver 5 g de permanganato de potasio en 100 mL de agua.
Solucin de Clorhidrato de HidroxilaminaDisolver 10 g de clorhidrato de hidroxilamina en 100 mL de agua.
Solucin de Cloruro EstannosoDisolver 10 g de SnCl2 2H2O en 20 mL de cido clorhdrico tibio y agregar 80 mL de agua.
Preparar soluciones nuevas cada semana.
Solucin Estndar de MercurioPreparar a partir de la Solucin Madre de Mercurio segn se indica en Mtodo I. Cada mL de la
Solucin Estndar de Mercurio contiene el equivalente a 1 mg de mercurio.
Preparacin de PruebaA menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar la cantidad, en g, de la
sustancia de prueba calculada por la frmula:
2,0/L
Pruebas Qumicas / 261 Mercurio 273
USP 38
en donde L es el lmite de mercurio, en ppm.
Mtodo IIa
Mtodo IIb
PrecaucinAlgunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva cuando se digieren con perxido de hidrgeno. Tomar
precauciones de seguridad en todo momento.
Preparacin EstndarPipetear 2,0 mL de la Solucin Estndar de Mercurio y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 mL,
agregar 3 mL de cido ntrico y 3 mL de cido sulfrico, mezclar y agregar una cantidad de perxido de hidrgeno al 30 por
ciento igual a la cantidad total usada para preparar la Preparacin de Prueba. Acoplar un condensador enfriado por agua adecuado con una junta ahusada estndar que se ajuste al matraz y someter a reflujo la mezcla en una campana de extraccin
durante 1 hora. Cortar el agua que circula a travs del condensador y calentar hasta que aparezcan humos blancos en el matraz. Enfriar y agregar cuidadosamente 10 mL de agua a travs del condensador mezclando, por rotacin suave. Volver a calentar hasta que aparezcan humos blancos, enfriar y agregar otros 15 mL de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz para obtener un volumen de 35 mL. Agregar 1 mL de la Solucin de Permanganato de Potasio, calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
Preparacin de PruebaTransferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 mL.
Agregar 5 mL de cido ntrico, 5 mL de cido sulfrico y algunas perlas de vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por
agua adecuado con una junta ahusada estndar que se ajuste al matraz y digerir en una campana de extraccin, preferentemente sobre una placa de calentamiento, y a una temperatura que no exceda los 120 hasta que comience la carbonizacin.
(Si se necesita cido sulfrico adicional para humedecer la muestra por completo, agregarlo cuidadosamente a travs del condensador, pero sin permitir que el volumen total agregado exceda de 10 mL.) Despus de que el cido haya descompuesto la
sustancia de prueba, agregar cuidadosamente, gota a gota a travs del condensador, perxido de hidrgeno al 30 por ciento,
permitir que la reaccin disminuya su intensidad, calentar nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy lentamente y mezclando bien para evitar una reaccin rpida; detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la
reaccin haya disminuido, calentar cuidadosamente y girar el matraz ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine
sobre el vidrio expuesto a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidacin en todo momento durante la
digestin agregando pequeas cantidades de solucin de perxido de hidrgeno cuando la mezcla se vuelva de color marrn
o se oscurezca. Continuar la digestin hasta que la materia orgnica se destruya y luego calentar a reflujo la mezcla durante 1
hora. Cortar el agua que circula a travs del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes humos de trixido
de azufre y la solucin se vuelva incolora o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar cuidadosamente 10 mL
de agua a travs del condensador, mezclando por rotacin suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos blancos.
Enfriar y agregar cuidadosamente 15 mL de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos mL de
agua para obtener un volumen de 35 mL. Agregar 1 mL de la Solucin de Permanganato de Potasio, calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
ProcedimientoProceder segn se indica en el Procedimiento en Mtodo IIa.
Captulos
Preparacin EstndarPipetear 2,0 mL de la Solucin Estndar de Mercurio, transferir a un vaso de precipitados de 100 mL
y agregar 35 mL de agua, 3 mL de cido sulfrico y 1 mL de solucin de permanganato de potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
Preparacin de PruebaTransferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un vaso de precipitados de 100 mL y
agregar 35 mL de agua. Mezclar y entibiar para disolver, si fuera necesario. Agregar 2 gotas de fenolftalena SR y, segn sea
necesario, neutralizar lentamente revolviendo constantemente, usando hidrxido de sodio 1 N o cido sulfrico 1 N. Agregar 3
mL de cido sulfrico y 1 mL de la Solucin de Permanganato de Potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj,
calentar a ebullicin durante unos segundos y enfriar.
ProcedimientoEnsamblar el Aparato de Aireacin segn se muestra en el diagrama adjunto, con el vaso de aireacin y la
trampa vacos y la llave de paso en la posicin de desvo. Conectar el aparato a una celda de absorcin y ajustar la velocidad
de flujo del aire o del nitrgeno de modo que, en el procedimiento siguiente, se obtengan una absorcin y una reproducibilidad mximas sin la formacin excesiva de espuma en la solucin de prueba. Obtener una lectura inicial estable a 253,6 nm
segn las instrucciones de funcionamiento del fabricante del instrumento.
Tratar la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba de modo similar, de la siguiente manera. Eliminar el exceso de permanganato agregando Solucin de Clorhidrato de Hidroxilamina, gota a gota, hasta que la solucin quede incolora. Lavar inmediatamente con agua la solucin en el vaso de aireacin y diluir con agua hasta 100 mL. Agregar 2 mL de la Solucin de Cloruro
Estannoso y reconectar inmediatamente el vaso de aireacin al aparato de aireacin. Girar la llave de paso de la posicin de
desvo a la posicin de aireacin y continuar la aireacin hasta que se haya pasado el pico de absorcin y la pluma registradora
vuelva al valor inicial. Desconectar el vaso de aireacin del aparato y lavar con agua despus de cada uso. Despus de hacer
correcciones por cualquier blanco de reactivo, toda absorbancia producida por la Preparacin de Prueba no excede la producida por la Preparacin Estndar.
274 267 Porosimetra por Intrusin de Mercurio / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
267 POROSIMETRA POR INSTRUSIN DE MERCURIO

En general, los diversos tipos de poros se pueden representar como aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo slido o como espacios (es decir, intersticios o espacios vacos) entre partculas slidas en un lecho, compacto o agregado. Porosidad es un trmino comnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material slido y se define con mayor precisin
como la relacin entre el volumen de poros y espacios vacos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del
slido. Adems de los poros accesibles, un slido puede comprender poros cerrados, que estn aislados de la superficie externa y a los cuales no son capaces de penetrar los fluidos. Este captulo general no abarca la caracterizacin de poros cerrados, es
decir, cavidades sin acceso a una superficie externa.
Los materiales porosos pueden presentarse en forma de polvos finos o gruesos, compactos, extrudidos, lminas o monolitos,
y su caracterizacin a menudo implica la determinacin del volumen total de los poros o porosidad, as como la distribucin
del tamao de los poros.
Se ha establecido debidamente que el desempeo de un slido poroso (p.ej., su resistencia, reactividad, permeabilidad o
poder adsorbente) depende de la estructura de sus poros. Se ha desarrollado un gran nmero de mtodos distintos para caracterizar la estructura de los poros. En vista de la complejidad de la mayora de los slidos porosos, no resulta extrao obtener
resultados que no siempre concuerdan y que no exista una tcnica definitiva que pueda garantizar una imagen completa de la
estructura de los poros. La seleccin del mtodo ms adecuado depende de la aplicacin del slido poroso, de su naturaleza
fsica y qumica, y del rango de tamaos de poro.
Este captulo ofrece pautas para medir la porosidad y la distribucin del tamao de los poros mediante porosimetra de mercurio, la cual es una prueba comparativa, generalmente destructiva, en la que el volumen de mercurio que penetra en un poro
o espacio vaco se determina como una funcin de la presin hidrosttica aplicada, que se puede relacionar con el dimetro
del poro. Asimismo, se puede inferir otra informacin a partir de las curvas de volumen-presin, por ejemplo, la forma de los
poros y sus interconexiones, el rea de las superficies interna y externa, la granulometra del polvo y la densidad aparente y
despus del asentamiento; sin embargo, el alcance del presente captulo no abarca dichos aspectos de la tcnica.
Las consideraciones prcticas actualmente limitan la presin absoluta mxima aplicada que pueden alcanzar algunos equipos de aproximadamente 400 MPa, que corresponde a un dimetro mnimo de poro equivalente a aproximadamente 0,003
mm. El dimetro mximo estar limitado por el tamao de la muestra debido a la diferencia del frente hidrosttico del mercurio entre los extremos superior e inferior de la muestra. Para la mayora de los propsitos, se puede considerar que este lmite
es de aproximadamente 400 mm.
Resulta posible determinar la porosidad interparticular e intraparticular, pero el mtodo no distingue entre estas porosidades
cuando coexisten.
El mtodo es apropiado para el estudio de la mayora de los materiales porosos. Sin embargo, puede no ser apropiado para
materiales que se amalgaman con mercurio, como ciertos metales, o puede ser necesaria una pasivacin preliminar. Asimismo,
la presin puede deformar o compactar otros materiales. En algunos casos, se pueden aplicar correcciones a la compresibilidad
de la muestra y an as obtener datos comparativos tiles.
La porosimetra de mercurio debe considerarse una tcnica comparativa, debido a que, para la mayora de los medios porosos, no se encuentra disponible una teora que permita un clculo absoluto de resultados de la distribucin del tamao de los
poros. Por lo tanto, esta tcnica se recomienda principalmente para estudios de desarrollo.
El mercurio es txico. Se deben tomar precauciones adecuadas para salvaguardar la salud del operador y de aqullos que
operen en el rea. El material de desecho se debe eliminar de una manera adecuada, de conformidad con los reglamentos
locales.
PRINCIPIO
La tcnica se basa en la medicin del volumen de mercurio resultante de la intrusin en un slido poroso como una funcin
de la presin aplicada. La medicin incluye nicamente aquellos poros en los que el mercurio puede penetrar a la presin aplicada.
Un lquido no humectante penetra en un sistema poroso slo a presin. La presin aplicada es inversamente proporcional al
ancho interno del poro. En poros cilndricos, la correlacin entre el dimetro del poro y la presin se obtiene mediante la ecuacin de Washburn:
p
dp
s
q
= presin aplicada, en pascales

= dimetro del poro, en metros
= tensin superficial del mercurio, en newtons por metro
= ngulo de contacto entre el mercurio y la muestra, en grados
USP 38
Pruebas Qumicas / 267 Porosimetra por Intrusin de Mercurio 275
APARATO
El portamuestras, conocido como penetrmetro o dilatmetro, tiene un tubo capilar calibrado a travs del cual se puede
evacuar la muestra y por el que puede entrar el mercurio. El tubo capilar est unido a un tubo ms ancho en el que se coloca
la muestra. El cambio en el volumen de mercurio resultante de la intrusin por lo general se mide por el cambio de la capacitancia entre la columna de mercurio en el tubo capilar y una funda metlica que rodea la parte externa del tubo capilar. Cuando se requieren mediciones precisas, el volumen interno del tubo capilar debe ser entre 20% y 90% del volumen previsto del
poro y de los espacios vacos de la muestra. Debido a que los distintos materiales presentan un amplio rango de porosidad,
pueden ser necesarios varios penetrmetros equipados con tubos capilares con diferentes dimetros y volmenes de muestra.
La Figura 1 presenta una configuracin tpica para un instrumento de porosimetra de mercurio. El porosmetro puede tener
diferentes puertos para la operacin a alta y baja presin; tambin es posible llevar a cabo la medicin a baja presin en una
unidad distinta.
El intervalo de presin es, por lo general, de 4 kPa a 300 kPa para la operacin a baja presin, y superior a 300 kPa para la
operacin a alta presin, lo cual depende particularmente del diseo del aparato y del uso previsto.
Captulos
Figura 1. Ejemplo de la configuracin de un instrumento para porosimetra de mercurio.
MTODO
Preparacin de la MuestraTratar la muestra previamente mediante calentamiento y/o evacuacin o con un flujo de gas
inerte para eliminar el material adsorbido que pudiera ocultar su porosidad accesible. La pasivacin de la superficie de slidos
humectables o amalgamables se puede lograr produciendo una capa fina de xido o recubriendo con estearato. Pesar la muestra del slido previamente tratado y transferir al penetrmetro. Luego, desgasificar el sistema de poros de la muestra al vaco
hasta una presin residual mxima de 7 Pa.
Llenado del Penetrmetro con MercurioUsar mercurio de calidad analtica. Cubrir la muestra con mercurio al vaco. El
vaco es necesario para asegurar la transferencia del mercurio desde el reservorio al penetrmetro. En un penetrmetro lleno,
la presin de llenado comprende la presin aplicada ms la contribucin de presin generada por el frente de mercurio que
entra en contacto con la muestra. La presin de llenado tpica es aproximadamente 4 kPa. Se puede minimizar la presin hidrosttica del mercurio sobre la muestra llenando el penetrmetro en las posiciones horizontales.
Medicin a Baja PresinAplicar aire o nitrgeno de manera controlada para incrementar la presin en las etapas correspondientes a los tamaos de los poros de inters o de manera continua a una velocidad baja. Registrar el cambio concomitante en la longitud de la columna de mercurio en el tubo capilar. Una vez alcanzada la presin mxima requerida, reducirla hasta
presin ambiental.
Medicin a Alta PresinDespus de medir en condiciones de baja presin, transferir el penetrmetro cargado con mercurio al puerto o unidad de alta presin del instrumento y cubrir con fluido hidrulico. El mercurio penetra en el sistema de
poros por medio del fluido hidrulico. Incrementar la presin en el sistema hasta la presin mxima alcanzada en la medicin a
baja presin y registrar el volumen de intrusin a esta presin, debido a que los volmenes de intrusin subsiguientes se calculan a partir de este volumen inicial. Incrementar la presin en las etapas correspondientes a los tamaos de poro de inters o
de manera continua a una velocidad baja. La cada en la columna de mercurio se mide hasta la presin mxima requerida. En
276 267 Porosimetra por Intrusin de Mercurio / Pruebas Qumicas
USP 38
caso necesario, se puede reducir la presin por etapas o de manera continua a una velocidad baja para determinar la curva de
extrusin del mercurio. Corregir para considerar los cambios en el volumen del mercurio, el penetrmetro y dems componentes del sistema detector de volumen a presin elevada. El grado de las correcciones requeridas se puede determinar a travs de mediciones blanco aplicando las mismas condiciones. La Figura 2 presenta una curva de volumenpresin determinada
experimentalmente.
Figura 2. Curva de volumenpresin como grfica semilogartmica.
Captulos
INFORME DE LOS RESULTADOS

Convertir las lecturas de la presin a dimetro de los poros usando la ecuacin de Washburn u otro modelo.
La tensin superficial de mercurio, s, no slo depende de la temperatura y del material, sino tambinen el caso de las
reas superficiales con curvas marcadasdel radio de la curvatura. En general, los valores entre 0,41 N m-1 y 0,52 N m-1 se
miden a temperatura ambiente. Si no se conoce el valor, se puede usar s = 0,48 N m1 .
El ngulo de contacto del mercurio, q, es ms de 90 en la mayora de los casos y se puede determinar con un instrumento
para medir el ngulo de contacto. Si no se conoce el valor q, se puede usar 130. Informar los valores de ngulo de contacto,
tensin superficial, as como el modelo usado para el clculo. La visualizacin de los datos se puede realizar mediante varios
tipos de grficas. Frecuentemente, se visualiza la distribucin del tamao de poros representando el dimetro de poro en las
abscisas y el volumen especfico dependiente de la intrusin en las ordenadas. En este caso, resulta apropiado representar las
abscisas en escala logartmica (ver la Figura 3). Los espacios entre las partculas de la muestra slida se incluyen como poros en
el clculo. Si los poros difieren en tamao de los espacios vacos, stos ltimos se pueden separar seleccionando el intervalo de
tamao de poro pertinente.
No se pueden usar las curvas de extrusin para calcular la distribucin del tamao de los poros (para histresis, ver la Figura
2), debido a que una parte del mercurio resultante de la intrusin siempre permanece en el sistema de poros. La relacin de
retencin puede ser de utilidad para la caracterizacin cualitativa de los poros a los que nicamente se puede acceder a travs
de aberturas estrechas (poros en forma de tintero).
Los valores caractersticos ms comunes, como el volumen especfico total resultante de la intrusin, la media y la mediana
del dimetro de poro se calculan a partir de la distribucin del tamao de los poros. Asimismo, la documentacin del procedimiento debe comprender la muestra, su preparacin, las condiciones de evacuacin y el instrumento utilizado.
Figura 3. Distribucin del volumen de los poros como grfica semilogartmica.
CONTROL DEL DESEMPEO DEL INSTRUMENTO

Puesto que la tcnica de porosimetra de mercurio es considerada una prueba comparativa, este captulo no proporciona
detalles sobre la misma. Sin embargo, se recomienda analizar un material de comparacin estable de manera rutinaria para
monitorear la calibracin y el desempeo del instrumento.
USP 38
Pruebas Fsicas / 268 Porosidad Mediante AdsorcinDesorcin de Nitrgeno 277
268 POROSIDAD MEDIANTE ADSORCINDESORCIN DE

NITRGENO
INTRODUCCIN
APARATO
Las mediciones generalmente se llevan a cabo usando el procedimiento volumtrico esttico, aunque tambin se pueden
emplear mtodos de flujo dinmico. Los usuarios de equipos comercialmente disponibles deben referirse a los documentos y
manuales del fabricante para obtener una descripcin de su aparato en particular. Por ejemplo, un aparato volumtrico esttico debe proveer lo siguiente: sistema de vaco para una presin de menos de 10 Pa, suministro de volmenes conocidos de
nitrgeno y helio de alta pureza, medicin exacta de presin y temperatura, y un medio para enfriar la muestra a la temperatura del nitrgeno lquido.
PRINCIPIO DE MEDICIN
La adsorcin de un gas inerte sobre las superficies slidas a bajas temperaturas es un fenmeno bien conocido y es el fundamento para la medicin del rea superficial de los slidos (ver el captulo general rea Superficial Especfica 846). A medida
que el gas se adsorbe sobre una superficie, se puede condensar en el interior de los poros accesibles. El volumen total de poro
y la distribucin de tamao de poro se pueden derivar de la isoterma de adsorcin de gas, la cual es una medicin de la cantidad adsorbida como una funcin de la presin parcial del adsorbato. Las isotermas de adsorcin se dividen en seis categoras
generales, dependiendo de la energtica relativa de la adsorcin y la presencia de poros. La Figura 1 representa las seis categoras generales de isotermas de adsorcin.
Los microporos (poros con tamaos menores de 2 nm) con frecuencia generan isotermas tipo I. Los mesoporos y macroporos normalmente producen isotermas tipo IV, pero la histresis puede ser difcil de observar en poros con tamaos mayores a
aproximadamente 100 nm, lo que produce una isoterma tipo II. Aunque es posible derivar cierta informacin, tal como la porosidad total, para materiales microporosos, la determinacin de las distribuciones del tamao de poro en dicho intervalo de
tamao est fuera del alcance de este captulo.
El adsorbato preferido es nitrgeno, mientras que la isoterma se determina a la temperatura del nitrgeno lquido (77,4 K).
Se pueden usar otros adsorbatos para propsitos especiales, aunque no se tratan en este captulo.
Captulos
La porosidad es un trmino comnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material slido y se define, con mayor precisin, como la relacin entre el volumen de poros y espacios vacos accesibles y el volumen total ocupado por una
cantidad dada del slido. Los poros cerrados o inaccesibles que estn aislados de la superficie externa se excluyen de esta definicin de volumen de poro. Los poros (o espacios vacos) pueden incluir aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo
slido o espacios entre partculas slidas en un compacto o agregado. Los poros se presentan en una variedad de materiales
slidos ms all de los compactos y los agregados, tales como polvos y tabletas, y su caracterizacin a menudo implica la determinacin del volumen de poro total o porosidad, as como la distribucin del tamao de poro. Por lo general, la clasificacin de los poros se hace por tamao en los siguientes grupos:
Microporosmenores de 2 nm
Mesoporos2 a 50 nm
Macroporosmayores de 50 nm
El mtodo del presente captulo, Porosidad mediante AdsorcinDesorcin de Nitrgeno 268, es complementario al del captulo general Porosimetra por Intrusin de Mercurio 267. La porosimetra por mercurio puede, en principio (tericamente),
usarse con dimetros de poro de 3 nm a 400 mm, aunque se aplica mayormente para el intervalo de 100 nm a 200 mm. La
adsorcindesorcin de nitrgeno se puede usar para caracterizar poros con tamaos menores de aproximadamente 300 nm,
pero es ms apropiado para el anlisis de mesoporos y en el intervalo inferior de macroporos de 2 a 100 nm.
USP 38
Captulos
278 268 Porosidad Mediante AdsorcinDesorcin de Nitrgeno / Pruebas Fsicas
Figura 1. Tipos de Isotermas. [Reproducido con autorizacin y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Reporting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommendations 1984)(Informe de fisisorcin para sistemas de gas/slido con referencia especial a la determinacin del rea superficial y
la porosidad. (Recomendaciones 1984) Pure Appl Chem. 1985;57(4):603619, Figura 2.]
PROCEDIMIENTO
Antes del anlisis, los analistas deben desgasificar la muestra para eliminar gases y vapores que se hayan adsorbido fsicamente sobre la superficie. Resulta necesario demostrar las condiciones de desgasificacin para obtener una adsorcindesorcin reproducible, un peso constante de la muestra y que no se produzcan cambios fsicos o qumicos detectables en la muestra. La desgasificacin de un gran nmero de sustancias a menudo se consigue mediante vaco, purgando la muestra en una
corriente fluida de gas seco no reactivo o aplicando un procedimiento de adsorcindesorcin cclica. Si resultara apropiado,
los analistas pueden aplicar temperaturas elevadas para aumentar la velocidad a la que los contaminantes abandonan la superficie. Los analistas deben ser precavidos para evitar que se afecte la naturaleza de la superficie y la integridad de la muestra
cuando se desgasifica a temperaturas elevadas. Si se emplea calentamiento, la temperatura y el tiempo de desgasificacin recomendados deben ser los mnimos requeridos para lograr una medicin reproducible de la isoterma de adsorcindesorcin.
Los analistas deben determinar la masa de la muestra despus de desgasificar o como alternativa, deben determinar la masa
despus de la medicin de adsorcindesorcin. El rea superficial total de la muestra debe ser mayor que 1 m2 y de preferencia mayor que 5 m2.
Medicin de las Isotermas

Los detalles especficos del proceso de medicin dependen del procedimiento usado. Los analistas deben seguir las instrucciones del fabricante para el instrumento usado en particular. La siguiente descripcin puede aplicarse de manera general:
Los analistas deben determinar la presin de vapor saturado del adsorbato, p0. Es preferible determinar p0 de manera experimental al momento de la medicin, aunque los analistas pueden usar un valor calculado.
Los analistas deben determinar la isoterma de sorcin de nitrgeno y deben medir el volumen adsorbido, Va, a la presin
relativa ms baja deseada (p/p0, el cociente entre la presin de adsorbato medida y la presin de su vapor saturado).
USP 38
Pruebas Fsicas / 268 Porosidad Mediante AdsorcinDesorcin de Nitrgeno 279
Los analistas repiten la medicin de Va a valores de presin relativa sucesivamente mayores hasta la mxima presin relativa deseada (por lo general, 0,99). Posteriormente, los analistas reducen la presin relativa de manera sucesiva para determinar las cantidades sorbidas en la porcin de desorcin de la isoterma. Los analistas deben medir al menos 20 puntos en
los segmentos de adsorcin y desorcin, abarcando un intervalo de presin relativa (p/p0) de aproximadamente 0,05
0,99. Los valores p/p0 se pueden distribuir para lograr la mejor resolucin de la distribucin del tamao de poro. Cuando
se est usando nicamente el segmento de desorcin para calcular la distribucin del tamao de poro, se pueden usar
menos puntos en el segmento de adsorcin.
ANLISIS DE DATOS
Anlisis de la Isoterma
La isoterma se presenta como una grfica de la cantidad de nitrgeno adsorbido (en volumen, Va, o moles, na) en funcin de
p/p0. Los datos de la isoterma tambin pueden presentarse en formato de tabla. Los tipos de isoterma e histresis se determinan a partir de la grfica, comparndola con los ejemplos de las Figuras 1 y 2. Una isoterma tipo I es comn para materiales
microporosos. Una isoterma tipo IV por lo general se presenta en materiales que contienen mesoporos o macroporos pequeos.
Captulos
Figura 2. Tipos de Ciclos de Histresis. [Reproducido con autorizacin y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et
al. Reporting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommendations 1984)(Informe de fisisorcin para sistemas de gas/slido con referencia especial a la determinacin del rea
superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984). Pure Appl Chem. 1985;57(4):603619, Figura 3.]
Generar una grfica t o aS para comparar la isoterma de la muestra de prueba con la de una isoterma de referencia tambin
ayuda a ilustrar la presencia de micro y mesoporosidad. La isoterma de referencia se puede calcular usando una expresin matemtica, aunque cuando el adsorbente tiene propiedades qumicas similares a las de la muestra de prueba, se recomienda
usar una isoterma de referencia determinada de manera experimental.
El mtodo de la grfica t se basa en la curva t, que es una grfica de la cantidad de nitrgeno adsorbido en el slido no
poroso como una funcin de t, el espesor estadstico de la capa adsorbida. El valor t se calcula mediante:
280 268 Porosidad Mediante AdsorcinDesorcin de Nitrgeno / Pruebas Fsicas
USP 38
Captulos
nm = cantidad de monocapa
a ERR (01-jul-2014) = espesor de una capa molecular simple, por lo general tomada como 0,354 nm para nitrgeno
En el mtodo de la grfica aS, la cantidad de nitrgeno adsorbido por el slido no poroso de referencia se normaliza usando
la cantidad adsorbida a alguna presin relativa fija (na,x), a menudo tomada como 0,4. Posteriormente, la adsorcin normalizada aS (igual a na/na,x) se grafica contra p/p0 para obtener una curva aS.
La grfica t o la grfica aS se construye graficando la cantidad de nitrgeno adsorbido por la muestra de prueba en funcin
de t o aS para el material de referencia, en lugar de p/p0. La conversin de p/p0 a t o aS se lleva a cabo tomando como referencia la curva t o la curva aS. La forma de la grfica depende de la naturaleza de la porosidad presente en la muestra de prueba,
conforme a lo siguiente:
(a) si la grfica t o aS es lineal y pasa a travs del origen, la muestra de prueba es no porosa o macroporosa.
(b) si la muestra de prueba contiene mesoporos, la grfica presenta una desviacin hacia arriba a la presin relativa correspondiente al comienzo de la condensacin capilar en los mesoporos ms pequeos
(c) si la muestra de prueba contiene microporos, la grfica presenta una desviacin hacia abajo debido a que no se pueden
desarrollar mltiples capas dentro del espacio limitado en el interior de los microporos.
Algunos materiales contienen combinaciones de poros, lo que puede resultar en una grfica compleja y difcil de interpretar.
En dichos casos, los analistas deben tener cuidado al analizar la isoterma.
Clculo de la Distribucin del Tamao de Poro

Este anlisis es vlido nicamente para clculos de las distribuciones del tamao de mesoporos.
El clculo de la distribucin del tamao de poro se basa en la ecuacin de Kelvin:
rK = radio del ncleo del poro (o radio de Kelvin) (nm)

sI = tensin superficial (N/m) del adsorbato lquido (nitrgeno)
nI = volumen molar del adsorbato condensado (nitrgeno) (cm3/mol)
R = constante universal de los gases, 8,3144 (J K1 mol1)
T = temperatura (K)
q = ngulo de contacto del adsorbato (0 para una superficie humedecida)
Para nitrgeno, la ecuacin 2 se reduce a:
El radio real del poro, rp, se calcula a partir del radio de Kelvin, corrigiendo por el espesor, t, del adsorbato en las paredes del
poro. Para poros cilndricos, rp = rk + t, y el dimetro del poro, dp, se obtiene mediante dp = 2(rk + t). Debido a la diferente
geometra de los poros en forma de ranura con lados paralelos, el ancho de la ranura se obtiene mediante rk + 2t.
Los analistas pueden calcular la distribucin del tamao de poro por volumen usando el mtodo de Barrett, Joyner y Halenda. Este modelo asume que los poros son rgidos y tienen una forma regular (p.ej., cilndrica o en forma de ranura), que no
hay microporos presentes y que la distribucin del tamao de poro no se extiende continuamente sobre los poros ms grandes que se pueden medir usando este procedimiento, lo cual implica que todos los poros evaluados se llenan a la presin relativa ms alta.
Los clculos de porosidad y de distribucin del tamao de poro que emplean la ecuacin de Kelvin deben realizarse usando
la isoterma de desorcin. La ecuacin de Kelvin se deriv para sistemas macroscpicos y no es estrictamente vlida a la escala
molecular. Por ende, la ecuacin de Kelvin se basa en un menisco intacto para describir con exactitud el fenmeno experimentales. Para los sistemas tratados en este captulo, esto se logra nicamente para la isoterma de desorcin. Sin embargo, para la
desorcin, la aplicacin de la ecuacin de Kelvin a tamaos de poro menores se ve limitada por la tensin superficial del adsorbato. El lmite se ilustra mediante el punto de cierre del ciclo de histresis en la isoterma. Para nitrgeno, este punto ocurre a
una presin relativa de aproximadamente 0,45, que corresponde a un radio de poro cilndrico limitante de aproximadamente
2 nm. Por consiguiente, la ecuacin de Kelvin no es aplicable a los microporos.
Clculo del Volumen de Microporos

Si la grfica t o aS indica la presencia de microporos, el volumen de los microporos se puede obtener a partir de la interseccin de la porcin lineal extrapolada de la curva.
USP 38
Pruebas Qumicas / 281 Residuo de Incineracin 281
Informe de Resultados
Por lo general, los resultados informados pueden incluir el volumen o la porosidad total de los poros, el volumen de los microporos, la media o la mediana del dimetro de poro, la distribucin del tamao de poro y el rea superficial de los poros.
CALIBRACIN Y VERIFICACIN DEL DESEMPEO DEL SISTEMA

Los analistas deben llevar a cabo la calibracin de los componentes individuales de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. La calibracin de transductores de presin y de sensores de temperatura se logra con referencia a dispositivos estndar de medicin de temperatura y presin que cuentan con calibraciones rastreables a estndares nacionales. La calibracin
del volumen del distribuidor mltiple (manifold) se logra a travs de las mediciones apropiadas de presin y temperatura,
usando espacios volumtricos con temperatura constante o slidos con volumen rastreable y conocido.
Un material de referencia certificado o un material de referencia definido localmente que sea rastreable a un material de
referencia certificado debe analizarse de manera regular para monitorear la calibracin y el desempeo del instrumento.
271 PRUEBA PARA SUSTANCIAS FCILMENTE CARBONIZABLES
281 RESIDUO DE INCINERACIN

Partes de este captulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Farmacopea Japonesa. Las partes que no estn armonizadas se indican con los smbolos (). Los textos armonizados de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este captulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pueden usar los mtodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado.
La prueba de Residuo de Incineracin/Cenizas Sulfatadas emplea un procedimiento para medir la cantidad de sustancia residual no volatilizada de una muestra cuando sta se incinera en presencia de cido sulfrico conforme al procedimiento que se
describe a continuacin. Generalmente esta prueba se emplea para determinar el contenido de impurezas inorgnicas en una
sustancia orgnica.
ProcedimientoCalcinar un crisol adecuado (por ejemplo de slice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 50 durante 30
minutos, enfriar el crisol en un desecador (gel de slice u otro desecante adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exactitud 1 a 2 g de la sustancia o la cantidad que se especifica en la monografa individual, en el crisol.
Humedecer la muestra con una pequea cantidad (generalmente 1 mL) de cido sulfrico y luego calentar suavemente a
una temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se carbonice totalmente. Enfriar; y luego , a menos que se
indique algo diferente en la monografa individual, humedecer el residuo con una pequea cantidad (generalmente 1 mL) de
cido sulfrico; calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos y calcinar a 600 50 , a menos que se especifique otra temperatura en la monografa individual, hasta que el residuo est completamente incinerado. Asegurarse, durante
todo el procedimiento, de que no se produzcan llamas en ningn momento. Enfriar el crisol en un desecador (gel de slice u
otro desecante adecuado), pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo.
A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del residuo as obtenido excede el lmite especificado en la monografa individual, humedecer nuevamente con cido sulfrico, calentar y calcinar como se indic anteriormente, usando un
Captulos
En las pruebas para sustancias fcilmente carbonizables, a menos que se indique algo diferente, agregar la cantidad especificada de la sustancia, reducida a polvo fino si se encuentra en forma slida, en pequeas porciones al recipiente para comparacin que es de vidrio incoloro resistente a la accin del cido sulfrico y contiene el volumen especificado de cido sulfrico
(ver en Especificaciones de Reactivos en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su disolucin, dejar la solucin en reposo durante 15 minutos, a
menos que se indique algo diferente, y comparar el color de la solucin con el del Lquido de Comparacin especificado (ver
Color y Acromatismo 631) utilizando un recipiente para comparacin, que tambin es de vidrio incoloro y tiene las mismas
dimensiones internas y cruzadas, observando los lquidos transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio
blanco.
Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el cido sulfrico, mezclar la muestra y el cido en un tubo de ensayo,
calentar segn se indica y transferir la solucin al recipiente para comparacin para observarla con el Lquido de Comparacin
designado (ver Color y Acromatismo 631).
282 281 Residuo de Incineracin / Pruebas Qumicas
USP 38
perodo de incineracin de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del residuo no difieran en ms de 0,5 mg o hasta
que el porcentaje del residuo cumpla con el lmite establecido en la monografa individual.
Realizar la incineracin en una campana bien ventilada, pero protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura
posible para lograr la combustin completa del carbn. Puede usarse una mufla, si se desea, cuyo uso para la calcinacin final
se recomienda a 600 50.
La mufla se puede calibrar empleando un termmetro digital adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra
un termopar estndar rastreable al Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls).
Verificar la exactitud de los circuitos de medicin y control de la mufla mediante la comprobacin de la temperatura fijada
para el uso previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las posiciones que reflejen el mtodo de uso eventual con respecto a la ubicacin de la muestra en anlisis. La tolerancia es de 25 en cada posicin medida.
Captulos
291 SELENIO
Solucin MadreDisolver 40,0 mg de selenio metlico en 100 mL de cido ntrico diluido (1 en 2) en un matraz volumtrico de 1000 mL, calentar moderadamente en un bao de vapor, si fuera necesario para completar la disolucin, agregar
agua a volumen y mezclar. Pipetear 5 mL de esta solucin y transferir a un matraz volumtrico de 200 mL, agregar agua a
volumen y mezclar. Cada mL de la solucin resultante contiene la cantidad equivalente a 1 mg de selenio (Se).
Solucin de DiaminonaftalenoDisolver 100 mg de 2,3-diaminonaftaleno y 500 mg de clorhidrato de hidroxilamina en
cido clorhdrico 0,1 N para obtener 100 mL. Preparar esta solucin el mismo da de su uso.
Solucin EstndarPipetear 6 mL de Solucin Estndar y transferir a un vaso de precipitados de 150 mL, y agregar 25 mL
de cido ntrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua.
Solucin de PruebaLa combustin completa del material de prueba es un factor importante para realizar la prueba. Para
los compuestos que se queman mal y producen holln, la adicin de xido de magnesio por lo general da como resultado una
combustin ms minuciosa y reduce la formacin de holln. Cuando se haya detectado la necesidad de agregar xido de magnesio, sta se especificar en la monografa individual. Utilizando un matraz de combustin de 1000 mL y empleando 25 mL
de cido ntrico diluido (1 en 30) como lquido absorbente, proceder segn se indica en Combustin en Matraz con Oxgeno
471, empleando 100 mg a 200 mg de muestra de prueba, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual. Al finalizar la combustin, colocar algunos mL de agua en el matraz, aflojar el tapn, luego enjuagar el tapn, el portamuestras y las paredes del matraz con aproximadamente 10 mL de agua. Transferir la solucin a un vaso de precipitados de
150 mL con la ayuda de aproximadamente 20 mL de agua y calentar moderadamente hasta temperatura de ebullicin. Calentar a ebullicin durante 10 minutos y dejar que se enfre a temperatura ambiente.
ProcedimientoTratar concomitantemente y en paralelo la Solucin Estndar, la Solucin de Prueba y el blanco de reactivos
constituido por 25 mL de cido ntrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua, segn se indica a continuacin. Agregar solucin de
hidrxido de amonio (1 en 2) para ajustar a un pH de 2,0 0,2. Diluir con agua a 60 mL y transferir a un separador de vidrio
con proteccin actnica con la ayuda de 10 mL de agua, agregando los 10 mL al separador. Agregar 200 mg de clorhidrato de
hidroxilamina, agitar por rotacin moderada para disolver; de inmediato agregar 5,0 mL de Solucin de Diaminonaftaleno, tapar y mezclar por rotacin suave. Dejar la solucin en reposo a temperatura ambiente durante 100 minutos. Agregar 5,0 mL
de ciclohexano, agitar vigorosamente durante 2 minutos y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y centrifugar el extracto de ciclohexano para eliminar el agua dispersada. Determinar las absorbancias de los extractos de ciclohexano
de la Solucin de prueba y de la Solucin estndar en una celda de 1 cm, a la longitud de onda de mxima absorcin, aproximadamente a 380 nm, con un espectrofotmetro adecuado, usando el extracto de ciclohexano del blanco de reactivos como
blanco, y comparar las absorbancias: la absorbancia de la Solucin de Prueba no es mayor que la de la Solucin Estndar cuando
se ha tomado una muestra de prueba de 200 mg, o no es mayor que la mitad de la absorbancia de la Solucin Estndar cuando se ha tomado una muestra de prueba de 100 mg.
OTRAS PRUEBAS Y VALORACIONES

301 CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE CIDO
NOTATodas
las pruebas se deben realizar a una temperatura de 37 3.

Calibracin del Medidor de pHCalibrar un medidor de pH usando soluciones amortiguadoras de calibracin de biftalato
de potasio 0,05 m y de tetraoxalato de potasio 0,05 m como se describe en pH 791.
Pruebas Qumicas / 301 Capacidad Neutralizante de cido 283
USP 38
mEq totales = (30 NHCl) (VNaOH NNaOH)

en donde NHCl y NNaOH son las normalidades del cido clorhdrico SV y del hidrxido de sodio SV, respectivamente; y VNaOH es el
volumen de hidrxido de sodio SV usado para la valoracin. Expresar el resultado como mEq del cido consumido por g de la
sustancia analizada.
Procedimiento para Tabletas que Deben MasticarsePipetear 30,0 mL de cido clorhdrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparacin de Prueba mientras se contina mezclando con el Mezclador Magntico durante 10 minutos, cronometrados con
exactitud, despus de agregar el cido. Interrumpir el mezclado brevemente y retirar sin demora cualquier base gomosa del
vaso de precipitados usando una aguja larga. Enjuagar sin demora la aguja con 20 mL de agua, recogiendo los lavados en el
vaso de precipitados y continuar mezclando durante 5 minutos exactamente cronometrados, despus comenzar a valorar de
inmediato y en un perodo que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el cido clorhdrico en exceso con hidrxido de
sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 10 a 15 segundos). Calcular el nmero de mEq de cido consumido por la Tableta analizada por la frmula:
mEq totales = (30 NHCl) (VNaOH NNaOH)
en donde los trminos son los definidos anteriormente.
Captulos
Mezclador MagnticoTransferir 100 mL de agua a un vaso de precipitados de 250 mL que contenga una barra mezcladora magntica de 40 mm 10 mm (u otro tamao adecuado) recubierta con tefln y con un anillo de giro en el centro.
Ajustar la velocidad de la barra mezcladora, de forma que cuando la barra mezcladora se centra en el vaso de precipitados, la
velocidad de mezclado sea de 300 30 rpm, determinada con un tacmetro ptico adecuado.
Preparacin de Prueba
PolvosTransferir a un vaso de precipitados de 250 mL, la porcin pesada con exactitud de la sustancia especificada en la
monografa individual, agregar 70 mL de agua y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Slidos EfervescentesTransferir a un vaso de precipitados de 250 mL, una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a
la dosificacin mnima declarada en la etiqueta, agregar 10 mL de agua y mezclar por rotacin moderada el vaso de precipitados mientras se reduce la intensidad de la reaccin. Agregar 10 mL ms de agua y mezclar por rotacin suave. Lavar las paredes del vaso de precipitados con 50 mL de agua, y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Suspensiones y Otros LquidosAgitar el recipiente hasta que el contenido sea uniforme y determinar la densidad. Transferir
a un vaso de precipitados de 250 mL una cantidad de la mezcla uniforme, pesada con exactitud, que equivalga a la dosificacin mnima declarada en la etiqueta, agregar agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 70 mL y mezclar en el
Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Tabletas de Disolucin BucalPesar con exactitud no menos de 20 tabletas de disolucin bucal y determinar el peso promedio. Seleccionar y pesar 2 tabletas de disolucin bucal y transferirlas a un vaso de precipitados de 250 mL que contenga 70 mL
de agua.
Tabletas No MasticablesPesar con exactitud no menos de 20 tabletas y determinar el peso promedio de las tabletas. Moler
las tabletas hasta un polvo fino, mezclar para obtener una mezcla uniforme y transferir a un vaso de precipitados de 250 mL
una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificacin mnima declarada en la etiqueta. Si se desea humedecer,
agregar no ms de 5 mL de alcohol (neutralizado a un pH aparente de 3,5) y mezclar para humedecer bien la muestra. Agregar 70 mL de agua y mezclar en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
Tabletas MasticablesPreparar segn se indica en Tabletas No Masticables.
Tabletas que Deben MasticarseTransferir 1 Tableta a un vaso de precipitados de 250 mL, agregar 50 mL de agua y mezclar
en el Mezclador Magntico durante 1 minuto.
CpsulasPesar con exactitud no menos de 20 cpsulas. Extraer completamente el contenido de las cpsulas con la ayuda
de un hisopo de algodn si fuera necesario. Pesar con exactitud las cpsulas vacas y determinar el peso promedio del contenido de cada cpsula. Mezclar el contenido combinado de las cpsulas para obtener una mezcla uniforme y proceder segn se
indica en Tabletas No Masticables, comenzando donde dice transferir una cantidad pesada con exactitud.
Procedimiento para Polvos, Slidos Efervescentes, Suspensiones y Otros Lquidos, Tabletas de Disolucin Bucal,
Tabletas No Masticables, Tabletas Masticables y CpsulasPipetear 30,0 mL de cido clorhdrico 1,0 N SV y transferir a la
Preparacin de Prueba mientras se contina mezclando con el Mezclador Magntico. [NOTACuando la capacidad neutralizante
de cido de la muestra en anlisis es mayor de 25 mEq, usar 60,0 mL de cido clorhdrico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones
correspondientes en los clculos.] Mezclar durante 15 minutos, cronometrados exactamente, despus de agregar el cido, comenzar a valorar de inmediato y en un perodo que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el cido clorhdrico en exceso
con hidrxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 10 a 15 segundos). Calcular el nmero de mEq
de cido consumido por la frmula:
284 311 Valoracin de Alginatos / Pruebas Qumicas
USP 38
311 VALORACIN DE ALGINATOS

APARATO
Captulos
El aparato necesario (ver Figura 1) contiene una vlvula dosificadora capilar, A, seguida de un caudalmetro, B, para controlar
y vigilar el flujo de nitrgeno a travs del sistema. Se emplean tubos de plstico vinlico halogenado* y una conexin de caucho, C, para conectar el caudalmetro a un brazo lateral de un matraz de reaccin, D. El matraz D es un matraz de fondo
redondo, de 250 mL, para ebullicin, apoyado en un manto de calefaccin adecuado, E. El matraz D est equipado con un
condensador de reflujo de bobina Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, G, que contiene dos
bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas estn limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de 3 pulgadas.
La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de un tubo de plstico vinlico halogenado y un conector con llave de
paso por torsin, I, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 mL, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta
el fondo del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una porosidad gruesa. El tamao de todas las juntas
de vidrio es de 24/40, excepto la junta de 45/50 del frasco de lavado de gas.
Figura 1. Aparato para Valoracin de Alginatos.
APTITUD DEL SISTEMA

Empleando D-glucuronolactona como el estndar, proceder como se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos
previos a la ebullicin. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes criterios: (1) la determinacin con un blanco da
como resultado un valor neto de volumetra, C, de entre 0,02 y 0,06 mEq, calculado de la siguiente manera:
Ab Bb
en donde Ab es el nmero de mEq de hidrxido de sodio 0,25 N en los 25 mL utilizados y Bb es el nmero de mEq de cido
clorhdrico 0,1 N utilizado en la volumetra con un blanco; y (2) el porcentaje de dixido de carbono, CO2, obtenido a partir
del estndar est entre 24,2% y 25,7%.
PROCEDIMIENTO
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg,
pesados con exactitud, al matraz de reaccin, D, agregar 50 mL de cido clorhdrico 0,1 N, agregar varias perlas de ebullicin
y conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando cido fosfrico como lubricante. [NOTASe puede emplear grasa
para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la lnea de nitrgeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de
agua refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto.
* Este tipo de tubos se denominan comnmente tubos Tygon. Esta nota se agrega a los efectos de una mayor claridad y no implica que la USP avale este producto.
USP 38
Pruebas Qumicas / 341 Agentes AntimicrobianosContenido 285
[NOTALos pasos previos a la ebullicin que se describen en este prrafo son opcionales y nicamente es necesario realizarlos cuando se sospecha de la presencia de carbonatos inorgnicos.] Mantener el flujo de nitrgeno a travs del aparato a una
velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefaccin, E, hasta el matraz, calentar la muestra y llevarla a
ebullicin, y mantener una ebullicin moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor, bajar el manto, E, y dejar que la
muestra se enfre durante aproximadamente 10 minutos.
Conectar el frasco lavador de gas vaco, J, y purgar el sistema con nitrgeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto
durante 5 minutos. Reducir el flujo de nitrgeno hasta 60 mL a 65 mL por minuto, agregar al frasco 10 gotas de alcohol butlico, 25,0 mL de hidrxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas
y volver a colocar la tapa. Desconectar la conexin de caucho, C, del brazo lateral y agregar 46 mL de cido clorhdrico a
travs del brazo lateral del matraz de ebullicin. Volver a unir la lnea de nitrgeno, acercar el manto de calefaccin y calentar
la mezcla de reaccin hasta ebullicin. Despus de 2 horas de ebullicin, aumentar el flujo de nitrgeno hasta 90 mL a 100 mL
por minuto, suspender el calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfre durante 10 minutos. Desconectar y desmontar el
frasco lavador de gas. Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien todas las partes del tubo de burbujeo y
tapar, recolectando los lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrgeno para forzar suavemente la salida de toda el
agua del tubo de burbujeo. Agregar al frasco inmediatamente 10 mL de solucin de cloruro de bario al 10% y una barra de
agitacin. Tapar hermticamente y mezclar lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mnimo de 5 minutos.
Agregar tres gotas de fenolftalena SR y valorar con cido clorhdrico 0,1 N SV. Realizar una determinacin con un blanco (ver
Valoraciones Volumtricas Residuales en Volumetra 541). Calcular el porcentaje de dixido de carbono, CO2, por la frmula:
2200[(A B) C]/(1000W)(1 D)
341 AGENTES ANTIMICROBIANOSCONTENIDO

Un componente esencial de las inyecciones conservadas en envases multidosis es el agente o los agentes que se incorporan
para reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del contenido, se produzca una contaminacin microbiana accidental del contenido restante. Es un requisito farmacopeico que la presencia y la cantidad agregada de tal(es) agente(s) consten en la etiqueta del envase. Los mtodos proporcionados aqu para los agentes ms usados deben emplearse para demostrar
que el agente declarado est presente pero no excede la cantidad declarada en la etiqueta en ms de 20%.
La concentracin de un conservante antimicrobiano agregado a una preparacin para uso oftlmico, nasal, tico y parenteral, multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida til del producto. Por ello, el fabricante debe determinar el nivel
mnimo en el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de modo que se garantice que este nivel de efectividad exceda durante toda la vida til del producto. En el momento de su fabricacin, el producto debe contener la cantidad
declarada del conservante antimicrobiano (dentro de un 20% considerando las variaciones originadas en la fabricacin y el
anlisis). La declaracin de la cantidad de conservante que se indica en la etiqueta, no pretende definir la cantidad de conservante a mantener durante la vida til del producto; sino la cantidad que fue agregada, dentro de las limitaciones del proceso,
y que no se excedi en ms de 20%. Un ejemplo de tal declaracin en la etiqueta es ___(unidad) agregado como conservante. [NOTA ____(unidad) es un nmero seguido de la unidad de medida, por ej. 0,015 mg por mL o 0,1%.]
Los agentes ms usados incluyen los dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercrico y timerosal, los cuatro steres homlogos del cido p-hidroxibenzoico, fenol, alcohol benclico y clorobutanol. Para los dos primeros mencionados se emplea el mtodo polarogrfico, mientras que para la determinacin de los otros agentes se emplea la cromatografa de gases cuantitativa.
MTODO GENERAL POR CROMATOGRAFA DE GASES

Los procedimientos generales que se establecen a continuacin son aplicables a la determinacin cuantitativa de alcohol
benclico, clorobutanol, fenol y los steres metlico, etlico, proplico y butlico del cido p-hidroxibenzoico; estos ltimos se
tratan como un grupo pero, si estn presentes en forma individual, se los puede determinar por separado. Preparar la Solucin
de Estndar Interno y la Preparacin Estndar para cada agente segn se indica a continuacin. A menos que se indique lo contrario, preparar la Preparacin de Prueba a partir de porciones medidas con exactitud de la Solucin de Estndar Interno y la
muestra de la prueba, de tamao tal que la concentracin del agente y la composicin del disolvente se correspondan estrechamente con la concentracin y la composicin de la Preparacin Estndar. En la siguiente tabla se proporcionan los parmetros operativos recomendados para el cromatgrafo de gases; el gas transportador es helio o nitrgeno y el detector es del tipo
de ionizacin a la llama.
Captulos
en donde A es el nmero de mEq de hidrxido de sodio 0,25 N en los 25 mL empleados; B es el nmero de mEq de cido
clorhdrico 0,1 N empleado para la volumetra de la muestra o del estndar; C es el valor neto de volumetra calculado en la
determinacin con un blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estndar tomado; y D es el porcentaje expresado hasta
la dcima de unidad (1 lugar decimal), obtenido en la prueba de Prdida por Secado para la muestra o para el estndar.
286 341 Agentes AntimicrobianosContenido / Pruebas Qumicas
USP 38
Parmetros Operativos Recomendados para

el Cromatgrafo de Gases
Dimensiones
de la Columna
Agente
Alcohol Benzlico
Long.
DI
Relleno de la Columna
Fases y Soporte
Velocidad de Flujo,
mL por min.
Temperatura de
la Columna
1,8 m
3 mm
5% G16/S1A
50
140
Clorobutanol
1,8 m
2 mm
5% G16/S1A
20
110
Fenol
1,2 m
3 mm
5% G16/S1A
50
145
Parabenos
1,8 m
2 mm
5% G2/S1A
20
150
Alcohol Benclico
Captulos
Solucin de Estndar InternoDisolver aproximadamente 380 mg de fenol en 10 mL de metanol contenido en un matraz volumtrico de 200 mL. Agregar agua a volumen y mezclar.
Preparacin EstndarDisolver aproximadamente 180 mg de ER Alcohol Benclico USP, pesados con exactitud, en 20,0
mL de metanol contenidos en un matraz volumtrico de 100 mL. Agregar la Solucin de Estndar Interno a volumen y mezclar.
ProcedimientoInyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 5 mL) de la Preparacin
Estndar y de la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de alcohol benclico y fenol. Calcular el contenido, en mg por mL,
de alcohol benclico (C7H8O) en la muestra tomada, por la frmula:
100(C/V)(p1/p2)(P2/P1)
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de alcohol benclico en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en mL, de la
muestra de la prueba usada para preparar cada 100 mL de la Preparacin de Prueba; p1 y p2 son las reas de los picos del alcohol benclico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba; y P1 y P2 son las reas de los picos
del alcohol benclico y el fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin Estndar.
Clorobutanol
Solucin de Estndar InternoTransferir aproximadamente 140 mg de benzaldehdo a un matraz volumtrico de 100
mL, agregar 10 mL de metanol y agitar por rotacin moderada para disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin EstndarTransferir aproximadamente 125 mg de ER Clorobutanol USP, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 25 mL. Agregar 2 mL de metanol, agitar por rotacin moderada para disolver, diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solucin y 5,0 mL de la Solucin de Estndar Interno a un matraz de 25 mL y mezclar para
obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 2,5 mg de clorobutanol por mL.
Preparacin de PruebaDiluir cuantitativamente, si fuera necesario, un volumen medido con exactitud de la muestra de
la prueba con metanol para obtener una solucin que no contenga ms de aproximadamente 5,0 mg de clorobutanol por mL.
Combinar 3,0 mL de esta solucin con 3,0 mL de la Solucin de Estndar Interno y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)[NOTAVer la tabla adjunta para determinar las dimensiones de la columna, el relleno de la columna con su fase y soporte, la velocidad de flujo y la temperatura de la columna.] Mantener la temperatura del inyector a 180 y la del detector, a 220. Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin Estndar y registrar el cromatograma segn se indica en el Procedimiento: los tiempos de retencin relativos son aproximadamente 0,8 para el benzaldehdo y 1,0 para el clorobutanol; la resolucin, R, entre el benzaldehdo y el clorobutanol no es menor de 2,0; y la desviacin
estndar relativa para inyecciones repetidas no es ms de 2,0%.
Estndar y de la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las reas correspondientes a los picos principales.
Calcular la cantidad, en mg, de clorobutanol (C4H7Cl3O) en cada mL de la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
C(L/D)(RU/RS)
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de clorobutanol, calculada con respecto a la sustancia anhidra, en la Preparacin Estndar; L es la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada mL de la muestra de prueba; D es la concentracin,
en mg por mL, de clorobutanol en la Preparacin de Prueba, respecto al volumen de la muestra sometida a la prueba y el grado
de dilucin; y RU y RS son los cocientes entre el pico de clorobutanol y el pico de benzaldehdo obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
Fenol
Solucin de Estndar InternoPipetear 1 mL de ER Alcohol Benclico USP y transferir a un matraz volumtrico de 500 mL,
agregar metanol a volumen y mezclar.
USP 38
Pruebas Qumicas / 341 Agentes AntimicrobianosContenido 287
Preparacin EstndarDisolver aproximadamente 75 mg de ER Fenol USP, pesados con exactitud, en 7,5 mL de metanol
contenidos en un matraz volumtrico de 100 mL. Agregar 20,0 mL de Solucin de Estndar Interno, luego agregar agua a volumen y mezclar.
Estndar y la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en la
tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de fenol y alcohol benclico. Calcular el contenido, en mg por mL,
de fenol (C6H6O) en cada mL de la muestra tomada, por la frmula:
100(C/V)(p1/p2)(P2/P1)
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de fenol en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en mL, de la muestra de
la prueba usada para preparar 100 mL de la Preparacin de Prueba; p1 y p2 son las reas de los picos de fenol y alcohol benclico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba; y P1 y P2 son las reas de los picos de fenol y alcohol benclico, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin Estndar.
Metilparabeno y Propilparabeno
10(CM/V)(p1/p3)(P3/P1)
en donde CM es la concentracin, en mg por mL, de metilparabeno en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en mL, de la
muestra tomada; p1 y p3 son las reas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de
la Preparacin de Prueba; y P1 y P3 son las reas de los picos del metilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a
partir de la Preparacin Estndar. De modo similar, calcular el contenido, en mg por mL, de propilparabeno (C10H12O3) en la
muestra sometida a la prueba, por la frmula:
10(CP/V)(p2/p3)(P3/P2)
en donde CP es la concentracin, en mg por mL, de propilparabeno en la Preparacin Estndar; V es el volumen, en mL, de la
muestra tomada; p2 y p3 son las reas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir
de la Preparacin de Prueba; y P2 y P3 son las reas de los picos del propilparabeno y la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparacin Estndar.
El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo similar.
MTODO POLAROGRFICO
Nitrato Fenilmercrico
Preparacin EstndarDisolver aproximadamente 100 mg de nitrato fenilmercrico, pesados con exactitud, en una solucin de hidrxido de sodio (1 en 250) contenida en un matraz volumtrico de 1000 mL y entibiar si fuera necesario para lograr una completa disolucin, agregar la solucin de hidrxido de sodio a volumen y mezclar. Pipetear 10 mL de esta solucin,
transferir a un matraz volumtrico de 25 mL y proceder segn se indica en la Preparacin de Prueba, comenzando desde donde
dice agregar 2 mL de solucin de nitrato de potasio (1 en 100).
Captulos
Solucin de Estndar InternoColocar aproximadamente 200 mg de benzofenona en un matraz volumtrico de 250 mL,
diluir a volumen con ter y mezclar.
Preparacin EstndarColocar 100 mg de ER Metilparabeno USP y 10 mg de ER Propilparabeno USP, pesados con exactitud, en un matraz volumtrico de 200 mL, diluir a volumen con Solucin de Estndar Interno y mezclar. Colocar 10 mL de esta
solucin en un matraz Erlenmeyer de 25 mL y proceder segn se indica en la Preparacin de Prueba, comenzando desde donde
dice Agregar 3 mL de piridina.
Preparacin de PruebaPipetear 10 mL de la muestra sometida a la prueba y 10 mL de la Solucin de Estndar Interno en
un separador pequeo. Agitar vigorosamente, permitir que las capas se separen, retirar la capa acuosa y ponerla en un segundo separador y transferir la capa de ter a un matraz pequeo a travs de un embudo que contenga sulfato de sodio anhidro.
Extraer la capa acuosa con dos porciones de ter de 10 mL y filtrar tambin los extractos a travs del sulfato de sodio anhidro.
Evaporar los extractos combinados en una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 10 mL y
luego transferir el residuo a un matraz Erlenmeyer de 25 mL. Agregar 3 mL de piridina, completar la evaporacin del ter y
hervir en una placa de calentamiento hasta que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 mL. Enfriar y agregar 1 mL de un
agente silanizante adecuado, como por ejemplo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida, bis(trimetilsilil)acetamida o una mezcla de
hexametildisilazano y trimetilclorosilano [2:1 3:1 (v/v)]. Mezclar y dejar en reposo durante no menos de 15 minutos.
ProcedimientoInyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (2 mL) de la solucin silanizada de la Preparacin Estndar y la Preparacin de Prueba, registrar los cromatogramas con el aparato ajustado a los parmetros establecidos en
la tabla adjunta y medir las reas correspondientes a los picos de metilparabeno, propilparabeno y benzofenona. Calcular el
contenido, en mg por mL, de metilparabeno (C8H8O3) en la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
288 341 Agentes AntimicrobianosContenido / Pruebas Qumicas
USP 38
Preparacin de PruebaPipetear 10 mL de la muestra de la prueba, transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, agregar

2 mL de solucin de nitrato de potasio (1 en 100) y 10 mL de solucin amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 (ver
Soluciones Amortiguadoras en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones) y, si fuera necesario, ajustar a un pH de 9,2 agregando cido ntrico 2 N. Agregar 1,5 mL de solucin de gelatina recin preparada (1 en 1000), luego agregar la solucin amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 a volumen y mezclar.
ProcedimientoPipetear una porcin de la Preparacin de Prueba y transferir a la celda polarogrfica y desairear burbujeando nitrgeno a travs de la solucin durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polargrafo
adecuado (ver Polarografa 801) y registrar el polarograma desde 0,6 hasta 1,5 voltios en comparacin con el electrodo de
calomel saturado. Determinar la corriente de difusin de la Preparacin de Prueba, (id)U, como la diferencia entre la corriente
residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente de difusin, (id)S, de la Preparacin
Estndar. Calcular la cantidad, en mg, de nitrato fenilmercrico (C6H5HgNO3) en cada mL de la muestra tomada, por la frmula:
2,5C[(id)U/(id)S]
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de nitrato fenilmercrico en la Preparacin Estndar.
Captulos
Timerosal
Preparacin EstndarEn el da de uso, colocar aproximadamente 25 mg de ER Timerosal USP, pesados con exactitud, en
un matraz volumtrico de 250 mL, agregar agua a volumen y mezclar. Proteger de la luz. Pipetear 15 mL de esta solucin en
un matraz volumtrico de 25 mL, agregar 1,5 mL de solucin de gelatina (1 en 1000), luego agregar solucin de nitrato de
potasio 1 en 100 a volumen y mezclar.
Preparacin de PruebaPipetear 15 mL de la muestra en anlisis, transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, agregar
1,5 mL de solucin de gelatina (1 en 1000), agregar solucin de nitrato de potasio (1 en 100) a volumen y mezclar.
ProcedimientoTransferir una porcin de la Preparacin de Prueba a la celda polarogrfica y desairear burbujeando nitrgeno a travs de la solucin durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polargrafo adecuado (ver
Polarografa 801) y registrar el polarograma de 0,2 a 1,4 voltios en comparacin con el electrodo de calomel saturado.
Determinar la corriente de difusin, (id)U, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante. De forma similar
y concomitante, determinar la corriente de difusin, (id)S, de la Preparacin Estndar. Calcular la cantidad, en mg, de timerosal
(C6H9HgNaO2S) en cada mL de la muestra sometida a la prueba, por la frmula:
1,667C[(id)U/(id)S]
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de timerosal en la Preparacin Estndar y los otros trminos son los definidos
anteriormente.
345 VALORACIN DE CIDO CTRICO/CITRATO Y FOSFATO

INTRODUCCIN
El siguiente procedimiento general de cromatografa inica se emplea para determinar el contenido de cido ctrico/citrato y
fosfato en los artculos farmacopeicos, cuando se especifica en las monografas individuales. Con respecto a la teora y los
principios de las mediciones usando cromatografa inica, ver Cromatografa Inica 1065.
VALORACIN
PROCEDIMIENTO
Fase mvil: Hidrxido de sodio o hidrxido de potasio 20 mM, a partir de un volumen apropiado de una solucin de
hidrxido de sodio o hidrxido de potasio, exentos de carbonato, de concentracin conocida y agua (de una resistividad
de no menos de 18 Mohmios-cm). Como alternativa, la Fase mvil se puede generar mediante electrolisis usando un generador automtico de eluyente. Proteger la Fase mvil del dixido de carbono atmosfrico.
Solucin estndar 1 (slo para la valoracin de cido ctrico/citrato): 20 mg/mL de citrato (C6H5O7) en hidrxido de
sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER cido Ctrico USP
Solucin estndar 2 (para la valoracin concomitante de citrato y fosfato): 20 mg/mL de citrato (C6H5O7) y 12 mg/mL
de fosfato (PO4) en hidrxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER cido Ctrico USP y fosfato monobsico de sodio
Solucin muestra (para la valoracin de cido ctrico/citrato): Nominalmente 20 mg/mL de citrato en hidrxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografa.
Solucin muestra (para la valoracin de fosfato): Nominalmente 12 mg/mL de fosfato en hidrxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografa.
Modo: HPLC
USP 38
Pruebas Qumicas / 361 Valoracin de Barbitricos 289
Detector: De conductividad con supresin

Columnas
Guarda columna: 4 mm 5 cm; relleno L61 de 13 mm
Columna analtica: 4 mm 25 cm; relleno L61 de 13 mm
Temperaturas
Columna: 30
Detector: 35
Supresor: Membrana autosupresora de aniones de 4 mm o un sistema de supresin qumica adecuado
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar 1 y/o Solucin estndar 2, segn corresponda.
[NOTALos tiempos de retencin relativos para fosfato y citrato son 0,57 y 1,0, respectivamente.]
Factor de asimetra: No ms de 2,0 para los picos de citrato y/o fosfato, segn corresponda.
Desviacin estndar relativa: No ms de 1,5% para los picos de citrato y/o fosfato, en seis inyecciones repetidas, segn corresponda.
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 1 y/o Solucin estndar 2, y Solucin muestra
A menos que se indique algo diferente en la monografa, calcular la concentracin de citrato o fosfato en la porcin de
Solucin muestra tomada:
rU
rS
CS
= respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solucin muestra

= respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2
= concentracin de citrato o fosfato en la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2 (mg/mL)
351 VALORACIN DE ESTEROIDES

El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores
tales como a-cetoles.
Preparacin EstndarDisolver en alcohol una cantidad adecuada del Estndar de Referencia USP especificado en la monografa individual, previamente secado en las condiciones especificadas en la monografa individual y pesado con exactitud, y
diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con alcohol para obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 10 mg por mL. Pipetear 20 mL de esta solucin y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapn de vidrio.
Preparacin de ValoracinPreparar segn se indica en la monografa individual.
ProcedimientoA sendos matraces que contienen la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente,
y a un matraz similar que contenga 20,0 mL de alcohol como blanco, agregar 2,0 mL de una solucin preparada por disolucin de 50 mg de azul de tetrazolio en 10 mL de metanol y mezclar. Agregar despus a cada matraz 2,0 mL de una mezcla de
alcohol e hidrxido de tetrametilamonio SR (9:1), mezclar y dejar en reposo en la oscuridad durante 90 minutos. Sin demora,
determinar al mismo tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar aproximadamente a 525 nm, utilizando un espectrofotmetro adecuado, contra el blanco. Calcular el resultado por la frmula dada
en la monografa individual, en donde C es la concentracin, en mg por mL, del Estndar de Referencia en la Preparacin Estndar; y AU y AS son las absorbancias de las soluciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente.
361 VALORACIN DE BARBITRICOS

Estndar Interno, Solucin del Estndar Interno, Preparacin Estndar y Preparacin de ValoracinPreparar segn
se indica en la monografa individual.
Sistema CromatogrficoEn condiciones tpicas, equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la
llama y con una columna de vidrio de 4 mm 0,9 m rellena con fase lquida G10 al 3% sobre soporte S1A de malla 80 a 100.
Mantener la temperatura de la columna a 200 10 y mantener el inyector y el detector aproximadamente a 225, la temperatura de la columna puede variar dentro de la tolerancia especificada, segn sea necesario, para cumplir las especificaciones
de Aptitud del Sistema y proporcionar tiempos de retencin apropiados. Emplear un gas trasportador adecuado, tal como nitr-
Captulos
Resultado = (rU/rS) CS
290 361 Valoracin de Barbitricos / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
geno seco, a una velocidad de flujo apropiada, como por ejemplo de 60 mL a 80 mL por minuto. Emplear inyeccin directa en
la columna. [NOTASi el instrumento no est equipado para inyeccin directa en la columna, emplear un inyector recubierto
de vidrio que se haya lavado sucesivamente con una solucin de limpieza de cido crmico, agua, metanol, cloroformo, una
solucin 1 en 10 de trimetilclorosilano en cloroformo y cloroformo.]
Aptitud del Sistema (ver Cromatografa 621)Inyectar en el cromatgrafo cinco inyecciones repetidas de la Preparacin
Estndar y registrar el cromatograma segn se indica en el Procedimiento: la desviacin estndar relativa para el cociente RS no
es ms de 1,5%. En un cromatograma apropiado, la resolucin, R, entre el cido barbitrico y el Estndar Interno no es menor
que el valor dado en la monografa individual y el factor de asimetra, T, para cada uno de los dos picos no es mayor de 2,0.
ProcedimientoInyectar en un cromatgrafo de gases apropiado una porcin adecuada (aproximadamente 5 mL) de la
Preparacin estndar y registrar el cromatograma. De modo similar, inyectar una porcin adecuada de la Preparacin de Valoracin y registrar el cromatograma. Calcular el contenido de barbiturato o cido barbitrico en la muestra de valoracin por la
frmula que se proporciona en la monografa individual, en donde RU es el cociente de respuesta entre los picos del cido
barbitrico y del Estndar Interno en la Preparacin de Valoracin; QS es el cociente entre el peso del barbitrico en la forma de
cido y el del Estndar Interno en la Preparacin Estndar; Ci es la concentracin, en mg por mL, de Estndar Interno en la
Solucin de Estndar Interno; y RS es el cociente de respuesta entre los picos del cido barbitrico y del Estndar Interno en la
Preparacin Estndar.
371 VALORACIN DE COBALAMINA CON MARCADOR

RADIOACTIVO
Todas las determinaciones de radioactividad requeridas por este mtodo deben hacerse con un equipo de conteo apropiado, durante un perodo de tiempo que sea ptimo de acuerdo con el equipo de conteo especfico empleado. Todos los procedimientos deben realizarse varias veces para obtener la mayor exactitud posible.
Estndares de Referencia USP 11ER Cianocobalamina USP.
Reactivo Marcador de CianocobalaminaDiluir con agua un volumen medido con exactitud de una solucin de cianocobalamina radioactiva* para producir una solucin que tenga una radioactividad entre 500 y 5000 conteos por minuto por mL.
Agregar 1 gota de cresol por litro de solucin preparada y almacenar en un refrigerador.
EstandarizacinPreparar en agua una solucin de una cantidad de ER Cianocobalamina USP, pesada con exactitud, que
contenga 20 mg a 50 mg por mL. Realizar la valoracin entera de una porcin de 10,0 mL de esta solucin, procediendo segn
se indica en la Preparacin de Valoracin, comenzando donde dice Agregar agua para obtener un volumen medido.
Solucin de CresolTetracloruro de CarbonoMezclar volmenes iguales de tetracloruro de carbono y cresol recientemente destilado.
Solucin de FosfatoCianuroDisolver 100 mg de cianuro de potasio en 1000 mL de una solucin saturada de fosfato
dibsico de sodio y mezclar.
Solucin de Butanol-Cloruro de BenzalconioDiluir una solucin de cloruro de benzalconio (17 en 100) con agua (3:1)
y mezclar con 36 volmenes de alcohol butlico.
Columna de Almina-ResinaColocar un trozo de lana de vidrio en el fondo de un tubo de vidrio que posea una constriccin en uno de sus extremos, como por ejemplo una bureta de 50 mL. Sosteniendo el tubo en posicin vertical, agregar un
volumen de una suspensin acuosa espesa de resina de intercambio inico (ver en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones), suficiente para obtener una columna de resina sedimentada de 7 cm de alto. Cuando el slido se haya sedimentado parcialmente, dejar que el agua drene, de manera que quede slo 1 cm de lquido encima de la columna de resina y comprimir la
resina suavemente. Luego agregar una suspensin acuosa espesa de almina anhidra (que no est lavada con cido) suficiente
para aumentar la altura de la columna sedimentada a 10 cm; dejar que drene el agua hasta que quede aproximadamente a 1
cm por encima de la almina. Agregar un trozo de lana de vidrio y lavar la columna, empleando un total de 50 mL de agua y
drenar nuevamente hasta un nivel de 1 cm por encima de la columna. Preparar una columna nueva para cada determinacin.
Preparacin de ValoracinTransferir a un vaso de precipitados una cantidad pesada o un volumen medido de la preparacin a valorar, con una actividad de vitamina B12 equivalente a la de 200 mg a 500 mg de cianocobalamina. Agregar agua
para obtener un volumen medido de no menos de 25 mL; luego agregar 5,0 mL de Reactivo Marcador de Cianocobalamina.
Trabajando bajo una campana, agregar 5 mg de nitrito de sodio y 2 mg de cianuro de potasio por cada mL de la solucin
resultante. Ajustar la solucin con cido clorhdrico diluido hasta pH 4 aproximadamente y calentar en bao de vapor durante
15 minutos. Enfriar y ajustar la solucin con hidrxido de sodio 1 N hasta un pH entre 7,6 y 8,0. Centrifugar o filtrar para
eliminar cualquier slido no disuelto.
ProcedimientoTransferir la Preparacin de Valoracin a un frasco de centrfuga de 250 mL, agregar 10 mL de Solucin de
CresolTetracloruro de Carbono, cerrar adecuadamente el frasco con un tapn de vidrio, de polietileno o de goma envuelto en
papel de aluminio, agitar vigorosamente durante 2 a 5 minutos y centrifugar. Retirar y guardar la capa de disolvente inferior.
* Una solucin de cianocobalamina, transformada en radioactiva mediante la incorporacin de 60Co, est disponible de Merck and Co., Inc., Rahway, NJ 07065.
USP 38
Pruebas Qumicas / 381 Tapones Elastomricos para Inyectables 291
R(CS/CU)(AU/AS)
en donde R es la cantidad, en mg, de cianocobalamina en la porcin de la solucin estndar tomada; CS y CU son los valores de
radioactividad promedio corregidos, expresados en conteos por minuto por mL, de la solucin estndar y de la solucin de
valoracin, respectivamente; y AU y AS son las absorbancias, determinadas a 361 nm, de la solucin de valoracin y de la solucin estndar, respectivamente.
381 TAPONES ELASTOMRICOS PARA INYECTABLES

INTRODUCCIN
Los tapones elastomricos para los envases usados en los tipos de preparaciones definidas en el captulo de pruebas generales Inyectables 1, estn hechos de materiales obtenidos por vulcanizacin (entrecruzamiento), polimerizacin, poliadicin, o
policondensacin de sustancias orgnicas macromoleculares (elastmeros). Las formulaciones de los tapones contienen elastmeros naturales o sintticos y aditivos orgnicos e inorgnicos para facilitar o controlar la vulcanizacin, impartir propiedades
fsicas y qumicas o color, o estabilizar la formulacin del tapn.
Este captulo se refiere a tapones usados para el almacenamiento a largo plazo de preparaciones definidas en el captulo de
pruebas generales Inyectables 1. Dichos tapones se utilizan generalmente como parte de un vial, frasco o sistema de envasado de una jeringa prellenada.
Este captulo se refiere a tapones formulados con sustancias elastomricas naturales o sintticas. No concierne a tapones hechos de elastmero de silicona; sin embargo, s se refiere a tapones tratados con silicona (p.ej., Dimeticona, NF). Al efectuar las
pruebas de este captulo, no es necesario tratar los tapones con silicona, aunque ninguna restriccin prohbe el uso de tapones
siliconizados.
Este captulo tambin se refiere a tapones recubiertos con otros materiales lubricantes (p.ej., materiales unidos qumica o
mecnicamente al tapn) no destinados a proporcionar una barrera para el elastmero base, y que de hecho no funcionan
como tal. Al efectuar las pruebas, los tapones con recubrimientos lubricantes sin funcin de barrera deben analizarse en su
estado recubierto.
Los siguientes comentarios se refieren nicamente a los tapones laminados o recubiertos con materiales destinados a proporcionar, o que funcionan como, una barrera para el elastmero base (p.ej., recubrimientos de PTFE o laca). No se permite usar
un material de barrera en un tapn que no cumpla con los requisitos farmacopeicos para convertirlo en uno que s los cumpla.
Captulos
Repetir la extraccin empleando una porcin de 5 mL de Solucin de CresolTetracloruro de Carbono y combinar los extractos
de las capas de disolvente inferiores en un frasco de centrfuga o separador de 50 mL a 100 mL de capacidad.
Lavar los extractos combinados con porciones sucesivas de 10 mL de cido sulfrico 5 N hasta que el ltimo lavado sea prcticamente incoloro (dos lavados bastan generalmente). Durante cada lavado, agitar durante 2 a 5 minutos, dejar que las capas
se separen, centrifugar si fuera necesario y descartar la capa cida. Lavar luego con dos porciones sucesivas de 10 mL de Solucin de FosfatoCianuro. Finalmente, lavar con 10 mL de agua. Descartar todos los lavados.
Al extracto lavado agregarle 30 mL de una mezcla de Solucin de Butanol-Cloruro de Benzalconio y tetracloruro de carbono
(2:1). Extraer con dos porciones de agua de 5 mL cada una, agitando vigorosamente cada vez durante 1 minuto, centrifugar,
retirar y guardar la capa superior acuosa.
Pasar los extractos acuosos combinados a travs de la Columna de Almina-Resina a una velocidad de aproximadamente 1
mL por minuto, mantener una capa de 1 cm de lquido sobre la parte superior de la columna, agregando agua segn sea
necesario. Descartar los primeros mL incoloros (generalmente alrededor de 5 mL) y recoger el eluato coloreado (generalmente
alrededor de 10 mL) en un tubo de centrfuga o separador de 50 mL que contenga 500 mL de cido actico diluido. Extraer el
eluato agitando durante 2 a 5 minutos con 5 mL de Solucin de CresolTetracloruro de Carbono y desechar la capa acuosa superior. Agregar al extracto 5,0 mL de agua, 5 mL de tetracloruro de carbono y 10 mL de alcohol butlico. Agitar, dejar que se
separe hasta que la capa superior est transparente y retirar la capa superior acuosa.
Determinar las absorbancias del extracto acuoso en una celda de 1 cm, a 361 nm y 550 nm, con un espectrofotmetro
apropiado, empleando una fuente de iluminacin de tungsteno. Hacer la lectura a 361 nm empleando un filtro capaz de reducir la luz dispersada. Calcular el cociente A361/A550: la pureza del extracto acuoso es aceptable si el cociente es entre 3,10 y
3,40. Si se observa un cociente fuera de este intervalo, purificar el extracto acuoso repitiendo el ciclo de extraccin, procediendo segn se indica en el prrafo anterior.
Si se observa un cociente de absorbancia aceptable en el extracto acuoso, determinar la radioactividad, en conteos por minuto, empleando un equipo de conteo apropiado durante un perodo de tiempo ptimo de acuerdo al equipo de conteo especfico empleado. Promediar los resultados y corregir el promedio por la radioactividad de fondo observada durante dos o
ms perodos de 30 minutos.
ClculosCalcular el contenido de cobalamina, expresado en mg de cianocobalamina, de la porcin tomada para la valoracin, por la frmula:
Captulos
292 381 Tapones Elastomricos para Inyectables / Pruebas Qumicas
USP 38
Por lo tanto, todas las Pruebas Fisicoqumicas conciernen a la frmula base de dichos tapones, as como sobre el tapn recubierto o laminado. Con el fin de obtener los resultados de las Pruebas Fisicoqumicas, stas deben efectuarse sobre tapones del mismo compuesto elastomrico sin recubrimiento o laminado, as como al tapn recubierto o laminado. Las Pruebas de Funcionalidad corresponden y deben efectuarse usando el tapn elastomrico laminado o recubierto. Las Pruebas Biolgicas conciernen
tanto al material de laminacin o recubrimiento como a la frmula base. Las Pruebas Biolgicas pueden efectuarse sobre el tapn laminado o recubierto, o sobre el material de laminacin o recubrimiento y los tapones del mismo compuesto elastomrico sin recubrimiento o laminado. En este ltimo caso, los resultados deben informarse por separado. La frmula base usada
para las pruebas fisicoqumicas o biolgicas, destinada a sustentar la conformidad farmacopeica de un tapn recubierto con
material de barrera, debera ser similar al tapn recubierto correspondiente en cuanto a configuracin y tamao.
Para todas las pruebas de este captulo, Tapones Elastomricos para Inyectables 381, efectuadas sobre cualquier tipo de tapn, es importante documentar el tapn en anlisis, incluyendo una descripcin completa del elastmero y de cualquier lubricante, recubrimiento, laminacin o tratamiento aplicado.
Este captulo establece los lmites de prueba para los tapones elastomricos Tipo I y Tipo II. Los tapones Tipo I son usados
generalmente para preparaciones acuosas. Los tapones Tipo II son los destinados generalmente a preparaciones no acuosas,
que si bien tienen propiedades optimizadas para usos especiales, es posible que no cumplan con todos los requisitos listados
para los tapones Tipo I debido a su configuracin fsica, al material de construccin o a ambos. Si un tapn no cumple con
uno o ms de los requisitos de prueba para Tipo I pero cumple con los requisitos para Tipo II, se le asigna una clasificacin final
de Tipo II. Todos los tapones elastomricos adecuados para usar en preparaciones inyectables deben cumplir con los lmites de
prueba para Tipo I o Tipo II. Sin embargo, no se pretende que esta especificacin sirva como nico criterio de evaluacin para
la seleccin de dichos tapones.
El uso de este captulo resulta apropiado al identificar tapones elastomricos que pueden ser aceptables para usar en preparaciones inyectables basndose en su reactividad biolgica, las propiedades fisicoqumicas de su extracto acuoso y su funcionalidad.
Los siguientes requisitos para la evaluacin de los tapones estn fuera del alcance de este captulo:
El establecimiento de pruebas y especificaciones para la identificacin de tapones
La verificacin de la compatibilidad fisicoqumica entre el tapn y el producto
La identificacin y determinacin de seguridad de los lixiviados de los tapones que se encuentran en el producto envasado
La verificacin de la funcionalidad del tapn del producto envasado bajo condiciones reales de almacenamiento y uso
El fabricante del producto inyectable (el usuario final) debe obtener del proveedor del tapn la garanta de que la composicin del tapn no vara y que es igual a la del tapn usado durante las pruebas de compatibilidad. Cuando el proveedor informa al usuario final de cambios en la composicin, se deben repetir las pruebas de compatibilidad, total o parcialmente, dependiendo de la naturaleza de los cambios. Los tapones deben almacenarse apropiadamente, limpiarse para remover los contaminantes ambientales y las endotoxinas, y para procesos aspticos, esterilizarse antes de usar en el envasado de productos inyectables.
CARACTERSTICAS
Los tapones elastomricos son translcidos u opacos y no tienen un color caracterstico; ste depende de los aditivos usados.
Son homogneos y prcticamente libres de rebabas y materiales adventicios (p.ej., fibras, partculas extraas y residuos de goma).
IDENTIFICACIN
Los tapones se hacen de una gran variedad de materiales elastomricos y recubrimientos polimricos opcionales. Por esta
razn, est ms all del propsito de este captulo especificar pruebas de identificacin que abarquen todas las posibles presentaciones de los tapones. Sin embargo, es responsabilidad del proveedor del tapn y del fabricante del producto inyectable (el
usuario final) verificar la formulacin elastomrica del tapn y cualquier recubrimiento o material laminado usado, de acuerdo
con las pruebas de identificacin apropiadas. Ejemplos de algunas de las metodologas analticas de prueba que se pueden
usar incluyen peso especfico, anlisis del porcentaje de cenizas, determinacin del contenido de azufre, prueba FTIR-ATR, cromatografa en capa delgada de un extracto, espectrofotometra de absorcin UV de un extracto o espectrofotometra de absorcin IR de un pirolisado.
PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
Los tapones elastomricos deben ajustarse a los requisitos biolgicos, fisicoqumicos y de funcionalidad, tanto cuando son
enviados por el proveedor de tapones al fabricante del producto inyectable (el usuario final) como cuando el usuario final los
pone en su estado definitivo, listos para usar.
Para aquellos tapones elastomricos procesados por el proveedor antes de la distribucin al usuario final, el proveedor deber demostrar el cumplimiento con los requisitos farmacopeicos de los tapones expuestos a dichos pasos de procesamiento y/o
USP 38
esterilizacin. De igual manera, si los tapones elastomricos recibidos por el usuario final son posteriormente procesados o esterilizados, el usuario final es responsable de demostrar que los tapones siguen cumpliendo con los requisitos farmacopeicos
despus de dichas condiciones de procesamiento y/o esterilizacin (es decir, en su estado listo para usar). Esto es especialmente importante si los tapones se deben exponer a procesos o condiciones que podran impactar significativamente las caractersticas biolgicas, fisicoqumicas o de funcionalidad del tapn (p.ej., radiacin gamma).
Para tapones que normalmente se lubrican con silicona antes de usar, est permitido efectuar las pruebas fisicoqumicas en
los tapones no lubricados con el fin de evitar una posible interferencia del mtodo y/o dificultades en la interpretacin de los
resultados de la prueba. Para tapones suministrados con otros recubrimientos lubricantes sin funcin de barrera, todas las
pruebas se deben efectuar usando el tapn recubierto.
Para tapones recubiertos o laminados con recubrimientos destinados a proveer una barrera (p.ej., recubrimientos de PTFE o
laca), las pruebas farmacopeicas fisicoqumicas se aplican al elastmero base no recubierto, as como al tapn recubierto. En
este caso, los proveedores son responsables de demostrar el cumplimiento con los requisitos fisicoqumicos farmacopeicos tanto del tapn recubierto como del no recubierto, procesado o tratado de forma tal que se simulen las condiciones usadas para
los tapones recubiertos antes del envo al usuario final. El tapn no recubierto sujeto a las pruebas fisicoqumicas debera ser
similar en tamao y configuracin al tapn recubierto correspondiente. Los usuarios finales de los tapones recubiertos son responsables tambin de demostrar el continuo cumplimiento con los requisitos fisicoqumicos farmacopeicos del tapn recubierto, procesado o tratado en una forma que simule las condiciones tpicas empleadas por el usuario final previo al uso.
En todos los casos, al informar los resultados de las pruebas es apropiado documentar todas las condiciones del procesamiento, pretratamiento, esterilizacin o lubricacin de los tapones.
La Tabla 1 resume los requisitos de prueba de los tapones y las responsabilidades del proveedor y del usuario final.
Tabla 1
Tapn con o sin

Recubrimiento de Silicona
Tapones con Recubrimiento

Lubricante (Material
Sin Funcin de Barrera; Diferente de Silicona)
Tapones con Recubrimiento
de Barrera
Pruebas Fisicoqumicas
Estas pruebas son obligatorias.
Pruebas de Funcionalidad
Pruebas Biolgicas
El uso de silicona es opcional.
Responsibilidad: proveedor y
usuario final.
Responsibilidad: proveedor y usuario final.
usuario final.
Estas pruebas se deben

realizar sobre el tapn recubierto.
Estas pruebas se deben realizar sobre el tapn recubierto.
Estas pruebas se deben realizar sobre el tapn recubierto.
usuario final.
Estas pruebas se deben realizar

sobre los tapones recubiertos.
Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones recubiertos.
Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones recubiertos.
usuario final.
O:
usuario final.
Y:
Estas pruebas se deben realizar
sobre los tapones sin recubrimiento (frmula base).
Responsibilidad: proveedor.
Estas pruebas se deben realizar sobre los tapones sin recubrimiento

(frmula base) y al material de laminado/recubrimiento (los resultados se informan por separado).
usuario final.
PRUEBAS BIOLGICAS
Se establecen dos etapas de pruebas. La primera etapa es la realizacin de un procedimiento de prueba in vitro segn se
describe en el captulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87. Los materiales que no cumplen con
los requisitos de la prueba in vitro estn sujetos a la segunda etapa de pruebas, que es la realizacin de pruebas in vivo, Prueba
de Inyeccin Sistmica y Prueba Intracutnea, segn los procedimientos presentados en el captulo de pruebas generales Pruebas
de Reactividad Biolgica, In Vivo 88. Los materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan someterse a pruebas in vivo.
Los tapones Tipo I y Tipo II deben cumplir con los requisitos de las pruebas de reactividad biolgica in vitro o in vivo.
[NOTAVer tambin el captulo de informacin general Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos,
Dispositivos Mdicos e Implantes 1031.]
Captulos
Requisitos de Prueba
Tipos de Tapones (Tal como

se Suministran o Utilizan)
USP 38
PRUEBAS FISICOQUMICAS
Preparacin de la Solucin S
Colocar dentro de un recipiente de vidrio adecuado, tapones enteros, sin cortar, que equivalgan a un rea superficial de
100 10 cm2. Cubrir los tapones con 200 mL de Agua Purificada o Agua para Inyeccin. Si no es posible conseguir el rea
superficial de tapn prescrita (100 10 cm2) usando tapones sin cortar, seleccionar el nmero de tapones que se aproximen
mejor a los 100 cm2, y ajustar el volumen de agua usado al equivalente de 2 mL por cada 1 cm2 de rea superficial real de
tapn utilizada. Calentar a ebullicin durante 5 minutos y enjuagar cinco veces con Agua Purificada o Agua para Inyeccin.
Colocar los tapones lavados en un matraz Erlenmeyer de vidrio Tipo I con cuello ancho (ver EnvasesVidrio 660), agregar
la misma cantidad de Agua Purificada o Agua para Inyeccin agregada inicialmente a los tapones, y pesar. Cubrir la boca del
matraz con un vaso de precipitados de vidrio Tipo I. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura de 121 2 dentro de 20 a 30 minutos y mantenerla durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Agregar Agua Purificada o Agua para Inyeccin para completar de nuevo la masa original. Agitar e inmediatamente decantar y recoger la solucin. [NOTAEsta solucin se debe agitar antes de usarse en cada una de las pruebas.]
Preparacin del Blanco
Captulos
Preparar una solucin blanco en forma similar, usando 200 mL de Agua Purificada o de Agua para Inyeccin, pero omitiendo los tapones.
Apariencia de la Solucin (Turbidez/Opalescencia y Color)

Determinacin de Turbidez (Opalescencia)
NOTALa determinacin de turbidez se puede efectuar por comparacin visual (Procedimiento A), o instrumentalmente, con
un turbidmetro de relacin adecuado (Procedimiento B). Para mayor informacin sobre turbidimetra, ver Espectrofotometra y
Dispersin de Luz 851. La evaluacin instrumental de transparencia constituye una prueba ms sensible que no depende de la
agudeza visual del analista.
Solucin de Sulfato de HidrazinaDisolver 1,0 g de sulfato de hidrazina en agua y diluir con agua hasta 100,0 mL. Dejar en
reposo durante 4 a 6 horas.
Solucin de HexametilentetraminaDisolver 2,5 g de hexametilentetramina en 25,0 mL de agua en un matraz Erlenmeyer
de vidrio tapado de 100 mL.
Suspensin Madre de OpalescenciaAgregar 25,0 mL de Solucin de Sulfato de Hidrazina a la Solucin de Hexametilentetramina en el matraz. Mezclar y dejar en reposo durante 24 horas. Esta suspensin es estable durante un perodo de 2 meses, siempre y cuando se almacene en un envase de vidrio sin defectos en su superficie. La suspensin no debe adherirse al vidrio y
debe mezclarse bien antes de usar.
Suspensin del Estndar de OpalescenciaPreparar una suspensin diluyendo 15,0 mL de la Suspensin Madre de Opalescencia con agua hasta 1000,0 mL. La Suspensin del Estndar de Opalescencia es estable durante aproximadamente 24 horas despus de la preparacin.
Suspensiones de ReferenciaPreparar de acuerdo con la Tabla 2. Mezclar y agitar antes de usar. [NOTALas suspensiones de
formacina estabilizada que se pueden usar para preparar estndares de turbidez estables y diluidos, estn disponibles comercialmente y se pueden usar despus de la comparacin con los estndares preparados como se ha descrito.]
Tabla 2
Suspensin de Referencia A
Suspensin de Referencia B
Suspensin de Referencia C
Suspensin de Referencia D
Estndar de Opalescencia
5,0 mL
10,0 mL
30,0 mL
50,0 mL
Agua
95,0 mL
90,0 mL
70,0 mL
50,0 mL
3 NTU
6 NTU
18 NTU
30 NTU
Unidades de Turbidez Nefelomtrica
Procedimiento A: Comparacin VisualUsar tubos de prueba idnticos, de vidrio neutro, incoloro y transparente con base
plana y un dimetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de lquido de 40 mm con Solucin S, un tubo
hasta la misma altura con agua, y cuatro tubos ms hasta la misma altura con Suspensiones de Referencia A, B, C y D. Comparar
las soluciones bajo luz diurna difusa 5 minutos despus de la preparacin de las Suspensiones de Referencia, observndolas verticalmente contra un fondo negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Suspensin de Referencia A puede distinguirse
fcilmente del agua y la Suspensin de Referencia B puede distinguirse fcilmente de la Suspensin de Referencia A.
RequisitoLa Solucin S no es ms opalescente que la Suspensin de Referencia B para tapones Tipo I y no ms opalescente
que la Suspensin de Referencia C para tapones Tipo II. La Solucin S se considera transparente si su transparencia es igual que la
del agua cuando se examina segn se describi anteriormente o si su opalescencia no es ms pronunciada que la de Suspensin de Referencia A (ver la Tabla 3).
USP 38
Procedimiento B: Comparacin InstrumentalMedir la turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbidmetro calibrado

adecuado (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851). Medir el blanco y corregir los resultados por el blanco. Las Suspensiones de Referencia A, B, C y D representan 3, 6, 18 y 30 Unidades de Turbidez Nefelomtrica (NTU, por sus siglas en ingls),
respectivamente. Medir la turbidez de la Solucin S con el turbidmetro calibrado.
RequisitoLa turbidez de la Solucin S no es mayor que la de la Suspensin de Referencia B (6 NTU FTU) para tapones Tipo I y
no es mayor que la de la Suspensin de Referencia C (18 NTU FTU) para tapones Tipo II (ver la Tabla 3).
Tabla 3
Mtodo de Comparacin
Requisitos de
Opalescencia
Procedimiento A
(Visual)
Procedimiento B
(Instrumental)
Tapones Tipo I
No ms opalescente que la Suspensin B
No ms de 6 NTU
Tapones Tipo II
No ms opalescente que la Suspensin C
No ms de 18 NTU
Determinacin de Color
Estndar de ColorPreparar una solucin diluyendo 3,0 mL de Lquido de Comparacin O (ver Color y Acromatismo 631)
con 97,0 mL de cido clorhdrico diluido.
ProcedimientoUsar tubos idnticos de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un dimetro interno de 15 a
25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de lquido de 40 mm con Solucin S y el segundo con Estndar de Color. Comparar los
lquidos bajo luz diurna difusa, observndolos verticalmente contra un fondo blanco.
RequisitoLa Solucin S no est ms intensamente coloreada que el Estndar de Color.
Solucin de Azul de BromotimolDisolver 50 mg de azul de bromotimol en una mezcla de 4 mL de hidrxido de sodio 0,02
M y 20 mL de alcohol. Diluir con agua hasta 100 mL.
ProcedimientoA 20 mL de Solucin S, agregar 0,1 mL de Solucin de Azul de Bromotimol. Si la solucin es amarilla, valorar
con hidrxido de sodio 0,01 N hasta alcanzar un punto final azul. Si la solucin es azul, valorar con cido clorhdrico 0,01 N
hasta alcanzar un punto final amarillo. Si la solucin es verde, es neutra y no se requiere una valoracin.
Correccin del BlancoProbar 20 mL de Blanco de manera similar. Corregir los resultados obtenidos para la Solucin S, sustrayendo o agregando el volumen de la solucin volumtrica requerida para el Blanco segn sea apropiado. (Ver Volumetra
541.)
RequisitoNo ms de 0,3 mL de hidrxido de sodio 0,01 N producen un color azul, o no ms de 0,8 mL de cido clorhdrico 0,01 N producen un color amarillo o no se requiere una valoracin.
Absorbancia
Procedimiento[NOTAEfectuar esta prueba dentro de las 5 horas de la preparacin de la Solucin S.] Pasar la Solucin S a
travs de un filtro con tamao de poro 0,45 mm, desechando los primeros mL de filtrado. Medir la absorbancia del filtrado a
una longitud de onda entre 220 y 360 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco en una celda pareada en el haz de referencia. Si se requiere diluir el filtrado antes de medir la absorbancia, corregir los resultados de la prueba por la dilucin.
RequisitoLas absorbancias a estas longitudes de onda no exceden de 0,2 para tapones Tipo I o 4,0 para tapones Tipo II.
Sustancias Reductoras
Procedimiento[NOTAEfectuar esta prueba dentro de las 4 horas de la preparacin de la Solucin S.] A 20,0 mL de Solucin
S, agregar 1 mL de cido sulfrico diluido y 20,0 mL de permanganato de potasio 0,002 M. Calentar a ebullicin durante 3
minutos. Enfriar, agregar 1 g de yoduro de potasio, y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 M, usando 0,25 mL de
solucin de almidn SR como indicador. Efectuar una valoracin usando 20,0 mL de blanco y anotar la diferencia en volumen
de tiosulfato de sodio 0,01 M requerido.
RequisitoLa diferencia entre los volmenes de las valoraciones no es mayor de 3,0 mL para tapones Tipo I y no es mayor
de 7,0 mL para tapones Tipo II.
Metales Pesados
ProcedimientoProceder segn se indica en Mtodo 1 en Metales Pesados 231. Preparar la Preparacin de Prueba usando
10,0 mL de Solucin S.
RequisitoLa Solucin S contiene no ms de 2 ppm de metales pesados como plomo.
Captulos
Acidez o Alcalinidad
USP 38
Cinc Extrable
Solucin de PruebaPreparar una Solucin de Prueba diluyendo 10,0 mL de Solucin S con cido clorhdrico 0,1 N hasta 100
mL. Preparar un blanco de prueba de forma similar, usando el Blanco en lugar de la Solucin S.
Solucin Estndar de CincPreparar una solucin (10 ppm de Zn) disolviendo sulfato de cinc en cido clorhdrico 0,1 N.
Soluciones de ReferenciaPreparar no menos de tres Soluciones de Referencia, diluyendo la Solucin Estndar de Cinc con cido clorhdrico 0,1 N. Las concentraciones de cinc en estas Soluciones de Referencia deben abarcar el lmite esperado para la
Solucin de Prueba.
ProcedimientoUsar un espectrofotmetro de absorcin atmica apropiado (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz
851) equipado con una lmpara de cinc de ctodo hueco y una llama de aireacetileno. Se puede usar un procedimiento
alterno tal como un anlisis de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en ingls) apropiadamente validado.
Probar cada una de las Soluciones de Referencia en la lnea de emisin de cinc a 213,9 nm por lo menos tres veces. Registrar
las lecturas estables. Enjuagar el aparato con la solucin del blanco de prueba cada vez, para garantizar que la lectura retorna
al valor inicial del blanco. Preparar una curva de calibracin a partir de la media de las lecturas obtenidas para cada Solucin de
Referencia. Registrar la absorbancia de la Solucin de Prueba. Determinar la concentracin de cinc en ppm de la Solucin de
Prueba usando la curva de calibracin.
RequisitoLa Solucin S contiene no ms de 5 ppm de cinc extrable.
Captulos
Amonio
Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio AlcalinaPreparar una solucin de 100 mL que contenga 11 g de yoduro de potasio y 15 g de yoduro mercrico en agua. Inmediatamente antes de usar, mezclar 1 volumen de esta solucin con un volumen igual de una solucin de hidrxido de sodio de 250 g por L.
Solucin de PruebaDiluir 5 mL de Solucin S con agua hasta 14 mL. Alcalinizarla, si fuera necesario, agregando hidrxido
de sodio 1 N y diluir hasta 15 mL con agua. Agregar 0,3 mL de Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina y cerrar el
recipiente.
Solucin Estndar de AmonioPreparar una solucin de cloruro de amonio en agua (1 ppm NH4). Mezclar 10 mL de la solucin de cloruro de amonio de 1 ppm con 5 mL de agua y 0,3 mL de Solucin de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina. Cerrar
el recipiente.
RequisitoDespus de 5 minutos, cualquier color amarillo en la Solucin de Prueba no es ms oscuro que el de la Solucin
Estndar de Amonio (no ms de 2 ppm de NH4 en la Solucin S).
Sulfuros Voltiles
ProcedimientoColocar tapones, cortados si fuera necesario, con un rea superficial total de 20 2 cm2 en un matraz de
100 mL y agregar 50 mL de una solucin de cido ctrico de 20 g por L. De la misma manera y en forma simultnea, preparar
una solucin de control en otro matraz de 100 mL, disolviendo 0,154 mg de sulfuro de sodio en 50 mL de una solucin de
cido ctrico de 20 g por L. Colocar un trozo de papel de acetato de plomo sobre la boca de cada matraz y asegurarlo en
posicin, poniendo sobre l un frasco para pesada invertido. Calentar los matraces en un autoclave a 121 2 durante 30 minutos.
RequisitoCualquier mancha negra en el papel, producida por la solucin de prueba, no es ms intensa que la producida
por la solucin de control.
PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD
NOTALas muestras tratadas segn se describi para la preparacin de la Solucin S y secadas al aire, se deben usar para las
Pruebas de Funcionalidad de Penetrabilidad, Fragmentacin y Capacidad de Autosellado. Las Pruebas de Funcionalidad se efectan
en tapones destinados a ser perforados por una aguja hipodrmica. La prueba de Capacidad de Autosellado se requiere slo
para tapones destinados a envases multidosis. La aguja especificada para cada prueba es una aguja hipodrmica lubricada de
bisel largo (ngulo de bisel: 12 2)1.
Penetrabilidad
ProcedimientoLlenar con agua 10 viales adecuados hasta el volumen nominal, colocar los tapones a examinar y asegurar
con una tapa. Usando una aguja hipodrmica nueva, segn se describi anteriormente, para cada tapn, perforar el tapn con
la aguja perpendicular a la superficie.
RequisitoLa fuerza de la perforacin no es mayor que 10 N (1 kgf) para cada tapn, determinada con una exactitud de
0,25 N (25 gf).
1
Consultar ISO 7864, Agujas hipodrmicas estriles para nico uso con un dimetro externo de 0,8 mm (Calibre 21).
USP 38
Pruebas Qumicas / 391 Valoracin de Epinefrina 297
Fragmentacin
Tapones para Preparaciones LquidasLlenar con agua 12 viales limpios hasta 4 mL menos de la capacidad nominal. Colocar
los tapones a examinar, asegurarlos con una tapa y dejar en reposo durante 16 horas.
Tapones para Preparaciones SecasColocar los tapones a examinar en 12 viales limpios y asegurar cada uno con una tapa.
ProcedimientoUsando una aguja hipodrmica segn se describi anteriormente, colocada en una jeringa limpia, inyectar
dentro de cada vial 1 mL de agua mientras se retira 1 mL de aire. Repetir este procedimiento cuatro veces para cada tapn,
perforando cada vez en un sitio diferente. Usar una aguja nueva para cada tapn, verificando que no se vuelva roma durante la
prueba. Filtrar el volumen total de lquido en todos los viales a travs de un nico filtro con un tamao de poro nominal no
mayor que 0,5 mm. Contar los fragmentos de caucho que se puedan ver a simple vista en la superficie del filtro.
RequisitoNo hay ms de cinco fragmentos visibles. Este lmite se basa en la suposicin de que los fragmentos con un dimetro >50 mm se pueden ver a simple vista. En caso de duda o controversia, examinar las partculas microscpicamente para
verificar su naturaleza y tamao.
Capacidad de Autosellado
391 VALORACIN DE EPINEFRINA

Estndares de Referencia USP 11ER Bitartrato de Epinefrina USP.
Solucin Ferro-CtricaEl da en que se va a utilizar, disolver 1,5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua, a los que se ha
agregado 1,0 mL de cido clorhdrico diluido (1 en 12) y 1,0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato de sodio en
10 mL de esta solucin y mezclar.
Solucin AmortiguadoraEn un matraz volumtrico de 50 mL, mezclar 4,2 g de bicarbonato de sodio, 5,0 g de bicarbonato de potasio y 18 mL de agua (no todos los slidos se disolvern en esta etapa). A otros 18 mL de agua, agregar 3,75 g de
cido aminoactico y 1,7 mL de hidrxido de amonio 6 N; mezclar para disolver y transferir esta solucin al matraz volumtrico de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir a volumen con agua y mezclar hasta dilucin completa.
Preparacin EstndarTransferir aproximadamente 18 mg de ER Bitartrato de Epinefrina USP pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 100 mL con ayuda de 20 mL de solucin de bisulfito de sodio (1 en 50), diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con solucin de bisulfito de
sodio (1 en 500) y mezclar. [NOTAHacer la dilucin final en el momento de llevar a cabo la valoracin.] La concentracin de
ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparacin Estndar es aproximadamente 18 mg por mL.
Preparacin de ValoracinTransferir a un matraz volumtrico de 50 mL un volumen medido con exactitud de la Inyeccin a valorar, que equivalga aproximadamente a 500 mg de epinefrina, diluir a volumen con solucin de bisulfito de sodio (1
en 500), si fuera necesario, y mezclar. [NOTALa concentracin final de bisulfito de sodio est en el intervalo de 1 a 3 mg por
mL, teniendo en cuenta todo el bisulfito presente en la Inyeccin a valorar.]
ProcedimientoA tres matraces Erlenmeyer de 50 mL con tapones de vidrio, transferir sendas alcuotas de 20,0 mL de la
Preparacin Estndar, de la Preparacin de Valoracin y de la solucin de bisulfito de sodio (1 en 500) para proporcionar el blanco. A cada matraz, agregar 200 mL de Solucin Ferro-Ctrica y 2,0 mL de Solucin Amortiguadora, mezclar y dejar las soluciones
en reposo durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones en celdas de 5 cm a la longitud de onda de mxima absorcin, aproximadamente a 530 nm, con un espectrofotmetro apropiado, utilizando el blanco para ajustar el instrumento. Calcular la cantidad, en mg, de epinefrina (C9H13NO3) en cada mL de Inyeccin, por la frmula:
(183,21/333,30)(0,05C/V)(AU/AS)
en donde 183,21 y 333,30 son los pesos moleculares de epinefrina y bitartrato de epinefrina, respectivamente; C es la concentracin, en mg por mL, de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparacin Estndar; y V es el volumen tomado, en mL, de
Inyeccin.
Captulos
ProcedimientoLlenar 10 viales adecuados con agua hasta el volumen nominal. Colocar los tapones a examinar y tapar.
Usando una jeringa hipodrmica nueva para cada tapn, segn se describi anteriormente, perforar cada tapn 10 veces en
un sitio diferente cada vez. Sumergir los 10 viales en una solucin de azul de metileno al 0,1% (1 g por L) y reducir la presin
externa en 27 kPa durante 10 minutos. Restablecer la presin atmosfrica y dejar los viales sumergidos durante 30 minutos.
Enjuagar el exterior de los viales.
RequisitoNinguno de los viales contiene vestigios de solucin azul.
298 401 Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Qumicas
USP 38
401 GRASAS Y ACEITES FIJOS

Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, blsamos y sustancias
similares.
Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de estearina, entibiar el recipiente en un bao de agua a 50
hasta que el aceite quede transparente; si el aceite no se clarifica al entibiarlo, filtrarlo a travs de un papel de filtro seco en un
embudo dentro de una camisa de agua caliente. Mezclar minuciosamente y pesar de una vez tantas porciones como sean necesarias para las distintas determinaciones, empleando preferiblemente una botella que tenga una pipeta gotero o una bureta
de pesaje. Si la muestra se solidifica a temperatura ambiente, mantenerla fundida hasta que se hayan tomado las porciones
necesarias.
PESO ESPECFICO
Determinar el peso especfico de una grasa o aceite segn se indica en Peso Especfico 841.
Captulos
TEMPERATURA DE FUSIN
Determinar la temperatura de fusin segn se indica para las sustancias de Clase II (ver Intervalo o Temperatura de Fusin
741).
NDICE DE ACIDEZ (CIDOS GRASOS LIBRES)

La acidez de las grasas y los aceites fijos en esta farmacopea pueden expresarse como el nmero de mL de lcali 0,1 N requerido para neutralizar los cidos libres en 10,0 g de sustancia. La acidez se expresa frecuentemente como el ndice de Acidez, que es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para neutralizar los cidos libres en 1,0 g de la sustancia. A
menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo I.
Mtodo I
ProcedimientoA menos que se especifique algo diferente, disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesados con
exactitud, en 50 mL de una mezcla de volmenes iguales de alcohol y ter (que se haya neutralizado a la fenolftalena con
hidrxido de potasio 0,1 N o hidrxido de sodio 0,1 N, a menos que se especifique algo diferente) contenidos en un matraz.
Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente fro, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agregar 1 mL de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de
potasio 0,1 N SV o hidrxido de sodio 0,1 N SV hasta que la solucin permanezca de color ligeramente rosado despus de
agitar durante 30 segundos. Calcular el ndice de Acidez o el volumen de lcali 0,1 N requerido para neutralizar 10,0 g de
muestra (cidos grasos libres), segn corresponda. Calcular el ndice de Acidez:
Resultado = (Mr V) (N/W)
Mr = peso molecular del hidrxido de potasio, 56,11
V = volumen (mL)
N = normalidad de la solucin de hidrxido de potasio o la solucin de hidrxido de sodio
W = peso de la muestra tomada (g)
Si el volumen de hidrxido de potasio 0,1 N SV o hidrxido de sodio 0,1 N SV requerido para la volumetra es menos de 2
mL, puede utilizarse una solucin volumtrica ms diluida o ajustar el tamao de la muestra de acuerdo con las necesidades.
Los resultados pueden expresarse en trminos del volumen de solucin volumtrica utilizado o en trminos del volumen equivalente de hidrxido de potasio 0,1 N o hidrxido de sodio 0,1 N.
Si se ha saturado el aceite con dixido de carbono para preservarlo, someter la solucin de alcohol-ter a reflujo suavemente
durante 10 minutos antes de la volumetra. Tambin se puede eliminar el dixido de carbono del aceite, exponindolo al vaco
durante 24 horas dentro de una cpsula de poca profundidad en un desecador, antes de pesar las muestras de prueba.
Mtodo II
ProcedimientoPreparar 125 mL de una mezcla de disolventes que contenga volmenes iguales de alcohol isoproplico y
tolueno. Antes de su uso, agregar 2 mL de una solucin de fenolftalena al 1% en alcohol isoproplico a la mezla de 125 mL y
Pruebas Qumicas / 401 Grasas y Aceites Fijos 299
USP 38
neutralizar con lcali hasta que se produzca un color rosado leve pero permanente. Pesar con exactitud la cantidad adecuada
de una muestra lquida bien mezclada, indicada en la Tabla 1 y disolverla en la mezcla de disolventes neutralizada. Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente fro, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agitar vigorosamente mientras se valora con hidrxido de potasio 0,1
N SV o hidrxido de sodio 0,1 N SV hasta que se produzca el primer color rosado permanente, de la misma intensidad que la
del disolvente neutralizado antes de mezclar con la muestra. Calcular el ndice de Acidez segn se indica en el Mtodo I.
Tabla 1
ndice de Acidez
Peso de Muestra (g)
01
20
14
10
415
2,5
1574,9
0,5
75,0
0,1
NDICE DE ESTERIFICACIN
Resultado = [Mr (VB VT) N]/W

VB = volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (mL)
VT = volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del cido clorhdrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
NDICE DE HIDROXILO
El ndice de Hidroxilo es el nmero de mg de hidrxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la
sustancia.
Reactivo de PiridinaAnhdrido ActicoAntes de usar, mezclar 3 volmenes de piridina recientemente abierta o recin
destilada con 1 volumen de anhdrido actico recin abierto o recin destilado.
ProcedimientoTransferir una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud y ajustada a la Tabla 2, a un matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapn de vidrio y agregar 5,0 mL de Reactivo PiridinaAnhdrido Actico. Transferir 5,0 mL de Reactivo PiridinaAnhdrido Actico a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapn de vidrio para proporcionar el blanco del reactivo.
Equipar ambos matraces con condensadores de reflujo con juntas de vidrio adecuadas, calentar en un bao de vapor durante
1 hora, agregar 10 mL de agua a travs de cada condensador y calentar en el bao de vapor durante 10 minutos adicionales.
Enfriar y agregar 25 mL de alcohol butlico previamente neutralizado a la fenolftalena SR con hidrxido de potasio alcohlico
0,5 N a cada matraz, vertiendo 15 mL a travs de cada condensador y lavando las paredes de cada matraz con las porciones
de 10 mL restantes despus de retirar los condensadores. Agregar 1 mL de fenolftalena SR a cada matraz y valorar con hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV, registrando el volumen, en mL, consumido por el cido residual en la solucin de prueba
como T y el consumido por el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 mL, mezclar aproximadamente 10 g de la
sustancia, pesada con exactitud, con 10 mL de piridina recin destilada y previamente neutralizada a la fenolftalena SR, agregar 1 mL de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV, registrando el volumen, en mL, consumido por el cido libre en la muestra de prueba como A. Calcular el ndice de Hidroxilo:
Resultado = [(Mr N)/W] {B + [(W A)/C] T}
N = normalidad exacta del hidrxido de potasio alcohlico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilacin (g)
C = peso de la sustancia tomada para la determinacin de cido libre (g)
Si se conoce el ndice de Acidez para la sustancia de prueba, calcular el ndice de Hidroxilo:
Captulos
El ndice de Esterificacin es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para saponificar los steres en 1,0 g de la
sustancia. Si se han determinado el ndice de Saponificacin y el ndice de Acidez, la diferencia entre stos dos representa el
ndice de Esterificacin, es decir, ndice de Esterificacin = ndice de Saponificacin ndice de Acidez.
ProcedimientoColocar 1,52 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL, agregar 2030
mL de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 mL de fenolftalena SR y valorar con hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV
hasta que se neutralice el cido libre. Agregar 25,0 mL de hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N SV y proceder segn se indica
en ndice de Saponificacin, comenzando donde dice Calentar el matraz, pero omitiendo la adicin posterior de fenolftalena
SR. Calcular el ndice de Esterificacin:
USP 38
Resultado = [(Mr N)/W] (B T) + ndice de Acidez

N = normalidad exacta del hidrxido de potasio alcohlico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilacin (g)
Tabla 2
Intervalo del ndice
de Hidroxilo
Peso de la Muestra de Prueba

(g)
020
10
2050
50100
100150
150200
1,5
200250
1,25
250300
1,0
300350
0,75
Captulos
NDICE DE YODO
El ndice de Yodo representa el nmero de g de yodo absorbido, en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A
menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, determinar el ndice de Yodo mediante el Mtodo I.
Mtodo I (Mtodo de Hanus)

ProcedimientoTransferir una cantidad de la muestra pesada con exactitud, segn se determina en la Tabla 3, a un matraz para yodo de 250 mL, disolver en 10 mL de cloroformo, agregar 25,0 mL de yodobromuro SR, tapar el vaso en forma
segura y dejar en reposo durante 30 minutos, protegido de la luz, agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este orden, 30
mL de yoduro de potasio SR y 100 mL de agua, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 N SV, agitando minuciosamente despus de cada adicin de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torne muy plido, agregar 3 mL de almidn SR y
continuar la valoracin con tiosulfato de sodio 0,1 N SV hasta que el color azul desaparezca. Realizar una prueba blanco al
mismo tiempo con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetra 541, Valoraciones Residuales). Calcular el ndice de Yodo:
Resultado = [Ar (VB VS) N]/(10 W)
Ar = peso atmico del yodo, 126,90
VB = volumen de tiosulfato de sodio 0,1 N SV consumido por la prueba del blanco (mL)
VS = volumen de tiosulfato de sodio 0,1 N SV consumido por la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV
NOTASi la porcin de sustancia tomada absorbe ms de la mitad del yodobromuro SR, repetir la determinacin empleando una porcin ms pequea de la sustancia en anlisis.
Tabla 3. Peso de las Muestras
ndice de
Yodo Esperado
Peso (g)
0,1
<5
3,0
520
1,0
2150
0,4
51100
0,2
101150
0,13
151200
0,1
Mtodo II
Solucin de Yoduro de PotasioDisolver 10,0 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 mL. Almacenar en recipientes resistentes a la luz.
Solucin Indicadora de AlmidnMezclar 1 g de almidn soluble con suficiente agua fra para obtener una pasta fina.
Agregar, mezclando, a 100 mL de agua hirviendo. Mezclar y enfriar. Emplear slo la solucin transparente.
USP 38
ProcedimientoFundir la muestra si no estuviera lquida todava. [NOTALa temperatura durante la fusin debe exceder
el punto de fusin de la muestra en no ms de 10.] Pasar a travs de dos trozos de papel de filtro para eliminar cualquier
impureza slida y los ltimos restos de humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 100 pero debe completarse dentro de los 5 minutos 30 segundos. La muestra debe estar absolutamente seca. Todo el material de vidrio debe estar
absolutamente limpio y completamente seco. Despus del filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura de
6871 1 antes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcance una temperatura de 6871 1, pesar inmediatamente
la muestra en un matraz para yodo de 500 mL, ajustndose a los pesos y la exactitud de pesada de la tabla adjunta. [NOTAEl
peso de la sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de yodocloruro SR de 5060% de la cantidad agregada, es decir,
del 100150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla recin preparada de ciclohexano y cido actico glacial (1:1) y agitar por rotacin suave hasta disolver la muestra. Agregar 25,0 mL de yodocloruro SR, tapar el matraz de forma
segura y agitar por rotacin suave para mezclar. Dejar en reposo a 25 5, protegido de la luz, agitando ocasionalmente, durante 1,0 2,0 horas, dependiendo del ndice de Yodo (IV) de la muestra: IV < 150, 1,0 hora; IV 150, 2,0 horas. Luego, dentro de los 3 minutos despus del tiempo de reaccin indicado, agregar en este orden, 20 mL de Solucin de Yoduro de Potasio y
150 mL de agua recin hervida y enfriada, y mezclar. Dentro de los 30 minutos, valorar el yodo liberado con tiosulfato de
sodio 0,1 N SV mientras se mezcla mecnicamente despus de cada adicin de tiosulfato. Cuando el color amarillo del yodo
haya desparecido casi por completo, agregar 12 mL de Solucin Indicadora de Almidn y continuar la valoracin con tiosulfato
de sodio 0,1 N SV hasta que desaparezca el color azul. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo, con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetra 541 Valoraciones Residuales). Calcular el ndice de Yodo,
segn se indica en Mtodo I.
NDICE DE PERXIDO
Resultado = [1000 (VT VB) N]/W

VT = volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba real (mL)
VB = volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba del blanco (mL)
N = normalidad exacta de la solucin de tiosulfato de sodio
NDICE DE SAPONIFICACIN
El ndice de Saponificacin es el nmero de mg de hidrxido de potasio necesario para neutralizar los cidos libres y saponificar los steres existentes en 1,0 g de la sustancia.
ProcedimientoColocar 1,52 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL y agregar 25,0
mL de hidrxido de potasio alcohlico 0,5 N. Calentar el matraz en un bao de vapor, bajo un condensador adecuado para
mantener el reflujo durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. [NOTAEl tiempo de reflujo puede ser de hasta
90 minutos para asegurar la saponificacin completa, dependiendo del tipo de ster a analizar.] Agregar a continuacin 1 mL
de fenolftalena SR y valorar el exceso de hidrxido de potasio con cido clorhdrico 0,5 N SV. Realizar una determinacin con
un blanco en las mismas condiciones (ver Volumetra 541, Valoraciones Residuales). La valoracin tambin puede realizarse
potenciomtricamente. Calcular el ndice de Saponificacin:
Resultado = [Mr (VB VT) N]/W
VB = volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (mL)
VT = volumen de cido clorhdrico 0,5 N consumido en la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del cido clorhdrico
Si el aceite se ha saturado con dixido de carbono con el propsito de conservarlo, dejarlo en una cpsula poco profunda en
un desecador de vaco durante 24 horas antes de pesar las muestras de prueba.
Captulos
El ndice de Perxido es el nmero que expresa, en miliequivalentes de oxgeno activo, la cantidad de perxido contenido
en 1000 g de la sustancia. [NOTAEsta prueba debe realizarse inmediatamente despus de tomar la muestra para evitar la oxidacin de la muestra de prueba.]
ProcedimientoA menos que se indique algo diferente, colocar aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exactitud, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapn de vidrio esmerilado. Agregar 30 mL de una mezcla de cido actico
glacial y cloroformo (3:2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 mL de solucin de yoduro de potasio saturada. Agitar durante 1
minuto exactamente y agregar 30 mL de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando lentamente la solucin
volumtrica y agitando continuamente, hasta que el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 mL de almidn
SR y continuar la valoracin, agitando enrgicamente, hasta que desaparezca el color azul. Realizar una determinacin con un
blanco en las mismas condiciones. [NOTAEl volumen de solucin volumtrica empleada en la determinacin con el blanco
no debe exceder 0,1 mL.] Calcular el ndice de Perxido:
USP 38
MATERIA INSAPONIFICABLE
Captulos
El trmino materia insaponificable en aceites o grasas, se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por medio
de hidrxidos alcalinos, pero que son solubles en disolventes de grasas ordinarios, y a los productos de saponificacin que son
solubles en dichos disolventes.
ProcedimientoTransferir aproximadamente 5,0 g del aceite o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de
250 mL, agregar 50 mL de una solucin de hidrxido de potasio alcohlico preparada disolviendo 12 g de hidrxido de potasio en 10 mL de agua y diluyendo esta solucin con alcohol hasta 100 mL, y calentar el matraz en un bao de vapor bajo un
condensador adecuado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando frecuentemente por rotacin suave. Enfriar a una
temperatura inferior a 25 y transferir el contenido del matraz a un separador con una llave de paso de tefln, enjuagando el
matraz con dos porciones de 50 mL de agua que se agregan al separador (no usar grasa en la llave de paso). Extraer con tres
porciones de 100 mL de ter, combinando los extractos de ter en otro separador que contenga 40 mL de agua. Rotar o agitar suavemente el separador durante unos minutos. [NOTASi se agita con demasiada fuerza, puede formarse una emulsin
difcil de separar.] Dejar que la mezcla se separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de ter con dos porciones
adicionales de 40 mL de agua y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de ter sucesivamente con una porcin de 40
mL de solucin de hidrxido de potasio (3 en 100) y una porcin de 40 mL de agua. Repetir tres veces esta secuencia de
lavado con solucin de hidrxido de potasio y agua. Lavar el extracto de ter con porciones de 40 mL de agua hasta que el
ltimo lavado no se torne rojo con la adicin de 2 gotas de fenolftalena SR. Transferir el extracto de ter a un matraz tarado y
enjuagar el separador con 10 mL de ter, agregando los enjuagues al matraz. Evaporar el ter en un bao de vapor y agregar
6 mL de acetona al residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el residuo a 105 hasta que las pesadas sucesivas difieran en no ms de 1 mg. Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porcin de aceite o grasa tomada:
Resultado = 100 (WR/WS)
WR = peso del residuo (g)
WS = peso del aceite o grasa tomado para la prueba (g)
Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente en el punto final de la fenolftalena, agregar fenolftalena
SR y valorar con hidrxido de sodio alcohlico 0,1 N SV hasta la primera aparicin de un color rosado plido que permanezca
durante no menos de 30 segundos. Si el volumen requerido de hidrxido de sodio alcohlico 0,1 N es superior a 0,2 mL, la
separacin de las capas no fue completa; el residuo pesado no puede considerarse como materia insaponificable y debe repetirse la prueba.
TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIN DE CIDOS GRASOS

Preparacin de los cidos GrasosCalentar 75 mL de solucin de glicerinahidrxido de potasio (preparada disolviendo
25 g de hidrxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de precipitados de 800 mL a 150 y agregar 50 mL de la
grasa clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15 minutos mezclando con frecuencia, pero sin permitir que la temperatura sobrepase los 150. La saponificacin se considera completa cuando la mezcla es homognea, sin partculas que se adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 mL de agua
prxima a su punto de ebullicin, en una cpsula con mango o un vaso de precipitados de 800 mL, agregar lentamente 50
mL de cido sulfrico diluido [preparado agregando agua y cido sulfrico (3:1)] y calentar la solucin, mezclando con frecuencia, hasta que los cidos grasos se separen claramente, formando una capa transparente. Lavar los cidos con agua hirviendo hasta que queden libres de cido sulfrico, recogerlos en un vaso de precipitados pequeo, colocar en un bao de
vapor hasta que el agua se haya sedimentado y los cidos grasos se vuelvan transparentes, filtrar en un vaso de precipitados
seco mientras est caliente y secar a 105 durante 20 minutos. Colocar los cidos grasos an calientes en un recipiente adecuado y enfriar en un bao de hielo hasta que se solidifiquen.
Prueba de Saponificacin CompletaColocar 3 mL de los cidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol.
Calentar la solucin a ebullicin y agregar un volumen igual de hidrxido de amonio 6 N. Se obtiene una solucin transparente.
ProcedimientoEmpleando un aparato similar al Aparato de Temperatura de Solidificacin especificado en el captulo Temperatura de Solidificacin 651, proceder segn se indica en Procedimiento, leyendo temperatura de solidificacin por punto
de solidificacin (los trminos son sinnimos). El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas del punto ms alto al
que llega la temperatura es la temperatura de solidificacin de los cidos grasos.
COMPOSICIN DE CIDOS GRASOS

Solucin EstndarPreparar una mezcla de ster de composicin conocida que contenga los steres requeridos en la monografa individual. Esta Solucin Estndar puede contener otros componentes. [NOTALas mezclas de steres estn disponibles comercialmente en Nu-Chek-Prep, Inc., PO Box 295, Elysian, MN 56028. Las mezclas de steres habituales que son tiles
para esta prueba incluyen Nu-Chek 17A y Nu-Chek 19A.] La mezcla Nu-Chek 17A tiene la siguiente composicin:
USP 38
Tabla 4
Porcentaje
ster de cido Graso
Longitud de la Cadena
de Carbono
N de
Enlaces Dobles
0
1,0
Miristato de metilo
14
4,0
Palmitato de metilo
16
3,0
Estearato de metilo
18
3,0
Araquidato de metilo
20
3,0
Behenato de metilo
22
3,0
Lignocerato de metilo
24
45,0
Oleato de metilo
18
15,0
Linoleato de metilo
18
3,0
Linolenato de metilo
18
20,0
Erucato de metilo
22
Longitud de la Cadena
de Carbono
N de
Enlaces Dobles
La mezcla Nu-Chek 19A tiene la siguiente composicin:

Tabla 5
Porcentaje
ster de cido Graso

Caprilato de metilo
5,0
Caprato de metilo
10
48,0
Laurato de metilo
12
15,0
Miristato de metilo
14
7,0
Palmitato de metilo
16
3,0
Estearato de metilo
18
12,0
Oleato de metilo
18
3,0
Linoleato de metilo
18
Solucin de Hidrxido de Sodio Metanlico 0,5 NDisolver 2 g de hidrxido de sodio en 100 mL de metanol.
Solucin de Prueba[NOTASi en la muestra de prueba hay cidos grasos que contengan ms de 2 enlaces dobles, extraer el aire del matraz purgndolo con nitrgeno durante unos minutos.] Transferir aproximadamente 100 mg de la muestra
de prueba a un matraz Erlenmeyer de 50 mL equipado con un condensador de reflujo adecuado enfriado con agua y una
barra mezcladora magntica. Agregar 4 mL de Solucin de Hidrxido de Sodio Metanlico 0,5 N y someter a reflujo hasta que
desaparezcan los glbulos de grasa (generalmente 510 minutos). Agregar 5 mL de una solucin preparada disolviendo 14 g
de trifluoruro de boro en metanol para obtener 100 mL, agitar por rotacin suave para mezclar y someter a reflujo durante 2
minutos. Agregar 4 mL de n-heptano cromatogrfico, a travs del condensador y someter a reflujo durante 1 minuto. Enfriar,
retirar el condensador, agregar aproximadamente 15 mL de solucin de cloruro de sodio saturada, agitar y dejar que las capas
se separen. Pasar la capa de n-heptano a travs de 0,1 g de sulfato de sodio anhidro (lavado previamente con n-heptano cromatogrfico) a un matraz apropiado. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 10 mL, diluir con n-heptano cromatogrfico a volumen y mezclar.
Solucin de Aptitud del SistemaTransferir aproximadamente 20 mg de cido esterico, de cido palmtico y de cido
oleico a un matraz Erlenmeyer de 25 mL equipado con un condensador a reflujo enfriado por agua adecuado y una barra mezcladora magntica, y proceder segn se indica para la Solucin de Prueba, empezando donde dice Agregar 5,0 mL de una
solucin preparada disolviendo.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la
llama, mantenido a una temperatura de aproximadamente 260, un sistema de inyeccin no dividido y una columna capilar
de slice fundida de 0,53 mm 30 m, ligada con una capa de fase G16 de 1,0 mm. Programar el cromatgrafo para que mantenga una temperatura de columna de 70 durante aproximadamente 2 minutos despus de la inyeccin, luego para que aumente la temperatura a una velocidad de 5/min hasta 240 y finalmente para que mantenga esta temperatura durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector aproximadamente a 220. El gas transportador es helio con una velocidad lineal
de aproximadamente 50 cm/s.
Cromatografiar la Solucin de Aptitud del Sistema y registrar las respuestas de los picos segn se indica en Procedimiento: los
tiempos de retencin relativos son aproximadamente 0,87 para el palmitato de metilo, 0,99 para el estearato de metilo y 1,0
para el oleato de metilo; la resolucin, R, entre el estearato de metilo y el oleato de metilo es no menos de 1,5; y la desviacin
estndar relativa de las respuestas de las reas de los picos de palmitato y estearato en inyecciones repetidas es no ms de
6,0%. La desviacin estndar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y del estearato en inyecciones
repetidas es no ms de 1,0%.
ProcedimientoInyectar por separado volmenes iguales (aproximadamente 1 mL) de la Solucin Estndar y la Solucin de
Prueba en el cromatgrafo, registrar los cromatogramas, identificar los picos de ster de los cidos grasos en el cromatograma
de la Solucin de Prueba, comparando los tiempos de retencin de estos picos con los del cromatograma de la Solucin Estn-
Captulos
7,0
USP 38
dar y medir las reas de los picos para todos los picos de ster de los cidos grasos en el cromatograma de la Solucin de Prueba. Calcular el porcentaje de cada componente de cido graso en la muestra de prueba:
Resultado = 100 (A/B)
A = rea de la respuesta de los picos obtenidos para cada componente de ster de cido graso individual
B = suma de las reas de todos los picos, excluido el pico del disolvente, en el cromatograma de la Solucin de Prueba
DETERMINACIN Y PERFIL DE CIDOS GRASOS OMEGA-3

El siguiente procedimiento se puede usar para la determinacin de cido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3), cido docosahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3) y cidos omega-3 totales que se obtienen de peces, plantas o fuentes microbianas en aceites
a granel y aceite encapsulado, ya sea como triglicridos o como steres etlicos. El trmino triglicrido es aplicable a aceites
de algas, aceites de pescado, aceites de hgado de pescado y productos que contienen cidos omega-3 en forma de triglicridos. Los resultados se expresan como cidos grasos libres o steres etlicos. Realizar las pruebas lo ms rpidamente posible.
Proteger las soluciones de la luz actnica, agentes oxidantes, catalizadores de oxidacin y aire.
Captulos
Contenido de EPA y DHA

ER ster Etlico del cido Docosahexaenoico USP
ER ster Etlico del cido Eicosapentaenoico USP
ER Tricosanoato de Metilo USP
Solucin AntioxidanteDisolver una cantidad, pesada con exactitud, de butil hidroxitolueno en 2,2,4-trimetilpentano para obtener una solucin con una concentracin de 0,05 mg por mL.
Solucin de Estndar InternoTransferir una cantidad de ER Tricosanoato de Metilo USP, pesada con exactitud, a un matraz volumtrico. Disolver en Solucin Antioxidante y diluir con el mismo disolvente hasta obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 7,0 mg/mL. [NOTAProteger la solucin de la evaporacin durante su uso.]
Tabla 6
Suma Aproximada
EPA + DHA
Cantidad de Muestra
a Pesar
(g)
30%50%
0,40,5
50%70%
0,3
>70%
0,25
Solucin de Prueba 1 (para triglicridos)En un matraz volumtrico de 10 mL, disolver la masa de la muestra a examinar,
de acuerdo con la Tabla 6, en Solucin Antioxidante y diluir con la misma solucin a volumen. Transferir 2,0 mL de esta solucin a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrgeno. Agregar 1,5 mL de una solucin de
hidrxido de sodio en metanol al 2% (p/v), tapar hermticamente con una tapa con recubrimiento interno de politetrafluoroetileno, mezclar y calentar en un bao de agua hirviendo durante 7 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de solucin de tricloruro de
borometanol (120 g en 1000 mL de metanol), cubrir con nitrgeno, tapar hermticamente, mezclar y calentar en un bao de
agua hirviendo durante 30 minutos. Enfriar a una temperatura de 4050, agregar 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano, tapar y
mezclar en un mezclador de vrtice o agitar vigorosamente durante al menos 30 segundos. Agregar inmediatamente 5 mL de
solucin saturada de cloruro de sodio que contenga 1 volumen de cloruro de sodio y 2 volmenes de agua. [NOTAAgitar de
vez en cuando. Antes de usar, decantar la solucin de cualquier sustancia no disuelta y filtrar si fuera necesario.] Cubrir con
nitrgeno, tapar y mezclar en un mezclador de vrtice o agitar minuciosamente durante al menos 15 segundos. Dejar que la
capa superior se torne transparente y transferir a otro tubo. Agitar la capa de metanol una vez ms con 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano y combinar los extractos de 2,2,4-trimetilpentano. Lavar los extractos combinados dos veces, cada una con 1 mL de
agua, y secar sobre sulfato de sodio anhidro.
Solucin de Prueba 2 (para triglicridos)Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solucin
de Prueba 1 a un matraz volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con Solucin de Estndar Interno a volumen. Puede aplicarse
calor suave (hasta un mximo de 60) para obtener una solucin transparente. Despus, proceder segn se indica en Solucin
de Prueba 1, comenzando donde dice Transferir 2,0 mL.
Solucin de Prueba 3 (para steres etlicos)En un matraz volumtrico de 10 mL, disolver la masa de la muestra a examinar, ajustndose a la Tabla 6, en Solucin de Estndar Interno y diluir con la misma solucin a volumen. Puede aplicarse calor
suave (hasta un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
Solucin de Prueba 4 (para steres etlicos)Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solucin de Prueba 3 a un matraz volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con Solucin Antioxidante a volumen.
USP 38
Tabla 7a (Inyeccin Dividida)
Temperatura
Inicial
()
Tiempo de
Espera
(Hold
Time)
a 170
(min)
Rampa de
Temperatura
(/min)
Temperatura
Final
()
Tiempo de
Espera
(Hold Time)
a la
Temperatura
Final
(min)
170
240
2,5
Tabla 7b (Inyeccin no Dividida)
Temperatura
Inicial
()
Tiempo de
Espera
(Hold
Time)
a 90
(min)
Rampa de
Temperatura
Nmero 1
(/min)
Hasta
Temperatura
()
Rampa de
Temperatura
Nmero 2
(/min)
Hasta
Temperatura
Final
()
Tiempo de
Espera
(Hold
Time)
a la
Temperatura
Final
(min)
90
30
170
240

Relacin de particin del flujo: 200:1. [NOTASi fuera necesario, ajustar la relacin de particin y/o la dilucin de la
muestra para obtener un factor de asimetra de 0,81,5 para los picos de los steres metlicos de cidos grasos en la Solucin de
Aptitud del Sistema 1, los picos de ster metlico o ster etlico del cido eicosapentaenoico y cido docosahexaenoico en la
Solucin de Prueba 1 y Solucin de Prueba 4, observando al mismo tiempo que para la Solucin de Prueba 1 o Solucin de Prueba
4 los picos debidos a los steres correspondientes de C18:3 n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3 y C22:5 n-3 son claramente
detectables. Si se utiliza la modalidad de inyeccin no dividida, las soluciones deben diluirse adicionalmente 1 en 200 con
Solucin Antioxidante.]
Captulos
Solucin Estndar 1aTransferir 60 mg de ER ster Etlico del cido Docosahexaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con Solucin de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
Solucin Estndar 1bTransferir 90 mg de ER ster Etlico del cido Eicosapentaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con Solucin de Estandar Interno a volumen. Puede aplicarse calor suave (hasta
un mximo de 60) para obtener una solucin transparente.
La Solucin Estndar 1a y la Solucin Estndar 1b estn listas para el anlisis de steres etlicos. Para el anlisis de triglicridos,
continuar con la Solucin Estndar 2a y la Solucin Estndar 2b.
Solucin Estndar 2aTransferir 2,0 mL de Solucin Estndar 1a a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrgeno. Despus, proceder segn se indica en Solucin de Prueba 1, comenzando donde dice, Agregar 1,5
mL.
Solucin Estndar 2bTransferir 2,0 mL de Solucin Estndar 1b a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrgeno. Despus, proceder segn se indica en Solucin de Prueba 1, comenzando donde dice, Agregar 1,5
mL.
Solucin de Aptitud del Sistema 1Transferir 0,300 g de palmitato de metilo, 0,300 g de estearato de metilo, 0,300 g de
araquidato de metilo y 0,300 g de behenato de metilo, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 10 mL, disolver y
diluir con Solucin Antioxidante a volumen.
Solucin de Aptitud del Sistema 2[NOTAEsta solucin debe prepararse slo para triglicridos y slo si el ster metlico
del cido tetracos-15-enoico no se observa claramente en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 2.] Transferir
55,0 mg de ster metlico del cido docosahexaenoico y aproximadamente 5,0 mg de ster metlico del cido tetracos-15enoico (cido nervnico), pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con Solucin Antioxidante
a volumen.
Modo: Cromatografa de gases
Columna: Capilar de slice fundida, de 0,25 mm 25 m; ligada con una pelcula de fase G16 de 0,20 mm
Temperaturas
Inyector
Inyeccin dividida: 250
Inyeccin no dividida: 90250
Detector: 270
Columna: Ver la Tabla 7a o la Tabla 7b.
USP 38
Aptitud del sistema (para triglicridos)
Muestras: Solucin de Aptitud del Sistema 1 y Solucin de Prueba 2 o Solucin de Aptitud del Sistema 2 (si es aplicable)
Aptitud del sistema (para steres etlicos)
Muestra: Solucin de Aptitud del Sistema 1
Requisitos de aptitud del sistema
Porcentajes de rea tericos (Solucin de Aptitud del Sistema 1): Los porcentajes de las reas, despus de ajustar por el peso
real, de los picos de palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, deben estar cada
uno dentro de 1,0% (absoluto) de los valores tericos provistos en la Tabla 8.
Tabla 8
Captulos
ster Metlico del

cido Graso
rea Terica (%) en una Solucin de Pesos Iguales de Palmitato de

Metilo, Estearato de Metilo, Araquidato de Metilo y Behenato de Metilo
Palmitato de metilo
24,37
Estearato de metilo
24,84
Araquidato de metilo
25,23
Behenato de metilo
25,56
[NOTAEl rea terica (%) en una solucin de pesos iguales (Tabla 8) se deriva de los factores de respuesta terica calculados,
que son 1,049; 1,029; 1,013 y 1,000 para palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo, respectivamente.]
Resolucin: Para triglicridos (Solucin de Prueba 2 o Solucin de Aptitud del Sistema 2): No menos de 1,2 entre los picos de
ster metlico del cido docosahexaenoico y ster metlico del cido tetracos-15-enoico
Analisis (para triglicridos)
Muestras: Solucin Estndar 2a, Solucin Estndar 2b, Solucin de Prueba 1 y Solucin de Prueba 2
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatogrfico de la Solucin de
Prueba 2 con el de la Solucin de Prueba 1 e identificar el pico del estndar interno presente en la Solucin de Prueba 2. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de triglicridos tomada:
Resultado = (RU/RS) (WS/WU) F 100
RU = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 2, calculado:
Resultado = 1/[(rU2/rT2) (rU1/rT1)]
[NOTASi rU1 = 0 debido a que no se observan picos en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de
Prueba 1, entonces RU = rT2/rU2.]
rU2 = respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 2
rT2 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solucin de Prueba 2
rU1 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 1
RS = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de
la Solucin Estndar 2a o la Solucin Estndar 2b
WS = peso del DHA tomado para preparar la Solucin Estndar 1a o peso del EPA tomado para preparar la Solucin Estndar 1b (mg)
WU = peso de la muestra tomada para preparar la Solucin de Prueba 2 (mg)
F = factor para expresar el contenido de DHA como cidos grasos libres, 0,921; y factor para expresar el contenido de EPA
como cidos grasos libres, 0,915
Anlisis (para steres etlicos)
Muestras: Solucin Estndar 1a, Solucin Estndar 1b, Solucin de Prueba 3 y Solucin de Prueba 4
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatogrfico de la Solucin de
Prueba 3 con el de la Solucin de Prueba 4 e identificar el pico del estndar interno presente en la Solucin de Prueba 3. Calcular
el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de steres etlicos tomada:
Resultado = (RU/RS) (WS/WU) 100
RU = cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 3, calculada segn se indica a continuacin:
Resultado = 1/[(rU3/rT3) (rU4/rT4)]
[NOTASi rU4 = 0 debido a que no se observan picos en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de
Prueba 4, entonces RU = rT3/rU3.]
USP 38
rU3 = respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 3
rU4 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin de Prueba 4
RS = cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estndar interno en el cromatograma de
la Solucin Estndar 1a o Solucin Estndar 1b
WS = peso del DHA tomado para preparar la Solucin Estndar 1a o peso del EPA tomado para preparar la Solucin Estndar 1b (mg)
WU = peso de la muestra tomada para preparar la Solucin de Prueba 3 (mg)
Contenido de cidos Omega-3 Totales (para triglicridos)

Calcular el porcentaje de los cidos omega-3 totales en la porcin de muestra de triglicridos tomada:
Resultado = EPA + DHA + [(An 3 (EPA + DHA)/(AEPA + ADHA)]
EPA = contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
DHA = contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An 3 = suma de las reas de los picos correspondientes a los steres metlicos C18:3 n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3
y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1
AEPA = rea del pico correspondiente al ster metlico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1
ADHA = rea del pico correspondiente al ster metlico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 1
Calcular el porcentaje de los cidos omega-3 totales en la porcin de muestra de steres etlicos tomada:
Resultado = EPA + DHA + [(An 3 (EPA + DHA)/(AEPA + ADHA)]
EPA = contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
DHA = contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An 3 = suma de las reas de los picos correspondientes a los steres etlicos C18:3 n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3 y
C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4
AEPA = rea del pico correspondiente al ster etlico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4
ADHA = rea del pico correspondiente al ster etlico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solucin de Prueba 4
AGUA Y SEDIMENTOS EN ACEITES FIJOS

AparatoLa centrfuga preferida tiene un dimetro de giro (d = distancia entre los extremos de los tubos cuando stos
estn girando) de 3843 cm y opera a una velocidad aproximada de 1500 rpm. Si se emplea una centrfuga de dimensiones
diferentes, calcular la velocidad deseada de las revoluciones:
Los tubos de la centrfuga tienen forma de pera y se les puede colocar tapones. La capacidad total de cada tubo es de aproximadamente 125 mL. Las graduaciones son claras y diferenciadas, y se leen hacia arriba desde el fondo del tubo, segn la
escala mostrada en la Tabla 9.
Tabla 9
Volumen
(mL)
Divisin de la Escala
(mL)
03
0,1
35
0,5
510
1,0
1025
5,0
2550
25,0
50100
50,0
ProcedimientoColocar 50,0 mL de benceno en cada uno de dos tubos de centrfuga y agregar a cada tubo 50,0 mL de
aceite, entibiado, si fuera necesario, para reincorporar la estearina separada y mezclar minuciosamente a 25. Tapar con firmeza los tubos y agitarlos enrgicamente hasta que el contenido se mezcle minuciosamente y sumergir los tubos en un bao de
agua a 50 durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimento en el fondo de cada tubo. Centrifugar repetidamente en perodos de 10 minutos hasta que el volumen combinado de agua y sedimen-
Captulos
Contenido de cidos Omega-3 Totales (para steres etlicos)
USP 38
to permanezca constante en 3 lecturas consecutivas. La suma de los volmenes de agua y sedimento combinados en los dos
tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.
NDICE DE ANISIDINA
El ndice de Anisidina se define como 100 veces la densidad ptica medida en una celda de 1 cm de una solucin que contiene 1 g de la sustancia a examinar en 100 mL de una mezcla de disolventes y reactivos, segn el mtodo que se describe a
continuacin. [NOTARealizar las operaciones lo ms rpidamente posible, evitando la exposicin a la luz actnica.]
Solucin de Prueba ADisolver 0,500 g de la sustancia a examinar en isooctano y diluir con el mismo disolvente hasta
25,0 mL.
Solucin de Prueba BAgregar 1,0 mL de una solucin de 2,5 g/L de p-anisidina en cido actico glacial a 5,0 mL de la
Solucin de Prueba A, agitar y almacenar protegida de la luz.
Solucin EstndarAgregar 1,0 mL de una solucin de 2,5 g/L de p-anisidina en cido actico glacial a 5,0 mL de isooctano, agitar y almacenar protegida de la luz.
ProcedimientoMedir la absorbancia de la Solucin de Prueba A a 350 nm usando isooctano como blanco. Medir la absorbancia de la Solucin de Prueba B a 350 nm, exactamente 10 minutos despus de su preparacin, usando la Solucin Estndar
como el lquido de compensacin. Calcular el ndice de Anisidina a partir de la expresin:
Captulos
Resultado = [25 (1,2AS AB)]/m

AS = absorbancia de la Solucin de Prueba B a 350 nm
AB = absorbancia de la Solucin de Prueba A a 350 nm
m = peso de la sustancia a analizar en la Solucin de Prueba A (g)
NDICE DE OXIDACIN TOTAL (TOTOX)

El ndice de Oxidacin Total se define:
Resultado = 2PV + AV
PV = ndice de Perxido
AV = ndice de Anisidina
TRAZAS DE METALES
Aparato
El aparato generalmente consiste en lo siguiente:
Matraces de DigestinUsar un matraz de politetrafluoroetileno con un volumen de aproximadamente 120 mL, equipado con un tapn impermeable, una vlvula para ajustar la presin en el interior del recipiente y un tubo de politetrafluoroetileno para permitir la liberacin de gas.
SistemaCerrar los matraces de forma impermeable usando la misma fuerza de torsin para cada uno de ellos.
Horno de MicroondasTiene una frecuencia de magnetrn de 2450 MHz, con una potencia de salida seleccionable de 0 a
630 70 vatios en incrementos de 1%, una computadora digital programable, una cmara de microondas recubierta con politetrafluoroetileno con un ventilador para extraccin con velocidad variable, un sistema de transmisin con plato giratorio y
tubos de escape para permitir la salida de humos.
Espectrmetro de Absorcin AtmicaEquipado con una lmpara de ctodo hueco como fuente de radiacin y una lmpara de deuterio como corrector de fondo. El sistema se equipa con lo siguiente:
1. Un horno de grafito como el dispositivo de atomizacin para cadmio, cobre, hierro, plomo, nquel y cinc.
2. Un sistema automatizado de generacin de vapores de hidruros de flujo continuo para arsnico y mercurio.
Procedimiento General
PrecaucinCuando se usan vasos de digestin de alta presin cerrados y equipo de laboratorio de microondas, se deben seguir
las precauciones e intrucciones de operacin y seguridad suministradas por el fabricante.
[NOTASi se utiliza un aparato alternativo, es posible que se requiera ajustarle los parmetros.]
LimpiezaLimpiar todo el material de vidrio y el equipo de laboratorio con una solucin de 10 mg/mL de cido ntrico
antes de usarlo.
cido Ntrico Libre de Trazas de MetalEl cido ntrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos para arsnico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), hierro (Fe), mercurio (Hg), plomo (Pb), nquel (Ni) y cinc (Zn) son iguales a 0,005; 0,005;
0,001; 0,02; 0,002; 0,001; 0,005 y 0,01 ppm, respectivamente.
USP 38
Pruebas Especficas
CADMIO (CD), COBRE (CU), HIERRO (FE), PLOMO (PB), NQUEL (NI) Y CINC (ZN)
Solucin Madre del EstndarPreparar una solucin con concentraciones conocidas de 5 mg/mL de cada elemento de
prueba.
Soluciones EstndarEn tres matraces volumtricos idnticos de 10 mL, introducir 10, 20 y 40 mL, respectivamente, de
Solucin Madre del Estndar. Agregar a cada matraz 5,0 mL de la Solucin de Prueba 1, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solucin de Prueba 2En un matraz volumtrico de 10 mL, agregar 5,0 mL de la Solucin de Prueba 1, diluir con agua a
volumen y mezclar.
Solucin Blanco 2En un matraz volumtrico de 10 mL, agregar 5,0 mL de Solucin Blanco 1, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Captulos
cido Clorhdrico Libre de Trazas de MetalEl cido clorhdrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos
para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,003; 0,003; 0,05; 0,005; 0,001; 0,004 y 0,005 ppm, respectivamente.
cido Sulfrico Libre de Trazas de MetalEl cido sulfrico cumple con los requisitos cuando los valores mximos para
As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,002; 0,001; 0,05; 0,005; 0,001; 0,002 y 0,005 ppm, respectivamente.
Solucin Madre de PruebaColocar en un matraz de digestin aproximadamente 0,5 g de aceite graso, pesados con
exactitud, segn se indica en cada monografa individual. Agregar 6 mL de cido Ntrico Libre de Trazas de Metal y 4 mL de
cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal. Cerrar el matraz.
Solucin Madre del BlancoMezclar 6 mL de cido Ntrico Libre de Trazas de Metal y 4 mL de cido Clorhdrico Libre de
Trazas de Metal en un matraz de digestin.
Solucin de Prueba 1Colocar el matraz de digestin que contiene la Solucin Madre de Prueba en el horno de microondas. Llevar a cabo la digestin en tres etapas, segn el siguiente programa: 80% de potencia durante 15 minutos, 100% de
potencia durante 5 minutos y 80% de potencia durante 20 minutos.
Al final del ciclo, dejar que el matraz se enfre. Agregar 4 mL de cido Sulfrico Libre de Trazas de Metal al matraz. Repetir el
programa de digestin. Despus de completar la digestin, dejar que el matraz se enfre a temperatura ambiente. Abrir el matraz de digestin y transferir la solucin transparente e incolora obtenida a un matraz volumtrico de 50 mL. Enjuagar el matraz de digestin dos veces, cada una con 15 mL de agua, y recoger los enjuagues en el matraz volumtrico. Agregar 1,0 mL
de una solucin de 10 mg/mL de nitrato de magnesio y 1,0 mL de una solucin de 100 mg/mL de fosfato dicido de amonio
al matraz volumtrico. Diluir con agua a volumen y mezclar. La solucin resultante es la Solucin de Prueba 1.
Solucin Blanco 1Colocar el matraz de digestin que contiene la Solucin Madre del Blanco en el horno de microondas.
Proceder segn se indica en Solucin de Prueba 1, comenzando donde dice Llevar a cabo la digestin en tres etapas, segn el
siguiente programa.
Calibracin Directa [NOTALas concentraciones de las soluciones estndar dependern de los contenidos de metal de la
sustancia de prueba.] Para mediciones de rutina, se preparan y examinan tres soluciones estndar, la Solucin Blanco 1 y la
Solucin de Prueba 1.
Emplear la Solucin de Prueba 1 y la Solucin Blanco 1 preparadas segn se indica anteriormente o segn se indica en la monografa. Preparar no menos de 3 soluciones estndar que contengan todos los metales a analizar. El valor de absorbancia esperado en la Solucin de Prueba 1 para cada metal deber estar comprendido dentro del intervalo de absorbancia calibrado
correspondiente, de preferencia en la parte media de dicho intervalo. Cualquier reactivo usado en la preparacin de la Solucin
de Prueba 1 se agrega en la misma concentracin en las soluciones estndar.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento usando el mismo nmero de repeticiones para cada una de las soluciones para obtener una lectura estable.
Preparar una curva de calibracin a partir de la media de las lecturas obtenidas con las soluciones estndar, graficando las
medias en funcin de la concentracin. Determinar la concentracin del elemento en la Solucin de Prueba 1 a partir de la
curva obtenida.
Estndar AgregadoAgregar volmenes iguales de la Solucin de Prueba 1, preparada segn se indica anteriormente o segn se indica en la monografa, a por lo menos cuatro matraces volumtricos idnticos. Agregar a todos los matraces menos a
uno volmenes progresivamente mayores de una solucin estndar que contenga una concentracin conocida del elemento
de prueba para obtener una serie de soluciones con concentraciones crecientes de manera estable del elemento que se sabe
produce respuestas en la parte lineal de la curva. Diluir el contenido de cada matraz con el disolvente especificado en la monografa a volumen y mezclar. Etiquetar el matraz sin el estndar adicionado como la solucin de prueba.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento, usando el mismo nmero de repeticiones para cada una de las soluciones, para obtener una lectura estable.
Graficar las absorbancias de las soluciones estndar y de la solucin de prueba en funcin de la cantidad agregada del elemento de prueba. [NOTALa solucin de prueba debe graficarse como si tuviera un contenido del elemento de prueba agregado equivalente a 0 mg o mg]. Extrapolar la lnea uniendo los puntos en la grfica hasta que se encuentre con el eje de concentracin. La distancia entre este punto y la interseccin de los ejes representa la concentracin del elemento de prueba en la
solucin de prueba.
USP 38
ProcedimientoMedir el contenido de Cd, Cu, Fe, Pb, Ni y Zn usando un espectrofotmetro de absorcin atmica equipado con un horno de grafito adecuado. Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solucin Blanco 2, las Soluciones Estndar y Solucin de Prueba 2 por lo menos tres veces cada una. El valor de absorbancia de la Solucin Blanco 2 se resta
del valor obtenido usando las Soluciones Estndar y la Solucin de Prueba 2. Proceder segn se indica en el mtodo de Estndar
Agregado en el Procedimiento General anterior. La Tabla 10 indica los parmetros instrumentales que pueden usarse.
Tabla 10
Longitud de onda (nm)
Ranura (nm)
Corriente de la lmpara (mA)
Temperatura de incineracin ()
Temperatura de atomizacin ()
Corrector de fondo
Flujo de nitrgeno (L/min)
Cd
Cu
Fe
Pb
Ni
Zn
228,8
324,8
248,3
283,5
232
213,9
0,5
0,5
0,2
0,5
0,2
0,5
10
800
800
800
800
800
800
1800
2300
2300
2200
2500
2000
Encendido
Apagado
Apagado
Apagado
Apagado
Apagado
Captulos
ARSNICO Y MERCURIO
Medir el contenido de arsnico y mercurio contra sus soluciones estndar de arsnico o mercurio a una concentracin conocida empleando el mtodo de Calibracin Directa de la seccin Procedimiento General anterior, con un sistema automatizado de
generacin de vapores de hidruros de flujo continuo.
Para el lmite de especificacin de 1 ppm para arsnico y el lmite de especificacin de 1 ppm para mercurio, preparar tres
soluciones de calibracin de trabajo con concentraciones conocidas de aproximadamente 5, 10 y 20 ng/mL, respectivamente,
para cada elemento de prueba.
El valor de absorbancia de la solucin blanco se resta automticamente del valor obtenido usando la solucin de prueba.
Arsnico
Solucin Blanco 3Agregar 1,0 mL de una solucin de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solucin Blanco 1
preparada segn se indica anteriormente. Dejar esta solucin en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente
50 minutos o a 70 durante aproximadamente 4 minutos.
Solucin de Prueba 3Agregar 1,0 mL de una solucin de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solucin de
Prueba 1 preparada segn se indica anteriormente. Dejar esta solucin en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 50 minutos o a 70 durante aproximadamente 4 minutos.
Reactivo cido 1: cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 1: Una solucin de 6 mg/mL de tetrahidroborato de sodio en una solucin de 5 mg/mL de hidrxido de
sodio
Se pueden utilizar los parmetros instrumentales de la Tabla 11.
Mercurio
Solucin Blanco 4Proceder segn se indica en Solucin Blanco 3.
Solucin de Prueba 4Proceder segn se indica en Solucin de Prueba 3.
Reactivo cido 2: Una solucin de 515 mg/mL de cido Clorhdrico Libre de Trazas de Metal
Reactivo Reductor 2: Una solucin de 10 mg/mL de cloruro estannoso en una solucin de 200 mg/mL de cido Clorhdrico
Libre de Trazas de Metal
Se pueden utilizar los parmetros instrumentales de la Tabla 11.
Tabla 11
As
Hg
Longitud de onda (nm)
193,7
253,7
0,5
Ancho de ranura (nm)
0,2
Corriente de la lmpara (mA)
10
Velocidad de flujo del reactivo cido (mL/min)
1,0
1,0
Velocidad de flujo del reactivo reductor (mL/min)
1,0
1,0
Velocidad de flujo para las soluciones blanco, estndar y de prueba (mL/min)
7,0
7,0
Celda de absorcin
Cuarzo (calentado)
Cuarzo (sin calentar)
Corrector de fondo
Apagado
Apagado
0,1
0,1
Velocidad de flujo de nitrgeno (L/min)
USP 38
COMPOSICIN DE ESTEROLES
Separacin de la Fraccin de Esteroles
1
2
Se puede obtener una placa para TLC de grado comercial en Sigma-Aldrich, N de catlogo z122785.
Se puede obtener un producto comercial en Kimble/Kontes como un filtro buchner con disco sinterizado, Kimax 28400-152.
Captulos
Solucin de Referencia ADisolver una cantidad de colesterol, pesada con exactitud, en cloroformo para obtener una solucin al 5% (p/v).
Fase Mvil: Una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y ter (65:35)
Solucin de Prueba APesar con exactitud 5 g de la sustancia de prueba en un matraz de 250 mL. Agregar 50 mL de
hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio alcohlico 2 N) y calentar hasta ebullicin suave, agitando vigorosamente y de manera continua, hasta que ocurra la saponificacin (la solucin se torna transparente). Continuar calentando
durante 20 minutos adicionales y agregar 50 mL de agua desde la parte superior del condensador. Enfriar el matraz hasta
aproximadamente 30. Transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 500 mL con varios enjuagues de
agua, hasta un volumen total de aproximadamente 50 mL. Agregar aproximadamente 80 mL de ter, agitar vigorosamente
durante aproximadamente 30 segundos y dejar que sedimente. [NOTACualquier emulsin puede destruirse mediante el rociado de pequeas cantidades de alcohol etlico o alcohol metlico.] Separar la fase acuosa inferior y recogerla en un segundo
embudo de separacin. Realizar de la misma forma dos extracciones adicionales en la fase de aguaalcohol, usando 6070 mL
de ter en cada ocasin. Combinar los extractos etreos en un solo embudo de separacin y realizar lavados con agua, de 50
mL cada uno, hasta que el agua de lavado no presente reaccin alcalina frente a la fenolftalena. Secar la fase etrea con sulfato de sodio anhidro y filtrar a travs de sulfato de sodio anhidro recolectando en un matraz de 250 mL previamente pesado,
lavando el embudo y filtrando con pequeas cantidades de ter. Destilar el ter hasta que el contenido del matraz se reduzca a
unos pocos mL y llevar a sequedad aplicando un ligero vaco o una corriente de nitrgeno. Completar el secado a 100 durante aproximadamente 15 minutos, luego pesar despus de enfriar en un desecador. Disolver la materia insaponificable as obtenida en cloroformo para obtener una solucin con una concentracin de aproximadamente 5%.
Solucin de Prueba BTratar 5 g de aceite de canola de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solucin de Prueba A, comenzando donde dice Agregar 50 mL de hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio
alcohlico 2 N).
Solucin de Prueba CTratar 5 g de aceite de girasol de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solucin de Prueba A, comenzando donde dice Agregar 50 mL de hidrxido de potasio alcohlico SR 2 (hidrxido de potasio
alcohlico 2 N).
ProcedimientoSumergir por completo en hidrxido de potasio alcohlico 0,2 N durante 10 segundos una placa de gel
de slice para cromatografa en capa delgada (ver Cromatografa 621), de 20 cm 20 cm con un espesor de capa de 200 mm
y un tamao de partcula de 517 mm1 sobre polister, luego dejar que se seque en una campana de extraccin durante 2
horas y finalmente colocar a 100 durante 1 hora. [NOTARetirar del dispositivo de calentamiento validado y mantener la placa en un desecador hasta que se requiera su uso. Las placas deben usarse dentro de los 15 das. Tambin se encuentran disponibles comercialmente placas para cromatografa en capa delgada que no requieren de preacondicionamiento]. Usar una placa
individual para cada solucin de prueba.
Colocar en la cmara una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y ter (65:35) hasta una profundidad
de aproximadamente 1 cm. Cerrar la cmara con la cubierta apropiada y dejar en reposo durante al menos 30 minutos. Se
pueden colocar tiras de papel de filtro sumergidas en el eluyente sobre las superficies internas de la cmara. [NOTALa fase
mvil debera reemplazarse para cada prueba para asegurar condiciones de elucin reproducibles.] Aplicar 0,3 mL de Solucin
de Prueba A aproximadamente a 2 cm a partir del borde inferior formando una franja que sea lo ms delgada y uniforme posible. Colocar 23 mL de Solucin de Referencia A en un extremo de la placa, alineados con la franja. Desarrollar los cromatogramas en una cmara equilibrada con la Fase Mvil hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente 1 cm
desde el borde superior de la placa. Retirar la placa de la cmara de desarrollo y evaporar la fase mvil empleando una corriente de aire caliente [NOTAEvitar el calor excesivo.] o dejando la placa bajo una campana durante un periodo corto. Rociar la
placa con una solucion alcohlica de 2,7-diclorofluorescena al 0,2% y examinar bajo luz UV a 254 nm. [NOTATambin se
encuentran disponibles comercialmente placas previamente tratadas con indicador de UV y se usan en forma equivalente]. En
cada una de las placas, marcar los lmites de la banda de esteroles, identificada mediante su alineacin con la mancha obtenida a partir de la Solucin de Referencia A a lo largo de los bordes de la fluorescencia e incluir adems el rea de las zonas que se
encuentran a 23 mm por encima y por debajo de las zonas visibles que corresponden a la Solucin de Referencia A. Retirar el
gel de slice de las reas marcadas y colocarlo en un embudo de filtracin provisto de un septo poroso G3.2 Agregar 10 mL de
cloroformo caliente, mezclar cuidadosamente con la esptula de metal, filtrar empleando vaco y recoger el filtrado en el matraz Erlenmeyer acoplado al embudo de filtracin. Lavar el residuo en el embudo tres veces con ter, aproximadamente 10 mL
cada vez, y recoger el filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta un volumen de 45 mL,
transferir la solucin residual a un tubo de ensayo de 10 mL, previamente pesado, con fondo cnico y tapn de cierre hermtico, y evaporar hasta sequedad mediante calentamiento moderado en una corriente suave de nitrgeno. Disolver el residuo en
unas pocas gotas de acetona y evaporar de nuevo hasta sequedad. Colocar a 105 durante aproximadamente 10 minutos,
dejar que se enfre en un desecador y pesar.
USP 38
Tratar la Solucin de Prueba B y la Solucin de Prueba C de la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba A.
Captulos
Determinacin de Esteroles
Solucin de Prueba DAgregar al tubo de ensayo que contiene la fraccin de esteroles separada de la sustancia de prueba
mediante cromatografia en capa delgada, una mezcla preparada recientemente de piridina anhidra, hexametildisilazano y clorotrimetilsilano (9:3:1) [NOTAEste reactivo tambin se encuentra comercialmente disponible y se utiliza de manera equivalente.], en una relacin de 50 mL por cada mg de esteroles, evitando cualquier absorcin de humedad. Tapar el tubo de ensayo y
agitar cuidadosamente hasta disolver completamente los esteroles. Dejar en reposo durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante unos pocos minutos si fuera necesario. Usar el sobrenadante. [NOTAEs normal que se produzca una leve opalescencia y no causa anomala. Sin embargo, la formacin de un flculo blanco o la aparicin de un color
rosado indica la presencia de humedad o el deterioro del reactivo. Si algo de esto ocurre, se debe repetir la prueba].
Solucin de Referencia EAgregar a 9 partes de los esteroles separados del aceite de canola mediante cromatografa en
capa delgada, 1 parte de colesterol. Tratar la mezcla de la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba D.
Solucin de Referencia FTratar los esteroles separados del aceite de girasol mediante cromatografia en capa delgada de
la misma forma que se indica para la Solucin de Prueba D.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la
llama y una columna capilar de vidrio o de slice fundida de 2030 m de largo, con un dimetro interno de 0,250,32 mm,
totalmente recubierta con una capa de fase estacionaria G27 o G36 de 0,10 a 0,30 mm. Mantener la temperatura del inyector
a 280, la temperatura del detector a 290 y la temperatura de la columna a 260 5. El gas transportador es helio con una
velocidad lineal de 2035 cm/s o hidrgeno con una velocidad lineal de 3050 cm/s. Se usa una relacin de particin de 1:50
a 1:100. Inyectar en el cromatgrafo Solucin de Referencia E y Solucin de Referencia F y registrar el cromatograma segn se
indica en Procedimiento: el tiempo de retencin debera ser de 20 5 minutos para b -sitosterol y todos los esteroles presentes
deben estar separados. El cromatograma obtenido con la Solucin de Referencia E presenta cuatro picos principales correspondientes a colesterol, brasicasterol, campesterol y b -sitosterol; y el cromatograma obtenido con la Solucin de Referencia F presenta cuatro picos principales correspondientes a campesterol, estigmasterol, b -sitosterol y D7-estigmastenol. Los tiempos de
retencin de los esteroles con referencia a b -sitosterol se indican en la Tabla 12.
Tabla 12. Tiempos de Retencin Relativos de Esteroles
para Dos Columnas Diferentes
Identificacin
Columna G36
Columna G27
Colesterol
0,67
0,63
Brasicasterol
0,73
0,71
24-Metileno-colesterol
0,82
0,80
Campesterol
0,83
0,81
Campestanol
0,85
0,82
Estigmasterol
0,88
0,87
D7-Campesterol
0,93
0,92
D5,23-Estigmastadienol
0,95
0,95
Clerosterol
0,96
0,96
b -Sitosterol
1,00
1,00
Sitostanol
1,02
1,02
D5-Avenasterol
1,03
1,03
D5,24-Estigmastadienol
1,08
1,08
D7-Estigmastenol
1,12
1,12
D7-Avenasterol
1,16
1,16
ProcedimientoInyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 1 mL) de Solucin de Prueba D, Solucin de Referencia E y Solucin de Referencia F, registrar los cromatogramas y medir las reas de los picos de esteroles.
Calcular el porcentaje de cada esterol individual en la fraccin de esteroles de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = 100 (A/S)
A = rea del pico debido al componente de esteroles a determinar
S = suma de las reas de los picos debidos a los componentes indicados en la Tabla 12
USP 38
Pruebas Qumicas / 413 Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales 313
411 VALORACIN DE CIDO FLICO
50C(RU/RS)
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de ER cido Flico USP en la Preparacin Estndar; y RU y RS son los cocientes
entre las respuestas de los picos de cido flico y de metilparabeno obtenidos a partir de la Preparacin de Valoracin y de la
Preparacin Estndar, respectivamente.
413 ANLISIS DE IMPUREZAS EN GASES MEDICINALES

INTRODUCCIN
El presente captulo de prueba general define los medios seguros y apropiados para el muestreo de envases de gases a alta
presin conteniendo distintas composiciones de gases medicinales usando tubos detectores de acuerdo con las monografas
USP, y utilizando el volumen total de gas recomendado por el fabricante del tubo detector. Ver Reactivos en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones para informacin sobre cada tubo detector referido.
En la actualidad se fabrican dos tipos de tubos detectores: aquellos que se utilizan con una bomba manual de volumen fijo
(p.ej., 100 mL/bombeo) y aquellos que se usan en un sistema de flujo continuo que se puede ajustar para pasar un volumen
de gas a travs del tubo detector a aproximadamente 1 atmsfera. Es importante usar un tipo de tubo detector que corresponda con el modo de intercambio de volumen de gas.
Para asegurar el paso del volumen de gas requerido a travs del tubo detector, medir el volumen de gas al momento del
anlisis usando una bomba manual o un caudalmetro calibrado para el gas que se analiza o corregido mediante un grfico de
calibracin. Los fabricantes de caudalmetros por lo general proveen grficos de volumen de flujo para gases comunes con cada uno de los tubos identificados en este captulo general. [NOTAVer el captulo general Valoracin de Gases Medicinales
415 para el muestreo.]
Captulos
El siguiente procedimiento se utiliza para la estimacin de cido flico como ingrediente de preparaciones farmacopeicas
que contienen otros elementos activos constituyentes.
Estndares de Referencia USP11ER cido Flico USP.
Fase MvilColocar 2,0 g de fosfato monobsico de potasio en un matraz volumtrico de 1 litro y disolver en aproximadamente 650 mL de agua. Agregar 12,0 mL de una solucin 1 en 4 de hidrxido de tetrabutilamonio en metanol, 7,0 mL de
cido fosfrico 3 N y 240 mL de metanol. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con cido fosfrico 3 N o hidrxido de amonio 6 N a un pH de 7,0, diluir a volumen con agua y mezclar. Filtrar a travs de un filtro de 0,45 mm y controlar nuevamente el
pH antes de usar. [NOTALa relacin entre el metanol y el agua puede variarse hasta 3% y el pH puede incrementarse hasta
7,15 para lograr una mejor separacin.]
Disolvente de DilucinPreparar segn se indica en Fase Mvil. Ajustar a pH 7,0 y burbujear nitrgeno a travs de la solucin durante 30 minutos antes de usar.
Solucin de Estndar InternoDisolver aproximadamente 25 mg de metilparabeno en 2,0 mL de metanol, diluir con
Disolvente de Dilucin a 50 mL y mezclar.
Solucin Estndar de cido FlicoTransferir aproximadamente 12 mg de ER cido Flico USP, pesados con exactitud, a
un matraz volumtrico de 50 mL con proteccin actnica; disolver en 2 mL de hidrxido de amonio, diluir a volumen con
Disolvente de Dilucin y mezclar.
Preparacin EstndarTransferir 2,0 mL de Solucin Estndar de cido Flico a un matraz volumtrico de 25 mL con proteccin actnica; agregar 2,0 mL de Solucin de Estndar Interno; agregar Disolvente de Dilucin a volumen y mezclar.
Preparacin de ValoracinTransferir una porcin pesada o medida con exactitud de la preparacin que se va a analizar
que contenga aproximadamente 1 mg de cido flico a un matraz volumtrico de 50 mL con proteccin actnica; agregar 4,0
mL de Solucin de Estndar Interno; agregar Disolvente de Dilucin a volumen y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 280 nm y una
columna de 15 cm 3,9 mm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 mL por minuto. Inyectar en el cromatgrafo la Preparacin Estndar y registrar el cromatograma segn se indica en el Procedimiento: debe haber una
lnea base de separacin entre el cido flico y el metilparabeno.
Estndar y de la Preparacin de Valoracin; registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Los tiempos de retencin relativos son aproximadamente 0,8 para cido flico y 1,0 para metilparabeno. Calcular la cantidad, en mg,
de C19H19N7O6 en la porcin de la preparacin tomada, por la frmula:
314 413 Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales / Pruebas Qumicas
USP 38
Sistema de Flujo Continuo

Identificar el gas contenido en el envase y seleccionar el regulador de gas apropiado. Conectar el regulador al envase del
gas. No aplicar lubricante o cinta de Tefln a las conexiones entre el envase y el regulador. Purgar el regulador con el gas en
anlisis. Ajustar el nivel del flotador para obtener la velocidad de flujo adecuada a fin de lograr el volumen total de gas recomendado por el fabricante. Acoplar el tubo detector, luego ajustar la velocidad de flujo al nivel requerido, segn se indica en
los grficos que acompaan al caudalmetro y al tubo detector. Cronometrar para alcanzar el volumen total de gas requerido
10 segundos al flujo fijado. En el tiempo establecido, cerrar la vlvula del regulador y luego la vlvula principal del envase.
Observar el tubo mientras contine conectado para determinar el grado de cambio de color y registrar el resultado. Retirar el
tubo y desconectar el aparato, equilibrar la presin de gas en el regulador permitiendo que el gas se libere a la atmsfera y
desconectar el regulador del envase. Desechar el tubo despus de su uso.
Bomba Manual de Volumen Fijo
Captulos
El mtodo alternativo consiste en aplicar la bomba manual detectora de gases. El sistema extrae un volumen constante con
cada bombeo. Para asegurar la exactitud del volumen total de gas, el usuario debe seguir las recomendaciones de bombeo
sugeridas por el fabricante de la bomba.
415 VALORACIN DE GASES MEDICINALES

INTRODUCCIN
Las monografas de gases medicinales USP tienen como propsito evaluar la pureza de un gas usado para tratamiento mdico o como componente de un proceso farmacutico. En general, la pureza se evala mediante una valoracin del contenido
del artculo y mediante anlisis de trazas de impurezas. La aplicacin de cromatografa de gases, anlisis paramagntico y tubos detectores para gases medicinales vara con respecto a los procedimientos tradicionales usados para analitos en fase lquida y, por lo tanto, requiere de una descripcin separada. Este captulo de pruebas generales se centra en la valoracin para
pruebas de contenido. El muestreo de impurezas se trata en el captulo general Anlisis de Impurezas en Gases Medicinales
413.
Este captulo incluye los aspectos relacionados con el muestreo y la calificacin para el anlisis por cromatografa de gases y
anlisis paramagntico de gases medicinales. Asimismo, este captulo incluye una descripcin de la configuracin, validacin y
calibracin iniciales de estos instrumentos. Los procedimientos especficos de valoracin se definen en la monografa especfica
para cada gas.
Las definiciones bsicas sobre calificacin y validacin instrumental se incluyen en los captulos de informacin general Calificacin de Instrumentos Analticos 1058 y Validacin de Mtodos Farmacopeicos 1225, respectivamente, por lo que no se repiten en este captulo. No obstante, cuando debido a la naturaleza del analito se requieran variaciones de los materiales presentados en los captulos mencionados, tales variaciones sern definidas en este captulo.
MTODOS
Cromatografa de Gases (GC)
Ver Cromatografa 621.
Detectores para Valoracin de Gases Medicinales

Los dos detectores ms comunes usados en los anlisis de gases medicinales son el detector de conductividad trmica (TCD,
por sus siglas en ingls) y el detector de ionizacin a la llama (FID, por sus siglas en ingls).
El TCD detectar cualquier gas o vapor que tenga una conductividad trmica que difiera significativamente de la alta conductividad trmica del gas de referencia, por lo regular helio, y por lo tanto, es prcticamente universal. Sin embargo, el lmite
de deteccin ms bajo generalmente aceptado para el TCD es 50 ppm v/v. Esto representa una limitacin para la evaluacin
de trazas de impurezas en gases medicinales.
El FID tambin se usa para la evaluacin de trazas de impurezas en gases medicinales, debido a que es ms sensible a compuestos orgnicos pero no produce seales para los gases medicinales ms comunes.
USP 38
Pruebas Qumicas / 415 Valoracin de Gases Medicinales 315
CALIFICACIN
Medicin Paramagntica de Oxgeno

TeoraEl analizador paramagntico mide el desplazamiento de un gas diamagntico (nitrgeno) ocasionado por un gas
paramagntico (oxgeno), en un campo magntico fuerte. Una celda de medicin por lo general emplea dos esferas de vidrio
conectadas por un tubo rellenas de nitrgeno, que se suspenden sobre una cinta de torsin entre imanes que concentran el
flujo alrededor de las esferas de vidrio. Cuando las molculas de oxgeno ingresan a la celda de medicin, las esferas de vidrio
se mueven por la fuerza ejercida por las molculas de oxgeno, que son atradas a la parte ms fuerte del campo magntico.
Mediante el uso de sensores pticos, una bobina de retroalimentacin y aparatos electrnicos adecuados, los analistas miden
una respuesta que es directamente proporcional a la presin parcial de oxgeno.
El oxgeno es el nico gas paramagntico de la atmsfera que se encuentra por encima de los niveles de trazas. No obstante,
los analizadores paramagnticos se pueden ver afectados por la susceptibilidad magntica del gas acompaante. Por lo tanto,
se debe evitar hacer cambios a los gases acompaantes en las monografas USP.
Consideraciones del Diseo

Las consideraciones del diseo para la adquisicin de nuevos instrumentos pueden incluir los siguientes parmetros:
DerivaCambio de la respuesta del instrumento para una concentracin determinada durante un tiempo establecido en
condiciones constantes y sin ajustes del instrumento por medios externos. La deriva es la suma de dos componentes, deriva
del cero y deriva de medicin. La deriva determina la frecuencia con que se debe calibrar el instrumento.
Deriva del CeroCambio en la respuesta cuando se mide gas cero.
Deriva de MedicinCambio en la respuesta con respecto a la concentracin de oxgeno durante la medicin del gas.
Temperatura de OperacinEl intervalo de temperatura ambiente en el que continuar siendo vlida la especificacin de
desempeo declarada del instrumento. Un coeficiente de temperatura mayor indicar que se permite un cambio ms pequeo
en la temperatura ambiente antes de que se requiera la recalibracin.
Presin OperativaEl instrumento debe operar a las presiones de entrada de las muestras a analizar.
Aspectos de la Calificacin
Calificacin de la Instalacin (IQ)Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del analizador de oxgeno se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de
oxgeno.
Se debe tener en cuenta lo siguiente segn sea aplicable:
Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
Fugas (debe estar exento de fugas);
Captulos
Calificacin de la Instalacin (IQ, por sus siglas en ingls)Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del cromatgrafo de gases se instale de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del Cromatgrafo de Gases.
Se debe tener en cuenta lo siguiente segn sea aplicable:
Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
Fugas (debe estar exento de fugas);
Muestreo representativo;
Velocidad de flujo de la muestra;
Tiempo de respuesta;
Seales de encendido correcto;
Suministro de energa (incluyendo regulacin de voltaje); y
Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presin).
Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls)La OQ verifica que el desempeo del Cromatgrafo de Gases sea
el previsto dentro de su intervalo de operacin esperado. Para el anlisis de producto final del gas medicinal, el Cromatgrafo
de Gases se prueba para asegurar la repetibilidad (verificacin de que la desviacin estndar relativa se corresponde con lo
declarado) para cada analito de inters. Debido a la naturaleza especfica del anlisis de gases medicinales y al nmero limitado
de analitos, en lugar de la OQ inicial o peridica, se pueden usar la calibracin de rutina y la verificacin de calibracin peridica del Cromatgrafo de Gases, as como el procedimiento de anlisis. Cuando un instrumento se usa para un rango ms amplio de analitos, resulta inapropiado realizar la calibracin y la verificacin de calibracin peridica en lugar de la OQ.
Calificacin de Desempeo (PQ, por sus siglas en ingls) Para el anlisis de producto final de los gases medicinales, el
Cromatgrafo de Gases se verifica de manera peridica en intervalos apropiados durante los anlisis con un gas de calibracin
(es decir, verificando que los resultados se correspondan con una determinada concentracin en un intervalo de exactitud y
precisin aceptables despus de un nmero especfico de inyecciones de la muestra).
Captulos
316 415 Valoracin de Gases Medicinales / Pruebas Qumicas
USP 38
Muestreo representativo;
Velocidad de flujo de la muestra;
Tiempo de respuesta;
Seales de encendido correcto;
Suministro de energa (incluyendo regulacin de voltaje); y
Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presin).
Calificacin Operativa (OQ)Los requisitos de la OQ verifican que el desempeo del analizador paramagntico sea el previsto dentro de su intervalo de operacin esperado y que sea adecuado para las condiciones reales de uso. Los instrumentos y
aparatos se deben calibrar y usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Debido a la naturaleza especfica del instrumento, en lugar de la OQ inicial y peridica, se puede usar la calibracin de rutina.
Calificacin del Desempeo (PQ)Los requisitos de la PQ verifican que el desempeo del analizador paramagntico sea
el esperado en su ambiente normal operativo. Para el anlisis de producto final de los gases medicinales, el analizador paramagntico se calibra inicialmente [ajustando a cero y calibrando (spanning) mediante un estndar certificado] de acuerdo con
las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno y se recalibra peridicamente para asegurar un desempeo continuo
aceptable.
Ajuste a Cero del Instrumento (establecimiento del lmite inferior)Usando el estndar certificado definido en la monografa, ajustar a cero el analizador pasando el gas cero en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante
del analizador de oxgeno. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura estable en el instrumento. Conforme se requiera,
ajustar la configuracin de la posicin del cero a un valor de 0,0% de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Confirmar que la lectura sea estable. [NOTADependiendo del uso previsto del instrumento, una alternativa
aceptable a este procedimiento es cambiar la configuracin de la posicin del cero a un valor diferente de 0,0%, siempre que
proporcione una mayor precisin en la medicin.]
Calibracin (spanning) del Intervalo de UsoEstablecer el lmite superior (span) con un gas de calibracin (span gas)
definido en la monografa y apropiado para el intervalo de uso. Pasar el gas de calibracin a travs del instrumento a la velocidad de flujo sugerida por el fabricante. Confirmar que la lectura sea estable. Ajustar la configuracin de la calibracin al valor
certificado del estndar de referencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxgeno. Confirmar que
la lectura sea estable.
VALIDACIN
La validacin de este instrumento por lo general se completa durante el proceso (IQ/OQ). La verificacin de rutina se lleva a
cabo segn se describe en las secciones OQ/PQ de este captulo y, por lo tanto, no se requiere de informacin especfica sobre
la validacin del instrumento.
PROCEDIMIENTO
Para Instrumentos Fuera de LneaAntes del anlisis, ajustar el cero del instrumento y calibrar (span) segn se describe
en la seccin PQ. [NOTALa calibracin no debe correrse concomitantemente con las muestras de prueba.] Conectar el gas
muestra al instrumento y establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante
del analizador. Mantener el flujo hasta que se observe una lectura constante en el instrumento. La definicin de lectura constante se incluye en las instrucciones del fabricante del analizador o en la documentacin para calificacin del instrumento del
usuario.
Para Instrumentos en LneaLos intervalos de calibracin son definidos por el fabricante del analizador, por el historial o
por medios estadsticos. Establecer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante.
MUESTREO
Muestreo de Fase LquidaLos cilindros que contienen un tubo de inmersin permiten obtener una muestra lquida a partir de la salida de la vlvula con el cilindro en posicin vertical. Si no se cuenta con un tubo de inmersin, el cilindro debe
colocarse en posicin invertida con el cilindro y la vlvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase lquida
est en contacto con la vlvula).
El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido. Los reguladores deben purgarse
con el gas que se va a muestrear. Cuando sea necesario, se debe medir el flujo hacia el analizador usando un caudalmetro
calibrado.
Muestreo de Fase GaseosaLos cilindros que no cuentan con un tubo de inmersin permiten obtener una muestra gaseosa de la salida de la vlvula con el cilindro en posicin vertical. Si se cuenta con un tubo de inmersin, el cilindro debe
colocarse en posicin invertida con el cilindro y la vlvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase gaseosa
est en contacto con el tubo de inmersin). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador
requerido.
Pruebas Qumicas / 425 AntibiticosValoracin Yodomtrica 317
USP 38
ESTNDARES CERTIFICADOS PARA EL ANLISIS DE GASES MEDICINALES

Las monografas USP para gases medicinales requieren de pruebas que usan estndares certificados para la calibracin del
instrumento y determinaciones analticas. Tales anlisis farmacopeicos se pueden llevar a cabo usando materiales de referencia
rastreables al U.S. National Institute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa de EE.UU.,
[NIST]) u otras organizaciones de estndares nacionales, p.ej., el Institute for National Measurement Standards (Instituto Nacional de Estndares de Medicin, Canad). Las monografas individuales, as como la seccin de reactivos, indicadores y soluciones hacen referencia al porcentaje nominal de diversos estndares certificados requeridos para llevar a cabo los anlisis de
gases medicinales. Los requisitos para las concentraciones certificadas reales en trminos de varianza del valor nominal se indican en la seccin Reactivos, Indicadores y Soluciones para cada estndar certificado pertinente.
425 ANTIBITICOSVALORACIN YODOMTRICA
Disolventes y Concentraciones Finales

Antibitico
Disolvente*
Concentracin
Final
Amoxicilina
Agua
1,0 mg por mL
Ampicilina
Agua
1,25 mg por mL
Ampicilina Sdica
Solucin Amortiguadora N 1
1,25 mg por mL
Cloxacilina Sdica
Agua
1,25 mg por mL
Ciclacilina
Dicloxacilina Sdica
Agua
1,0 mg por mL
1,25 mg por mL
Meticilina Sdica
1,25 mg por mL
Nafcilina Sdica
1,25 mg por mL
Oxacilina Sdica
1,25 mg por mL
Penicilina G Potsica
2000 unidades por mL
Penicilina G Sdica
Penicilina V Potsica
Feneticilina Potsica
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la seccin Medios y
Diluyentes en AntibiticosValoraciones Microbiolgicas 81, excepto que no se requiere su esterilizacin antes de usarlas.
Preparacin de ValoracinA menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada, pesada con exactitud, de la
muestra en anlisis y diluir cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solucin con una concentracin final
conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2 mL de esta solucin y transferir a cada uno de dos matraces
Erlenmeyer de 125 mL con tapn de vidrio.
Procedimiento
Inactivacin y VolumetraAgregar 2,0 mL de hidrxido de sodio 1,0 N a 2,0 mL de la Preparacin Estndar y de la Preparacin de Valoracin, en sus respectivos matraces, mezclar por rotacin moderada y dejar en reposo durante 15 minutos. Agregar
a cada matraz 2,0 mL de cido clorhdrico 1,2 N y 10,0 mL de yodo 0,01 N SV. Tapar de inmediato y dejar en reposo durante
15 minutos. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidn yoduro SR al acercarse al punto
final y continuar la volumetra hasta que el color azul desaparezca.
Determinacin con un BlancoEn un matraz que contenga 2,0 mL de la Preparacin Estndar, agregar 10,0 mL de yodo 0,01
N SV. Si la Preparacin Estndar contiene amoxicilina o ampicilina, agregar de inmediato 0,1 mL de cido clorhdrico 1,2 N.
Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidn yoduro SR cerca del punto final y
continuar la volumetra hasta que el color azul desaparezca. Tratar en forma similar un matraz que contenga 2,0 mL de la
Preparacin de Valoracin.
Captulos
El siguiente mtodo se utiliza para la valoracin de la mayora de los medicamentos antibiticos farmacopeicos derivados de
la penicilina y sus formas farmacuticas, cuando la valoracin yodomtrica resulta particularmente apropiada.
Preparacin EstndarDisolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada del Estndar de Referencia USP especificado en la monografa individual, previamente secado bajo las condiciones citadas en la monografa individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas, con el
mismo disolvente hasta obtener una solucin con una concentracin conocida aproximada a la que se especifica en la tabla.
Pipetear 2,0 mL de esta solucin y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 mL con tapn de vidrio.
318 425 AntibiticosValoracin Yodomtrica / Pruebas Qumicas
USP 38
ClculosCalcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada mL de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la
Preparacin Estndar, por la frmula:
(2CP)/(B I)
en donde C es la concentracin, en mg por mL, de Estndar de Referencia en la Preparacin Estndar; P es la potencia, en mg
(o unidades) por mg, del Estndar de Referencia; B es el volumen, en mL, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la
Determinacin con un Blanco; e I es el volumen, en mL, de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la Inactivacin y Volumetra.
Calcular la potencia de la muestra en anlisis por la frmula especificada en la monografa individual.
429 MEDICIN DEL TAMAO DE PARTCULA POR DIFRACCIN DE

LUZ
Captulos
INTRODUCCIN
El mtodo se basa en las normas ISO 13320-1(1999) y 9276-1(1998).
Este captulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa.
La tcnica de difraccin de luz lser usada para la determinacin de la distribucin del tamao de las partculas se basa en el
anlisis del patrn de difraccin producido cuando las partculas se exponen a un haz de luz monocromtica. Histricamente,
los primeros instrumentos de difraccin lser usaban slo dispersin en ngulos pequeos. No obstante, desde entonces la
tcnica se ha ampliado para incluir dispersin de la luz lser en un intervalo angular ms amplio y la aplicacin de la teora de
Mie, adems de la aproximacin de Fraunhofer y de la difraccin anmala.
La tcnica no puede distinguir entre dispersin por partculas individuales y dispersin por grupos de partculas primarias, es
decir por aglomerados o agregados. Dado que la mayora de las muestras de partculas contienen aglomerados o agregados y
como el foco de inters generalmente se centra en la distribucin del tamao de las partculas primarias, los grupos por lo
general se dispersan en partculas primarias antes de la medicin.
Para partculas no esfricas, se obtiene una distribucin de tamao de esferas equivalentes, debido a que la tcnica supone
en su modelo ptico que las partculas son esfricas. La distribucin de tamao de partcula resultante puede diferir de la obtenida por mtodos que se basan en otros principios fsicos (p.ej., sedimentacin, tamizado).
Este captulo proporciona una gua para la medicin de las distribuciones de tamao de las partculas en diferentes sistemas
dispersos (p.ej., polvos, atomizaciones, aerosoles, suspensiones, emulsiones y burbujas de gas en lquidos) por medio del anlisis de sus patrones angulares de dispersin de luz. No se consideran en este captulo los requisitos particulares de la medicin
del tamao de las partculas de productos especficos.
PRINCIPIO
Una muestra representativa, dispersada a una concentracin adecuada en un lquido o gas apropiado, se pasa a travs de un
haz de luz monocromtica, generalmente un lser. La luz dispersada por las partculas a diversos ngulos se mide con un detector de multielementos. Se registran los valores numricos que representan el patrn de dispersin para su posterior anlisis.
Estos valores del patrn de dispersin se transforman luego, por medio de un modelo ptico y un procedimiento matemtico
adecuados, para obtener la proporcin entre el volumen total y un nmero discreto de clases de tamao, formando una distribucin volumtrica del tamao de partculas.
INSTRUMENTO
El instrumento se ubica en un entorno donde no se vea afectado por el ruido elctrico, las vibraciones mecnicas, las fluctuaciones de temperatura, la humedad o la luz brillante directa.
En la Figura 1 se muestra un ejemplo de configuracin de un instrumento de difraccin de luz lser. Se puede usar otro equipo.
USP 38
Pruebas Qumicas / 429 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz 319
Figura 1. Ejemplo de configuracin de un instrumento de difraccin de luz lser.
DESARROLLO DEL MTODO

La medicin del tamao de las partculas por difraccin lser puede arrojar datos reproducibles, incluso en la regin submicromtrica, siempre que el instrumento usado y la muestra analizada sean cuidadosamente controlados para limitar la variabilidad de las condiciones de la prueba (p.ej., medio de dispersin, mtodo de preparacin de la dispersin de la muestra).
Tradicionalmente, la medicin del tamao de partcula utilizando difraccin lser se ha limitado a partculas comprendidas
en un intervalo de aproximadamente 0,1 mm a 3 mm. Debido a los recientes avances en el diseo de lentes y equipos, los
instrumentos modernos son habitualmente capaces de exceder este intervalo. Con el informe de validacin, el usuario demuestra la aplicabilidad del mtodo para el uso previsto.
Muestreo
La tcnica de muestreo debe ser adecuada para obtener una muestra representativa de un volumen apropiado para la medicin del tamao de partculas. Se pueden aplicar tcnicas de divisin de muestras tales como la del separador rotatorio de
muestras o el mtodo de cono y divisin por cuarteo.
Evaluacin del Procedimiento de Dispersin

La muestra a analizar se inspecciona, visualmente o con la ayuda de un microscopio, para estimar su intervalo de tamao y
forma de partculas. El procedimiento de dispersin debe ajustarse al propsito de la medicin. El propsito puede ser tal, que
se prefiera desaglomerar los grupos en partculas primarias tanto como sea posible o, por el contrario, conservar los grupos tan
intactos como sea posible. En este sentido, las partculas de inters pueden ser partculas primarias o grupos de partculas.
Para el desarrollo de un mtodo, es aconsejable verificar que no ocurra la conminucin de las partculas y, a la inversa, que la
dispersin de las partculas o grupos sea satisfactoria. Por lo general, esto puede hacerse cambiando la energa de dispersin y
monitoreando el cambio de la distribucin del tamao de las partculas. La distribucin de tamao medida no debe cambiar
Captulos
El instrumento est compuesto por una fuente de luz lser, un sistema ptico para procesar el haz de luz, una regin de
medicin de la muestra (o celda), una lente de Fourier y un detector de multielementos para medir el patrn de la luz dispersada. Tambin se requiere un sistema de datos para la deconvolucin de los datos de dispersin en una distribucin volumtrica de tamaos, as como el anlisis e informe de los datos asociados.
Las partculas pueden entrar al haz lser en dos posiciones. En el caso convencional, las partculas entran al haz paralelo antes de la lente colectora y dentro de su distancia de trabajo. En la llamada ptica de Fourier inversa, las partculas entran por
detrs de la lente colectora y por lo tanto, en un haz convergente. La ventaja de la configuracin convencional es que queda
un paso de longitud razonable para la muestra dentro de la distancia de trabajo de la lente. La segunda configuracin admite
slo longitudes de paso pequeas, pero permite la medicin de luz dispersa en ngulos ms grandes, lo cual es til cuando
hay presencia de partculas submicromtricas.
La interaccin del haz de luz incidente con el conjunto de las partculas dispersas da como resultado un patrn de dispersin
con distintas intensidades de luz en diversos ngulos. La distribucin de intensidad angular total, constituida por la luz directa
y la dispersa, se enfoca entonces sobre un detector de multielementos por medio de una lente o una serie de lentes. Estas
lentes crean un patrn de dispersin que, dentro de ciertos lmites, no depende de la ubicacin de las partculas en el haz de
luz. Por consiguiente, la distribucin de intensidad angular continua se convierte en una distribucin de intensidad espacial
discreta en un set de elementos detectores.
Se supone que el patrn de dispersin medido del conjunto de partculas es idntico a la suma de los patrones de todas las
partculas dispersivas individuales presentadas en posiciones relativas aleatorias. Se debe tener en cuenta que las lentes y por lo
tanto, el detector, slo captan un intervalo angular limitado de luz dispersa.
320 429 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
de manera significativa si la muestra est bien dispersada y las partculas no son frgiles ni solubles. Por otra parte, si el proceso
de fabricacin (p.ej., cristalizacin, molienda) del material ha cambiado, se debe verificar la aplicabilidad del mtodo (p.ej., por
comparacin microscpica).
Las atomizaciones, aerosoles y burbujas de gas en un lquido se deben medir directamente, siempre que su concentracin
sea adecuada, puesto que el muestreo o la dilucin generalmente alteran la distribucin del tamao de las partculas.
En otros casos (como por ejemplo emulsiones, pastas y polvos), se pueden dispersar muestras representativas en los lquidos
adecuados. A menudo se usan aditivos dispersantes (humectantes, estabilizadores) y/o fuerzas mecnicas (p.ej., agitacin, ultrasonido) para la desaglomeracin o desagregacin de grupos de partculas y la estabilizacin de la dispersin. Para estas dispersiones lquidas, lo que se usa ms comnmente es un sistema de recirculacin, que consiste en una celda de medicin ptica, un bao de dispersin por lo general equipado con un mezclador y un generador de ultrasonido, una bomba y tuberas.
Las celdas de agitacin sin sistema recirculante son tiles cuando se dispone slo de pequeas cantidades de muestra o cuando se utilizan lquidos especiales en la dispersin.
Los polvos secos tambin pueden convertirse en aerosoles por medio del uso de dispersadores de polvo seco adecuados, los
cuales aplican fuerzas mecnicas para la desaglomeracin o desagregacin. Por lo general, los dispersadores usan la energa
del gas comprimido o la presin diferencial de un sistema de vaco para dispersar las partculas hasta convertirlas en un aerosol
que es soplado a travs de la zona de medicin, habitualmente hacia la entrada de una unidad de vaco que recolecta las partculas. Sin embargo, en el caso de partculas o grnulos ms gruesos y de libre fluidez, el efecto de la gravedad puede ser suficiente para dispersar las partculas adecuadamente.
Si el tamao mximo de las partculas de la muestra excede el intervalo de medicin del instrumento, el material que es
demasiado grueso se puede retirar por tamizado, informndose la masa y el porcentaje del material retirado. Sin embargo,
cabe sealar que despus del pretamizado la muestra deja de ser representativa, a menos que se compruebe lo contrario.
Optimizacin de la Dispersin Lquida

Los lquidos, surfactantes y dispersantes usados para dispersar polvos deben:
ser transparentes a la longitud de onda del lser y estar prcticamente exentos de burbujas de aire o partculas;
tener un ndice de refraccin que difiera del correspondiente al material de prueba;
no ser disolventes del material de prueba (lquido puro o solucin saturada, prefiltrada);
no alterar el tamao de los materiales de prueba (p.ej., por efecto de la solubilidad, aumento de la solubilidad o recristalizacin);
favorecer la fcil formacin y estabilidad de la dispersin;
ser compatibles con los materiales usados en el instrumento (como juntas tricas, juntas de estanqueidad, tuberas, etc.);
y
poseer una viscosidad apropiada para facilitar la recirculacin, agitacin y filtracin.
Para humedecer las partculas y estabilizar la dispersin a menudo se usan agentes tensoactivos y/o dispersantes. Para el caso
de cidos y bases dbiles, la amortiguacin del medio dispersante a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a la
identificacin de un dispersante adecuado.
Se puede hacer una verificacin preliminar de la calidad de la dispersin por medio de una inspeccin visual o microscpica.
Tambin es posible tomar muestras fraccionadas de una dispersin madre bien mezclada. Dichas dispersiones madre se forman agregando un lquido a la muestra mientras se mezcla, por ejemplo, con una varilla de vidrio, una esptula o un mezclador por vrtice. Se debe tener cuidado de asegurar la transferencia de una muestra representativa y de que no se sedimenten
las partculas ms grandes. Por lo tanto, se prepara una pasta de la muestra o se lleva a cabo un muestreo rpido de una suspensin que se mantiene bajo agitacin.
Optimizacin de la Dispersin con Gas

Para atomizaciones y dispersiones de polvo seco se puede utilizar un gas comprimido exento de aceite, agua y partculas.
Para retirar dichos materiales del gas comprimido se puede usar una secadora provista de filtro. Toda unidad de vaco debe
estar localizada lejos de la zona de medicin, de forma que no altere la medicin.
Determinacin del Intervalo de Concentracin

Con el fin de producir una relacin seal-ruido aceptable en el detector, la concentracin de partculas en la dispersin debe
exceder un nivel mnimo. De igual manera, debe estar por debajo de un nivel mximo con el fin de evitar la dispersin mltiple. El intervalo de concentracin est influenciado por el ancho del haz lser, la longitud de paso de la zona de medicin, las
propiedades pticas de las partculas y la sensibilidad de los elementos detectores.
En vista de lo anterior, se deben efectuar las mediciones con diferentes concentraciones de partculas para determinar el intervalo apropiado de la concentracin para cualquier muestra tpica de material. [NOTAEn diferentes instrumentos, las concentraciones de partculas se representan habitualmente mediante magnitudes y escalas diferentes, p.ej., oscurecimiento, concentracin ptica, nmero proporcional de la masa total.]
USP 38
Pruebas Qumicas / 429 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz 321
Determinacin del Tiempo de Medicin

El tiempo de medicin, el tiempo de lectura del detector y la frecuencia de adquisicin se determinan experimentalmente,
de acuerdo con la precisin requerida. Por lo general, el tiempo de medicin permite un gran nmero de barridos o escaneos
en intervalos de tiempo cortos.
Seleccin de un Modelo ptico Apropiado
Validacin
Tpicamente, la validacin de un procedimiento se puede determinar por la evaluacin de su especificidad, linealidad, intervalo, exactitud, precisin y robustez. En el anlisis del tamao de partculas por difraccin de luz lser no aplica la especificidad, segn la definicin de la ICH, y no es posible discriminar los diferentes componentes en una muestra, ni discriminar entre
aglomerados y partculas dispersas a menos que se complemente adecuadamente con tcnicas microscpicas. No se puede
aplicar a este procedimiento la exploracin de una relacin lineal entre concentracin y respuesta o un modelo matemtico de
interpolacin. Ms que evaluar la linealidad, este mtodo requiere la definicin de un intervalo de concentracin dentro del
cual el resultado de las mediciones no vare significativamente. Las concentraciones por debajo de ese intervalo producen un
error debido a la deficiente relacin seal-ruido, mientras que las concentraciones por encima de ese intervalo producen un
error debido a la dispersin mltiple. El intervalo depende principalmente del hardware del instrumento. La exactitud se debe
confirmar a travs de una apropiada calificacin del instrumento y de una comparacin con un anlisis microscpico, mientras
que la precisin se puede evaluar por medio de una determinacin de repetibilidad.
La repetibilidad que se consiga con el mtodo depende principalmente de las caractersticas del material (molido o sin moler, robusto o frgil, ancho de la distribucin de su tamao, etc.) mientras que la repetibilidad requerida depende del propsito de la medicin. Los lmites obligatorios no se pueden especificar en este captulo puesto que la repetibilidad (diferentes preparaciones de la muestra) puede variar apreciablemente de una sustancia a otra. Sin embargo, una buena prctica consiste en
aspirar a criterios de aceptacin para repetibilidad, tales como % RSD 10% [n = 6] para cualquier valor central de la distribucin (p.ej., para x50). Los valores a los lados de la distribucin (p.ej., x10 y x90) sern sometidos a criterios de aceptacin menos
estrictos, como % RSD 15% [n = 6]. Por debajo de 10 mm, estos valores deben duplicarse. La robustez se puede analizar durante la seleccin y optimizacin de los medios y fuerzas de dispersin. El cambio de la energa dispersante se puede monitorear por el cambio en la distribucin del tamao de las partculas.
MEDICIN
Precauciones
Seguir las instrucciones en el manual del instrumento:
no mirar nunca de frente el haz lser directo o sus reflexiones;
conectar a tierra todos los componentes del instrumento para prevenir la ignicin de los disolventes o explosiones del
polvo;
verificar la configuracin del instrumento (p.ej., calentamiento, intervalo de medicin y lentes requeridos, distancia de trabajo apropiada, posicin del detector, ausencia de luz diurna brillante directa); y
en el caso de dispersiones hmedas, evitar burbujas de aire, evaporacin de lquidos, efecto schlieren u otras inhomogeneidades en la dispersin; de igual manera, evitar una relacin masa-flujo inapropiada del dispersador o un flujo de aire
Captulos
La mayora de los instrumentos usan la aproximacin de Fraunhofer o la teora de Mie, aunque a veces se aplican otras aproximaciones para el clculo de la matriz de dispersin. La eleccin del modelo terico depende de la aplicacin prevista y las
diferentes suposiciones (tamao, absorbancia, ndice de refraccin, rugosidad, orientacin cristalina, mezcla, etc.) hechas para
el material de prueba. Si los valores del ndice de refraccin (partes real e imaginaria para la longitud de onda usada) no se
conocen exactamente, entonces se puede usar la aproximacin de Frauenhofer o la teora de Mie con una estimacin realista
del ndice de refraccin. La primera tiene la ventaja de que es simple y no necesita valores del ndice de refraccin; la segunda
por lo general arroja distribuciones menos sesgadas del tamao de las partculas, en el caso de partculas pequeas. Por ejemplo, si se usa el modelo Fraunhofer para muestras que contienen una cantidad apreciable de partculas pequeas, transparentes, la cantidad de partculas pequeas calculada puede resultar significativamente sobreestimada. Con el fin de obtener resultados rastreables, es esencial documentar los valores del ndice de refraccin usados, porque pequeas diferencias en los valores supuestos para la parte real e imaginaria del ndice de refraccin complejo pueden ocasionar diferencias significativas en las
distribuciones de tamao de las partculas resultantes. A menudo se aplican valores bajos de la parte imaginaria del ndice de
refraccin (aproximadamente 0,01 a 0,1 i) para permitir la correccin de la absorbancia en funcin de la rugosidad de superficie de las partculas. En general, cabe anotar que las propiedades pticas de la sustancia a analizar, as como la estructura
(p.ej., forma, rugosidad de superficie y porosidad) influyen en el resultado final.
322 429 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Luz / Pruebas Qumicas
USP 38
turbulento en el caso de dispersiones secas; dichos efectos pueden ocasionar distribuciones errneas del tamao de partculas.
Medicin de la Dispersin de la Luz de las Muestras Dispersadas

Despus de la alineacin adecuada de la parte ptica del instrumento se debe efectuar una medicin blanco del medio de
dispersin exento de partculas, usando el mismo mtodo utilizado para la medicin de la muestra. La seal de ruido de fondo
debe estar por debajo del umbral apropiado. Los datos suministrados por el detector se guardan con el fin de restarlos posteriormente de los datos obtenidos con la muestra. La dispersin de la muestra se mide de acuerdo con el mtodo desarrollado.
Para cada elemento del detector se calcula una seal promedio, a veces junto con su desviacin estndar. La magnitud de la
seal de cada elemento del detector depende del rea de deteccin, de la intensidad de la luz y de la eficiencia cuntica. Las
coordenadas (tamao y posicin) de los elementos del detector junto con la distancia focal de la lente determinan el intervalo
de los ngulos de dispersin para cada elemento. La mayora de los instrumentos miden tambin la intensidad del haz lser
central (sin dispersar). La relacin entre la intensidad de una muestra dispersada y la obtenida en su ausencia (la medicin
blanco) indica la proporcin de luz dispersada y por lo tanto la concentracin de partculas.
Captulos
Conversin del Patrn de Dispersin en Distribucin del Tamao de Partcula

Este paso de deconvolucin es la inversa del clculo de un patrn de dispersin para una distribucin dada del tamao de
partcula. La suposicin de la forma esfrica de las partculas es especialmente importante por cuanto la mayora de los algoritmos usan la solucin matemtica para la dispersin por partculas esfricas. Adems, los datos medidos siempre contienen
errores aleatorios y sistemticos que podran viciar las distribuciones de tamao. Se han desarrollado varios procedimientos
matemticos para usar en los instrumentos disponibles. Estos permiten cierta ponderacin de las desviaciones entre los patrones de dispersin medidos y calculados (p.ej., cuadrados mnimos), algunas restricciones (p.ej., no negatividad para cantidades
de partculas), y/o cierta suavizacin de la curva de distribucin de tamao.
Los algoritmos utilizados son especficos para cada marca y modelo de equipo y estn amparados por una licencia. Las diferencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden dar lugar a diferencias en las distribuciones de tamaos de las
partculas calculadas.
Repeticiones
El nmero de mediciones repetidas (con preparaciones de muestras individuales) a efectuar depende de la precisin requerida en la medicin. Se recomienda fijar este nmero en el mtodo especfico de una sustancia.
INFORME DE RESULTADOS
Los datos de distribucin del tamao de las partculas por lo general se informan como una distribucin acumulada de los
tamaos inferiores y/o como distribucin de la densidad por volumen. El smbolo x se usa para indicar el tamao de la partcula, que a su vez se define como el dimetro de una esfera de volumen equivalente. Q3(x) indica la fraccin en volumen de las
partculas de tamao menor a x. En una representacin grfica, x se representa sobre la abscisa y la variable dependiente Q3
sobre la ordenada. Los valores caractersticos ms comunes se calculan por interpolacin de la curva de distribucin del tamao de partculas. Con frecuencia se usan tamaos de partculas de las fracciones acumuladas del 10%, 50%, y 90% (x10, x50, y
x90, respectivamente); x50 se conoce tambin como la mediana del tamao de partcula. Se reconoce que el smbolo d se usa
tambin ampliamente para designar el tamao de partcula, por lo cual el smbolo x podra reemplazarse por d.
Por otra parte, se debe documentar suficiente informacin sobre la muestra, la preparacin de la muestra, las condiciones de
dispersin y el tipo de celda. Dado que los resultados dependen del instrumento particular, el programa de anlisis de datos y
el modelo ptico usado, estos detalles tambin se deben documentar.

Usar el instrumento segn las instrucciones del fabricante y llevar a cabo las calificaciones prescritas con la frecuencia adecuada, de acuerdo con el uso del instrumento y las sustancias a examinar.
Calibracin
Los sistemas de difraccin lser, aunque suponen propiedades idealizadas de las partculas, se basan en los principios fundamentales de la dispersin de la luz lser. Por eso, no se requiere una calibracin en el sentido estricto. Sin embargo, es necesario confirmar que el instrumento funciona correctamente. Esto puede efectuarse usando cualquier material de referencia certificado que sea aceptable en la prctica industrial. Se examina el procedimiento de medicin completo, incluidos la recoleccin
USP 38
Pruebas Qumicas / 431 Determinacin de Grupos Metoxilo 323
Calificacin del Sistema

Adems de la calibracin, el desempeo del instrumento debe calificarse a intervalos regulares o tan frecuentemente como
sea apropiado. Esto se puede llevar a cabo usando un material de referencia apropiado, como se mencion en el prrafo anterior.
La calificacin del sistema se basa en el concepto de que el equipo, la electrnica, el software y las operaciones analticas
constituyen un sistema integral que se puede evaluar como una entidad. Se examina el procedimiento de medicin completo,
incluidos la recoleccin de la muestra, la dispersin de la muestra, el transporte de la muestra a travs de la zona de medicin,
la medicin y el procedimiento de deconvolucin. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
En general, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se considera que la respuesta de un instrumento de difraccin lser cumple con los requisitos si el valor x50 no se desva en ms de 10% del intervalo de valores del
material de referencia. Si se evalan opcionalmente los valores a los lados de la distribucin (p.ej., x10 y x90), estos valores no se
deben desviar en ms de 15% del intervalo de valores certificado. Por debajo de 10 mm, estos valores deben duplicarse.
NOTAPara la calibracin del instrumento, en el prrafo sobre Calibracin se especifican requisitos ms estrictos.
431 DETERMINACIN DE GRUPOS METOXILO

AparatoEl aparato para la determinacin de grupos metoxilos se muestra esquemticamente en la figura adjunta. El matraz de ebullicin, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introduccin de dixido de carbono o nitrgeno y est conectado a una columna, B, que sirve para separar el cido yodhdrico acuoso del yoduro de metilo que es ms voltil. El yoduro de
metilo pasa a travs de agua en una trampa depuradora, C, y finalmente es absorbido en la solucin de bromocido actico
en el tubo de absorcin D. El dixido de carbono o nitrgeno se introduce a travs de un dispositivo que regula la presin y se
conecta al aparato por medio de un capilar pequeo que contiene un pequeo trozo de algodn. [NOTAEvitar el uso de
disolventes orgnicos al limpiar este aparato, ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinacin. Esta prueba se
emplea tambin para la determinacin de grupos etoxilo con un tiempo de reaccin de 80 minutos y un equivalente de solucin volumtrica de 0,751 mg de (OC2H5).]
Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esfrica de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales
del aparato. La parte superior del depurador C consta de una junta esfrica 35/20, cuya mitad superior est conectada por
medio del brazo lateral al tubo D. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el agregado de agua a la trampa. Adems,
permite el acceso al tubo de ensayo (de 10 mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el tubo interno del depurador
C.
Captulos
de la muestra, la dispersin de la muestra, el transporte de la muestra a travs de la zona de medicin, la medicin y el procedimiento de deconvolucin. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
Los materiales de referencia certificados preferidos constan de partculas esfricas de una distribucin conocida. Deben estar
certificados en lo que respecta a la distribucin del tamao en porcentaje de masa por medio de una tcnica absoluta, si estuviese disponible, y usarse junto con un procedimiento operativo acordado y detallado. Si se aplica la teora de Mie en el anlisis
de datos, es fundamental que se indiquen las partes real e imaginaria del ndice de refraccin complejo del material. La representacin de la distribucin del tamao de partculas por volumen igualar a la de la distribucin por masa, siempre que la
densidad de las partculas sea la misma para todas las fracciones de tamaos.
La respuesta de un instrumento de difraccin lser cumple con los requisitos si el valor medio de x50 de por lo menos tres
mediciones independientes no se desva en ms de 3% del intervalo de valores certificado del material de referencia certificado. Los valores medios para x10 y x90 no se deben desviar del intervalo de valores certificado en ms del 5%. Por debajo de 10
mm, estos valores deben duplicarse.
Pese a que se prefiere el uso de materiales compuestos por partculas esfricas, tambin pueden usarse partculas no esfricas. Preferentemente, stas deben tener valores certificados o tpicos provenientes de anlisis de difraccin lser efectuados segn un procedimiento operativo acordado y detallado. El uso de valores de referencia obtenidos por mtodos distintos de la
difraccin lser puede ocasionar una desviacin significativa. El motivo de esta desviacin es que los distintos principios inherentes a los diversos mtodos pueden conducir a diferentes dimetros de esferas equivalentes para la misma partcula no esfrica.
Aunque se prefiere el uso de de materiales de referencia certificados, se pueden emplear tambin otros materiales de referencia bien definidos. Estos consisten en sustancias de composicin y distribucin de tamao de partculas tpicas para una
clase especificada de sustancias. La distribucin del tamao de partculas de los mismos ha demostrado ser estable con el tiempo. Los resultados deben cumplir con los datos previamente determinados, con la misma precisin y desviacin que el material
de referencia certificado.
USP 38
Captulos
324 431 Determinacin de Grupos Metoxilo / Pruebas Qumicas
Aparato para la Determinacin de Grupos Metoxilos

Reactivos
SOLUCIN DE BROMO-CIDO ACTICODisolver 100 g de acetato de potasio en 1000 mL de una solucin constituida por 900
mL de cido actico glacial y 100 mL de anhdrido actico. En el da de su utilizacin, agregar 5 mL de bromo a 145 mL de
esta solucin.
CIDO YODHDRICOEst disponible comercialmente una solucin reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullicin
constante preparada para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede prepararse destilando cido yodhdrico sobre fsforo rojo, pasando dixido de carbono o nitrgeno a travs del aparato durante la destilacin. Usar la mezcla de punto de ebullicin constante (entre 55% y 58% de HI) que destila entre 126 y 127, que es incolora o casi incolora. [PrecaucinSe deben
tomar medidas de seguridad al destilar cido Yodhdrico.] Colocar el cido en frascos pequeos de color mbar con tapn de
vidrio purgados con dixido de carbono o nitrgeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y oscuro.
ProcedimientoPreparar el aparato desconectando la junta esfrica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Conectar las dos partes, empleando una cantidad mnima de una grasa de silicona apropiada para sellar la junta esfrica. Agregar
7 mL de Solucin de Bromo-cido Actico en el tubo de absorcin D. Pesar la muestra en una cpsula de gelatina tarada y colocarla en el matraz de ebullicin junto con unas pocas perlas de ebullicin o pedazos de plato poroso. Finalmente agregar 6 mL
de cido Yodhdrico y juntar el matraz a la columna, empleando una cantidad mnima de grasa de silicona apropiada para sellar
la unin. Burbujear dixido de carbono o nitrgeno a travs del aparato a una velocidad de 2 burbujas por segundo; colocar el
matraz de ebullicin en un bao de aceite o manto de calentamiento a 150 y continuar la reaccin durante 40 minutos para
la determinacin de grupos metoxilo, u 80 minutos para la determinacin de grupos etoxilo. Drenar el contenido del tubo de
absorcin en un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 10 mL de solucin de acetato de sodio (1 en 4). Lavar el tubo
con agua, agregar los lquidos de lavado al matraz y finalmente, diluir con agua hasta aproximadamente 125 mL. Agregar cido frmico, gota a gota, agitando por rotacin moderada hasta que el color marrn rojizo del bromo desaparezca; luego agregar 3 gotas adicionales. Por lo general, se requiere un total de 12 a 15 gotas. Dejar en reposo durante 3 minutos y agregar 15
mL de cido sulfrico diluido y 3 g de yoduro de potasio y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,1 N SV usando 3 mL
de almidn SR como indicador. Realizar una determinacin con un blanco, incluyendo tambin una cpsula de gelatina y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio 0,1 N equivale a 0,517 mg de (OCH3).
Pruebas Qumicas / 441 Valoracin de Niacina o Niacinamida 325
USP 38
441 VALORACIN DE NIACINA O NIACINAMIDA

ER cido 6-Hidroxinicotnico USP (ver el Procedimiento 4)
ER Niacina USP
ER Niacinamida USP
NOTALos Estndares de Referencia secados previamente se pueden almacenar en un desecador sobre gel de slice. Proteger de la luz.
MTODO QUMICO
Tabla 1. Mezclas de Reaccin para la Valoracin de Niacina o

NiacinamidaMtodo Qumico
Tubo 1
(mL)
Tubo 2
(mL)
Preparacin estndar
1,0
1,0
Preparacin de valoracin
1,0
1,0
Dilucin de amonaco (hidrxido de amonio, diluido a 1

en 50)
0,5
0,5
0,5
0,5
Agua
6,5
1,5
6,5
1,5
Solucin de bromuro
de ciangeno
5,0
5,0
Solucin de cido sulfanlico
2,0
2,0
2,0
2,0
1 gota
1 gota
Componente
cido clorhdrico
Tubo 3
(mL)
Tubo 4
(mL)
Agregar al Tubo 1 la Solucin de cido sulfanlico, agitar bien, agregar el cido clorhdrico, mezclar, colocar en un espectrofotmetro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo 2 la Solucin de bromuro de ciangeno, mezclar y a los
30 segundos, cronometrados con exactitud, despus de completar la adicin del bromuro de ciangeno, agregar la Solucin
de cido sulfanlico, agitando por rotacin suave. Cerrar el tubo, colocarlo en el espectrofotmetro y despus de 2 minutos medir su absorbancia a 450 nm contra el Tubo 1 utilizado como blanco, designando la absorbancia como AS. Repetir el procedi-
Captulos
El siguiente procedimiento fotomtrico implica la reaccin colorimtrica de niacina o niacinamida con bromuro de ciangeno en presencia de cido sulfanlico. Se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en las monografas como
Niacina, Inyeccin; Niacinamida, Inyeccin y Niacinamida, Tabletas.
[NOTADeterminar a partir de la informacin del etiquetado si la vitamina presente en la muestra de valoracin es niacina o
niacinamida y emplear la preparacin estndar correspondiente (ya sea Preparacin estndar de niacina o Preparacin estndar
de niacinamida) segn se indica en el Procedimiento.]
Solucin de bromuro de ciangeno: Disolver 5 g de bromuro de ciangeno en agua para obtener 50 mL.
[PRECAUCINPreparar esta solucin bajo una campana, ya que el bromuro de ciangeno se volatiliza a temperatura ambiente y el
vapor es sumamente irritante y venenoso.]
Solucin de cido sulfanlico: Agregar 15 mL de agua y 3 mL de hidrxido de amonio 6 N a 2,5 g de cido sulfanlico.
Mezclar y, si fuera necesario, agregar mezclando ms hidrxido de amonio 6 N hasta que el cido se disuelva. Ajustar el pH de
la solucin con cido clorhdrico 3 N a aproximadamente 4,5 empleando verde de bromocresol SR como indicador externo, y
diluir con agua hasta 25 mL.
Solucin madre de niacina estndar: Transferir 25,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumtrico de 500 mL, disolver
en solucin de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solucin de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrigerador.
Cada mL de esta solucin contiene 50 mg de ER Niacina USP.
Preparacin estndar de niacina: Transferir 10,0 mL de Solucin madre de niacina estndar a un matraz volumtrico de
100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solucin contiene 5 mg de ER Niacina USP.
Solucin madre de niacinamida estndar: Transferir 50,0 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 500
mL, disolver en solucin de alcohol (1 en 4), diluir con solucin de alcohol (1 en 4) a volumen y mezclar. Almacenar en un
refrigerador. Cada mL de esta solucin contiene 100 mg de ER Niacinamida USP.
Preparacin estndar de niacinamida: Transferir 10,0 mL de Solucin madre de niacinamida estndar a un matraz volumtrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solucin contiene 10 mg de ER Niacinamida USP.
Preparacin de valoracin: Preparar segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento: Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las cantidades de la Preparacin estndar correspondiente, de
la Preparacin de valoracin, de la Dilucin de amonaco y de Agua segn se indican en la Tabla 1. Luego agregar los dems
componentes, respectivamente, segn se indican en la tabla, conforme a las instrucciones que se proporcionan en este captulo.
326 441 Valoracin de Niacina o Niacinamida / Pruebas Qumicas
USP 38
miento con el Tubo 3 (como blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4 como AU. Calcular la cantidad de niacina o niacinamida en la muestra segn se indica en la monografa individual.
Captulos
MTODOS CROMATOGRFICOS
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se proveen para la determinacin de niacina o niacinamida como un ingrediente farmacutico activo, como un ingrediente de suplemento diettico o como un componente de suplementos dietticos o de formas farmacuticas.
Usar el Estndar de Referencia USP apropiado para la niacina o niacinamida presente en la formulacin.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmsfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan
de la muestra de prueba y de los Estndares de Referencia, usando preferiblemente material de vidrio con proteccin actnica.
Procedimiento 1
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina o niacinamida en:
Vitaminas olesolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin usando agua caliente o agitacin mecnica
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones
reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Diluyente: Acetonitrilo, cido actico glacial y agua (5:1:94)
Fase mvil: Una mezcla de metanol, cido actico glacial y agua (27:1:73) que contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato de
sodio por cada 100 mL
Solucin estndar: Transferir 80 mg de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 200 mL y agregar
180 mL de Diluyente. Sumergir el matraz en un bao de agua caliente mantenido a 6570 durante 10 minutos agitando
regularmente o usando un mezclador de vrtice, hasta que se disuelvan todos los materiales slidos. Enfriar rpidamente en un
bao de agua fra durante 10 minutos a temperatura ambiente y diluir con Diluyente a volumen.
Solucin muestra: Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalente
a 10 mg de niacinamida y 2,5 mg de clorhidrato de piridoxina, de riboflavina y de clorhidrato de tiamina a un tubo de centrfuga de 50 mL. Agregar 25,0 mL de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vrtice durante 30 segundos para suspender
el polvo completamente. Sumergir el tubo de centrfuga en un bao de agua caliente mantenido a 6570, calentar durante
5 minutos y mezclar en un mezclador de vrtice durante 30 segundos. Volver a sumergir el tubo en el bao de agua caliente,
calentar durante otros 5 minutos y mezclar en un mezclador de vrtice durante 30 segundos. Filtrar una porcin de la solucin, enfriar a temperatura ambiente y usar el filtrado transparente. [NOTAUsar el filtrado dentro de las 3 horas de la filtracin.]
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 3,9 mm 30 cm; relleno L1
Aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%
Anlisis
Medir las reas de los picos de niacina o niacinamida.
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C6H5NO2) o niacinamida (C6H6N2O) en la porcin de la Muestra
tomada:
Resultado = (rU/rS) (CS/CU) 100
rU = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solucin estndar
CS = concentracin de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/mL)
CU = concentracin nominal de niacina o niacinamida en la Solucin muestra (mg/mL)
Procedimiento 2
Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin mediante el Disolvente de extraccin, calor y agitacin mecnica.
USP 38

Procedimiento 3
Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
Este procedimiento implica la extraccin de analitos de la formulacin mediante mezclas de disolventes orgnicos, calor y
agitacin mecnica.
Reactivo: 25 mg/mL de edetato disdico en agua
Fase mvil: Transferir 0,4 mL de trietilamina, 15,0 mL de cido actico glacial y 350 mL de metanol a un matraz volumtrico
de 2000 mL. Diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen.
Solucin madre del estndar: 1,5 mg/mL de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Reactivo, calentando si fuera necesario.
Solucin estndar: Transferir 5,0 mL de Solucin madre del estndar a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 10,0 mL de
un a mezcla de metanol y cido actico glacial (9:1) y 30,0 mL de una mezcla de metanol y etilenglicol (1:1). Tapar, agitar
durante 15 minutos en un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado.
Solucin muestra: Para tabletas, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porcin del polvo,
equivalente a 7,5 mg de niacina o niacinamida, a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 10,0 mL de una mezcla de metanol y cido actico glacial (9:1) y 30,0 mL de una mezcla de metanol y etilenglicol (1:1). Tapar, agitar durante 15 minutos en
un bao de agua mantenido a 60 y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado.
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Captulos
Solucin A: Transferir 1 mL de cido actico glacial y 2,5 g de edetato disdico a un matraz volumtrico de 100 mL. Disolver
y diluir con agua a volumen.
Disolvente de extraccin: Solucin A y metanol (3:1)
Fase mvil: Solucin de acetato de sodio 0,1 M (13,6 mg/mL de acetato de sodio en agua). Ajustar con cido actico a un
pH de 5,4. [NOTASe puede agregar una pequea cantidad de metanol (hasta 1%) a la Fase mvil para mejorar la resolucin.]
Solucin madre del estndar: 1 mg/mL de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Disolvente de extraccin
Solucin estndar: Transferir 5,0 mL de Solucin madre del estndar a un matraz volumtrico de 25 mL y diluir con Disolvente de extraccin a volumen.
Solucin muestra: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de niacina o niacinamida, piridoxina y riboflavina, cuando se encuentran presentes en la formulacin.] Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalente a 2 mg de riboflavina, a un matraz volumtrico de 200 mL. Si la riboflavina no se
encuentra presente en la formulacin, transferir una porcin del polvo, equivalente a 2 mg de piridoxina. Si la piridoxina no se
encuentra presente en la formulacin, transferir una porcin del polvo, equivalente a 20 mg de niacina o niacinamida. Agregar
100,0 mL de Disolvente de extraccin y mezclar durante 20 minutos, usando un agitador de movimiento tipo mueca (wrist
action). Sumergir el matraz en un bao de agua mantenido a 7075 y calentar durante 20 minutos. Mezclar en un mezclador de vrtice durante 30 segundos, enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente.
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0% [NOTASi fuera necesario, purgar la columna con metanol entre inyecciones.]
Anlisis
tomada:
USP 38

Aptitud del sistema
Anlisis
tomada:
Captulos

Procedimiento 4
Este procedimiento se puede usar para describir niacina como:
Un ingrediente farmacutico activo
Un ingrediente de suplemento diettico
Un ingrediente en las tabletas de liberacin prolongada de niacina
Este procedimiento implica disolver el analito en Diluyente, una mezcla de metanol y agua (82:18), o extraer el analito de
la formulacin con Diluyente y agitacin mecnica
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar A, la
Solucin estndar B, la Solucin muestra A, la Solucin muestra B y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a
continuacin.
Diluyente: Metanol y agua (82:18)
Fase mvil: Metanol y agua (82:18), ajustada con cido actico glacial a un pH de 3,15 0,05
Solucin de aptitud del sistema: 0,25 mg/mL de ER Niacina USP, 0,050 mg/mL de ER cido 6-Hidroxinicotnico USP y 0,10
mg/mL de piridina en Diluyente
Solucin estndar A: Para un ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento diettico, usar 0,25 mg/mL de
ER Niacina USP en Diluyente.
Solucin estndar B: Para tabletas de liberacin prolongada, usar 0,25 mg/mL de ER Niacina USP, 0,050 mg/mL de ER cido 6-Hidroxinicotnico USP y 0,0978 mg/mL de piridina en Diluyente.
Solucin muestra A: Para un ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento diettico, usar 0,25 mg/mL de
Niacina en Diluyente.
Solucin muestra B: Para tabletas de liberacin prolongada, transferir una cantidad del polvo, equivalente a 50 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar Diluyente y mezclar durante 2
horas. Diluir con Diluyente hasta una concentracin final de 0,25 mg/mL de niacina.
Modo: HPLC
Detector: UV 260 nm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar A o Solucin estndar B [NOTALos tiempos de retencin relativos para piridina, cido 6-hidroxinicotnico y niacina son 0,14; 0,64 y 1,0, respectivamente, Solucin de aptitud del sistema.]
Resolucin: No menos de 1,5 entre piridina y cido 6-hidroxinicotnico y no menos de 1,5 entre cido 6-hidroxinicotnico
y niacina, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solucin estndar A o
Solucin estndar B
Anlisis
Muestras: Solucin estndar A y Solucin muestra A o Solucin estndar B y Solucin muestra B
Calcular el porcentaje de niacina (C6H5NO2) en la porcin de la Muestra tomada:
USP 38

rU = respuesta del pico de niacinamida de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de niacinamida de la Solucin estndar
CS = concentracin de ER Niacinamida USP en la Solucin estndar (mg/mL)
CU= concentracin de Niacinamida en la Solucin muestra (mg/mL)
Procedimiento 6
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacina como:
Un ingrediente activo en las tabletas de niacina
Este procedimiento implica la extraccin de la niacina de la formulacin usando agua, calor y agitacin mecnica.
Solucin A: Solucin 5 mM de 1-hexanosulfonato de sodio en agua
Fase mvil: Metanol, acetonitrilo, cido actico glacial y Solucin A (14:7:1:78)
Solucin estndar: 0,050 mg/mL de ER Niacina USP en agua. Disolver con ayuda de calor en un bao de vapor.
Solucin muestra: Para tabletas, transferir el equivalente a 500 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas
a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar 50 mL de agua y calentar en un bao de vapor durante 30 minutos. Someter a
ultrasonido durante 2 minutos, agitar mecnicamente durante 15 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Diluir con agua
hasta 0,050 mg/mL y filtrar.
Modo: HPLC
Detector: UV 262 nm
Captulos
rU = respuesta del pico de niacina de la Solucin muestra A o Solucin muestra B

rS = respuesta del pico de niacina de la Solucin estndar A o Solucin estndar B
CS = concentracin de ER Niacina USP en la Solucin estndar A o Solucin estndar B (mg/mL)
CU = concentracin de Niacina en la Solucin muestra A o concentracin nominal de niacina en la Solucin muestra B
(mg/mL)
Procedimiento 5
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de niacinamida como:
Un ingrediente farmacutico activo
Un ingrediente de suplemento diettico
Este procedimiento implica disolver niacinamida como el ingrediente farmacutico activo o ingrediente de suplemento
diettico en Fase mvil
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar, la
Solucin de niacina, la Solucin muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metanol y 1-heptanosulfonato de sodio 0,005 M (30:70)
Solucin estndar: Transferir 50 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumtrico de 100 mL. Agregar 3 mL de agua
para disolver y diluir con Fase mvil a volumen. Diluir con Fase mvil hasta 0,04 mg/mL.
Solucin de niacina: Preparar segn se indica en Solucin estndar, usando ER Niacina USP en lugar de ER Niacinamida USP.
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar y Solucin de niacina.
Solucin muestra: Preparar segn se indica en Solucin estndar, usando Niacinamida en lugar de ER Niacinamida USP.
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Aptitud del sistema
Resolucin: No menos de 3,0 entre niacina y niacinamida, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacinamida en inyecciones repetidas, Solucin estndar
Anlisis
Calcular el porcentaje de niacinamida (C6H6N2O) en la porcin de la Muestra tomada:
USP 38
Aptitud del sistema

Eficiencia de la columna: No menos de 1000 platos tericos para el pico de niacina
Factor de asimetra: No menos de 2,0 para el pico de niacina
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solucin estndar
Anlisis
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C6H5NO2) en la porcin de la Muestra tomada:
rU = respuesta del pico de niacina de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de niacina de la Solucin estndar
CS = concentracin de ER Niacina USP en la Solucin estndar (mg/mL)
CU = concentracin nominal de niacina en la Solucin muestra (mg/mL)
Captulos
451 VOLUMETRA CON NITRITO

El siguiente mtodo general se utiliza para la determinacin de la mayora de los medicamentos farmacopeicos con sulfonamidas y sus formas farmacuticas, as como de otros medicamentos farmacopeicos para los cuales la volumetra con nitrito
resulta particularmente apropiada.
Estndares de referencia USP 11ER Sulfanilamida USP.
ProcedimientoPesar con exactitud aproximadamente 500 mg en el caso de una sulfonamida, o la cantidad especificada
en la monografa individual y transferir a un recipiente apropiado abierto. Agregar 20 mL de cido clorhdrico y 50 mL de
agua, mezclar hasta disolver, enfriar hasta aproximadamente 15, lentamente valorar con nitrito de sodio 0,1 M SV, previamente normalizado frente a ER Sulfanilamida USP.
Determinar electromtricamente el punto final empleando electrodos apropiados (de platino-calomel o platino-platino). Colocar la punta de la bureta debajo de la superficie de la solucin para evitar la oxidacin del nitrito de sodio por efecto del aire
y agitar la solucin suavemente, usando un agitador magntico, evitando la formacin de un vrtice de aire bajo la superficie y
manteniendo la temperatura aproximadamente a 15. La volumetra puede llevarse a cabo manualmente, o con un titulador
automtico. En la volumetra manual, agregar la solucin volumtrica hasta que la volumetra est cerca de 1 mL del punto
final y luego, agregar porciones de 0,1 mL, dejando que transcurra no menos de 1 minuto entre cada adicin. (La aguja del
instrumento se desva y luego regresa aproximadamente a su posicin original hasta que se alcanza el punto final).
El peso, en mg, de la sustancia al que equivale cada mL de nitrito de sodio 0,1 M SV es el indicado en la monografa individual.
Para la valoracin de Tabletas de sulfonamidas u otros frmacos, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con
exactitud una porcin del polvo, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de frmaco
especificada en la monografa individual y proceder segn se indica previamente, desde donde dice transferir a un recipiente
apropiado abierto.
Para la valoracin de Inyectables y otras formas lquidas para las que se especifica la volumetra con nitrito, pipetear una
porcin, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de frmaco especificada en la monografa individual, y transferir a un recipiente abierto apropiado y proceder segn se indica previamente, desde donde dice
Agregar 20 mL de cido clorhdrico.
461 DETERMINACIN DE NITRGENO

Algunos alcaloides y otros compuestos orgnicos que contienen nitrgeno no proporcionan todo el nitrgeno que contienen al someterlos a digestin con cido sulfrico; en consecuencia, estos mtodos no pueden emplearse para la determinacin
de nitrgeno en todos los compuestos orgnicos.
MTODO I
Nitratos y Nitritos AusentesColocar aproximadamente 1 g de la sustancia, pesado con exactitud, en un matraz de Kjeldahl de 500 mL de vidrio de borosilicato duro. El material a analizar, si es slido o semislido, puede envolverse en una hoja de
Pruebas Qumicas / 466 Impurezas Comunes 331
USP 38
MTODO II
AparatoSeleccionar un matraz de Kjeldahl de 300 mL adecuado, del cual se libera el nitrgeno por digestin cida en
primer lugar y luego se transfiere cuantitativamente al recipiente de volumetra mediante destilacin con vapor.
ProcedimientoColocar en el matraz de digestin del aparato una cantidad del material pesada o medida con exactitud,
equivalente a 2 a 3 mg de nitrgeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de sulfato de potasio y sulfato cprico (10:1) y
lavar el cuello del matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material adherido a l. Agregar 7 mL de cido
sulfrico, dejando que se escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con rotacin suave, agregar cuidadosamente 1 mL de perxido de hidrgeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del matraz. (No agregar perxido de hidrgeno durante la digestin).
Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador elctrico hasta que la solucin tome un color azul transparente y las paredes del matraz estn exentas de material carbonoso. Agregar cuidadosamente 70 mL de agua a la mezcla de digestin, enfriar la solucin y preparar para destilacin con vapor. Agregar 30 mL de solucin de hidrxido de sodio (2 en 5) a
travs de un embudo, de manera tal que la solucin fluya hacia abajo por la pared interna del matraz para formar una capa
bajo la solucin cida; enjuagar el embudo con 10 mL de agua, cerrar hermticamente el aparato y comenzar la destilacin
con vapor inmediatamente. Recibir el destilado en 15 mL de solucin de cido brico (1 en 25), a la cual se le han agregado
3 gotas de rojo de metilo-azul de metileno SR y agua suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar la
destilacin hasta que el destilado mida de 80 a 100 mL. Retirar el matraz de absorcin, enjuagar el extremo del tubo condensador con una cantidad pequea de agua y valorar volumtricamente el destilado con cido sulfrico 0,01 N SV. Realizar una
determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de cido sulfrico 0,01 N SV equivale a 140,1 mg
de nitrgeno.
Cuando se toma una cantidad de material que contiene ms de 2 mg a 3 mg de nitrgeno, puede emplearse cido sulfrico
0,02 N o 0,1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 mL para la volumetra. Si el peso seco total de material tomado es
mayor de 100 mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de cido sulfrico y de hidrxido de sodio.
466 IMPUREZAS COMUNES

Esta prueba tiene como fin evaluar la presencia de impurezas comunes en artculos oficiales y se utiliza cuando una monografa individual as lo indica. Las impurezas comunes se definen como aquellas especies en frmacos y/o productos farmacuticos que no poseen una actividad biolgica indeseable significativa en las cantidades presentes. Estas impurezas pueden surgir
de la sntesis, preparacin o degradacin de los artculos farmacopeicos. En algunos casos, se pueden detectar impurezas que
representan un riesgo potencial para la salud. Dado que dichas impurezas no seran identificadas individualmente por el uso
Captulos
papel de filtro exento de nitrgeno para transferirlo mas cmodamente al matraz. Agregar 10 g de sulfato de potasio en polvo
o sulfato de sodio anhidro, 500 mg de sulfato cprico en polvo y 20 mL de cido sulfrico. Inclinar el matraz en un ngulo de
aproximadamente 45 y calentar moderadamente la mezcla, manteniendo la temperatura debajo del punto de ebullicin hasta que deje de producir espuma. Aumentar el calor hasta que el cido llegue a una ebullicin intensa y continuar el calentamiento hasta que la solucin se torne casi incolora o adquiera un color verde transparente durante 30 minutos. Dejar que se
enfre, agregar 150 mL de agua, mezclar el contenido del matraz y volver a enfriar. Agregar cuidadosamente 100 mL de solucin de hidrxido de sodio (2 en 5), de tal manera que la solucin fluya hacia abajo por la pared interna del matraz y forme
una capa bajo la solucin cida. Agregar inmediatamente unos pedazos de cinc granulado y, sin demorarse, conectar el matraz a un bulbo de conexin (trampa) Kjeldahl, previamente unido a un condensador, cuyo tubo de salida est sumergido debajo de la superficie de 100 mL de solucin de cido brico (1 en 25) contenidos en un matraz Erlenmeyer o en un frasco de
boca ancha de aproximadamente 500 mL de capacidad. Mezclar el contenido del matraz de Kjeldahl mediante rotacin moderada y destilar hasta que se hayan destilado aproximadamente cuatro quintas partes del contenido del matraz. Valorar con
cido sulfrico 0,5 N SV, determinando el punto final potenciomtricamente. Realizar una determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de cido sulfrico 0,5 N SV equivale a 7,003 mg de nitrgeno.
Cuando se sabe que el contenido de nitrgeno de la sustancia es bajo, el cido sulfrico 0,5 N SV puede reemplazarse por
cido sulfrico 0,1 N SV. Cada mL de cido sulfrico 0,1 N SV equivale a 1,401 mg de nitrgeno.
Nitratos y Nitritos PresentesColocar una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud, que corresponda aproximadamente a 150 mg de nitrgeno, en un matraz de Kjeldahl de 500 mL de vidrio de borosilicato duro y agregar 25 mL de cido
sulfrico en el cual se ha disuelto previamente 1 g de cido saliclico. Mezclar el contenido del matraz y dejar reposar la mezcla
durante 30 minutos agitando frecuentemente. Agregar a la mezcla 5 g de tiosulfato de sodio en polvo y volver a mezclar; luego, agregar 500 mg de sulfato cprico en polvo y proceder segn se indica en Nitratos y Nitritos Ausentes, desde donde dice
Inclinar el matraz a un ngulo de aproximadamente 45.
Cuando se sabe que el contenido de nitrgeno de la sustancia excede de 10%, pueden agregarse entre 500 mg y 1 g de
cido benzoico, antes de la digestin, para facilitar la descomposicin de la sustancia.
Captulos
332 466 Impurezas Comunes / Pruebas Qumicas
USP 38
estricto de este Captulo General, puede ser necesario realizar otra evaluacin diferente para garantizar que las impurezas detectadas cumplen con los requisitos establecidos en la definicin de Impurezas Comunes. La seleccin de pruebas y valoraciones admite cantidades previstas de impurezas que no son objetables para el uso habitual del artculo.
Informe y EspecificacionesA menos que la monografa individual indique algo diferente, se seleccion el valor 2,0% como lmite general para la cantidad total de impurezas comunes en monografas en las que la documentacin no respaldaba la
adopcin de otros valores.
Cuando una monografa establece lmites para componentes concomitantes y/o impurezas/productos de degradacin especificados, estas especies no deben incluirse en la estimacin de impurezas comunes a menos que as lo especifique la monografa individual. Los componentes concomitantes se definen como especies caractersticas de muchos frmacos que no se consideran impurezas en el sentido Farmacopeico. Son ejemplos de componentes concomitantes los ismeros geomtricos y pticos (o racematos) y los antibiticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza txica debido a su efecto biolgico indeseable significativo no se considera un componente concomitante.
MetodologaA menos que se indique algo diferente en la monografa individual, la estimacin de la cantidad y nmero
de impurezas comunes se hace mediante mtodos relativos en lugar de la comparacin estricta con Estndares de Referencia
individuales. La deteccin no especfica de impurezas comunes tambin es consecuente con esta clasificacin.
Los mtodos de evaluacin tpicos empleados para las impurezas comunes son las tcnicas por cromatografa en capa delgada (TLC, por sus siglas en ingls). Ver en Cromatografa 621 una explicacin general de la tcnica por cromatografa en capa
delgada. Las pruebas para sustancias relacionadas o pureza cromatogrfica tambin pueden usarse para evaluar la presencia de
impurezas comunes. Tambin pueden emplearse, con la debida justificacin, otros mtodos alternativos (p.ej., HPLC, HPTLC,
etc.). A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, usar el siguiente mtodo.
Solucin de PruebaPreparar una solucin de la sustancia en anlisis en el disolvente especificado en la monografa para
obtener una concentracin final conocida con exactitud de aproximadamente 10 mg por mL. [NOTAPara disolver el frmaco
se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
Soluciones EstndarPreparar soluciones del Estndar de Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente especificado en la monografa, para obtener concentraciones conocidas con exactitud de 0,01 mg por mL, 0,05 mg por mL, 0,1 mg
por mL y 0,2 mg por mL. [NOTAPara disolver el frmaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.]
ProcedimientoUtilizar una placa para cromatografa en capa delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de slice
para cromatografa de 0,25 mm de espesor y la Fase mvil especificada en la monografa. Aplicar a la placa volmenes iguales
(de 20 mL) de la Solucin de Prueba y de las Soluciones Estndar, empleando una corriente de nitrgeno para secar las manchas.
Desarrollar el cromatograma en una cmara preequilibrada hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cmara y secar al aire. Examinar la placa utilizando las tcnicas de visualizacin especificadas. Localizar en el cromatograma de la Solucin de Prueba cualquier mancha diferente de la
mancha principal y determinar las intensidades relativas por comparacin con las manchas obtenidas en los cromatogramas de
las Soluciones Estndar correspondientes. Ver la discusin anterior en cuanto al informe y especificacin de impurezas comunes
totales.
CLAVE DE LAS TCNICAS DE VISUALIZACIN
(1) Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm.

(2) Utilizar Yodoplatinato SR.
(3) Solucin AMezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 mL de agua y 10 mL de cido actico glacial.
Solucin BDisolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua. Mezclar A y B para obtener una Solucin Madre, la cual se
puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 10 mL de la Solucin Madre con 20 mL de cido actico glacial y diluir con agua hasta 100 mL.
(4) Solucin de Ninhidrina para RociadoDisolver 200 mg de ninhidrina en 100 mL de alcohol. Calentar la placa despus de
rociarla.
(5) Solucin de cido para RociadoEn un bao de hielo, agregar lenta y cuidadosamente, y mezclando, 10 mL de cido
sulfrico a 90 mL de alcohol. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
(6) Solucin de cidoDicromato para RociadoAgregar suficiente dicromato de potasio a 100 mL de cido sulfrico para obtener una solucin saturada. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
(7) VainillinaDisolver 1 g de vainillina en 100 mL de cido sulfrico.
(8) Cloramina T-cido TricloroacticoMezclar 10 mL de una solucin acuosa de cloramina T al 3% con 40 mL de una solucin alcohlica de cido tricloroactico al 25%. Preparar inmediatamente antes de usar.
(9) Folin-CAgregar 10 g de tungstato de sodio y 2,5 g de molibdato de sodio a 70 mL de agua, agregar 5 mL de cido
fosfrico al 85% y 10 mL de cido clorhdrico al 36% y someter esta solucin a reflujo durante 10 horas.
(10) KMnO4Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en 100 mL de agua.
(11) DABMezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehdo en 100 mL de cido clorhdrico 0,6 N.
(12) DACMezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehdo en 100 mL de cido clorhdrico 1 N.
(13) FerricianuroMezclar volmenes iguales de una solucin de cloruro frrico al 1% y de una solucin de ferricianuro de
potasio al 1%. Usar inmediatamente.
USP 38
Pruebas Qumicas / 467 Disolventes Residuales 333
(14) Fast Blue BReactivo ADisolver 500 mg de Sal de Fast Blue B en 100 mL de agua.
Reactivo BHidrxido de sodio 0,1 N.
Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B.
(15) Cianuro Frrico AlcalinoDiluir 1,5 mL de una solucin de ferricianuro de potasio al 1% con agua hasta 20 mL y agregar
10 mL de una solucin de hidrxido de sodio al 15%.
(16) Solucin de Yodo para RociadoPreparar una solucin de yodo al 0,5% en cloroformo.
(17) Exponer la placa durante 10 minutos a los vapores de yodo en una cmara cerrada preequilibrada que tenga cristales
de yodo en el fondo.
(18) Solucin ADisolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua.
Solucin BPreparar una solucin de 0,5 g de almidn soluble en 50 mL de agua caliente.
Mezclar volmenes iguales de la Solucin A y de la Solucin B inmediatamente antes de usar.
(19) PTSSDisolver 20 g de cido p-toluensulfnico en 100 mL de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a
110 y examinarla bajo luz UV a 366 nm.
(20) Solucin de o-Tolidina para RociadoDisolver 160 mg de o-tolidina en 30 mL de cido actico glacial, diluir con agua
hasta 500 mL, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta que el yoduro de potasio se haya disuelto.
(21) Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 mL de solucin de cido cloroplatnico (1 en 10) con 97 mL de agua,
seguido del agregado de 100 mL de una solucin de yoduro de potasio (6 en 100).
(22) Solucin de YodoMetanol para RociadoPreparar una mezcla de yodo SR y metanol (1:1).
INTRODUCCIN
Este captulo general se aplica a frmacos, excipientes y productos existentes. Toda sustancia o producto se encuentra sujeto
al control pertinente de disolventes que pudieran estar presentes en una sustancia o producto.
Generalmente no se mencionan las pruebas de disolventes residuales en las monografas especficas cuando los lmites a aplicar cumplen con los que se especifican ms adelante, ya que los disolventes empleados pueden variar de un fabricante a otro.
El objetivo de este captulo general es proporcionar las cantidades aceptables de disolventes residuales en productos farmacuticos para la seguridad del paciente. El captulo recomienda el uso de disolventes menos txicos y describe niveles considerados toxicolgicamente aceptables para algunos disolventes residuales.
Para propsitos farmacopeicos, los disolventes residuales en productos farmacuticos se definen como las sustancias qumicas orgnicas voltiles que se emplean o producen durante la fabricacin de frmacos o excipientes, o en la preparacin de
productos farmacuticos. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las tcnicas prcticas de fabricacin. La seleccin adecuada del disolvente para la sntesis de un frmaco o un excipiente puede mejorar el rendimiento o determinar caractersticas tales como la forma cristalina, la pureza y la solubilidad. Por lo tanto, a veces el disolvente puede ser un
elemento crtico en el proceso de sntesis. Este captulo general no trata los disolventes que se emplean deliberadamente como
excipientes ni los solvatos. No obstante, se debe evaluar y justificar el contenido de disolventes en tales productos.
Dado que los disolventes residuales no proporcionan ningn beneficio teraputico, deben eliminarse en lo posible, para
cumplir con las especificaciones del producto y de sus ingredientes, las buenas prcticas de fabricacin u otros requisitos basados en la calidad. Los productos farmacuticos no deben contener niveles de disolventes residuales superiores a los que permitan los datos de seguridad. Evitar el uso de disolventes que ocasionen una toxicidad inaceptable (Clase 1, Tabla 1) en la produccin de frmacos, excipientes o productos farmacuticos, a menos que su uso pueda justificarse fehacientemente mediante
una evaluacin de riesgobeneficio. Se deber limitar el uso de disolventes asociados a una toxicidad menos grave (Clase 2,
Tabla 2) para proteger a los pacientes de posibles efectos adversos. En una situacin ideal, se deberan emplear los disolventes
menos txicos (Clase 3, Tabla 3). En el Apndice 1 se proporciona la lista de todos los disolventes incluidos en este captulo
general. Estas tablas y el listado no son exhaustivos. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente para usar un disolvente nuevo que no se indica actualmente en
este captulo, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente, el lmite de disolvente residual
aprobado en el artculo y el procedimiento de prueba adecuado para dicho disolvente residual en el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa individual. Cuando se aprueba un disolvente nuevo a travs del proceso de ICH, este
disolvente nuevo se agregar a la lista correspondiente en este captulo general. En ese momento, se considerar la eliminacin
del requisito de la prueba para el disolvente especfico en la monografa individual.
Se debern analizar los frmacos, excipientes y productos farmacuticos para detectar la presencia de disolventes residuales
cuando se sepa que los procesos de purificacin o produccin dan como resultado la presencia de tales disolventes residuales.
Solamente es necesario realizar pruebas para los disolventes residuales que se emplean o producen en la purificacin o fabricacin de frmacos, excipientes o productos.
Aunque los fabricantes pueden optar por realizar una prueba al producto farmacutico, se puede emplear un procedimiento
acumulativo para calcular los niveles de disolventes residuales en el producto farmacutico a partir de los niveles en los ingre-
Captulos
467 DISOLVENTES RESIDUALES
334 467 Disolventes Residuales / Pruebas Qumicas
USP 38
dientes usados para producir el producto farmacutico. Si los clculos dan como resultado un nivel igual o inferior al proporcionado en este captulo general, no es necesario considerar la realizacin de la prueba de disolventes residuales al producto
farmacutico. Sin embargo, si el nivel calculado est por encima del nivel recomendado, se debe analizar el producto farmacutico para determinar si el proceso de formulacin redujo el nivel del disolvente correspondiente hasta la cantidad aceptable. Tambin se debe analizar un producto farmacutico si durante su fabricacin se utiliza un disolvente residual.
Para los fines de esta Farmacopea, cuando el fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente de un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del
disolvente y el lmite de disolvente residual aprobado en el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa
individual.
Ver el Apndice 2 para obtener informacin de referencia adicional sobre disolventes residuales.
Captulos
CLASIFICACIN DE DISOLVENTES RESIDUALES POR EVALUACIN DE RIESGO

El Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Qumicas (International Program on Chemical Safety, IPCS, por sus
siglas en ingls) emplea la expresin ingesta diaria tolerable (IDT) para describir los lmites de exposicin a sustancias qumicas
txicas, y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y otros institutos y autoridades sanitarias nacionales e internacionales
emplean la expresin ingesta diaria admisible (IDA). La expresin exposicin diaria permitida (EDP) se define como la ingesta
farmacuticamente admisible de disolventes residuales para evitar crear confusiones con valores diferentes de IDA de una misma sustancia.
Los disolventes residuales que se evalan en este captulo general se listan en el Apndice 1 segn su estructura y nombre
comn. Los mismos han sido evaluados en funcin del riesgo que pueden suponer para la salud humana y colocados en una
de las tres clases que figuran a continuacin:
Clase de
Disolvente
Residual
Evaluacin
Disolventes que deben evitarse.
Clase 1
Sustancias conocidas como carcingenas para los seres humanos.

Sustancias seriamente sospechosas de ser carcingenas para los seres humanos.
Sustancias que representan riesgos ambientales.
Disolventes que deben limitarse.
Clase 2
Sustancias carcingenas y no genotxicas, o posibles agentes causantes de otras toxicidades irreversibles

tales como neurotoxicidad o teratogenicidad, en animales.
Disolventes sospechosos de causar otras toxicidades importantes pero reversibles.
Disolventes con bajo potencial txico
Clase 3
Disolventes con bajo potencial txico para los seres humanos; no es necesario un lmite de exposicin
basado en el riesgo para la salud.
[NOTALos disolventes residuales de Clase 3 tienen EDP de 50 mg o ms por da.]*
* Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por da, ver las consideraciones presentadas en la seccin Clase 3 en Lmites de Disolventes Residuales.
MTODOS PARA ESTABLECER LMITES DE EXPOSICIN

El mtodo empleado para establecer la EDP respecto a disolventes residuales se presenta en el Apndice 3.
Para los artculos designados como slo para uso veterinario, se pueden justificar niveles ms elevados de EDP y de lmite
de concentracin en casos excepcionales, basados en la dosis diaria real, la especie para la cual estn destinados y los datos
toxicolgicos pertinentes, considerando el impacto sobre la seguridad del consumidor. Para los fines de esta Farmacopea,
cuando un fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente de un lmite superior, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP el lmite de disolvente residual aprobado en el artculo y la justificacin. La USP
considerar entonces este tema en la monografa individual.
OPCIONES PARA DESCRIBIR LOS LMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES DE CLASE 2

Existen dos opciones para establecer los lmites de disolventes residuales de Clase 2.
Opcin 1
Se emplean los lmites de concentracin en ppm indicados en la Tabla 2. stos se calcularon empleando la ecuacin que
figura a continuacin, suponiendo un peso de producto de 10 g administrado diariamente.
Concentracin (ppm) = (1000 mg/mg x EDP)/dosis
USP 38
En este caso, la EDP se expresa en mg por da y la dosis se expresa en g por da.

Estos lmites se consideran aceptables para todos los frmacos, excipientes y productos farmacuticos. Por lo tanto, esta opcin se puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no ha sido fijada. Si todos los frmacos y excipientes de una formulacin
cumplen con los lmites que se proporcionan en la Opcin 1, estos componentes se pueden usar en cualquier proporcin. No
es necesario realizar clculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda de 10 g. Los productos que se administran en
dosis superiores a 10 g por da se contemplan en la Opcin 2.
Opcin 2
Cantidad en la
Formulacin
(g)
Contenido de
Acetonitrilo
(ppm)
Frmaco
0,3
800
0,24
Excipiente 1
0,9
400
0,36
Componente
Exposicin
Diaria
(mg)
Excipiente 2
3,8
800
3,04
Producto farmacutico
5,0
728
3,64
El Excipiente 1 cumple con el lmite de la Opcin 1, pero el frmaco, el excipiente 2 y el producto farmacutico no cumplen
con el lmite de la Opcin 1. No obstante, el producto farmacutico cumple con el lmite de la Opcin 2 de 4,1 mg por da y de
ese modo se ajusta a los criterios de aceptacin de este captulo general.
A continuacin, se ofrece otro ejemplo que emplea acetonitrilo como disolvente residual. El peso diario mximo administrado de un producto farmacutico es 5,0 g y el producto farmacutico contiene dos excipientes. La composicin del producto
farmacutico y el contenido mximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.
Cantidad en la
Formulacin (g)
Contenido de
Acetonitrilo
(ppm)
Exposicin
Diaria
(mg)
Frmaco
0,3
800
0,24
1,80
Componente
Excipiente 1
0,9
2000
Excipiente 2
3,8
800
3,04
Producto farmacutico
5,0
1016
5,08
En este ejemplo, el producto farmacutico no cumple con el lmite de la Opcin 1 ni con el de la Opcin 2 segn esta suma. El
fabricante podra analizar el producto farmacutico para determinar si el proceso de formulacin redujo el nivel de acetonitrilo.
Si, durante la formulacin, el nivel de acetonitrilo no se redujo a los lmites permitidos, el producto no cumple con los lmites
de disolventes segn se describen en este captulo y el fabricante del producto farmacutico debe tomar otras medidas para
reducir la cantidad de acetonitrilo en el producto farmacutico. En algunos casos, el fabricante puede haber recibido la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre dicho nivel ms elevado de disolvente residual. Si ste fuera el caso, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el lmite de disolvente residual aprobado en el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa individual.
PROCEDIMIENTOS ANALTICOS
Normalmente, los disolventes residuales se determinan empleando tcnicas cromatogrficas tales como la cromatografa de
gases. Los mtodos oficiales para analizar el contenido de disolventes residuales se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes Residuales de este captulo general. Las Advertencias Generales tratan el uso de otros mtodos
en circunstancias especiales (ver 6.30. Mtodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Si estn presentes disolventes de
Clase 3, se puede usar un mtodo no especfico como por ejemplo prdida por secado.
Captulos
No se requiere que cada componente del producto farmacutico cumpla con los lmites proporcionados en la Opcin 1. Se
puede emplear la EDP expresada en mg por da segn se indica en la Tabla 2 con la dosis diaria mxima conocida y la ecuacin anteriormente mencionada, para determinar la concentracin de disolvente residual permitida en un producto farmacutico. Tales lmites se consideran aceptables, si se demuestra que el disolvente residual se ha reducido al mnimo factible. Los
lmites deben ser realistas en cuanto a la precisin analtica, la capacidad de fabricacin y la variacin razonable en el proceso
de fabricacin. Los lmites tambin deben reflejar las normas de fabricacin actuales.
La Opcin 2 se puede aplicar sumando las cantidades de disolventes residuales presentes en cada uno de los componentes
del producto farmacutico. La suma de las cantidades de disolvente por da debe ser menor que la indicada por la EDP.
A continuacin, se ofrece un ejemplo de la aplicacin de la Opcin 1 y la Opcin 2 para la concentracin de acetonitrilo en
un producto farmacutico. La exposicin diaria permitida al acetonitrilo es 4,1 mg por da; por lo tanto, el lmite de la Opcin
1 es 410 ppm. El peso diario mximo administrado de un producto farmacutico es 5,0 g y el producto farmacutico contiene
dos excipientes. La composicin del producto farmacutico y el contenido mximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.
USP 38
INFORME DE NIVELES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Los fabricantes de productos farmacuticos necesitan cierta informacin acerca del contenido de disolventes residuales en
frmacos o excipientes para cumplir con los criterios de este captulo general. Las siguientes declaraciones se proporcionan
como ejemplos aceptables de la informacin que podra ofrecer un proveedor de frmacos o excipientes a un fabricante de
productos farmacuticos. El proveedor podra escoger alguna de las que se presentan a continuacin, segn corresponda:
Es probable que estn presentes slo disolventes de Clase 3. La prdida por secado es menos de 0,5%.
Es probable que estn presentes slo los disolventes X, Y, ... de Clase 2. Todos se encuentran por debajo del lmite de la
Opcin 1. (Aqu el fabricante mencionara los disolventes de Clase 2 representados por X, Y, ...)
Es probable que estn presentes slo los disolventes X, Y, ... de Clase 2 y disolventes de Clase 3. Los disolventes residuales
de Clase 2 se encuentran por debajo del lmite de la Opcin 1 y los disolventes residuales de Clase 3 se encuentran por
debajo de 0,5%.
La frase es probable que estn presentes, segn se usa en los ejemplos anteriores, hace referencia al disolvente usado o
producido en la etapa final de fabricacin y a los disolventes usados o producidos en las etapas iniciales de fabricacin y que
no son eliminados uniformemente mediante un proceso validado.
Si es probable que estn presentes los disolventes de Clase 1, stos se deberan identificar y cuantificar. Si los disolventes de
Clase 2 3 estn presentes en cantidades superiores a los lmites de la Opcin 1 0,5%, respectivamente, stos se deben identificar y cuantificar.
Captulos
LMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Clase 1 (Disolventes que deben evitarse)
Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 1) no deben emplearse en la fabricacin de frmacos, excipientes o productos
farmacuticos debido a su inaceptable toxicidad o sus efectos ambientales perjudiciales. No obstante, si es inevitable su uso en
la fabricacin de un medicamento con una ventaja teraputica significativa, sus niveles deben estar restringidos tal como se
muestra en la Tabla 1, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual. El disolvente 1,1,1-tricloroetano se
ha incluido en la Tabla 1 debido a que representa un riesgo ambiental. El lmite indicado de 1500 ppm est basado en la revisin de datos de seguridad.
Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase 1 en la fabricacin o purificacin de frmacos, excipientes o
productos farmacuticos y no son eliminados durante el proceso, estos disolventes se deben identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes Residuales de este captulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1
(Disolventes que deben evitarse)
Disolvente
Benceno
Lmite de
Concentracin (ppm)
2
Motivo
Carcingeno
Tetracloruro de carbono
Txico y presenta riesgos para el medio ambiente
1,2-Dicloroetano
Txico
1,1-Dicloroeteno
Txico
1,1,1-Tricloroetano
1500
Presenta riesgos para el medio ambiente
Clase 2
Los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) deben estar limitados en los frmacos, excipientes y productos farmacuticos
debido a su toxicidad inherente. Las EDP se proporcionan con una aproximacin de 0,1 mg por da y las concentraciones con
una aproximacin de 10 ppm. Los valores indicados no reflejan la precisin analtica necesaria del proceso de determinacin.
La precisin se debe determinar como parte de la validacin del procedimiento.
Si los disolventes residuales de Clase 2 estn presentes en cantidades superiores a los lmites de la Opcin 1, stos se deben
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. [NOTALos siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se detectan con facilidad mediante
las condiciones de inyeccin de fase gaseosa que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirrolidona y sulfolano. Es
necesario emplear otros procedimientos validados apropiados para la cuantificacin de estos disolventes residuales. Tales procedimientos se debern remitir a la USP para su revisin y posible inclusin en la monografa individual correspondiente. Adems, puede usarse ER Mezcla CDisolventes Residuales de Clase 2 USP para desarrollar un procedimiento alternativo.]
USP 38
Disolvente
EDP
(mg/da)
Lmite de
Concentracin
(ppm)
Acetonitrilo
4,1
410
Ciclohexano
38,8
3880
Clorobenceno
3,6
360
Cloroformo
0,6
60
600
6,0
0,7
70
1,2-Dicloroeteno
18,7
1870
N,N-Dimetilacetamida
10,9
1090
N,N-Dimetilformamida
8,8
880
1,2-Dimetoxietano
1,0
100
1,4-Dioxano
3,8
380
Etilenglicol
6,2
620
2-Etoxietanol
1,6
160
Formamida
2,2
220
Hexano
2,9
290
Metanol
30,0
3000
Metilbutilcetona
0,5
50
Metilciclohexano
11,8
1180
N-Metilpirrolidona
5,3
530
2-Metoxietanol
0,5
50
Nitrometano
0,5
50
Piridina
2,0
200
Sulfolano
1,6
160
Tetrahidrofurano
7,2
720
Tetralina
1,0
100
Tolueno
8,9
890
Tricloroetileno
0,8
80
Xileno*
21,7
2170
* Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etilbenceno
Clase 3
Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3) son menos txicos y representan un riesgo menor para la
salud humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase 3 no incluye disolventes que representen un riesgo
para la salud humana a los niveles normalmente aceptados en productos farmacuticos. Sin embargo, no hay estudios de carcinogenicidad o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales de Clase 3. Los datos disponibles indican
que son menos txicos en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos en estudios de genotoxicidad.
Se considera que aquellas cantidades de disolventes residuales de 50 mg por da o menos (correspondientes a 5000 ppm o
0,5% en la Opcin 1) seran aceptables sin necesidad de justificacin. Cantidades superiores pueden tambin ser aceptables
siempre que sean realistas en relacin con la capacidad de fabricacin y las buenas prcticas de fabricacin. Para los fines de
esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobacin por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre un
nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el
lmite de disolvente residual aprobado para el artculo. La USP considerar entonces este tema en la monografa individual. Si
el lmite de disolvente de Clase 3 en una monografa individual es superior a 50 mg por da, ese disolvente residual se debe
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la seccin Identificacin, Control y Cuantificacin de Disolventes
Residuales de este captulo general, con las debidas modificaciones a las soluciones estndar, se deben aplicar siempre que sea
posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
(Limitados por las buenas prcticas de fabricacin u otros requisitos basados en la calidad en frmacos, excipientes y productos farmacuticos)
Acetato de butilo
Etanol
Acetato de etilo
ter terc-butilmetlico
Acetato de isobutilo
ter etlico
Acetato de isopropilo
Formiato de etilo
Captulos
Cloruro de metileno
Cumeno
USP 38

(Limitados por las buenas prcticas de fabricacin u otros requisitos basados en la calidad en frmacos, excipientes y productos farmacuticos)
(Continuacin)
Acetato de metilo
Heptano
Acetato de propilo
3-Metil-1-butanol
Acetona
Metiletilcetona
cido actico
Metilisobutilcetona
cido frmico
2-Metil-1-propanol
Anisol
Pentano
1-Butanol
1-Pentanol
2-Butanol
1-Propanol
Dimetil sulfxido
2-Propanol
Otros Disolventes Residuales

Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 tambin podran interesar a los fabricantes de frmacos, excipientes o
productos farmacuticos. No obstante, no se han encontrado datos toxicolgicos adecuados para fundamentar una EDP.
Tabla 4. Otros Disolventes Residuales
(Para los cuales no se han encontrado datos toxicolgicos adecuados)
Captulos
cido tricloroactico
ter isoproplico
cido trifluoroactico
ter de petrleo
1,1-Dietoxipropano
Isooctano
1,1-Dimetoximetano
Metil isopropil cetona
2,2-Dimetoxipropano
Metiltetrahidrofurano
IDENTIFICACIN, CONTROL Y CUANTIFICACIN DE DISOLVENTES RESIDUALES

Siempre que sea posible, la sustancia en anlisis debe disolverse para liberar el disolvente residual. Dado que la USP se ocupa
de productos farmacuticos, as como de ingredientes activos y excipientes, a veces puede ser aceptable que algunos de los
componentes de la formulacin no se disuelvan por completo. En tales casos, puede ser necesario reducir el producto farmacutico primero a polvo fino, de manera que se pueda liberar cualquier disolvente residual que pudiera estar presente. Esta
operacin debe realizarse lo ms rpido posible para evitar la prdida de disolventes voltiles durante el procedimiento.
[NOTAEl agua exenta de sustancias orgnicas que se especifica en los siguientes procedimientos no produce picos que interfieran significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografa.]
Disolventes Residuales de Clase 1 y Clase 2

Los siguientes procedimientos son tiles para identificar y cuantificar disolventes residuales cuando no est disponible la informacin acerca de los disolventes residuales que pudieran estar presentes en el material. Cuando la informacin acerca de la
presencia de disolventes residuales especficos est disponible, slo es necesario llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar
la cantidad de disolventes residuales presentes. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo para la aplicacin de las pruebas de
lmite de disolventes residuales.
ARTCULOS SOLUBLES EN AGUA
Procedimiento A
Solucin Madre del Estndar de Clase 1[NOTAAl transferir las soluciones, colocar la punta de la pipeta justo por debajo de
la superficie del lquido y mezclar.] Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 9 mL de dimetil sulfxido, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado
aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 10 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Solucin Estndar de Clase 1Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase
gaseosa apropiado que contenga 5,0 mL de agua (colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del lquido
para dispensar), tapar y mezclar.
USP 38
Captulos
Fig. 1. Diagrama relativo a la identificacin de disolventes residuales y la aplicacin de pruebas de lmite.

Soluciones Madre del Estndar de Clase 2Transferir 1,0 mL de ER Mezcla ADisolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumtrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre A del Estndar de Clase 2. Transferir 1,0 mL de ER Mezcla BDisolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumtrico de 100 mL, diluir con agua a
volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre B del Estndar de Clase 2.
Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2Transferir 1,0 mL de Solucin Madre A del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2Transferir 5,0 mL de Solucin Madre B del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de PruebaTransferir aproximadamente 250 mg del artculo en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 25 mL, disolver y diluir con agua a volumen, y mezclar.
Solucin de PruebaTransferir 5,0 mL de Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de la Solucin Madre de Prueba, tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama y una columna de slice fundida de 0,32 mm 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 mm o una columna
macrocapilar de 0,53 mm 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 mm. El gas transportador es nitrgeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1:5. [NOTALa relacin de particin
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40 durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 10 por minuto hasta 240 y mantenerla a 240 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
USP 38
del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 1, la
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma segn se indica
en Procedimiento: la relacin seal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin
seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento[NOTASe recomienda incrementar la temperatura de la lnea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (siguiendo alguno de los sets
de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase
2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de cualquier
pico diferente del pico de 1,1,1-tricloroetano en la Solucin de Prueba es mayor o igual a la del pico correspondiente en la
Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de 1,1,1tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1,1,1-tricloroetano en la Solucin Estndar
de Clase 1, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artculo cumple con los
requisitos de esta prueba.
Tabla 5. Parmetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa
Sets de Parmetros Operativos
para el Inyector de Fase Gaseosa
Captulos
Temperatura de equilibrio ()
80
105
80
Tiempo de equilibrio (min)
60
45
45
Temperatura de lnea de transferencia () (si corresponde)
85
110
105
8090
105115
8090
60
60
60
Temperatura de la jeringa () (si corresponde)

Gas transportador: nitrgeno o helio a una presin adecuada
Tiempo de presurizacin (s) (si corresponde)
Volumen de inyeccin (mL)*
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del mtodo. Se permite inyectar una cantidad menor
a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.
Procedimiento B
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Soluciones Madre del Estndar de Clase 2, Solucin
Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2, Solucin Madre de Prueba, Solucin de Prueba y Solucin de
Aptitud del Sistema de Clase 1Preparar segn se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama y una columna de slice fundida de 0,32 mm 30 m recubierta con una capa de fase G16 de 0,25 mm o una columna
macrocapilar de 0,53 mm 30 m recubierta con una capa de fase G16 de 0,25 mm. El gas transportador es nitrgeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1:5. [NOTALa relacin de particin
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 50 durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 6 por minuto hasta 165 y mantenerla a 165 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del
inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 1 y la Solucin
de Aptitud del Sistema de Clase 1, y registrar el cromatograma segn se indica en Procedimiento: la relacin seal-ruido del benceno en la Solucin Estndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del
Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo y cis-dicloroeteno en la Solucin Estndar Mezcla A de
Clase 2 no es menor de 1,0.
de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa, descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de
Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si las respuestas de los
picos en la Solucin de Prueba de los picos identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los picos correspondientes en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el
Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Madre A del Estndar de Clase 2, Solucin
Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Madre de Prueba, Solucin de Prueba y Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1Preparar segn se indica en Procedimiento A.
Solucin Madre del Estndar [NOTAPreparar por separado una Solucin Madre del Estndar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para los disolventes de Clase 1 diferentes de 1,1,1-tricloroetano, preparar la primera dilucin segn se indica para la primera dilucin en Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estndar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
USP 38
5(C/W)[rU /(rST rU)]

en donde C es la concentracin, en mg por mL, del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin Madre del Estndar; W es el peso, en g, del artculo en anlisis tomado para preparar la Solucin Madre de Prueba; y rU y rST son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solucin de Prueba y la Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, respectivamente.
ARTCULOS INSOLUBLES EN AGUA
Procedimiento A[NOTASe puede usar dimetil sulfxido como disolvente alternativo en lugar de dimetilformamida.]
Solucin Madre del Estndar de Clase 1Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar (reservar una porcin de esta solucin para la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1). Transferir 1,0 mL de esta solucin a un
matraz volumtrico de 10 mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Solucin Estndar de Clase 1Transferir 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar de Clase 1 a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Soluciones Madre del Estndar de Clase 2Transferir 1,0 mL de ER Mezcla ADisolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumtrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. sta es la Solucin Madre A del Estndar de Clase 2. Transferir 0,5 mL de ER Mezcla B
Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumtrico de 10 mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
sta es la Solucin Madre B del Estndar de Clase 2.
Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2Transferir 1,0 mL de Solucin Madre A del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2Transferir 1,0 mL de Solucin Madre B del Estndar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de PruebaTransferir aproximadamente 500 mg del artculo en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumtrico de 10 mL, disolver y diluir con dimetilformamida a volumen, y mezclar.
Solucin de PruebaTransferir 1,0 mL de Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Captulos
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solucin con una concentracin final de 1/20 del valor indicado
en la Tabla 1 2 (en Lmite de Concentracin).
Solucin EstndarTransferir 1,0 mL de esta solucin a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 5,0 mL de
agua, tapar y mezclar.
Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada[NOTAPreparar por separado una Solucin de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de
Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 1,0 mL de Solucin Madre del Estndar,
tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)[NOTASi se verifica que los resultados de la cromatografa del Procedimiento A son inferiores a los del Procedimiento B, se puede sustituir el Sistema Cromatogrfico del Procedimiento B.] Equipar un
cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama y una columna de slice fundida de 0,32 mm 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 mm o una columna macrocapilar de 0,53 mm 30 m recubierta con una capa de fase G43
de 3,0 mm. El gas transportador es nitrgeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de
particin de 1:5. [NOTALa relacin de particin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura
de la columna a 40 durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 10 por minuto hasta 240 y mantenerla a 240
durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 1, la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2,
y registrar el cromatograma segn se indica en Procedimiento: la relacin seal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es
menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor
de 1,0.
de parmetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volmenes iguales de fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar, Solucin de Prueba y Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artculo en anlisis, por la frmula:
Captulos
USP 38
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1Mezclar 5 mL de la Solucin Madre de Prueba con 0,5 mL de la dilucin intermedia reservada de la Solucin Madre del Estndar de Clase 1. Transferir 1,0 mL de esta solucin a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar el cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama y una columna macrocapilar de 0,53 mm 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 mm. El gas transportador es
helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relacin de particin de 1:3. [NOTALa relacin de particin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40 durante 20 minutos, luego aumentarla a una velocidad de 10 por minuto hasta 240 y mantenerla a 240 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140 y 250, respectivamente. Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar de Clase 1, la
Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma segn se indica
en Procedimiento: la relacin seal-ruido de 1,1,1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 1 no es menor de 5; la relacin
seal-ruido de cada pico en la Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolucin, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
cualquier condensacin potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatgrafo (usar los sets de parmetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 10 psi) volmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase
2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos
principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1,1,1-tricloroetano, en la Solucin de Prueba es mayor o igual
al pico correspondiente en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, o si
la respuesta del pico de 1,1,1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1,1,1-tricloroetano en la Solucin Estndar de Clase 1, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento B
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1, Soluciones
Madre del Estndar de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2, Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2, Solucin Madre de
Prueba y Solucin de PruebaPreparar segn se indica en Procedimiento A.
Sistema CromatogrficoProceder segn se indica en Procedimiento B en Artculos Solubles en Agua con una relacin de particin de 1:3. [NOTALa relacin de particin puede modificarse para optimizar la sensibilidad.]
operativos para inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 10 psi) volmenes
iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar de Clase 1, Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2,
Solucin Estndar Mezcla B de Clase 2 y Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de los picos identificados en la Solucin de Prueba en el Procedimiento A son mayores o iguales a los picos
correspondientes en la Solucin Estndar de Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estndar Mezcla de Clase 2, llevar a
cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artculo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solucin Madre del Estndar de Clase 1, Solucin Estndar de Clase 1, Solucin de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solucin Madre
A del Estndar de Clase 2 y Solucin Estndar Mezcla A de Clase 2Proceder segn se indica en Procedimiento A.
Solucin Madre del Estndar [NOTAPreparar por separado una Solucin Madre del Estndar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para disolventes de Clase 1 diferentes de 1,1,1-tricloroetano, preparar la primera
dilucin segn se indica para la primera dilucin en Solucin Madre del Estndar de Clase 1 en el Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estndar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente residual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solucin con una concentracin final de 1/20 del valor especificado en la Tabla 1 o Tabla 2 (en Lmite de Concentracin).
Solucin EstndarTransferir 1,0 mL de la Solucin Madre del Estndar a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado,
que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin Madre de PruebaProceder segn se indica en Procedimiento A.
Solucin de PruebaTransferir 1,0 mL de la Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada [NOTAPreparar por separado una Solucin de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 1,0 mL de
Solucin Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1 mL de Solucin Madre del Estndar y 4,0
mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema CromatogrficoProceder segn se indica en Procedimiento C en Artculos Solubles en Agua.
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presin del vial de 10 psi) volmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solucin Estndar, Solucin de Prueba y Solucin de Prueba con una
USP 38
Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad,
en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artculo en anlisis, por la frmula:
10(C/W)[rU /(rST rU)]
en donde C es la concentracin, en mg por mL, del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin Madre del Estndar; W es el peso, en g, del artculo en anlisis tomado para preparar la Solucin Madre de Prueba; y rU y rST son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solucin de Prueba y la Solucin de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, respectivamente.
Disolventes Residuales de Clase 3

Si estn presentes los disolventes de Clase 3, el nivel de disolventes residuales se puede determinar segn se indica en Prdida por Secado 731 cuando la monografa del artculo en anlisis incluye un procedimiento de prdida por secado que especifique un lmite superior de no ms de 0,5% (de acuerdo con la Opcin 1 en este capitulo general), o se puede realizar una
determinacin especfica del disolvente. Si la monografa del artculo en anlisis no incluye un procedimiento de prdida por
secado o si el lmite de disolvente de Clase 3 en una monografa individual es superior a 50 mg por da (lo que corresponde a
5000 ppm 0,5% en la Opcin 1), el disolvente residual de Clase 3 individual o los disolventes presentes en el artculo en
anlisis se deben identificar y cuantificar, aplicando los procedimientos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones
a las soluciones estndar, siempre que sea posible. Si ste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. En estos procedimientos se deben usar Estndares de Referencia USP, siempre que estn disponibles.
Carcingenos genotxicos: Son carcingenos que producen cncer al afectar los genes o cromosomas.
Exposicin diaria permitida (EDP): La mxima ingesta diaria admisible de un disolvente residual en productos farmacuticos.
Factor de modificacin: Un factor determinado segn el criterio profesional de un toxiclogo y que se aplica a datos de valoraciones biolgicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres humanos de manera segura.
Ingesta diaria admisible (IDA): La mxima ingesta diaria admisible de sustancias qumicas txicas. Este trmino es empleado
por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS).
Ingesta diaria tolerable (IDT): La exposicin diaria tolerable a sustancias qumicas txicas. Este trmino es empleado por el
Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Qumicas (IPCS).
Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar efectos adversos en el sistema nervioso.
Nivel mnimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en ingls): La dosis mnima de una sustancia en un estudio o grupo de
estudios que produce un incremento biolgicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los
seres humanos o animales expuestos a esta sustancia.
Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en ingls): La dosis mxima de una sustancia que no produce un incremento
biolgicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales expuestos a
esta sustancia.
Sustancias seriamente sospechosas de carcinogenidad para los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay evidencia epidemiolgica de carcinognesis pero de la que existen datos de genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinognesis en
roedores.
Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra
una sustancia durante el embarazo.
Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados por una sustancia que desaparecen cuando termina la exposicin.
LISTA DEL APNDICE 1.

Ver la tabla Apndice 1. Lista de Disolventes Residuales Incluidos en Este Captulo General.
APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL
Disolvente
Acetato de butilo
Otros nombres
ster butlico del cido actico
Acetato de etilo
ster etlico del cido actico
Acetato de isobutilo
ster isobutlico del cido actico
Acetato de isopropilo
ster isoproplico del cido

actico
Acetato de metilo
ster metlico del cido actico
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
Estructura
Clase
CH3COO(CH2)3CH3
Clase 3
CH3COOCH2CH3
Clase 3
CH3COOCH2CH(CH3)2
Clase 3
CH3COOCH(CH3)2
Clase 3
CH3COOCH3
Clase 3
Captulos
GLOSARIO
USP 38
APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL (Continuacin)

Disolvente
Otros nombres
Acetato de propilo
ster proplico del cido actico
Acetona
2-Propanona
Propan-2-ona
Acetonitrilo
cido actico
cido etanoico
Captulos
cido frmico
Estructura
Clase
CH3COOCH2CH2CH3
Clase 3
CH3COCH3
Clase 3
CH3CN
Clase 2
CH3COOH
Clase 3
HCOOH
Clase 3
Anisol
Metoxibenceno
Clase 3
Benceno
Benzol
Clase 1
1-Butanol
Alcohol n-butlico
Butan-1-ol
2-Butanol
Alcohol sec-butlico
Butan-2-ol
Ciclohexano
Hexametileno
CH3(CH2)3OH
Clase 3
CH3CH2CH(OH)CH3
Clase 3
Clase 2
Clorobenceno
Clase 2
Cloroformo
Triclorometano
CHCl3
Clase 2
Cloruro de metileno
Diclorometano
CH2Cl2
Clase 2
Cumeno
Isopropilbenceno
(1-Metiletil)benceno
1,2-Dicloroetano
sim-Dicloroetano
Dicloruro de etileno
Cloruro de etileno
CH2ClCH2Cl
Clase 1
1,1-Dicloroeteno
1,1-Dicloroetileno
Cloruro de vinilideno
H2C=CCl2
Clase 1
1,2-Dicloroeteno
1,2-Dicloroetileno
Dicloruro de acetileno
ClHC=CHCl
Clase 2
N,N-Dimetilacetamida
DMA
CH3CON(CH3)2
Clase 2
N,N-Dimetilformamida
DMF
HCON(CH3)2
Clase 2
Dimetil sulfxido
Metilsulfinilmetano
Metil sulfxido
DMSO
(CH3)2SO
Clase 3
1,2-Dimetoxietano
ter dimetlico de etilenglicol

Monoglima
Dimetil celosolve
H3COCH2CH2OCH3
Clase 2
1,4-Dioxano
p-Dioxano
[1,4]Dioxano
Etanol
Alcohol etlico
ter terc-butilmetlico
2-Metoxi-2-metilpropano
Clase 2
Clase 2
CH3CH2OH
Clase 3
(CH3)3COCH3
Clase 3
ter etlico
ter dietlico
Etoxietano
1,1-Oxibisetano
CH3CH2OCH2CH3
Clase 3
Etilenglicol
1,2-Dihidroxietano
1,2-Etanodiol
HOCH2CH2OH
Clase 2
2-Etoxietanol
Celosolve
Formamida
Metanamida
Formiato de etilo
Heptano
CH3CH2OCH2CH2OH
Clase 2
HCONH2
Clase 2
ster etlico del cido frmico
HCOOCH2CH3
Clase 3
n-Heptano
CH3(CH2)5CH3
Clase 3
Hexano
n-Hexano
CH3(CH2)4CH3
Clase 2
Metanol
Alcohol metlico
CH3OH
Clase 2
USP 38
APNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPTULO GENERAL (Continuacin)

Disolvente
Otros nombres
3-Metil-1-butanol
Alcohol isoamlico
Alcohol isopentlico
3-Metilbutan-1-ol
Metilbutilcetona
2-Hexanona
Hexan-2-ona
Estructura
Clase
(CH3)2CHCH2CH2OH
Clase 3
CH3(CH2)3COCH3
Clase 2
Metilciclohexano
Ciclohexilmetano
Metiletilcetona
2-Butanona
MEK
Butan-2-ona
Metil isobutil cetona
4-Metilpentan-2-ona
4-Metil-2-pentanona
MIBK
N-Metilpirrolidona
1-Metilpirrolidin-2-ona
1-Metil-2-pirrolidinona
2-Metil-1-propanol
Alcohol isobutlico
2-Metilpropan-1-ol
(CH3)2CHCH2OH
Clase 3
2-Metoxietanol
Metil celosolve
CH3OCH2CH2OH
Clase 2
Pentano
n-Pentano
1-Pentanol
Alcohol amlico
Pentan-1-ol
Alcohol pentlico
CH3CH2COCH3
Clase 3
CH3COCH2CH(CH3)2
Clase 3
Clase 2
CH3NO2
Clase 2
CH3(CH2)3CH3
Clase 3
CH3(CH2)3CH2OH
Clase 3
Piridina
Clase 2
1-Propanol
Propan-1-ol
Alcohol proplico
2-Propanol
Propan-2-ol
Alcohol isoproplico
Sulfolano
1,1-Dixido de
tetrahidrotiofeno
Tetracloruro de carbono
Tetraclorometano
Tetrahidrofurano
xido de tetrametileno
Oxaciclopentano
Clase 2
Tetralina
1,2,3,4-Tetrahidronaftaleno
Clase 2
Tolueno
Metilbenceno
1,1,1-Tricloroetano
Metilcloroformo
Tricloroetileno
1,1,2-Tricloroeteno
Xileno*
Dimetilbenceno
Xilol
CH3CH2CH2OH
Clase 3
(CH3)2CHOH
Clase 3
Clase 2
CCl4
Clase 1
Clase 2
CH3CCl3
Clase 1
HClC=CCl2
Clase 2
Clase 2
APNDICE 2. REFERENCIA ADICIONAL

A2.1. Reglamentacin Ambiental de Disolventes Orgnicos Voltiles
Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en la elaboracin de productos farmacuticos figuran como
productos qumicos txicos en las monografas de los Criterios Sanitarios Ambientales (EHC, por sus siglas en ingls) y en el
Sistema Integrado de Informacin de Riesgo (IRIS, por sus siglas en ingls). Entre los objetivos de grupos tales como el Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Qumicas (IPCS, por sus siglas en ingls), la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en ingls) y la Administracin de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA, por sus siglas en ingls) se incluye la determinacin de niveles de exposicin admisibles. Su propsito es mante-
Captulos
Nitrometano
Clase 2
USP 38
ner la integridad medioambiental y proteger la salud de los seres humanos frente a los posibles efectos nocivos de las sustancias qumicas ocasionados por una exposicin medioambiental a largo plazo. Los procedimientos relativos a la estimacin de
los lmites de exposicin mxima segura estn basados generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles
datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios a plazos ms cortos modificando el mtodo, por ejemplo
empleando factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos documentos se refiere en primer lugar a la exposicin a
largo plazo o durante toda la vida de la poblacin general al medio ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua
potable y otros medios).
Captulos
A2.2. Disolventes Residuales en Productos Farmacuticos

Los lmites de exposicin que figuran en este captulo general estn establecidos con respecto a metodologas y datos de
toxicidad descritos en monografas del EHC e IRIS. Sin embargo, se deben tener en cuenta al establecer los lmites de exposicin las siguientes suposiciones especficas sobre los disolventes residuales que se emplearn en la sntesis y formulacin de
productos farmacuticos.
1. Los pacientes (no la poblacin en general) emplean los productos farmacuticos para tratar sus enfermedades o como
profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades.
2. La suposicin de una exposicin del paciente durante toda su vida no es necesaria para la mayora de los productos farmacuticos, pero puede ser adecuada como hiptesis de trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos.
3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la produccin de productos farmacuticos y a menudo son parte de los productos medicinales.
4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes residuales salvo en circunstancias excepcionales.
5. Los datos de los estudios toxicolgicos que se emplean para determinar los niveles admisibles de disolventes residuales
deben provenir de protocolos apropiados, como por ejemplo los que describen la Organizacin para la Cooperacin y el
Desarrollo Econmico (OECD, por sus siglas en ingls), la EPA y el Libro Rojo de la FDA.
APNDICE 3. PROCEDIMIENTOS PARA ESTABLECER LMITES DE EXPOSICIN

El mtodo Gaylor-Kodell para la evaluacin del riesgo (Gaylor, D. W. y Kodell, R. L., Linear Interpolation Algorithm for Low
Dose Assessment of Toxic Substance. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, 4:305, 1980) es apropiado para los
disolventes carcinognicos de Clase 1. Solamente cuando se dispone de datos fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse
una extrapolacin mediante modelos matemticos para fijar lmites de exposicin. Los lmites de exposicin para los disolventes residuales de Clase 1 podran determinarse empleando un factor de seguridad mayor (es decir, de 10 000 a 100 000) con
respecto al nivel sin efecto observable (NOEL). La deteccin y la cuantificacin de estos disolventes residuales se efectan mediante tcnicas analticas de ltima generacin.
Los niveles de exposicin admisibles que figuran en este captulo general para los disolventes residuales de Clase 2 se establecieron mediante el clculo de los valores de EDP conforme a los procedimientos para fijar lmites de exposicin en productos farmacuticos (pgina 5748 del PF 15(6) [nov.dic. 1989]) y el mtodo adoptado por la IPCS para la Evaluacin del Riesgo
para la Salud Humana de los Productos Qumicos [Assessing Human Health Risk of Chemicals (Environmental Health Criteria
170, OMS, 1994)]. Estos procedimientos son similares a los que emplea la EPA de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Estados Unidos (Libro Rojo) y otros organismos. El mtodo se describe en este documento para facilitar la comprensin del origen
de los valores de EDP. No es necesario realizar estos clculos para emplear los valores de EDP que figuran en la Tabla 2 de este
documento.
La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL) o del nivel mnimo de efecto observable (LOEL), en los estudios ms
importantes en animales, de la siguiente manera:
EDP = (NOEL Ajuste por Peso)/(F1 F2 F3 F4 F5)
(1)
La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de
modificacin que se proponen en este documento para relacionar datos con seres humanos son del mismo tipo que los factores de incertidumbre empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales (Environmental Health Criteria 170, OMS, Ginebra,
1994) y los factores de modificacin o los factores de seguridad en el Pharmacopeial Forum. La suposicin de una exposicin sistmica del 100% se emplea en todos los clculos sin tener en cuenta la va de administracin.
Los factores de modificacin son los siguientes:
F1 =
Un factor que representa la extrapolacin entre especies

F1 =
2 para extrapolacin de perros a seres humanos
F1 =
2,5 para extrapolacin de conejos a seres humanos
F1 =
3 para extrapolacin de monos a seres humanos
F1 =
5 para extrapolacin de ratas a seres humanos
F1 =
10 para extrapolacin de otros animales a seres humanos
F1 =
12 para extrapolacin de ratones a seres humanos
USP 38
El factor F1 tiene en cuenta la relacin comparativa entre el rea de superficie y el peso corporal de las especies involucradas y
de los seres humanos. El rea de superficie (S) se calcula como:
S = kM0,67
(2)
en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor 10. Los pesos corporales empleados en la ecuacin
figuran a continuacin en la Tabla A3.1.
F2 =
F3 =
Un factor de 10 representa la variabilidad entre individuos. Por lo general, se proporciona un factor de 10 para todos los disolventes orgnicos y 10 se usa en todo este captulo general.
Un factor de variabilidad que representa los estudios de toxicidad por exposicin a corto plazo.
F3 =
1 para estudios con una duracin de al menos la mitad del ciclo vital (1 ao para roedores o conejos; 7 aos para gatos, perros
y monos).
F3 =
1 para estudios reproductivos que cubren el periodo completo de organognesis.
F3 =
2 para un estudio de 6 meses en roedores o de 3,5 aos en no roedores.
F3 =
5 para un estudio de 3 meses en roedores o de 2 aos en no roedores.
F3 =
10 para estudios de ms corta duracin.
En todos los casos, se ha empleado el factor ms alto para los estudios con una duracin intermedia (p.ej., un factor de 2 para
un estudio de 9 meses en roedores).
F4 =
F4 =
1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4 =
5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna
F4 =
5 para un efecto teratognico con toxicidad materna
F4 =
10 para un efecto teratognico sin toxicidad materna
Un factor variable que se puede aplicar si no se ha establecido un nivel sin efecto.
Cuando slo est disponible un LOEL, se puede emplear un factor de hasta 10 dependiendo de la gravedad de la toxicidad.
Para el ajuste por peso, se supone un peso corporal arbitrario para humanos adultos para ambos sexos de 50 kilogramos (kg).
Este peso relativamente bajo proporciona un factor de seguridad adicional con respecto a los pesos estndar de 60 70 kg
que se usan a menudo en este tipo de clculos. Se reconoce que algunos pacientes adultos pesan menos de 50 kg; se considera que estos pacientes se incluyen mediante los factores de seguridad empleados para determinar una EDP. Si el disolvente
estaba presente en una formulacin especficamente destinada para uso peditrico, sera apropiado realizar un ajuste para un
peso corporal inferior.
Como ejemplo de la aplicacin de esta ecuacin, se considera un estudio de toxicidad de acetonitrilo en ratones que est
resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, N 1, Suplemento, abril 1997, pgina S24. Se calcula que el NOEL es de 50,7 mg kg1 da1.
La EDP para el acetonitrilo en este estudio se calcula de la siguiente manera:
EDP = (50,7 mg kg1 da1 50 kg)/(12 10 5 1 1) = 4,22 mg da1
En este ejemplo,
F1 =
12 representa la extrapolacin de ratones a seres humanos
F2 =
10 representa las diferencias entre seres humanos individuales
F3 =
5 porque la duracin del estudio fue de slo 13 semanas
F4 =
1 porque no se encontr toxicidad grave
F5 =
1 porque se determin el nivel sin efecto

A3.1. Valores Empleados en los Clculos en este Documento
Peso corporal de ratas
425 g
Peso corporal de ratas preadas
330 g
Peso corporal de ratones
28 g
Peso corporal de ratonas preadas
30 g
Peso corporal de cobayos
500 g
Peso corporal de monos Rhesus
2,5 kg
Peso corporal de conejas (preadas o no)
4 kg
Peso corporal de perros Beagle
11,5 kg
Volumen respiratorio de ratas
290 L/da
Captulos
F5 =
Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, p.ej., carcinogenicidad no genotxica, neurotoxicidad o teratogenicidad. En
estudios de toxicidad reproductiva, se emplean los siguientes factores:
USP 38
A3.1. Valores Empleados en los Clculos en este Documento (Continuacin)

Volumen respiratorio de ratones
43 L/da
Volumen respiratorio de conejos
1440 L/da
Volumen respiratorio de cobayos
430 L/da
Volumen respiratorio de humanos
28 800 L/da
Volumen respiratorio de perros
9000 L/da
Volumen respiratorio de monos
1150 L/da
Consumo de agua de ratones
5 mL/da
Consumo de agua de ratas
30 mL/da
Consumo de alimentos de ratas
30 g/da
Se emplea la ecuacin de gases ideales, PV = nRT, para convertir las concentraciones de gases empleados en estudios de
inhalacin de unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m3. Se propone como ejemplo un estudio de toxicidad reproductiva en ratas por inhalacin de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, N 1, Suplemento, abril 1997, pgina S9.
Captulos
La relacin 1000 L = 1 m3 se emplea para convertir los valores a mg/m3.
469 ETILENGLICOL, DIETILENGLICOL Y TRIETILENGLICOL EN SUSTANCIAS

ETOXILADAS
El siguiente procedimiento se usa para determinar la concentracin de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales en
productos etoxilados. Los productos etoxilados pueden contener etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales como
resultado del proceso de fabricacin. El procedimiento es adecuado para las siguientes sustancias:
1. Polietilenglicol 200
6. Polisorbato 20
7. Polisorbato 40
8. Polisorbato 60
9. Polisorbato 80
10. Polietilenglicol monometil ter 350
11. Polietilenglicol monometil ter 550
12. Aceite de ricino polioxilado 35
13. Hidroxiestearato de polioxilo 15
14. Polioxil 20 cetoestearil ter
15. Estearato de polioxilo 8
16. Octoxinol 9
17. Nonoxinol 9
IMPUREZAS
PROCEDIMIENTO
Diluyente: Acetona
Solucin estndar: 25 mg/mL de ER Etilenglicol USP, 40 mg/mL de ER Dietilenglicol USP, 40 mg/mL de ER Trietilenglicol
USP y 40 mg/mL de ER 1,3-Butanodiol USP (estndar interno) en Diluyente
Solucin muestra: 40 mg/mL de la sustancia de prueba y 40 mg/mL de ER 1,3-Butanodiol USP (estndar interno) en Diluyente
Modo: Cromatografa de Gases
Columna: Capilar, de 0,53 mm 30 m; ligada con una capa de fase G3 de 1,0 mm
Temperaturas
Detector: 290
Inyector: 270
Columna: Ver la Tabla 1.
Pruebas Qumicas / 469 Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol 349
USP 38
Tabla 1
Temperatura
Final
()

a la Temperatura
Final
(min)
10
60
10
170
15
280
0; 60a
Temperatura
Inicial
()
Rampa de
Temperatura
(/min)
40
60
170
El tiempo de espera fue de 0 minutos para la Solucin estndar y 60 minutos para la Solucin muestra y el Diluyente.

Volumen de inyeccin: 1,0 mL
Tipo de inyeccin: Dividida; relacin de particin, 2:1
Camisa del inyector (liner): Dispositivo comn desactivado, para sistemas de inyeccin con o sin divisin, ahusado (taper) y con lana de vidrio, para propsitos generales
Tiempo de corrida: 26 minutos para la Solucin estndar; 86 minutos para la Solucin muestra y el Diluyente
Aptitud del sistema
[NOTAVer la Tabla 2 para los tiempos de retencin relativos.]
Tabla 2
Nombre
Etilenglicol
0,45
1,3-Butanodiol (estndar interno)
1,00
Dietilenglicol
1,25
Trietilenglicol
1,70
Requisitos de aptitud del sistema

Resolucin: No menos de 20 entre etilenglicol y 1,3-butanodiol; no menos de 20 entre 1,3-butanodiol y dietilenglicol;
no menos de 20 entre dietilenglicol y trietilenglicol
Factor de asimetra: 0,81,8 para cada uno de los cuatro picos asignados a etilenglicol, 1,3-butanodiol, dietilenglicol y
trietilenglicol
Desviacin estndar relativa: No ms de 5,0% para el cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) y el estndar interno
Anlisis
Identificar los picos de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol en la Solucin muestra por comparacin con los de la Solucin estndar.
Calcular el contenido de etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol, en mg/g, en la porcin de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = (RU/RS) (CS/CU) F
RU
RS
CS
CU
F
= cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estndar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estndar interno) de la Solucin muestra
= cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estndar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estndar interno) de la Solucin estndar
= concentracin del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) en la Solucin estndar (mg/mL)
= concentracin de la sustancia de prueba en la Solucin muestra (mg/mL)
= factor de conversin (1000 mg/g)
ER 1,3-Butanodiol USP
ER Dietilenglicol USP
ER Etilenglicol USP
ER Trietilenglicol USP
Captulos
Tiempo de
Retencin
Relativo
350 471 Combustin en Matraz con Oxgeno / Pruebas Qumicas
USP 38
471 COMBUSTIN EN MATRAZ CON OXGENO
Captulos
El procedimiento de combustin en matraz con oxgeno constituye el paso preparatorio en la determinacin de bromo, cloro, yodo, selenio y azufre en algunos artculos farmacopeicos. La combustin del material en anlisis (generalmente orgnico)
produce compuestos inorgnicos hidrosolubles, los cuales se analizan para determinar los elementos especficos, segn se indica en la monografa individual o en el captulo general.
La advertencia que figura en el Procedimiento slo indica las precauciones de seguridad mnimas y subraya la necesidad de
proceder con extremo cuidado en todas las etapas.
AparatoEl aparato1 consta de un matraz Erlenmeyer de paredes gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de
copa, de 500 mL de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), equipado con un tapn de vidrio esmerilado al que se ha soldado un dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un alambre de platino grueso y un
pieza de malla de platino soldada de aproximadamente 1,5 2 cm.
Aparato para la Combustin en Matraz con Oxgeno

Procedimiento[PrecaucinUsar lentes de seguridad y colocar una proteccin de seguridad adecuada entre el aparato y usted. Tomar las precauciones necesarias para asegurar que el matraz est perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de
disolventes orgnicos.] Si se trata de un slido, pesar la sustancia colocndola sobre un trozo de papel de filtro exento de haluros de aproximadamente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el slido quede envuelto por aquel. Si se trata de
sustancias lquidas, pesarlas en cpsulas taradas; las cpsulas de policarbonato1 se utilizan para lquidos cuyos volmenes no
excedan de 200 mL, mientras que las cpsulas de gelatina resultan adecuadas para volmenes mayores. [NOTAEs posible que
las cpsulas de gelatina contengan cantidades significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo de cpsulas,
efectuar una determinacin con un blanco y realizar las correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de
filtro, a modo de mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar en el matraz el lquido absorbente especificado en la monografa individual o en el captulo general, humedecer la junta del tapn con agua y desplazar el aire del matraz con una
corriente rpida de oxgeno, agitando el lquido por rotacin moderada para favorecer la absorcin de oxgeno. [NOTALa
saturacin del lquido con oxgeno es clave para el xito del procedimiento de combustin.] Encender la tira de papel de filtro
por medios adecuados. Si se enciende la tira fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra en el matraz, invertir el matraz para que la solucin de absorcin selle el tapn y sostener el tapn en su lugar con firmeza. Se puede
omitir la inversin del matraz si se enciende en un sistema cerrado. Una vez finalizada la combustin, agitar el matraz vigorosamente y dejarlo en reposo durante no menos de 10 minutos agitando intermitentemente. Luego proceder segn se indica en
la monografa individual o en el captulo general.
481 VALORACIN DE RIBOFLAVINA

El siguiente procedimiento es apropiado para las preparaciones donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una
mezcla de varios ingredientes. Al emplearlo, se debe mantener el pH de las soluciones por debajo de 7,0 y proteger las soluciones de la luz solar directa en todo momento.
Estndares de Referencia USP 11ER Riboflavina USP.
Solucin Madre del Estndar de RiboflavinaA 50,0 mg de ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la
luz en un desecador sobre pentxido de fsforo, agregar aproximadamente 300 mL de cido actico 0,02 N y calentar la
mezcla en un bao de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya disuelto. Luego enfriar, agregar cido
actico 0,02 N para obtener 500 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
1 Thomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, NJ 08085 provee un aparato [Nmeros de Catlogo 6513-C20 (de 500 mL de capacidad) y
6513-C30 (de 1000 mL de capacidad)] y cpsulas [Nmero de Catlogo 6513-84 (1000 cpsulas)] adecuados.
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Pruebas Qumicas / 501 Sales de Bases Orgnicas Nitrogenadas 351
0,0001(IU IB)/(IS IU).

Calcular la cantidad, en mg, de C17H20N4O6 en cada cpsula o tableta.
501 SALES DE BASES ORGNICAS NITROGENADAS

Preparacin EstndarA menos que se indique algo diferente, preparar una solucin en cido sulfrico diluido (1 en 70)
que contenga, en cada mL, aproximadamente 500 mg del Estndar de Referencia USP especificado, calculados con respecto a
la sustancia anhidra y pesados con exactitud.
Preparacin de ValoracinSi la forma farmacutica es una tableta, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas,
pesar con exactitud una porcin del polvo, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y transferir a un
separador de 125 mL; o, si la forma farmacutica es un lquido, transferir un volumen de ste, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y medido con exactitud, a un separador de 125 mL. Luego agregar al separador 20 mL de
cido sulfrico diluido (1 en 350) y agitar vigorosamente durante 5 minutos. Agregar 20 mL de ter, agitar cuidadosamente y
filtrar la fase cida, recogindola en un segundo separador de 125 mL. Agitar la fase etrea con dos porciones de 10 mL de
cido sulfrico diluido (1 en 350), filtrar cada porcin del cido y recolectarla en el segundo separador y desechar el ter.
Agregar 10 mL de hidrxido de sodio SR y 50 mL de ter al extracto cido, agitar cuidadosamente y transferir la fase acuosa a
un tercer separador de 125 mL que contenga 50 mL de ter. Agitar cuidadosamente el tercer separador y desechar la fase
acuosa. Lavar sucesivamente las dos soluciones etreas con una nica porcin de 20 mL de agua y desechar el agua. Extraer
cada una de las dos soluciones etreas con porciones de 20 mL, 20 mL y 5 mL de cido sulfrico diluido (1 en 70), en el orden
* Las concentraciones de las soluciones de cido clorhdrico e hidrxido de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden
variar segn la cantidad de material tomado para la valoracin, el volumen de la solucin de prueba y el efecto amortiguador del material.
Captulos
Diluir una porcin medida con exactitud de esta solucin, usando cido actico 0,02 N, hasta una concentracin de 10,0 mg
de ER Riboflavina USP seca por mL para obtener la Solucin Madre del Estndar de Riboflavina. Almacenar bajo tolueno en un
refrigerador.
Preparacin EstndarDiluir a volumen con agua 10,0 mL de la Solucin Madre del Estndar de Riboflavina en un matraz
volumtrico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 mg de ER Riboflavina USP. Preparar una Preparacin Estndar nueva
para cada valoracin.
Preparacin de ValoracinColocar una cantidad del material a valorar en un matraz de tamao adecuado y agregar un
volumen de cido clorhdrico 0,1 N igual en mL a no menos de 10 veces el peso seco del material en g, aunque la solucin
resultante no debe contener ms de 100 mg de riboflavina por mL. Si el material no es fcilmente soluble, pulverizarlo para que
pueda dispersarse uniformemente en el lquido. Luego agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con cido clorhdrico 0,1 N.
Calentar la mezcla en un autoclave entre 121 y 123 durante 30 minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezcla hasta que las partculas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla, agitando vigorosamente, a un pH de 6,0 a 6,5 con
solucin de hidrxido de sodio* y, de inmediato, agregar solucin de cido clorhdrico* hasta que no haya ms precipitacin
(por lo general a un pH de aproximadamente 4,5, el punto isoelctrico de muchas de las protenas presentes). Diluir la mezcla
con agua para obtener un volumen medido que contenga aproximadamente 0,11 mg de riboflavina en cada mL y filtrar a travs de papel que se sepa que no adsorbe riboflavina. A una alcuota del filtrado, agregar, agitando vigorosamente, una solucin de hidrxido de sodio* para producir un pH de 6,6 a 6,8, diluir la solucin con agua para obtener un volumen final medido que contenga aproximadamente 0,1 mg de riboflavina en cada mL y, si la solucin se enturbia, filtrar nuevamente.
ProcedimientoAgregar a cada uno de cuatro o ms tubos (o recipientes de reaccin) 10,0 mL de la Preparacin de Valoracin. Agregar a cada uno de dos o ms de estos tubos 1,0 mL de la Preparacin Estndar y mezclar y luego agregar a cada
uno de los dos o ms tubos restantes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de cido actico glacial y mezclar; luego agregar, mezclando, 0,50 mL de solucin de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minutos. Agregar a cada tubo, mezclando, 0,50 mL de solucin de perxido de hidrgeno, con lo cual el color del permanganato
desaparecer en 10 segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxgeno. Cuando haya cesado
la produccin de espuma, eliminar las burbujas de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinacin de los tubos
para que la solucin fluya lentamente de un extremo a otro.
En un fluorofotmetro adecuado que tenga un filtro de entrada con un estrecho intervalo de transmitancia y un mximo
aproximadamente a 440 nm y un filtro de salida con un estrecho intervalo de transmitancia y un mximo aproximadamente a
530 nm, medir la fluorescencia de todos los tubos y designar la lectura promedio de los tubos que contienen solamente la
Preparacin de Valoracin como IU y el promedio de los tubos que contienen la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar como IS. Luego, a uno o ms tubos de cada tipo, agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de sodio y medir nuevamente
la fluorescencia a los 5 segundos; designar la lectura promedio como IB.
ClculoCalcular la cantidad, en mg, de C17H20N4O6 en cada mL de la Preparacin de Valoracin tomado, por la frmula:
352 501 Sales de Bases Orgnicas Nitrogenadas / Pruebas Qumicas
USP 38
indicado, pero siempre extrayendo primero la solucin etrea del tercer separador y despus la del segundo separador. Combinar los extractos cidos en un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con el cido y mezclar.
NOTAEl ter puede sustituirse por hexano o heptano si el coeficiente de particin de la base nitrogenada entre el agua y el
hexano, o entre el agua y el heptano, favorece una extraccin completa hacia la fase orgnica.
ProcedimientoA menos que se indique algo diferente, diluir 5,0 mL de la Preparacin Estndar y 5,0 mL de la Preparacin
de Valoracin con cido sulfrico diluido (1 en 70) hasta 100,0 mL y determinar la absorbancia de cada solucin a la longitud
de onda especificada, usando cido sulfrico diluido (1 en 70) como blanco. Designar la absorbancia de la solucin de la Preparacin Estndar como AS y la de la Preparacin de Valoracin como AU y calcular el resultado de la valoracin segn se indique
en la monografa individual.
Captulos
503 CIDO ACTICO EN PPTIDOS

El siguiente procedimiento se debe usar para determinar la cantidad de acetato o cido actico en pptidos. El acetato es un
contra-in comn en muchas preparaciones de pptidos.
Estndares de Referencia USP 11ER cido Actico Glacial USP.
Solucin de Hidrxido de Sodio ConcentradoDisolver 42 g de hidrxido de sodio en agua y diluir con agua a 100 mL.
Solucin AAgregar 0,7 mL de cido fosfrico a 1000 mL de agua y ajustar con Solucin de Hidrxido de Sodio Concentrado
hasta un pH de 3,0.
Solucin BUsar metanol.
DiluyentePreparar una mezcla de Solucin A y Solucin B (95:5).
Solucin Estndar[NOTALa concentracin puede ajustarse dependiendo de la cantidad de acetato o cido actico que
se espera est presente en el material de prueba.] Disolver en Diluyente una cantidad, pesada con exactitud, de ER cido Actico Glacial USP para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 0,1 mg por mL.
Solucin de PruebaPreparar segn se indica en la monografa individual. La cantidad de material usado se puede adaptar dependiendo de la cantidad de cido actico esperada.
Sistema Cromatogrfico (ver Cromatografa 621)Equipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 210 nm y una
columna de 4,6 mm 25 cm rellena con material L1 de no ms de 5 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,2
mL por minuto. Programar el cromatgrafo del siguiente modo.
Tiempo
(minutos)
Solucin A
(%)
Solucin B
(%)
95
equilibrio
isocrtica
05
95
510
9550
550
1020
50
50
2022
5095
505
Elucin
gradiente lineal
isocrtica
gradiente lineal
Inyectar en el cromatgrafo la Solucin Estndar y registrar el cromatograma segn se indica en el Procedimiento: el tiempo de
retencin de cido actico est entre 3 y 4 minutos y la desviacin estndar relativa para inyecciones repetidas no es ms de
5%.
ProcedimientoInyectar por separado en el cromatgrafo volmenes iguales (aproximadamente 10 mL) de la Solucin Estndar y de la Solucin de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos de cido actico. Calcular el
porcentaje de cido actico en la porcin de material tomada, por la frmula:
100(CS/M)(rU/rS)
en donde CS es la concentracin de cido actico en la Solucin Estndar; M es la concentracin, en mg por mL, de la Solucin
de Prueba, basada en el peso del material de prueba tomado y el grado de dilucin; y rU y rS son las respuestas de los picos de
cido actico obtenidos a partir de la Solucin de Prueba y la Solucin Estndar, respectivamente.
511 VALORACIN DE UN ESTEROIDE AISLADO

En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar se separa de los esteroides extraos relacionados y excipientes mediante
cromatografa en capa delgada y se determina despus de la recuperacin a partir del cromatograma.
Pruebas Qumicas / 525 Dixido de Azufre 353
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525 DIXIDO DE AZUFRE

Los siguientes mtodos se proporcionan a efectos de la determinacin de dixido de azufre en excipientes farmacuticos.
MTODO I
Procedimiento
Mezclar 20 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, con 200 mL de un disolvente adecuado, segn se indica en la
monografa individual, y mezclar hasta obtener una suspensin homognea. Dejar en reposo la mezcla de prueba hasta que la
mayor parte de la muestra se haya sedimentado y filtrar la porcin acuosa a travs de papel (Whatman N 1 o equivalente). A
100 mL del filtrado transparente, agregar un disolvente adicional segn se indica en la monografa individual, agregar 3 mL de
almidn SR y valorar con solucin de yodo 0,01 N SV hasta el primer color azul o prpura permanente. Cada mL de solucin
de yodo 0,01 N SV consumido corresponde a 0,003% de dixido de azufre encontrado.
MTODO II
Procedimiento
Transferir aproximadamente 50 a 100 g de la sustancia en anlisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250
mL, agregar 100 a 150 mL de agua y mezclar. Enfriar entre 5 y 10. Mientras se mezcla con un mezclador magntico, agregar
10 mL de hidrxido de sodio 1,5 N fro (a una temperatura entre 5 y 10). Mezclar durante 20 segundos adicionales y agregar 10 mL de solucin indicadora de almidn, preparada de la siguiente manera: mezclar 10 g de almidn soluble con 50 mL
de agua fra, transferir a 1000 mL de agua en ebullicin, mezclar hasta que se disuelva por completo, enfriar y agregar 1 g de
cido saliclico como conservante. [NOTADesechar la solucin despus de 1 mes.] Agregar 10 mL de cido sulfrico 2,0 N (a
una temperatura entre 5 y 10) y valorar inmediatamente con yodo 0,005 N SV hasta que persista un color azul claro durante
1 minuto (ver Volumetra 541). Realizar una determinacin con un blanco, usando 200 mL de agua tratada de manera similar
que la solucin en anlisis y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de yodo 0,005 N equivale a 0,16 mg de SO2.
Captulos
Preparacin de la PlacaPreparar una suspensin espesa con 30 g de gel de slice para cromatografa y una sustancia fluorescente adecuada agregando gradualmente aproximadamente 65 mL de una mezcla de agua y alcohol (5:2), y mezclando.
Transferir la suspensin espesa a una placa limpia de 20 cm 20 cm, extender hasta obtener una capa uniforme de 250 mm
de espesor y dejar que se seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Calentar la placa a 105 durante 1 hora y almacenar en un desecador.
Disolvente AMezclar cloruro de metileno con metanol (180:16).
Disolvente BMezclar cloroformo con acetona (4:1).
Preparacin EstndarDisolver en una mezcla de volmenes iguales de cloroformo y alcohol una cantidad adecuada del
Estndar de Referencia USP especificado en la monografa individual, previamente secada segn se indic (ver Estndares de
Referencia USP 11) y pesada con exactitud, para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente
2 mg por mL.
Preparacin de ValoracinPreparar segn se indica en la monografa individual.
ProcedimientoDividir el rea de la placa cromatogrfica en tres secciones iguales y usar las secciones izquierda y derecha
para la Preparacin de Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente, y la seccin central para el blanco. Aplicar 200 mL
de la Preparacin de Valoracin y 200 mL de la Preparacin Estndar en franjas alejadas en 2,5 cm del borde inferior de la seccin
correspondiente de la placa. Secar la solucin a medida que se aplica, con ayuda de una corriente de aire. Usando el Disolvente
especificado en la monografa individual, desarrollar el cromatograma en una cmara adecuada, previamente equilibrada y
con recubrimiento interno de papel absorbente, hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido 15 cm por encima de las
franjas iniciales.
Retirar la placa, evaporar el disolvente y localizar la banda principal ocupada por la Preparacin Estndar observndola bajo
luz UV. Marcar esta banda, adems de las bandas correspondientes en la Preparacin de Valoracin y en las secciones del blanco de la placa. Quitar el gel de slice de cada banda por separado, ya sea raspando sobre papel satinado o usando un dispositivo adecuado recolector por vaco y transferirlo a un tubo de centrfuga de 50 mL con tapn de vidrio. Agregar 25,0 mL de
alcohol a cada tubo y agitar durante no menos de 2 minutos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos, pipetear 20 mL del
sobrenadante de cada tubo y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapn de vidrio, agregar 2,0 mL de una solucin
preparada por disolucin de 50 mg de azul de tetrazolio en 10 mL de metanol y mezclar. Proceder segn se indica en el
Procedimiento en Valoracin de Esteroides 351, comenzando donde dice Luego a cada matraz.
354 525 Dixido de Azufre / Pruebas Qumicas
USP 38
MTODO III
Procedimiento
Disolver 20,0 g de la muestra de prueba en 150 mL de agua caliente en un matraz de fondo redondo y cuello largo, agregar
5 mL de cido fosfrico y 1 g de bicarbonato de sodio, e inmediatamente conectar el matraz a un condensador. [NOTASe
puede reducir la produccin excesiva de espuma mediante el agregado de unas pocas gotas de un agente antiespumante adecuado.] Destilar 50 mL, recibiendo el destilado bajo la superficie de 50 mL de yodo 0,1 N. Acidificar el destilado con unas
pocas gotas de cido clorhdrico, agregar 2 mL de cloruro de bario SR y calentar en un bao de vapor hasta que el lquido sea
casi incoloro. El precipitado de sulfato de bario, si lo hubiera, una vez filtrado, lavado e incinerado, pesa no ms de 3 mg, que
corresponde a no ms de 0,004% de dixido de azufre, haciendo las correcciones para cualquier sulfato que pudiera estar
presente en 50 mL del yodo 0,1 N.
MTODO IV
Captulos
En esta prueba, el dixido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio cido en ebullicin y se extrae
con una corriente de dixido de carbono. El gas separado se recoje en una solucin de perxido de hidrgeno diluida, en la
que el dixido de azufre se oxida a cido sulfrico y se valora con lcali estndar, usando un medidor de pH para controlar el
valor de pH y la valoracin. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la
prueba de aptitud del sistema.
Dixido de CarbonoUsar dixido de carbono con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 100 10 mL por minuto.
Solucin de Perxido de HidrgenoDiluir perxido de hidrgeno al 30% con agua para obtener una solucin al 3%.
Neutralizar la solucin de perxido de hidrgeno al 3% con hidrxido de sodio 0,01 N a un pH de 4,1 determinado potenciomtricamente.
Solucin de Metabisulfito de PotasioTransferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2S2O5) y 0,2 g de edetato disdico
a un matraz volumtrico de 1000 mL. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTASe usa edetato disdico para proteger al in sulfito de la oxidacin.]
Aparato
El diagrama adjunto muestra un aparato adecuado para la determinacin de dixido de azufre (Figura 1).
Figura 1. Aparato para el Mtodo IV.
USP 38
El aparato consiste en un matraz de ebullicin de 500 mL de fondo redondo con tres cuellos, A; un embudo de separacin, B,
con una capacidad de 100 mL o mayor; un tubo de entrada de gas de longitud sificiente para permitir la introduccin de
dixido de carbono a 2,5 cm del fondo del matraz de ebullicin; un condensador de reflujo, C, con una longitud de la camisa
de 200 mm; y un tubo de salida, E, que conecta el extremo superior del condensador de reflujo con el fondo de un tubo de
ensayo receptor, D. Aplicar una pelcula fina de grasa para llaves de paso a las superificies de sellado de todas las juntas, excepto la junta que est entre el embudo de separacin y el matraz de ebullicin, y sujetar las juntas con abrazaderas para garantizar la hermeticidad.
Prueba de Aptitud del Sistema

Prueba AUsando la Solucin de Metabisulfito de Potasio como el estndar, proceder segn se indica en Procedimiento, excepto que se deben reemplazar 25,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solucin de Metabisulfito de Potasio. Calcular el
contenido, en mg por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/VP
en donde 1000 es el factor de conversin de mg a mg; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y VP es el volumen, en mL, de la
Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.
Prueba BEn un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solucin de yodo 0,02 N y 5 mL de cido clorhdrico
2 N. Agregar 1 mL de almidn SR y valorar con la Solucin de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloracin. Calcular el contenido, en mg por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio por la frmula:
en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; VI es el volumen, en mL, de solucin de yodo usado en la prueba; NI es la
normalidad de la solucin de yodo; y VP es el volumen, en mL, de la Solucin de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre los contenidos de dixido de azufre obtenidos a partir de la Prueba A y la Prueba B es no ms de 5% de su
valor promedio. La Prueba B se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a la finalizacin de la Prueba A. [NOTAEsto
evita una variacin potencial del contenido de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena
a temperatura ambiente.]
Procedimiento
Agregar 150 mL de agua al matraz de ebullicin (A). Cerrar la llave de paso del embudo de separacin y comenzar el flujo
de dixido de carbono a una velocidad de 100 5 mL por minuto a travs del aparato. Iniciar el flujo refrigerante del condensador. Colocar 10 mL de Solucin de Perxido de Hidrgeno en el tubo de ensayo receptor (D). Despus de 15 minutos, sin
haber interrumpido el flujo de dixido de carbono, retirar el embudo de separacin (B) del matraz de ebullicin y transferir
25,0 g de la muestra de prueba al matraz de ebullicin con ayuda de 100 mL de agua. Aplicar grasa para llaves de paso a la
junta externa del embudo de separacin y volver a colocar el embudo de separacin en el matraz de ebullicin. Cerrar la llave
de paso del embudo de separacin y agregar 80 mL de cido clorhdrico 2 N al embudo de separacin. Abrir la llave de paso
del embudo de separacin para permitir que la solucin de cido clorhdrico fluya en el matraz de ebullicin, cerrando la llave
de paso antes de que escurran los ltimos mL de cido clorhdrico para evitar que el dixido de azufre escape hacia el embudo
de separacin. Calentar la mezcla a ebullicin durante 1 hora. Abrir la llave de paso del embudo, detener el flujo de dixido de
carbono, discontinuar el calentamiento del matraz, y detener el flujo de agua refrigerante en el condensador. Retirar el tubo de
ensayo receptor y transferir su contenido a un matraz Erlenmeyer de 200 mL de cuello ancho. Enjuagar el tubo de ensayo
receptor con una pequea porcin de agua, agregar el enjuague al matraz Erlenmeyer de 200 mL, y mezclar. Calentar en un
bao de agua durante 15 minutos y dejar que se enfre. Agregar 0,1 mL de azul de bromofenol SR y valorar el contenido con
hidrxido de sodio 0,1 N SV hasta que el color cambie de amarillo a azul violceo y el cambio de color persista durante al
menos 20 segundos. Realizar una determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetra 541). Calcular el contenido, en mg por g, de dixido de azufre en la muestra de prueba tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/W
en mL, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y W es el peso, en g, de la muestra
de prueba tomada.
MTODO V
En este mtodo, de manera similar al Mtodo IV, el dixido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio
cido en ebullicin y se extrae con una corriente de nitrgeno. El gas separado se recoje en una solucin de perxido de hidrgeno diluida, en la que el dixido de azufre se oxida a cido sulfrico y se valora con lcali estndar, usando rojo de metilo
Captulos
1000(32,03)VINI/VP
USP 38
como indicador. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de
aptitud del sistema.
Solucin de Perxido de HidrgenoDiluir una porcin de perxido de hidrgeno al 30 por ciento con agua para obtener una solucin al 3%. Justo antes de su uso, agregar 3 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar hasta un punto final amarillo
con hidrxido de sodio 0,01 N. No exceder el punto final.
NitrgenoUsar nitrgeno de alta pureza con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 200 10 mL por minuto.
Evitar la presencia de oxgeno pasando el nitrgeno a travs de un depurador, tal como pirogalol alcalino, que se prepara segn se indica a continuacin: agregar 4,5 g de pirogalol a un frasco de lavado de gases, purgar el frasco con nitrgeno durante 3 minutos, y agregar una solucin que contenga 85 mL de agua y 65 g de hidrxido de potasio mientras se mantiene una
atmsfera de nitrgeno en el frasco.
Solucin de Metabisulfito de PotasioTransferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2S2O5) y 0,2 g de edetato disdico
a un matraz volumtrico de 1000 mL. Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTASe usa edetato disdico para proteger al in sulfito de la oxidacin.]
Captulos
Aparato
El aparato (ver la Figura 2) est diseado para realizar la transferencia selectiva de dixido de azufre de la muestra en cido
clorhdrico acuoso en ebullicin a la Solucin de Perxido de Hidrgeno en el vaso G. La contrapresin se limita a la presin inevitable debida a la altura de la Solucin de Perxido de Hidrgeno por encima del extremo del burbujeador, F. Mantener la contrapresin lo ms baja posible reduce la probabilidad de prdida de dixido de azufre por fugas. Calentar a ebullicin previamente los tubos de vinilo y silicona. Aplicar una pelcula fina de grasa para llaves de paso a las superficies de sellado de todas las
juntas, excepto la junta entre el embudo de separacin y el matraz, y sujetar las juntas para garantizar la hermeticidad. El embudo de separacin, B, tiene una capacidad de 100 mL o mayor. El adaptador de entrada, A, con una manguera conectora,
permite aplicar presin de carga a la solucin. [NOTANo se recomienda el uso de un embudo de goteo que equilibre la presin debido a que el condensado, que puede contener dixido de azufre, se deposita en el embudo y en el brazo lateral.]
Figura 2. Aparato para el Mtodo V.
USP 38
El matraz de fondo redondo, C, es un matraz de 1000 mL con tres juntas cnicas tipo 24/40. El tubo de entrada de gas, D,
tiene una longitud suficiente para permitir la introduccin del nitrgeno a 2,5 cm del fondo del matraz. El condensador Allihn,
E, tiene una longitud de camisa de 300 mm. El burbujeador, F (ver la Figura 3), est fabricado con vidrio segn las dimensiones
proporcionadas en la Figura 3. La Solucin de Perxido de Hidrgeno est contenida en el vaso, G, con un dimetro interno de
aproximadamente 2,5 cm y una profundidad de aproximadamente 18 cm. Hacer que circule un refrigerante, como por ejemplo una mezcla de agua y metanol (4:1) mantenida a 5, para enfriar el condensador.
Prueba de Aptitud del Sistema

Prueba AUsando la Solucin de Metabisulfito de Potasio como el estndar, proceder segn se indica en Procedimiento, excepto qe se deben reemplazar los 50,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solucin de Metabisulfito de Potasio. Calcular
el contenido, en mg por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/VP
en mL, de solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y VP es el volumen, en mL, de
Solucin de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.
Prueba BEn un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solucin de yodo 0,02 N y 5 mL de cido clorhdrico
2 N. Agregar 1 mL de almidn SR y valorar con la Solucin de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloracin. Calcular el contenido, en mg por mL, de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio por la frmula:
1000(32,03)VINI/VP
en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; VI es el volumen, en mL, de solucin de yodo usado en la prueba; NI es la
normalidad de solucin de yodo; y VP es el volumen, en mL, de Solucin de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre el contenido de dixido de azufre obtenido a partir de la Prueba A y la Prueba B es no ms de 5% de su
valor promedio. La Prueba B deber realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la finalizacin de la Prueba A. [NOTAEsto
evita la variacin potencial del contenido de dixido de azufre en la Solucin de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a
temperatura ambiente.]
Procedimiento
Colocar el aparato en un manto de calentamiento controlado por un dispositivo regulador de energa. Agregar 400 mL de
agua al matraz. Cerrar la llave de paso del embudo de separacin y agregar 90 mL de cido clorhdrico 4 N al embudo de
separacin. Comenzar el flujo de nitrgeno a una velocidad de 200 10 mL por minuto. Iniciar el flujo refrigerante del condensador. Agregar 30 mL de Solucin de Perxido de Hidrgeno al vaso (G). Despus de 15 minutos, retirar el embudo de separacin y transferir al matraz una mezcla de 50,0 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, y 100 mL de solucin
alcohlica (5 en 100). Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separacin, volver a colocar el embudo de separacin al matraz de junta cnica, y reanudar concomitantemente el flujo de nitrgeno. Aplicar presin de carga
sobre la solucin de cido clorhdrico en el embudo de separacin con una pera de goma provista de una vlvula. Abrir la llave
de paso del embudo de separacin para permitir que la solucin de cido clorhdrico fluya en el matraz. Continuar manteniendo por encima de la solucin de cido clorhdrico una presin suficiente para forzarla hacia el interior del matraz. [NOTASi
fuera necesario, se puede cerrar la llave de paso temporalmente para incrementar la presin.] Para evitar fugas de dixido de
Captulos
Figura 3. Burbujeador (F) para el aparato del Mtodo V.
USP 38
azufre hacia el embudo de separacin, cerrar la llave de paso antes de que escurran los ltimos mL de cido clorhdrico. Aplicar
suficiente energa al manto de calentamiento para generar aproximadamente 85 gotas de reflujo por minuto. Despus de someter a reflujo durante 1,75 horas, retirar el vaso (G), agregar 3 gotas de rojo de metilo SR, y valorar el contenido con hidrxido de sodio 0,01 N SV, usando una bureta de 10 mL con un tubo de desborde y una manguera que conecte a un tubo de
absorcin de dixido de carbono, hasta un punto final amarillo que persista durante al menos 20 segundos. Realizar una determinacin con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetra 541). Calcular la cantidad, en mg, de SO2 en cada
g de la muestra de prueba tomada por la frmula:
1000(32,03)VN/W
en donde el factor 1000 convierte mg a mg; 32,03 es el peso miliequivalente de dixido de azufre; V es el volumen, en mL, de
solucin volumtrica consumida; N es la normalidad de la solucin volumtrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba
tomada.
Captulos
531 VALORACIN DE TIAMINA

Estndares de Referencia USP 11ER Clorhidrato de Tiamina USP.
El siguiente procedimiento se proporciona para la determinacin de tiamina como ingrediente de Preparaciones farmacopeicas que contengan otros componentes activos.
Soluciones y Disolventes Especiales
SOLUCIN DE FERRICIANURO DE POTASIODisolver 1,0 g de ferricianuro de potasio en agua para obtener 100 mL. Preparar la
solucin el mismo da de su uso.
REACTIVO DE OXIDACINMezclar 4,0 mL de la Solucin de Ferricianuro de Potasio con suficiente hidrxido de sodio 3,5 N para
obtener 100 mL. Usar esta solucin dentro de las 4 horas posteriores.
SOLUCIN MADRE DE SULFATO DE QUININADisolver 10 mg de sulfato de quinina en cido sulfrico 0,1 N para obtener 1000
mL. Conservar esta solucin, protegida de la luz, en un refrigerador.
SOLUCIN ESTNDAR DE SULFATO DE QUININADiluir cido sulfrico 0,1 N con Solucin Madre de Sulfato de Quinina (39:1). Esta
solucin emite fluorescencia aproximadamente en el mismo grado que el tiocromo obtenido de 1 mg de clorhidrato de tiamina y se usa para corregir el fluormetro a intervalos frecuentes debido a la variacin en la sensibilidad entre una lectura y otra
dentro de una valoracin. Preparar esta solucin el mismo da de su uso.
Solucin Madre de Clorhidrato de Tiamina EstndarTransferir aproximadamente 25 mg de ER Clorhidrato de Tiamina
USP, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de 1000 mL. Disolver el Estndar pesado en aproximadamente 300 mL
de solucin de alcohol diluido (1 en 5) ajustada con cido clorhdrico 3 N hasta un pH de 4,0 y llevar a volumen con el alcohol
diluido acidificado. Almacenar en un envase resistente a la luz, en un refrigerador. Preparar esta solucin madre nueva cada
mes.
Preparacin EstndarDiluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas una porcin de la Solucin Madre de Clorhidrato
de Tiamina Estndar con cido clorhdrico 0,2 N para obtener la Preparacin Estndar, cada mL de la cual representa 0,2 mg del
ER Clorhidrato de Tiamina USP.
Preparacin de ValoracinColocar en un matraz volumtrico adecuado una cantidad suficiente del material a valorar,
pesada con exactitud o medida por volumen segn se indique, de modo que al diluir a volumen con cido clorhdrico 0,2 N,
la solucin resultante contenga aproximadamente 100 mg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por mL. Si la muestra es
difcil de disolver, se puede calentar la solucin en un bao de vapor y luego enfriar y diluir a volumen con el cido. Diluir
cuantitativamente y en diluciones sucesivas 5 mL de esta solucin usando cido clorhdrico 0,2 N hasta una concentracin estimada de 0,2 mg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por mL.
ProcedimientoPipetear 5 mL de la Preparacin Estndar y transferir a cada uno de tres o ms tubos (u otros recipientes
adecuados) de aproximadamente 40 mL de capacidad. A cada uno de dos de estos tubos agregar rpidamente (en 1 2 segundos) mezclando, 3,0 mL del Reactivo de Oxidacin y dentro de 30 segundos agregar 20,0 mL de alcohol isobutlico, luego
mezclar vigorosamente durante 90 segundos por agitacin manual de los tubos tapados, o haciendo burbujear una corriente
de aire en la mezcla. Preparar un blanco en el tubo restante del estndar sustituyendo el Reactivo de Oxidacin por un volumen
equivalente de hidrxido de sodio 3,5 N y procediendo de la misma manera.
Pipetear 5 mL de la Preparacin de Valoracin y transferir a cada uno de tres o ms tubos similares. Tratar estos tubos de
manera similar a como se indica para los tubos que contienen la Preparacin Estndar.
Pipetear 2 mL de alcohol deshidratado y transferir a cada uno de seis tubos, agitar por rotacin suave durante algunos segundos, permitir que las fases se separen y decantar o extraer aproximadamente 10 mL de solucin de alcohol isobutlico sobrenadante transparente a celdas estandarizadas, luego medir la fluorescencia en un fluormetro adecuado que tenga un filtro
de entrada de intervalo de transmitancia estrecho con un mximo aproximadamente a 365 nm y un filtro de salida con un
intervalo de transmitancia estrecho con un mximo aproximadamente a 435 nm.
ClculosLa cantidad de mg de C12H17ClN4OS HCl en cada 5 mL de la Preparacin de Valoracin est dada, por la frmula:
Pruebas Qumicas / 541 Volumetra 359
USP 38
(A b)/(S d)
en donde A y S son las lecturas promedio del fluormetro de las porciones de la Preparacin de Valoracin y la Preparacin
Estndar tratadas con el Reactivo de Oxidacin, respectivamente, y b y d son las lecturas de los blancos de la Preparacin de
Valoracin y la Preparacin Estndar, respectivamente.
Calcular la cantidad, en mg, de clorhidrato de tiamina (C12H17ClN4OS HCl) en el material de valoracin sobre la base de las
alcuotas tomadas. Cuando se indique, la cantidad, en mg, de mononitrato de tiamina (C12H17N5O4S) se puede calcular por
multiplicacin de la cantidad encontrada de C12H17ClN4OS HCl por 0,9706.
541 VOLUMETRA
Captulos
Valoraciones Volumtricas DirectasLa volumetra directa es el tratamiento de una sustancia soluble en solucin, y contenida en un recipiente adecuado, con una solucin estandarizada apropiada (la solucin volumtrica), donde el punto final se
determina en forma instrumental, o visualmente con ayuda de un indicador adecuado.
La solucin volumtrica se agrega desde una bureta de capacidad adecuada que se elige de acuerdo con la concentracin
(normalidad), de modo tal que el volumen consumido sea de entre 30% y 100% de la capacidad nominal de la bureta.
[NOTAEn los casos en que se requiera menos de 10 mL de solucin volumtrica, se debe utilizar una microbureta adecuada.]
La aproximacin al punto final se hace directamente pero con cuidado, y finalmente la solucin volumtrica se agrega gota a
gota desde la bureta para que la ltima gota no sobrepase el punto final. La cantidad de sustancia valorada se puede calcular a
partir del volumen, el factor de normalidad o molaridad de la solucin volumtrica, y el factor de equivalencia de la sustancia
que se especifica en la monografa correspondiente.
Valoraciones Volumtricas ResidualesAlgunas valoraciones farmacopeicas requieren la adicin de un volumen determinado de una solucin volumtrica, en exceso del necesario para reaccionar con la sustancia a valorar. Despus, el excedente
de esta solucin se valora con una segunda solucin volumtrica. Esto constituye una volumetra residual y tambin se conoce
como retrovaloracin o valoracin por retorno. La cantidad de la sustancia valorada se puede calcular a partir de la diferencia entre el volumen de la solucin volumtrica que se agreg originalmente corregida por medio de una valoracin con un
blanco y el consumido por la solucin volumtrica en la retrovaloracin, teniendo en cuenta los respectivos factores de molaridad o normalidad de las dos soluciones y el factor de equivalencia para la sustancia indicado en la monografa correspondiente.
Valoraciones ComplejomtricasEl xito de las valoraciones complejomtricas depende de varios factores. La constante
de equilibrio de formacin del complejo del reactivo en la solucin volumtrica-analito debe ser lo suficientemente grande como para que, en el punto final, casi el 100% del analito haya formado el complejo. El complejo final se debe formar lo suficientemente rpido para que el tiempo de anlisis sea prctico. Cuando la reaccin analtica no es rpida, algunas veces puede
resultar til realizar una volumetra residual.
En general, los indicadores para valoraciones complejomtricas son en s mismos agentes formadores de complejos. La reaccin entre el in metlico y el indicador debe ser rpida y reversible. La constante de equilibrio de formacin del complejo
metal-indicador debe ser lo suficientemente grande como para producir un cambio de color marcado pero debe ser menor
que la correspondiente al complejo metal-valorante. La eleccin del indicador tambin est limitada por el intervalo de pH en
el que se debe efectuar la reaccin de formacin del complejo y por la interferencia de otros iones presentes en la muestra o
de la solucin amortiguadora. Los iones que interfieren, a menudo se pueden enmascarar o secuestrar mediante la adicin
de otro agente formador de complejos. (La tcnica de enmascaramiento tambin se usa en las valoraciones redox).
Valoraciones por xido-Reduccin (Redox)Con frecuencia, se pueden llevar a cabo determinaciones de manera conveniente mediante el uso de un reactivo que provoque la oxidacin o la reduccin del analito. Muchas curvas de valoracin redox no son simtricas respecto al punto de equivalencia y, de ese modo, no es posible la determinacin grfica del punto final;
pero se dispone de indicadores para muchas determinaciones y adems, frecuentemente los reactivos redox pueden servir como sus propios indicadores. Igual que en cualquier tipo de volumetra, el indicador ideal cambia de color en un punto final
que est lo ms prximo posible al punto de equivalencia. En consecuencia, cuando la solucin volumtrica sirve como su propio indicador, la diferencia entre el punto final y el punto de equivalencia slo est determinada por la habilidad del analista
para detectar el cambio de color. Un ejemplo comn es el uso del in permanganato como componente de una solucin volumtrica de oxidacin ya que un leve exceso se puede detectar por su color rosado. Otras soluciones volumtricas que pueden
servir como sus propios indicadores son el yodo, las sales de cerio (IV) y el dicromato de potasio. En la mayora de los casos, sin
embargo, el uso de un indicador redox producir un punto final mucho ms marcado.
Puede ser necesario ajustar el estado de oxidacin del analito antes de la volumetra mediante el uso de un agente oxidante
o reductor adecuado; despus, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ejemplo, mediante precipitacin. Esta es casi siempre la prctica habitual en la determinacin de agentes oxidantes, ya que la mayora de soluciones volumtricas de agentes
reductores son oxidadas lentamente por el oxgeno atmosfrico.
Valoraciones Volumtricas en Disolventes No AcuososLos cidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo
como sustancias que cuando se disuelven en agua, proporcionan iones de hidrgeno e hidroxilo, respectivamente. Esta defini-
Captulos
360 541 Volumetra / Pruebas Qumicas
USP 38
cin, introducida por Arrhenius, no reconoce el hecho de que propiedades caractersticas de los cidos o las bases tambin se
pueden desarrollar en otros disolventes. Una definicin ms generalizada es la de Brnsted, quien defini un cido como una
sustancia que proporciona protones y una base como una sustancia que se combina con protones. Una definicin an ms
amplia es la de Lewis, quien defini un cido como cualquier sustancia que acepta un par de electrones, una base como cualquier sustancia que dona un par de electrones y la neutralizacin como la formacin de una unin de coordinacin entre un
cido y una base.
La fuerza aparente de un cido o una base se determina por su grado de reaccin con un disolvente. En solucin acuosa
todos los cidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con el disolvente para sufrir una conversin casi
completa en el in oxonio y el anin del cido (efecto nivelador). En un disolvente dbilmente protfilo como el cido actico,
el grado de formacin del in acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la fuerza para cidos es perclrico,
bromhdrico, sulfrico, clorhdrico y ntrico (efecto diferenciador).
El cido actico reacciona de forma incompleta con el agua para formar in oxonio y por lo tanto es un cido dbil. En
contraste, se disuelve en una base como etilendiamina y reacciona en forma tan completa con el disolvente que se comporta
como un cido fuerte. Lo mismo es vlido para el cido perclrico.
Este efecto nivelador tambin se observa en el caso de las bases. En cido sulfrico, casi todas las bases parecen tener la
misma fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en la serie constituida por cido sulfrico, cido actico, fenol, agua, piridina y butilamina, las bases se vuelven progresivamente ms dbiles hasta que todas, excepto las ms fuertes, pierden sus propiedades bsicas. En orden de fuerza decreciente, las bases ms fuertes son 2-aminoetxido de sodio, metxido de potasio, metxido de sodio y metxido de litio.
Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores propiedades cidas o bsicas cuando se disuelven en disolventes
orgnicos. De esta manera, la eleccin del disolvente adecuado permite la determinacin de una variedad de tales sustancias
mediante valoracin en medios no acuosos. Adems, dependiendo de cual sea la parte fisiolgicamente activa del compuesto,
con frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disolvente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se
pueden valorar directamente, pero en preparaciones farmacuticas a menudo es necesario aislar el ingrediente activo de los
excipientes y vehculos que interfieran.
Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar como cidos estn los cidos de haluros, anhdridos de cidos, cidos
carboxlicos, aminocidos, enoles como barbituratos y xantinas, imidas, fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de
compuestos que se pueden valorar como bases estn las aminas, compuestos heterocclicos que contienen nitrgeno, oxazolinas, compuestos de amonio cuaternario, sales alcalinas de cidos orgnicos, sales alcalinas de cidos inorgnicos dbiles y algunas sales de aminas. Muchas sales de cidos halogenados se pueden valorar en cido actico o anhdrido actico despus de
agregar acetato de mercurio, que elimina iones haluros formando un complejo de halgeno-mercurio sin ionizar e introduce el
acetato ionizado.
Para la volumetra de un compuesto bsico se prefiere una solucin volumtrica de cido perclrico en cido actico glacial,
aunque en casos especiales se usa cido perclrico en dioxano. El sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta til en este
caso. En cido actico como disolvente, este sistema de electrodos funciona de acuerdo con la teora.
Para la volumetra de un compuesto cido, se dispone de dos clases de soluciones volumtricas: los alcxidos de metales
alcalinos y los hidrxidos de tetraalquilamonio. Con frecuencia se usa una solucin volumtrica de metxido de sodio en una
mezcla de metanol y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un precipitado gelatinoso con el metxido de
sodio, se emplea metxido de litio en un disolvente de metanol-benceno.
Cuando se emplean soluciones volumtricas de alcxidos de metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el empleo de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes bsicos. El electrodo indicador de antimonio, aunque algo errtico,
resulta til en estos casos. El uso de hidrxidos de amonio cuaternario, por ej., el hidrxido de tetra-n-butilamonio y el hidrxido de trimetilhexadecilamonio (en benceno-metanol o alcohol isoproplico), presenta dos ventajas sobre las otras dos soluciones volumtricas: (a) la sal de tetraalquilamonio del cido valorado es soluble en el medio de valoracin y (b) se puede emplear un par de electrodos de vidrio calomel, de uso corriente en la mayora de los laboratorios analticos, para llevar a cabo
valoraciones volumtricas potenciomtricas.
Debido a la interferencia producida por el dixido de carbono, los disolventes empleados en la valoracin de sustancias cidas se deben proteger de la exposicin excesiva al aire atmosfrico durante la valoracin mediante una proteccin adecuada o
una atmsfera inerte. La absorcin de dixido de carbono se puede determinar mediante la volumetra con un blanco. El blanco no debe exceder ms de 0,01 mL de metxido de sodio SV 0,1 N por mL de disolvente.
El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de color de un indicador, o potenciomtricamente, segn se
especifique en la monografa correspondiente. Si se usa un electrodo de calomel como referencia, es recomendable sustituir la
solucin acuosa de cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio 0,1 N en cido actico glacial para valoraciones
en disolventes cidos o cloruro de potasio en metanol para valoraciones en disolventes bsicos.
Cuando en la monografa correspondiente se indica el uso de estas u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se
modifica retirando en primer lugar la solucin acuosa de cloruro de potasio y el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, enjuagando con agua y luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no acuoso indicado y finalmente, llenando el electrodo con la mezcla no acuosa indicada.
En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el in de plata podra interferir, el electrodo de calomel se puede
sustituir por un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de plata-cloruro de plata es ms resistente y su
Pruebas Qumicas / 541 Volumetra 361
USP 38
uso ayuda a eliminar sales de mercurio txicas del laboratorio. En general se puede utilizar un puente salino para evitar la interferencia del in plata.
Los sistemas ms tiles para volumetra en disolventes no acuosos se indican en la Tabla 1.
Tabla 1. Sistemas para Valoraciones Volumtricas No Acuosas
Tipo de
Disolvente
Disolvente1
cido (para valoracin

de bases y sus sales)
Relativamente Neutro
(para valoracin
diferencial de bases)
Bsico (para valoracin

de cidos)
Relativamente Neutro
(para valoracin
diferencial de cidos)
cido actico glacial
Acetonitrilo
Dimetilformamida
Acetona
Anhdrido actico
Alcoholes
n-Butilamina
Acetonitrilo
cido frmico
Cloroformo
Piridina
Metil etil cetona
cido propinico
Benceno
Etilendiamina
Metil isobutil cetona
Cloruro de sulfurilo
Tolueno
Morfolina
Alcohol terc-butlico
Clorobenceno
Acetato de etilo
Dioxano
Indicador
Cristal violeta
Rojo de metilo
Azul de timol
Azo violeta
Rojo de quinaldina
Naranja de metilo
Thymolphthalein
Azul de bromotimol
p-Naftolbencena
p-Naftolbencena
Alfazurina 2-G
p-Hidroxiazobenceno
Azul de timol
p-Hidroxiazobenceno
Vidriocalomel
Vidriocalomel
Antimoniocalomel
Antimoniocalomel
Vidrioplatacloruro de plata
Calomelplatacloruro de
plata
Antimoniovidrio
Vidriocalomel
Antimonioantimonio2
Vidrioplatino2
Mercurioacetato mercrico
Platinocalomel
Vidriocalomel
1
Los disolventes relativamente neutros de baja constante dielctrica como benceno, tolueno, cloroformo o dioxano se pueden emplear junto con cualquier
disolvente cido o bsico para aumentar la sensibilidad del punto final de la valoracin.
2 En solucin volumtrica.
Indicadores y Deteccin Potenciomtrica del Punto FinalEl mtodo ms simple y conveniente para determinar el punto de equivalencia, es decir, el punto en el que la reaccin analtica estequiomtrica est terminada, es mediante el uso de
indicadores. Estas sustancias qumicas, generalmente coloreadas, responden a cambios en la solucin antes y despus del punto de equivalencia presentando cambios de color que se pueden detectar visualmente como el punto final de la reaccin, lo
que constituye una estimacin confiable del punto de equivalencia.
Un mtodo til de determinacin del punto final es mediante mediciones electroqumicas. Si un electrodo indicador, sensible a la concentracin de la especie sometida a la reaccin volumtrica y un electrodo de referencia cuyo potencial no es sensible a ninguna especie disuelta, se sumergen en la solucin a valorar para formar una celda galvnica, la diferencia de potencial
entre los electrodos se puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la reaccin. Cuando es posible graficar correctamente dichas series de cambios (por ejemplo, para el caso de una valoracin cido-base, el pH en funcin de los
mL de solucin volumtrica agregada; para valoraciones de precipitacin, complejomtricas o de xido-reduccin, los mV en
funcin de los mL de solucin volumtrica agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porcin que cambia rpidamente (punto de ruptura) cerca del punto de equivalencia. El punto medio de esta porcin vertical o punto de inflexin se
puede considerar como punto final. El punto de equivalencia tambin se puede determinar matemticamente sin trazar una
curva de valoracin. Sin embargo, se debe tener en cuenta que en reacciones asimtricas en las que el nmero de aniones que
reaccionan no es igual al nmero de cationes que reaccionan, el punto final definido por la inflexin de la curva de volumetra
no ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiomtrico. En consecuencia, la deteccin potenciomtrica del punto
final mediante este mtodo no es adecuada para reacciones asimtricas, como por ejemplo la reaccin de precipitacin,
2Ag+ + CrO42
y la reaccin de xido-reduccin,
5Fe+2 + MnO4.
Todas las reacciones cido-base, sin embargo, son simtricas. De este modo, la deteccin potenciomtrica del punto final se
puede emplear en valoraciones volumtricas cido-base y en otras valoraciones volumtricas que comprendan reacciones simtricas reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se indique lo contrario en la monografa correspondiente.
Existen dos tipos de tituladores electromtricos. El primero agrega la solucin volumtrica automticamente y registra las
diferencias de potencial del electrodo durante el curso de la titulacin dando la curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo,
Captulos
Verde de malaquita
Electrodos
Azo violeta
o-Nitroanilina
362 541 Volumetra / Pruebas Qumicas
USP 38
el agregado de solucin volumtrica se lleva a cabo automticamente hasta que se alcanza un potencial o pH preseleccionado,
que representa el punto final y en ese momento cesa el agregado de solucin volumtrica.
Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones volumtricas potenciomtricas, se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Sistemas de Electrodos para Valoraciones Volumtricas Potenciomtricas
Valoracin
volumtrica
Ecuacin1
Electrodo indicador
Electrodo de referencia
Aplicaciones2
cido-base
Vidrio
E = k + 0,0591 pH
Calomel o platacloruro de
plata
Valoracin volumtrica de
cidos y bases
Precipitimetra (plata)
Plata
E = E + 0,0591 log [Ag +]
Calomel (con puente salino

de nitrato de potasio)
Valoracin volumtrica con

plata o de plata que comprende haluros o tiocianatos
Complejometra
Mercuriomercurio (II)
E = E + 0,0296(log k pM)
Calomel
Valoracin volumtrica de diversos metales (M), p.ej.,

Mg+2, Ca+2, Al+3, Bi+3, con
EDTA
xidoreduccin
Platino
E = E + (0,0591/n) log
[ox]/[red]
Calomel o platacloruro de
plata
Valoraciones volumtricas
con arsenito, bromo, cerato,
dicromato, hexacianoferrato
(III), yodato, nitrito, permanganato, tiosulfato
Captulos
1 Forma apropiada de la ecuacin de Nernst que describe el sistema de electrodos indicado: k = constante del electrodo de vidrio; k = constante derivada del
equilibrio HgHg(II)EDTA; M = cualquier metal que se pueda valorar con EDTA; [ox] y [red] de la ecuacin, ox + ne
red.
2 La lista es representativa pero no est completa.
Correcciones con un BlancoComo se hizo notar anteriormente, el punto final determinado en una volumetra es una
estimacin del punto de equivalencia de la reaccin. La validez de esta estimacin depende, entre otros factores, de la naturaleza de las sustancias a valorar y de la concentracin de la solucin volumtrica. Para aumentar la confiabilidad de la determinacin del punto final en valoraciones volumtricas, se realiza una correccin con un blanco adecuado. Dicha correccin con un
blanco se obtiene habitualmente mediante una valoracin residual del blanco, en la que el procedimiento indicado se repite en
todos los detalles excepto que la muestra en anlisis se omite. En tales casos, el volumen real de solucin volumtrica, equivalente a la sustancia analizada, es la diferencia entre el volumen consumido en la valoracin residual del blanco y el consumido
en la valoracin de la muestra. El volumen corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la cantidad de sustancia valorada, de la misma manera que se indica en Valoraciones volumtricas residuales. Cuando el punto final se determina
potenciomtricamente, la correccin del blanco en general es inapreciable.
551 VALORACIN DE VITAMINA E

INTRODUCCIN
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina E como ingrediente farmacutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopeicas
en las formas alfa tocoferol (C29H50O2), acetato de alfa tocoferilo (C31H52O3), o succinato cido de alfa tocoferilo (C33H54O5).
Durante toda esta valoracin, proteger de la atmsfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estndar de Referencia y las que deriven de stos, usando preferentemente una atmsfera de gas inerte y material de vidrio
con proteccin actnica.
Cuando se especifique vitamina E (alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato cido de alfa tocoferilo) en el siguiente
procedimiento, usar la forma qumica presente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP pertinente.
VALORACIN
PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de vitamina E en:
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
ste es un procedimiento neutro que implica el uso de dimetil sulfxido para disolver los excipientes en la muestra,
seguido de una extraccin lquido-lquido de la vitamina E con hexano. Luego, el extracto de hexano se evapora al
vaco hasta sequedad, y el residuo se reconstituye con metanol antes de inyectarlo en el cromatgrafo.
USP 38
Pruebas Qumicas / 551 Valoracin de Vitamina E 363
Captulos
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Solucin A: Solucin de cido fosfrico (1 en 100) en agua
Fase mvil: Metanol y Solucin A (19:1)
Solucin de aptitud del sistema: Preparar una solucin de 0,65 mg/mL de ER Ergocalciferol USP en metanol. Transferir
1,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 100 mL que contenga 100 mg de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP.
Disolver en 30 mL de metanol, con ayuda de ultrasonido, si fuera necesario, y diluir con metanol a volumen. Almacenar
esta solucin en un refrigerador.
Solucin estndar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP o ER Succinato cido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, tpicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en anlisis, pero que no exceda de 7,5 g del polvo, a un tubo de
centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido y
aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador
en un bao de agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumtrico. [NOTACapacidad del matraz volumtrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 mL de n-hexano
por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales
de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 mL de esta
solucin a un recipiente adecuado y evaporar al vaco a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo con
ayuda de metanol a un matraz volumtrico adecuado y diluir con metanol a volumen hasta obtener una concentracin de
2 mg/mL de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo.
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porcin de la mezcla, tpicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en anlisis, pero
que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.
[NOTAPara Cpsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas cortando las cubiertas de las Cpsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una masa homognea. Transferir una porcin de la masa, tpicamente equivalente a 20 mg de la forma de
vitamina E en anlisis, pero que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido por cada g del contenido de las Cpsulas y
aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g del contenido de las Cpsulas, y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se
mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y transferir la capa de hexano con
una pipeta a un matraz volumtrico. [NOTACapacidad del matraz volumtrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 mL de nhexano por cada g del contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos
y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 mL
de esta solucin a un recipiente adecuado y evaporar al vaco a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo
con ayuda de metanol a un matraz volumtrico adecuado y diluir con metanol a volumen hasta obtener una concentracin
de 2 mg/mL de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo.
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 8 mm 10 cm; relleno L1 de 5 mm
Aptitud del sistema
[NOTALos tiempos de retencin relativos para ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo son aproximadamente 0,5 y 1,0,
respectivamente.]
Resolucin: No menos de 12 entre ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Factor de asimetra: 0,81,2, Solucin de aptitud del sistema
Anlisis
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato cido de alfa tocoferilo en la porcin de la muestra tomada:
364 551 Valoracin de Vitamina E / Pruebas Qumicas
USP 38
Captulos
rU
rS
CS
= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin muestra

= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin estndar
= concentracin de la forma de vitamina E pertinente del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin estndar (mg/mL)
= concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra (mg/mL)
CU
PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para las formulaciones que contienen vitaminas A, D y E. La aplicacin incluye:
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con cido sulfrico metanlico, seguido de una extraccin
con 2,2,4-trimetilpentano.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin de aptitud del sistema, la Solucin estndar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Mezclar 240 mL de metanol con 10 mL de agua, seguido de 0,5 mL de cido fosfrico al 50%, y diluir con
acetonitrilo hasta 1000 mL.
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en un
matraz volumtrico de 100 mL. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solucin de ascorbato de sodiopirogalol: Transferir 10 g de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumtrico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP y de ER Succinato cido de Alfa Tocoferilo USP en metanol
Solucin estndar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP, o ER Succinato cido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solucin muestra para Tabletas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del
polvo, nominalmente equivalente a una cantidad de 90 mg de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido
de alfa tocoferilo. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de ascorbato de sodiopirogalol, agitar lentamente y
dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y luego agitar durante
12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de
vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos para romper la emulsin y hasta que el sobrenadante se torne transparente. Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumtrico adecuado; el volumen de la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano
y la capacidad del matraz volumtrico son tales que la concentracin final de la Solucin muestra es equivalente a la de la
Solucin estndar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de metanol y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metanol a volumen.
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de
la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada, si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir
el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del
contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 55 mg de vitamina E, a un
recipiente con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de
ascorbato de sodiopirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya
cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en
un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulf-
USP 38

rU
rS
CS
= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin muestra

= respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solucin estndar
= concentracin de la forma de vitamina E pertinente del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin estndar (mg/mL)
CU
= concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra (mg/mL)
[NOTAPara calcular la concentracin nominal, tomar en cuenta el volumen de extraccin inicial de 26,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y el factor de dilucin al cambiar el disolvente de 2,2,4-trimetilpentano a metanol.]
PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para la determinacin de vitamina E en:
Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
Este procedimiento emplea la saponificacin de la muestra, seguida de una extraccin lquidolquido de vitamina E a
partir de la muestra con n-hexano. Evaporar el extracto de hexano hasta sequedad y reconstituir el residuo en una
mezcla de acetonitrilo y acetato de etilo (1:1).
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Acetonitrilo y acetato de etilo (1:1)
Solucin de hidrxido de potasio: [NOTAUsada en la muestra para Solucin Oral.] Transferir 90 g de pellets de hidrxido de potasio a un matraz volumtrico de 100 mL que contenga 60 mL de agua. Mezclar hasta disolver, enfriar y diluir con
agua a volumen.
Solucin estndar: 0,3 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP en Diluyente
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalente a 8 mg de alfa tocoferol, a un matraz de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado. Agregar 25,0 mL de
agua, 25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidrxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un bao de
Captulos
rico metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar
12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 10
minutos. Centrifugar durante 10 minutos para romper la emulsin y hasta que el sobrenadante se torne transparente.
Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumtrico adecuado, el volumen de
la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano y el tamao del matraz volumtrico son tales que la concentracin
final de la Solucin muestra es equivalente a la de la Solucin estndar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de
metanol y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metanol a volumen.
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Aptitud del sistema
[NOTALos tiempos de retencin relativos para succinato cido de alfa tocoferilo, alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo
son aproximadamente 0,6; 0,8 y 1,0, respectivamente.]
Resolucin: No menos de 4,0 entre succinato cido de alfa tocoferilo y alfa tocoferol; no menos de 3,0 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Anlisis
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo en la porcin de la muestra tomada:
Captulos
USP 38
agua mantenido a 55. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 125
mL. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin
de 250 mL y repetir la extraccin con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano.
Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar
3 gotas de cido actico glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a travs de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con
unos pocos mL de n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un bao de
agua mantenido a 50 y evaporar la solucin de hexano con ayuda de un evaporador rotatorio hasta sequedad. Inmediatamente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta disolver el residuo.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido
adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a una cantidad de 8,0 mg de alfa tocoferol, a un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio. Agregar 25,0 mL de agua,
25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidrxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un bao de agua
mantenido a 55. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 125 mL.
Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente
durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin de 250
mL y repetir la extraccin con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los
extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de
cido actico glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a travs de sulfato
de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL
de n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un bao de agua mantenido a 50 y evaporar la solucin de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio. Inmediatamente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta disolver el residuo.
Solucin muestra para Solucin Oral: Transferir una cantidad de Solucin Oral, equivalente a 1,5 mg de alfa tocoferol, a
un matraz Erlenmeyer de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado y agregar 25,0 mL de alcohol deshidratado.
Conectar un condensador de reflujo y someter a reflujo en un bao de agua en ebullicin durante 1 minuto. Agregar con
cuidado 3 mL de Solucin de hidrxido de potasio a travs del condensador y continuar sometiendo a reflujo durante 30
minutos. Retirar el matraz del bao y enjuagar el condensador con aproximadamente 15 mL de agua. Enfriar y transferir
con un volumen mnimo de agua a un embudo de separacin de 250 mL. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y
agregar los enjuagues al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 1 minuto y dejar que las capas se
separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separacin de 250 mL y repetir la extraccin con 50 mL de nhexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua,
dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de cido actico glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces ms. Filtrar la capa de hexano lavada a travs de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo
redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con n-hexano, y agregar el enjuague a la solucin de hexano
en el matraz. Evaporar la solucin de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un bao de
agua mantenido a aproximadamente 50. Inmediatamente, agregar 5,0 mL de Diluyente y agitar por rotacin suave hasta
disolver el residuo.
Modo: HPLC
Detector: UV 291 nm
Aptitud del sistema
Anlisis
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina E, como alfa tocoferol, en la porcin de la muestra tomada:
rU
rS
= respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solucin muestra

= respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solucin estndar
USP 38
CS
CU
= concentracin de ER Alfa Tocoferol USP en la Solucin estndar (mg/mL)

= concentracin nominal de vitamina E, como alfa tocoferol, en la Solucin muestra (mg/mL)
[NOTACalcular el alfa tocoferol equivalente a acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo, multiplicando sus
contenidos por los factores 0,91 0,81, respectivamente.]
Captulos
PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento de cromatografa de gases se usa para la determinacin de vitamina E como ingrediente farmacutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopeicas. Puede usarse para:
Vitamina E
Cpsulas de Vitamina E
Preparacin de Vitamina E
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan y se usan apropiadamente segn se indica a continuacin.
Solucin de estndar interno: 10 mg/mL de escualano en ciclohexano
Solucin de aptitud del sistema: 0,1 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP y de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en ciclohexano
Solucin estndar 1: 10 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP en Solucin de estndar interno
Solucin estndar 2: 10 mg/mL de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en Solucin de estndar interno
Solucin estndar 3: Transferir 30,0 mg de ER Succinato cido de Alfa Tocoferilo USP a un vial de 20 mL. Agregar 2,0 mL
de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0,1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno
y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Ingredientes Activos Farmacuticos
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): 10 mg/mL de Vitamina E (d- o dl-alfa
tocoferol o acetato de d- o dl-alfa tocoferilo) en Solucin de estndar interno
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo): Transferir 30,0 mg de Vitamina E (succinato
cido de d- o dl-alfa tocoferilo) a un vial de 20 mL. Agregar 2,0 mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0,1 mL
de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1
hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de
una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta
disolver.
Soluciones muestra para Preparaciones de Vitamina E
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma lquida): Disolver una porcin
de Preparacin en Solucin de estndar interno para preparar una solucin de Vitamina E (d- o dl-alfa tocoferol o acetato
de d- o dl-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 10 mg/mL.
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo en forma lquida): Transferir una porcin de Preparacin, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o dl-alfa tocoferilo), a un vial de 20 mL. Agregar 2,0
mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0,1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a
ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar
justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Solucin muestra 3 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma slida): Transferir una porcin
de Preparacin, equivalente a 50 mg de alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo, a un matraz adecuado para reflujo.
Agregar 5 mL de agua y calentar en un bao de agua a 60 durante 10 minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter a
reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de ter. Agitar vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
porciones de 25 mL de ter, combinando los extractos con la capa etrea original. Lavar los extractos combinados con
una porcin de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etreas a travs de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrgeno, evaporar la solucin etrea en un bao de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solucin etrea se derrame por ebullicin. Retirar el recipiente del bao de agua cuando queden 5 mL y completar
la evaporacin sin aplicar calor. Disolver el residuo en Solucin de estndar interno para preparar una solucin de Vitamina
E (d- o dl-alfa tocoferol o acetato de d- o dl-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 10 mg/mL.
Solucin muestra 4 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo en forma slida): Transferir una porcin de Preparacin, equivalente a 30 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o dl-alfa tocoferilo), a un matraz adecuado para reflujo. Agregar 5 mL de agua y calentar en un bao de agua a 60 durante 10 minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter
a reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de ter. Agitar
vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
Captulos
USP 38
porciones de 25 mL de ter, combinando los extractos con la capa etrea original. Lavar los extractos combinados con
una porcin de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etreas a travs de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrgeno, evaporar la solucin etrea en un bao de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solucin etrea se derrame por ebullicin. Retirar el recipiente del bao de agua cuando queden 5 mL. Transferir
cuantitativamente el remanente a un vial de 20 mL y completar la evaporacin sin aplicar calor. Agregar 2,0 mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0,1 mL de cido clorhdrico al vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido.
Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno y
mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Cpsulas de Vitamina E
Solucin muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 10 Cpsulas en un
frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cpsulas a un vaso de precipitados de 100 mL.
Retirar cualquier sustancia adherida a las Cpsulas vacas lavando con varias porciones pequeas de n-hexano. Desechar
los lavados y dejar que las Cpsulas vacas se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a nhexano. Pesar las Cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cpsula.
Disolver una porcin del contenido combinado de las Cpsulas en Solucin de estndar interno para preparar una solucin
de Vitamina E (d- o dl-alfa tocoferol o acetato de d- o dl-alfa tocoferilo) con una concentracin nominal de 10 mg/mL.
Solucin muestra 2 (vitamina E como succinato cido de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 10 Cpsulas en un frasco de
pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cpsulas a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier sustancia adherida a las Cpsulas vacas lavando con varias porciones pequeas de n-hexano. Desechar los lavados y
dejar que las Cpsulas vacas se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-hexano. Pesar las
Cpsulas vacas en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cpsula. Transferir una porcin del contenido combinado de las Cpsulas, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato cido de d- o dl-alfa tocoferilo), a un vial de 20 mL. Agregar 2,0 mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y 0,1 mL de cido clorhdrico al
vial. Tapar hermticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora 5 minutos. Retirar
de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un bao de vapor con ayuda de una corriente de nitrgeno.
Agregar 3,0 mL de Solucin de estndar interno y mezclar en un mezclador de vrtice hasta disolver.
Temperaturas
Columna: 280
Inyector: 290
Detector: 290
1 mL/min ERR (01-sep-2014)
Velocidad de flujo:
Relacin de particin: 100:1
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar apropiada
Resolucin: No menos de 3,5 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para los cocientes entre las respuestas de los picos de la forma de vitamina E pertinente y el estndar interno en inyecciones repetidas, Solucin estndar apropriada
Anlisis
Muestras: Solucin estndar y Solucin muestra apropiadas
Calcular el porcentaje de vitamina E en trminos de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato cido de alfa tocoferilo en la porcin de la muestra tomada:
Resultado = (RU/RS) (CS/CU) 100
RU
RS
CS
CU
= cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estndar interno de la Solucin
muestra apropiada
= cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estndar interno de la Solucin estndar apropiada
= concentracin del Estndar de Referencia USP correspondiente en la Solucin estndar apropiada (mg/mL)
= concentracin nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solucin muestra apropiada (mg/mL)
USP 38
Tabla 1
Temperatura
Inicial
()
Rampa de
Temperatura
(/min)
Temperatura
Final
()
Tiempo de Espera
(Hold Time)
a la
Temperatura
Final
(min)
260
20
340

Relacin de particin: 200:1
Aptitud del sistema
Factor de asimetra: No ms de 2,0 para el pico de alfa tocoferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el cociente entre las respuestas de los picos de alfa tocoferol y el
estndar interno en inyecciones repetidas
Anlisis
Calcular el porcentaje de vitamina E como d-alfa tocoferol en la porcin de la muestra tomada:
Resultado = (RU/RS) (WS/WU) 100
RU
RS
WS
= cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estndar interno de la Solucin muestra
= cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estndar interno de la Solucin estndar
= peso de ER Alfa Tocoferol USP usado para preparar la Solucin estndar (mg)
Captulos
PROCEDIMIENTO 5
Este procedimiento de cromatografa de gases se usa para la determinacin de Vitamina E (como d- o dl-alfa tocoferol) en:
Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol (Succinato de vitamina E y polietilenglicol es una mezcla que se forma
mediante la esterificacin de succinato cido de d-alfa tocoferilo y polietilenglicol).
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Disolvente: 0,25 mL de fenolftalena SR en 1 L de alcohol
Solucin de estndar interno: 12 mg/mL de araquidato de etilo en isooctano
Solucin estndar: Transferir 32,5 mg de ER Alfa Tocoferol USP a un matraz de reaccin adecuado. Agregar 2 mL de piridina y 0,5 mL de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%, y calentar el matraz a 100 durante
10 minutos. Enfriar el matraz, agregar 5,0 mL de Solucin de estndar interno seguido de 20 mL de isooctano y agitar.
Solucin muestra: Transferir una cantidad equivalente a 0,1000,160 g de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol fundido a 60 a un tubo de cultivo (de aproximadamente 20 cm de longitud y 2,5 cm de dimetro) equipado con un tapn
de rosca. Agregar 4050 mg de cido ascrbico y unas pocas perlas de ebullicin, seguido de 20 mL de Disolvente.
[NOTASometer la solucin a reflujo suavemente sin que se produzca emisin del contenido. Colocar el tubo en un bloque
de calentamiento ajustado a 100150.] Cuando la muestra se disuelva por completo, agregar 0,25 g de hidrxido de
potasio y continuar sometiendo a reflujo durante 30 minutos. Retirar el tubo del calor y, mientras el contenido est caliente, agregar 12 mL de cido clorhdrico, gota a gota, hasta que la coloracin rosada desaparezca. [PRECAUCINReaccin
exotrmica. Dejar que el cido se deslice poco a poco dentro del tubo para evitar salpicaduras.] Enfriar el tubo, luego lavar
las paredes del tubo con 20 mL de agua. Agregar 5,0 mL de Solucin de estndar interno, tapar y agitar para asegurar un
mezclado minucioso. Dejar el tubo en reposo hasta que se formen dos capas diferenciadas. Transferir 2,53,5 mL de la
capa superior a un matraz de reaccin adecuado y agregar 2,0 mL de piridina seguida de 2,5 mL de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%. Calentar el matraz a 100 durante 10 minutos. Enfriar y luego agregar 12
mL de isooctano.
Temperaturas
Inyector: 280
Detector: 345
Columna: Ver la Tabla 1.

WU
USP 38
= peso de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol tomado para preparar la Solucin muestra (mg)
ER Alfa Tocoferol USP
ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP
ER Succinato cido de Alfa Tocoferilo USP
ER Ergocalciferol USP
561 ARTCULOS DE ORIGEN BOTNICO

MUESTREO
Captulos
Con el fin de reducir el efecto de la desviacin sistemtica de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es necesario asegurar que la composicin de la muestra usada sea representativa de la partida de material que est siendo examinada.
Los procedimientos de muestreo siguientes son el mnimo que se considera aplicable a artculos de origen vegetal. Algunos
artculos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos ms rigurosos que involucren el muestreo de ms envases o de
ms muestras por envase.
Muestra Bruta
Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homognea, tomar
muestras individuales del nmero de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuacin. Cuando la partida
no se puede considerar homognea, dividirla en subpartidas que sean tan homogneas como sea posible y, a continuacin,
muestrear cada una como una partida homognea. Cuando el nmero de envases en la partida (N) es 11 o ms y cada envase
de la partida est marcado en orden con un nmero o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero, intermedio y ltimo.
N de Envases
en la Partida (N)
N de Envases
que Deben Ser Muestreados (n)
110
Todos
1119
11
>19
n = 10 + (N/10)
(Redondear n al siguiente nmero entero ms alto.)

Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar est formado
por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensin, y en el caso de todos los materiales molidos o en
polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del
envase, tomando no menos de dos centros desde ngulos diferentes. Para materiales con partes componentes de ms de 1 cm
en cualquier dimensin, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben
tomar a una profundidad de 10 cm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las
capas interiores.
Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo cuidado de no aumentar el grado de fragmentacin ni de afectar significativamente el contenido de humedad.
Para artculos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las pruebas. Para artculos en envases que contienen entre 1 y 5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del
envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras
y retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen ms de 5 kg, retirar tres muestras, de
modo que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las
muestras y retirar una porcin suficiente para realizar las pruebas.
Muestra de Laboratorio
Preparar la muestra de laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta.
NOTALa reduccin de muestra por cuarteo consiste en la distribucin pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en
la forma de un cuadrado, y la posterior divisin por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes
opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite segn sea necesario hasta obtener la cantidad requerida.
La muestra de laboratorio debe ser de un tamao suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.
USP 38
Pruebas Qumicas / 561 Artculos de Origen Botnico 371
Muestra de Prueba
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la
muestra de prueba segn se indica a continuacin.
Reducir por cuarteo el tamao de la muestra de laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
contine siendo representativa. En el caso de artculos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de
modo que pase a travs de un tamiz de malla estndar N 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede
moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo hacindolo rodar sobre un papel o pao de muestreo, extenderlo hasta formar una capa delgada y retirar la porcin para analizar.
MTODOS DE ANLISIS
Materia Orgnica Extraa
Muestra de PruebaA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, pesar las cantidades siguientes de la muestra de laboratorio, teniendo cuidado de que la porcin tomada sea representativa (reducir la muestra por cuarteo si fuera necesario).
Races, rizomas, corteza y hierbas
500 g
Hojas, flores, semillas y frutos
250 g
Cortar los frmacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g)
50 g
Cenizas Totales
Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba, que represente 24 g del material secado al
aire e incinerar, suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 25, hasta que no quede carbn y
determinar el peso de la ceniza. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbn, extraer la masa carbonizada con agua
caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro exento de ceniza, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la
ceniza quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporar hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de
675 25. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbn, enfriar el crisol, agregar 15 mL de alcohol, deshacer la
ceniza con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 25. Enfriar en un desecador, pesar la ceniza y calcular el porcentaje de ceniza total con referencia al peso del artculo tomado.
Cenizas Insolubles en cido

Calentar a ebullicin la ceniza obtenida segn se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 mL de cido clorhdrico 3 N
durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro exento de ceniza, lavar con agua
caliente, incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en cido calculada con referencia al peso del artculo
tomado.
Cenizas Solubles en Agua

Calentar a ebullicin la ceniza obtenida segn se indica en Cenizas Totales con 25 mL de agua durante 5 minutos. Recoger la
materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro exento de ceniza. Lavar con agua caliente e incinerar durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en
Cenizas Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra segn se determin en
Cenizas Totales.
Extractos Solubles en Alcohol

Mtodo 1 (mtodo de extraccin en caliente)Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en
polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio. Agregar 100 mL de alcohol y pesar el matraz. Agitar y
dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un condensador de reflujo al matraz y calentar a ebullicin suave durante 1 hora,
enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original con alcohol. Agitar y filtrar rpidamente a travs de un filtro seco. Transferir 25
mL del filtrado a una cpsula tarada de fondo plano y evaporar en un bao de agua hasta sequedad. Secar a 105 durante 6
horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extrable
en alcohol en la muestra de prueba.
Captulos
Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgnica extraa tanto como sea posible.
Pesar y determinar el porcentaje de materia orgnica extraa en el peso del artculo tomado.
372 561 Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas
USP 38
Mtodo 2 (mtodo de extraccin en fro)Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo
grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer con tapn de vidrio. Agregar 100 mL de alcohol, tapar el matraz y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente durante las primeras 8 horas y, a continuacin, dejar en reposo. Filtrar rpidamente,
procurando no perder alcohol. Evaporar 25 mL del filtrado hasta sequedad en una cpsula tarada, poco profunda y de fondo
plano, y secar a 105 hasta peso constante. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extrable en alcohol en la muestra de
prueba.
Extractos Solubles en Agua

Mtodo 1 (mtodo de extraccin en caliente)Proceder segn se indica en el Mtodo 1 (mtodo de extraccin en caliente) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol.
Mtodo 2 (mtodo de extraccin en fro)Proceder segn se indica en el Mtodo 2 (mtodo de extraccin en fro) en
Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe usar agua en lugar de alcohol.
Captulos
Fibra Cruda
Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del artculo, con ter. Agregar
200 mL de cido sulfrico diluido en ebullicin (1 en 78) al residuo agotado con ter, en un matraz de 500 mL, y conectar el
matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego pasar a travs de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente
ya no sea cido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 mL de solucin de hidrxido de sodio en ebullicin, ajustada a 1,25% por valoracin volumtrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante
30 minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rpidamente a travs de un filtro tarado, lavar el residuo con agua
hirviendo hasta que el ltimo lavado sea neutro y secar a 110 hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso constante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 110 y el de la ceniza representa el peso de fibra cruda.
NOTALa ebullicin con cido y lcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momento en que el lquido (que se enfra por debajo del punto de ebullicin al agregarlo al matraz fro) vuelve a alcanzar su punto de
ebullicin. Despus de llevar la solucin al punto de ebullicin, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la
ebullicin. Durante la ebullicin, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solucin toda
partcula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la operacin de ebullicin ayuda a evitar la formacin excesiva de espuma.
Contenido de Almidn
Mtodo 1El siguiente es un procedimiento general para todos los azcares reductores y se puede utilizar para determinar
el contenido de almidn en artculos botnicos.
Extracto de MaltaUsar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar. Preparar el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g de
malta molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTASi se usa un mezclador elctrico, mezclar
durante 20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la infusin.
Solucin de PruebaExtraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 10
mL de ter, usando un filtro que retenga completamente el grnulo de almidn ms pequeo. Dejar evaporar el ter del residuo y lavar con 250 mL de solucin de alcohol acuosa (10 en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un
vaso de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60 (evitando, si es
posible, gelatinizar el almidn) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr
una disolucin completa de los azcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco
de agua tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora.
Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el precipitado con porciones sucesivas de 50 mL de solucin de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a travs de un filtro
adecuado hasta que los lavados estn exentos de azcar. [NOTAPara comprobar la presencia de azcar, transferir unas gotas
de los lavados a un tubo de ensayo, agregar 3 4 gotas de una solucin de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por disolucin de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede
uniforme, dejar fluir entre 24 mL de cido sulfrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posicin vertical. Si hay presencia de azcar, la interfase de los dos lquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar
toda la solucin se torna violeta azulado.]
Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua. Sumergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice todo
el almidn. Enfriar el vaso de precipitados a 55, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1
hora. Volver a calentar a ebullicin durante algunos minutos, enfriar a 55, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a
USP 38
esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado en el examen microscpico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar.
Procedimiento GeneralTransferir 200 mL de la Solucin de Prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo,
agregar 20 mL de cido clorhdrico y calentar en un bao de agua hirviendo durante 21/2 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro
con hidrxido de sodio SR, completar la neutralizacin con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y
filtrar. El volumen de la alcuota tomada depende del contenido de almidn de la muestra en anlisis (ver la Tabla 1). La alcuota debera contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de 400
mL resistente a los lcalis, agregar 50 mL de tartrato cprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y
calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la ebullicin durante 2 minutos exactos. Filtrar la solucin caliente de inmediato a travs de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar minuciosamente el precipitado de xido cuproso con agua aproximadamente a 60, luego con 10 mL de alcohol y finalmente con
10 mL de ter.
Tabla 1. Determinacin de la Alcuota ptima
Contenido de Almidn Esperado
(%)
Alcuota
(mL)
60
25
50
35
40
50
30
50
20
50
Porcentaje de dextrosa = (peso de dextrosa en mg 0,1 500)/(peso de la muestra en g alcuota en mL)

Contenido de almidn = % de dextrosa 0,9
Tabla 2. Clculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu2O) (Expresado en mg)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
10
4,0
90
38,9
170
75,1
250
112,8
330
152,2
410
193,7
12
4,9
92
39,8
172
76,0
252
113,7
332
153,2
412
194,7
14
5,7
94
40,6
174
76,9
254
114,7
334
154,2
414
195,8
16
6,6
96
41,5
176
77,8
256
115,7
336
155,2
416
196,8
18
7,5
98
42,4
178
78,8
258
116,6
338
156,3
418
197,9
20
8,3
100
43,3
180
79,7
260
117,6
340
157,3
420
199,0
22
9,2
102
44,2
182
80,6
262
118,6
342
158,3
422
200,1
24
10,0
104
45,1
184
81,5
264
119,5
344
159,3
424
201,1
26
10,9
106
46,0
186
82,5
266
120,5
346
160,3
426
202,2
28
11,8
108
46,9
188
83,4
268
121,5
348
161,4
428
203,3
30
12,6
110
47,8
190
84,3
270
122,5
350
162,4
430
204,4
32
13,5
112
48,7
192
85,3
272
123,4
352
163,4
432
205,5
34
14,3
114
49,6
194
86,2
274
124,4
354
164,4
434
206,5
36
15,2
116
50,5
196
87,1
276
125,4
356
165,4
436
207,6
38
16,1
118
51,4
198
88,1
278
126,4
358
166,5
438
208,7
40
16,9
120
52,3
200
89,0
280
127,3
360
167,5
440
209,8
Captulos
Para soluciones de azcares reductores de relativamente alta pureza, proceder segn se indica en el Mtodo 1A para determinar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el xido cuproso seco. Para soluciones de azcares reductores que contienen grandes cantidades de impurezas orgnicas, incluida sacarosa, proceder segn se indica en el Mtodo 1B para determinar
la cantidad de cobre reducido obtenido por valoracin volumtrica con tiosulfato de sodio.
MTODO 1ASecar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 110 2, enfriar a
temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso del xido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidn por la siguiente frmula:
USP 38
Captulos
Tabla 2. Clculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu2O) (Expresado en mg) (Continuacin)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
xido
Cuproso
(Cu2O)
Dextrosa
(D-Glucosa)
42
17,8
122
53,2
202
89,9
282
128,3
362
168,5
442
210,9
44
18,7
124
54,1
204
90,9
284
129,3
364
169,6
444
212,0
46
19,6
126
55,0
206
91,8
286
130,3
366
170,6
446
213,1
48
20,4
128
55,9
208
92,8
288
131,3
368
171,6
448
214,1
50
21,3
130
56,8
210
93,7
290
132,3
370
172,7
450
215,2
52
22,2
132
57,7
212
94,6
292
133,2
372
173,7
452
216,3
54
23,0
134
58,6
214
95,6
294
134,2
374
174,7
454
217,4
56
23,9
136
59,5
216
96,5
296
135,2
376
175,8
456
218,5
58
24,8
138
60,4
218
97,5
298
136,2
378
176,8
458
219,6
60
25,6
140
61,3
220
98,4
300
137,2
380
177,9
460
220,7
62
26,5
142
62,2
222
99,4
302
138,2
382
178,9
462
221,8
64
27,4
144
63,1
224
100,3
304
139,2
384
180,0
464
222,9
66
28,3
146
64,0
226
101,3
306
140,2
386
181,0
466
224,0
68
29,2
148
65,0
228
102,2
308
141,2
388
182,0
468
225,1
70
30,0
150
65,9
230
103,2
310
142,2
390
183,1
470
226,2
72
30,9
152
66,8
232
104,1
312
143,2
392
184,1
472
227,4
74
31,8
154
67,7
234
105,1
314
144,2
394
185,2
474
228,3
76
32,7
156
68,6
236
106,0
316
145,2
396
186,2
476
229,6
78
33,6
158
69,5
238
107,0
318
146,2
398
187,3
478
230,7
80
34,4
160
70,4
240
108,0
320
147,2
400
188,4
480
231,8
82
35,3
162
71,4
242
108,9
322
148,2
402
189,4
482
232,9
84
36,2
164
72,3
244
109,9
324
149,2
404
190,5
484
234,1
86
37,1
166
73,2
246
110,8
326
150,2
406
191,5
486
235,2
88
38,0
168
74,1
248
111,8
328
151,2
408
192,6
488
236,3
MTODO 1B
Solucin de Tiosulfato de SodioTransferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumtrico de
100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
Solucin de Yoduro de PotasioDisolver 42 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua.
Solucin de Acetato de SodioDisolver 5,74 g de acetato de sodio en 10 mL de agua.
Solucin de CobreTransferir aproximadamente 0,3 g de cobre electroltico puro, pesados con exactitud, a un matraz de
250 mL, agregar 5 mL de cido ntrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 mL de agua y calentar a ebullicin
para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y calentar a ebullicin hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar, agregar 10 mL de Solucin de Acetato de Sodio seguidos de 10 mL de Solucin de Yoduro de Potasio y valorar con la Solucin de Tiosulfato de Sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidn SR para producir un
marcado color azul y continuar con la valoracin. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de potasio y mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoracin hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un mL
de solucin de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 10 mg de cobre. [NOTAEs esencial que la concentracin de
la Solucin de Yoduro de Potasio se regule cuidadosamente. Si la solucin contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la
volumetra, agregar 4,25 g de yoduro de potasio para obtener una solucin total de 100 mL. Si hay presentes cantidades mayores de Cu, agregar lentamente Solucin de Yoduro de Potasio desde una bureta con agitacin constante en cantidades proporcionalmente mayores.]
ProcedimientoLavar con agua el precipitado de xido cuproso obtenido en el Procedimiento General, cubrir este filtro con
un vidrio de reloj y disolver el xido cuproso con 5 mL de cido ntrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj.
Recoger el filtrado en un matraz de 250 mL, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz.
Calentar a ebullicin el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y calentar a ebullicin hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder segn se indica en Solucin de Cobre comenzando donde dice agregar 10 mL de Solucin de Acetato de Sodio. A partir del volumen de Solucin de Tiosulfato de Sodio consumido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicndolo por 1,1259 para obtener el peso, en mg, de xido cuproso. Basndo-
USP 38
(0,9C/106)(V1)(250/V0)(100/E)(100/W) = 2,25CV1/V0EW
en donde E es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada; V0 es el volumen, en mL, de la alcuota tomada del matraz
volumtrico de 250 mL; W es el porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba; y V1 es el volumen, en mL, si se realiza
una dilucin adicional (ver Nota 2 en Soluciones de Prueba). [NOTAV0 es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilucin adicional.]
Captulos
se en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de xido cuproso. El contenido de almidn
equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinacin con un blanco usando 50 mL
de tartrato cprico alcalino SR y 50 mL de Extracto de Malta. Si el peso del xido cuproso as obtenido excede 0,5 mg, corregir
el resultado de la determinacin de forma adecuada. [NOTAEl tartrato cprico alcalino SR se deteriora en reposo y la cantidad de xido cuproso obtenida en la determinacin con un blanco aumenta.]
Mtodo 2El mtodo siguiente es especfico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede
explicar las diferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no
varan en ms de 2%.
Solucin de GlucoamilasaPreparar una solucin de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales
(UI)/mL. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra
de prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI.
Solucin Amortiguadora de AcetatoDisolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 mL de agua, agregar 12,0 mL de cido actico glacial y mezclar. El pH de esta solucin es 4,8.
Solucin Amortiguadora de FosfatoDisolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobsico de
sodio en 50,0 mL de agua. Ajustar con cido fosfrico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37, diluir con agua hasta 100,0
mL y mezclar. [NOTAEl pH del medio de la solucin amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH deseado a la temperatura que se utilizar durante la incubacin.]
Solucin EnzimticaDisolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo II de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo I de rbano
picante) y 10 mg de ferrocianuro de potasio en 100 mL de Solucin Amortiguadora de Fosfato. [NOTAEsta mezcla se puede
almacenar en un refrigerador durante un perodo de hasta 10 das.]
cido Sulfrico 18 NAgregar lentamente, mezclando, 54 mL de cido sulfrico a 102 mL de agua, dejar que se enfre a 25
y mezclar.
Soluciones EstndarDisolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solucin
que contenga 1,0 mg de ER Dextrosa USP por mL. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solucin en agua
para obtener las Soluciones Estndares A, B, C, D y E, con concentraciones conocidas de 10, 20, 25, 40 y 50 mg/mL de ER Dextrosa USP, respectivamente. [NOTAEsperar 4 horas para que termine la mutarrotacin antes de usar.]
Soluciones de PruebaExtraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25 mL
de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en un horno de aire a 105 durante aproximadamente 8 horas. [NOTA 1Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibir la glucoamilasa.] Enfriar y transferir el
matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de prueba,
pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 mL de agua y ajustar con cido fosfrico a un pH entre
5,07,0; si fuera necesario. Calentar a ebullicin la suspensin durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a un
autoclave y calentar a 135 durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura prxima a 55 y agregar
2,5 mL de Solucin Amortiguadora de Acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solucin a 45 1 g. Sumergir el
matraz en un bao de agua mantenido a 55 1 y agregar 5 mL de Solucin de Glucoamilasa. Agitar el matraz por rotacin
suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrlisis, pasar a travs de un papel de filtro a un matraz volumtrico de 250 mL, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con
agua a volumen y mezclar. Transferir 1 mL de una alcuota que contenga entre 2060 mg de D-glucosa a cada uno de cinco
tubos de ensayo. [NOTA 2Para obtener el intervalo de concentracin de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente
con agua a volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 mL de Solucin Enzimtica a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colocarlos en la oscuridad a 37 1 durante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 minutos, agregar 2 mL de cido Sulfrico 18 N a cada uno de los tubos de ensayo para detener la reaccin y mezclar.
Solucin ControlTransferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidn a un matraz tarado
previamente y proceder segn se indica en Soluciones de Prueba, comenzando donde dice agregar 25 mL de agua y ajustar el
pH con cido fosfrico.
ProcedimientoDeterminar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones Estndar y las Soluciones de Prueba a la
longitud de onda de absorbancia mxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotmetro apropiado, utilizando la
Solucin Control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones Estndar en funcin de la concentracin, en mg/mL, de dextrosa, y trazar la lnea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A
partir de la grfica as obtenida, determinar la concentracin, C, en mg/mL, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba
y calcular la concentracin promedio, en mg/mL, de la solucin en anlisis. El porcentaje del contenido de almidn en el peso
de la muestra de prueba tomada se calcula por la frmula:
USP 38
Determinacin de Aceite Voltil

Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magntico.
Introducir en el matraz una barra de agitacin magntica de forma ovoide y acoplar un condensador de tubo enfriado por
agua y una trampa para aceite voltil apropiada del tipo que se ilustra.
Captulos
Trampas para Aceite Voltil

Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del artculo para producir entre 1 y 3 mL de aceite voltil. Normalmente
no es necesario triturar semillas, frutos pequeos u hojas quebradas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no
fuera posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrn purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del
artculo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecuado. Calentar a ebullicin el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullicin suave
durante 2 horas, o hasta que el aceite voltil se haya separado completamente del artculo y ya no se recoja en el tubo graduado del separador.
Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite voltil en el tubo graduado del separador, se puede leer en dcimos de 1
mL, y se puede calcular el volumen de aceite voltil por cada 100 g del artculo usando el peso del artculo tomado para el
anlisis. Las graduaciones en el separador para aceites ms pesados que el agua se colocan de manera que el aceite permanezca por debajo del condensado acuoso que fluye automticamente de regreso al matraz.
Contenido de Agua
Para artculos sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 10 g de la Muestra de Laboratorio cortando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los
frutos ms pequeos de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar
que no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparacin y que la porcin tomada sea representativa de
la Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua segn se indica en Procedimiento para Artculos de Origen Botnico
en Determinacin de Agua 921, Mtodo III (Gravimtrico).
PRUEBA DE AFLATOXINAS
[PrecaucinLas aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales que contienen aflatoxinas.]
Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g
para aflatoxina B1 (AFB1) y no ms de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2). Se puede
usar un enfoque basado en el riesgo de contaminacin para determinar el alcance de la prueba. Al determinar el cumplimiento, se considera la presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan los siguientes procedimientos analticos para determinar el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo I. Si la aptitud del
sistema no cumple con los requisitos, usar el Mtodo II o el Mtodo III.
Mtodo I
La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 en cualquier material de origen
vegetal.
Reactivo de Acetato de CincCloruro de AluminioDisolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua
suficiente para obtener 100 mL.
Solucin de Cloruro de SodioDisolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua.
USP 38
Mtodo II
Solucin de Cloruro de SodioVer Mtodo I.
Captulos
Solucin de Prueba 1Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximadamente 50 g pesados con exactitud de material en polvo a un matraz con tapn de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de
metanol y agua (17:3). Agitar mecnicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTASi la solucin contiene pigmentos vegetales que interfieren, proceder segn se indica para la Solucin de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del filtrado y recoger la porcin siguiente de 40 mL. Transferir el filtrado a un embudo de separacin. Agregar 40
mL de Solucin de Cloruro de Sodio y 25 mL de ter de petrleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y
transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separacin. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separacin, cada vez con 25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgnica inferior y recoger las capas orgnicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Evaporar el disolvente orgnico en un bao de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un bao de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder segn se indica para Procedimiento de Limpieza en Solucin de Prueba 2; de lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de
cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecnicamente si fuera necesario.
Solucin de Prueba 2Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 mL.
Agregar 20 mL de Reactivo de Acetato de CincCloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g de un coadyuvante de filtracin adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar
los primeros 50 mL del filtrado y recoger la porcin siguiente de 80 mL. Proceder segn se indica para la Solucin de Prueba 1,
comenzando donde dice Transferir el filtrado a un embudo de separacin.
Procedimiento de LimpiezaColocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapn de lana de vidrio en el
fondo de un tubo cromatogrfico de 10 mm 300 mm. Preparar una suspensin espesa de 2 g de gel de slice con una mezcla de ter etlico y ter de petrleo (3:1), verter la suspensin espesa en la columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de
disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de
sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar
el matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una velocidad de no ms de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de ter de petrleo, 3 mL de ter etlico y 3 mL de
cloruro de metileno, eluir a una velocidad de no ms de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una
mezcla de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no ms de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda
de vaco. Recoger este eluato en un vial pequeo, agregar una perla de ebullicin si fuera necesario y evaporar hasta sequedad
en un bao de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecnicamente si fuera necesario.
Solucin de Prueba 3Si existen interferencias con el residuo, proceder segn se indica en Procedimiento de Limpieza con
IAC en Solucin de Prueba en Mtodo II.
Solucin de Aflatoxinas[PrecaucinLas aflatoxinas son muy txicas. Manipular con cuidado.] Diluir el ER Aflatoxinas USP
1:5 con acetonitrilo para obtener una solucin con una concentracin de 0,4 mg/mL de AFB1 y de AFG1, y 0,1 mg/mL de AFB2
y de AFG2.
ProcedimientoAplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 10 mL de la Solucin de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 10 mL de la
Solucin de Prueba 1, Solucin de Prueba 2, o Solucin de Prueba 3 a una placa adecuada para cromatografa en capa delgada
(ver Cromatografa 621) recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 0,25 mm. Superponer 5 mL
de la Solucin de Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 10 mL de la Solucin de Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma en una cmara no saturada que contenga una fase mvil constituida por una mezcla de
cloroformo, acetona y alcohol isoproplico (85:10:5) hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido no menos de 15 cm
desde el origen. Retirar la placa de la cmara de desarrollo, marcar el frente de la fase mvil y dejar que la placa se seque al
aire. Localizar las manchas en la placa bajo luz UV a 365 nm.
Aptitud del SistemaLas cuatro aplicaciones de la Solucin de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba que concide en tono y ubicacin
con aqullas de la Solucin de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba con la Solucin de Aflatoxinas
superpuesta no es de menor intensidad que la de la Solucin de Aflatoxinas correspondiente.
Criterios de AceptacinNinguna mancha de las aplicaciones de la Solucin de Prueba corresponde a las manchas obtenidas con las aplicaciones de la Solucin de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solucin de Prueba, comparar la ubicacin de cada mancha fluorescente de la Solucin de Prueba con las de la Solucin de Aflatoxinas para identificar el
tipo de aflatoxina presente. La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solucin de Prueba, cuando se
compara con la de la aflatoxina correspondiente en la Solucin de Aflatoxinas representa la concentracin aproximada de aflatoxina en la Solucin de Prueba. Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los
lmites son no ms de 5 ng/g para AFB1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2, a menos que se especifique algo diferente.
Captulos
USP 38
Solucin Salina Amortiguada con FosfatoPreparar una solucin amortiguadora de fosfato 10 mM que contenga cloruro
de sodio 0,138 M y cloruro de potasio 0,0027 M en agua, y ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,4.1
Columna de Inmunoafinidad (IAC, por sus siglas en ingls)Antes de acondicionar, ajustar la IAC a temperatura ambiente. Para acondicionar, aplicar 10 mL de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a travs
de la columna por gravedad a una velocidad de 23 mL/min. Dejar 0,5 mL de la Solucin Salina Amortiguada con Fosfato sobre
la parte superior de la columna hasta que se aplique la Solucin de Prueba.
Solucin de Prueba
Extraccin de la MuestraTransferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exactitud, a
un matraz con tapn de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metanol y agua (17:3). Agitar mecnicamente en forma
vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porcin siguiente de 4
mL. Transferir el filtrado a un embudo de separacin. Agregar 4 mL de Solucin de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano y agitar
durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separacin.
Extraer la capa acuosa en el embudo de separacin dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando durante
1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgnica inferior, y recoger las capas orgnicas combinadas
en un matraz Erlenmeyer de 50 mL. Evaporar el disolvente orgnico en un bao de agua. Transferir el extracto remanente a un
tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un bao de agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias en el
residuo, proceder segn se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo obtenido anteriormente en 200 mL de acetonitrilo y agitar mecnicamente, si fuera necesario.
Procedimiento de Limpieza con IACDisolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metanol y agua (60:40) y luego diluir con
5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 10 mL de Solucin Salina
Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metanol. Evaporar el eluato con nitrgeno y disolver el residuo en 200
mL de acetonitrilo.
Solucin de Aflatoxinas[PrecaucinLas aflatoxinas son muy txicas. Manipular con cuidado.] Diluir cuantitativamente el
ER Aflatoxinas USP 1:50 con acetonitrilo para obtener una solucin que contenga 0,04 mg/mL de AFB1 y de AFG1, y 0,01
mg/mL de AFB2 y de AFG2.
AnlisisAplicar por separado 5; 7,5 y 10 mL de Solucin de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 10 mL de la Solucin de Prueba
a un placa para HPTLC adecuada (ver Cromatografa 621) recubierta con una capa de mezcla de gel de slice para cromatografa de 200 mm. Superponer 5 mL de Solucin de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 10 mL de la Solucin de
Prueba. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cmara saturada que contenga una fase
mvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido no menos de 72 mm desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cmara de desarrollo,
marcar el frente de la fase mvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa
mediante el barrido de la densidad de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicacin de cada mancha
fluorescente de la Solucin de Prueba con las de la Solucin de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La
concentracin de aflatoxinas en la Solucin de Prueba se puede calcular a partir de la curva de calibracin obtenida de los datos
de barrido con Solucin de Aflatoxinas.
Aptitud del SistemaLas cuatro aplicaciones de Solucin de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba que coincida en tono y ubicacin con
las de Solucin de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solucin de Prueba con la Solucin de Aflatoxinas superpuesta no
es de menor intensidad que la de la Solucin de Aflatoxinas correspondiente. La recuperacin media de la cantidad agregada
conocida de AFB1 y AFG1 es no menos de 70%.
Criterios de Aceptacin Cuando la monografa individual requiere el cumplimiento con los lmites de aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g para AFB1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2, a menos que especifique algo diferente.
Mtodo III
Se proporciona este mtodo de prueba como un ejemplo para la deteccin de la presencia posible de AFB1 y de aflatoxinas
totales (AF: suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2). Se ha demostrado que este mtodo es adecuado para ginseng y jengibre en
polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artculos de origen botnico.
Solucin Amortiguadora de Fosfato 0,1 MDisolver 8,69 g de fosfato disdico anhidro y 4,66 g de fosfato monosdico
anhidro o 5,36 g de fosfato monosdico monohidrato en 800 mL de agua, ajustar con hidrxido de sodio 2 M a un pH de 7,4,
agregar 10 mL de polisorbato 20, y diluir hasta 1 L.
Solucin Salina Amortiguada con FosfatoPreparar segn se indica en el Mtodo II.
Soluciones Estndar de Trabajo de AflatoxinasPreparar seis soluciones en sendos matraces volumtricos de 10 mL segn la Tabla 3. Diluir con una mezcla de metanol y agua (1:1, v/v) a volumen. Almacenar en un refrigerador y equilibrar a
temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las soluciones en el da de su uso.
Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-3813.
USP 38
Tabla 3. Preparacin de Soluciones Estndar de Trabajo de Aflatoxinas

Concentracin Final de Aflatoxinas
de la Solucin Estndar de Trabajo de Aflatoxinas
(ng/mL)
Soluciones Estndar de Trabajo de

Aflatoxinas
ER Aflatoxinas USP
(mL)
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
SAF
12,5
0,25
0,0625
0,25
0,0625
0,625
25
0,5
0,125
0,5
0,125
1,25
50
0,25
0,25
2,5
100
0,5
0,5
200
10
2
3
Columna de AflaOchraTest (G1017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
Celda fotoqumica para derivatizacin post-columna, tipo PHRED Reactor Fotoqumico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar no mirar
directamente la lmpara UV.
4 Celda electroqumica para derivatizacin post-columna, tipo Kobra (R-Biopharm Inc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender la
corriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
Captulos
Columna de Inmunoafinidad (IAC)2Usar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos monoclonales de
reactividad cruzada con AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2. Las columnas de inmunoafinidad tienen una capacidad mnima de no menos
de 100 ng de aflatoxinas totales y proporcionan una recuperacin de no menos de 80% para AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2 cuando
se aplican 5 ng de AFB1, de AFB2, de AFG1 y de AFG2 en 10 mL de metanol al 10% en Solucin Salina Amortiguada con Fosfato
(v/v).
Solucin de Prueba
ExtraccinPesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrfuga de 50 mL. Agregar 1 g de cloruro
de sodio y 25 mL de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300). Mezclar en un mezclador de vrtice
hasta que las partculas de muestra y el disolvente de extraccin se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s2) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos
firme. Pipetear y transferir de inmediato 7 mL a un tubo de centrfuga de 50 mL, agregar 28 mL de Solucin Amortiguadora de
Fosfato 0,1 M, mezclar y filtrar a travs de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 mL del filtrado (equivalente a 1 g de la
muestra de prueba) en una probeta graduada de 25 mL y proceder inmediatamente con la cromatografa de IAC.
Limpieza de IAC[NOTAPara la limpieza de IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente. Retirar la
tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermtico). Dejar que el lquido pase a
travs de la columna hasta dejar aproximadamente 23 mm de lquido por encima del lecho de la columna. Transferir los 25
mL del filtrado, obtenido en Extraccin, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a travs de la columna por gravedad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar
aproximadamente 2 mL de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de
solvente, lavar la columna con 3 mL adicionales de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 mL de agua (se puede agregar 5 mL de Solucin Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan
otras tcnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facilidad). Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 mL de aire a travs de la columna con una jeringa. Eluir con 1 mL de
metanol y recoger los analitos en un matraz volumtrico de 3 mL, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la columna se seque. Dejar en reposo durante 1 minuto, luego eluir con 1 mL adicional de metanol, y recoger en el mismo matraz
volumtrico. Dejar que la columna se seque y forzar 10 mL de aire a travs de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen.
Usar esta dilucin como la Solucin de Prueba y realizar el anlisis de aflatoxinas de inmediato.
Solucin de Aptitud del SistemaPreparar una muestra adicionada, agregando 5 mL de Solucin Estndar de Trabajo de
Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g, repitiendo el procedimiento para la Solucin de Prueba, usando 20 mL en lugar de 25 mL
de la mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300).
Sistema Cromatogrfico
Velocidad de Flujo0,8 mL/minuto
DeteccinDetector de fluorescencia; ajustar la longitud de onda de excitacin (Ex) a 362 nm y la longitud de onda de
emisin (Em) a 440 nm.
Columna4,6 mm 15 cm; relleno L1 de 3 mm
Fase MvilIsocrtica
PARA DERIVATIZACIN POST-COLUMNA CON CELDA FOTOQUMICA3Agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150)
PARA DERIVATIZACIN POST-COLUMNA CON CELDA ELECTROQUMICA4Una solucin preparada mezclando 1 L de una mezcla de
agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150); 350 mL de cido ntrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio
Sistemas de Derivatizacin Post-Columna (PCD, por sus siglas en ingls)
CELDA PHREDCelda fotoqumica para derivatizacin post-columna3
CELDA KOBRACelda electroqumica, celda de bromacin para derivatizacin post-columna.4
Captulos
USP 38
Anlisis
Derivatizacin Post-Columna para AflatoxinasUsar una celda fotoqumica o electroqumica. Inyectar 50 mL de blanco de
reactivo (Solucin Estndar de Trabajo de Aflatoxinas 1), las Soluciones Estndares de Trabajo de Aflatoxinas 26 o la Solucin de
Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solucin de Prueba comparando los tiempos de retencin con los de los estndares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG2, AFG1, AFB2 y AFB1. Despus de pasar a travs
de la celda fotoqumica o electroqumica, AFG1 y AFB1 han derivatizado para formar AFG2a (derivado de AFG1) y AFB2a (derivado de AFB1). [NOTALas estructuras qumicas de los derivados que resultan de bromacin electroqumica y fotlisis no son
iguales. Las estructuras de los productos de fotlisis de AFB1 y AFG1 no se han definido.] Los tiempos de retencin de AFG2,
AFG2a, AFB2 y AFB2a estn entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoqumica; los tiempos de retencin
usando la celda electroqumica resultan en perodos de tiempo ms breves. Los picos se deben resolver hasta la lnea base.
Construir una curva estndar para cada aflatoxina. Determinar la concentracin de cada aflatoxina en la Solucin de Prueba a
partir de la curva de calibracin.
Curvas de Calibracin de AflatoxinasSe preparan las curvas de calibracin para cada una de las aflatoxinas usando las Soluciones Estndar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el intervalo de
0,254 ng/mL para AFB1 y AFG1, y el intervalo de 0,06251 ng/mL para AFB2 y AFG2. Construir las curvas de calibracin antes
de su anlisis segn la Tabla 3 y verificar la linealidad de la grfica. Si el rea de respuesta de la porcin de prueba se encuentra
fuera (ms alto) del intervalo de la calibracin, entonces la Solucin de Prueba debe diluirse con una mezcla de metanol y agua
(1:1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC.
Cuantificacin de AflatoxinasSe realiza la cuantificacin de aflatoxinas midiendo las reas de los picos a cada tiempo de
retencin de aflatoxina y comparndolos con la curva de calibracin correspondiente.
Aptitud del SistemaLa recuperacin media de la cantidad agregada conocida de AFB1 (2 mg/kg) y de aflatoxinas totales
(5 mg/kg) es no menos de 68% y 70%, respectivamente. La desviacin estndar relativa (RSD) es no ms de 10% para AFB1 y
para aflatoxinas totales.
ClculosGraficar el rea del pico (respuesta, eje y) de cada estndar de toxina en funcin de la concentracin (ng/mL, eje
x) y determinar la pendiente (S) y la interseccin con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente
frmula:
Toxina (mg/kg) = {[(R a)/S] V/W} F
en donde R es el rea del pico de la Solucin de Prueba; V es el volumen final de la Solucin de Prueba inyectada (mL); y F es el
factor de dilucin. F = 1 cuando V = 3 mL. W es 1 g de la muestra de prueba pasada a travs de la columna de inmunoafinidad. Las aflatoxinas totales son la suma de AFG2, AFG1, AFB2 y AFB1.
Criterios de aceptacinCuando la monografa individual requiera cumplimiento con los lmites para aflatoxinas, los lmites son no ms de 5 ng/g para AFB1 y no ms de 20 ng/g para la suma de AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2, excepto cuando se indique
algo diferente.
MTODO GENERAL PARA ANLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS

DefinicinSiempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominacin de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o
mezcla de sustancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas o animales que provocan
daos durante la produccin, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercializacin de artculos puros, o
que interfieren de algn otro modo con estos procesos. La denominacin incluye sustancias elaboradas para ser usadas como
reguladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o despus de la
cosecha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.
LmitesDentro de los Estados Unidos, muchos productos botnicos se tratan como suplementos dietticos y por eso estn sujetos a las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley
Federal sobre Alimentos, Medicamentos y Productos Cosmticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los lmites de plaguicidas en alimentos estn determinados por la Agencia de Proteccin del Medio Ambiente (EPA - Environmental Protection
Agency) segn se indica en el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos [Code of Federal Regulations (40 CFR Part 180)] o
el Diario Oficial (FR - Federal Register). Para plaguicidas qumicos sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA, los valores
lmites deben estar por debajo del lmite de deteccin del mtodo especificado. Los resultados con valores menores a los lmites de deteccin de la EPA se consideran cero. Por lo tanto, los lmites aqu detallados no son vlidos en los Estados Unidos
cuando los artculos de origen botnico estn etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los lmites se pueden aplicar
en otros pases donde se permite la presencia de residuos de plaguicidas. A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, el artculo a examinar debe cumplir con los lmites indicados en la Tabla 4. Los lmites de supuestos plaguicidas que no se indican en la Tabla 4 deben cumplir las reglamentaciones de la EPA. En casos en donde un plaguicida no se
indica en la Tabla 4 ni en las reglamentaciones de la EPA, calcular el lmite por la frmula:
Lmites (mg/kg) = AM/100B
USP 38
en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; M es el peso corporal,
en kg (60 kg); y B es la dosis diaria del artculo, en kg.
Si el artculo est destinado para la preparacin de extractos, tinturas o otras formas farmacuticas de la cual el mtodo de
preparacin modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los lmites por la frmula:
Lmites (mg/kg) = AME/100B
donde E es el factor de extraccin del mtodo de preparacin, determinado experimentalmente; y A, M y B se definen anteriormente.
Puede concederse una exencin total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los
plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y despus de cosechar) del tratamiento de la partida y se
puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prcticas agrcolas y de recoleccin (GACP, por sus siglas en ingls).
Tabla 4
Sustancia
Lmite
(mg/kg)
Acefato
0,1
Alaclor
0,05
Aldrina y dieldrina (suma de)
0,05
Azinfos-etlico
0,1
Azinfos-metlico
Bromuro inorgnico (calculado como in bromuro)
50
0,05
0,05
Bromopropilato
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano)
0,05
Clorfenvinfos
0,5
Clorpirifos-etlico
0,2
Clorpirifos-metlico
0,1
Clortal-dimetlico
0,01
Ciflutrina (suma de)
0,1
l-Cihalotrina
Cipermetrina e ismeros (suma de)
DDT (suma de o,p-DDE, p,p-DDE, o,p-DDT, p,p-DDT, o,p-TDE y p,p-TDE)
Deltametrina
0,5
Diazinn
0,5
Diclofluanida
0,1
Diclorvos
Dicofol
0,5
Dimetoato y ometoato (suma de)
0,1
Ditiocarbamatos (expresado como CS2)
Endosulfn (suma de ismeros y sulfato de endosulfano)
Endrina
Etin
Etrimfos
0,05
2
0,05
Fenclorofos (suma de fenclorofos y fenclorofos-oxn)
0,1
Fenitrotin
0,5
Fenpropatrina
0,03
Fensulfotin (suma de fensulfotin, fensulfotin-oxn, fensulfotin-oxonsulfona y fensulfotin-sulfona)
0,05
Fentin (suma de fentin, fentin-oxn, fention-oxn-sulfona, fentin-oxn-sulfxido, fentin-sulfona y

fentin-sulfxido)
0,05
Fenvalerato
1,5
Flucitrinato
0,05
t-Fluvalinato
0,05
Fonofos
0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepxido y trans-heptaclorepxido)
0,05
Hexaclorbenceno
0,1
Captulos
Bromofos-etlico
Bromofos-metlico
USP 38
Lmite
(mg/kg)
Sustancia
Hexaclorociclohexano (suma de ismeros a-, b -, - y e-)
0,3
ERR (01-jul-2014)
Lindano (g-hexaclorociclohexano)
0,6
Malatin y malaoxn (suma de)
Mecarbam
0,05
Metacrifos
0,05
Metamidofos
0,05
Metidatin
0,2
Metoxiclor
0,05
Mirex
0,01
Monocrotofos
0,1
Paratin-etlico y Paraoxn-etlico (suma de)
0,5
Paratin-metlico y Paraoxn-metlico (suma de)
0,2
Pendimetalina
0,1
Pentacloranisol
0,01
Captulos
Permetrina e ismeros (suma de)
Fosalona
0,1
Fosmeto
0,05
Butxido de piperonilo
Pirimifos-etlico
0,05
Pirimifos-metlico (suma de pirimifos-metlico y N-desetil-pirimifos-metlico)
Procimidona
0,1
Profenofos
0,1
Protiofos
0,05
Piretro (suma de cinerina I, cinerina II, jasmolina I, jasmolina II, piretrina I y piretrina II)
Quinalfos
3
0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina y metil pentaclorofenil sulfuro)
S-421
0,02
Tecnaceno
0,05
Tetradifona
0,3
Vinclozolina
0,4
ReactivosUsar reactivos y disolventes que estn libres de cualquier contaminante, especialmente plaguicidas, que puedan
interferir en el anlisis. Con frecuencia es necesario usar disolventes de grado especial adecuados para el anlisis de residuos de
plaguicidas, o disolventes que se hayan vuelto a destilar recientemente en un aparato totalmente de vidrio. En todos los casos,
se han de realizar pruebas con un blanco adecuado.
Preparacin del AparatoLimpiar todo el equipo, especialmente el material de vidrio, para garantizar que est libre de
plaguicidas. Remojar todo el material de vidrio durante un mnimo de 16 horas en una solucin detergente sin fosfatos, enjuagar con abundante agua destilada y, a continuacin, lavar con acetona, seguida de hexano o heptano.
Anlisis Cualitativo y Cuantitativo de Residuos de PlaguicidasEmplear procedimientos analticos validados (p.ej., FDA
Pesticide Analytical Manual (PAM) [http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/PesticideAnalysisManualPAM/default.htm], u otros procedimientos analticos validados de acuerdo con la gua de la UE [NOTAN de documento
SANCO/10232/2006, http://ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf] o Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225.) que cumplan con los criterios siguientes. El mtodo, especialmente con respecto a los pasos de purificacin, es
adecuado para la combinacin de residuos de plaguicidas y la sustancia en anlisis, y no es susceptible a interferencias de sustancias coextrables. Medir los lmites de deteccin y cuantificacin para cada combinacin de matriz de plaguicida que debe
ser analizada: el mtodo muestra la recuperacin de entre 70% y 110% de cada plaguicida; la repetibilidad y la reproducibilidad del mtodo son no menores que los valores apropiados indicados en la Tabla 5; y las concentraciones de las soluciones de
prueba y de referencia y la calibracin del aparato son tales que se obtiene una respuesta lineal del detector analtico.
Tabla 5
Intervalo de Concentracin
de los Plaguicidas
(mg/kg)
Repetibilidad
(RSD)
(%)
Reproducibilidad
(RSD)
(%)
0,001 0,01
30
60
> 0,01 0,1
20
40
USP 38
Intervalo de Concentracin
de los Plaguicidas
(mg/kg)
Repetibilidad
(RSD)
(%)
Reproducibilidad
(RSD)
(%)
> 0,1 1
15
30
>1
10
20
PRUEBAS DE PLAGUICIDAS
Captulos
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se pueden usar los mtodos siguientes para el anlisis
de plaguicidas. En funcin de la sustancia que se est examinando, puede ser necesario modificar, extensamente en ocasiones,
el procedimiento descrito a continuacin. Adems, puede ser necesario llevar a cabo otro mtodo con otra columna con una
polaridad diferente, otro mtodo de deteccin (p.ej., espectrometra de masa) o un mtodo diferente (p.ej., mtodo inmunoqumico) para confirmar los resultados.
Extraccin[NOTAEmplear el procedimiento siguiente para el anlisis de muestras de artculos que tengan un contenido
de agua de menos de 15%. Las muestras que tengan un contenido de agua mayor se pueden secar, siempre que el procedimiento de secado no afecte significativamente el contenido del plaguicida.] Agregar 100 mL de acetona a 10 g de la sustancia
en polvo grueso en anlisis y dejar en reposo durante 20 minutos. Agregar 1 mL de una solucin en tolueno que contenga 1,8
mg de carbofenotin por mL. Mezclar en un mezclador de alta velocidad durante 3 minutos. Filtrar esta solucin y lavar el
residuo con dos porciones de 25 mL de acetona. Combinar el filtrado y los lavados, y calentar, en un evaporador rotatorio,
manteniendo la temperatura del bao por debajo de 40 hasta que el disolvente se haya evaporado casi por completo. Agregar al residuo unos pocos mL de tolueno y volver a calentar hasta que se elimine totalmente la acetona. Disolver el residuo en
8 mL de tolueno. Pasar a travs de un filtro de membrana con un tamao de poro de 45 mm, enjuagar el matraz y el filtro con
tolueno, diluir con tolueno hasta 10,0 mL (Solucin A) y mezclar.
Purificacin
Insecticidas Organoclorados, Organofosforados y PiretroidesEquipar un cromatgrafo de exclusin por tamao con una columna de acero inoxidable de 7,8 mm 30 cm con relleno L21 de 5 mm. El tolueno se usa como fase mvil a una velocidad de
flujo de aproximadamente 1 mL/minuto.
Funcionamiento de la ColumnaInyectar 100 mL de una solucin de tolueno que contenga, en cada mL, 0,5 mg de rojo de
metilo y 0,5 mg de azul de oracet o equivalente. La columna no es adecuada a menos que el color de los eluatos cambie de
anaranjado a azul en un volumen de elucin de aproximadamente 10,3 mL. Calibrar la columna, si fuera necesario, usando
una solucin en tolueno que contenga concentraciones adecuadas del plaguicida de inters que tenga el menor peso molecular (por ejemplo, diclorvos) y del que tenga el mayor peso molecular (por ejemplo, deltametrina). Determinar qu fraccin del
eluato contiene ambos plaguicidas.
Purificacin de la Solucin de PruebaInyectar un volumen adecuado (100 a 500 mL) de Solucin A en el cromatgrafo. Recoger la fraccin (Solucin B) segn se indica ms arriba en Funcionamiento de la Columna. Los plaguicidas organofosforados eluyen entre 8,8 y 10,9 mL. Los plaguicidas organoclorados y piretroides eluyen entre 8,5 y 10,3 mL.
Insecticidas Organoclorados y PiretroidesEn una columna cromatogrfica de 5 mm 10 cm, introducir una pieza de algodn exenta de grasa y 0,5 g de gel de slice tratado del siguiente modo. Calentar el gel de slice para cromatografa en un
horno a 150 durante al menos 4 horas. Dejar que se enfre y agregar, gota a gota, una cantidad de agua correspondiente a
1,5% del peso del gel de slice usado. Agitar vigorosamente hasta que desaparezcan los aglomerados y continuar agitando
mecnicamente durante 2 horas. Acondicionar la columna con 1,5 mL de hexano. [NOTATambin se pueden usar columnas
previamente rellenas que contengan aproximadamente 0,50 g de un gel de slice adecuado, siempre que hayan sido validadas
con antelacin.] Concentrar la Solucin B casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio o de nitrgeno exento de
oxgeno, y diluir con tolueno a un volumen adecuado (200 mL a 1 mL, de acuerdo con el volumen inyectado en la preparacin
de la Solucin B). Transferir cuantitativamente esta solucin a la columna y proceder con la cromatografa usando 1,8 mL de
tolueno como fase mvil. Recoger el eluato (Solucin C).
Anlisis Cuantitativo de Insecticidas Organofosforados
Solucin de PruebaConcentrar la Solucin B casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio, diluir con tolueno
hasta 100 mL y mezclar.
Solucin EstndarPreparar al menos tres soluciones en tolueno que contengan cada uno de los plaguicidas de inters y
carbofenotin en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibracin.
Sistema CromatogrficoEquipar un cromatgrafo de gases con un detector de ionizacin a la llama alcalina o un detector
de fotometra a la llama y una columna de slice fundida de 0,32 mm 30 m recubierta con una capa de fase G1 de 0,25 mm.
Usar hidrgeno como gas transportador. Tambin se pueden usar otros gases, como helio o nitrgeno. Mantener la temperatura del inyector a 250 y la del detector, a 275. Mantener la temperatura de la columna a 80 durante 1 minuto, luego aumentarla a 150 a una velocidad de 30/minuto, mantener a 150 durante 3 minutos y, luego, aumentarla a 280 a una velocidad de 4/minuto y mantener a esta temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotin como estndar interno. [NOTASi
fuera necesario, usar un segundo estndar interno para identificar cualquier posible interferencia con el pico de carbofenotin
correspondiente.] Inyectar el volumen elegido de cada solucin, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los pi-
USP 38
cos. Calcular el contenido de cada plaguicida a partir de las reas correspondientes a los picos y las concentraciones de la solucin.
Anlisis Cuantitativo de Insecticidas Organoclorados y Piretroides
Solucin de PruebaConcentrar la Solucin C casi hasta sequedad, con la ayuda de una corriente de helio o de nitrgeno
exento de oxgeno, diluir con tolueno hasta 500 mL y mezclar.
Solucin EstndarPreparar al menos tres soluciones en tolueno que contengan cada uno de los plaguicidas de inters y
carbofenotin en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibracin.
Sistema CromatogrficoEquipar un cromatgrafo de gases con un detector de captura de electrones, un dispositivo que
permite la inyeccin directa en fro en la columna, y una columna de slice fundida de 0,32 mm 30 m recubierta con una
capa de fase G1 de 0,25 mm. Usar hidrgeno como gas transportador. Tambin se pueden usar otros gases, como helio o
nitrgeno. Mantener la temperatura del inyector a 275 y la del detector, a 300. Mantener la temperatura de la columna a
80 durante 1 minuto, luego aumentarla a 150 a una velocidad de 30/minuto, mantener a 150 durante 3 minutos y, luego,
aumentar a 280 a una velocidad de 4/minuto y mantener a esta temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotin como
estndar interno. [NOTASi fuera necesario, usar un segundo estndar interno para identificar cualquier posible interferencia
con el pico de carbofenotin correspondiente.] Inyectar el volumen elegido de cada solucin, registrar los cromatogramas y
medir las respuestas de los picos. Calcular el contenido de cada plaguicida a partir de las reas de los picos y las concentraciones de las soluciones.
Captulos
563 IDENTIFICACIN DE ARTCULOS DE ORIGEN BOTNICO

La identificacin de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricacin de medicamentos, excipientes, o suplementos
dietticos se lleva a cabo examinando las caractersticas morfolgicas e histolgicas del artculo en anlisis y realizando pruebas
de diagnstico qumicas. Las caractersticas botnicas y qumicas obtenidas del examen del artculo de prueba se comparan
luego con las caractersticas botnicas y qumicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especificar artculos de referencia
para ayudar a la adecuada identificacin botnica y qumica de la planta y de las partes de la planta. Un artculo de referencia
puede ser un Material de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identificacin qumica como botnica, o un Estndar de Referencia USP, que se usa slo para la identificacin qumica.
MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Los Materiales de Referencia Autenticados USP son rganos o tejidos vegetales certificados por provenir de una planta identificada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticacin es realizada por especialistas
en taxonoma botnica, anatoma vegetal, fitoqumica u otros cientficos especialistas en plantas contratados por la USP. Un
Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un rgano o tejido vegetal seco y pulverizado que se puede obtener
de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir races, tallos, hojas, flores, frutos y
semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estndar consiste en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diagnstico
botnico y qumico que se aplican en el anlisis de materias primas. Un artculo de prueba debe tener todas las caractersticas
botnicas y qumicas especificadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al propsito
al que est destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera apropiada. Por lo general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambiente fresco, seco y protegidos de la luz y de la infestacin de insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento especiales,
las instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se degradan con
el tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su uso en identificacin qumica. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no estn destinados para emplearse en la fabricacin de productos farmacuticos, excipientes ni suplementos dietticos.
IDENTIFICACIN BOTNICA
La identificacin botnica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricacin de productos farmacuticos,
excipientes, o suplementos dietticos consiste en determinar las caractersticas macroscpicas e histolgicas (microscpicas) de
la parte de la planta, como por ejemplo, raz, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se utiliza en la fabricacin del artculo. La
identificacin puede incluir tambin la inspeccin de las caractersticas organolpticas del tejido vegetal, como la presencia o
ausencia de un olor caracterstico. Las monografas oficiales individuales pueden incluir informacin botnica de posibles especies adulterantes para asegurar su ausencia en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el rgano o el tejido
vegetal, es necesario tener un conocimiento bsico de anatoma vegetal.
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Pruebas Qumicas / 563 Identificacin de Artculos de Origen Botnico 385
Morfologa y Anatoma Vegetal Diagnstica

Esta seccin trata exclusivamente las caractersticas morfolgicas y anatmicas diagnsticas de plantas vasculares y de las
diversas partes de las plantas, tales como races, tallos, hojas, flores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos
farmacuticos, excipientes o suplementos dietticos. Las plantas vasculares comprenden las Pteridofitas (helechos y plantas relacionadas con los helechos; por ejemplo, los gneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semilla, en las que la semilla no est encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los gneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiospermas (plantas de semilla, donde la semilla est encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los gneros Allium, Digitalis, Panax,
Matricaria y Rauwolfia). Algunas de las caractersticas anatmicas diagnsticas que se especifican en una monografa individual
(ver Caractersticas botnicas en monografas individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un
rgano; la disposicin y el tipo de clulas de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o
conductos laticferos dentro de un rgano; el nmero de clulas epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo
de sustancias ergsticas como por ejemplo almidn, inulina, glbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de calcio, cistolitos, polifenoles, lquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared
celular.
RACES
TALLOS
Varias caractersticas macroscpicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnstico de la especie comprenden los
atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrn de
crecimiento de las yemas; la posicin y disposicin de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, pas o
espinas. Comenzando con el tejido ms externo, la disposicin interna de tejidos en los tallos jvenes de la mayora de las
especies es epidermis, corteza, un anillo concntrico de haces vasculares separados entre s por haces medulares parenquimatosos y mdula. Segn la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas
especies puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledneas, la disposicin de los haces
vasculares no es concntrica, sino que los haces estn esparcidos a travs de toda una masa de tejido parenquimatoso en la
parte interior de la epidermis. Debido a esta disposicin, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la mdula.
En los tallos de plantas leosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reemplace con un peridermo que consta de sber, felgeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar mltiples peridermos (ritidoma). En el peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como caractersticas diagnsticas. Por
debajo del peridermo estn los restos de la corteza, el floema primario, el floema secundario, el cmbium vascular, el xilema
secundario, el xilema primario y la mdula. Tambin hay haces medulares. Igual que en la raz, el tipo y la disposicin de las
clulas conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicacin de material ergstico, tambin pueden ser caractersticas diagnsticas. Los rizomas pueden tener algunas caractersticas morfolgicas similares a las de las races y por lo tanto se pueden confundir con races. Sin embargo,
los rizomas se pueden identificar correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes.
HOJAS
Algunas caractersticas macroscpicas de las hojas que pueden permitir el diagnstico de la especie comprenden los atributos de las lminas foliares, el pecolo, las estpulas y la filotaxia. El tejido ms externo de la lmina foliar es la epidermis, seguida
Captulos
Los tejidos presentes en races jvenes, comenzando desde el tejido ms externo, comprenden una epidermis con pelos radiculares, corteza, endodermis, periciclo, floema, xilema y, en algunas especies, mdula. En algunas especies, la capa o capas
ms externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se denominan hipodermis. En especies que presentan crecimiento secundario de la raz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las races que
presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de sber (tejido suberoso), felgeno (cmbium
suberoso) y felodermo como el tejido ms externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de floema primario, floema secundario, cmbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen radios medulares que separan en grupos a las principales clulas conductoras del floema (elementos cribosos o clulas cribosas) y a las principales clulas conductoras del xilema (vasos y traqueidas). La mayora de las especies de plantas que presentan crecimiento
secundario carecen de mdula en la raz. El tipo y la disposicin de las clulas conductoras principales de los tejidos vasculares
puede permitir el diagnstico de la especie. Las races de muchas especies se desarrollan como rganos de almacenamiento
alimenticio. Este tipo de races se caracteriza por la presencia de abundante parnquima y grandes cantidades de almidn u
otros polisacridos. La presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicacin de material ergstico tambin pueden ser caractersticas diagnsticas. Desde el punto de vista morfolgico, las races se pueden distinguir de los rizomas (los tallos subterrneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que estn presentes en
los rizomas.
386 563 Identificacin de Artculos de Origen Botnico / Pruebas Qumicas
USP 38
por los tejidos mesfilo y vascular. Entre las caractersticas diagnsticas microscpicas de las clulas epidrmicas estn el grosor
y las marcas de la cutcula, la forma y disposicin de los estomas y las clulas guardianas, la disposicin y tamao de clulas
subsidiarias, el nmero de estomas (nmero de estomas por unidad de superficie) y el ndice estomtico (nmero de estomas
por nmero de unidades de clulas epidrmicas). Otras caractersticas tiles en la identificacin de material foliar consisten en
los tipos y la disposicin de los tricomas (pelos de los vegetales) presentes; el tipo y la disposicin de los tejidos mesfilo y
vascular; la relacin de mesfilo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces parenquimatosos o esclerenquimatosos, mesfilo paraveinal, endodermis y tejido de transfusin; el tipo y la disposicin de las
clulas conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposicin de fibras, esclereidas y otros tejidos; y la presencia, la ubicacin y el aspecto fsico del material ergstico.
FLORES
Captulos
Las flores son las mejores caractersticas morfolgicas diagnsticas de cualquier planta floral y la estructura floral es el criterio
principal que se usa en taxonoma vegetal. Las caractersticas diagnsticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la
presencia, el nmero y el aspecto de las partes florales principales (spalos, ptalos, estambres y carpelos); el tipo de simetra
que presentan las partes florales; la posicin relativa de los ovarios con respecto a las dems partes de la flor; el nmero de
vulos por ovario; el tipo de placentacin del ovario; el aspecto fsico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la presencia de recubrimientos o tricomas glandulares; y caractersticas fsicas de estructuras accesorias, como el receptculo y las
brcteas. Las caractersticas histolgicas y la presencia de materiales ergsticos en los tejidos de las partes florales permiten
tambin el diagnstico de la especie.
FRUTOS
La identificacin de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observacin de
varios criterios macroscpicos. Estos criterios comprenden el nmero de pistilos que tiene el fruto; el nmero de carpelos dentro de cada pistilo; el nmero de semillas dentro de cada carpelo, la placentacin del fruto; y si el fruto es dehiscente, indehiscente o carnoso. Algunas otras caractersticas diagnsticas son las referentes al nmero de suturas en un fruto dehiscente, la
determinacin de si las semillas estn unidas o no a la pared del pericarpio, las caractersticas fsicas de las tres capas del pericarpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto fsico de tejidos accesorios como
el receptculo y las brcteas. Las caractersticas histolgicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identificacin. Las caractersticas de las semillas dentro del fruto tambin son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.
SEMILLAS
Las caractersticas macroscpicas de las semillas que se utilizan en la identificacin comprenden la forma y el tamao de la
semilla; el aspecto de la superficie del recubrimiento de la semilla; la posicin del hilio y del micrpilo; y la presencia de estructuras accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como los arilos, carncula, o cuerpos oleosos. Las caractersticas fsicas del
embrin, tales como su tamao, forma, posicin y el nmero y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspecto de tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagametofito (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endosperma, permiten tambin diagnosticar la especie. Las caractersticas histolgicas del recubrimiento de la semilla y otras estructuras y tejidos de la semilla tambin se pueden utilizar para identificar la especie.
Microtcnica
El anlisis histolgico de muestras botnicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario
el empleo de tinciones citolgicas u otros reactivos para visualizar determinadas caractersticas histolgicas. Se pueden emplear
polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de
almidn, cristales de oxalato de calcio, algunas fibras y granos de arena (presentes como un contaminante) que se pueden
observar como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuente de iluminacin y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada
plana, lo que permite que pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano especfico. El campo se torna brillante cuando los dos polarizadores se alinean y cuando los dos polarizadores estn cruzados, el campo se oscurece.
PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO
Procedimiento general: Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes medios de montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identificacin del artculo de prueba. Si se dispone de
un Material de Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utilizados para el artculo de prueba. Colocar 1 2 gotas de agua, Solucin de alcoholglicerina, Solucin de hidrato de cloral, u otra
solucin reactivo en el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y me-
USP 38
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos pticos

Soluciones Reactivo y
Dispositivos pticos
Deteccin
Concrecin de Carbonato de calcio
cido actico diluido
Cristales de oxalato de calcio
Polarizadores cruzados
Celulosa
Solucin de carmnalumbreverde de metilo

cido yodhdrico
Solucin de yodocloruro de cinc
Citoplasma
Solucin de cido pcrico alcohlico
1,8-Dihidroxiantraquinonas
Solucin de hidrxido de potasio 1 M
Aceites esenciales
Solucin de tetrxido de osmio

Solucin de sudn III
Inulina
Solucin de naftolcido sulfrico
Lignina

Solucin de floroglucinolcido clorhdrico
Reactivo universal
Lpidos (cutina, ceras y suberina incluidas)

Solucin de sudn III
Reactivo universal
Pectina y muclago
Solucin de rojo de rutenio

Solucin de tionina
Solucin de azul de toluidina
Fitoglicgeno
Solucin de rojo de rutenio
Cuerpos proteicos
Solucin de cido pcrico alcohlico

Saponina
Mezcla de sangregelatina
Solucin de yodoglicerina
(confirmar mediante prueba con Mezcla de sangregelatina)
Almidn
Polarizadores cruzados
Solucin de yodo
Reactivo universal
Taninos y otros polifenoles
Solucin de cloruro frrico

Tabla 2. Agentes Blanqueadores y Clarificantes y Medios de Montaje
Usar
Agentes Blanqueadores
Medios de Montaje y Agentes

Solucin de hipoclorito de sodio
Captulos
dios de montaje). Transferir una pequea seccin de tejido vegetal o una porcin de polvo de la planta al medio de montaje o
solucin reactivo y cubrirla con un cubreobjetos limpio. (Para obtener ms informacin sobre tcnicas de preparacin especficas, ver Preparacin de montajes temporales y cortes manuales, Maceracin o Preparacin de material pulverizado, segn corresponda). Para evitar la formacin de burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ngulo adecuado,
de tal manera que su borde entre primero en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Eliminar el exceso de lquido del extremo del cubreobjetos con un trozo de papel de filtro. Las burbujas de aire se pueden eliminar
colocando el portaobjetos en un desecador de vaco. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden eliminar calentando la muestra a ebullicin suave sobre una llama pequea, como la de una lmpara de alcohol. Para reemplazar el
medio de montaje o solucin reactivo, colocar gotas del nuevo medio de montaje o solucin reactivo en un borde del cubreobjetos. Colocar una tira de papel de filtro en el extremo opuesto del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o
solucin reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solucin reactivo corra sobre el tejido o material pulverizado. Los aceites vegetales tambin pueden ser arrastrados del tejido de esta manera, lavando el portaobjetos con ter de petrleo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solucin de hidrato de cloral. No usar Solucin de hidrato de
cloral inmediatamente despus de tratar el tejido vegetal con disolventes inflamables sin haber lavado minuciosamente el tejido con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inflame cuando el portaobjetos se coloque sobre una llama
pequea para calentar el tejido a ebullicin. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean voltiles o corrosivas
para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la observacin, agregar al
portaobjetos una pequea gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio ptico (ver Microscopa ptica
776) y examinar las caractersticas histolgicas.
Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y medios de montaje: Los siguientes reactivos, dispositivos pticos y medios de montaje se emplean en la identificacin de clulas, tejidos, caractersticas estructurales y sustancias
ergsticas en el tejido o material pulverizado (ver la Tabla 1 y la Tabla 2).
USP 38
Tabla 2. Agentes Blanqueadores y Clarificantes y Medios de Montaje (Continuacin)
Captulos
Usar
Medios de Montaje y Agentes
Agentes Clarificantes
Solucin de hidrato de cloral

Solucin de lactocloral
Solucin de lactofenol
Medios de Montaje
Glicerina
Solucin de glicerinaalcohol
Mezcla de glicerinagelatina
Agua
Solucin de cido pcrico alcohlicoPreparar una solucin de cido pcrico al 1% en alcohol. El cido pcrico es til para
teir clulas que tienen un citoplasma denso, como las clulas de aleurona en semillas. Colocar una pequea cantidad del material vegetal pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de ter de petrleo para eliminar aceites vegetales que interferiran con la reaccin. Centrifugar y desechar el ter de petrleo. Empapar el polvo vegetal en Solucin
de cido pcrico alcohlico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porcin del polvo a un portaobjetos y observar
al microscopio. El citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [PRECAUCINEl cido pcrico es
explosivo cuando se seca. Manipular de manera adecuada.]
Mezcla de sangregelatinaAgregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solucin de cloruro de sodio al 0,9% y
dejar hinchar durante 30 minutos. Calentar el gel mezclndolo hasta aproximadamente 80, en un bao de agua. Enfriar a 40
y agregar 6 mL de sangre bovina desfibrinada. Calentar a 4550 y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una
capa delgada de aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posicin horizontal. Para evitar prdidas de la
mezcla de sangregelatina por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar
una bandeja. Despus de enfriarse y solidificarse, la mezcla est lista para usar. [NOTAAlmacenar en una cmara hmeda durante no ms de 12 das, a 34.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeos del material vegetal en polvo sobre la capa de sangre-gelatina, dejando una separacin de algunos mm entre ellos, transferir a un humidificador durante
algunas horas y observar. Las partculas que contengan saponinas originarn zonas claras transparentes en la sangregelatina.
Solucin de carmnalumbreverde de metiloCalentar a ebullicin 1,5 g de carmn durante 30 minutos en una solucin de
sulfato de potasio y aluminio al 15%. Enfriar, filtrar y agregar mezclando 10 mL de una solucin de verde de metilo al 0,75%.
Agregar de 12 gotas al material vegetal. La lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color violeta
rojizo.
Solucin de hidrato de cloralUsar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solucin como agente clarificante, agregar algunas
gotas al material vegetal y calentar a ebullicin brevemente sobre una llama pequea. El hidrato de cloral disuelve el contenido
celular y las sustancias intercelulares, y permite observar fcilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para
ayudar a la identificacin de sber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas,
estomas y polen.
Polarizadores cruzadosEste dispositivo ptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidn
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidn aparecen como objetos brillantes, birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidn observados bajo la luz polarizada tambin presentan el
efecto de la cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor despus de clarificar la muestra con Solucin de hidrato de cloral u otro agente clarificante.
cido actico diluidoAgregar de 12 gotas al material vegetal y observar inmediatamente al microscopio. Los depsitos de
carbonato de calcio se disuelven con efervescencia.
Solucin de cloruro frricoDiluir 1 mL de cloruro frrico SR con 9 mL de agua. Para la deteccin de grupos hidroxilo fenlicos, como taninos y flavonoides, agregar la solucin a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos. Los taninos y
otros polifenoles se tornan de color de negro azulado a verde.
GlicerinaUsar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solucin de glicerinaalcoholMezclar volmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje.
Mezcla de glicerinagelatinaAgregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y
agregar 70 mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un bao de agua y filtrar a travs de un embudo
precalentado que contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se lica antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar
algunas gotas al material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparacin se utiliza para
el almacenamiento a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con blsamo de
Canad despus de algunos meses de secado.
cido yodhdricoAgregar de 12 gotas al material vegetal. Las paredes celulares de celulosa se tornan de color azul a violeta azulado.
Solucin de yodoAgregar de 12 gotas de yodo 0,1 N SV al material vegetal. Las partculas de almidn se tornan de color
azul oscuro a violeta azulado; esta reaccin es reversible si se calienta. [NOTALas protenas, los lpidos y la celulosa se tornan
de amarillo a marrn. Las partculas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la identificacin diagnstica de estas caractersticas.]
Solucin de yodoglicerinaDisolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequea cantidad de agua y agregar 10 mL de una mezcla de glicerina y agua (1:1). Agregar 12 gotas al material vegetal en polvo. Las muestras que contie-
USP 38
Captulos
nen saponinas forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una muestra diera un resultado positivo para
saponina, el resultado se debe confirmar realizando tambin una prueba a la muestra con la Mezcla de sangregelatina.
Solucin de lactocloralDisolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de cido lctico, calentando suavemente. Agregar
algunas gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeo desecador al vaco
para eliminar las burbujas de aire. La Solucin de hidrato de cloral y la Solucin de lactocloral se usan para el mismo tipo de identificacin, excepto que la Solucin de lactocloral es un agente clarificante ms fuerte y se usa para el material vegetal que es
ms difcil de clarificar.
Solucin de lactofenolMezclar 20 g de cido lctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar.
ste es un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de polen.
Solucin de naftolcido sulfricoPreparar una solucin al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de
solucin de 1-naftol y 1 gota de cido sulfrico. Los cristales de inulina se tornan de color rojo amarronado y luego se disuelven.
Solucin de tetrxido de osmioDisolver 0,1 g de tetrxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar 12 gotas de la
solucin as obtenida al material vegetal. Los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lpidos, los taninos y los cuerpos proteicos se tornan de color marrn a negro.
Solucin de floroglucinolcido clorhdricoEsta solucin se utiliza para la identificacin de la lignina y otros derivados de hidroxifenilpropano; tejidos lignificados como esclereidas, vasos, fibras y clulas ptreas; y parnquima lignificado. Humedecer el
polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque durante 23 minutos antes de colocar el cubreobjetos.
Agregar algunas gotas de solucin de cido clorhdrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las clulas lignificadas se tornan de color rojo carmn. [NOTAEste colorante no es estable.] Las clulas que presentan derivados de hidroxifenilpropano, como vainillina y cido ferlico, tambin se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxifenilpropano se pueden extraer del material vegetal y luego ste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxifenilpropano, sumergir repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador de vrtice, centrifugar y desechar el
alcohol entre los lavados. A continuacin tratar el material vegetal segn la especificacin provista anteriormente, comenzando
con el agregado de floroglucinol SR.
Solucin de hidrxido de potasio 1 MAgregar 1 gota al material vegetal. Las clulas que contienen 1,8-dihidroxiantraquinonas se tien de rojo.
Solucin de rojo de rutenioAgregar algunas gotas de hidrxido de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTAAlmacenar esta
solucin protegindola de la luz.] Agregar 12 gotas al material vegetal. Las membranas celulares que contienen pectina, el
muclago cido y el fitoglicgeno se tornan de color rojo.
Solucin de hipoclorito de sodioEsta solucin se usa para blanquear cortes con una coloracin intensa. Sumergir el material
vegetal en la solucin durante algunos minutos hasta que est suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y montar
con un agente de montaje adecuado. [NOTAEl hipoclorito de sodio extraer la lignina; el tejido vegetal tratado de esta manera dar un resultado negativo para lignina.]
Solucin de sudn IIIDisolver 0,5 g de sudn III en 50 mL de alcohol o alcohol isoproplico con ebullicin a reflujo. Enfriar,
filtrar y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 12 gotas de esta solucin al polvo vegetal. Los aceites esenciales, las ceras, la
cutina, la suberina, los aceites grasos y otros lpidos se combinan con este colorante lipoflico y se tornan de un color rojo anaranjado a un color rojo despus de un perodo corto.
Solucin de tioninaPreparar una solucin de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25%. Sumergir la muestra seca en
esta solucin. Despus de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25%. El muclago se habr hinchado formando glbulos esfricos y se habr tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los
tabiques lignificados se tornarn de color azul o violeta azulado.
Solucin de azul de toluidinaUtilizando azul de toluidina, proceder segn se indica en Solucin de tionina.
Reactivo universal
Solucin A: Diluir 20 mL de una solucin de sudn III saturada con cido lctico con 30 mL de cido lctico.
Solucin B: Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua.
Solucin C: Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
Procedimiento: Combinar la Solucin A, la Solucin B y la Solucin C y agregar mezclando 2,5 mL de cido clorhdrico. [NOTA
La solucin se usa sin filtrar.] Para identificacin, agregar 23 gotas a la muestra y calentar a ebullicin suave sobre una llama
pequea. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeas de Reactivo universal durante la ebullicin. Cubrir con el
cubreobjetos. Los elementos lignificados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrn rojizo, los lpidos de color
rojo y el almidn de color violeta azulado.
AguaUsar como medio de montaje. [NOTATodos los grados de agua son aceptables para este propsito.]
Solucin de cloruro de cincyodoDisolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua.
Agregar 0,5 g de yodo 0,1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con
proteccin actnica. Agregar 12 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos. Las paredes celulares de
celulosa se tien de color azul a violeta azulado.
Preparacin de montajes temporales y cortes manuales: Cuando se use tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebullicin suave en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces como
material vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas
Captulos
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en polvo para ayudar a visualizar las caractersticas del tejido (ver Preparacin y uso de soluciones reactivo, dispositivos pticos y
medios de montaje).
Para sacar una pelcula epidrmica de la hoja, ptalo, spalo, brctea u otro apndice similar a la hoja, enrollar el tejido formando un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de tefln, que haya sido humedecida con agua. Con
una pinza tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrs, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en
agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio
Si resulta difcil obtener una pelcula epidrmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar
el tejido en una solucin de cido ntrico al 40% 60%, a 60 durante 34 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar
con facilidad. La pelcula epidrmica despus se lava en agua de 35 veces para eliminar el exceso de cido ntrico. Neutralizar
el tejido en una solucin de hidrxido de potasio al 1% o una solucin de hidrxido de sodio al 1%. Lavar nuevamente el
tejido con agua, montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio.
Un mtodo alternativo para preparar tejido foliar para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja (aproximadamente 5 mm 5 mm) durante 15 minutos en Solucin de hidrato de cloral en un bao de agua. Transferir el tejido a un
portaobjetos, agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para determinar el tipo, la distribucin y el nmero de estomas, al igual que el ndice estomtico.
El nmero de estomas se determina contando el nmero de estomas por unidad de superficie de un campo microscpico.
Determinar el nmero de estomas en al menos 10 sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Registrar la superficie foliar que se est observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el nmero de estomas de las distintas superficies es muy diferente.
Para calcular el ndice estomtico, la muestra se observa al microscopio con poco aumento. El tamao de la superficie se
define con un micrmetro ocular calibrado y se determina el nmero de estomas y el nmero de clulas epidrmicas para esa
superficie. El ndice estomtico se calcula:
Resultado = (100 S)/(E + S)
S = nmero de estomas para una superficie determinada
E = nmero de clulas epidrmicas de la misma superficie
Determinar el ndice estomtico en al menos 10 sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamente registrar la superficie foliar que se est observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los ndices estomticos de las distintas superficies son muy diferentes
Para hacer un corte transversal de una hoja o races delgadas, tallos u otros apndices delgados, poner el apndice que se va
a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apndice con una porcin del tejido expuesto. Con una
cuchilla afilada, revestida de tefln, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin
mover el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ngulo. Se puede necesitar cierta prctica
para poder obtener cortes lo suficientemente delgados, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos,
estos cortes se puedan utilizar para determinar la organizacin del tejido (por ejemplo, el nmero de capas en empalizada en
la hoja, el grosor de la cutcula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas
se desafilan rpidamente, se deben reemplazar con frecuencia.
Usar el corte transversal del tejido foliar as obtenido para determinar la relacin de mesfilo en empalizada. Alternativamente, calentar a ebullicin fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm2 en Solucin de hidrato de cloral, montar, cubrir con un
cubreobjetos y observar al microscopio. Identificar grupos de cuatro clulas epidrmicas adaxiales y contar las clulas de mesfilo en empalizada que se extiendan por debajo y estn cubiertas al menos en el 50% por las clulas epidrmicas. Este valor
dividido entre 4 es la relacin de mesfilo en empalizada. Determinar la relacin de mesfilo en empalizada de al menos
10 grupos de clulas epidrmicas y calcular el valor medio. La relacin de mesfilo en empalizada tambin se puede determinar en material foliar en polvo.
Para hacer un corte transversal de tallos o races gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leosos, sostener el
tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de tefln, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
transversal del apndice. Montar en agua, otro medio o solucin reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y examinar al microscopio. En general, con un poco de prctica se pueden hacer cortes que sean lo suficientemente delgados como
para determinar la organizacin del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribucin del parnquima, la presencia de cristales y
similares.
Maceracin: Para la adecuada identificacin del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus clulas individuales antes del examen microscpico. Esta tcnica puede ser particularmente til para tejidos leosos u otros tejidos
duros. El material se corta en pequeos trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos
de aproximadamente 1 mm de grosor. Segn la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los mtodos siguientes. Para
tejidos duros o muy lignificados, usar el Mtodo I. Para tejidos que no estn muy lignificados, usar el Mtodo II.
Mtodo I
Solucin A: Usar solucin de cido ntrico 4 N.
Solucin B: Preparar una mezcla de solucin de trixido de cromo 1,2 M y cido sulfrico (7:4).
Procedimiento: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de la
Solucin A y de la Solucin B (1:1). Calentar en un bao de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y
transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de diseccin, agregar 12 gotas de medio de montaje, cubrir
USP 38
con un cubreobjetos y examinar al microscopio. Si fuera necesario, las clulas se pueden separar ms entre s al presionar el
cubreobjetos con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dar un resultado negativo en la prueba para lignina.
Mtodo II
Procedimiento: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solucin de
hidrxido de potasio 2 M. Calentar en un bao de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a
un portaobjetos. Agregar 12 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo,
aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dar un resultado negativo en la prueba para lignina.
Preparacin de materiales en polvo: Colocar 1 2 gotas de agua, otro medio de montaje o una solucin reactivo en el
centro de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de diseccin con agua y sumergir en el polvo en anlisis.
Transferir una pequea cantidad de material que se adhiera a la aguja al lquido en el portaobjetos y mezclar minuciosamente
y con cuidado. Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organizacin de las estructuras del tejido
dentro del tejido vegetal, las caractersticas importantes a observar del material vegetal en polvo son las caractersticas fsicas y
qumicas de los tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las caractersticas qumicas y fsicas de sustancias ergsticas. Los tejidos, clulas y sustancias ergsticas especficas que se van a examinar se especifican en la monografa individual.
PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS
Tabla 3
Solucin de Deshidratacin
Tiempo (h)
Alcohol al 50%
12
Alcohol al 70%
12
Alcohol al 90%
12
Alcohol al 95%
12
Alcohol deshidratado con 0,1% de safranina O
24
Alcohol deshidratado
Se agrega safranina O a la penltima solucin de deshidratacin de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado incluido en parafina. Si el tejido que se va a cortar es duro o leoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie
se deba aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios das en alcohol al 70% o en
soluciones con concentraciones de alcohol an ms altas.
Captulos
Cuando sea necesario revelar caractersticas histolgicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delgados del tejido. Los cortes deben ser lo suficientemente delgados para transmitir luz y se deben cortar en un plano que permita
exponer las caractersticas deseadas. El material vegetal se mata, fija y deshidrata en forma adecuada y se incluye en parafina u
otro medio de inclusin. El medio de inclusin se usa como una matriz de soporte slido durante el corte del tejido. Despus
de efectuar el corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tincin de la muestra para ayudar a la diferenciacin de determinadas estructuras.[NOTAEl proceso de fijacin, deshidratacin, inclusin y tincin se puede acelerar significativamente si se
utiliza un horno de microondas diseado especficamente para trabajo histolgico.]
Muerte y fijacin: El primer paso en la preparacin de material vegetal para corte es matar las clulas vivas y conservar el
tejido. Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un fijador qumico. Un buen fijador de uso general para
material vegetal es una mezcla de formaldehdo, cido actico y alcohol (FAA).
Solucin FAAMezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de cido actico glacial, 10 mL de solucin de formaldehdo y 35 mL de
agua. [NOTAPreparar peridicamente una solucin nueva, ya que con el almacenamiento pierde su eficacia.]
ProcedimientoSumergir completamente el material vegetal en la Solucin FAA. Dejar el material sumergido durante 1824
horas a temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar indefinidamente en Solucin FAA, siempre que el mismo
permanezca completamente sumergido y no se deje secar. Determinados tejidos pueden requerir infiltracin al vaco para facilitar la penetracin del fijador. La infiltracin al vaco es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos epidrmicos, o si flotara en la superficie de la solucin de fijacin. Colocar el tejido en un vial pequeo que contenga el fijador. Colocar el vial sin tapar en una campana de cristal o desecador que est conectado a una fuente de vaco, preferentemente una
bomba de vaco con sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vaco a una campana de extraccin para evitar que los
vapores de fijacin llenen la habitacin. Encender lentamente el vaco. No usar un vaco fuerte porque el fijador puede comenzar a hervir y daar el tejido. A medida que el aire residual es extrado del tejido, ste subir a la superficie. Encender y apagar
durante varios ciclos de vaco hasta que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo encendido.
Deshidratacin del tejido: La parafina y otros medios de inclusin son hidrfobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua
del tejido vegetal despus de la fijacin. Esto se lleva a cabo sumergiendo el tejido fijado en soluciones de deshidratacin, siendo estas soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solucin final de la
serie es alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido fijado una o dos veces con alcohol nuevo al 50% para eliminar trazas
de FAA. Eliminar esta solucin y eliminar a continuacin cualquier otra solucin de deshidratacin decantando la solucin o
eliminndola con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solucin de deshidratacin (alcohol al 70%) al vial, sumergiendo el tejido completamente. La serie graduada alcoholagua y los tiempos sugeridos para la inmersin del tejido se listan
en la Tabla 3.
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Inclusin
Preparacin para inclusin
Remocin de alcohol: La parafina es el medio de inclusin ms comn, aunque se dispone de otros medios de inclusin. Despus de la deshidratacin, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshidratadoxileno, debido a que la parafina no es soluble en alcohol. La serie graduada de alcohol deshidratadoxileno y los tiempos
sugeridos para la inmersin del tejido se listan en la Tabla 4.
Tabla 4
Captulos
Solucin de Remocin de Alcohol
Tiempo (h)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (3:1)
Xileno
Xileno
Remocin de xileno: Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente parafina para infiltrar el tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo:
1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de parafina al vial del tejido, tapar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 4 horas. Agregar ms perlas de parafina hasta que no se disuelvan ms perlas.
2. Colocar el tejido en un horno mantenido a 4245. Agregar 23 perlas de parafina cada hora hasta que a esa temperatura no se disuelvan ms perlas.
3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. No tapar y transferir el vial a un
horno mantenido a 5860.
4. Despus que la parafina se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas ms tarde), verter la mitad del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. Transferir el vial al horno mantenido a 5860 si la parafina comienza a
solidificarse.
5. Repetir el cuarto paso dos veces ms, despus verter todo el volumen de parafinaxileno. Reemplazar con parafina pura
fundida. Aproximadamente 4 horas ms tarde, verter la parafina y reemplazarla con parafina pura fundida nueva. Volver a
verter y reemplazar 4 horas ms tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [NOTATransferir el vial al horno mantenido a 5860 si la parafina comienza a solidificarse en algn momento.]
Procedimiento de inclusinVerter el tejido con la parafina en un molde de inclusin. La parafina debe cubrir el tejido por
completo aproximadamente 35 mm. Colocar el molde de inclusin en una plataforma de calentamiento precalentada, diseada para trabajo histolgico. Ajustar el tejido en el molde con la orientacin adecuada para realizar el corte. Lentamente, enfriar la parafina deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado fro de la plataforma, hasta que la parafina se solidifique. Sumergir el bloque de parafina en agua helada para enfriarlo rpidamente y evitar que se formen cristales de parafina. Almacenar el
bloque de parafina a 4.
Corte y montaje: Cortar el bloque de parafina en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido.
Recortar el bloque de parafina lo ms cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectngulo o una forma casi trapezoidal. Este recorte evitar problemas de corte debidos al exceso de parafina alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales,
orientar el tejido en un ngulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya superficie se haya empapado en parafina
fundida. Fijar el bloque de parafina a la superficie del bloque de tejido. Agregar una pequea cantidad de parafina fundida a la
base del bloque de parafina para facilitar la formacin de un sello ms impermeable. Enfriar el bloque a 4.
Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de parafina en un micrtomo. Usar una cuchilla de micrtomo de
acero inoxidable adecuadamente afilada. Ajustar el micrtomo para hacer cortes de 815 mm de grosor (10 mm es el grosor
ptimo para la mayora de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del siguiente modo. Se puede preparar un adhesivo en forma de solucin con 1% de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se
calienta a 3035 para disolver la gelatina. Hacer un frotis de una pelcula delgada del adhesivo as obtenido sobre el portaobjetos, dejar que se seque, enjuagar con una solucin de formaldehdo SR al 4% y agregar una pequea cantidad de agua. Colocar al revs las secciones cortadas sobre el portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una solucin de formaldehdo SR al 4%. Los cortes se extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas.
Colocar el portaobjetos sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42, para que los cortes se expandan. Pipetear
y secar el exceso de agua y solucin de formaldehdo. Secar durante toda la noche en un horno a 42 para asegurar la adherencia del corte de tejido al portaobjetos.
Tincin
Preparacin para tincinSumergir dos veces en xileno el portaobjetos con el tejido fijado, durante 1015 minutos cada vez
para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en la siguiente secuencia de soluciones, dejndolo durante 5 minutos
en cada solucin y teniendo cuidado de no sacar el tejido: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1:1), alcohol deshidratado, alcohol y una solucin de alcohol al 70%. El tejido se blanquea antes de la tincin si est opaco debido a la presencia
de taninos u otros materiales ergsticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una solucin de permanganato de potasio al 1% durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solucin de cido oxlico al 5% durante 1 minuto y enjuagar
minuciosamente con agua. El material est ya listo para la tincin. Para la mayora de los trabajos de identificacin botnica se
USP 38
Tabla 5
Solucin
Tiempo
Alcohol al 35%
5 min
Una solucin filtrada de cloruro de cinc al 2%
1 min
Agua
Solucin de tincin de safranina O
Agua
Solucin de tincin de anaranjado G
Agua
Una solucin filtrada de cido tnico al 5%
Agua
Una solucin de sulfato frrico amnico al 1%
Agua
5s
5 min
5s
1 min
5s
5 min
3s
2 min
15 s
Alcohol al 45%
10 s
Alcohol al 90%
10 s
Alcohol deshidratado
10 s
12 min
Finalmente, almacenar en xileno hasta que est listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se teirn de negro azulado, los ncleos de color amarillo, los granos de almidn de color negro y las paredes celulares lignificadas
de color rojo.
Montaje del cubreobjetos: El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparacin del portaobjetos. Como
adhesivo se puede usar blsamo de Canad, diluido con una pequea porcin de xileno. En el mercado existen otros medios
de montaje disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el portaobjetos puede examinarse al microscopio. Todo el proceso de preparacin de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 das o ms.
Microscopa electrnica de barrido: Los productos botnicos comercializados por lo general se encuentran en forma de
polvo o en trozos, lo que dificulta y generalmente imposibilita la autenticacin mediante un mtodo rutinario de corte transversal del artculo. Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos ms pequeos, lo
que dificulta y en ocasiones imposibilita la deteccin de puntuaciones y lignificaciones en las paredes usando un microscopio
ptico. Las estructuras que son resistentes a estos procesos son ms tiles en la identificacin. La microscopa electrnica de
barrido (SEM, por sus siglas en ingls) es til para caracterizar el tamao y la morfologa de muestras microscpicas. Mediante
Captulos
recomienda usar uno de los dos procedimientos de tincin siguientes. El primer procedimiento de tincin emplea safranina O
contrastada con fast green. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con anaranjado G.
Tincin de safranina Ofast green
Solucin de tincin de safranina O: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solucin de formaldehdo (50:25:25:2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio para obtener una solucin que contenga 1% de acetato de sodio y mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener una solucin que contenga 1% de safranina O y mezclar.
Solucin de tincin de fast green: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo (1:1:1) que
contenga 0,05% de fast green FCF.
Procedimiento: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70% segn se describe en Preparacin para tincin,
sumergir durante 224 horas, dependiendo del tejido, en Solucin de tincin de safranina O. Eliminar el exceso de colorante
sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solucin de alcohol que contenga 0,5% de
cido pcrico durante 210 segundos para eliminar an ms el exceso de colorante del corte y ayudar a la diferenciacin de las
estructuras del tejido. Para detener la accin del cido pcrico, transferir el portaobjetos durante 10 segundos a 1 minuto a una
solucin de alcohol que contenga 4 gotas de hidrxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos al
alcohol deshidratado durante 10 segundos. Inspeccionar visualmente al microscopio el tejido teido para comprobar si es necesaria una mayor decoloracin con cido pcrico. Contrastar durante 1015 segundos en Solucin de tincin de fast green. Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2:1:1); cada cambio
dura 510 segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5) durante 1 minuto.
Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que est listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas, los
ncleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas o suberizadas, se teirn de color rojo. El citoplasma y las paredes celulares de celulosa se teirn de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido.
Tincin de anaranjado Gsafranina O
Solucin de tincin de safranina O: Preparar una solucin de safranina O al 0,004%.
Solucin de tincin de anaranjado G: Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de cido tnico y 4 gotas de cido clorhdrico en agua
y diluir con agua hasta 100 mL.
Procedimiento: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70%, segn se describe en Preparacin para Tincin,
transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5.
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la SEM es posible observar e identificar las caractersticas diferenciales ms detalladas en la estructura de los tricomas, elementos peculiares en la epidermis, junto con material granular superficial que contenga compuestos especficos, lo cual ayuda en la
identificacin de especies particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topologa superficial de una extensa
variedad de materiales vegetales y puede desempear un papel vital en la autenticacin de un producto botnico completo,
aqullos en forma de polvo, distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una
mezcla de polvos.
El captulo general de USP Microscopa Electrnica de Barrido 1181 proporciona una introduccin e informacin general
acerca de la SEM con respecto a su aplicacin a artculos farmacopeicos.
La SEM produce una resolucin ms alta en comparacin con la resolucin obtenible usando un microscopio ptico y las
imgenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imgenes con una gran profundidad de
campo, lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el anlisis de muestras de tamaos tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografas electrnicas con los detalles topogrficos de
un objeto claramente visibles para el ojo humano. La resolucin mxima para la SEM (la distancia mnima por la cual se pueden separar y observar los dos objetos como objetos distintos) es de 1020 nm en comparacin con 200300 nm para la microscopa ptica. El aumento tpico de la SEM vara de 10 a 300 000. Los instrumentos comerciales SEM tambin estn disponibles con aumentos tan bajos como 5 y tan altos como 2 000 000. En comparacin, los microscopios pticos modernos
tpicos tienen un intervalo de aumento de 10 a 2000. A un aumento bajo, las imgenes obtenidas con la SEM proporcionan
ms informacin que aqullas obtenidas mediante microscopa ptica. La SEM puede producir imgenes cuyos constrastes se
basan en variaciones composicionales de las muestras.
Captulos
IDENTIFICACIN QUMICA
Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artculo, se realiza la identificacin qumica junto con la identificacin botnica descrita anteriormente. La identificacin qumica generalmente emplea procedimientos cromatogrficos para
detectar la presencia de compuestos indicadores o marcadores especificados en la monografa individual. Se pueden emplear
perfiles espectroscpicos o cromatogrficos para obtener la identificacin qumica mediante la comparacin de huellas dactilares o caracterizaciones con un estndar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de mtodos espectroscpicos son ultravioleta (UV, por sus siglas en ingls), infrarrojo (IR) e IR por transformada de Fourier (ver Pruebas de Identificacin Espectrofotomtrica
197). Algunos ejemplos de mtodos cromatogrficos son cromatografa lquida de alta presin (HPLC, por sus siglas en ingls), cromatografa en capa delgada (TLC, por sus siglas en ingls), TLC bidimensional y cromatografa de gases (GC, por sus
siglas en ingls) (ver Cromatografa 621). Los mtodos analticos utilizados para producir huellas dactilares deben ser capaces
de detectar tantos componentes qumicos como sea posible. Puede resultar til emplear huellas dactilares mltiples, tales como una combinacin de mtodos analticos con principios de separacin y condiciones de prueba diferentes. Adems de los
mtodos cromatogrficos espectroscpicos, en la monografa individual tambin se pueden especificar mtodos cualitativos de
qumica hmeda.
Quimiotaxonoma
La quimiotaxonoma es la clasificacin de las plantas, basada en sus componentes qumicos, y la misma puede resultar til
para la identificacin de artculos botnicos. Los compuestos metablicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden
dividir en dos amplias categoras, en base a sus funciones. La primera categora comprende los metabolitos primariosmetabolitos que participan en los procesos fisiolgicos vegetales, que son absolutamente necesarios para la vida y estn presentes
en todo el reino vegetal. Estos procesos comprenden la fotosntesis, la respiracin y el metabolismo de los cidos nucleicos, las
protenas, los carbohidratos y los lpidos. La segunda categora comprende metabolitos secundarioscompuestos que no se
consideran absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interacciones de las plantas con otros organismos, como interacciones alelopticas; en la defensa qumica contra herbvoros y patgenos vegetales, y en las seales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos
secundarios tienen actividad farmacolgica. Tambin representan la base de la quimiotaxonoma vegetal. Los metabolitos secundarios pertenecen a varias clases qumicas diferentes, tales como aminocidos no proteicos, flavonoides, xantonas, cumarinas, poliacetilenos, polictidos cclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen
nitrgeno y alcaloides. Estas clases qumicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser especficas para
determinadas clases, rdenes y familias botnicas. Por otra parte, muchas subclases qumicas y compuestos secundarios particulares son especficos para determinadas subfamilias, gneros o especies. Estas subclases qumicas y compuestos particulares
son los que se pueden usar como compuestos marcadores para ayudar a la identificacin adecuada del material vegetal.
Principios Activos y Compuestos Marcadores

Para la identificacin qumica de artculos botnicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas complejas de varios componentes qumicos. En la gran mayora de los extractos botnicos no se conoce con certeza cul de los
diferentes componentes es responsable del efecto farmacolgico informado. En general, se cree que los distintos componentes
USP 38
Uso de Artculos de Referencia USP

Se usan artculos de referencia para ayudar a la identificacin de compuestos marcadores dentro del artculo de prueba. Los
artculos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estndares de Referencia USP (ver Estndares de Referencia USP 11), segn lo que especifique en la monografa individual. Los Estndares de Referencia USP utilizados para identificar compuestos indicadores o marcadores en los artculos de prueba pueden ser una entidad qumica purificada nica, una
mezcla de entidades qumicas purificadas o un extracto estandarizado preparado a partir del artculo vegetal autenticado. Adems se pueden utilizar Estndares de Referencia USP para cuantificar compuestos marcadores, segn se especifique en la monografa individual.
Se somete un artculo de prueba pulverizado a un procedimiento de extraccin especificado (ver Mtodos de Extraccin en
Extractos Botnicos 565) y se prepara para el anlisis cromatogrfico o de qumica hmeda. Cuando se dispone de un Material de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extraccin que al artculo de prueba. Luego se someten la preparacin de prueba y los artculos de referencia al mismo procedimiento cromatogrfico o de qumica hmeda
especificado en la monografa individual. Se compara la respuesta de la preparacin de prueba con la respuesta de los artculos
de referencia para determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artculo de prueba.
MTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIN DE ARTCULOS DE ORIGEN

BOTNICO
Debido a que a menudo resulta imposible la identificacin morfolgica cuando el material vegetal original consta de partes
de la planta secas, cortadas y modificadas o procesadas, o cuando el material consiste nicamente en una sola parte entera de
la planta sin caracteres taxonmicos, estos tipos de muestras por lo regular requieren mtodos de identificacin adicionales,
tales como identificacin basada en ADN. Los mtodos basados en ADN han demostrado ser eficientes para distinguir materiales vegetales genuinos de materiales adulterantes en matrices botnicas complejas y pueden complementar a los mtodos de
identificacin botnica tradicionales que se basan en caractersticas morfolgicas o qumicas. Adems, los mtodos basados en
ADN a menudo son ms confiables que los mtodos tradicionales, en especial cuando se aplican a muestras de un slo rgano
que carecen de caracteres taxonmicos de diagnstico, a materiales en polvo en los que ya no son apreciables las caractersticas que los distinguen o cuando es difcil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfolgicamente similares.
Cdigo de Barras de ADN (DNA Barcoding)

El cdigo de barras de ADN es un mtodo de identificacin particular basado en secuenciacin de ADN que emplea secuencias especficas cortas de loci de ADN nuclear o de plstidos para la identificacin de especies de plantas. Las pruebas se basan
en la comparacin de las secuencias de nucletidos de un tramo especfico de ADN (secuencias de ADN o cdigo de barras de
ADN) para realizar una identificacin basada en secuencias del ADN. Asimismo, los mtodos basados en ADN, tales como las
tecnologas de secuenciacin de nueva generacin (NGS, por sus siglas en ingls), son capaces de identificar mltiples especies
en una mezcla, incluyendo especies esperadas e inesperadas.
Captulos
actan en forma sinrgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artculos para los que existen monografas oficiales, se eligen determinados componentes qumicos del artculo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas
para determinar su contenido. La eleccin de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores,
se basa en ciertas consideraciones. Actualmente, en las monografas oficiales se especifican los siguientes tipos de compuestos
marcadores y pueden ser identificados en materias primas:
Principios activos: Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clnica. Generalmente, en la monografa individual se especifica un intervalo o contenido mnimo de los principios activos. Una determinacin
cuantitativa de los principios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacuticas botnicas provee la informacin
necesaria para determinar fechas de caducidad apropiadas.
Marcadores activos: Estos componentes tienen actividad farmacolgica conocida que contribuye en cierto grado a la eficacia. Sin embargo, la eficacia clnica de estos componentes puede no estar demostrada. Generalmente, en las monografas
individuales se especifica un contenido o intervalo mnimo de los marcadores activos. Una determinacin cuantitativa de los
marcadores activos durante estudios de estabilidad de formas farmacuticas botnicas provee la informacin necesaria para
determinar fechas de caducidad apropiadas.
Marcadores analticos: Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros componentes del extracto botnico a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la identificacin positiva del artculo en anlisis. Adems, mantener un contenido mnimo o un intervalo especfico de los marcadores
analticos ayuda a lograr la normalizacin del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los
estudios de estabilidad.
Marcadores negativos: Estos componentes pueden tener propiedades alergnicas o txicas. La presencia de estos componentes resulta indeseable en el extracto botnico. Por ejemplo, los cidos ginkglicos del ginkgo pertenecen a esta categora. Las monografas individuales pueden tener especificado un lmite estricto para estos marcadores negativos.
USP 38
Identificacin de Productos Botnicos Usando Secuenciacin del ADN (Sanger)

El proceso de identificacin de productos botnicos que usa secuenciacin del ADN (Sanger) incluye seleccin de marcadores, extraccin del ADN, cebadores y amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciacin del ADN y
comparacin con materiales de referencia, tal como se describe en las secciones siguientes. Ver Tcnicas Basadas en cidos NucleicosExtraccin, Deteccin y Secuenciacin 1126, Tcnicas Basadas en cidos NucleicosAmplificacin 1127 y Tcnicas Basadas en cidos NucleicosGenotipificacin 1129 para informacin adicional.
SELECCIN DE MARCADORES
La secuencia seleccionada debe ser lo suficientemente especfica para capturar cualquier especie primaria adulterante y potencial en la muestra, pero tambin lo suficientemente universal para evitar reacciones de falsos negativos para especies estrechamente relacionadas. Por ejemplo, un cebador especfico para una especie no es apropiado para la mayora de los procedimientos de identificacin, debido a que no pueden detectarse los adulterantes y porque una falla en la amplificacin puede ser
el resultado tanto de la ausencia de las especies o de la degradacin del ADN. En muchos casos, un solo marcador puede ser
suficiente para la identificacin, pero mltiples marcadores de diversas partes del genoma (p.ej. material nuclear o de los plstidos) aseguran la deteccin de los hbridos. Por lo regular, las regiones usadas para la identificacin de secuencias de ADN
tienen una longitud de 100 a 1500 pares de bases. Los fragmentos de ADN ms pequeos pueden ser menos susceptibles a la
degradacin del ADN.
Captulos
EXTRACCIN DEL ADN
Antes de que se pueda llevar a cabo la amplificacin del marcador deseado, se debe extraer el ADN genmico en su totalidad. La aptitud de un procedimiento de extraccin genmica depende del material inicial y de la pureza del ADN requerido
para las aplicaciones posteriores. Los procedimientos principales se describen a continuacin, adems de que se encuentran
disponibles diversos kits comerciales para ajustarse a diferentes tipos de muestras y aplicaciones.
Se debe extraer del material vegetal molido todo el ADN genmico. Los materiales vegetales pueden homogeneizarse manualmente usando un mortero y una mano de mortero, una moledora mecnica u otro aparato, dependiendo de la naturaleza
del material. La extraccin y purificacin de la totalidad del ADN genmico puede ser complicada debido a la abundancia de
metabolitos secundarios (polisacridos, taninos, aceites esenciales, fenoles, alcaloides y ceras) en muchas especies de plantas
medicinales. Algunos metabolitos secundarios pueden coprecipitar con el ADN durante la extraccin y pueden inhibir otras
reacciones enzimticas, incluyendo la digestin por restriccin y la PCR. En particular, grandes cantidades de polisacridos
complejos pueden imposibilitar la extraccin de ADN utilizable, volviendo la porcin acuosa del extracto demasiado viscosa
como para permitir que el ADN se separe eficientemente de los polisacridos contaminantes. Este tipo de contaminacin puede llevar a una escasa extraccin de ADN y puede evitar el acceso de enzimas modificadoras.
Resultan apropiados numerosos mtodos de extraccin de ADN usados comnmente para una amplia variedad de materiales vegetales frescos y secos, incluyendo bromuro de cetiltrimetilamonio, mtodos basados en slice y una variedad de kits disponibles comercialmente que emplean columnas de slice o perlas magnticas recubiertas con vidrio. Aunque muchos de estos
mtodos funcionan bien en materiales frescos y secos y en cualquier parte de la planta, aqullos que se degradan o que contienen niveles significativos de compuestos secundarios u otros inhibidores de la PCR pueden requerir ajustes menores en los protocolos estndar de extraccin.
CEBADORES Y AMPLIFICACIN POR PCR
Por lo regular, los cebadores para PCR tienen una longitud de 18 a 30 bases y amplifican una regin con una longitud de
100 a 1500 pares de bases. Como se indic anteriormente, los cebadores para PCR pueden ser universales, es decir, capaces
de amplificar cualquier organismo potencial presente en una muestra de prueba (incluyendo hongos, plantas y animales o un
subconjunto importante y predecible) o pueden ser especficos de taxn, lo que significa que han sido diseados para amplificar slo organismos de un conjunto determinado (es decir, familia, gneros, especies o subespecies). Para la amplificacin universal, se utilizan diversas regiones gnicas nucleares, mitocondriales y de plstidos, incluyendo nrITS, nrITS1, nrITS2, matK,
rbcL, espaciador intergnico psbAtrnH, cox3, COI (tambin conocido como cox1), espaciador externo transcrito, 18S, 5S, espaciador intergnico trnLtrnF e intrn trnL. Los cebadores especficos de taxn pueden estar diseados basndose en las protenas encontradas en grupos vegetales especficos (p.ej., el gen de lecitina de soja encontrado en la soja) u obteniendo secuencias de cualquier regin variable de ADN para el taxn determinado y cebadores diseados para unirse nica y especficamente a las secuencias del taxn de inters.
SECUENCIACIN DEL ADN
Resulta ms comn llevar a cabo la secuenciacin del ADN usando el protocolo de Sanger, que se ha modificado para usar
terminadores colorantes fluorescentes en un aparato de electroforesis capilar, aunque en este momento, se estn abriendo pa-
Pruebas Qumicas / 565 Extractos Botnicos 397
USP 38
so diversas tecnologas emergentes de secuenciacin [p.ej., secuenciacin de nueva generacin (NGS)]. Una vez que el colorante fluorescente se ha incorporado en el ADN amplificado, se identifican las bases mediante su emisin de luz a diferentes
longitudes de onda. Los datos resultantes son un cromatograma que se puede visualizar y analizar usando diversos programas
computarizados de anlisis de secuencias.
COMPARACIN CON MATERIALES DE REFERENCIA
Las secuencias de ADN de los artculos de prueba se comparan con secuencias obtenidas de diversos materiales de referencia
en una matriz alineada (proceso comnmente referido como alineacin), lo cual permite examinar visualmente las secuencias
para identificar posiciones de nucletidos diagnsticas. Aunque una buena cantidad de programas computarizados son capaces de automatizar las comparaciones entre secuencias derivadas de artculos de prueba y secuencias de referencia, el desempeo vara considerablemente. Se recomienda que los investigadores verifiquen siempre de forma manual los resultados sugeridos por los programas computarizados para confirmar la identidad. Las identificaciones positivas no son posibles cuando las
secuencias de los artculos de prueba caen fuera del intervalo de variacin conocido representado en las secuencias de referencia. Si se ha utilizado un nmero suficientemente grande de materiales de referencia para desarrollar la prueba, la mayora de
los materiales de prueba deberan identificarse sin ambigedad basndose en los datos de secuencias de ADN.
565 EXTRACTOS BOTNICOS
MTODOS DE EXTRACCIN
Percolacin
En la fabricacin de extractos, la percolacin es un mtodo comnmente usado. El material sin refinar a extraer se reduce a
trozos de un tamao adecuado, si fuera necesario, luego se mezcla bien con una porcin del disolvente especificado y se deja
en reposo durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se transfiere a un percolador, se agrega una cantidad suficiente
del disolvente especificado para cubrir toda la masa slida y se deja percolar la mezcla lentamente (a una velocidad no mayor
de 1 mL por minuto por 1000 g de material), manteniendo la materia a extraer siempre recubierta con una capa de disolvente.
El residuo se puede prensar y el lquido obtenido se combina con el percolado. Los percolados totales se concentran, generalmente por destilacin a presin reducida, a fin de someter los contenidos de inters en el artculo bajo extraccin al menor
calor posible.
Maceracin
A menos que se especifique algo diferente, el material crudo a extraer se reduce a trozos del tamao adecuado, se mezcla
bien con el disolvente de extraccin especificado y se deja en reposo a temperatura ambiente en un recipiente cerrado durante
un tiempo adecuado, agitando frecuentemente hasta que la materia soluble se disuelva. La mezcla se filtra, la materia insoluble
se lava con el mismo disolvente usado para la maceracin y los filtrados se combinan y concentran, por lo general a presin
reducida, hasta lograr la consistencia deseada.
Captulos
En la prctica de extraccin para artculos de origen botnico, los componentes de inters se separan total o parcialmente
de los otros componentes con ayuda de agua, alcohol, mezclas de alcohol y agua u otros disolventes adecuados. El proceso de
extraccin implica la extraccin de los componentes deseados de la materia de origen vegetal con disolventes adecuados, la
evaporacin de todo o casi todo el disolvente y el ajuste de los lquidos, masas o polvos residuales a los estndares prescritos.
Se pueden agregar sustancias inertes adecuadas como vehculos o diluyentes para mejorar las caractersticas fsicas. Se pueden
agregar agentes antimicrobianos y otros conservantes adecuados para preservar la integridad. Los extractos pueden estar sujetos a procesos que aumentan el contenido de los componentes caracterizados, que disminuyan el contenido de componentes
no deseados, o ambos. Los extractos que no tienen sustancias inertes agregadas ni procesamientos ms all de la extraccin se
llaman extractos naturales. En algunas preparaciones, la materia de origen vegetal puede tener un tratamiento previo mediante la inactivacin de enzimas y contaminantes microbianos, molienda, desengrasado o un procedimiento similar.
Los extractos se pueden definir como preparaciones con consistencia lquida, slida o semislida. Los productos obtenidos
mediante extraccin son extractos lquidos, extractos en polvo, extractos semislidos y tinturas.
398 565 Extractos Botnicos / Pruebas Qumicas
USP 38
PREPARACIONES
Extractos Lquidos
Los EXTRACTOS LQUIDOS son preparaciones de materia de origen vegetal que contienen alcohol como disolvente o como conservante, o ambos, y estn hechos de forma que cada mL contiene los componentes extrados de 1 g del material crudo que
representa, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Se pueden preparar a partir de extractos
adecuados y pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados.
Los extractos lquidos farmacopeicos se producen por percolacin, a menudo despus de un perodo de maceracin. El disolvente requerido se especifica en la monografa individual. El procedimiento de fabricacin comn incluye la concentracin
de las porciones ms diluidas de percolado por evaporacin o destilacin al vaco a temperaturas por debajo de 60. El tiempo
de maceracin y la velocidad de flujo durante la percolacin se pueden modificar para ajustarlos a la cantidad y naturaleza del
material sin refinar que se extrae, siempre que la composicin de los componentes de inters extrados no se altere negativamente.
La velocidad de flujo del percolado puede ser lenta, moderada o rpida. Con referencia a la extraccin de 1000 g del material inicial, a una velocidad lenta, no se produce ms de 1 mL de percolado por minuto; a una velocidad moderada, se producen entre 1 y 3 mL por minuto; y a una velocidad rpida, se producen entre 3 y 5 mL por minuto. Los extractos lquidos que
tienden a depositar sedimentos se pueden dejar en reposo por un tiempo y luego filtrar, o se puede decantar la porcin transparente, siempre que el lquido transparente resultante cumpla con las normas de la Farmacopea.
Captulos
Extractos en Polvo
Los EXTRACTOS EN POLVO son preparaciones slidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida por evaporacin del disolvente usado para la extraccin. Pueden contener sustancias adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabilizantes y conservantes. Los extractos en polvo estandarizados se ajustan al contenido definido de componentes, usando materiales inertes adecuados o un extracto en polvo de la materia de origen vegetal usada para la preparacin. Cuando corresponda, se especifica un lmite para el disolvente en la monografa individual.
Extractos Semislidos
Los EXTRACTOS SEMISLIDOS, tambin conocidos como extractos blandos o extractos pilulares, son preparaciones que tienen
una consistencia entre la de los extractos lquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporacin parcial del disolvente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohlicas usadas como disolventes de extraccin. Pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados. Un extracto semislido y un extracto en polvo obtenidos del mismo material son
intercambiables como frmacos o complementos, pero cada uno tiene sus propias ventajas.
Requisitos Farmacopeicos Generales

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, los requisitos Farmacopeicos para los extractos lquidos, extractos en polvo y extractos semislidos son los siguientes.
Envasado y AlmacenamientoAlmacenar en envases impermeables resistentes a la luz. [NOTAVer Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.]
EtiquetadoEtiquetar indicando el nombre de la parte de la planta usada, el nombre de los disolventes, con excepcin de
los disolventes hidroalcohlicos, usados en la preparacin, el contenido, en porcentaje, de los principios activos o compuestos
marcadores identificados en la monografa individual, y el nombre y la concentracin de cualquier conservante antimicrobiano
o de otro tipo. Cuando se desconocen los principios activos, se declara la relacin entre el material inicial y el producto final.
Para los extractos semislidos y extractos en polvo, se indica la identidad y la cantidad de todos los excipientes agregados. En
tales casos, se puede declarar el porcentaje de extracto natural.
Residuo de EvaporacinTransferir rpidamente aproximadamente 2 mL, determinados con exactitud, de Extracto Lquido, aproximadamente 0,5 g de Extracto en Polvo, o aproximadamente 2 g de Extracto Semislido a un matraz de fondo redondo tarado. Evaporar hasta sequedad en un bao de agua y secar el residuo entre 100 y 105 durante 3 horas. Dejar que se
enfre en un desecador sobre pentxido de fsforo y determinar el peso del residuo obtenido: no menos del 95% de la muestra de Extracto en Polvo permanece como residuo; o no menos del 70% de la muestra de Extracto Semislido permanece como residuo. [NOTALos lmites para los Extractos Lquidos se especifican en las monografas individuales.]
Disolventes ResidualesSi se prepara con disolventes que no sean alcohol, agua o mezclas de alcohol y agua, cumplen
con los requisitos para Disolventes Residuales 467. [NOTAVer en el documento de la ICH Impurezas: Disolventes Residuales
para obtener informacin relacionada.]
Residuos de PlaguicidasProceder segn se indica en Artculos de Origen Botnico 561: cumple con los requisitos.
Metales pesados, Mtodo II 231: 20 mg por g.
Pruebas Qumicas / 565 Extractos Botnicos 399
USP 38
Contenido de Alcohol, Mtodo II 611 (si estuviera presente): entre 90% y 110% de la cantidad declarada en la etiqueta de
C2H5OH se encuentra en Extracto Lquido y Extracto Semislido.
Tinturas
Las TINTURAS son preparaciones lquidas, por lo general preparadas por extraccin de materia vegetal con alcohol o mezclas
hidroalcohlicas. Tradicionalmente, las tinturas de artculos potentes de origen botnico representan la actividad de 10 g del
frmaco en 100 mL de tintura, ajustndose la concentracin despus de la prueba para ajustar el contenido de principios activos o compuestos marcadores. La mayora de las dems tinturas vegetales representan 20 g de la respectiva materia vegetal en
100 mL de tintura.
Las diferentes tinturas no siempre se diluyen para obtener la misma relacin de materia vegetal inicial con la tintura final.
Esta relacin depende de los requisitos indicados en las pruebas especficas para contenido de principios activos o de compuestos marcadores incluidos en las monografas individuales. A medida que se preparan las tinturas, se valoran de acuerdo con
estas pruebas de contenido. Utilizando los valores obtenidos a partir de tales valoraciones, la concentracin final de una tintura
se ajusta agregando ms disolvente o evaporndolo parcialmente.
A menos que se especifique algo diferente, las tinturas generalmente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de
materia vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de maceracin.
PROCESO DE PERCOLACIN
PROCESO DE MACERACIN
Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de extraccin indicado en un recipiente cerrado y colocar en un
lugar tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 das o hasta que el material soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro.
Cuando se haya filtrado la mayor parte del lquido, lavar el residuo sobre el filtro con una cantidad suficiente del disolvente de
extraccin indicado, combinar los filtrados para producir 1000 mL de tintura y mezclar.
REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES
A menos que se especifique algo diferente en las monografas individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son
los siguientes.
Envasado y AlmacenamientoAlmacenar en envases impermeables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposicin a
la luz solar directa y al calor excesivo. [NOTAVer Conservacin, Envasado, Almacenamientoy Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.]
EtiquetadoDeclarar en la etiqueta el nombre de la parte de la planta usada para la preparacin, el nombre del disolvente
o de la mezcla disolvente usada para la extraccin, el contenido de los componentes de inters y la relacin entre el material
inicial y el producto final.
Captulos
Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con una cantidad suficiente del disolvente de extraccin indicado para humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante 15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador
adecuado y compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del disolvente de extraccin indicado para saturar el
material a extraer y cubrir la parte superior del percolador. Cuando el lquido est a punto de gotear, cerrar el orificio inferior y
dejar macerar durante 24 horas o durante el tiempo especificado en la monografa. Si la monografa individual no requiere
prueba de contenido de principios activos o compuestos marcadores, dejar que la percolacin proceda lentamente o a la velocidad indicada (ver definiciones de velocidad de flujo en Extractos Lquidos), agregar gradualmente una cantidad suficiente de
disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos marcadores, recolectar slo 950 mL del percolado, mezclar y analizar una porcin segn se indica en la monografa individual. Diluir el
resto del percolado con la cantidad de disolvente de extraccin que indique la prueba de contenido que es necesaria para
producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar.
400 571 Valoracin de Vitamina A / Pruebas Qumicas
USP 38
571 VALORACIN DE VITAMINA A
Captulos
MTODOS QUMICOS
Procedimiento 1
El siguiente procedimiento se utiliza para la determinacin de vitamina A en ingredientes dietticos o ingredientes farmacuticos. Cumple con el procedimiento adoptado en 1956 para uso internacional por la International Union of Pure and Applied
Chemistry (Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada).
Realizar la valoracin sin demora y tomar precauciones a lo largo del procedimiento para reducir al mnimo la exposicin a la
luz actnica y al oxgeno atmosfrico y otros agentes oxidantes, usando preferentemente material de vidrio con proteccin actnica y una atmsfera de gas inerte.
Para los artculos de prueba que contienen tocoferol, se debe usar un mtodo cromatogrfico apropiado.
Solucin muestra: Pesar, contar o medir con exactitud una porcin de la muestra de prueba, que se espera contenga el
equivalente a no menos de 0,15 mg de retinol, pero que no contenga ms de 1 g de grasa. Si se presenta en forma de cpsulas, tabletas u otro slido, de modo que no se puede saponificar de manera eficiente segn las instrucciones descritas a continuacin, someter a reflujo la porcin tomada en 10 mL de agua en un bao de vapor durante aproximadamente 10 minutos,
triturar el slido remanente con una varilla de vidrio de punta roma y entibiar durante aproximadamente 5 minutos ms.
Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y agregar 30 mL de alcohol, seguidos por 3 mL de solucin de
hidrxido de potasio (9 en 10). Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de vidrio de borosilicato durante 30
minutos. Enfriar la solucin, agregar 30 mL de agua y transferir a un separador cnico. Agregar 4 g de sulfato de sodio decahidrato reducido a polvo fino. Extraer agitando con una porcin de 150 mL de ter durante 2 minutos y luego, si se forma una
emulsin, con tres porciones de 25 mL de ter. Combinar los extractos etreos, si fuera necesario, y lavar agitando por rotacin suave con 50 mL de agua. Repetir el lavado de manera ms vigorosa con tres porciones adicionales de 50 mL de agua.
Transferir el extracto etreo lavado a un matraz volumtrico de 250 mL, agregar ter a volumen y mezclar.
Evaporar una porcin de 25,0 mL del extracto etreo hasta aproximadamente 5 mL. Sin aplicar calor y con ayuda de una
corriente de gas inerte o vaco, continuar la evaporacin hasta aproximadamente 3 mL. Disolver el residuo en un volumen de
alcohol isoproplico suficiente para obtener una concentracin esperada equivalente a 3 mg5 mg de vitamina A por mL o para
obtener una absorbancia en el intervalo de 0,50,8 a 325 nm.
Modo: UV
Longitudes de onda analticas: 310; 325 y 334 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isoproplico
Anlisis
Determinar las absorbancias de la Solucin muestra a 310; 325 y 334 nm. Calcular la vitamina A, como contenido de retinol
(C20H30O), en mg, en la porcin de muestra tomada, usando una de las siguientes frmulas:
Resultado = (0,549 A325)/(L C)
o
Resultado = (0,549 [A325])/(L C)
L = longitud de la celda de absorcin (cm)
C = concentracin en la solucin final de alcohol isoproplico de la muestra de prueba (g/100 mL) o cpsulas o tabletas
(unidades/100 mL)
[A325] = absorbancia corregida a 325 nm, calculada:
Resultado = (6,815 A325) (2,555 A310) (4,260 A334)
Cada mg de vitamina A, como retinol (C20H30O), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
Usar la primera frmula cuando A325, la absorbancia observada a 325 nm, est entre [A325]/1,030 y [A325]/0,970. Usar la segunda frmula cuando [A325] tenga un valor menor que A325/1,030.
[NOTAEl intervalo de los lmites de error para este procedimiento analtico, en el que se indica el grado de discrepancia
que se puede esperar en los resultados de diferentes laboratorios a P = 0,05, es aproximadamente 8%.]
Procedimiento 2
Este procedimiento se usa para ingredientes dietticos o ingredientes farmacuticos en forma de steres de retinilo puro o
preparados a partir de steres de retinilo puro en un vehculo excipiente.
Solucin muestra: Disolver 25100 mg, pesados con exactitud, en 5 mL de pentano y diluir con alcohol isoproplico hasta obtener una concentracin esperada equivalente a 34,5 mg/mL de retinol.
USP 38
Pruebas Qumicas / 571 Valoracin de Vitamina A 401
Modo: UV
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isoproplico
Anlisis
Calcular la vitamina A, como contenido de retinol (C20H30O), en mg, en la porcin de muestra tomada:
Resultado = (0,570 A326)/(L C)
A326 = absorbancia a 326 nm
L = longitud de la celda de absorcin (cm)
C = concentracin de la Solucin muestra (g/100 mL)
Cada mg de vitamina A, como retinol (C20H30O), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
1
2
Usar el valor de 0,872 para convertir acetato de retinilo en su equivalente de retinol.

Usar el valor de 0,546 para convertir palmitato de retinilo en su equivalente de retinol.
Captulos
Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina A como un ingrediente farmacutico activo, como un ingrediente de suplemento diettico o como un componente de suplementos dietticos o de
medicamentos terminados.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmsfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan
de la muestra de prueba y de los Estndares de Referencia, usando preferiblemente una atmsfera de gas inerte y material de
vidrio con proteccin actnica.
Cuando se especifique una forma de ster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo) en el siguiente procedimiento, usar la forma qumica presente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP correspondiente.
ER Acetato de Retinilo USP
ER Palmitato de Retinilo USP
Procedimiento 1
ste es un procedimiento neutro que implica simplemente la disolucin de la muestra directamente en hexano y su inyeccin en el cromatgrafo de lquidos o la extraccin de la muestra disolvindola primero en dimetil sulfxido, seguida por una
extraccin lquidolquido de la vitamina A con hexano. Aunque su sistema cromatogrfico puede separar los ismeros 13-cis y
todo trans de vitamina A, nicamente se usa el pico del ismero todo trans para la cuantificacin de vitamina A. El procedimiento se puede usar para determinar la vitamina A en una materia prima, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, en Cpsulas
de Vitaminas Oleosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e
Hidrosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y en Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e
Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra y la Solucin de
aptitud del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano
Solucin estndar 1: 15 mg/mL de retinol,1 a partir de ER Acetato de Retinilo USP en n-hexano
Solucin estndar 2: 15 mg/mL de retinol,2 a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en n-hexano
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar 1 y de Solucin estndar 2.
Solucin muestra para materias primas: Transferir acetato de retinilo o palmitato de retinilo, pesados con exactitud,
equivalente a 15 mg de retinol, a un matraz volumtrico de 100 mL, disolver y diluir con n-hexano a volumen y mezclar. Pipetear y transferir 5,0 mL de esta solucin a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir con n-hexano a volumen y mezclar.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C20H30O), a un tubo de centrfuga con tapa de
rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 mL de
n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.]
Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3
mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones
adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta
solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin nominal de 15 mg/mL de vitamina A, como retinol
(C20H30O). [NOTAPodra no ser necesaria la dilucin.]
Captulos
USP 38
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porcin de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como
retinol (C20H30O), a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.[NOTAPara Cpsulas de
gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas, cortando las cubiertas de las Cpsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado, y triturando hasta formar una masa homognea. Transferir una porcin de la masa, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C20H30O), a un
tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a
un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido,
agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir
esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin nominal de 15
mg/mL de vitamina A, como retinol (C20H30O). [NOTAPodra no ser necesaria la dilucin.]
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin de aptitud del sistema y Solucin estndar 1 o Solucin estndar 2
Resolucin: No menos de 10 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retinilo, Solucin de aptitud del sistema
Desviacin estndar relativa: No ms de 3,0%, Solucin estndar 1 o Solucin estndar 2
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 1 o Solucin estndar 2 y la Solucin muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C20H30O), en la porcin de muestra tomada:
rU = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra correspondiente
rS = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2
CS = concentracin de retinol (C20H30O) en la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2 (mg/mL)
CU = concentracin de vitamina A, como retinol (C20H30O), en la Solucin muestra (mg/mL)
Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con cido sulfrico metanlico, seguido por extraccin con 2,2,4trimetilpentano. La preparacin muestra se puede usar para la formulacin que contiene vitaminas A, D y E. La aplicacin incluye Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y
Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, las Soluciones muestra, la Solucin de
aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y acetato de etilo (99,7: 0,3)
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en
un matraz volumtrico de 100 mL. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solucin de ascorbato de sodiopirogalol: Transferir 10 g de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumtrico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin estndar 1: 15 mg/mL de retinol1, a partir de ER Acetato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin estndar 2: 15 mg/mL de retinol2, a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: Mezclar volmenes iguales de Solucin estndar 1 y de Solucin estndar 2.
Solucin muestra para Tabletas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad entre 0,4 mg y 2,5 mg retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de
Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de
ascorbato de sodiopirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un
USP 38
Pruebas Qumicas / 571 Valoracin de Vitamina A 403

rU = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2
CS = concentracin de retinol (C20H30O) en la Solucin estndar 1 o la Solucin estndar 2 (mg/mL)
CU = concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C20H30O), en la Solucin muestra (mg/mL). [NOTAUsar 26,5 mL
como el volumen final de la Solucin muestra para calcular la concentracin nominal.]
Procedimiento 3
Este procedimiento emplea la saponificacin del estndar y de la muestra, seguida por una extraccin lquidolquido de
vitamina A a partir de la muestra con una mezcla de n-hexano y cloruro de metileno (3:1). Se pueden caracterizar y cuantificar
los ismeros 13-cis y todo trans de vitamina A. El procedimiento se puede usar para Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cpsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra y las soluciones
Fase mvil: n-Hexano y alcohol isoproplico (92:8)
Disolvente de extraccin: n-Hexano y cloruro de metileno (3:1)
Solucin de hidrxido de potasio: 800 mg/mL de hidrxido de potasio en agua. [NOTAAgregar cuidadosamente el hidrxido de potasio al agua. Mezclar y enfriar.]
Diluyente: 10 mg/mL de pirogalol en alcohol
Captulos
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico
metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 10 minutos.
Centrifugar durante 10 minutos para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario,
diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulacin. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando
con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 2,5 mg de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de ascorbato de sodiopirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12
minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta
formar una suspensin y agitar durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos para romper la emulsin y para que el
sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la de la Solucin estndar.
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Aptitud del sistema
Resolucin: No menos de 8,0 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de retinilo
Anlisis
Muestras: Solucin estndar 1 o Solucin estndar 2 y Solucin muestra
Captulos
USP 38
Solucin estndar: Diluir ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP con Diluyente hasta obtener una concentracin de 8,5 mg/mL de retinol1,2 (C20H30O). Transferir 10,0 mL de esta solucin a un matraz de 125 mL con tapn y agregar 5 mL de agua, 5 mL de Diluyente y 3 mL de Solucin de hidrxido de potasio. Ajustar bien el tapn, agitar durante 15 minutos sobre un bao de agua mantenido a 60 5 y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 mL de agua y 25,0 mL de Disolvente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar vigorosamente durante 60 segundos. Enjuagar las paredes del matraz con 60
mL de agua y dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen. Retirar una porcin de la capa orgnica para
inyectarla en el cromatgrafo. Esta Solucin estndar contiene 3,4 mg/mL de retinol.
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 1,3 mg
de retinol, a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 5 mL de agua, 15 mL de Diluyente y 3 mL de Solucin de hidrxido de
potasio. Ajustar bien el tapn, agitar durante 15 minutos sobre un bao de agua mantenido a 60 5 y enfriar a temperatura
ambiente. Agregar 7 mL de agua y 25,0 mL de Disolvente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar vigorosamente durante
60 segundos, o ms si fuera necesario, para completar la extraccin. Enjuagar las paredes del matraz con 60 mL de agua y
dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen. [NOTANo agitar porque podra formarse una emulsin.]
Retirar una porcin de la capa orgnica y diluir cuantitativamente, y en diluciones sucesivas si fuera necesario, con Disolvente
de extraccin para obtener una concentracin de 3,4 mg/mL de retinol.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino un nmero contado de Tabletas. Transferir una porcin del polvo,
equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 5 mL de agua, 15 mL de Diluyente y 3 mL de
Solucin de hidrxido de potasio. Tapar hermticamente, agitar durante 15 minutos sobre un bao de agua mantenido a 60 5
y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 mL de agua y 25,0 mL de Disolvente de extraccin. Ajustar bien el tapn y agitar
vigorosamente durante 60 segundos, o ms si fuera necesario, para completar la extraccin. Enjuagar las paredes del matraz
con 60 mL de agua y dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen. [NOTANo agitar porque podra
formarse una emulsin.] Retirar una porcin de la capa orgnica y diluir con Disolvente de extraccin para obtener una concentracin de 3,4 mg/mL de retinol.
Modo: HPLC
Detector: UV 335 nm
Aptitud del sistema
Anlisis
Resultado = (rT1/rT2) (CS/CU) 100
rT1 = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de ster de retinilo y 13-cis de ster de retinilo de la
Solucin muestra
rT2 = suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de ster de retinilo y 13-cis de ster de retinilo de la
Solucin estndar
CS = concentracin de retinol (C20H30O) en la Solucin estndar (mg/mL)
CU = concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C20H30O), en la Solucin muestra (mg/mL)
Procedimiento 4
Este procedimiento emplea una extraccin lquidolquido de vitamina A a partir de la muestra con hexano, seguida por la
evaporacin de hexano y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1:1). Se puede usar
para la determinacin de vitamina A en la Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles y la Solucin Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y el Diluyente se preparan segn se indica a continuacin.
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1:1)
Solucin estndar: 0,33 mg/mL de retinol1,2 (C20H30O), a partir de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo
USP en Diluyente
USP 38
Pruebas Qumicas / 581 Valoracin de Vitamina D 405

rU = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de la forma todo trans de ster de retinilo de la Solucin estndar
CS = concentracin de retinol (C20H30O) en la Solucin estndar (mg/mL)
CU = concentracin nominal de vitamina A, como retinol (C20H30O), en la Solucin muestra (mg/mL)
581 VALORACIN DE VITAMINA D

Los siguientes procedimientos de cromatografa de lquidos se usan para la determinacin de vitamina D como ingrediente
farmacutico activo, como ingrediente de suplemento diettico o como componente de formas farmacuticas farmacopeicas.
Durante toda esta valoracin, proteger de la atmsfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estndar de Referencia y las que deriven de stos, usando preferentemente una atmsfera de gas inerte y material de vidrio
con proteccin actnica.
Cuando se especifique vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) en el siguiente procedimiento, usar la forma qumica presente en la formulacin y el Estndar de Referencia USP pertinente.
ER Colecalciferol USP
ER Ergocalciferol USP
ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina D USP
Procedimiento 1
Este procedimiento usa una preparacin de la muestra sin ajuste de pH y conlleva el uso de dimetil sulfxido para disolver
los excipientes en la muestra, seguido por una extraccin lquido-lquido de la vitamina D con hexano. La separacin cromatogrfica se logra usando modo de fase normal sobre una columna L8. Se puede usar para determinar vitamina D sola o en combinacin con otras vitaminas y minerales en formas farmacuticas farmacopeicas.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y la Solucin de aptitud
del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y alcohol isoproplico (99:1)
Solucin estndar: 2 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en n-hexano
Solucin de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solucin estndar a 60 durante 1 hora para isomerizar parcialmente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 0,1 mg de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrfu-
Captulos
Solucin muestra para formas farmacuticas lquidas: Transferir un volumen medido con exactitud de Solucin Oral,
equivalente a 3,3 mg de retinol, a un embudo de separacin de 500 mL que contenga 10 mL de agua y 20 mL de alcohol
deshidratado. Agregar 150 mL de ter de petrleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 mL de ter de petrleo,
tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y filtrar el extracto de ter de petrleo en un matraz de
fondo redondo de 500 mL a travs de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solucin hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un bao de agua mantenido a aproximadamente 65. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Diluyente, agitar por rotacin suave hasta disolver el residuo y filtrar.
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm 50 cm (dos columnas concatenadas de 4,6 mm 25 cm cada una); relleno L1
Aptitud del sistema
Anlisis
Captulos
406 581 Valoracin de Vitamina D / Pruebas Qumicas
USP 38
ga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un bao de
agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa
y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y transferir la capa de hexano
con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de
dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz
volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumtrico
con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin
de 2 mg/mL de colecalciferol o ergocalciferol. [NOTAPodra no ser necesaria la dilucin.]
Solucin muestra para Cpsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cpsulas a un recipiente adecuado, mezclar y
pesar. Transferir una porcin de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 0,1 mg de vitamina D, como
colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln. [NOTAPara
Cpsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cpsulas cortando las cubiertas de
las Cpsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y triturando hasta formar una
masa homognea. Transferir una porcin de la masa, equivalente a no menos de 0,1 mg de vitamina D, como colecalciferol o
ergocalciferol, a un tubo de centrfuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de tefln.] Agregar aproximadamente 2
mL de dimetil sulfxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cpsulas y agitar durante 45
minutos en un agitador en un bao de agua mantenido a 60. [NOTAAjustar el agitador para asegurar que el contenido del
recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 10
minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumtrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de
contenido de las Cpsulas a la capa de dimetil sulfxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumtrico. Repetir esta extraccin con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir
los extractos en el matraz volumtrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solucin con n-hexano hasta obtener una solucin con una concentracin de 2 mg/mL de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol. [NOTAPodra no ser
necesaria la dilucin.]
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar y Solucin de aptitud del sistema
Resolucin: No menos de 10 entre la forma presente de vitamina D y su precursor correspondiente, Solucin de aptitud del
sistema
Anlisis
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C27H44O) o ergocalciferol (C28H44O) en la porcin de muestra tomada:
Resultado = (rU/rS) (CS/CU) F 100
rU = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra
rS = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar
CS = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar (mg/mL)
CU = concentracin nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin muestra (mg/mL)
F = factor de correccin que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la Solucin
muestra, 1,09
Procedimiento 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con bicarbonato de sodio, una solucin cida antioxidante que genera la emisin de gas; lecitina como surfactante; y dimetil sulfxido, seguido por cido sulfrico metanlico para crear una
dispersin y extraer de manera eficiente la vitamina D de los componentes de la matriz en la fase de 2,2,4-trimetilpentano. La
separacin se logra en un modo de fase normal sobre una columna L24. La preparacin muestra y el Sistema cromatogrfico
usados en este procedimiento tambin son adecuados para determinar vitamina A y E cuando se encuentran presentes en la
formulacin; los analistas deben realizar los ajustes correspondientes en el tamao de la muestra y longitud de onda de deteccin.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra, la Solucin de aptitud
del sistema y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: n-Hexano y alcohol butlico terciario (98,75: 1,25)
USP 38

Captulos
Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de cido sulfrico a 80 mL de metanol en un

matraz volumtrico de 100 mL. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solucin de ascorbato de sodiopirogalol: Transferir 10 g de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumtrico
de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de cido sulfrico y diluir con agua a volumen.
Solucin estndar: 1 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solucin de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solucin estndar a 60 durante 1 hora para isomerizar parcialmente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solucin muestra para Tabletas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porcin del polvo
nominalmente equivalente a una cantidad de no menos de 0,1 mg de vitamina D. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5
mL de Solucin de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin
de ascorbato de sodiopirogalol, agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya
cesado la emisin de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico
metanlico 3 N, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 10 minutos.
Centrifugar durante 10 minutos para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario,
diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la
Solucin muestra para Cpsulas: [NOTAEsta preparacin es adecuada para la determinacin de vitamina A, vitamina D y
presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Usando una
cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando
con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cpsulas con ayuda de una corriente de aire
seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a no menos de 0,1 mg de la cantidad declarada de
vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solucin de lecitina y 12,5
mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vrtice. Agregar 6 mL de Solucin de ascorbato de sodiopirogalol,
agitar lentamente y dejar que la solucin se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisin de gases y
luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfxido, mezclar en un mezclador de vrtice hasta
formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solucin de cido sulfrico metanlico 3 N, mezclar en un
mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano,
mezclar en un mezclador de vrtice hasta formar una suspensin y agitar durante 10 minutos. Centrifugar durante 10 minutos
para romper la emulsin y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentracin cercana a la de la Solucin estndar.
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucin estndar y Solucin de aptitud del sistema
Resolucin: No menos de 4,0 entre la forma de vitamina D presente y su precursor correspondiente, Solucin de aptitud del
sistema
Anlisis
Captulos
USP 38
Procedimiento 3
Este procedimiento es adecuado para matrices con excipientes que son solubles o degradables en condiciones alcalinas. Emplea la saponificacin de la solucin muestra, seguida por una extraccin lquidolquido con hexano y una limpieza por extraccin en fase slida (EFS) usando una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isoproplico (99,8: 0,2) como eluyente. La
Solucin estndar se somete a un tratamiento similar para compensar prdidas en la recuperacin debidas a la isomerizacin.
Posteriormente, el eluato se evapora y el residuo se reconstituye en acetonitrilo antes de inyectarlo en el cromatgrafo. La separacin se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Fase mvil: Acetonitrilo y metanol (91:9)
cido actico diluido: Solucin de cido actico glacial (1 en 10) en agua
Solucin de fenolftalena: 10 mg/mL de fenolftalena en alcohol
Solucin de hidrxido de potasio: Disolver lentamente 14 g de hidrxido de potasio en una mezcla de 31 mL de alcohol
deshidratado y 5 mL de agua. Preparar en el da de su uso.
Disolvente de extraccin: Cloruro de metileno y alcohol isoproplico (99,8:0,2)
Columna de extraccin: Relleno de slice con una relacin entre la masa del sorbente y el volumen de la columna de 500
mg a 2,8 mL o equivalente. [NOTAAcondicionar la columna lavndola inicialmente con 4,0 mL de una mezcla de cloruro de
metileno y alcohol isoproplico (4:1), seguida de 5,0 mL de Disolvente de extraccin. No dejar que la columna se seque.]
Solucin madre del estndar: 0,2 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en alcohol deshidratado.
[NOTAPreparar cada 4 semanas. Almacenar en un congelador.]
Solucin estndar: Diluir un volumen de Solucin madre del estndar con alcohol deshidratado hasta obtener una concentracin de 5 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP. Preparar esta solucin en el da de su uso. Transferir 2,0 mL
de esta solucin a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solucin de hidrxido de potasio,
tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 mL de n-hexano y transferir el enjuague
al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que
las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 mL de agua a la capa de hexano en el embudo de separacin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa
acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 mL de agua al embudo de separacin. Agregar cido actico diluido,
gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen.
Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeo
trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL
de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50
hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 mL de Disolvente de extraccin para disolver el residuo. Transferir esta solucin a
una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 mL de
Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 mL de Disolvente de extraccin y desechar esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 mL de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar
el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrgeno. Agregar inmediatamente 2,0 mL de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cromatgrafo.
Solucin muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porcin del polvo, equivalente a 10 mg de colecalciferol o ergocalciferol, a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solucin de hidrxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a
temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua
al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 mL de nhexano y transferir el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo
durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 mL de agua a la capa de
hexano en el embudo de separacin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se
separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 mL de agua al embudo de separacin.
Agregar cido actico diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta
que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro,
colocado sobre un pequeo trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de
sodio con unos pocos mL de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un
evaporador rotatorio a 50 hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 mL de Disolvente de extraccin para disolver el residuo. Transferir esta solucin a una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de
fondo redondo con 1,0 mL de Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 mL de
Disolvente de extraccin y desechar esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 mL de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en
un matraz adecuado. Colocar el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una
corriente de nitrgeno. Agregar inmediatamente 2,0 mL de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cromatgrafo.
USP 38

muestra, 1,09
Procedimiento 4
Este procedimiento se aplica a formas farmacuticas lquidas. Emplea una extraccin lquido-lquido de la muestra con hexano, seguida por la evaporacin del hexano y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo
(1:1). La separacin se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y el Diluyente se preparan segn se indica a continuacin.
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1:1)
Solucin estndar: 5 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Diluyente
Solucin muestra: Transferir un volumen medido con exactitud de la muestra, equivalente a 50 mg de colecalciferol o ergocalciferol, a un embudo de separacin de 500 mL que contenga 10 mL de agua y 20 mL de alcohol deshidratado. Agregar 150
mL de ter de petrleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 mL de ter de petrleo, tapar, agitar y dejar que
las capas se separen. Desechar la capa acuosa. Escurrir el extracto de ter de petrleo en un matraz de fondo redondo de 500
mL a travs de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solucin hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un
Captulos
Solucin muestra para Cpsulas: Pesar no menos de 20 Cpsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cpsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido
a las cubiertas de las cpsulas vacas lavando con varias porciones de ter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las
Cpsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cpsulas vacas en un frasco de pesada tarado y
calcular el peso neto del contenido de las Cpsulas. Transferir una porcin del contenido de las Cpsulas, equivalente a 10 mg
de ergocalciferol o colecalciferol, a un matraz de 125 mL con tapn. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solucin de hidrxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un bao de agua mantenido a 60. Dejar que se enfre a temperatura
ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separacin de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua al matraz,
tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solucin al embudo de separacin. Enjuagar el matraz con 60 mL de n-hexano y
transferir el enjuague al embudo de separacin. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en reposo durante
15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 mL de agua a la capa de hexano
en el embudo de separacin, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las capas se separen
y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solucin de fenolftalena y 15,0 mL de agua al embudo de separacin. Agregar
cido actico diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo durante 10 minutos hasta que las
capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a travs de sulfato de sodio anhidro, colocado
sobre un pequeo trozo de algodn, en un matraz de fondo redondo de 100 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio
con unos pocos mL de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50 hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 mL de Disolvente de extraccin para disolver el residuo. Transferir esta solucin a una Columna de extraccin en fase slida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 mL de Disolvente de extraccin y transferir a la columna. Eluir la Columna de extraccin con 2,0 mL de Disolvente
de extraccin y desechar esta fraccin. Eluir la columna con 7,0 mL de Disolvente de extraccin y recoger el eluato en un matraz
adecuado. Colocar el matraz en un bao de agua tibia mantenido a 42 y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente
de nitrgeno. Agregar inmediatamente 2,0 mL de acetonitrilo al residuo y usar la solucin para inyectarla en el cromatgrafo.
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Aptitud del sistema
Anlisis
USP 38
bao de agua mantenido a aproximadamente 65. Agregar inmediatamente 10,0 mL de Diluyente, agitar por rotacin suave
hasta disolver el residuo y filtrar.
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: Dos columnas, 4,6 mm 25 cm, conectadas en serie; ambas con relleno L1
Aptitud del sistema
Anlisis
Captulos

muestra, 1,09
Procedimiento 5
Este procedimiento emplea la disolucin de vitamina D en tolueno y la solucin se inyecta en el cromatgrafo de lquidos.
Se puede aplicar a matrices simples tales como vitaminas puras e ingredientes que no requieren saponificacin y que son solubles en tolueno. La separacin se logra en modo de fase normal.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, la Solucin muestra y la Solucin de aptitud
del sistema se preparan segn se indica a continuacin.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatogrfica rellenando un tubo cromatogrfico, de 8 cm 60 cm, con
500 g de tierra silcea para cromatografa de 50 a 250 mm, activada mediante secado a 150 durante 4 horas. (Ver Cromatografa 621, Cromatografa en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a travs de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapn de vidrio.
Fase mvil: Alcohol n-amlico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solucin de aptitud del sistema: 250 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina D USP en 10 mL de una
mezcla de tolueno y Fase mvil (1:1). Calentar esta solucin a reflujo a 90 durante 45 minutos y enfriar. [NOTAEsta solucin
contiene colecalciferol, precolecalciferol y trans-colecalciferol. Para las soluciones madre, seguir estos procedimientos: usar material de vidrio con proteccin actnica, disolver las muestras sin calentar y preparar las soluciones en el da de su uso.]
Solucin madre del estndar: 0,6 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno
Solucin estndar: 120 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Fase mvil, preparada a partir de Solucin
madre del estndar
Solucin madre de la muestra: 0,6 mg/mL of colecalciferol o ergocalciferol en tolueno
Solucin muestra: 120 mg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase mvil, preparada a partir de Solucin madre de la
muestra
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Velocidad de flujo: Se puede variar para cumplir con los Requisitos de aptitud del sistema
Aptitud del sistema
[NOTALos tiempos de retencin relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, respectivamente.]
Resolucin: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
USP 38
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol

Anlisis
FC = CS/rS
CS = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (mg/mL)
rS = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentracin, CS, en mg/mL, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B:
CS = FC rS
FC = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
rS = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar B
Calcular la concentracin, Cpre, en mg/mL, de precolecalciferol o pre-ergocalciferol:
Captulos

Procedimiento 6
El procedimiento emplea la disolucin de la muestra en Fase mvil y la solucin se inyecta en el cromatgrafo de lquidos. La
aplicacin incluye colecalciferol y ergocalciferol disueltos en aceite vegetal comestible, polisorbato 80 o propilenglicol, ninguno de los cuales interferir con el precursor correspondiente de modo que ste pueda cuantificarse. La separacin se logra en
modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separacin de las formas trans de los precursores de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar y la Solucin muestra se preparan segn
se indica a continuacin.
Fase mvil: Hexano y pentanol (997:3)
Solucin madre del estndar: Disolver ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno y diluir con Fase mvil hasta
50 mg/mL. [NOTAPreparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin estndar A: 5 mg/mL, a partir de Solucin madre del estndar en Fase mvil. [NOTAAlmacenar a una temperatura
que no exceda de 0.]
Solucin estndar B: Transferir 5,0 mL de Solucin madre del estndar a un matraz de fondo redondo equipado con un condensador de reflujo. Desplazar el aire con nitrgeno y someter a reflujo durante 1 hora en un bao de agua bajo una atmsfera de nitrgeno para obtener una solucin que contenga colecalciferol y precolecalciferol. Enfriar, transferir la solucin con
ayuda de varias porciones de Fase mvil a un matraz volumtrico de 50 mL y diluir con Fase mvil a volumen.
Solucin muestra: Equivalente a 5 mg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase mvil, a partir de un volumen de muestra
medido con exactitud
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar B (ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP)
[NOTALos tiempos de retencin relativos para precolecalciferol y colecalciferol son aproximadamente 0,4 y 1,0, respectivamente, y aproximadamente 0,8 y 1,0 para pre-ergocalciferol y ergocalciferol, respectivamente.]
Resolucin: No menos de 1,0 entre los picos de precolecalciferol y colecalciferol. No menos de 1,0 entre los picos de preergocalciferol y ergocalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol
Anlisis
Muestras: Solucin estndar A, Solucin estndar B y Solucin muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, FC:
USP 38
Cpre = CS CS
CS = concentracin de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (mg/mL)
CS = concentracin de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B (mg/mL)
Calcular el factor de respuesta, Fpre, para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:
Fpre = Cpre/rp
Cpre = concentracin de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (mg/mL)
rp = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin estndar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como colecalciferol (C27H44O) o como ergocalciferol (C28H44O)
en la porcin de muestra tomada:
Captulos
Resultado = {[(FC rC) + (Fpre rpre)]/CU} 100

FC = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
rC= rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra
Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
rpre = rea del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin muestra
Procedimiento 7
Este procedimiento emplea la saponificacin de la muestra, seguida por una extraccin lquidolquido con terter de petrleo y por la evaporacin del terter de petrleo y la reconstitucin del residuo en una mezcla de tolueno y Fase mvil
(1:4). Se aplica a soluciones en aceite y cpsulas que contengan soluciones de vitamina D en aceite, en las que el aceite no
interfiera con el precursor correspondiente de modo que ste pueda cuantificarse. La separacin se logra en modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separacin de las formas trans de los precursores de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, las Soluciones estndar, la Solucin muestra y las soluciones
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatogrfica rellenando un tubo cromatogrfico, de 8 cm 60 cm, con
500 g de tierra silcea para cromatografa de 50 a 250 mm, activada mediante secado a 150 durante 4 horas. (Ver Cromatografa 621, Cromatografa en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a travs de la columna y recoger el eluato en un matraz con
tapn de vidrio.
Fase mvil: Alcohol n-amlico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solucin de butil hidroxitolueno: 10 mg/mL de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografa
Solucin acuosa de hidrxido de potasio: 1 g/mL de hidrxido de potasio en agua recientemente calentada a ebullicin.
[NOTAPreparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin alcohlica de hidrxido de potasio: 3 g de hidrxido de potasio en 50 mL de agua recientemente calentada a
ebullicin. Agregar 10 mL de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullicin hasta 100 mL. [NOTAPreparar
esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de ascorbato de sodio: Disolver 175 mg/mL de cido ascrbico en hidrxido de sodio 1 N. [NOTAPreparar en el
da de su uso.]
Solucin de sulfuro de sodio: 12 g de sulfuro de sodio en 20 mL de agua. Diluir con glicerina hasta 100 mL.
Solucin madre del estndar: 0,5 mg/mL de ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP en tolueno. [NOTAPreparar esta
solucin en el da de su uso.]
Solucin estndar A: 20 mg/mL, a partir de Solucin madre del estndar en Fase mvil. [NOTAAlmacenar esta solucin a una
temperatura que no exceda de 0.]
Solucin estndar B: Pipetear y transferir 4 mL de Solucin madre del estndar a un matraz de fondo redondo equipado con
un condensador de reflujo y agregar 2 3 cristales de butil hidroxitolueno. Desplazar el aire con nitrgeno y calentar en un
bao de agua mantenido a una temperatura de 90 con luz tenue bajo una atmsfera de nitrgeno durante 45 minutos para
obtener una solucin que contenga vitamina D y pre-vitamina D. Enfriar, transferir con ayuda de varias porciones de Fase mvil
a un matraz volumtrico de 100 mL y diluir con Fase mvil a volumen.
Solucin de aptitud del sistema: Agregar 100 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoracin de Vitamina D USP a un matraz
volumtrico de 10 mL. Agregar una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase mvil a volumen y mezclar. Calentar una porcin de esta
solucin a reflujo a 90 durante 45 minutos y enfriar.
Solucin muestra: Someter a reflujo no menos de 10 Cpsulas con una mezcla de 10 mL de Solucin de ascorbato de sodio y
2 gotas de Solucin de sulfuro de sodio en un bao de vapor durante 10 minutos, triturar los slidos remanentes con una varilla
de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento durante 5 minutos. Enfriar y agregar 25 mL de alcohol y 3 mL de Solucin acuosa de hidrxido de potasio. Someter la mezcla a reflujo en un bao de vapor durante 30 minutos. Enfriar rpidamente
bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador cnico, enjuagando el matraz de saponificacin
con dos porciones de 15 mL de agua, 10 mL de alcohol y dos porciones de 50 mL de ter. [NOTAUsar el ter dentro de las
24 horas despus de abrir el envase.] Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30
segundos y dejar en reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes. Transferir la fase acuosa a un segundo separador
USP 38
FD = CS/rS
CS = concentracin de ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (mg/mL)
rS = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentracin, CS, en mg/mL, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B:
CS = FD rS
FD = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
rS = rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin estndar B
Calcular la concentracin, Cpre, en mg/mL, para pre-ergocalciferol:
Cpre = CS CS
CS = concentracin de ER Ergocalciferol USP en la Solucin estndar A (mg/mL)
CS = concentracin de colecalciferol o ergocalciferol en la Solucin estndar B (mg/mL)
Calcular el factor de respuesta, Fpre, para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:
Fpre = Cpre/rp
Cpre = concentracin de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (mg/mL)
rp = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin estndar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como ergocalciferol (C28H44O) o como colecalciferol (C27H44O)
en la porcin de muestra tomada:
Resultado = {[(FD rC) + (Fpre rpre)]/CU} 100
FD = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
rC= rea del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solucin muestra
Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Captulos
cnico, agregar una mezcla de 10 mL de alcohol y 50 mL de ter de petrleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen,
transferir la fase acuosa a un tercer separador cnico y transferir la fase de ter de petrleo al primer separador, enjuagando el
segundo separador con dos porciones de 10 mL de ter de petrleo y agregando los enjuagues al primer separador. Agitar la
fase acuosa en el tercer separador con 50 mL de ter de petrleo y agregar la fase de ter de petrleo al primer separador.
Lavar los extractos combinados de terter de petrleo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 mL de Solucin alcohlica de hidrxido de potasio y lavar vigorosamente con porciones de 50 mL de agua hasta que el ltimo lavado sea neutro
frente a la fenolftalena. Escurrir las gotas de agua remanentes de los extractos combinados de terter de petrleo, agregar 2
lminas de papel de filtro de 9 cm en tiras al separador y agitar. Transferir los extractos lavados de terter de petrleo a un
matraz de fondo redondo, enjuagando el separador y el papel con ter de petrleo. Combinar los enjuagues de ter de petrleo con los extractos de terter de petrleo, agregar 100 mL de Solucin de butil hidroxitolueno y mezclar. Evaporar hasta sequedad al vaco agitando por rotacin suave en un bao de agua mantenido a una temperatura no superior a 40. Enfriar bajo
una corriente de agua e introducir nitrgeno suficiente para restaurar la presin atmosfrica. Disolver y diluir el residuo sin demora en un volumen medido con exactitud de una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase mvil, hasta que la concentracin de
vitamina D sea aproximadamente 25 mg/mL.
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Aptitud del sistema
NOTALos tiempos de retencin relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, respectivamente.
Resolucin: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
Anlisis
Muestras: Solucin estndar A, Solucin estndar B y Solucin muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, FD:
Captulos
USP 38
rpre = rea del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solucin muestra

Procedimiento 8
Este procedimiento es adecuado para la determinacin de colecalciferol en aceites y matrices grasas. Emplea dos sistemas
cromatogrficos, uno para la limpieza de la muestra y el otro para la determinacin de vitamina D. El estndar, estndar interno y las soluciones muestra se someten a saponificacin, seguida por una extraccin lquidolquido con una mezcla de ter y
hexano (1:1). El extracto se evapora y reconstituye en la Solucin de butil hidroxitolueno.
A menos que se especifiquen en las monografas individuales, la Solucin estndar, las Soluciones muestra, la Solucin de estndar interno y las soluciones reactivo se preparan segn se indica a continuacin.
Solucin A: Alcohol n-amlico y hexano deshidratado (3:997)
Solucin B: Acetonitrilo, agua y cido fosfrico (96: 3,8: 0,2)
Solucin de butil hidroxitolueno: 10 mg/mL de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografa
Solucin acuosa de hidrxido de potasio: Disolver 800 mg de hidrxido de potasio en 1000 mL de agua recientemente
calentada a ebullicin, mezclar y enfriar. [NOTAPreparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin alcohlica de hidrxido de potasio: Disolver 3 g de hidrxido de potasio en 50 mL de agua recientemente calentada a ebullicin, agregar 10 mL de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullicin hasta 100 mL. [NOTA
Preparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de cido ascrbico: 100 mg/mL de cido ascrbico en agua. [NOTAPreparar esta solucin en el da de su uso.]
Solucin de estndar interno: 5 mg/mL de ER Ergocalciferol USP en alcohol
Solucin madre del estndar: 5 mg/mL de ER Colecalciferol USP en alcohol
Solucin estndar: Transferir 2,0 mL de Solucin madre del estndar y 2,0 mL de Solucin de estndar interno a un matraz de
fondo redondo. Proceder segn se indica en Solucin muestra 1 comenzando donde dice Agregar 5 mL de.
Solucin muestra 1: Transferir 4,00 g de aceite a un matraz de fondo redondo. Agregar 5 mL de Solucin de cido ascrbico,
100 mL de alcohol y 10 mL de Solucin acuosa de hidrxido de potasio y mezclar. Someter la mezcla a reflujo en un bao de
vapor durante 30 minutos. Agregar 100 mL de una solucin de cloruro de sodio de 10 mg/mL. Enfriar rpidamente bajo una
corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador de 500 mL, enjuagando el matraz de saponificacin con
75 mL de una solucin de cloruro de sodio de 10 mg/mL y luego con 150 mL de una mezcla de ter y hexano (1:1). Agitar
vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas
capas se tornen transparentes. Desechar la capa inferior. Lavar los extractos de ter y hexano agitando vigorosamente con 50
mL de Solucin alcohlica de hidrxido de potasio y luego lavando con tres porciones de 50 mL de una solucin de cloruro de
sodio de 10 mg/mL. Filtrar la capa superior a travs de 5 g de sulfato de sodio anhidro sobre un papel de filtracin rpida en
un matraz de 250 mL adecuado para un evaporador rotatorio. Lavar el filtro con 10 mL de una mezcla de ter y hexano (1:1),
y combinar con el extracto. Evaporar el disolvente a presin reducida a una temperatura que no exceda de 30 y llenar con
nitrgeno cuando la evaporacin se haya completado. Alternativamente, evaporar el disolvente bajo una corriente suave de
nitrgeno a una temperatura que no exceda de 30. Disolver el residuo en 1,5 mL de Solucin de butil hidroxitolueno. [NOTA
Puede ser necesario calentar suavemente en un bao ultrasnico. Una fraccin grande del residuo blanco es colesterol.]
Solucin muestra 2: Agregar 2,0 mL de Solucin de estndar interno a 4,00 g de aceite y proceder segn se indica en Solucin muestra 1 comenzando donde dice Agregar 5 mL de.
Sistema cromatogrfico de limpieza
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase mvil: Solucin A
Columna de limpieza: Acero inoxidable; de 4,6 mm 25 cm; relleno L10
Anlisis (limpieza)
Muestras: Solucin estndar , Solucin muestra 1 y Solucin muestra 2
Recoger por separado los eluatos desde 2 minutos antes hasta 2 minutos despus del tiempo de retencin de colecalciferol
en un tubo de vidrio que contenga 1 mL de Solucin de butil hidroxitolueno y equipado con un cierre hermtico. Evaporar cada
tubo bajo una corriente de nitrgeno a una temperatura que no exceda de 30. Disolver cada residuo en 1,5 mL de acetonitrilo e inyectar en el sistema cromatogrfico analtico siguiente.
Sistema cromatogrfico analtico
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase mvil: Solucin B
Columna analtica: Acero inoxidable; de 4,6 mm 15 cm; relleno L1 de 5 mm
Aptitud del sistema
Muestra: Solucin estndar (despus de la limpieza)
USP 38
Pruebas Qumicas / 591 Determinacin de Cinc 415
Resolucin: No menos de 1,4 entre colecalciferol y ergocalciferol

Desviacin estndar relativa: No ms de 2,0% para el pico de colecalciferol, en inyecciones repetidas
Anlisis
Muestras: Solucin estndar, Solucin muestra 1 y Solucin muestra 2 (despus de la limpieza)
Calcular el contenido de vitamina D, en mg/g, en la porcin de muestra tomada:
Resultado = (RU/RS) (CS/CU)
RS = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estndar interno de la Solucin estndar
CS = concentracin de ER Colecalciferol USP en la Solucin estndar (mg/mL)
CU= concentracin de aceite en la Solucin muestra 2 (g/mL)
RU = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estndar interno de la Solucin estndar 2, segn se calcula a continuacin:
RU = rU2/[rIS2 (rIS1 rU2/rU1)]
[NOTASi rIS1 = 0 debido a que no se observa ningn pico en el sitio del estndar interno en el cromatograma de la Solucin
muestra 1, entonces RU = rU2/rIS2.]
rU2 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solucin muestra 2
rIS2 = respuesta del pico del estndar interno de la Solucin muestra 2
rIS1 = respuesta del pico del estndar interno de la Solucin muestra 1
rU1 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solucin muestra 1
La necesidad de establecer una determinacin cuantitativa de cinc en las Preparaciones farmacopeicas de insulina refleja el
hecho de que este elemento es un componente esencial de los cristales de insulina-cinc. De la misma manera que el plomo, se
puede determinar el contenido de cinc por el mtodo de la ditizona o mediante absorcin atmica.
Mtodo de Ditizona
Para esta prueba, seleccionar todos los reactivos que contengan el menor contenido posible de metales pesados. Si fuera
necesario, destilar el agua y otros disolventes en aparatos de vidrio duro o vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los materiales de vidrio con cido ntrico diluido tibio (1 en 2) y luego con agua. Evitar el uso en el separador de cualquier lubricante
que se disuelva en cloroformo.
Soluciones y Disolventes Especiales
SOLUCIN ALCALINA DE CITRATO DE AMONIODisolver 50 g de citrato dibsico de amonio en agua para obtener 100 mL. Agregar 100 mL de hidrxido de amonio. Eliminar los metales pesados que podran estar presentes, por extraccin de la solucin
con porciones de 20 mL de Solucin de Extraccin de Ditizona (ver Plomo 251) hasta que la solucin de ditizona retenga un
color verde transparente, luego extraer la ditizona remanente en la solucin de citrato por agitacin con cloroformo.
CLOROFORMODestilar el cloroformo en un aparato de vidrio duro o vidrio de borosilicato, recibiendo el destilado en suficiente alcohol deshidratado para obtener una concentracin final de 1 mL de alcohol por cada 100 mL de destilado.
SOLUCIN DE DITIZONAEmplear Solucin Estndar de Ditizona (ver Plomo 251), preparada con el Cloroformo destilado.
SOLUCIN ESTNDAR DE CINCDisolver 625 mg de xido de cinc, pesados con exactitud y previamente incinerados suavemente hasta peso constante, en 10 mL de cido ntrico y agregar agua hasta obtener 500,0 mL. Esta solucin contiene 1,0 mg de
cinc por mL.
SOLUCIN ESTNDAR DE CINC DILUIDADiluir 1 mL de Solucin Estndar de Cinc, medido con exactitud, con 2 gotas de cido
ntrico y suficiente agua para obtener 100,0 mL. Esta solucin contiene 10 mg de cinc por mL. Usar esta solucin dentro del
periodo de 2 semanas.
SOLUCIN DE CIDO TRICLOROACTICODisolver 100 g de cido tricloroactico en agua hasta obtener 1000 mL.
ProcedimientoTransferir de 1 a 5 mL de la preparacin a analizar, medidos con exactitud, a un tubo de centrfuga graduado de 40 mL. Si fuera necesario, agregar cido clorhdrico 0,25 N, gota a gota, hasta obtener una solucin transparente.
Agregar 5 mL de Solucin de cido Tricloroactico y suficiente agua para obtener 40,0 mL. Mezclar y centrifugar.
Transferir a un separador de vidrio duro un volumen exactamente medido del sobrenadante que, se supone, contiene de 5
mg a 20 mg de cinc y agregar agua hasta obtener aproximadamente 20 mL. Agregar 1,5 mL de Solucin Alcalina de Citrato de
Amonio y 35 mL de Solucin de Ditizona. Agitar vigorosamente 100 veces. Permitir que la fase clorofrmica se separe. Insertar
un trozo cilndrico de algodn en el vstago del separador para extraer el agua que est emulsionada en el cloroformo. Recoger en un tubo de ensayo el extracto clorofrmico (descartando la primera porcin que pase) y determinar la absorbancia a
530 nm, con un espectrofotmetro apropiado.
Captulos
591 DETERMINACIN DE CINC
416 591 Determinacin de Cinc / Pruebas Qumicas
USP 38
Calcular la cantidad de cinc contenida por referencia a una curva estndar de absorbancia-concentracin obtenida utilizando 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL y, si el contenido de cinc de la muestra extrada excede 15 mg, tambin 2,0 mL de la Solucin
Estndar de Cinc Diluida. Corregir la curva estndar mediante una determinacin concomitante de un blanco segn se indica,
donde se usan todos los reactivos pero no se agrega cinc.

601 MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIN: PRUEBAS DE
CALIDAD DE DESEMPEO DE AEROSOLES, ATOMIZADORES Y
POLVOS
Captulos
TABLA DE CONTENIDO
Introduccin
A. Uniformidad de Dosis Liberada
A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales
A.1.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.1.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Atomizadores Nasales
A.1.1.2 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles Nasales
A.2 Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin
A.2.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin
A.3 Polvos Nasales
A.3.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos Nasales
A.4 Polvos para Inhalacin
A.4.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos para Inhalacin
B. Distribucin del Tamao de Gotitas/PartculasAerosoles, Atomizadores y Polvos Nasales
B.1 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Lser
C. Distribucin del Tamao AerodinmicoAerosoles, Atomizadores y Polvos para Inhalacin
C.1 Principios Generales de la Medicin del Tamao Aerodinmico de Partculas
C.1.1 Medicin de Estacin
C.1.2 Prdida de Frmaco entre Estaciones (Prdidas en las Paredes)
C.1.3 Reingreso por Arrastre
C.1.4 Balance de Masa
C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para InhalacinImpactador Andersen (sin preseparador)
C.2.1 DiseoAparato 1
C.2.2 ProcedimientoAparato 1
C.3 Aparato 2 para Polvos para InhalacinImpactador Marple-Miller
Pruebas Fsicas / 601 Medicamentos Nasales y para Inhalacin 417
USP 38
C.4 Aparato 3 para Polvos para InhalacinImpactador Andersen (con preseparador)
C.5 Aparato 4 para Polvos para InhalacinImpactador (Impinger) Multiestacin en Fase Lquida
C.6 Aparato 5 para Polvos para InhalacinImpactador de Nueva Generacin (con preseparador)
C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para InhalacinImpactador de Nueva Generacin (con preseparador)
Captulos
INTRODUCCIN
Las principales mediciones de desempeo para aerosoles, atomizadores y polvos nasales y para inhalacin se relacionan con
la dosis liberada al paciente, incluyendo la uniformidad de la dosis liberada y las mediciones pertinentes de tamao de partcula (ptico o aerodinmico) dependiendo de la forma farmacutica. Las secciones siguientes presentan descripciones de cada
una de stas. El captulo Medicamentos Nasales y para InhalacinInformacin General y Pruebas de Calidad del Producto 5,
provee una tabla de nomenclatura de la que se pueden obtener los trminos descriptivos para varias formas farmacuticas.
A. UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales
La siguiente prueba se aplica a aerosoles y atomizadores nasales, formulados como suspensiones no acuosas o acuosas o
soluciones de frmacos que generalmente se presentan en envases multidosis y provistos de vlvulas o bombas dosificadoras.
En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el atomizador segn se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso.
A.1.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de la dosis mnima liberada
recolectada al inicio de la vida de la unidad y al final de la vida de la misma, se determinar en 10 envases distintos. Esto representa un total de 20 determinaciones. Estas mediciones deben realizarse despus de cebar el sistema segn se describe en el
etiquetado o en las instrucciones de uso. El nmero de dosis no debe exceder de 2 atomizaciones (es decir, un total de 20
determinaciones).
A.1.1.1 Muestreo de la dosis liberada de atomizadores nasales
ProcedimientoPara garantizar una recoleccin de dosis in vitro reproducible, se recomienda emplear un medio mecnico de
accionamiento del sistema dosificador o bomba para liberar las dosis que se van a recolectar. El procedimiento de accionamiento mecnico debe tener controles adecuados para los parmetros crticos de accionamiento mecnico (p.ej., fuerza de
accionamiento, velocidad de accionamiento, longitud del desplazamiento y periodos de descanso). La prueba debe realizarse
en unidades que hayan sido minuciosamente agitadas y cebadas de acuerdo con las instrucciones de uso para el paciente. La
unidad de prueba debe accionarse en una posicin vertical o casi vertical con la vlvula hacia arriba. La dosis recolectada al
inicio de cada uno de los 10 envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado, y la dosis recolectada al
final de la vida de cada envase debe corresponder al ltimo nmero de dosis declarado en la etiqueta del envase. Las dosis
entre las dos muestras de prueba secuenciales deben desecharse apropiadamente.
418 601 Medicamentos Nasales y para Inhalacin / Pruebas Fsicas
USP 38
Para productos en suspensin, la dosis debe ser liberada en un envase adecuado (por ejemplo, un vial de centelleo) en el
cual se pueda lograr la transferencia cuantitativa desde el envase en anlisis. Se utiliza un mtodo analtico validado para determinar la cantidad de frmaco en cada dosis liberada y los datos se informan como porcentaje de la cantidad declarada. Para
productos en solucin, la dosis liberada se puede determinar gravimtricamente a partir del peso de la dosis liberada y de la
concentracin y la densidad de la solucin de llenado del producto en anlisis.
A.1.1.2 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles nasales: Ver A.2.1.1 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin.
Captulos
A.2 Aerosoles para Inhalacin y Atomizadores para Inhalacin

Las siguientes pruebas se aplican a aerosoles para inhalacin (comnmente conocidos como inhaladores de dosis fija) y atomizadores para inhalacin. Los aerosoles para inhalacin se formulan como suspensiones o soluciones de un frmaco en propelentes y posiblemente en otros excipientes adecuados, y se presentan como unidades multidosis. Los atomizadores para inhalacin son, por lo regular, formulaciones lquidas acuosas envasadas en un sistema compacto de envasecierre que contiene
una bomba atomizadora integral. Consultar el captulo 5 para informacin adicional. Los siguientes mtodos de prueba son
especficos para estos productos y pueden requerir modificaciones cuando los analistas analizan tecnologas de inhalacin alternativas (por ejemplo, aerosoles para inhalacin o atomizadores para inhalacin activados por la respiracin). No obstante,
los requisitos farmacopeicos para todas las formas farmacuticas de dosis fija para inhalcin requieren determinar la dosis liberada y la distribucin del tamao aerodinmico. En todos los casos y para todas las pruebas, el producto debe ser preparado y
probado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta y las instrucciones de uso. Cuando el fabricante del producto no provea dichas instrucciones, se deben seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen en las pruebas siguientes.
La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin que
contienen formulaciones de frmacos (p.ej., solucin o suspensin) en presentaciones con dosis medidas por el dispositivo o
con dosis premedidas o prefijadas. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la
vida de la unidad. (Para productos envasados en unidades de dosificacin prefijadas/premedidas, consultar tambin el captulo
Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905.) En esta prueba, una dosis se define como el nmero mnimo recomendado de
atomizaciones especificado en el etiquetado o en las instrucciones de uso del producto, pero no ms de dos atomizaciones.
Para aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin, la dosis liberada esperada se especifica en la etiqueta, a menos
que se especifique algo distinto en la monografa individual. Su valor refleja el contenido medio de frmaco esperado para un
gran nmero de dosis liberadas recolectadas de muchas unidades del producto, empleando el mtodo especificado en la monografa.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis liberadas recolectadas al comienzo de la vida de la unidad (despus de realizar el cebado segn se describe en la etiqueta o en las instrucciones
de uso) y al final de la vida de la unidad declarada en la etiqueta, se determinar a partir de 10 envases distintos (es decir, un
total de 20 determinaciones).
A.2.1.1 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalacin y atomizadores para inhalacin
ProcedimientoPara determinar el contenido de ingrediente activo en la nube descargada de un aerosol para inhalacin y de
un atomizador para inhalacin, usar el Aparato A de muestreo (ver la Figura 1) descrito a continuacin. Preparar el producto
para su uso de acuerdo con las instrucciones del etiquetado para agitar, cebar y disparar. A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, con la bomba de vaco en funcionamiento y asegurando una velocidad de flujo de aire a travs
del dispositivo del producto de 28,3 L de aire por minuto (5%), descargar en el aparato los accionamientos mnimos recomendados a travs del adaptador de boquilla, accionando el sistema de medicin durante un tiempo suficiente para garantizar
que la dosis se haya descargado por completo. El volumen de aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. La dosis recolectada
de cada uno de los 10 envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado y la dosis recolectada al final
de la vida de cada envase debe ser la ltima dosis de acuerdo con lo declarado en la etiqueta. A menos que se indique algo
diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y recolectar el primer accionamiento posterior al cebado. Esperar 5 segundos y recolectar el siguiente accionamiento, cuando se justifique. Las dosis entre
las dos muestras de prueba secuenciales (es decir, el comienzo y el final de la vida del envase) deben desecharse de manera
apropiada. Se debe tener en cuenta que, para los aerosoles para inhalacin, la velocidad de las descargas (nmero de descargas por unidad de tiempo) que se van a desechar no debe ocasionar un enfriamiento excesivo del envase. Despus de las recolecciones individuales del nmero mnimo de accionamientos de cada unidad en cada muestra de prueba secuencial, retirar el
producto del Aparato A (ver la Figura 1) y desconectar el vaco. Valorar por separado el contenido de frmaco en el aparato al
comienzo y al final de las muestras de prueba secuenciales despus de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado.
Aparato AEl aparato de muestreo (ver la Figura 1) consta de una base para soporte de filtro con un soporte de filtro de malla
abierta, como una criba de acero inoxidable, un tubo de recoleccin fijado o atornillado a la base para soporte de filtro y un
adaptador de boquilla para garantizar un sellado hermtico entre el tubo de recoleccin y la boquilla. Usar un adaptador de
USP 38
boquilla que garantice que la abertura de la boquilla del producto est nivelada con la cara frontal o con el borde indentado
de 2,5 mm que est en el tubo de recoleccin de muestra, segn sea apropiado. El conector de vaco est conectado a un
sistema compuesto por una fuente de vaco, un regulador de flujo y un caudalmetro. La fuente debe ser capaz de arrastrar aire
a travs de todo el dispositivo, incluyendo el filtro y el producto a analizar, a la velocidad de flujo deseada. Durante las pruebas
de aerosoles para inhalacin, el aire debe extraerse de forma continua a travs del sistema de manera que se evite la prdida
del medicamento por fuga al medio ambiente que lo rodea. La base para soporte de filtro est diseada para soportar discos
de filtro de 25 mm de dimetro. Con el flujo de aire empleado, el tubo de recoleccin de muestra y el disco de filtro deben ser
capaces de recolectar cuantitativamente la dosis liberada. El disco de filtro y los restantes materiales utilizados en la construccin del aparato deben ser compatibles con el frmaco y los disolventes empleados para extraer el frmaco del filtro. Un extremo del tubo de recoleccin est diseado para sostener firmemente el filtro contra la base para soporte de filtro. Una vez montado, las uniones entre los componentes del aparato son hermticas, de forma que cuando se aplica vaco a la base del filtro,
todo el aire extrado a travs del aparato de recoleccin pasa a travs del dispositivo del producto.
Captulos
Figura 1. Aparato de muestreo para aerosoles y atomizadores para inhalacin
A.3 Polvos Nasales

La siguiente prueba se aplica a polvos nasales presentados en unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. En
todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el polvo segn se indica en el etiquetado y en las instrucciones de
uso.
USP 38
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis mnimas liberadas
de 10 envases individuales se determinar al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al nmero correspondiente de dosis
medidas declarado en la etiqueta. Esto representa un total de 20 determinaciones. Para polvos nasales envasados en unidades
monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 10 unidades de dosificacin.
A.3.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos nasales: Para garantizar una recoleccin de dosis in vitro reproducible, se
recomienda emplear un medio adecuado de accionamiento del dispositivo para liberar las dosis a recolectar. Las unidades de
prueba se deben accionar en posicin vertical o casi vertical. Las dos dosis separadas recolectadas incluyen la primera dosis y la
dosis correspondiente a la ltima dosis declarada de cada una de 10 unidades. Las dosis entre las dos muestras de prueba secuenciales para cada unidad se deben desechar apropiadamente. Se emplea un mtodo analtico validado para determinar la
cantidad de frmaco en cada dosis liberada y los datos se registran como porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta.
Para polvos nasales, se recomienda el aparato B (Figura 2).
Captulos
A.4 Polvos para Inhalacin

Las siguientes pruebas se aplican a polvos para inhalacin (comnmente conocidos como inhaladores de polvo seco) presentados como unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. Los requisitos farmacopeicos para todos estos medicamentos requieren la determinacin de la dosis liberada y de la distribucin de tamao aerodinmico. En todos los casos y
para todas las pruebas, preparar y probar el producto segn se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. Cuando el
fabricante del producto no provea dichas instrucciones, seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen
en las pruebas siguientes.
La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para polvos para inhalacin en presentaciones con dosis medida por
el dispositivo y premedidas (incluyendo multidosis ordenadas) cuyo etiquetado indica que se deben usar con el sistema de liberacin especificado. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la vida de la
unidad. (Para formulaciones envasadas en unidades de dosis premedidas, consultar tambin el captulo 905.) Se debe tener
en cuenta que la dosis liberada esperada es el contenido medio de frmaco de un gran nmero de dosis liberadas recolectadas
de muchas unidades en condiciones experimentales definidas. En muchos casos, el valor esperado puede depender de la forma en que se realice la prueba para la dosis liberada. Para polvos para inhalacin, en los que la cantidad que se declara en la
etiqueta es usualmente la dosis premedida o medida del frmaco, la dosis liberada esperada se especifica en la monografa
individual y generalmente es menor que la cantidad que se declara en la etiqueta. Su valor refleja el contenido medio de frmaco esperado para un gran nmero de dosis liberadas recolectadas del producto, empleando el mtodo especificado en la
monografa.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de la dosis mnima liberada de
10 envases individuales se determina de acuerdo con el procedimiento descrito a continuacin.
La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada durante toda la vida de la unidad se requiere para medicamentos envasados en
unidades de dosis medida por el dispositivo o unidades de dosis premedidas con dosis mltiples ordenadas que tienen una
secuencia de dosis predeterminada.
A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, el contenido de frmaco de las dosis liberadas se recolectar al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al nmero de dosis declarado en la etiqueta. Se obtendrn dos determinaciones de 10 unidades individuales de medicamento. Esto representa un total de 20 determinaciones.
Para polvos para inhalacin envasados en unidades monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 10 unidades de dosificacin.
A.4.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos para inhalacin: Emplear el Aparato B (ver la Figura 2) para determinar el
contenido del ingrediente activo emitido de la boquilla de un polvo para inhalacin. Este aparato puede muestrear las dosis
emitidas a distintas velocidades de flujo de aire.
USP 38
Figura 2. Aparato B: Aparato de muestreo para polvos para inhalacin. (Ver la Tabla 1 para especificaciones de los componentes.)
Tabla 1. Especificaciones de Componentes para el Aparato B (ver la Figura 2)
Cdigo
Artculo
Descripcin
Dimensiones
Ver la Figura 2
34,85 mm de dimetro interno 12 cm de longitud
Filtrob
Ver la Figura 2
Filtro de fibra de vidrio de 47 mm
Conector
(p.ej., acoplamiento corto

de metal con ramificacin
a P3 de dimetro menor)
8 mm de dimetro interno
Tubera de vaco
(p.ej., tubera de silicona

con un dimetro externo
de 14 mm y un dimetro
interno de 8 mm)
Un tubo de longitud adecuada de dimetro interno 8 mm con un volumen interno de 25 mL 5 mL.
Vlvula solenoide de dos

vasc
Ver la Figura 2
Vlvula solenoide de 2 vas, 2 puertos, con un dimetro interno 8 mm y

un tiempo de respuesta de apertura de 100 milisegundos.
Bomba de vacod
Ver la Figura 2
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo requerida a

travs del aparato ensamblado con el polvo para inhalacin en el adaptador de boquilla. Conectar la bomba a la vlvula solenoide empleando
una tubera de vaco corta y ancha ( 10 mm de dimetro interno) y conectores para minimizar los requisitos de capacidad de la bomba.
Temporizadore
Ver la Figura 2
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la vlvula solenoide durante el lapso de tiempo requerido.
Ver la Figura 2
2,2 mm de dimetro interno, 3,1 mm de dimetro externo, a nivel con la

superficie interna del tubo de recoleccin de muestra, centrado y sin rebabas, a 59 mm de su entrada. Las llaves de presin P1, P2 y P3 no se
deben abrir al exterior durante la recoleccin de la dosis.
P1
P1, P2, P3
H
Llave de paso de presin

Mediciones de presinf
Vlvula de control de flujog
Ver la Figura 2
Vlvula reguladora ajustable con mximo Cv 1h.
a A modo de ejemplo, un producto Millipore nmero XX4004700 (Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, MA 01732), modificado de forma que el
tubo de salida tenga un dimetro interno de 8 mm, equipado con un producto Gelman nmero 61631.
b A/E (Gelman Sciences Inc., 600 South Wagner Road, Ann Arbor, MI 48106) o equivalente.
c Producto ASCO nmero 8030G13, Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932.
d Producto Gast tipo 1023, 1423 2565 (Gast Manufacturing Inc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
e Producto Eaton nmero 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente.
f A modo de ejemplo, un manmetro PDM 210 (Air-Neotronics Ltd., Neotronics Technology plc, Parsonage Road, Takeley, Bishop's Stortford, CM226PU, Gran
Bretaa) o equivalente.
g Un producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS (Parker Hannifin plc., Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaa) o equivalente.
h Coeficiente de Flujo, segn lo define la norma ISA S75.02 Control valve capacity test procedure en Standards and Recommended Practices for Instrumentation
and Control, 10ma. edicin, Vol. 2; 1989. Publicada por Instrument Society of America, 67 Alexander Drive, PO Box 1227, Research Triangle Park, NC 27709,
EE.UU.
Aparato BEl aparato es similar al que se describe en la Figura 1 para analizar los aerosoles para inhalacin. Sin embargo, en
este caso el filtro y el tubo de recoleccin tienen un dimetro interno mayor para poder alojar discos de filtro de 47 mm de
dimetro. Esta caracterstica permite la recoleccin de las dosis a mayores velocidades de flujo de airehasta 100 L de aire/
minutocuando resulta necesario. Un adaptador de boquilla garantiza un sellado hermtico entre el tubo de recoleccin y la
boquilla del polvo para inhalacin en anlisis. El adaptador de boquilla debe garantizar que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto del tubo de recoleccin de la muestra. Los conectores de tubera, si se emplean,
deben tener un dimetro interno 8 mm para evitar que sus propios dimetros internos creen una resistencia significativa al
flujo de aire. Se debe seleccionar una bomba de vaco con un exceso de capacidad para extraer aire a la velocidad de flujo
volumtrico especificada a travs del aparato de muestreo y del producto simultneamente. Una vlvula de dos vas, operada
mediante solenoide, de baja resistencia y controlada por un temporizador est interpuesta entre la bomba de vaco y la vlvula
de control de flujo para controlar la duracin del flujo. Este tipo de vlvula permite que se extraigan 4,0 L de aire (5%) desde
la boquilla del producto a la velocidad de flujo especificada. El control del flujo se logra asegurando que se produzca un flujo
Captulos
Tubo de recoleccin de
muestraa
Captulos
USP 38
crtico (snico) en la vlvula de control de flujo (la relacin de presin absoluta P3/P2 es 0,5 en condiciones de flujo estacionario).
ProcedimientoOperar el aparato a un flujo de aire que produzca una cada de presin de 4 kPa (40,8 cm de H2O) en el producto a analizar y durante un lapso de tiempo que sea congruente con la extraccin de 2,0 L de aire desde la boquilla del
producto. [NOTASi la velocidad de flujo y la duracin se definieran de forma diferente en la monografa, ajustar el sistema
con una aproximacin de 5% con respecto a esos valores.] El volumen del aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. Determinar la velocidad de flujo de prueba usando el Aparato B de la siguiente manera. Insertar el producto en el adaptador de
boquilla para asegurar un sellado hermtico. En los casos en que el envase del medicamento modifique la resistencia del producto al flujo de aire, usar un dispositivo con el envase cargado, sin el medicamento (con el envase previamente vaciado). En
los otros casos, usar un dispositivo sin carga (sin el medicamento). Conectar un puerto de un transductor de presin diferencial
a la llave de presin, P1, y dejar el otro abierto a la atmsfera exterior. Encender la bomba y abrir la vlvula solenoide de dos
vas. Ajustar la vlvula de control de flujo hasta que la cada de presin a travs del producto sea de 4,0 kPa (40,8 cm de H2O).
Asegurarse de que se produzca un flujo crtico (snico) en la vlvula de control de flujo determinando los valores individuales
de presin absoluta P2 y P3 de manera que la relacin P3/P2 sea 0,5. Si no se logra la relacin P3/P2, cambiar la bomba por
una ms potente y medir nuevamente la velocidad de flujo. Las condiciones de flujo crtico (snico) en la vlvula de control de
flujo son necesarias para asegurar que el flujo volumtrico de aire extrado de la boquilla no se vea afectado por fluctuaciones
de la bomba y modificaciones de la resistencia al flujo de aire en el producto. Retirar el producto del adaptador de boquilla sin
alterar la vlvula de control de flujo, medir la velocidad del flujo de aire extrado desde la boquilla, Qout, conectando hermticamente un caudalmetro al adaptador de boquilla. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtrico que sale
del medidor de manera hermtica para determinar directamente Qout o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo
volumtrico que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el
flujo volumtrico de entrada (Qin) calcular:
Qout = QinP0/(P0 DP)
P0 = presin atmosfrica
DP = cada de la presin en el medidor
Si la velocidad de flujo es >100 L de aire/minuto, ajustar la vlvula de control de flujo hasta que Qout sea igual a 100 L/minuto;
de lo contrario, registrar el valor de Qout, sin modificar la vlvula de control de flujo. Definir la duracin del flujo de prueba,
p.ej., a 60 L/minuto T = 120/Qout, en segundos, de manera que un volumen de 2,0 L de aire (5%) se extraiga del producto a
la velocidad de flujo de prueba Qout y ajustar de manera correspondiente el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas. Cebar o cargar el dispositivo con polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la
etiqueta. Con la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide cerrada, insertar la boquilla del producto horizontalmente en el adaptador de boquilla. Descargar el polvo en el aparato de muestreo activando el temporizador que controla la
vlvula solenoide y extrayendo 2,0 L de aire desde el producto a la velocidad de flujo previamente definida. Repetir la operacin completa n 1 veces, comenzando donde dice Cebar o cargar el dispositivo con polvo, en donde n es el nmero de
veces definido en el etiquetado como la dosis mnima recomendada. Desmontar el envase del dispositivo de polvo para inhalacin del aparato de muestreo y desconectar la tubera de vaco D. Valorar el contenido de frmaco en el aparato despus de
enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Cuando se especifique en la monografa individual, realizar esta prueba en condiciones de temperatura y humedad controladas.
B. DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE GOTITAS/PARTCULASAEROSOLES, ATOMIZADORES Y

POLVOS NASALES
En el caso de aerosoles, atomizadores y polvos nasales en suspensin y en solucin, la distribucin del tamao de las gotitas/
partculas se debe determinar para la nube liberada subsiguiente a la descarga en condiciones experimentales especificadas. Si
se usa un mtodo de difraccin de lser (para ms detalles, consultar la descripcin de este mtodo en la seccin siguiente), la
distribucin del tamao de las gotitas se puede controlar en trminos de intervalos para el 10 (D10), 50 (D50) y 90 (D90) percentil de la distribucin de tamao acumulativa ponderada por volumen (masa), as como el alcance de la distribucin, expresado como [(D90 D10)/D50], y el porcentaje de gotitas de menos de 10 mm. Se debe tomar en cuenta que D50 es idntico al
dimetro medio del volumen (masa) cuando la distribucin es unimodal. Los procedimientos analticos apropiados y validados
o calibrados para la determinacin del tamao de las gotitas/partculas emitidas deben describirse a detalle suficiente para permitir una evaluacin exacta y reproducible que incluya lo siguiente:
informacin completa sobre el aparato y los accesorios
modo terico (aproximacin de LorenzMie o de Fraunhofer)
la aplicacin de la opcin de desactivacin para uno o ms de los detectores ms internos para mitigar los efectos del
direccionamiento del haz (slo se aplica a aerosoles nasales)
versin del software
colocacin de la muestra con respecto al banco ptico del difractmetro del lser
intervalo de medicin
ancho del haz
condicin de accionamiento del lser con respecto al inicio y el trmino de la secuencia de medicin
USP 38
lmite inferior de deteccin (si no se usa el accionamiento del lser)

y lmite de obstruccin de luz (lmite superior del intervalo de deteccin en trminos de la concentracin de partculas).
B.1 Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de Lser

Los medicamentos nasales destinados para aplicacin tpica en la cavidad nasal producen gotitas lquidas que a menudo
son mucho ms grandes que el intervalo de operacin de los impactadores inerciales multiestacin. Por ende, la difraccin de
lser (en ocasiones llamada dispersin de luz lser en ngulo bajo) es una alternativa aceptable para determinar la distribucin
del tamao debido a que no hay necesidad de relacionar la escala del tamao con el dimetro aerodinmico.
La teora y los principios operativos para la difraccin de lser se encuentran adecuadamente descritos en la norma ISO
13320:2009. Estos sistemas usan el patrn de dispersin de luz producido por el paso de una nube de gotitas a travs de la
zona de medicin para desarrollar la distribucin de tamao ponderada por volumen en un proceso iterativo en el que se usa
un modelo terico (ya sea de Fraunhofer o de LorenzMie) para interpretar los datos. El proceso se resume esquemticamente
en la figura Figura 3. [NOTASi se selecciona la opcin del modelo de LorenzMie, ser necesario ingresar valores para los
componentes reales (refraccin) e imaginarios (absorcin) del ndice de refraccin para el lquido que se est estudiando. Los
fabricantes de equipos de difraccin de lser proveen esta informacin para medios lquidos comnmente encontrados, a travs de su sitio Web o a solicitud.]
Captulos
Figura 3. Conversin de los datos de dispersin de luz en una distribucin del tamao de las gotitas por difractometra de
lser.
Se requiere un aparato que sea capaz de evaluar aerosoles o atomizadores. [NOTAno todos los equipos de difraccin de
lser disponibles comercialmente tienen dicha capacidad.] Configurar el sistema de medicin de acuerdo con el procedimiento
descrito esquemticamente en la Figura 4.
Figura 4. Configuracin para difractometra de lser con un medicamento nasal.
USP 38
Captulos
Los atomizadores para medicamentos nasales por lo general se miden usando un arreglo de banco abierto con una configuracin de estacin de accionamiento automtico de manera que se pueda optimizar la reproducibilidad de la operacin del
inhalador de un accionamiento al siguiente. Esta precaucin es particularmente importante para mediciones ms exactas con
bombas para atomizadores nasales. Verificar la alineacin del inhalador con la configuracin ptica del difractmetro de lser
usando las herramientas provistas por el fabricante para optimizar el banco ptico. Verificar que la obstruccin del haz de luz
est dentro de los lmites superior e inferior especificados por el fabricante, consultando el manual del operador para el sistema
de difraccin de lser que se est usando. Es necesaria la extraccin de vaco para eliminar las gotitas de manera eficiente despus de que pasan a travs del lser. Se podra presentar un resultado no representativo si el ajuste de este valor es demasiado
bajo (por lo general <5%). Asimismo, ocurrir un error no cuantificable debido a la dispersin mltiple si la obstruccin de la
luz est por encima del lmite superior recomendado. [NOTAEste lmite vara entre fabricantes y adems puede variar entre
los sistemas de difraccin de lser del mismo fabricante.]
Realizar tantas determinaciones repetidas como sea necesario para lograr un conjunto de datos representativo. Inspeccionar
cada distribucin de tamao presentada, idealmente en formato diferencial ponderado por volumen o equivalente para evaluar si es o no unimodal y simtrica. [NOTAEl siguiente anlisis de datos asume el cumplimiento con estos criterios. En caso
contrario, puede ser necesario un anlisis adicional que tome en cuenta la presencia de ms de un modo en la distribucin o
sesgo.]
Asumiendo que la densidad del lquido que se investiga es constante independientemente del tamao de las gotitas, las distribuciones de tamao ponderadas por volumen se pueden tratar como distribuciones de tamao ponderadas por masa con el
propsito de interpretar los datos. A partir de los datos acumulativos de distribucin del tamaovolumen, calcular la media y
una desviacin estndar para los tamaos que correspondan a fracciones de masa de menos del 10%, 50% y 90% de la distribucin (D10, D50 y D90).
C. DISTRIBUCIN DEL TAMAO AERODINMICOAEROSOLES, ATOMIZADORES Y POLVOS

PARA INHALACIN
C.1 Principios Generales de la Medicin del Tamao Aerodinmico de Partculas
La distribucin del tamao de partculas o gotitas en la nube descargada por los aerosoles y atomizadores para inhalacin y
la distribucin del tamao de partculas en la nube descargada de los polvos para inhalacin son parmetros importantes para
evaluar el desempeo del producto. Aunque se puede usar la medicin del tamao de partcula por microscopa para evaluar
el nmero de partculas grandes, de aglomerados y de partculas extraas en las emisiones de los aerosoles y atomizadores
para inhalacin, cuando sea posible, esta prueba debe reemplazarse con un mtodo para determinar la distribucin del tamao aerodinmico del aerosol del frmaco que abandona el producto. El dimetro aerodinmico de una partcula de aerosol es
igual al dimetro de una esfera de densidad unitaria con la misma velocidad gravimtrica de asentamiento. La distribucin de
tamao aerodinmico define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalacin. En la prctica, muchos inhaladores
descargan frmaco en forma de partculas o gotitas de gran tamao (la fraccin balstica) que salen del inhalador a gran velocidad e impactan quedando capturadas en las superficies hmedas de la boca y garganta. El remanente de la descarga del
inhalador es aerosol til, una fraccin no balstica que se inhala en el resto del tracto respiratorio.
Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partculas y las gotas de los aerosoles de acuerdo con los dimetros aerodinmicos. El principio de operacin de estos dispositivos, mediante el cual las partculas y gotitas de aerosol se separan de la
corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la Figura 5. Debido a que las dimensiones del tubo de admisin
utilizado para conectar los productos a impactadores en cascada y a impactadores en fase lquida (que se muestran en los
Aparatos 1; 2; 3; 4; 5 y 6) tambin definen la masa del frmaco que ingresa en el dispositivo para clasificar el tamao aerodinmico, estas dimensiones se definen cuidadosamente y, cuando es posible, se mantienen constantes entre aparatos (ver las
Figuras 6; 7; 8; 9; 10 y 11).
USP 38
Captulos
Figura 5. Representacin esquemtica del principio de operacin de los impactadores en cascada. (Se muestra un solo chorro por estacin del impactador. Los impactadores con chorros mltiples en cada estacin funcionan de la misma manera.)
C.1.1 MEDICIN DE ESTACIN
Los fabricantes de dispositivos de impacto en cascada proporcionan una calibracin definitiva para las caractersticas de separacin de cada estacin de impacto en trminos de la relacin entre la eficiencia de recoleccin a dicha estacin y el dimetro aerodinmico de las partculas y gotitas que la atraviesan en forma de aerosol. La calibracin es una propiedad que depende de la dimensin y la disposicin espacial del chorro, de la superficie sobre la que se recoge, y de la velocidad del flujo de
aire que atraviesa. Debido a que los chorros pueden causar corrosin y desgaste a lo largo del tiempo, las dimensiones crticas
de cada estacin, que definen la calibracin de la estacin de impacto, deben medirse peridicamente. Este proceso conocido
como medicin de estacin evita la necesidad de la calibracin repetida usando aerosoles estndar y asegura que, en el anlisis
de las emisiones de los productos, slo se utilicen aquellos dispositivos que cumplen con las especificaciones. El proceso incluye la medicin y el ajuste de las dimensiones crticas del instrumento.
C.1.2 PRDIDA DE FRMACO ENTRE ESTACIONES (PRDIDAS EN LAS PAREDES)
Cuando sean posibles variaciones en la metodologa y no se especifique un aparato en la monografa, el procedimiento seleccionado debe asegurar que se pierda no ms del 5% de la masa de frmaco total descargada del producto (dentro del impactador) entre las superficies de recoleccin de muestra del dispositivo de impacto. En el caso de que se sepa que las prdidas
de frmaco entre estaciones son >5%, se debe usar otro aparato alternativo o bien el procedimiento debe realizarse de tal forma que las prdidas en las paredes se incluyan junto con la recoleccin de la placa asociada. A modo de ejemplo, los siguientes procedimientos descritos para los Aparatos 1 y 3 han sido redactados incluyendo las prdidas en las paredes junto con la
placa de recoleccin asociada. No obstante, siempre que se sepa que tales prdidas son 5% de la masa total de frmaco descargada dentro del impactador y que no haya instrucciones contrarias en una monografa individual, el procedimiento puede
simplificarse valorando slo el frmaco que est sobre las placas de recoleccin.
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C.1.3 REINGRESO POR ARRASTRE
Cuando sea posible variar la metodologa, el mtodo seleccionado debe apuntar a minimizar el reingreso de partculas por
arrastre (desde una estacin de impacto superior a una inferior) en las estaciones que contribuyan a fracciones del tamao
definido en la monografa individual, especialmente cuando esto pueda alterar las cantidades recolectadas de frmaco. Minimizar el nmero de dosis muestreadas, usar superficies de recoleccin de partculas recubiertas y probar que los procedimientos para dosis mltiples producen resultados estadsticamente similares a los obtenidos a partir de un nmero de dosis menor
son mtodos que se pueden emplear para este propsito. En el caso de que no se pueda evitar el reingreso por arrastre, se
deben normalizar el nmero de dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duracin total del flujo de aire a
travs del dispositivo de impacto en cascada. En estas circunstancias, la presentacin de los datos de impacto no debe asumir
la validez de la calibracin del impactador (es decir, los rangos de dimetros aerodinmicos no deben ser asignados a masas de
frmacos recolectadas en estaciones especficas).
Usando mtodos de valoracin apropiados y un dispositivo de impacto medido adecuado, los analistas pueden determinar
la distribucin de tamao aerodinmico de partculas de los frmacos que salen de las boquillas de los aerosoles y atomizadores para inhalacin o polvos para inhalacin. Si los lmites de temperatura o humedad para el uso del producto estn indicados
en la etiqueta, puede ser necesario controlar la temperatura y la humedad del aire del entorno del dispositivo y del aire que lo
atraviesa para que se ajusten a esos lmites. Se presumen las condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente
en las monografas individuales.
Captulos
C.1.4 BALANCE DE MASA
Adems de la distribucin de tamao, las buenas prcticas analticas dictan que se debe lograr un balance de masa completo para confirmar que toda la cantidad de frmaco descargada desde el producto y que se captura y se mide en el tubo de
admisin a travs del filtro terminal del mpactador en cascada, est comprendida en el intervalo aceptable con respecto a la
dosis liberada medida. El resultado para la masa recuperada se puede expresar en trminos de cada accionamiento como porcentaje de la dosis liberada declarada, la cual representa la dosis liberada desde la boquilla.
La masa total de frmaco recolectada en todos los componentes (balance de material) dividida por el nmero total de dosis
mnimas recomendadas descargadas es por lo regular no menos de 85% y no ms de 115% de la cantidad declarada que se
espera liberar. sta no es una prueba del producto pero sirve para asegurar que los resultados de la prueba son vlidos.
Procedimiento
Usar uno de los siguientes dispositivos de impacto multiestacin, o uno equivalente, para determinar la distribucin de tamao aerodinmico de partculas de los frmacos que salen de las boquillas de aerosoles y atomizadores para inhalacin o
polvos para inhalacin. Los Aparatos 1 y 6 [Figuras 6 y 11 (sin preseparador), respectivamente] estn destinados para su uso
con aerosoles y atomizadores para inhalacin a una sola velocidad de flujo de aire. Los Aparatos 2, 3, 4 y 5 (Figuras 8, 9, 10 y
11, respectivamente) estn destinados para uso con polvos para inhalacin a la velocidad de flujo de aire apropiada, Qout, determinada anteriormente, siempre que el valor Qout est comprendido en el intervalo de 30100 L/minuto. [NOTASi Qout es
>100 L/minuto, la prueba debe ser realizada ajustando Qout a 100 L/minuto; si Qout es menor que 30 L/minuto, la prueba se
realiza con Qout a 30 L/minuto.]
La Tabla 2 indica el aparato usado para determinar el tamao aerodinmico de partculas y los productos que se pueden
evaluar.
Tabla 2. Aparato para Tamao Aerodinmico de Partcula:
Su Descripcin y los Productos que se Pueden Evaluar
Aparato
Descripcin
Producto
Impactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (sin preseparador)
Aerosoles y atomizadores para inhalacin
Impactador Marple-Miller
Polvos para inhalacin
Impactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (con preseparador)
Impactador Multiestacin en Fase Lquida
Impactador de Nueva Generacin (con preseparador)
Impactador de Nueva Generacin (sin preseparador)
Aerosoles y atomizadores para inhalacin
Tabla 3. Valores Lmite para Todos los Impactadores a Velocidades de Flujo Especificadas
a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuracin Estndar para Operacin a 28,3 L/minuto en Comparacin con
Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/minuto y 90 L/minuto
Estacin
28,3 mL/minuto
60 L/minuto
90 L/minuto
2
1
8,0
8,6
6,5
0a
9,0
6,5
5,2
5,8
4,4
3,5
La versin de la estacin 0 usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificacin externa que permite otra estacin en lugar de equiparla con el cono adaptador de
admisin. Sus caractersticas y desempeo internos se mantienen sin cambios.
USP 38
Tabla 3. Valores Lmite para Todos los Impactadores a Velocidades de Flujo Especificadas
a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuracin Estndar para Operacin a 28,3 L/minuto en Comparacin con
Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/minuto y 90 L/minuto (Continuacin)
Estacin
28,3 mL/minuto
60 L/minuto
90 L/minuto
4,7
3,2
2,6
3,3
1,9
1,7
2,1
1,2
1,0
1,1
0,55
0,22
0,7
0,26
0,4
La versin de la estacin 0 usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificacin externa que permite otra estacin en lugar de equiparla con el cono adaptador de
admisin. Sus caractersticas y desempeo internos se mantienen sin cambios.
b. Puntos de Corte (mm) para el Aparato 2 a 60 y 90 L/minuto

Estacin
Velocidad de Flujo
60 L/minuto
Velocidad de Flujo
90 L/minuto
10,0
8,1
5,0
4,0
2,5
2,0
1,25
1,0
0,63
0,5
Captulos
c. Puntos de Corte (mm) para el Aparato 4 a 60 L/minuto

Estacin
Velocidad de Flujo
(60 L/minuto)
13,0
6,8
3,1
1,7
d. Puntos de Corte (mm) para el Aparato 5 y 6 a 30, 60 y 100 L/minuto

Estacin
Velocidad de Flujo
(30 L/minuto)
Velocidad de Flujo
(60 L/minuto)
Velocidad de Flujo
(100 L/minuto)
1
2
11,76
8,06
6,12
6,40
4,46
3,42
3,97
2,82
2,18
2,30
1,66
1,31
1,36
0,94
0,72
0,83
0,55
0,40
0,54
0,34
0,24
MOCa
0,36
0,14
0,07
a MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls). Los tamaos corresponden a una eficiencia de recoleccin del 80% para esta estacin de
respaldo.
C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para InhalacinImpactador Andersen (sin

preseparador)
Usar el Aparato 1 o un equivalente, a una velocidad de flujo de 28,3 L/minuto (5%) conforme a lo especificado por el fabricante del impactador en cascada.
C.2.1 DISEOAPARATO 1
El diseo y montaje de este aparato y del tubo de admisin para conectar el impactador a un producto se muestran en las
Figuras 6, 6a y 6b.1
1 Se puede obtener un impactador en cascada adecuado como Modelo Mk II de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa sin
el preseparador. El producto se conecta al impactador a travs del tubo de admisin, por encima del cono de ingreso que se muestra en la Figura 6. Si se emplea
un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de admisin de la Figura 6a, aunque el cono de ingreso (Figura 6b) debe ser reemplazado por otro que se ajuste
al impactador en cuestin. Se debe tener en cuenta que las superficies internas del tubo de admisin (Figura 6a) estn diseadas para ajustarse a nivel con sus
contrapartes en el cono de ingreso (Figura 6b). Este diseo evita la captura del aerosol en la junta entre los dos tubos.
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Captulos
Figura 6. Aparato 1: Montaje del tubo de admisin y del cono de ingreso sobre el impactador en cascada.
Figura 6a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisin para uso con aerosoles y atomizadores para inhalacin y polvos
para inhalacin.
USP 38
Captulos
Figura 6b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisin en el impactador en cascada
Andersen sin preseparador. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la superficie (Ra) debe ser aproximadamente de 0,4 mm.
Las dimensiones crticas de ingeniera de los fabricantes para las estaciones del Aparato 1 figuran en la Tabla 4. Durante el
uso, puede producirse la oclusin y bloqueo de las toberas de chorros y, por lo tanto, es necesario justificar las tolerancias de
medicin durante el uso.
Tabla 4. Dimensiones Crticas para las Toberas de Chorro del Aparato 1
Nmero de Estacin
Nmero
de Chorros
Dimetro de
Tobera (mm)
96
2,55 0,025
96
1,89 0,025
400
0,914 0,013
400
0,711 0,013
400
0,533 0,013
400
0,343 0,013
400
0,254 0,013
201
0,254 0,013
C.2.2 PROCEDIMIENTOAPARATO 1
Ajustar el impactador en cascada de mltiples estaciones segn se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro
terminal debajo de la ltima estacin para capturar todas las partculas finas que de otra manera escaparan del dispositivo.
Para asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya
demostrado que esto es innecesario. Unir el tubo de admisin y el adaptador de boquilla de manera que se produzca un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin segn se muestra en la Figura 6. Emplear un adaptador de
boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto del tubo de admisin.
Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estn conectadas y selladas hermticamente para evitar
fugas. Encender la bomba de vaco para extraer el aire a travs del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a travs del
sistema con un caudalmetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisin. Ajustar la vlvula de control de flujo en
la bomba de vaco para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida y asegurarse de que el flujo de
USP 38
aire a travs del sistema quede comprendido en un intervalo de 5% con respecto a la velocidad de flujo especificada por el
fabricante. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5
segundos y accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vaco en funcionamiento, insertar la boquilla
en su adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la dosis mnima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la vlvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de desmontar el producto del adaptador de boquilla, agitar el producto, colocarlo nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la siguiente dosis mnima recomendada. Repetir hasta que se haya descargado el nmero de dosis requerido. El nmero de dosis mnimas recomendadas debe ser tal que permita una determinacin exacta y precisa de la distribucin de tamao aerodinmico.
[NOTAUsualmente, el nmero de dosis mnimas recomendadas no es >10.] Despus de descargar la ltima dosis, retirar el
producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado, y
diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada, colocar cada estacin y su respectiva placa de recoleccin o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para extraer el frmaco de cada uno
de stos. [NOTASi se ha determinado que las prdidas en las paredes del impactador son 5%, entonces se necesita analizar
solamente el material recolectado en las placas.] Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Empleando el
mtodo de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los
componentes. Para analizar los datos, proceder segn se indica en Anlisis de Datos.
C.3 Aparato 2 para Polvos para InhalacinImpactador Marple-Miller

Captulos
El diseo y el montaje del Aparato 2 y del tubo de admisin para conectar el impactador al producto se muestran en la
Figura 8.2 [NOTAEl tubo de admisin se muestra en detalle en la Figura 6a.] El impactador tiene cinco estaciones de impactacin y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumtrico de aire de 60 L/minuto (la velocidad del flujo nominal, Qn), los
dimetros aerodinmicos lmite D50,Qn de las Estaciones 15 son 10; 5; 2,5; 1,25 y 0,625 mm, respectivamente. El filtro terminal
retiene eficazmente el frmaco suspendido en el aerosol en el rango de tamao de partcula de hasta 0,625 mm. Colocar el
impactador en cascada multiestacin con el sistema de control segn se especifica en la Figura 7. Para asegurar una captura
eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u otro
lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, segn se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de
la estacin final para capturar todas las partculas finas que de otra manera escaparan del dispositivo. Unir el tubo de admisin
y el adaptador de boquilla, de manera que se produzca un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada estn conectadas y selladas hermticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide y calibrar el flujo de aire a travs del sistema segn se indica a
continuacin. Conectar un caudalmetro al tubo de admisin. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtrico que sale del medidor para determinar directamente Qout o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumtrico que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volumtrico de entrada (Qin), calcular:
Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida, Qout, de manera que el valor de Qout est dentro del 5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar
que se produzca el flujo crtico en la vlvula de control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la prueba,
empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulacin, medir
la presin absoluta a ambos lados de la vlvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relacin de P3/P2 0,5 indica
flujo crtico. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms potente y medir nuevamente la velocidad
de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra
esta vlvula durante un lapso de T segundos, segn se determin durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o
cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de
boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, abriendo la vlvula solenoide de dos vas durante un
lapso de T segundos. Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de
boquilla. Si se requieren dosis adicionales para recolectar la muestra, recargar el producto segn las instrucciones que figuran
2 Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller Impactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN. El producto debe conectarse al
impactador mediante el tubo de admisin que se muestra en la Figura 6a.
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en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin hasta que el nmero de dosis requerido
haya sido descargado. Despus de la descarga de la ultima dosis, apagar la bomba de vaco. Enjuagar el adaptador de boquilla
y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada y colocar el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjuagar para extraer el frmaco de cada
una de las estaciones y del filtro y diluir cuantitativamente cada uno hasta un volumen apropiado. Empleando el mtodo de
anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los componentes.
Figura 8. Aparato 2: Montaje del tubo de admisin, colector de estaciones y portafiltro. (Impactador Marple-Miller, Modelo
160 con tubo de admisin USP.)
Tabla 5. Dimensiones Crticas para las Toberas de Chorro del Aparato 2
Nmero de
Estacin
Nmero de
Chorros
Dimetro de
Tobera (mm)
16,8 0,05
20
3,40 0,03
40
1,70 0,01
80
0,84 0,01
160
0,41 0,01
Captulos
Figura 7. Aparatos 2; 3, 4 5: Equipos de control general. (Ver la Tabla 6 para especificaciones de los componentes.)
USP 38
Realizar la prueba utilizando el Aparato 2 a la velocidad de flujo de aire, Qout determinada anteriormente, durante la prueba
de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que Qout sea 100 L/minuto. [NOTASi Qout es >100 L/minuto, utilizar una velocidad
de flujo de aire de 100 L/minuto.] Conectar el aparato al sistema de control de flujo basado en el flujo crtico (snico) segn se
especifica en la Figura 7 (ver tambin la Tabla 6).
Tabla 6. Especificaciones de los Componentes para la Figura 7
Cdigo
Descripcin
Dimensiones
Conector
p.ej., acoplamiento corto de metal con ramificacin a P3 de dimetro menor
8 mm de dimetro interno
Tubera de vaco
p.ej., tubera de silicona con un dimetro

externo de 14 mm y un dimetro interno
de 8 mm
Un tubo de longitud adecuada de dimetro interno 8 mm

con un volumen interno de 25 mL 5 mL
Vlvula solenoide de dos

vasa
Ver la Figura 7
Vlvula solenoide de 2 vas, 2 puertos, con un dimetro interno 8 mm y un tiempo de respuesta de apertura de
100 milisegundos.
Ver la Figura 7
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo

requerida a travs del aparato ensamblado con el inhalador de polvo seco en el adaptador de boquilla. Conectar
la bomba a la vlvula solenoide empleando una tubera de
vaco corta y ancha (10 mm de dimetro interno) y conectores para minimizar los requisitos de capacidad de la
bomba.
Ver la Figura 7
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente

a la vlvula solenoide durante el lapso de tiempo requerido.
Bomba de vacob
Captulos
Artculo
Temporizadorc
E
P2, P3
F
Determinadas en condiciones de flujo estacionario con un

transductor de presin absoluta.
Mediciones de Presin
Vlvula de control de flujod
Ver la Figura 7
Vlvula reguladora ajustable con Cv 1 mximo.
A modo de ejemplo, el producto ASCO nmero 8030G13 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver tambin la nota al pie h en la Tabla 1.
b Producto Gast tipo 1023, 1423 2565 (Gast Manufacturing Inc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
c A modo de ejemplo, el producto Eaton nmero 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094)
o equivalente.
d Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin plc, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaa). Ver tambin la nota
al pie h en la Tabla 1.
En condiciones de flujo constante, a la velocidad de flujo de aire volumtrico apropiada a travs de todo el aparato, asegurarse de que se ocasione un flujo crtico (snico) en la vlvula de control de flujo determinando los valores de presin absoluta,
P2 y P3, de manera que la relacin P3/P2 sea 0,5. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms
potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada una de
las estaciones del impactador en cascada para asegurar que las partculas que hayan impactado en una estacin dada no se
reintroduzcan por arrastre en la corriente de aire que fluye a menos que se haya demostrado que esto no es necesario. Analizar
los datos segn se indica en Anlisis de Datos.
C.4 Aparato 3 para Polvos para InhalacinImpactador Andersen (con preseparador)

El Aparato 3 es idntico al Aparato 1 (Figura 6), excepto que el preseparador del fabricante se instala encima de la Estacin 0
para recolectar masas grandes de polvo no inhalable antes de que ingresen al impactador; y la conexin de salida, que se utiliza para conexin al tubo de vaco B (Figura 7), se reemplaza por otra que tenga un dimetro interno 8 mm. Para conectar el
preseparador del impactador al tubo de admisin (Figura 6a), usar una pieza superior especialmente diseada para el preseparador. Esto se muestra en la Figura 93. Por lo tanto, el impactador tiene ocho estaciones, un preseparador (para recoleccin de
partculas grandes) y un filtro terminal. Puede no requerirse un preseparador para ciertos polvos modificados por ingeniera, en
especial aqullos con baja densidad aparente. Conectar el impactador en cascada al sistema de control especificado en la Figura 7. Omitir la Estacin 6 y la Estacin 7 del impactador si la velocidad de flujo de prueba, Qout, usada durante el anlisis de
Uniformidad de Dosis Liberada fue 60 L/minuto. Para asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a
partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, segn se
describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estacin final para capturar todas las part3 El impactador en cascada est disponible como el producto Andersen 1ACFM Non-Viable Cascade Impactor (Mark II) de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway,
Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el preseparador.
USP 38
Captulos
culas finas que de otra manera escaparan del dispositivo. Colocar un volumen adecuado (hasta 10 mL) de un disolvente apropiado en el preseparador o recubrir las superficies de recoleccin de partculas del preseparador para prevenir el reingreso de
las partculas impactadas por arrastre. [PrecaucinAlgunos disolventes pueden producir mezclas de airevapor inflamables que se
pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operacin de la bomba mnimos, etc.) para garantizar la proteccin del operador durante
la prueba.] Conectar un adaptador de boquilla moldeado al extremo del tubo de admisin de manera que se produzca un
sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el
extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes
estaciones del impactador en cascada estn conectadas y selladas hermticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide de dos vas y calibrar el flujo de aire a travs del sistema segn
se indica a continuacin. Cebar o cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con
la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma
horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisin. Una vez que el inhalador est en posicin, descargar el polvo
dentro del aparato activando el temporizador y abriendo la vlvula solenoide de dos vas durante el lapso de tiempo requerido,
T 5%, segn se determin durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Despus de que la vlvula solenoide de dos
vas se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el
polvo para inhalacin segn las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y
repetir la operacin hasta que el nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de la descarga de la ltima dosis,
retirar el inhalador del adaptador de boquilla y apagar la bomba de vaco.
Desmontar cuidadosamente el aparato. Usando un disolvente adecuado, enjuagar para extraer el frmaco del adaptador de
boquilla, el tubo de admisin y el preseparador, y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjuagar para extraer el frmaco de cada estacin y de la placa de impacto situada inmediatamente debajo y recoger los enjuagues
en matraces de tamao apropiado. Diluir cuantitativamente cada matraz hasta un volumen apropiado. Empleando el mtodo
de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada una de las muestras.
USP 38
Captulos
Figura 9. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisin USP. El
material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de
superficie (Ra) de aproximadamente 0,4 mm.
Proceder segn se indica en el Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 3.
C.5 Aparato 4 para Polvos para InhalacinImpactador (Impinger) Multiestacin en Fase Lquida
NOTAEl Aparato 4, un impactador multiestacin en fase liquida, tiene un nmero reducido de estaciones y su uso est ampliamente difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este documento para beneficio de los usuarios de otros
pases.
El diseo y el montaje del Aparato 4 se muestran en las Figuras 10, 10a y 10b.4 El tubo de admisin, empleado para conectar
el impactador (impinger) multiestacin en fase lquida a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador multiestacin en fase lquida que consiste en las Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado (Estacin
5). Las estaciones de recoleccin del impactador multiestacin en fase lquida (ver la Figura 10 y la Tabla 7) se mantienen hmedas, a diferencia de los impactadores tradicionales, como por ejemplo los Aparatos 1; 2; 3; 5 y 6. Este humedecimiento puede producir un efecto similar al recubrimiento de las estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a determinadas velocidades de flujo,
aunque esto debe confirmarse demostrando el control del reingreso por arrastre segn se ha descrito previamente. Una esta4 El impactador en fase lquida de cinco estaciones est disponible en Copley Instruments, plc, Nottingham, Gran Bretaa. El producto debe conectarse al impactador mediante el tubo de admisin que se muestra en la Figura 8 y la Figura 6a.
USP 38
Captulos
cin de impacto comprende una pared divisoria metlica horizontal y superior (B) a travs de la cual sobresale un tubo metlico de entrada de chorro (A) con su placa de impacto (D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo (F), que
forma la pared vertical de la estacin; y una pared divisoria metlica horizontal inferior (G) a travs de la cual un tubo (H) se
conecta a la estacin inferior. El tubo que entra en la estacin 4 (U) termina en una disposicin de chorros mltiples. La placa
de impacto (D) se asegura en un marco metlico (J), el cual se ajusta mediante dos alambres (K) a un manguito (L) asegurada
sobre el tubo de chorro (C). Para ms detalles sobre el tubo de chorro y la placa de impacto, ver la Figura 10a. El plano horizontal de la placa de recoleccin es perpendicular al eje del tubo de chorro y se alinea centralmente. La superficie superior de
la placa de impacto se eleva levemente por encima del borde del marco metlico. Un surco alrededor del permetro de la pared divisoria horizontal gua la posicin del cilindro de vidrio. Los cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) contra las paredes
divisorias horizontales y se sujetan mediante seis pernos (N). Las aberturas de muestreo se sellan con tapones. El fondo de la
pared divisoria inferior de la Estacin 4, tiene una protuberancia concntrica fijada con una junta trica de goma (P) que la
sella contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro (R), es una cubeta con un hueco concntrico en el que
se calza un soporte de filtro perforado (S). El portafiltro est diseado para filtros de 76 mm de dimetro. El montaje completo
de la estacin de impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de funcionamiento ultrarrpido (T). El impactador multiestacin en fase lquida est equipado con un tubo de admisin (Figura 6a) que se ajusta al tubo de entrada de chorro de la
Estacin 1. Una junta trica de goma en el tubo de chorro proporciona un sellado hermtico al tubo de admisin. Un adaptador de boquilla elastomrico para insertar el producto en anlisis proporciona un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin.
Asegurarse de que el Aparato 4 est limpio y exento de solucin del frmaco proveniente de pruebas anteriores. Colocar un
filtro de 76 mm de dimetro en la estacin de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presin capaz de recolectar
cuantitativamente el aerosol del frmaco que lo atraviesa, que tambin permita una recuperacin cuantitativa del frmaco recolectado. Armar el Aparato 4 empleando el sistema de control especificado en la Figura 7. Unir el tubo de admisin (Figura 6a)
y el adaptador de boquilla para que se produzca un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin.
Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo abierto
del tubo de admisin. Asegurarse de que las diferentes estaciones del aparato estn conectadas hermticamente para evitar
fugas. Poner en marcha la bomba de vaco, abrir la vlvula solenoide de dos vas y calibrar el flujo de aire a travs del sistema
segn se indica a continuacin. Conectar al tubo de admisin un caudalmetro calibrado para medir la velocidad del flujo volumtrico que sale del medidor. Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida, Qout, de manera que el valor de Qout est dentro del 5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crtico en la vlvula de control de flujo al valor Qout que se va a emplear
durante la prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en
circulacin, medir la presin absoluta a ambos lados de la vlvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relacin de
P3/P2 0,5 indica flujo crtico. Si no se alcanza esta relacin de P3/P2, cambiar la bomba por una ms potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas,
de manera que abra esta vlvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad
de Dosis Liberada. Dispensar 20 mL de un disolvente capaz de disolver el frmaco dentro de cada una de las cuatro estaciones
superiores del Aparato 4 y colocar nuevamente los tapones. [PrecaucinAlgunos disolventes pueden producir mezclas de aire
vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operacin de la bomba mnimos, etc.) para garantizar la proteccin del operador durante la prueba.] Inclinar el aparato para humedecer los tapones y de esa forma neutralizar sus cargas electroestticas. Ajustar el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra la vlvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Cebar o
cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de
boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la vlvula solenoide de dos vas durante el lapso requerido, T 5%. Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado, retirar el
producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalacin segn
las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin hasta que el
nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de descargar la ultima dosis, apagar la bomba de vaco.
Desarmar la estacin de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente retirar el filtro (Figura 10b) y extraer el frmaco con disolvente.
Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente
hasta un volumen apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va a la Estacin 1 (Figura 10), permitiendo
que el disolvente fluya dentro de la estacin. Enjuagar para extraer el frmaco de las paredes internas y de la placa de recoleccin de cada una de las cuatro estaciones superiores del aparato y transferir a la solucin de la estacin respectiva, inclinando y
rotando el aparato, asegurndose de que no haya transferencia de lquido entre las estaciones. Empleando el mtodo de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada uno de los seis volmenes de
disolvente. Asegurarse de que el mtodo corrija la posible evaporacin de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar
el uso de un estndar interno (de concentracin original conocida en el disolvente y valorado al mismo tiempo que el frmaco)
o la transferencia cuantitativa del contenido lquido de cada una de las estaciones, seguida por una dilucin hasta un volumen
conocido. Empleando el mtodo de anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco recolectada en cada una de las muestras.
Captulos
USP 38
Figura 10. Aparato 4: Esquema del impactador multiestacin en fase lquida. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los
componentes.)
Tabla 7. Unidades Componentes del Impactador (Impinger) Multiestacin en Fase Lquida
(ver la Figura 10, la Figura 10a y la Figura 10b)
Cdigo
Artculo
Descripcin
A, H
Tubo de chorro
Tubo de metal atornillado a una pared divisora sellada por una junta (C), superficie interna pulida
B, G
Pared divisoria
Placa circular de metal, dimetro
Junta
Placa de impacto
Cilindro de vidrio
Marco de metal
Ver la Figura 10a

120
Grosor
Ver la Figura 10a
p.ej., de PTFE
Para adaptarse al tubo del chorro
Disco de vidrio sinterizado de porosidad O

Dimetro
Dimensiones
(en mm a menos que se
indique algo diferente)
Ver la Figura 10a
Tubo de vidrio cortado pulido plano

Altura, incluyendo juntas
46
Dimetro externo
100
Espesor de pared
3,5
Dimetro (F) de la abertura de muestreo
18
Tapn de la abertura de muestreo
ISO 24/25
Marco circular con perfil en L con ranura

Dimetro interno
Para adaptarse a la placa de impacto
Altura
Grosor de la seccin horizontal
0,5
Grosor de la seccin vertical
USP 38
Tabla 7. Unidades Componentes del Impactador (Impinger) Multiestacin en Fase Lquida

(ver la Figura 10, la Figura 10a y la Figura 10b) (Continuacin)
Cdigo
K
Artculo
Descripcin
Alambre de acero que interconecta el marco de
metal y el manguito (dos por cada marco)
Alambre
Dimetro
L
Dimensiones
(en mm a menos que se
indique algo diferente)
Manguito
Manguito metlico fijado al tubo de chorro mediante tornillos

Dimetro interno
Para adaptarse al tubo del chorro
Altura
Grosor
Junta
p.ej., de silicona
Para adaptarse al cilindro de vidrio
Perno
Perno con tuerca de metal (seis pares), longitud
205
Junta trica
Dimetro
Junta trica de goma, dimetro grosor
66,34 2,62
Junta trica
Junta trica de goma, dimetro grosor
29,1 1,6
Portafiltro
Bastidor de metal con pie y salida
Ver la Figura 10b
Soporte de filtro
Lmina de metal perforada, dimetro
65
3
Distancia entre orificios (puntos centrales)
Captulos
Dimetro de orificio
Cierres de funcionamiento ultrarrpido
Tubo de chorros
mltiples
Tubo de chorro (H) que termina en disposicin de

chorros mltiples
Ver insertos en Figura 10a
Salida
Salida y tobera para conexin a vaco
Dimetro interno 10 (Figura 10b)
Figura 10a. Aparato 4: Detalles del tubo de chorro y la placa de impacto. Los insertos muestran el extremo del tubo de chorros mltiples (U) que lleva a la Estacin 4. (Ver la Tabla 8 para especificaciones de dimensiones.)
Tabla 8. Aparato 4Dimensiones del Impactador Multiestacin en Fase Lquida.
Estacin
Nmero de Toberas
Dimetro
(mm)
Valor
Nominal
Tolerancia ()
25,0
0,1a
14,0
0,1a
8,0
0,1a
Cortesa de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaa.
USP 38
Tabla 8. Aparato 4Dimensiones del Impactador Multiestacin en Fase Lquida. (Continuacin)

Nmero de Toberas
Estacin
4
a
Dimetro
(mm)
Entrada
6,3a
0,1a
Salida
2,7a
0,05a
Cortesa de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaa.
Captulos
Figura 10b. Aparato 4: Vista expandida de la Estacin 5. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.)
Proceder segn se indica en Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 4.
C.6 Aparato 5 para Polvos para InhalacinImpactador de Nueva Generacin (con preseparador)
El diseo y montaje del Aparato 55 se muestran en las Figuras 11, 11a, 11b, 11c y 11d. El tubo de admisin, empleado para
conectar el impactador a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador en cascada con siete estaciones y un colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls). Las curvas de eficiencia de recoleccin para cada estacin
son marcadas y minimizan la superposicin entre estaciones. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material
adecuado.
El diseo del impactador presenta cubetas de impacto extrables con todas las cubetas en un mismo plano (Figuras 1111c).
El impactador tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las cubetas de impacto, el cuerpo sellador que mantiene en su lugar los chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se muestran en las Figuras 1111b). Se
emplean mltiples toberas en todas las estaciones salvo en la primera (11c). El flujo pasa a travs del impactador siguiendo un
patrn en forma de dientes de sierra.
La medicin de la estacin se realiza peridicamente junto con la confirmacin de otras dimensiones crticas para el eficaz
funcionamiento del impactador. Las dimensiones crticas se proporcionan en la Tabla 9.
Tabla 9. Dimensiones Crticas para los Aparatos 5 y 6
Descripcin
Preseparador (ver la Dimensin a en la Figura 11d)
Estacin
1a
Dimetro de tobera
12,80 0,05
14,30 0,05
Estacin 2a Dimetro de tobera
4,88 0,04
2,185 0,02
1,207 0,01
0,608 0,01
Estacin 6aDimetro de tobera
0,323 0,01
Estacin 7aDimetro de tobera

MOCa
Profundidad de cubeta opcional (ver la Dimensin b en la Figura 11b)
a
b
Dimensiones
(mm)
0,206 0,01
Aproximadamente 0,070
14,625 0,10
Ver la Figura 11c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls).
Ver la Figura 11b.
El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation Pharmaceutical Impactor en MSP Corporation, Minneapolis, MN.
USP 38
Tabla 9. Dimensiones Crticas para los Aparatos 5 y 6 (Continuacin)

0,52 mm
Rugosidad de la superficie de la cubeta recolectora

Estacin 1Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin c)b
0 1,18
5,236 0,736
8,445 0,410
11,379 0,237
13,176 0,341
13,999 0,071
Estacin 7Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensin
c)b
Opcional: MOCDistancia de la tobera al cuerpo selladorb

a
b
14,000 0,071
14,429 14,571
Ver la Figura 11c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en ingls).
Ver la Figura 11b.
Figura 11. Aparato 5 (se muestra con el preseparador colocado en su lugar).
Captulos
En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se mantienen juntos entre s como un solo dispositivo. Se tiene
acceso a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una prueba de un producto. Las cubetas se mantienen
en una bandeja que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar simultneamente del impactador levantando la bandeja.
Un tubo de admisin con dimensiones internas idnticas a las que se definen en la Figura 6a se conecta a la entrada del
impactador. Cuando sea necesario, con los polvos para inhalacin, se puede agregar un preseparador para evitar sobrecargar
la primera estacin. El preseparador se conecta entre el tubo de admisin y el impactador. Se emplea un adaptador de boquilla adecuado para proporcionar un sellado hermtico entre la boquilla del producto y el tubo de admisin.
El aparato contiene un colector con microorificios (MOC) terminal que, para la mayora de las formulaciones, puede eliminar
la necesidad de un filtro final, segn se determine mediante la validacin del mtodo. El MOC es la placa de toberas y cubeta
de recoleccin del impactador. La placa de toberas contiene, nominalmente, 4032 orificios, cada uno con un dimetro de
aproximadamente 70 mm. La mayora de las partculas que no fueron capturadas en la Estacin 7 del impactador sern capturadas en la superficie de la cubeta que est debajo del MOC. Para formulaciones con una fraccin significativa de partculas no
capturadas por el MOC, hay un portafiltro opcional que puede reemplazar al MOC. Como alternativa se puede colocar un
filtro terminal (a menudo, la fibra de vidrio es adecuada) en un portafiltro externo al Aparato 5 y 6, que se ubica a continuacin del MOC.
Captulos
Figura 11a. Componentes del Aparato 5.
Figura 11b. Disposicin de los pasajes entre estaciones del Aparato 5.
Figura 11c. Configuracin de toberas del Aparato 5.
USP 38
USP 38
Figura 11d. Disposicin del preseparador para el Aparato 5.


Ajustar la vlvula de control de flujo para lograr un flujo estable a travs del sistema a la velocidad requerida, Qout (5%). Asegurar que se produzca flujo crtico en la vlvula de control de flujo mediante el Procedimiento descrito para el Aparato 2. Ajustar
el temporizador que controla la operacin de la vlvula solenoide de dos vas, de manera que abra la vlvula durante el mismo
lapso de tiempo, T, que el que se emple durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada.
Cebar o cargar el polvo para inhalacin conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vaco en
funcionamiento y la vlvula solenoide de dos vas cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisin. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la vlvula
solenoide de dos vas durante el lapso requerido, T (5%). Despus de que la vlvula solenoide de dos vas se haya cerrado,
retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalacin segn las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operacin
hasta que el nmero de dosis requerido haya sido descargado. Despus de descargar la ltima dosis, apagar la bomba de vaco.
Captulos
Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura 11d), a menos que se haya demostrado experimentalmente que su omisin
no da como resultado un incremento en la prdida de frmaco entre estaciones (>5%) o en el reingreso de partculas por
arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para
asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol,
aceite siliconado u otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a sta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de
forma que el sistema sea hermtico.
El preseparador puede prepararse del siguiente modo. Montar el inserto del preseparador en la base del preseparador; conectar la base del preseparador a la entrada del impactador; agregar hasta aproximadamente 15 mL del disolvente empleado
para la recuperacin de la muestra a la cubeta central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del preseparador encima
de este montaje; y cerrar las dos grampas sujetadoras. [PrecaucinAlgunos disolventes pueden producir mezclas de airevapor
inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a travs de la bomba de vaco. Tomar las precauciones correspondientes
(p.ej., disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos mnimos de operacin de la bomba, etc.) para garantizar la proteccin del operador durante la prueba.]
Conectar un tubo de admisin con dimensiones internas segn se definen en la Figura 6a a la entrada del impactador o a la
entrada del preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 11d). Colocar en posicin un adaptador de boquilla adecuado al final del tubo de admisin de manera que el extremo final de la boquilla del producto, cuando se inserta,
est alineado a lo largo del eje horizontal del tubo de admisin. La cara frontal de la boquilla del producto est a nivel con la
cara frontal del tubo de admisin, produciendo un sellado hermtico. Cuando se une al adaptador de boquilla, el producto
debe colocarse en la misma orientacin en la que est previsto que se use. Conectar el aparato al sistema de flujo conforme al
esquema especificado en la Figura 7.
A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de
Dosis Liberada, extrayendo 4,0 L de aire desde la boquilla del producto a travs del aparato. Conectar un caudalmetro al tubo
de admisin. Emplear un caudalmetro calibrado para medir el flujo volumtrico que sale del medidor o calcular el flujo volumtrico que sale del medidor (Qout) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor calibrado para el flujo volumtrico
de entrada (Qin), calcular:
USP 38
Desarmar el aparato y recuperar el frmaco a analizar de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisin y el adaptador de
boquilla del preseparador y extraer el frmaco en una alcuota de disolvente; si se hubiera empleado el preseparador, retirarlo
del impactador sin derramar el disolvente dentro de ste ltimo; y recuperar el ingrediente activo de todas las superficies internas. Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recoleccin y recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alcuota de disolvente. Empleando el mtodo de
anlisis especificado en la monografa individual, determinar la masa de frmaco contenida en cada alcuota de disolvente.
C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para InhalacinImpactador de Nueva Generacin

(sin preseparador)
El Aparato 6 es idntico al Aparato 5 (Figuras 1111d) excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este aparato a una
velocidad de flujo de 30 L/minuto (5%), a menos que se indique algo diferente en la monografa individual.
Captulos
Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una captura eficiente de partculas, recubrir la superficie de recoleccin de partculas de cada estacin con glicerol, aceite siliconado u
otro lquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente voltil, a menos que se haya demostrado que esto es
innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a sta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea
hermtico. Conectar a la entrada del impactador un tubo de admisin con las dimensiones internas que se definen en la Figura
6a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto est a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisin. Encender la bomba de vaco para extraer el aire a travs del impactador en cascada y calibrar el
flujo de aire a travs del sistema con un caudalmetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisin. Ajustar la
vlvula de control de flujo de la bomba de vaco para lograr un flujo constante a travs del sistema a la velocidad requerida, y
asegurarse de que el flujo de aire que recorre el sistema est dentro del 5% de esa velocidad de flujo. A menos que se indique
algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y accionar el disparador para
desechar una descarga. Con la bomba de vaco en funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador de boquilla e inmediatamente disparar para descargar la dosis mnima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la vlvula presionada
durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, agitar el producto, reinsertarlo en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para
descargar la siguiente dosis mnima recomendada.
Repetir hasta que se haya descargado el nmero de dosis requerido. El nmero de dosis mnimas recomendadas debe ser tal
que permita una determinacin exacta y precisa de la Distribucin de Tamao Aerodinmico. [NOTAUsualmente, el nmero de
dosis mnimas recomendadas no es >10.] Despus de que la ltima dosis haya sido descargada, retirar el producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisin con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues
cuantitativamente hasta un volumen apropiado.
Desarmar el aparato y recuperar el frmaco para su anlisis de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisin y el adaptador de boquilla del aparato y recuperar el frmaco depositado en una alcuota de disolvente; abrir el impactador liberando el
mecanismo de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recoleccin; y extraer el ingrediente activo de cada cubeta con una alcuota de disolvente. Empleando el mtodo de anlisis especificado en la monografa
individual, determinar la cantidad de ingrediente activo contenida en cada alcuota de disolvente.
602 PROPELENTES
PrecaucinLos propelentes que son hidrocarburos son extremadamente inflamables y explosivos. Tomar las precauciones necesarias y realizar el muestreo y las operaciones analticas bajo una campana de extraccin bien ventilada.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTREO

Este procedimiento se utiliza para obtener muestras de prueba de propelentes que son gases a aproximadamente 25 y que
se almacenan en cilindros presurizados. Emplear un cilindro para muestras de acero inoxidable equipado con una vlvula de
acero inoxidable con una capacidad de no menos de 200 mL que soporte 240 psi o una presin mayor. Secar el cilindro con la
vlvula abierta a 110 durante 2 horas y vaciar el cilindro caliente hasta menos de 1 mm de mercurio. Cerrar la vlvula, enfriar
y pesar. Conectar un extremo de una tubera de carga al envase del propelente ajustando bien y conectar sin ajustar el otro
Pruebas Fsicas / 602 Propelentes 443
USP 38
extremo al cilindro para muestras. Abrir con cuidado el envase del propelente y dejar que el propelente purgue la tubera de
carga y salga a travs de la conexin sin ajustar. Evitar una purga excesiva, ya que esto provoca la congelacin de humedad en
la tubera de carga y las conexiones. Ajustar la conexin del cilindro para muestras, abrir la vlvula del cilindro para muestras y
dejar que el propelente fluya hacia el interior del cilindro vaco. Continuar el muestreo hasta que se obtenga la cantidad deseada de muestra, luego cerrar la vlvula del envase del propelente y, finalmente, cerrar la vlvula del cilindro para muestras.
[PrecaucinNo sobrecargar el cilindro para muestras. La expansin hidrulica ocasionada por los cambios de temperatura puede
causar la explosin de un cilindro sobrecargado.] Pesar nuevamente el cilindro para muestras cargado y calcular el peso de la
muestra.
TEMPERATURA DE EBULLICIN APROXIMADA

Transferir una muestra de 100 mL a un tubo de centrfuga tarado en forma de pera de 100 mL que contenga algunas piedras de ebullicin y pesar. Suspender un termmetro en el lquido y colocar el tubo en un medio mantenido a una temperatura de 32 por encima de la temperatura de ebullicin esperada. Cuando la lectura del termmetro permanezca constante, registrar como temperatura de ebullicin la lectura del termmetro despus de que se haya destilado como mnimo el 5% de la
muestra. Conservar el resto de la muestra para la determinacin de residuos de alto punto de ebullicin.
RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIN, MTODO I
RESIDUOS DE ALTO PUNTO DE EBULLICIN, MTODO II

Preparar una serpentina de enfriamiento con una tubera de cobre (de aproximadamente 6 mm de dimetro exterior aproximadamente 6,1 m de largo) para que entre en un matraz con camisa al vaco. Sumergir la serpentina de enfriamiento en una
mezcla de hielo seco y acetona en el matraz con camisa al vaco y conectar un extremo de la tubera al cilindro para muestras
con propelente. Abrir cuidadosamente la vlvula del cilindro para muestras, purgar la serpentina de enfriamiento con aproximadamente 50 mL de propelente y desechar esta porcin de propelente licuado. Continuar descargando el propelente licuado
desde la serpentina de enfriamiento y recogerlo en un cono de sedimentacin de 1000 mL previamente enfriado hasta que el
cono se llene hasta la marca de 1000 mL. Dejar que el propelente se evapore, usando un bao de agua tibia mantenido a
aproximadamente 40 para reducir el tiempo de evaporacin. Cuando todo el lquido se haya evaporado, enjuagar el cono de
sedimentacin con dos porciones de 50 mL de pentano y combinar los enjuagues en una cpsula de evaporacin tarada de
150 mL. Transferir 100 mL de pentano a una segunda cpsula de evaporacin tarada de 150 mL, colocar ambas cpsulas de
evaporacin en un bao de agua; evaporar hasta sequedad y calentar las cpsulas en una estufa a 100 durante 60 minutos.
Enfriar las cpsulas en un desecador y pesar. Repetir el calentamiento durante periodos de 15 minutos hasta que la variacin
de peso entre pesadas sucesivas no sea ms de 0,1 mg y calcular el peso del residuo obtenido a partir del propelente como la
diferencia entre los pesos de los residuos en las dos cpsulas de evaporacin.
CONTENIDO DE AGUA
Proceder segn se indica en el captulo Determinacin de Agua 921, con las siguientes modificaciones: (a) Utilizar un recipiente de sistema cerrado para volumetra con una abertura a travs de la cual pasa un tubo de dispersin de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestreo. (b) Diluir el Reactivo con metanol anhidro hasta obtener un factor de equivalencia de agua de entre 0,2 y 1,0 mg/mL, y dejar reposar esta solucin diluida durante no menos de 16 horas antes de la
estandarizacin. (c) Obtener una muestra de 100 g segn se indica en Procedimiento General de Muestreo e introducir la muestra en el vaso de valoracin a travs del tubo de dispersin de gases a una velocidad de aproximadamente 100 mL de gas por
minuto. Si fuera necesario, calentar suavemente el cilindro para muestras para mantener esta velocidad de flujo.
OTRAS DETERMINACIONES
Para los aerosoles que utilizan propelentes, realizar las pruebas que se especifican en las monografas individuales de propelentes del NF.
Captulos
Dejar que destilen 85 mL de la muestra segn se indica en la prueba para Temperatura de Ebullicin Aproximada y transferir el
tubo de centrfuga que contiene los 15 mL remanentes de la muestra a un medio mantenido a una temperatura de 10 por
encima de la temperatura de ebullicin. Despus de 30 minutos, retirar el tubo del bao de agua, secarlo con material absorbente y pesar. Calcular el peso del residuo.
444 603 Aerosoles Tpicos / Pruebas Fsicas
USP 38
603 AEROSOLES TPICOS

INTRODUCCIN
Los aerosoles tpicos contienen frmacos en solucin o en suspensin, envasados a presin, que se liberan al activar un sistema de vlvulas apropiado. Los aerosoles tpicos deben seguir los requisitos de las pruebas de calidad descritos en los captulos
de pruebas generales Medicamentos Nasales y para InhalacinInformacin General y Pruebas de Calidad del Producto 5, Pruebas de Recuento Microbiano 61, Pruebas de Microorganismos Especficos 62, Llenado Mnimo 755 y Velocidad de Fuga 604.
Los aerosoles tpicos incluyen espumas y atomizadores dermatolgicos. Las espumas de los aerosoles tpicos deben incluir la
apariencia fsica de la espuma y de la espuma colapsada.
Captulos
VELOCIDAD DE DESCARGA Y CANTIDAD DESCARGADA

Realizar estas pruebas exclusivamente en envases equipados con vlvulas de descarga continua.
Velocidad de Descarga: Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, agitar si la etiqueta incluye esta instruccin,
retirar las tapas y las cubiertas, y accionar cada vlvula durante 23 segundos. Pesar cada envase con exactitud y sumergir en
un bao de temperatura constante hasta que la presin interna se equilibre a una temperatura de 25, determinada por la
constancia de la presin interna, segn se indica ms adelante en Prueba de Presin. Retirar los envases del bao, eliminar el
exceso de humedad secando con una toalla de papel, agitar, si la etiqueta incluye esta instruccin, accionar cada vlvula durante 5,0 segundos (medidos con exactitud, empleando un cronmetro) y pesar nuevamente cada envase. Devolver los envases al bao de temperatura constante y repetir el procedimiento previo tres veces ms para cada envase. Calcular el promedio
de Velocidad de Descarga, en g/s, para cada envase.
Cantidad Descargada: Devolver los envases al bao de temperatura constante, continuar descargando en accionamientos de 5 segundos hasta vaciar los envases. [NOTAAsegurar que pase suficiente tiempo entre los accionamientos para evitar
un enfriamiento significativo del envase.] Calcular la prdida total de peso de cada envase. sta es la Cantidad Descargada.
PRUEBA DE PRESIN
Realizar esta prueba slo en aerosoles tpicos equipados con vlvulas de descarga continua.
Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, retirar las tapas y las cubiertas, y sumergir en un bao de temperatura
constante hasta que la presin interna sea constante a una temperatura de 25. Retirar los envases del bao, agitar y retirar el
disparador y el agua, si la hubiera, del vstago de la vlvula. Colocar cada envase en posicin vertical y determinar la presin
en cada envase colocando un manmetro calibrado sobre el vstago de la vlvula, sostenindolo con firmeza y accionando la
vlvula de manera que quede completamente abierta. El manmetro se calibra para presiones aproximadas a las esperadas y
est equipado con un adaptador apropiado para las dimensiones particulares del vstago de la vlvula. Leer la presin directamente del manmetro.
LLENADO MNIMO
Los aerosoles tpicos cumplen con los requisitos para aerosoles que figuran en Llenado Mnimo 755.
PRUEBA DE FUGA
Proceder segn se indica en Velocidad de Fuga 604.
NMERO TOTAL DE DESCARGAS POR ENVASE

Realizar esta prueba slo en aerosoles tpicos equipados con vlvulas dosificadoras, simultneamente con la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada y en los mismos envases utilizados en dicha prueba. Determinar el nmero total de descargas o
entregas contando el nmero de descargas para cebado ms las usadas para determinar el contenido del roco y continuar
accionando el disparador hasta completar el nmero de descargas declarado en la etiqueta. Los requisitos se cumplen si todos
los envases o inhaladores analizados contienen un nmero de descargas que no sea menor al declarado en la etiqueta.
UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles tpicos equipados con vlvulas dosificadoras. Para recoger la dosis mnima, proceder segn se indica en la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Inhaladores de Dosis Fija e
Inhaladores de Polvo Seco, segn se describe en el captulo 601, excepto que se debe modificar el aparato de muestreo de
USP 38
Pruebas Fsicas / 610 Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos 445
dosis de manera que sea capaz de capturar cuantitativamente la dosis descargada de la preparacin que se est analizando. A
menos que se indique algo diferente en la monografa individual, aplicar los criterios de aceptacin para Inhaladores de Dosis
Fija e Inhaladores de Polvo Seco segn se describe en el captulo 601.
604 VELOCIDAD DE FUGA
610 MTODOS DE MUESTREO MICROBIOLGICO ALTERNATIVOS

PARA PRODUCTOS NASALES E INHALADORES NO ESTRILES
INTRODUCCIN
El muestreo apropiado de productos no estriles susceptibles a la contaminacin microbiana puede ser complicado, debido
a que estos productos a menudo se llenan en envases primarios especiales, diseados para proteger al producto de la contaminacin inadvertida durante su almacenamiento y uso. Estos diseos especiales pueden hacer ms difcil la toma de muestras
aspticas de tamao o volumen suficientes para el anlisis microbiolgico. A menos que se utilicen metodologas especiales,
puede resultar difcil realizar el muestreo de productos tales como formas farmacuticas en polvo, lquidos nasales o para inhalacin, sin exponerlos potencialmente a contaminacin microbiana extraa. El presente captulo de pruebas generales proporciona tales metodologas especiales para el muestreo de formas farmacuticas para inhalacin o nasales de alto y bajo contenido. Las metodologas de muestreo alternativas pueden ofrecer mejores maneras para muestrear envases de forma asptica. Toda metodologa alternativa debe utilizar tcnicas aspticas y se debe llevar a cabo en condiciones ambientales y de otro tipo,
apropiadas para el muestreo asptico.
FORMAS FARMACUTICAS PARA INHALACIN Y NASALES

Los productos farmacuticos nasales e inhaladores de bajo contenido (en lo sucesivo, PFNI de bajo contenido) son productos que presentan un llenado esperado de menos de 100 mg de polvo o 1 mL de formulacin lquida por unidad (envase
Captulos
Seleccionar 12 envases de aerosol y registrar la fecha y la hora con una aproximacin de media hora. Pesar cada envase con
una aproximacin de 1 mg y registrar el peso de cada uno, en mg, como W1. Dejar en reposo los envases en posicin vertical
a una temperatura de 25,0 2,0 durante no menos de 3 das, y pesar nuevamente cada envase, registrar el peso de cada
uno, en mg, como W2 y registrar la fecha y la hora con una aproximacin de media hora. Determinar el tiempo, T, en horas,
durante el que se analizaron los envases. Calcular la velocidad de fuga, en mg por ao, de cada envase tomado, por la frmula: (365)(24/T)(W1 W2).
Cuando se analizan envases de aerosol de vidrio recubiertos de plstico, secar los envases en un desecador durante 1218
horas y dejarlos en reposo en una atmsfera de humedad constante durante 24 horas antes de determinar el peso inicial segn
se indic anteriormente. Realizar la prueba bajo las mismas condiciones de humedad constante. Vaciar el contenido de cada
envase analizado empleando una tcnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presin interna, retirar la vlvula y verter).
Retirar el contenido residual enjuagando con disolventes adecuados y luego enjuagar con algunas porciones de metanol. Mantener el envase, la vlvula y todas las partes relacionadas como una unidad, y calentar todo junto a 100 durante 5 minutos.
Enfriar, pesar, registrar el peso como W3 y determinar el peso neto de llenado (W1 W3) para cada envase analizado. [NOTASi
el peso neto de llenado promedio se ha determinado previamente, dicho valor puede emplearse en lugar del valor (W1 W3)
mencionado anteriormente.] Los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio por ao para los 12 envases no es
ms de 3,5% del peso neto de llenado, y ninguno de los envases tiene fugas de ms de 5,0% del peso neto de llenado por
ao. Si 1 envase tiene fugas de ms de 5,0% por ao y si ninguno de los envases tiene fugas de ms de 7,0% por ao, determinar la velocidad de fuga para 24 envases adicionales, segn se indica en esta prueba. No ms de 2 de los 36 envases tienen
fugas de ms de 5,0% del peso neto de llenado por ao y ninguno de los 36 envases tiene fugas de ms de 7,0% del peso
neto de llenado por ao. Cuando el peso neto de llenado es menos de 15 g y la etiqueta contiene una fecha de caducidad, los
requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio de los 12 envases no es mayor de 525 mg por ao y ninguno de los
envases tiene fugas mayores de 750 mg por ao. Si 1 envase tiene fugas de ms de 750 mg por ao pero de no ms de 1,1 g
por ao, determinar la velocidad de fuga sobre 24 envases adicionales, segn se indica en esta prueba. No ms de 2 de los 36
envases tiene fugas mayores de 750 mg por ao y ninguno de los 36 envases tiene fugas mayores de 1,1 g por ao. Esta
prueba es adicional a la prueba de fuga habitual que se realiza en lnea a cada envase.
446 610 Mtodos de Muestreo Microbiolgico Alternativos / Pruebas Fsicas
USP 38
primario). Ejemplos de estos productos incluyen polvos para inhalacin previamente medidos, ms comnmente conocidos
como inhaladores de polvo seco, y atomizadores nasales monodosis.
Los PFNI de alto contenido son productos farmacuticos multidosis que presentan un llenado esperado de ms de 100 mg
de polvo o ms de 1 mL de formulacin liquida por unidad. Ejemplos de estos productos incluyen aerosoles para administracin por inhalacin y va nasal, conocidos como inhaladores de dosis fija; polvos para inhalacin con dosis medidas para dispositivos; y aerosoles nasales multidosis.
La cantidad o volumen apropiado de muestra debe basarse en la metodologa de prueba, incluido cualquier captulo de
pruebas generales pertinente, como los captulos 61 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano y 62 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos. El anlisis se puede llevar
a cabo en el polvo seco a granel sin envasar, en la formulacin lquida o en el producto terminado. Si el anlisis se realiza slo
en el material a granel, entonces se debe validar la capacidad del proceso para prevenir la contaminacin microbiana desde el
lote a granel hasta el producto terminado. El anlisis se debe llevar a cabo en el producto terminado cuando el proceso no est
validado.
DETERMINACIN DEL TAMAO DE LA MUESTRA
Captulos
Para cada prueba microbiolgica, muestrear 10 envases o unidades del producto farmacutico o un nmero de unidades
que sea representativo de la partida y que pueda proporcionar como mnimo 1 gramo de producto. Para tamaos de partida
menores de 200 unidades (p.ej., partidas usadas en ensayos clnicos), el tamao de la muestra se puede reducir al 1% de las
unidades o a 1 unidad, lo que resulte mayor. Se puede combinar el contenido de envases individuales para el anlisis.
ANLISIS DEL GRANEL PARA PFNI DE BAJO CONTENIDO

Es preferible el anlisis de lote a granel para PFNI de bajo contenido en lugar del anlisis del producto terminado, debido a
que permite tomar muestras de mayores tamaos que son representativas de la partida, sin incrementar indebidamente el riesgo de contaminacin microbiana inadvertida. El anlisis del granel se puede llevar a cabo en polvos o en preparaciones lquidas justo antes del llenado. Cuando se realiza el anlisis del granel en lugar del anlisis del producto terminado, se debe validar
la capacidad de los procesos de fabricacin posteriores al muestreo (p.ej., llenado y envasado) para prevenir contaminacin
microbiana de conformidad con las buenas prcticas de fabricacin vigentes (CGMP). Para pruebas de recuento microbiano,
se pueden muestrear al menos 10 g o 10 mL de material a granel o, para las pruebas de microorganismos especficos, se puede muestrear 1 g o 1 mL de material de prueba. Para tamaos pequeos de partida (es decir, menos de 1000 g o 1000 mL), el
tamao de muestra recomendado es 1% de la partida para las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos especficos.
MTODOS DE MUESTREO PARA PFNI DE ALTO CONTENIDO

Inhaladores de Polvo Seco
Los inhaladores de polvo seco tienen un reservorio interno que contiene una cantidad suficiente de formulacin para dosis
mltiples que son dosificadas por el dispositivo durante la activacin por parte del paciente. En estos casos, se deben emplear
procedimientos validados apropiados para muestrear un envase de producto farmacutico no estril.
Aerosoles para Inhalacin

Tomar en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con la inhalacin del producto farmacutico y el posible peligro
de inflamacin. Evitar la contaminacin de las muestras usando tcnicas aspticas siempre que sea necesario.
MTODO DE ACCIONAMIENTO AUTOMTICO
El contenido de los envases de los aerosoles para inhalacin se puede recolectar accionando automticamente cada envase
de aerosol y recolectando la formulacin liberada en un filtro estril adecuado.
MTODO A TEMPERATURA AMBIENTE
Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en
un ambiente controlado. Vaciar el contenido del envase de aerosol en un vaso estril usando un dispositivo con aguja u otro
dispositivo similar (p.ej., el conducto de ingreso de agua de una mquina para hacer hielo). Si se ha demostrado que el propelente no inhibe el crecimiento de microorganismos, se puede agregar el contenido del vaso estril directamente a los medios
lquidos o a las soluciones amortiguadoras para la prueba. De otro modo, esperar a que el propelente se evapore del vaso,
dejando el vaso a temperatura ambiente durante varios minutos. Eliminar el propelente gaseoso residual inclinando ligeramen-
USP 38
Pruebas Fsicas / 611 Determinacin de Alcohol 447
te el vaso o permitiendo el paso de una corriente lenta de gas estril microbiolgicamente inerte sobre la superficie del mismo.
En el caso de algunos propelentes menos voltiles, por ejemplo, combinaciones de clorofluorocarbono (CFC) 11/12, se puede
calentar el vaso suavemente (a temperatura 45) para ayudar a la evaporacin. Una vez evaporado el propelente, agregar los
medios lquidos o las soluciones amortiguadoras y mezclar el contenido para preparar para el anlisis.
La expulsin directa en los caldos de cultivo o las soluciones amortiguadoras puede ser factible siempre que se cuente con
un dispositivo con aguja que sea lo suficientemente fino y fuerte como para perforar el envase y permitir que el contenido
salga lentamente. En este caso, el contenido puede ser expulsado y mezclado en el medio acuoso. Existe la posibilidad de que
se formen capas de propelente y de medio acuoso, lo cual puede requerir un mayor periodo de espera y calentamiento suave
(que no exceda de 45) para evaporar el propelente.
MTODO CON ENFRIAMIENTO
Atomizadores Nasales Multidosis

Los envases de atomizadores nasales multidosis a menudo tienen una tapa de rosca, precintada, o de anclaje hermtico. El
envase se puede abrir desenroscando la tapa, cortando el sello o usando una herramienta para retirar el precinto, con cuidado
de evitar la contaminacin microbiana durante el proceso. Despus de retirar la tapa, por lo general resulta apropiado el uso
de los mtodos de muestreo tradicionales, como los descritos en los captulos de pruebas generales 61 Examen Microbiolgico
de Productos No Estriles: Pruebas de Recuento Microbiano y 62 Examen Microbiolgico de Productos No Estriles: Pruebas de Microorganismos Especficos.
611 DETERMINACIN DE ALCOHOL

MTODO IMTODO DE DESTILACIN
El mtodo I se utiliza para la determinacin de alcohol a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Es adecuado para examinar la mayora de los extractos lquidos y las tinturas, siempre que la capacidad del matraz de
destilacin sea suficiente (normalmente de dos a cuatro veces el volumen del lquido a calentar) y la velocidad de destilacin
sea la necesaria para producir destilados transparentes. Los destilados turbios pueden clarificarse mediante agitacin con talco
o con carbonato de calcio y filtracin, despus de lo cual la temperatura del filtrado se ajusta y el contenido de alcohol se
determina a partir del peso especfico. Durante todas las manipulaciones, tomar precauciones para minimizar la prdida de
alcohol por evaporacin.
Tratar los lquidos que forman una cantidad inconveniente de espuma durante la destilacin acidificndolos fuertemente con
cidos fosfrico, sulfrico o tnico, o tratarlos con un leve exceso de solucin de cloruro de calcio o con una pequea cantidad
de parafina o aceite de silicona antes de comenzar la destilacin.
Evitar las proyecciones durante la destilacin agregando trozos de material poroso insoluble, como carburo de silicio, o perlas.
Para Lquidos que se Supone que Contienen 30% de Alcohol o MenosCon una pipeta, transferir a un aparato de destilacin adecuado no menos de 25 mL del lquido en el que se debe determinar el contenido de alcohol y observar la temperatura a la que se midi el volumen. Agregar un volumen igual de agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea
aproximadamente 2 mL menor que el volumen tomado de lquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se
midi el lquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el volumen original del lquido de prueba y mezclar. El destilado es transparente o no ms que levemente turbio y no contiene ms que trazas de sustancias voltiles,
Captulos
Colocar los envases de aerosol desinfectados en hielo seco o en una suspensin espesa de hielo seco (garantizar la calidad
microbiana del hielo seco y del lquido para formar la suspensin espesa), o en un criocongelador durante el periodo necesario
para licuar el contenido. Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los
envases se sequen en un ambiente asptico. Abrir aspticamente los envases de aerosol usando una herramienta apropiada. Se
debe tener en cuenta que la congelacin puede afectar la viabilidad de los microorganismos. Para productos basados en CFC,
verter el contenido de los envases en vasos estriles. Dejar que escape el propelente y combinar el residuo con un diluyente
adecuado para el producto farmacutico. Tambin se pueden emplear otros procedimientos especficos para el frmaco. Para
productos basados en hidrofluoroalcanos, verter el contenido de los envases en vasos estriles parcialmente sumergidos en vasos ms grandes que contengan hielo seco. Expulsar el propelente, por ejemplo, evaporando el material hasta sequedad con
una corriente lenta de aire comprimido estril, filtrado y libre de aceite. Combinar el residuo con un diluyente apropiado para
el producto farmacutico. Un mtodo alternativo para analizar todo el contenido de un envase previamente enfriado consiste
en verter el contenido del envase abierto en una unidad de filtracin por membrana estril, dejar que escape el propelente y
luego enjuagar con una cantidad adecuada de diluyente estril.
Captulos
448 611 Determinacin de Alcohol / Pruebas Fsicas
USP 38
adems de alcohol y agua. Determinar el peso especfico del lquido a 25, segn se indica en Peso Especfico 841, y usar este
resultado para establecer el porcentaje, en volumen, de C2H5OH contenido en el lquido examinado por referencia a la Tabla
Alcoholimtrica en la seccin Tablas de Referencia.
Para Lquidos que se Supone que Contienen Ms de 30% de AlcoholProceder segn se indica en el prrafo anterior,
excepto que se debe hacer lo siguiente: diluir la muestra con aproximadamente el doble de su volumen en agua, recoger un
volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el doble del volumen del lquido de prueba original, ajustar
a la temperatura a la cual se midi el lquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el doble del
volumen original del lquido de prueba, mezclar y determinar el peso especfico. La proporcin de C2H5OH, en volumen, en
este destilado, segn se determina a partir de su peso especfico, equivale a la mitad del C2H5OH contenido en el lquido examinado.
Tratamiento Especial
CIDOS Y BASES VOLTILESAcidificar levemente las preparaciones que contengan bases voltiles con cido sulfrico diluido
antes de destilar. Si hay cidos voltiles presentes, alcalinizar levemente la preparacin con hidrxido de sodio SR.
GLICERINAA los lquidos que contengan glicerina, agregar suficiente agua para que el residuo, despus de la destilacin,
contenga no menos de 50% de agua.
YODOAntes de la destilacin, tratar todas las soluciones que contengan yodo libre con cinc en polvo o decolorar con una
cantidad apenas suficiente de solucin de tiosulfato de sodio (1 en 10), seguida de algunas gotas de hidrxido de sodio SR.
OTRAS SUSTANCIAS VOLTILESLos alcoholados, elxires, tinturas y preparaciones similares que contienen proporciones apreciables de sustancias voltiles, adems de alcohol y agua, tales como aceites voltiles, cloroformo, ter, alcanfor, etc., requieren
tratamiento especial, como se describe a continuacin:
Para Lquidos que se Supone que Contienen 50% de Alcohol o MenosMezclar en un separador 25 mL de la muestra en anlisis, medidos con exactitud, con aproximadamente el mismo volumen de agua. Saturar esta mezcla con cloruro de sodio, luego
agregar 25 mL de ter de petrleo y agitar la mezcla para extraer los ingredientes voltiles que interfieran. Transferir la capa
separada inferior a un segundo separador y repetir la extraccin dos veces con dos porciones ms de 25 mL de ter de petrleo. Extraer las soluciones combinadas de ter de petrleo con tres porciones de 10 mL de una solucin saturada de cloruro de
sodio. Combinar las soluciones salinas y destilar de la manera habitual, recogiendo un volumen de destilado que presente un
cociente simple en relacin al volumen de la muestra original.
Para Lquidos que se Supone que Contienen Ms de 50% de AlcoholAjustar la muestra en anlisis a una concentracin de
aproximadamente 25% de alcohol diluyendo con agua y luego proceder segn se indica en Para Lquidos que se Supone que
Contienen 50% de Alcohol o Menos, comenzando donde dice Saturar esta mezcla con cloruro de sodio.
En la preparacin de Colodin o Colodin Flexible para destilacin, usar agua en lugar de la solucin saturada de cloruro de
sodio que se indica anteriormente.
Si hay aceites voltiles presentes slo en pequeas proporciones y se obtiene un destilado turbio, y no se ha empleado el
tratamiento con ter de petrleo, se puede clarificar el destilado y adecuarlo para la determinacin de peso especfico agitndolo con aproximadamente un quinto de su volumen de ter de petrleo o filtrndolo a travs de una capa fina de talco.
MTODO IIMTODO DE CROMATOGRAFA DE GASES

Usar el Mtodo IIa cuando el Mtodo II se especifica en la monografa individual. Para obtener un anlisis de los principios en
los que se basa, ver Cromatografa de Gases en Cromatografa 621.
Estndares de referencia USPER Determinacin de AlcoholAcetonitrilo USP. ER Determinacin de AlcoholAlcohol USP.
Mtodo IIa
AparatoEn condiciones tpicas, usar un cromatgrafo de gases equipado con un detector de ionizacin a la llama y una
columna cromatogrfica de vidrio de 4 mm 1,8 m rellena con soporte S3 de malla 100 a 120, usando nitrgeno o helio
como gas transportador. Antes de usar, acondicionar la columna durante la noche a 235 con un flujo lento de gas transportador. Mantener la temperatura de la columna a 120 y la temperatura del inyector y el detector a 210. Ajustar el flujo del gas
transportador y la temperatura de modo que el acetonitrilo, el estndar interno, eluya entre 5 y 10 minutos.
Soluciones
Preparacin Madre de PruebaDiluir la muestra en anlisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solucin que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparacin de PruebaPipetear 5 mL de la Preparacin Madre de Prueba y de ER Determinacin de AlcoholAcetonitrilo
USP [NOTAAlternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solucin de
estndar interno], transferir a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin EstndarPipetear 5 mL de ER Determinacin de AlcoholAlcohol USP y de ER Determinacin de Alcohol
Acetonitrilo USP [NOTAAlternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solucin de estndar interno], transferir a un matraz volumtrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
ProcedimientoInyectar por duplicado en el cromatgrafo de gases aproximadamente 5 mL de la Preparacin de Prueba y
de la Preparacin estndar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes entre las respuestas de los picos. Calcular el
porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en anlisis, por la frmula:
USP 38
Pruebas Fsicas / 616 Densidad Aparente y por Asentamiento 449

CD(RU/RS)
en donde C es la concentracin declarada de ER Determinacin de AlcoholAlcohol USP; D es el factor de dilucin (cociente

entre el volumen de la Preparacin Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y RU y RS son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del SistemaEn un cromatograma adecuado, el factor de resolucin, R, no es menor de 2; el factor de
asimetra del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparacin Estndar presentan una desviacin estndar relativa de no ms de 2,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estndar interno.
Mtodo IIb
CD(RU/RS)
en donde C es la concentracin declarada de ER Determinacin de AlcoholAlcohol USP; D es el factor de dilucin (cociente
entre el volumen de la Preparacin Madre de Prueba y el volumen de muestra tomado); y RU y RS son los cocientes de respuesta
entre los picos obtenidos a partir de la Preparacin de Prueba y de la Preparacin Estndar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del SistemaEn un cromatograma adecuado, el factor de resolucin, R, entre alcohol y el estndar
interno no es menor de 4; el factor de asimetra del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la
Preparacin Estndar presentan una desviacin estndar de no ms de 4,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del
estndar interno.
616 DENSIDAD APARENTE Y DENSIDAD POR ASENTAMIENTO DE

LOS POLVOS
DENSIDAD APARENTE
Este captulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. La porcin que no est armonizada se marca con los smbolos () para especificar este hecho.
La densidad aparente de un polvo es la relacin de la masa de una muestra de polvo sin asentar y su volumen, incluida la
contribucin del volumen del espacio vaco entre las partculas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la
densidad de las partculas de polvo como de la distribucin espacial de las partculas en el lecho de polvo. La densidad aparente se expresa en gramos por mL (g/mL) aunque la unidad internacional es el kilogramo por metro cbico (1 g/mL =
1000 kg/m3) porque las mediciones se hacen usando probetas. Tambin se puede expresar en gramos por centmetro cbico
(g/cm3). Las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo dependen de la preparacin, el tratamiento y el
almacenamiento de la muestra, es decir la forma en que se manipul. Las partculas se pueden compactar para que tengan un
intervalo variable de densidades aparentes; sin embargo, la ms ligera perturbacin del lecho de polvo puede producir un
cambio en la densidad aparente. Por lo tanto, a menudo es muy difcil medir la densidad aparente de un polvo con buena
reproducibilidad y, al informar los resultados, es fundamental especificar cmo se hizo la determinacin. La densidad aparente
de un polvo se determina midiendo el volumen de una muestra de polvo de peso conocido, que puede haber sido pasada a
Captulos
AparatoEquipar un cromatgrafo de gases con un inyector partido con una relacin de particin de 5 : 1, un detector de
ionizacin a la llama y una columna capilar de 0,53 mm 30 m recubierta con una pelcula de 3,0 mm de fase G43. Usar helio
como gas transportador a una velocidad de flujo de 34,0 cm por segundo. Programar el cromatgrafo para mantener la temperatura de la columna a 50 durante 5 minutos, luego aumentar la temperatura a una velocidad de 10 por minuto hasta
200, y mantener a esa temperatura durante 4 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 210 y la del detector a 280.
Soluciones
Preparacin Madre de PruebaDiluir la muestra en anlisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solucin que
contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparacin de PruebaPipetear 5 mL de la Preparacin Madre de Prueba y de ER Determinacin de AlcoholAcetonitrilo
USP [NOTAAlternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como solucin de
estndar interno], y transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparacin EstndarPipetear 5 mL de ER Determinacin de AlcoholAlcohol USP y de ER Determinacin de Alcohol
Acetonitrilo USP [NOTAAlternativamente, se puede usar una solucin acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solucin de estndar interno], y transferir a un matraz volumtrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
ProcedimientoInyectar por duplicado en el cromatgrafo de gases aproximadamente de 0,2 a 0,5 mL de la Preparacin
de Prueba y de la Preparacin Estndar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes de respuesta de los picos. Calcular el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en anlisis, por la frmula:
450 616 Densidad Aparente y por Asentamiento / Pruebas Fsicas
USP 38
travs de un tamiz, en una probeta graduada (Mtodo I) o midiendo la masa de un volumen conocido de polvo que haya sido
pasado a travs de un volmetro a un vaso (Mtodo II) o un recipiente de medidas (Mtodo III).
Se prefieren el Mtodo I y el Mtodo III.
Mtodo IMedicin en una Probeta Graduada
Captulos
ProcedimientoPasar una cantidad de material suficiente para completar la prueba a travs de un tamiz con aperturas
mayores o iguales a 1,0 mm, de ser necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento; esto se debe hacer cuidadosamente para evitar cambios en la naturaleza del material. Introducir sin compactar
aproximadamente 100 g de la muestra de prueba, M, pesada con una exactitud de 0,1%, en una probeta graduada, seca, de
250 mL (legible hasta 2 mL). Si fuera necesario, nivelar cuidadosamente el polvo, sin compactarlo, y tomar la lectura del volumen aparente sin asentar (V0) con una aproximacin a la unidad ms cercana de la escala. Calcular la densidad aparente en
g/mL por la frmula M/V0. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Si la densidad del polvo es demasiado baja o demasiado alta, de tal forma que la muestra de prueba tenga un volumen aparente sin
asentamiento de ms de 250 mL o menos de 150 mL, no es posible usar una muestra de polvo de 100 g. Por lo tanto, se debe
seleccionar una cantidad diferente de polvo como muestra de prueba, de manera que su volumen aparente sin asentamiento
sea de 150 a 250 mL (volumen aparente mayor o igual a 60% del volumen total de la probeta); el peso de la muestra de
prueba se especifica en la expresin de los resultados. Para muestras de prueba que tengan un volumen aparente entre 50 y
100 mL, se puede usar una probeta de 100 mL, legible hasta 1 mL; el volumen de la probeta se especifica en la expresin de
los resultados.
Mtodo IIMedicin en un Volmetro

AparatoEl aparato (Figura 1) consta de un embudo superior provisto de un tamiz de 1,0 mm.1 El embudo est montado
sobre una caja deflectora que contiene cuatro placas deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a medida
que pasa. El embudo que se encuentra en el fondo de la caja deflectora recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad
especificada colocado directamente debajo del embudo. El vaso puede ser cilndrico (con una capacidad de 25,00 0,05 mL y
con un dimetro interno de 30,00 2,00 mm) o cbico (con una capacidad de 16,39 0,2 mL cuyas dimensiones internas
son de 25,400 0,076 mm).
Figura 1.
ProcedimientoDejar que un exceso de polvo fluya a travs del aparato y recogerlo en el vaso colector de la muestra hasta que ste se desborde, usando al menos 25 cm3 de polvo con el vaso cbico y 35 cm3 de polvo con el vaso cilndrico. Quitar
cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del vaso pasando suavemente el filo de la hoja de una esptula ubicada en direccin perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del vaso, tomando las precauciones necesarias
para que la esptula est siempre perpendicular y as evitar la compactacin o la remocin del polvo del vaso. Limpiar el material que hubiera podido quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso del polvo, M, con una aproximacin de 0,1%. Calcular la densidad aparente, en g/mL, por la frmula:
(M)/(V0)
El aparato (Volmetro de Scott) se ajusta a las dimensiones que aparecen en ASTM 329 90.
USP 38
Pruebas Fsicas / 616 Densidad Aparente y por Asentamiento 451
en donde V0 es el volumen del vaso, en mL. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo diferentes.
Mtodo IIIMedicin en un Recipiente

AparatoEl aparato consta de un recipiente cilndrico de acero inoxidable de 100 mL, con las dimensiones que se especifican en la Figura 2.
Figura 2.
DENSIDAD POR ASENTAMIENTO

La densidad por asentamiento es una densidad aparente aumentada, obtenida despus de golpetear mecnicamente un recipiente que contiene la muestra de polvo. La densidad por asentamiento se obtiene golpeteando mecnicamente una probeta o un recipiente de medicin graduado que contenga una muestra de polvo. Despus de determinar el volumen o peso inicial del polvo, se golpetea mecnicamente la probeta o recipiente de medicin y se toman las lecturas de volumen o peso
hasta que sean prcticamente constantes. El asentamiento mecnico se obtiene levantando la probeta o recipiente y dejndolo
caer por su propio peso desde una altura especificada, por alguno de los tres mtodos que se describen a continuacin. Puede
ser preferible emplear dispositivos que rotan la probeta o recipiente durante el golpeteo a fin de reducir al mnimo la posibilidad de que la masa se separe durante el asentamiento.
Mtodo I
AparatoEl aparato (Figura 3) consta de lo siguiente:
Una probeta graduada de 250 mL (legible hasta 2 mL, con una masa de 220 44 g)
Un aparato de asentamiento capaz de producir, en 1 minuto, nominalmente, 250 15 golpes desde una altura de 3 0,2
mm o, nominalmente, 300 15 golpes desde una altura de 14 2 mm. El soporte de la probeta graduada, con su dispositivo de fijacin, tiene una masa de 450 10 g.
Captulos
ProcedimientoPasar una cantidad de polvo suficiente para completar la prueba a travs de un tamiz de 1,0 mm, si fuera
necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento y permitir que la muestra
obtenida fluya libremente hacia el recipiente de medicin hasta que se desborde. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo
de la parte superior del recipiente como se describi para el Mtodo II. Determinar el peso (M0) del polvo con una aproximacin de 0,1%, restando la masa, previamente determinada, del recipiente de medicin vaco. Calcular la densidad aparente
(g/mL) por la frmula M0/100 y registrar el promedio de tres determinaciones, usando tres muestras de polvo diferentes.
USP 38
Captulos
452 616 Densidad Aparente y por Asentamiento / Pruebas Fsicas
Figura 3.
ProcedimientoProceder segn se describi anteriormente para la determinacin del volumen aparente (V0). Fijar la probeta en el soporte. Realizar 10, 500 y 1250 golpes en la misma muestra de polvo y leer los volmenes correspondientes V10,
V500 y V1250 con una aproximacin a la unidad ms cercana de la escala. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 2
mL, V1250 es el volumen por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 2 mL, repetir en incrementos, por ej., de
1250 golpes, hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 2 mL. Para algunos polvos, puede ser
apropiado un nmero menor de golpes, si se ha validado. Calcular la densidad por asentamiento (g/mL), usando la frmula
m/VF en donde VF es el volumen final por asentamiento. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Especificar la altura de cada con los resultados. Si no es posible utilizar una muestra de prueba de 100 g,
usar una cantidad reducida y una probeta graduada apropiada de 100 mL (legible hasta 1 mL) que pese 130 16 g y est
montada en un soporte que pese 240 12 g. Las condiciones de la prueba modificada se especifican en la expresin de los
resultados.
Mtodo II
Aparato y ProcedimientoProceder segn se indic en Mtodo I, excepto que el analizador mecnico proporciona una
cada fija de 3 0,2 mm a una velocidad nominal de 250 golpes por minuto.
Mtodo III
Aparato y ProcedimientoProceder segn se indic en el Mtodo IIIMedicin en un Recipiente para medir la densidad
aparente en un recipiente de medicin equipado con la tapa que se muestra en la Figura 2. El recipiente de medicin con la
tapa se levanta 5060 veces por minuto mediante un aparato medidor de densidad por asentamiento adecuado. Efectuar
200 golpes, retirar la tapa y quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente de medicin segn se
describe en el Mtodo IIIMedicin en un Recipiente para medir la densidad aparente. Repetir el procedimiento con 400 golpes.
Si la diferencia entre las dos masas obtenidas despus de 200 y 400 golpes excede el 2%, realizar una prueba efectuando
200 golpes adicionales hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menos de 2%. Calcular la densidad por asentamiento (g/mL) usando la frmula MF/100, donde MF es la masa del polvo en el recipiente de medicin. Registrar el promedio
Pruebas Fsicas / 621 Cromatografa 453
USP 38
de tres determinaciones usando tres muestras de polvo diferentes. Especificar las condiciones de la prueba en los resultados,
incluyendo la altura de la cada.
MEDIDAS DE LA COMPRESIBILIDAD DE UN POLVO

Dado que las interacciones entre las partculas que afectan las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo tambin afectan el flujo del polvo, una comparacin entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento puede proporcionar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en un polvo determinado. A menudo, este tipo de
comparacin se usa como un ndice de la capacidad de flujo del polvo, por ejemplo, el ndice de Compresibilidad o el ndice de
Hausner, segn se describe a continuacin.
El ndice de Compresibilidad y el ndice de Hausner son medidas que expresan la propensin de un polvo a la compresin,
segn se describi antes. Como tales, son medidas de la capacidad de asentamiento de un polvo y permiten evaluar la importancia relativa de las interacciones entre partculas. En un polvo que fluye libremente, dichas interacciones son menos relevantes, y la densidad aparente y la densidad por asentamiento tendrn valores ms cercanos. En el caso de materiales de menor
fluidez, generalmente existen interacciones mayores entre las partculas y se observa una diferencia mayor entre la densidad
aparente y la densidad por asentamiento. El ndice de Compresibilidad y el ndice de Hausner reflejan estas diferencias.
ndice de CompresibilidadCalcular por la frmula:
100(V0 VF)/V0
V0/VF
Dependiendo del material, el ndice de compresibilidad se puede determinar usando V10 en vez de V0. [NOTASi se usa V10,
debe especificarse claramente en los resultados.]
621 CROMATOGRAFA
INTRODUCCIN
Las tcnicas de separacin cromatogrfica son mtodos de separacin de mltiples etapas en los que los componentes de
una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra mvil. La fase estacionaria puede ser un
slido, un lquido absorbido sobre un slido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna, extendida
como una capa, distribuida como pelcula o aplicada mediante otras tcnicas. La fase mvil puede ser gaseosa o lquida o un
fluido supercrtico. La separacin puede basarse en adsorcin, distribucin de masa (particin) o intercambio inico; o puede
basarse en diferencias entre las propiedades fisicoqumicas de las molculas, tales como tamao, masa o volumen. Este captulo contiene procedimientos generales, definiciones y clculos de parmetros comunes y describe requisitos generales para aptitud del sistema. Los tipos de cromatografa tiles en el anlisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos
cromatogrficos de la USP son: cromatografa en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografa
en capa delgada de alta resolucin) y de lquidos presurizados (comnmente llamada cromatografa lquida de alta presin o
alta resolucin).
Esta seccin describe los procedimientos bsicos usados cuando se describe un mtodo cromatogrfico en una monografa.
Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografa individual.
Cromatografa en Papel
Fase Estacionaria: La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en
cuyo caso el flujo del disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientacin de las fibras del papel con respecto al
flujo del disolvente se debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la direccin de mquina).
Aparato: El equipo esencial para cromatografa en papel comprende una cmara hermtica al vapor provista de entradas
para agregar el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosin aproximadamente 5 cm ms corta que la altura
Captulos
V0 = volumen aparente sin asentar

VF = volumen final asentado
ndice de Hausner
Captulos
454 621 Cromatografa / Pruebas Fsicas
USP 38
interior de la cmara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifn que, a su vez,
sostienen las hojas cromatogrficas. El fondo de la cmara est cubierto con la mezcla de disolventes o fase mvil indicada. La
saturacin de la cmara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con
la fase mvil indicada.
Siembra: La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volmenes convenientes, medidos con micropipetas adecuadas, de la solucin resultante que contengan normalmente de 120 mg del compuesto, en zonas de 6 a 10 mm de dimetro y con una separacin de no menos de 3 cm.
Procedimiento para Cromatografa Descendente en Papel
1. Suspender la hoja cromatogrfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifn para sostener el extremo superior de
la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTAAsegurar que la porcin de la hoja que cuelga por debajo de las varillas est
suspendida libremente en la cmara sin tocar la gradilla o las paredes de la cmara o el lquido que est en el interior de la
cmara.]
2. La cmara se sella para permitir su equilibrio (saturacin) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exceso de presin, si fuera necesario.
3. Despus de equilibrar la cmara, la fase mvil previamente preparada se introduce en la cubeta a travs de la entrada.
4. Cerrar la entrada y dejar que la fase mvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel.
5. Retirar la hoja de la cmara.
6. Marcar rpidamente la ubicacin de la fase mvil y secar la hoja.
7. Observar el cromatograma y medir directamente o despus del revelado adecuado para localizar las manchas del frmaco
o de los frmacos aislados.
Procedimiento para Cromatografa Ascendente en Papel
1. Agregar la fase mvil al fondo de la cmara.
2. La cmara se sella para permitir su equilibrio (saturacin) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exceso de presin, si fuera necesario.
3. Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase mvil para permitir que la fase mvil ascienda en la hoja cromatogrfica por capilaridad.
4. Cuando la fase mvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cmara, retirar la hoja, marcar rpidamente la ubicacin
del frente de la fase mvil, y secar la hoja.
5. Observar el cromatograma y medir directamente o despus del revelado adecuado para localizar las manchas del frmaco
o de los frmacos aislados.

Fase Estacionaria: La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo
fino que se aplica sobre una lmina o placa de vidrio, plstico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacionaria para TLC tiene un tamao de partcula promedio de 1015 mm, y la de TLC de alta resolucin (HPTLC) tiene un tamao
de partcula promedio de 5 mm. Se pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente si se especifican en una monografa. La muestra aplicada a la regin preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas
en la interfase entre el preadsorbente y el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorcin, la particin o
una combinacin de ambos efectos, segn el tipo especfico de fase estacionaria.
Aparato: Usar una cmara cromatogrfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre hermticamente y un tamao adecuado para las placas. Revestir
como mnimo una pared de la cmara cromatogrfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase mvil a la
cmara cromatogrfica de modo que proporcione, despus de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado
a la dimensin de la placa utilizada. Cerrar la cmara cromatogrfica y dejar que se equilibre. [NOTAA menos que se indique
algo diferente, las separaciones se realizan en una cmara saturada.]
Deteccin/Visualizacin: A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV
de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm), as como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las
manchas.
Siembra: Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porciones lo suficientemente pequeas para obtener manchas circulares de 25 mm de dimetro (12 mm sobre placas
de HPTLC) o bandas de 1020 mm 12 mm (510 mm 0,51 mm sobre placas de HPTLC) a una distancia adecuada del
borde inferior y de los bordes laterales de la placa. [NOTADurante el desarrollo, la posicin de la aplicacin debe estar por lo
menos 5 mm (TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase mvil.] Aplicar las soluciones sobre una lnea paralela al
borde inferior de la placa con una separacin mnima de 10 mm (5 mm en placas de HPTLC) entre los centros de las manchas
o 4 mm (2 mm en placas de HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen.
Procedimiento
1. Colocar la placa en la cmara, asegurando que las manchas o bandas estn por encima de la superficie de la fase mvil.
2. Cerrar la cmara.
3. Dejar que la fase mvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase mvil haya recorrido tres cuartos de la longitud
de la placa o la distancia indicada en la monografa.
USP 38
4. Retirar la placa, marcar el frente de la fase mvil con un lpiz, y dejar que se seque.
5. Visualizar los cromatogramas segn se indica.
6. Determinar los valores del factor de retardo cromatogrfico (RF) para las manchas o zonas principales.
7. Se puede realizar una identificacin presuntiva mediante la observacin de las manchas o zonas con valores RF idnticos y
de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estndar en la misma
placa. Una comparacin visual del tamao o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimacin semicuantitativa. La mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometra (mediciones de absorbancia o fluorescencia).
Cromatografa en Columna
Cromatografa de Gases (GC)

Fase Estacionaria Lquida: Este tipo de fase est disponible en columnas rellenas o capilares.
Cromatografa de Gases en Columna Rellena: La fase estacionaria lquida se deposita sobre un soporte slido inerte finamente dividido, como por ejemplo tierra de diatomeas, polmeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la columna que por lo regular tiene un dimetro interno de 24 mm y una longitud de 13 m.
Cromatografa de Gases en Columna Capilar: En las columnas capilares, las cuales no estn rellenas con soporte slido,
la fase estacionaria lquida se deposita sobre la superficie interna de la columna y puede unirse qumicamente a ella.
Fase Estacionaria Slida: Este tipo de fase est disponible nicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase
slida es un adsorbente activo, como por ejemplo almina, slice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas
poliaromticas porosas, que a veces se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase lquida. [NOTALas columnas capilares y rellenas deben acondicionarse antes del uso, hasta que la lnea base y otras caractersticas sean estables. Los
distribuidores de columnas y materiales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.]
Aparato: Un cromatgrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y
un dispositivo registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se puede variar como parte
Captulos
Soporte Slido: Usar tierra silcea purificada para separacin de fase normal. Usar tierra silcea cromatogrfica silanizada
para cromatografa de particin en fase reversa.
Fase Estacionaria: Modificar el soporte slido agregando la fase estacionaria especificada en la monografa individual. Si
se emplea una mezcla de lquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introduccin del soporte slido.
Fase Mvil: La fase mvil se especifica en la monografa individual. Si la fase estacionaria es una solucin acuosa, equilibrar con agua. Si la fase estacionaria es un lquido orgnico polar, equilibrar con ese lquido.
Aparato: A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, el tubo cromatogrfico tiene un dimetro interno de aproximadamente 22 mm y una longitud de 200300 mm. Acoplado al tubo cromatogrfico se encuentra un
tubo de salida sin llave de paso con un dimetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de aproximadamente 50
mm.
PREPARACIN DEL APARATO: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado
de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte slido para producir una mezcla homognea y liviana. Transferir esta
mezcla al tubo cromatogrfico y apisonar empleando presin suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad especificada de soporte slido es ms de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada
porcin. Si la valoracin o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente especificada
para cada segmento, apisonar despus de la adicin de cada segmento y agregar cada segmento directamente sobre el anterior. Apisonar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTALa fase mvil debe fluir a travs de
una columna rellena adecuadamente como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografa en fase reversa,
como un goteo lento.]
Si se incorpora la solucin del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatogrfico
raspando el vaso de precipitados usado para la preparacin de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g
de Soporte Slido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solucin muestra antes de agregar el trozo final de lana
de vidrio por encima del relleno.
Procedimiento
1. Transferir la fase mvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a travs de la columna por accin
de la gravedad.
2. Enjuagar la punta de la columna cromatogrfica con aproximadamente 1 mL de fase mvil antes de cada cambio en la
composicin de la fase mvil y despus de completar la elucin.
3. Si se introduce el analito en la columna como una solucin en la fase mvil, dejar que pase completamente al relleno de
la columna, luego agregar fase mvil en varias porciones pequeas, dejando que cada porcin drene completamente, antes de agregar el grueso de la fase mvil.
4. Cuando el procedimiento indique el uso de mltiples columnas cromatogrficas montadas en serie y se especifique la adicin de fase mvil en porciones divididas, dejar que cada porcin drene por completo a travs de cada columna, y enjuagar la punta de la columna con fase mvil antes de la adicin de cada porcin sucesiva.
USP 38
del anlisis. Los gases transportadores tpicos son helio, nitrgeno o hidrgeno, dependiendo de la columna y el detector en
uso. El tipo de detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monografa individual. La seal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en funcin del tiempo y la
medida del rea o altura del pico, es una funcin de la cantidad presente.
Programa de Temperatura: La longitud y la calidad de una separacin por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatogrfica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografa individual indica las
condiciones en formato de tabla. La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la
temperatura final y el tiempo de espera (hold time) a la temperatura final.
Procedimiento
1. Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una seal constante.
2. Inyectar una muestra a travs del septo del inyector, o usar un muestreador automtico.
3. Comenzar el programa de temperatura.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar segn se indica en la monografa.
Captulos
Cromatografa de Lquidos (HPLC)

El trmino cromatografa de lquidos, segn se usa en los compendios, es sinnimo de cromatografa lquida de alta presin y
de cromatografa lquida de alta resolucin. La cromatografa de lquidos es una tcnica de separacin basada en una fase estacionaria slida y una fase mvil lquida.
Fase Estacionaria: Las separaciones se logran por procesos de particin, adsorcin o intercambio inico, segn el tipo de
fase estacionaria empleada. Las fases estacionarias ms comnmente usadas son la slice modificada o las microperlas de polmero. Las microperlas se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo de relleno especfico necesario para
completar un anlisis se indica mediante la designacin L en la monografa individual (ver tambin la seccin Columnas Cromatogrficas ms adelante). A menudo, el tamao de las microperlas tambin se describe en la monografa. Los cambios en el
tipo y tamao de relleno se analizan en la seccin Aptitud del Sistema de este captulo.
Columna Cromatogrfica: El trmino columna incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubrimiento interno y polimricas, rellenas con una fase estacionaria. La longitud y el dimetro interno de la columna afectan la
separacin y, por lo tanto, las dimensiones tpicas de la columna se incluyen en la monografa individual. Los cambios en las
dimensiones de la columna se analizan en la seccin Aptitud del Sistema de este captulo. Las monografas farmacopeicas no
incluyen el nombre comercial de las columnas apropiadas; esta omisin evita la interpretacin de cualquier tipo de respaldo
para un producto de un proveedor y permite la adaptacin a cambios normales en el mercado. Ver la seccin Columnas Cromatogrficas para ms informacin.
En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre que se cumplan los siguientes requisitos, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no mayor de
15% de la longitud de la columna analtica, (b) el dimetro interno debe ser igual o menor que el de la columna analtica y (c)
el material de relleno debe ser el mismo que en la columna analtica (p.ej., slice) y contener la misma fase ligada (p.ej., C18).
En todo caso, se deben cumplir todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial con la
guarda columna instalada.
Fase Mvil: La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes, segn se define en la monografa individual.
Aparato: Un cromatgrafo de lquidos consta de un recipiente que contiene la fase mvil, una bomba para forzar el paso
de la fase mvil a travs del sistema a alta presin, un inyector para introducir la muestra en la fase mvil, una columna cromatogrfica, un detector y un dispositivo de recoleccin de datos.
Elucin en Gradiente: Se denomina elucin en gradiente o programacin del disolvente a la tcnica de cambiar continuamente la composicin del disolvente durante la cromatografa. El perfil de elucin en gradiente se presenta en la monografa individual como una tabla de gradientes, que indica el tiempo y la composicin proporcional de la fase mvil en el tiempo
indicado.
Procedimiento
1. Equilibrar la columna y el detector con fase mvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una seal constante.
2. Inyectar una muestra a travs del inyector o usar un muestreador automtico.
3. Comenzar el programa de gradientes.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar segn se indica en la monografa.
COLUMNAS CROMATOGRFICAS
Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USPNF se encuentra en la
seccin Reactivos, Indicadores y SolucionesColumnas Cromatogrficas de USPNF y PF. Esta lista pretende ser una referencia til
para el tcnico en cromatografa en la identificacin de la columna cromatogrfica correspondiente especificada en la monografa individual.
USP 38
DEFINICIONES E INTERPRETACIN DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma: Un cromatograma es una representacin grfica de la respuesta del detector, concentracin de analito
en el efluente u otra cantidad usada como una medida de concentracin del efluente en funcin del volumen de efluente o del
tiempo. En la cromatografa planar se puede usar el trmino, cromatograma para referirse al papel o capa con las zonas separadas.
La Figura 1 representa una separacin cromatogrfica tpica de dos sustancias, 1 y 2. tR1 y tR2 son los tiempos de retencin
respectivos; h es la altura, h/2 es la mitad de la altura y Wh/2 es el ancho a la mitad de la altura, para el pico 1. W1 y W2 son los
anchos de los picos 1 y 2, respectivamente, en la lnea base. Los picos de aire son una caracterstica de los cromatogramas de
gases y corresponden al frente de la fase mvil en la cromatografa de lquidos. El tiempo de retencin de estos picos de aire o
componentes no retenidos se denomina tM.
Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (tambin conocido como volumen de demora en elucin a gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna.
Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elucin de un componente no retenido (ver la
Figura 1, mostrado como un pico de aire o de componente no retenido, con la escala de la lnea base en minutos).
Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase mvil requerido para eluir un componente no retenido.
Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en mL/min:
VM = tM F
En la cromatografa de exclusin por tamao, se usa el smbolo VO.
Nmero de Platos Tericos (N)1: N es una medida de eficiencia de la columna. Para los picos gaussianos, se calcula por
la ecuacin:
N = 16(tR/W)2
en donde tR es el tiempo de retencin de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los
lados relativamente rectos del pico hasta la lnea base. El valor de N depende de la sustancia cromatografiada as como de las
condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase mvil o gas transportador, la calidad del
relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la pelcula de fase estacionaria, el dimetro interno y la longitud de la columna.
Cuando se usan integradores electrnicos, puede ser conveniente determinar el nmero de platos tericos por la ecuacin:
donde Wh/2 es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso de discrepancias, slo se deben usar las ecuaciones basadas en el ancho del pico en la lnea base.
Pico: El pico es la porcin del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual eluye de la columna. Si la separacin es incompleta, se puede registrar la elucin de dos o ms componentes como un pico no
resuelto.
Relacin Pico/Valle (p/v): La p/v se pueden emplear como un criterio de aptitud del sistema en una prueba de sustancias
relacionadas cuando no se logra la separacin entre dos picos en la lnea base. La Figura 2 representa una separacin incomple1 Los parmetros k, N, r y r se desarrollaron para separaciones por GC isotrmicas y separaciones por HPLC isocrticas. Debido a que estos trminos son
G
parmetros termodinmicos, son vlidos nicamente para separaciones realizadas a temperatura, composicin de la fase mvil y velocidad de flujo constantes. No
obstante, para separaciones realizadas con un programa de temperatura o gradiente de disolventes, estos parmetros se pueden usar simplemente como medio de
comparacin para asegurar que existen las condiciones cromatogrficas adecuadas para llevar a cabo los mtodos segn se indican en la monografas.
Captulos
Figura 1. Separacin cromatogrfica de las dos sustancias.
USP 38
ta de dos sustancias, donde Hp es la altura del pico menor por encima de la lnea base extrapolada y Hv es la altura en el punto
ms bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la lnea base extrapolada:
Captulos
p/v = Hp/Hv
Figura 2.
Determinacin de la relacin pico/valle.
Retardo Relativo (Rret): El retardo relativo es el cociente entre la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida
simultneamente por un compuesto de referencia (ver la Figura 3) y se usa en una cromatografa planar.
Rret = b/c
Figura 3. Cromatografa planar tpica.

Retencin Relativa (r)1: Es el cociente entre el tiempo de retencin ajustado de un componente y el de otro usado como
referencia obtenido en condiciones idnticas:
r = tR2 tM/tR1 tM
donde tR2 es el tiempo de retencin medido desde el punto de inyeccin del compuesto de inters; tR1 es el tiempo de retencin medido a partir del punto de inyeccin del compuesto usado como referencia; y tM es el tiempo de retencin de un marcador no retenido definido en el procedimiento, todos determinados en condiciones experimentales idnticas en la misma columna.
Tiempo de Retencin Relativo (RRT): Tambin conocido como tiempo relativo no ajustado. Las comparaciones en la
USP normalmente se realizan en trminos de retencin relativa no ajustada, a menos que se indique de otro modo.
RRT = tR2/tR1
El smbolo rG tambin se usa para designar los valores de retencin relativa no ajustados.
USP 38
Desviacin Estndar Relativa Porcentual
Factor de Retardo (RF): El factor de retardo es el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la
distancia recorrida simultneamente por la fase mvil y se usa en cromatografa planar. Usando los smbolos de la Figura 3:
RF = b/a
Factor de Retencin (k)1: El factor de retencin tambin se conoce como el factor de capacidad (k). Se define como:
El factor de retencin de un componente se puede determinar a partir del cromatograma:
Tiempo de Retencin (tR): En cromatografa lquida y cromatografa de gases, el tiempo de retencin, tR, se define como
el tiempo transcurrido entre la inyeccin de la muestra y la aparicin de la respuesta mxima. Se puede usar tR como un parmetro para identificacin. Los tiempos de retencin cromatogrficos son caractersticos de los compuestos que representan,
pero no son nicos. La coincidencia de los tiempos de retencin de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse
como un criterio parcial en la construccin de un perfil de identidad, pero es insuficiente por s misma para establecer la identidad. Los tiempos de retencin absolutos de un compuesto dado varan de un cromatograma al siguiente.
Volumen de Retencin (VR): El volumen de retencin es el volumen de fase mvil requerido para la elucin de un componente. Se puede calcular a partir del tiempo de retencin y de la velocidad de flujo en mL/min:
VR = tR F
Resolucin (RS):
La resolucin es la separacin de dos componentes en una mezcla, calculada por:

RS = 2 (tR2 tR1)/(W1 + W2)
donde tR2 y tR1 son los tiempos de retencin de los dos componentes; y W2 y W1 son los anchos correspondientes en las bases
de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la lnea base.
Cuando se usan integradores electrnicos, puede ser conveniente determinar la resolucin, mediante la ecuacin:
RS = 1,18 (tR2 tR1)/(W1,h/2 + W2,h/2)
Factor de Separacin (a): El factor de separacin es la retencin relativa calculada para dos picos adyacentes (por convencin, el valor del factor de separacin siempre es >1):
a = k2/k1
Factor de Simetra (AS)2:
calcula por:
El factor de simetra (tambin conocido como factor de asimetra) de un pico (ver la Figura 4) se
AS = W0,05/2f
donde W0,05 es el ancho del pico al 5% de la altura y f es la distancia del mximo del pico hasta el borde inicial del pico, midiendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura desde de la lnea base.
2 Una prctica comn consiste en medir el Factor de Asimetra como el cociente entre la distancia entre la lnea vertical que conecta el pice del pico con la lnea
base interpolada y el frente del pico, y la distancia entre dicha lnea y el pico medido a la inversa al 10% de la altura del pico (ver la Figura 4) sera (W0,10 f0,10)/
f0,10. No obstante, para los propsitos de la USP, nicamente es vlida la frmula (AS) segn se presenta en este captulo.
Captulos
k = (tR tM)/tM
USP 38
Figura 4.
Factor de Asimetra (T):
Pico cromatogrfico asimtrico.
Ver Factor de Simetra.
Captulos
APTITUD DEL SISTEMA

Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los mtodos de cromatografa de lquidos y de gases. Estas
pruebas se usan para verificar que el sistema cromatogrfico sea adecuado para el anlisis que se pretende efectuar.
Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas electrnicos, las operaciones analticas y las muestras
analizadas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal.
Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatogrfico incluyen lo siguiente:
Composicin, fuerza inica, temperatura y pH aparente de la fase mvil
Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presin
Las caractersticas de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatogrfico (basado en partculas o monoltico), tamao de partcula, tamao de poro y rea superficial especfica
En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el grado de modificacin qumica (segn se
expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, etc.)
La resolucin, RS, es una funcin del nmero de platos tericos, N (tambin referido como eficiencia), el factor de separacin, a, y el factor de capacidad, k. [NOTATodos los trminos y smbolos se definen en la seccin anterior Definiciones e Interpretacin de Cromatogramas.] Para una fase mvil y una fase estacionaria determinadas, se puede especificar N para asegurar
que los compuestos que eluyen muy cerca entre s se resuelvan unos de otros, para establecer el poder de resolucin general
del sistema y para asegurar que el estndar interno se resuelva del frmaco. Este es un medio menos confiable para asegurar la
resolucin que la medicin directa de la misma. La eficiencia de la columna es, en parte, un reflejo de la agudeza del pico, que
es tambin importante para la deteccin de trazas de componentes.
Las inyecciones repetidas de una preparacin estndar u otras soluciones estndar se comparan entre s para determinar si se
cumplen los requisitos de precisin. A menos que se especifique de otro modo en la monografa individual, se usan los datos
de cinco inyecciones repetidas del analito para calcular la desviacin estndar relativa, %RSD, si el requisito es 2,0% o menos;
se usan los datos de seis inyecciones repetidas si el requisito de desviacin estndar relativa es ms de 2,0%.
Para la Valoracin en una monografa de un frmaco, donde el valor es 100% para la sustancia pura, y no se especifica una
desviacin estndar relativa mxima, se calcula la %RSD mxima permitida para una serie de inyecciones de la solucin de
referencia como:
%RSD = KBn/t90%,n1
donde K es una constante (0,349), obtenida a partir de la expresin K = (0,6/2) (t90%,5/6), en la que 0,6/2 representa la
desviacin estndar relativa porcentual requerida despus de seis inyecciones para B = 1,0; B es el lmite superior provisto en la
definicin de la monografa individual menos 100%; n es el nmero de inyecciones repetidas de la solucin de referencia (3
n 6); y t90%,n1 es el valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n 1 grados de libertad.
A menos que se indique de otro modo, la desviacin estndar relativa mxima permitida no excede del valor apropiado provisto en la tabla de requisitos de repetibilidad. Este requisito no se aplica a las pruebas para sustancias relacionadas.
Requisitos para Desviacin Estndar Relativa
Nmero de Inyecciones Individuales
3
2,0
0,41
0,59
2,5
0,73
0,85
0,52
0,74
0,92
3,0
1,06
0,62
0,89
1,10
1,27
B (%)
RSD Mxima Permitida
USP 38
El factor de simetra, AS, una medicin de la simetra del pico, la unidad es el valor que adquiere para picos perfectamente
simtricos; y su valor se incrementa conforme la asimetra se vuelve ms pronunciada (ver la Figura 4). En algunos casos, pueden observarse valores menores a la unidad. A medida que la simetra del pico se aleja de valores de 1, la integracin y por lo
tanto la precisin se tornan menos confiables.
La relacin seal-ruido (S/N) es un parmetro til de aptitud del sistema. La S/N se calcula segn se indica a continuacin:
S/N = 2H/h
donde H es la altura del pico medido a partir del pice del pico hasta la lnea base extrapolada sobre una distancia 5 veces el
ancho del pico a su altura media; y h es la diferencia entre el valor de ruido ms grande y ms pequeo observados sobre una
distancia 5 veces el ancho del pico a su altura media y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del pico de
inters (ver la Figura 5).
Ruido y pico cromatogrfico, componentes de la relacin S/N.
Estas pruebas de aptitud del sistema se realizan recolectando datos a partir de inyecciones repetidas del estndar u otras
soluciones segn se especifica en la monografa individual.
La especificacin de parmetros definidos en una monografa no excluye el uso de otras condiciones de operacin aptas.
Puede ser necesario realizar ajustes al sistema cromatogrfico especificado para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema. Los ajustes realizados a los sistemas cromatogrficos para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema no deben
hacerse para compensar fallas en la columna o malfuncionamiento del sistema. Se permiten ajustes nicamente cuando se encuentran disponibles estndares adecuados (incluyendo Estndares de Referencia) para todos los compuestos usados en la
prueba de aptitud; y los ajustes o el cambio de columna generan un cromatograma que cumple con todos los requisitos de
aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial.
Si es necesario realizar ajustes a las condiciones operativas para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema, cada uno
de los parmetros en la lista siguiente es la variacin mxima que se puede considerar, a menos que se indique algo distinto en
la monografa; estos cambios pueden requerir datos de verificacin adicionales. Para verificar la aptitud del mtodo en estas
nuevas condiciones, evaluar las caractersticas de desempeo analtico pertinentes que sean potencialmente afectadas por el
cambio. Mltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeo del sistema y deben considerarse cuidadosamente antes de implementarlos. En algunas circunstancias, puede ser deseable usar una columna para HPLC con dimensiones
distintas a las prescritas en el procedimiento oficial (longitud, dimetro interno y/o tamao de partcula diferentes). En todo
caso, los cambios en las caractersticas qumicas (designacin L) de la fase estacionaria debern considerarse como una modificacin del mtodo y requerirn validacin completa. No se recomienda realizar ajustes a la composicin de la fase mvil en
la elucin en gradiente puesto que puede ocasionar cambios en la selectividad. Si se requieren ajustes, se permiten cambios en
el relleno de la columna (manteniendo las mismas propiedades qumicas), en la duracin del tiempo de espera isocrtico inicial
(cuando se indique) y/o ajustes en el volumen de residencia. Las concesiones adicionales para el ajuste de gradientes se tratan
a continuacin.
pH de la Fase Mvil (HPLC): El pH de la solucin amortiguadora acuosa usada en la preparacin de la fase mvil se puede ajustar dentro de 0,2 unidades del valor o intervalo especificado. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocrticas.
Concentracin de Sales en la Solucin Amortiguadora (HPLC): La concentracin de las sales usadas en la preparacin
de la solucin amortiguadora acuosa empleada en la fase mvil se puede ajustar dentro de 10% siempre que se cumpla con
la variacin del pH permitida (ver arriba). Se aplica a las separaciones en gradiente e isocrticas.
Relacin de los Componentes en la Fase Mvil (HPLC): Los siguientes lmites de ajuste aplican a componentes minoritarios de la fase mvil (especificados a 50% o menos). La cantidad de estos componentes se puede ajustar en un 30% relativo. Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de 10% absoluto (es decir, en relacin a la fase
mvil total). Se puede ajustar un componente minoritario en una mezcla ternaria. A continuacin se presentan ejemplos de
ajustes para mezclas binarias y ternarias.
Mezclas Binarias
RELACIN ESPECIFICADA DE 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio mximo permitido de 10% absoluto en cada componente. Por lo tanto, slo se puede ajustar la relacin de la fase mvil dentro del intervalo de 40:60
60:40.
Captulos
Figura 5.
Captulos
USP 38
RELACIN ESPECIFICADA DE 2:98: 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por lo tanto, el ajuste mximo permitido se encuentra dentro
del intervalo de 1,4: 98,62,6: 97,4.
Mezclas Ternarias
RELACIN ESPECIFICADA DE 60:35:5: Para el segundo componente, 30% de 35 es 10,5% absoluto, que excede el cambio mximo permitido de 10% absoluto en cualquier componente. Por lo tanto, el segundo componente slo puede ajustarse dentro del intervalo de 25%45% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, usar una
cantidad suficiente del primer componente para obtener un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de
50:45:570:25:5 58,5: 35: 6,561,5: 35: 3,5 cumplirn con el requisito.
Longitud de Onda del Detector UVVisible (HPLC): No estn permitidas las desviaciones de las longitudes de onda especificadas en el procedimiento. Se usa el procedimiento especificado por el fabricante del detector, u otro procedimiento validado, para verificar que el error en la longitud de onda del detector sea, como mximo, 3 nm.
Fase Estacionaria
LONGITUD DE LA COLUMNA (GC
Se puede ajustar tanto como 70%.
ERR (01-ene-2015)):
LONGITUD DE LA COLUMNA (HPLC): Ver Tamao de Partcula (HPLC) ms adelante.
DIMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (HPLC): Se puede ajustar siempre que la velocidad lineal se mantenga constante. Ver Velocidad de Flujo (HPLC) ms adelante.
DIMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (GC)Se puede ajustar tanto como 50%.
ESPESOR DE LA PELCULA (GC CAPILAR)Se puede ajustar tanto como 50% a 100%.
Tamao de Partcula (HPLC): Para separaciones isocrticas, se puede modificar el tamao de partcula y/o la longitud de
la columna siempre que la relacin entre la longitud de la columna (L) y el tamao de partcula (dp) permanezca constante o
dentro del intervalo entre 25% y +50% de la relacin L/dp prescrita. Como alternativa (igual que para la aplicacin del ajuste
de tamao de partcula para partculas con superficies porosas), se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que el
nmero de platos tericos (N) est dentro del intervalo 25% a +50%, con respecto a la columna prescrita. Se debe tener
cuidado cuando el ajuste resulte en un nmero mayor de platos tericos pues esto genera volmenes de pico menores y puede requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extra columna originado por factores tales como la tubuladura del instrumento, el volumen de celda del detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyeccin. Cuando no se
mencione el tamao de partcula en la monografa, la relacin se debe calcular usando el tamao de partcula ms grande
designado en la definicin USP de la columna. Para separaciones en gradiente, no se permiten cambios en la longitud de la
columna, en el dimetro interno de la columna ni en el tamao de partcula.
Tamao de la Partcula (GC): Es aceptable cambiar la malla de un soporte para GC de un tamao de partcula mayor a
uno menor o de uno menor a uno mayor siempre que la cromatografa cumpla con los requisitos de aptitud del sistema y se
mantenga la misma relacin del intervalo de tamao de partcula. La relacin del intervalo del tamao de partcula se define
como el dimetro de la partcula ms grande dividida por el dimetro de la partcula ms pequea.
Velocidad de Flujo (GC): La velocidad de flujo se puede ajustar tanto como 50%.
Velocidad de Flujo (HPLC): Cuando se modifica el tamao de partcula, puede ser necesario ajustar la velocidad de flujo
debido a que las columnas con un tamao de partcula menor requerirn de velocidades lineales ms altas para el mismo desempeo (medido por una reduccin de la altura del plato). Los cambios en la velocidad de flujo para un cambio en el dimetro de la columna y en el tamao de partcula se pueden realizar mediante:
F2 = F1 [(dc22 dp1)/(dc12 dp2)]

donde F1 y F2 son las velocidades de flujo para las condiciones originales y modificadas, respectivamente; dc1 y dc2 son los dimetros de columna respectivos; y dp1 y dp2 son los tamaos de partcula.
Cuando se realiza un cambio de partculas de 3 mm a <3 mm en separaciones isocrticas, se puede justificar un aumento
adicional en la velocidad lineal (ajustando la velocidad de flujo), siempre que la eficiencia de la columna no caiga en ms del
20%. De manera similar, un cambio de partculas de <3 mm a 3 mm puede requerir la reduccin adicional de la velocidad
lineal (velocidad de flujo) para evitar una reduccin en la eficiencia de la columna de ms del 20%. No se permiten cambios
en F, dc y dp para separaciones en gradiente.
Adems, la velocidad de flujo se puede ajustar en 50% (slo en separacin isocrtica).
EJEMPLOS: Los ajustes en la longitud de la columna, el dimetro interno, el tamao de partcula y la velocidad de flujo se
pueden usar de manera combinada para proveer condiciones equivalentes (mismo N), pero con diferencias en la presin y el
tiempo de corrida. La tabla siguiente lista algunas de las configuraciones de columna ms populares para proveer una eficiencia equivalente (N) mediante el ajuste de estas variables.
Valores Relativos
Longitud
(L, mm)
Dimetro de la
Columna (dc, mm)
Tamao de
Partcula
(dp, mm)
250
4,6
150
4,6
150
2,1
30 000
0,2
1,0
1,0
1,0
100
4,6
3,5
28 600
1,4
1,0
1,9
0,5
Tiempo de
Corrida
L/dp
10
25 000
0,5
0,8
0,2
3,3
30 000
1,0
1,0
1,0
1,0
Presin
USP 38
Valores Relativos
Dimetro de la
Columna (dc, mm)
Tamao de
Partcula
(dp, mm)
100
2,1
3,5
28 600
0,3
1,0
1,9
0,5
75
4,6
2,5
30 000
2,0
1,0
4,0
0,3
Longitud
(L, mm)
L/dp
Presin
Tiempo de
Corrida
75
2,1
2,5
30 000
0,4
1,0
4,0
0,3
50
4,6
1,7
29 400
2,9
1,0
8,5
0,1
50
2,1
1,7
29 400
0,6
1,0
8,5
0,1
CUANTIFICACIN
Durante la cuantificacin, no tomar en cuenta los picos producidos por disolventes y reactivos o generados por la fase mvil
o la matriz de la muestra.
En el intervalo lineal, el rea del pico y la altura del pico son generalmente proporcionales a la cantidad de compuesto eluido. Las reas y las alturas de los picos se miden comnmente mediante integradores electrnicos, pero se pueden determinar
de modos ms clsicos. En general, se emplean las reas de los picos pero pueden ser menos exactas si se producen interferencias. Los componentes medidos se separan de cualquier componente interferente. Se deben minimizar las asimetras tanto en
la parte anterior como en la posterior del pico y se debe evitar la medicin de picos dentro de las colas de otros picos.
Aunque se prefiere la comparacin de los picos de impurezas con los del cromatograma de un estndar de la impureza a
una concentracin similar, las pruebas de impurezas pueden basarse en la medicin de las respuestas de los pico debidos a
impurezas y expresarse como un porcentaje del rea del pico del frmaco. El estndar puede ser el mismo frmaco a un nivel
correspondiente de impurezas, por ejemplo, a 0,5%, asumiendo respuestas idnticas de los picos. Cuando las impurezas deben determinarse con una mayor certeza, usar un estndar de la misma impureza o aplicar un factor de correccin basado en
la respuesta de la impureza relativa a la del componente principal.
Mtodo de Estndar Externo: La concentracin del componente cuantificado se determina comparando las respuestas
obtenidas a partir de la solucin muestra con las respuestas obtenidas a partir de una solucin estndar.
Mtodo del Estndar Interno: Se introducen cantidades iguales del estndar interno en la solucin muestra y en una solucin estndar. El estndar interno se selecciona de modo que no reaccione con el material de prueba, se resuelva de los com-
Captulos
Por ejemplo, si una monografa especifica una columna de 150 mm 4,6 mm, de 5 mm, operada a 1,5 mL/minuto, se puede esperar la misma separacin con una columna de 75 mm 2,1 mm, de 2,5 mm operada a 1,5 mL/minuto 0,4 = 0,6 mL/
minuto, junto con un aumento en la presin de aproximadamente cuatro veces y una reduccin en el tiempo de corrida hasta
aproximadamente 30% del original.
Volumen de Inyeccin (HPLC): El volumen de inyeccin se puede ajustar siempre que sea congruente con la precisin, la
linealidad y los lmites de deteccin aceptados. Se debe tomar en cuenta que un volumen excesivo de inyeccin puede llevar a
un ensanchamiento inaceptable de la banda, ocasionando una reduccin en N y en la resolucin. Aplica a las separaciones en
gradiente e isocrticas.
Volumen de Inyeccin y Volumen de Divisin (Split Volume) (GC): El volumen de inyeccin y el volumen de divisin
se pueden ajustar si la deteccin y la repetibilidad son satisfactorias.
Temperatura de la Columna (HPLC): La temperatura de la columna se puede ajustar tanto como 10. Se recomienda la
termostatizacin de la columna para mejorar el control y la reproducibilidad del tiempo de retencin. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocrticas.
Temperatura del Horno (GC): La temperatura del horno se puede ajustar tanto como 10%.
Programa de Temperatura del Horno (GC): Se permiten ajustes de la temperatura segn se especific anteriormente.
Cuando la temperatura especificada se debe mantener o cuando la temperatura debe cambiarse de un valor a otro, se permite
un ajuste de hasta 20%.
A menos de se indique algo distinto en la monografa, los parmetros de aptitud del sistema se determinan a partir del pico
del analito.
Los valores medidos de Rr o RF o tR para la muestra no se desvan de los valores obtenidos para el compuesto o la mezcla de
referencia en ms que los estimados de confiabilidad estadsticamente determinados en valoraciones repetidas del compuesto
de referencia. Los tiempos de retencin relativos, si se proporcionan en las monografas, son con fines informativos nicamente
para facilitar la identificacin de los picos. No existen criterios de aceptacin pertinentes a los tiempos de retencin relativos.
El sistema operativo final debe someterse a una prueba de aptitud para determinar su eficiencia. Realizar inyecciones de las
preparaciones apropiadas segn se requiera para demostrar una adecuada Aptitud del sistema en toda la corrida (segn se describe en la seccin Sistema cromatogrfico del procedimiento en una monografa).
La preparacin puede ser una preparacin estndar o una solucin que contenga una cantidad conocida de analito y cualquier material adicional (por ejemplo, excipientes o impurezas) tiles para el control del sistema analtico. Siempre que haya
un cambio significativo en el sistema cromatogrfico (equipo, componentes de la fase mvil, u otros componentes) o en un
reactivo crtico, debera restablecerse la Aptitud del sistema. Ningn anlisis de muestras es aceptable a menos que se haya demostrado la aptitud del sistema.
USP 38
Captulos
ponentes cuantificados (analitos), y no contenga impurezas con el mismo tiempo de retencin que los analitos. Las concentraciones de los analitos se determinan comparando los cocientes entre las reas de sus picos o las alturas de sus picos y el estndar interno en la solucin muestra, con los cocientes entre las reas o alturas de sus picos y el estndar interno en la solucin
estndar.
Procedimiento de Normalizacin: El contenido porcentual de un componente del material de prueba se calcula determinando el rea del pico correspondiente como un porcentaje del rea total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a
disolventes o reactivos o que surgen de la fase mvil o de la matriz de la muestra y aquellos por debajo del lmite en el que
pueden descartarse.
Procedimiento de Calibracin: Se determina la relacin entre la seal medida o evaluada y y la cantidad de la sustancia x
(por ejemplo, concentracin, masa) y se calcula la funcin de calibracin. Los resultados analticos se calculan a partir de la
seal del analito medida o evaluada y su posicin en la curva de calibracin.
En las pruebas para impurezas tanto para el Mtodo del Estndar Externo, cuando se usa una dilucin de la solucin muestra
para comparacin, como para el Procedimiento de Normalizacin, se aplica cualquier factor de correccin indicado en la monografa (por ejemplo, cuando el factor de respuesta relativa est fuera del intervalo de 0,81,2).
Cuando la prueba de impurezas indica el total de impurezas o cuando existe una determinacin cuantitativa de una impureza, es importante seleccionar un ajuste de umbral apropiado y condiciones apropiadas para la integracin de las reas de los
picos. En tales pruebas, el lmite en el cual, o por debajo del cual se descarta un pico, es generalmente 0,05%. De esta forma,
el ajuste de umbral del sistema de recoleccin de datos corresponde al menos a la mitad de este lmite. Integrar el rea del
pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal, preferiblemente mediante extrapolacin valle a
valle de la lnea base (extrapolacin tangencial).
631 COLOR Y ACROMATISMO

DefinicinA los efectos de este captulo, el color se puede definir como la percepcin o la respuesta subjetiva de un observador al estmulo objetivo de energa radiante en el espectro visible que se extiende en el intervalo de longitudes de onda
de 400 nm a 700 nm. El color percibido es una funcin de tres variables: las propiedades espectrales del objeto, tanto absorbentes como reflectantes; las propiedades espectrales de la fuente de iluminacin; y las caractersticas visuales del observador.
Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente especfica de iluminacin cuando un observador no puede
detectar una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores iguales, con una fuente de iluminacin y no con
otra, constituyen un par metamrico. El color de dos objetos es igual para todas las fuentes de iluminacin si los espectros de
absorcin y de reflectancia de los dos objetos son idnticos.
El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala de color para la transmisin de luz. Esto implica la ausencia completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto carece de absorbancias. A efectos prcticos, el observador en este caso percibe poca o ninguna absorcin en el espectro visible.
Atributos del ColorComo la sensacin de color tiene un componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede describirse exclusivamente en trminos espectrofotomtricos. Por lo tanto, los atributos comunes del color no pueden corresponder
uno a uno con la terminologa espectral.
Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. (1) el matiz, o la cualidad segn la cual una familia de colores se distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y trminos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que
distingue un color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que distingue un color fuerte de uno dbil, o el
grado en el cual un color difiere de un gris del mismo valor.
Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir un espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier
color por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente uniforme si la distancia geomtrica entre dos colores en
el espacio de color es directamente una medida de la distancia del color entre ellos. A menudo se eligen coordenadas cilndricas por conveniencia. Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del oscuro al claro o del negro al blanco y
poseen un matiz indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrndose en una seccin transversal perpendicular al eje del valor, el matiz se determina por el ngulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se determina por la distancia desde
el eje longitudinal. Los matices rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios estn dados por diferentes ngulos. Los
colores a lo largo de un radio de una seccin transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un matiz ms intenso a
medida que se aleja. Por ejemplo, el agua incolora o acromtica tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna cromaticidad.
Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un matiz especfico. A medida que se agrega ms soluto, el color se torna ms
oscuro, ms intenso, o ms profundo; es decir, generalmente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si el
soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece
indeterminado.
Las mediciones espectroscpicas de laboratorio pueden convertirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resultados espectroscpicos para tres luces o estmulos elegidos se ponderan mediante tres funciones de distribucin para producir
los valores tricromticos, X, Y, Z (ver ColorMedicin Instrumental 1061). Las funciones de distribucin se determinaron en
experimentos de comparacin de color con sujetos humanos.
Pruebas Fsicas / 641 Totalidad de la Disolucin 465
USP 38
Lquidos de Comparacin
Lquido de Comparacin
Partes de
Cloruro Cobaltoso SC
Partes de
Cloruro
Frrico SC
Partes de
Sulfato
Cprico SC
Partes de Agua
0,1
0,4
0,1
4,4
0,3
0,9
0,3
3,5
0,1
0,6
0,1
4,2
0,3
0,6
0,4
3,7
0,4
1,2
0,3
3,1
0,3
1,2
0,0
3,5
0,5
1,2
0,2
3,1
0,2
1,5
0,0
3,3
0,4
2,2
0,1
2,3
0,4
3,5
0,1
1,0
0,5
4,5
0,0
0,0
0,8
3,8
0,1
0,3
0,1
2,0
0,1
2,8
0,0
4,9
0,1
0,0
0,1
4,8
0,1
0,0
0,2
0,4
0,1
4,3
0,2
0,3
0,1
4,4
0,3
0,4
0,2
4,1
0,2
0,1
0,0
4,7
0,5
0,5
0,4
3,6
641 TOTALIDAD DE LA DISOLUCIN

Colocar la cantidad de la sustancia especificada en la monografa individual en una probeta de vidrio de 10 mL, de aproximadamente 13 mm 125 mm de tamao, con tapn de vidrio, meticulosamente limpia. Utilizando el disolvente especificado
* Las colecciones de muestras de color, ordenadas segn matiz, valor y cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en la designacin
de colores de muestras por comparacin visual estn disponibles en GretagMacbeth LLC, 617 Little Britain Road, New Windsor, NY 12553-6148.
Captulos
Los valores tricromticos no son coordenadas en un espacio de color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto
varias transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las cuales se describe en el captulo citado 1061 Color
Medicin Instrumental. El valor es a menudo una funcin solamente del valor de Y. La obtencin de uniformidad en el subespacio de matiz y cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido prctico, esto significa que en una comparacin visual de
colores, cuando dos objetos difieren significativamente en matiz, resulta difcil decidir cul tiene mayor cromaticidad. Esto seala la importancia de elegir un estndar de comparacin lo ms parecido posible al color de la muestra, especialmente para
los atributos de matiz y cromaticidad.
Determinacin de Color y EstndaresLa percepcin del color y de la igualdad de colores depende de las condiciones de
observacin e iluminacin. Las determinaciones deben hacerse usando iluminacin difusa y uniforme bajo condiciones que reduzcan al mnimo las sombras y la reflectancia no espectral. La superficie de los polvos debe alisarse con presin suave para
que puedan presentar una superficie plana sin irregularidades. Los lquidos deben compararse en tubos para comparacin de
color iguales, contra un fondo blanco. Si se descubre que los resultados varan con la iluminacin, se considerarn correctos los
valores obtenidos con luz de da natural o artificial. En lugar de la determinacin visual debe emplearse un mtodo instrumental apropiado.
Los colores de los estndares deben ser lo ms parecidos posibles a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferencias de color. Los estndares para materiales opacos estn disponibles como conjuntos de muestras indicadoras de color que se
disponen en un espacio visualmente uniforme.* Estndares para comparaciones de color de lquidos, identificados mediante
una letra, se pueden preparar segn la tabla adjunta. Para preparar el lquido de comparacin requerido, pipetear y transferir
los volmenes prescritos de las soluciones de prueba colorimtricas [ver en Soluciones Colorimtricas (SC) en la seccin Reactivos, Indicadores, y Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparacin y mezclar la solucin en el recipiente. Hacer
la comparacin segn se indica en la monografa individual, bajo las condiciones de observacin previamente descritas. Los
lquidos de comparacin u otras combinaciones de las soluciones colorimtricas pueden emplearse en concentraciones muy
bajas para medir desviaciones del acromatismo.
466 641 Totalidad de la Disolucin / Pruebas Fsicas
USP 38
en la monografa o en la etiqueta del producto, llenar la probeta casi hasta el estrechamiento del cuello. Agitar suavemente
para disolver: La solucin no es menos transparente que un volumen igual del mismo disolvente contenido en un recipiente
similar y examinado de modo similar.
Captulos
643 CARBONO ORGNICO TOTAL

El carbono orgnico total (COT) es una medida indirecta de las molculas orgnicas presentes en las aguas para uso farmacutico, determinadas como carbono. Las molculas orgnicas se introducen en el agua junto con el agua original, desde los
materiales del sistema de purificacin y distribucin, desde biopelculas que se desarrollan en el sistema y desde los envases de
agua estril y de agua no estril. El COT tambin puede emplearse como un atributo de control del proceso, para monitorear
el funcionamiento de las operaciones unitarias que conforman el sistema de purificacin y distribucin. Una medicin de COT
no es un reemplazo de la prueba de control microbiolgico o de endotoxinas. Aunque puede haber una relacin cualitativa
entre el COT y la actividad microbiolgica, no existe una correlacin numrica directa.
Existen varios mtodos aceptables para analizar el COT. Este captulo no respalda, limita ni impide el empleo de tecnologas
alternativas, sino que ofrece una orientacin para calificar estas tecnologas analticas para su uso, as como tambin una gua
para interpretar los resultados de los instrumentos para emplearlos como una prueba de lmite.
Los aparatos que se usan comnmente para determinar el COT en aguas para uso farmacutico comparten el objetivo de
oxidar las molculas orgnicas del agua para producir dixido de carbono, seguido de la medicin de la cantidad de dixido
de carbono producido. Posteriormente, la cantidad determinada de CO2 producido se usa para calcular la concentracin de
carbono orgnico en el agua.
Todas las tecnologas deben distinguir entre el carbono inorgnico, que puede estar presente en el agua proveniente de
fuentes como CO2 y bicarbonato disueltos, y el CO2 generado por la oxidacin de molculas orgnicas en la muestra. La distincin se puede lograr determinando el carbono inorgnico y restndolo del carbono total (que es la suma de carbono orgnico
y carbono inorgnico), o eliminando el carbono inorgnico de la muestra antes de oxidarla. Aunque el paso de eliminacin
tambin puede eliminar molculas orgnicas, este carbono orgnico eliminable se encuentra presente en cantidades inapreciables en las aguas para uso farmacutico.
AGUA A GRANEL
Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Purificada, Agua para Inyeccin, Agua para Hemodilisis y el condensado de Vapor Puro a granel.
Requisitos del Aparato: Este mtodo de prueba se lleva a cabo como una prueba en lnea (on-line test) o como una
prueba de laboratorio fuera de la lnea de produccin (off-line test), empleando un instrumento calibrado. La aptitud del aparato debe demostrarse peridicamente, segn se describe a continuacin. Adems, debe tener especificado un lmite de deteccin, establecido por el fabricante, de 0,05 mg/L (0,05 ppm) de carbono o menor.
Cuando se analiza agua para propsitos de control de calidad, se debe asegurar que el instrumento y sus datos estn bajo
un control apropiado y que los mtodos y lugares de muestreo tanto de las mediciones en lnea como de las mediciones fuera
de lnea sean representativos de la calidad del agua usada. Se debe tomar en cuenta el carcter de la produccin, distribucin
y uso del agua al momento de seleccionar una medicin en lnea o fuera de lnea.
Estndares de Referencia USP 11: ER 1,4-Benzoquinona USP. ER Sacarosa USP.
Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no ms de 0,10 mg/L. [NOTAPuede ser necesario establecer un
requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del mtodo.]
Preparacin de Envases: La contaminacin orgnica de los envases da lugar a valores de COT ms altos. Por lo tanto, se
deben usar materiales de laboratorio y envases que hayan sido meticulosamente limpiados para eliminar los residuos orgnicos. Se puede emplear cualquier mtodo eficaz para eliminar la materia orgnica (ver Limpieza de Material de Vidrio 1051).
Utilizar Agua Reactivo para el enjuague final.
Solucin Estndar: A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solucin con una concentracin de 1,19 mg/L de sacarosa (0,50 mg/L de carbono).
Solucin de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad pesada con exactitud de ER 1,4-Benzoquinona
USP para obtener una solucin con una concentracin de 0,75 mg/L (0,50 mg/L de carbono).
Control de Agua Reactivo: Usar una cantidad adecuada de Agua Reactivo obtenida al mismo tiempo que la utilizada en la
preparacin de la Solucin Estndar y de la Solucin de Aptitud del Sistema.
Muestra de Agua: Obtener una muestra en lnea o fuera de lnea que refleje de manera apta la calidad del agua usada.
Otras Soluciones de Control: Preparar soluciones apropiadas de blanco de reactivos u otras soluciones especificadas necesarias para establecer la lnea de base del aparato o para realizar ajustes en la calibracin siguiendo las instrucciones del fabricante, y correr los blancos apropiados para ajustar a cero el instrumento, si fuera necesario.
USP 38
Pruebas Fsicas / 645 Conductividad del Agua 467
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rW. Repetir la prueba utilizando la Solucin Estndar y registrar la respuesta, rS. Calcular la respuesta corregida de la Solucin Estndar, que es tambin la
respuesta lmite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin Estndar. El lmite terico de
0,50 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solucin Estndar, rS rW. Analizar la Solucin de Aptitud del Sistema en el aparato y registrar la respuesta, rSS. Calcular la respuesta corregida de la Solucin de Aptitud del Sistema, restando la
respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin de Aptitud del Sistema, rSS rW. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solucin de Aptitud del Sistema:
eficiencia de la respuesta % = 100[(rSS rW)/(rS rW)]
en donde rSS es la respuesta del instrumento para la Solucin de Aptitud del Sistema; rW es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo y rS es la respuesta del instrumento para la Solucin Estndar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual no es menos de 85% ni ms de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, rU. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si rU no es mayor que la respuesta lmite, rS rW. Este mtodo se puede realizar usando instrumental en lnea o
fuera de lnea que cumpla con los Requisitos del Aparato.
AGUA ESTRIL
eficiencia de la respuesta % = 100[(rSS rW)/(rS rW)]

en donde rSS es la respuesta del instrumento para la Solucin de Aptitud del Sistema; rW es la respuesta del instrumento para el
Control de Agua Reactivo; y rS es la respuesta del instrumento para la Solucin Estndar. El sistema es apto si la eficiencia de la
respuesta porcentual es no menos de 85% ni ms de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, rU. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si rU no es mayor que la respuesta lmite, rS rW, determinada en los requisitos de Aptitud del Sistema, en Agua
Estril
645 CONDUCTIVIDAD DEL AGUA

INTRODUCCIN
La conductividad elctrica del agua es una medida del flujo de electrones facilitado con iones. Las molculas de agua se disocian en iones en funcin del pH y la temperatura, producindose una conductividad fcil de predecir. Algunos gases, especialmente el dixido de carbono, se disuelven fcilmente en el agua e interactan para formar iones, lo que tambin afecta la
Captulos
Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril Purificada, Agua Estril para Irrigacin y Agua Estril para Inhalacin.
Seguir los requisitos en Agua a Granel, con las siguientes excepciones.
Requisitos del Aparato: Adems de cumplir con los Requisitos del Aparato en Agua a Granel, el aparato debe tener un
lmite de deteccin especificado por el fabricante de 0,10 mg/L (0,10 ppm) de carbono o menor.
Control de Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no ms de 0,50 mg/L. [NOTAPuede ser necesario
establecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del mtodo.]
Solucin Estndar: A menos que se indique algo diferente en la monografa individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solucin con una concentracin de 19,0 mg/L de sacarosa (8,0 mg/L de carbono).
Solucin de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER 1,4-Benzoquinona USP para obtener una solucin con una concentracin de 12,0 mg/L (8,0 mg/L de carbono).
Muestra de Agua: Obtener una muestra que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Puede que se requieran varios envases para contar con suficiente
agua para analizar.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rW. Repetir la prueba utilizando la Solucin Estndar y registrar la respuesta, rS. Calcular la respuesta corregida de la Solucin Estndar, que es tambin la
respuesta lmite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin Estndar. El lmite terico de
8,0 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solucin Estndar, rS rW. Analizar la Solucin de Aptitud del Sistema
en el aparato y registrar la respuesta, rSS. Calcular la respuesta corregida de la Solucin de Aptitud del Sistema, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solucin de Aptitud del Sistema, rSS rW. Calcular la eficiencia de la
respuesta porcentual de la Solucin de Aptitud del Sistema:
468 645 Conductividad del Agua / Pruebas Fsicas
USP 38
conductividad en forma predecible. Para los fines de este captulo, estos iones y la conductividad resultante se pueden considerar como intrnsecos al agua.
La presencia de iones extraos tambin afecta la conductividad del agua. Los iones extraos usados para determinar las especificaciones de conductividad que se describen a continuacin son los iones cloruro y amonio. En cuanto al nivel de impurezas inicas permitidas en el agua, la mayor proporcin corresponde a la conductividad del in cloruro ubicuo (en una concentracin terica final de 0,47 ppm cuando el cloruro constitua una prueba de calidad requerida en la USP 22 y en versiones
anteriores) y al in amonio (con un lmite de 0,3 ppm). Para mantener la electroneutralidad el nivel de impurezas permitido
incluye una cantidad balanceada de aniones (tales como cloruro, para contrarrestar el in amonio) y cationes (tales como sodio, para contrarrestar el in cloruro). Los iones extraos como los mencionados, pueden tener un efecto significativo en la
pureza qumica del agua y en la aptitud para su uso en aplicaciones farmacuticas.
El procedimiento en la seccin Agua a Granel est especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada, el Agua para Inyeccin, el Agua para Hemodilisis y el condensado de Vapor Puro. El procedimiento en la seccin Agua Estril
est especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada Estril, Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril
para Inhalacin y Agua Estril para Irrigacin.
Los procedimientos siguientes se deben realizar usando instrumental que haya sido calibrado, cuyas constantes de celda del
sensor de conductividad hayan sido determinadas con exactitud y cuya funcin de compensacin de temperatura haya sido
desactivada para la Etapa 1 del anlisis de Agua a Granel. Para las mediciones en lnea y fuera de lnea, la aptitud del instrumento para las pruebas de control de calidad depende tambin de los sitios de muestreo en el sistema del agua. Los sitios seleccionados para el instrumento de muestreo deben reflejar la calidad del agua empleada.
Captulos
ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO Y PARMETROS DE FUNCIONAMIENTO

La conductividad del agua debe medirse con exactitud usando instrumentos calibrados. Una medicin de la conductividad
elctrica consiste en la determinacin de la conductancia, G (o su inversa, la resistencia, R), del fluido entre y alrededor de los
electrodos. La conductancia (1/R) se ve directamente afectada por las propiedades geomtricas de los electrodos; es decir, la
conductancia es inversamente proporcional a la distancia (d) entre los electrodos y proporcional al rea (A) de los mismos. Esta
relacin geomtrica (d/A) se conoce como constante de celda, Q. Por consiguiente, la conductancia medida se normaliza para
la constante de celda a fin de determinar la conductividad, k, de acuerdo con la siguiente ecuacin:
conductividad, k (S/cm) = Q (cm1)/R (W)
Si fuera necesario, se deben ajustar y verificar la constante de celda y la medida de resistencia.
Constante de celda: La constante de celda debe conocerse con una aproximacin de 2%. La constante de celda puede ser
verificada directamente, usando una solucin de conductividad conocida o rastreable, o indirectamente, comparando la lectura del instrumento obtenida con el sensor de conductividad en cuestin con las lecturas obtenidas con un sensor de conductividad con constante de celda conocida o rastreable. Si fuera necesario, ajustar la constante de celda siguiendo el protocolo del
instrumento provisto por el fabricante del mismo. La frecuencia de la verificacin/calibracin se determina en funcin del diseo del sensor.
Medicin de resistencia: La calibracin (o verificacin) de la medicin de resistencia se logra reemplazando los electrodos
del sensor de conductividad con resistores de precisin que tengan estndares rastreables al NIST o a autoridades nacionales
equivalentes en otros pases (con una exactitud que no se aleje en ms de 0,1% del valor declarado) para obtener una respuesta de conductividad prevista del instrumento. La exactitud de la medicin de resistencia es aceptable si la conductividad
medida con el resistor rastreable se encuentra dentro de 0,1 mS/cm del valor calculado, de acuerdo con la ecuacin anterior.
Por ejemplo, el resistor rastreable es 50 kW y la constante de celda, Q, es 0,10 cm1. El valor calculado es 2,0 106 S/cm 2,0
mS/cm. El valor medido debe ser 2,0 0,1 mS/cm. El instrumento debe tener una resolucin mnima de 0,1 mS/cm en el intervalo ms bajo.
Los valores de conductividad deseados deben basarse en el tipo de agua que se va a analizar y deben ser iguales o menores
que el lmite de conductividad del agua para dicho tipo de agua. Se pueden incluir mltiples circuitos de medicin en el medidor o el sensor y cada circuito puede requerir de verificacin o calibracin independiente antes del uso. La frecuencia de la
recalibracin se determina en funcin del diseo del instrumento.
Verificacin del sistema: La constante de celda del sensor del usuario se puede determinar con el sistema de medicin de
resistencia del usuario, o la constante de celda se puede determinar con un sistema de medicin de resistencia independiente.
Si la constante de celda se determina con un sistema de medicin de resistencia independiente, se recomienda que el usuario
verifique que el sensor ha sido apropiadamente conectado al sistema de medicin de resistencia para asegurar un funcionamiento adecuado. La verificacin puede hacerse comparando los valores de conductividad (o resistividad) presentados en la
pantalla del equipo de medicin, con los de un dispositivo externo calibrado medidor de conductividad. Los dos valores de
conductividad (o resistividad) no compensados por temperatura deben ser equivalentes entre s o tener una aproximacin de
5%, o bien deben tener una diferencia que sea aceptable con respecto a la criticidad del agua producida y/o a los intervalos
de conductividad del agua en los que se realizaron las mediciones. Los dos sensores de conductividad se deben posicionar lo
suficientemente juntos para medir la misma muestra de agua a la misma temperatura y calidad del agua.
Compensacin de temperatura y mediciones de temperatura: Debido a que la temperatura tiene un efecto sustancial sobre las lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas altas y bajas, muchos instrumentos corrigen automticamente
Pruebas Fsicas / 645 Conductividad del Agua 469
USP 38
la lectura real para mostrar el valor que tericamente se observara a la temperatura nominal de 25. Normalmente, la correccin se efecta mediante un sensor de temperatura incluido junto con el sensor de conductividad y un algoritmo informtico
incluido en el instrumento. Este algoritmo de compensacin de temperatura puede no ser exacto para los distintos tipos de
agua e impurezas. Por esta razn, los valores de conductividad usados en la prueba de la Etapa 1 para Agua a Granel son mediciones no compensadas por temperatura. Otras pruebas de conductividad que se especifican para la medicin a 25 pueden
usar mediciones compensadas por temperatura o mediciones no compensadas por temperatura.
Se requiere una medicin de temperatura para la prueba de la Etapa 1 o para las otras pruebas a 25. sta puede realizarse
usando el sensor de temperatura incluido en el sensor de la celda de conductividad. Tambin es aceptable un sensor de temperatura externo colocado cerca del sensor de conductividad. La exactitud de las mediciones de temperatura debe ser de 2.
AGUA A GRANEL
El procedimiento y los lmites de prueba en esta seccin estn destinados para Agua Purificada, Agua para Inyeccin, Agua
para Hemodilisis, el condensado de Vapor Puro y cualquier otra monografa que especifique esta seccin.
Se trata de un mtodo de prueba de tres etapas para realizar el anlisis en lnea o fuera de lnea. La prueba de conductividad
en lnea proporciona mediciones en tiempo real y oportunidades para controlar, tomar decisiones e intervenir en el proceso en
tiempo real. Se deben tomar las precauciones necesarias en la recoleccin de muestras de agua para las mediciones de conductividad fuera de lnea. El mtodo de muestreo, el envase de muestreo y los factores ambientales, tales como la concentracin ambiental de dixido de carbono y los vapores orgnicos pueden afectar la muestra. El procedimiento se puede iniciar en
la Etapa 2 si se prefiere el anlisis fuera de lnea.
ETAPA 1
La Etapa 1 est destinada para la medicin en lnea o puede realizarse fuera de lnea en un recipiente apropiado.
1. Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando una lectura de conductividad que no haya sido compensada por temperatura.
2. Mediante la Tabla 1, determinar el valor de temperatura que no sea mayor que la temperatura medida, es decir, la temperatura inmediatamente inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el lmite. [NOTANo interpolar.]
3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en la etapa 2, el agua cumple
con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor especificado en la tabla, pasar a la
Etapa 2.
Tabla 1. Etapa 1Requisitos de Temperatura y Conductividad
(slo para mediciones de conductividad no compensadas por temperatura)
Temperatura
Requisito de Conductividad (mS/cm)
0,6
0,8
10
0,9
15
1,0
20
1,1
25
1,3
30
1,4
35
1,5
40
1,7
45
1,8
50
1,9
55
2,1
60
2,2
65
2,4
70
2,5
75
2,7
80
2,7
85
2,7
90
2,7
95
2,9
100
3,1
Captulos
Procedimiento
470 645 Conductividad del Agua / Pruebas Fsicas
USP 38
ETAPA 2
4. Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 1, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se
observa la conductividad de manera peridica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorcin de
dixido de carbono atmosfrico) es menos de 0,1 mS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. [NOTALas mediciones de
conductividad en esta etapa pueden ser compensadas por temperatura a 25 o no compensadas por temperatura.]
5. Si la conductividad no es mayor de 2,1 mS/cm, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la
conductividad es mayor de 2,1 mS/cm, pasar a la Etapa 3.
ETAPA 3
Captulos
6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos aproximadamente de haber efectuado la determinacin de conductividad
en el paso 5, manteniendo la temperatura de la muestra a 25 1. Agregar una solucin saturada de cloruro de potasio a la
misma muestra de agua (0,3 mL por cada 100 mL de la muestra de prueba) y determinar el pH con una aproximacin de 0,1
unidades de pH segn se indica en pH 791.
7. Empleando la Tabla 2, determinar el lmite de conductividad en el valor de pH medido. Si la conductividad medida en el
paso 4 no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en el paso 6, el agua cumple con los requisitos de la
prueba de conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor o si el pH est fuera del intervalo de 5,07,0, el
agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad.
Tabla 2. Etapa 3Requisitos de pH y Conductividad
(slo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmsfera)
pH
Requisito de Conductividad (mS/cm)
5,0
4,7
5,1
4,1
5,2
3,6
5,3
3,3
5,4
3,0
5,5
2,8
5,6
2,6
5,7
2,5
5,8
2,4
5,9
2,4
6,0
2,4
6,1
2,4
6,2
2,5
6,3
2,4
6,4
2,3
6,5
2,2
6,6
2,1
6,7
2,6
6,8
3,1
6,9
3,8
7,0
4,6
AGUA ESTRIL
El procedimiento y los lmites de prueba estn destinados para Agua Purificada Estril, Agua Estril para Inyeccin, Agua Estril
para Inhalacin y Agua Estril para Irrigacin y cualquier otra monografa que especifique esta seccin. Las aguas estriles proceden de Agua Purificada o Agua para Inyeccin y por lo tanto se ha determinado que cumplen con los requisitos para Agua a
Granel antes de ser envasadas. La especificacin proporcionada representa el valor mximo de conductividad permitido, tomando en cuenta la limitacin del mtodo de medicin y una razonable lixiviacin (leaching) del envase. La eleccin de la
especificacin y del volumen de muestreo se debe definir y validar de acuerdo con el propsito previsto del agua.
USP 38
Pruebas Fsicas / 651 Temperatura de Solidificacin 471
Procedimiento
Obtener una muestra que refleje de manera adecuada la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el
envase para homogeneizar la muestra de agua. Se pueden requerir varios envases para recolectar suficiente agua para el anlisis.
Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura,
si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 1, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se observa la conductividad de manera peridica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorcin de dixido
de carbono atmosfrico) es menos de 0,1 mS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad.
Para envases con un volumen nominal de 10 mL o menos, si la conductividad no es mayor que 25 mS/cm, el agua cumple
con los requisitos. En envases con un volumen nominal mayor que 10 mL, si la conductividad no es mayor que 5 mS/cm, el
agua cumple con los requisitos.
651 TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIN
Aparato de Temperatura de Solidificacin
Captulos
La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado lquido al slido cuando se enfra es un ndice til de su pureza si se
libera calor al producirse la solidificacin, siempre que toda impureza presente se disuelva slo en el lquido y no en el slido.
Las sustancias puras tienen un punto de congelacin bien definido, pero generalmente las mezclas se congelan a diferentes
temperaturas. Para muchas mezclas, la temperatura de solidificacin, determinada siguiendo estrictamente los siguientes mtodos empricos, es un ndice til de su pureza. El mtodo para determinar las temperaturas de solidificacin que se describe
en este documento se aplica a sustancias que funden entre 20 y 150, que es el intervalo del termmetro usado en el bao.
La temperatura de solidificacin es el punto mximo (o en caso de no existir un mximo, el punto de inflexin) en la curva de
temperatura-tiempo.
AparatoEnsamblar un aparato similar al ilustrado, donde el recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 100
mm en el que se coloca un termmetro adecuado de intervalo corto, suspendido en el centro y un mezclador de alambre,
aproximadamente de 30 cm de largo, que se dobla en su extremo inferior en un anillo horizontal que rodea el termmetro.
Emplear un termmetro con un intervalo que no exceda de 30, graduado en divisiones de 0,1 y calibrado para una inmersin a 76 mm pero no usado a esa profundidad. La serie ASTM E1 89C a 96C es una serie disponible y adecuada de termmetros, que abarcan un intervalo desde 20 hasta +150. Se pueden usar otros aparatos para medir temperaturas siempre y
cuando estn validados para este procedimiento (ver Termmetros 21). Las dimensiones deben estar comprendidas entre
20% con respecto a las que se muestran en la figura.
Captulos
472 651 Temperatura de Solidificacin / Pruebas Fsicas
USP 38
El recipiente para la muestra se encuentra sostenido, mediante un corcho, dentro de un cilindro adecuado, impermeable al
agua, con un dimetro interno de aproximadamente 50 mm y 11 cm de longitud. A su vez, el cilindro se apoya en un bao
con una altura suficiente como para proporcionar una capa de no menos de 37 mm alrededor de los lados y del fondo del
cilindro. El bao externo tiene un termmetro apropiado.
ProcedimientoFundir la sustancia, si es un slido, a una temperatura que no exceda de 20 por encima del punto de
solidificacin esperado y verterla en el tubo de ensayo hasta una altura de 50 mm a 57 mm. Armar el aparato con el bulbo del
termmetro del tubo de ensayo inmerso en un punto medio entre la parte superior e inferior de la muestra en el tubo de
ensayo. Llenar el bao hasta aproximadamente 12 mm desde la parte superior del tubo con un lquido apropiado a una temperatura de 4 a 5 por debajo del punto de solidificacin esperado.
En caso de que la sustancia sea un lquido a temperatura ambiente, llevar a cabo la determinacin empleando un bao a
una temperatura de aproximadamente 15 por debajo del punto de solidificacin esperado.
Cuando la muestra de prueba est enfriada aproximadamente a 5 por encima del punto de solidificacin esperado, ajustar
el bao a una temperatura de 7 a 8 por debajo del punto de congelacin esperado. Revolver continuamente la muestra hasta terminar la prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo entre la parte superior e inferior de la muestra, a una velocidad constante de 20 ciclos completos por minuto.
Frecuentemente, la congelacin puede inducirse frotando las paredes internas del tubo de ensayo con el termmetro, o introduciendo un fragmento pequeo de la sustancia previamente solidificada. Un sobreenfriamiento pronunciado puede causar
una desviacin respecto del patrn normal de cambios de temperatura. Si esto ltimo ocurre, repetir la prueba, introduciendo
partculas pequeas del material en anlisis en forma slida a intervalos de 1 a medida que la temperatura se acerca al punto
de solidificacin esperado.
Registrar la lectura del termmetro del tubo de ensayo cada 30 segundos. Continuar revolviendo slo mientras baje gradualmente la temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva constante o comience a subir levemente. Continuar
registrando la temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos durante 3 minutos, despus de que la temperatura comience a caer nuevamente despus de haber permanecido constante.
El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas comprendidas dentro de un intervalo de 0,2 constituye la temperatura de solidificacin. Estas lecturas se encuentran cerca de un punto de inflexin o un mximo, en la curva de temperaturatiempo, que se produce despus de que la temperatura se vuelva constante o comience a subir y antes de que empiece a bajar
nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximacin de 0,1 constituye la temperatura de solidificacin.
659 REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO

(Este captulo ser oficial el 1 de mayo de 2016)
Eliminar lo siguiente:
Todas las monografas USP y NF deben contar con requisitos de envasado y almacenamiento. Las opciones de los distintos
tipos de envase, para la porcin de la leyenda referida a envasado, se consignan en este captulo. Asimismo, se proporcionan
definiciones como pautas para la seleccin y adaptacin de los requisitos de envasado de productos farmacuticos. Para los
ingredientes farmacuticos activos (API, por sus siglas en ingls), el envase de eleccin sera impermeable, bien cerrado o, si
fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado.
Cuando no se proporcionen instrucciones o limitaciones especficas en el etiquetado del artculo, los artculos deben protegerse de la humedad, congelacin y calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribucin. Los
frmacos estn exentos de dicha norma.USP38
ENVASADONT
Los envases no deben interactuar fsica o qumicamente con los artculos oficiales de modo que se ocasione el incumplimiento de sus requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza.
En este captulo se proporcionan opciones de los distintos tipos de envase. Para medicamentos e ingredientes farmacuticos activos, las opciones de envases son impermeable, bien cerrado, o si fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado. Para artculos que no sean frmacos ni medicamentos, para
NT
Es importante destacar que las operaciones referidas al "envasado" incluyen el envasado primario propiamente dicho, as como las operaciones de empacado
(envasado secundario) y embalaje (envasado terciario para el transporte).
USP 38
Pruebas Fsicas / 659 Requisitos de Envasado y Almacenamiento 473
los que no se proporcionan instrucciones o limitaciones especficas, los artculos deben protegerse de la humedad, la congelacin y el calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribucin.
Los requisitos farmacopeicos para el uso de envases especificados tambin se aplican a artculos envasados por el farmacutico u otro dispensador, a menos que la monografa individual indique algo diferente.USP38
DEFINICIONES GENERALES
Pueden aceptarse excepciones, slo en las condiciones descritas en el captulo Preparacin MagistralPreparaciones Estriles 797.
Captulos
Sistema de envasado (tambin referido como sistema de envasecierre): Se refiere al conjunto de los componentes de los
envases que contienen y protegen el artculo, e incluye los componentes de los envases primarios y los componentes de los
envases secundarios, si stos ltimos se utilizaran para ofrecer proteccin adicional.
Envases: Receptculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacutico activo, excipiente o forma farmacutica, y que est o puede estarUSP38 en contacto directo con el artculo. El envase inmediato o primario es aqul que est
en contacto directo con el artculo constantemente. El cierre es una parte del envase. El envase debe estar limpio antes de
llenarse. Puede ser necesario tomar precauciones y emplear procedimientos de limpieza especiales para asegurar que cada envase est limpio y que no se introduzca materia extraa en el artculo o sobre el mismo.USP38
Componentes del envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envasecierre, incluyendo el envase primario (p.ej.,
ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en
cartucho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos
internos; puertos de administracin; envolturas; accesorios de administracin; y etiquetas.
Componentes de los envases primarios: Componentes de los envases que estn en contacto directo o que pueden entrar
en contacto directo con el artculo.
Componentes de los envases secundarios (empaque): Componentes de los empaques que no estn y que no entrarn en
contacto directo con el artculo. USP38
Envase terciario (embalaje): Componentes de los envases que no estn en contacto directo con el artculo pero que facilitan su manipulacin y transporte para evitar daos derivados de la manipulacin fsica y de las condiciones de almacenamiento a las que se somete el artculo.
Materiales de construccin: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plstico, elastmeros, metal) usados para fabricar componentes de los envases (envases primarios, empaques y embalajes).
Envases
Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artcuUSP38 multidosis (o de dosis mltiple):
lo para administracin parenteral sin alterar la seguridad, el contenido, la calidad o la pureza de la porcin remanente.
Ver Envases Multidosis en Contenido en Envases para Inyectables 697.USP38
Envases
Sistemas de envasado que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo sin alteUSP38 de unidades mltiples:
rar la seguridad, la concentracin o potencia, la calidad o la pureza de la porcin remanente.
Envases
Sistemas de envasado que contienen una cantidad de un artculo destinado para administracin
USP38 unitarios:
como dosis nica o como un dispositivo terminado individual destinado para ser utilizado inmediatamente luego de la apertura del envase. Preferiblemente, el envase primario o el secundario, o el empaque protector utilizado debe estar diseado de
forma tal que se evidencie cualquier alteracin en el contenido.USP38
Envases
Envases monodosis son envases de medicacin estril para administracin parenteral (inyeccin
USP38 monodosis:
o infusin) que no estn sujetos a cumplir con los requisitos de los criterios de eficacia antimicrobiana. [NOTAnicamente
para esta definicin, el envase es sinnimo de sistema de envase y sistema de envasecierre.] Un envase monodosis est diseado para su uso en un paciente individual como una inyeccin/infusin individual.1 Un envase monodosis se etiqueta como
tal y debe incluir instrucciones de desecho apropiadas en la etiqueta, si hubiera espacio disponible. Los viales, ampollas y jeringas prellenadas son ejemplos de envases monodosis.USP38
Envases
Sistemas de envasado unitarios para un artculo destinado a su administracin como dosis
USP38 de dosis nica:
nica por una va que no sea la parenteral.
Envases
Sistemas de envasado que contienen una cantidad especfica de un artculo que est destiUSP38 de unidad de uso:
nado a dispensarse como tal, sin ninguna modificacin posterior, excepto la adicin de un etiquetado adecuado. El envase de
unidad de uso no se puede reenvasar para su venta.
Envases a granel para farmacias: Sistemas de envaseUSP38 de una preparacin estril para uso parenteral que contienen
muchas monodosis. El contenido est destinado para su uso en programas de preparacin de mezclas en farmacias y est restringido a la preparacin de mezclas para infusin o al llenado de jeringas estriles vacas con un dispositivo de transferencia
estril.
El cierre debe ser penetrado slo una vez despus de la reconstitucin, si fuera necesario,
USP38 usando un dispositivo de
transferencia estril adecuado o equipo dispensador que permita la dosificacin medida del contenido. El Envase a granel para
farmacias slo se emplear en un rea de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un rea equivalente
de aire limpio para preparacin magistral).
Captulos
474 659 Requisitos de Envasado y Almacenamiento / Pruebas Fsicas
USP 38
La nomenclatura Envase a granel para farmacias se limita a las formas farmacuticas denominadas Inyeccin, para Inyeccin
o Emulsin Inyectable, segn se establece en el captulo Nomenclatura 1121, Estructuras Generales de Nomenclatura.USP38
El envase a granel para farmacias, aunque contenga ms de una monodosis, est exento del lmite de volumen de 30 mL
para envases multidosis y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento
de microorganismos. Para requisitos de etiquetado, ver el captulo Etiquetado 7.USP38
Inyecciones de pequeo volumen: Una inyeccin queUSP38 se envasa en envases que declaran contener 100 mL o menos.
Inyecciones de gran volumen: UnaUSP38 inyeccin destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran contener ms de 100 mL.
Envases
Sistemas de envase diseados o construidos para cumplir con las normas de la ConsuUSP38 seguros para nios:
mer Product Safety Commission (Comisin de Seguridad del Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte
de nios (16 CFR 1700.20).
Envases
Sistemas de envase diseados o construidos para cumplir con las normas
USP38 adecuados para la tercera edad:
de la Consumer Product Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de personas de edad avanzada (16 CFR 1700.20).
Envases
Sistemas de envase que no pueden ser abiertos sin la destruccin
USP38 que evidencian su alteracin intencional:
evidente del sello o de alguna parte del sistema de envase. El envase que evidencia su alteracin intencional debe usarse para
un artculo estril destinado para uso oftlmico u tico, excepto cuando se trata de una preparacin magistral extempornea
para su dispensacin inmediata segn receta mdica. Los artculos destinados a la venta sin prescripcin mdica tambin deben cumplir, cuando corresponda, con los requisitos de la FDA relativos al etiquetado y envasado que evidencie la alteracin
intencional. El envase primario y/o el empaque o envase secundario, o el embalaje protector utilizado por fabricantes o distribuidores para todas las formas farmacuticas, salvo excepciones especficas, se disea, preferentemente para evidenciar cualquier alteracin en el contenido.
Envases hermticos: Sistemas de envase que impiden la penetracin del aire o cualquier otro gas en las condiciones usuales
o habituales de manejo, transporte, almacenamiento o distribucin.USP38
Envases
Sistemas de envase que protegen el contenidoUSP38 de la contaminacin por lquidos, sliUSP38 impermeables:
dos o vapores extraos; de la prdida del artculo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporacin en condiciones habituales o
usuales de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin, pudindose volver a cerrar de forma impermeable una vez
abierto. Cuando se especifique un envase impermeable, ste puede sustituirse con un envase hermtico para una sola dosis de
un artculo. [NOTACuando en una monografa individual se especifique el envasado y almacenamiento en un envase impermeable o bien cerrado, el envase usado para dispensar el artculo prescrito cumple con los requisitos en el captulo Envases
Pruebas de Desempeo 671.]USP38
Envases
Sistemas de envase que protegen el contenidoUSP38 de la contaminacin por slidos USP38
USP38 bien cerrados:
extraos y de la prdida del artculo en condiciones habituales o usuales de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin. Ver EnvasesPruebas de Desempeo 671.
Envases
Sistemas de envase que protegen el contenidoUSP38 de los efectos de la luz por medio
USP38 resistentes a la luz:
de las propiedades especficas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un
envase transparent e incoloro o translcido puede ser convertido en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o mediante el uso de un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible
el uso de la cubierta opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artculo se haya usado o administrado. Cuando en una monografa individual se indique proteger de la luz, se entiende que el artculo se debe conservar en un envase
resisitente a la luz. Ver el captulo EnvasesPruebas de Desempeo 671, Prueba de Transmisin de Luz.
Sistema de cierre negro o bandas negras: El uso de un sistema de cierre negro en un vial (es decir, una tapa de sobresello
negra y un casquillo negro para sostener el cierre elastomrico) o el uso de una banda o serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se reserva slo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyeccin y est prohibido
su uso en cualquier otra inyeccin. Ver el captulo Etiquetado 7.USP38
ENVASADO DE INYECTABLES
La validacin de la integridad del envasecierre debe demostrar la ausencia de la introduccin de contaminacin microbiana
y de impurezas fsicas o qumicas. Adems, se deben mantener las cantidades o concentraciones totales y relativas especificadas de solutos y vehculos frente a la exposicin a las condiciones extremas previstas en la fabricacin y procesamiento, almacenamiento, transporte y distribucin. Los cierres para envases multidosis deben permitir la extraccin del contenido sin retirar
o destruir el cierre. El cierre debe permitir la penetracin de una aguja y el cierre inmediato tras retirarla, protegiendo el envase
de la contaminacin. La validacin de la integridad del envasecierre del envase multidosis debe incluir una verificacin de que
un envase de ese tipo impide la contaminacin microbiana o la prdida del contenido del producto en las condiciones previstas de mltiples entradas y usos.
Los sistemas de envase para venoclisis en tndem (piggyback containers) son por lo general sistemas de envasecierre de
infusin intravenosa empleados para administrar una segunda infusin a travs de algn tipo de conector o a travs de un
USP 38
ENVASADO DE GASES MEDICINALES

Cilindro de gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metlico construido de acero o aluminio diseado para contener
gases medicinales a presin. Los gases medicinales incluyen Dixido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, xido
ntrico, xido Nitroso USP, Nitrgeno NF y Oxgeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad
de encaje pareado Pin-Index para dixido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, xido nitroso y oxgeno en cilindros de Tamao E o menor.
COMPONENTES RELACIONADOS
Muchos componentes relacionados se gradan para administracin en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante
garantizar que se provea el componente de dosificacin apropiado o que se especifique un componente para propsitos generales, como los descritos en esta seccin, para la administracin de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduaciones deben ser legibles e indelebles.
Los componentes relacionados graduados que se decriben en esta seccin son de uso general. Las marcas de graduacin
deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de uso, el error de volumen en el que se incurre al medir lquidos para la administracin de dosis individuales por
medio de dichos componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparacin lquida con la
que se usar el componente graduado. Pocas preparaciones lquidas comparten las mismas caractersticas superficiales y de
flujo. Por tanto, el volumen administrado vara considerablemente de una preparacin a otra.
Los polmeros e ingredientes agregados a los polmeros que se usan en la fabricacin de componentes relacionados deben
cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales), Ttulo 21, Indirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos).
Dosificador: Dispositivo de medicin que consiste en un vaso pequeo que se incluye en el envase de los artculos lquidos
orales o que se puede vender y comprar por separado.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava con un mango que se incluye en el envase de los artculos lquidos orales o que se puede vender y comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para medicamentos: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translcido que generalmente est equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artculos lquidos orales o se puede vender y
comprar por separado.
Aunque la capacidad de los goteros generalmente vara, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un dimetro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTAPocos lquidos medicinales comparten
Captulos
puerto inyector en el equipo de administracin del primer lquido, evitndose as la necesidad de inyectar en otro sitio al paciente. Los envases para venoclisis en tndem son tambin conocidos como envases de infusin secundaria.
El volumen de inyeccin en un sistema de envase monodosis proporciona la cantidad especificada para administracin parenteral nica y no debe ser superior a 1 L.
Las preparaciones destinadas para administracin intrarraqudea, intracisternal o peridural se envasan slo en sistemas de envase monodosis.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, un sistema de envase multidosis contiene un volumen de inyeccin suficiente para permitir la extraccin de no ms de 30 mL.
Las siguientes inyecciones estn exentas de la restriccin de 1 L de los requisitos anteriores relacionados con el envasado:
1. Inyecciones envasadas para uso extravascular como soluciones de irrigacin o dilisis peritoneal.
2. Inyecciones envasadas para uso intravascular como nutricin parenteral o como lquido de reemplazo o sustitucin para
ser administrado en forma continua durante una hemofiltracin.
Las inyecciones envasadas para uso intravascular que pudieran usarse como lquido durante una hemodilisis u otros procedimientos de reemplazo mediante administracin intermitente, continua o en bolo, deben cumplir con la restriccin de 1 L a
menos que se trate de una excepcin mencionada anteriormente. Cuando se declara que las inyecciones estn destinadas para
uso veterinario, stas estn exentas de los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las limitaciones para sistemas de envase monodosis y de las limitaciones de volumen para los envases multidosis.
Envases para slidos estriles: Los envases, incluyendo los cierres, para slidos secos destinados para inyeccin no deben
presentar ninguna interaccin fsica o qumica con la preparacin que altere de alguna manera la concentracin o potencia, la
calidad o la pureza ms all de los requisitos oficiales, en condiciones habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso. Un sistema de envase para un slido estril debe permitir la adicin de un disolvente adecuado y la extraccin de
porciones de la solucin o suspensin resultante de tal modo que se mantenga la esterilidad del producto. Cuando la Valoracin en una monografa indica un procedimiento para la Solucin muestra, donde se deba tomar el contenido total extrable de
un sistema de envase monodosis con una jeringa y aguja hipodrmicas, se extraer ese contenido en la forma ms completa
posible con una jeringa hipodrmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y
equipada con una aguja nmero 21 de una longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la precaucin de expeler
cualquier burbuja de aire, y se descargar en un recipiente para dilucin y valoracin.USP38
USP 38
las mismas caractersticas superficiales y de flujo con el agua, por lo que el tamao de las gotas vara considerablemente de
una preparacin a otra.]
Jeringa para administracin oral: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo y un mbolo fabricados con material
de plstico rgido y transparente o translcido adecuado y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artculos lquidos orales o se puede vender y comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artculo lquido directamente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un
tamao, forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El
cuerpo puede estar graduado.
Cucharita de t: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava poco profunda, de forma ovalada o redonda,
que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de t contiene 4,93 0,24 mL. Para la administracin de artculos, se puede considerar que la cucharadita de t representa un volumen de 5 mL.
Los artculos destinados para administracin mediante cucharita de t se deben formular tomando en cuenta una dosificacin en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibracin basada en una cucharadita de t, el componente usado para administrar artculos lquidos deber liberar 5 mL. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa
aceptable a la cucharita de t graduada descrita en este captulo.
Captulos
LEY DE ENVASADO PARA LA PREVENCIN DE ENVENENAMIENTO O PPPA (Poison

Prevention Packaging Act)
Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayora de los medicamentos de administracin por va oral para humanos de venta bajo receta, medicamentos de administracin por va oral controlados, algunos medicamentos de administracin
por va oral de venta sin receta mdica, algunos suplementos dietticos y para muchas preparaciones farmacuticas de venta
libre para proteger al pblico de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR
1700.14).
El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR
1700.15 y 16 CFR 1700.16) las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los
que no se cierran y los de dosis nica.
No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los
fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medicamento ha de ser reenvasado por el farmacutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pueden dispensar en envases que no sean seguros para nios si el comprador lo solicita o si una receta vlida as lo indica (15
U.S.C. 1473).
Los fabricantes o envasadores de preparaciones farmacuticas de venta libre reglamentados por la PPPA estn autorizados a
envasar un tamao de producto en envases que no sean seguros para nios siempre que tambin provean envases especiales
de tamao habitual. Los envases que no sean seguros para nios requieren un etiquetado especial (16 CFR 1700.5).
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
En algunas monografas se establecen instrucciones especficas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la
temperatura o humedad a las que se debe almacenar y transportar el artculo. Estas condiciones se aplican excepto cuando la
etiqueta del artculo indica condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se
proporcionan condiciones de almacenamiento especficas en la monografa individual, pero la etiqueta de un artculo establece
condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se deben aplicar. USP38
Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 25 y 10 (13 y 14 F).
Refrigerador: Es un lugar froUSP38 con una temperatura mantenida entre 2 y 8 (36 y 46 F).
Fro: Toda temperatura que no exceda de 8 (46 F).
Fresco: Toda temperatura entre 8 y 15 (46 y 59 F). [NOTACuando se indique que un artculo debe almacenarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la
monografa individual.]
Temperatura ambiente: La temperatura predominante en un rea de trabajo.
Temperatura ambiente controlada: La temperatura mantenida termostticamente que abarcaUSP38 la prevalente en el
ambiente usual de trabajo de 2025 (6877 F). Tambin se deben cumplir las siguientes condiciones.
La temperatura cintica media no debe exceder de 25.
USP38 Se permiten desviaciones entre 15 y 30 (59 y 86 F) experimentadas en farmacias, hospitales y depsitos, y durante el transporte. Siempre queUSP38 la temperatura cintica media no
exceda de 25, se permiten elevaciones pasajerasUSP38 de temperatura no superiores a 40 siempre que no duren msUSP38
de 24 horas. Slo se permiten elevaciones superiores a 40 cuando el fabricante as lo instruye.
Los artculos pueden etiquetarse para almacenamiento a temperatura ambiente controlada o hasta 25, u otra referencia
escrita con base en la misma temperatura cintica media.
USP 38
Un artculo para el que se indique almacenamiento a Temperatura ambiente controlada puede almacenarse o distribuirse alternativamente en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual o en la
etiqueta.
Clido (tibio): Toda temperatura entre 30 y 40 (86 y 104 F)
Calor excesivo: Toda temperatura por encima de 40 (104 F)
Lugar seco: El trmino lugar seco se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20
(68 F) o de la presin de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinacin puede hacerse por medicin directa en el lugar o basndose en informacin de las condiciones climticas. La determinacin se basa en no menos de 12 mediciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estacin del ao, durante un ao, o si los registros los
demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artculo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa
siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase
que haya sido validado para proteger al artculo del vapor hmedo, incluyendo el almacenamiento a granel.
Proteccin de la congelacin: Cuando adems del riesgo de rotura del envase, la congelacin de un artculo pueda ocasionar la prdida de contenido o potencia, o la alteracin destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artculo de la congelacin.
Proteccin de la luz: Cuando la luz pueda ocasionar la prdida de contenido o potencia de un artculo, o la alteracin destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artculo de la luz.
659 REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO
ENVASES
El envase no debe interaccionar fsica o qumicamente con los artculos oficiales de modo que se ocasionen fallas en el cumplimiento de los requisitos de seguridad, identidad, contenido, calidad o pureza de dichos artculos. Este captulo provee definiciones para envases y almacenamiento.
DEFINICIONES GENERALES
Sistema de Envase (tambin referido como sistema de envasecierre): Se refiere al conjunto de los componentes del envase
que contienen y protegen al artculo, e incluye los componentes del envase primario y los componentes del envase secundario,
si ste ltimo se utilizara para ofrecer proteccin adicional.
Envase Primario: Receptculo que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacutico activo, excipiente o forma
farmacutica, y que est en contacto directo con el artculo.
Componentes del Envase: Cualquier parte del envase o del sistema de envasecierre, incluido el envase primario (p.ej., ampollas, jeringas prellenadas, viales, frascos); el recubrimiento interno del envase primario (p.ej., recubrimiento interno en cartucho tubular); el cierre (p.ej., tapas de rosca, tapones); los casquillos y sobresellos; recubrimiento interno del cierre; sellos internos; puertos de administracin; envolturas; accesorios de administracin; y etiquetas.
Componentes Primarios de los Envases: Componentes de envases que estn en contacto directo o que pueden entrar en
contacto directo con el artculo.
Componentes Secundarios de los Envases: Componentes de envases que no estn y que no entrarn en contacto directo
con el artculo, pero que pueden proveer proteccin adicional.
Envase Terciario (embalaje): Componentes de envases que no estn en contacto directo con el artculo pero que facilitan
su manipulacin y transporte para evitar daos derivados de la manipulacin fsica y de las condiciones de almacenamiento a
las que se somete el artculo.
Captulos
(Este captulo ser oficial hasta el 30 de abril de 2016)

Todas las monografas USP y NF deben contar con requisitos de envasado y almacenamiento. Las opciones de los distintos
tipos de envase, para la porcin de la leyenda referida a envasado, se consignan en este captulo. Asimismo, se proporcionan
definiciones como pautas para la seleccin y adaptacin de los requisitos de envasado de productos farmacuticos. Para los
ingredientes farmacuticos activos (API, por sus siglas en ingls), el envase de eleccin sera impermeable, bien cerrado o, si
fuera necesario, resistente a la luz. Para los excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volmenes (cuyos envases pueden ser desde tambores a vagones cisterna), el envase bien cerrado es, por defecto, el envase apropiado.
Cuando no se proporcionen instrucciones o limitaciones especficas en el etiquetado del artculo, los artculos deben protegerse de la humedad, congelacin y calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribucin. Los
frmacos estn exentos de dicha norma.
Captulos
USP 38
Materiales de Construccin: Se refiere a los materiales (p.ej., vidrio, plstico, elastmeros, metal) usados para fabricar componentes de envases.
Envases Multidosis (o de dosis mltiple): Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo para
administracin parenteral sin alterar la seguridad, contenido, calidad o pureza de la porcin remanente. Ver Envases Multidosis
en Inyectables 1, Determinacin del Volumen de Inyeccin en los Envases.
Envases de Unidades Mltiples: Sistemas de envases que permiten retirar porciones sucesivas de un artculo sin alterar la
seguridad, contenido, calidad o pureza de la porcin remanente.
Envases Unitarios: Sistemas de envases que contienen una cantidad de un artculo destinado para administracin como dosis nica o un dispositivo terminado individual destinado para un solo uso.
Envases Monodosis (ver tambin Inyectables 1, Envases para Inyecciones): Envases unitarios para un artculo destinado a su
administracin parenteral. Deben ser etiquetados como envases monodosis. ERR (01-dic-2014) Entre los ejemplos de envases monodosis se incluyen jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusin y envases con cierres sellados cuando se los
etiqueta como tales.
Envases de Dosis nica: Sistemas de envases unitarios para un artculo destinado a su administracin como dosis nica por
una va que no sea parenteral.
Envases de Unidad de Uso: Sistemas de envases que contienen una cantidad especfica de un artculo que est destinado a
dispensarse como tal, sin ninguna modificacin posterior excepto por la adicin de un etiquetado adecuado. El envase de Unidad de Uso no se puede reenvasar para su venta.
Envases a Granel Para Farmacias: Envases de una preparacin estril para uso parenteral que contienen muchas monodosis.
El contenido est destinado para su uso en programas de preparacin de mezclas en farmacias y est restringido a la preparacin de mezclas para infusin o al llenado de jeringas estriles vacas con un dispositivo de transferencia estril.
Luego de la reconstitucin, su cierre debe ser perforado slo una vez usando un dispositivo de transferencia estril o equipo
dispensador que permita la dosificacin medida del contenido. El Envase a Granel Para Farmacias slo se emplear en un rea
de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar (o un rea equivalente de aire limpio para preparacin magistral).
La nomenclatura Envase a Granel Para Farmacias se limita a Inyecciones, artculos para Inyeccin o Emulsiones Inyectables segn se define en Inyectables 1, Nomenclatura.
Los Envases a Granel Para Farmacias, aunque contengan ms de una monodosis, estn exentos del lmite de volumen de 30
mL para envases multidosis, y del requisito de contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para prevenir el crecimiento de microorganismos. Cuando un envase se ofrece como Envase a Granel Para Farmacias, la etiqueta debe (a) indicar
explcitamente Envase a Granel para FarmaciasNo usar para infusin directa, (b) contener o hacer referencia a informacin
sobre tcnicas apropiadas para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una declaracin que limite el tiempo
en el que el envase se puede usar una vez perforado el cierre, siempre que su contenido se haya mantenido en las condiciones
de almacenamiento declaradas.
Inyecciones de Pequeo Volumen: Inyeccin monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que
declaran contener 100 mL o menos.
Inyecciones de Gran Volumen: Inyeccin monodosis destinada para uso intravenoso y que se envasa en envases que declaran contener ms de 100 mL.
Envases Seguros para Nios: Sistemas de envases diseados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Product Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de
nios (16 CFR 1700.20).
Envases Adecuados para la Tercera Edad: Sistemas de envases diseados o construidos para cumplir con las normas de la
Consumer Product Safety Commission (Comisin de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases
por parte de personas de edad avanzada (16 CFR 1700.20).
Envases Que Evidencian su Alteracin Intencional: Sistemas de envases que no pueden ser abiertos sin la destruccin evidente del sello o de alguna otra parte del sistema de envase.
Envases Impermeables: Sistemas de envases que protegen a los artculos de la contaminacin por lquidos, slidos o vapores
extraos; de la prdida del artculo; y de eflorescencia, delicuescencia o evaporacin en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin. Ver EnvasesPruebas de Desempeo 671.
Envases Bien Cerrados: Sistemas de envases que protegen a los artculos de la contaminacin por slidos y lquidos extraos
y de la prdida del artculo en condiciones habituales o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribucin.
Ver EnvasesPruebas de Desempeo 671.
Envases Resistentes a la Luz: Sistemas de envases que protegen el contenido de los efectos de la luz por medio de las propiedades especficas del material que los compone, incluyendo los recubrimientos aplicados sobre los mismos. Un envase
translcido o incoloro y transparente puede convertirse en un envase resistente a la luz mediante una cubierta exterior opaca o
mediante un envase secundario, en cuyo caso la etiqueta del envase debe indicar que es imprescindible el uso de la cubierta
opaca o que se requiere el envase secundario hasta que el artculo se haya usado o administrado. Ver EnvasesPruebas de Desempeo 671, Prueba de Transmisin de Luz.
USP 38
ENVASES PARA GASES MEDICINALES

Cilindro de Gas: Un cilindro de gas es un sistema de envase metlico construido de acero o aluminio diseado para contener gases medicinales a presin. Los gases medicinales incluyen Dixido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, xido ntrico, xido Nitroso USP, Nitrgeno NF y Oxgeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad de encaje pareado Pin-Index para dixido de carbono, ciclopropano, helio, aire medicinal, xido nitroso y oxgeno en
cilindros de Tamao E o menor.
COMPONENTES RELACIONADOS
POISON PREVENTION PACKAGING ACT (Ley de Envases para Prevenir Envenenamientos o

PPPA)
Esta ley exige el uso de envases especiales para la mayora de los medicamentos de administracin por va oral para humanos de venta bajo receta, medicamentos de administracin por va oral controlados, algunos medicamentos de administracin
por va oral de venta sin receta mdica, algunos suplementos dietticos y para muchas preparaciones farmacuticas de venta
libre para proteger al pblico de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones (16 CFR
1700.14).
El envase primario para sustancias reglamentadas por la PPPA debe cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR
1700.15 y 16 CFR 1700.16, las cuales rigen para todos los tipos de envases, incluidos los que pueden volver a cerrarse, los
que no se cierran y los de dosis nica.
No se requieren envases especiales para los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Los
fabricantes o envasadores de medicamentos a granel de venta bajo receta no necesitan usar envases especiales si el medica-
Captulos
Muchos componentes relacionados se gradan para administracin en dosis determinadas. Es responsabilidad del fabricante
garantizar que se provea el componente de dosificacin apropiado o que se especifique un componente para propsitos generales, como los descritos en esta seccin, para la administracin de la dosis apropiada con la exactitud prevista. Las graduaciones deben ser visibles e indelebles.
Los componentes graduados que se decriben en esta seccin son de uso general. Las marcas de graduacin deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga contacto con la boca o producto. En condiciones ideales de
uso, el error de volumen en el que se incurre al medir lquidos para la administracin de dosis individuales por medio de dichos
componentes graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparacin lquida con la que se usar el
componente graduado. Pocas preparaciones lquidas comparten las mismas caractersticas superficiales y de flujo. Por tanto, el
volumen administrado vara considerablemente de una preparacin a otra.
Los polmeros e ingredientes agregados a los polmeros que se usan en la fabricacin de componentes relacionados deben
cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Code of Federal Regulations (Cdigo de Reglamentos Federales), Ttulo 21, Indirect Food Additives (Aditivos Alimentarios Indirectos).
Dosificador: Dispositivo de medicin que consiste en un pequeo vaso que se incluye en el envase de los artculos lquidos
orales o que se puede vender o comprar por separado.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava con un mango que se incluye en el envase de los artculos lquidos orales o que se puede vender o comprar por separado. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para Medicamentos: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translcido que generalmente est equipado con un bulbo depresible. Se incluye en el envase de artculos lquidos orales o se puede vender o
comprar por separado.
Aunque la capacidad de los goteros generalmente vara, el extremo de descarga debe ser una abertura redonda con un dimetro externo de aproximadamente 3 mm. El cuerpo puede estar graduado. [NOTAPocos lquidos medicinales comparten
las mismas caractersticas superficiales y de flujo que el agua, por lo que el tamao de las gotas vara considerablemente de
una preparacin a otra.]
Jeringa para Administracin Oral: Dispositivo de medicin que consiste en un cuerpo y un mbolo fabricados con material
de plstico rgido y transparente o translcido y que tiene un sello en el extremo. Se incluye en el envase de artculos lquidos
orales o se puede vender o comprar por separado. La jeringa debe expulsar una cantidad medida del artculo lquido directamente en la boca del paciente. Las alas para los dedos ubicadas en el extremo abierto del cuerpo deben tener un tamao,
forma y resistencia apropiados y deben permitir que la jeringa se pueda sostener de manera segura durante el uso. El cuerpo
puede estar graduado.
Cucharita de T: Dispositivo de medicin que consiste en una parte cncava poco profunda, de forma ovalada o redonda,
que se encuentra al final de un mango. Se ha establecido que una cucharadita de t contiene 4,93 0,24 mL. Para la administracin de artculos, se puede considerar que la cucharadita de t representa 5 mL.
Los artculos destinados para administracin mediante cucharita de t se deben formular tomando en cuenta una dosificacin en unidades de 5 mL, por lo que, siempre que se indique una calibracin basada en una cucharadita de t, el componente usado para administrar artculos lquidos deber liberar 5 mL. Una cuchara disponible en el hogar no es una alternativa
aceptable a la cucharita de t graduada descrita en este captulo.
USP 38
mento ha de ser reenvasado por el farmacutico. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la PPPA se pueden dispensar en envases inseguros para nios si el comprador lo solicita o si la receta original as lo indica (15 U.S.C. 1473).
Los fabricantes o envasadores de medicamentos de venta libre reglamentados por la PPPA estn autorizados a envasar un
tamao de producto en envases inseguros para nios siempre que provean el tamao de venta habitual en envases especiales.
Los envases inseguros para nios requieren un etiquetado especial (16 CFR 1700.5).
Captulos
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
En algunas monografas se establecen instrucciones especficas con respecto a las condiciones de almacenamiento, p.ej., la
temperatura o humedad, a las que se debe almacenar y transportar el artculo. Estas condiciones aplican excepto cuando la
etiqueta del artculo indique condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estabilidad. Cuando no se
proporcionan condiciones de almacenamiento especficas en la monografa individual, pero la etiqueta de un artculo establece
condiciones de almacenamiento basadas en estudios de estabilidad, tales instrucciones de almacenamiento son las que se deben aplicar. Las condiciones de almacenamiento vigentes para artculos se definen de acuerdo con los siguientes trminos.
Congelador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 25 y 10 (13 y 14 F).
Refrigerador: Es un lugar con una temperatura mantenida entre 2 y 8 (36 y 46 F).
Fro: Toda temperatura que no exceda de 8 (46 F).
Fresco: Toda temperatura entre 8 y 15 (46 y 59 F). [NOTACuando se indique que un artculo debe almacenarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, en un refrigerador, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.]
Temperatura Ambiente: La temperatura predominante en un rea de trabajo.
Temperatura Ambiente Controlada: La temperatura mantenida entre 20 y 25 (68 y 77 F) prevalente en el ambiente
usual de trabajo. Tambin se deben cumplir las siguientes condiciones:
La temperatura cintica media no debe exceder de 25. La temperatura cintica media es un valor calculado que corresponde a la temperatura isotrmica que simula los efectos no isotrmicos de las variaciones de temperatura de almacenamiento.
Se permiten desviaciones entre 15 y 30 (59 y 86 F) experimentadas en farmacias, hospitales y depsitos y durante el
transporte, siempre que la temperatura cintica media no exceda de 25.
Se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40 siempre que no duren ms de 24 horas. Slo se permiten elevaciones superiores a 40 cuando el fabricante as lo instruye.
Los artculos pueden etiquetar para almacenamiento a temperatura ambiente controlada o hasta 25, u otra referencia
escrita con base en la misma temperatura cintica media.
Un artculo para el que se indique almacenamiento a Temperatura Ambiente Controlada alternativamente puede almacenarse
o distribuirse en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual o en la
etiqueta.
Clido: Toda temperatura entre 30 y 40 (86 y 104 F).
Calor Excesivo: Toda temperatura por encima de 40
(104 F).
Lugar Seco: El trmino lugar seco se refiere a un sitio con una humedad relativa promedio que no exceda de 40% a 20
(68 F) o de la presin de vapor de agua equivalente a otras temperaturas. La determinacin puede hacerse por medicin directa en el lugar o basndose en informacin de las condiciones climticas. La determinacin se basa en por lo menos 12 mediciones espaciadas equitativamente y realizadas ya sea durante una estacin del ao, durante un ao, o si los registros los
demostrasen, durante el periodo de almacenamiento del artculo. Puede haber valores de hasta 45% de humedad relativa
siempre que el promedio no exceda de 40%. Se considera almacenamiento en un lugar seco al almacenamiento de un envase
que haya sido validado para proteger al artculo del vapor hmedo, incluyendo el almacenamiento a granel.
Proteccin contra la congelacin: Cuando adems del riesgo de rotura del envase, la congelacin de un artculo pueda
ocasionar la prdida de contenido o potencia, o la alteracin destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las
instrucciones apropiadas para proteger al artculo contra la congelacin.
Proteccin contra la Luz: Cuando la luz pueda ocasionar la prdida de contenido o potencia de un artculo, o la alteracin
destructiva de sus caractersticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones apropiadas para proteger al artculo de la luz.
Pruebas Fsicas / 660 EnvasesVidrio 481
USP 38
660 ENVASESVIDRIO
DESCRIPCIN
PRUEBAS ESPECFICAS
La Prueba de Vidrio Granulado en combinacin con la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidroltica determina el tipo
de vidrio. La resistencia hidroltica se determina por la cantidad de lcali que libera el vidrio en las condiciones especificadas.
Dicha cantidad de lcali es extremadamente pequea en el caso de los vidrios ms resistentes, por lo que es muy importante
prestar la debida atencin a todos los detalles de las pruebas y utilizar aparatos de alta calidad y precisin. La utilizacin de
material de referencia estndar (SRM, por sus siglas en ingls) de vidrio en forma rutinaria al realizar estas pruebas, ayuda a
asegurar la exactitud del mtodo. Los materiales de referencia para vidrio de borosilicato (SRM 623) y vidrio de soda, cal y
slice (SRM 622) estn disponibles en el Instituto Nacional de Normas y Tecnologa del gobierno de EE.UU. (National Institute
of Standards and Technology, NIST).USP38 Estas pruebas deben realizarse en un rea relativamente exenta de humos y polvo
excesivo. La seleccin de la prueba se presenta en la Tabla 1 y la Tabla 2.
Tabla 1. Determinacin de Tipos de Vidrio
Tipo de Envase
I, II, III
Prueba
Prueba de Vidrio
Granulado
Propsito
Distingue el vidrio de borosilicato Tipo I del vidrio de soda, cal y slice Tipos II y III
La superficie interna de los envases de vidrio es la superficie de contacto para las preparaciones farmacuticas, y la calidad de
esta superficie se determina mediante la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidroltica. La Prueba de Atacado de Superficie se puede usar para determinar si la alta resistencia hidroltica se debe a la composicin qumica o al tratamiento de la superficie. Como alternativa, la comparacin de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial se puede
usar en la Tabla 2.
Captulos
Los envases de vidrio para uso farmacutico estn destinados a entrar en contacto directo con los productos farmacuticos.
El vidrio usado para los envases farmacuticos es de borosilicato (neutro) o de soda, cal y slice. El vidrio de borosilicato contiene cantidades significativas de xido brico, xido de aluminio y xidos alcalinos y/o alcalino trreos en el entramado vtreo.USP38 Debido a su composicin qumica, el vidrio de borosilicato presenta una alta resistencia hidroltica y una alta resistencia al impacto trmico; est clasificado como vidrio Tipo I. El vidrio de soda, cal y slice es un vidrio de slice que contiene
xidos de metales alcalinos, principalmente xido de sodio y xidos alcalino trreos, principalmente xido de calcio en el
entramado vtreo.USP38 Debido a su composicin qumica, el vidrio de soda, cal y slice presenta una resistencia hidroltica moderada; est clasificado como vidrio Tipo III. El tratamiento adecuado de la superficie interna de los envases de vidrio de soda,
cal y slice Tipo III aumentar su resistencia hidroltica de un grado moderado a alto, cambiando as la clasificacin del vidrio a
Tipo II.
A continuacin, se presentan recomendaciones con respecto a la aptitud del tipo de vidrio para envases de productos farmacuticos, basadas en las pruebas de resistencia hidroltica. Los envases de vidrio Tipo I son adecuados para la mayora de los
productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo II son adecuados para la mayora de los productos
acuosos cidos y neutros para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo II se pueden usar para productos parenterales alcalinos siempre que se demuestre su aptitud mediante datos de estabilidad. Los envases de vidrio Tipo III por lo
general no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando se cuenta con datos de
pruebas de estabilidad adecuados que indican que el vidrio Tipo III es satisfactorio.
Se puede tratar la superficie interna de los envases de vidrio para mejorar su resistencia hidroltica. Asimismo, se puede tratar
la superficie externa de los envases de vidrio para reducir la friccin o para proteger de la abrasin o rotura. El tratamiento de
la superficie externa se realiza de manera que no contamine la superficie interna del envase.
El captulo Envases de VidrioEvaluacin de la Durabilidad de la Superficie Interna 1660 proporciona informacin sobre la
composicin qumica de los tipos de vidrio, la formacin de los envases de vidrio y los factores que afectan la durabilidad de la
superficie interna de los envases de vidrio. Este captulo tambin contiene metodologa recomendada para evaluar el potencial
que tiene un medicamento para ocasionar la formacin de partculas de vidrio y descamacin.USP38
El vidrio se puede colorear para que ofrezca proteccin de la luz mediante la adicin de pequeas cantidades de xidos de
metales y se analiza segn se indica en Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado. Un envase transparente e incoloro que se convierte en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver el captulo Requisitos de Envasado y
Almacenamiento 659, Envases Resistentes a la Luz) est exento de los requisitos de transmisin espectral. USP38
482 660 EnvasesVidrio / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 2. Determinacin de la Resistencia Hidroltica

de la Superficie Interna
Tipo de Envase
I, II, III
I, II
Prueba
Propsito
Prueba de Vidrio
Superficial
Determina la resistencia hidroltica de la superficie interna; distingue entre envases Tipo I y Tipo II con alta resistencia hidroltica, y envases
Tipo III con resistencia hidroltica moderada
Prueba de Atacado de Superficie o comparacin de

los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la
Prueba de Vidrio Superficial
Cuando resulta necesario, determina si la alta

resistencia hidroltica se debe al tratamiento de
la superficie interna o a la composicin qumica de los envases de vidrio
Los envases de vidrio deben cumplir con sus especificaciones respectivas de identidad y resistencia hidroltica superficial para
ser clasificados como vidrio Tipo I, II o III. Los envases Tipo I o Tipo II para productos parenterales acuosos se analizan para
determinar la presencia de arsnico extrable.
Resistencia Hidroltica
Captulos
APARATO
Autoclave: Para estas pruebas, usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 1, equipado con un termmetro, o un termopar calibrado que permita una medicin de la temperatura independente del sistema de autoclave; un registrador adecuado;USP38 un manmetro, una vlvula de ventilacin y una bandeja con suficiente capacidad para acomodar el
nmero de envases requeridos para llevar a cabo la prueba por encima del nivel del agua. Limpiar el autoclave y dems aparatos minuciosamente con Agua Purificada antes de usar.
Mortero y mano de mortero: Usar un mortero y una mano de mortero de acero endurecido, construidos de acuerdo con
las especificaciones de la Figura 1.
Figura 1. Mortero y mano de mortero para pulverizar vidrio.

Otros aparatos: Tambin se requiere un juego de tres tamices enmarcados, de malla cuadrangular de acero inoxidable N
25, 40 y 50, segn la numeracin de EE.UU. (ver Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por Tamizado Analtico
786, Tabla 1. Tamaos de las Series de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters); un agitador mecnico para tamices o
una mquina de tamizado que pueda usarse para tamizar los granos;USP38 un martillo magntico de acero templado; un imn
permanente; frascos de pesada; tapones; lmina metlica (p.ej. aluminio, acero inoxidable); un horno de aire caliente con capacidad de mantener una temperatura de 140 5; una balanza capaz de pesar hasta 500 g con una exactitud de 0,005 g; un
desecador y un bao ultrasnico.
USP 38
REACTIVOS
Agua exenta de dixido de carbono: Se trata de Agua Purificada que se ha calentado a ebullicin vigorosa durante 5 minutos o ms y se ha dejado enfriar protegindola de la absorcin de dixido de carbono de la atmsfera, o Agua Purificada con
una resistividad no menor de 18 Mohm-cm.
Solucin de rojo de metilo: Disolver 50 mg de rojo de metilo en 1,86 mL de hidrxido de sodio 0,1 M y 50 mL de etanol
(96%), y diluir con Agua Purificada hasta 100 mL. Para analizar la sensibilidad, agregar 100 mL de agua exenta de dixido de
carbono y 0,05 mL de cido clorhdrico 0,02 M a 0,1 mL de la solucin de rojo de metilo. La solucin resultante debe ser roja.
No se requieren ms de 0,1 mL de hidrxido de sodio 0,02 M para cambiar el color a amarillo. El cambio de color de rojo a
amarillo corresponde a un cambio en el pH de 4,4 (rojo) a 6,0 (amarillo).
Prueba de Vidrio Granulado

La Prueba de Vidrio Granulado se puede realizar sobre los envases o sobre las caas que se usan para fabricar envases tubulares de vidrio.
MTODO
Llenado y calentamiento: Pesar 10,00 g de los granos limpios y secos en dos matraces Erlenmeyer diferentes. Pipetear y
transferir 50 mL de Agua Purificada exenta de dixido de carbono a cada uno de los matraces Erlenmeyer (soluciones de prueba). Pipetear y transferir 50 mL de Agua Purificada exenta de dixido de carbono a un tercer matraz Erlenmeyer que servir
como blanco. Distribuir los granos de manera uniforme sobre las bases planas de los matraces agitando suavemente. Cubrir los
matraces con placas de vidrio neutro o papel aluminio enjuagados con Agua Purificada o con vasos de precipitados invertidos
de modo tal que las superficies internas de los vasos de precipitados se ajusten fcilmente a los bordes superiores de los matraces. Colocar los tres matraces en el autoclave que contiene el agua a temperatura ambiente y asegurar que se mantengan sujetos por encima del nivel del agua en el vaso. Realizar las siguientes operaciones:
1. Insertar el extremo de un dispositivo termomtrico calibrado en un envase lleno a travs de un agujero de aproximadamente el dimetro del termopar y conectarlo a un dispositivo de medicin externo. Si el envase es demasiado pequeo
para insertar un termopar, aplicar un termopar en un envase similar adecuado. Como alternativa, usar el termmetro interno del autoclave.
2. Cerrar firmemente la puerta o la tapa del autoclave, dejando la vlvula de venteo abierta.
3. Iniciar el registro automtico de la temperatura en funcin del tiempo y calentar el autoclave a una velocidad regular tal
que se libere vapor vigorosamente por la vlvula de venteo despus de 2030 minutos, y se mantenga la liberacin vigo-
Captulos
Enjuagar los envases a analizar con Agua Purificada y secar en el horno. Envolver al menos tres de los artculos de vidrio en
papel limpio y triturar hasta obtener dos muestras de aproximadamente 100 g cada una en trozos con un tamao de no ms
de 30 mm. Colocar en el mortero 3040 g de las piezas con un tamao de entre 10 y 30 mm tomadas de una de las muestras,
insertar la mano del mortero y golpearla firmemente con el martillo una sola vez. Como alternativa, transferir las muestras a un
molino de bolas, agregar las bolas y triturar el vidrio. Transferir el contenido del mortero o del molino de bolas al tamiz ms
grueso (N 25) de los tamices. Repetir la operacin hasta que todos los fragmentos hayan sido transferidos al tamiz. Agitar
manualmente los tamices durante un periodo breve y retirar el vidrio remanente en los tamices N 25 y N 40. Triturar de
nuevo estas porciones, repitiendo la operacin hasta que queden aproximadamente 10 g de vidrio en el tamiz N 25. Desechar esta porcin y la porcin que pase a travs del tamiz N 50. Volver a montar los tamices y agitar durante 5 minutos.
Transferir a un frasco de pesada los granos de vidrio que pasaron a travs del tamiz N 40 y que quedaron retenidos en el
tamiz N 50. Repetir el procedimiento de triturado y tamizado con la segunda muestra de vidrio hasta obtener dos muestras
de granos, cada una con un peso mayor de 10 g.
Extender cada muestra sobre una pieza de papel satinado limpio y extraer las partculas de hierro pasndo el imn sobre
ellas. Transferir cada muestra a un vaso de precipitados para limpiarlas. Agregar 30 mL de acetona a los granos en cada vaso
de precipitados y frotar los granos usando medios adecuados, como por ejemplo, una varilla de vidrio con punta de goma o
recubierta de plstico. Despus de frotar los granos, dejar que sedimenten y decantar la mayor cantidad de acetona posible.
Agregar 30 mL adicionales de acetona, agitar por rotacin suave, decantar y agregar una nueva porcin de acetona. Llenar el
vaso del bao ultrasnico con agua a temperatura ambiente, luego colocar el vaso de precipitados en la gradilla y sumergirlo
hasta que el nivel de acetona est al mismo nivel que el agua; aplicar ultrasonido durante 1 minuto. Agitar por rotacin suave
el vaso de precipitados, dejar que sedimente y decantar la mayor cantidad de acetona posible; luego repetir la operacin de
limpieza ultrasnica. Si persiste una leve turbidez, repetir la limpieza ultrasnica y el lavado con acetona hasta que la solucin
permanezca transparente. Agitar por rotacin suave y decantar la acetona. Secar los granos colocando el vaso de precipitados
primero sobre una placa tibia y luego calentando a 140 durante 20 minutos en un horno de secado. Transferir los granos
secos de cada vaso de precipitados a sendos frascos de pesada, tapar y enfriar en un desecador.
USP 38
rosa de vapor durante 10 minutos adicionales. Para los autoclaves que usan un generador de vapor, no es necesario mantener la temperatura durante 10 minutos a 100.
4. Cerrar la vlvula de venteo y aumentar la temperatura de 100 a 121 a una velocidad de 1/min durante 2022 minutos.
5. Mantener la temperatura a 121 1 durante 30 1 minutos, desde el momento en que se alcanza la temperatura de espera.
6. Enfriar hasta 100 a una velocidad de 0,5/min, ventilando para evitar la formacin de vaco, durante 4044 minutos.
7. No abrir el autoclave hasta que se haya enfriado hasta 95.
8. Retirar las muestras calientes del autoclave tomando las precauciones de seguridad apropiadas y enfriar las muestras con
cuidado a temperatura ambiente durante 30 minutos, evitando el impacto trmico.
USP38
Valoracin: Agregar 0,05 mL de Solucin de rojo de metilo a cada uno de los tres matraces. Valorar la solucin blanco inmediatamente con cido clorhdrico 0,02 M, luego valorar las soluciones de prueba hasta que el color sea idntico al obtenido
con la solucin blanco. Restar el volumen de valoracin para la solucin blanco del volumen de valoracin de las soluciones de
prueba. Calcular el valor medio de los resultados, en mL, de cido clorhdrico 0,02 M por gramo de la muestra. Repetir la
prueba si los valores ms altos y ms bajos observados difieren en ms del intervalo permisible provisto en la Tabla 3.
Captulos
Tabla 3. Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos

Media de los Valores Obtenidos para el Consumo de Solucin de cido
Clorhdrico por gramo de Granos de Vidrio (mL/g)
Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
No ms de 0,10
25% de la media
0,100,20
20% de la media
No menos de 0,20
10% de la media
USP38
NOTACuando se necesite obtener un punto final bien definido, decantar la solucin transparente en un matraz diferente
de 250 mL. Enjuagar los granos agitando por rotacin suave con tres porciones de 15 mL de agua exenta de dixido de carbono y agregar los lavados a la solucin principal. Agregar 0,05 mL de la Solucin de rojo de metilo. Valorar y calcular segn se
indic anteriormente. En este caso, agregar tambin 45 mL de Agua Purificada exenta de dixido de carbonoUSP38 y 0,05 mL
de Solucin de rojo de metilo a la solucin blanco.
LMITES
El volumen no excede los valores indicados en la Tabla 4.USP38

Tabla
4.
USP38
Lmites de Prueba para la Prueba de Vidrio Granulado

Volumen Mximo de HCl 0,02 M por g de Vidrio de Prueba (mL)
Volumen de Llenado (mL)

Todos
Tipo I
Tipos II y III
0,1
0,85
Prueba de Vidrio Superficial

DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE LLENADO
El volumen de llenado es el volumen de Agua Purificada que se debe agregar al envase para los fines de la prueba. Para
viales, frascos, cartuchos y jeringas, el volumen de llenado es 90% de la capacidad de desbordamiento. Para ampollas, se refiere al volumen hasta la altura del hombro.
Viales y frascos: Seleccionar seis viales o frascos secos del lote de muestra, o tres si su capacidad excede de 100 mL, y eliminar toda suciedad o residuo. Pesar los envases vacos con una exactitud de 0,1 g. Colocar los envases sobre una superficie
horizontal y llenarlos con Agua Purificada hasta aproximadamente el borde superior, evitando el desbordamiento y la introduccin de burbujas de aire. Ajustar los niveles de lquido hasta la lnea de desbordamiento. Pesar los envases llenos para obtener
la masa de agua expresada con dos decimales para envases con un volumen nominal menor o igual a 30 mL, y expresada con
un decimal para envases con un volumen nominal mayor de 30 mL. Calcular el valor medio de la capacidad de desbordamiento en mL y multiplicarlo por 0,9. Este volumen, expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de envases
particular.
Cartuchos y jeringas: Seleccionar seis jeringas o cartuchos secos y sellar la pequea abertura (la boca de los cartuchos; el
cierre Luer o la aguja insertada de las jeringas), usando un material inerte. Determinar la capacidad de desbordamiento media
y el volumen de llenado de acuerdo con Viales y frascos.
Ampollas: Colocar al menos seis ampollas secas sobre una superficie horizontal plana y llenarlas con Agua Purificada usando
una bureta hasta que el agua alcance el punto A, donde el cuerpo de la ampolla comienza a estrecharse para formar el hombro de la ampolla (ver la Figura 2). Leer las capacidades, expresadas con dos decimales y calcular el valor medio. Este volumen,
USP 38
expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de ampollas particular. El volumen de llenado se puede determinar tambin por peso.
Figura 2. Volmenes de llenado de ampollas hasta el punto A.

PRUEBA
Tabla
5.
USP38
Volumen de SolucinUSP38 de Prueba y

Nmero de Valoraciones
Volumen de Llenado
(mL)
Volumen de SolucinUSP38 de
Prueba
para Una Valoracin
(mL)
Nmero de Valoraciones
No ms de 3
25,0
330
50,0
30100
100,0
No menos de 100
100,0
MTODO
Limpieza: Eliminar cualquier residuo o polvo. Poco antes de la prueba, enjuagar cada envase cuidadosamente al menos dos
veces con Agua Purificada, llenar con Agua PurificadaUSP38 y dejar en reposo hasta su anlisis. Inmediatamente antes del anlisis, vaciar los envases; enjuagarlos una vez con Agua Purificada, luego con agua exenta de dixido de carbono y dejar que
escurran. Completar el procedimiento de limpieza dentro de los 2030USP38 minutos desde el momento del primer enjuage. Las ampollas cerradas se pueden entibiarUSP38 en un bao de agua o en una estufa de aire a no ms de 40USP38 durante aproximadamente 2 minutos antes de abrirlas para evitar el aumento de presin en el envase.USP38 No enjuagar antes de
analizar.
Llenado y calentamiento: Llenar los envases con agua exenta de dixido de carbono hasta el volumen de llenado. Cerrar los
envases en forma de cartucho o jeringas prellenables de manera adecuada con material que no interfiera con la prueba. Se
debe cerrar holgadamente cada envase, incluidas las ampollas, con un material inerte, como por ejemplo, una tapa de vidrio
neutro o papel aluminio previamente enjuagados con Agua Purificada. Colocar los envases en la bandeja del autoclave, el cual
contiene una cantidad de agua tal que la bandeja permanece por encima del agua. Cerrar el autoclave y realizar los pasos 1
8 del procedimiento de autoclavado segn se indica en la Prueba de Vidrio Granulado, excepto que la temperatura debe mantenerse a 121 1 durante 60 1 minutos. Si se usa un bao de agua para enfriar las muestras, procurar que el agua no entre
en contacto con las cubiertas de papel aluminio que las cubren sin ajustar, para evitar la contaminacin de la solucin de extraccin.USP38 Las soluciones de extraccin se analizan valorando de acuerdo con el mtodo descrito a continuacin.
Valoracin: Llevar a cabo la valoracin dentro de la primera hora despus de retirar los envases del autoclave. Combinar los
lquidos obtenidos de los envases y mezclar. Introducir el volumen prescrito (ver la Tabla 5USP38) en un matraz Erlenmeyer.
Transferir el mismo volumen de agua exenta de dixido de carbono a un segundo matraz similar para usarlo como blanco.
Agregar a cada matraz 0,05 mL de Solucin de rojo de metilo por cada 25 mL de lquido. Valorar el blanco con cido clorhdrico
0,01 M. Valorar la solucinUSP38 de prueba con el mismo cido hasta que el color de la solucin resultante sea igual que el
obtenido para el blanco. Restar el valor encontrado para la valoracin con el blanco, del encontrado para la solucinUSP38 de
prueba y expresar los resultados en mL de cido clorhdrico 0,01 M por 100 mL de solucinUSP38 de prueba. Expresar los
Captulos
La determinacin se lleva a cabo en envases sin usar. Los volmenes de la solucinUSP38 de prueba requeridos para la determinacin final se presentan en la Tabla 5.USP38
USP 38
valores de la valoracin menores de 1,0 mL con dos decimales; expresar los valores de la valoracin mayores o iguales a 1,0
mL con un decimal.
LMITES
Los resultados, o el promedio de los resultados si se realiza ms de una valoracin, no exceden los valores declarados en
la Tabla 6.USP38
Tabla
Captulos
Volumen de Llenado
(mL)
6.
USP38
Valores Lmite para la Prueba de Vidrio Superficial

Volumen Mximo de HCl 0,01 M por 100 mL de
(mL)
Solucin
USP38
de Prueba
Tipos I y II
Tipo III
No ms de 1
2,0
20,0
12
1,8
17,6
2 3
1,6
16,1USP38
35
1,3
13,2USP38
510
1,0
10,2
1020
0,80
8,1
2050
0,60
6,1
50100
0,50
4,8
100200
0,40
3,8
200500
0,30
2,9
No menos de 500
0,20
2,2
Prueba de Atacado de Superficie

La Prueba de Atacado de Superficie se usa de manera adicional a la Prueba de Vidrio Superficial cuando es necesario determinar
si se ha tratado la superficie de un envase y/o para distinguir entre envases de vidrio Tipo I y Tipo II. Como alternativa, se
puede usar la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial. La Prueba de Atacado de Superficie puede realizarse con
muestras sin usar o con muestras usadas en la Prueba de Vidrio Superficial.
MTODO
Viales y frascos: Los volmenes de solucinUSP38 de prueba requeridos se presentan en la Tabla 5.USP38 Enjuagar los envases dos veces con Agua Purificada, llenar hasta el punto de desbordamiento con una mezcla de un volumen de cido fluorhdrico y nueve volmenes de cido clorhdrico, y dejar en reposo durante 10 minutos. Vaciar los envases y enjuagar cuidadosamente cinco veces con Agua Purificada. Inmediatamente antes de la prueba, enjuagar una vez ms con Agua Purificada. Someter estos envases al mismo procedimiento de esterilizacin en autoclave y determinacin segn se indica en la Prueba de Vidrio
Superficial. Si los resultados son considerablemente ms altos que los obtenidos de las superficies originales (por un factor de
aproximadamente 510), significa que la superficie de las muestras ha sido tratada. [PrecaucinEl cido fluorhdrico es extremadamente agresivo. Incluso en cantidades pequeas puede ocasionar lesiones que ponen en riesgo la vida.]
Ampollas, cartuchos y jeringas: Aplicar el mtodo de prueba segn se indica en Viales y frascos. Si la superficie de las ampollas, cartuchos y jeringas no ha sido tratada, entonces los valores obtenidos sern ligeramente ms bajos que los obtenidos en
las pruebas previas. [NOTALa superficie interna de las ampollas, cartuchos y jeringas fabricadas con tubos de vidrio Tipo I
normalmente no se somete a tratamiento.]
DISTINCIN ENTRE ENVASES DE VIDRIO TIPO I Y TIPO II
Los resultados obtenidos de la Prueba de Atacado de Superficie se comparan con los obtenidos de la Prueba de Vidrio Superficial. Para envases de vidrio Tipo I, los valores obtenidos son cercanos a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial. Para
envases de vidrio Tipo II, los valores obtenidos exceden en gran medida a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial; y son
similares pero no mayores que los obtenidos para envases de vidrio Tipo III con el mismo volumen de llenado.
Pruebas Fsicas / 661 EnvasesPlsticos 487
USP 38
IMPUREZAS
Arsnico 211
Usar como Preparacin de Prueba 35 mL de agua de un envase de vidrio Tipo I o Tipo II, o para envases ms pequeos, 35
mL del contenido combinado de varios envases de vidrio Tipo I o Tipo II, preparados segn se indica en la Prueba de Vidrio
Superficial. El lmite no excede de 0,1 mg/g.
FUNCIONALIDAD
Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado
MTODO
Colocar la muestra en el espectrofotmetro con su eje cilndrico paralelo a la abertura y de tal manera que el haz de luz sea
perpendicular a la superficie de la seccin y que las prdidas por reflexin sean mnimas. Medir la transmisin de la muestra
con respecto al aire en la regin espectral 290450 nm, de manera continua o en intervalos de 20 nm.
LMITES
La transmisin espectral observada para envases de vidrio coloreado para productos no parenterales no excede del 10% a
cualquier longitud de onda en el intervalo 290450 nm, independientemente del tipo y capacidad del envase de vidrio. La
transmisin espectral observada en los envases de vidrio coloreado para productos parenterales no excede los lmites provistos
en la Tabla 7.USP38
Tabla
7.
USP38
Lmites de Transmisin Espectral para Envases de Vidrio Coloreado para Productos Parenterales
Volumen Nominal
(mL)
Percentaje Mximo de Transmisin Espectral a Cualquier Longitud de Onda entre

290 nm y 450 nm
Envases Sellados a la Llama
Envases con Cierres
No ms de 1
50
25
12
45
20
25
40
15
510
35
13
1020
30
12
No menos de 20
25
10
661 ENVASESPLSTICOS
INTRODUCCIN
El propsito de este captulo es proveer las normas para los materiales y componentes plsticos usados para envasar artculos
mdicos (productos farmacuticos, biolgicos, suplementos dietticos y dispositivos). Las definiciones que aplican a este captulo se suministran en Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659. Las normas y las pruebas para las propiedades funcionales de los envases y sus componentes se proporcionan en el captulo general EnvasesPruebas de Desempeo 671.
Captulos
APARATO Un espectrofotmetro UV-Vis, equipado con un detector de fotodiodos o un tubo fotomultiplicador acoplado con
una esfera de integracin.
PREPARACIN DE LA MUESTRA Romper el envase de vidrio o cortarlo con una sierra circular equipada con un disco abrasivo
en hmedo, como por ejemplo, un disco de carborundo o diamante. Seleccionar las secciones representativas del espesor de
la pared y cortarlas de un tamao adecuado para montarlas en un espectrofotmetro. Despus de cortar, lavar y secar cada
muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra es demasiado pequea para cubrir la abertura del portamuestras,
cubrir la porcin descubierta de la abertura con cinta o papel opaco, siempre que la longitud de la muestra sea mayor que la
de la abertura. Antes de colocar en el portamuestras, lavar, secar y limpiar la muestra con un pao para lentes. Montar la
muestra con ayuda de cera u otros medios adecuados, procurando no dejar huellas dactilares u otras marcas.
Captulos
488 661 EnvasesPlsticos / Pruebas Fsicas
USP 38
Adems de las normas suministradas aqu, los ingredientes agregados a los polmeros y los usados en la fabricacin de los
envases deben cumplir con los requisitos de las secciones aplicables del Cdigo de Reglamentaciones Federales (Code of Federal
Regulations), Ttulo 21, Aditivos Alimentarios Indirectos (Indirect Food Additives), o haber sido evaluados por la FDA y considerados sustancias aceptables para el uso indicado.
Los artculos plsticos se identifican y caracterizan por espectroscopa IR y calorimetra de barrido diferencial. En este captulo
se suministran normas para la identificacin y caracterizacin de los diferentes tipos de plstico y al final del captulo se proporcionan los procedimientos de anlisis. El grado de anlisis depende de si el envase tiene contacto directo con el producto farmacutico o no, y el riesgo se basa en la va de administracin.
Los plsticos estn compuestos por una mezcla de polmeros homlogos que tienen una gran variedad de pesos moleculares. Los plsticos pueden contener otras sustancias, como por ejemplo: residuos del proceso de polimerizacin, plastificantes,
estabilizadores, antioxidantes, pigmentos y lubricantes. Estos materiales cumplen con los requisitos para contacto con los alimentos segn se especifican en el Cdigo de Reglamentaciones Federales, Ttulo 21. Ciertos factores tambin pueden afectar la
aptitud de un plstico para un uso especfico, como por ejemplo la composicin del plstico, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el tratamiento de la superficie, los medios de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorcin y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacenamiento. Las pruebas de extraccin estn diseadas para caracterizar los
componentes extrados e identificar los posibles migrantes. El grado o alcance de las pruebas para las sustancias extrables del
componente depende del uso al que est destinado y al grado de riesgo de impactar en forma adversa la eficacia del artculo
farmacopeico (medicamento, producto biolgico, suplemento diettico o dispositivo). En este captulo se suministran pruebas
de extraccin de resinas especficas para polietileno, polipropileno, tereftalato de polietileno y tereftalato de polietileno G. Los
dems plsticos se analizan segn se indica para Pruebas Fisicoqumicas en la seccin Mtodos de Prueba. Efectuar la prueba de
Capacidad Amortiguadora solamente cuando los envases estn destinados a contener un producto lquido.
Los componentes plsticos usados para los productos de alto riesgo, como aquellos destinados para inhalacin, preparacin
parenteral y uso oftlmico se analizan usando las Pruebas Biolgicas en la seccin Mtodos de Prueba.
Los envases plsticos destinados a envasar productos preparados para uso parenteral cumplen con los requisitos para Pruebas Biolgicas y Pruebas Fisicoqumicas en la seccin Mtodos de Prueba. Las normas aplican tambin a envases de polietileno
usados para envasar formas farmacuticas secas para administracin oral que no estn destinadas a reconstituirse en solucin.
ENVASES DE POLIETILENO
Propsito
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta seccin caracterizan los envases y componentes producidos a partir de
polietileno de baja densidad o polietileno de alta densidad, de resinas homopolimricas o copolimricas, que se consideran
adecuados para envasar indistintamente formas farmacuticas secas para administracin oral que no estn destinadas a reconstituirse en solucin. Todos los componentes de polietileno se someten a anlisis por espectroscopa IR y calorimetra de barrido
diferencial. Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha de caducidad de una forma farmacutica especfica contenida en un envase de polietileno apropiado, se puede utilizar cualquier otro envase de polietileno que cumpla con
estos requisitos para envasar dicha forma farmacutica, siempre que los programas de estabilidad apropiados se amplen para
incluir el envase alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la forma farmacutica se mantienen hasta la fecha de caducidad.
Antecedentes
Ambos polietilenos, de baja y alta densidad, son polmeros de cadena larga sintetizados a partir de no menos de 85,0% de
etileno y no menos de 95,0% de olefinas totales en condiciones controladas de calor y presin mediante reacciones en las que
se emplean catalizadores. Los otros ingredientes olefnicos que se utilizan con mayor frecuencia son el buteno, el hexeno y el
propileno. El espectro de absorcin IR de ambos polietilenos, de alta y baja densidad, es tpico de los polietilenos y cada uno
de ellos tiene propiedades trmicas caractersticas. La densidad del polietileno de alta densidad est entre 0,941 g por cm3 y
0,965 g por cm3. La del polietileno de baja densidad est entre 0,850 g por cm3 y 0,940 g por cm3. Otras propiedades que
pueden afectar la aptitud del polietileno incluyen el mdulo de elasticidad, el ndice de fusin, la resistencia a las fisuras por
estrs ambiental y el grado de cristalinidad posterior al moldeado.
Polietileno de Alta Densidad

Espectroscopa InfrarrojaProceder segn se indica para Reflectancia Interna Mltiple en la seccin Mtodos de Prueba. El
espectro corregido de la muestra presenta bandas de absorcin principales slo a las mismas longitudes de onda que las del
espectro del ER Polietileno de Alta Densidad USP.
Calorimetra de Barrido DiferencialProceder segn se indica para Anlisis Trmico en la seccin Mtodos de Prueba. El
termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad USP, determinado de la misma mane-
USP 38
ra, y la temperatura de la endoterma (fusin) en el termograma de la muestra no difiere de la del Estndar de Referencia USP
en ms de 6,0.
Metales Pesados y Residuo No VoltilPreparar extractos de muestras para estas pruebas segn se indica para Pruebas
Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba, excepto que por cada 20,0 mL de Medio de Extraccin la porcin ser de 60 cm2, independientemente del espesor.
METALES PESADOSLos envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba.
RESIDUO NO VOLTILProceder segn se indica para Residuo No Voltil en Pruebas Fisicoqumicas, excepto que el Blanco ser el
mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferencia entre las cantidades obtenidas de la
Preparacin de la Muestra y del Blanco no excede de 12,0 mg cuando se emplea agua mantenida a una temperatura de 70
como Medio de Extraccin; no excede de 75,0 mg cuando se emplea alcohol mantenido a una temperatura de 70 como Medio
de Extraccin; y no excede de 100,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos a una temperatura de 50 como Medio de
Extraccin.
Componentes Usados en Contacto con Preparaciones Lquidas OralesProceder segn se indica para Capacidad Amortiguadora en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba.
Polietileno de Baja Densidad
ENVASES DE POLIPROPILENO
Propsito
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta seccin caracterizan los envases de polipropileno, producidos a partir de
homopolmeros o copolmeros, que se consideran adecuados para envasar indistintamente formas farmacuticas lquidas y slidas secas de administracin oral. Si se han realizado estudios de estabilidad adecuados para establecer la fecha de caducidad
de una forma farmacutica especfica contenida en un envase de polipropileno apropiado, se puede utilizar cualquier otro envase de polipropileno que cumpla con estos requisitos para envasar dicha forma farmacutica, siempre que los programas de
estabilidad apropiados se amplen para incluir el envase alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y
pureza de la forma farmacutica se mantienen hasta la fecha de caducidad.
Antecedentes
Los polmeros de propileno son polmeros de cadena larga sintetizados a partir de propileno o de propileno y otras olefinas
en condiciones controladas de calor y presin, empleando catalizadores. Entre las otras olefinas que se utilizan con mayor frecuencia se incluyen, a modo de ejemplo, el etileno y el buteno. Los polmeros de propileno, los ingredientes usados para fabricar los polmeros de propileno y los ingredientes utilizados en la fabricacin de los envases cumplen con los requisitos establecidos en las secciones pertinentes del Cdigo de Reglamentaciones Federales, Ttulo 21.
Ciertos factores, como por ejemplo la composicin del plstico, los procedimientos de procesamiento y limpieza, los medios
de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorcin, la adsorcin y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de alma-
Captulos
Espectroscopa InfrarrojaProceder segn se indica para Reflectancia Interna Mltiple en Mtodos de Prueba. El espectro
corregido de la muestra presenta bandas de absorcin principales slo a las mismas longitudes de onda que las del espectro
del ER Polietileno de Baja Densidad USP.
Calorimetra de Barrido DiferencialProceder segn se indica para Anlisis Trmico en Mtodos de Prueba. El termograma
de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad USP, determinado de la misma manera, y la temperatura de la endoterma (fusin) en el termograma de la muestra no difiere de la del Estndar de Referencia USP en ms de 8,0.
Metales Pesados y Residuo no VoltilPreparar extractos de muestras para estas pruebas segn se indica para Preparacin de la Muestra en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba, excepto que por cada 20,0 mL de Medio de Extraccin la porcin ser de 60 cm2, independientemente del espesor.
METALES PESADOSLos envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba.
RESIDUO NO VOLTILProceder segn se indica para Residuo No Voltil en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de
Prueba, excepto que el Blanco ser el mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferencia entre las cantidades obtenidas a partir de la Preparacin de la Muestra y del Blanco no excede de 12,0 mg cuando se emplea
agua mantenida a una temperatura de 70 como Medio de Extraccin; no excede de 75,0 mg cuando se emplea alcohol mantenido a una temperatura de 70 como Medio de Extraccin; y no excede de 350,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos a una temperatura de 50 como Medio de Extraccin.
Captulos
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cenamiento tambin pueden afectar la aptitud de un plstico para un uso especfico. Se deben realizar pruebas apropiadas
para determinar la aptitud de un polipropileno especfico.
El polipropileno posee un espectro de absorcin IR tpico y propiedades trmicas caractersticas. Su densidad est entre
0,880 g por cm3 y 0,913 g por cm3. Las propiedades de permeacin de envases moldeados de polipropileno pueden alterarse
incorporando polmero molido, segn la proporcin de material molido en el producto final. Otras propiedades que pueden
afectar la aptitud del polipropileno utilizado en envases de frmacos son: la permeabilidad al oxgeno y a la humedad, el mdulo de elasticidad, el ndice de flujo de fusin, la resistencia a las fisuras por estrs ambiental y el grado de cristalinidad despus del moldeado. Se deben cumplir los requisitos de esta seccin cuando el tipo de envase definido en la misma se usa para
envasar formas farmacuticas slidas secas y lquidas de administracin oral.
Espectroscopa InfrarrojaProceder segn se indica para Reflectancia Interna Mltiple en Mtodos de Prueba. El espectro
corregido de la muestra presenta bandas de absorcin principales slo a las mismas longitudes de onda que las del espectro
respectivo del ER Homopolmero de Polipropileno USP o del estndar de copolmero de polipropileno, determinados de manera similar.
Calorimetra de Barrido DiferencialProceder segn se indica para Anlisis Trmico en Mtodos de Prueba. La temperatura
de la endoterma (fusin) en el termograma no difiere de la del Estndar de Referencia USP para homopolmeros en ms de
6,0. La temperatura de la endoterma obtenida a partir del termograma de la muestra del copolmero de polipropileno no
difiere de la del estndar de copolmero de polipropileno en ms de 12,0.
Metales Pesados y Residuo no VoltilPreparar extractos de muestras para estas pruebas segn se indica para Preparacin de la Muestra en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de Prueba, excepto que por cada 20 mL de Medio de Extraccin la porcin ser de 60 cm2, independientemente del espesor.
METALES PESADOSLos envases cumplen con los requisitos para Metales Pesados en Pruebas Fisicoqumicas de la seccin Mtodos de Prueba.
RESIDUO NO VOLTILProceder segn se indica para Residuo No Voltil en la seccin Pruebas Fisicoqumicas en Mtodos de
Prueba, excepto que el Blanco ser el mismo disolvente usado en cada una de las siguientes condiciones de prueba: la diferencia entre las cantidades obtenidas a partir de la Preparacin de la Muestra y del Blanco no excede de 10,0 mg cuando se emplea
agua mantenida a una temperatura de 70 como Medio de Extraccin; no excede de 60,0 mg cuando se emplea alcohol mantenido a una temperatura de 70 como Medio de Extraccin; y no excede de 225,0 mg cuando se emplean hexanos mantenidos a una temperatura de 50 como Medio de Extraccin. Los envases cumplen con estos requisitos de Residuo No Voltil para
todos los medios de extraccin anteriormente mencionados. [NOTALos hexanos y el alcohol son inflamables. Para evaporar
estos disolventes, utilizar una corriente de aire con un bao de agua y utilizar una estufa a prueba de explosiones para secar el
residuo.]
FRASCOS DE TEREFTALATO DE POLIETILENO YENVASES DE TEREFTALATO DE

POLIETILENO G
Propsito
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta seccin caracterizan los frascos de tereftalato de polietileno (PET, por sus
siglas en ingls) y de tereftalato de polietileno G (PETG, por sus siglas en ingls), ambos adecuados para envasar formas farmacuticas lquidas de administracin oral. Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha de caducidad de
una forma farmacutica lquida de administracin oral especfica envasada en un frasco que cumple con los requisitos establecidos en este documento para frascos de PET o PETG, se puede utilizar cualquier otro frasco de PET o PETG que cumpla estos
requisitos para envasar dicha forma farmacutica siempre que los programas de estabilidad se amplen para incluir el frasco
alternativo a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la forma farmacutica se mantienen hasta la
fecha de caducidad. Efectuar las pruebas que correspondan a fin de determinar la aptitud de un frasco especfico de PET o
PETG para dispensar una forma farmacutica lquida de administracin oral en particular.
Antecedentes
Las resinas de PET son polmeros cristalinos de cadena larga preparados mediante condensacin de etilenglicol con tereftalato de dimetilo o cido tereftlico. Las resinas de copolmero de PET se preparan de manera similar, con la excepcin de que
tambin pueden contener una pequea cantidad de cido isoftlico (un porcentaje molar de no ms de 3) o 1,4-ciclohexanodimetanol (un porcentaje molar de no ms de 5). La polimerizacin se realiza en condiciones controladas de calor y vaco,
empleando catalizadores y estabilizadores.
Las resinas de copolmero de PET tienen propiedades fsicas y espectrales similares a las del PET y a los efectos prcticos se las
considera como PET. Las pruebas y especificaciones que se proporcionan en esta seccin para caracterizar a las resinas y los
frascos de PET tambin se aplican a las resinas de copolmeros de PET y a los frascos fabricados con stas.
Las resinas de copolmero de PET y el PET, generalmente presentan una estructura molecular muy ordenada. Como consecuencia, muestran un comportamiento trmico caracterstico que depende de la composicin, incluyendo una temperatura de
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Captulos
transicin vtrea de aproximadamente 76 y una temperatura de fusin de aproximadamente 250. Estas resinas tienen un espectro de absorcin IR distintivo que permite diferenciarlas de otros materiales plsticos (por ejemplo: policarbonato, poliestireno, polietileno y resinas de PETG). El PET y las resinas de copolmero de PET tienen una densidad entre 1,3 y 1,4 g por cm3 y
una viscosidad intrnseca mnima de 0,7 dL por g, que corresponde a un peso molecular promedio en nmero de aproximadamente 23 000 daltones.
Las resinas de PETG son polmeros de alto peso molecular preparados mediante condensacin de etilenglicol con tereftalato
de dimetilo o cido tereftlico y un porcentaje molar de 15 a 34 de 1,4-ciclohexanodimetanol. Las resinas PETG son polmeros
transparentes, amorfos, que poseen una temperatura de transicin vtrea de aproximadamente 81 y no tienen un punto de
fusin cristalino, segn se determina por calorimetra de barrido diferencial. Estas resinas de PETG tienen un espectro de absorcin IR caracterstico que permite diferenciarlas de otros materiales plsticos, incluso el PET. Las resinas de PETG tienen una
densidad de aproximadamente 1,27 g por cm3 y una viscosidad intrnseca mnima de 0,65 dL por g, que corresponde a un
peso molecular promedio en nmero de aproximadamente 16 000 daltones.
Las resinas de PET y de PETG y otros ingredientes utilizados en la fabricacin de estos frascos cumplen con los requisitos de
las secciones pertinentes del Cdigo de Reglamentaciones Federales, Ttulo 21, en lo referente al uso de estos materiales en contacto con alimentos y bebidas alcohlicas. Las resinas de PET y de PETG no contienen plastificantes, adyuvantes de procesamiento o antioxidantes. Los colorantes que se empleen en la fabricacin de frascos de PET y de PETG, si los hubiera, no migran
al lquido contenido en el frasco.
Espectroscopa InfrarrojaProceder segn se indica en Reflectancia Interna Mltiple en la seccin Mtodos de Prueba. El
espectro de la muestra corregido presenta bandas de absorcin principales slo a las mismas longitudes de onda que las del
espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP o ER Tereftalato de Polietileno G USP, determinados de manera similar.
Calorimetra de Barrido DiferencialProceder segn se indica en Anlisis Trmico en la seccin Mtodos de Prueba. Para
tereftalato de polietileno, el termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno USP, determinado de manera similar: el punto de fusin (Tm) de la muestra no difiere del punto de fusin del Estndar de Referencia USP en
ms de 9,0 y la temperatura de transicin vtrea (Tg) de la muestra no difiere de la del Estndar de Referencia USP en ms de
4,0. Para tereftalato de polietileno G, el termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno G
USP, determinado de manera similar: la temperatura de transicin vtrea (Tg) de la muestra no difiere de la del Estndar de
Referencia USP en ms de 6,0.
Extraccin de ColorantesSeleccionar tres frascos de prueba. Cortar una porcin relativamente plana de la pared de un
frasco y recortarla, segn sea necesario, para que pueda colocarse en el portamuestras del espectrofotmetro. Obtener el espectro visible de la pared barriendo la porcin del espectro visible desde 350 nm hasta 700 nm. Determinar la longitud de
onda de mxima absorbancia con una aproximacin de 2 nm. Llenar los dos frascos de prueba restantes, empleando alcohol
al 50% para frascos de PET y alcohol al 25% para frascos de PETG. Sellar los frascos con sellos impermeables, como por ejemplo papel de aluminio y colocar los cierres. Llenar un frasco de vidrio que tenga la misma capacidad que los frascos de prueba
con el disolvente que corresponda, sellar el frasco con un sello impermeable, como por ejemplo papel de aluminio y colocar el
cierre. Incubar los frascos de prueba y el frasco de vidrio a 49 durante 10 das. Retirar los frascos y dejar que se equilibren a
temperatura ambiente. Determinar concomitantemente las absorbancias de las soluciones de prueba en celdas de 5 cm a la
longitud de onda de mxima absorbancia (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851), empleando el disolvente del frasco
de vidrio como blanco. Los valores de absorbancia as obtenidos son menores a 0,01 para ambas soluciones de prueba.
Metales Pesados, Partes Totales de Tereftalolo y Etilenglicol
MEDIO DE EXTRACCIN
Agua Purificada(ver monografa).
Alcohol al 50 por cientoDiluir 125 mL de alcohol con agua hasta 238 mL y mezclar.
Alcohol al 25 por cientoDiluir 125 mL de Alcohol al 50 por ciento con agua hasta 250 mL y mezclar.
n-Heptano.
PROCEDIMIENTO GENERAL[NOTAUtilizar un Medio de Extraccin de Alcohol al 50 por ciento para frascos de PET y Alcohol al
25 por ciento para frascos de PETG.] Para cada Medio de Extraccin, llenar una cantidad suficiente de frascos de prueba al 90%
de su capacidad nominal para obtener no menos de 30 mL. Llenar un nmero correspondiente de frascos de vidrio con Agua
Purificada, un nmero correspondiente de frascos de vidrio con Alcohol al 50 por ciento o Alcohol al 25 por ciento y un nmero
correspondiente de frascos de vidrio con n-Heptano para emplearlos como blancos de los Medios de Extraccin. Sellar los frascos
con sellos impermeables, como por ejemplo papel de aluminio, y colocar los cierres. Incubar los frascos de prueba y los frascos
de vidrio a 49 durante 10 das. Retirar los frascos de prueba con las muestras de los Medios de Extraccin, los frascos de vidrio
con los blancos de los Medios de Extraccin y almacenarlos a temperatura ambiente. No transferir las muestras de los Medios de
Extraccin a otros recipientes de almacenamiento.
METALES PESADOSPipetear 20 mL del extracto de Agua Purificada de los frascos de prueba, filtrado si fuera necesario, y transferir a uno de dos tubos para comparacin de color de 50 mL y reservar el extracto restante de Agua Purificada en los frascos
de prueba para utilizarlo en la prueba de Etilenglicol. Ajustar el extracto con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N a un
pH entre 3,0 y 4,0, utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Diluir con agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar.
Pipetear 2 mL de Solucin Estndar de Plomo recin preparada (en el da de uso) (ver Metales Pesados 231) y transferir al
segundo tubo para comparacin de color, y agregar 20 mL de Agua Purificada. Ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de
Captulos
USP 38
amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0, utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Diluir con
agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar.
Agregar a cada tubo 1,2 mL de tioacetamida-glicerina bsica SR y 2 mL de Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver
Metales Pesados 231), diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: todo color que se produzca dentro de los 10 minutos en el
tubo que contiene el extracto de Agua Purificada de los frascos de prueba no excede el que se produce en el tubo que contiene
la Solucin Estndar de Plomo, observando ambos tubos hacia abajo sobre una superficie blanca (1 ppm en el extracto).
PARTES TOTALES DE TEREFTALOLODeterminar la absorbancia del extracto de Alcohol al 50 por ciento o de Alcohol al 25 por
ciento en una celda de 1 cm a la longitud de onda de mxima absorbancia, aproximadamente a 244 nm (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851), utilizando el blanco de Medio de Extraccin correspondiente como blanco: la absorbancia del
extracto no excede de 0,150, correspondiente a no ms de 1 ppm de tereftalolo total.
Determinar la absorbancia del extracto de n-Heptano en una celda de 1 cm a la longitud de onda de mxima absorcin,
aproximadamente a 240 nm, (ver Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851), utilizando el Medio de Extraccin de n-Heptano
como blanco: la absorbancia del extracto no excede de 0,150, correspondiente a no ms de 1 ppm de tereftalolo total.
ETILENGLICOL
Solucin de cido PerydicoDisolver 125 mg de cido perydico en 10 mL de agua.
cido Sulfrico DiluidoAgregar despacio y mezclando constantemente 50 mL de cido sulfrico a 50 mL de agua y dejar
que se enfre a temperatura ambiente.
Solucin de Bisulfito de SodioDisolver 0,1 g de bisulfito de sodio en 10 mL de agua. Usar esta solucin dentro de los 7 das
de preparada.
Solucin de Cromotropato DisdicoDisolver 100 mg de cromotropato disdico en 100 mL de cido sulfrico. Proteger esta
solucin de la luz y utilizar dentro de los 7 das de preparada.
Solucin EstndarDisolver en agua una cantidad, pesada con exactitud, de etilenglicol y diluir cuantitativamente, y si fuera
necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solucin con una concentracin conocida de aproximadamente 1 mg por
mL.
Solucin de PruebaEmplear el extracto de Agua Purificada.
ProcedimientoTransferir 1,0 mL de la Solucin Estndar a un matraz volumtrico de 10 mL. Transferir 1,0 mL de la Solucin
de Prueba a un segundo matraz volumtrico de 10 mL. Transferir 1,0 mL del Medio de Extraccin de Agua Purificada a un tercer
matraz volumtrico de 10 mL. Agregar a cada uno de los tres matraces 100 mL de Solucin de cido Perydico, agitar por rotacin suave para mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar 1,0 mL de Solucin de Bisulfito de Sodio a cada matraz y
mezclar. Agregar 100 mL de Solucin de Cromotropato Disdico a cada matraz y mezclar. [NOTAAnalizar todas las soluciones
dentro del plazo de 1 hora despus de agregar la Solucin de Cromotropato Disdico.] Con cuidado, agregar 6 mL de cido
sulfrico a cada matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfren a temperatura ambiente. [PrecaucinLa dilucin de cido
sulfrico produce mucho calor y puede hacer que la solucin entre en ebullicin. Realizar esta adicin cuidadosamente. Se desprendern gases de dixido de azufre. Se recomienda usar una campana de extraccin]. Diluir a volumen cada solucin con cido Sulfrico Diluido y mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las soluciones obtenidas a partir de la Solucin Estndar y de la Solucin de Prueba en celdas de 1 cm a la longitud de onda de mxima absorcin aproximadamente a 575 nm, (ver
Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851), usando la solucin del blanco de Medio de Extraccin de Agua Purificada: la absorbancia de la solucin obtenida a partir de la Solucin de Prueba no excede de la absorbancia de la solucin obtenida a partir de
la Solucin Estndar, correspondiendo a no ms de 1 ppm de etilenglicol.
MTODOS DE PRUEBA
Reflectancia Interna Mltiple
AparatoUtilizar un espectrofotmetro IR capaz de corregir por el espectro del blanco, equipado con accesorios de reflectancia interna mltiple y una placa de reflectancia interna KRS-5.1 Un cristal KRS-5 de 2 mm de espesor con un ngulo de
incidencia de 45 proporciona un nmero suficiente de reflejos.
Preparacin de la MuestraCortar dos secciones planas de un espesor equivalente al espesor promedio de la pared del
envase y recortarlas, segn sea necesario, a fin de obtener segmentos que tengan un tamao conveniente para montarlos en
el accesorio de reflectancia interna mltiple. Con cuidado para evitar rayar las superficies, secar las muestras con papel seco o,
si fuera necesario, limpiarlas con una tela suave humedecida con metanol y dejarlas secar. Montar firmemente las muestras en
ambos lados de la placa KRS-5 de reflectancia interna, asegurndose de lograr un contacto superficial adecuado. Antes del
montaje en la placa, las muestras pueden comprimirse mediante exposicin a temperaturas de aproximadamente 177 a alta
presin (15 000 psi o ms) para obtener pelculas uniformes delgadas.
Procedimiento GeneralColocar las secciones de la muestra en el accesorio de reflectancia interna mltiple y colocar el
conjunto en el haz de la muestra del espectrofotmetro IR. Ajustar la posicin de la muestra y de los espejos dentro del accesorio para permitir la mxima transmisin de luz del haz de referencia no atenuado. (Si se trata de un instrumento de haz doble,
completar los ajustes en el accesorio y luego atenuar el haz de referencia para permitir una deflexin de escala completa du1 El accesorio de reflectancia interna mltiple y la placa de KRS-5 se pueden obtener de diversas fuentes, entre las que se incluyen Beckman Instruments, Inc., 2500
Harbor Blvd., Fullerton, CA 92634, y Perkin Elmer Corp., Main Ave., Norwalk, CT 06856.
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rante el barrido de la muestra.) Determinar el espectro IR de 3500 cm1 a 600 cm1 para polietileno y polipropileno, y de 4000
cm1 a 400 cm1 para PET y PETG.
Anlisis Trmico
Pruebas Biolgicas
Las pruebas biolgicas in vitro se realizan segn los procedimientos establecidos en Prueba de Reactividad Biolgica, In Vitro
87. Los componentes que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan ser sometidos a pruebas adicionales. No se asigna ningn tipo de designacin de clase de plstico para estos materiales. Los materiales que no cumplen con los
requisitos de las pruebas in vitro no son adecuados para envases de productos farmacuticos.
Si se necesita una designacin de clase para plsticos y otros polmeros que cumplan con los requisitos de las Pruebas de
Reactividad Biolgica, In Vitro 87, realizar las pruebas in vivo apropiadas que se especifican en Clasificacin de Plsticos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88.
Pruebas Fisicoqumicas
Las siguientes pruebas, diseadas para determinar las propiedades fsicas y qumicas de los plsticos y sus extractos, estn
basadas en la extraccin del material plstico y es esencial que se emplee la cantidad de plstico indicada. Asimismo, es necesario que el rea superficial especificada est disponible para la extraccin a la temperatura indicada.
Parmetros de Prueba
Medio de ExtraccinA menos que se indique algo diferente en alguna de las pruebas especficas descritas a continuacin,
emplear Agua Purificada (ver monografa) como Medio de Extraccin y mantenerla a una temperatura de 70 durante la extraccin de la Preparacin de la Muestra.
BlancoUsar Agua Purificada cuando se especifique un blanco en las siguientes pruebas.
AparatosEmplear un bao de agua y los Envases de Extraccin segn se describen en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88. Proceder segn se indica en el primer prrafo en Preparacin del Equipo en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo
88. [NOTALos envases y equipos no necesitan estar esterilizados.]
Preparacin de la MuestraUtilizar una porcin de una muestra de plstico homognea, que equivalga a 120 cm2 de rea
superficial total (ambos lados combinados), por cada 20,0 mL de Medio de Extraccin y subdividir en tiras de aproximadamente
3 mm de ancho y con una longitud lo ms prxima posible a 5 cm. Transferir la muestra subdividida a una probeta graduada
de vidrio Tipo I de 250 mL con tapn de vidrio y agregar aproximadamente 150 mL de Agua Purificada. Agitar durante aproximadamente 30 segundos, drenar y desechar el lquido, y repetir con un segundo lavado.
Extracto de Preparacin de la MuestraTransferir la Preparacin de la Muestra a un matraz de extraccin adecuado y agregar
la cantidad requerida de Medio de Extraccin. Extraer la muestra mediante calentamiento en un bao de agua a la temperatura
especificada para el Medio de Extraccin durante 24 horas. Enfriar, pero a una temperatura no menor a 20. Pipetear 20 mL del
extracto preparado y transferir a un recipiente adecuado. [NOTAEmplear esta porcin en la prueba de Capacidad Amortiguadora.] De inmediato decantar el extracto restante recogiendo el filtrado en un recipiente limpiado adecuadamente y sellarlo.
Residuo No VoltilTransferir, en porciones adecuadas, 50,0 mL del Extracto de Preparacin de la Muestra, a un crisol tarado adecuado (preferentemente un crisol de slice fundida que haya sido lavado con cido) y evaporar la materia voltil en un
bao de vapor. Emplear el mismo procedimiento para evaporar 50,0 mL del Blanco en un segundo crisol. [NOTASi se espera
obtener un residuo oleoso, inspeccionar el crisol repetidamente durante la evaporacin y el perodo de secado y reducir el ca-
Captulos
Procedimiento GeneralCortar una seccin que pese aproximadamente 12 mg y colocarla en el platillo para la muestra
de prueba. [NOTAEs esencial un buen contacto entre el platillo y la termocupla para lograr resultados reproducibles.] Determinar el termograma bajo nitrgeno, empleando las condiciones de calentamiento y enfriamiento especificadas para el tipo de
resina utilizado, con un equipo capaz de realizar las determinaciones especificadas en Anlisis Trmico 891.
Para PolietilenoDeterminar el termograma bajo nitrgeno a una temperatura entre 40 y 200 con una velocidad de calentamiento entre 2 y 10 por minuto, seguido de enfriamiento a una velocidad entre 2 y 10 por minuto hasta 40.
Para PolipropilenoDeterminar el termograma bajo nitrgeno a una temperatura entre la temperatura ambiente y 30
por encima del punto de fusin. Mantener la temperatura durante 10 minutos, luego enfriar hasta 50 por debajo de la temperatura del pico de cristalizacin a una velocidad de 10 a 20 por minuto.
Para Tereftalato de PolietilenoCalentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 280 a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 20 por minuto. Mantener la muestra a 280 durante 1 minuto. Enfriar rpidamente la muestra
hasta temperatura ambiente, volver a calentar hasta 280 a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 5 por minuto.
Para Tereftalato de Polietileno GCalentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 120 a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 20 por minuto. Mantener la muestra a 120 durante 1 minuto. Enfriar rpidamente la muestra
hasta temperatura ambiente, volver a calentar hasta 120 a una velocidad de calentamiento de aproximadamente 10 por minuto.
Captulos
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lor si el aceite tiende a ascender por las paredes del crisol.] Secar a 105 durante 1 hora: la diferencia entre las cantidades obtenidas a partir del Extracto de Preparacin de la Muestra y el Blanco no excede de 15 mg.
Residuo de Incineracin 281[NOTANo es necesario realizar esta prueba cuando el resultado de la prueba de Residuo
No Voltil no excede de 5 mg.] Proceder con los residuos obtenidos a partir del Extracto de Preparacin de la Muestra y del
Blanco en la prueba para Residuo No Voltil descrita anteriormente, utilizando, si fuera necesario, una cantidad adicional de
cido sulfrico pero agregando la misma cantidad de cido sulfrico a cada crisol: la diferencia entre las cantidades de residuo
de incineracin obtenidas a partir del Extracto de Preparacin de la Muestra y el Blanco no excede de 5 mg.
Metales PesadosPipetear 20 mL del Extracto de Preparacin de la Muestra, filtrado si fuera necesario, y transferir a uno de
dos tubos para comparacin de color de 50 mL. Ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y
4,0 utilizando papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir con agua hasta aproximadamente 35
mL y mezclar.
Pipetear 2 mL de Solucin Estndar de Plomo (ver Metales Pesados 231), transferir al segundo tubo de comparacin de color
y agregar 20 mL del Blanco. Ajustar con cido actico 1 N o hidrxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0 utilizando papel
indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir con agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar. Agregar
a cada tubo 1,2 mL de tioacetamidaglicerina bsica SR y 2 mL de Solucin Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver Metales
Pesados 231), diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: el color marrn que se produzca dentro de los 10 minutos en el tubo
que contiene el Extracto de Preparacin de la Muestra no excede del que se produce en el tubo que contiene la Solucin Estndar de Plomo, observando ambos tubos hacia abajo sobre una superficie blanca (1 ppm en el extracto).
Capacidad AmortiguadoraValorar potenciomtricamente la porcin de 20 mL previamente recolectada del Extracto de
Preparacin de la Muestra hasta un pH de 7,0, utilizando cido clorhdrico 0,010 N o hidrxido de sodio 0,010 N, segn se
requiera. Tratar una porcin de 20,0 mL del Blanco en forma similar: si se requiere la misma solucin volumtrica tanto para el
Extracto de Preparacin de la Muestra como para el Blanco, la diferencia entre los dos volmenes no es mayor de 10,0 mL; si se
requiere cido para el Extracto de Preparacin de la Muestra o el Blanco y lcali para el otro, el total de los dos volmenes requeridos no es mayor de 10,0 mL.
670 ENVASESCOMPONENTES AUXILIARES

Los componentes auxiliares de los envases son artculos que se usan para respaldar o mejorar los sistemas de envase y cierre.
Estos artculos incluyen, entre otros, torunda farmacutica (pharmaceutical coil) para envases. Los componentes que se describen en este captulo deben cumplir con los requisitos aqu provistos y los requisitos adicionales especificados en otros captulos.
TORUNDA FARMACUTICA
La torunda farmacutica se usa como material de relleno en envases de unidades mltiples para formas farmacuticas orales
slidas a fin de evitar la ruptura de tabletas o cpsulas durante el transporte. El material de relleno se debe desechar una vez
que se ha abierto el frasco.
Soluciones
Solucin Yodada de Cloruro de Cinc Disolver 20 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de Agua
Purificada. Agregar 0,5 g de yodo y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Proteger de la luz.
Solucin de Cloruro de Cinccido FrmicoDisolver 20 g de cloruro de cinc en 80 g de una solucin de 850 g/L de
cido frmico anhidro.
Solucin al 1% de Colorante N 4 para Identificacin de Fibras DuPont1 Disolver 3,8 g de colorante en polvo en
378,5 mL de agua desionizada.
Torunda Farmacutica de Algodn

El algodn purificado es el pelo de la semilla de las variedades cultivadas de Gossypium hirsutum L. u otras especies de Gossypium (Fam. Malvaceae). Se elimina el material graso y se blanquea, y no contiene ms que trazas de residuo de hojas, pericarpio, recubrimiento de la semilla u otras impurezas. La torunda farmacutica de algodn se usa en frascos de formas farmacuticas orales slidas para evitar la ruptura.
El Colorante N 4 para Identificacin de Fibras DuPont est disponible en Pylam Products Co., 2175 East Cedar Street, Tempe, AZ 85281: www.pylamdyes.com.
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Pruebas Fsicas / 670 EnvasesComponentes Auxiliares 495
Torunda Farmacutica de Rayn

La torunda farmacutica de rayn es una forma fibrosa de celulosa regenerada blanqueada que se usa como relleno en frascos de formas farmacuticas orales slidas para evitar la ruptura. Consiste exclusivamente en fibras de rayn excepto por unas
pocas fibras extraas aisladas que pueden estar presentes.
[NOTASe ha demostrado que la torunda farmacutica de rayn es una fuente potencial de problemas de disolucin para
cpsulas de gelatina o tabletas recubiertas de gelatina que resultan del entrecruzamiento de la gelatina.]
2 Un sistema de anlisis adecuado que consiste en tiras de prueba de perxido Reflectoquant y un instrumento de reflectometra RQflex se puede obtener de
EMD Chemicals Inc., 480 S. Democrat Road, Gibbstown, NJ 08027: www.emdchemicals.com.
Captulos
Identificacin
A: Cuando se examinan al microscopio, se observa que cada fibra consiste en una clula, de hasta aproximadamente 4
cm de largo y 40 mm de ancho, en forma de un tubo aplanado con paredes gruesas y redondeadas que estn a menudo retorcidas.
B: Cuando se tratan con Solucin Yodada de Cloruro de Cinc, las fibras se tornan de color violeta.
C: Agregar 10 mL de Solucin de Cloruro de Cinccido Frmico a 0,1 g de fibras, calentar a 40, y dejar en reposo durante
2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras no se disuelven.
D: Pesar aproximadamente 5 g de fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de Solucin
al 1% de Colorante N 4 para Identificacin de Fibras DuPont en ebullicin y continuar la ebullicin suavemente por no menos de
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra, y exprimir el lquido en exceso: las fibras se tornan de color verde.
Acidez o AlcalinidadSumergir aproximadamente 10 g de fibras en 100 mL de Agua Purificada recientemente hervida y
enfriada, y dejar que se macere durante 2 horas. Decantar dos porciones de 25 mL del agua, con ayuda de una varilla de vidrio, en sendas cpsulas. Agregar a una porcin 3 gotas de fenolftalena SR y agregar a la otra porcin 1 gota de anaranjado de
metilo SR. Ninguna porcin se presenta de color rosa cuando se la observa contra un fondo blanco.
FluorescenciaExaminar una capa de aproximadamente 5 mm de espesor bajo luz UV a 365 nm. Presenta solamente una
ligera fluorescencia violeta amarronada y unas pocas partculas de color amarillo. No presenta una fluorescencia azul intensa,
excepto por la que pueden presentar unas pocas fibras aisladas.
Concentracin de Perxido de Hidrgeno ResidualColocar 1 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 30
mL de Agua Purificada y mezclar durante 3 minutos con una varilla de vidrio. Verter el contenido en otro recipiente limpio (no
exprimir la muestra), o alternativamente, retirar las fibras de la solucin con tenacillas limpias. Retirar una tira de prueba analtica de perxido2 de su envase y sumergir el extremo de prueba en el lquido de muestra durante 2 segundos. Agitar para eliminar el exceso de lquido, insertar inmediatamente la tira de prueba en un instrumento de reflectometra adecuado, y registrar
la lectura en mg/kg (ppm), y calcular la concentracin de perxido de hidrgeno residual en ppm.
Para un mtodo alternativo, colocar 20 g en un vaso de precipitados, agregar 400 mL de Agua Purificada, mezclar, agregar
20 mL de cido sulfrico al 20%, y mezclar el contenido. Valorar con solucin de permanganato de potasio 0,100 N hasta un
color rosado plido que permanezca durante 30 segundos. Registrar la cantidad de contenido y calcular la concentracin en
ppm.
Se encuentra no ms de 50 ppm usando cualquiera de los mtodos.
Prdida por Secado 731Secar 5,00 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante: pierde no ms de 8,0% de su
peso.
Residuo de Incineracin 281Colocar 5 g de fibras en una cpsula de porcelana o platino y humedecer con cido sulfrico 2 N. Calentar suavemente el algodn hasta que se carbonice, luego incinerar con mayor intensidad hasta que el carbono
se haya consumido completamente: Queda no ms de 0,20% de residuo.
Sustancias Solubles en AguaColocar 10,00 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 1000 mL de Agua Purificada y calentar a ebullicin suave durante 30 minutos, agregando agua segn se requiera para mantener el volumen. Verter
el agua a travs de un embudo en otro vaso y exprimir el exceso de agua del algodn con una varilla de vidrio. Lavar el algodn en el embudo con dos porciones de 250 mL de agua hirviendo, presionando el algodn despus de cada lavado. Filtrar el
extracto y los lavados combinados y lavar bien el filtro con agua caliente. Evaporar el extracto y los lavados combinados hasta
un volumen pequeo, transferir a una cpsula de porcelana o platino tarada, evaporar hasta sequedad, y secar el residuo a
105 hasta peso constante. El residuo pesa no ms de 0,35%.
Materia GrasaCompactar 10,00 g de fibras en un extractor Soxhlet equipado con un receptor tarado y extraer con ter
etlico durante 4 horas a una velocidad tal que permita que el ter se descargue por sifn no menos de cuatro veces por hora.
La solucin de ter etlico en el matraz no presenta trazas de color azul, verde o marrn. Evaporar el extracto hasta sequedad y
secar a 105 durante 1 hora. El peso del residuo no excede de 0,7%.
ColorantesCompactar aproximadamente 10 g en un percolador estrecho y extraer lentamente con alcohol hasta que el
percolado alcance 50 mL. Cuando se observa hacia abajo a travs de una columna de 20 cm de profundidad, el percolado
puede presentar un color amarillento, pero no una coloracin azul o verde.
Otra Materia ExtraaPequeos trozos de algodn no contienen manchas de aceite o partculas metlicas por inspeccin
visual.
496 670 EnvasesComponentes Auxiliares / Pruebas Fsicas
USP 38
Captulos
Identificacin
A: Cuando se tratan con Solucin Yodada de Cloruro de Cinc, las fibras se tornan de color violeta.
B: Agregar 10 mL de Solucin de Cloruro de Cinccido Frmico a 0,1 g de fibras, calentar a 40, y dejar en reposo durante
2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras se disuelven por completo, excepto por las fibras de rayn mate en las que se
conservan partculas de titanio.
C: Pesar aproximadamente 5 g de las fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solucin
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra, y exprimir el lquido en exceso: las fibras se tornan de color verde azulado.
Acidez o Alcalinidad, Fluorescencia, Materia Grasa, Colorantes y Otra Materia ExtraaProceder segn se indica en
Torunda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar torunda farmacutica de rayn. El peso de la muestra para materia
grasa es 5 g y el peso del residuo no excede de 0,5%.
Prdida por Secado 731Secar 5,00 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante: pierde no ms de 11,0% de
su peso.
Residuo de Incineracin 281: No ms de 1,50%, determinado en una muestra de prueba de 5,00 g.
Cenizas Insolubles en cidoAgregar 25 mL de cido clorhdrico 3 N al residuo obtenido en la prueba de Residuo de Incineracin y calentar a ebullicin durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de filtracin tarado, lavar con agua
caliente, incinerar, y pesar: el residuo pesa no ms de 1,25%.
Sustancias Solubles en AguaProceder segn se indica en Torunda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar
torunda farmacutica de rayn. El residuo pesa no ms de 1,0%.
Torunda Farmacutica de Polister

La torunda farmacutica de polister es un material blanco e inodoro que se usa como relleno en frascos de formas farmacuticas orales slidas para evitar la ruptura.
Identificacin
A: Proceder segn se indica en Espectroscopa Infrarroja en la seccin de Mtodos de Prueba. Determinar el espectro IR de
4000 a 650 cm1 (2,5 a 15 mm). El espectro obtenido de la muestra presenta bandas de absorcin principales nicamente a las
mismas longitudes de onda que el espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP.
B: Pesar aproximadamente 5 g de las fibras, embeber con agua, y exprimir el exceso. Agregar fibras a 100 mL de Solucin
1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fra, y exprimir el lquido en exceso: las fibras se tornan de color anaranjado
plido.
Acidez o AlcalinidadProceder segn se indica en Torunda Farmacutica de Algodn, excepto que se debe usar torunda
farmacutica de polister.
Prdida por Secado 731Secar 5,00 g de fibras en un horno a 105 hasta peso constante: pierde no ms de 1,0% de su
peso.
Residuo de Incineracin 281: No ms de 0,5%, determinado en una muestra de prueba de 5,00 g.
Acabado sobre FibrasEl acabado sobre las fibras usado para el procesamiento debe cumplir con los reglamentos de la
FDA para el contacto con alimentos.
Mtodos de Prueba
ESPECTROSCOPA INFRARROJA3
Aparato: FTIR o un espectrmetro de doble haz capaz de barrer de 4000 a 650 cm1 (2,5 a 15 mm).
Mtodo 1 (Disco de Bromuro de Potasio)Usar tijeras para cortar las fibras de polister (1 a 3 mg) en longitudes cortas (menos de 1 mm de largo), mezclar con 200 mg de bromuro de potasio en polvo, y moler en un molino de bolas durante 1 a 2
minutos. Transferir a una matriz para discos de bromuro de potasio y formar un disco.
Mtodo 2 (Pelcula Fundida)Generar una pelcula presionando fibras de polister entre lminas de TFE-fluorocarbono y colocar entre placas calientes.
3 Se puede encontrar informacin adicional sobre mtodos de identificacin para fibras en Standard Test Methods for Identification of Fibers in Textiles (Mtodos de Prueba Estndar para Identificacin de Fibras en Textiles). Versin actual del Mtodo D276 de ASTM, publicada por ASTM International, 100 Barr Harbor
Drive, P.O. Box C700, West Conchohocken, PA 19428-2959. www.astm.org.
Pruebas Fsicas / 671 EnvasesPruebas de Desempeo 497
USP 38
671 ENVASESPRUEBAS DE DESEMPEO

INTRODUCCIN
El propsito de este captulo es proporcionar normas para las propiedades funcionales de los sistemas de envasado que se
usan para formas farmacuticas orales slidas y lquidas para medicamentos y suplementos dietticos. Las definiciones aplicables a este captulo se encuentran en el captulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659. Las siguientes pruebas sirven
para determinar la velocidad de transmisin de vapor hmedo (velocidad de permeabilidad al vapor de agua) y la transmisin
espectral de los envases de plstico.
Los mtodos de prueba para medir las velocidades de transmisin de vapor hmedo que se detallan en este captulo pueden
ser tiles para los fabricantes de medicamentos y de suplementos dietticos para determinar el nivel de proteccin provisto por
los sistemas de envasado de formas farmacuticas orales slidas. Adems, se proveen mtodos adicionales para determinar la
clasificacin de sistemas de envasado para formas farmacuticas orales slidas y lquidas que se reenvasan en envases unitarios
y envases de unidades mltiples (Tabla 1), ya sea por organizaciones o por farmacuticos al momento de la dispensacin de
acuerdo con lo indicado en la receta mdica. Pueden existir otros sistemas de envasado a los que podran aplicarse los mtodos de prueba de esta seccin; sin embargo, se debe describir cualquier tipo de desviacin. Si se usan otros mtodos para
medir la velocidad de transmisin de vapor hmedo, deben describirse con suficiente detalle para justificar su uso.
Tabla 1. Mtodos de Prueba de Transmisin de Vapor Hmedo en Sistemas de Envasado
Formas Farmacuticas
Orales Lquidas
Ttulo de la Seccin
Determinacin del Nivel de

Barrera de Proteccin
Clasificacin para Envases

de Unidades Mltiples
Clasificacin para Envases Unitarios y Envase de Dosis nica
Aplicacin
Envases de unidades mltiples con sello intacto o

abierto y envases unitarios
y de dosis nica
Envases de unidades mltiples con cierre aplicado y

sello en estado intacto o
abierto
Envases unitarios y de
dosis nica en esta- Envases de unidades mltiples y
do sellado
unitarios
Fabricantes
Fabricantes
Envasadores
Reenvasadores
Farmacias
Fabricantes
Envasadores
Reenvasadores
Farmacias
Usuarios
Clasificacin para Envases de Unidades Mltiples y Envase de Dosis

nica
Fabricantes
Envasadores
Reenvasadores
Farmacias
Definiciones
BlsterDomo de plstico o de laminado de aluminio moldeado, sellado y cerrado que contiene la cpsula o la tableta
(por lo general, en un envase unitario o de dosis nica).
Blster de barrera bajaBlsteres hechos con materiales de barrera baja, moldeados y sellados de tal manera que la velocidad de transmisin de vapor hmedo al analizarla a 40/75% de humedad relativa (HR) sea mayor de 1,0 mg/cavidadda.
Blster de barrera altaBlsteres hechos con materiales de barrera alta, moldeados y sellados de tal manera que la velocidad de transmisin de vapor hmedo al analizarla a 40/75% de humedad relativa sea menor de 1,0 mg/cavidad-da.
Blster de barrera ultra altaBlsteres hechos con materiales de barrera ultra alta, moldeados y sellados de tal manera
que la velocidad de transmisin de vapor hmedo al analizarla a 40/75% de humedad relativa sea menor de 0,01 mg/
cavidad-da.
Tira de blsteresGrupo contiguo de blsteres moldeados y sellados con una tapa. El nmero de blsteres por tira por lo
regular va de uno a diez, pero puede tener un nmero mayor. En ocasiones, se puede hacer referencia a la tira de blsteres
como un sistema de envasado.
Cavidad o burbujaDomo de plstico o de laminado de aluminio moldeado, sellado y cerrado (ver Blster).
Velocidad de transmisin de vapor hmedoEs la transmisin de vapor hmedo por unidad de tiempo a travs de un
sistema de envasado, en estado estacionario y en condiciones especficas de temperatura y humedad. Estos mtodos de
prueba emplean medicin gravimtrica para determinar la velocidad de ganancia en peso como resultado de la transmisin de vapor de agua hacia el interior del sistema de envasado y la captacin subsiguiente mediante un desecante dentro
del sistema de envasado.
Muestra de prueba (o muestra)Para envases de unidades mltiples, el frasco es la muestra de prueba; mientras que
para envases unitarios o de dosis nica, la tira de blster que contiene mltiples cavidades es la muestra de prueba. Cuando se prueban blsteres, se pueden agrupar varias tiras (es decir, varias muestras) en una unidad de prueba para realizar la
prueba.
Unidad de pruebaPara envases de unidades mltiples, el frasco es tanto la unidad de prueba como la muestra de prueba, y para envases unitarios o monodosis, la unidad de prueba es un grupo de muestras de prueba (tiras de blsteres) que
se procesan juntas para medir su exposicin a la temperatura y humedad y para pesarlas en cada tiempo de muestreo. El
Captulos
Formas Farmacuticas
Orales Slidas
498 671 EnvasesPruebas de Desempeo / Pruebas Fsicas
USP 38
propsito de la unidad de prueba para envases unitarios o monodosis es sacar ventaja de la ganancia de peso aditiva que
resulta de una mayor cantidad de cavidades que las presentes en una sola tira. Cuando se habla de la unidad de prueba,
en el caso de los frascos, se hace para mantener la congruencia en la denominacin de los tres mtodos de prueba.
TRANSMISIN DE VAPOR HMEDO

Determinacin de la Proteccin de Barrera para Sistemas de Envasado para Formas Farmacuticas
Orales Slidas
Esta seccin describe los mtodos de prueba de transmisin de vapor hmedo para envases de unidades mltiples (Mtodo
1), envase unitarios y de dosis nica de alta barrera (Mtodo 2) y envases unitarios y de dosis nica de baja barrera (Mtodo 3)
usados por los fabricantes de formas farmacuticas orales slidas. El propsito de este mtodo es obtener velocidades de transmisin de vapor hmedo confiables y especficas que se puedan usar para diferenciar entre el desempeo de la barrera de los
sistemas de envasado usados para artculos reglamentados; el mtodo se basa en el mtodo ASTM D7709.1
Este mtodo presenta las siguientes caractersticas:
a. Informa un valor de transmisin de vapor hmedo especfico para un envase en lugar de una clasificacin
b. Provee sensibilidad y precisin suficientes para permitir diferenciar el desempeo de la barrera entre los envases
c. Las condiciones de uso para analizar estos sistemas de envasado son las mismas que las usadas para el anlisis de estabilidad acelerado del envase primario de artculos reglamentados (por lo regular, humedad relativa de 75% a 40).
Captulos
EQUIPO
Se debe contar con los siguientes elementos:

Una balanza de capacidad suficiente para pesar las muestras de prueba durante todo el periodo de la prueba (ver Pesada
en una Balanza Analtica 1251). La balanza debe tener una sensibilidad adecuada para detectar las pequeas diferencias
de peso que se producen entre tiempos de anlisis consecutivos. La incertidumbre de la pesada deber ser menor que el
5% de la ganancia en peso de un tiempo de muestreo al siguiente. La incertidumbre de la pesada es por lo regular tres
veces la resolucin/sensibilidad de la balanza. Por ejemplo, una balanza con una resolucin de 0,1 mg es aceptable para
sistemas de envasado cuya ganancia en peso por intervalo de tiempo sea mayor o igual a 6 mg [(0,1 3)/5%], que es 60
veces la sensibilidad de la balanza.
Una cmara capaz de mantener una temperatura de 40 2 y una humedad relativa de 75 5%.
DESECANTE
Mtodo 1: El desecante es cloruro de calcio anhidro en forma de grnulos. Pueden resultar adecuados otros desecantes, tales
como el tamiz molecular o el gel de slice. Si se usa cloruro de calcio anhidro, presecar a 215 5 durante 71/4 1/4 horas para
asegurar que todo hexahidrato presente se convierta completamente a la forma anhidra. Enfriar el desecante en un desecador
durante al menos 2 horas antes de su uso.
Mtodos 2 y 3: El desecante es gel de slice moldeado de tal forma que se ajuste al tamao y forma de la cavidad de blster
usada. Pueden resultar adecuados otros desecantes, por ejemplo, un tamiz molecular. Si se usa gel de slice, presecarlo en una
estufa con circulacin de aire forzado usando una de las siguientes condiciones: 155 5 durante 31/4 1/4 horas 150 5
durante 41/4 1/4 horas. Si se usa un tamiz molecular, presecarlo en una mufla a 595 25. Secar los tamices 4 y 3 durante
31/4 1/4 horas; secar el tamiz 13X durante 51/4 1/4 horas. Enfriar el desecante en un desecador durante al menos 2 horas antes
de su uso. [NOTASe ha demostrado2 que el cloruro de calcio anhidro puede contener calcio hexahidrato, que pierde agua
slo cuando la temperatura alcanza los 200.]
PROCEDIMIENTO
Mtodo 1: Usar 15 envases de unidades mltiples y 15 cierres que sean representativos del sistema a analizar. Preparar las
muestras de prueba llenando cada envase de unidades mltiples hasta dos tercios de su capacidad con desecante y luego, para
cierres de rosca, cerrar usando el torque especificado en la Tabla 2. Para otros tipos de cierre, aplicar de acuerdo con el mtodo de incumbencia. Asegurar que se haya aplicado la membrana correcta en el rea de colocacin del acabado del frasco,
logrando el sellado apropiado. Identificar cada envase de unidades mltiples con tinta indeleble. No usar etiquetas. Si hay necesidad de incrementar la precisin del mtodo, el usuario puede probar el sistema sin el cierre siempre que un sello impermeable permanezca en el envase.
1 ASTM D7709. Standard Test Methods for Measuring Water Vapor Transmission Rate (WVTR) of Pharmaceutical Bottles and Blisters published by ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
2 Determination of water vapor transmission rate (WVTR) of HDPE bottles for pharmaceutical products. Chen, Yisheng and Yanxia Li, International Journal of Pharmaceutics, 358 (2008) 137143.
USP 38
Si se desea, pesar cada envase de unidades mltiples a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para
el tiempo cero, pero no usarlo en el clculo de la permeacin. Colocar todos los envases en la cmara de prueba (humedad
relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar todos los envases de unidades mltiples en intervalos de
tiempo de 7 das 1 hora. Pesar los envases de unidades mltiples en los das 7; 14; 21; 28 y 35 para obtener los datos en
estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo 0 hasta el da 7 es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes
de pesar los envases en cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante aproximadamente 30 minutos a la temperatura y humedad relativa de pesada. Limitar el tiempo fuera de la cmara a menos de 2 horas. Registrar los pesos de manera
apropiada para luego calcular la lnea de regresin.
Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca
Dimetro del
Cierrea
(mm)
Intervalo de Ajuste
Sugerido con
Torque Aplicado
Manualmenteb
(pulgada-libras)
Intervalo de Ajuste
Sugerido con
Torque Aplicado
Manualmenteb
(Newton-metros)
0,56
10
0,68
13
0,90
15
59
0,561,02
18
710
0,791,13
20
812
0,901,36
914
1,021,58
1018
1,132,03
1,362,37
28
1221
30
1323
1,472,60
33
1525
1,692,82
38
1726
1,922,94
43
1727
1,923,05
48
1930
2,153,39
53
2136
2,374,07
58
2340
2,604,52
63
2543
2,824,86
66
2645
2,945,08
70
2850
3,165,65
83
3265
3,627,35
86
4065
4,527,35
89
4070
4,527,91
100
4570
5,097,91
110
4570
5,097,91
120
5595
6,2210,74
132
6095
6,7810,74
a
b
Para probrar envases con dimetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al dimetro de cierre de mayor tamao siguiente.
Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores
en ambos lados de retiro y aplicacin est disponible con los siguientes intervalos: 1) 025 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2)
050 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0100 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para ms
detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closures ASTM Method D3198, publicado por la ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
Mtodo 2: Usar 10 unidades de prueba para este mtodo. Proveer un mnimo de 10 cavidades de blster por cada unidad de
prueba. Si la tira contiene menos de 10 cavidades, agrupar suficientes tiras para formar una unidad de prueba que contenga al
menos 10 cavidades. Esto es necesario para proveer una ganancia en peso suficiente en cada intervalo de tiempo. Llenar con
un desecante previamente secado y sellar los blsteres en un equipo capaz de llenar y sellar correctamente el blster. El desecante debe llenar la cavidad. El peso total del desecante debe ser la cantidad suficiente para cumplir con el requisito de evitar
la saturacin parcial del desecante antes de completar la prueba. Llenar los blsteres en una atmsfera de humedad baja (lo
ms baja posible, pero con una humedad relativa de no ms de 50%). No exponer los desecantes a la humedad ambiental por
ms de 30 minutos antes de sellar. Identificar cada muestra de prueba con tinta indeleble; no usar etiquetas. Una unidad de
prueba constar de una o ms muestras de prueba. Agrupar las muestras de prueba en unidades de prueba.
Pesar cada unidad de prueba a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para el tiempo cero. Colocar todas las unidades de prueba en la cmara de prueba (humedad relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la
pesada. Pesar todas las unidades de prueba en intervalos de tiempo de 7 das 1 hora. Pesar las unidades de prueba en los das
Captulos
22
24
Captulos
USP 38
7; 14; 21; 28 y 35 para obtener 5 datos en estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo 0 hasta el da 7
es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes de pesar a cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante 30 5 minutos a la temperatura y humedad relativa de pesada controladas. Limitar el tiempo fuera de la cmara a menos de 2 horas.
Registrar los pesos de manera apropiada para luego calcular la lnea de regresin.
Puede ser que no se consiga alcanzar toda la precisin y sensibilidad que este mtodo puede proveer al medir los blsteres
de barrera ultra alta. Para blsteres de barrera ultra alta, las unidades de prueba deben tener no menos de 10 cavidades, pero
no ms de 30. Los ejemplos incluyen blsteres de aluminio-aluminio o blsteres muy pequeos hechos de otros materiales. Alternativamente, se puede duplicar o triplicar el tiempo de los intervalos de pesada para lograr una ganancia en peso de la
muestra de prueba de al menos 6 mg por intervalo.
Mtodo 3: Preparar las unidades de prueba segn se indica en el Mtodo 2. Colocar todas las unidades de prueba en la cmara de prueba (humedad relativa de 75% a 40) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar las unidades de prueba luego
de 2 das (48 1 hora). En ese momento, la diferencia en peso (la ganancia en peso) se divide por el nmero de blsteres y das
(2) en cada unidad de prueba y esto se toma como la velocidad de transmisin de vapor hmedo en mg/blster/da. El nmero
de blsteres analizados depende de las caractersticas del material de barrera, del tamao del blster y de la sensibilidad de la
balanza usada en la prueba. Para este mtodo, se puede obviar el requisito de cinco pesadas consecutivas debido a que el
desecante se satura rpidamente cuando se envasa en un envase de barrera baja y se almacena a una humedad relativa de
75% a 40. [NOTAPara envases unitarios y de dosis nica de barrera baja, la ganancia en peso despus del segundo da
muestra un perfil curvilneo tpico de la cercana a la saturacin del desecante. Obtener cinco pesadas dentro de los 2 das no
es viable y podra aumentar la variabilidad. Los Mtodos 2 y 3 pueden requerir el uso de mltiples tiras de blsteres agrupadas
para obtener ganancias en peso con una magnitud suficiente para usar la sensibilidad de la balanza que se usa. Al agruparlas,
estas tiras o muestras de prueba se denominan unidades de prueba. La ganancia en peso en cada periodo de pesada deber
ser 20 veces la sensibilidad de la balanza y la sensibilidad de la balanza es 3 veces la precisin de la balanza. En otras palabras,
la ganancia en peso mnima por intervalo de tiempo debe ser al menos 60 veces la precisin de la balanza.]
CLCULOS
Para los Mtodos 1 y 2, realizar el anlisis de regresin para cada unidad de prueba. Por lo regular, el punto de datos inicial
(en el da 0) no se incluye en el ajuste de la lnea de regresin. La pendiente de la lnea de regresin es la velocidad de transmisin de vapor hmedo de cada unidad de prueba. Para el Mtodo 1, la pendiente es la velocidad de transmisin de vapor hmedo para el envase de unidades mltiples correspondiente. Para el Mtodo 2, la velocidad de transmisin de vapor hmedo
de cada cavidad de blster se calcula dividiendo la pendiente por el nmero de cavidades en cada unidad de prueba.
Para el Mtodo 3, calcular la ganancia en peso en mg/da desde el da 0 hasta el da 2 usando las 10 unidades de prueba. La
velocidad de transmisin de vapor hmedo de cada blster se calcula dividiendo la ganancia en peso por 2 (para 2 das) y el
nmero de blsteres en cada unidad de prueba.
Ecuacin de Regresin:
W = I + MT
Clculos:
Interseccin (I) = W MT
donde
M = pendiente de la lnea de regresin
N = nmero de datos (cada dato consta de un peso y un tiempo)
W = peso medido
W = media del peso total
T = tiempo de muestreo
T = media del tiempo de muestreo total
I = ordenada al origen de la lnea de regresin (punto en el que la lnea de regresin se intersecta con el eje vertical)
igual a la suma de productos cruzados (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar la media del peso total del
valor en peso y la media del tiempo total del valor de tiempo y multiplicar las dos diferencias para obtener un producto cruzado. Posteriormente, sumar todos los productos cruzados N).
USP 38
igual a la suma de las desviaciones cuadrticas (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar el tiempo medio
total del valor de tiempo y elevar al cuadrado la diferencia. Posteriormente, sumar todas las diferencias cuadradas N).
RESULTADOS
Mtodo 1: Informar la velocidad de transmisin de vapor hmedo como el valor promedio, en mg/da por envase, y la desviacin estndar de las 15 pendientes. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Mtodo 2: Informar la velocidad de transmisin de vapor hmedo como el valor promedio, en mg/da por cavidad, y la desviacin estndar de las 10 pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Mtodo 3: Informar la velocidad de transmisin de vapor hmedo como el valor promedio desde el da 0 hasta el da 2, en
mg/da por blster, y la desviacin estndar de las 10 pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de
envase cierre analizado.
Clasificacin para Sistemas de Envasado para Envases de Unidades Mltiples para Formas
Farmacuticas Orales Slidas
DESECANTE
Colocar una cantidad de cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 83 en un recipiente poco profundo, procurando excluir el
polvo fino, secar a 110 durante 1 hora y enfriar en un desecador.
PROCEDIMIENTO
Seleccionar 12 envases de tamao y tipo uniformes, limpiar las superficies de sellado con un pao libre de pelusa y cerrar y
abrir cada envase 30 veces. Cerrar el envase firme y uniformemente cada vez. Cerrar los envases con tapa de rosca con un
torque dentro del intervalo especificado en la Tabla 2. Agregar Desecante a 10 de los envases, designados como envases de
prueba, llenando cada uno hasta 13 mm por debajo del cierre si el volumen del envase es 20 mL o ms, o llenando cada uno
hasta dos tercios de su capacidad si el volumen del envase es menos de 20 mL. Si el interior del envase tiene ms de 63 mm
de profundidad, puede colocarse un relleno inerte o un espaciador en el fondo para minimizar el peso total del envase y Desecante; la capa de Desecante en dicho envase no debe ser de menos de 5 cm de profundidad. Cerrar cada envase inmediatamente despus de agregar el Desecante, aplicando el torque especificado en la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de
rosca. A cada uno de los 2 envases restantes, designados como controles, agregar un nmero suficiente de perlas de vidrio para
lograr un peso aproximadamente igual al de cada uno de los envases de prueba y cerrarlos, aplicando el torque especificado en
la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de rosca. Registrar el peso de los envases individuales as preparados con una
aproximacin de 0,1 mg si el volumen del envase es menos de 20 mL, con una aproximacin de 1 mg si el volumen del envase es mayor o igual a 20 mL pero menos de 200 mL, o con una aproximacin de 1 centigramo (10 mg) si el volumen del
envase es mayor o igual a 200 mL y almacenar a una humedad relativa de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTA
Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la
humedad especificada. Se pueden emplear otros mtodos para mantener estas condiciones.] Despus de 336 1 hora (14
das), registrar el peso de los envases individuales de la misma manera. Llenar completamente cinco envases vacos del mismo
tipo y tamao que los envases en anlisis con agua o con un slido no compresible y de libre fluidez, como perlas de vidrio
pequeas bien apisonadas, hasta el nivel indicado por la superficie del cierre cuando est colocado en su lugar. Transferir el
contenido de cada envase a una probeta graduada y determinar el volumen promedio de los envases, en mL. Calcular la velocidad de transmisin de vapor hmedo, en mg/da/L:
(1000/14V)[(TF TI) (CF CI)]
V = volumen del envase (mL)
TF = peso final de cada envase de prueba (mg)
Ti = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los dos controles (mg)
3 Cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 adecuado est disponible comercialmente como el Artculo JT1313-1 en VWR International (www.vwr.com; telfono
1-800-952-5000).
Captulos
El procedimiento y esquema de clasificacin siguientes se proveen para evaluar las caractersticas de transmisin de vapor
hmedo de envases de unidades mltiples. La informacin recopilada debe usarse para tomar una decisin informada con respecto a la aptitud del sistema de envasado para formas farmacuticas orales slidas.
USP 38
Ci = peso promedio inicial de los dos controles (mg)

Clasificacin: Los sistemas de envasado son impermeables si no ms de 1 de los 10 envases de prueba excede 100 mg/da/L
en la transmisin de vapor hmedo, y ninguno excede 200 mg/da/L. Los sistemas de envasado son bien cerrados si no ms de
1 de los 10 envases de prueba excede 2000 mg/da/L en la transmisin de vapor hmedo, y ninguno excede 3000 mg/da/L.
ENVASES DE POLIETILENO Y POLIPROPILENO
Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado trmico de un laminado de aluminiopolietileno, u otro sello
apropiado.4 Analizar segn se indica en la seccin Procedimiento.
Clasificacin: Los envases de polietileno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor hmedo excede de 10 mg/da/L en no ms de 1 de los 10 envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/da/L. Los envases de
polietileno de baja densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor hmedo excede de 20 mg/da/L
en no ms de 1 de los 10 envases de prueba y ninguno excede de 30 mg/da/L.
Los envases de polipropileno analizados cumplen con los requisitos si la transmisin de vapor hmedo no excede de 15
mg/da/L en ms de 1 de los 10 envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/da/L.
Captulos
Clasificacin para Sistemas de Envasado para Envases de Unitarios y Envases de Dosis nica para
Formas Farmacuticas Orales Slidas
hmedo de envases unitarios y envases de dosis nica. La informacin obtenida debe usarse para tomar una decisin informada con respecto a la aptitud del sistema de envasado para formas farmacuticas orales slidas.
DESECANTE
Secar pellets de desecante adecuado5 a 110 durante 1 hora antes de su uso y enfriar en un desecador. Usar pellets que
pesen aproximadamente 400 mg cada uno y con un dimetro de aproximadamente 8 mm. [NOTASi fuera necesario, debido
al tamao limitado de los envases de dosis nica, se pueden usar pellets que pesen menos de 400 mg cada uno y que tengan
un dimetro menor de 8 mm.]
PROCEDIMIENTO
Mtodo 1: Sellar no menos de 10 envases de dosis nica con un pellet en cada uno y sellar 10 envases de dosis nica vacos
adicionales que servirn de control, usando dedales o pinzas con extremos almohadillados para manipular los envases sellados.
Enumerar los envases y registrar los pesos individuales6 con una aproximacin de 1 mg. Pesar los controles de la misma unidad
y dividir el peso total por el nmero de controles para obtener el promedio. Almacenar todos los envases a una humedad relativa de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTAUn sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de
agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros mtodos para mantener estas condiciones.] Despus de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo mltiplo de ste (ver Clasificacin), retirar los
envases de la cmara y permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el rea de pesada. Registrar nuevamente el peso
de los envases individuales y de los controles combinados de la misma manera. [NOTASi algn pellet indicador se torna de
color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso del grnulo excede de 10%, terminar la prueba y considerar
vlidas slo las determinaciones anteriores.] Devolver los envases a la cmara de humedad. Calcular, con dos cifras significativas, la velocidad de transmisin de vapor hmedo, en mg/da, de cada envase tomado:
(1/N)[(WF WI) (CF CI)]
N = nmero de das transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
WF = peso final de cada envase de prueba (mg)
Wi = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los controles (mg)
Ci = peso promedio inicial de los controles (mg)
4 Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una
segunda capa de papel de aluminio de no menos de 0,018 mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo adecuados. Se puede obtener
tambin un sellado apropiado mediante el empleo de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por 60% de cera amorfa refinada y 40% de cera de
parafina cristalina refinada.
5 Los pellets de desecante indicadores de humedad adecuados se encuentran disponibles comercialmente en fuentes tales como Unit Dose Supply, P.O. Box 104,
Ringoes, NJ 08551-0104 (www.unitdose.net; telephone 609-310-1456), como Indicating Desiccant Pellets (Pellets de Desecante Indicadores), Artculo N
TK-1002.
6 Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden requerir periodos de prueba de ms de 28 das si las pesadas se realizan en una balanza para preparar
medicamentos recetados Clase A (ver Balanzas y Aparatos Volumtricos para Prescripciones 1176). El uso de una balanza analtica que permita registrar los pesos
con una sensibilidad de dcima o centsima de miligramo lleva a una caracterizacin ms precisa entre envases y/o perodos de prueba ms cortos.
USP 38
[NOTACuando las velocidades de transmisin de vapor hmedo son menores de 5 mg/da y cuando se observa que los controles llegan a un estado de equilibrio dentro de los 7 das, las velocidades individuales de transmisin de vapor hmedo pueden determinarse con mayor exactitud empleando en el clculo los valores obtenidos a los 7 das para los pesos del envase de
prueba y del envase de control como WI y CI, respectivamente. En tal caso, un intervalo de prueba adecuado para la Clase A
(ver Clasificacin) sera no menos de 28 das despus del periodo de equilibrio inicial de 7 das (un total de 35 das).]
Mtodo 2: Usar este procedimiento para empaques (por ejemplo, tarjetas de blsteres) que incorporen varios envases de dosis nica o blsteres sellados por separado. Sellar un nmero suficiente de empaques, de modo que se sometan a la prueba no
menos de cuatro empaques y un total de no menos de 10 envases de dosis nica o blsteres llenados con un pellet en cada
unidad. Sellar el mismo nmero de empaques vacos, de los que cada uno contenga el mismo nmero de envases de dosis
nica o blsteres que los usados en los empaques de prueba, para utilizarlos como control. Almacenar todos los envases a una
humedad relativa de 75 3% y a una temperatura de 23 2. [NOTAUn sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por
cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros
mtodos para mantener estas condiciones.] Despus de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo mltiplo de ste (ver
Clasificacin), retirar los empaques de la cmara y dejar que se equilibren durante aproximadamente 45 minutos. Registrar los
pesos de los empaques individuales y devolverlos a la cmara. Pesar los empaques control como una sola unidad y dividir el
peso total por el nmero de empaques control para obtener el peso promedio del empaque vaco. [NOTASi algn pellet indicador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso promedio del pellet en cualquiera de los
empaques excede de 10%, terminar la prueba y considerar vlidas slo las determinaciones anteriores.] Calcular, con dos cifras
significativas, la velocidad promedio de transmisin de vapor hmedo, en mg/da, para cada envase de dosis nica o blster en
cada empaque tomado:
N = nmero de das transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
X = nmero de unidades por empaque selladas por separado
WF = peso final de cada empaque de prueba (mg)
Wi = peso inicial de cada empaque de prueba (mg)
CF = peso final de los empaques de control (mg)
Ci = peso inicial de los empaques de control (mg)
Usando el Desecante indicado para el Mtodo 1 y el Mtodo 2, pesar los envases o empaques de prueba y de control despus
de cada 24 horas y despus de los intervalos de prueba adecuados para las pesadas finales. WF y CF son segn se indica a continuacin: 24 horas para la Clase D; 48 horas para la Clase C; 7 das para la Clase B; y no menos de 28 das para la Clase A.
Clasificacin: Los envases de dosis nica individuales analizados segn el Mtodo 1 se designan de la siguiente manera: Clase
A si no ms de 1 de 10 envases analizados excede de 0,5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor hmedo y ninguno
excede de 1 mg/da; Clase B si no ms de 1 de 10 envases analizados excede de 5 mg/da y ninguno excede de 10 mg/da;
Clase C si no ms de 1 de 10 envases analizados excede de 20 mg/da y ninguno excede de 40 mg/da; y Clase D si los envases
analizados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisin de vapor hmedo.
Los envases analizados segn el Mtodo 2 se designan de la siguiente manera: Clase A si ningn envase analizado excede de
0,5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor hmedo promedio para blster; Clase B si ningn envase analizado excede
de 5 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor hmedo promedio para blster; Clase C si ningn envase analizado excede de 20 mg/da en la velocidad de transmisin de vapor hmedo promedio para blster; y Clase D si los envases analizados no
cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisin de vapor hmedo promedio para blster.
Clasificacin para Sistemas de Envasado para Envases de Unidades Mltiples y Envases de Dosis
nica para Formas Farmacuticas Orales Lquidas
hmedo de envases de unidades mltiples. La informacin recopilada debe usarse para tomar una decisin informada con respecto a la aptitud del sistema de envasado para formas farmacuticas lquidas orales. [NOTADeterminar los pesos de los sistemas de envasecierre individuales (frasco, sello interno, si se usa, y cierre), tanto el peso de tara como el peso de llenado, con
una aproximacin de 0,1 mg si la capacidad del frasco es menos de 200 mL; con una aproximacin de 1 mg si la capacidad
del frasco es 200 mL o ms, pero menos de 1000 mL; o al centigramo ms cercano (10 mg) si la capacidad del frasco es 1000
mL o ms.]
PROCEDIMIENTO
Seleccionar 12 frascos de tamao y tipo uniformes y limpiar las superficies de sellado con un pao libre de pelusa. Acondicionar cada frasco con un cierre, recubrimiento interno del cierre (si corresponde) y un sello. Numerar cada sistema de envase
cierre y registrar el peso de tara.
Retirar los cierres y, usando una pipeta, llenar 10 frascos con agua hasta la capacidad de llenado. Llenar dos envases con
perlas de vidrio hasta el mismo peso de los envases de prueba llenos. Si se emplean cierres de rosca, aplicar una fuerza de
Captulos
[1/(N X)][(WF WI) (CF CI)]
USP 38
torsin que est dentro del intervalo especificado en la Tabla 2 y almacenar los envases sellados a una temperatura de 25 2 y
una humedad relativa de 40 2%. Despus de 336 1 horas (14 das), registrar el peso de los envases individuales y calcular la
velocidad de prdida de peso en agua, en porcentaje por ao, para cada frasco tomado:
[(W1i WT) (W14i WT) (WC1 WC14)] 365 {[100/(W1i WT)] 14}
W1i = peso inicial de cada frasco individual (i)
WT = peso de tara
W14i = peso de cada frasco individual (i) a los 14 das
WC1 = peso inicial del envase de control en el da 1
WC14 = peso del envase de control a los 14 das
Clasificacin: El sistema de envasado cumple con los requisitos para ser impermeable si el porcentaje de prdida de peso en
agua no excede de 2,5% por ao en no ms de 1 de los 10 envases de prueba y ninguno excede de 5,0% por ao.
TRANSMISIN ESPECTRAL
Aparato7
Captulos
Utilizar un espectrofotmetro de sensibilidad y exactitud adecuadas, adaptado para medir la cantidad de luz transmitida a
travs de los materiales plsticos usados en los envases farmacuticos. Adems, el espectrofotmetro tiene la capacidad de medir y registrar la luz transmitida en rayos difusos y paralelos.
Procedimiento
Seleccionar trozos que representen el promedio del espesor de la pared. Cortar secciones circulares de dos o ms reas del
envase y recortarlas, segn sea necesario, para obtener segmentos de un tamao adecuado para montarlos en el espectrofotmetro. Despus de cortarlas, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra fuera demasiado
pequea para abarcar la abertura del portamuestras, tapar el espacio sobrante de la abertura con un papel opaco o una cinta
adhesiva, siempre y cuando la longitud de la muestra exceda la de la ranura del espectrofotmetro. Limpiar la muestra inmediatamente antes de montarla en el portamuestras con papel para limpiar objetivos. Montar la muestra con ayuda de una cera
adherente, o empleando otro medio adecuado, y tomar las precauciones necesarias para evitar dejar huellas digitales u otras
marcas en las superficies a travs de las cuales debe pasar la luz. Colocar la seccin en el espectrofotmetro con su eje cilndrico paralelo al plano de la ranura y aproximadamente centrado en relacin a la ranura. Cuando est correctamente colocada, el
haz de luz es normal en relacin a la superficie de la seccin y las prdidas por reflexin son mnimas.
Medir continuamente la transmitancia de la seccin en relacin al aire en la regin espectral de inters con un instrumento
de registro o en intervalos de aproximadamente 20 nm con un instrumento manual, en la regin de 290450 nm.
Lmites
La transmisin espectral observada no excede los lmites que se proporcionan en la Tabla 3 para envases destinados para uso
parenteral. La transmisin espectral observada para envases de plstico para productos destinados a la administracin oral o
tpica no excede de 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo de 290450 nm.
Tabla 3. Lmites para Plsticos de Clases I a VI
Tamao Nominal
(en mL)
Porcentaje Mximo de Transmisin Espectral

a Cualquier Longitud
de Onda
entre 290 y 450 nm
50
45
40
10
35
20
30
50
15
[NOTANingn envase con un tamao intermedio a los listados anteriormente presenta una transmisin espectral mayor que
la del envase de tamao inmediatamente superior listado en la Tabla 3. Para envases con tamaos superiores a 50 mL, se aplican los lmites establecidos para envases de 50 mL.]
7 Para ms detalles sobre el aparato y los procedimientos, se pueden consultar las siguientes publicaciones de la ASTM International, 100 Barr Harbor Drive, West
Conshohocken, PA 19428-2959: Standard Test Method of Test for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plastics, ASTM Method D1003-11e1;
Standard Practice for Computing the Colors of Objects by Using the CIE System, ASTM Method E308-08.
Pruebas Fsicas / 691 Algodn 505
USP 38
691 ALGODN
Antes de determinar la absorbencia y la longitud de la fibra, extraer el Algodn de su envoltorio y acondicionarlo durante no
menos de 4 horas en una atmsfera estndar a una humedad relativa de 65 2% a 21 1,1 (70 2F).
Prueba de Absorbencia
ProcedimientoPreparar una canastilla de prueba usando alambre de cobre de aproximadamente 0,4 mm de dimetro
(N 26 B. & S.) que no pese ms de 3 g, con forma de cilindro de aproximadamente 5 cm de dimetro y 8 cm de profundidad
y con espacios de aproximadamente 2 cm entre cada alambre. Tomar porciones de algodn purificado que pesen 1 0,05 g
de cinco partes diferentes del paquete, tirando pero sin cortar. Colocar las porciones combinadas en la canastilla y pesar. Sostener la canastilla por uno de los lados aproximadamente a 12 mm por encima de la superficie del agua a 25 1 y, luego,
dejarla caer en el agua. Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronmetro, el tiempo requerido en segundos
hasta que la canastilla se sumerja completamente.
Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 10 segundos en la misma posicin horizontal; luego colocarla de
inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso de la canastilla de prueba y del algodn purificado para
determinar el peso del agua absorbida.
Longitud de Fibra
Clasificador Doble de Fibra de Algodn

consta de dos bancos de peines rgidamente montados uno al lado del otro sobre una base comn. Cada banco de peines
consta de por lo menos 12 peines individuales, separados 3,2 mm uno detrs de otro y montados en ranuras para que a medida que se acercan durante el proceso de fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios, puedan descender debajo del plano
de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila de dientes puntiagudos de 12 mm de largo exactamente alineados, que
son agujas de 0,38 mm de dimetro. Los dientes estn espaciados a una distancia de 62 a 25 mm entre s a lo largo de una
extensin de aproximadamente 50 mm.
El equipo accesorio consta de pinzas para clasificar las fibras, una rejilla para comprimir la fibra, una placa lisa para comprimir la fibra y placas recubiertas de terciopelo. Las pinzas clasificadoras constan de dos piezas de latn de aproximadamente 75
mm de largo unidas en uno de sus extremos y ligeramente curvadas en forma de pico en el otro para agarrar las fibras que
sobresalgan cerca de la superficie de los peines. Por lo general, uno de los bordes sujetadores posee un almohadillado de cuero
o de otro material fibroso. El borde por el que se toman las fibras tiene un ancho de aproximadamente 19 mm.
La rejilla que comprime las fibras consta de una serie de varillas de latn separadas a una distancia de 3,2 mm entre s para
que puedan colocarse entre los peines a fin de apretar las fibras entre los dientes. La placa lisa para comprimir las fibras consta
de una placa pulida de latn de aproximadamente 25 50 mm con una perilla o mango en la superficie superior, mediante el
cual la placa puede pasarse sobre las fibras cuando stas se colocan en la superficie de las placas recubiertas de terciopelo. Las
placas recubiertas de terciopelo, sobre las cuales se pueden distribuir las fibras, son lminas de aluminio de aproximadamente
* NOTAEl mtodo aqu descrito se adapta especialmente al aparato clasificador Suter-Webb Duplex Cotton Fiber, pero introduciendo alteraciones ms o menos
obvias en el procedimiento, tambin se puede llevar a cabo con dos clasificadores Baer dispuestos en serie, o con un aparato Johannsen u otro aparato similar.
Captulos
Para determinar la longitud y la distribucin de la longitud de las fibras de algodn en el algodn purificado emplear el siguiente mtodo:
Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determinacin de la longitud de fibra del algodn purificado en una
atmsfera estable de humedad relativa de 65 2% a 21 1,1 (70 2F).
Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que se adeca bien al clasificador* de mayor uso en la actualidad en los Estados Unidos.
AparatoEl clasificador (ver ilustracin)
Captulos
506 691 Algodn / Pruebas Fsicas
USP 38
100 mm 225 mm 2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de alta calidad, preferentemente de
color negro.
Seleccin del AlgodnDespus de desenrollar el algodn, preparar una muestra de prueba representativa tomando, de
un paquete que contenga de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeos (de aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en
todo el volumen del rollo, tomando 16 trozos representativos de cada mitad longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados
del rollo y tener la precaucin de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para evitar que se seleccionen slo las fibras
largas o las cortas, extraer todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre los dedos.
De los paquetes de no ms de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de los envases de ms de 4 onzas pero no ms de 8 onzas,
tomar 16 trozos, en forma bien distribuida.
Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccionar cada par combinado dividindolos longitudinalmente en dos partes aproximadamente iguales y utilizar una parte en el
mezclado adicional. (La otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o control adicional.)
Repetir el proceso descrito en el prrafo anterior con las sucesivas mitades de la serie bifurcada hasta que slo se obtenga un
trozo: la porcin de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar en forma paralela las fibras de la porcin de prueba final integrada extrayndolas y enrollndolas entre los dedos. Tomar la precaucin de retener todas las fibras, en lo posible
incluyendo aquellas que forman botones (partculas de fibras enmaraadas) y lanillas (masas apelmazadas de fibras), desechando slo las motas (fragmentos de semillas inmaduras con fibras) y todo material extrao que no sea fibra, como por ejemplo
tallos, hojas y fragmentos de las cscaras de las semillas.
De la porcin final integrada descrita en el prrafo anterior, separar longitudinalmente una porcin de prueba de 75 2 mg,
pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de control que pudiera ser necesaria.
ProcedimientoCon la rejilla para comprimir las fibras, insertar cuidadosamente la porcin de prueba pesada en un banco
de peines del clasificador de algodn de modo tal de que se extienda a travs de los peines en ngulos aproximadamente
rectos.
Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una porcin pequea de las fibras extendindolas a travs de los
dientes del peine ms cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las fibras para que emerjan de los peines hacia adelante y transferirlas a las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas en forma paralela entre s y en un
ngulo aproximadamente recto con respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan cerca de la cara del
peine frontal como sea posible. Con la rejilla para comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a los
dientes de los peines. Continuar la operacin hasta que se hayan transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Durante esta transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del primer banco una vez que todas las fibras sobresalientes hayan sido retiradas.
Girar la mquina a 180 y transferir las fibras de algodn nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el
prrafo anterior.
Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante las dos transferencias anteriores, acomodndolas lo ms cerca posible a la superficie frontal del peine prximo. Este emparejamiento de las puntas de las fibras sobresalientes tambin
puede incluir la extraccin de fibras desparejas del frente o de la parte de atrs de los bancos de peines, para volver a colocarlas dentro o sobre el manojo principal de algodn en los peines.
Girar nuevamente la mquina a 180. Soltar en forma sucesiva los peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de
las fibras ms largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras
que ms sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara
frontal del peine ms prximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones de la misma manera hasta que se hayan extrado todas las fibras. Para no alterar excesivamente la porcin de prueba y de ese modo viciar el fraccionamiento de longitudes en grupos, hacer varias tracciones (8 a 10) entre cada par de peines.
Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con
los extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos distales colocados en una lnea recta. Presionar luego hacia
abajo suavemente y en forma homognea con la placa para comprimir fibras antes de liberar la traccin de las pinzas. Emplear
no menos de 50 y no ms de 100 tracciones para fraccionar la porcin de prueba.
Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente media pulgada) o ms de longitud y pesar el grupo con
una aproximacin de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1/4 de pulgada) o
menos de longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras restantes de longitudes intermedias y pesarlas.
La suma de los tres pesos no difiere del peso inicial de la porcin de prueba en ms de 3 mg. Dividir el peso de cada uno de
los dos primeros grupos por el peso de la porcin de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de fibra en los dos intervalos
de longitud.
USP 38
Pruebas Fsicas / 696 Slidos Cristalinos 507
695 CRISTALINIDAD
Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los requisitos de cristalinidad establecidos en la monografa individual de un frmaco.
ProcedimientoEn Microscopa ptica 776 se describe un detallado procedimiento de la prueba.
696 CARACTERIZACIN DE SLIDOS CRISTALINOS POR

MICROCALORIMETRA Y CALORIMETRA DE DISOLUCIN
Para los propsitos de este captulo, los materiales cristalinos, parcialmente cristalinos y amorfos se consideran slidos.
INTRODUCCINEL CONCEPTO DE CRISTALINIDAD
MTODO 1MICROCALORIMETRA (DETERMINACIN DE CONTENIDO AMORFO)

La mayora de los procesos qumicos, fsicos y biolgicos tienen un intercambio de calor asociado. La microcalorimetra es
una tcnica altamente sensible para monitorear y cuantificar los cambios exotrmicos (que producen de calor) y endotrmicos
(que absorben calor) asociados con tales procesos. La tcnica permite determinar la velocidad y extensin de las reacciones
qumicas, los cambios de fase o los cambios de estructura.
Se pueden observar eventos trmicos que producen nicamente una fraccin de un microvatio usando microcalorimetra.
Esto significa que se deben detectar diferencias de temperatura menores de 10-6 K. La microcalorimetra por lo regular emplea
el principio de flujo de calor (prdida de calor), donde, en un vaso definido trmicamente, el calor producido (o absorbido)
Captulos
Una retcula cristalina perfectamente ordenada, donde cada molcula ocupa su lugar esperado en la retcula es un ideal que
casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el que un slido contiene la mayor densidad posible de imperfecciones (defectos de diversas dimensionalidades), donde se pierde todo el orden de largo alcance y donde slo permanece el
orden de corto alcance, impuesto por las molculas adyacentes ms cercanas. Los cristales reales estn en algn punto entre
estos dos extremos. La posicin de un cristal en una escala delimitada por estos dos extremos se denomina cristalinidad.
Todos los cristales reales, incluso los que estn en estado puro, poseen algunas imperfecciones o defectos en su retcula, que
incrementan tanto la energa (entalpa en condiciones de presin atmosfrica constante) como el desorden (expresado como
la entropa) de su retcula cristalina. Se dice que un cristal es altamente cristalino cuando posee una densidad relativamente
baja de imperfecciones y una cristalinidad alta. Por el contrario, una partcula con una densidad de imperfecciones relativamente alta se dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad. En trminos ideales, a una partcula totalmente amorfa le corresponde una cristalinidad de cero. Las partculas amorfas pueden contener dominios ordenados de alguna manera que pueden actuar como ncleos para la cristalizacin; de tales partculas denominadas amorfas se dice que poseen
una cristalinidad de bajo nivel pero finita.
La capacidad de detectar y cuantificar la cantidad de material amorfo dentro de una sustancia altamente cristalina es de
gran importancia durante el desarrollo y la fabricacin subsiguiente de una preparacin farmacutica.
En realidad, un polvo probablemente contiene partculas con diferentes grados de cristalinidad, as como puede contener
partculas con formas y tamaos variados. Cuanto ms baja es la cristalinidad de un slido, mayor es su entalpa y su entropa.
El aumento de la entalpa nunca se compensa totalmente con el incremento en la entropa; por lo tanto, la energa libre de
Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento neto. As, cuanto ms baja es la cristalinidad de un material
(polvo), y consecuentemente, cuanto mayor es su carcter amorfo, mayor es su solubilidad intrnseca aparente y su velocidad
de disolucin, pero menor es su estabilidad termodinmica. Debido a la gran relevancia de estas propiedades, la cristalinidad
es asimismo una propiedad importante y es necesario medirla mediante un mtodo adecuado.
En este captulo, la cristalinidad o el contenido de partes amorfas de un polvo se miden mediante mtodos de calorimetra,
tales como microcalorimetra o calorimetra de disolucin, aunque se pueden emplear otros mtodos (p.ej., ver el captulo general Caracterizacin de Slidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difraccin de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) 941).
Muchas sustancias son capaces de cristalizar en ms de un tipo de retcula cristalina, lo que se conoce como polimorfismo.
Cuando se incorpora agua o un disolvente en la retcula cristalina, a los cristales se les denomina hidratos o solvatos. Debido al
diferente orden cristalino y/o conformacin molecular y energa de la retcula, las distintas formas cristalinas a menudo presentan distintas propiedades fsicas. Por cuestiones de simplicidad, las mediciones de calorimetra para determinar el grado de cristalinidad discutida en este captulo asumen una forma cristalina slida que se halla presente slo en el material de inters. La
teora y tcnica experimental se pueden expandir fcilmente a sistemas polimrficos tomando las consideraciones adecuadas
de las diferencias de entalpa entre los polimorfos.
508 696 Slidos Cristalinos / Pruebas Fsicas
USP 38
fluye desde (o hacia dentro del) vaso en un esfuerzo por restablecer el equilibrio trmico con su entorno. La estabilidad trmica
excepcional con sus alrededores debe obtenerse mediante un aislador de calor (heat sink) o un entorno regulado electrnicamente.
La energa trmica de una muestra activa en el vaso de reaccin se canaliza generalmente a travs de elementos Peltier; dichos elementos actan como generadores termoelctricos usando el efecto Seebeck. La energa trmica se convierte en una
seal de voltaje proporcional al flujo de calor.
Por lo general, los resultados se presentan como una medicin de la energa trmica producida por unidad de tiempo (Vatio) en funcin del tiempo.
Aparato
Los microcalormetros a menudo se disean como sistemas gemelos con un vaso de medicin y un vaso de referencia. Los
vasos generalmente estn hechos de vidrio o acero inoxidable. Para ciertas aplicaciones, se pueden usar vasos especialmente
diseados que permiten la adicin de un material gaseoso, lquido o slido.
Calibracin
El microcalormetro se calibra para el flujo de calor (energa por unidad de tiempo) usando fuentes de calor elctrico externas o internas o una reaccin estndar adecuada.
Captulos
Sensibilidad
La sensibilidad del mtodo micocalorimtrico se puede evaluar con respecto a una muestra estndar apropiada, que se analiza de acuerdo con el mtodo correspondiente en conjunto con la determinacin del ruido de la lnea base del instrumento.
Procedimiento
Pesar una cantidad apropiada del material en un vaso adecuado. Cerrar el vaso cuidadosamente para evitar cualquier evaporacin de disolventes y colocar los vasos en el portamuestras. Si resulta apropiado, permitir que el vaso se equilibre a la temperatura de la medicin antes de colocarlo en la posicin de medicin.
Comenzar el anlisis y registrar el flujo de calor con el tiempo sobre la abscisa y el flujo de calor sobre la ordenada (especificar la direccin del flujo de calor exotrmico o endotrmico).
Deteccin y Cuantificacin de Contenido Amorfo en PolvosEl estado amorfo es metaestable con respecto al estado
cristalino; por consiguiente, puede producirse recristalizacin. La medicin del calor de recristalizacin permite determinar el
contenido amorfo mediante el rea del pico de recristalizacin. Resulta posible cuantificar el contenido amorfo de la muestra
relacionando el resultado del microcalormetro para una muestra con el obtenido a partir de un estndar amorfo. El intervalo
de contenido amorfo abarcado por este mtodo depende de la sustancia individual que se va a analizar. En casos favorables, se
pueden alcanzar lmites de deteccin por debajo de 1%.
Es posible iniciar la recristalizacin sometiendo la muestra a una humedad relativa ms alta o a una atmsfera que contenga
vapor orgnico. La muestra generalmente se coloca en una ampolla que tambin contiene un pequeo tubo de ensayo que a
su vez contiene una solucin salina acuosa saturada, un disolvente orgnico o una mezcla de disolventes.
El calor de recristalizacin por lo regular se mide usando una masa de muestra fija colocada en un vaso de vidrio o acero. Al
seleccionar el tubo de ensayo que contiene la solucin salina saturada o el disolvente orgnico se debe optar por un tubo lo
suficientemente largo para permitir una saturacin total de la atmsfera sobre la muestra. La masa de la muestra y la naturaleza de la atmsfera de vapor sobre la muestra deben permitir que la recristalizacin ocurra de tal forma que se observe un pico
definido, claramente separado de los eventos trmicos iniciales ocasionados por la introduccin de la muestra.
Las condiciones en las que ocurra la transicin de la fase amorfa a un estado cristalino termodinmicamente ms estable
tendrn un impacto significativo sobre el tiempo de recristalizacin. En particular, las mezclas fsicas de material puramente
amorfo y cristalino se comportarn de forma diferente a un material parcialmente cristalino. Estos efectos se deben tomar en
cuenta al desarrollar un mtodo.
La Figura 1 muestra una respuesta tpica para la recristalizacin de un material mayoritariamente amorfo. La primera parte de
la curva representa diversos procesos concurrentes que ocurren de manera simultnea, tales como la absorcin de vapor de
agua en las partes amorfas del polvo y por la generacin de vapor de agua a partir del tubo de ensayo. Despus de esta respuesta inicial, se presenta una gran respuesta exotrmica ocasionada por la recristalizacin del material amorfo. Tambin incluida, aunque inobservable, est la expulsin del exceso de agua de las partes recristalizadas y su condensacin. Por consiguiente, el rea bajo esta respuesta de recristalizacin exotrmica es proporcional al calor de recristalizacin.
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Pruebas Fsicas / 696 Slidos Cristalinos 509
Figura 1. Resultado microcalorimtrico tpico de energa (en mW) en funcin del tiempo (en horas): pico de colapso amorfo
(I) y pico de recristalizacin (II) para lactosa mayoritariamente amorfa a 25 y a una humedad relativa de 75%.
MTODO 2CALORIMETRA DE DISOLUCIN (DETERMINACIN DE CRISTALINIDAD)
Pc (%) = 100(DHss DHsa)/(DHsc DHsa)

Resulta claro que la cristalinidad expresada en una escala porcentual depende de tres valores medidos y que las entalpas de
disolucin se pueden reemplazar por otras cantidades fsicas correspondientes que dependan de la cristalinidad. Sin embargo,
el valor de la cristalinidad porcentual de una muestra depende no slo de la naturaleza y del mtodo de preparacin de los dos
estndares de referencia, sino tambin de la eleccin de la cantidad fsica que se mide.
La entalpa de la disolucin se mide ya sea mediante un calormetro de disolucin isoperiblico (con permetro constante, es
decir, camisa) o mediante un calormetro de disolucin isotrmico (con temperatura constante). Por lo general, se realizan como mnimo tres mediciones con cada muestra. Posteriormente, se calcula la media aritmtica de estos tres valores. Los requisitos exactos dependern de la capacidad del equipo y del grado de exactitud requerido.
Calorimetra de Disolucin Isoperiblica

En el calormetro de disolucin isoperiblico, el cambio de temperatura durante el proceso de disolucin ocasiona un cambio correspondiente en la temperatura del sistema disolventesoluto (es decir, en la solucin). Este cambio de temperatura se
mide con un sensor de temperatura, que est conectado a un circuito elctrico que registra una seal elctrica que corresponde al cambio de temperatura. Por lo regular, este cambio de temperatura en forma electrnica se mide a intervalos de tiempo
definidos con precisin para proporcionar datos de temperaturatiempo que una computadora recoge, analiza y posteriormente grafica. Una corrida con un blanco sin la adicin del soluto slido al disolvente normalmente no muestra un cambio
discernible en la pendiente de la grfica de temperaturatiempo.
Para los calormetros de disolucin isoperiblicos, la respuesta es lo suficientemente rpida, pero se deben hacer correcciones por cualquier prdida o ganancia de calor originada a partir del bao. Por lo tanto los calormetros de disolucin isoperiblicos tienen ms ventajas que los calormetros de disolucin isotrmica cuando el proceso de disolucin es relativamente rpido. Para todas las mediciones de la entalpa de la disolucin empleando calormetros de disolucin isoperiblicos, la eleccin
Captulos
La calorimetra de disolucin proporciona un medio para determinar la entalpa de disolucin (es decir, el calor de disolucin
a presin atmosfrica constante) de una sustancia. La entalpa de disolucin se define como la entalpa de la sustancia disuelta
en la solucin a una concentracin definida, menos la entalpa de la sustancia original. El disolvente para el proceso de disolucin debe ser tal que la masa del slido se disuelva dentro de un intervalo de tiempo que corresponda con el tiempo de respuesta del calormetro, segn se analiza a continuacin. La entalpa de una disolucin es proporcional a la cantidad de slido
que se disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpa molar o un gramo para la entalpa especfica. Si la
sustancia posee una pureza adecuada (segn se determina mediante el grado de exactitud requerida) y se conoce su masa
molecular, se prefiere la entalpa molar; en caso contrario, se emplea la entalpa especfica. La entalpa de disolucin depende
levemente tanto de la temperatura, que generalmente es de 25,0, como de la concentracin final del soluto disuelto.
Por lo general, se prefiere expresar la cristalinidad, Pc, de una sustancia en una escala porcentual. Este procedimiento requiere de dos estndares de referencia, a saber, una muestra altamente cristalina para la que se asume una cristalinidad de 100% y
que posea una entalpa de disolucin medida de DHsc, y una muestra amorfa para la que se asume una cristalinidad de 0% y
que posea una entalpa de disolucin medida de DHsa. A partir de estos valores y de la entalpa, DHss, la disolucin medida del
slido en anlisis, se puede calcular la cristalinidad porcentual del slido, Pc, segn se indica a continuacin:
510 696 Slidos Cristalinos / Pruebas Fsicas
USP 38
del disolvente es un paso crtico. La naturaleza y la masa del disolvente y la masa de la muestra se eligen de forma que el
cambio de calor total correspondiente a la disolucin total del slido se complete en el plazo de cinco minutos agitando vigorosamente a una velocidad de rotacin constante dentro del intervalo de 400600 revoluciones/minuto.
Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del calormetro y su contenido para cada corrida del calormetro. Esta
determinacin se logra mediante el calentamiento elctrico del contenido de la celda del calormetro. La capacidad trmica
efectiva se determina de acuerdo con uno de dos protocolosrealizando una determinacin despus del rompimiento de la
ampolla o realizando una determinacin antes y una segunda determinacin despus del rompimiento de la ampolla, y posteriormente promediando los dos resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento elctrico se establecen mediante la
exactitud y confiabilidad de las calibraciones qumicas anteriormente mencionadas.
Calorimetra de Disolucin Isotrmica

En el calormetro de disolucin isotrmico (temperatura constante), el cambio de temperatura durante el proceso de disolucin se compensa mediante un cambio de energa igual pero opuesto, de tal manera que la temperatura del sistema disolventesoluto (es decir, en la solucin) se mantenga esencialmente constante. Este cambio igual pero opuesto de energa se mide
y, cuando se invierte su signo, proporciona la entalpa de disolucin. Para calormetros isotrmicos, la respuesta es relativamente lenta, pero el proceso de compensacin elimina el efecto de prdidas o ganancias de calor causadas por el bao. Por lo
tanto, los calormetros de disolucin isotrmicos son ms ventajosos que los calormetros de disolucin isoperiblicos cuando
el proceso de disolucin es relativamente lento.
Captulos
Solucin de Calibracin del Calormetro

Para asegurar la exactitud del calormetro, se deben realizar calibraciones qumicas regularmente. Para una disolucin endotrmica, la calibracin del calormetro se verifica midiendo el calor absorbido durante la disolucin de cloruro de potasio en
agua destilada a 298,15 K (25,0). El cambio de entalpa establecido en este proceso endotrmico es 235,5 J/g (17,56 kJ/mol).
Para una disolucin exotrmica, el calormetro se verifica midiendo el calor producido durante la disolucin de 5 g/L de trometamina [tris(hidroximetil)aminometano, THAM] en una solucin acuosa de cido clorhdrico 0,1 M a 298,15 K (25,0). El calor
establecido para el proceso mencionado anteriormente es de 246,0 J/g (29,80 kJ/mol).
Manejo de la Muestra
La estabilidad qumica y fsica de los slidos puede verse reducida al disminuir la cristalinidad. En particular, los slidos de
baja cristalinidad, especialmente los slidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua de la atmsfera, lo que provoca cristalizacin y un aumento correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras anhidras cuya cristalinidad se va a
determinar, deben almacenarse en condiciones de cero humedad o a niveles inferiores a la humedad crtica en cmaras selladas que contengan un desecante que preferentemente contenga un indicador de eficacia. Cuando se van a llevar a cabo estudios de cristalinidadhumedad, la muestra se almacena en una cmara sellada que contenga una solucin salina saturada para
proporcionar una humedad relativa definida.
697 CONTENIDO EN ENVASES PARA INYECTABLES
Oficial el 1 de mayo de 2016

Cada envase de inyeccin debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de frmaco (ver Formas Farmacuticas 1151, Exceso de Volumen en Inyectables). Dicha extraccin se debe realizar de acuerdo a las
instrucciones del etiquetado, cuando se provean.
DETERMINACIN DEL VOLUMEN DE INYECCIN EN LOS ENVASES

Esta seccin est armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a esta seccin armonizada. Una porcin del presente texto (ver ms adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; est marcada con
smbolos () para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las preparaciones viscosas y oleosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosamente justo antes de extraer el contenido. Luego, el contenido se enfra a una temperatura de 2025 antes de medir el volu-
Pruebas Fsicas / 698 Volumen de Entrega 511
USP 38
USP38
698 VOLUMEN DE ENTREGA

PROPSITO
Las siguientes pruebas estn diseadas para garantizar que las preparaciones lquidas orales, cuando se transfieren desde su
envase original, entreguen el volumen de la forma farmacutica que se declara en la etiqueta del artculo.
ALCANCE
Estas pruebas se aplican a productos que se dispensan vertiendo desde el envase. Estas pruebas se aplican a productos que
se suministran como preparaciones lquidas o como preparaciones lquidas reconstituidas a partir de slidos mediante el agregado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas pruebas no son obligatorias para los artculos envasados en
envases unitarios cuando la monografa incluye la prueba de Uniformidad de Unidades de Dosificacin 905.
DETERMINACIN DE DENSIDAD
Debido a la tendencia de las preparaciones lquidas orales a atrapar aire al ser agitadas o transferidas, determinar primero la
masa entregada resulta un mtodo ms exacto de determinacin del volumen entregado, usando luego la densidad del material para convertir la masa en volumen entregado. Para usar este mtodo, se requiere una determinacin de la densidad del
material. A continuacin se indica un mtodo para determinar la densidad:
1. Tarar un matraz volumtrico de 100 mL que contenga 50,0 mL de agua.
2. Agregar aproximadamente 25 g de producto bien agitado, agitando el contenido por rotacin suave hasta mezclar.
3. Volver a pesar el matraz.
Captulos
men. Las formulaciones de slidos estriles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de retirar
su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, segn sea apropiado.
Envases MonodosisSeleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 10 mL o ms, 3 envases si el volumen nominal es
ms de 3 mL y menos de 10 mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Tomar individualmente el contenido
total de cada envase seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y
provista con una aguja de calibre 21 con una longitud de no menos de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire
de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada para contener ms que para verter los volmenes marcados) de un tamao tal que el volumen que se va a medir ocupe
al menos el 40% de su volumen graduado. Como alternativa, el volumen del contenido, en mL, puede calcularse como la
masa, en g, dividida por la densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de una cantidad
suficiente de envases puede combinarse para obtener el volumen requerido para la medicin, siempre que, para cada envase,
se emplee un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 10 mL o ms se puede determinar
abrindolos y vaciando el contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, no es menor que la suma de los volmenes nominales de los envases tomados
colectivamente.
Envases MultidosisPara Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un nmero especfico de dosis de un volumen determinado, seleccionar 1 envase y proceder segn se indica para los envases monodosis, empleando el mismo nmero
de conjuntos diferentes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos
de la dosis indicada.
Inyecciones en Cartuchos o Jeringas PrellenadasSeleccionar 1 envase si el volumen es 10 mL o ms, 3 envases si el
volumen nominal es ms de 3 mL y menos de 10 mL, o 5 envases si el volumen nominal es 3 mL o menos. Si fuera necesario,
equipar los envases con los accesorios requeridos para su uso (aguja, mbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados
tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la aguja, empujando el mbolo en forma lenta y continua. Determinar el volumen, en mL, calculado como la masa, en g, divida por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.
Soluciones Intravenosas de Gran VolumenPara soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a
una probeta graduada seca, de una capacidad tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen
nominal de la probeta. Medir el volumen transferido.
El volumen no es menor que el volumen nominal.
512 698 Volumen de Entrega / Pruebas Fsicas
USP 38
4. Agregar desde una bureta, una cantidad de agua medida con exactitud hasta llevar el contenido del matraz a volumen,
mientras se agita por rotacin suave. Registrar el volumen agregado desde la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:
W/V
en donde W es el peso, en g, del material tomado; y V es 50,0 mL menos el volumen de agua necesario para ajustar el contenido del matraz a volumen, en mL. Se pueden usar otros mtodos para determinar la densidad, dependiendo de la formulacin (p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas).
PREPARACIONES DE PRUEBA
Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma
farmacutica correspondiente.
Soluciones Orales y Suspensiones OralesAgitar individualmente el contenido de 10 envases.
Polvos Cuyas Etiquetas Declaran el Volumen de la Preparacin Lquida Oral que Resulta cuando el Polvo se
Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el EtiquetadoReconstituir 10 envases con el volumen de diluyente declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar individualmente.
Captulos
PROCEDIMIENTO
El volumen de entrega se puede determinar por peso, segn se indica a continuacin:
1. Vaciar el contenido del envase en un recipiente tarado adecuado (dejando que escurra durante no ms de 5 segundos
para envases unitarios, y no ms de 10 minutos para envases de unidades mltiples).
2. Determinar la masa del contenido.
3. Calcular el volumen usando la densidad .
Como alternativa, se puede usar el siguiente procedimiento por volumen:
1. De acuerdo con las condiciones de uso, o segn se indique en el etiquetado, vaciar cuidadosamente el contenido de cada
envase en sendas probetas individuales, graduadas y secas, con una capacidad marcada que no exceda de dos veces y
media el volumen a medir, y calibradas para contener (ver Aparatos Volumtricos 31). Se debe tener cuidado de evitar
que se formen burbujas de aire durante el proceso. Si el etiquetado carece de instrucciones, sujetar los envases en un ngulo de aproximadamente 30 con respecto a la horizontal y vaciar, cuidadosamente, el contenido en la probeta graduada.
2. Dejar escurrir cada envase durante un periodo que no exceda de 10 minutos para envases de unidades mltiples y 5 segundos para envases unitarios, a menos que se especifique de otra manera en la monografa.
3. Cuando no haya burbujas, medir el volumen de cada mezcla.
CRITERIOS DE ACEPTACIN
Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento de esta prueba.
Para Envases de Unidades Mltiples (ver la Figura 1)El volumen promedio de lquido obtenido a partir de los 10 envases
es no menos de 100% y el volumen de ningn envase es menos de 95% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la
prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado pero el volumen de ningn envase es menos de 95% de la cantidad declarada, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el
volumen de no ms de 1 envase es menos de 95%, pero es no menos del 90% del volumen declarado. El volumen promedio
de lquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado; y el volumen de lquido
obtenido de no ms de 1 de los 30 envases es menos de 95%, pero no menos de 90% del volumen declarado en el etiquetado.
USP 38
Pruebas Fsicas / 698 Volumen de Entrega 513
Captulos
Figura 1. Esquema de decisin para envases de unidades mltiples. (V = Volumen promedio. V decl. = Volumen declarado)
Para Envases Unitarios (ver la Figura 2)El volumen promedio de lquido obtenido a partir de los 10 envases es no menos
de 100% y el volumen de cada uno de los 10 envases se encuentra dentro del intervalo de 95%110% del volumen declarado
en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en
el etiquetado, pero el volumen de ningn envase se encuentra fuera del intervalo de 95%110%, o si B, el volumen promedio
es no menos de 100% y el volumen de no ms de 1 envase se encuentra fuera del intervalo de 95%110%, pero dentro del
intervalo de 90%115%. El volumen promedio de lquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado y el volumen obtenido de no ms de 1 de los 30 envases se encuentra fuera del intervalo de 95%
110% pero dentro del intervalo de 90%115% del volumen declarado en el etiquetado.
USP 38
Captulos
514 698 Volumen de Entrega / Pruebas Fsicas
Figura 2. Esquema de decisin para envases unitarios. (V = Volumen promedio. V decl. = Volumen declarado)
699 DENSIDAD DE SLIDOS

TRMINOS Y DEFINICIONES
El trmino densidad se refiere a la distribucin espacial promedio de la masa en un material. La densidad de los slidos tpicamente se expresa en g por cm3, mientras que en los lquidos la densidad se expresa generalmente en g por mL a una temperatura de referencia establecida.
La densidad de una partcula slida puede tomar diferentes valores segn el mtodo empleado para medir el volumen de la
partcula. Es importante distinguir entre tres posibilidades diferentes.
La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacos
que no son parte fundamental de la disposicin tridimensional molecular. Es una propiedad de cada material particular y, por
lo tanto, debe ser independiente del mtodo de determinacin. La densidad verdadera de un cristal perfecto puede determinarse a partir del tamao y la composicin de la unidad celular.
La densidad picnomtrica, medida por picnometra de gases, es una medicin de la densidad conveniente para polvos farmacuticos. En un picnmetro de gases, el volumen ocupado por una masa conocida de polvo se determina mediante la medicin del volumen de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el volumen de gas desplazado es la densidad
picnomtrica. La densidad picnomtrica equivale a la densidad verdadera a menos que el material contenga espacios vacos
impenetrables, o poros cerrados que sean inaccesibles al gas empleado en el picnmetro.
La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la partcula de poros abiertos que son ms pequeos que un
tamao lmite, que depende del mtodo de medicin. Una tcnica comn de medicin es la porosimetra de mercurio, donde
Pruebas Fsicas / 699 Densidad de Slidos 515
USP 38
el tamao lmite del poro depende de la presin mxima de penetracin. Debido a la contribucin adicional del volumen de
poro, la densidad granular nunca ser mayor que la densidad verdadera. Un concepto relacionado es la densidad aerodinmica,
que es la densidad de la partcula con un volumen definido por la envoltura aerodinmica de la partcula en una corriente de
flujo. Tanto los poros cerrados como los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se llenan con el lquido
impregnante. Por lo tanto, si la partcula es porosa, la densidad aerodinmica depende de la densidad del lquido utilizado en
la prueba.
En sntesis, tanto la densidad picnomtrica como la densidad verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pueden distinguir estas cantidades segn el mtodo de medicin.
La densidad de un material depende de la cohesin molecular. En el caso de los gases y los lquidos, la densidad depende de
la temperatura y la presin. En el caso de los slidos, la densidad tambin variara segn la estructura del cristal y el grado de
cristalinidad. Si los slidos son amorfos, la densidad tambin puede depender de los antecedentes de preparacin y tratamiento de esta sustancia. En consecuencia, a diferencia de los lquidos, las densidades de dos slidos qumicamente equivalentes
pueden ser diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado slido. La densidad de las partculas constitutivas es
una caracterstica fsica importante de los polvos farmacuticos.
Ms all de estas definiciones sobre densidad de la partcula, la densidad aparente de un polvo incluye la contribucin al volumen del espacio vaco entre las partculas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad como de la
compactacin de las partculas de polvo.
PICNOMETRA DE GASES PARA LA MEDICIN DE DENSIDAD
Fig. 1. Esquema de Picnmetro de Gases.

La muestra, con una masa w y un volumen Vs, se coloca dentro de una celda de prueba sellada que tiene un volumen de
celda sin contenido de Vc. La presin de referencia del sistema, Pr se determina en el manmetro mientras la vlvula que conecta el volumen de referencia con la celda de prueba est abierta. Se cierra la vlvula para separar el volumen de referencia,
Vr, de la celda de prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medicin a una presin inicial, Pi. Luego, se abre la
vlvula para conectar el volumen de referencia, Vr, con la celda de la prueba y la presin desciende a la presin final, Pf. Si el
gas de medicin se comporta idealmente en las condiciones de medicin, el volumen de la muestra, Vs, se calcula mediante la
siguiente expresin:
La densidad, r, se calcula por la ecuacin:
Los detalles del diseo instrumental pueden diferir, pero todos los picnmetros de gases dependen de la medicin de los cambios de presin a medida que se agrega o se elimina un volumen de referencia de la celda de prueba.
La densidad medida es una media ponderada por volumen de las densidades de las partculas individuales que constituyen
el polvo. La densidad ser errnea si el gas de la prueba se adsorbe o se absorbe en el polvo o si se producen contaminantes
voltiles a partir del polvo durante la medicin. La adsorcin o absorcin se evitan mediante una eleccin apropiada del gas de
prueba. Normalmente se elige helio. Los contaminantes voltiles del polvo se eliminan mediante la desgasificacin del polvo a
travs de una purga constante con helio antes de la medicin. Ocasionalmente, los polvos pueden desgasificarse al vaco. Si los
Captulos
La picnometra de gases es un mtodo conveniente y apropiado para la medicin de la densidad de partculas de polvo. En
la Figura 1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnmetro de gases.
516 699 Densidad de Slidos / Pruebas Fsicas
USP 38
contaminantes voltiles no interfieren con la medicin, los volmenes de muestra proporcionados por dos lecturas consecutivas no difieren en ms del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes voltiles durante la medicin, el peso de la
muestra debe tomarse despus de la medicin picnomtrica del volumen.
Captulos
Mtodo
Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de calibracin se hayan determinado para el picnmetro de gases
mediante un procedimiento apropiado de calibracin. El gas a utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique
otro gas en la monografa individual correspondiente. La temperatura del picnmetro de gases debe estar entre 15 y 30 y no
debe variar en ms de 2 durante el curso de la medicin. Cargar la celda de prueba con la sustancia en anlisis que se ha
preparado segn la monografa individual correspondiente. Secar la sustancia en anlisis, cuando se indica 699D, segn se
describe en Prdida por secado en la monografa correspondiente, a menos que se especifiquen otras condiciones de secado en
la prueba de Densidad de slidos de la monografa. Cuando se indica 699U, la sustancia en anlisis se emplea sin secar. Emplear una cantidad de polvo recomendada en el manual operativo para el picnmetro. Sellar la celda de prueba del picnmetro y purgar el sistema del picnmetro con el gas de prueba segn el procedimiento indicado en las instrucciones de funcionamiento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vaco, seguir las recomendaciones de las monografas individuales
correspondientes y las instrucciones del manual operativo del picnmetro.
La secuencia de medicin anterior describe el procedimiento para el picnmetro de gases que aparece en la Figura 1. Si el
picnmetro tiene una operacin o construccin diferentes, del que se muestra en la Figura 1, seguir el procedimiento operativo
indicado en el manual de uso del picnmetro.
Repetir la secuencia de medicin para la misma muestra de polvo hasta que las mediciones consecutivas del volumen de
muestra, Vs, no difieran en ms del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir el peso final de polvo, w. Calcular la densidad picnomtrica, r, de la muestra segn la Ecuacin 2.
701 DESINTEGRACIN
Este captulo general est armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa.
Los textos de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este captulo general, se pueden usar los mtodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea Japonesa para demostrar el cumplimiento de los requisitos. Estas farmacopeas
se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado.
Las partes del texto de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, estn indicadas con smbolos () para especificar este hecho.
Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cpsulas se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se las coloca en un medio lquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuacin. Se requiere el cumplimiento con
los lmites de Desintegracin establecidos en las monografas individuales excepto cuando la etiqueta indica que las tabletas o
cpsulas estn destinadas para su uso como trociscos (troches) o para ser masticadas o estn diseadas como formas farmacuticas de liberacin prolongada o formas farmacuticas de liberacin retardada. Determinar el tipo de unidades en anlisis
segn lo que indique el etiquetado o por observacin y aplicar el procedimiento correspondiente a 6 o ms unidades de dosificacin.
A los efectos de esta prueba, la desintegracin no implica la disolucin completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se
define como desintegracin completa al estado en el cual los residuos de la unidad, excepto la cubierta insoluble de una cpsula o los fragmentos del recubrimiento insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la superficie inferior del disco, constituyen una masa blanda sin un ncleo firme y palpable.
APARATO
El aparato consta de un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados bajo de 1000 mL, con una altura entre 138
mm y 160 mm y con un dimetro interno de 97 mm a 115 mm para el lquido de inmersin, una disposicin termosttica
para calentar el lquido entre 35 y 39 y un dispositivo para elevar y sumergir la canastilla en el lquido de inmersin a una
frecuencia constante entre 29 y 32 ciclos por minuto recorriendo una distancia de no menos de 53 mm y no ms de 57 mm.
El volumen del lquido en el recipiente es tal que en el punto ms alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permanece al menos 15 mm por debajo de la superficie del lquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del recipiente en
el recorrido descendente. En ningn momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El
tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo del recorrido descendente y el cambio de sentido se produce
en una transicin suave y no con un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo
de su eje. No hay un movimiento horizontal significativo ni un movimiento del eje que no sea vertical.
USP 38
Pruebas Fsicas / 701 Desintegracin 517
1 El uso de deteccin automtica empleando discos modificados est permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Tales discos deben cumplir con
los requisitos de densidad y dimensin que se proporcionan en este captulo.
Captulos
Montaje de Canastilla-GradillaEl montaje de canastilla-gradilla consiste en seis tubos transparentes abiertos en sus extremos, de 77,5 2,5 mm de longitud cada uno, con un dimetro interno de aproximadamente 20,7 mm a 23 mm y una pared
de 1,0 mm a 2,8 mm de espesor; los tubos estn sostenidos en posicin vertical por dos placas, de 88 mm a 92 mm de dimetro y de 5 mm a 8,5 mm de espesor cada una, con seis orificios de 22 mm a 26 mm de dimetro cada uno, equidistantes del
centro de la placa y equidistantes entre s. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero
inoxidable tramado que posee una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un dimetro de alambre
de 0,57 mm a 0,66 mm. Las piezas del aparato se arman y se sostienen rgidamente por medio de tres pernos que pasan a
travs de las dos placas. Se proporciona un medio adecuado para suspender el montaje de canastilla-gradilla del dispositivo de
ascenso y descenso, utilizando un punto de su eje.
El diseo del montaje de canastilla-gradilla se puede variar de alguna forma, siempre que se mantengan las especificaciones
para los tubos de vidrio y el tamao del tamiz de la malla. El montaje de canastilla-gradilla se ajusta a las dimensiones que se
encuentran en la Figura 1.
DiscosEl uso de discos est permitido exclusivamente cuando est especificado o autorizado en la monografa. Si se especifica en la monografa individual, cada tubo presenta un disco cilndrico de 9,5 0,15 mm de espesor y 20,7 0,15 mm
de dimetro. El disco est hecho de un material plstico transparente adecuado, con un peso especfico entre 1,18 y 1,20.
Cinco orificios paralelos de 2 0,1 mm se extienden entre los extremos del cilindro. Uno de los orificios est centrado en el eje
cilndrico. Los otros orificios estn centrados a 6 0,2 mm del eje en lneas imaginarias perpendiculares al eje y paralelas entre
s. Se cortan cuatro planos idnticos de forma trapezoidal en la pared del cilindro, casi perpendiculares a los extremos del cilindro. La forma trapezoidal es simtrica; sus lados paralelos coinciden con los extremos del cilindro y son paralelos a una lnea
imaginaria que conecta los centros de dos orificios adyacentes de 6 mm desde el eje cilndrico. El lado paralelo del trapezoide
en la parte inferior del cilindro tiene un largo de 1,6 0,1 mm y sus bordes inferiores se encuentran a una profundidad de 1,5
a 1,8 mm de la circunferencia del cilindro. El lado paralelo del trapezoide en la parte superior del cilindro tiene un largo de 9,4
0,2 mm y su centro se encuentra a una profundidad de 2,6 0,1 mm de la circunferencia del cilindro. Todas las superficies
del disco son lisas. Si se especifica el uso de discos en la monografa individual, agregar un disco a cada tubo y hacer funcionar el aparato segn se indica en el Procedimiento. Los discos se ajustan a las dimensiones que se encuentran en la Figura 11.
518 701 Desintegracin / Pruebas Fsicas
Captulos
USP 38
Figura 1. Aparato de desintegracin. (Todas las dimensiones estn expresadas en mm.)
PROCEDIMIENTO
Tabletas Sin CubiertaColocar 1 unidad de dosificacin en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si se indica,
agregar un disco. Hacer funcionar el aparato, usando agua o el medio especificado como el lquido de inmersin; mantener a
37 2. Al final del tiempo especificado en la monografa, levantar la canastilla del lquido y observar las tabletas: todas las
tabletas se han desintegrado completamente. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales. El requisito se cumple si se desintegran no menos de 16 tabletas del total de 18 tabletas analizadas.
Tabletas Con Cubierta SimpleAplicar la prueba de Tabletas Sin Cubierta, haciendo funcionar el aparato durante el tiempo especificado en la monografa individual.
Tabletas de Liberacin Retardada (Recubrimiento Entrico)Colocar 1 tableta en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azcar soluble, sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido gstrico simulado SR a 37 2 como el lquido de inmersin. Al cabo de 1 hora de inmersin en el fluido gstrico simulado SR, levantar la canastilla y observar las tabletas: las
tabletas no muestran signos de desintegracin, resquebrajamiento o ablandamiento. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido intestinal simulado SR a 37 2 como lquido de inmersin, durante el tiempo especificado en la monografa. Sacar la canastilla del lquido y observar las tabletas: todas las tabletas se desintegran completamente. Si 1 2 tabletas no se
desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas
se desintegran completamente.
Tabletas BucalesAplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Despus de 4 horas, sacar la canastilla del lquido y observar
las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con
12 tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
USP 38
Pruebas Fsicas / 705 Tabletas con Ranurado Funcional 519
Tabletas SublingualesAplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Al final del tiempo especificado en la monografa individual: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
tabletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.
Cpsulas de Gelatina DuraAplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Fijar a la superficie de la placa superior del montaje de canastilla-gradilla, una tela de alambre que se pueda desprender, que tenga una trama cuadrada simple con aberturas
de 1,8 mm a 2,2 mm y con un dimetro de alambre de 0,60 mm a 0,655 mm, segn se describe en Montaje de CanastillaGradilla. Observar las cpsulas dentro del tiempo especificado en la monografa individual: todas las cpsulas se han desintegrado excepto los fragmentos de las cubiertas. Si 1 2 cpsulas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12
cpsulas adicionales: no menos de 16 del total de 18 cpsulas analizadas se desintegran completamente.
Cpsulas de Gelatina BlandaProceder segn se indica en Cpsulas de Gelatina Dura.
705 ATRIBUTOS DE CALIDAD PARA TABLETAS CUYO ETIQUETADO

INDICA RANURADO FUNCIONAL
PROPSITO
ALCANCE
Este captulo se aplica a tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional y a las porciones partidas que representan cualquier fraccin declarada de la dosis completa de la tableta ranurada funcionalmente. Las tabletas deben partirse como parte
del procedimiento de prueba y se deben definir las condiciones de almacenamiento de las porciones partidas como parte de
dicho procedimiento. Para las pruebas de Disolucin o Desintegracin, los analistas deben usar slo las porciones partidas de las
tabletas que se consideran aceptables mediante la prueba de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional.
PARTICIN DE LAS TABLETAS CON RANURADO FUNCIONAL

Procedimiento de Prueba
1. Tomar una muestra aleatoria de 30 tabletas intactas y proceder segn se indica a continuacin.
2. Pesar con exactitud cada tableta y registrar su peso.
3. Para cada tableta intacta, determinar el peso esperado de las porciones partidas dividiendo el peso de la tableta entera
por el nmero designado de porciones partidas indicado en el etiquetado.
4. Partir manualmente cada tableta (sin ayuda mecnica) en el nmero designado de porciones partidas y pesar cada porcin partida.
5. Para cada tableta, determinar el porcentaje del peso esperado en cada porcin partida.
Una tableta aceptable se parte en el nmero designado de porciones y cada porcin partida tiene no menos de 75% y no
ms de 125% del peso esperado para la porcin de tableta partida. [NOTASeparar las porciones de tableta partida obtenidas
de las tabletas aceptables para someterlas al anlisis subsiguiente de disolucin o desintegracin.]
Criterios de aceptacin: No menos de 28 de las 30 tabletas son aceptables.
DISOLUCIN
Usar porciones partidas de las tabletas que son aceptables de acuerdo con la prueba de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional.
Captulos
Este captulo provee atributos de calidad para productos cuyo etiquetado aprobado indica que las tabletas se pueden partir
para producir mltiples porciones que tienen una dosis fraccionada (cuyo etiquetado indica ranurado funcional) exacta. La
cantidad declarada en la etiqueta de las porciones partidas debe ser una fraccin simple de la cantidad declarada para la tableta intacta basndose en el nmero de ranuras y el tamao de la porcin partida (p.ej., una mitad, un tercio o un cuarto). Al
momento de partirlas, las tabletas intactas deben cumplir con la especificacin de la monografa. Con excepcin de la dosis, se
espera que cada porcin partida de las tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional cumpla con los atributos de calidad
de las tabletas enteras. Las porciones partidas que resultan de subdividir una tableta ranurada funcionalmente deben cumplir
con las pruebas de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional y Disolucin o Desintegracin provistas en este captulo.
520 705 Tabletas con Ranurado Funcional / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabletas de Liberacin Inmediata

La disolucin para tabletas de liberacin inmediata se realiza en la etapa S2 (ver Disolucin 711). Analizar 12 porciones de
tableta partida de acuerdo con las especificaciones para Medio, Aparato, Tiempos y Anlisis. El promedio de los 12 resultados es
no menor que Q y ningn resultado es menor que Q 15%.
Tabletas de Liberacin Prolongada
Captulos
Realizar el anlisis de disolucin de porciones de tableta partida a partir de tabletas de liberacin prolongada usando uno de
los dos procedimientos alternativos. La monografa especifica el procedimiento que se debe usar.
Procedimiento 1 (Procedimiento para Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada, Disolucin 711): Analizar individualmente 12 porciones de tableta partida y 12 tabletas intactas.
Medio, Aparato y Anlisis: Proceder segn se indica en la monografa siguiendo la prueba apropiada que se indica en el
etiquetado. Los tiempos de muestreo de la prueba del perfil de disolucin se determinan segn se indica a continuacin. Usar
los tiempos de muestreo provistos en la prueba de disolucin apropiada de la monografa. Como mnimo, usar tres tiempos de
muestreo, de modo que no ms de uno de ellos exceda el 85% disuelto.
Calcular el factor de similitud (f2) para los resultados de las tabletas intactas y los resultados de la porcin partida de tableta:
Rt = porcentaje acumulativo del frmaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las tabletas intactas en cada uno
de los tiempos de muestreo n seleccionados
Tt = porcentaje acumulativo del frmaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las porciones de tableta partida
en cada uno de los tiempos de muestreo n seleccionados
Criterios de aceptacin: El valor calculado f2 es no menos de 50 (intervalo aceptable: 50100).
Procedimiento 2 (Procedimiento para Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada, Disolucin 711): Usar una porcin partida de tableta como la unidad de dosificacin. Analizar individualmente 12 unidades de dosificacin.
Medio, Aparato, Tiempos y Anlisis: Conforme a lo provisto en la monografa siguiendo el nmero de prueba apropiado
que se indica en el etiquetado.
Criterios de aceptacin: Las cantidades liberadas, como porcentajes de la cantidad declarada, en los tiempos especificados,
cumplen con los criterios de aceptacin para el nivel L2 de la Tabla de Aceptacin 2 del captulo 711.
DESINTEGRACIN
La prueba de desintegracin slo es necesaria cuando se usa como sustituta de la prueba de disolucin conforme a lo especificado en la monografa. Seguir el procedimiento usando porciones de las tabletas partidas que sean aceptables de acuerdo
con la prueba de Particin de las Tabletas con Ranurado Funcional como la unidad de dosificacin (ver Desintegracin 701).
711 DISOLUCIN
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado.
Las partes del texto de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, estn indicadas con smbolos () para especificar este hecho.
Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolucin si estuvieran indicados en la monografa individual de las formas farmacuticas administradas oralmente. Para los fines de este captulo general, una unidad de
dosificacin est definida como 1 tableta, 1 cpsula o la cantidad que se especifique. De los tipos de aparatos que se describen en este captulo, utilizar el que se especifica en la monografa individual. Cuando la etiqueta indica que el artculo tiene
recubrimiento entrico, y cuando la monografa individual incluye una prueba de disolucin o desintegracin sin establecer
especficamente que se aplica a artculos de liberacin retardada, emplear el procedimiento y la interpretacin indicados para
Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. Si se trata
de cpsulas de gelatina dura o blanda, o de tabletas recubiertas con gelatina que no cumplen con las especificaciones de Disolucin, repetir la prueba del siguiente modo. Cuando se especifica utilizar agua o un medio con un pH inferior a 6,8 como el
Medio en la monografa individual, se puede emplear el mismo Medio especificado agregando pepsina purificada, de forma
Pruebas Fsicas / 711 Disolucin 521
USP 38
que la actividad resultante sea igual o menor a 750 000 Unidades por 1000 mL. Para medios con un pH igual o mayor a 6,8,
se puede agregar pancreatina de forma que la actividad de proteasa sea de no ms de 1750 Unidades USP por 1000 mL.
Estndares de Referencia USP 11 ER Tabletas de Prednisona USP
APARATO
Aparato 1 (Aparato con Canastilla)
Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de agitacin son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material
inerte, segn las especificaciones de la Figura 1. Se puede emplear una canastilla con un bao de oro de aproximadamente
0,0001 pulgadas (2,5 mm) de espesor. La unidad de dosificacin se coloca en una canastilla seca al comienzo de cada prueba.
La distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a 25 2 mm durante la prueba.
1
2
Los materiales deben ser tales que no produzcan sorcin, reacciones ni interferencias con la muestra en anlisis.
Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fcilmente un termmetro y para retirar las muestras.
Captulos
El aparato consta de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro material inerte y transparente;1 un motor; un eje propulsor
metlico y una canastilla cilndrica. El vaso est parcialmente sumergido en un bao de agua adecuado de cualquier dimensin
conveniente o recibe calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de calentamiento. Durante el transcurso
de la prueba, el bao de agua o el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el interior del vaso a 37 0,5 y
garantizan que el fluido del bao se mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual est colocado, aumenta significativamente el movimiento, agitacin o vibracin, por encima de los producidos por el
elemento de agitacin que gira con suavidad. Es preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el elemento
de agitacin durante la prueba. El vaso es cilndrico y de fondo semiesfrico con las siguientes dimensiones y capacidades:
para 1 L de capacidad nominal, la altura es de 160 mm a 210 mm y el dimetro interno es de 98 mm a 106 mm; para 2 L
de capacidad nominal, la altura es de 280 mm a 300 mm y el dimetro interno es de 98 mm a 106 mm; y para 4 L de capacidad nominal, la altura es de 280 mm a 300 mm y el dimetro interno es de 145 mm a 155 mm. Las paredes del vaso cilndrico tienen un reborde en el extremo superior. Se puede utilizar una tapa para retardar la evaporacin.2 Colocar el eje propulsor
de forma tal que su eje central guarde una distancia mxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso
y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para regular la
velocidad con el objeto de seleccionar y mantener la velocidad de rotacin del eje propulsor a la velocidad especificada en la
monografa individual, con una aproximacin de 4%.
522 711 Disolucin / Pruebas Fsicas
Captulos
USP 38
Figura 1. Elemento de Agitacin de Canastilla
Aparato 2 (Aparato con Paleta)

Emplear el Aparato 1, excepto que se usa una paleta compuesta por un aspa y un eje como elemento de agitacin. Colocar
el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia mxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje
vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. La lnea central vertical
del aspa est alineada con el eje propulsor de forma tal que el extremo inferior del aspa est nivelado con el extremo inferior
del eje propulsor. La paleta cumple con las especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el fondo interno
del vaso y el borde inferior del aspa se mantiene a 25 2 mm durante la prueba. El aspa metlica o de otro material inerte
adecuado y el eje forman una unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo desmontable de dos partes adecuado,
siempre y cuando las partes permanezcan firmemente ajustadas durante la prueba. El eje y el aspa de la paleta pueden estar
recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que la unidad de dosificacin se hunda hasta el fondo del vaso antes de
empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificacin se les puede agregar una pieza pequea, suelta, de algn material no
reactivo, como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo de sumersin alternativo. Tambin se pueden emplear otros dispositivos de sumersin validados.
USP 38
Captulos
Figura 2. Elemento de Agitacin de Paleta
Figura 2a. Dispositivo de sumersin alternativo. Todas las dimensiones estn expresadas en mm.
Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
El equipo se compone de un grupo de vasos cilndricos de vidrio de fondo plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio,
accesorios de un material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material adecuado) y mallas de un material adecuado
no absorbente ni reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros oscilantes; un motor y una transmisin que
hacen oscilar los cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario, traslada los cilindros oscilantes en sentido
horizontal hacia otra hilera de vasos. Los vasos estn parcialmente sumergidos en un bao de agua adecuado de un tamao
conveniente que permita mantener la temperatura a 37 0,5 durante la prueba. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual el equipo est colocado, produce una cantidad importante de movimiento, agitacin o vibracin, que exceda la oscilacin vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilacin y mantenerla a la
velocidad de inmersin especificada en la monografa individual, dentro de 5%. Es preferible emplear un aparato que permita observar las muestras y los cilindros oscilantes. Los vasos cuentan con una tapa de evaporacin que permanece colocada
durante la prueba. Los componentes se ajustan a las dimensiones que se indican en la Figura 3, a menos que se especifique
algo diferente en la monografa individual.
Captulos
USP 38
Figura 3. Aparato 3 (cilindro oscilante)
Aparato 4 (Celda de Flujo)

El equipo se compone de un depsito y una bomba para el Medio de Disolucin, una celda de flujo y un bao de agua que
mantiene el Medio de Disolucin a 37 0,5. Usar la celda del tamao especificado en la monografa individual.
La bomba desplaza el Medio de Disolucin a travs de la celda de flujo en direccin ascendente. La bomba tiene un intervalo
de operacin de 240 mL a 960 mL por hora y las velocidades de flujo estndares son de 4 mL, 8 mL y 16 mL por minuto. La
bomba debe suministrar un flujo constante (5% de la velocidad de flujo nominal); el perfil del flujo es sinusoidal con una
pulsacin de 120 10 pulsos por minuto. Se puede usar tambin una bomba no pulstil. Los procedimientos de la prueba de
disolucin en los que se usa una celda de flujo deben estar caracterizados con respecto a la velocidad y a las pulsaciones.
La celda de flujo (ver las Figuras 4 y 5), de un material transparente e inerte, est montada verticalmente con un sistema de
filtro (especificado en la monografa individual) que impide que se escapen partculas no disueltas de la parte superior de la
celda; el dimetro estndar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la base cnica de la celda est generalmente llena de
pequeas perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de dimetro y una de esas perlas, de aproximadamente 5 mm, est
ubicada en el pice para proteger el tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver las Figuras 4 y 5) para
colocar formas farmacuticas especiales, por ejemplo, tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un bao de agua y se
mantiene la temperatura a 37 0,5.
USP 38
Captulos
Figura 4. Celda grande para tabletas y cpsulas (arriba) y portatabletas para la celda grande (abajo) del Aparato 4. (Todas las
dimensiones estn expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
Captulos
USP 38
Figura 5. Celda pequea para tabletas y cpsulas (arriba) y portatabletas para celda pequea (abajo) del Aparato 4. (Todas
las dimensiones estn expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas de goma para fijar la celda. La bomba est separada de la unidad de disolucin a fin de proteger a esta ltima de las vibraciones que pueda originar la bomba. La bomba no debe estar
colocada en un nivel superior al de los recipientes de depsito. Las conexiones entre tubos son lo ms cortas posible. Emplear
tuberas de material inerte adecuado, como por ejemplo tefln de aproximadamente 1,6 mm de dimetro interno y conexiones con rebordes qumicamente inertes.
APTITUD DEL APARATO
La determinacin de la aptitud del aparato que se utilizar en la prueba de disolucin debe incluir el cumplimiento de las
dimensiones y tolerancias indicadas anteriormente. Adems, los parmetros de prueba cruciales que es necesario controlar peridicamente mientras se usa el aparato incluyen el volumen y la temperatura del Medio de Disolucin, la velocidad de rotacin
(Aparato 1 y Aparato 2), la velocidad de inmersin (Aparato 3) y la velocidad de flujo del medio (Aparato 4).
Controlar peridicamente que el desempeo del equipo de disolucin sea aceptable. Comprobar la aptitud de un aparato
individual mediante la Prueba de Verificacin del Desempeo.
USP 38
Prueba de Verificacin del Desempeo, Aparatos 1 y 2Analizar el ER Tabletas de Prednisona USP, de acuerdo con las
condiciones operativas especificadas. El aparato es apto si los resultados obtenidos estn dentro del intervalo aceptable que se
indica en la hoja de datos tcnicos especfica para el lote usado y el aparato analizado.
Prueba de Verificacin del Desempeo, Aparato 3[Se incluir ms adelante.]
Prueba de Verificacin del Desempeo, Aparato 4[Se incluir ms adelante.]
PROCEDIMIENTO
Aparato 1 y Aparato 2
FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA
FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN PROLONGADA
Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata.

Medio de DisolucinProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata.
TiempoLos tiempos de prueba, que generalmente son tres, se expresan en horas.
FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
Emplear el Mtodo A o el Mtodo B y el aparato especificado en la monografa individual. Todos los tiempos de prueba
especificados deben cumplirse con una tolerancia de 2%, a menos que se especifique algo diferente.
Mtodo A
Procedimiento (a menos que se indique algo diferente en la monografa individual)
ETAPA CIDAColocar 750 mL de cido clorhdrico 0,1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre
a una temperatura de 37 0,5. Colocar 1 unidad de dosificacin en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el
aparato a la velocidad especificada en la monografa.
Despus de funcionar 2 horas con cido clorhdrico 0,1 N, retirar una alcuota del lquido y proceder de inmediato segn se
indica para la Etapa Amortiguada.
3 Filtrar las muestras de prueba inmediatamente despus de tomarlas, salvo que se demuestre que la filtracin no es necesaria. Usar un filtro inerte que no adsorba
el ingrediente activo y que no contenga sustancias extrables que pudieran interferir en el anlisis.
4 Un mtodo para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, mezclando suavemente, hasta aproximadamente 41; inmediatamente filtrar al vaco utilizando un filtro con un tamao de poro de 0,45 mm o menor, mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vaco durante aproximadamente 5 minutos.
Tambin se puede emplear otra tcnica de desgasificacin validada para eliminar los gases disueltos.
Captulos
Colocar el volumen indicado de Medio de Disolucin (1%) en el vaso del aparato indicado en la monografa individual,
ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de Disolucin a 37 0,5 y quitar el termmetro. Colocar 1 unidad de dosificacin en
el aparato, verificando que no queden burbujas de aire en su superficie y poner el aparato en funcionamiento inmediatamente
a la velocidad indicada en la monografa individual. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o a cada tiempo especificado, retirar una muestra de una zona equidistante entre la superficie del Medio de Disolucin y la parte superior de la canastilla o
aspa rotatoria que no est a menos de 1 cm de la pared del vaso. [NOTASi se indica tomar ms de una muestra, usar volmenes iguales de Medio de Disolucin nuevo a 37 en lugar de las alcuotas tomadas para el anlisis o, si se demuestra que no es
necesario reemplazar el medio, corregir el clculo por el cambio de volumen. Mantener el vaso cubierto durante el transcurso
de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla en anlisis con una frecuencia adecuada.] Realizar el anlisis segn se indica en la monografa individual empleando un mtodo de valoracin adecuado.3 Repetir la prueba con otras unidades de la
forma farmacutica.
Si se emplean equipos automticos para muestreo o si se introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verificar que los resultados obtenidos con el aparato modificado son equivalentes a los obtenidos con el aparato estndar descrito
en este captulo general.
Medio de DisolucinEmplear un medio de disolucin adecuado. Emplear el disolvente especificado en la monografa
individual. El volumen especificado se refiere a mediciones realizadas entre 20 y 25. Si el Medio de Disolucin es una solucin
amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una aproximacin de 0,05 unidades con respecto al pH indicado en la monografa individual. [NOTALos gases disueltos pueden causar la formacin de burbujas que pueden alterar los resultados de la
prueba. Si los gases disueltos interfieren en los resultados de la disolucin, eliminarlos antes de iniciar las pruebas.4]
TiempoCuando se especifica un solo tiempo, la prueba se puede concluir en un perodo ms corto, siempre y cuando se
cumpla el requisito de cantidad mnima disuelta. Tomar las muestras slo en los tiempos indicados con una tolerancia de 2%.
Procedimiento para una Muestra Combinada para Formas Farmacuticas de Liberacin InmediataUsar este procedimiento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra Combinada en la monografa individual. Proceder segn se
indica en Procedimiento para Aparato 1 y Aparato 2 en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata. Combinar volmenes iguales de soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas y emplear la muestra combinada como la muestra
de prueba. Determinar la cantidad promedio del ingrediente activo disuelto en la muestra combinada.
Captulos
USP 38
Realizar un anlisis de la alcuota empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se especifica en la monografa individual.
ETAPA AMORTIGUADA[NOTACompletar la adicin de la solucin amortiguadora y ajuste de pH dentro de los 5 minutos.]
Con el aparato en funcionamiento a la velocidad indicada en la monografa, agregar 250 mL de fosfato tribsico de sodio
0,20 M previamente equilibrado a 37 0,5 al lquido del vaso. Ajustar, si fuera necesario, con cido clorhdrico 2 N o hidrxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45 minutos o durante el tiempo especificado en
la monografa individual. Al finalizar ese perodo, retirar una alcuota del lquido y efectuar el anlisis empleando un mtodo
de valoracin adecuado. El procedimiento se especifica en la monografa individual. La prueba puede concluir en un perodo
ms corto que el especificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mnima disuelta se cumple antes de lo previsto.
Mtodo B
Procedimiento (a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual)
ETAPA CIDAColocar 1000 mL de cido clorhdrico 0,1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre
a una temperatura de 37 0,5. Colocar 1 unidad de dosificacin en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el
aparato a la velocidad especificada en la monografa. Despus de funcionar 2 horas con cido clorhdrico 0,1 N, retirar una
alcuota del lquido y proceder de inmediato segn se indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un anlisis de la alcuota empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se especifica en la monografa individual.
ETAPA AMORTIGUADA [NOTAPara esta etapa del procedimiento, emplear una solucin amortiguadora previamente equilibrada a una temperatura de 37 0,5.] Escurrir el cido del vaso y agregarle 1000 mL de una solucin amortiguadora de fosfato de pH 6,8, preparada mezclando cido clorhdrico 0,1 N y fosfato tribsico de sodio 0,20 M (3:1) y ajustando, si fuera necesario, con cido clorhdrico 2 N o con hidrxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 0,05. [NOTAEste paso tambin puede llevarse
a cabo retirando del aparato el vaso que contiene el cido, reemplazndolo con otro vaso que contenga la solucin amortiguadora y transfiriendo la unidad de dosificacin al vaso que contiene la solucin amortiguadora.]
Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo especificado en la monografa individual. Al cabo de
ese perodo, retirar una alcuota del lquido y analizarla empleando un mtodo de valoracin adecuado. El procedimiento se
especifica en la monografa individual. La prueba puede concluir en un perodo ms corto que el especificado para la Etapa
Amortiguada si el requisito de cantidad mnima disuelta se cumple antes de lo previsto.
Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
Colocar el volumen indicado del Medio de Disolucin en cada vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de
Disolucin a 37 0,5 y retirar el termmetro. Colocar 1 unidad de la forma farmacutica en cada uno de los seis cilindros oscilantes, procurando eliminar las burbujas de aire de la superficie de cada unidad de dosificacin y poner en funcionamiento el
aparato inmediatamente, segn se especifica en la monografa individual. Durante el recorrido ascendente y descendente, los
cilindros oscilantes recorren una distancia total de 9,9 cm a 10,1 cm. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o en cada
tiempo especificado, elevar los cilindros oscilantes y retirar una porcin de la solucin en anlisis de una zona equidistante entre la superficie del Medio de Disolucin y el fondo de cada vaso. Efectuar el anlisis segn se indica en la monografa individual. Si fuera necesario, repetir la prueba con otras unidades de forma farmacutica.
Medio de DisolucinProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
TiempoProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 3.

Medio de DisolucinProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada en Aparato 1 y Aparato
2.
TiempoProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada en Aparato 1 y Aparato 2.
FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA
Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada, Mtodo B en Aparato 1 y Aparato 2 usando una fila
de vasos para los medios de la etapa cida y la siguiente fila de vasos para los medios de la etapa amortiguada y usando los
volmenes de medio especificados (generalmente de 300 mL).
USP 38
Aparato 4 (Celda de Flujo)

FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN INMEDIATA
Colocar las perlas de vidrio en la celda especificada en la monografa. Colocar 1 unidad de dosificacin sobre las perlas o, si
as se especifica en la monografa, sobre un soporte de alambre. Ensamblar la tapa del filtro y unir las partes mediante una
abrazadera adecuada. Introducir con la bomba el Medio de Disolucin entibiado a 37 0,5 a travs del extremo inferior de la
celda a fin de obtener la velocidad de flujo especificada en la monografa individual y medida con una exactitud del 5%.
Recoger el eluato en fracciones en cada tiempo indicado. Efectuar el anlisis segn se indica en la monografa individual. Repetir la prueba con otras unidades de forma farmacutica.
Medio de DisolucinProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.

Medio de DisolucinProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.
TiempoProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata en Aparato 4.
FORMAS FARMACUTICAS DE LIBERACIN RETARDADA
INTERPRETACIN
Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se cumplen los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades de dosificacin analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 1. Continuar con las
tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a S1 o a S2. La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo
disuelto especificada en la monografa individual, expresada como un porcentaje del contenido declarado de la unidad de
dosificacin; los valores de 5%, 15% y 25% en la Tabla de Aceptacin 1 son los porcentajes del contenido declarado de forma
que estos valores y Q estn expresados en unidades equivalentes.
Tabla de Aceptacin 1
Etapa
N de
Unidades Analizadas
S1
Ninguna unidad es menor que Q + 5%.
S2
El promedio de 12 unidades (S1 + S2) es igual o mayor que Q, y ninguna unidad es menor que Q 15%.
S3
12
El promedio de 24 unidades (S1 + S2 + S3) es igual o mayor que Q, no ms de 2 unidades son menores
que Q 15%, y ninguna unidad es menor que Q 25%.
Criterios de Aceptacin
Muestra Combinada para Formas Farmacuticas de Liberacin InmediataA menos que se especifique algo diferente
en la monografa individual, se cumple con los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de la muestra
combinada se ajustan a la Tabla de Aceptacin para una Muestra Combinada adjunta. Continuar con las tres etapas de prueba a
menos que los resultados se ajusten a S1 o a S2. La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo disuelto especificada en la
monografa individual, expresada como un porcentaje del contenido declarado.
Tabla de Aceptacin para una Muestra Combinada
Etapa
N de
Unidades Analizadas
Criterios de
Aceptacin
S1
La cantidad disuelta promedio no es menor que Q + 10%.
S2
La cantidad disuelta promedio (S1 + S2) es igual o mayor que Q + 5%.
S3
12
La cantidad disuelta promedio (S1 + S2 + S3) es igual o mayor que Q.
Captulos
Proceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada en Aparato 1 y Aparato 2 empleando los medios
indicados.
TiempoProceder segn se indica en Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada en Aparato 1 y Aparato 2.
USP 38
Formas Farmacuticas de Liberacin Prolongada

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se cumplen los requisitos si las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades de dosificacin analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 2. Continuar con los
tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L1 o a L2. Los lmites de la cantidad de ingrediente activo disuelto se expresan como porcentajes del contenido declarado. Los lmites comprenden cada valor de Qi, que representa la cantidad disuelta en cada intervalo fraccional de dosificacin especificado. Si se especifica ms de un intervalo en la monografa
individual, los criterios de aceptacin se aplican por separado a cada intervalo.
L1
Ningn valor individual se encuentra fuera de los intervalos especificados y, en el momento final de la
prueba, ningn valor individual es menor que la cantidad especificada.
L2
El valor promedio de las 12 unidades (L1 + L2) se encuentra dentro de cada intervalo especificado y no
es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; ningn valor representa ms
del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; y ningn valor representa ms
del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la
prueba.
L3
12
El valor promedio de las 24 unidades (L1 + L2 + L3) se encuentra dentro de los intervalos especificados y
no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; no ms de 2 de las 24
unidades presentan ms del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; no
ms de 2 de las 24 unidades presentan ms del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba; y ninguna de las unidades presenta ms del 20%
del contenido declarado fuera de cada uno de los intervalos especificados ni presenta ms del 20% del
contenido declarado por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.
Captulos
Nivel
N de
Unidades Analizadas
Criterios
Formas Farmacuticas de Liberacin Retardada

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
Etapa cidaA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se cumplen los requisitos de esta
parte de la prueba si las cantidades, basadas en el porcentaje de contenido declarado, de ingrediente activo disuelto a partir
de las unidades analizadas, se ajustan a la Tabla de Aceptacin 3. Continuar con todos los niveles de prueba a menos que los
resultados de las etapas amortiguada y cida se ajusten en un nivel previo.
Nivel
N de
Unidades Analizadas
A1
Ningn valor individual de la cantidad disuelta excede el 10%.
A2
El promedio de la cantidad disuelta de las 12 unidades (A1 + A2) no es ms del 10% y ninguna unidad
individual se disuelve ms del 25%.
A3
12
El promedio de la cantidad disuelta de las 24 unidades (A1 + A2 + A3) no es ms del 10% y ninguna
unidad individual se disuelve ms del 25%.
Criterios
Etapa AmortiguadaA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, se cumplen los requisitos si
las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptacin 4. Continuar
con los tres niveles de prueba a menos que los resultados de las dos etapas se ajusten antes de lo previsto. El valor de Q en la
Tabla de Aceptacin 4 es el 75% disuelto a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual. La cantidad,
Q, especificada en la monografa individual, representa la cantidad total de ingrediente activo disuelto en las Etapas cida y
Amortiguada, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Los valores de 5%, 15% y 25% que aparecen en la
Tabla de Aceptacin 4 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q estn expresados en los
mismos trminos.
Nivel
N de
Unidades Analizadas
B1
Cada unidad no es menor que Q + 5%.
B2
El promedio de 12 unidades (B1 + B2) es igual o mayor que Q y ninguna unidad es menor que Q 15%.
B3
12
El promedio de 24 unidades (B1 + B2 + B3) es igual o mayor que Q, no ms de 2 unidades son menores
que Q 15%, y ninguna unidad es menor que Q 25%.
Criterios
Pruebas Fsicas / 721 Intervalo de Destilacin 531
USP 38
721 INTERVALO DE DESTILACIN

Para determinar el intervalo de temperaturas dentro del cual se destila un lquido oficial, o el porcentaje de material que se
destila entre dos temperaturas especificadas, emplear el Mtodo I o el Mtodo II segn se indica en la monografa individual.
El lmite inferior del intervalo es la temperatura indicada por el termmetro cuando la primera gota del condensado deja la punta del condensador y el lmite superior es el Punto Seco, es decir, la temperatura a la cual la ltima gota de lquido se evapora
del fondo del matraz de destilacin, sin tener en cuenta el lquido que pueda quedar en las paredes del matraz, o la temperatura observada al recogerse la proporcin especificada en la monografa individual.
NOTAEnfriar todos los lquidos que destilan por debajo de 80 a entre 10 y 15 antes de medir la muestra a destilar.
Mtodo I
AparatoEmplear un aparato similar al especificado para el Mtodo II, excepto que se debe usar un matraz de destilacin
que tenga una capacidad de 50 a 60 mL y que tenga un cuello de 10 a 12 cm de largo y 14 a 16 mm de dimetro interno. La
perforacin de la placa aislante superior, si se emplea una, debe ser tal que cuando el matraz se fija en ella, la porcin del
matraz que queda por debajo de la superficie superior del material aislante tenga una capacidad de 3 a 4 mL.
ProcedimientoProceder segn se indica en el Mtodo II, pero colocar en el matraz slo 25 mL del lquido a analizar.
Mtodo II
t = t0 + [(t0104 + 0,033)(760 p)]

en donde t es la temperatura de ebullicin corregida, en la escala Celsius; t0 es la temperatura de ebullicin medida, en la
escala Celsius; y p es la presin baromtrica al momento de la medicin, en mm Hg.
Captulos
AparatoEmplear un aparato que conste de las siguientes partes:

Matraz de DestilacinUn matraz de destilacin de fondo redondo, de vidrio resistente al calor, de 200 mL de capacidad y
con una longitud total de 17 a 19 cm y un cuello de 20 a 22 mm de dimetro interno. A media distancia del cuello, aproximadamente a 12 cm del fondo del matraz, tiene conectado un brazo lateral de 10 a 12 cm de largo y 5 mm de dimetro interno,
que forma un ngulo de 70 a 75 con la parte inferior del cuello.
CondensadorUn condensador recto de vidrio de 55 a 60 cm de largo con una camisa de agua de aproximadamente 40
cm de largo, o un condensador de otro diseo con una capacidad de condensacin equivalente. El extremo inferior del condensador puede ser curvo para que acte como tubo de salida, o puede conectarse a un adaptador acodado que cumpla con
el mismo propsito.
Placas AislantesDos piezas de placas aislantes cuadradas de 5 a 7 mm de espesor y de 14 a 16 cm de lado, apropiadas
para concentrar el calor en la parte inferior del matraz. Cada placa tiene un orificio en el centro y las dos placas difieren slo en
el dimetro del orificio, es decir, los dimetros son 4 cm y 10 cm, respectivamente. Cuando se utilizan, las placas se colocan
una sobre la otra en un trpode u otro soporte adecuado, con la placa que tiene el orificio ms grande colocada sobre la otra.
ReceptorUna probeta graduada de 100 mL con subdivisiones de 1 mL.
TermmetroPara evitar la necesidad de correccin por vstago emergente, se recomienda un termmetro exactamente
normalizado, de inmersin parcial con subdivisiones lo ms pequeas posibles (no ms de 0,2). Los termmetros adecuados
estn disponibles como series ASTM E-1 de 37C a 41C y de 102C a 107C (ver Termmetros 21). Cuando se coloca en posicin, el vstago queda ubicado en el centro del cuello y la parte superior de la cmara de contraccin (o bulbo, si se emplea
uno de 37C o 38C) est a la altura del borde inferior de la salida del brazo lateral.
Fuente de CalorUn mechero Bunsen pequeo, o un calentador o manto elctricos con una capacidad de ajuste comparable a la de un mechero Bunsen.
ProcedimientoEnsamblar el aparato y colocar en el matraz 100 mL del lquido a analizar, evitando que penetre lquido
por el brazo lateral. Insertar el termmetro, proteger todo el ensamble de mechero y matraz de las corrientes de aire externas
y aplicar calor, regulndolo para que transcurran entre 5 y 10 minutos hasta que la primera gota del destilado caiga del condensador. Continuar la destilacin a una velocidad de 4 a 5 mL de destilado por minuto, recogiendo el destilado en el receptor. Observar la temperatura cuando la primera gota del destilado caiga del condensador y nuevamente cuando la ltima gota
de lquido se evapora del fondo del matraz o cuando el porcentaje especificado haya destilado. A menos que se especifique
algo diferente en la monografa individual, aplicar la correccin por vstago emergente cuando sea necesario e informar las
temperaturas ajustando la presin baromtrica por la siguiente frmula:
532 724 Liberacin de Frmacos / Pruebas Fsicas
USP 38
724 LIBERACIN DE FRMACOS

ALCANCE
Esta prueba se provee para determinar el cumplimiento con los requisitos de liberacin o disolucin de frmacos cuando se
declara en las monografas individuales para sistemas transdrmicos (STD) y otras formas farmacuticas. A partir de los tipos de
aparatos aqu descritos, usar el especificado en la monografa individual.
NORMAS GENERALES DE LIBERACIN DE FRMACOS

Aparato 5 (Paleta sobre Disco)
Captulos
Aparato: Usar la paleta y el vaso del Aparato 2 segn se describe en Disolucin 711, agregando un dispositivo en forma de
disco diseado para mantener el STD en el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco est diseado para minimizar todo
volumen muerto entre el disco y el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco mantiene el STD plano y se coloca de tal
manera que la superficie de liberacin sea paralela a la parte inferior del aspa de la paleta (ver la Figura 1a, la Figura 1b y la
Figura 1c). Se mantiene una distancia de 25 2 mm entre el aspa de la paleta y la superficie del dispositivo en forma de disco
durante la prueba. Se pueden usar otros dispositivos adecuados (ver la Figura 2), siempre que no adsorban o absorban, reaccionen o interfieran con la muestra en anlisis.
Figura 1a. Paleta sobre disco.

(Todas las mediciones se expresan en mm a menos que se indique de otro modo.)
USP 38
Pruebas Fsicas / 724 Liberacin de Frmacos 533
Figura 1b. Paleta sobre disco (malla y vidrio de reloj).
Captulos
Figura 1c. Broche para sujetar la malla y el vidrio de reloj.
Figura 2. Malla de alambre de sujecin.
Captulos
USP 38
Aptitud del aparato: Proceder segn se indica en Aparato 2 en Disolucin 711, Aptitud del Aparato, Prueba de Verificacin del
Desempeo, Aparatos 1 y 2.
Medio: Proceder segn se indica en Medio de Disolucin en Disolucin 711, Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacuticas de Liberacin Inmediata.
Procedimiento
Colocar el volumen declarado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 0,5.
Aplicar el STD al dispositivo en forma de disco, asegurndose de que la superficie de liberacin est lo ms lisa posible y que
el STD est completamente sujeto al disco con firmeza. El STD con la superficie de liberacin hacia arriba puede sujetarse al
disco usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una malla o una
membrana. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin daar la superficie de ste ltimo.
Colocar el dispositivo en forma de disco de forma plana en el fondo del vaso con la superficie de liberacin hacia arriba y
paralela borde del aspa de la paleta y de la superficie del Medio. Asegurarse de que la superficie del STD est libre de burbujas
de aire. El borde inferior de la paleta est a 25 2 mm de la superficie del dispositivo en forma de disco. Se puede cubrir el
vaso durante la prueba para minimizar la evaporacin.
Poner en funcionamiento inmediatamente el aparato a la velocidad especificada en la monografa.
En cada intervalo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte superior
del aspa, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el anlisis en cada alcuota de muestra segn se indica en la monografa individual, corrigiendo por cualquier prdida de volumen, segn sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.
Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras se deben retirar dentro de
una tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo
ms corto.
Interpretacin: A menos que se indique de otro modo en la monografa individual, los requisitos se cumplen si las cantidades
de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptacin 1 siguiente. Continuar analizando a lo largo de los
tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2.
Nivel
Nmero de Unidades
Analizadas
L1
Ningn valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado.
El valor promedio de las 12 unidades (L1 + L2) se encuentra dentro del intervalo especificado. Ningn valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado en ms de
10% del promedio del intervalo especificado.
12
El valor promedio de las 24 unidades (L1 + L2 + L3) se encuentra dentro del intervalo especificado. No ms de 2 de las 24 unidades se encuentran fuera del intervalo especificado en ms de 10% del promedio del intervalo especificado; y ninguna de las unidades
se encuentra fuera del intervalo especificado en ms de 20% del promedio del intervalo
especificado.
L2
L3
Criterios
Aparato 6 (Cilindro)
Aparato: Usar el vaso segn se describe en Disolucin 711, Aparato, Aparato 1 (Aparato con Canastilla), excepto que se debe
reemplazar la canastilla y el eje con un elemento mezclador cilndrico de acero inoxidable con las especificaciones mostradas
en la Figura 3. Este elemento mezclador cilndrico consta de dos partes, una comprende el eje y el cilindro superior, y la otra es
la extensin del cilindro. Puesto que ambas partes se enumeran en serie, se recomienda mantenerlas pareadas, debido a que el
ajuste de friccin se realiza de manera individual para cada cilindro, lo que permite un calce muy ajustado. La distancia entre la
parte inferior interna del vaso y el cilindro se mantiene a 25 2 mm durante la prueba.
USP 38
Captulos
Figura 3. Elemento mezclador cilndrico.

(Todas las medidas se expresan en cm a menos que se indique de otro modo.)
Medio: Ver Medio de Disolucin en Disolucin 711, Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacuticas de Liberacin
Inmediata.
Procedimiento
Colocar el volumen indicado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 0,5.
Aplicar el STD al cilindro, asegurndose de que la superficie de liberacin est lo ms lisa posible y que el STD est completamente sujeto al cilindro con firmeza. El STD con la superficie de liberacin hacia el Medio puede sujetarse al cilindro usando un
procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de
nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia
de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin daar la superficie. Si se requiere reforzar ms la sujecin del STD al cilindro, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polmero.
Colocar el cilindro en el aparato y hacer rotar inmediatamente a la velocidad especificada en la monografa individual. Se
puede cubrir el vaso durante la prueba para minimizar la evaporacin.
En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte
superior del cilindro rotatorio, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el anlisis en cada alcuota de muestra segn se indica en la monografa individual, corrigiendo por cualquier prdida de volumen, segn sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.
Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una
tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo ms
corto.
USP 38
de ingrediente activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptacin 1 anterior. Continuar analizando a lo largo de los
tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2.
Aparato 7 (Soporte Oscilante)
Captulos
Aparato: El ensamblaje consta de (1) un grupo de recipientes para soluciones volumtricamente calibrados o tarados hechos
de vidrio o de otro material inerte adecuado que no deben adsorber o absorber, reaccionar ni interferir con la muestra que se
est analizando; (2) un motor y una transmisin que hacen oscilar el sistema en sentido vertical y que, si se desea, trasladan
automticamente el sistema en sentido horizontal hacia otra hilera de vasos; y (3) un grupo de portamuestras adecuados (ver
la Figura 4 y las Figuras 5a, 5b, 5c y 5d).
Figura 4. Disco oscilante portamuestras.
Figura 5a. Portamuestras de sistemas transdrmicosdisco angular.
USP 38
Figura 5b. Portamuestras de sistemas transdrmicoscilindro.
Figura 5c. Portatabletas para tabletas orales de liberacin prolongadavarilla, puntiaguda para encolado.
Captulos
Figura 5d. Portatabletas para tabletas orales de liberacin prolongadasoporte de resorte.

Durante la prueba, los recipientes para soluciones se sumergen parcialmente en un bao de agua adecuado de cualquier
tamao conveniente que permite mantener la temperatura dentro de los recipientes a 32 0,5 para STD o a 37 0,5 para
otras formas farmacuticas.
Ninguna parte del equipo, incluyendo el entorno en el que ste se coloca, contribuye con movimiento, agitacin o vibracin
importante ms all de la debida al movimiento oscilante suave y vertical del portamuestras.
Se prefiere un aparato que permita la observacin del sistema y del portamuestras durante la prueba.
Usar un portamuestras y recipiente del tamao especificado en la monografa individual.
Medio: Ver Medio de Disolucin en Disolucin 711, Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacuticas de Liberacin
Inmediata.
Preparacin de la muestra A (para tabletas de bomba osmtica): Sujetar cada unidad a analizar a un portamuestras adecuado
usando un procedimiento apropiado y validado tal como el uso de un adhesivo para adherir el borde de la tableta al portamuestras (p.ej., Figura 5c), al soporte de resorte (Figura 5d), a una pequea bolsa de red de nailon o a una membrana.
Preparacin de la muestra B (para STD): Aplicar el STD al portamuestras adecuado, asegurndose de que la superficie de liberacin est lo ms lisa posible y que el STD est completamente sujeto al portamuestras con firmeza. El STD puede sujetarse al
portamuestras con la superficie de liberacin contra el Medio usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de
burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado
la capa protectora del STD sin daar la superficie de ste ltimo. Si se requiere reforzar ms la sujecin del STD al portamuestras, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polmero.
USP 38
Captulos
Preparacin de la muestra C (para otras formas farmacuticas): Sujetar cada forma farmacutica a analizar al portamuestras
adecuado.
Procedimiento: Colocar el volumen declarado de Medio en los recipientes para soluciones y equilibrar a la temperatura de
prueba.
Suspender cada portamuestras preparado en un agitador de oscilacin vertical de modo que cada sistema se sumerja continuamente en Medio durante toda la prueba.
Hacerlos oscilar a una frecuencia de aproximadamente 30 ciclos/minuto con una amplitud de aproximadamente 2 cm, o
conforme se especifique en la monografa individual, durante el tiempo especificado.
En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar los recipientes para solucin del bao, enfriar a temperatura ambiente y
agregar suficiente disolvente (es decir, agua, en la mayora de los casos) para corregir por prdidas por evaporacin.
Realizar el anlisis en cada muestra segn se indica en la monografa individual. Repetir esta prueba con tantos sistemas
transdrmicos adicionales como sean necesarios.
Tiempo: Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una
tolerancia de 15 minutos o 2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo ms
corto.
de ingrediente activo liberado del STD se ajustan a la Tabla de Aceptacin 1 anterior o a la tabla de aceptacin apropiada en
Disolucin 711 para las dems formas farmacuticas. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2.
729 DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE GLBULOS EN EMULSIONES

INYECTABLES DE LPIDOS
INTRODUCCIN
Las emulsiones inyectables para administracin intravenosa, que se utilizan en la terapia de nutricin parenteral total (TPN,
por sus siglas en ingls), son emulsiones estriles de aceite de soja en agua utilizadas para proveer un suministro amplio de
cidos grasos esenciales, linoleico y linolnico, que se dispersan con la ayuda de un agente emulsionante en Agua para Inyeccin. Como alternativa, se puede mezclar el aceite de soja con otros aceites adecuados (triglicridos neutros), como el aceite
de crtamo, triglicridos de cadena media (MCT, por sus siglas en ingls) derivados de aceites de coco o de semilla de palma,
aceite de oliva o un aceite marino como el de arenque. El tamao de las gotitas de lpidos es crtico: debido a la filtracin
mecnica, los glbulos de grasa de mayor tamao (>5 mm) pueden quedar atrapados en los pulmones. Las caractersticas
esenciales del tamao de una emulsin inyectable de lpidos para uso intravenoso incluyen el dimetro medio de las gotitas de
lpidos y el intervalo de los distintos dimetros de gotitas que se distribuyen alrededor del dimetro medio, lo que se expresa
como la desviacin estndar. Especficamente, las cantidades de glbulos de grasa que constituyen la cola de la curva de distribucin correspondiente al mayor tamao de glbulos son particularmente importantes con respecto a la seguridad de la infusin. Se debe controlar que estas dos regiones de la distribucin del tamao de glbulos (el tamao medio de las gotitas y la
cola de la curva de distribucin correspondiente al mayor tamao de gotitas) se mantengan dentro de los lmites especificados.
Para la determinacin del dimetro medio de las gotitas de lpidos y la distribucin de los tamaos de glbulos de mayor
dimetro en las emulsiones inyectables de lpidos se utilizan los dos mtodos que se describen a continuacin. El Mtodo I y el
Mtodo II deben ser validados. Los mtodos que se describen a continuacin para evaluar la calidad de las emulsiones inyectables de lpidos se deben realizar en dos etapas.
MTODO IMTODO DE DISPERSIN DE LA LUZ

Para la determinacin del tamao medio de las gotitas de las emulsiones inyectables de lpidos, puede usarse una de las dos
tcnicas de dispersin de la luz ms comunes: (1) dispersin dinmica de la luz (DDL), conocida tambin como espectroscopa
de correlacin fotnica (ECF) o (2) dispersin clsica de la luz, basada en la teora de dispersin de Mie. La tcnica DDL o ECF
se basa en el anlisis de las fluctuaciones temporales rpidas en la intensidad de la luz dispersada que se producen debido al
movimiento Browniano aleatorio, o difusin, de cualquier partcula, incluidas las gotitas de lpidos, suspendidas en un lquido.
La intensidad se mide a un ngulo determinado (por lo general 90) por medio de un detector adecuado (p.ej., un tubo fotomultiplicador) capaz de medir la intensidad de la luz dispersada, que flucta rpidamente, producida por las gotitas en difusin, suspendidas. Generalmente, estos datos de intensidad de luz dispersada se utilizan para calcular la funcin de autocorrelacin de intensidad, que es una funcin de decaimiento exponencial simple en funcin del tiempo para gotitas de tamao
uniforme. La distribucin de los tamaos de las gotitas se expresa por funciones exponenciales de distintos tiempos de decaimiento. La funcin de autocorrelacin que generan los datos de intensidad de luz dispersada obtenidos a partir de una emul-
USP 38
Pruebas Fsicas / 729 Distribucin del Tamao de Glbulos 539
Captulos
sin dada puede ser invertida por medio de un algoritmo adecuado de deconvolucin para obtener la distribucin aproximada de coeficientes de difusin ponderados por intensidad. A partir de sta, se calcula la distribucin de gotitas de dimetro
pequeo, mediante la ecuacin de Stokes-Einstein y las reglas de la dispersin clsica de la luz (Mie).
Por el contrario, la dispersin clsica de la luz basada en la teora de Mie analiza la variacin espacial, no la temporal, de la
intensidad de la luz dispersada al medir a la ltima como una funcin del ngulo de dispersin, tpicamente a lo largo de un
gran intervalo de ngulos detectados. Las fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersin debidas al movimiento
Browniano se promedian en el tiempo para cada medicin angular. Esta variacin angular se produce como consecuencia de
la interferencia mutua de las ondas individuales dispersadas que llegan al detector con fases distintas desde puntos diferentes
dentro de una gotita de lpidos dada as como desde otras partculas. La amplitud de la variacin angular es significativa toda
vez que el dimetro de la gotita no sea pequeo en comparacin con la longitud de onda de la luz lser (tpicamente, 635
nm). Las gotitas de un tamao e ndice de refraccin determinados producen una curva nica de intensidad de dispersin en
funcin del ngulo de dispersin. La distribucin de los tamaos de gotitas origina una dependencia angular final que representa la superposicin o suma de las curvas individuales (distintas) de intensidad en funcin del ngulo. La dependencia angular medida de la intensidad de dispersin obtenida a partir de una muestra de emulsin dada puede ser invertida por medio de
un algoritmo adecuado de deconvolucin y la teora de dispersin de Mie para obtener la distribucin aproximada del tamao
de gotitas.
As, la dispersin de la luz, mediante la dispersin dinmica de la luz (es decir, fluctuaciones temporales debidas a la difusin
de las gotitas) o la dispersin clsica de la luz/teora de Mie (es decir, intensidad promedio en funcin del ngulo), puede proporcionar resultados aceptables para el dimetro medio y la desviacin estndar de la distribucin del tamao de las gotitas.
Para ilustrar el mtodo usado en el Mtodo I, se describe una tcnica de dispersin dinmica de la luz. Para una gua sobre los
instrumentos que utilizan la dispersin clsica de la luz - teora de Mie, ver Medicin del Tamao de Partcula por Difraccin de
Luz 429.
AparatoUn instrumento DDL/ECF adecuado, con o sin la capacidad de dilucin automtica de muestra, y controlado por
un software validado, se utiliza para llevar a cabo la medicin con el ngulo de dispersin generalmente ajustado a 90. Se
informan los resultados ponderados por intensidad (dimetro medio y desviacin estndar), siempre que se indique claramente cules son los valores que se proveen y que tambin se den los valores de los parmetros necesarios para los clculos requeridos.
AguaPasar agua destilada a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,2 mm y desgasificar por ultrasonido o usar
Agua Estril para Inyeccin almacenada en un envase de vidrio.
Preparacin EstndarAgregar una cantidad adecuada de suspensin concentrada, conteniendo partculas estndar de ltex de poliestireno rastreables al NIST u otras nanoesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homognea. La suspensin diluida tendr un aspecto levemente turbio. Si el
instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial
por inyeccin directa en el instrumento con una jeringa, producindose automticamente una dilucin adicional para optimizar la concentracin de gotitas para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin manual mayor con Agua
(tpicamente por un factor de 10, por lo menos, sobre la primera dilucin) y su instilacin posterior en una celda de goteo. Las
especificaciones del instrumento determinarn el esquema ptimo de dilucin que logre la intensidad de dispersin adecuada
para el anlisis por celda. As, se debe optimizar la concentracin de ltex en la muestra final para el instrumento DDL/ECF
utilizado. Esto se deber llevar a cabo separadamente para tres estndares de tamao distintos de aproximadamente 100 nm,
250 nm y 400 nm (anlisis triplicado por tamao) y los resultados correspondientes del dimetro medio ponderado por intensidad y la desviacin estndar deben coincidir con los valores esperados dentro de errores aceptables.
Preparacin de PruebaAgregar un volumen adecuado de muestra de la emulsin inyectable de lpidos a un volumen
preestablecido de agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homognea. La suspensin diluida tendr un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, se puede
analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con una jeringa. Automticamente se producir
una dilucin adicional de la muestra para optimizar la concentracin de gotitas para el anlisis, lo que asegura que no se produzcan artefactos debidos a la dispersin mltiple o las interacciones entre las gotitas. Alternativamente, la muestra podra requerir una dilucin manual mayor con Agua (tpicamente por un factor de 10, por lo menos, sobre la primera dilucin) y su
instilacin posterior en una celda de goteo. Las especificaciones del instrumento determinarn el esquema ptimo de dilucin que logre la intensidad de dispersin adecuada para el anlisis por celda. As, se debe optimizar la concentracin de la
emulsin inyectable de lpidos en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado.
Aptitud del SistemaUsando la Preparacin Estndar, medir el dimetro medio de partculas ponderado por intensidad y
la desviacin estndar correspondiente. El sistema es apto una vez que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio y los
resultados se han estabilizado y se obtienen por triplicado las mediciones del dimetro medio de las gotitas. El coeficiente de
variacin (CV) no debe superar el 10% del dimetro medio de las gotitas rastreables al NIST. Un valor mayor de CV indica que
las microesferas de ltex no son aptas como estndar porque carecen inherentemente de uniformidad o se han aglomerado a
un nivel inaceptable. En este caso, se debe seleccionar y probar otra suspensin ltex estndar.
Procedimiento e InterpretacinSi el instrumento DDL/ECF est equipado con un sistema de dilucin automtico, usar
una jeringa desechable para cargar la Preparacin Estndar o la Preparacin de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilucin
automtico, transferir la preparacin adecuadamente diluida a una celda y colocarla en el espectrmetro. Dejar que la muestra
se equilibre a una temperatura controlada preestablecida cercana a la temperatura ambiente (entre 20 y 25, como en la defi-
540 729 Distribucin del Tamao de Glbulos / Pruebas Fsicas
USP 38
nicin de la USP que se encuentra en Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659). Ajustar el ngulo de dispersin del instrumento a 90 y llevar a cabo las mediciones. En tanto que la bondad del ajuste chi cuadrado (c2) se mantenga aceptablemente bajo (de acuerdo con las especificaciones del instrumento), los resultados para la Preparacin de Prueba son aceptables.
Los valores excesivos del parmetro c2 sugieren que la distribucin de gotitas no es normal y pueden indicar una emulsin
inestable. El dimetro medio de las gotitas ponderado por intensidad (MDD) para las emulsiones inyectables de lpidos debe
ser inferior a 500 nm o 0,5 mm, independientemente de la concentracin de la fase lpida dispersa.
Captulos
MTODO IIMEDICIN DEL CONTENIDO DE GLBULOS GRANDES POR EL MTODO DE

OBSTRUCCIN O EXTINCIN DE LUZ
Para la determinacin de la extensin de la cola de la curva de distribucin correspondiente al mayor tamao de gotita (>5
mm) de las emulsiones inyectables de lpidos se usa un mtodo de obstruccin de la luz (LO, por sus siglas en ingls) o extincin de la luz (LE, por sus siglas en ingls) que emplea la tcnica de determinacin ptica del tamao de partculas individuales
(glbulos) (SPOS, por sus siglas en ingls). Durante la aplicacin de la tcnica LE/SPOS, el pasaje de una gotita a travs de una
zona estrecha de deteccin ptica causa el bloqueo de una porcin del haz de luz incidente, lo que provoca la reduccin momentnea de la intensidad de la luz que alcanza al detector de extincin. Idealmente, la magnitud de esta reduccin en la
seal es proporcional al rea de seccin transversal de la gotita (considerada ms pequea que el espesor de la zona de deteccin), es decir, al cuadrado del dimetro de la gotita. Durante la optimizacin del instrumento LE/SPOS para una muestra de
emulsin determinada, debe probarse una serie de diluciones para lograr uniformidad entre las muestras. El objetivo es la identificacin de un intervalo estndar de diluciones que produzcan datos uniformes y sean las ms adecuadas para la formulacin
evaluada. Idealmente, cuando se comparan emulsiones distintas, se utiliza el mismo nmero aproximado de glbulos en cada
determinacin de tamao y una vez que se alcanza un estndar, se lo incorpora al plan de muestreo de rutina para las pruebas
de validacin. Siempre que la concentracin de glbulos de grasa est por debajo del lmite de coincidencia del sensor (determinado por la celda de flujo y el diseo ptico), slo pasar un glbulo, como mximo, a travs de la zona de deteccin en
un momento determinado, lo que permite que se lo cuente y se mida con exactitud (con menos de 1% de eventos de coincidencia). Es necesario conocer el lmite de coincidencia y la velocidad ptima del flujo para el sensor LE/SPOS usado. Adems,
es prudente que se realicen las mediciones de dimetro grande a una concentracin reducida de la emulsin para que la concentracin mensurable de gotitas desde un umbral de deteccin (p.ej., >1,8 mm) hasta un lmite superior (p.ej., 50 mm) slo
sea aproximadamente un tercio del lmite nominal de coincidencia para el sensor usado. Las alturas resultantes de los pulsos
individuales se convierten en dimetros de gotitas mediante una curva de calibracin estndar construida previamente a partir
de microesferas de poliestireno de tamao uniforme rastreables al NIST con dimetros conocidos. Para una gua adicional en el
uso de la metodologa de obstruccin de la luz, consultar el captulo general Partculas en Inyectables 788.
AparatoPara la medicin se usa un instrumento de obstruccin de la luz adecuado, con o sin capacidad de dilucin automtica de la muestra y controlado por un ordenador personal (PC). Se informan los datos de distribucin del tamao de partculas ponderado por nmero y volumen, siempre que se indique claramente cules son los valores que se proveen y que tambin se den los valores de los parmetros necesarios para todos los clculos requeridos.
AguaPasar agua destilada a travs de un filtro con un tamao de poro de 0,2 mm o usar Agua Estril para Inyeccin almacenada en un envase de vidrio.
Preparacin EstndarAgregar una cantidad adecuada de suspensin concentrada, conteniendo partculas estndar de ltex de poliestireno rastreables al NIST u otras microesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homognea. Si el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un
sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con
una jeringa o una lnea de muestreo de Tefln. Luego, se produce automticamente una dilucin adicional de la muestra para
optimizar la concentracin de partculas para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin manual mayor
con agua (tpicamente por un factor de 10, por lo menos, sobre la primera dilucin). La muestra diluida resultante se instila
luego en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estril Tipo I, antes de pasarla por el sensor. En cualquiera de los casos, la concentracin final de partculas debe estar por debajo del lmite de coincidencia del sensor. Se debe
obtener la exactitud de la determinacin de tamao y recuento del instrumento de obstruccin de la luz mediante dos estndares de tamao distintos de aproximadamente 5 mm y 10 mm (anlisis triplicado por tamao). Para los estndares despus de
la calibracin del sistema, ajustar el umbral de deteccin del instrumento a 1,8 mm, extendido a un lmite superior de 50 mm.
Los resultados correspondientes del dimetro medio deben coincidir con los valores esperados, dentro de 10% de la desviacin estndar relativa y una exactitud de tamao de 90%110%. Adems, el nmero de recuento de partculas obtenido por
mL tambin debe coincidir dentro de 10% con los valores de concentracin certificados en la documentacin provista con
cada estndar de tamao rastreable al NIST.
Preparacin de PruebaAgregar un volumen adecuado de muestra de la emulsin inyectable de lpidos (anlisis triplicado
por muestra) a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los lquidos para obtener una suspensin homognea. La emulsin diluida tendr un aspecto levemente turbio. Si el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un
sistema de dilucin automtico, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyeccin directa en el instrumento con
USP 38
Pruebas Fsicas / 730 Espectroqumica de Plasma 541
730 ESPECTROQUMICA DE PLASMA

Las tcnicas instrumentales basadas en plasma que se utilizan en el anlisis farmacutico se clasifican en dos grandes grupos:
a) las tcnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado y b) las tcnicas en las que el plasma se genera en la superficie de la muestra o cerca de ella. El plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en ingls) es una fuente de excitacin
de alta temperatura que desolvata, vaporiza y atomiza muestras aerosolizadas e ioniza los tomos resultantes. Estos iones y
tomos excitados pueden detectarse posteriormente mediante la observacin de sus lneas de emisin, un mtodo denominado espectroscopa de emisin atmica de plasma inductivamente acoplado (ICPAES, por sus siglas en ingls), que tambin se
conoce como espectroscopa de emisin ptica de plasma inductivamente acoplado (ICPOES, por sus siglas en ingls), o los
iones excitados o en estado fundamental pueden determinarse mediante una tcnica que se denomina espectrometra de masas de plasma inductivamente acoplado (ICPMS, por sus siglas en ingls). La ICPAES y la ICPMS son tcnicas que permiten
analizar uno o varios elementos y constituyen procedimientos generales apropiados, tanto para anlisis secuenciales como para
anlisis simultneos, con un amplio intervalo lineal y buena sensibilidad.
Una nueva tcnica de espectroscopa de plasma es la espectroscopa de descomposicin inducida por lser (LIBS, por sus
siglas en ingls). La tcnica LIBS consiste en calentar directamente la muestra en estado lquido, slido o gaseoso con un lser
pulsado o indirectamente por un plasma generado por el lser. Como resultado, la muestra se volatiliza en el punto de contacto con el lser, reduciendo los constituyentes volatilizados a tomos, fragmentos moleculares y grupos ms grandes, en el plasma que se forma en la superficie de la muestra o un poco ms arriba de ella. La emisin de los tomos e iones de la muestra se
recolecta, generalmente con fibra ptica u otro sistema de visualizacin remota y se mide con un dispositivo detector, como
por ejemplo un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en ingls). La LIBS se puede utilizar para realizar
anlisis cualitativos o cuantitativos con una curva estndar de trabajo. Aunque la industria farmacutica an no ha incorporado
la utilizacin generalizada de la LIBS, sta puede resultar adecuada para realizar mediciones tanto en el rea de produccin
como en el laboratorio, en el lugar fsico o en lnea. Su potencial la convierte en una tcnica viable para la espectroqumica de
plasma en el laboratorio farmacutico, no obstante, siendo la LIBS una tcnica relativamente nueva, este captulo general no la
tratar en forma detallada.1
La preparacin de la muestra es de suma importancia en el anlisis mediante tcnicas basadas en plasma y es el primer paso
en todo anlisis por ICPAES o ICPMS. Los resultados de las tcnicas basadas en plasma dependen en gran medida del trans* El cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en ingls) con dietilhexilftalato (DEHP, por sus siglas en ingls) demostr inducir el rompimiento de las emulsiones
inyectables de lpidos (Sistema de Presentacin de Informes sobre Problemas con Productos Farmacuticos. Acceso a Archivo No. 11173 de la USP, el 15 de mayo,
1991).
1 Yueh F-Y, Singh JP, Zhang H. Laser-induced breakdown spectroscopy, elemental analysis. En: Encyclopedia of Analytical Chemistry: Instrumentation and Applications. New York: Wiley; 2000:20662087.
Captulos
una jeringa o lnea de muestreo de Tefln no reactiva*. Luego, se produce automticamente una dilucin adicional de la muestra para optimizar la concentracin de gotitas/glbulos para el anlisis. Alternativamente, la muestra requerira una dilucin
manual mayor con agua (tpicamente por un factor de por lo menos 10 sobre la primera dilucin). La muestra diluida resultante se instila en un recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estril Tipo I. En cualquiera de los casos, la concentracin final de gotitas/glbulos debe estar por debajo del lmite de coincidencia del sensor.
Aptitud del SistemaRealizar antes del procedimiento de prueba, usando la Preparacin Estndar de partculas de 5 y de
10 mm rastreables al NIST. Medir por triplicado el dimetro de partcula ponderado por nmero y los conteos/mL del estndar.
El sistema es adecuado cuando las mediciones por triplicado del dimetro medio de partcula ponderado por nmero estn
dentro de 10% del valor estipulado, tanto en trminos de repetibilidad (CV) como de la cercana al tamao certificado en la
etiqueta del estndar rastreable al NIST.
Procedimiento e InterpretacinSi el instrumento de obstruccin de la luz est equipado con un sistema de dilucin automtico, usar una jeringa o lnea de muestreo de Tefln desechable para cargar la Preparacin Estndar o la Preparacin de
Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilucin automtica, transferir la muestra a un recipiente limpio y adecuado, de gran
volumen, como un vaso de vidrio estril Tipo I conteniendo un volumen adecuado de agua. Dejar que la muestra y el agua se
mezclen bien para obtener una suspensin homognea. Ajustar el umbral de deteccin del instrumento a 1,8 mm, extendido a
un lmite superior de 50 mm, y variar la concentracin y/o los tiempos de la recoleccin de datos de tal manera que haya al
menos un factor de dos en la diferencia del nmero total de glbulos que miden >5 mm entre al menos dos corridas de la
muestra. En cualquier caso, el nmero de glbulos que miden >5 mm debe ser lo suficientemente grande para representar un
nmero de glbulos adecuado que sea estadsticamente representativo de la poblacin de dimetro mayor de la cola de la
curva de distribucin correspondiente a la emulsin nativa. Los lmites de la fase dispersa para los glbulos de grasa de dimetro mayor ponderado por volumen, expresados como el porcentaje de grasa en glbulos mayores de 5 mm (PFAT5) para una
emulsin inyectable de lpidos dada, no deben exceder de 0,05%.
Captulos
542 730 Espectroqumica de Plasma / Pruebas Fsicas
USP 38
porte de la muestra al plasma. Como el sistema de introduccin de muestra de la ICPAES y la ICPMS es el mismo, los mtodos mediante los cuales se preparan las muestras pueden aplicarse a ambas tcnicas. El mtodo ms convencional para introducir la muestra en el plasma es la nebulizacin de la solucin. Si se emplea la nebulizacin de la solucin, es necesario disolver
las muestras slidas para introducirlas en el plasma para su anlisis. Las muestras se pueden disolver en cualquier disolvente
apropiado. Existe una gran preferencia por el uso de soluciones acuosas o diluidas de cido ntrico porque sus interferencias
son mnimas en comparacin con otros disolventes. Para disolver la muestra tambin se pueden emplear perxido de hidrgeno, cido clorhdrico, cido sulfrico, cido perclrico, distintas combinaciones de cidos o mezclas de cidos con distintas
concentraciones. El cido fluorhdrico diluido tambin se puede usar, aunque cuando se emplea es necesario tomar las precauciones necesarias para garantizar la seguridad del analista y proteger el equipamiento de cuarzo para introduccin de muestra;
especficamente, el nebulizador, la cmara de roco y el tubo interno de la antorcha los cuales deben estar fabricados con materiales resistentes al cido fluorhdrico. Se pueden emplear otras alternativas para disolver la muestra, tales como bases diluidas, disolventes orgnicos puros o diluidos, combinaciones de cidos o bases y distintas combinaciones de disolventes orgnicos, entre otras.
Cuando las muestras se introducen en el plasma por nebulizacin de la solucin, es importante considerar los posibles efectos de la matriz e interferencias que el disolvente pueda generar. En casos en los que la exactitud y la precisin no sean adecuadas, se debe emplear un estndar interno apropiado y/o se debe homologar la matriz del estndar con la matriz de las
muestras en los anlisis ICPAES e ICPMS. En todo caso, la seleccin de un estndar interno apropiado debe tener en cuenta
el analito en cuestin, la energa de ionizacin, las longitudes de onda o las masas y la naturaleza de la matriz de la muestra.
Cuando una muestra no es soluble en ninguno de los disolventes aceptables, se pueden emplear diferentes tcnicas de digestin. Entre ellas est la digestin por calentamiento en placa o la digestin asistida por microondas, tanto en recipientes
cerrados como abiertos. La seleccin del tipo de tcnica de digestin depende de la naturaleza de la muestra a digerir y de los
analitos en estudio.
Por lo general no se recomienda la digestin en recipientes abiertos en los anlisis de metales voltiles; por ejemplo, selenio
y mercurio. La aptitud de una tcnica de digestin, sea en un recipiente abierto o cerrado, debe respaldarse con experimentos
de recuperacin de cantidades conocidas agregadas para comprobar que, en un intervalo de tolerancia aceptable, los metales
voltiles no se han evaporado durante la preparacin de la muestra. Utilizar cidos, bases y perxido de hidrgeno ultra puros,
especialmente cuando se emplea la ICPMS. El agua desionizada debe tener 18 megaohmios como mnimo. Verificar las posibles interferencias del diluyente antes de utilizarlo en un anlisis. Seleccionar los disolventes orgnicos de la calidad ms alta
disponible con respecto al contenido de contaminantes metlicos, ya que no siempre es posible obtener estos disolventes
exentos de metales.
Es importante tomar en cuenta la seleccin del tipo, material de construccin, tratamiento previo y limpieza del instrumental
de laboratorio analtico empleado en los anlisis ICPAES e ICPMS. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicacin
especfica, resistente a custicos, cidos y/o disolventes orgnicos. En algunos anlisis, se debe proceder con la diligencia debida para prevenir la adsorcin de analitos sobre la superficie de los recipientes, especialmente en los anlisis a nivel de ultratraza. La contaminacin de las soluciones de muestra con metales o iones presentes en el envase puede tambin generar resultados inadecuados.
El uso de instrumental que no ha sido certificado para cumplir con las tolerancias Clase A para matraces volumtricos es
aceptable si se ha demostrado experimentalmente que la linealidad, exactitud y precisin del mtodo son adecuadas para el
estudio a realizar.
INTRODUCCIN DE LA MUESTRA
Existen dos formas de introducir la muestra en el nebulizador: con una bomba peristltica o por autosuccin. Se prefiere el
uso de la bomba peristltica, la cual garantiza que la velocidad de flujo de la muestra y de la solucin estndar hacia el nebulizador es la misma, independientemente de la viscosidad de la muestra. En algunos casos, cuando no es indispensable emplear
la bomba peristltica, puede utilizarse la autosuccin.
Existen varios tipos de nebulizadores disponibles: neumticos (concntricos y de flujo cruzado), de rejilla y ultrasnicos.
Tambin estn disponibles los micronebulizadores, los nebulizadores de alta eficacia, los nebulizadores de alta eficacia por inyeccin directa y los nebulizadores de inyeccin de flujo. La seleccin del nebulizador para cada anlisis se debe hacer en funcin de la matriz de la muestra, del analito y de la sensibilidad deseada. Algunos nebulizadores son mejores para las soluciones
viscosas o las que contengan slidos disueltos en altas concentraciones, mientras que otros son mejores para soluciones orgnicas.
Tener en cuenta que la autosuccin de un fluido se debe a los efectos de Bernoulli o de Venturi. No se puede obtener autosuccin con todos los tipos de nebulizadores. Por ejemplo, se requiere de un nebulizador concntrico para la autosuccin de
una solucin.
Una vez que la muestra sale del nebulizador en forma de aerosol, ingresa a la cmara de roco que est diseada para seleccionar slo las gotitas ms pequeas de la solucin de muestra para que ingresen al plasma, como resultado, normalmente
slo de 1% a 2% del aerosol de muestra llega al ICP, aunque algunos nebulizadores con estos fines especficos estn diseados
para permitir que prcticamente todo el aerosol de la muestra ingrese al ICP. Al igual que con los nebulizadores, existen varios
tipos de cmaras de roco disponibles para ICPAES o ICPMS, como por ejemplo la cmara de roco de doble pasaje de Scott
y las cmaras de roco ciclnicas con distintas configuraciones. Seleccionar una cmara de roco compatible con la muestra y el
USP 38
disolvente, considerando que es necesario que se equilibre y vace en el menor tiempo posible. Cuando se seleccione una cmara de roco, se debe tener en cuenta la naturaleza de la matriz de la muestra, la sensibilidad deseada y el analito.
Los sistemas de cromatografa de lquidos o de gases pueden interconectarse con ICPAES e ICPMS para lograr especiacin
molecular, inica u otros modos de separacin qumica basados en emisin elemental o espectrometra de masas.
En ltima instancia, se debe demostrar experimentalmente que la seleccin del equipo de introduccin de la muestra ofrece
suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisin en el anlisis.
Adems de soluciones nebulizadas, tambin es posible analizar muestras slidas directamente por ablacin lser (LA, por sus
siglas en ingls). En esos casos, la muestra ingresa directamente a la antorcha en forma de humo. En vista de las dificultades
que presenta la obtencin de estndares apropiados, las tcnicas de LAICP y LAICPMS se consideran ms adecuadas para
los anlisis cualitativos de compuestos farmacuticos. Sin embargo, se pueden realizar anlisis cuantitativos si se demuestra
mediante un mtodo de validacin apropiado que los estndares disponibles son adecuados.2
PREPARACIN ESTNDAR
ICP
La fuente de excitacin de ICP est compuesta por un suministro de gas argn, una antorcha, una bobina de induccin de
radio frecuencia (RF), una unidad apareadora de impedancia y un generador RF. El gas que se utiliza ms comnmente en la
ICP es el argn. La antorcha de plasma consiste en tres tubos de cuarzo concntricos, denominados tubo interno, intermedio y
exterior. Los tubos intermedios y externos por lo general estn hechos de cuarzo. El tubo interno puede estar hecho de cuarzo
o almina si el anlisis se realiza con soluciones con cido fluorhdrico. El flujo del gas nebulizador transporta el aerosol de la
solucin de muestra a travs del tubo interno de la antorcha y lo introduce en el plasma. El tubo intermedio transporta el gas
intermedio (a veces denominado auxiliar). El flujo del gas intermedio ayuda a elevar el plasma y a hacerlo salir de los tubos
intermedio e interno para evitar que se fundan y que se depositen carbono y sales en el tubo interno. El tubo exterior transporta el gas exterior (a veces denominado plasma o refrigerante) que se utiliza para crear y mantener el plasma toroidal. El flujo
tangencial del gas refrigerante a travs de la antorcha mantiene el plasma donde debe estar, impidiendo que el ICP se expanda hacia el tubo exterior y lo llene y que la antorcha se funda. Alrededor de la antorcha se encuentra la bobina de induccin
RF, tambin denominada bobina de carga, que genera un campo magntico oscilatorio. Este campo genera a su vez una corriente oscilatoria en los iones y electrones formados a partir del argn. La unidad apareadora de impedancia permite acoplar
eficientemente la energa RF del generador con la de la bobina de carga. La unidad puede ser de tipo activa o pasiva. Una
unidad apareadora activa ajusta la impedancia de la energa RF mediante una red capacitiva, mientras que la de tipo pasiva
2 Para informacin adicional acerca de la ablacin lser, ver Russo R, Mao X, Borisov O, Liu H. Laser ablation in atomic spectrometry. En: Encyclopedia of Analytical
Chemistry: Instrumentation and Applications. New York: Wiley; 2000.
Captulos
Se pueden adquirir soluciones estndar de uno o mltiples elementos, con concentraciones rastreables a estndares de referencia primarios, como los del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls), para emplearlas en la
preparacin de soluciones estndar de trabajo. Como alternativa, se pueden preparar soluciones estndar de elementos a partir de materiales estndar y determinar independientemente sus concentraciones, segn corresponda. Las soluciones estndar
de trabajo, especialmente aquellas empleadas en los anlisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida til limitada. Como
regla general, las soluciones estndar de trabajo deben conservarse por un perodo no mayor a 24 horas a menos que se demuestre su estabilidad experimentalmente. La seleccin de la matriz de la preparacin estndar es de vital importancia. Los
experimentos de recuperacin de cantidades conocidas agregadas deben realizarse sobre matrices especficas para la muestra
para determinar la exactitud del mtodo. Si los efectos de matriz de la muestra ocasionan demasiadas inexactitudes, los estndares, blancos y soluciones de muestra deben ser lo ms parecidos posible a la matriz para reducir al mnimo las interferencias.
Cuando no sea posible homologar la matriz, se recomienda utilizar para la ICPAES o ICPMS un estndar interno apropiado
o el mtodo de estndar adicionado. Tambin se pueden introducir estndares internos a travs de un conector "T" en el tubo
de subida de la muestra. En cualquier caso, en la seleccin de un estndar interno apropiado se debe tener en cuenta los analitos en cuestin, sus energas de ionizacin y excitacin, sus comportamientos qumicos, sus longitudes de onda o masas y la
naturaleza de la matriz de la muestra. En ltima instancia, se debe demostrar experimentalmente que la seleccin del estndar
interno ofrece suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisin en el anlisis.
El mtodo de estndar adicionado consiste en el agregado a la muestra de una concentracin conocida del elemento analito
a no menos de dos niveles de concentracin adems de una preparacin de la muestra sin el agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en funcin de la concentracin del elemento analito agregado y se traza la recta
de regresin lineal correspondiente a los datos. La concentracin del analito en la muestra se obtiene multiplicando el valor
absoluto del punto donde la recta corta el eje x por el factor de dilucin que corresponda.
La presencia de carbn disuelto a concentraciones de pequeo porcentaje en soluciones acuosas eleva la ionizacin de selenio y de arsnico en un plasma de argn inductivamente acoplado. Este fenmeno por lo general resulta en el sesgado positivo de las medidas cuantitativas de selenio y arsnico mediante ICPAES e ICPMS, las cuales pueden corregirse mediante el
mtodo de estndar adicionado o el agregado de un pequeo porcentaje de carbn, como el cido actico glacial analticamente puro, a los estndares de linealidad.
USP 38
ajusta la impedancia directamente a travs del circuito generador. La transferencia de energa entre la bobina y el argn que se
produce dentro de la bobina de carga del generador RF genera un plasma autnomo. Los iones y electrones del argn colisionan con los tomos del analito que estn en el plasma a alta temperatura, ionizndolos y excitndolos. La temperatura del
plasma es de 6000 a 10 000 K, tal que bsicamente todas las uniones covalentes y las interacciones entre los analitos se han
eliminado.
Captulos
ICPAES
El plasma inductivamente acoplado puede emplearse en sistemas de deteccin pticos o de espectrometra de masas. En el
primer caso, ICPAES, la deteccin del analito se realiza a alguna de las longitudes de onda de emisin del analito en cuestin.
Existe una amplia variedad de sistemas ICPAES disponibles con distintas tecnologas, cada uno con distintas capacidades y
con sus propias ventajas y desventajas. Los sistemas de deteccin simultnea permiten analizar varios elementos al mismo
tiempo, reduciendo los tiempos de anlisis, y mejorando la deteccin y correccin de ruido de fondo. Los sistemas secuenciales funcionan con una longitud de onda a la vez y luego pasan a la siguiente y, a menudo, ofrecen una variedad ms amplia de
bandas analticas para seleccionar la de trabajo. Los dispositivos detectores, incluyendo los dispositivos de acoplamiento de
carga y los de inyeccin de carga, con detectores dispuestos en un chip, brindan la posibilidad de combinar las ventajas que
ofrecen los sistemas secuenciales y los simultneos. Estos tipos de dispositivos de deteccin se usan con los espectrmetros
ms potentes, ofreciendo un anlisis rpido y una amplia seleccin de bandas analticas.
El ICP puede observarse en planos axiales o radiales (tambin llamados laterales). La antorcha se coloca por lo general en
posicin horizontal en plasmas de observacin axial y la muestra se observa desde el pice; la antorcha se coloca en posicin
vertical en plasmas de observacin radial y la muestra se observa lateralmente. La observacin axial del plasma puede ofrecer
relaciones seal ruido mayores (mejores lmites de deteccin y precisin); no obstante, tambin incurre en mayores interferencias espectrales y de matriz. Los mtodos validados con un instrumento de configuracin radial probablemente no sern cien
por ciento aplicables a un instrumento de configuracin axial y viceversa.
Tambin existen sistemas con ambas configuraciones de observacin, lo que permite al analista aprovechar la configuracin
de antorcha ms ventajosa. La seleccin de la configuracin de la antorcha ptima depender de la matriz de la muestra, del
analito en cuestin, de la(s) longitud(es) de onda analtica seleccionada(s), del costo de la instrumentacin, de la sensibilidad
requerida y de los instrumentos disponibles en cada laboratorio.
Independientemente de la configuracin de la antorcha o de la tecnologa del detector, la ICPAES es una tcnica que proporciona una medicin cuantitativa y/o cualitativa de la emisin ptica de tomos e iones excitados a longitudes de onda especficas. Estas mediciones luego se utilizan para determinar la concentracin del analito en la muestra en estudio. Un tomo o
in atmico excitado emite un conjunto de diferentes frecuencias de luz caractersticas de la transicin energtica tpica de ese
elemento. En general, la intensidad de la luz es proporcional a la concentracin del analito. Es necesario realizar correcciones
por emisin de fondo proveniente del plasma. Las concentraciones de la muestra se determinan por lo general a partir de una
curva de trabajo de estndares conocidos sobre el intervalo de concentraciones similar al intervalo de inters. Sin embargo, es
posible realizar calibraciones de un nico punto en determinadas circunstancias, como por ejemplo en el caso de las pruebas
de lmite, si la metodologa se ha validado en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisin,
tolerancia y robustez.
Debido a que las transiciones entre los niveles de energa atmica estn bien definidas y a que los tomos en ICP estn bastante diluidos, las lneas de emisin tienen anchos de bandas estrechos. Sin embargo, dado que los espectros de emisin de la
ICP contienen muchas lneas y que las alas de estas lneas se superponen para producir un ruido de fondo casi continuo por
encima del ruido continuo que resulta de la recombinacin de iones de argn con electrones, se requiere un espectrmetro de
alta resolucin en la ICPAES. La decisin respecto a qu lnea espectral se va a medir debe incluir una evaluacin de las potenciales interferencias espectrales. En la muestra, todos los tomos se excitan simultneamente; sin embargo la presencia de mltiples elementos en algunas muestras puede producir una superposicin de espectros. Las interferencias espectrales tambin
pueden deberse a emisiones de fondo de la muestra o del plasma. Los ICP modernos generalmente cuentan con un dispositivo
que permite realizar las correcciones de ruido de fondo as como se pueden aplicar varias tcnicas de correccin de ruido de
fondo. La correccin de ruido de fondo simple generalmente consiste en medir la intensidad de la emisin de fondo en algn
punto que no se encuentre cercano al pico principal y restar el valor obtenido de la seal total. Los modelos matemticos para
restar la seal de la interferencia como correccin de ruido de fondo tambin pueden emplearse con ciertos tipos de espectrmetros ICPAES.
La seleccin de la lnea espectral apropiada para el anlisis es fundamental para un buen anlisis por ICPAES, independientemente de la configuracin de antorcha o del tipo de detector que se utilice. Aunque por lo general se prefieran ciertas longitudes de onda, la seleccin final debe hacerse en el contexto de la matriz de la muestra, el tipo de instrumento y la sensibilidad
requerida. El analista podra comenzar con las longitudes de onda recomendadas por el fabricante del instrumento y luego
seleccionar otras longitudes de onda alternativas segn las recomendaciones del fabricante o en funcin de las tablas de longi-
USP 38
tudes de onda publicadas.3,4,5,6,7 En ltima instancia, se debe demostrar experimentalmente que la seleccin de longitudes de
onda para el anlisis ofrece suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud y precisin en cada caso particular.
Se pueden optimizar la potencia, las velocidades de flujo del gas, la altura de la visualizacin y la posicin de la antorcha a
fin de obtener la mejor seal. Sin embargo, se debe tener en cuenta que estas variables pueden influir en las interferencias
espectrales y de matriz.
En general, es recomendable utilizar la ICP en condiciones robustas, las cuales se pueden evaluar basndose en el par de
lneas MgII/MgI a (280,270 nm/285,213 nm). Si el cociente de las intensidades es mayor de 6,0 en una solucin acuosa, la ICP
es robusta, y menos susceptible a interferencias de la matriz. Generalmente se busca un cociente de aproximadamente 10,0.
Tener en cuenta que el trmino condiciones robustas no guarda relacin alguna con el trmino robustez aplicado a la validacin
de mtodos analticos. No es obligatorio utilizar un instrumento con un cociente MgII/MgI mayor de 6,0, sin embargo, se sugiere para optimizar los parmetros del instrumento en circunstancias diversas.
El anlisis de los elementos del Grupo I puede considerarse una excepcin a esta estrategia. Cuando se forman iones atmicos a partir de elementos de este grupo, stos asumen una configuracin electrnica de gas noble, con la correspondiente alta
energa de excitacin. Dado que el primer estado de excitacin de estos iones es extremadamente alto, se excitan slo unos
pocos, por lo que la intensidad de la emisin es baja. Esta situacin puede mejorarse reduciendo la ionizacin fraccionada, lo
que puede lograrse ajustando a una potencia menor en combinacin con ajustes en la altura de la visualizacin o el flujo del
gas nebulizador, o mediante el agregado de un agente supresor de la ionizacin a las muestras y estndares.
Cuando se utilizan disolventes orgnicos, a menudo es necesario usar ms potencia, ms flujo del gas intermedio e interno y
menos flujo del gas nebulizador que con soluciones acuosas, y reducir el flujo del gas nebulizador. Cuando se emplean disolventes orgnicos, puede ser necesario inyectar pequeas cantidades de oxgeno para que no se acumule carbn en la antorcha.
La exactitud de la longitud de onda en ICPAES debe determinarse de acuerdo con los procedimientos operativos aplicables
del fabricante. Debido a las diferencias inherentes entre los distintos tipos de instrumentos disponibles, no se puede establecer
un procedimiento de aptitud del sistema general. Deben efectuarse las rutinas de calibracin recomendadas por el fabricante
de cada ICPAES. Estas pruebas pudieran incluir, de manera no taxativa, la calibracin de la longitud de onda para varios elementos con una solucin de referencia, la calibracin de la longitud de onda interna con mercurio (Hg) y el barrido espectral
para ubicar los picos. El analista debe verificar el sistema segn las recomendaciones del fabricante.
Estandarizacin
El instrumento debe estandarizarse para la cuantificacin al momento de utilizarlo. Sin embargo, dado que la ICPAES es
una tcnica considerada en general lineal en el intervalo de 6 a 8 rdenes de magnitud, no siempre es necesario demostrar
continuamente la linealidad con una curva estndar compuesta por varios estndares. Una vez que el mtodo se ha desarrollado y se emplea de forma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un nico estndar. Es apropiado emplear
la calibracin de un nico punto en las pruebas de lmite de materiales de produccin y productos finales si la metodologa se
ha validado de forma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisin, tolerancia y
robustez. Tambin es aceptable el empleo de estandarizacin de un nico punto en anlisis cualitativos ICPAES en los que el
propsito del experimento es confirmar la presencia o ausencia de elementos sin el requisito de una cuantificacin exacta.
Se deben valorar un blanco y soluciones estndares que abarquen el intervalo esperado de concentraciones de la muestra y
graficar la respuesta del detector en funcin de la concentracin del analito, tal como en el caso en que la concentracin de un
componente conocido se determina dentro de una tolerancia especfica. Sin embargo, no siempre es posible emplear un estndar que abarque estas concentraciones cuando se realiza un anlisis en el lmite de deteccin o en su cercana. En anlisis
realizados para demostrar la ausencia o eliminacin de elementos por debajo de un lmite especfico es aceptable prescindir de
un conjunto de estndares que abarquen todas las concentraciones. Es necesario elegir la cantidad y las concentraciones de las
soluciones estndar utilizadas segn el propsito de la cuantificacin, el analito en estudio, la sensibilidad deseada y la matriz
de la muestra. Se debe emplear el anlisis de regresin de la grfica del estndar para evaluar la linealidad de la respuesta del
detector y, a menudo, las monografas individuales pueden establecer criterios para el error residual de la lnea de regresin. En
un escenario ptimo, se debe demostrar un coeficiente de correlacin para la curva de trabajo no menor de 0,99 u otro valor
distinto si as se especifica en la monografa individual. Sin embargo, la naturaleza de la matriz de la muestra, el o los analitos,
la sensibilidad deseada y el tipo de instrumentacin disponible pueden hacer que un coeficiente de correlacin inferior a 0,99
sea aceptable. En estos casos se recomienda que el analista proceda con sumo cuidado y que utilice estndares de trabajo adicionales.
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4
5
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7
Payling R, Larkins P. Optical Emission Lines of the Elements. New York: Wiley; 2000.
Harrison GR. Massachusetts Institute of Technology Wavelength Tables [tambin conocida como MIT Wavelength Tables]. Cambridge, MA: MIT Press; 1969.
Winge RK, Fassel VA, Peterson VJ, Floyd MA. Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy: An Atlas of Spectral Information. New York: Elsevier; 1985.
Boumans PWJM. Spectrochim Acta A. 1981;36B:169.
Boumans PWJM. Line Coincidence Tables for Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry. 2nd ed.; Oxford, UK: Pergamon; 1984.
Captulos
Calibracin
USP 38
A fin de demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicial del sistema, se debe volver a determinar una solucin de las
usadas para trazar la curva estndar inicial, a modo de estndar de verificacin, a intervalos apropiados durante el anlisis de
todo el conjunto de muestras. El estndar nuevamente analizado debe concordar con una aproximacin de 10% con su valor
esperado, o segn se especifique en la monografa individual, para el caso de anlisis de un nico elemento, con longitudes de
onda analticas comprendidas entre 200 y 500 nm o con concentraciones de >1 mg por mL. El estndar nuevamente analizado
debe concordar con una aproximacin de 20% con su valor terico, o segn se especifique en la monografa individual, para
el caso de anlisis de varios elementos con longitudes de onda analticas de <200 o >500 nm o con concentraciones de <1 mg
por mL. Si la monografa individual proporciona pautas diferentes para el nuevo anlisis del estndar de verificacin, rige lo
que especifica la monografa.
Captulos
Procedimiento
Utilizar los parmetros del instrumento especificados en la monografa individual. Sin embargo, debido a las diferencias en
las configuraciones de los equipos, los parmetros recomendados por el fabricante pueden emplearse y modificarse segn sea
necesario. Aunque una monografa especifique los parmetros a utilizar, se pueden utilizar otros parmetros operativos adecuados y ajustar las condiciones de trabajo cuando sea necesario. Pero es necesario contar con datos de validacin adecuados
que respalden la utilizacin de condiciones alternativas, y para fines oficiales, las condiciones especificadas en la monografa
tienen precedencia. La informacin obtenida de cada introduccin de una nica muestra se considera un nico resultado. ste
puede ser el promedio de lecturas secuenciales y repetidas de una nica introduccin de la solucin de la muestra o del estndar apropiado. Las concentraciones de la muestra se calculan a partir de la curva de trabajo que se obtiene graficando la respuesta del detector en funcin de la concentracin del analito en las soluciones estndar. Con frecuencia, el instrumento realiza este clculo directamente.
ICPMS
Cuando el plasma inductivamente acoplado emplea un sistema de deteccin de espectrometra de masas, la tcnica se denomina de plasma inductivamente acoplado y espectrometra de masas (ICPMS, por sus siglas en ingls). En esta tcnica, los
analitos se detectan directamente a sus masas atmicas. Como estas masas deben estar cargadas para que se puedan detectar
en la ICPMS, el mtodo depende de la capacidad de la fuente del plasma de atomizar e ionizar los componentes de la muestra. Al igual que en la ICPAES, se encuentra disponible una amplia variedad de sistemas ICPMS.
Los sistemas ms comunes son los de cuadrupolo. Los sistemas de ICPMS de "tiempo de vuelo" cobran cada vez mayor
importancia. Si bien an no se utilizan de forma generalizada, es muy probable que aumente su uso en el futuro. Adicionalmente, tambin se encuentran disponibles instrumentos de alta resolucin por sectores de campo.
La ICPMS, cualquiera sea el diseo o la configuracin del instrumento, proporciona una medida cuantitativa y cualitativa de
los componentes de la muestra. Los tomos del analito generan iones por efecto del plasma. Estos iones se extraen del plasma
que se encuentra a presin atmosfrica a travs de un cono de muestreo y se transfieren a una zona de baja presin, que normalmente se mantiene a una presin cercana a 1 Torr. En este proceso de extraccin, se forma un haz supersnico a partir de
los gases del plasma muestreados conteniendo los analitos que determina muchas de las propiedades de los iones resultantes
del analito. El cono de seleccin, ubicado detrs del cono de muestreo, selecciona los iones de haz supersnico a medida
que emergen del cono de muestreo. Detrs del cono de seleccin se encuentra una zona de baja presin, que normalmente se
mantiene cercana a un miliTorr. Finalmente, los iones seleccionados atraviesan el orificio de una tercera etapa e ingresan a una
zona que se mantiene cercana a un microTorr, donde encuentran la ptica para iones y pasan al espectrmetro de masas. All
los iones se separan segn su relacin masa-carga: (m/z). El intervalo de masas de ICPMS comprende hasta 240 unidades de
masa atmica (uma). Segn la configuracin del equipo, se pueden formar aductos de analito con diluyentes, argn o sus productos de descomposicin. Tambin se forman xidos e iones de analito de carga mltiple, los cuales pueden aumentar la
complejidad de los espectros de masa resultantes. La optimizacin de los parmetros operativos reduce las interferencias; estos
parmetros incluyen los flujos de gas (velocidades de flujo del gas central, intermedio y exterior), flujo de la solucin de la
muestra, potencia de RF, voltaje del lente de extraccin, etc.; o mediante la utilizacin de celdas de colisin o de reaccin, u
operando con plasma fro, si estuviera disponible en el instrumento. Salvo que el laboratorio genere o analice istopos que no
existen en la naturaleza, una lista de istopos naturales proporcionar al analista istopos aceptables para fines analticos. Los
perfiles isotpicos tambin facilitan la identificacin y confirmacin de elementos. Adems, existen tablas de interferencias comunes y de interferencias isobricas poliatmicas con factores de correccin.
La ICPMS generalmente ofrece lmites de deteccin considerablemente ms bajos (mejores) que la ICPAES, en gran medida gracias a que genera un ruido de fondo extremadamente bajo. Esta capacidad es una de las grandes ventajas de la ICPMS
en la determinacin de concentraciones muy bajas de un analito o cuando se requiere la eliminacin de interferencias de la
matriz. En el ltimo caso, algunas interferencias se pueden evitar simplemente con una dilucin adicional de la solucin de
muestra. En algunas aplicaciones, se pueden detectar analitos a concentraciones inferiores a ng por L (ppt) empleando la ICP
MS. Como regla general, la ICPMS como tcnica requiere que las muestras contengan sustancialmente menos slidos totales
disueltos que los que requiere la ICPAES.
El xito de un anlisis ICPMS depende de la seleccin correcta de la masa analtica, independientemente del diseo del
instrumento. Si bien algunas masas se consideran primariamente, dada su rica abundancia natural, a veces se utiliza una masa
USP 38
alternativa para un elemento determinado a fin de evitar la superposicin de espectros (interferencias isobricas). La seleccin
de la masa analtica siempre se debe realizar en funcin de la matriz de la muestra, del tipo de instrumento y de las concentraciones a medir. El analista podra comenzar con las masas recomendadas por el fabricante del instrumento en particular y luego seleccionar otras masas alternativas segn las recomendaciones del fabricante o en funcin de las tablas de istopos naturales publicadas.8
La optimizacin de un mtodo de ICPMS depende de los parmetros del plasma y el medio de introduccin de la muestra.
Estos instrumentos permiten regular la potencia, las velocidades de flujo del gas y la posicin de la antorcha a fin de obtener la
seal ms adecuada. Cuando se utilizan disolventes orgnicos, a menudo es necesario utilizar ms potencia y menos flujo del
gas nebulizador que con soluciones acuosas. En algunos casos puede que sea necesario agregar pequeas cantidades de oxgeno en el gas central o intermedio para que no se deposite carbn en la antorcha o en el orificio del cono de muestreo. Con
algunos disolventes orgnicos puede ser necesario usar conos de muestreo o de seleccin con punta de platino para disminuir
la degradacin del cono.
Calibracin
En las determinaciones por ICPMS, la exactitud del espectro de masas debe estar de acuerdo con lo indicado en los procedimientos operativos aplicables. Debido a las diferencias inherentes en los distintos tipos de instrumentos disponibles, no se ha
establecido un procedimiento de aptitud del sistema general. Se deben consultar las pruebas recomendadas por el fabricante
de cada instrumento de ICPMS. Estas pruebas pueden incluir, de manera no taxativa, la puesta a punto con una o ms masas
de referencia, el barrido espectral para ubicar los picos y la calibracin de masas. El analista debe verificar el sistema segn las
recomendaciones del fabricante del instrumento.
Se debe estandarizar el instrumento para la cuantificacin al momento de su uso. Como la respuesta (seal en funcin de la
concentracin) de la ICPMS normalmente se considera lineal en el intervalo de 6 a 8 rdenes de magnitud, no siempre es
necesario demostrar continuamente la linealidad mediante una curva de trabajo. Una vez que el mtodo se ha desarrollado y
se emplea de forma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un nico estndar. Es apropiado emplear la
calibracin de un nico punto en las pruebas de lmite de materiales de produccin y productos finales si la metodologa se ha
validado de forma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisin, tolerancia y
robustez. Se deben valorar un blanco y soluciones estndares que abarquen el intervalo esperado de concentraciones de la
muestra y graficar la respuesta del detector en funcin de la concentracin del analito. La seleccin de la cantidad y concentracin de las soluciones estndar utilizadas se realizar segn el analito en estudio, las concentraciones esperadas y la matriz de
la muestra y quedan a criterio del analista. En un escenario ptimo, se debe demostrar un coeficiente de correlacin para la
curva estndar de trabajo no menor de 0,99 u otro valor distinto si as se especifica en la monografa individual. Sin embargo,
la naturaleza de la matriz de la muestra, el analito, la sensibilidad deseada y el tipo de instrumentacin disponible pueden hacer que un coeficiente de correlacin inferior a 0,99 sea aceptable. En estos casos se recomienda que el analista proceda con
sumo cuidado y que utilice estndares de trabajo adicionales.
A fin de demostrar la estabilidad del sistema desde la normalizacin inicial, se debe volver a determinar una solucin de las
usadas para trazar la curva estndar inicial, a modo de estndar de verificacin, a intervalos apropiados durante el anlisis de
todo el conjunto de muestras. Se pueden establecer intervalos apropiados, como por ejemplo cada 5 10 muestras o segn lo
considere satisfactorio el analista, teniendo en cuenta el tipo de anlisis en cuestin. El estndar nuevamente analizado debe
concordar con una aproximacin de 10% con su valor esperado para el caso de anlisis de un nico elemento, con masas
analticas exentas de interferencias o con concentraciones de >1 ng por mL. El estndar nuevamente analizado debe concordar
con su valor esperado con una aproximacin de 20% para anlisis de mltiples elementos o cuando las concentraciones son
de <1 ng por mL. Si la monografa individual proporciona pautas diferentes para el nuevo anlisis del estndar de verificacin,
rige lo que especifica la monografa.
El mtodo de estndar adicionado debe usarse en situaciones en que se esperan o sospechan interferencias de la matriz. Este
mtodo implica agregar una concentracin conocida del elemento analito a la solucin de muestra a no menos de dos niveles
de concentracin. La respuesta del instrumento se grafica en funcin de la concentracin del elemento analito agregado y se
traza la recta de regresin lineal correspondiente a los datos. La concentracin del analito en la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x por el factor de dilucin que corresponda.
Procedimiento
Utilizar los procedimientos que se indican en la monografa individual para el modo de deteccin y los parmetros del instrumento. Aunque una monografa especifique los parmetros a utilizar, se pueden utilizar otros parmetros operativos adecuados y ajustar las condiciones de trabajo segn sea necesario. Pero es necesario contar con datos de validacin adecuado
8 Horlick G, Montaser A. Analytical characteristics of ICPMS. En: Montaser A, Editor. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. New York: Wiley-VCH; 1998:516
518.
Captulos
Estandarizacin
USP 38
que respalden la utilizacin de condiciones alternativas, y para fines oficiales, las condiciones especificadas en la monografa
tienen precedencia. Sin embargo, debido a las diferencias en las configuraciones de los equipos, el analista puede comenzar
con los parmetros por defecto sugeridos por el fabricante y modificarlos segn sea necesario. La informacin obtenida de
cada introduccin de una nica muestra se considera un nico resultado. ste puede ser el promedio de lecturas secuenciales y
repetidas de una nica introduccin de la solucin de la muestra o del estndar apropiado. Las concentraciones de la muestra
se calculan a partir de la curva de trabajo que se obtiene graficando la respuesta del detector en funcin de la concentracin
del analito en las soluciones estndar. Los instrumentos ms modernos cuentan con dispositivos que realizan este clculo.
GLOSARIO
ANTORCHA:
Serie de tres tubos concntricos, generalmente de cuarzo, donde se genera el plasma inductivamente acoplado.
Caracterstica de diseo de algunos de los instrumentos de ICPMS. Las celdas de colisin permiten reducir las interferencias causadas por el argn o iones poliatmicos y facilitan el anlisis de los elementos que podran estar afectados por esas interferencias.
CELDA DE REACCIN: Es similar a la Celda de Colisin, pero funciona bajo un principio diferente. Est diseada para reducir o
eliminar las interferencias espectrales.
CONO DE MUESTREO: Un cono de metal (generalmente con la punta de platino, aluminio o nquel) con una pequea abertura a
travs de la cual fluye la muestra ionizada una vez que emergi del plasma.
CONO DE SELECCIN: Un cono metlico con una abertura por donde fluye la muestra ionizada luego de pasar por el cono de
muestreo y antes de ingresar a la zona de alto vaco de ICPMS.
ESTNDAR ADICIONADO: Mtodo que se utiliza para determinar la concentracin real del analito en la muestra cuando la viscosidad o los efectos de la matriz puedan causar determinaciones errneas.
ESTNDAR INTERNO: El elemento que se agrega o est presente en la misma concentracin en los blancos, estndares y muestras, y se usa como referencia de intensidad en el anlisis. Es un requisito indispensable en los anlisis cuantitativos por ICPMS
y es recomendable para trabajar con ICPAES.
GAS AUXILIAR: Ver Gas Intermedio (o Auxiliar).
GAS CENTRAL (O NEBULIZADOR): Uno de los tres flujos de argn en una antorcha ICP. El gas central se emplea para nebulizar la
solucin de la muestra, formando una neblina de finsimas partculas, que luego pasa al tubo central de la antorcha para ingresar al plasma.
GAS DE PLASMA: Ver Gas Externo (o Refrigerante o de Plasma).
GAS EXTERNO (O REFRIGERANTE O DE PLASMA): Fuente principal de suministro de gas para el plasma.
GAS INTERMEDIO (O AUXILIAR):
Gas que se utiliza para despegar el plasma de la superficie de la antorcha, y as se impide que
el tubo intermedio se funda y se acumulen carbn y sales en el tubo interno.
GAS REFRIGERANTE: Ver Gas Externo (o Refrigerante o de Plasma).
IONES CON CARGA MLTIPLE:
tomos que se convierten en iones con carga doble o triple (X++, X+++, etc.) cuando se someten a
la alta temperatura de ionizacin de la ICP. Cuando se detectan por MS, la masa aparente de estos iones ser 1/2 1/3 de la
masa atmica.
m: La masa del in en estudio.
NEBULIZADOR: El dispositivo que se utiliza para transformar la muestra en un aerosol homogneo que se mezcla con el argn,
que posteriormente se enva a la ICP.
PLASMA FRO: Condiciones para el plasma empleado por ICPMS que producen un plasma ms fro que lo habitual en estos
anlisis. Esta condicin se obtiene mediante menos potencia y mayor velocidad de flujo del gas central, y se emplea para contribuir en la reduccin de interferencias isotpicas ocasionadas por el argn y algunos iones poliatmicos.
POTENCIA: El nmero de vatios necesario para encender el gas y mantener el plasma durante un anlisis. Los requisitos de potencia varan segn la matriz de la muestra y cada analito.
SECUENCIAL: Una de las posibles configuraciones para la AES o MS en la que las lneas de emisin discretas o picos isotpicos
se observan mediante un barrido o salteo del intervalo espectral con un monocromador o por barrido del espectrmetro de
masas.
SIMULTNEA: Una de las posibles configuraciones para la AES o MS en la que las lneas de emisin escogidas o picos isotpicos
se observan al mismo tiempo con un policromador o espectrmetro de masas simultneo, con lo cual aumenta la velocidad
del anlisis en un anlisis de muestras con varios elementos.
OBSERVACIN AXIAL: Configuracin del plasma en la tcnica de AES en la que el plasma est orientado hacia el recorrido ptico
del espectrmetro, tambin conocida con el nombre de observacin desde el pice.
OBSERVACIN LATERAL: Ver Observacin Radial.
OBSERVACIN RADIAL: Configuracin del plasma en la tcnica de AES en la que el plasma se visualiza de forma ortogonal con
respecto al recorrido ptico del espectrmetro. Tambin se denomina observacin de lado. Ver tambin Observacin Lateral.
Captulos
CELDA DE COLISIN:
Pruebas Fsicas / 733 Prdida por Incineracin 549
USP 38
731 PRDIDA POR SECADO
733 PRDIDA POR INCINERACIN

Este procedimiento tiene como objeto determinar el porcentaje del material de prueba que se volatiliza y se elimina en las
condiciones especificadas. El procedimiento, tal como se aplica generalmente, no es destructivo para la sustancia que se analiza; sin embargo, la sustancia puede transformarse, por ejemplo, produciendo un anhdrido.
Realizar la prueba sobre material finamente pulverizado y deshacer los grumos, si fuera necesario, con ayuda de un mortero
antes de pesar la muestra. Pesar la muestra a analizar sin aplicar ms tratamientos, a menos que se especifique un secado preliminar a una temperatura inferior u otro pretratamiento especial en la monografa individual. A menos que se especifique otro
equipo en la monografa individual, efectuar la incineracin en una mufla o un horno adecuado que pueda mantener la temperatura dentro de los 25 de variacin con respecto a la temperatura requerida para la prueba, y emplear un crisol adecuado,
completo con su tapa, previamente incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la prueba, enfriado en un
desecador y pesado con exactitud.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con
exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximadamente igual a la calculada por la frmula:
10/L
Disponible como antibiotic moisture content flask de Kimble-Kontes, 1022 Spruce St., Vineland, NJ 08362-1502.
Captulos
El procedimiento que se establece en este captulo determina la cantidad de materia voltil de cualquier tipo que se elimina
en las condiciones especificadas. Para sustancias que parecen contener agua como nico constituyente voltil, es apropiado
aplicar el procedimiento que se indica en el captulo Determinacin de Agua 921 y as se especifica en la monografa individual.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, realizar la determinacin en una muestra de prueba
de 1 a 2 g. Mezclar la sustancia a examinar y, si estuviera en forma de partculas grandes, reducir el tamao de las partculas
aproximadamente a 2 mm, triturando rpidamente la muestra antes de pesarla. Tarar un frasco para pesada adecuado, de poca profundidad, con tapn de vidrio que se haya secado durante aproximadamente 30 minutos bajo las mismas condiciones
que deben emplearse en la determinacin y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Colocar la muestra a analizar
en el frasco, volver a colocar el tapn y pesar con exactitud el frasco y el contenido. Distribuir la muestra a analizar tan uniformemente como sea posible, agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una profundidad de aproximadamente 5 mm
por lo general, y no ms de 10 mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado en la cmara de secado,
retirando el tapn y dejndolo tambin en la cmara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el tiempo especificado en la monografa. [NOTALa temperatura especificada en la monografa debe considerarse comprendida en el intervalo
de 2 de la cifra especificada.] Cuando en una monografa se especifica secar hasta peso constante, el secado deber continuarse hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en ms de 0,50 mg por g de sustancia tomada, realizando la segunda
pesada despus de una hora adicional de secado. Al abrir la cmara, cerrar rpidamente el frasco, permitiendo que llegue a
temperatura ambiente en un desecador antes de pesarlo.
Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se especifica para la determinacin de la Prdida por Secado, mantener el frasco y su contenido durante 1 a 2 horas a una temperatura de 5 a 10 inferior a la temperatura de fusin y luego
secar a la temperatura especificada.
Si se van a analizar cpsulas, utilizar una porcin del contenido mezclado de no menos de 4 cpsulas.
Si se van a analizar tabletas, utilizar el polvo de no menos de 4 tabletas.
En caso de que la monografa individual indique que la prdida por secado debe determinarse mediante anlisis termogravimtrico, utilizar una electrobalanza sensible.
En el caso de que la monografa individual indique secado al vaco sobre un desecador, utilizar un desecador al vaco, una
pistola de secado al vaco u otro aparato de secado al vaco adecuado.
En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante
se mantenga siempre completamente eficaz mediante su recambio frecuente.
En caso de que la monografa individual indique secar en un frasco con tapn con perforacin capilar1 al vaco, utilizar un
frasco o tubo con un tapn con un capilar de 225 25 mm de dimetro y mantener la cmara de calentamiento a una presin
de 5 mm de mercurio o menor. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire seco a la cmara de calentamiento,
retirar el frasco y con el tapn con perforacin capilar todava en su sitio, permitir que se enfre a temperatura ambiente en un
desecador antes de pesar.
550 733 Prdida por Incineracin / Pruebas Fsicas
USP 38
en donde L es el lmite (o el valor de la media de los lmites) para la Prdida por incineracin, en porcentaje. Incinerar el crisol
destapado cargado y cubrir a la temperatura (25) y durante el periodo de tiempo indicado en la monografa individual. Incinerar durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineracin hasta peso constante. Una vez completada cada
incineracin, cubrir el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente antes de pesar.
735 ESPECTOMETRA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X
Captulos
INTRODUCCIN
La espectrometra de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en ingls) es un mtodo instrumental basado en la medicin de fotones de rayos X caractersticos originados por excitacin de electrones de las capas internas atmicas mediante una
fuente primaria de rayos X. El mtodo de XRF se puede usar para anlisis cualitativos y cuantitativos de lquidos, polvos y materiales slidos. Los rayos X producidos por un tubo de rayos X incluyen lneas caractersticas que corresponden al material del
nodo y un continuo conocido como radiacin Bremsstrahlung. Se pueden usar ambos tipos de rayos X para excitar tomos e
inducir as los rayos X. El instrumental para XRF se puede dividir en dos categoras: Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de
Longitud de Onda (WDXRF, por sus siglas en ingls) y Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Energa (EDXRF, por sus siglas en
ingls). El factor principal que distingue a estas tecnologas es el mtodo usado para separar el espectro emitido por los tomos en la muestra. La energa de los fotones de rayos X es caracterstica para una transicin electrnica dada en un tomo y es
de carcter cualitativo. La intensidad de la radiacin emitida indica el nmero de tomos excitados en la muestra y constituye el
carcter cuantitativo del mtodo.
CALIFICACIN DE ESPECTRMETROS PARA XRF

Calificacin de la Instalacin
Ver el captulo general USP Calificacin de Instrumentos Analticos 1058.
Calificacin Operativa
El propsito de la calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) es verificar que el sistema opere dentro de las tolerancias esperadas usando muestras apropiadas con propiedades espectrales conocidas. La calificacin operativa es una verificacin
de los parmetros crticos de operacin y debe realizarse despus de llevar a cabo la instalacin, reparaciones o mantenimientos importantes que pudiera afectar el desempeo de los instrumentos. Es importante tomar en cuenta que todas las muestras
de calibracin deben manejarse con guantes de algodn o nitrilo y deben almacenarse en envases plsticos sellados. Alternativamente, pueden estar integradas en el instrumento.
Las pruebas y especificaciones de calificacin operativa en las secciones siguientes representan nicamente ejemplos tpicos
(ver las Tablas 1 y 3). Se pueden usar otras pruebas y estndares para establecer tolerancias para estos propsitos. El proveedor
del instrumento a menudo pone a disposicin muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de calificacin de la
instalacin.
Tabla 1. Especificaciones de Calificacin Operativa para EDXRF
Prueba
Procedimiento
Criterios de
Aceptacin
Posicin del pico
El espectro debe tener un conteo de al menos 3000 en

los mximos de los picos de Al Ka y Cu Ka. La energa
Adquirir un espectro de energa de una muestra de cali- correspondiente a los picos de Al Ka y Cu Ka no debe
bracin de AlCu.
diferir en ms de 0,1% de los valores tabulados.
Resolucin del detector
Calcular la resolucin (ancho total a la mitad de su altura mxima) a la misma energa y a la misma velocidad El valor de resolucin no debe cambiar en ms de 10%
del valor determinado en la calificacin de la instalacin.
de conteo usada para la calificacin de la instalacin.
Velocidad de recuento
Medir la velocidad de recuento en las lneas de Al y Cu

Ka de la muestra de calibracin de energa.
Cambia <10% con respecto a las mediciones iniciales en

la calificacin de la instalacin en cada pico.
Para propsitos de calibracin de espectrmetros EDXRF se ha seleccionado una muestra de calibracin de energa que consiste en un disco de aleacin AlCu (EN AW-AlCu6BiPb; Alloy (Aleacin) 2011, ASTM B211). Esta aleacin por lo general se
encuentra disponible, es resistente a la corrosin y provee intensidades adecuadas tanto para Al Ka como para Cu Ka. Estas
lneas caractersticas abarcan las energas tpicas usadas para los anlisis de XRF. Asimismo, se puede obtener informacin suficiente de los espectros registrados en este material para evaluar la resolucin del detector. La Tabla 2 proporciona una especificacin ms completa sobre la composicin de esta muestra de calibracin.
Pruebas Fsicas / 735 Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X 551
USP 38
Tabla 2. Especificacin de la Concentracin de los Elementos de la Aleacin AlCu (el balance remanente es aluminio)
(en % en peso)
Elemento
Cu
56
Zn
0,3 mximo
Fe
0,7 mximo
Bi
0,20,6
Pb
0,20,6
Si
0,4 mximo
Cuando el intervalo de energa de las lneas analticas para las que se usar el espectrmetro incluya energas superiores a
50 keV, se deber usar tungsteno metlico puro W (99,5% mnimo) en lugar de la aleacin AlCu. Este metal es estable, est
fcilmente disponible y provee lneas caractersticas bien definidas a 8,40 keV (lnea L) y 59,3 keV (lnea K).
Tabla 3. Especificaciones de Calificacin Operativa para WDXRF
Prueba
Criterios de
Aceptacin
Procedimiento
El ngulo correspondiente al pico mximo no debe diferir en

ms de 0,10 grados 2q del ngulo medido en la calificacin
de la instalacin.
Resolucin del detector
Ancho total a la mitad de su altura mxima a longitudes de

onda especificadas a las mismas condiciones de medicin
que al momento de la calificacin de la instalacin. RepeNo cambia ms de 20%
tir para cada detector disponible.
Velocidad de recuento
Medir la velocidad de conteo en la muestra de monitoreo

especfica a una longitud de onda especificada a las mismas condiciones de medicin que al momento de la calificacin de la instalacin. Repetir para cada detector disponible.
Cambia <10% con respecto a las mediciones iniciales en la

calificacin de la instalacin
Usar Inconel 625 (Special Metals Corporation, New Hartford, NY) como una muestra para espectrmetros de WDXRF. Otras
designaciones para esta aleacin son UNS N06625, DIN 2.4856, ASTM B443, ASME SB-443 y AMS 5599. Se trata de una aleacin basada en nquel que incluye cromo, molibdeno y niobio como los elementos ms importantes de la aleacin. La Tabla 4
proporciona una especificacin ms completa sobre la composicin.
Tabla 4. Concentraciones Elementales del Inconel 625
Elemento
(en % en Peso)
Ni
58,0 mnimo
Cr
20,023,0
Fe
5,0 mximo
Mo
8,010,0
Nba
3,154,15
ste puede incluir Ta.
Una pieza pulida de Inconel 625 jams debera requerir trabajo de superficie siempre que se almacene y use apropiadamente.
Todos los detectores usados en la WDXRF secuencial, sin importar si se trata de detectores de flujo proporcional, de gas sellado o de centelleo, pueden detectar las caractersticas de radiacin del nquel. En combinacin con la radiacin Mo K (y L),
las pruebas relacionadas con la posicin del pico y la respuesta del detector de los espectrmetros de WDXRF pueden completarse fcilmente. La Tabla 5 incluye las longitudes de onda o energas tpicas que se usan en el anlisis de XRF.
Tabla 5. Energas y Longitudes de Ondaa para Al, Ni, Cu, Mo y W
Al
Ni
Cu
Mo
Transicin de la lnea Ka1
KL2,3
KL2,3
KL2,3
KL3
KL3
Energa de Ka1 (eV)
1487
7473
8041
17479
59310
Longitud de onda de Ka1

()
8,340
1,659
1,542
0,709
0,209
Transicin de la lnea La1
N/Ab
N/A
N/A
L3M5
L3M5
Energa de La1 (eV)
N/A
N/A
N/A
2293,2
8398,2
Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, Indelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energas de transicin de
rayos X: nuevo enfoque para una evaluacin integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1):3599. Para Al, Ni y Cu, las energas Ka1 y Ka2 de la Tabla V se promediaron
con la ponderacin 2:1. La conversin de longitud de onda usa el valor hc/E de la pgina 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI.
b N/A = no aplica.
Captulos
ngulo del pico
Llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Repetir para cada cristal.
552 735 Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 5. Energas y Longitudes de Ondaa para Al, Ni, Cu, Mo y W (Continuacin)

Longitud de onda de La1
()
Al
Ni
Cu
Mo
N/A
N/A
N/A
5,4066
1,47632
Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, Indelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energas de transicin de
rayos X: nuevo enfoque para una evaluacin integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1):3599. Para Al, Ni y Cu, las energas Ka1 y Ka2 de la Tabla V se promediaron
con la ponderacin 2:1. La conversin de longitud de onda usa el valor hc/E de la pgina 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI.
b N/A = no aplica.
Calificacin del Desempeo

El propsito de la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones crticas que impacten en la calidad.
Dependiendo del uso tpico, las especificaciones para la calificacin de desempeo pueden ser diferentes de las especificaciones del fabricante. Se pueden usar pruebas de calificacin de desempeo especficas para cada mtodo, tambin conocidas
como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificacin de desempeo para mtodos validados.
Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo de la XRF dependen del instrumento y de la aplicacin que se va a usar. La demostracin de un desempeo estable del instrumento durante periodos prolongados provee cierta garanta de que pueden obtenerse mediciones confiables a partir de los espectros de
muestra, usando experimentos de XRF previamente validados.
Captulos
PROCEDIMIENTO
Recomendaciones Generales
Los analistas deben verificar la aptitud de todos los reactivos y materiales con respecto a la posibilidad de contaminacin
antes de usarlos dependiendo del mtodo usado. El anlisis de un elemento ubicuo a menudo requiere el uso del grado ms
puro de reactivo o material disponible. Los portamuestras y las ventanas de soporte deben ser apropiadas para el anlisis y la
configuracin del instrumento. Los analistas deben evaluar la limpieza del equipo usado para preparar muestras para anlisis
de XRF a fin de evitar la contaminacin cruzada de las muestras.
MUESTRAS
Lquidos
Las muestras lquidas pueden introducirse directamente en el espectrmetro XRF siempre y cuando la solucin conste de
una sola fase y su volatilidad sea suficientemente baja. El anlisis de muestras lquidas requiere el uso de un portamuestras especial para lquidos y de una ventana de soporte disponible comercialmente compuesta por una pelcula de polmero adecuado. Alternativamente, las muestras lquidas pueden transferirse a la superficie de un disco y secarse antes de su anlisis. Por lo
general, el experimento se lleva a cabo usando un gas para purga. Se pueden agregar cantidades conocidas de estndares en
solucin directamente a la muestra lquida en concentraciones apropiadas para facilitar la exactitud, la precisin y las pruebas
de especificidad segn se requiera para la validacin del mtodo.
Polvos
Los polvos preparados pueden medirse directamente en un portamuestras para lquidos. Alternativamente, se pueden comprimir en forma de pellets. Si el polvo tiene propiedades autoaglutinantes deficientes, puede ser necesario un aglutinante tal
como una cera o etilcelulosa.
Asimismo, los polvos pueden prepararse para anlisis de XRF fundiendo el material de muestra en un vidrio usando un fundente, por lo general tetraborato de sodio, tetraborato de litio y metaborato de litio. Debido a que las temperaturas requeridas
para fundir el fundente y disolver la muestra son relativamente elevadas (8001300), este procedimiento no es adecuado
para el anlisis de elementos voltiles tales como mercurio y arsnico.
Las muestras de polvos se pueden mezclar con cantidades apropiadas de un material estndar de referencia certificado para
mejorar la exactitud, la precisin y las pruebas de especificidad segn se requiera para la validacin del mtodo. Alternativamente, se pueden agregar cantidades conocidas apropiadas de estndares en solucin a las muestras en polvo y posteriormente secarlas, molerlas si fuera necesario y mezclarlas minuciosamente antes del anlisis. Las adiciones de estndares se pueden
usar en los casos en que las propiedades fsicas o qumicas del polvo pueden introducir un sesgo en la respuesta del analito.
Estndares
Se pueden usar materiales de referencia apropiados que sean rastreables al National Institute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnologa)) o equivalentes en la preparacin de estndares de XRF.
USP 38
Pruebas Fsicas / 735 Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X 553
Anlisis
Para los parmetros instrumentales (si fuera aplicable) seguir el procedimiento de la monografa individual. Debido a las diferencias entre fabricantes con respecto a las configuraciones de los equipos, los analistas pueden usar las condiciones predeterminadas sugeridas por el fabricante. Al momento de su uso, el instrumento debe estandarizarse para el uso pretendido. Los
analistas deben usar estndares de calibracin que abarquen el intervalo esperado de concentraciones tpicas de analito. Al llevar a cabo un anlisis en o cerca del lmite de deteccin, los analistas no siempre pueden usar un estndar que abarque todo el
intervalo, lo cual es aceptable para prueba de lmites. Los analistas deberan usar anlisis de regresin de la grfica estndar
para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, mientras que las monografas individuales pueden establecer criterios
para el error residual de la lnea de regresin.
Para demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicial del sistema, los analistas deben volver a valorar el estndar de calibracin usado en la curva estndar inicial como estndar de verificacin a intervalos apropiados durante el anlisis de la totalidad de un conjunto de muestras. Tambin resulta aceptable el uso de un estndar preparado de manera independiente. A
menos que se indique de otro modo en la monografa individual, el estndar revalorado debe coincidir con su valor esperado
con una aproximacin de 2% para la Valoracin o de 20% para un anlisis de impurezas.
Las concentraciones de muestra se calculan en funcin de la curva de trabajo que se genera al graficar la respuesta del instrumento en funcin de la concentracin del analito en las soluciones estndar.
VALIDACIN Y VERIFICACIN
Validacin
El objetivo de la validacin de un mtodo de XRF es demostrar que el procedimiento de medicin sea adecuado para su
propsito esperado, incluyendo la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o forma farmacutica
(valoraciones de Categora I), la determinacin cuantitativa de impurezas o lmites de prueba (Categora II) y las pruebas de
identificacin (Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (ver la Tabla 2 en el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225), el proceso de validacin del mtodo analtico para XRF requiere el anlisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisin, lmite de cuantificacin y robustez.
Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un mtodo de XRF son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analtico. El captulo 1225 trata los principios generales aplicables. Los criterios de aceptacin especficos
para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido del mtodo. Las muestras para validacin
deben ser independientes del conjunto de calibracin.
EXACTITUD
Para valoraciones de Categora I o pruebas de Categora II, los analistas pueden determinar la exactitud realizando estudios
de recuperacin mediante el uso de la matriz apropiada que tenga concentraciones conocidas agregadas de elementos. Asimismo, se puede usar un material estndar certificado apropiado provisto por la USP. Adems, se considera una prctica aceptable comparar los resultados de la valoracin obtenidos usando el mtodo XRF que se est validando con aqullos obtenidos
de un mtodo analtico establecido. Cuando los analistas usan el mtodo de estndar agregado, las evaluaciones de exactitud
se basan en la concentracin calculada a partir de la interseccin de la curva, con el eje de concentracin a ordenada cero, no
en la recuperacin calculada a partir de las adiciones de estndares individuales.
Criterios de aceptacin: Recuperacin de 98,0%102,0% para valoracin de frmacos y formas farmacuticas, recuperacin del 70,0%150,0% para anlisis de impurezas. Estos criterios de aceptacin deben cumplirse en todo el intervalo validado.
PRECISIN
Repetibilidad
Los analistas deben evaluar el mtodo analtico midiendo las concentraciones de seis estndares distintos al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, los analistas pueden medir las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres muestras distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente
Captulos
Las normativas de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de
los mtodos analticos descritos en la USPNF no estn obligados a validar la exactitud y confiabilidad de dichos mtodos, sino
que deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. En este contexto, y de acuerdo con dichas normativas, se requiere
de validacin cuando se usa un procedimiento de XRF para analizar un artculo no oficial y cuando dicho procedimiento se usa
como una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artculo oficial (ver las Advertencias Generales 6.30 de la USPNF).
Por otra parte, la verificacin se debe realizar la primera vez que se analiza un artculo oficial usando un procedimiento USP
(para fines informativos nicamente, referirse al captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226).
554 735 Espectrometra de Fluorescencia de Rayos X / Pruebas Fsicas
USP 38
cercanas de modo que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentracin. En este caso, se combina la repetibilidad a las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de aceptacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de frmacos, no ms de
2,0% para la valoracin de formas farmacuticas y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
Precisin intermedia
Los analistas deben establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisin analtica del mtodo. Las variables tpicas
incluyen realizar el anlisis en das distintos, usando diferentes instrumentos, o que dos o ms analistas realicen el mtodo.
Como mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para totalizar seis experimentos proveer una estimacin de la precisin intermedia.
Criterios de aceptacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de frmacos, no ms de
3,0% para la valoracin de formas farmacuticas y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.
ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe poder determinar de manera inequvoca cada analito elemental en presencia de otros componentes
que se esperan encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de aceptacin: Se demuestra cumpliendo el requisito de Exactitud.
Captulos
LMITE DE CUANTIFICACIN
El lmite de cuantificacin (LOQ, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
6 mediciones repetidas de un blanco y multiplicando por 10. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver 1225). Para confirmar la exactitud, se debe realizar una medicin de una muestra de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa y a la que se le agregan cantidades conocidas de tal manera que la concentracin sea similar a la concentracin
de lmite de cuantificacin.
Criterios de aceptacin: El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar de manera precisa y exacta al analito
en un nivel equivalente al 50% de la especificacin.
LINEALIDAD
Los analistas deben demostrar una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta de XRF corregida preparando no menos de cinco estndares a concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la muestra de prueba.
Posteriormente, la curva estndar debe evaluarse usando mtodos estadsticos apropiados tales como la regresin de cuadrados mnimos. Se deben determinar el coeficiente de correlacin (R), la ordenada al origen y la pendiente de la lnea de regresin.
Para experimentos que no tienen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta de XRF, se deben aplicar
mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Criterios de aceptacin: R es no menos de 0,995 para valoraciones de Categora I y no menos de 0,99 para pruebas
cuantitativas de Categora II.
INTERVALO
El intervalo se define como el intervalo entre la concentracin superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo concentraciones superior e inferior) para el que se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad y exactitud.
Criterios de aceptacin: Para criterios de aceptacin centrados en 100,0%: 80,0%120,0%. Para criterios de aceptacin
no centrados: 10% por debajo del lmite inferior de la especificacin hasta 10% por encima del lmite superior de la especificacin. Para uniformidad de contenido: 70,0130,0%. Para la Categora II los requisitos del intervalo son 50,0%120,0% de los
criterios de aceptacin.
ROBUSTEZ
La confiabilidad de una medicin analtica se debe demostrar realizando cambios deliberados a los parmetros experimentales. Para la XRF esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas.
Criterios de aceptacin: La medicin de la respuesta de un estndar o de una muestra despus de un cambio en los parmetros experimentales no debe diferir de la medida obtenida con el mismo estndar usando parmetros establecidos en ms
de 2,0% para una valoracin de una forma farmacutica y no ms de 20,0% para un anlisis de impurezas.
USP 38
Pruebas Fsicas / 736 Espectrometra de Masas 555
Verificacin
El objetivo de una verificacin de un mtodo XRF es demostrar que el procedimiento descrito en la monografa especfica, se
est llevando a cabo con una exactitud, sensibilidad y precisin adecuadas. De acuerdo con el captulo 1226, si no se consigue verificar el procedimiento farmacopeico de acuerdo con la monografa, el procedimiento puede no ser adecuado para su
uso con el artculo en anlisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido
en las Advertencias Generales 6.30 de la USPNF.
Aunque no se requiere la revalidacin completa de un mtodo de XRF farmacopeico, la verificacin de mtodos de XRF farmacopeicos debe incluir por lo menos la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, exactitud, precisin y
lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, segn se indica en la seccin Validacin (anterior).
736 ESPECTROMETRA DE MASAS

INTRODUCCIN
ANLISIS CUALITATIVO
La MS es una tcnica sensible y altamente especfica para la identificacin de analitos. La identificacin o verificacin de estructuras (es decir, la comparacin contra un estndar autntico) mediante MS es particularmente potente cuando se usa junto con una tcnica de separacin tal como cromatografa de gases (GC, por sus siglas en ingls) o cromatografa de lquidos de
alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls). Se puede obtener mayor especificidad en el anlisis usando espectrometra de
masas en tndem (MS/MS, por sus siglas en ingls) o espectrometra de masas de alta resolucin (HRMS, por sus siglas en
ingls). Adems, utilizando HRMS se puede cumplir con requerimientos ms estrictos en cuanto a la exactitud de la masa determinada.
Parmetros Experimentales
Se deben definir los siguientes parmetros experimentales de MS para un procedimiento cualitativo (p.ej., identificacin).
RESOLUCIN DE MASAS
La resolucin de masa unitaria es suficiente para la mayora de las pruebas de identificacin. Cuando se requiere mayor resolucin, sta se especifica en el procedimiento y la demostracin de la resolucin adecuada se incluye en las pruebas de aptitud
del sistema para el procedimiento.
EXACTITUD DE MASAS
Una exactitud o concordancia de masas de 0,50 unidades de masa para iones con una sola carga con un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones. En las pruebas de identificacin, una exactitud o concordancia de
masas de 0,05% con un estndar conocido debera ser suficiente para la identificacin de molculas grandes (mayores de
m/z 2000) cuando se utilizan iones con cargas mltiples.
Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, la exactitud de masas se especifica en el procedimiento. Posteriormente,
se incluye una demostracin de este requerimiento en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte
del protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento (PQ, por sus siglas en ingls) tema que se trata
ms adelante en este captulo.
Captulos
La espectrometra de masas (MS, por sus siglas en ingls) es una tcnica analtica basada en la medicin de la relacin masa/
carga de especies inicas relacionadas con el analito que se est investigando. La MS se puede usar para determinar la masa
molecular y la composicin elemental de un analito, as como para elucidar en detalle la estructura del analito.
Adems de ser reconocida como una poderosa herramienta de elucidacin estructural, la MS tambin se usa ampliamente
para mediciones cuantitativas. Para informacin adicional, ver el captulo de informacin general Aplicaciones de la Espectrometra de Masas 1736, el cual provee una discusin detallada sobre MS.
El instrumental para MS disponible actualmente ofrece mltiples capacidades para anlisis cualitativo y cuantitativo, lo que
resulta en una amplia variedad de enfoques experimentales disponibles para cada necesidad analtica. Debido a la diversidad
de enfoques, este captulo no presenta procedimientos especficos, sino que provee informacin sobre el diseo experimental
y sobre la aptitud del sistema para los procedimientos de MS.
556 736 Espectrometra de Masas / Pruebas Fsicas
USP 38
INTERVALO DE MASAS
El intervalo de masas que se va a barrer tambin se presenta en el procedimiento. El intervalo de masas debe abarcar todos
los iones usados como parte de la confirmacin de la identificacin.
Aptitud del Sistema

La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir la demostracin del desempeo adecuado para los siguientes atributos experimentales.
RESOLUCIN DE MASAS
Se incluye una demostracin de la resolucin apropiada en las pruebas de aptitud del sistema para un procedimiento. La
prueba de desempeo establecida en el protocolo de calificacin del desempeo del instrumento que se realiza diariamente o
previo al procedimiento, puede ser suficiente. Cuando se requieren resoluciones mayores a las de masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostracin de una resolucin adecuada junto con sus criterios de aceptacin.
Captulos
EXACTITUD DE MASAS
Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostracin de la exactitud de masas, o alternativamente, sta forma parte del protocolo de calificacin del desempeo del instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50
unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las
aplicaciones. Cuando se requiera una mayor exactitud de masas para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios
de aceptacin apropiados.
Instrucciones para la Interpretacin

Un experimento de identificacin o verificacin implica la comparacin del compuesto de inters con un estndar autntico
(p.ej., un Estndar de Referencia USP). Para esta forma de identificacin o verificacin, el estndar y la muestra se analizan en
condiciones idnticas y deben presentar resultados que estn dentro del error experimental aceptable para el procedimiento.
Las aplicaciones de la MS para propsitos de identificacin en una monografa oficial pueden incorporar los datos de los espectros de masa nicamente, o pueden combinar esta informacin con el tiempo de retencin cromatogrfico si las necesidades
de identificacin de una monografa en particular indican una mayor especificidad.
Adems, el procedimiento debe incluir los criterios establecidos para considerar que existe una correpondencia entre el espectro de masas del compuesto y del estndar autntico. Si el procedimiento representa la nica prueba de identificacin espectroscpica o si ninguna otra prueba de identificacin (p.ej., mapeo de pptidos o anlisis de aminocidos) provee informacin estructural, el espectro del estndar debe tener una alta similitud con el de la muestra y se debe usar para la comparacin
un mnimo de tres iones estructuralmente relevantes, de preferencia uno de los cuales sea un in que represente la masa molecular del analito. Cuando slo se produzca el in que representa la molcula intacta, se puede usar la masa exacta o el espectro MS/MS del in molecular para fortalecer la identificacin. En caso de que tambin se lleven a cabo otras pruebas de identificacin pertinentes desde el punto de vista estructural, la comparacin se puede realizar con menos iones, siempre y cuando
uno de ellos represente la masa molecular del analito. Por ejemplo, la prueba de identificacin por MS para una protena puede examinar slo un in que represente la masa molecular si se realizan otras pruebas para confirmar la estructura de la protena.
ANLISIS CUANTITATIVO
La sensibilidad y especificidad de la MS tambin la vuelve una herramienta analtica adecuada para la cuantificacin de analitos. La cuantificacin es particularmente potente cuando se usa junto con una tcnica de separacin tal como GC o HPLC. Se
puede obtener mayor especificidad en el anlisis usando MS/MS o HRMS.
Parmetros Experimentales
Los siguientes parmetros experimentales deben definirse dentro de un procedimiento cuantitativo de MS (p.ej., identificacin).
USP 38
RESOLUCIN DE MASAS
La resolucin de masa unitaria es suficiente para la mayora de las pruebas cuantitativas. Cuando se requiere una resolucin
mayor, sta se especifica en el procedimiento y se incluye una demostracin de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento.
EXACTITUD DE MASAS
Las exactitudes de masas citadas en la seccin de anlisis cualitativo anterior deberan ser suficientes para la mayora de las
aplicaciones cuantitativas. Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, sta se especifica en el procedimiento. Se incluye una demostracin de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte del
protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento.
SELECCIN DE MASAS
Las masas que se van a monitorear (p.ej., intervalo de masas, masas individuales o transiciones MS/MS) se detallan en el
procedimiento.
Aptitud del Sistema
RESOLUCIN DE MASAS
Se incluye una demostracin de la resolucin apropiada para el procedimiento en las pruebas de aptitud del sistema o como
parte del protocolo establecido para la calificacin del desempeo del instrumento. Cuando se requieran resoluciones mayores
que la masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostracin de la resolucin adecuada junto con sus criterios de aceptacin.
EXACTITUD DE MASAS
Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostracin de la exactitud de masas, o alternativamente sta forma parte del protocolo de calificacin del desempeo del instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50
unidades de masa para iones con una sola carga de un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones. Si se requiere una exactitud de masas mayor para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios de aceptacin apropiados.
PRECISIN
La aptitud del sistema incluye una demostracin de precisin adecuada. Ver la Tabla 1 para lmites mximos de precisin.
Por lo regular, los lmites de aptitud del sistema se ajustan a lmites ms estrictos que los empleados para asegurar la precisin
adecuada para los experimentos de validacin. (Ver tambin la seccin sobre Validacin y Verificacin de Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas.)
LINEALIDAD
La aptitud del sistema incluye una demostracin de la linealidad adecuada. Ver la Tabla 1 para lmites de linealidad apropiados. (Ver tambin la seccin sobre Validacin y Verificacin de Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas.)
EXACTITUD
En ciertos casos, las muestras de control de calidad (o de verificacin) tambin pueden ser apropiadas para incluirse en el
procedimiento para asegurar la calidad de la medicin. Normalmente, estas muestras de control de calidad tienen una concentracin de analito conocida y se preparan de manera idntica a las muestras de prueba. En caso de utilizarse, las muestras
de control de calidad (o de verificacin) se preparan tambin como forma de verificacin de la exactitud del mtodo en el
momento de su realizacin. El procedimiento especifica el nmero u orden del anlisis de las muestras de control de calidad (o
de verificacin) requeridas. Los criterios de aceptacin de los resultados de las muestras de control de calidad (o de verifica-
Captulos
La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir una demostracin del desempeo adecuado para los siguientes atributos experimentales, segn sea lo apropiado para el procedimiento.
USP 38
cin) deben alinearse con los requisitos de la validacin segn el tipo de aplicacin (es decir, Categora I o II) como se describe
en la Tabla 1.
En ciertas aplicaciones (p.ej., pruebas de lmites), puede ser necesario incluir una demostracin de la capacidad para detectar el analito a un nivel establecido. Para estas aplicaciones, el procedimiento especifica el lmite y los criterios de aceptacin
(p.ej., relacin seal-ruido).
CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE ESPECTROMETRA DE MASAS

La calificacin de un instrumento de MS se puede dividir en tres elementos: calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas
en ingls), calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para
informacin adicional, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos 1058, que puede ser un recurso til, aunque no
obligatorio.
Captulos
La calificacin de la instalacin provee evidencia de que los aparatos y el software se instalan de manera tal que se garantice
el uso seguro y efectivo del instrumento en la ubicacin deseada.
En la calificacin operativa, se caracteriza el desempeo de un instrumento usando estndares para verificar que el sistema
opera dentro de las especificaciones deseadas. El propsito de la calificacin operativa es demostrar que el desempeo del instrumento es adecuado para una aplicacin dada. Dado que existe una gran variedad de estrategias para la medicin de los
espectros de MS, se recomienda la calificacin operativa mediante estndares con propiedades espectrales conocidas. Debido
a la diversidad del instrumental de MS, de las interfases y de los enfoques experimentales, los instrumentos de MS deben calificarse en funcin de las especificaciones deseadas para la aplicacin de inters, no slo respecto a las especificaciones provistas
por el fabricante.

La calificacin del desempeo ayuda a determinar la capacidad del instrumento para cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones crticas. La documentacin sobre calificacin del desempeo debe describir lo siguiente:
la definicin de los criterios de desempeo especficos y los procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de
prueba y parmetros instrumentales;
los elementos que se medirn para evaluar los criterios y las especificaciones predefinidas;
el intervalo de prueba, que pueden ser mediciones diarias o en el momento de su utilizacin;
el uso de muestras para enmarcar la muestra problema o grupos de muestras; y
acciones correctivas a implementar si el espectrmetro no cumple con las especificaciones.
La calificacin peridica del desempeo debe incluir un subconjunto de las pruebas de calificacin operativa para asegurar
que el desempeo del instrumento est a un nivel en el que produzca datos que sean adecuados para el uso pretendido. Dependiendo del uso tpico del instrumento, las especificaciones para la calificacin del desempeo pueden ser superiores o inferiores a las especificaciones de instalacin provistas por el fabricante. Se pueden usar pruebas de calificacin del desempeo
especficas para el mtodo, tambin conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificacin
del desempeo para procedimientos validados.
Debido a la diversidad de las configuraciones instrumentales y a las estrategias experimentales de la MS, podra no estar disponible una muestra o experimento estndar para todas las evaluaciones de calificacin del desempeo. Por ende, a menudo
se necesitan pruebas de calificacin del desempeo especficas para el mtodo o pruebas de aptitud del sistema. El diseo experimental de la calificacin del desempeo debe ser lo suficientemente robusto para asegurar el desempeo adecuado del
instrumento para la aplicacin pretendida, incluyendo las especificaciones asociadas con la medicin. Como mnimo, los experimentos de calificacin del desempeo deben incluir lo siguiente.
Para aplicaciones cualitativas, el experimento de calificacin del desempeo incluye una verificacin de la exactitud de
masas obtenida con el instrumento. Una exactitud o concordancia de 0,50 unidades de masa para iones con una sola
carga respecto a un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones.
Para aplicaciones cuantitativas, el experimento de calificacin del desempeo incluye verificaciones de exactitud de masas
y precisin. Una exactitud o concordancia de 0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estndar conocido debera ser suficiente para la mayora de las aplicaciones. Los criterios de aceptacin para la precisin se
USP 38
establecen considerando la capacidad del instrumento y del mtodo, y proveen controles suficientes con respecto a las
especificaciones de la medicin en cuestin.
Caracterizacin del Desempeo del Instrumento

Los procedimientos especficos, los criterios de aceptacin y los intervalos de tiempo para la caracterizacin del desempeo
del espectrmetro de masas dependen del instrumento y de las aplicaciones pretendidas. Muchas aplicaciones de MS emplean
experimentos previamente validados que relacionan los espectros de masas con una propiedad qumica de inters. Tpicamente se busca demostrar un desempeo estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta prctica provee cierta garanta de que se pueden tomar mediciones confiables de los espectros de muestra usando experimentos de MS previamente validados.
VALIDACIN Y VERIFICACIN DE PROCEDIMIENTOS ANALTICOS DE ESPECTROMETRA DE

MASAS
Categoras de Medicin para Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas

Las caractersticas de desempeo requeridas para la validacin de un procedimiento analtico de MS, asumiendo las especificaciones de la USP tpicas para la Categora I de 98,0%102,0% para frmacos y 95,0%105,0% para medicamentos, se listan
en la Tabla 1. Las caractersticas reales de desempeo de la validacin dependern de las especificaciones empleadas y debern
proveer evidencia suficiente de que la capacidad de medicin es suficiente para dichas especificaciones. Un protocolo de validacin del procedimiento debe especificar los experimentos de validacin y los criterios de validacin requeridos. Estos criterios se determinan de acuerdo con el propsito del procedimiento analtico.
Tabla 1. Requisitos para Mediciones Analticas
Caractersticas del
Desempeo
Analtico
Especificidad
Categora I
Categora II
Cuantitativa
Se asegura usando un estndar de referencia, cuando resulte posible, y por una ausencia demostrable de interferencia de otros componentes
Linealidad
Coeficiente de correlacin, (R), no menos de 0,995
Coeficiente de correlacin, (R), no menos de 0,99
Intervalo
Para criterios de aceptacin centrados en 100,0%:

80,0%120,0%.
Para criterios de aceptacin no centrados: 10,0%
por debajo del lmite inferior hasta
10,0% por encima del lmite superior.
Para uniformidad de contenido:
70,0%130,0%
50%120%
Exactitud
98,0%102,0% (frmaco)
95,0%105,0% (medicamento)
80,0%120,0%
Repetibilidad
No ms de 1,0% (frmaco)
No ms de 2,0% (medicamento)
No ms de 20,0%
Precisin intermedia
No ms de 1,0% (frmaco)
No ms de 3,0% (medicamento)
Lmite de cuantificacin
Robustez
No ms de 25,0%
El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar el
analito con precisin y de manera exacta a un nivel equivalente al 50% de la especificacin.
La confiabilidad de una medicin analtica debe demostrarse mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales.
Captulos
La validacin se requiere nicamente cuando un procedimiento de MS es una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artculo oficial.
El objetivo de validar un procedimiento de MS es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito, incluyendo la
determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o en un medicamento (valoraciones de Categora I), determinacin cuantitativa de impurezas (Categora II) y pruebas de identificacin (Categora IV). [NOTAPara informacin adicional sobre las diferentes definiciones de categoras, ver el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225.] Dependiendo de la categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico requiere un anlisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisin, lmite de cuantificacin y robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a
mtodos con estndar externo y al mtodo de estndar agregado.
El captulo 1225 provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
especficos de validacin para cada caracterstica. La intencin de las siguientes secciones es proveer al usuario criterios especficos de validacin que representen las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso pretendido.
USP 38
Validacin del Procedimiento Analtico

El objetivo de la validacin del procedimiento analtico es demostrar que ste es adecuado para su propsito mediante la
realizacin de experimentos y obteniendo resultados que cumplan con los criterios de aceptacin predefinidos. Los procedimientos analticos de MS pueden incluir pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de lmite para la presencia de impurezas, cuantificacin de un componente en un producto o formulacin o pruebas de
identificacin.
PARMETROS DE VALIDACIN
Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un procedimiento analtico son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analtico. Para informacin adicional sobre los principios generales aplicables, ver el captulo
1225. Los criterios de aceptacin especficos para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido
del procedimiento analtico.
La Tabla 1 provee las caractersticas de desempeo que se requieren como parte de una validacin para cada categora de
procedimientos analticos.
Captulos
ESPECIFICIDAD
El propsito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las seales pretendidas del analito estn
libres de interferencia de componentes e impurezas en el material de prueba. Se pueden realizar pruebas de especificidad para
comparar los espectros de los componentes y de las impurezas que se conocen a partir de procesos sintticos, formulaciones y
preparaciones de prueba. La especificidad tambin debe demostrarse para cualquier material agregado como parte del procedimiento (p.ej., especificidad frente a estndares internos marcados con istopos).
Para procedimientos analticos de identificacin por MS (Categoras I y II), los experimentos de validacin pueden incluir
experimentos de MS multidimensionales a fin de validar las asignaciones correctas de la estructura u origen de los iones.
LINEALIDAD
La concentracin de analito y la respuesta del instrumento presentan una relacin lineal. sta se demuestra midiendo las
respuestas del analito a partir de no menos de cinco soluciones estndar a concentraciones que abarquen el intervalo de concentracin anticipado de los analitos en la solucin de prueba. Para la Categora I, las soluciones estndar pueden prepararse a
partir de materiales de referencia en disolventes apropiados. Para la Categora II (procedimientos analticos de MS que se usan
para cuantificar impurezas), las muestras para demostrar linealidad se preparan fortificando muestras de prueba (que contengan bajas concentraciones de analito) con cantidades conocidas de analito, o fortificando muestras de la matriz a concentraciones en el rango esperado. Posteriormente, se construye la curva de calibracin usando procedimientos analticos estadsticos
apropiados tales como regresin de cuadrados mnimos. Luego, se determinan el coeficiente de correlacin (R), la ordenada al
origen y, la pendiente de la lnea de regresin y el valor cuadrtico medio de los residuos. Los valores absolutos determinados
para estos factores son apropiados para el procedimiento que se est validando.
INTERVALO
El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito est dado por el procedimiento analtico de MS cuantitativo. ste
por lo regular se basa en las especificaciones del artculo de prueba de la monografa de la USP. Se trata del intervalo dentro
del cual el procedimiento analtico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisin, y se puede obtener a partir de una evaluacin de dicho procedimiento analtico.
Los intervalos recomendados para los diversos procedimientos analticos de MS son los siguientes.
Para la Categora Ivaloracin de un frmaco (o producto terminado): 80%120% de la concentracin de prueba;
Para la Categora Iuniformidad de contenido: un mnimo de 70%130% de la concentracin de prueba;
Para la Categora IIdeterminacin de una impureza: 50%120% de los criterios de aceptacin;
EXACTITUD
La exactitud de un procedimiento analtico de MS cuantitativo se determina para todo el intervalo analtico requerido. Por lo
regular, los niveles de concentraciones se evalan usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Preparacin de muestras para exactitud: Para valoraciones de frmacos (Categora I), la exactitud se determina analizando
un estndar de referencia de pureza conocida. Para valoraciones de medicamentos (Categora I), se debe usar una muestra
compuesta de un estndar de referencia u otros componentes en un producto farmacutico terminado para la validacin del
procedimiento analtico. Los resultados de la valoracin se comparan con el valor terico del estndar de referencia para estimar errores o recuperacin porcentual. Para la cuantificacin de impurezas (Categora II), la exactitud del procedimiento anal-
USP 38
Pruebas Fsicas / 741 Intervalo o Temperatura de Fusin 561
tico se puede determinar realizando estudios con frmacos o productos fortificados con cantidades conocidas del analito en
estudio.
Los resultados de la valoracin obtenidos del procedimiento analtico que se est validando pueden compararse con los de
un procedimiento analtico alternativo establecido.
PRECISIN
Repetibilidad: El procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de soluciones estndar en tres concentraciones distintas que abarcan el intervalo analtico. Como alternativa, se pueden medir las
concentraciones de seis soluciones estndar distintas al 100% de la concentracin de prueba. Posteriormente, se evala la desviacin estndar relativa a partir de las mediciones de las determinaciones repetidas para determinar si las soluciones cumplen
con los criterios de aceptacin.
Precisin intermedia: Se debe establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento analtico. Las variables tpicas incluyen realizar el anlisis en das distintos, usando diferentes instrumentos que sean adecuados conforme a lo especificado en el procedimiento analtico, o siendo dos o ms los analistas que lleven a cabo el procedimiento
analtico.
ROBUSTEZ
La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales
crticos. Estos pueden incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento, cromatogrficas y de
ionizacin especficas.
Verificacin del Procedimiento Analtico

La Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes de los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los
procedimientos analticos descritos en los compendios USPNF no necesitan validar los procedimientos que se provean en una
monografa. En su lugar, simplemente deben verificar la aptitud de los procedimientos en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin de un procedimiento de MS es demostrar que el procedimiento tal como se especifica en una
monografa especfica puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisin adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el captulo de informacin general Validacin de
Procedimientos Farmacopeicos 1226, si la verificacin del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografa no es exitosa,
el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificacin de un procedimiento farmacopeico de MS incluye como mnimo la ejecucin de los parmetros de validacin
para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme lo indicado en la seccin Validacin y Verificacin de Procedimientos Analticos de Espectrometra de Masas del presente captulo.
741 INTERVALO O TEMPERATURA DE FUSIN

Para fines Farmacopeicos, el intervalo de fusin, la temperatura de fusin o el punto de fusin se definen como los puntos
de temperatura entre los cuales o el punto en el que se detecta la primera fase lquida detectable hasta la temperatura en la
cual no hay fase slida aparente, excepto para las Clases II y III, segn se aclara ms adelante. Una transicin de fusin puede
ser instantnea para un material altamente puro, pero por lo general se observa un intervalo desde el comienzo hasta el final
del proceso. Los factores que influyen en esta transicin incluyen el tamao de la muestra, el tamao de las partculas, la eficacia de la difusin del calor y la velocidad de calentamiento, entre otras variables, que se controlan a travs de instrucciones del
procedimiento. Se deben aplicar las siguientes condiciones para lograr uniformidad y repetibilidad durante las determinaciones
del punto de fusin. Usar material secado, que ha sido reducido a polvo cuidadosamente e introducido en un tubo capilar
hasta una altura nominal de 3 mm, y realizar la determinacin del punto de fusin a una velocidad de calentamiento de 1/
Captulos
El lmite de cuantificacin se valida midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades agregadas conocidas de analito al 50% de la especificacin.
A partir de estas determinaciones repetidas, se pueden determinar la exactitud y la precisin. Los ejemplos de especificaciones para determinaciones cuantitativas de Categora II consisten en que la concentracin medida est dentro del 70%130%
de la concentracin de las cantidades agregadas conocidas y la desviacin estndar relativa sea no ms de 15%.
562 741 Intervalo o Temperatura de Fusin / Pruebas Fsicas
USP 38
min. En algunos artculos, el proceso de fusin va acompaado por descomposicin simultnea, la cual se evidencia visualmente como un efecto secundario como oscurecimiento del material, carbonizacin, burbujeo u otro incidente. El impacto visual
de esta reaccin secundaria con frecuencia oscurece el final del proceso de fusin, por lo cual puede ser imposible determinarlo con exactitud. En esas circunstancias, slo el comienzo de la fusin se puede establecer con exactitud y se debe informar
como la temperatura de fusin. La exactitud del aparato usado segn se describe a continuacin debe verificarse a intervalos
adecuados mediante el uso de uno o ms de los Estndares de Referencia de Punto de Fusin USP disponibles, preferentemente aqullos que fundan a temperaturas lo ms cercanas posible a las temperaturas de fusin de los compuestos en anlisis (ver
Estndares de Referencia USP 11). Los Estndares de Referencia de Punto de Fusin USP estn destinados para verificar la exactitud del dispositivo y no son adecuados para la calibracin.
A continuacin se describen ocho procedimientos para la determinacin del intervalo o temperatura de fusin, los cuales
varan segn la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa ninguna clase en la monografa, emplear el procedimiento
para la Clase Ia para sustancias cristalinas o amorfas y el procedimiento para la Clase II para sustancias cerosas.
El procedimiento conocido como determinacin del punto de fusin de mezcla, en el cual el intervalo o temperatura de
fusin de un slido en anlisis se compara con el de una mezcla ntima de partes iguales del slido y de una muestra autntica
del mismo, p.ej., el Estndar de Referencia USP correspondiente, si estuviera disponible, puede emplearse como una prueba de
identificacin confirmatoria. La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla constituye una evidencia confiable
de identidad qumica.
Captulos
APARATOS
Se pueden usar aparatos con cmaras u otro equipo computarizado que proporcionen ventajas en cuanto a exactitud, sensibilidad o precisin siempre que hayan sido debidamente calificados.
Aparato I: Un ejemplo de Aparato I adecuado para la determinacin del intervalo de fusin consiste en un recipiente de
vidrio para un bao de lquido transparente, un dispositivo mezclador apropiado, un termmetro exacto y una fuente controlada de calor. El lquido del bao se selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por lo general, se utiliza parafina
lquida liviana y ciertas siliconas lquidas que se adaptan bien a intervalos ms altos de temperatura. El lquido del bao tiene la
suficiente profundidad para permitir la inmersin del termmetro a la profundidad especificada de manera que el bulbo quede
aproximadamente a 2 cm del fondo del bao. El calor puede ser suministrado por una llama abierta o elctricamente. El tubo
capilar tiene aproximadamente 10 cm de largo y 0,81,2 mm de dimetro interno, con paredes de 0,20,3 mm de espesor.
Aparato II: Se puede emplear un instrumento en los procedimientos para las Clases I, Ia y Ib. Un ejemplo de Aparato II
adecuado para la determinacin del intervalo de fusin consiste en un bloque de metal que puede calentarse a velocidad controlada, con su temperatura monitoreada mediante un sensor. El bloque permite alojar el tubo capilar que contiene la sustancia de prueba y controlar el proceso de fusin, normalmente por medio de un haz de luz y un detector. Se puede procesar la
seal del detector a travs de una microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de fusin, o bien la seal
del detector se puede graficar para permitir el clculo visual del punto o intervalo de fusin.
PROCEDIMIENTOS
Procedimiento para la Clase I, Aparato I: Reducir la sustancia en anlisis a un polvo muy fino y, a menos que se indique
algo diferente, deshidratar la sustancia secndola a la temperatura especificada en la monografa correspondiente cuando contiene agua de hidratacin. Si la sustancia no contiene agua de hidratacin, secarla sobre un desecante apropiado durante no
menos de 16 horas (o en las condiciones indicadas en Prdida por Secado 731, si fuera apropiado).
Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo
del tubo que tenga 3 mm de altura al compactarla tanto como sea posible golpeteando suavemente sobre una superficie slida. El fabricante del instrumento puede especificar variaciones en el tamao de las muestras en funcin del diseo del mismo.
Calentar el bao hasta que la temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del punto de fusin esperado. Retirar el
termmetro y acoplar rpidamente el tubo capilar al termmetro mojando ambos con una gota del lquido del bao o de
alguna otra manera y ajustar su altura para que el material en el capilar quede al nivel del bulbo del termmetro. Colocar el
termmetro nuevamente en el bao y continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera que la temperatura
ascienda a una velocidad de aproximadamente 3/min. Cuando la temperatura est aproximadamente a 3 por debajo del
lmite inferior del intervalo de fusin esperado, reducir el calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad de
aproximadamente 1/min. Continuar el calentamiento hasta que se complete la fusin.
La temperatura a la cual la columna de la sustancia en anlisis se colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier
punto indica el comienzo de la fusin y la temperatura a la cual la sustancia de prueba se torna completamente lquida corresponde al final de la fusin o punto de fusin. Las dos temperaturas caen dentro de los lmites del intervalo de fusin. Si la
fusin ocurre con descomposicin, la temperatura de fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo
especificado.
Procedimiento para la Clase Ia, Aparato I: Preparar la sustancia de prueba y cargar el capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Calentar el bao hasta que la temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del punto
de fusin esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1/min. Insertar el capilar segn se indica en Procedimiento para Clase I, Aparato I cuando la temperatura est aproximadamente a 5 por debajo del lmite inferior del intervalo de fu-
USP 38
Pruebas Fsicas / 741 Intervalo o Temperatura de Fusin 563
Captulos
sin esperado y continuar el calentamiento hasta completar la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I.
Procedimiento para la Clase Ib, Aparato I: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una
temperatura de 10 o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo
capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en
un desecador al vaco y secar a una presin que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente despus
de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo y, tan pronto como sea practicable, proceder con la determinacin del intervalo de fusin segn se indica a continuacin. Calentar el bao hasta que la temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del intervalo de fusin esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de
ascenso de aproximadamente 1/min hasta completar la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I.
Si el tamao de partcula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
segn se indic anteriormente. Luego, aplicando la menor presin posible, triturar cuidadosamente las partculas hasta un tamao adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.
Procedimiento para la Clase I, Aparato II: Preparar la sustancia en anlisis y cargar el tubo capilar segn se indica en
Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la
temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del punto de fusin esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de
calentamiento y continuar el calentamiento a una velocidad de ascenso de temperatura de aproximadamente 1/min hasta
completar la fusin.
La temperatura a la cual la seal del detector se desva por primera vez de su valor inicial indica el comienzo de la fusin y la
temperatura a la cual la seal del detector alcanza su valor definitivo corresponde al final de la fusin o punto de fusin. Las
dos temperaturas caen dentro de los lmites del intervalo de fusin. Si la fusin ocurre con descomposicin, la temperatura de
fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo especificado.
Procedimiento para la Clase Ia, Aparato II: Preparar la sustancia de prueba y cargar el tubo capilar segn se indica en
Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la
temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del punto de fusin esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1/min. Insertar el tubo capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I cuando la temperatura est
aproximadamente a 5 por debajo del lmite inferior del intervalo de fusin esperado y continuar calentando hasta completar
la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Si la fusin ocurre con descomposicin, la temperatura de fusin correspondiente al comienzo de la fusin est dentro del intervalo especificado.
Procedimiento para la Clase Ib, Aparato II: Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una
temperatura de 10, o menor, durante al menos 2 horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el
tubo capilar segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado
en un desecador al vaco y secar a una presin que no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente despus de retirar del desecador, sellar a la llama el extremo abierto del tubo, y tan pronto como sea practicable, proceder con la
determinacin del intervalo de fusin segn se indica a continuacin. Operar el aparato segn las indicaciones del fabricante.
Calentar el bloque hasta que la temperatura est aproximadamente a 10 por debajo del intervalo de fusin esperado. Luego,
introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de aproximadamente 1/min hasta completar la fusin. Registrar el intervalo de fusin segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I.
Si el tamao de partcula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
segn se indic anteriormente. Luego, aplicando la menor presin posible, triturar cuidadosamente las partculas hasta un tamao adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.
Procedimiento para la Clase II: Fundir cuidadosamente el material que se desea probar a la menor temperatura posible y
colocarlo en un tubo capilar con ambos extremos abiertos, a una profundidad de aproximadamente 10 mm. Enfriar el tubo
cargado a 10 o menos durante 24 horas, o mantenerlo en contacto con hielo durante no menos de 2 horas. Luego unir el
tubo capilar al termmetro por medios adecuados, ajustarlo en un bao de agua de manera que el borde superior del material
quede 10 mm por debajo del nivel del agua y calentar segn se indica en Procedimiento para la Clase I, Aparato I excepto que
se debe regular la velocidad de ascenso de temperatura a razn de aproximadamente 1,0/min, dentro de los 5 de la temperatura de fusin esperada. La temperatura a la cual el material comienza a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusin.
Procedimiento para la Clase III: Fundir lentamente una cantidad de la sustancia de prueba, mientras se mezcla, hasta
que alcance una temperatura de 9092. Retirar la fuente del calor y dejar que la sustancia fundida se enfre a una temperatura de 810 por encima del punto de fusin esperado. Enfriar el bulbo de un termmetro adecuado a 5, secarlo y mientras
todava est fro colocarlo en la sustancia fundida hasta que quede sumergida aproximadamente la mitad inferior del bulbo.
Retirarlo de inmediato y mantenerlo en posicin vertical lejos del calor hasta que se opaque la superficie de la cera. Luego,
sumergirlo durante 5 minutos en un bao de agua con una temperatura que no exceda de 16.
Fijar el termmetro firmemente a un tubo de ensayo de manera que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo
del tubo de ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un bao de agua ajustado a aproximadamente 16 y aumentar la temperatura del bao a una velocidad de aproximadamente 2/min hasta 30. Luego, cambiar a una velocidad de aproximadamente
1/min y observar la temperatura a la cual se desprende del termmetro la primera gota de sustancia fundida. Repetir la determinacin dos veces con una porcin recin fundida de la sustancia de prueba. Si la variacin de las tres determinaciones es de
564 741 Intervalo o Temperatura de Fusin / Pruebas Fsicas
USP 38
menos de 1, tomar el promedio de las tres como punto de fusin. Si la variacin de las tres determinaciones es 1 o mayor de
1, hacer dos determinaciones adicionales y tomar el promedio de las cinco.
Captulos
751 PARTCULAS METLICAS EN UNGENTOS OFTLMICOS

La siguiente prueba est diseada para limitar a un nivel que se considera no objetable el nmero y tamao de partculas
metlicas que puede haber presentes en ungentos oftlmicos.
ProcedimientoExtrudir tanto como sea posible, en forma individual, el contenido de 10 tubos en sendas placas de Petri
de 60 mm transparentes, de fondo plano y exentas de marcas de cualquier tipo. Cubrir las placas y calentar a 85 durante 2
horas, aumentando la temperatura levemente, si fuera necesario, para asegurar la obtencin del estado lquido. Tomando precauciones para no perturbar la muestra fundida, dejar enfriar cada una de las placas a temperatura ambiente hasta lograr la
solidificacin.
Retirar las tapas e invertir cada placa de Petri en la platina de un microscopio apropiado ajustado para proporcionar un aumento de 30x y equipado con un ocular con micrmetro de disco calibrado para el aumento empleado. Adems de la fuente
de luz usual, dirigir otra fuente de iluminacin por encima del ungento a un ngulo de 45. Examinar el fondo de la placa de
Petri en su totalidad para verificar la presencia de partculas metlicas. La variacin de la intensidad de la fuente de iluminacin
superior permite que se reconozcan estas partculas metlicas por su reflexin caracterstica de la luz.
Contar el nmero de partculas metlicas de 50 mm o de mayor tamao en cualquier dimensin: los requisitos se cumplen si
el nmero total de tales partculas en los 10 tubos no excede de 50 y si no hay ms de 1 tubo que contenga ms de 8 partculas metlicas. Si no se obtienen estos resultados, repetir la prueba en 20 tubos adicionales: los requisitos se cumplen si el nmero total de partculas metlicas que tienen un tamao de 50 mm o mayor, en cualquier dimensin, no excede de 150 en los
30 tubos analizados y si no hay ms de 3 tubos, individualmente, que contengan ms de 8 partculas de este tipo.
755 LLENADO MNIMO

Las siguientes pruebas y especificaciones se aplican a artculos tales como cremas, geles, jaleas, lociones, ungentos, pastas,
polvos y aerosoles, incluso los aerosoles tpicos presurizados y no presurizados, en envases cuyo contenido declarado en la
etiqueta no es ms de 150 g 150 mL.
PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACUTICAS DIFERENTES A LOS AEROSOLES Para envases cuya etiqueta declara un peso, seleccionar una muestra de 10 envases llenos y quitar todas las etiquetas cuyo peso pueda variar cuando se extrae el contenido del
envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con un medio apropiado y pesar individualmente. Extraer cuantitativamente el contenido de cada envase, cortndolo de manera tal que quede abierto y lavndolo con
un disolvente apropiado, si fuera necesario, teniendo cuidado de retener el cierre y las otras partes de cada envase. Secar y
volver a pesar cada uno de los envases vacos junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre los dos pesos es el
peso neto del contenido del envase. Para envases cuya etiqueta declara un volumen, verter el contenido de 10 envases en 10
probetas graduadas apropiadas y dejar que drenen completamente. Registrar el volumen del contenido de cada uno de los 10
envases. El contenido neto promedio de los 10 envases no es menor que la cantidad declarada y el contenido neto de cualquier envase individual no es menos de 90% de la cantidad declarada en aquellos casos en que la cantidad declarada es de
60 g o 60 mL o menos, o no es menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es de ms de 60 g o 60
mL pero no ms de 150 g o 150 mL. Si no se cumple este requisito, determinar el contenido de 20 envases adicionales. El
contenido promedio de los 30 envases no es menor que la cantidad declarada y el contenido neto de no ms de 1 de los 30
envases es menos de 90% de la cantidad declarada en aquellos casos en que la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos,
o es menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es ms de 60 g o 60 mL pero no ms de 150 g o
150 mL.
PROCEDIMIENTO PARA AEROSOLES Seleccionar una muestra de 10 envases llenos y quitar cualquier etiquetado cuyo peso podra variar durante la remocin del contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con medios apropiados y pesar individualmente. Retirar el contenido de cada envase empleando una tcnica segura (por
ejemplo, enfriar para reducir la presin interna, retirar la vlvula y verter). Retirar el contenido residual con disolventes apropiados y luego enjuagar con unas pocas porciones de metanol. Retener el envase, la vlvula y todas las partes del mismo como
una unidad y calentarlas a 100 durante 5 minutos. Enfriar y volver a pesar cada uno de los envases junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre el peso original y el peso del envase vaco es el peso neto de llenado. Determinar el peso
neto de llenado para cada envase analizado. Los requisitos se cumplen si el peso neto del contenido de cada uno de los 10
envases no es menor que la cantidad declarada.
USP 38
Pruebas Fsicas / 761 Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear 565
761 ESPECTROSCOPA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR

INTRODUCCIN
La espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN) es un mtodo analtico basado en las propiedades magnticas de
ciertos ncleos atmicos. Al igual que con otros tipos de espectroscopa, la absorcin o emisin de energa electromagntica a
frecuencias caractersticas proporciona informacin sobre la estructura. La RMN difiere de otros tipos de espectroscopa en que
los niveles discretos de energa entre los que ocurren las transiciones se presentan slo cuando el ncleo se somete a un campo
magntico.
Aunque se la reconoce ampliamente como una de las ms poderosas herramientas de elucidacin de estructuras qumicas
disponibles, tambin se la puede usar para mediciones cualitativas y cuantitativas exactas, siempre que se use un diseo experimental apropiado. Consultar el captulo de informacin general 1761 Aplicaciones de la Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear. [NOTALos captulos con nmeros superiores a 1000 se proveen nicamente para fines informativos.]
CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE RMN

La calificacin de un instrumento de RMN se puede dividir en tres etapas: Calificacin de Instalacin (IQ, por sus siglas en
ingls), Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y Calificacin de Desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para
un anlisis ms detallado, ver el captulo de informacin general Calificacin de Instrumentos Analticos 1058.
Los requisitos de Calificacin de Instalacin proveen evidencia de una instalacin adecuada de hardware y software para el
instrumento de manera segura y efectiva en la ubicacin deseada.
En la Calificacin Operativa se caracteriza el desempeo del instrumento usando estndares para verificar que el sistema
opera de acuerdo con las especificaciones esperadas. El propsito de la Calificacin Operativa es demostrar que el desempeo
del instrumento es apto para una aplicacin determinada. Debido a que se encuentran disponibles una gran cantidad de modos distintos para medir espectros de RMN, se recomienda usar estndares con propiedades espectrales conocidas durante la
Calificacin Operativa. Por lo general, se encuentran disponibles estndares de referencia en tubos para RMN sellados para
determinar la relacin seal-ruido y la forma de la lnea espectral.
Calificacin de Desempeo
La Calificacin de Desempeo ayuda a determinar que el instrumento sea capaz de cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones crticas para la calidad. La documentacin de la Calificacin del Desempeo debe describir lo siguiente:
1. Criterios de desempeo especficos definidos y procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y
parmetros del instrumento.
2. Los elementos a medir para evaluar los criterios y las especificaciones definidas a priori para dichos criterios.
3. El intervalo de prueba, que puede ser al momento de usar.
4. El uso de muestras extremas (bracketing) o de un grupo de varias muestras.
5. Una lista definida de las acciones correctivas que podran implementarse si el espectrmetro no cumpliera con las especificaciones.
La Calificacin de Desempeo peridica debe incluir un subconjunto de pruebas de Calificacin Operativa para asegurar que
el instrumento se desempea produciendo datos adecuados para el uso que se le intenta dar. Dependiendo del uso tpico, las
especificaciones de la Calificacin de Desempeo pueden ser ms o menos estrictas que las especificaciones de instalacin del
fabricante. Las mediciones crticas para la calidad de los espectros incluyen una medicin de la relacin seal-ruido y pruebas
de resolucin para todos los ncleos de inters. Las pruebas de Calificacin de Desempeo especficas para un mtodo, tambin conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar como requisitos de Calificacin de Desempeo en el caso
de procedimientos validados.
Las pruebas y muestras para la Calificacin de Desempeo citadas en las secciones siguientes son slo ejemplos tpicos. Se
pueden usar otras pruebas y muestras para establecer especificaciones para propsitos especficos. Los proveedores de instrumentos a menudo suministran muestras y parmetros de prueba que se pueden usar como parte del paquete de Calificacin
de Desempeo.
Captulos
Calificacin de Instalacin
566 761 Espectroscopa de Resonancia Magntica Nuclear / Pruebas Fsicas

MEDICIN DE LA RESOLUCIN Y DE LA FORMA DE LA LNEARMN DE 1H
USP 38
(ver la Figura 1)
Captulos
Muestra: Cloroformo al 1% en acetona-d6 ( 500 MHz), cloroformo al 3% en acetona-d6, desgasificada y sellada

Ancho del espectro: < 1 KHz
Tiempo de adquisicin de datos: No menos de 10 segundos
ngulo de deflexin: 90
Tiempo de relajacin: 60 segundos
Velocidad de giro: Esttica 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin sin desacoplamiento
Procesamiento: Sin ensanchamiento de lnea, completado de ceros hasta 128 k
Figura 1. Espectro de RMN de 1H de cloroformo en acetona-d6 obtenido a 400 MHz. El ancho de la lnea medido a 0,55% y
a 0,11% de los satlites 13C fue 2,7 y 5,5 Hz, respectivamente.
Compensar el magneto con especial atencin a las compensaciones fuera de eje, obtener una sola adquisicin, someter a
correccin de fase para obtener una absorcin pura y medir el ancho de la lnea a 50%, 0,55% y 0,11% de la intensidad mxima. El ancho de la lnea debe cumplir con las especificaciones para estas alturas y, adems, la forma de la lnea debe ser lorentziana. Con frecuencia, en los espectrmetros de RMN modernos, la forma de la lnea se obtiene en muestras sin girar, puesto
que es posible compensar muy bien fuera de eje, tanto que no existe ninguna diferencia fundamental entre los espectros obtenidos girando la muestra y con la muestra sin girar. Adems, los espectros bidimensionales se deben obtener sobre muestras
estticas.
MEDICIONES DE RELACIN SEAL-RUIDORMN DE 1H
(ver la Figura 2)
Muestra: Etilbenceno al 0,1% en cloroformo-d, etilbenceno al 1% en cloroformo-d (< 200 MHz) desgasificado y sellado
Ancho del espectro: 10 ppm
Tiempo de adquisicin de datos: 400 milisegundos
Tiempo de espera para relajacin: 60 segundos
Velocidad de giro: 0 aproximadamente 20 Hz
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de la lnea de 1 Hz
Referencia: Tetrametilsilano (TMS) = 0,0 ppm o el centro del cuarteto = 2,65 ppm
USP 38
Se debe elegir la concentracin de etilbenceno para lograr mediciones de relacin seal-ruido especificadas en el intervalo
de 201000. Las concentraciones que generalmente resultan en mediciones fuera de dicho intervalo tienen una utilidad limitada para la evaluacin del desempeo del instrumento. Sin embargo, convencionalmente se utilizan soluciones estndar establecidas. Se debe compensar el magneto lo mejor posible. Idealmente, esta prueba debe realizarse inmediatamente despus
de la prueba de la forma de la lnea puesto que la mayora de las compensaciones estarn casi maximizadas. Obtener una sola
adquisicin, someter el espectro a correccin de fase en el modo de absorcin pura y medir la relacin seal-ruido del cuarteto
de etilbenceno. Este experimento se puede realizar girando la muestra o con la muestra esttica. Si las compensaciones fuera
de eje estn bien ajustadas, el valor de la relacin seal-ruido medido sobre muestras giradas slo debe ser aproximadamente
10% mayor que el obtenido con muestras estticas. Una relacin mayor indica que se puede lograr una compensacin fuera
de eje adicional.
Los espectrmetros modernos tienen un software que lleva a cabo la medicin de la relacin seal-ruido una vez que el operador ha identificado las regiones de la seal y del ruido. Los clculos tambin pueden realizarse manualmente. Medir la amplitud (A) desde el centro de la lnea base hasta el pico de la ms alta de las dos lneas centrales en el cuarteto. Medir la altura del
ruido entre picos (H) desde el pico de ruido inferior hasta el pico de ruido superior en la regin de 35 ppm. El ruido puede
multiplicarse verticalmente por un factor para obtener una medicin exacta de los espectros con relacin seal-ruido alta. Calcular la relacin seal-ruido segn se indica a continuacin:
S/N = k 2,5 A/H
[1]
donde k es el factor de expansin vertical de la regin de ruido usada. El factor de 2,5 convierte la relacin seal-ruido entre
picos en la media cuadrtica (rms, por sus siglas en ingls) del ruido, que es la convencin estndar para informar la sealruido en la espectroscopa de RMN. Se pueden usar clculos de seal-ruido computarizados siempre que las especificaciones se
establezcan y analicen usando el mismo procedimiento. El uso de un valor de relacin seal-ruido menor que el especificado
por el fabricante es permisible, a discrecin del espectroscopista, siempre y cuando se determine que dicho valor es suficiente
para la aplicacin en uso.
MEDICIONES DE RELACIN SEAL-RUIDO DE RMN DE
13
(ver la Figura 3)
Muestra: p-Dioxano al 40% en benceno-d6 (v/v) (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: Aproximadamente 200 ppm
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de lnea de 3,5 Hz, completado de ceros hasta 32k
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del benceno = 128,4 ppm
Captulos
Figura 2. Espectro de RMN de 1H de etilbenceno al 0,1% obtenido a 400 MHz con una relacin seal-ruido de 550:1
Captulos
USP 38
Figura 3. Espectro de RMN de 13C del estndar ASTM de p-dioxano al 40% en benceno-d6 (v/v) obtenido a 100,6 MHz, con
una relacin seal-ruido de 140:1
Usando un magneto bien compensado, obtener una sola adquisicin despus de un tiempo de espera mnimo de 300 segundos, colocar el espectro en fase de absorcin pura y medir la altura del triplete del benceno a aproximadamente 128,4
ppm desde el centro de la lnea base. El ruido entre picos se puede medir segn se indic anteriormente con una expansin
vertical apropiada a 80120 ppm. Los clculos de la relacin seal-ruido se pueden realizar tal como indica la Ecuacin 1 o
mediante clculo computarizado.
El triplete del benceno-d6 no se intensifica por efecto nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en ingls). Por consiguiente, esta prueba verifica slo el desempeo del canal 13C.
DESEMPEO DE LOS CANALES
C Y 1H
13
(ver la Figura 4)
Muestra: Etilbenceno hasta al 10% en cloroformo-d (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: 200 ppm
Duracin de la adquisicin de datos: 64k puntos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisicin con desacoplamiento de pulso compuesto ajustado al centro del espectro
de 1H
Procesamiento: Exponencial con ensanchamiento de lnea de 0,3 Hz
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del cloroformo-d = 77,23 ppm
USP 38
La compensacin debe ser suficiente para cumplir con las pruebas de resolucin y de forma de la lnea descritas anteriormente. La medicin de la relacin seal-ruido se realiza a partir de la altura del pico de la mayor de las dos resonancias cercanas a 128 ppm. El ruido se mide segn se indic anteriormente en la regin de 80120 ppm, con una expansin vertical apropiada. La relacin seal-ruido es calculada por la computadora o conforme a la Ecuacin 1.
MEDICIONES DE RELAXOMETRARMN DE CAMPO BAJO
La Calificacin de Desempeo debe realizarse antes de la recoleccin de datos experimentales.

Disolver una cantidad pesada con exactitud de cloruro de manganeso (II) tetrahidrato (peso molecular 197,91) en agua y
diluir cuantitativamente con agua para obtener soluciones de comprobacin con concentraciones conocidas de 0,9; 2,7 y 4,5
mM.
Colocar una porcin de cada una de las soluciones en portamuestras adecuados para el modelo de espectrmetro de RMN
de campo bajo en uso. Entibiar a 40 durante no menos de 10 minutos y medir el tiempo de relajacin espn-entorno (T1) del
agua. El promedio T1 para mediciones repetidas debe estar dentro del 5% de 156; 52 y 32 ms para las soluciones de 0,9; 2,7 y
4,5 mM, respectivamente.
Caracterizacin del Desempeo del Instrumento

Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo del espectrmetro de RMN dependen del instrumento y del uso que se pretende dar. Muchas aplicaciones de RMN emplean experimentos
previamente validados que relacionan los espectros de RMN con una propiedad fsica o qumica de inters. Se debe demostrar
el desempeo estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta prctica ofrece cierta garanta sobre la confiabilidad
de las mediciones de muestra tomadas a partir de espectros usando experimentos de RMN previamente validados.
ANLISIS DE RMN CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

La espectroscopa de RMN se ha utilizado en un amplio rango de aplicaciones tales como elucidacin de estructuras, estudios termodinmicos, cinticos y mecansticos, y anlisis cuantitativo. Algunas de estas aplicaciones estn ms all del alcance
de los mtodos farmacopeicos.
Todas las caractersticas de las sealesdesplazamiento qumico, multiplicidad, ancho de lnea, constantes de acoplamiento,
intensidad relativa y tiempo de relajacin proveen informacin analtica.
Captulos
Figura 4. Espectro de RMN de 13C de etilbenceno al 10% obtenido con una sonda dual 1H/13C enfriada criognicamente a
150,9 MHz, con una relacin seal-ruido de 640:1
USP 38
Captulos
Aplicaciones Cualitativas
La comparacin de un espectro existente en la bibliografa o de un estndar autntico con el de una muestra de prueba
puede usarse para confirmar la identidad de un compuesto y detectar la presencia de impurezas que generan seales extraas.
Los espectros de RMN con estructuras simples pueden describirse adecuadamente mediante el uso de los valores numricos
para los desplazamientos qumicos y las constantes de acoplamiento, y mediante el nmero relativo de ncleos representados
por la integral de cada seal. (Los instrumentos modernos cuentan con software que genera espectros simulados con estos
datos). Tambin deben proporcionarse detalles experimentales, como por ejemplo el disolvente usado y la referencia para el
desplazamiento qumico.
Para muestras desconocidas, el anlisis de RMN, usualmente combinado con otras tcnicas analticas, es una herramienta
poderosa para la elucidacin de estructuras. Los desplazamientos qumicos proporcionan informacin del entorno qumico de
los ncleos. Existe una amplia bibliografa de referencia con tablas y reglas de correlacin para predecir los desplazamientos
qumicos. La multiplicidad de las seales proporciona informacin estructural importante. La magnitud de la constante de acoplamiento escalar, J, entre protones residuales en estructuras aromticas, olefnicas o cicloalqulicas sustituidas se usa para identificar la posicin relativa de los sustituyentes. Los espectros de rutina de 13C se obtienen en condiciones de desacoplamiento
protnico, lo que anula todos los acoplamientos heteronucleares 13C-1H. Como resultado de este desacoplamiento, las seales
de carbono aparecen como singuletes, a menos que estn presentes otros ncleos no desacoplados (p.ej.,19F,31P).
El intercambio qumico es un ejemplo del efecto de la velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los
espectros de RMN. Si un protn puede experimentar diferentes ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotacin en
torno a un enlace, equilibrios de intercambio, inversin de anillo, etc.), la apariencia del espectro ser una funcin de la velocidad del proceso. Los procesos lentos (en una escala de tiempo de RMN) proporcionan ms de una seal de las especies que se
interconvierten, los procesos rpidos promedian estas seales en una lnea, y los procesos intermedios producen seales anchas, que en ocasiones son difciles de encontrar en los espectros.
Los programas de los espectrmetros modernos de RMN por Transformada de Fourier toman en cuenta secuencias de pulsos mucho ms complejas que la acumulacin repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales experimentos incluyen
anlisis multidimensionales homonucleares o heteronucleares que determinan la correlacin de acoplamientos y pueden simplificar la interpretacin de espectros complejos.
Ver el captulo 1761 para descripciones detalladas de los experimentos bidimensionales ms comunes.
Aplicaciones Cuantitativas
I. Consideraciones generales de la RMN cuantitativa: ver el captulo 1761.
II. El alcance de esta seccin se limita a la cuantificacin mediante RMN unidimensional. Aunque se puede usar cualquier
ncleo activo de RMN para obtener datos cuantitativos, la informacin de este captulo se limita al 1H. Existen dos tipos
de cuantificacin mediante RMN: relativa y absoluta.
(A) La cuantificacin relativa implica medir cantidades relativas de las especies en una muestra basndose en la integracin de picos debidos a cada una de las especies medidas. Las integrales se normalizan mediante el factor N, es decir,
la integral se divide por el nmero de ncleos equivalentes representados por dicho pico para proporcionar la concentracin molar relativa de cada componente.
(B) La cuantificacin absoluta es la medicin directa de la cantidad real de analito independiente de otros componentes contenidos en dicha muestra. Existen dos mtodos bsicos de cuantificacin absoluta basados en el tipo de estndar de referencia usados para calibrar la seal de RMN.
(1) Estndar de referencia interno:
(a) Definicin: El estndar de referencia se disuelve conjuntamente con el analito en la solucin de prueba.
(b) Procedimiento
Preparacin de la solucin tpica para RMN: Una solucin para RMN se prepara con pesos exactos
del analito y del estndar de referencia. La fuente de error ms grande en este mtodo de RMN cuantitativo se deriva del pesaje, por lo que se recomienda usar pesos ms grandes para minimizar errores.
Este mtodo cuantitativo se basa en una comparacin del estndar de referencia y los picos de RMN
del analito y sus respectivas concentraciones. Debido a que el analito y el estndar de referencia se encuentran en la misma solucin, el volumen donde el analito y el estndar de referencia estn contenidos es el mismo, por lo que nicamente se comparan sus masas. Por lo tanto, no es necesario un volumen exacto. Por lo general, las soluciones se preparan por triplicado como mnimo.
Adquisicin de datos: Los datos se adquieren en condiciones cuantitativas, ver el captulo
1761. Por ejemplo, se debe esperar al menos 5 veces el T1 ms largo cuando se usa un pulso de
90 antes de repetir el pulso.
Procesamiento de datos: Procesar los datos, usando completado de ceros si fuera necesario, de
modo que haya un nmero suficiente de puntos para definir un pico. Por ejemplo, la experiencia
ha demostrado que se necesitan al menos 16 puntos para obtener una buena representacin
cuantitativa de un pico.
USP 38

Anlisis: Integrar los picos apropiados. Por ejemplo, evitar el uso de picos superpuestos o los que
se deban a hidrgenos susceptibles de intercambio. La determinacin de la cantidad de analito se
deriva de la proporcionalidad bsica entre la intensidad del pico y la concentracin del soluto.
donde I = integral; N = factor de normalizacin; y [ ]1H = 1H concentracin molar relativa y los

subndices A y RS representan el analito y el estndar de referencia, respectivamente.
Por consiguiente, la masa del analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuacin.
donde MA = masa del analito, MM = masa molar y P = pureza del estndar de referencia.
(c) Una aplicacin comn de la cuantificacin absoluta es la determinacin de la pureza de una muestra. La
pureza porcentual en peso se calcula mediante
(2) Estndar de referencia externo

(a) Definicin: El mtodo clsico de estndar de referencia externo consiste en soluciones de un estndar de
referencia y un analito que se encuentran en tubos para RMN separados. Una variacin del mtodo del estndar de referencia externo es insertar la solucin de prueba del estndar contenida en un tubo coaxial en
la solucin de prueba del analito contenida en un tubo para RMN. Otra variacin consiste en la introduccin de una seal generada por computadora en el espectro de una solucin estndar de referencia de concentracin conocida para calibrar la respuesta de la seal (intensidad por concentracin molar 1H, en el caso de la RMN de 1H), seguida por la insercin de una seal calibrada generada por computadora en el espectro de una solucin de prueba del analito. Esta seccin tratar el uso de una referencia externa en el
sentido clsico.
(b) Procedimiento
Preparacin de la solucin para RMN: Las soluciones para RMN con concentraciones conocidas de
analito y de estndar de referencia se preparan usando pesos y volmenes exactos. Nuevamente, se
recomienda el uso de pesos ms grandes para minimizar el error de pesaje. Por lo regular, se preparan
soluciones repetidas del analito y del estndar de referencia. El analito y el estndar de referencia deben prepararse usando el mismo disolvente para minimizar las diferencias de ajuste.
Adquisicin y procesamiento de datos: Igual que en II.B.1.b, estndar de referencia interno. Aplicar
los mismos parmetros de adquisicin y procesamiento a los espectros del analito y del estndar de
referencia.
Anlisis: Integrar los picos apropiados en los espectros del analito y del estndar de referencia. La cantidad de analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuacin:
donde V = volumen.
Aplicacin a la pureza porcentual en peso: Los valores de pureza porcentual en peso se pueden calcular de manera similar a la indicada en la Ecuacin 5.
(C) Los mtodos de estndar de referencia interno y externo tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas.
(1) Interacciones qumicas: La preparacin del estndar de referencia y del material de prueba en soluciones separadas previene interacciones qumicas entre la muestra de prueba y el estndar de referencia que de otro modo
podran ocurrir con un estndar de referencia interno.
(2) Superposicin de espectros: El uso de un estndar de referencia externo tambin previene la superposicin potencial entre los picos del estndar de referencia y de la muestra de prueba que puede ocurrir con un estndar
interno.
Captulos
donde MS es la masa total de la muestra con contribuciones del analito ms cualquier contaminante que
pudiera estar presente en la muestra como por ejemplo agua y sales. Al combinar las Ecuaciones 3 y 4, la
pureza porcentual en peso se calcula mediante
USP 38
(3) Calibracin: Una vez que se ha calibrado la respuesta de RMN con soluciones de estndares de referencia externos, dicha calibracin puede aplicarse a cualquier otra muestra en el mismo disolvente siempre que i) se haya
demostrado la estabilidad del instrumento durante el tiempo entre el que se lleva a cabo la calibracin y el momento en que se adquieren los datos en el material de prueba, ii) se haya establecido la aptitud del sistema en el
da en que se realiza la medicin del material de prueba y iii) se comparen las integrales absolutas. Para los estndares de referencia internos, la medicin del estndar de referencia y de la muestra de prueba se lleva a cabo
en condiciones absolutamente idnticas.
(4) Exactitud y precisin: Se pueden preparar soluciones mltiples de estndares de referencia para promediar los
errores en las mediciones de masa y volumen durante la preparacin de la muestra, con lo que se mejora la
exactitud de la respuesta de RMN calibrada. Para los estndares de referencia internos, se realizan mediciones
individuales del estndar de referencia y del analito para cada solucin de prueba duplicada. Los errores combinados que se derivan de las mediciones de masa del estndar de referencia y de la muestra de prueba, as como
las variaciones electrnicas de los instrumentos determinan la desviacin estndar del promedio MA o de los valores de pureza porcentual en peso.
Captulos
VALIDACIN Y VERIFICACIN DE PROCEDIMIENTOS ANALTICOS DE RMN

Cuando se proporciona un procedimiento de RMN en una monografa, es necesario verificar su aptitud en las condiciones
reales de uso (ver el captulo 1226). La validacin es necesaria nicamente cuando un mtodo de RMN se presenta como
alternativa al procedimiento oficial para el anlisis de un artculo oficial. El objetivo de la validacin de un procedimiento de
RMN es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito deseado, incluyendo lo siguiente: determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o producto farmacutico (valoraciones de Categora I), determinacin cuantitativa
de impurezas (valoraciones de Categora II) y pruebas de identificacin (valoraciones de Categora IV). [NOTAPara definiciones sobre las diferentes categoras, consultar el captulo 1225 Validacin de Procedimientos Farmacopeicos.] Dependiendo de la
categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico requerir el anlisis de la especificidad, linealidad, intervalo,
exactitud, precisin, lmite de cuantificacin y robustez. Dichas caractersticas de desempeo analtico se aplican a mtodos
estandarizados externamente y los mtodos de estndares agregados.
El captulo 1225 ofrece definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios
de validacin especficos para cada caracterstica. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario de criterios de
validacin especficos que representan las expectativas mnimas para esta tecnologa. Podran requerirse criterios de aceptacin
ms rigurosos para cada aplicacin particular a fin de demostrar la aptitud para el uso deseado.
Validacin de Procedimientos Analticos

El objetivo de la validacin de un procedimiento analtico es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para el propsito al que est destinado, mediante la realizacin de experimentos y que los resultados obtenidos a partir de ellos cumplan
con criterios de aceptacin predefinidos. Los procedimientos analticos de RMN pueden incluir lo siguiente: pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de lmite para detectar la presencia de impurezas, cuantificacin de componentes en un producto o formulacin y/o pruebas de identificacin.
Las caractersticas de desempeo que demuestran la aptitud de un procedimiento analtico son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analtico. El captulo 1225 presenta una discusin sobre los principios generales aplicables. Los
criterios de aceptacin especficos para cada parmetro de validacin deben ser congruentes con el uso pretendido del procedimiento analtico.
A continuacin se proporcionan las caractersticas de desempeo requeridas como parte de una validacin para cada una de
las categoras de procedimientos analticos.
ESPECIFICIDAD
El propsito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las seales del analito a medir estn exentas
de interferencia proveniente de los componentes e impurezas en el material de prueba. La especificidad se puede aplicar a
todas las categoras y es un requisito de la Categora IV. Como prueba de especificidad se pueden comparar los espectros de
RMN del analito con los de otros componentes de las formulaciones y las preparaciones de prueba, as como los de impurezas
conocidas derivadas de los procesos sintticos. Para un procedimiento analtico de identificacin por RMN (Categora IV), las
pruebas de validacin pueden incluir experimentos de RMN multidimensionales para validar las correctas asignaciones de los
desplazamientos qumicos y as confirmar la estructura del analito.
Criterios de validacin: La especificidad se asegura mediante el uso de un estndar de referencia, siempre que sea posible, as como la demostracin de la ausencia de interferencias procedentes de otros componentes.
USP 38

LINEALIDAD
La relacin de linealidad es aqulla exhibida entre la concentracin de analito y la respuesta del instrumento, la cual se debe
demostrar midiendo las respuestas del analito de no menos de cinco soluciones estndar a concentraciones que abarquen el
intervalo de concentracin anticipado de analitos de la solucin de prueba. Para la Categora I, las soluciones estndar se pueden preparar a partir de materiales de referencia en un disolvente para RMN apropiado. Para la Categora II, en procedimientos analticos de RMN que se usan para cuantificar impurezas, se pueden preparar muestras de linealidad agregando cantidades conocidas de muestras de prueba adecuadas que contengan bajas cantidades de analito o agregando cantidades conocidas de una matriz conteniendo el analito en concentraciones incluidas en el intervalo esperado. Posteriormente, se debe construir la curva estndar usando procedimientos analticos y estadsticos adecuados tales como la regresin de cuadrados mnimos. Asimismo, se debe determinar el coeficiente de correlacin (R), la ordenada al origen y la pendiente de la lnea de regresin. Los valores absolutos determinados para dichos factores deben ser apropiados para el procedimiento que se est validando.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para las valoraciones de Categora I,
y no menos de 0,99 para las pruebas cuantitativas de Categora II.
INTERVALO
EXACTITUD
La exactitud de un procedimiento analtico de RMN cuantitativo se debe determinar a travs del intervalo analtico requerido. Por lo general, se evalan tres niveles de concentracin usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Para valoraciones de frmacos (Categora I), la exactitud se puede determinar analizando un estndar de referencia de pureza conocida. Para productos farmacuticos (Categora I), se debe usar una muestra compuesta de estndar de referencia y de
otros componentes de un producto farmacutico terminado para la validacin del procedimiento analtico. Los resultados de
la valoracin se comparan con el valor terico del estndar de referencia para estimar errores o recuperacin porcentual. Para
la cuantificacin de impurezas (Categora II), la exactitud del procedimiento analtico se puede determinar mediante estudios
con frmacos o productos con cantidades agregadas y concentraciones conocidas del analito en anlisis. Tambin resulta
aceptable comparar los resultados de valoracin del procedimiento analtico que se est validando con los de un procedimiento analtico alternativo ya establecido.
Criterios de validacin: 98,0%102,0% de recuperacin para frmacos, 95,0%105,0% de recuperacin para valoracin
de productos farmacuticos terminados preparados magistralmente y 80,0%120,0% de recuperacin para los anlisis cuantitativos de impurezas. Estos criterios deben cumplirse durante todo el intervalo pretendido.
PRECISIN
Repetibilidad: El procedimiento analtico debe ser evaluado midiendo las concentraciones de seis soluciones estndar distintas al 100% de la concentracin de prueba. Se debe evaluar el cumplimiento de la desviacin estndar relativa de las determinaciones repetidas con los criterios de aceptacin. Como alternativa, es posible medir las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentracin. Si esto se lleva a cabo, se
combina la repetibilidad de las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para frmacos, no ms de 2,0% para productos farmacuticos terminados preparados magistralmente y no ms de 20,0% para los anlisis cuantitativos de impurezas.
Precisin intermedia: Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento analtico. Las variables tpicas incluyen llevar a cabo el anlisis en diferentes das usando diferentes instrumentos que
sean adecuados de acuerdo con lo especificado en el mtodo analtico y/o que dos o ms analistas realicen el procedimiento
analtico. Como mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos ofrecern una estimacin de la precisin intermedia.
Captulos
El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito se proporciona mediante el procedimiento analtico de RMN
cuantitativa. Por lo regular, ste se basa en las especificaciones del artculo de prueba de la monografa USP. Se trata del intervalo dentro del cual el procedimiento analtico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisin, obteniendo de este modo un valor confiable de dicho procedimiento analtico. A continuacin se proporcionan intervalos recomendados para varios procedimientos analticos de RMN.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora I, cuando los criterios de aceptacin est centrados en 100,0%, el intervalo de validacin es 80,0%120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin comprende desde
10,0% por debajo del lmite inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo es
70,0%130,0%. Para las pruebas cuantitativas de Categora II, el intervalo de validacin abarca 50,0%120,0% de los criterios
de aceptacin.
USP 38
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para frmacos, no ms de 3,0% para productos farmacuticos terminados preparados magistralmente y no ms de 25,0% para anlisis cuantitativos de impurezas.
LMITE DE CUANTIFICACIN (QL, POR SUS SIGLAS EN INGLS)
El lmite de cuantificacin se puede validar midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades
agregadas conocidas de analito al 50% de la especificacin.
A partir de estas determinaciones repetidas es posible determinar la exactitud y la precisin. Algunos ejemplos de especificaciones para las determinaciones cuantitativas de Categora II son que la concentracin medida est dentro del 70,0%130,0%
de la concentracin agregada conocida y la desviacin estndar relativa es no ms de 15%.
ROBUSTEZ
La confiabilidad de una medicin analtica se debe demostrar mediante cambios deliberados en parmetros experimentales
crticos. Esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, retraso
entre pulsos con una ligera variacin, temperatura de la sonda y posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La
robustez es necesaria para los mtodos cuantitativos de Categora I y Categora II.
Captulos
Verificacin de Procedimientos Analticos

Los reglamentos de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes de los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que
los usuarios de procedimientos analticos descritos en los compendios USPNF no requieren validar dichos procedimientos
cuando se proporcionen en una monografa, sino que simplemente deben verificar su aptitud ante condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificacin de un procedimiento de RMN es demostrar que ste, conforme a lo descrito en una monografa
especfica, puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisin adecuadas usando los instrumentos,
analistas y matrices de muestras disponibles. De acuerdo con el captulo de informacin general 1226 Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos, cuando falla la verificacin del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografa, el procedimiento
podra no ser adecuado para su uso con el artculo de prueba. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo segn lo permitido por las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificacin de un procedimiento de RMN farmacopeico debe como mnimo incluir la ejecucin de los parmetros de
validacin para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, segn se indica en esta
seccin.
GLOSARIO
Estndar interno: Un estndar interno (IS, por sus siglas en ingls) es una sustancia que se agrega a una solucin muestra
en una concentracin conocida. Se debe seleccionar un estndar interno que presente al menos una resonancia de RMN
que no se superponga con las del analito. El cociente entre las reas de los picos de un estndar interno especfico y un
analito se usa para determinar la concentracin del analito. Se debe conocer el nmero de ncleos correspondiente a los
picos integrados en el estndar interno y los espectros de analito.
Referencia de RMN: Una referencia de RMN, tambin conocida como referencia de desplazamiento de RMN, es una sustancia agregada a una muestra y a partir de la cual se establece el desplazamiento qumico para la escala . ERR (01-jul-2014)
Los ejemplos comunes de anlisis de protones y de carbono por RMN incluyen tetrametilsilano (TMS) para su uso en disolventes orgnicos y la sal sdica del cido 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfnico (DSS) o 3-trimetilsililpropionato de sodio
(TMSP) para su uso en medios acuosos. En ambos casos, el desplazamiento qumico de los picos de metilo se define como
0,0 ppm.
Estndar de referencia: Un estndar de referencia es una sustancia cuya estructura qumica especfica se confirma por
medios experimentales. En la espectroscopa de RMN, un estndar de referencia generalmente se usa para los anlisis cualitativos de un material de prueba. La estructura se puede confirmar al comparar directamente los desplazamientos qumicos y las multiplicidades de los picos en el espectro de RMN del material de prueba contra el espectro del estndar de
referencia adquirido en condiciones experimentales comparables.
USP 38
Pruebas Fsicas / 776 Microscopa ptica 575
771 UNGENTOS OFTLMICOS
776 MICROSCOPA PTICA

La microscopa ptica para la caracterizacin de partculas por lo general es una tcnica adecuada para partculas con un
tamao de 1 mm o mayor. El lmite inferior est determinado por la resolucin del microscopio. El lmite superior es menos
estricto y est determinado por las dificultades que presenta para caracterizar partculas de mayor tamao. Adems de la microscopa ptica, existen diversas tcnicas alternativas para la caracterizacin de partculas. La microscopa ptica es una tcnica sumamente recomendable para caracterizar partculas que no son esfricas, mtodo que tambin puede constituir la base
de otros mtodos de calibracin ms rutinarios y ms rpidos.
AparatoEmplear un microscopio estable y protegido de vibraciones. Es necesario que el aumento del microscopio (resultado del aumento del objetivo, ocular y de otros componentes adicionales) sea suficiente para caracterizar adecuadamente
hasta la partcula ms pequea de la muestra en anlisis. Buscar para cada intervalo de aumento, el mayor valor de apertura
numrica del objetivo. En algunos casos, se recomienda usar los filtros polarizadores con analizadores y placas de retardo adecuadas. Con objetivos acromticos se recomienda emplear un filtro cromtico de poca transmisin espectral, de preferencia
apocromticos, y son necesarios para obtener los colores que correspondan en la microfotografa. Con la lmpara y los accesorios colocados debajo de la platina del microscopio se deben emplear condensadores corregidos al menos por aberracin esfrica. La apertura real del diafragma del condensador y la presencia de aceites de inmersin afectan la apertura numrica del
condensador de los accesorios ubicados por debajo de la platina y es necesario que sta coincida con la del objetivo en las
condiciones de uso.
AjusteEs de suma importancia que todos los elementos del sistema ptico estn alineados con precisin y que el enfoque
sea el adecuado. Enfocar los elementos segn las recomendaciones del fabricante del microscopio. Se recomienda alinear el eje
con precisin.
IluminacinPara que la iluminacin sea adecuada, es necesario que la intensidad de la luz sea uniforme y regulable en
todo el campo visual. Se recomienda emplear la iluminacin de Kohler. Si se trabaja con partculas coloreadas, elegir el color
de los filtros para controlar el contraste y el detalle de la imagen.
Caracterizacin VisualEs necesario que el aumento y la apertura numrica sean suficientes para permitir la correcta resolucin de las imgenes de las partculas a caracterizar. Determinar el aumento real con un micrmetro de objetivo calibrado
para ajustar un micrmetro ocular. Una forma de reducir los errores al mnimo es trabajar con un aumento suficiente para que
Captulos
Sustancias AgregadasEn los ungentos oftlmicos se pueden agregar sustancias apropiadas para aumentar su estabilidad o utilidad, siempre que sean inocuas en las cantidades administradas y no interfieran con la eficacia teraputica o con las
respuestas a las valoraciones y pruebas especificadas, a menos que se prohba su uso en la monografa individual correspondiente. En un artculo destinado a uso oftlmico no pueden agregarse agentes colorantes con el nico fin de colorear el producto terminado (ver tambin Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y en Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51).
En los ungentos oftlmicos que se presentan en envases de ms de una dosis debe agregarse una sustancia o una mezcla
de sustancias apropiadas para impedir el crecimiento de microorganismos, independientemente del mtodo de esterilizacin
empleado, a menos que se indique algo diferente en la monografa individual correspondiente o a menos que la frmula por s
misma sea bacteriosttica. Tales sustancias se emplean en concentraciones que matan o impiden el crecimiento de microorganismos en los ungentos oftlmicos (ver tambin Prueba de Eficacia Antimicrobiana 51 y Agentes AntimicrobianosContenido
341). Aunque se empleen tales sustancias, se utilizan procesos de esterilizacin para el ungento terminado o para todos los
ingredientes si el ungento se fabrica bajo estrictas condiciones aspticas (ver tambin Preparaciones Parenterales y Tpicas en
la seccin Sustancias Agregadas, en Advertencias Generales, y Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
1211). Los ungentos oftlmicos que se presentan en envases de una sola dosis no requieren el agregado de agentes antibacterianos; sin embargo, estos ungentos deben cumplir con los requisitos de las Pruebas de Esterilidad 71.
EnvasesLos envases para ungentos oftlmicos, incluidos los cierres, no producen ninguna interaccin fsica o qumica
con la preparacin que pueda alterar la potencia, calidad o pureza ms all de los requisitos oficiales bajo las condiciones normales de manipulacin, distribucin, almacenamiento, venta y uso.
Partculas MetlicasSeguir el Procedimiento establecido en Partculas Metlicas en Ungentos Oftlmicos 751.
PrdidaSeleccionar 10 tubos del Ungento, con sus respectivos sellos aplicados cuando as se especifique. Limpiar y secar
minuciosamente las superficies externas de cada tubo con un pao absorbente. Colocar los tubos en posicin horizontal sobre
una hoja de papel secante absorbente en un horno mantenido a una temperatura de 60 3 durante 8 horas. No se produce
ninguna prdida significativa durante la prueba o al finalizar la misma (no considerar trazas del ungento cuando se supone
que se originan en forma externa desde el sello plegado del tubo o la rosca de la tapa). Si se observan prdidas en uno de los
tubos, pero no en ms de uno, repetir la prueba con 20 tubos adicionales del Ungento. El requisito se cumple si no se observa ninguna prdida en los primeros 10 tubos probados, o si se observan prdidas en no ms de uno de los 30 tubos probados.
Captulos
576 776 Microscopa ptica / Pruebas Fsicas
USP 38
la imagen de la partcula sea de al menos 10 divisiones del ocular. Calibrar cada objetivo por separado. Para calibrar la escala
del ocular, verificar que la escala del micrmetro del objetivo y la escala del ocular estn alineadas. De esta forma, se puede
determinar con precisin la distancia entre las divisiones del ocular del portaobjeto. En algunos casos, es necesario emplear
distintos aumentos para caracterizar materiales con una amplia distribucin de tamaos.
Caracterizacin FotogrficaSi se emplean mtodos fotogrficos para determinar el tamao de las partculas, tomar las
precauciones necesarias para que el objetivo est bien enfocado en el plano de la emulsin fotogrfica. Fotografiar un micrmetro de objetivo calibrado con una pelcula fotogrfica de velocidad, resolucin y contraste adecuados para determinar el
aumento real. La exposicin y el procesamiento deben ser idnticos para las fotografas de la muestra de prueba y para la determinacin del aumento. Tanto la resolucin del microscopio como la exposicin y los procesos de revelado e impresin influyen en el tamao aparente de la imagen fotogrfica.
Preparacin del Medio de MontajeEl medio de montaje se selecciona segn las propiedades fsicas de la muestra de
prueba. Para ver los detalles de los bordes de la muestra, es necesario un contraste adecuado, aunque no excesivo, entre la
muestra y el medio de montaje. Para distinguir las partculas individuales en estudio, es necesario que estn dispuestas en un
mismo plano y con la dispersin adecuada. Adems, es necesario que las partculas sean representativas de la distribucin del
tamao de las partculas y que no sufran ninguna alteracin durante la preparacin del medio de montaje. Tomar las precauciones necesarias para que se cumpla este importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje adecuado, considerar la
solubilidad del analito.
Caracterizacin de la CristalinidadSi la monografa individual de un frmaco indica caracterizar la cristalinidad, se puede determinar por microscopa ptica. Montar algunas partculas de la muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre
un portaobjetos de vidrio limpio, a menos que la monografa individual especifique algo diferente. Analizar el preparado con
un microscopio de luz polarizada: al girar la platina del microscopio, las partculas presentan birrefringencia (interferencia de
colores) y posiciones de extincin.
Prueba de Lmite del Tamao de Partculas por MicroscopaPesar una cantidad adecuada del polvo a analizar (entre
10 mg y 100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 10 mL de un medio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si
fuera necesario, un agente humectante. Suspender las partculas en un medio de densidad igual o similar y agitar para mantener la homogeneidad de la suspensin de partculas. Introducir una porcin de la suspensin homognea en una celda de conteo adecuada, observar en un rea del microscopio que corresponda a no menos de 10 mg del polvo a analizar. Contar las
partculas cuya dimensin mxima supera el lmite de tamao indicado. El lmite de tamao y el nmero mximo de partculas
que exceden el lmite se definen para cada sustancia.
Caracterizacin del Tamao de PartculasLa complejidad de la medicin del tamao de las partculas vara segn la forma de la partcula, y el nmero de partculas caracterizadas debe ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre
aceptable en los parmetros de medicin. La norma ISO 9276, por ejemplo, proporciona informacin adicional sobre la medicin del tamao de las partculas, tamao de la muestra y anlisis de los datos. Si se trata de partculas esfricas, el tamao est
definido por el dimetro. Si se trata de partculas irregulares, hay distintas definiciones del tamao de partcula. En general,
para partculas de forma irregular, la caracterizacin del tamao debe incluir informacin sobre el tipo de dimetro medido y
sobre la forma de la partcula. A continuacin se describen varias medidas usadas comnmente para el tamao de partculas
(ver la Figura 1):
Figura 1: Medidas comnmente usadas para el tamao de partculas.

Dimetro de FeretLa distancia entre lneas paralelas imaginarias tangentes a una partcula orientada de forma aleatoria y
perpendicular a la escala del ocular.
USP 38
Pruebas Fsicas / 776 Microscopa ptica 577
Dimetro de MartinEl dimetro de la partcula en el punto en el que divide una partcula orientada de forma aleatoria en
dos reas proyectadas iguales.
Dimetro del rea ProyectadaEl dimetro de un crculo cuya rea proyectada es la misma que la de la partcula.
LongitudLa medida ms larga tomada de extremo a extremo de la partcula orientada en paralelo a la escala del ocular.
AnchoLa medida ms larga de la partcula tomada en ngulo recto a la longitud.
Caracterizacin de la Forma de la PartculaSi se trata de partculas de forma irregular, la caracterizacin del tamao
debe incluir informacin sobre la forma de la partcula. Verificar la homogeneidad del polvo usando el aumento que corresponda. A continuacin se describen algunos de los descriptores usados comnmente para la forma de la partcula (ver la Figura
2):
Captulos
Figura 2: Medidas usadas comnmente para la forma de la partcula.

AcicularPartcula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor similares.
ColumnarPartcula larga y fina, de ancho y espesor superiores a los de una partcula acicular.
EscamaPartcula fina y plana, de longitud y ancho similares.
PlacaPartculas planas de longitud y ancho similares pero de mayor espesor que las escamas.
ListnPartcula larga y fina en forma de hoja.
Cubos o esferasPartculas cbicas o esfricas, de largo, ancho y espesor de dimensiones similares.
Consideraciones GeneralesLa partcula se considera, en general, la unidad discreta ms pequea. Una partcula puede
estar en estado de gotita lquida o semislida, un cristal nico o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algunos casos, las partculas estn asociadas. El grado de asociacin se puede describir en los siguientes trminos:
LaminarPlacas superpuestas.
AgregadoMasa de partculas adheridas.
AglomeradoPartculas amalgamadas o cementadas.
ConglomeradoMezcla de dos o ms tipos de partculas.
EsferulitaGrupo con estructura radial.
DrusaPartcula recubierta de pequesimas partculas.
La partcula se puede describir en los siguientes trminos:
BordesAngulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados.
pticoColor (usando filtros de compensacin del color apropiados), transparente, translcida, opaca.
DefectosOclusiones, inclusiones.
Las caractersticas de la superficie se pueden describir en los siguientes trminos:
ResquebrajadaDivisin parcial, rotura o fisura.
LisaSin irregularidades, proyecciones ni reas rugosas.
PorosaCon orificios o canales.
speraNo lisa, con protuberancias o dispareja.
PunteadaCon pequeas hendiduras.
578 781 Rotacin ptica / Pruebas Fsicas
USP 38
781 ROTACIN PTICA
Captulos
INTRODUCCIN
Muchas sustancias farmacuticas son pticamente activas dado que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera
que la luz transmitida emerge en un ngulo cuantificable con respecto al plano de la luz incidente. Esta propiedad es caracterstica de algunos cristales y de muchos lquidos o soluciones de slidos de uso farmacutico. En aquellos casos en que un lquido o un soluto en solucin posea esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios centros asimtricos,
normalmente un tomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes. El nmero de ismeros pticos es 2n, en donde n es el
nmero de centros asimtricos. La polarimetra, medicin de la rotacin ptica de un artculo farmacutico, puede ser el nico
medio conveniente para distinguir entre s ismeros pticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de identidad
y pureza.
Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar propiedades pticas rotatorias son quirales. Aqullas que rotan la luz en el
sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de iluminacin, son dextrgiras, o ismeros pticos (+), y aqullas que
rotan la luz en el sentido contrario a las agujas del reloj se llaman levgiras o ismeros pticos (). (Los smbolos d- y l- que
anteriormente se empleaban para indicar ismeros dextro- y levgiros ya no se utilizan, debido a la confusin con los smbolos
D- y L-, que se refieren a las configuraciones relacionadas con el D-gliceraldehdo. Los smbolos R y S as como a y b tambin
se emplean para indicar la configuracin, es decir, el ordenamiento de los tomos o grupos de tomos en el espacio.)
Las propiedades fsicoqumicas de las sustancias quirales no superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma
cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas enantimeros, son idnticas, salvo por esta propiedad y por sus
reacciones con otras sustancias quirales. Los enantimeros presentan a menudo diferencias profundas en sus caractersticas farmacolgicas y toxicolgicas, debido al hecho de que los receptores biolgicos y las enzimas son quirales. Muchos artculos de
origen natural, como por ejemplo los aminocidos, las protenas, los alcaloides, los antibiticos, los glicsidos y los azcares,
existen como compuestos quirales. La sntesis de estos compuestos a partir de materiales no quirales usualmente resulta en
cantidades iguales de enantimeros, es decir, los racematos. Los racematos tienen una rotacin ptica neta nula y sus propiedades fsicas pueden diferir de las de los enantimeros que los componen. Para obtener los ismeros pticos individuales pueden emplearse mtodos de sntesis estereoselectivos o estereoespecficos o de separacin de mezclas racmicas.
La medicin de la rotacin ptica se realiza empleando un polarmetro.1 La ecuacin general usada en polarimetra es:
en donde [a] es la rotacin especfica a la longitud de onda l, t es la temperatura, a es la rotacin observada en grados (), l es
la longitud de paso en decmetros y c es la concentracin del analito en g por 100 mL. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor
medido, en grados (), para una solucin que contiene 1 g en 100 mL, medido en una celda con una longitud de paso de 1,0
decmetro en determinadas condiciones de longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos artculos Farmacopeicos, especialmente los lquidos, tales como los aceites esenciales, el requisito de rotacin ptica se expresa en funcin de la
rotacin observada a, medida en las condiciones definidas en la monografa correspondiente.
Histricamente, la polarimetra se realizaba empleando un instrumento en el cual se estimaba el grado de rotacin ptica al
igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este motivo, se empleaba con mayor frecuencia la lnea D de la
lmpara de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible.2 La rotacin especfica determinada en la lnea D se
expresa con el smbolo:
y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo
las obtenibles con las lneas de la lmpara de mercurio, aisladas a travs de filtros de mxima transmitancia, aproximadamente
a 546; 436; 405; 365 y 325 nm en un polarmetro fotoelctrico, ha demostrado proporcionar ventajas en sensibilidad con una
reduccin consiguiente de la concentracin del compuesto de prueba. En general, la rotacin ptica observada a 436 nm es
aproximadamente el doble y a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm.2 La reduccin de la concentracin
del soluto requerida para la medicin a veces puede lograrse mediante la conversin de la sustancia en anlisis en una sustancia que tenga una rotacin ptica significativamente mayor. La rotacin ptica tambin resulta afectada por el disolvente empleado para la medicin y esto debe especificarse en todos los casos.
1 Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles en la Office of Standard Reference Materials, National Institute of Standards and Technology, NIST (Oficina de Materiales de Referencia Estndar, Instituto Nacional de Normas y Tecnologa), Gaithersburg, MD 20899, como lotes vigentes de Materiales de Referencia
Estndar, Dextrosa y Sacarosa. Como alternativa, la calibracin puede controlarse empleando un Estndar de Referencia de Polarizacin, que consiste en una placa
de cuarzo montada sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estndares, normalizados respecto a estndares del NIST, se encuentran disponibles en
Rudolph Research Analytical, ubicado en 55 Newburgh Road, Hackettstown, NJ 07840, EE.UU.
2 Todas las referencias a longuitudes de onda son en vaco. La lnea D de sodio es 589,44 en vaco y 589,3 en aire.
USP 38
Pruebas Fsicas / 785 Osmolalidad y Osmolaridad 579
En la actualidad, es prctica comn emplear otras fuentes de luz, tales como lmparas de xenn o halgenas de tungsteno,
con filtros apropiados, puesto que stas pueden ser menos costosas, adems de ser de larga duracin y tener un amplio rango
de longitudes de onda de emisin con respecto a las fuentes de luz tradicionales.
PROCEDIMIENTOS
Rotacin Especfica
Rotacin Angular
A menos que se indique de otro modo, la referencia Rotacin Angular 781A en una monografa significa que la rotacin
ptica del lquido sin diluir se mide en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25 C, corregida por la lectura del tubo vaco y seco.2
785 OSMOLALIDAD Y OSMOLARIDAD

INTRODUCCIN
La presin osmtica tiene una importancia fundamental en todos los procesos biolgicos donde hay difusin de solutos o
transferencia de lquidos a travs de membranas. La smosis sucede cuando un disolvente, pero no las molculas de soluto,
pasa a travs de una membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor concentracin para llegar al equilibrio. Es
muy importante para los profesionales conocer las presiones osmticas para poder determinar si una solucin parenteral es
hipoosmtica, isoosmtica o hiperosmtica. Una medicin cuantitativa de la presin osmtica facilita la dilucin requerida para producir una solucin isoosmtica con respecto a la sangre entera.
PRESIN OSMTICA
La presin osmtica de una solucin depende del nmero de partculas en la solucin y, por lo tanto, se la considera como
una propiedad coligativa. Una partcula puede ser una molcula o un in o una especie agregada (por ejemplo, un dmero)
que puede existir en forma diferenciada en solucin. Una solucin presenta un comportamiento ideal cuando no hay interaccin entre los solutos y el disolvente, excepto cuando las molculas del disolvente estn unidas a los solutos mediante enlaces
de hidrgeno o enlaces covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen un soluto no disociado, la presin osmtica (p) es directamente proporcional a su molalidad (el nmero de moles de soluto por kilogramo de disolvente):
p = (rRT/1000)m
en donde r es la densidad del disolvente a la temperatura T (en la escala absoluta); R es la constante universal del gases; y m es
la molalidad de la solucin. Para el caso de una solucin real que contiene ms de un soluto, la presin osmtica se calcula por
la frmula:
p = (rRT/1000)SnimiFm,i
en donde ni es el nmero de partculas formadas por la disociacin de una molcula del isimo soluto (el nmero ordinal del
soluto); ni = 1 para solutos no inicos (que no se disocian); mi es la molalidad del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto);
y Fm,i es el coeficiente osmtico molal del isimo soluto. El coeficiente osmtico molal tiene en cuenta la desviacin de una
Captulos
La referencia Rotacin Especfica 781S en una monografa significa que esa rotacin especfica se calcular a partir de las
rotaciones pticas observadas en la Solucin de prueba o Solucin muestra, obtenidas segn se indica en ese mismo texto. A
menos que se indique de otro modo, las mediciones de rotacin ptica se realizan en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25 C.2
Cuando se emplea un polarmetro fotoelctrico, se hace una sola medicin corregida por el blanco de disolvente. Cuando se
emplea un polarmetro visual, se utiliza el promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la lectura del mismo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura, que se aplica a la solucin o al lquido en anlisis, debe mantenerse con
una aproximacin de 0,5 del valor establecido. Emplear la misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma orientacin angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de tal manera que la luz la atraviese en la misma direccin cada
vez. La rotacin especfica, a menos que se especifique algo diferente, se calcula con respecto a la sustancia seca cuando se
especifica Prdida por Secado en la monografa correspondiente o con respecto a la sustancia anhidra cuando se especifica
Determinacin de Agua.
La rotacin ptica de las soluciones se debe determinar dentro de los 30 minutos posteriores a la preparacin. En el caso de
sustancias que puedan sufrir racemizacin o mutarotacin, se deben tomar precauciones para estandarizar el tiempo entre la
adicin del soluto al disolvente y la introduccin de la solucin en el tubo polarimtrico.
580 785 Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Fsicas
USP 38
solucin con respecto al comportamiento ideal. Su valor depende de la concentracin del soluto o los solutos en la solucin,
de sus propiedades qumicas y de sus caractersticas inicas. El valor del coeficiente osmtico molal de un soluto se puede determinar experimentalmente midiendo el descenso del punto de congelacin a diferentes concentraciones molales. A concentraciones de inters farmacutico, el valor del coeficiente osmtico molal es menos de uno. El coeficiente osmtico molal disminuye al aumentar la concentracin del soluto (Tabla 1).
OSMOLALIDAD
La osmolalidad de una solucin xm se representa mediante la frmula
xm = SnimiFm,i
La osmolalidad de una solucin real se corresponde con la molalidad de la solucin ideal que contiene solutos que no se disocian y se expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente (Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente),
una unidad que es similar a la molalidad de una solucin. As, la osmolalidad es la medida de la presin osmtica ejercida por
una solucin real a cada lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presin osmtica, otras propiedades coligativas de la solucin, tales como la disminucin de la presin de vapor, la elevacin del punto de ebullicin y el descenso del
punto de congelacin, tambin estn directamente relacionadas con la osmolalidad de la solucin. As, la osmolalidad de una
solucin se determina tpicamente con la mayor exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de congelacin
(DTf):
Captulos
DTf = kf xm
en donde kf es la constante crioscpica molal, que es una propiedad del disolvente. Para el agua, el valor de kf es 1,860 por
Osmol. Es decir, 1 Osmol de un soluto agregado a 1 kg de agua hace descender el punto de congelacin en 1,860.
OSMOLARIDAD
La osmolaridad de una solucin es una cantidad terica expresada en osmoles por L (Osmol por L) de una solucin y se usa
ampliamente en la prctica clnica porque expresa los osmoles en funcin del volumen. La osmolaridad no se puede medir
pero se calcula tericamente a partir del valor de osmolalidad medido experimentalmente.
A veces, la osmolaridad (xc) se calcula tericamente a partir de las concentraciones molares:
xc = Snici
en donde ni es la que se define anteriormente y ci es la concentracin molar del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto) en
solucin. Por ejemplo, la osmolaridad de una solucin que se prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solucin
de cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera:
[3 10 g/L/1449,25(peso mol. de vancomicina) + 2 9 g/L/58,44(peso mol. de cloruro de sodio)] 1000 = 329 mOsmol/L
El resultado sugiere que la solucin es ligeramente hiperosmtica dado que la osmolalidad de la sangre est entre 285 y 310
mOsmol por kg. Sin embargo, la solucin ha resultado ser hipoosmtica y tiene una osmolalidad determinada experimentalmente de 255 mOsmol por kg.1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad calculados tericamente a partir de la concentracin de una solucin se deben interpretar con cautela y este valor puede no representar las propiedades osmticas de las
soluciones de infusin.
La discrepancia entre los resultados tericos (osmolaridad) y los experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de
que la presin osmtica est relacionada con la osmolalidad y no con la osmolaridad. Ms significativamente, la discrepancia
entre los resultados experimentales y los clculos tericos se debe a que la presin osmtica de una solucin real es menor que
la de una solucin ideal debido a las interacciones entre las molculas del soluto o entre las molculas del soluto y del disolvente en una solucin. Estas interacciones reducen la presin que ejercen las molculas del soluto sobre la membrana semipermeable, lo que reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparacin con los valores tericos. Esta diferencia
est relacionada con el coeficiente osmtico molal (Fm,i). El ejemplo tambin ilustra la importancia de determinar experimentalmente la osmolalidad de una solucin, en vez de calcular el valor tericamente.
MEDICIN DE LA OSMOLALIDAD
Normalmente, el valor de osmolalidad de una solucin se determina midiendo el descenso del punto de congelacin de una
solucin.
AparatoEl aparato, un osmmetro para medir el descenso del punto de congelacin, consiste en lo siguiente: un medio
para enfriar el recipiente utilizado para la medicin; un resistor sensible a la temperatura (termistor), con un dispositivo ade-
Kastango, E.S. y Hadaway, L. International Journal of Pharmaceutical Compounding 5, (2001) 465-469.
Pruebas Fsicas / 785 Osmolalidad y Osmolaridad 581
USP 38
cuado para medir la diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en funcin de cambios de temperatura o en
osmolalidad; y un mecanismo para mezclar la muestra.
Los osmmetros que miden la presin de vapor de las soluciones se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen
de muestra ms pequeo (generalmente aproximadamente 5 mL), aunque la exactitud y precisin de los resultados de las determinaciones de osmolalidad son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmmetros que dependen de la observacin del punto de congelacin de las soluciones.
Soluciones EstndarPreparar las Soluciones Estndar como se indica en la Tabla 1, segn sea necesario.2
Tabla 1. Soluciones Estndar para Calibracin del Osmmetro*
Soluciones Estndar
(Peso en g de cloruro de sodio
por kg de agua)
Osmolalidad
(mOsmol/kg)
(xm)
Coeficiente
Osmtico Molal
(Fm, NaCl)
Descenso del
Punto de Congelacin ()
DTf
3,087
100
0,9463
0,186
6,260
200
0,9337
0,372
9,463
300
0,9264
0,558
12,684
400
0,9215
0,744
15,916
500
0,9180
0,930
19,147
600
0,9157
1,116
22,380
700
0,9140
1,302
* Adaptado de la Farmacopea Europea, 4a Edicin, 2002, pg. 50.
xc = 1000xm / (1000 / r + Swini)

donde wi es el peso en g; y ni es el volumen especfico parcial, en mL por g, del isimo soluto (el nmero ordinal del soluto). El
volumen especfico parcial de un soluto es el cambio en volumen de una solucin cuando se disuelve 1 g adicional de soluto
en la solucin. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades de la solucin antes y despus de agregar el soluto.
Los volmenes especficos parciales de las sales son generalmente muy pequeos, alrededor de 0,1 mL por g. Sin embargo, los
otros solutos son generalmente mayores. Por ejemplo, los volmenes especficos parciales de los aminocidos estn entre 0,6
mL y 0,9 mL por g. Se puede demostrar por la ecuacin anterior que correlaciona la osmolaridad con la osmolalidad que,
xc = xm (r c)
donde r es la densidad de la solucin y c es la concentracin de soluto total, ambas expresadas en g por mL. Por lo tanto,
alternativamente, la osmolaridad puede calcularse tambin a partir de la osmolalidad determinada experimentalmente a partir
2 Se pueden usar soluciones comercialmente disponibles para calibracin de osmmetros, con osmolalidades iguales o diferentes a las que se listan en la Tabla 1 y
estandarizadas con mtodos rastreables al NIST.
Captulos
Solucin de PruebaEn el caso de un slido para inyeccin, reconstituir con el diluyente apropiado segn se indica en las
instrucciones del etiquetado. En el caso de soluciones, usar la muestra tal como se encuentra. [NOTASe puede diluir una solucin para que quede dentro del intervalo de medicin del osmmetro, si fuera necesario, pero el resultado se deber expresar
como el resultado de la solucin diluida y NO se debe multiplicar por un factor de dilucin para calcular la osmolalidad de la
solucin original, a menos que se especifique algo diferente en la monografa. El coeficiente osmtico molal es una funcin de
la concentracin. Por lo tanto, cambia con la dilucin.]
ProcedimientoPrimero, calibrar el instrumento segn las instrucciones del fabricante. Confirmar la calibracin del instrumento con, por lo menos, una solucin de la Tabla 1 de manera que la osmolalidad de la Solucin Estndar se encuentre dentro de 50 mOsmol/kg del valor esperado de la Solucin de Prueba o en el centro del intervalo esperado de osmolalidad de la
Solucin de Prueba. La lectura del instrumento debe estar dentro de 4 mOsmol por kg de la Solucin Estndar. Introducir un
volumen adecuado de cada Solucin Estndar en la celda de medicin conforme a las instrucciones del fabricante y poner en
marcha el sistema de enfriamiento. En general, el dispositivo de mezcla se programa para que opere a una temperatura inferior
a la temperatura ms baja esperada de descenso del punto de congelacin. El aparato indica cuando se ha logrado el equilibrio. Si fuera necesario, calibrar el osmmetro utilizando un dispositivo de ajuste adecuado de modo que la lectura corresponda a la osmolalidad o al valor de descenso del punto de congelacin de la Solucin Estndar que aparece en la Tabla 1. [NOTA
Si la lectura del instrumento indica el descenso del punto de congelacin, la osmolalidad se puede derivar usando la frmula
apropiada en Osmolalidad.] Repetir el procedimiento con cada Solucin de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solucin de Prueba
directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el descenso del punto de congelacin.
Suponiendo que el valor del coeficiente osmtico es esencialmente el mismo ya sea que la concentracin se exprese en molalidad o molaridad, la osmolalidad de una solucin determinada experimentalmente se puede convertir en osmolaridad de la
misma manera que la concentracin de una solucin se convierte de molalidad a molaridad. A menos que una solucin est
muy concentrada, la osmolaridad de una solucin (xc) se puede calcular a partir de su osmolalidad determinada experimentalmente (xm):
582 785 Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Fsicas
USP 38
de la medicin de la densidad de la solucin mediante un mtodo adecuado y el peso total del soluto, despus de la correccin por contenido de agua, disuelto por mL de la solucin.
Captulos
786 ESTIMACIN DE LA DISTRIBUCIN DEL TAMAO DE

PARTCULA POR TAMIZADO ANALTICO
El tamizado es uno de los mtodos ms antiguos para clasificar los polvos y los grnulos segn la distribucin del tamao de
partcula. El tamizado utilizando un lienzo tejido como tamiz, consiste bsicamente en clasificar las partculas segn su tamao
intermedio (es decir, segn su ancho o amplitud). Se recomienda el tamizado mecnico si la mayora de las partculas superan
los 75 mm aproximadamente. Si se trata de partculas ms pequeas, durante el tamizado se observa que su escaso peso no
ejerce la fuerza suficiente para contrarrestar las fuerzas de adhesin y cohesin superficial, que hacen que las partculas se aglutinen unas con otras y al tamiz. Por este motivo, las partculas que se esperara que pasaran por el tamiz, en realidad no lo
hacen. Para este tipo de materiales se recomienda emplear otros mtodos de agitacin, como por ejemplo el tamizado con un
chorro de aire o el tamizado snico. No obstante, el tamizado se puede emplear en algunos casos para algunos polvos o grnulos cuya mediana de tamao de partcula sea inferior a 75 mm, siempre que el mtodo se pueda validar. En trminos farmacuticos, el tamizado es el mtodo de preferencia para clasificar polvos o grnulos sin mezclas ms gruesos. El mtodo es especialmente atractivo ya que tanto los polvos como los grnulos se clasifican solamente en funcin del tamao de partcula y en
la mayora de los casos el anlisis se puede efectuar con el material seco.
Entre los factores limitantes que presenta el mtodo se encuentran la necesidad de contar con una cantidad de muestra
apreciable (segn sea la densidad del polvo o de los grnulos y el dimetro de los orificios del tamiz, generalmente como mnimo 25 g) y la dificultad que presentan polvos o grnulos oleosos o cohesivos que obstruyen los orificios del tamiz. En esencia,
el mtodo estima el tamao en dos dimensiones ya que el pasaje a travs del orificio del tamiz a menudo presenta mayor
dependencia del ancho y del espesor mximos que del largo.
Este mtodo est destinado a estimar la distribucin del tamao de partcula total de un material sin mezclar. No est diseado para determinar la proporcin de partculas que pasan o que se retienen por uno o dos tamices.
A menos que la monografa individual especifique algo diferente, estimar la distribucin del tamao de partcula segn se
describe en Mtodo de Tamizado en Seco. Si se presentan dificultades para alcanzar el punto final (es decir, el material no pasa
fcilmente por los tamices) o si fuera necesario emplear los tamices con los orificios ms pequeos del intervalo de tamizado
(de menos de 75 mm), se debe evaluar si no sera conveniente emplear otro mtodo para determinar el tamao de partcula.
Se debe tamizar en condiciones tales que no generen ni prdida ni aumento del contenido de humedad de la muestra. Controlar la humedad relativa ambiente del lugar donde se efecta el tamizado de forma de impedir que la muestra absorba o
pierda humedad. El tamizado analtico de prueba normalmente se realiza en condiciones de humedad ambiente salvo que hubiera pruebas que indicaran lo contrario. Cualquier condicin especial aplicable al material en cuestin debe estar detallada en
la monografa individual.
Principios del Tamizado AnalticoLos tamices analticos constan de una malla de alambre, de tejido simple, que se asume deja aberturas casi cuadrangulares y que est sellada en la base de un recipiente cilndrico abierto. El mtodo analtico de
base consiste en apilar los tamices uno sobre el otro, encimndolos en orden ascendente de tamao de orificio y luego colocar
el polvo de muestra en el tamiz superior.
Someter a agitacin el grupo de tamices apilados durante un tiempo normalizado y luego determinar con exactitud el peso
del material retenido en cada tamiz. Por este mtodo se calcula el porcentaje, en peso, del polvo retenido en cada uno de los
tamices utilizados.
El procedimiento para estimar la distribucin del tamao de partcula de un nico polvo farmacutico est diseado, en general, para trabajar con polvos en los que al menos el 80% de las partculas supera los 75 mm. El parmetro dimensional que se
emplea para determinar la distribucin del tamao de partcula por tamizado analtico es el largo de uno de los lados del orificio cuadrangular ms pequeo a travs del cual pasar la partcula.
TAMICES ANALTICOS
Los tamices analticos adecuados para efectuar las pruebas farmacopeicas cumplen con las especificaciones contenidas en la
versin ms actualizada de la Norma ISO 3310-1 de la Organizacin Internacional de Normalizacin: Tamices AnalticosRequisitos Tcnicos y Pruebas (ver la Tabla 1). A menos que la monografa especifique algo diferente, emplear los tamices ISO
que se enumeran como tamao principal en la Tabla 1. A menos que la monografa especifique algo diferente, emplear los
tamices ISO que figuran en la Tabla 1 segn la recomendacin indicada para ese tamiz.
Pruebas Fsicas / 786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula 583
USP 38
Tabla 1. Tamaos de las Series de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters

Abertura Nominal ISO
Tamaos
Principales
Tamaos Adicionales
R 20/3
R 20
R 40/3
11,20 mm
11,20 mm
11,20 mm
Tamiz No.
EE.UU.
Tamices USP
Recomendados
(micrones)
Tamiz
Europeo
No.
Tamiz
Japons
No.
11200
10,00 mm
9,50 mm
9,00 mm
8,00 mm
8,00 mm
8,00 mm
7,10 mm
6,70 mm
6,30 mm
5,60 mm
5,60 mm
5,60 mm
5600
3,5
5,00 mm
4,75 mm
4,50 mm
4,00 mm
4,00 mm
4,00 mm
3,35 mm
2,80 mm
2,36 mm
2,00 mm
10
1,70 mm
12
1,40 mm
14
1,18 mm
16
1,00 mm
18
850 mm
20
710 mm
25
600 mm
30
500 mm
35
425 mm
40
355 mm
45
300 mm
50
250 mm
60
212 mm
70
180 mm
80
4000
4000
4,7
3,55 mm
2,80 mm
2,80 mm
2800
2800
6,5
2,50 mm
7,5
2,24 mm
2,00 mm
2,00 mm
2000
2000
8,6
1,80 mm
10
1,60 mm
1,40 mm
1,40 mm
1400
1400
12
1,25 mm
14
1,12 mm
1,00 mm
1,00 mm
1000
1000
16
900 mm
18
800 mm
710 mm
710 mm
710
710
22
630 mm
26
560 mm
500 mm
500 mm
500
500
30
450 mm
36
400 mm
355 mm
355 mm
355
355
42
315 mm
50
280 mm
250 mm
250 mm
250
250
60
224 mm
70
200 mm
180 mm
180 mm
160 mm
180
180
83
Captulos
5,5
3,15 mm
584 786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 1. Tamaos de las Series de Tamices Estndar segn el Intervalo de Inters (Continuacin)
Abertura Nominal ISO
Tamaos
Principales
R 20/3
Tamaos Adicionales
R 20
R 40/3
Tamiz No.
EE.UU.
150 mm
100
125 mm
120
106 mm
140
90 mm
170
75 mm
200
63 mm
230
53 mm
270
45 mm
325
Tamices USP
Recomendados
(micrones)
Tamiz
Europeo
No.
Tamiz
Japons
No.
100
140 mm
125 mm
125 mm
125
125
119
112 mm
140
100 mm
90 mm
90 mm
90
90
166
80 mm
200
71 mm
63 mm
63 mm
63
63
235
56 mm
282
Captulos
50 mm
45 mm
45 mm
45
45
330
38
391
40 mm
38 mm
Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaos de partcula de la muestra de prueba estn comprendidos en el
intervalo. Se recomienda emplear un grupo de tamices encajados con una progresin de 2 del rea de los orificios del tamiz.
Encajar los tamices de forma que la malla con orificios ms grandes quede en el extremo superior y la que tenga los orificios
ms pequeos en el extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignndoles un valor en micrmetros o en milmetros.
[NOTALos nmeros de malla que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar conversiones.] Los tamices
analticos son preferentemente de acero inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo adecuado.
Tanto la primera calibracin del tamiz analtico como las subsiguientes se realizan segn lo dispuesto en la versin ms actualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsiones considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En algunos casos, se pueden emplear mtodos pticos para
calibrar el tamiz, estimando el tamao promedio del orificio y la variabilidad que pudieran presentar los orificios de la malla.
Alternativamente tambin se pueden emplear Esferas de Vidrio Estndar para medir los orificios reales de los tamices analticos
en el intervalo de 212 mm a 850 mm. A menos que la monografa individual especifique algo diferente, analizar el tamiz con
temperatura ambiente controlada y en condiciones de humedad relativa ambiente.
Limpieza de los Tamices AnalticosEn condiciones ideales se recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de
aire o con un chorro de lquido. Si despus del chorro de lquido o de aire, todava se observan orificios obstruidos por partculas del material en estudio, emplear un cepillo como ltimo recurso pasndolo suavemente y tomando las precauciones necesarias para no daar el tamiz.
Muestra de PruebaSi la monografa del material en estudio no indica el peso de la muestra de prueba, emplear una
muestra de prueba de 25 g a 100 g, dependiendo de la densidad aparente, y tamices analticos de 200 mm de dimetro. Para
tamices de 76 mm calcular la cantidad de material adecuada considerando que es aproximadamente 1/7 de la cantidad que
puede colocarse en un tamiz de 200 mm. Determinar el peso ms apropiado para un material dado, tamizando muestras de
distintos tamaos pesadas con exactitud, por ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecnico durante el mismo
periodo de tiempo. [NOTASi los resultados obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el porcentaje obtenido en el tamiz de orificios ms pequeos con la muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado grande.] Si
slo se dispone de una muestra de 10 g a 25 g, se pueden emplear tamices analticos de menor dimetro que cumplan con las
mismas especificaciones de la malla. En este caso, volver a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario
emplear muestras con una masa menor (por ejemplo, hasta 5 g). Para materiales con densidad de partculas aparente baja, o
de materiales compuestos principalmente por partculas de forma muy isodiamtrica, puede ser necesario emplear una muestra de menos de 5 g en un tamiz de 200 mm, para as evitar la obstruccin excesiva de los orificios del tamiz. En la validacin
de un mtodo de tamizado analtico en particular, se asume que el problema de la obstruccin de los orificios se tom en
consideracin.
Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder cantidades de agua considerables con las variaciones de humedad, efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma anloga, si se sabe que el material en estudio genera
carga electrosttica, tomar las precauciones necesarias para garantizar que esa carga no altere los resultados del anlisis. En
algunos casos, se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-esttico, como un dixido de silicio coloidal
USP 38
Pruebas Fsicas / 786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula 585
u xido de aluminio, para reducir el efecto a un mnimo. Si no se puede eliminar la carga esttica ni la absorcin o prdida de
agua, es necesario emplear otra tcnica para determinar el tamao de partcula.
Mtodos de AgitacinTodos los distintos tipos de dispositivos de agitacin para tamices y polvos estn disponibles comercialmente y son adecuados para el tamizado analtico. Sin embargo, las distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de
estas fuerzas sobre las partculas en estudio que emplean los distintos mtodos de agitacin producirn resultados distintos y
tendrn puntos finales distintos. Algunos mtodos emplean la agitacin mecnica o electromagntica que induce un cierto
grado de oscilacin vertical o de movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una combinacin de golpes
suaves y de movimiento circular en el plano horizontal. Otro mtodo consiste en arrastrar las partculas en un chorro de aire.
Es necesario indicar en los resultados qu mtodo de agitacin se emple y con qu parmetros (si estn sujetos a variacin),
ya que los cambios en las condiciones de agitacin generan cambios en los resultados del tamizado analtico y en la determinacin del punto final y en algunos casos la variacin es lo suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan
con los requisitos en ciertas circunstancias.
Determinacin del Punto FinalEl tamizado analtico se da por concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no
presenta variaciones de ms de 5% o de 0,1 g (10% si se emplean tamices de 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo
tamiz. Si en cualquiera de los tamices hay menos del 5% del total de la muestra, aumentar el punto final para ese tamiz hasta
un cambio de peso de no ms de 20% del peso previo obtenido en ese tamiz.
Si se encuentra ms del 50% del peso total de la muestra en cualquiera de los tamices, a menos que esta circunstancia est
indicada en la monografa, repetir la prueba agregando a ese conjunto de tamices un tamiz con orificios ms grandes, de tamao intermedio entre el tamao del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz en el orden del grupo original,
es decir, agregando el tamiz de la serie ISO omitido en el conjunto de tamices.
Agitacin Mecnica
Mtodo de Tamizado en SecoTarar cada tamiz con una aproximacin de 0,1 g. Colocar una cantidad de la muestra de
prueba pesada con exactitud en el tamiz superior (el de orificios ms grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5
minutos. A continuacin desmontar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de tamices sin que haya prdida de material.
Volver a pesar cada tamiz y determinar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el peso del material utilizando
una bandeja recolectora u otro adminculo similar para recolectar el material. Volver a montar el conjunto de tamices y agitar
durante 5 minutos. Desmontar y pesar cada uno de los tamices como se describi anteriormente. Repetir los pasos hasta obtener los resultados del punto final (ver Determinacin del Punto Final en Tamices Analticos) Una vez completado el anlisis, conciliar los pesos del material. Las prdidas totales no exceden de 5% del peso de la muestra original.
Repetir el anlisis con una muestra nueva, pero usando un solo tiempo de tamizado igual a la sumatoria de los tiempos mencionados anteriormente. Confirmar que este tiempo de tamizado cumple con los requisitos de la determinacin de punto final.
Una vez validado el punto final para un material especfico, ese tiempo nico de tamizado fijado se puede usar en los prximos
anlisis, siempre y cuando la distribucin del tamao de partcula est comprendida dentro de los lmites de la variacin normal.
Si se observara que las partculas retenidas en uno cualquiera de los tamices estn en forma de agregados y no de partculas
individuales, es poco probable que el tamizado mecnico en seco proporcione una buena reproducibilidad. En ese caso se debe emplear otro mtodo de anlisis del tamao de partcula.
Mtodos de Arrastre por Aire

Tamizado con un Chorro de Aire o Tamizado SnicoHay disponibles comercialmente varios tipos distintos de equipos para
tamizar que utilizan una corriente de aire circulante. El sistema que emplea un nico tamiz por vez se denomina tamizado por
chorro de aire. En lneas generales, la metodologa es similar a la descrita para el Mtodo de Tamizado en Seco con un chorro de
aire normalizado en lugar del mecanismo de agitacin descrito. La distribucin del tamao de partcula se obtiene mediante
anlisis secuenciales en tamices individuales comenzando por el tamiz con orificios ms pequeos. A menudo, el tamizado por
chorro de aire se realiza con tamices de orificios ms pequeos que los empleados en el tamizado en seco. La tcnica resulta
ms adecuada si slo es necesario cuantificar las fracciones que estn por encima o por debajo de un lmite de tamao.
El mtodo de tamizado snico emplea un conjunto de tamices y la muestra circula en un columna de aire que oscila verticalmente y eleva la muestra y la devuelve a los orificios de la malla a un cierto nmero de pulsos por minuto. En algunos casos, si
se emplea el tamizado snico es necesario disminuir el tamao de la muestra a 5 g.
Los mtodos de tamizado por chorro de aire y snico pueden ser tiles para polvos o grnulos con los que no se obtienen
un anlisis significativo empleando las tcnicas de tamizado mecnico.
Estos mtodos dependen en gran medida de que la dispersin del polvo en la corriente de aire sea apropiada. Puede ocurrir
que se encuentren dificultades para cumplir con este requisito si el mtodo se emplea con los tamices en el extremo inferior
del intervalo (es decir, de menos de 75 mm), cuando las partculas tienden a tener mayor cohesin y en particular si el material
presenta una tendencia a cargarse electrostticamente. Los motivos expuestos subrayan la importancia de la determinacin del
Captulos
MTODOS DE TAMIZADO
586 786 Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula / Pruebas Fsicas
USP 38
punto final y que es crucial confirmar que el material cuyo tamao excede el previsto est compuesto de partculas aisladas y
no de agregados.
INTERPRETACIN
Los datos sin procesar deben incluir el peso de la muestra en anlisis, el tiempo total de tamizado y la descripcin precisa de
la metodologa de tamizado empleada as como los valores fijados para todo parmetro variable, adems de los pesos del material retenido en cada tamiz individual y del peso en la bandeja. En algunos casos se recomienda convertir estos datos en una
distribucin acumulativa del peso y, si se desea expresar la distribucin en trminos del peso acumulado de partculas de tamao inferior al esperado, el intervalo de tamices empleados debe incluir un tamiz por cuyos orificios pasa todo el material. Si se
observan indicios de que el material retenido en los tamices est compuesto por agregados formados durante el proceso de
tamizado, el anlisis no es vlido.
Captulos
787 PARTCULAS SUBVISIBLES EN INYECTABLES DE PROTENAS

TERAPUTICAS
Este captulo se puede usar como alternativa al captulo general Partculas en Inyectables 788 de la USP. Este captulo trata
especficamente de inyectables de protenas teraputicas y preparaciones relacionadas, lo cual permite el uso de volmenes de
los productos y alcuotas de prueba ms pequeas para determinar el contenido de partculas, con instrucciones para la manipulacin de las muestras que toman en cuenta las cuestiones asociadas con el anlisis de estos materiales. Aunque la metodologa y los lmites presentados en este captulo son los preferidos para inyectables de protenas teraputicas, se considera aceptable el uso de mtodos analticos alternativos aceptados por las autoridades reglamentarias con lmites de partculas subvisibles adecuadamente desarrollados.
Los inyectables de protenas teraputicas son productos de protenas o pptidos, obtenidos por biotecnologa, conforme a lo
definido en el captulo Artculos Obtenidos por Biotecnologa 1045,1 as como otros inyectables de protenas teraputicas tales
como protenas teraputicas obtenidas de fuentes naturales, incluyendo sus preparaciones finales para infusin. No se incluyen
en este captulo ciertas preparaciones que no se pueden adaptar a estas pruebas, tales como las vacunas profilcticas.
Las partculas en inyectables de protenas teraputicas son sustancias mviles no disueltas que pueden originarse de diversas
fuentes. Las partculas pueden ser (a) verdaderamente extraas o extrnsecas, p.ej., material extrao inesperado, tal como
celulosa; (b) intrnsecas resultantes del proceso de fabricacin, mediante incorporacin o por limpieza deficiente, tales como
metales o juntas del tanque, lubricantes, equipo de llenado, o que resultan de la inestabilidad, p.ej., cambios por el paso del
tiempo, tales como formas salinas insolubles de frmacos o degradacin del empaque; y (c) inherentes, tales como partculas de la protena o de los componentes de la formulacin. Todos estos tipos de partculas se pueden detectar y contar usando
el mtodo de prueba descrito en este captulo. Asimismo, para los mtodos de obstruccin de luz (OL), las burbujas de gas por
lo regular se cuentan durante el anlisis de partculas y se consideran artefactos del recuento. Para la determinacin de partculas subvisibles en inyectables de protenas teraputicas, el mtodo preferido es la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin
de Luz. La Prueba de Conteo Microscpico de Partculas similar a la descrita en el captulo 788 puede ser til para casos en los
que las partculas que se estn analizando sean en su mayora no proteinceas, o para casos en los que pudiera considerarse
importante examinar las caractersticas de las partculas. Los resultados de esta prueba no son equivalentes a los de la prueba
de OL.
No todos los inyectables de protenas teraputicas pueden examinarse directamente para determinar la presencia de partculas subvisibles con el mtodo de OL. Cuando el mtodo de prueba no se puede aplicar de forma directa a muestras de prueba
especficas, segn se determine por cualquier problemtica con la verificacin del mtodo (reproducibilidad, linealidad), se
puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente apropiado para permitir el anlisis mediante obstruccin de luz. La
verificacin del mtodo puede ser necesaria para garantizar la idoneidad de los procedimientos de manejo de la muestra y el
desempeo del mtodo para cada medicamento.
En las pruebas descritas a continuacin, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o grupo de unidades para
determinar la presencia de partculas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que an no han sido analizadas. Por
consiguiente, se deben desarrollar planes de muestreo basndose en factores operativos conocidos para sustentar inferencias
vlidas derivadas de los datos observados a fin de caracterizar el nivel de partculas en un grupo grande de unidades. Los planes de muestreo se deben basar considerando el volumen de producto, nmero de partculas histricamente encontradas en
comparacin con los lmites, distribucin del tamao de partcula y variabilidad de los recuentos de partculas entre unidades.
Los productos que se usan con un filtro final durante su administracin (en lnea) estn exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos cientficos para justificar la exencin.
Slo para propsitos de informacin, los analistas pueden referirse al captulo 1045, el cual puede ser til, aunque no obligatorio.
USP 38
Pruebas Fsicas / 787 Partculas Subvisibles en Inyectables 587
PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Los analistas deben usar un instrumento adecuado que se base en el principio de bloqueo de luz y que permita una determinacin automtica del tamao y del nmero de partculas.
El sensor seleccionado debe ser apropiado para el intervalo de tamao de partcula que se quiere determinar y el nmero de
partculas esperado. Diversas etapas de estandarizacin, tales como exactitud del volumen de muestra, velocidad de flujo de la
muestra, resolucin del sensor, calibracin y exactitud del recuento de partculas, resultan importantes para la operacin apropiada del aparato y se discuten con mayor detalle en el captulo de informacin general Mtodos para la Determinacin de Partculas en Inyectables y Soluciones Oftlmicas 1788.2
Para propsitos de calibracin del equipo, usar estndares de tamao de partcula rastreables al NIST o estndares rastreables equivalentes; ver el captulo 1788. Estos estndares por lo general son de entre 2 y 100 mm. Los analistas deberan verificar el desempeo del aparato usando el ER Recuento de Partculas USP dispersado en agua exenta de partculas usando un
volumen apropiado. Se debe tener cuidado de evitar la aglomeracin de partculas durante la dispersin en el proceso de calibracin. La definicin de Agua Exenta de Partculas se encuentra en la seccin introductoria de Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Precauciones Generales
Etapas Preparatorias
El material de vidrio seleccionado para el mtodo debe ser adecuado para el volumen de las alcuotas de blanco y de muestra, permitir un mezclado fcil y una limpieza repetitiva a fin de prevenir cualquier contribucin significativa a los recuentos de
partculas. Por lo regular, se utilizan vasos dedicados nica y exclusivamente para esta prueba. La limpieza y enjuague del material de vidrio del mtodo debe realizarse en una zona contigua al rea del recuento.
El rea de trabajo y el equipo deben estar separados del trfico general del laboratorio. Debe disponerse de un buen suministro de agua filtrada (que cumpla con el requisito de Agua Exenta de Partculas) y de un equipo de soporte mantenido en
buenas condiciones para el trabajo de rutina. Consultar el captulo de informacin general 1788.2
Se recomiendan dos tipos de controles del sistema: una Prueba Blanco y una Verificacin de la Aptitud del Sistema.
1. La Prueba Blanco involucra lo siguiente:
a. La que se realiza al inicio del da o del anlisis para asegurar que se ha tenido especial cuidado durante la preparacin
del sitio y del aparato que se va a usar (Blanco Ambiental).
b. Todos los blancos adicionales que se realizan durante el da (por ejemplo entre familias de productos) tambin deben
cumplir con los requisitos de la Prueba Blanco (Blanco de Procedimiento).
2. La Verificacin de la Aptitud del Sistema se realiza para verificar el recuento/mL apropiado y la relacin con respecto al ER
Recuento de Partculas USP vigente o el estndar comercial equivalente. Ver el captulo de informacin general 1788.2
Prueba Blanco
La siguiente prueba se lleva a cabo para verificar que (a) el ambiente es adecuado para la prueba, (b) el material de vidrio se
ha limpiado apropiadamente y que (c) el agua o disolvente adecuado que se va a usar se encuentra exento de partculas (b y c
constituyen el blanco). Determinar el recuento en cinco alcuotas de agua exenta de partculas o disolvente adecuado desgasificados, que sean representativas del volumen de prueba del producto (pero no menos de 1 mL). Si el nmero de partculas
con un tamao de 10 mm o mayor excede de 1 partcula por mL para el volumen combinado de las alcuotas, entonces no han
sido suficientes las precauciones tomadas para la prueba. Repetir las etapas preparatorias hasta que el entorno, el material de
vidrio y el agua sean adecuados para la determinacin de la prueba. En principio, la Prueba Blanco debe realizarse cada da
(entorno) y se recomienda durante toda la rutina diaria, en especial entre familias de productos (procedimiento).
Verificacin de la Aptitud del Sistema

Para verificar la aptitud del sistema, el Agua Exenta de Partculas y el ER Recuento de Partculas USP o la suspensin acuosa
estndar comercial equivalente se analizan en el mismo tipo de envase, o similar a los de las muestras de producto, se desgasifican de la misma manera y, por lo general, se manipulan de la misma manera que el artculo de prueba. Asegurar que el siste2
Slo para propsitos de informacin, los analistas pueden referirse al captulo 1788, el cual puede ser til, aunque no obligatorio.
Captulos
Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten el ingreso de partculas, de preferencia en una cabina de flujo laminar. Se
debe limpiar y manipular adecuadamente todo el material de vidrio y el equipo usado para evitar la introduccin de partculas.
Se debe tener cuidado de minimizar la agitacin y dems situaciones de estrs para las preparaciones (para lquidos o polvos
reconstituidos) y de prevenir la introduccin de burbujas de aire en la preparacin en anlisis. Esto ltimo es de particular importancia al combinar o transferir las preparaciones al recipiente en el que se llevar a cabo la determinacin.
588 787 Partculas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Fsicas
USP 38
ma puede cumplir con el requisito de la Prueba Blanco. Determinar las partculas en una muestra del ER Recuento de Partculas
USP que corresponda al volumen de prueba del producto, de acuerdo con el mtodo descrito a continuacin. Los resultados
obtenidos de la Preparacin estndar deben caer dentro de las especificaciones establecidas del Estndar de Referencia.
Captulos
Mtodo
Las muestras de producto se analizan de la manera que represente la entrega lo ms adecuadamente posible (p.ej., el contenido descargado de una jeringa). Para productos parenterales con un volumen suficiente (es decir, un volumen lo suficientemente grande para facilitar el anlisis), el anlisis de unidades individuales tiene a menudo un carcter diagnstico. Para productos parenterales que no cuentan con un volumen suficiente, mezclar con cuidado y de manera minuciosa cada unidad,
luego combinar el contenido de un nmero adecuado de unidades en un recipiente distinto para obtener el volumen requerido para una sola prueba (por lo general, 0,25,0 mL). Si se lleva a cabo una dilucin, asegurar que el recipiente del blanco
tenga un volumen suficiente para el producto y los diluyentes y que se introduzca el menor nmero de partculas posible durante el proceso. Abrir cada unidad con cuidado, retirar el cierre sellante y evitar la contaminacin del contenido antes del
muestreo, de la dilucin o, si fuera necesario, de la combinacin.
Cuando se especifique un disolvente del producto, p.ej., para slidos liofilizados o polvos para uso parenteral, la reconstitucin o dilucin debe realizarse con la cantidad apropiada de disolvente especificado. En este caso, se puede analizar el disolvente mismo para asegurar que no representa una fuente significativa de partculas. No se permite restar el recuento de partculas del disolvente al recuento total.
La eliminacin de burbujas de gas es un paso clave, en especial para productos proteinceos que atrapan gas fcilmente. Se
recomiendan dos mtodos: dejar en reposo el fluido del producto bajo presin ambiental o aplicando un vaco suave (p.ej., 75
Torr). Se pueden usar otros mtodos siempre que se demuestre su idoneidad. Se debe evitar el uso de ultrasonido.
Una vez que las muestras han sido desgasificadas, se deben volver a mezclar suavemente para suspender todas las partculas,
mezclando suavemente, pero de manera minuciosa, el contenido de la muestra usando medios adecuados, tal como la agitacin manual del envase por rotacin suave y lenta. No es recomendable mezclar el fluido del producto mediante inversin en
ningn momento.
Inmediatamente despus de mezclar, retirar no menos de cuatro alcuotas, cada una con un volumen apropiado para la capacidad del instrumento (por lo general, 0,25,0 mL). Contar el nmero de partculas que estn por encima del intervalo de
tamao seleccionado, incluyendo las partculas con tamaos iguales o mayores de 10 y 25 mm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera alcuota y calcular el nmero promedio de partculas en cada intervalo de tamao para las alcuotas remanentes de la preparacin en anlisis. Asimismo, se puede aplicar un volumen de tara para controlar el muestreo que
debe ser representativo del intervalo dinmico del sensor y del volumen de la aguja.
Se permite diluir siempre que se demuestre que el diluyente y los mtodos son apropiados y que se utilice el menor nivel de
dilucin que permita un anlisis reproducible. En ciertas circunstancias, puede ser necesario diluir las muestras para obtener
resultados confiables. ste puede ser el caso de productos con altas concentraciones y/o productos de alta viscosidad que no
se puedan retirar para su transferencia apropiada al instrumento; productos que ocasionen la saturacin del sensor del instrumento debido a recuentos elevados, en especial para los intervalos de tamao menores de 10 mm; y en casos en los que la alta
concentracin resulte en diferencias muy pequeas en el ndice de refraccin entre la solucin y los agregados proteicos, entre
otros. En situaciones en las que se lleve a cabo la dilucin de la muestra, se debe demostrar que la dilucin y la aptitud del
esquema de dilucin seleccionado, incluida la seleccin del diluyente, estn justificadas. La aptitud del esquema de dilucin y
del diluyente se puede evaluar demostrando la uniformidad de los resultados a lo largo de un intervalo de dilucin. Se deben
considerar estudios que relacionen el recuento de partculas con y sin dilucin en los intervalos de tamao esperados. Asimismo, se deberan realizar estudios que exploren el impacto de la dilucin sobre la reduccin del nmero de agregados o el incremento de las partculas debidas a los cambios en la proporcin de protena con respecto a los excipientes. Se puede verificar el impacto de la dilucin usando una tcnica ortogonal para justificar la aptitud del mtodo.
Evaluacin
Los valores siguientes se derivan histricamente de los captulos generales 788 y 789. Si las especificaciones son distintas
a las establecidas a continuacin, se indicarn en las monografas individuales siempre que estuvieran disponibles.
Para productos parenterales que son inyectables de protenas teraputicas para infusin o inyeccin provistos en envases con
un contenido nominal menor o igual a 100 mL:
El nmero promedio de partculas con un tamao igual o mayor de 10 mm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 6000 por envase,
y las de tamao igual o mayor de 25 mm no debe exceder de 600.
USP 38
Pruebas Fsicas / 788 Partculas en Inyectables 589
Para inyectables de protenas teraputicas provistos en envases con un contenido nominal de ms de 100 mL, y preparaciones o inyectables para infusin parenteral con un contenido nominal de ms de 100 mL:
El nmero promedio de partculas con un tamao igual o mayor de 10 mm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 25/mL, y las de
tamao igual o mayor de 25 mm no debe exceder de 3/mL. Asimismo, la carga total de partculas con un tamao igual o mayor de 10 mm no debe
exceder de 6000 por envase y las de tamao igual o mayor de 25 mm no debe exceder de 600 por envase.
Los productos que se usan con un filtro final durante su administracin (en lnea) estn exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos cientficos para justificar la exencin. No obstante, se espera que los filtrados cumplan con este captulo. Para productos que se proveen en <100 mL o que se reconstituyen primero en <100 mL y luego se diluyen para infusin
en un volumen >100 mL, se debe evaluar el contenido de partculas antes y despus de la dilucin, y evaluarse segn su volumen final.
PRUEBA DE RECUENTO MICROSCPICO DE PARTCULAS
788 PARTCULAS EN INYECTABLES

Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningn cambio unilateral a este captulo armonizado. Las partes del texto de este captulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, estn indicadas
con smbolos () para especificar este hecho.
Las partculas en inyectables e infusiones parenterales consisten en partculas no disueltas mviles extraas, que no son burbujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones.
Segn se indica en Inyectables 1, las soluciones para inyeccin que se administran por va intramuscular o subcutnea deben cumplir con los requisitos de Partculas en Inyectables 788. Este requisito ha sido pospuesto indefinidamente para productos de uso veterinario. Las preparaciones parenterales envasadas y etiquetadas exclusivamente para usar como soluciones de
irrigacin estn exentas de los requisitos de Partculas en Inyectables 788. Las preparaciones radiofarmacuticas estn exentas
de los requisitos de Partculas en Inyectables 788. Los productos parenterales cuyo etiquetado especifica el uso de un filtro
final antes de la administracin estn exentos de los requisitos de Partculas en Inyectables 788, siempre que se disponga de
datos cientficos que justifiquen dicha exencin.
Para la determinacin de las partculas, se especifican a continuacin dos procedimientos, el Mtodo 1 (Prueba de Conteo de
Partculas por Obstruccin de Luz) y el Mtodo 2 (Prueba de Conteo Microscpico de Partculas). Cuando se examinan inyecciones
e infusiones parenterales para detectar la presencia de partculas subvisibles, es preferible aplicar el Mtodo 1. Sin embargo,
puede ser necesario analizar algunas preparaciones mediante la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz seguida
de la Prueba de Conteo Microscpico de Partculas para determinar en forma concluyente si cumple con los requisitos.
No todas las preparaciones parenterales se pueden examinar con uno de estos mtodos o con ambos para detectar la presencia de partculas subvisibles. Cuando el Mtodo 1 no es aplicable, p.ej., en el caso de preparaciones que presenten una
transparencia reducida o una viscosidad aumentada, se debe llevar a cabo la prueba segn el Mtodo 2. Las emulsiones, coloides y preparaciones liposomales son algunos ejemplos. De la misma manera, los productos que producen burbujas de aire u
otro gas cuando se aspiran dentro del sensor tambin pueden requerir un anlisis de conteo microscpico de partculas. Si la
viscosidad de la preparacin a analizar es lo suficientemente alta como para impedir el anlisis por cualquiera de los dos mtodos, se puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir su viscosidad, segn sea necesario, y
as permitir la realizacin del anlisis.
Los resultados obtenidos al analizar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partculas no
pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias vlidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partculas en un grupo grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadsticamente confiables.
A los fines de este captulo, preparacin parenteral de pequeo volumen es sinnimo de inyeccin de pequeo volumen, y
preparacin parenteral de gran volumen es sinnimo de inyeccin de gran volumen.
Captulos
Como se indic anteriormente, el mtodo de obstruccin de luz es el mtodo preferido para inyectables de protenas teraputicas e infusiones parenterales. No obstante, se puede usar el mtodo microscpico cuando resulte necesario, como en el
caso de la determinacin exclusiva de partculas de tipo extrnseco e intrnseco. Sin embargo, al utilizar este mtodo, se debe
demostrar que tambin se estn contando otras clases de partculas (p.ej., inherentes). Para la determinacin de la aceptabilidad del producto, aplicar los lmites para la prueba microscpica con membrana del captulo general 788. Debido a la interferencia de algunas partculas de protenas y de sus caractersticas fsicas (frgiles o translcidas), los resultados de la Prueba de
Conteo Microscpico de Partculas no son equivalentes a los de la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz, y dichos
mtodos no pueden considerarse intercambiables.
590 788 Partculas en Inyectables / Pruebas Fsicas
USP 38
MTODO 1 PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Usar un aparato adecuado basado en el principio de bloqueo de la luz que permita una determinacin automtica del tamao de las partculas y el nmero de partculas segn el tamao. La definicin de agua exenta de partculas se proporciona en
Especificaciones de ReactivosReactivos, Indicadores y Soluciones.
Calibrar el aparato usando dispersiones que contengan partculas esfricas de tamaos conocidos entre 10 mm y 25 mm. Dispersar el estndar de partculas en agua exenta de partculas. Se deben tomar las precauciones necesarias para evitar el agregado de partculas durante la dispersin. La aptitud del sistema puede verificarse usando el ER Partculas para Conteo USP.
Captulos
Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partculas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y equipo de filtracin usados, excepto los filtros de membrana, con una
solucin de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmediatamente antes de usar, enjuagar el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de partculas.
Procurar no introducir burbujas de aire en la preparacin a analizar, especialmente cuando se transfieren porciones de la
preparacin al recipiente en el cual se llevar a cabo la determinacin.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio se ha limpiado correctamente y que el
agua a usar se encuentra exenta de partculas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partculas en cinco
muestras de agua exenta de partculas de 5 mL cada una, segn el mtodo que se describe ms adelante. Si el nmero de
partculas con un tamao igual o mayor de 10 mm excede de 25 para la muestra combinada de 25 mL, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio y
agua sean adecuados para la prueba.
Mtodo
Mezclar el contenido de la muestra invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosamente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partculas y quitar el cierre, evitando la contaminacin del contenido. Eliminar las burbujas gaseosas mediante las medidas
apropiadas tales como dejar en reposo durante 2 minutos o someter a ultrasonido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pequeo volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 10 o ms unidades en un recipiente limpio para obtener un
volumen de no menos de 25 mL; la solucin de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un nmero adecuado de
viales y diluyndolo hasta 25 mL con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas adecuado cuando el
agua exenta de partculas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o
ms pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas apropiado
cuando el agua exenta de partculas no es adecuada.
En el caso de envases a granel para farmacias para uso parenteral etiquetados con la leyenda No Destinado para Infusin
Directa, proceder segn se indica para preparaciones parenterales de pequeo volumen cuando el volumen sea 25 mL o ms.
Calcular el resultado de la prueba en una porcin que sea equivalente a la dosis mxima provista en el etiquetado. Por ejemplo, si el volumen total del envase a granel es 100 mL y el volumen de dosis mxima es 10 mL, entonces el conteo promedio
de partculas por mL se multiplicara por 10 para obtener el resultado de prueba basndose en la dosis mxima de 10 mL.
[NOTAPara los clculos de los resultados de la prueba, considerar esta porcin de dosis mxima equivalente al contenido de
un envase lleno.]
Los productos envasados con compartimentos duales diseados para contener un producto farmacutico y un disolvente
deben ser preparados y analizados segn se indica para preparaciones parenterales de gran volumen o preparaciones parenterales de pequeo volumen, dependiendo del volumen del envase. Mezclar cada unidad segn se indica en el etiquetado, activando y agitando para asegurar el mezclado minucioso de los componentes individuales y la disolucin del medicamento.
El nmero de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluacin estadsticamente vlida. Para preparaciones parenterales de gran volumen o de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o ms, se pueden analizar menos de
10 unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Tomar cuatro porciones, de no menos de 5 mL cada una, y contar el nmero de partculas iguales o mayores de 10 mm y 25
mm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porcin y calcular el nmero medio de partculas para la preparacin a examinar.
USP 38
Pruebas Fsicas / 788 Partculas en Inyectables 591
Evaluacin
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de ms de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
1.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
1.B.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 1.B.
[NOTALa Farmacopea Japonesa usa la Prueba 1.A..]
Si el nmero promedio de partculas excede los lmites, analizar la preparacin mediante la Prueba de Conteo Microscpico de
Partculas.
Prueba 1.A (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de ms de 100 mL)La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presentes en las unidades analizadas no excede de 25 partculas iguales o mayores de 10 mm por mL y no excede de 3 partculas iguales o mayores de 25 mm
por mL.
Prueba 1.B (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 100 mL)La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presentes en las unidades
analizadas no excede de 6000 partculas iguales o mayores de 10 mm por envase y no excede de 600 partculas iguales o mayores de 25 mm por envase.
MTODO 2 PRUEBA DE CONTEO MICROSCPICO DE PARTCULAS
Fig. 1. Retcula circular para la medicin del dimetro de partculas. El crculo grande que est dividido por filamentos en
cuadrantes se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en ingls). Los crculos transparentes y de color negro, con dimetros de 10 mm y 25 mm en 100, se proporcionan como elementos de comparacin para clasificar las partculas por tamao.
Se requieren dos iluminadores. Uno es un iluminador episcpico interno de campo brillante, el otro es un auxiliar externo de
foco regulable para dar iluminacin oblicua reflejada en un ngulo de incidencia de 1020.
El dispositivo de filtracin para retener las partculas consiste en un soporte de filtro, de vidrio u otro material adecuado,
provisto de una fuente de vaco y un filtro de membrana adecuado.
El filtro de membrana tiene un tamao adecuado, de color negro o gris oscuro, reticulado o no y con un tamao nominal
de poro de 1,0 mm o menor.
Captulos
Usar un microscopio binocular adecuado, un dispositivo de filtracin para retener partculas y un filtro de membrana para el
anlisis.
Ajustar el microscopio con aumentos de 100 10 y equiparlo con un micrmetro ocular calibrado con un micrmetro objetivo, una platina mecnica capaz de sostener y recorrer toda la superficie de filtracin del filtro de membrana y dos iluminadores adecuados para proporcionar iluminacin episcpica adems de la iluminacin oblicua.
El micrmetro ocular es una retcula circular para la medicin del dimetro de partculas (ver la Figura 1) y consiste en un
crculo grande que tiene filamentos sealadores que lo dividen en cuadrantes, crculos de referencia transparentes y de color
negro, con dimetros de 10 mm y 25 mm en aumentos de 100, y una escala lineal con graduaciones en incrementos de 10
mm. Calibrar empleando un micrmetro de platina, certificado por una institucin de normalizacin nacional o internacional.
Un error relativo de la escala lineal de la retcula dentro de 2% es aceptable. El crculo grande se denomina campo reticular
(GFOV, por sus siglas en ingls).
592 788 Partculas en Inyectables / Pruebas Fsicas
USP 38
Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partculas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y de ensamblaje para filtracin usados, excepto los filtros de membrana,
con una solucin de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente.
Inmediatamente antes de usar, enjuagar ambos lados del filtro de membrana y el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y
luego por adentro, con agua exenta de partculas.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio y el filtro de membrana se han limpiado
correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partculas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partculas en 50 mL de agua exenta de partculas, segn el mtodo que se describe ms adelante. Si ms de 20 partculas
con un tamao igual o mayor de 10 mm o si ms de cinco partculas con un tamao igual o mayor de 25 mm estn presentes
dentro del rea de filtracin, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio, filtro de membrana y agua sean adecuados para la prueba.
Captulos
Mtodo
Mezclar el contenido de las muestras invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosamente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partculas y quitar el cierre, evitando la contaminacin del contenido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pequeo volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 10 o ms unidades en un recipiente limpio; la solucin de
prueba puede prepararse mezclando el contenido de un nmero adecuado de viales y diluyndolo hasta 25 mL con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas apropiado cuando el agua exenta de partculas no es adecuada. Las
preparaciones parenterales de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o ms pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partculas o con un disolvente exento de partculas adecuado
cuando el agua exenta de partculas no es adecuada.
El nmero de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluacin estadsticamente vlida. Para preparaciones parenterales de gran volumen o de pequeo volumen con un volumen de 25 mL o ms, se pueden analizar menos de
10 unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Humedecer con varios mL de agua exenta de partculas el interior del soporte de filtro provisto con el filtro de membrana.
Transferir al embudo de filtracin el volumen total de una solucin combinada o una unidad individual y aplicar vaco. Si fuera
necesario, agregar gradualmente porciones de la solucin hasta filtrar todo el volumen. Despus de la ltima adicin de solucin, empezar a enjuagar las paredes internas del soporte de filtro empleando un chorro de agua exenta de partculas. Mantener el vaco hasta que la superficie del filtro de membrana se encuentre exenta de lquidos. Colocar el filtro de membrana en
una placa de Petri y dejarlo secar al aire con la tapa ligeramente abierta. Despus de que el filtro de membrana se haya secado,
colocar la placa de Petri en la platina del microscopio, recorrer todo el filtro de membrana bajo la luz reflejada por un dispositivo de iluminacin y contar el nmero de partculas mayores o iguales a 10 mm y el nmero de partculas mayores o iguales a
25 mm. Como alternativa, se permite el conteo parcial del filtro de membrana y la determinacin del conteo total del filtro por
clculos. Calcular el nmero medio de partculas para la preparacin que se va a analizar.
El proceso de medicin del tamao de partculas usando la retcula circular se lleva a cabo estimando el dimetro equivalente de la partcula en comparacin con los crculos de referencia de 10 mm y 25 mm de la retcula. De esta forma, no se mueven
las partculas de sus lugares originales dentro del campo reticular y no se superponen en los crculos de referencia para la comparacin. El dimetro interno de los crculos de referencia transparentes de la retcula se usa para medir las partculas blancas y
transparentes, mientras que el dimetro externo de los crculos de referencia negro opaco de la retcula se usa para medir el
tamao de las partculas oscuras.
Cuando se realiza la Prueba de Conteo Microscpico de Partculas, no se debe intentar la medicin o el conteo de materiales
amorfos, semilquidos, o morfolgicamente indiferenciados y que tengan la apariencia de una mancha o decoloracin en el
filtro de membrana. Estos materiales muestran poco o ningn relieve y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una
pelcula. En tales casos, puede facilitarse la interpretacin del conteo analizando una muestra de la solucin mediante la Prueba
de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz.
Evaluacin
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de ms de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.B.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.B.
[NOTALa Farmacopea Japonesa usa la Prueba 2.A.]
USP 38
Pruebas Fsicas / 789 Partculas en Soluciones Oftlmicas 593
Prueba 2.A (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de ms de 100 mL)La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades analizadas no excede de 12 partculas iguales o mayores de 10 mm por mL y no excede de 2 partculas iguales o mayores de 25 mm
por mL.
Prueba 2.B (Soluciones para infusin parenteral o soluciones para inyeccin suministradas en envases con un contenido nominal
de menos de 100 mL)La preparacin cumple con la prueba si el nmero promedio de partculas presente en las unidades
analizadas no excede de 3000 partculas iguales o mayores de 10 mm por envase y no excede de 300 partculas iguales o mayores de 25 mm por envase.
789 PARTCULAS EN SOLUCIONES OFTLMICAS
PRUEBA DE CONTEO DE PARTCULAS POR OBSTRUCCIN DE LUZ

Esta prueba se aplica a las soluciones oftlmicas, incluidas las soluciones que han sido reconstituidas a partir de slidos estriles, para los cuales se especifica una prueba de deteccin de Partculas en la monografa individual. La prueba cuenta las partculas slidas o lquidas en suspensin.
Aparato de Prueba, Normalizacin del Instrumento, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y ClculosProceder como se indica en la Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz en Partculas en Inyectables 788.
InterpretacinLa solucin oftlmica cumple con los requisitos de la prueba si el nmero promedio de partculas presente
en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 1. Si el nmero promedio de partculas
excede del lmite, analizar el artculo mediante la Prueba de Conteo de Partculas Microscpicas.
Captulos
Las partculas estn formadas por sustancias extraas, mviles, de diversos orgenes, que no son burbujas de gas, que no
pueden cuantificarse por medio de un anlisis qumico debido a la pequea cantidad de material que representan y debido a
su composicin heterognea. Las soluciones oftlmicas deben estar esencialmente exentas de partculas que se puedan observar en una inspeccin visual. Las pruebas aqu descritas son pruebas fsicas desarrolladas con el propsito de contar las partculas extraas dentro de intervalos especficos de tamao.
Cada solucin oftlmica para la cual la monografa incluya una prueba para Partculas est sujeta a los lmites de partculas
establecidos para la prueba que se est aplicando, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Cuando sean adecuados lmites ms altos, stos estarn especificados en la monografa individual. Las preparaciones oftlmicas
que sean suspensiones, emulsiones o geles estn exentas de estos requisitos, al igual que lo estn los dispositivos mdicos.
Consultar la monografa especfica cuando surja alguna duda sobre la aplicacin de la prueba.
Los procedimientos de obstruccin de luz y microscpico para la determinacin de partculas en soluciones oftlmicas son
idnticos a los de las inyecciones; por lo tanto, cuando corresponda, habr una referencia cruzada con Partculas en Inyectables
788. Este captulo describe un mtodo de prueba consistente en dos etapas. En primer lugar, la solucin oftlmica se analiza
por medio del procedimiento de obstruccin la luz (etapa 1). Si no cumple con los lmites establecidos, se debe pasar a la
prueba microscpica (etapa 2) con sus lmites propios. Cuando por razones tcnicas la solucin oftlmica no pueda ser analizada por obstruccin de luz, se podr utilizar la prueba microscpica exclusivamente. Se requiere documentacin que demuestre
que no se puede analizar la solucin oftlmica por el procedimiento de obstruccin de luz, o que ste produce resultados invlidos.
Se espera que la mayora de los artculos cumplan con los requisitos usando simplemente la prueba de obstruccin de luz;
sin embargo podra ser necesario someter algunos artculos a la prueba de obstruccin de luz seguida de la prueba microscpica para determinar en forma concluyente si se cumple con los requisitos. Todo producto que no sea una solucin pura y que
tenga una transparencia y viscosidad que se aproximen a las del agua puede proporcionar datos errneos cuando se lo analiza
con el mtodo de conteo por obstruccin de luz. Estos materiales pueden analizarse por medio del mtodo de conteo microscpico. En ciertos casos, la viscosidad de un material a analizar puede ser lo suficientemente alta como para impedir el anlisis
por cualquiera de los dos mtodos de prueba. En este caso, se puede realizar una dilucin cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir la viscosidad lo necesario y permitir la realizacin del anlisis.
En las pruebas descritas a continuacin, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o un grupo de unidades
para detectar la presencia de partculas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo
tanto, si se desean realizar inferencias vlidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partculas en un grupo grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadsticamente confiables basados en factores de operacin
conocidos. Los planes de muestreo deben basarse en el volumen de producto, el nmero de partculas encontrado histricamente en comparacin con los lmites, la distribucin de tamaos de partculas presentes y la variabilidad del conteo de partculas entre unidades.
594 789 Partculas en Soluciones Oftlmicas / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 1. Prueba de Conteo de Partculas por Obstruccin de Luz

Dimetro
Nmero de partculas
10 mm
25 mm
50 por mL
5 por mL
Captulos
PRUEBA DE CONTEO MICROSCPICO DE PARTCULAS

Algunos artculos no pueden analizarse en forma satisfactoria con el mtodo de obstruccin de luz. En dichos casos, las monografas individuales especifican claramente que slo se debe realizar un recuento microscpico de partculas. La prueba de
recuento de partculas microscpicas enumera partculas subvisibles, esencialmente slidas, en soluciones oftlmicas, luego de
recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa. Algunas soluciones oftlmicas, tales como soluciones que no se filtran
fcilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de anlisis utilizando la prueba microscpica.
Cuando se realiza la prueba microscpica, no se debe intentar la medicin o el conteo de materiales amorfos, semilquidos o
morfolgicamente indiferenciados de algn otro modo y que tengan la apariencia de una mancha o coloracin en la superficie
de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningn relieve en la superficie y presentan un aspecto gelatinoso o similar
al de una pelcula. Debido a que este material en solucin consiste en unidades en el orden de 1 mm o menores, que se pueden contar slo despus de la agregacin o deformacin en una membrana analtica, puede facilitarse la interpretacin del
recuento analizando una muestra de la solucin por medio del mtodo de recuento de partculas por obstruccin de luz.
Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Enumeracin de PartculasProceder segn se
indica para la Prueba de Conteo de Partculas Microscpicas en Partculas en Inyectables 788.
InterpretacinLa solucin oftlmica cumple con los requisitos de la prueba si el nmero promedio de partculas presente
en las unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 2.
Tabla 2. Conteo de Partculas por Mtodo Microscpico
Dimetro
Nmero de partculas
10 mm
25 mm
50 mm
50 por mL
5 por mL
2 por mL
790 PARTCULAS VISIBLES EN INYECTABLES

Todos los productos destinados para administracin parenteral deben inspeccionarse visualmente para determinar la presencia de partculas conforme a lo especificado en el captulo Inyectables 1. Los slidos secos, a partir de los cuales se preparan
las soluciones reconstituidas para inyeccin, cumplen con los requisitos para Soluciones Reconstituidas del captulo Inyectables
1 cuando se preparan justo antes de su uso. A lo largo de este captulo, el trmino esencialmente libre de significa que, cuando los medicamentos inyectables se inspeccionan conforme a lo descrito en este captulo, no se observan partculas visibles en
un nmero de unidades mayor al especificado. Las partculas se definen en el captulo Partculas en Inyectables 788 como
partculas extraas mviles no disueltas, que no son burbujas de gases, involuntariamente presentes en las soluciones. Entre los
ejemplos de dichas partculas se incluye, entre otros, fibras, vidrio, metal, materiales elastomricos y precipitados. No obstante,
algunos productos, tales como los derivados de protenas, pueden contener partculas inherentes o aglomerados; en tales casos, los requisitos para partculas visibles se especifican en la monografa individual o en la solicitud aprobada segn los reglamentos.
Cuando las caractersticas del contenido o del sistema de envasecierre limita la capacidad de inspeccin del contenido total, se debe inspeccionar una muestra de los envases de la partida como complemento de la inspeccin al 100%, mediante la
inspeccin del contenido reconstituido o retirado de los envases (polvos secos, envases mbar oscuros, suspensiones, o lquidos con colores intensos) de una muestra de los envases de la partida. Las caractersticas destructivas de estas pruebas requiere
el uso de una muestra ms pequea1 que el muestreo aceptable tradicionalmente utilizado en pruebas no destructivas luego
de la inspeccin al 100%. Aunque las pruebas descritas en este captulo pueden ser tiles durante la realizacin de estudios
para examinar la estabilidad del producto, este captulo no pretende establecer requisitos nuevos de anlisis para estudios de
estabilidad.
Procedimiento de Inspeccin
Cuando se usa junto con una inspeccin al 100% durante el proceso de fabricacin, este procedimiento resulta suficiente
para demostrar que la partida est esencialmente exenta de partculas visibles. No obstante, un programa completo para el
control y monitoreo de partculas contina siendo un prerrequisito esencial.
1 Los planes de muestreo con niveles especiales descritos en las normas ANSI/ASQ Z1.42008 o ISO 2859 son apropiados para su uso como guas en la seleccin
del tamao de la muestra y de los criterios de aceptacin para este propsito.
Pruebas Fsicas / 791 pH 595
USP 38
Las unidades inspeccionadas deben estar exentas de partculas visibles cuando se examinan sin aumento (excepto la correccin ptica, segn se requiera para establecer una visin normal) contra un fondo negro y contra un fondo blanco. La iluminacin en el punto de inspeccin se mantiene a una intensidad mnima de entre 2000 y 3750 lux, lo cual se puede lograr mediante el uso de dos lmparas fluorescentes de 13 W 15 W (p.ej., F13/T5 F15/T8). Se recomienda el uso de un balastro de
alta frecuencia para reducir el parpadeo de las lmparas fluorescentes. Asimismo, son aceptables las fuentes de luz alternativas
(p.ej., incandescentes, diodo emisor de luz o LED, por sus siglas en ingls) que proveen iluminacin en el punto de inspeccin
dentro del intervalo de intensidad mnimo especificado. Se recomienda una intensidad de iluminacin mayor para examinar
soluciones coloreadas o productos en envases de materiales diferentes al vidrio transparente.
Antes de realizar la inspeccin, retirar cualquier etiqueta adherida al envase, y lavar y secar el exterior del mismo. La unidad
que se va a inspeccionar debe agitarse por rotacin suave y/o invertirse, asegurando que no se produzcan burbujas de aire, e
inspeccionarse durante aproximadamente 5 segundos contra cada fondo. Se debe registrar la presencia de cualquier partcula.
Muestreo para la Liberacin de Partidas (A Continuacin de la Inspeccin al 100% de la

Fabricacin)
Muestrear e inspeccionar la partida usando las normas ANSI/ASQ Z1.4 ( ISO 2859-1). Inspeccin General de Nivel II, planes
de muestreo individual para inspeccin normal con un lmite de calidad de aceptacin (AQL, por sus siglas en ingls) de
0,65%. Resultan aceptables los planes de muestreo alternativos con una proteccin equivalente o mejor. No ms que el nmero de unidades especificadas contiene partculas visibles.
Producto en Distribucin2
791 pH
INTRODUCCIN
Para propsitos farmacopeicos, el pH se define como el valor dado por un sensor potenciomtrico adecuado, apropiadamente estandarizado, y un sistema de medicin. [NOTAEl sistema de medicin comnmente recibe el nombre de medidor
de pH. Aunque el medidor de pH an es de uso comn, el sistema de medicin tambin puede incluirse dentro del sensor de
pH y la seal de pH se puede transmitir de manera digital a un dispositivo externo tal como una computadora, Controlador
Lgico Programable (PLC, por sus siglas en ingls), Sistema de Control Distribuido (DCS, por sus siglas en ingls), sistema de
adquisicin de datos, terminal u otro dispositivo controlado por microprocesador.] Por definicin, el pH es igual a log10[aH+]
donde aH+ es la actividad del hidrgeno (H+) o del in hidronio (H3O+) y la actividad de iones de hidrgeno se aproxima de
manera muy cercana a la concentracin de iones de hidrgeno.
La escala prctica del pH se define de la manera siguiente:
pH = pHs + [(E ES)/k]
E = potencial medido cuando la celda galvnica contiene la solucin en anlisis (pH)
ES = potencial medido cuando la celda galvnica contiene la solucin amortiguadora de normalizacin apropiada (pHs)
k = cambio en el potencial por cambio de unidad en el pH y se deriva de la ecuacin de Nernst (segn se indica a continuacin)
k = loge(10) (RT/nF)
R = 8,314 J/mol/K
T = temperatura (K)
n = moles por reaccin media
F = constante de Faraday, 96485 C/mol
La ecuacin resultante es [0,05916 + 0,0001984(T 25)] voltios a la temperatura T. Los valores de k de 1535 se proveen
en la Tabla 1.
2 El anlisis descrito en Producto en Distribucin es permisible nicamente si el Muestreo para la Liberacin de Partidas (A Continuacin de la Inspeccin al 100% de la
Fabricacin) se ha realizado exitosamente.
Captulos
Si fuese necesario evaluar el producto que se ha enviado a los clientes (p.ej., debido a una queja o inters reglamentario),
muestrear e inspeccionar 20 unidades. Si no se observan partculas en la muestra, la partida se considera esencialmente libre
de partculas visibles. Si se encuentran disponibles, pueden examinarse unidades adicionales para obtener mayor informacin
sobre el riesgo de presencia de partculas en la partida.
596 791 pH / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 1. Valores de k para Diversas Temperaturas
Temperatura
(C)
k
(V)
15,00
0,05718
20,00
0,05817
25,00
0,05916
30,00
0,06016
35,00
0,06115
Los valores de k a otras temperaturas pueden determinarse a partir de la ecuacin anterior. Para propsitos prcticos, los
valores de k se determinan a partir de la calibracin del sensor de pH.
Captulos
SISTEMA DE MEDICIN DE pH
El sistema de medicin consta de: (1) un electrodo de medicin sensible a la actividad de los iones hidrgeno, por lo regular
un electrodo de vidrio, aunque son posibles otros tipos de electrodos, (2) un electrodo de referencia adecuado, por ejemplo,
un electrodo de platacloruro de plata y (3) un sistema de medicin de voltaje con una resistencia de entrada capaz de medir
a una impedancia de entrada alta del sensor de pH. El electrodo de medicin y de referencia pueden estar separados o combinados. El sistema de medicin de voltaje puede estar separado del sensor de pH o integrado en el sensor. Para la mayora de
las aplicaciones, ser necesaria una medicin de la temperatura para compensar la influencia de la temperatura descrita anteriormente en la ecuacin de Nernst. Se puede incluir un dispositivo de temperatura en el sensor de pH, o se puede usar un
dispositivo de temperatura externo.
REQUISITOS INSTRUMENTALES
El sistema de medicin debe ser capaz de llevar a cabo una calibracin del pH de 2 puntos (ver ms adelante). La exactitud
del sistema de medicin de pH se describe en la seccin Calibracin. La resolucin del sistema de medicin de pH debe ser al
menos un pH de 0,01. El instrumento deber ser capaz de compensar la temperatura en la medicin del sensor de pH para
convertir la seal de milivoltios en unidades de pH a cualquier temperatura, ya sea de forma automtica usando un dispositivo
de temperatura incorporado en el sistema del sensor o mediante el ingreso manual de la temperatura de la muestra en el sistema de medicin. La exactitud del sistema de medicin de la temperatura deber ser 1 C. La resolucin del sistema de medicin de la temperatura deber ser de al menos 0,1 C. Las mediciones de pH realizadas en laboratorio por lo regular se realizan
a 25 2 C a menos que se especifique de otro modo en la monografa individual o en este captulo. No obstante, resultan
aceptables temperaturas fuera de este rango si la preparacin de las muestras es ms conveniente a temperaturas alternativas.
Los ejemplos de mediciones no realizadas en laboratorio incluyen muestras de prueba del interior de los tubos del proceso,
contenedores y tanques, as como otras condiciones de procesamiento no estndar. [NOTALas definiciones de pH, de la escala de pH y de los valores asignados a las soluciones amortiguadoras de estandarizacin se proveen con el propsito de establecer un sistema prctico y operativo, de modo que los resultados puedan compararse entre laboratorios. Los valores de pH as
medidos no se corresponden exactamente con los obtenidos por la definicin, pH = log aH+, sino que los valores obtenidos
estn estrechamente relacionados con la actividad del in hidrgeno en soluciones acuosas.] [NOTACuando un sistema de
medicin de pH se estandariza usando una solucin amortiguadora acuosa y luego se usa para medir el pH de sistemas no
acuosos, la constante de ionizacin del cido o de la base, la constante dielctrica del medio, el potencial de unin lquida
(que puede originar errores de aproximadamente 1 unidad de pH), as como la respuesta del in hidrgeno del electrodo de
vidrio, cambian totalmente. Por estas razones, los valores as obtenidos con soluciones que slo son de naturaleza parcialmente
acuosa se pueden considerar nicamente como valores aparentes de pH.]
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE NORMALIZACIN DEL SISTEMA DE MEDICIN DE pH

Las soluciones amortiguadoras de normalizacin se preparan conforme a lo indicado en la Tabla 2.1 Las sales amortiguadoras
de pureza requerida se pueden obtener del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa, de otras autoridades nacionales o de
otros proveedores. Las soluciones amortiguadoras deben almacenarse en envases adecuados que aseguren la estabilidad del
pH hasta la fecha de caducidad y que estn equipados con un cierre hermtico. Para soluciones amortiguadoras con valores
superiores a 11, el almacenamiento debe realizarse en envases que sean resistentes al dixido de carbono o que minimicen su
intrusin, ya que esto podra disminuir el pH de la solucin amortiguadora. En el caso de soluciones amortiguadoras con valores menores de 11, deben prepararse en intervalos que no excedan de 3 meses. Las soluciones amortiguadoras con valores
1 Se pueden usar soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente para el sistema de medicin de pH, normalizadas mediante mtodos rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST) u otras autoridades nacionales, cuya etiqueta indique un valor de pH con una exactitud de 0,02 unidades de pH. Se
pueden usar soluciones preparadas a partir de los materiales de grado reactivo de la ACS u otros materiales adecuados, siempre y cuando el pH de la solucin
resultante sea el mismo que el de la solucin preparada a partir del material certificado del NIST (u otras autoridades nacionales). Las soluciones amortiguadoras
con valores superiores a 12 deben usarse inmediatamente o se deben preparar usando agua recientemente calentada a ebullicin y almacenarse en condiciones
que minimicen la absorcin y el ingreso de dixido de carbono.
Pruebas Fsicas / 791 pH 597
USP 38
superiores a 11, comnmente deben prepararse y usarse en el momento a menos que se restrinja el ingreso de dixido de
carbono. Todas las soluciones amortiguadoras deben prepararse usando Agua Purificada. La Tabla 2 indica el pH de las soluciones amortiguadores como una funcin de la temperatura. Las instrucciones presentadas en este captulo estn destinadas a la
preparacin de soluciones con concentraciones molales (m) designadas. Sin embargo, para facilitar su preparacin, las instrucciones se proveen en molaridad. La diferencia entre la concentracin de preparaciones molales y molares para estas soluciones
amortiguadoras es menos del 1% y la diferencia de pH es inapreciable. La calibracin usando soluciones amortiguadoras debe
realizarse en el intervalo de temperatura de las soluciones amortiguadoras citadas en la Tabla 2. [NOTALa compensacin de
temperatura en la ecuacin de Nernst corrige nicamente el cambio que produce la temperatura en los milivoltios de salida
del electrodo, no el cambio real del pH de la solucin amortiguadora con la temperatura, el cual es nico para cada solucin
amortiguadora.] Se encuentran disponibles caractersticas tales como reconocimiento automtico de solucin amortiguadora o
correccin del pHtemperatura de la solucin amortiguadora que proveen la conveniencia al acomodar la influencia de la temperatura sobre las soluciones amortiguadoras. La respuesta de pHtemperatura se puede determinar a partir de los valores de
la Tabla 2.
Tabla 2. Valores de pH de Soluciones Amortiguadoras de Normalizacin
Tartrato
cido de
Potasio
Saturado
a 25
Citrato
Dicido de
Potasio,
0,05 M
Biftalato
de
Potasio,
0,05 m
Fosfato
Equimolal,
0,05 m
Tetra
borato
desodio,
0,01 m
Carbonato
de Sodio,
0,025 M y
Bicarbo
nato deSodio,
0,025 M
Hidrxido
de
Calcio,
Saturado a
25
13,00
10
1,67
4,00
6,92
9,33
15
1,67
3,80
4,00
6,90
7,45
9,28
10,12
12,81
20
1,68
3,79
4,00
6,88
7,43
9,23
10,06
12,63
12,45
25
1,68
3,56
3,78
4,01
6,86
7,41
9,18
10,01
30
1,68
3,55
3,77
4,02
6,85
7,40
9,14
9,97
12,29
35
1,69
3,55
3,76
4,02
6,84
7,39
9,10
9,93
12,13
40
1,69
4,04
6,84
9,07
11,98
45
1,70
4,05
6,83
9,04
11,84
50
1,71
4,06
6,83
9,01
11,71
55
1,72
4,08
6,83
8,99
11,57
60
1,72
4,09
6,84
8,96
11,45
DpH/DC
0,0010
0,0014
0,0022
0,0018
0,0016
0,0028
0,0074
0,0096
0,0310
La preparacin de volmenes alternativos a las mismas concentraciones que las indicadas ms adelante es aceptable.
Tetraoxalato de potasio, 0,05 m: Disolver 12,61 g de KH3(C2O4)2 2H2O y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Tartrato cido de potasio, saturado a 25: Agregar C4H5KO6 a agua hasta exceder la saturacin a 25. Posteriormente,
filtrar o decantar.
Citrato dicido de potasio, 0,05 M: Disolver 11,41 g de C6H7KO4 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Biftalato de potasio, 0,05 m: Disolver 10,12 g de KHC8H4O4, previamente secados a 110 durante 1 hora y diluir con
agua hasta obtener 1000,0 mL.
Fosfato equimolal, 0,05 m: Disolver 3,53 g de Na2HPO4 y 3,39 g de KH2PO4, cada uno previamente secado a 120 durante 2 horas y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Fosfato dicido de potasio, 0,0087 M y fosfato cido disdico, 0,0303 M: Disolver 1,18 g de KH2PO4 y 4,30 g de
Na2HPO4, ambos secados durante 2 horas a 120 2, y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Tetraborato de sodio, 0,01 m: Disolver 3,80 g de Na2B4O7 10H2O y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL. Proteger
de la absorcin de dixido de carbono.
Carbonato de sodio, 0,025 M y bicarbonato de sodio, 0,025 M: Disolver 2,64 g de Na2CO3 y 2,09 g de NaHCO3 y
diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Hidrxido de calcio, saturado a 25: Agregar Ca(OH)2 a agua hasta exceder la saturacin a 25. Usar agua recientemente
calentada a ebullicin y protegida de la atmsfera para limitar la absorcin de dixido de carbono. Posteriormente, filtrar o
decantar.
CALIBRACIN
Debido a las variaciones en la naturaleza y la operacin de los sistemas de medicin de pH disponibles, resulta poco prctico
proveer instrucciones universales para la estandarizacin del sistema de medicin. Sin embargo, los prrafos siguientes establecen los principios generales a seguir. Examinar los electrodos, especialmente el electrodo de referencia y el nivel de electrlito,
Captulos
Temperatura
(C)
Tetra
oxalato
de potasio,
0,05 m
Fosfato
Dicido
de
Potasio,
0,0087 M
y
Fosfato
cido
Disdico,
0,0303 M
Captulos
598 791 pH / Pruebas Fsicas
USP 38
cuando se usa electrlito lquido. Si fuera necesario, volver a llenar el suministro de electrolito y tomar las dems precauciones
indicadas por los fabricantes del instrumento y el electrodo.
La calibracin o verificacin del sistema de medicin de pH debe realizarse peridicamente. El desempeo histrico del sistema de medicin, la criticidad de la medicin de pH, el mantenimiento del sensor de pH y la frecuencia de la operacin de
medicin se usan para determinar la frecuencia de la calibracin/verificacin.
Si el pH de la solucin amortiguadora es sensible al dixido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullicin recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseado para minimizar el
ingreso de dixido de carbono.
1. Para estandarizar el sistema de medicin de pH, seleccionar tres soluciones amortiguadoras de normalizacin, de preferencia las provistas en la Tabla 2, de modo que el pH esperado del material en anlisis caiga dentro de su intervalo. Se
usan dos de las soluciones amortiguadoras para el proceso de calibracin, y la tercera solucin amortiguadora se usa para
la verificacin. El valor de la solucin amortiguadora de verificacin debe estar entre los valores de las soluciones amortiguadoras de calibracin. Si el intervalo operativo del sensor de pH est por encima del intervalo de pH de las soluciones
amortiguadoras en la Tabla 2, entonces 1) seleccionar dos soluciones amortiguadoras de la Tabla 2 con pH cercano o 2)
seleccionar una de la Tabla 2 y otra solucin amortiguadora preparada y documentada que est fuera del intervalo.
2. Enjuagar el sensor de pH varias veces con agua y luego con la primera solucin amortiguadora.
3. Sumergir el sensor de pH en la primera solucin amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
4. Si la medicin de temperatura y la compensacin automtica no se incluyen en el sistema de medicin, ingresar manualmente en el instrumento la temperatura de la solucin amortiguadora y el valor de pH de la solucin amortiguadora a
dicha temperatura. Para las temperaturas que no se encuentren listadas en la Tabla 2, usar interpolacin lineal para determinar el valor de pH como una funcin de temperatura.
5. Iniciar la secuencia de calibracin de 2 puntos con la primera solucin amortiguadora de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
6. Retirar el sensor de pH de la primera solucin amortiguadora y enjuagar los electrodos con agua y luego la segunda solucin amortiguadora.
7. Sumergir el sensor de pH en la segunda solucin amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
dicha temperatura.
9. Continuar la secuencia de calibracin de 2 puntos con la segunda solucin amortiguadora de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10. Despus de completar el proceso de calibracin de 2 puntos, verificar que la pendiente y el desplazamiento de pH estn
dentro de los parmetros aceptables. Los parmetros tpicos aceptables son pendientes en el intervalo del 90%105% y
un desplazamiento de 30 mV (0,5 unidades de pH a 25 C). Dependiendo del instrumental de pH, la pendiente y el
desplazamiento de pH se pueden determinar mediante software o mtodos manuales. Si estos parmetros no estn dentro de los parmetros aceptables, se debe limpiar el sensor adecuadamente, volver a llenar, realizar un servicio de mantenimiento o reemplazarlo, y se debe repetir el proceso de calibracin de 2 puntos.
11. Retirar el sensor de pH de la segunda solucin amortiguadora y enjuagar minuciosamente con agua y, posteriormente,
con la solucin amortiguadora de verificacin.
12. Sumergir el sensor de pH en la solucin amortiguadora de verificacin a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla
2.
dicha temperatura.
14. La lectura de pH deber estar dentro de 0,05 unidades de pH del valor en la Tabla 2 a la temperatura de la solucin
amortiguadora.
OPERACIN
Todas las muestras de prueba deben prepararse usando Agua Purificada, a menos que se especifique algo diferente en la
monografa. Todas las mediciones de prueba deben usar compensacin de temperatura en la ecuacin de Nernst manual o
automtica.
1. Preparar el material de prueba de acuerdo con los requisitos en la monografa o de acuerdo con procedimientos especficos. Si el pH de la muestra de prueba es sensible al dixido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullicin recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseado para minimizar el ingreso de dixido de carbono.
2. Enjuagar el sensor de pH con agua, luego con algunas porciones del material de prueba.
3. Sumergir el sensor de pH en el material de prueba y leer el valor de pH y la temperatura.
En todas las mediciones de pH, permitir un tiempo suficiente para la estabilizacin de la temperatura y la medicin de pH.
USP 38
Pruebas Fsicas / 795 Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 599
Las funciones de diagnstico tales como la medicin de la resistencia del electrodo de vidrio o de referencia pueden estar
disponibles para determinar las deficiencias del equipo. Consultar con el proveedor del electrodo para informacin sobre herramientas de diagnstico para asegurar la funcin apropiada del electrodo.
Cuando sean suficientes los valores de pH aproximados, pueden ser adecuados los indicadores y papeles de prueba (ver
Indicadores y Papeles Indicadores de Prueba, en la seccin de Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Para informacin sobre soluciones amortiguadoras y sobre la composicin de las soluciones amortiguadoras estndar requeridas en las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver Soluciones Amortiguadoras en la seccin Soluciones. Esta seccin referida
no tiene el propsito de reemplazar el uso de las soluciones amortiguadoras de calibracin de pH listadas en la Tabla 2.
795 PREPARACIN MAGISTRALPREPARACIONES NO ESTRILES

INTRODUCCIN
DEFINICIONES
INGREDIENTE FARMACUTICO ACTIVO (API, por sus siglas en ingls)Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a su
uso en una preparacin magistral de medicamentos, convirtindose as en el ingrediente activo de dicha preparacin y que
proporciona una actividad farmacopeica u otro efecto directo en el diagnstico, cura, mitigacin, tratamiento o prevencin de
enfermedades en humanos y animales o que afecta la estructura y funcin del cuerpo.
SUSTANCIAS AGREGADASSon ingredientes necesarios para elaborar una preparacin pero sin la intencin ni la expectativa de
causar una respuesta farmacolgica si se administran aisladamente en la cantidad o concentracin contenida en una dosis nica de la preparacin magistral. El trmino se usa como sinnimo con los trminos ingredientes inactivos, excipientes e ingredientes farmacuticos.
FECHA LMITE DE USO (FLU)Es la fecha despus de la cual no debe usarse una preparacin magistral y se determina a partir de
la fecha de elaboracin de la preparacin.
COMPONENTECualquier ingrediente usado en la elaboracin de una preparacin magistral de frmacos, incluyendo cualquier
ingrediente activo o sustancia agregada que se usa en su preparacin.
PREPARADORProfesional autorizado por la jurisdiccin apropiada para elaborar preparaciones magistrales de acuerdo con una
receta u orden de medicacin de un prescriptor autorizado.
PREPARACIN MAGISTRALLa preparacin, mezcla, reconstitucin, alteracin, envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo de administracin del medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripcin, orden de medicacin o iniciativa de
un profesional autorizado basado en la relacin entre el profesional, el paciente, el farmacutico y el preparador en el curso de
una prctica profesional. La preparacin magistral incluye lo siguiente:
La preparacin de formas farmacuticas para pacientes humanos y animales
La preparacin de medicamentos o dispositivos anticipando recetas de medicamentos basadas en patrones rutinarios de
prescripcin observados con regularidad
La reconstitucin o manipulacin de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o ms ingredientes
La preparacin de medicamentos o dispositivos con el propsito de investigacin (clnica o acadmica), enseanza o anlisis qumico, o como resultado incidental de los mismos
La preparacin de medicamentos y dispositivos para uso en el lugar de trabajo del prescriptor cuando as lo permita la
legislacin federal y estatal
FRMACO PELIGROSOCualquier frmaco identificado por al menos uno de los seis criterios siguientes:
Carcinogenicidad
Teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo
Toxicidad reproductiva en humanos
Toxicidad en rganos a dosis bajas en humanos o animales
Genotoxicidad
Captulos
El propsito de este captulo es proporcionar a los preparadores pautas sobre la aplicacin de buenas prcticas de preparacin magistral para la preparacin magistral de formulaciones no estriles para su dispensacin y/o administracin en humanos o animales. La preparacin magistral es una parte integral de la prctica farmacutica y es esencial para brindar atencin
mdica. Este captulo y las monografas aplicables sobre formulacin ayudan a definir las buenas prcticas de preparacin magistral. Asimismo, este captulo proporciona informacin general para mejorar la capacidad del preparador en las instalaciones
de preparacin magistral para que elabore preparaciones magistrales extemporneas de contenido, calidad y pureza aceptables. Los farmacuticos, profesionales de la salud y dems personas implicadas en la preparacin magistral de medicamentos
deben cumplir con las legislaciones, reglamentaciones y pautas estatales y federales sobre preparacin magistral.
600 795 Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles / Pruebas Fsicas
USP 38
Nuevos frmacos que reproduzcan frmacos peligrosos en su estructura o toxicidad [se pueden encontrar ejemplos en las
publicaciones vigentes del National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH)]
FABRICACINLa produccin, propagacin, conversin o procesamiento de un frmaco o dispositivo mdico, ya sea directa o
indirectamente, mediante extraccin del frmaco de sustancias de origen natural o mediante sntesis qumica o biolgica. La
fabricacin tambin puede incluir cualquier envasado o reenvasado de las sustancias o etiquetado o reetiquetado de envases
para su reventa en farmacias, por parte de profesionales u otras personas.
PREPARACINA los efectos de este captulo, se refiere a una forma farmacutica o suplemento diettico elaborado por preparacin magistral o un dispositivo en el que el preparador ha introducido un frmaco. Este trmino se usar para describir formulaciones preparadas magistralmente; el trmino producto se usar para describir formas farmacuticas fabricadas. (Para las
definiciones de sustancia oficial y productos oficiales, ver Advertencias y Requisitos Generales.)
ESTABILIDADSe define como la conservacin, dentro de ciertos lmites especficos y durante todo el periodo de almacenamiento y utilizacin, de las mismas propiedades y caractersticas que posea la preparacin cuando se elabor (ver en Consideraciones sobre Estabilidad en la Prctica de Dispensacin 1191, la tabla Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad).
VEHCULOComponente de uso interno o externo empleado como portador o diluyente en el que se suspenden o disuelven
lquidos, semislidos o slidos. Ejemplos de vehculos incluyen, entre otros, agua, jarabes, elxires, lquidos oleaginosos, portadores slidos y semislidos y productos de propiedad exclusiva.
Captulos
CATEGORAS DE LA PREPARACIN MAGISTRAL

Cada una de las tres categoras generales de preparaciones no estriles descritas en esta seccin est asociada con diferentes
niveles de experiencia, capacitacin e instalaciones fsicas.
Los criterios usados para determinar la clasificacin general incluyen:
grado de dificultad o complejidad del proceso de preparacin magistral
informacin y advertencias sobre la estabilidad
requisitos de envasado y almacenamiento
formas farmacuticas
complejidad de los clculos
disposicin biolgica local contra sistmica
nivel de riesgo para el preparador
potencial de riesgo de daos al paciente
Ver Preparacin MagistralPreparaciones Estriles797 para niveles de riesgo relacionados con preparaciones estriles. Las
reas de especialidad tales como la de preparados radiofarmacuticos requieren de capacitacin especial y sobrepasan el alcance del presente captulo. Los preparadores debern adquirir y mantener conocimientos y habilidades en todas las reas (p.ej.,
formas farmacuticas, poblacin de pacientes y especialidad mdica) para las que elaboran preparaciones.
Descripcin de las Categoras

SimpleElaboracin de una preparacin que cuenta con una monografa de preparacin magistral en la Farmacopea de los
Estados Unidos de Amrica (USP) o que se presenta en un artculo de una publicacin de referencia que contiene cantidades
especficas de todos los componentes, un procedimiento y equipo de preparacin magistral y datos de estabilidad para dicha
formulacin con las FLU apropiadas; o reconstitucin o manipulacin de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o ms ingredientes segn lo indicado por el fabricante. Entre los ejemplos se incluye Captopril, Solucin Oral,
Indometacina, Gel Tpico y Bromuro de Potasio, Solucin Oral para Uso Veterinario.
ModeradaElaboracin de una preparacin que requiere de clculos o procedimientos especiales (tales como calibracin
de cavidades en moldes de unidades de dosificacin) para determinar las cantidades de los componentes por cada preparacin o por cada unidad de dosificacin individualizada; o elaborar una preparacin que carece de datos de estabilidad para su
formulacin especfica. Entre los ejemplos se incluye Sulfato de Morfina, Supositorios, trociscos de clorhidrato de difenhidramina
y mezcla de dos o ms cremas fabricadas cuando no se conoce la estabilidad de la mezcla.
ComplejaElaboracin de una preparacin que requiere de capacitacin, entorno de trabajo, instalaciones, equipo y procedimientos especiales para asegurar resultados teraputicos apropiados. Entre los ejemplos de posibles tipos de preparaciones
complejas se incluyen formas farmacuticas transdrmicas, preparaciones de liberacin modificada y algunos insertos y supositorios para efectos sistmicos.
RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR

La responsabilidad del preparador es obtener preparaciones magistrales de contenido, calidad y pureza aceptables de conformidad con la receta u orden de medicacin. Adems, es responsabilidad del preparador dispensar la preparacin terminada,
con el envasado y etiquetado apropiados y conforme a los requisitos establecidos por las agencias estatales, consejos de farmacia estatales, legislaciones federales y dems agencias reglamentarias aplicables, cuando corresponda. Los individuos que participen en la preparacin magistral de medicamentos o suplementos dietticos debern tener la competencia necesaria en pre-
USP 38
paracin magistral y debern expandir sus conocimientos continuamente sobre la preparacin magistral participando en seminarios y/o estudiando la literatura apropiada. Adems, debern tener conocimiento sobre el contenido de este captulo y estar
familiarizados con los captulos 797, Formas Farmacuticas 1151, Clculos Farmacuticos en la Preparacin Magistral de Prescripciones 1160, Garanta de Calidad en la Preparacin Magistral 1163, Balanzas y Aparatos Volumtricos para Prescripciones
1176, 1191, Informacin Escrita de los Medicamentos RecetadosGuas 1265 y dems legislaciones, pautas y normas sobre
preparacin magistral aplicables.
Para asegurar la calidad de las preparaciones magistrales, los preparadores debern apegarse a los siguientes principios generales (se proporciona informacin adicional sobre estos principios generales en la seccin siguiente).
Principios Generales de Preparacin Magistral
PROCESO DE PREPARACIN MAGISTRAL

El preparador es responsable de asegurar que cada preparacin magistral individual cumpla con los criterios provistos en
esta seccin (se proporciona informacin adicional sobre estos criterios en las secciones siguientes).
Criterios para la Elaboracin de una Preparacin Magistral para Cada Frmaco

1. Se ha evaluado la aptitud de la dosis, la seguridad y el uso previsto de la preparacin o dispositivo en trminos de:
las propiedades qumicas y fsicas de los componentes
forma farmacutica
aptitud teraputica y va de administracin, incluyendo la disposicin biolgica local y sistmica
limitaciones legales, si las hubiera.
2. Se debe crear un Registro Maestro de Formulacin antes de elaborar la preparacin por primera vez. Este registro deber
seguirse cada vez que se elabore dicha preparacin. Adems, debe completarse un Registro de Preparacin Magistral cada
vez que se elabore una preparacin.
3. Los ingredientes usados en la formulacin debern tener la identidad, calidad y pureza esperadas. Si la formulacin es
para uso en humanos, los ingredientes no debern estar incluidos en la lista de frmacos o medicamentos especficos reconocidos en instancias federales que hayan sido retirados o extrados del mercado por razones de seguridad o eficacia
(ver www.FDA.gov). Si la formulacin es para animales con los que se producen alimentos, los ingredientes no debern
estar incluidos en una lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. Se
han consultado los Certificados de Anlisis, cuando sea aplicable, y las MSDS para todos los ingredientes usados.
4. La preparacin magistral se elabora en un rea limpia y sanitizada de manera apropiada, dedicada a esta actividad (ver la
seccin Instalaciones de Preparacin Magistral).
5. Se elabora nicamente una preparacin a la vez en un espacio de trabajo especfico.
6. Se ha seleccionado el equipo de preparacin magistral apropiado y se ha inspeccionado su limpieza y funcionamiento
correcto, y se usa de manera apropiada.
7. Se establece una FLU confiable para asegurar que la preparacin terminada tiene su potencia, pureza, calidad y caractersticas aceptadas, al menos hasta la FLU indicada en el etiquetado.
Captulos
1. El personal est capacitado de manera apropiada y tiene la competencia y calificaciones necesarias para realizar las tareas
asignadas. Dicha capacitacin debe estar documentada.
2. Los ingredientes para la preparacin magistral tienen la identidad, pureza y calidad apropiadas, se adquieren de fuentes
confiables, y se almacenan de manera apropiada de acuerdo con las especificaciones del fabricante o las normas USP.
3. Los envases de componentes a granel cuentan con las etiquetas apropiadas de comunicacin de riesgo de la Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (ver www.OSHA.gov) y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales
(MSDS, por sus siglas en ingls) para todos los frmacos y qumicos usados en la preparacin estn disponibles para el
personal de preparacin magistral.
4. Todo el equipo usado en la preparacin magistral se conserva limpio, recibe el mantenimiento apropiado y se usa de manera apropiada.
5. El ambiente de preparacin magistral es adecuado para su propsito previsto; y se implementan procedimientos para prevenir la contaminacin cruzada, especialmente cuando se elaboran preparaciones con frmacos (p.ej., frmacos peligrosos y alrgenos conocidos como la penicilina) que requieren de precauciones especiales.
6. Slo se permite personal autorizado en las inmediaciones de las operaciones de preparacin magistral.
7. Existe garanta de que los procesos siempre se llevan a cabo segn se especifica o en la forma prevista y que son reproducibles.
8. Las condiciones de la preparacin magistral son adecuadas a fin de prevenir errores.
9. Todos los aspectos de la preparacin magistral se documentan de manera apropiada.
10. Existen procedimientos y registros adecuados para investigar y corregir fallas o problemas en la preparacin magistral, el
anlisis o la preparacin misma.
USP 38
8. El personal que participa en la preparacin magistral mantiene una buena higiene de manos y usa vestimenta limpia,
apropiada para el tipo de preparacin magistral que se elabora (p.ej., protectores para el cabello, chaquetas, batas, guantes, mscaras faciales, zapatos, delantales u otros artculos) segn sea necesario para proteger al personal de la exposicin
a sustancias qumicas y para prevenir la contaminacin de los frmacos.
9. La preparacin se elabora de acuerdo con este captulo, otras normas oficiales referidas en este captulo, e informacin y
datos cientficos pertinentes.
10. El preparador verifica los procesos crticos (incluyendo, entre otros, pesaje, medicin y mezclado) para asegurar que los
procedimientos, cuando se usen, darn constantemente como resultado la calidad esperada de la preparacin terminada.
11. La preparacin final se evala usando factores tales como peso, aptitud de mezclado, claridad, olor, color, consistencia,
pH y anlisis analtico, segn sea apropiado; y esta informacin se registra en el Registro de Preparacin Magistral (ver
1163).
12. La preparacin se envasa segn se recomienda en la seccin Envasado y Envases de Preparaciones Magistrales de este captulo.
13. El envase de la preparacin se etiqueta de conformidad con todas las legislaciones estatales y federales aplicables. El etiquetado deber incluir la FLU y la informacin de almacenamiento y manipulacin. El etiquetado debe indicar que sta
es una preparacin magistral.
14. El preparador ha revisado el Registro Maestro de Formulacin y el Registro de Preparacin Magistral para asegurarse que
no hayan ocurrido errores en el proceso de preparacin magistral y que la preparacin es adecuada para su uso.
15. La preparacin se entrega al paciente o al proveedor de cuidados con la consulta apropiada.
Captulos
INSTALACIONES DE PREPARACIN MAGISTRAL

Las instalaciones de preparacin magistral debern tener un espacio adecuado especficamente diseado para preparar las
prescripciones. Este espacio deber mantener la colocacin ordenada del equipo y materiales para prevenir confusiones entre
ingredientes, envases, etiquetas, materiales en proceso y preparaciones terminadas; asimismo, su diseo, disposicin y uso se
enfoca en prevenir contaminacin cruzada accidental. Las reas destinadas a las preparaciones estriles debern estar separadas y ser distintas de las usadas para las preparaciones no estriles (ver Preparacin MagistralPreparaciones Estriles 797, Calidad y Control Ambiental).
Se debe proveer agua potable para el lavado de manos y equipo. Esta agua cumple con normas establecidas en National
Primary Drinking Water Regulations (Reglamentaciones Bsicas sobre Agua Potable) de la Environmental Protection Agency
(Agencia de Proteccin Ambiental) (40 CFR Parte 141). Se deber usar Agua Purificada (ver la monografa de Agua Purificada)
para elaborar preparaciones de medicamentos no estriles cuando las formulaciones indiquen el uso de agua. Se debe usar
Agua Purificada para enjuagar el equipo y los utensilios. Cuando se usa agua para elaborar una preparacin estril, se deben
seguir las monografas y los captulos generales apropiados (ver Agua para Uso Farmacutico 1231).
El sistema de caeras deber estar libre de defectos que pudieran contribuir a la contaminacin de las preparaciones magistrales. Se debe contar con acceso fcil a instalaciones de lavado de manos y equipo en las reas de preparacin magistral. Dichas instalaciones debern incluir, entre otros, agua caliente y fra, jabn o detergente y secadores de aire o toallas desechables o de un solo uso. Las reas usadas para la preparacin magistral debern mantenerse limpias, ordenadas y en condiciones
sanitarias, y debern mantenerse en buenas condiciones de mantenimiento. La basura debe depositarse y desecharse de manera sanitaria y oportuna y de conformidad con las pautas locales, estatales y federales.
Toda el rea de preparacin magistral y de almacenamiento debe mantenerse bien iluminada. Hay que controlar los sistemas de calefaccin, de ventilacin y de aire acondicionado para evitar la descomposicin y contaminacin de los productos
qumicos (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento 659 y las condiciones de almacenamiento dispuestas por el fabricante). Se debe mantener un monitoreo adecuado de temperatura y humedad segn se requiera para ciertos componentes y formas farmacuticas preparadas. Todos los componentes, equipos y envases deben almacenarse alejados del piso a fin de prevenir la contaminacin y permitir la inspeccin y limpieza del rea de elaboracin y almacenamiento de la preparacin magistral.
Los frmacos peligrosos deben ser almacenados, preparados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en
condiciones que protejan a los trabajadores del cuidado de la salud y dems personal. A continuacin se presentan referencias
para la manipulacin segura de frmacos antineoplsticos y peligrosos en instalaciones de cuidados de la salud:
OSHA Technical Manual (Manual Tcnico de OSHA)Seccin VI: Captulo 2, Controlling Occupational Exposure to Hazardous Drugs (Control de Exposicin Ocupacional a Frmacos Peligrosos)
NIOSH Alert (Alerta de NIOSH): Preventing Occupational Exposure to Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Health
Care Settings (Prevencin de Exposicin Ocupacional a Frmacos Antineoplsticos y Otros Frmacos Peligrosos en Instalaciones de Cuidados de la Salud) [DHHS (NIOSH) Publicacin No. 2004-165] y actualizaciones.
La eliminacin de todos los frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales correspondientes. Todo el personal que lleve a cabo la eliminacin de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las reas de
almacenamiento y preparacin de frmacos peligrosos deber estar capacitado en los procedimientos adecuados para protegerse a s mismos y prevenir la contaminacin.
USP 38
EQUIPO PARA ELABORAR LA PREPARACIN MAGISTRAL

El equipo y los utensilios usados para elaborar la preparacin magistral de un medicamento debern tener un diseo y capacidad apropiados. Para no afectar ni alterar la pureza de las preparaciones, la composicin del equipo deber ser adecuada, de
modo que las superficies que entran en contacto con los componentes no reaccionen, no provoquen adiciones, ni los adsorban. El tipo y las dimensiones del equipo dependen de las formas farmacuticas y las cantidades que se preparen (ver 1176 y
los manuales de instrucciones suministrados por el fabricante del equipo).
El equipo deber almacenarse para protegerlo de la contaminacin y deber estar ubicado de forma tal que se facilite su
uso, mantenimiento y limpieza. El equipo automatizado, mecnico, electrnico y de otros tipos usado en la elaboracin o anlisis de preparaciones magistrales deber inspeccionarse de manera rutinaria, calibrarse segn sea necesario, y verificarse para
asegurar el desempeo adecuado. El preparador deber inspeccionar el equipo para determinar su aptitud de uso inmediatamente antes de realizar las operaciones de preparacin magistral. El equipo deber limpiarse apropiadamente despus de su
uso.
Se debe tener extremo cuidado al limpiar el equipo usado en la elaboracin de preparaciones magistrales que requieran de
precauciones especiales (p.ej., antibiticos, materiales citotxicos y otros materiales peligrosos). Cuando sea posible, se debe
destinar equipo especial para tal propsito, o cuando se use el mismo equipo para todos los productos farmacuticos, se debe
contar con procedimientos adecuados para permitir la limpieza meticulosa del equipo antes de usarlo con otros medicamentos. Cuando sea posible, se debe usar equipo desechable para reducir la probabilidad de biocarga o contaminacin cruzada.
SELECCIN, MANIPULACIN Y ALMACENAMIENTO DE COMPONENTES

Captulos
Las siguientes pautas se deben seguir al seleccionar, manipular y almacenar componentes para las preparaciones magistrales.
1. Se recomienda una sustancia de calidad Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP), Formulario Nacional (NF) o
Food Chemicals Codex (FCC) como fuente de ingredientes para elaborar todas las preparaciones.
2. Los preparadores deben intentar primero usar componentes fabricados en una instalacin registrada con la FDA. Cuando
no sea posible obtener componentes de una instalacin registrada con la FDA, los preparadores deben usar su criterio
profesional al seleccionar una fuente aceptable y confiable y deben establecer la pureza y la seguridad mediante mtodos
razonables, los cuales deben incluir un Certificado de Anlisis, reputacin del fabricante y confiabilidad de la fuente.
3. Las preparaciones magistrales oficiales se elaboran a partir de ingredientes individuales que cumplen con los requisitos de
la monografa oficial para los ingredientes que cuentan con monografa. Estas preparaciones se pueden etiquetar con las
siglas USP o NF, segn corresponda.
4. Cuando no sea posible obtener componentes de calidad farmacopeica, se pueden usar componentes de alta calidad tales
como aqullos que son qumicamente puros, de grado reactivo analtico o certificados por la American Chemical Society.
No obstante, estos componentes se deben usar con cuidado puesto que los estndares para reactivos analticos o los materiales de grado certificado por la American Chemical Society no consideran si una impureza presente implica riesgos de
seguridad para humanos o animales.
5. Para componentes en envases con una fecha de caducidad proporcionada por el fabricante o distribuidor, el material puede usarse en la preparacin magistral antes de dicha fecha de caducidad (a) cuando el material se almacene en su envase
original en condiciones que eviten la descomposicin de las sustancias qumicas (ver 1191 y 659, a menos que se citen
otras condiciones en la etiqueta), (b) cuando exista una exposicin mnima del material remanente cada vez que se extrae
material del envase y (c) cuando cualquier extraccin del envase es llevada a cabo por personal capacitado en la manipulacin adecuada del material. Si el componente ha sido transferido a un envase distinto, dicho envase deber identificarse
con el nombre del componente, proveedor original, lote o nmero de control, fecha de transferencia y fecha de caducidad, y deber ofrecer una integridad equivalente o mejor que la del envase original.
6. Para componentes que no tienen fechas de caducidad asignadas por el fabricante o el proveedor, el preparador deber
etiquetar el envase con la fecha de recepcin y asignar una fecha de caducidad prudente al componente que no exceda
de tres aos a partir de la fecha de recepcin (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin,
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales) basndose en la naturaleza del componente
y su mecanismo de degradacin, el envase en el que est envasado y las condiciones de almacenamiento.
7. Cuando se usa un medicamento fabricado como fuente del ingrediente activo, el medicamento deber haber sido fabricado en una instalacin registrada con la FDA y el envase del producto provisto por el fabricante deber estar etiquetado
con un nmero de control de partida y una fecha de caducidad. Cuando se elaboran preparaciones magistrales con medicamentos fabricados, el preparador debe considerar todos los ingredientes, incluidos los excipientes presentes en el medicamento con respecto al uso previsto de la preparacin magistral, as como el efecto que tendr la manipulacin del medicamento sobre la aptitud teraputica y la estabilidad de los componentes.
8. Cuando la preparacin est destinada para su uso como suplemento diettico o nutricional, el preparador deber respetar
este captulo y deber cumplir con todos los requisitos federales y estatales. En general, los suplementos dietticos se preparan con ingredientes que cumplen con las normas USP, FCC o NF. Cuando no existan tales estndares, se pueden usar
sustancias con una calidad de grado alimenticio comprobada usando otros procedimientos adecuados.
USP 38
9. Cuando un componente se deriva de animales rumiantes (p.ej., bovinos, caprinos, ovinos), el proveedor deber proporcionar garanta por escrito de que el componente cumple con todas las leyes federales que rigen los requisitos de procesamiento, uso e importacin para estos materiales.
10. Cuando se elaboran preparaciones magistrales para humanos, el preparador deber consultar la lista de componentes que
han sido retirados o extrados del mercado por la FDA por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Cuando se
elaboran preparaciones magistrales para animales con los que se producen alimentos, el preparador debe consultar la lista
de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos.
11. Todos los componentes usados en la elaboracin de preparaciones magistrales deben almacenarse segn las instrucciones
del fabricante o de acuerdo con los requisitos de la monografa USP, NF o FCC, en un rea limpia y en condiciones de
temperatura y humedad apropiadas (temperatura ambiente controlada, refrigerador o congelador). Todos los componentes deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminacin, y rotarse de modo que
se use primero el componente ms antiguo. Todos los envases deben etiquetarse apropiadamente.
Captulos
CRITERIOS DE ESTABILIDAD Y DETERMINACIN DE LA FECHA LMITE DE USO

La FLU es la fecha despus de la cual la preparacin magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de elaboracin de la preparacin. Debido a que las preparaciones magistrales estn destinadas a administrarse inmediatamente o luego
de un perodo de almacenamiento corto, las fechas lmite de uso pueden determinarse en funcin de criterios distintos a los
utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados.
Las FLU deben fijarse de manera conservadora. Para determinar la FLU, los preparadores deben consultar y aplicar la informacin disponible en la documentacin y literatura sobre la estabilidad en general y la del frmaco en particular, y deben considerar:
la naturaleza del frmaco y su mecanismo de degradacin
la forma farmacutica y sus componentes
el potencial de proliferacin microbiana en la preparacin
el envase en el que est envasado
las condiciones de almacenamiento esperadas
la duracin prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin, Envasado,
Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales).
Cuando se usa un producto fabricado como fuente del ingrediente activo farmacutico para una preparacin magistral no
estril, la fecha de caducidad del producto no podr usarse como nico elemento para fijar una FLU para la preparacin magistral, sino que el preparador deber referirse a la informacin de estabilidad provista por el fabricante y a la literatura para obtener informacin aplicable sobre estabilidad, compatibilidad y degradacin de ingredientes, adems de considerar los factores
de estabilidad presentados en 1191; asimismo, deber usar sus conocimientos de preparacin magistral y experiencia. Todos
los datos de estabilidad deben ser cuidadosamente interpretados en funcin de la formulacin preparada real.
Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado para detectar signos de inestabilidad durante todas las
etapas del proceso de preparacin, dispensacin y almacenamiento. En 1191, Consideraciones sobre Estabilidad en la Prctica
de Dispensacin, se encuentran detalles ms especficos sobre algunos signos de deterioro fsico comunes. Sin embargo, la degradacin qumica excesiva y otras prdidas de concentracin del frmaco ocasionadas por reacciones suelen ser invisibles.
Pautas Generales Para Fijar la Fecha Lmite de Uso

Ante la ausencia de informacin de estabilidad del frmaco y de la preparacin especficos, la siguiente tabla presenta las
fechas lmite de uso mximas recomendadas para preparaciones magistrales de frmacos no estriles que se envasan en envases impermeables y resistentes a la luz y se almacenan a temperatura ambiente controlada, a menos que se indique algo distinto (ver 659). Los frmacos o qumicos que tienden a descomponerse requerirn de FLU ms cortas.
FLU por Tipo de Formulacina
Para Formulaciones No AcuosasLa FLU no deber ser mayor al tiempo restante hasta la fecha de caducidad ms cercana de cualquier ingrediente
activo farmacutico o 6 meses, lo que ocurra primero.
Para Formulaciones Orales que Contienen AguaLa FLU no deber ser mayor de 14 das cuando se almacenan a temperaturas fras controladas.
Para Formulaciones Lquidas o Semislidas que Contienen Agua, de aplicacin Tpica/Drmica o sobre MucosasLa FLU no deber ser mayor
de 30 das.
a Las siguientes FLU mximas se recomiendan para preparaciones magistrales de medicamentos no estriles cuando no se cuenta con informacin de estabilidad
del frmaco o la preparacin especficos. La FLU no deber ser mayor a la fecha de caducidad indicada en el envase de cualquier componente.
Las preparaciones susceptibles deben contener agentes antimicrobianos adecuados que las protejan de la contaminacin
por bacterias, levaduras y hongos introducidos inadvertidamente durante o despus del proceso de preparacin magistral.
Cuando existe una contraindicacin para conservantes antimicrobianos en estas preparaciones magistrales, ser necesario almacenar la preparacin a temperatura fra controlada; para asegurar el almacenamiento y la manipulacin adecuados de tales
preparaciones magistrales por parte del paciente o el proveedor de cuidados, resulta esencial instruir y ofrecer consulta apro-
USP 38
piada al paciente. No se deben usar conservantes antimicrobianos como sustitutos de las buenas prcticas de preparacin magistral.
Para informacin sobre asignacin de FLU para medicamentos reenvasados para dispensacin o administracin, ver Fecha de
Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales y Envasado y ReenvasadoEnvases Unitarios 1136.
Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparacin magistral estril. La preparacin y el envasado de medicamentos
estriles, (incluidas las preparaciones oftlmicas) requieren un cumplimiento estricto de las pautas contenidas en 797 y en las
instrucciones de etiquetado del fabricante.
ENVASADO Y ENVASES DE PREPARACIONES MAGISTRALES
DOCUMENTACIN SOBRE PREPARACIN MAGISTRAL

La documentacin, escrita o electrnica, permite al preparador rastrear, evaluar y repetir sistemticamente los pasos incluidos en todo el proceso de elaboracin de una preparacin magistral, siempre que lo necesite. Todos los preparadores que dispensan recetas deben cumplir con los requisitos de manutencin de registros de sus consejos estatales de farmacia. No se requiere documentacin adicional cuando el preparador elabora una preparacin magistral de acuerdo con las instrucciones del
etiquetado provistas por el fabricante. Todas las dems preparaciones magistrales requerirn de documentacin adicional segn se describe en esta seccin.
El perodo de conservacin de los registros es idntico al perodo dispuesto por la legislacin estatal para cualquier receta
mdica. El registro puede ser una copia de la prescripcin, escrita o en forma de registro electrnico, que incluya el Registro
Maestro de Formulacin y el Registro de Preparacin Magistral.
Registro Maestro de Formulacin

Este registro deber incluir:
nombre oficial o asignado, contenido y forma farmacutica de la preparacin
clculos requeridos para determinar y verificar cantidades de componentes y dosis de ingredientes farmacuticos activos
descripcin de todos los ingredientes y sus cantidades
informacin sobre compatibilidad y estabilidad, incluyendo referencias cuando estn disponibles
equipo necesario para elaborar la preparacin, cuando corresponda
instrucciones de mezclado que debern incluir:
1. orden de mezclado
2. temperaturas de mezclado u otros controles ambientales
3. duracin del mezclado
4. otros factores pertinentes a la reproduccin de la preparacin a medida que se elabora.
informacin de etiquetado de la muestra, que deber contener, adems de la informacin legalmente requerida:
1. nombre genrico y cantidad o concentracin de cada ingrediente activo
2. FLU asignada
3. condiciones de almacenamiento
4. nmero de prescripcin o de control, segn corresponda.
envase usado para la dispensacin
requisitos de envasado y almacenamiento
descripcin de la preparacin final
procedimientos de control de calidad y resultados esperados.
Captulos
El preparador debe asegurar que los envases y cierres de envases usados en el envasado de preparaciones magistrales cumplen con los requisitos de USP (ver 659; EnvasesVidrio 660; EnvasesPlsticos 661; EnvasesPruebas de Desempeo
671; 1136); y cuando estn disponibles, las monografas de preparacin magistral. No se espera que los preparadores realicen las pruebas descritas en los captulos mencionados, pero deben tener conocimiento acerca de las normas en ellos descritas. Los proveedores de envases deben proporcionar, cuando se les solicite, la verificacin del cumplimiento del envase con
USP. Los envases y cierres de envases destinados para la elaboracin de preparaciones magistrales estriles deben manipularse
segn se indica en 797.
Los envases y cierres debern estar fabricados con material limpio y adecuado a fin de no alterar la calidad, contenido o
pureza de la preparacin magistral. Utilizar un envase seleccionado segn las propiedades fsicas y qumicas de la preparacin
magistral. Se debe considerar la interaccin envasefrmaco para sustancias con propiedades adsortivas o de lixiviacin.
Los envases y cierres deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminacin, y rotarse
de modo que se usen primero los ms antiguos. Los envases y cierres de envases deben almacenarse de modo que se permita
la inspeccin y limpieza del rea de almacenamiento.
USP 38
Registro de Preparacin Magistral

El Registro de Preparacin Magistral deber contener:
el nombre oficial o asignado, contenido y dosis de la preparacin
referencia al Registro Maestro de Formulacin para la preparacin
nombres y cantidades de todos los componentes
fuentes, nmeros de lote y fechas de caducidad de los componentes
cantidad total preparada
nombre de la persona que elabor la preparacin, nombre de la persona que llev a cabo los procedimientos de control
de calidad y nombre del preparador que aprob la preparacin
fecha de preparacin
nmero de control o prescripcin asignado
FLU asignada
doble etiqueta segn se describe en el Registro Maestro de Formulacin
descripcin de la preparacin final
resultados de los procedimientos de control de calidad (p.ej., intervalo de peso de las cpsulas llenadas, pH de lquidos
acuosos)
documentacin de cualquier problema de control de calidad y cualquier reaccin adversa o problema de la preparacin
informados por el paciente o el proveedor de cuidados.
Captulos
Procedimientos Operativos Estndar

Todos los procedimientos significativos realizados en el rea de preparacin magistral deben estar cubiertos por procedimientos operativos estndar (POE) escritos. Deben desarrollarse procedimientos para instalaciones, equipo, personal, preparacin, envasado y almacenamiento de preparaciones magistrales para asegurar la confiabilidad, exactitud, calidad, seguridad y
uniformidad de la preparacin magistral. La aplicacin de POE establece una uniformidad en los procedimientos, adems de
proveer referencias para la orientacin y capacitacin del personal.
Archivos de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales

Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en ingls) deben ser de fcil acceso para todos los
empleados que trabajan con medicamentos o productos qumicos a granel ubicados en las instalaciones de preparacin magistral. Debe instruirse a los empleados acerca de cmo conseguir e interpretar la informacin necesaria.
CONTROL DE CALIDAD
La seguridad, la calidad y el desempeo de las preparaciones magistrales dependen de una correcta utilizacin de los ingredientes, clculos bien hechos, mediciones precisas y exactas, condiciones y procedimientos de formulacin adecuados y el
ejercicio prudente del criterio farmacutico. El preparador deber realizar una ltima verificacin de cada procedimiento utilizado en el proceso de preparacin magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deber observar
la preparacin terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deber investigar cualquier discrepancia, adoptando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar la receta mdica al paciente.
Controles para la Preparacin Magistral

1. Es necesario seguir el Registro Maestro de Formulacin, el Registro de Preparacin Magistral, y los procedimientos escritos
relacionados durante la ejecucin del proceso de preparacin magistral. Cualquier desviacin en los procedimientos debe
ser documentada.
2. El preparador deber realizar una verificacin y posteriormente volver a verificar cada procedimiento en cada etapa del
proceso. Cuando sea posible, una segunda persona capacitada debe verificar cada etapa crtica del proceso de preparacin.
3. El preparador deber contar con procedimientos establecidos por escrito que describan las pruebas o exmenes realizados
a la preparacin magistral (p.ej., el grado de variacin de peso entre cpsulas) para asegurar su uniformidad e integridad.
4. Se deben establecer procedimientos de control adecuados para monitorear los resultados y para verificar el desempeo
de los procesos de preparacin y equipos que pudieran ser responsables de las variaciones en las preparaciones magistrales finales.
5. Para ms informacin y pautas sobre los procesos de control de calidad recomendados, ver 1163.
USP 38
CONSEJOS AL PACIENTE
Al momento de dispensar la receta, se debe aconsejar al paciente o al representante del paciente sobre el uso, almacenamiento, manipulacin y desecho apropiados de la preparacin. Adems, se debe instruir al paciente o al representante del paciente para que informe sobre cualquier evento adverso y para que observe e informe al preparador sobre cualquier cambio en
las caractersticas fsicas de la preparacin magistral (ver 1191, Responsabilidad del Farmacutico). El preparador deber investigar y documentar cualquier problema informado que se relacione con una preparacin magistral, y deber tomar las medidas
correctivas.
CAPACITACIN
PREPARACIONES MAGISTRALES PARA PACIENTES ANIMALES

La responsabilidad del preparador para proporcionar preparaciones magistrales de alta calidad a los pacientes se extiende
ms all de los seres humanos. Todas las partes de este captulo se aplican a preparaciones magistrales formuladas para pacientes animales. Se deber determinar antes de realizar la preparacin magistral si la misma est destinada al uso de un paciente
animal (p.ej., de compaa, de competicin, para alimento).
Debido a que el alimento derivado de pacientes animales puede ser consumido por seres humanos, se debe tener cuidado
para prevenir que los residuos del frmaco ingresen en la cadena alimenticia humana cuando se elaboran preparaciones magistrales para su uso en pacientes animales. Por esta razn, todos los preparadores que preparan formulaciones para animales
deben tener conocimientos funcionales sobre regulacin y aplicacin de frmacos en pacientes animales. Por ley, los veterinarios estn obligados a proporcionar a los cuidadores de animales con los que se producen alimentos un periodo de retencin
de los tejidos de animales tratados (p.ej. carne, leche, huevo) antes de introducirlos en el suministro alimenticio humano. Este
periodo se denomina tiempo de retiro (WDT, por sus siglas en ingls) y, por ley, tambin se debe incluir en la etiqueta de
dispensacin de cada prescripcin preparada para especies que se usan en la produccin de alimentos.
El uso de frmacos en cualquier animal de competicin est estrictamente regulado por los gobiernos federal y estatales,
adems de los rganos que rigen cada una de las disciplinas especficas. Las penas por infringir dichas reglas pueden ser severas para todos los que contribuyan con la falta, incluidos veterinarios, farmacuticos y cuidadores.
El farmacutico deber estar apercibido de las limitantes para las especies especficas en su capacidad fisiolgica y metablica que pudieran resultar en toxicidad cuando se usan ciertos frmacos o excipientes en las preparaciones magistrales. Por esta
razn, los preparadores que elaboran preparaciones para animales deben usar, cuando sea posible, formulaciones desarrolladas especficamente para pacientes animales. Cuando dichas formulaciones no estn disponibles, el preparador deber revisar
Captulos
Todo el personal implicado en la preparacin, evaluacin, envasado y dispensacin de preparaciones magistrales deber recibir capacitacin adecuada para el tipo de preparacin magistral realizada. Es responsabilidad del preparador asegurar la implementacin de un programa de capacitacin y que ste se aplique de manera continua. El personal de preparacin magistral
debe ser evaluado por lo menos una vez al ao. Las etapas en el proceso de capacitacin incluyen lo siguiente:
Todos los empleados implicados en la preparacin magistral farmacutica debern leer y familiarizarse con este captulo.
Adems, deben estar familiarizados con el contenido de la USP Pharmacists' Pharmacopeia y dems publicaciones pertinentes, lo cual incluye cmo leer e interpretar las MSDS.
Todos los empleados debern leer y familiarizarse con cada uno de los procedimientos relacionados con la preparacin
magistral, incluyendo aqullos que involucren las instalaciones, equipo, personal, preparacin magistral en s misma, evaluacin, envasado, almacenamiento y dispensacin.
Todo el personal que elabore preparaciones magistrales de frmacos peligrosos deber estar totalmente capacitado en almacenamiento, manipulacin y desecho de estos frmacos. Esta capacitacin se debe dar antes de preparar o manipular
frmacos peligrosos. Para informacin sobre capacitacin de personal que elabora preparaciones magistrales de frmacos
peligrosos, ver las referencias en la seccin Instalaciones de Preparacin Magistral de este captulo.
Todas las actividades de capacitacin debern quedar documentadas. El preparador deber reunirse con los empleados
para revisar su trabajo y responder cualquier pregunta de los empleados en relacin con los procedimientos de preparacin magistral.
El preparador deber hacer una demostracin de los procedimientos para el empleado y deber observar y guiar al empleado durante todo el proceso de capacitacin. Posteriormente, el empleado repetir el procedimiento sin recibir ayuda
alguna por parte del preparador pero bajo su supervisin directa.
Cuando el empleado haya demostrado al preparador un conocimiento verbal y funcional del procedimiento se le permitir realizar el procedimiento sin supervisin directa. No obstante, el preparador deber estar presente fsicamente y deber
aprobar todos los ingredientes y sus cantidades, as como la preparacin final.
Cuando el preparador est satisfecho con el conocimiento y competencia del empleado, el preparador deber firmar los
registros de documentacin para demostrar que el empleado ha recibido la capacitacin adecuada.
El preparador deber monitorear continuamente el trabajo del empleado y asegurar que los clculos y el trabajo del empleado sean exactos y se realicen de manera adecuada.
El preparador es el nico responsable de la preparacin terminada.
USP 38
la literatura para determinar si un componente especfico de la frmula es txico para las especies a tratar. La extrapolacin de
formulaciones que se preparan magistralmente destinadas para su uso en humanos puede no ser adecuada para especies animales y puede ocasionar resultados negativos.
Los veterinarios y farmacuticos que elaboran preparaciones para pacientes animales deben estar familiarizados con todas las
legislaciones estatales y federales relacionadas con el uso de frmacos en animales, incluyendo, entre otras, la Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Frmacos y Cosmticos); la Animal Drug Amendment (Enmienda sobre Frmacos en Animales); la Animal Medicinal Drug Use Clarification Act (Ley de Aclaracin del Uso Medicinal de Frmacos en Animales); y la Compliance Policy Guideline for Compounding of Drugs for Use in Animal Patients (Gua sobre las Polticas de Preparacin Magistral de Frmacos para su Uso en Pacientes Animales) de la FDA.
797 PREPARACIN MAGISTRALPREPARACIONES ESTRILES
Captulos
INTRODUCCIN
El objetivo de este captulo es describir las condiciones y prcticas para evitar lesiones, e incluso la muerte de pacientes como
resultado de (1) contaminacin microbiana (no esterilidad), (2) endotoxinas bacterianas en exceso, (3) variabilidad en la concentracin pretendida de los ingredientes correctos, que exceda bien sea los lmites de la monografa para artculos oficiales
(ver Oficial y Artculos Oficiales en las Advertencias y Requisitos Generales) o 10% para los artculos no oficiales, (4) contaminantes qumicos y fsicos no esperados, y (5) ingredientes de calidad inadecuada en las preparaciones magistrales estriles
(PME). Las PME contaminadas son potencialmente ms riesgosas para los pacientes cuando se administran en cavidades corporales, los sistemas nervioso y vascular, los ojos y las articulaciones y cuando se usan como baos para rganos y tejidos vivos. Cuando las PME contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85) son potencialmente ms riesgosas para los pacientes cuando se administran dentro del sistema nervioso central.
A pesar de la exhaustiva atencin dedicada en este captulo a la provisin, mantenimiento y evaluacin de la calidad de aire,
resulta fundamental evitar la contaminacin directa o por contacto fsico. Por lo general, se reconoce que el contacto fsico o
directo de sitios crticos de las PME con contaminantes, especialmente fuentes microbianas, representa la ms alta probabilidad
de riesgo para los pacientes. Por lo tanto, el personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente
cuidadoso en evitar la contaminacin por contacto de las PME, tanto dentro de las reas ISO Clase 5 (ver Tabla 1), como fuera
de ellas.
Con el fin de conseguir las cinco condiciones y prcticas descritas anteriormente, este captulo proporciona las normas mnimas de prctica y calidad para las PME de frmacos y nutrientes, basadas en la informacin cientfica actual, as como en las
mejores prcticas para preparaciones magistrales estriles. El uso de tecnologas, tcnicas, materiales y procedimientos distintos de los descritos en este captulo no est prohibido mientras se pruebe que son equivalentes o superiores, con significacin
estadstica, a los descritos aqu. Las normas de este captulo no se refieren a la administracin clnica de PME a pacientes mediante aplicacin, implantacin, infusin, inhalacin, inyeccin, insercin, instilacin e irrigacin, que son las rutas de administracin. En este captulo se describen cuatro categoras especficas de PME: nivel de riesgo bajo, nivel de riesgo mediano y nivel
de riesgo alto, y uso inmediato. La preparacin magistral estril difiere de la preparacin no estril (ver Preparacin Magistral
Preparaciones No Estriles 795 y Buenas Prcticas de Preparacin Magistral 1075) principalmente al requerir el mantenimiento
de la esterilidad cuando se preparan exclusivamente con ingredientes y componentes estriles (es decir, PME de uso inmediato, PME de nivel de riesgo bajo y PME de nivel de riesgo mediano) y la consecucin de esterilidad al prepararlas con ingredientes y componentes no estriles (es decir, PME de nivel de riesgo alto). Algunas diferencias entre las normas para la preparacin
magistral estril en este captulo y aquellas de las preparaciones magistrales no estriles en Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795 incluyen, entre otras, ambientes de aire con clasificacin ISO (ver Tabla 1); vestimenta y guantes del personal; capacitacin del personal y pruebas sobre principios y prcticas de manipulaciones aspticas y esterilizacin; especificaciones de calidad ambiental y monitoreos; y desinfeccin de guantes y superficies de fuentes ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Tabla 1. Clasificacin ISO de Partculas en el Aire Ambiental (los lmites se expresan en partculas mayores o iguales a 0,5 mm por metro cbico
[ISO actual] y pie cbico [anteriormente Norma Federal N 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en ingls)])*
Nombre de la Clase
Recuento de Partculas
Clase ISO
FS 209E de EE.UU.
ISO, m3
FS 209E, pie3
Clase 1
35,2
Clase 10
352
10
Clase 100
3520
100
Clase 1000
35 200
1000
Clase 10 000
352 000
10 000
* Adaptado de la FS N 209E, Administracin de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1:1999, Cleanrooms
and associated controlled environmentsPart 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partculas mayores o iguales a 0,5 mm por m3 (ISO Clase 5)
equivalen a 100 partculas por pie3 (Clase 100) (1 m3 = 35,2 pies3).
Pruebas Fsicas / 797 Preparacin MagistralPreparaciones Estriles 609
USP 38
Tabla 1. Clasificacin ISO de Partculas en el Aire Ambiental (los lmites se expresan en partculas mayores o iguales a 0,5 mm por metro cbico
[ISO actual] y pie cbico [anteriormente Norma Federal N 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en ingls)])* (Continuacin)
Nombre de la Clase
Recuento de Partculas
Clase ISO
FS 209E de EE.UU.
ISO, m3
FS 209E, pie3
Clase 100 000
3 520 000
100 000
* Adaptado de la FS N 209E, Administracin de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1:1999, Cleanrooms
and associated controlled environmentsPart 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partculas mayores o iguales a 0,5 mm por m3 (ISO Clase 5)
equivalen a 100 partculas por pie3 (Clase 100) (1 m3 = 35,2 pies3).
ORGANIZACIN DE ESTE CAPTULO

Las secciones de este captulo estn organizadas para facilitar a los profesionales de salud la comprensin de las prcticas
fundamentales relativas a la exactitud y calidad requeridas para preparar las PME. Proporcionan la base para el desarrollo e
implementacin de procedimientos esenciales para la elaboracin segura de PME de niveles de riesgo bajo, mediano y alto, y
PME de uso inmediato, las cuales se clasifican segn el potencial de contaminacin microbiana, qumica y fsica. El captulo se
divide en las siguientes secciones principales:
Definiciones
Responsabilidad del Personal de Preparacin Magistral
Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME
Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica
PME de Uso Inmediato
Envases Monodosis y Multidosis
Frmacos Peligrosos como PME
Preparados Radiofarmacuticos como PME
Extractos de Alrgenos como PME
Verificacin de la Exactitud y Esterilidad de la Preparacin Magistral
Calidad y Control Ambiental
Procedimientos Operativos Estndares (POE) Sugeridos
Elementos de Control de Calidad
Verificacin de Dispositivos Automatizados de Preparacin Magistral (DAP) para Nutricin Parenteral
Controles y Pruebas de Liberacin de las Preparaciones Terminadas
Almacenamiento y Fechado de Lmite de Uso
Mantenimiento de la Esterilidad, Pureza y Estabilidad de las PME Dispensadas y Distribuidas.
Capacitacin del Paciente o Persona Encargada de Su Cuidado
Monitoreo del Paciente e Informe de Eventos Adversos
Programa de Garanta de Calidad (QA)
Abreviaturas y Acrnimos
Captulos
Las normas en este captulo estn destinadas a todas las personas que elaboren PME y todos los sitios donde se preparen
PME (p.ej., hospitales y otras instituciones de salud, clnicas de tratamiento de pacientes, farmacias, instituciones de prctica
mdica y otras instalaciones y sitios en donde se preparen, almacenen y transporten PME). Entre las personas que hacen las
preparaciones magistrales estriles se cuentan farmacuticos, enfermeras, tcnicos de farmacia y mdicos. Estos trminos reconocen que la mayora de las preparaciones magistrales estriles las realizan o supervisan farmacuticos en farmacias y tambin
que este captulo aplica a todo el personal de salud que prepara, almacena y transporta PME. A los efectos de este captulo,
PME incluye cualquiera de las siguientes:
(1) Preparaciones magistrales de productos biolgicos, de diagnstico, frmacos, nutrientes y productos radiofarmacuticos,
incluyendo, entre otras, a las siguientes formas farmacuticas que deben estar estriles cuando se administran a pacientes:
inhalaciones bronquiales y nasales acuosas, baos y soluciones para rganos y tejidos vivos, inyecciones (p.ej., dispersiones coloidales, emulsiones, soluciones, suspensiones), irrigaciones para heridas y cavidades corporales, gotas y ungentos
oftlmicos e implantes tisulares.
(2) Productos estriles fabricados, que se preparan estrictamente de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etiquetado aprobado del fabricante (prospectos adjuntos del producto) o se preparan en forma diferente a lo publicado en dicho etiquetado. [NOTALa FDA estipula que la Preparacin Magistral no incluye mezclado, reconstitucin o acciones similares que se efecten de acuerdo con las instrucciones contenidas en el etiquetado aprobado suministrado por el fabricante del producto, as como otras instrucciones del fabricante que concuerden con el etiquetado [21 USC 321 (k) y
(m)]. Sin embargo, el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto adjunto del producto) rara vez describe la calidad ambiental (p.ej., designacin de Clase ISO del aire, la duracin de la exposicin a aire no clasificado por ISO, la vestimenta y
guantes del personal, ni otras precauciones aspticas bajo las cuales se preparan los productos estriles para administracin). La fecha o el tiempo lmite de uso y almacenamiento (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795) para productos estriles que han sido abiertos o preparados para administracin no
se especifican en todos los prospectos adjuntos de todos los productos estriles. Adems, cuando se especifican, tales duraciones pueden referirse a la estabilidad qumica y no necesariamente a la pureza o seguridad microbiolgicas.]
610 797 Preparacin MagistralPreparaciones Estriles / Pruebas Fsicas
USP 38
Apndices IV
Los requisitos y recomendaciones en este captulo se resumen en el Apndice I. Al final del texto principal, antes de los Apndices, se incluye una lista de abreviaturas y acrnimos.
Todo el personal que participa en la elaboracin de PME tiene la responsabilidad de comprender estas prcticas y precauciones fundamentales, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos procedimientos y la calidad de la PME final para evitar daos.
Captulos
DEFINICIONES
Aislador Asptico de Contencin para Preparacin Magistral (CACI, por sus siglas en ingls)Un aislador asptico para preparacin magistral (CAI, por sus siglas en ingls) diseado para proteger al trabajador de la exposicin a concentraciones
indeseables de frmacos dispersados en el aire durante los procesos de preparacin y transferencia del material y para proporcionar un ambiente asptico para la elaboracin de preparaciones magistrales estriles. No debe ocurrir intercambio de aire
con el medio que lo rodea, a menos que el aire pase primero a travs de un sistema de filtro de retencin microbiana (HEPA,
como mnimo) capaz de retener las concentraciones de partculas areas del tamao y estado fsico del frmaco que se est
preparando magistralmente. Cuando se trabaja con frmacos voltiles peligrosos, el aire de salida del aislador se debe extraer a
travs de una ventilacin debidamente diseada en el edificio.
Aislador Asptico para Preparacin Magistral (CAI, por sus siglas en ingls)Una forma de aislador especficamente
diseado para la elaboracin magistral de ingredientes o preparaciones farmacuticas. Est diseado para mantener un ambiente asptico de preparacin dentro del aislador, durante los procesos de preparacin magistral y transferencia de material.
No debe ocurrir intercambio de aire entre el aislador y el medio que lo rodea, a menos que el aire haya pasado primero a
travs de un filtro de retencin microbiana (HEPA, como mnimo).1
AntesalaUna sala ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o mejor, donde el personal efecta procedimientos de higiene de manos y
vestimenta, clasificacin de componentes, ingreso de rdenes, etiquetado de PME y otras actividades que producen gran cantidad de partculas. Es tambin un rea de transicin que (1) brinda la garanta de que las relaciones de presin se mantienen
constantemente de forma que el aire fluya de las zonas limpias a las sucias y (2) reduce la necesidad de que el control del
sistema de calefaccin, ventilacin y aire acondicionado (HVAC) responda a perturbaciones grandes.2
rea CrticaUn ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
rea Directa de Preparacin Magistral (ADP)Un rea crtica dentro de un control de ingeniera primario (CIP) ISO Clase
5 (ver Tabla 1) donde los sitios crticos se exponen a aire unidireccional filtrado por HEPA, conocido tambin como primer aire.
rea Segregada para Elaboracin de Preparaciones MagistralesUn espacio reservado, bien sea un rea demarcada o
un cuarto, que se restringe a la preparacin de PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Dicha rea debe
contener un dispositivo que proporcione flujo de aire unidireccional de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la elaboracin de
PME y no debe destinarse a actividades ni contener materiales que sean extraos a la preparacin magistral estril.
Cabina de Seguridad Biolgica (CSB)Una cabina ventilada para proteccin ambiental, de la PME, del personal y del
producto, que tiene un frente abierto, con flujo de aire hacia el interior para proteccin del personal, flujo de aire laminar descendente con filtracin de alta eficiencia para partculas areas (HEPA, por sus siglas en ingls) para proteccin del producto y
salida de aire con filtracin HEPA para proteccin ambiental.
Control de Ingeniera Primario (CIP)Un dispositivo o cuarto que brinda un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la
exposicin de sitios crticos cuando se elaboran las PME. Dichos dispositivos incluyen, entre otros, cabinas de flujo laminar
(CFL), cabinas de seguridad biolgica (CSB), aisladores aspticos para preparacin magistral (CAI) y aisladores aspticos de
contencin para preparacin magistral (CACI).
Cuarto de Presin NegativaUn cuarto que est a presin ms baja que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia el cuarto.2
Cuarto de Presin PositivaUn cuarto que est a presin ms alta que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto
de aire es hacia afuera del cuarto.2
Cuarto Limpio (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116 y tambin la definicin
de Zona Amortiguadora)Un cuarto en el que se controla la concentracin de partculas en el aire para que cumpla con una
clasificacin de limpieza especificada de partculas areas. Se monitorean los microorganismos en el ambiente para que la concentracin microbiana en el aire, las superficies y el atuendo del personal no exceda el lmite de limpieza especificado.
DesinfectanteUn agente, generalmente un agente qumico pero en ocasiones fsico, que libra de la infeccin y destruye
los patgenos causantes de enfermedad u otros microorganismos peligrosos, pero que no necesariamente elimina esporas
bacterianas o fngicas. Se refiere a sustancias aplicadas a objetos inanimados.
Empaque a Granel para Farmacias (ver Envases para Inyecciones en Inyectables 1)Un envase de una preparacin estril
para uso parenteral que contiene muchas dosis nicas. El contenido est destinado para su uso en un programa de mezclas de
farmacia y est restringido a la preparacin de mezclas para infusin o, a travs de un dispositivo de transferencia estril, para
el llenado de jeringas estriles vacas. El cierre se perforar slo una vez despus de la reconstitucin, usando un dispositivo de
transferencia o set de dispensacin estril y adecuado que permita la distribucin medida del contenido. El empaque a granel
1 CETA Applications Guide for the Use of Compounding Isolators in Compounding Sterile Preparations in Healthcare Facilities, CAG-001-2005, Controlled Environment
Testing Association (CETA), 8 de noviembre de 2005.
2 Ver Laboratory Design Guide (Gua de diseo del laboratorio) de la American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers, Inc. (ASHRAE).
USP 38
3 U.S. Food and Drug Administration, Guidance for Industry, Sterile Drug Products Produced by Aseptic ProcessingCurrent Good Manufacturing Practice, septiembre
de 2004.
Captulos
para farmacias slo se emplear en un rea de trabajo adecuada, como por ejemplo una campana de flujo de aire laminar (o
un rea equivalente de preparacin magistral de aire limpio).
Cuando se ofrezca un envase como empaque a granel para farmacias, la etiqueta debe (a) indicar en forma visible Empaque a Granel para Farmacias, No Usar para Infusin Directa, (b) contener o referir a informacin sobre las tcnicas apropiadas
para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una leyenda que limite el plazo dentro del cual se puede utilizar el envase una vez que ha sido perforado, siempre y cuando se mantenga bajo las condiciones de almacenamiento declaradas.
Envase Monodosis (ver Advertencias y Requisitos Generales y Envases para Inyecciones en Inyectables 1)Un envase monodosis es un envase unitario para artculos (ver Advertencias y Requisitos Generales) o preparaciones destinadas solamente a la
administracin por va parenteral. Est destinado a un solo uso. Debe estar etiquetado como envase monodosis. Ejemplos de
envases monodosis son: jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusin y envases con cierres sellados, cuando se
los etiquete como tales.
Envase Multidosis (ver Advertencias y Requisitos Generales y Envases para Inyecciones en Inyectables 1)Un envase de unidades mltiples para artculos o preparaciones destinadas a administracin parenteral solamente y que por lo general contiene
conservantes antimicrobianos. La fecha lmite de uso (FLU) para un envase multidosis abierto o perforado (p.ej., perforado con
aguja), que tiene conservantes antimicrobianos, es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51), a menos que el fabricante especifique algo distinto.
Esterilizacin por FiltracinPaso de un lquido o solucin a travs de una membrana de grado de esterilizacin para producir un efluente estril.
Esterilizacin TerminalAplicacin de un proceso letal (p.ej., vapor bajo presin o autoclavado) a los envases sellados,
con el fin de conseguir un nivel de garanta de esterilidad predeterminado, generalmente menor que 106, o una probabilidad
de menos de uno en un milln de que haya una unidad no estril.3
Etiquetado [ver Advertencias y Requisitos Generales y 21 USC 321 (k) y (m)]Trmino que se refiere a todas las etiquetas o
marbetes y dems materiales escritos, impresos o grficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artculo
o preparacin, sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio en que est incluido, con excepcin de los embalajes externos destinados al transporte. El trmino etiqueta designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
Frmacos PeligrososLos frmacos se clasifican como peligrosos si los estudios en animales o humanos indican que la exposicin a ellos tiene potencial para causar cncer, toxicidad reproductiva o del desarrollo, o daos a los rganos. (Ver la publicacin actual de NIOSH).
Fecha Lmite de Uso (FLU) (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles
795)A los efectos de este captulo, la fecha u hora despus de la cual no se debe almacenar o transportar una PME. Esta
fecha se determina a partir de la fecha u hora de preparacin.
Flujo Unidireccional (ver nota 3 al pie de pgina)Un flujo de aire que se mueve en una sola direccin de una forma robusta y uniforme y a una velocidad suficiente como para barrer las partculas lejos del rea crtica de prueba o procesamiento,
en forma reproducible.
Membranas de Grado de EsterilizacinMembranas para las que se ha documentado que retienen 100% de un cultivo
de 107 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta por centmetro cuadrado de superficie de
membrana bajo una presin de no menos de 30 psi (2,0 bar). Dichas membranas de filtro tienen tamao de poro nominal de
0,22 mm o 0,2 mm, dependiendo de la prctica utilizada por el fabricante.
PreparacinUna preparacin, o una PME, que es un medicamento o nutriente estril preparado magistralmente en una
farmacia autorizada u otra institucin relacionada con la salud, de acuerdo con la orden de un prescriptor autorizado; el artculo puede contener productos estriles o no.
Primer AireEl aire que sale del filtro HEPA en una corriente unidireccional que carece prcticamente de partculas.
Procesamiento Asptico (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116)Una modalidad de procesar productos farmacuticos y mdicos que involucra la esterilizacin por separado del producto y del empaque (envases y cierres o material de empaque para dispositivos mdicos) y la transferencia del producto al envase y su cierre en
condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 1) como mnimo.
ProductoUn medicamento o nutriente estril fabricado comercialmente, cuya seguridad y eficacia han sido evaluadas por
la FDA. Los productos van acompaados de informacin completa para prescribir, la cual se conoce comnmente como el
etiquetado del fabricante aprobado por la FDA o prospecto adjunto del producto.
Prueba de Llenado de Medios (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116)Una
prueba utilizada para calificar los procesos o la tcnica asptica del personal que elabora la preparacin magistral, y con el fin
de garantizar que con los procesos usados se puedan elaborar productos estriles sin contaminacin microbiana. Durante esta
prueba, se sustituye el producto farmacutico real con un medio de crecimiento microbiano, como el Medio de Digerido de
Casena y Soja, para simular la mezcla de la preparacin magistral.3 Los puntos que se deben considerar en el desarrollo de la
prueba de llenado de medios son: procedimientos de llenado de medios, seleccin de medios, volumen de llenado, incubacin, tiempo y temperatura, inspeccin de las unidades llenas, documentacin, interpretacin de los resultados y posibles acciones correctivas requeridas.
USP 38
Sitio CrticoUn sitio que incluye cualquier componente o superficies de recorrido de lquidos (p.ej., septos de viales,
puertos de inyeccin, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en
riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas) o
contaminacin por contacto. En el sitio crtico, el riesgo de contaminacin microbiana por partculas aumenta con el tamao
de las aberturas y el tiempo de exposicin.
Zona AmortiguadoraEl sitio donde est localizado fsicamente el control de ingeniera primario (CIP). Las actividades que
ocurren en esta rea incluyen la preparacin y clasificacin de componentes y suministros usados al preparar la PME.
Captulos
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIN MAGISTRAL

El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de asegurar que las PME estn debidamente identificadas, medidas, diluidas y mezcladas, y correctamente purificadas, esterilizadas, envasadas, selladas, etiquetadas, almacenadas, dispensadas y distribuidas. Estas responsabilidades incluyen el mantenimiento de condiciones higinicas apropiadas y el suministro de
etiquetado e instrucciones suplementarias para la administracin clnica correcta de las PME.
Los supervisores de preparacin magistral deben asegurar, ya sea mediante la evaluacin directa o a travs de fuentes de
informacin apropiadas, que cada PME mantiene el contenido declarado hasta su FLU dentro de los lmites de la monografa
correspondiente de USP, o dentro de un 10% de variacin en los casos no especificados. Todas las PME deben prepararse de
manera tal que se mantenga la esterilidad y se reduzca al mnimo la introduccin de partculas.
Todo procedimiento escrito de garanta de calidad debe incluir los siguientes controles de proceso, los cuales debern aplicarse, segn corresponda, a las PME especficas: exactitud y precisin de la medicin y pesado; requisitos de esterilidad; mtodos de esterilizacin y purificacin; intervalos y lmites seguros de concentracin de ingredientes, endotoxinas bacterianas y
partculas; pH; totalidad y exactitud de la informacin incluida en el etiquetado; asignacin de la FLU; y requisitos de empaque
y almacenamiento. El dispensador deber, cuando corresponda y sea factible, obtener y evaluar los resultados de las pruebas
de identidad, contenido, pureza y esterilidad antes de dispensar una PME. Los profesionales de la salud, calificados y autorizado, a cargo de supervisar la preparacin magistral y la dispensacin de las PME debern asegurar que se cumplan los siguientes objetivos:
1. El personal de preparacin magistral debe contar con las habilidades, educacin, instruccin y capacitacin apropiadas
para realizar y documentar correctamente las siguientes actividades relacionadas con sus responsabilidades en la preparacin estril:
a. realizar la limpieza antisptica de manos y desinfeccin de las superficies de preparacin no estriles;
b. seleccionar y colocarse la vestimenta en forma apropiada;
c. mantener o conseguir la esterilidad de las PME en dispositivos CIP, ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y proteger al personal y
a los ambientes de preparacin magistral de la contaminacin por frmacos radioactivos, citotxicos y quimiotxicos
(ver Frmacos Peligrosos como PME y Preparados Radiofarmacuticos como PME);
d. identificar, pesar y medir los ingredientes; y
e. manipular los productos estriles en forma asptica, esterilizar las PME de nivel de riesgo alto y etiquetar e inspeccionar la calidad de las PME.
2. Los ingredientes deben tener la identidad, calidad y pureza correctas.
3. Los envases de ingredientes abiertos o parcialmente usados que se van a emplear posteriormente en PME deben almacenarse apropiadamente bajo condiciones de acceso restringido en las instalaciones donde se realiza la preparacin magistral. Dichos envases no podrn utilizarse cuando se detecte en una inspeccin visual que hay roturas no autorizadas en el
envase, cierre y sello; cuando el contenido no posea el aspecto, aroma y textura esperados; cuando el contenido no pase
las pruebas de identificacin especificadas por la institucin responsable de la preparacin magistral, y cuando haya excedido la FLU o fecha de caducidad.
4. Las PME que contienen agua y que son no estriles durante cualquier fase del procedimiento de preparacin deben esterilizarse dentro de las 6 horas posteriores a la finalizacin de la preparacin, para reducir al mnimo la generacin de endotoxinas bacterianas.
5. Los mtodos de esterilizacin deben lograr la esterilidad de las PME, manteniendo el contenido declarado de los ingredientes activos y la integridad fsica del envase.
6. Los dispositivos utilizados para medicin, mezclado, esterilizacin y purificacin deben estar limpios y ser apropiadamente
exactos y eficaces para los usos a los que estn destinados.
7. Se debe evaluar cuidadosamente el dao potencial relacionado con las sustancias agregadas, y las diferencias en el grado
y la velocidad de biodisponibilidad de los ingredientes activos para las vas de administracin no oral antes de dispensar y
administrar dichas PME.
8. El envase seleccionado para las PME debe ser apropiado para conservar la esterilidad y el contenido hasta la FLU.
9. Durante su uso, el entorno de preparacin magistral debe mantener la esterilidad o la pureza previa a la esterilizacin de
la PME, segn corresponda.
10. Las etiquetas de las PME deben indicar los nombres y las cantidades o concentraciones de los ingredientes activos; y las
etiquetas o etiquetado de inyecciones (ver Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales) enumeran los nombres y las cantidades o concentraciones de todos los ingredientes (ver Inyectables
1). Antes de su dispensacin o administracin, debe verificarse visualmente la transparencia de las soluciones y, adems,
USP 38
deben revisarse la identidad y la cantidad de los ingredientes, los procedimientos de preparacin y esterilizacin de las
PME y los criterios de liberacin especficos para asegurarse de que sean exactos y completos.
11. Las FLU deben asignarse basndose en pruebas directas o por extrapolacin de publicaciones de referencia y otra documentacin confiables (ver Criterios de Estabilidad y Fecha Lmite de Uso en Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles
795).
12. Los procedimientos para medir, mezclar, diluir, purificar, esterilizar, envasar y etiquetar deben ajustarse a la secuencia correcta y al nivel de calidad establecido para cada PME en particular.
13. Las deficiencias en la preparacin magistral, etiquetado, envasado y pruebas e inspeccin de calidad deben poder detectarse y corregirse rpidamente.
14. Cuando el tiempo y la disponibilidad de personal lo permitan, las manipulaciones y los procedimientos de preparacin
magistral deben estar separados de la inspeccin y revisin de calidad postpreparacin que se llevan a cabo antes de la
dispensacin de las PME.
Este captulo enfatiza la necesidad de mantener estndares elevados de calidad y control en relacin con los procesos, componentes y ambientes de preparacin, y en relacin con las habilidades y los conocimientos del personal a cargo de la elaboracin de las PME. El rigor de los controles de calidad durante el proceso, de la inspeccin y pruebas de calidad posteriores a la
preparacin, aumenta en forma proporcional al nivel de riesgo potencial que supone la va de administracin. Por ejemplo, la
falta de esterilidad, la contaminacin excesiva con endotoxinas bacterianas, los errores significativos en la concentracin de los
ingredientes y el uso de ingredientes incorrectos en las PME son potencialmente ms peligrosos para los pacientes cuando stas se administran en el sistema vascular y en el sistema nervioso central que cuando se lo hace a travs de las otras vas.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIN MICROBIANA EN LAS PME
PME de Nivel de Riesgo Bajo

Las PME preparadas en las siguientes condiciones tienen un riesgo bajo de contaminacin.
Condiciones de Riesgo Bajo
1. Las PME se preparan mediante manipulacin asptica y en un ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1)
o una calidad de aire superior usando nicamente ingredientes, productos, componentes y dispositivos estriles.
2. La preparacin magistral slo incluye manipulaciones de transferencia, medicin y mezclado usando no ms de tres empaques de productos estriles fabricados comercialmente y no ms de dos ingresos en cualquier envase estril o empaque
(p.ej., bolsa, vial) del producto estril o envase/dispositivo de administracin para preparar la PME.
3. Las manipulaciones se limitan a la apertura asptica de ampollas, la penetracin de tapones desinfectados de viales con
agujas y jeringas estriles, y la transferencia de lquidos estriles en jeringas estriles a dispositivos de administracin estril, envases de otros productos estriles y envases para almacenamiento y dispensacin.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo bajo, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de
Esterilidad 71), los perodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administracin,
Captulos
Las tres categoras de contaminacin descritas para PME en esta seccin se asignan principalmente de acuerdo con el potencial de contaminacin microbiana durante la preparacin magistral de PME de nivel de riesgo bajo y nivel de riesgo mediano o
el potencial que representa la falta de esterilizacin de las PME de nivel de riesgo alto, en donde cualesquiera de stas podra
ocasionar daos, o incluso la muerte del paciente. Las PME de nivel de riesgo alto se deben esterilizar antes de administrarlas a
los pacientes. Para asignar a una PME el nivel de riesgo correspondientebajo, mediano o altodeben tenerse en cuenta las
probabilidades de que sta sufra (1) contaminacin microbiana (p.ej., microorganismos, esporas y endotoxinas) y (2) contaminacin qumica y fsica (p.ej., sustancias qumicas y materias fsicas extraas). Las fuentes potenciales de contaminacin incluyen, entre otras, sustancias slidas y lquidas provenientes del personal y los objetos utilizados en la preparacin magistral;
componentes no estriles empleados e incorporados antes de la esterilizacin terminal; las condiciones inapropiadas dentro del
ambiente controlado de preparacin; los procedimientos de preesterilizacin prolongados en el caso de preparaciones acuosas; y formas farmacuticas no estriles usadas en la elaboracin de las PME.
Las caractersticas que se describen a continuacin para PME de nivel de riesgo bajo, mediano y alto deben considerarse
como una gua sobre el grado y rigor de cuidado necesario en la preparacin magistral, pero no es exhaustiva ni prescriptiva.
Los profesionales de la salud autorizados, a cargo de supervisar las preparaciones magistrales tienen la responsabilidad de determinar las prcticas de calidad de los procedimientos y del ambiente, y los atributos necesarios para el nivel de riesgo asignado a cada PME.
Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME inmediatamente despus del mezclado o llenado aspticos finales o
inmediatamente despus de la esterilizacin final, a menos que lo impidan las caractersticas especficas de la preparacin. Despus del almacenamiento y transporte de las PME recin terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degradacin qumica de los ingredientes, contaminacin por daos fsicos en los envases y permeabilidad de los envases de plstico y
elastomricos. En estos casos, el personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de considerar los riesgos adicionales potenciales para la integridad de las PME al momento de asignar las FLU. La duracin del almacenamiento previo a la administracin y los lmites de temperatura especificados en las siguientes subsecciones se aplican cuando no existan resultados directos de pruebas de esterilidad que justifiquen lmites diferentes para las PME especficas.
Captulos
USP 38
las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no ms de 48 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no ms de 14 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requisitos
Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin entre 25 y 10.
Ejemplos de Preparacin Magistral de Riesgo Bajo
1. Transferencias nicas de formas farmacuticas estriles desde ampollas, frascos, bolsas y viales, usando jeringas estriles
con agujas estriles, otros dispositivos de administracin y otros envases estriles. El contenido de la solucin de las ampollas debe pasarse a travs de un filtro estril para retirar cualquier partcula.
2. Medicin y transferencia asptica simple con no ms de tres empaques de productos estriles fabricados comercialmente,
incluyendo una solucin para infusin o diluyente para elaborar las mezclas de frmacos y soluciones nutricionales.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o MenosSi el CIP es un CAI o un CACI que no cumple con los
requisitos descritos en Colocacin de Controles de Ingeniera Primarios o es una cabina de flujo laminar (CFL) o una cabina de
seguridad biolgica (CSB) que no puede ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces slo
se pueden preparar PME no peligrosas y preparados radiofarmacuticos de nivel de riesgo bajo, segn las rdenes de un mdico para un paciente especfico y la administracin de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparacin o
segn lo recomendado en el prospecto adjunto del fabricante, cualquiera que sea menor. Las PME de nivel de riesgo bajo y
con FLU de 12 horas o menos deben cumplir con los cuatro criterios siguientes:
1. Los CIP (CFL, CSB, CAI, CACI) deben certificarse y mantenerse como ISO Clase 5 (ver Tabla 1) segn se describe en Diseo
de la Instalacin y Controles Ambientales para la exposicin de sitios crticos y deben estar en un rea segregada de preparacin magistral y restringida a actividades de preparacin estril que minimicen el riesgo de contaminacin de la PME.
2. El rea segregada de preparacin magistral no debe estar en una instalacin que tenga ventanas o puertas sin sellar que
conecten con el exterior o que tenga un flujo de trfico alto, o que est adyacente a sitios de construccin, almacenamiento o preparacin de alimentos. Se debe tener en cuenta que sta no pretende ser una lista exhaustiva.
3. El personal debe seguir los procedimientos descritos en Limpieza y Vestimenta del Personal y Requisitos Adicionales del Personal antes de la preparacin magistral. Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Los lavabos deben estar separados del rea inmediata del dispositivo de CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
4. Segn se describe en el captulo, se deben seguir las especificaciones de Limpieza y Desinfeccin de las reas de Preparacin
Magistral Estril, Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin, as como Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) para Partculas Viables y No Viables.
El personal de preparacin magistral debe reconocer que la ausencia de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1)
en un ambiente general no controlado aumenta la probabilidad de contaminacin microbiana, y que la duracin de la administracin de PME contaminadas con microbios que exceda de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonizacin microbiana clnicamente significativa y por lo tanto de dao para el paciente, especialmente si se trata de pacientes crticamente
enfermos o inmunocomprometidos.
Garanta de CalidadLas prcticas de garanta de calidad incluyen, entre otras, las siguientes:
1. Desinfeccin rutinaria y pruebas de calidad del aire del entorno de preparacin directo para reducir al mnimo la contaminacin microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
2. Verificacin visual de que el personal de preparacin magistral est usando correctamente los elementos y los tipos de
vestimenta protectora apropiados, incluyendo gafas y mscaras.
3. Revisin de todas las rdenes y envases de ingredientes para asegurar que la identidad y cantidad de los ingredientes incorporados en la preparacin magistral fueron los correctos.
4. Inspeccin visual de las PME para asegurar la ausencia de partculas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y
bolsas y la informacin exacta y completa del etiquetado.
Procedimiento de Prueba de Llenado de MediosEsta prueba, u otra equivalente, debe ser efectuada al menos una vez
al ao por cada persona autorizada para realizar una preparacin en un entorno de nivel de riesgo bajo, en condiciones que
simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de PME de nivel de riesgo bajo. Una
vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de
calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir tres series de cuatro alcuotas de 5 mL de Medio de Digerido de Casena y
Soja estril (tambin conocido como caldo tripticasa de soja o agar tripticasa de soja [TSA]), con la misma combinacin de
jeringa de 10 mL y aguja con venteo estriles, a viales separados de 30 mL, transparentes, vacos, sellados y estriles (es decir,
cuatro alcuotas de 5 mL a cada uno de los tres viales de 30 mL). Fijar aspticamente sellos adhesivos estriles a los tapones de
goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20 y 25 o entre 30 y 35 durante un mnimo de 14 das. Si
se usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico
1116). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbiano, segn se describe en la seccin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de
Limpieza y Desinfeccin.
PME de Nivel de Riesgo Mediano

Cuando las PME se preparan aspticamente bajo Condiciones de Riesgo Bajo, y existe una o ms de las siguientes condiciones,
dichas PME tienen un riesgo mediano de contaminacin.
USP 38
PME de Nivel de Riesgo Alto

Las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones indicadas a continuacin estn contaminadas o tienen un riesgo alto
de contaminarse.
Condiciones de Riesgo Alto
1. Se incorporan ingredientes no estriles, incluyendo productos fabricados comercialmente que no estn destinados para
vas de administracin estriles (p.ej., oral) o se emplea un dispositivo no estril antes de la esterilizacin terminal.
2. Cualquiera de los siguientes elementos se exponen a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante ms de 1
hora (ver PME de Uso Inmediato):
contenido estril de productos fabricados comercialmente,
PME que carecen de conservantes antimicrobianos eficaces, y
superficies estriles de dispositivos y envases para la preparacin, transferencia, esterilizacin y envasado de PME.
3. El personal de preparacin magistral tiene vestimenta y guantes inapropiados (ver Limpieza del Personal y Uso de Equipo
Protector de Barrera).
4. Las preparaciones no estriles que contienen agua se almacenan durante ms de 6 horas antes de su esterilizacin.
5. Se presume, sin verificar el etiquetado y la documentacin de los proveedores o sin determinacin directa, que la pureza
qumica y el contenido de los ingredientes cumplen con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases no
abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Seleccin de Ingredientes en Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795).
Captulos
Condiciones de Riesgo Mediano

1. Se combinan o agrupan mltiples dosis individuales o pequeas de productos estriles para preparar una PME que se administrar a varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones.
2. El proceso de preparacin magistral incluye manipulaciones aspticas complejas, aparte de la transferencia de volumen
nica.
3. El proceso de preparacin magistral tiene una duracin inusualmente prolongada, como la requerida para completar la
disolucin o el mezclado homogneo.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo mediano, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas
de Esterilidad 71), los perodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administracin, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no ms de 30 horas a temperatura ambiente
controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no ms de 9 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin entre 25 y 10.
Ejemplos de Preparacin Magistral de Riesgo Mediano
1. Preparacin magistral de lquidos para nutricin parenteral total usando dispositivos manuales o automatizados durante la
que se realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de los productos que se usan como fuente de nutrientes al
dispositivo o mquina para suministrar todos los componentes nutricionales a un envase estril final.
2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyeccin e infusin con ms de tres productos farmacuticos estriles y evacuacin del aire presente en dichos reservorios antes de dispensar el dispositivo llenado.
3. Transferencia de volmenes de mltiples ampollas o viales a uno o ms envases estriles finales.
Garanta de CalidadLos procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos
procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, adems, una prueba de llenado de medios ms exigente, que debe
realizarse en forma anual o con mayor frecuencia.
Procedimiento de Prueba de Llenado de MediosEsta prueba, u otra equivalente, debe realizarse al menos anualmente
en condiciones que simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de preparaciones
magistrales. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de
un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir aspticamente por gravedad seis alcuotas de 100 mL de
Medio Digerido de Casena y Soja estril a travs de tubuladuras separadas, a sendos recipientes estriles evacuados. A continuacin, distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinacin estril de jeringa de 10 mL y aguja de calibre 18
para intercambiar dos alcuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por ejemplo, despus de agregar una alcuota de 5 mL del primer recipiente al segundo recipiente del par, agitar este ltimo durante 10 segundos, tomar una alcuota
de 5 mL y volver a colocarla en el primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante 10 segundos y transferir
la siguiente alcuota de 5 mL de vuelta al segundo recipiente del par. Despus de los dos intercambios de alcuotas de 5 mL en
cada par de recipientes, inyectar aspticamente una alcuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial de 10 mL, transparente, vaco, sellado y estril, usando una jeringa de 10 mL y una aguja con venteo estriles. Fijar aspticamente sellos adhesivos estriles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20 y 25 o entre 30 y 35 por
un mnimo de 14 das. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de las muestras de llenado de medios, entonces tales
envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbiano, segn se describe en la seccin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de
Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin.
Captulos
USP 38
Si las preparaciones esterilizadas de nivel de riesgo alto no han pasado una prueba de esterilidad, los perodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administracin, las PME deben almacenarse de forma apropiada
y exponerse durante no ms de 24 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante
no ms de 3 das a temperatura fra (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 das en estado slido de congelacin
entre 25 y 10. [NOTA No se requieren pruebas de esterilidad para PME esterilizadas en autoclave, a menos que se preparen en lotes de ms de 25 unidades.]
Todos los dispositivos de medicin, mezclado y purificacin no estriles deben enjuagarse bien con agua estril apirgena y
luego deben escurrirse o secarse en su totalidad inmediatamente antes de utilizarlos para realizar preparaciones magistrales de
riesgo alto. Todas las soluciones PME de nivel de riesgo alto sometidas a esterilizacin terminal deben prefiltrarse, pasndolas
por un filtro con un tamao de poro nominal de no ms de 1,2 mm, antes o durante el llenado de los envases finales, con el fin
de retirar las partculas. La esterilizacin por filtracin de las PME de nivel de riesgo alto debe realizarse con un filtro estril de
tamao de poro nominal de 0,2 mm o 0,22 mm, totalmente en un entorno con calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o
superior.
Ejemplos de Condiciones de Riesgo Alto
1. Disolucin de polvos de frmacos y nutrientes a granel no estriles para preparar soluciones que se esterilizarn en forma
terminal.
2. Exposicin de los ingredientes y componentes estriles usados para preparar y envasar PME en una calidad de aire inferior
a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante ms de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato).
3. Medicin y mezclado de ingredientes estriles en dispositivos no estriles antes de su esterilizacin.
4. Se supone, sin evidencia apropiada ni determinacin directa, que los envases de ingredientes a granel contienen al menos
un 95% en peso de su parte qumica activa y que no se han contaminado ni adulterado entre un uso y otro.
Garanta de CalidadLos procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedimientos que para las PME de riesgo bajo. Adems, cada persona autorizada para elaborar PME de riesgo alto, debe realizar
semestralmente una prueba de llenado de medios que represente una preparacin magistral de nivel de riesgo alto.
Procedimiento de Llenado de Medios para PME Esterilizadas por FiltracinEsta prueba, u otra equivalente, debe realizarse en condiciones que simulen las situaciones ms difciles o extremas que se encuentran durante la elaboracin de preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo del procedimiento de prueba (en la siguiente secuencia):
1. Disolver en 100 mL de agua no bacteriosttica 3 g de Medio de Digerido de Casena y Soja no estril disponible comercialmente para preparar una solucin no estril al 3%.
2. Extraer 25 mL del medio en tres jeringas estriles de 30 mL. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 10 mL
estriles. Estos viales son los controles positivos para generar un crecimiento microbiano exponencial, el cual se evidencia
por una turbidez visible despus de su incubacin.
3. Bajo condiciones aspticas y utilizando tcnicas aspticas, fijar a cada jeringa una unidad de filtracin estril con un tamao de poro nominal de 0,2 mm o 0,22 mm y una aguja de calibre 20. Inyectar los siguientes 10 mL de cada jeringa en tres
viales de 10 mL estriles. Repetir el proceso en tres viales ms. Etiquetar todos los viales, fijar sellos adhesivos estriles al
cierre de los nueve viales e incubarlos a una temperatura de 20 a 25 o de 30 a 35 durante un mnimo de 14 das. Si se
usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento
Asptico 1116). Inspeccionar los viales durante 14 das para detectar cualquier crecimiento microbiano, segn se describe en la seccin Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y
Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin.
CAPACITACIN Y EVALUACIN DEL PERSONAL EN TCNICAS DE MANIPULACIN ASPTICA

El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda de instruccin audiovisual y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conocimientos prcticos en las manipulaciones aspticas, as como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO
Clase 5 (ver Tabla 1) antes de empezar a preparar las PME. Inicialmente, el personal de preparacin magistral deber realizar
una revisin didctica y pasar pruebas escritas y de llenado de medios para evaluar la destreza en la manipulacin asptica; en
adelante, se sometern a dichas pruebas al menos una vez al ao, en el caso de preparaciones magistrales de niveles de riesgo
bajo y mediano, y semestralmente, en el caso de preparaciones de nivel de riesgo alto. El personal de preparacin magistral
que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonizacin microbiana profusa, deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en
preparacin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica.
Prueba de Desafo de Llenado de MediosLa destreza del personal para preparar PME aspticamente se puede evaluar
usando una verificacin de llenado de medios de cultivos bacterianos lquidos y estriles3 (es decir, transferencia de un medio
de cultivo bacteriano estril a travs de una jeringa y aguja estriles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
prctica asptica del personal de preparacin magistral. Las pruebas de llenado de medios representan las condiciones ms
exigentes o difciles con las que el personal en proceso de evaluacin puede encontrarse durante la elaboracin de PME de un
determinado nivel de riesgo y durante la esterilizacin de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafo de llenado de
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medios que simulan la elaboracin de PME de nivel de riesgo alto se usan tambin para verificar la capacidad del ambiente y
del proceso de preparacin magistral para producir una preparacin estril.
Los medios lquidos de cultivo estriles disponibles comercialmente, como el Medio de Digerido de Casena y Soja (ver Pruebas de Esterilidad 71), debern promover la colonizacin exponencial de las bacterias que el personal de preparacin magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20 a 25 o
de 30 a 35 durante 14 das como mnimo. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de muestras de llenado de medios,
entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116). Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 das, significa que no se ha pasado la prueba.
PME DE USO INMEDIATO
ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS

Los envases monodosis abiertos o perforados con aguja, tales como bolsas, frascos, jeringas y viales de productos estriles y
PME se deben usar dentro de 1 hora si se abren en aire de calidad inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) (ver PME de Uso Inmediato) y desechar cualquier contenido restante. Los viales monodosis expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o ms limpio se
pueden usar hasta 6 horas despus de la perforacin inicial con la aguja. Las ampollas monodosis abiertas no se deben almacenar por ningn perodo. Los envases multidosis (p.ej., viales) estn formulados para retirar porciones en mltiples ocasiones,
porque generalmente contienen conservantes antimicrobianos. La FLU despus de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51), a menos que el fabricante especifique algo distinto.
FRMACOS PELIGROSOS COMO PME

Aunque los beneficios teraputicos potenciales de las preparaciones magistrales estriles de frmacos peligrosos por lo general sobrepasan los riesgos de sus efectos adversos en pacientes enfermos, los profesionales de la salud expuestos se arriesgan a
efectos adversos similares, sin ningn beneficio teraputico. La exposicin ocupacional a frmacos peligrosos pueden llevar a
(1) efectos agudos, como erupciones cutneas; (2) efectos crnicos, incluso eventos adversos reproductivos; y (3) posiblemente cncer (ver Apndice A de NIOSH Publication N 2004-165).
Captulos
La provisin de uso inmediato est destinada slo a aquellas situaciones en las cuales es necesario administrar de emergencia
o en forma inmediata una PME a un paciente. Dichas situaciones pueden incluir reanimacin cardiopulmonar, tratamiento en
sala de emergencias, preparacin de agentes de diagnstico, o terapia crtica donde la preparacin de la PME bajo las condiciones descritas para PME de Nivel de Riesgo Bajo somete al paciente a un riesgo adicional debido a las demoras en la terapia.
Las PME de uso inmediato no estn destinadas a almacenamiento para necesidades anticipadas o preparacin magistral de
lotes. Las preparaciones magistrales que tienen nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto no deben prepararse como PME
de uso inmediato.
Las PME de uso inmediato estn eximidas de los requisitos descritos para PME de Nivel de Riesgo Bajo, slo cuando se cumplen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparacin magistral incluye la transferencia simple de no ms de tres empaques fabricados comercialmente de productos estriles no peligrosos o productos radiofarmacuticos de diagnstico desde los envases originales del fabricante, y no ms de dos ingresos dentro de cualquier envase estril o empaque individual (p.ej., bolsa, vial) de solucin
estril para infusin o envase/dispositivo de administracin. Por ejemplo, los antineoplsticos no deben prepararse como
PME de uso inmediato porque son frmacos peligrosos.
2. A menos que la preparacin lo requiera, el procedimiento de preparacin magistral es un proceso continuo que no debe
exceder 1 hora.
3. Durante la preparacin, se sigue una tcnica asptica y, de no administrarse inmediatamente, la PME terminada permanece bajo supervisin continua para minimizar el potencial de contacto con superficies no estriles, la introduccin de partculas o lquidos biolgicos, la mezcla con otras PME y el contacto directo de las superficies externas.
4. La administracin comienza a ms tardar una hora despus de haber comenzado la preparacin de la PME.
5. A menos que el prepador administre inmediata y completamente la PME, o el preparador vigile la administracin inmediata y completa de la misma, la PME debe llevar una etiqueta que indica la informacin de identificacin del paciente, los
nombres y las cantidades de todos los ingredientes, el nombre o iniciales de la persona que prepar la PME, as como la
FLU de 1 hora y la hora exactas.
6. Si la administracin no ha comenzado dentro de 1 hora de haberse iniciado la preparacin de la PME, sta debe descartarse de inmediato en forma segura y adecuada.
La preparacin en condiciones inferiores a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) aumenta la probabilidad de contaminacin microbiana,
y la duracin de la administracin de PME contaminadas con microbios cuando excede de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonizacin microbiana clnicamente significativa y por lo tanto de dao para el paciente, especialmente si se trata
de pacientes crticamente enfermos o inmunocomprometidos.
Captulos
USP 38
Los frmacos peligrosos se deben preparar para administracin slo bajo condiciones que protejan a los profesionales de la
salud y a otro personal en las reas de preparacin y almacenamiento. Los frmacos peligrosos se deben almacenar separados
de otro inventario, de manera que se evite la contaminacin y la exposicin del personal. Muchos frmacos peligrosos tienen
presiones de vapor suficientes que permiten la volatilizacin a temperatura ambiente; por lo tanto, se prefiere el almacenamiento dentro de un rea de contencin, tal como un cuarto de presin negativa. El rea de almacenamiento debe tener suficiente ventilacin general de salida, con al menos 12 cambios de aire por hora (CAPH)4 para diluir y retirar cualquier contaminante areo.
Los frmacos peligrosos se deben manejar con precaucin en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepcin, distribucin, aprovisionamiento, inventariado, preparacin para administracin y eliminacin. Los frmacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1), con controles de ingeniera protectores y siguiendo las prcticas aspticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminacin apropiados definidos en este captulo.
Se debe limitar el acceso a las reas donde se almacenen y elaboren preparaciones de frmacos para proteger a las personas
que no estn involucradas en tal proceso.
Todos los frmacos peligrosos se deben preparar en una CSB5 o un CACI que cumple o excede los estndares para CACI en
este captulo. Las CSB o los CACI ISO Clase 5 (ver Tabla 1) deben ubicarse en un rea ISO Clase 7 (ver Tabla 1) que est fsicamente separada (es decir, un rea diferente de las reas de preparacin) y que tenga ptimamente una presin negativa de no
menos de 0,01 pulgadas de columna de agua con respecto a las antesalas adyacentes de presin positiva ISO Clase 7 (ver
Tabla 1) o mejor, proporcionando as un flujo hacia adentro para contener cualquier partcula de frmaco presente en el aire.
Se debe instalar un indicador de presin en el que pueda consultarse fcilmente la correcta presurizacin del cuarto. Las CSB y
los CACI deben estar ptimamente ventilados en un 100% al exterior a travs de filtracin HEPA.
Si un CACI que cumple los requisitos de este captulo se usa fuera de una zona amortiguadora, el rea de preparacin magistral debe mantener una presin negativa mnima de 0,01 pulgadas de columna de agua y tener un mnimo de 12 CAPH.
Cuando se usan dispositivos de sistema cerrado para transferencia de vial (CSTD, por sus siglas en ingls) (es decir, sistemas
de transferencia del vial que no permiten ventilacin ni exposicin de la sustancia peligrosa al ambiente), deben estar dentro
del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) de una CSB o un CACI. Se prefiere el uso de un CSTD debido a su proceso de sistema
cerrado inherente. En instalaciones que preparan un volumen bajo de frmacos peligrosos, se acepta el uso de dos niveles de
contencin (p.ej., un CSTD dentro de una CSB o un CACI que est ubicado en un cuarto de presin no negativa).
Cuando se usan CSTD y se realiza una preparacin magistral en una CSB o un CACI, debe usarse equipo protector para el
personal (EPP) apropiado. El EPP debe incluir batas, mscaras, gafas protectoras, gorras, cubrecalzado o calzado destinado a
ese propsito, doble enguantado con guantes estriles similares a los usados en quimioterapia y el cumplimiento con las recomendaciones del fabricante al usar un CACI.
Todo el personal que elabora preparaciones con frmacos peligrosos debe capacitarse ampliamente en el almacenamiento,
manipulacin y eliminacin de estos frmacos. La capacitacin debe ocurrir antes de preparar o manipular PME peligrosas y su
eficacia debe ser verificada probando tcnicas especficas de preparacin para frmacos peligrosos. Dicha verificacin debe ser
documentada para cada persona al menos anualmente. Esta capacitacin debe incluir el repaso didctico de los frmacos peligrosos, incluyendo las propiedades mutagnicas, teratognicas y carcinognicas, y debe incluir capacitacin continua para cada nuevo frmaco peligroso que entre al mercado. El personal de preparacin magistral que est en edad reproductiva debe
confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los frmacos peligrosos. La capacitacin debe incluir al menos los
siguientes puntos: (1) prcticas de manipulacin asptica segura; (2) tcnicas de presin negativa cuando se utiliza una CSB o
un CACI; (3) uso correcto de dispositivos CSTC; (4) procedimientos de contencin, limpieza y eliminacin en caso de rupturas
y derramamientos; y (5) tratamiento del personal en caso de exposicin por contacto o inhalacin.
NOTADado que las normas de valoracin y las cantidades inaceptables de contaminacin de cada frmaco no han sido establecidos en la literatura, el siguiente prrafo es slo una recomendacin. A medida que se desarrollen y prueben estos mtodos de ensayo se adoptarn las normas apropiadas.
Con el fin de garantizar la contencin, especialmente en operaciones de preparacin que involucren grandes volmenes de
frmacos peligrosos, se deben tomar muestras ambientales rutinariamente para detectar frmacos peligrosos no contenidos
(p.ej., inicialmente como punto de referencia y al menos cada 6 meses o ms a menudo segn sea necesario para verificar la
contencin). Este muestreo ambiental debe incluir la obtencin de muestras con paos (wipe sampling) de la superficie del
rea de trabajo de una CSB y un CACI; mostradores donde se colocan las preparaciones terminadas; reas adyacentes a una
CSB y un CACI, incluso el piso directamente debajo del rea de trabajo; y reas de administracin a pacientes. Los marcadores
comunes de frmacos peligrosos que se pueden analizar incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato y fluorouracilo. Si se
encuentra alguna contaminacin mensurable (se ha visto que concentraciones de ciclofosfamida mayores que 1,00 ng por cm2
causan captacin del frmaco en humanos) por cualquiera de estos procedimientos de garanta de calidad, los profesionales
de salud deben tomar la decisin de identificar, documentar y contener la causa de la contaminacin. Tal accin puede incluir
la recapacitacin, limpieza cuidadosa (utilizando un jabn de pH elevado y agua) y mejora de los controles de ingeniera. Algunos ejemplos de formas de mejorar los controles de ingeniera incluyen (1) ventilar la CSB o el CACI 100% hacia el exterior; (2)
implementar un CSTD; o (3) reevaluar los tipos de CSB o CACI.
4 Guidelines for Environmental Infection Control in Health-Care Facilities, Recommendations of CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC), MMWR, vol. 52, no. RR-10, junio 6, 2003, figura 3, pg. 12.
5 NSF/ANSI 49.
USP 38
La eliminacin de desechos de frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. Todo
el personal que efecta las actividades rutinarias de eliminacin de desechos y limpieza en las reas de almacenamiento y preparacin con frmacos peligrosos debe recibir capacitacin en los procedimientos apropiados para protegerse y prevenir la
contaminacin.
PREPARADOS RADIOFARMACUTICOS COMO PME
EXTRACTOS DE ALRGENOS COMO PME

Los extractos de alrgenos como PME son inyecciones monodosis y multidosis para uso intradrmico o subcutneo, preparados por mdicos especialmente capacitados y el personal bajo su supervisin directa. Los extractos de alrgenos como PME
quedan exentos de los requisitos indicados para el personal, ambiente y almacenamiento de todos los Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME descritos en este captulo, slo cuando se cumplen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparacin magistral involucra la transferencia simple por medio de agujas y jeringas de productos estriles
comerciales de alrgenos y sustancias estriles apropiadas agregadas (p.ej., glicerina, fenol y cloruro de sodio para inyeccin).
2. Todos los extractos de alrgenos como PME deben contener sustancias apropiadas en concentraciones eficaces para prevenir el crecimiento de microorganismos. Los extractos de alrgenos no conservados deben cumplir con los requisitos
apropiados de nivel de riesgo para PME en este captulo.
3. Antes de comenzar las actividades de preparacin magistral, el personal sigue un procedimiento cuidadoso de lavado de
manos para quitar los detritos bajo las uas con un limpiador de uas bajo agua tibia corriente, seguido por un lavado
vigoroso de manos y brazos hasta el codo, durante al menos 30 segundos, con un jabn antimicrobiano o no antimicrobiano y agua.
4. El personal de preparacin magistral se coloca gorras, mascarillas que cubran el vello facial, batas y mscaras.
5. El personal de preparacin magistral realiza el lavado antisptico de manos con un exfoliante quirrgico a base de alcohol
con actividad persistente.
6. El personal de preparacin magistral utiliza guantes estriles exentos de polvo que sean compatibles con alcohol isoproplico al 70% (IPA) antes de comenzar las manipulaciones de la preparacin magistral.
7. El personal de preparacin magistral desinfecta los guantes intermitentemente con IPA estril al 70% cuando prepara
mltiples extractos de alrgenos como PME.
8. Los cuellos de las ampollas y los tapones de viales en los envases de ingredientes estriles fabricados comercialmente se
desinfectan frotndolos cuidadosamente con hisopos empapados en IPA estril al 70% para garantizar que los sitios crti-
Captulos
En el caso de la produccin de preparados radiofarmacuticos para tomografa por emisin de positrones (PET), el captulo
Preparados Radiofarmacuticos para Tomografa por Emisin de PositronesPreparacin Magistral 823 reemplaza este captulo.
Despus de la liberacin de un preparado radiofarmacutico para PET como producto farmacutico terminado de una instalacin de produccin, el posterior manejo, manipulacin o uso del producto ser considerado como preparacin magistral y el
contenido de esta seccin y captulo es aplicable.
A los efectos de este captulo, los preparados radiofarmacuticos magistrales elaborados a partir de componentes estriles en
envases estriles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos para una inyeccin monodosis o no ms de 30 mL tomados
de un envase multidosis (ver Inyectables 1) se deben nombrar segn las normas para PME de Nivel de Riesgo Bajo y cumplir
con ellas.
Al preparar magistralmente estos productos radiofarmacuticos, se deben usar jeringas y viales apropiadamente blindados
dentro de un CIP que funcione adecuadamente y que est certificado como ISO Clase 5 (ver Tabla 1), localizado en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o ms limpio, que permita el cumplimiento con los requisitos especiales de manipulacin, proteccin y flujo de aire negativo.
Los viales de productos radiofarmacuticos destinados a mltiples usos, preparados magistralmente con tecnecio 99m, expuestos a un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y perforados por agujas sin contaminacin por contacto directo, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante. El almacenamiento y transporte de los viales adecuadamente
blindados de PME radiofarmacuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado sin una designacin especifica de clase
ISO.
Los sistemas generadores de tecnecio 99m/molibdeno 99 deben almacenarse y eluirse (manejarse) bajo las condiciones recomendadas por el fabricante y las reglamentaciones estatales y federales aplicables. Dichos sistemas generadores deben eluirse en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o ms limpio que permita cumplir con los requisitos especiales de manipulacin, proteccin y flujo de aire. Para limitar la exposicin aguda y crnica del personal de inspeccin a un nivel de radiacin
tan bajo como sea razonablemente posible (ALARA), se debe efectuar la inspeccin visual directa, de acuerdo con ALARA, de
las PME radiofarmacuticas que contengan concentraciones altas de dosis de radioactividad.
Los preparados radiofarmacuticos elaborados como PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos se deben preparar en un rea segregada. Se debe fijar una lnea de demarcacin que defina el rea de preparacin magistral segregada. Los
materiales y la vestimenta expuestos en el rea de atencin y tratamiento del paciente no deben cruzar una lnea de demarcacin dentro del rea de preparacin magistral segregada.
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cos estn hmedos durante al menos 10 segundos y se dejen secar antes de usarlos para la preparacin de extractos de
alrgenos como PME.
9. Las manipulaciones aspticas de las preparaciones magistrales minimizan la contaminacin directa por contacto (p.ej., de
las puntas de los dedos de los guantes, sangre, secreciones orales y nasales, piel y cosmticos descamados, otros materiales no estriles) con sitios crticos (p.ej., agujas, ampollas abiertas, tapones de viales).
10. La etiqueta de cada vial multidosis (VMD) de extractos de alrgenos como PME incluye el nombre de un paciente especfico as como la FLU y el intervalo de temperatura de almacenamiento que se asignan basndose en las recomendaciones
del fabricante o publicaciones de referencia.
11. Las ampollas monodosis de extractos de alrgenos como PME no se deben almacenar para uso adicional subsiguiente.
El personal que prepara extractos de alrgenos como PME debe ser consciente del mayor riesgo potencial de contaminacin
microbiana y con materia extraa cuando los extractos de alrgenos como PME se preparan cumpliendo con criterios anteriores en vez de seguir las normas ms rigurosas de este captulo para Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME.
Aunque los extractos de alrgenos como PME pueden representar riesgos para la salud de los pacientes cuando se inyectan
intradrmica o subcutneamente, estos riesgos son sustancialmente mayores si el extracto se inyecta por va intravenosa inadvertidamente.
Captulos
VERIFICACIN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIN MAGISTRAL

Los procedimientos de preparacin magistral y los mtodos de esterilizacin de PME deben corresponder con los especificados en la documentacin escrita, debidamente confeccionada y verificada por la institucin responsable de la preparacin magistral. La verificacin requiere pruebas planificadas, monitoreo y documentacin que permitan demostrar el cumplimiento de
los requisitos de calidad ambiental, las prcticas del personal y los procedimientos crticos para conseguir y mantener la esterilidad, exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad
para el Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad 71) con muestras de PME de riesgo bajo y mediano, y deben agregarse
indicadores biolgicos (IB) estndar autocontenidos a muestras no dispensables de PME de nivel de riesgo alto antes de su
esterilizacin terminal para determinar en la evaluacin posterior si el ciclo de esterilizacin fue adecuado (ver Indicadores Biolgicos para Esterilizacin 1035). Las PME envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para verificar su integridad
fsica y aspecto esperado, incluyendo la cantidad de llenado final. La exactitud de las identidades, concentraciones, cantidades
y purezas de los ingredientes de las PME se deben confirmar revisando las etiquetas en los envases, observando y documentando las mediciones correctas con los dispositivos aprobados y correctamente estandarizados, y revisando la informacin en el
etiquetado y en los certificados de anlisis proporcionados por los proveedores. Cuando no se pueda confirmar la identidad, la
pureza, el contenido y la esterilidad correctas de los ingredientes y componentes de las PME (por ejemplo, en caso de jeringas
sin etiquetado, ampollas abiertas, tapones de viales y bolsas perforados, envases de ingredientes con etiquetado incompleto),
dichos ingredientes y componentes se deben desechar de inmediato.
Algunos ingredientes individuales, como frmacos a granel, no se etiquetan con las fechas de caducidad cuando se mantienen estables indefinidamente en sus empaques comerciales, bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Sin embargo,
a pesar de conservar estabilidad qumica completa, dichos ingredientes pueden ganar o perder humedad durante el almacenamiento y uso. Los cambios en el contenido de humedad pueden requerir pruebas (ver Prdida por Secado 731) para determinar la cantidad correcta que se debe pesar para obtener el contenido exacto de las partes qumicas activas en las PME (ver
Clculos Farmacuticos en la Preparacin Magistral de Prescripciones 1160).
Aunque no se requiere, se recomienda realizar un ensayo qumico cuantitativo indicador de estabilidad para garantizar la
exactitud de la preparacin de las PME, especialmente de aquellas que contienen ingredientes farmacuticos con un estrecho
intervalo de concentracin teraputica en plasma.
Mtodos de Esterilizacin
Los profesionales de la salud autorizados que estn a cargo de supervisar las preparaciones magistrales son responsables de
asegurar que el mtodo de esterilizacin seleccionado (ver Mtodos de Esterilizacin en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de
Artculos Farmacopeicos 1211) esterilice y mantenga el contenido, pureza, calidad e integridad del envase de las PME. El proceso de esterilizacin seleccionado se obtiene a partir de la experiencia y de las fuentes de informacin apropiadas (p.ej., ver
Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211) y, preferentemente, se verifica hasta donde sea posible
para conseguir la esterilidad de las PME especficas. stas son algunas guas generales para asignar un mtodo de esterilizacin
apropiado a una PME y sus componentes:
1. Debe comprobarse que las PME se mantienen fsica y qumicamente estables cuando se las somete al mtodo de esterilizacin seleccionado.
2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden cubrirse hermticamente con papel de aluminio y luego exponerse a calor seco
en un horno a una temperatura media de 250 durante 30 minutos para lograr la esterilidad y despirogenizacin (ver
Esterilizacin por Calor Seco en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85). Dichos artculos deben usarse de inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado
para la elaboracin de las PME de Nivel de Riesgo Bajo y Mediano.
USP 38
3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estril usado para esterilizar las soluciones de PME, ya sea durante su preparacin magistral o su administracin, es qumica y fsicamente compatible con la PME.
ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR FILTRACIN
ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR VAPOR
El proceso de esterilizacin trmica utilizando vapor saturado bajo presin, o esterilizacin en autoclave, es el mtodo preferido para la esterilizacin terminal de preparaciones acuosas que, segn se ha verificado, mantienen su estabilidad qumica y
fsica bajo las condiciones empleadas (ver Esterilizacin por Vapor en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211). Para lograr la esterilidad, todos los materiales deben exponerse al vapor a una temperatura de 121, bajo una
presin de aproximadamente 1 atmsfera o 15 psi, durante un tiempo que, segn se haya verificado mediante pruebas, logre
la esterilidad de los artculos. Por lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME. Debe contemplarse el
tiempo requerido para que el material alcance los 121 antes de medir la duracin de la exposicin de esterilizacin.
Si no se exponen directamente los artculos a vapor presurizado, pueden sobrevivir algunos microorganismos y esporas. Antes de su esterilizacin, los dispositivos de plstico, vidrio y metal deben envolverse hermticamente en un papel o tela de bajo
desprendimiento de partculas o sellarse en sobres que impidan la penetracin microbiana despus de su esterilizacin. Inmediatamente antes de llenar las ampollas y viales que se esterilizarn con vapor, las soluciones deben pasarse por un filtro con
un tamao nominal de poro de no ms de 1,2 mm para eliminar las partculas. Los envases sellados deben poder generar vapor
internamente; en consecuencia, los viales vacos con tapn y precintados deben contener una pequea cantidad de humedad
para generar vapor.
La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por vapor para cada PME debe estar documentada por escrito en la institucin responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin con vapor debe verificarse utilizando
IB apropiados de Bacillus stearothermophilus (ver Indicadores Biolgicos 1035) y otros mtodos de verificacin, como los dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211 y Pruebas de Esterilidad 71).
ESTERILIZACIN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR CALOR SECO
La esterilizacin por calor seco se realiza por lo general como un proceso por lotes en un horno destinado a esterilizacin. El
aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a travs de la cmara, por medio de un dispositivo ventilador. El horno
debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposicin. La esterilizacin por calor seco requiere temperaturas ms altas y tiempos de exposicin ms prolongados que la esterilizacin por vapor. El calor seco se debe usar
slo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daa el material o ste es impermeable. Durante la esterilizacin se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulacin del aire
caliente. La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institucin responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin por calor seco debe verificarse utilizando IB apropiados de Bacillus subtilis (ver Indicadores Biolgicos 1035) y otros mtodos de verificacin, como los
dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211 y Pruebas de
Captulos
Los filtros estriles disponibles comercialmente deben estar aprobados para la esterilizacin de lquidos farmacuticos de uso
en seres humanos. Los filtros estriles usados para esterilizar las PME deben estar exentos de pirgenos y tener un tamao nominal de poro de 0,2 0,22 mm. El fabricante debe certificar que retienen al menos 107 microorganismos de una cepa de
Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta en cada centmetro cuadrado del rea superficial de la cara superior del filtro en condiciones similares a las que se utilizarn para esterilizar las PME (ver Condiciones de Alto Riesgo en PME de Nivel de Riesgo Alto).
El supervisor de preparacin magistral debe asegurar, en forma directa o a partir de documentacin apropiada, que los filtros sean qumica y fsicamente estables en las condiciones de presin y temperatura que se utilizarn, que tengan capacidad
suficiente para filtrar los volmenes requeridos y que logren la esterilidad y mantengan la calidad farmacutica previa a la filtracin, incluida la concentracin de ingredientes de la PME especfica. Las dimensiones del filtro y el lquido a esterilizar deben
permitir que el proceso de esterilizacin se complete rpidamente sin reemplazar el filtro durante el proceso. Cuando se sabe
que la PME contiene una cantidad excesiva de partculas, debe colocarse un prefiltro de membrana con un tamao nominal de
poro mayor, antes del filtro de esterilizacin, para eliminar las partculas contaminantes grandes y aumentar al mximo la eficacia del filtro de esterilizacin.
Las unidades de filtracin usadas para esterilizar las PME tambin deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como la prueba de punto de burbuja.
El personal de preparacin magistral debe verificar que los filtros seleccionados logren la esterilizacin de las PME que se
estn esterilizando. Las desviaciones significativas respecto de las propiedades qumicas y fsicas normales o esperadas de las
PME (p.ej., alcoholes miscibles en agua) podran causar daos no detectables en la integridad del filtro y la reduccin de los
microorganismos a un tamao ms pequeo que el de los poros del filtro.
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Esterilidad 71). [NOTALa esterilizacin por calor seco se puede efectuar a una temperatura ms baja de la que podra ser
eficaz para la despirogenizacin].
Despirogenizacin por Calor Seco

La despirogenizacin por calor seco se debe usar para eliminar los pirgenos y los microbios viables de los materiales o envases de vidrio, como los viales. Un ciclo tpico sera de 30 minutos a 250. La descripcin del ciclo de despirogenizacin por
calor seco y su duracin para artculos de una carga especfica debe estar documentada por escrito en la institucin responsable de la preparacin magistral. La eficacia del ciclo de despirogenizacin por calor seco se debe verificar usando viales para
desafo de endotoxinas (VDE). La prueba de endotoxinas bacterianas se debe efectuar en los VDE para verificar que el ciclo es
capaz de conseguir una reduccin de 3 log en endotoxinas (ver Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos
1211 y Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85).
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL
Captulos
Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de contaminacin de una PME depende de la calidad de los componentes incorporados, del proceso utilizado, del desempeo del personal y de las condiciones ambientales en las que se realiza el
proceso. Los niveles de exigencia requeridos en relacin con las condiciones ambientales dependen del grado de exposicin
esperado de la PME al entorno inmediato durante su procesamiento. En esta seccin se describen la calidad y el control de las
condiciones ambientales para cada nivel de riesgo de operacin. Adems, las operaciones que utilizan componentes no estriles requieren el uso de un mtodo de preparacin diseado para obtener una preparacin estril.
Exposicin de Sitios Crticos

Mantener la esterilidad y la limpieza (es decir, ausencia de materia extraa estril) de los sitios crticos es una salvaguarda
importante para las PME. Los sitios crticos son aquellos que incluyen cualquier componente o superficie de recorrido de lquidos (p.ej., septos de viales, puertos de inyeccin, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores
de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas), o contaminacin por contacto. El riesgo o probabilidad de que los sitios crticos se contaminen con
microorganismos y materia extraa se incrementa con el aumento del rea expuesta de los sitios crticos, la densidad o concentracin de los contaminantes y la duracin de la exposicin a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 1). Los
ejemplos incluyen una ampolla abierta o un tapn en un vial de 10 mL o de mayor volumen o un puerto de inyeccin en un
envase de solucin intravenosa que tiene un rea ms grande que la punta de la aguja o de una jeringa.
Las caractersticas del sitio crtico tambin influyen en el grado de riesgo de contaminacin. Despus de frotarla con una
gasa embebida en IPA estril al 70%, la superficie relativamente spera y permeable de un tapn elastomrico retiene microorganismos y otros contaminantes con ms facilidad que la superficie de vidrio ms lisa del cuello de una ampolla. En consecuencia, puede esperarse que la desinfeccin de la superficie sea ms eficaz en el caso de una ampolla.
En la prctica de preparacin magistral estril, se debe dar la ms alta prioridad a la proteccin de los sitios crticos, evitando
el contacto fsico y los contaminantes areos. Los contaminantes areos, especialmente aquellos generados por el personal de
preparacin magistral estril, tienen muchas ms probabilidades de llegar a los sitios crticos que los contaminantes que estn
adheridos al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. Ms an, las partculas grandes y de alta densidad que se
generan e introducen mediante las manipulaciones de la preparacin magistral y el personal tienen el potencial de asentarse
en los sitios crticos incluso cuando dichos sitios estn expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas

Las fuentes ms comunes de aire de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos son CFL horizontales y
verticales, CAI y CACI. Un cuarto limpio (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116)
es un ambiente para preparaciones magistrales provisto con HEPA o aire filtrado con HEPA, el cual cumple con ISO Clase 7 (ver
Tabla 1), y cuyo acceso est limitado al personal capacitado y autorizado para realizar la preparacin magistral estril y la limpieza de las instalaciones. Una zona amortiguadora es un rea provista con aire de calidad ISO Clase 7 (ver Tabla 1) como
mnimo.
La Figura 1 es una representacin conceptual de la colocacin de un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) en un rea de preparacin
magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Este plano muestra el rea de
operacin ms crtica localizada dentro del CIP en un rea designada (ver definicin de rea de Preparacin Magistral Segregada) separada de las actividades no esenciales para la preparacin de las PME. La colocacin de dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparacin magistral en el rea segregada
debe estar restringida o limitada, dependiendo de su efecto sobre la calidad del aire en el CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
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Figura 1. Representacin conceptual de la colocacin de un CIP ISO Clase 5 en un rea de preparacin magistral segregada,
usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos.
Figura 2. Representacin conceptual de la distribucin de una instalacin para la preparacin de PME clasificadas como de
riesgo bajo, mediano y alto.
La colocacin de los dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales
para la preparacin magistral en las antesalas y las zonas amortiguadoras est dictada por su efecto sobre la calidad ambiental
requerida para las atmsferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de
Partculas Viables y No Viables). Cada instalacin de preparacin magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes
de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos y esterilizacin por filtracin estn adecuadamente
ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.
Diseo de la Instalacin y Controles Ambientales

Las instalaciones de preparacin magistral estn fsicamente diseadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contaminacin area con los sitios crticos. Estas instalaciones deben proporcionar tambin un ambiente de trabajo
cmodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20 o menos, para brindar condiciones de comodidad al
personal de preparacin magistral para que se desempee correctamente mientras est ataviado con la vestimenta requerida
para la preparacin magistral asptica. Los CIP por lo general incluyen, entre otros, CFL, CSB, CAI y CACI, los cuales brindan
un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la exposicin de sitios crticos. Los CIP deben mantener las condiciones ISO Clase 5
(ver Tabla 1) o mejores para las partculas de 0,5 mm (condiciones dinmicas de funcionamiento) mientras se preparan PME.
Captulos
La Figura 2 es una representacin conceptual de la distribucin de una instalacin para la preparacin de PME clasificadas
como de nivel de riesgo bajo, mediano y alto. La calidad del aire ambiental aumenta con el movimiento desde el lmite externo hacia el rea directa de preparacin magistral (ADP). La colocacin de dispositivos en las antesalas y las zonas amortiguadoras est dictada por su efecto sobre la calidad ambiental designada de las atmsferas y superficies, que debe ser verificada por
monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables). Cada instalacin de preparacin magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos y esterilizacin por filtracin estn adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.
Captulos
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Los controles de ingeniera secundarios, tales como zonas amortiguadoras y antesalas, por lo general sirven como centro para
la ubicacin del CIP. Las zonas amortiguadoras estn diseadas para mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 1) como
mnimo, para partculas de 0,5 mm bajo condiciones dinmicas, y condiciones ISO Clase 8 (ver Tabla 1) para partculas iguales
o mayores de 0,5 mm bajo condiciones dinmicas para las antesalas. El control de contaminacin area se logra en el CIP por
medio de filtros HEPA. El flujo de aire en el CIP debe ser unidireccional (flujo laminar) y debido a la eficiencia de recoleccin de
partculas del filtro, cuando se trata de preparacin magistral asptica, el primer aire en la cara del filtro est libre de contaminacin por partculas areas. El aire filtrado por HEPA debe suministrarse en las reas crticas (ISO Clase 5, ver Tabla 1) a una
velocidad suficiente para arrastrar las partculas lejos del rea de preparacin magistral y mantener el flujo de aire unidireccional durante las operaciones. El diseo y control apropiados evitan la turbulencia y el aire estancado en el rea crtica. En el rea
crtica se debe realizar un anlisis del patrn de aire in situ por medio de estudios con humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y la accin de arrastre sobre el producto bajo condiciones dinmicas.
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar
en el proceso de preparacin magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas. Las polticas y procedimientos para el mantenimiento y trabajo dentro del rea del CIP se deben poner por escrito y cumplir. Las polticas y procedimientos estarn determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparacin magistral asptica utilizadas
durante la preparacin de las PME. El ambiente de trabajo de la PME est diseado para tener las superficies de trabajo ms
limpias (CIP) localizadas en una zona amortiguadora. La zona amortiguadora deber mantener condiciones ISO Clase 7 (ver
Tabla 1) como mnimo, para las partculas iguales o mayores de 0,5 mm bajo condiciones de operacin dinmicas. El cuarto
debe estar segregado de los espacios circundantes no clasificados, para reducir el riesgo de que se soplen, arrastren o introduzcan de otra manera contaminantes dentro del ambiente de flujo unidireccional de aire filtrado y tal segregacin debe monitorearse en forma constante. Para cuartos que proporcionan una separacin fsica por medio de paredes, puertas y cabinas de
transferencia de materiales (pass-throughs), se requiere una presin positiva diferencial mnima de 0,02 a 0,05 pulgadas de
columna de agua. Para zonas amortiguadoras no fsicamente separadas de las antesalas, se debe emplear el principio de desplazamiento del flujo de aire. Este concepto utiliza un principio de baja presin diferencial y alto flujo de aire. El uso de desplazamiento del flujo de aire requiere por lo general una velocidad de aire igual o mayor a 40 pies por minuto desde la zona
amortiguadora, pasando por la lnea de demarcacin hacia la antesala.
El concepto de desplazamiento no debe usarse para preparacin magistral de alto riesgo.6 El CIP debe estar ubicado dentro
de una zona amortiguadora de tal manera que se eviten condiciones que podran afectar adversamente su funcionamiento.
Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes provenientes de las puertas abiertas, el trfico del personal o los flujos de aire provenientes de los sistemas de HVAC pueden alterar el flujo de aire unidireccional en cabinas de frente abierto. Los operadores tambin pueden producir alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y al colocar objetos sobre la superficie de
trabajo. El CIP debe ubicarse fuera del flujo de trfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto
no causen perturbaciones. Los intercambios de aire del cuarto por lo general se expresan como CAPH. Se necesita un adecuado flujo de aire filtrado por HEPA y suministrado a la zona amortiguadora y a la antesala, con el fin de mantener la clasificacin
de limpieza durante la actividad operativa a travs de los CAPH. Los factores que deben considerarse al determinar los requisitos de cambio de aire incluyen la cantidad de personas que trabajan en el cuarto y los procesos de preparacin magistral que
generan partculas, as como los efectos de la temperatura. Una zona amortiguadora y una antesala ISO Clase 7 (ver Tabla 1)
provistas de aire filtrado por HEPA deben recibir no menos de 30 CAPH. El CIP es una buena forma de incrementar los cambios
de aire en el suministro de aire de un rea, pero no puede ser la nica fuente de aire filtrado por HEPA. Cuando el rea cuenta
con un dispositivo de recirculacin ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se considera adecuado un mnimo de 15 CAPH a travs de los
filtros HEPA que abastecen el rea, siempre y cuando los CAPH combinados no sean menores de 30. Se pueden requerir ms
intercambios de aire, dependiendo de la cantidad de personas y procesos. El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso y los retornos se deben montar a un nivel bajo en la pared, creandose as una dilucin general, de arriba
hacia abajo, del aire del rea con el aire filtrado por HEPA. No se recomienda ubicar los retornos en el cielo raso. Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamao de partcula ms penetrante y deben probarse por fugas en la fbrica
y de nuevo in situ despus de la instalacin.7
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente controlado. Slo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para realizar las actividades de preparacin magistral y stos deben ser impermeables, lavables, resistentes a los desinfectantes y no desprender partculas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al cuarto, primero se lo debe limpiar y
desinfectar. Siempre que sea posible, los equipos y otros elementos usados en la zona amortiguadora no deben retirarse del
cuarto, salvo para su calibracin, reparacin u otras actividades asociadas con el mantenimiento correcto del equipo.
Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas y no deben desprender partculas para facilitar su limpieza y reducir al
mnimo los espacios en los que podran acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las superficies deben ser resistentes a los daos causados por agentes desinfectantes. Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o
enmasilladas para evitar la formacin de grietas donde pueda acumularse polvo. Si los cielos rasos constan de paneles incrusta6 ISO 14644-4:2001 Cleanrooms and associated controlled environmentsDesign, construction, and start-up, Case Postale 56, CH-1211 Geneve 20, Switzerland,
tel. +41 22 749 01 11.
7 Por definicin (IEST RP CC 0001.4), los filtros HEPA tienen como mnimo una eficacia de 99,97% cuando se prueban usando un fotmetro y partculas de 0,3
mm generadas termalmente o clasificadas segn el tamao de partcula ms penetrante, usando un contador de partculas.
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dos, stos se deben impregnar con un polmero para hacerlos impermeables e hidrfobos y, adems, se debe enmasillar todo
su permetro para sellar la unin con el armazn que hace de soporte. Las paredes pueden ser de material flexible (p.ej., polmero de alta densidad), paneles unidos entre s y sellados o placas de yeso con revestimiento epxico. Preferentemente, los
pisos deben cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinlico, trmicamente soldadas y arqueadas hacia los zcalos. Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberas de servicios que pasan por el cielo raso o
las repisas de las ventanas. La superficie externa de los artefactos de iluminacin embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar
sellada y al ras del cielo raso. Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. La zona
amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plstico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fcilmente. Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plstico no poroso o planchas metlicas, con ruedas de
buena calidad y fciles de limpiar para facilitar su movilidad. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben
ser lisos, de material impermeable y fciles de limpiar y desinfectar y, adems deben estar libres de grietas y no desprender
partculas; la cantidad, el diseo, y la forma de instalacin deben ser tales que faciliten una limpieza y sanitizacin eficaces.
Colocacin de los Controles de Ingeniera Primarios
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables

El programa de muestreo ambiental debe proporcionar informacin al personal y a los directivos para demostrar que el CIP
mantiene un ambiente dentro del rea de preparacin magistral, que garantiza en forma constante niveles de partculas viables y no viables aceptablemente bajas. El rea de preparacin magistral incluye los CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) (CFL, CSB,
CAI y CACI), las zonas amortiguadoras, las antesalas y las reas segregadas de preparacin magistral.
El muestreo ambiental se debe tomar como parte de un programa integral de gestin de la calidad y se llevar a cabo, como
mnimo, bajo cualquiera de las siguientes condiciones:
como parte de la puesta en servicio y certificacin de nuevas instalaciones y equipo;
despus de cualquier reparacin de las instalaciones y equipos;
como parte de la recertificacin de las instalaciones y equipos (es decir, cada 6 meses);
en respuesta a problemas identificados en los productos terminados o tcnicas del personal; o
Los procedimientos de muestreo se detallan en CETA Applications Guide CAG-002-2006, seccin 2.09.
Captulos
Los CIP (CFL, CSB, CAI y CACI) deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) de acceso restringido (ver Figura 1), con las siguientes excepciones para CAI/CACI:
Slo el personal autorizado y los materiales requeridos para la preparacin magistral y la limpieza deben permitirse en la
zona amortiguadora.
Los procedimientos de preesterilizacin para las PME de alto riesgo, como por ejemplo pesar y mezclar, se deben completar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8 (ver Tabla 1).
Los CIP deben ubicarse fuera de las vas de trfico y lejos de las corrientes de aire del cuarto que pudieran perturbar los
patrones de flujo de aire deseados.
Los CAI y los CACI deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) a menos que cumplan con
todas las condiciones siguientes:
El aislador debe proporcionar aislamiento del cuarto y mantener la ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante las condiciones dinmicas de operacin, incluso la transferencia de ingredientes, componentes y dispositivos dentro y fuera del aislador y durante la preparacin de PME.
Los recuentos de partculas de muestras tomadas aproximadamente 6 a 12 pulgadas ms arriba del sitio de exposicin
crtica deben mantener niveles ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la preparacin magistral.
No se deben contar ms de 3520 partculas (0,5 mm y ms grandes) por m3 durante la transferencia de material, con la
sonda del contador de partculas ubicada tan cerca de la puerta de transferencia como sea posible, sin obstruir la transferencia.8
El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de obtener del fabricante la documentacin indicando que los
CAI/CACI cumplirn con esta norma cuando se ubiquen en ambientes donde los recuentos de partculas excedan ISO Clase 8
(ver Tabla 1) para partculas iguales o mayores de 0,5 mm. Cuando se usen aisladores para la preparacin magistral estril, el
tiempo de recuperacin para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) se debe documentar y se deben desarrollar
los procedimientos internos para garantizar que deje transcurrir el tiempo de recuperacin adecuado despus de transferir los
materiales, antes y durante las operaciones de preparacin magistral.
Si el CIP es un CAI o un CACI que no cumple con los requisitos arriba mencionados o es una CFL o una CSB que no se
puede ubicar dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1), entonces slo se pueden preparar PME no peligrosas y radiofarmacuticas de nivel de riesgo bajo, segn las rdenes de un mdico, para un paciente especfico, y la administracin de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparacin o segn lo recomendado en el prospecto del empaque del fabricante, cualquiera que sea menor.
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en respuesta a problemas con las PME, prcticas de trabajo observadas del personal de preparacin magistral o infecciones relacionadas con el paciente (donde la PME se considera una fuente potencial de la infeccin).
Captulos
PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTCULAS AMBIENTALES NO VIABLES
Un programa de muestras de partculas areas no viables difiere del de partculas viables en que est planeado para que
mida directamente el desempeo de los controles de ingeniera usados para crear los diversos niveles de limpieza de aire, por
ejemplo, ISO Clase 5, 7, u 8 (ver Tabla 1).
Verificacin del Desempeo de los Controles de IngenieraLos CIP (CFL, CSB, CAI y CACI) y los controles de ingeniera
secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) son componentes esenciales de la estrategia de control general de contaminacin para la preparacin magistral asptica. Por lo tanto, es fundamental que funcionen tal como estn diseados y que los
niveles de contaminacin resultantes estn dentro de lmites aceptables. Los procedimientos de certificacin, como aquellos
sealados en Certification Guide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006)9 deben ser efectuados por una persona calificada, por lo menos cada 6 meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique o altere o se haga una reparacin mayor en
las instalaciones.
Recuento Total de PartculasLa certificacin que cada rea con clasificacin ISO, por ejemplo, ISO Clase 5, 7 y 8 (ver
Tabla 1) est dentro de las normas establecidas, se debe realizar al menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAI o
el CACI se reubiquen o la estructura fsica de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. Las pruebas deben ser efectuadas por operadores calificados, usando equipo electrnico de ltima tecnologa con los siguientes resultados:
ISO Clase 5: no ms de 3520 partculas iguales o mayores de 0,5 mm por metro cbico de aire para cualquier CFL, CSB,
CAI y CACI;
ISO Clase 7: no ms de 352 000 partculas iguales o mayores de 0,5 mm por metro cbico de aire para cualquier zona
amortiguadora;
ISO Clase 8: no ms de 3 520 000 partculas iguales o mayores de 0,5 mm por metro cbico de aire para cualquier antesala.
El personal de supervisin u otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificacin para
garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, las presiones del cuarto y CAPH apropiados.
MONITOREO DE LA PRESIN DIFERENCIAL
Se debe instalar un manmetro o velocmetro para supervisar el diferencial de presin o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparacin magistral. Los resultados debern revisarse y documentarse en un cuaderno de bitcora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mnima debe
ser diariamente) o mediante un dispositivo de grabacin continua. La presin entre el rea ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y el rea
general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua). En instalaciones donde se preparan
PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mnima de 0,2 metros por
segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.
PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTCULAS AREAS AMBIENTALES VIABLES
El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prcticas de vestuario apropiadas, de la tcnica asptica del personal de preparacin magistral
y de la presencia de contaminacin superficial, asumiendo que todo el trabajo se desempea en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla
1) y controles de ingeniera secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 1),
certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes porque el personal de preparacin magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estriles
con el fin de conseguir la esterilidad.
Un programa de muestreo junto con una auditora de observacin estn diseados para evaluar la competencia de las prcticas de trabajo del personal de preparacin magistral, permitiendo la implementacin de las acciones correctivas de manera
continua (ver Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin).
Plan de MuestreoSe debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partculas areas viables, basado
en la evaluacin de riesgo de las actividades de preparacin magistral efectuadas.
Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y en las zonas
ISO Clase 7 y 8 (ver Tabla 1), as como en las zonas segregadas de preparacin magistral con ms alto riesgo de contaminacin (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5 [ver Tabla 1], mostradores cercanos a las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)). El plan debe incluir: ubicacin de la muestra, mtodo de recoleccin, frecuencia
de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del da, en lo que respecta a la actividad de la zona de preparacin magistral
y los niveles de accin.
9
Controlled Environment Testing Association, 1500 Sunday Drive, Ste. 102, Raleigh, NC 27607; www.CETAinternational.org.
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Captulos
La revisin de los datos generados durante un muestreo puede detectar cantidades elevadas de biocarga microbiana area;
dichos cambios pueden ser indicio de cambios adversos en el ambiente. Se recomienda que el personal de preparacin magistral se remita a Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116 y a las Guidelines for Environmental Infection Control in Healthcare Facilities, 2003, de los CDC (Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades)
para ms informacin.
Medio de CrecimientoPara facilitar el crecimiento bacteriano se debe utilizar un medio de crecimiento microbiolgico
general, como el Medio de Digerido de Casena y Soja. En los ambientes de preparacin magistral con nivel de riesgo alto se
debe usar un agar con extracto de malta u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. Los medios usados para el muestreo de superficies deben complementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA
con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partculas Areas ViablesLa evaluacin de microorganismos areos usando mtodos volumtricos de recoleccin en los ambientes de aire controlado (CFL, CAI, cuarto limpio o zonas amortiguadoras y antesalas) debe efectuarla personal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
El mtodo de impacto debe ser el mtodo preferido de muestreo volumtrico de aire. El uso de placas de sedimentacin
para muestreo cualitativo de aire puede no ser capaz de determinar adecuadamente la calidad del aire en el ambiente controlado. La sedimentacin de partculas por gravedad en placas de cultivo depende del tamao de la partcula y puede estar influenciada por el movimiento del aire. Por consiguiente, la cantidad de unidades formadoras de colonias (ufc) en una placa de
sedimentacin puede no siempre estar relacionada con las concentraciones de las partculas viables en el ambiente muestreado.
Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contaminacin, durante las actividades de preparacin magistral y otras actividades como clasificacin de componentes, etiquetado, vestimenta y limpieza. Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro
de la CFL y otras reas donde la turbulencia de reflujo de aire puede ingresar a la zona de preparacin magistral (puertas de
entrada, dentro y alrededor del CIP y ambientes ISO Clase 5 [ver Tabla 1]). Debe considerarse el efecto general que el mtodo
de muestreo escogido tendr sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparacin magistral.
Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, preparada en un CIP (CFL, CSB, CAI) que mantiene una ISO
Clase 5 (ver Tabla 1), el muestreo del aire se debe efectuar en lugares dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras reas (ver Tabla
1) que estn muy cerca del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) durante la certificacin del CIP.
Dispositivos de Muestreo de AireExiste una gran cantidad de fabricantes de equipos electrnicos para muestreo de aire.
Es importante que el personal consulte los procedimientos recomendados por el fabricante al usar un equipo para efectuar el
muestreo volumtrico de aire. Se deben seguir las instrucciones en el manual del usuario provisto por el fabricante en lo que
respecta a la verificacin y uso de muestreadores elctricos de aire que recolectan activamente volmenes de aire para anlisis.
Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar seleccionado, con el fin de maximizar la sensibilidad. Los dispositivos volumtricos para muestreo de aire tienen que calibrarse y repararse segn lo recomendado por el
fabricante.
Se recomienda que el personal de preparacin magistral se remita tambin a Metodologa e Instrumental para Cuantificacin
de Microorganismos Viables Transportados por el Aire en Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116, que proporciona ms informacin sobre el uso de muestreadores volumtricos de aire y el volumen de aire que se
debe recolectar para detectar variaciones de la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del AireComo parte de la recertificacin de instalaciones y equipos, el muestreo del
aire se debe efectuar al menos dos veces al ao (es decir, cada 6 meses). Si la preparacin magistral se realiza en mltiples
ubicaciones dentro de una institucin (p.ej., farmacia principal, satlites), se requiere el muestreo ambiental para cada rea de
preparacin individual. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo
electrnico para muestreo de aire. Cualquier actividad de construccin o de reparacin de equipos dentro de una instalacin
puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Perodo de IncubacinAl final del perodo de muestreo o exposicin indicado para la toma de muestras de aire se recuperan las placas de medio de crecimiento microbiano, se aseguran sus tapas (p.ej., con cinta) y luego se invierten e incuban a
una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El TSA se debe incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 48 a 72 horas. El agar con extracto de malta u otro medio apto para hongos se
debe incubar entre 26 y 30 durante 5 a 7 das. Se debe contar e informar la cantidad de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de muestreo ambiental. Los recuentos de las muestras de
aire se deben transformar en ufc por metro cbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de DatosEl muestreo microbiano viable del aire en el ambiente de
preparacin magistral adquiere valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una situacin inaceptable. Los datos
de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparacin magistral. Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiologa.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin (ver Tabla 2) debe dar lugar a una reevaluacin de la
aptitud de las prcticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtracin de aire dentro de las instalaciones de preparacin magistral asptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
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cin. Las posibles fuentes incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA daados y cambios en la vestimenta o prcticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el rea afectada y tomar nuevas muestras.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de accin se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 2 deben usarse slo como gua. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la farmacia, las acciones
correctivas futuras se tomarn de acuerdo con la identificacin de los microorganismos recuperados (al menos el gnero) hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de
aire por impacto. Los microorganismos altamente patgenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo,
hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbilogo competente, un profesional de
control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 2. Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana*
(ufc por metro cbico [1000 litros] de aire por placa)
Clasificacin
Muestra de Aire
ISO Clase 5
>1
ISO Clase 7
> 10
ISO Clase 8 o menor calidad
> 100
* Guidance for IndustrySterile Drug Products Produced by Aseptic ProcessingCurrent Good Manufacturing PracticeUS HHS, FDA, septiembre de 2004.
Captulos
Requisitos Adicionales para el Personal

Los alimentos, bebidas y materiales expuestos en reas de cuidado y tratamiento de pacientes no deben introducirse en antesalas, zonas amortiguadoras o reas segregadas para preparacin magistral en las que haya componentes e ingredientes de
PME. Cuando las actividades de preparacin magistral requieran la manipulacin de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales biolgicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones
deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipo usado en las actividades
de preparacin de PME y deben controlarse por medio de POE especficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los
suministros y componentes empacados para preparacin magistral, como agujas, jeringas, sets de tubos y soluciones parenterales de pequeo y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA
estril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 1), antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras. La higiene de manos y los procedimientos de vestimenta del personal se efectan tambin en la antesala, la cual
puede contener un lavabo que se pueda accionar sin usar las manos y un sistema cerrado dispensador de jabn para minimizar
el riesgo de contaminacin extrnseca. Deber existir algn tipo de demarcacin que separe la antesala de la zona amortiguadora. Despus de entrar a la zona amortiguadora deben tomarse las medidas adecuadas para efectuar la limpieza antisptica
de manos usando un exfoliante quirrgico a base de alcohol con actividad persistente, seguido del uso de guantes estriles.
Limpieza y Desinfeccin del rea de Preparacin Magistral

El contacto ambiental es una fuente importante de contaminacin microbiana de las PME. Por consiguiente, se requiere
atencin escrupulosa en la limpieza y desinfeccin de las reas de preparacin magistral estril para minimizar dicha fuente de
contaminacin de las PME.
Las prcticas de limpieza y desinfeccin, as como las frecuencias mencionadas en esta seccin aplican a las zonas de preparacin magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposicin de sitios crticos, as como a las zonas amortiguadoras, antesalas y
zonas segregadas de preparacin magistral. El personal de preparacin magistral es responsable de garantizar que la frecuencia de limpieza est de acuerdo con los requisitos estipulados en la Tabla 3 y determinar los productos para limpieza y desinfeccin que se van a usar (ver Apndice II). El personal de preparacin magistral debe tener en cuenta toda poltica organizacional o institucional relacionada con la seleccin de desinfectantes. Todas las prcticas y polticas de limpieza y desinfeccin para
la preparacin de PME se deben incluir por escrito en los POE y las debe seguir todo el personal de preparacin magistral.
Tabla 3. Frecuencia Mnima de Limpieza y Desinfeccin de las Zonas de Preparacin Magistral
Lugar
Frecuencia Mnima
Control de Ingeniera Primario ISO Clase 5 (ver Tabla 1)

(p.ej., CFL, CSB, CAI, CACI)
Al comenzar cada turno, antes de cada lote, a ms tardar 30 minutos despus de la desinfeccin previa de la superficie cuando se estn llevando a cabo actividades de preparacin magistral, despus de derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie est contaminada
Mostradores y superficies de trabajo fcilmente limpiables
Diariamente
Pisos
Diariamente
Paredes
Mensualmente
Cielos rasos
Mensualmente
Estantes de almacenamiento
Mensualmente
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Captulos
La seleccin y uso de desinfectantes en instituciones de salud est dictada por varias propiedades, tales como actividad microbicida, inactivacin por materia orgnica, residuos y vida til (ver Apndice II). En general, los desinfectantes altamente txicos, como el glutaraldehdo no se usan sobre las superficies del ambiente (p.ej., pisos, mostradores). Muchos desinfectantes
registrados por la EPA son de un solo paso. Esto significa que el desinfectante est formulado para ser eficaz en presencia de
suciedad leve a moderada, sin un paso previo de limpieza.
Las superficies en CFL, CSB, CAI y CACI, a las que estn expuestos los sitios crticos, requieren desinfeccin ms frecuente
que las superficies del ambiente como paredes y cielos rasos. La desinfeccin de zonas de preparacin magistral estril debe
hacerse de manera peridica con los intervalos mencionados en la Tabla 3 cuando ocurren derramamientos, cuando las superficies estn visiblemente sucias y cuando se sabe o se sospecha que se ha introducido contaminacin microbiana en las zonas
de preparacin magistral.
Cuando la superficie que se va a desinfectar est muy sucia, se recomienda una limpieza antes de la aplicacin del desinfectante. El personal de preparacin magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en prctica los procedimientos de limpieza y desinfeccin del rea directa de preparacin magistral (ADP) escritos en los POE. La limpieza y desinfeccin deben hacerse antes de la preparacin magistral. Para hacer la limpieza, se deben quitar todos los artculos y limpiar
las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos slidos solubles en agua
se quitan con agua estril (para inyeccin o irrigacin) y paos que no desprendan partculas. Luego se pasa un pao con un
agente desinfectante que no deje residuos, como IPA al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparacin magistral.
Las prcticas ms crticas antes de la preparacin de las PME son la limpieza y desinfeccin de las superficies en CFL, CSB,
CAI y CACI. Por consiguiente, dichas superficies se deben limpiar y desinfectar con frecuencia: al comenzar cada turno de trabajo, antes de la preparacin de cada lote, cada 30 minutos durante los perodos continuos de preparacin de PME individuales, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie est contaminada debido a fallas procedimentales.
Las superficies de trabajo en las zonas amortiguadoras ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y las antesalas ISO Clase 8 (ver Tabla 1), as
como las zonas segregadas de preparacin magistral se deben limpiar y desinfectar por lo menos diariamente, y el polvo y los
detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparacin
magistral, usando un mtodo que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8 (ver Tabla 1) (ver Desinfectantes y Antispticos
1072).
Los pisos en la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona de preparacin magistral segregada se friegan con un agente
limpiador y desinfectante una vez al da, a una hora en que no se est realizando ninguna operacin asptica. La limpieza del
suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE
escritos. El personal de preparacin magistral tiene la responsabilidad de garantizar que dicha limpieza se haga apropiadamente. En la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona segregada de preparacin magistral, se deben limpiar y desinfectar
mensualmente las paredes, cielos rasos y estanteras. Slo deben utilizarse agentes de limpieza y desinfeccin aprobados teniendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la generacin de residuos inapropiados o txicos (ver Apndice II). Sus cronogramas de uso y mtodos de aplicacin deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y el de preparacin magistral deben cumplirlos.
Todos los materiales de limpieza, como paos, esponjas y trapeadores, no deben desprender partculas, y deben estar compuestos preferentemente por microfibras sintticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras o limpias, antesalas y reas
segregadas de preparacin magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. Pueden usarse trapeadores, tanto en la zona amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala, pero nicamente en ese orden. Lo ideal sera
que todas los enseres de limpieza se descartaran despus de un uso, recolectndolos en bolsas plsticas apropiadas y retirndolos del lugar con la mnima agitacin. Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basndose en las recomendaciones de los fabricantes) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se
mantiene y el uso repetido no incrementa la biocarga del rea que se est limpiando.
Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej.,
IPA estril al 70%), empleando un frasco rociador u otro mtodo de aplicacin adecuado. Despus de rociar o limpiar con el
desinfectante la superficie a desinfectar, sta se debe dejar secar y durante este tiempo el artculo no se debe usar para la preparacin magistral.
Para desinfectar puntos de entrada de bolsas y viales, es preferible limpiar con hisopos pequeos estriles impregnados en
IPA al 70%, los cuales se consiguen comercialmente en envases laminados sellados individuales (o un mtodo comparable),
dejando secar el IPA antes de perforar los tapones con agujas estriles y de romper los cuellos de las ampollas. La superficie de
los hisopos estriles con IPA al 70% usados para desinfectar puntos de entrada de envases y dispositivos estriles no debe entrar en contacto con ningn otro objeto antes de tocar la superficie del punto de entrada. No se deben utilizar compresas de
gasa empapadas en IPA estril al 70% ni otros materiales que desprendan partculas para desinfectar los puntos de entrada
estriles de envases y dispositivos.
Cuando se reciben suministros estriles en bolsas selladas destinadas a conservarlos estriles hasta el momento de abrirlos,
los suministros estriles se pueden retirar de las bolsas que los recubren cuando se introducen en el CIP (CFL, CSB, CAI, CACI)
ISO Clase 5 (ver Tabla 1) sin que sea necesario desinfectar los artculos individuales del suministro estril. No se pueden llevar
cajas de embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o limpia ni al rea segregada de preparacin magistral.
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Limpieza y Vestimenta del Personal

La cuidadosa limpieza de manos y brazos y el uso correcto del adecuado equipo protector para el personal (EPP) por parte
del personal de preparacin magistral constituye el primer paso ms importante en la prevencin de contaminacin microbiana de las PME. Adems, el personal debe ser completamente competente y estar muy motivado para realizar manipulaciones
aspticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. Del cuerpo humano normalmente se desprenden clulas escamosas a una velocidad de 106 o ms por hora y esas partculas de la piel estn cargadas de microorganismos.10,11 Cuando los individuos tienen prurito, quemaduras de sol, lceras exudantes, conjuntivitis, infeccin respiratoria activa
o usan cosmticos, estas partculas se desprenden incluso a mayor velocidad. Las partculas desprendidas por el personal de
preparacin magistral representan un incremento en el riesgo de contaminacin microbiana de los sitios crticos de PME. Por
lo tanto, el personal de preparacin magistral que presenta alguna de las afecciones antes mencionadas debe ser excluido del
trabajo en zonas de preparacin magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) e ISO Clase 7 (ver Tabla 1), hasta que dichas afecciones
desaparezcan.
Antes de ingresar en una zona amortiguadora o en una zona segregada de preparacin magistral (ver PME de Nivel de Riesgo
Bajo con FLU de 12 Horas o Menos), el personal de preparacin magistral debe quitarse las prendas personales exteriores (p.ej.,
bandanas, abrigos, sombreros, chaquetas, bufandas, suteres, chalecos), todos los cosmticos, porque desprenden escamas y
partculas, y todas las joyas de las manos y muecas, as como otras joyas y accesorios visibles (p.ej., aretes, pendientes para
labios o cejas (pirsins)) que puedan interferir con la eficacia del EPP (p.ej., ajuste de guantes y puos de mangas). El uso de
uas postizas o prolongaciones est prohibido mientras se trabaja en el ambiente estril de preparacin magistral. Las uas
naturales se deben mantener limpias y recortadas.
El personal debe usar el siguiente EPP en un orden que vaya de las actividades consideradas ms sucias hasta las ms limpias.
Las actividades de vestimenta consideradas ms sucias incluyen el calzado de zapatos destinados a la preparacin magistral o
cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial (p.ej., cubiertas para la barba, adems de mscaras), mscaras protectoras para la cara y ojos. Los protectores para los ojos son opcionales, a menos que se trabaje con irritantes como agentes
germicidas desinfectantes o se elaboren preparaciones con frmacos peligrosos.
Despus de ponerse el calzado especial o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial, y mscaras, se debe
realizar un procedimiento de limpieza de manos para retirar los detritos debajo de las uas con un limpiador de uas, bajo
agua tibia corriente, seguido de una limpieza meticulosa de las manos. Las manos y los antebrazos se deben lavar hasta los
codos con agua y jabn (bien sea antimicrobiano o no), durante 30 segundos al menos, mientras se est en la antesala. No se
recomienda el uso de cepillos antimicrobianos porque causan irritacin y lesiones cutneas. Se secan las manos y los antebrazos completamente hasta los codos, bien sea con toallas desechables sin pelusas o con un secador de manos electrnico. Despus de completar el lavado de manos, se viste una bata con mangas que no desprenda partculas, que ajuste de manera cmoda alrededor de las muecas y cierre en el cuello. Se deben usar batas destinadas para la zona amortiguadora, que sean de
preferencia desechables. Si se visten batas reutilizables, se deben lavar apropiadamente para uso en la zona amortiguadora.
Una vez dentro de la zona amortiguadora o del rea segregada de preparacin magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con
FLU de 12 Horas o Menos) y antes de calzar guantes estriles sin talco, se debe efectuar una limpieza antisptica de manos con
un exfoliante quirrgico para manos exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente12, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las manos se deben dejar secar completamente antes de calzar los guantes estriles.
Los guantes estriles deben ser el ltimo artculo puesto antes de comenzar la preparacin magistral. Los guantes se contaminan cuando entran en contacto con superficies no estriles durante las actividades de preparacin magistral. La desinfeccin
de las manos enguantadas se debe hacer frotando o untando IPA estril al 70% en todas las superficies de contacto de los
guantes y dejando secar completamente las manos enguantadas. Usar slo guantes cuya compatibilidad con la desinfeccin
con alcohol haya sido probada por el fabricante. Durante todo el procedimiento de preparacin magistral se debe aplicar IPA
estril al 70% en forma rutinaria, al igual que siempre que se toquen superficies no estriles (p.ej., viales, mostradores, sillas,
carros). Los guantes se deben inspeccionar rutinariamente, durante el uso, en busca de orificios, pinchazos o rasgones, reemplazndolos de inmediato si stos se detectan. La limpieza antisptica de manos se debe efectuar como se indic anteriormente. Se debe capacitar y evaluar al personal de preparacin magistral sobre cmo evitar el contacto con los sitios crticos.
Cuando el personal de preparacin magistral sale del rea de preparacin durante un turno de trabajo, se debe quitar la
bata exterior, conservndola en el rea de preparacin magistral si no est visiblemente sucia, para volvrsela a poner durante
ese mismo turno nicamente. Sin embargo, los cubrecalzado, las mascarillas que cubran el vello facial y gorras, mscaras protectoras para la cara y ojos, as como los guantes se deben reemplazar por otros nuevos antes de volver a entrar al rea de
preparacin magistral y se debe efectuar de nuevo la higiene de las manos.
Durante las actividades de preparacin magistral de alto riesgo que preceden a la esterilizacin terminal, como son el pesado y mezclado de ingredientes no estriles, el personal de preparacin magistral debe estar vestido y enguantado igual que si
estuviera realizando una preparacin magistral en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1). El personal de preparacin magistral
adecuadamente vestido y enguantado que se exponga a un aire cuya calidad se sepa o sospeche inferior a ISO Clase 7 (ver
Tabla 1) debe cambiar EPP, adems de lavarse las manos apropiadamente, efectuando limpieza antisptica de la manos con un
10
11
12
Agalloco J, Akers JE. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceutical Technology, 2005. Aseptic Processing supplement, s16.
Eaton T. Microbial Risk Assessment for Aseptically Prepared Products. Am Pharm Rev. 2005; 8 (5, Sep/Oct): 4651.
Guideline for Hand Hygiene in Health care Settings, MMWR, el 25 de octubre de 2002, vol. 51, N RR-16 disponible en Internet en http://www.cdc.gov/handhygiene/.
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exfoliante quirrgico a base de alcohol, sin agua, y calzar guantes estriles al volver a ingresar a la zona amortiguadora ISO
Clase 7 (ver Tabla 1). Cuando las fuentes del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) son CAI o CACI, los requisitos de vestimenta y
guantes para el personal de preparacin magistral deben ser iguales a los descritos anteriormente, a menos que el fabricante
del aislador pueda proporcionar documentacin por escrito, basada en pruebas ambientales validadas, de que no se requiere
algn componente del EPP o de la limpieza del personal.
Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de

Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin
EVALUACIN DE COMPETENCIA EN VESTIMENTA Y PRCTICAS ASPTICAS DE TRABAJO
El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prcticas de vestuario apropiadas; de la tcnica asptica del personal de preparacin magistral
y de la presencia de contaminacin superficial, asumiendo que todo el trabajo se realiza en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y
controles de ingeniera secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 1), certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes
porque el personal de preparacin magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estriles con
el fin de conseguir la esterilidad. El personal de preparacin magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la
elaboracin de PME y siempre que se efecte un llenado de medios asptico, usando un formulario como el Formulario de
Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magistral (ver Apndice III) y el procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal, segn se indica a
continuacin.
Evaluacin de la Prctica Asptica de Trabajo por Medio del Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del
PersonalEl muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin magistral se debe realizar en la
elaboracin de PME de todos los niveles de riesgo, dado que la contaminacin por contacto directo es la fuente ms probable
de introduccin de microorganismos en las PME preparadas por seres humanos. El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe usar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta,
as como para educar al personal de preparacin magistral en las prcticas de trabajo apropiadas, las cuales incluyen desinfeccin frecuente y repetida de guantes, usando IPA estril al 70% durante la preparacin de las PME. Todo el personal debe
demostrar competencia en los procedimientos adecuados de higiene de las manos y vestimenta, as como en las prcticas
aspticas de trabajo (p.ej., desinfeccin de las superficies de los componentes, desinfeccin rutinaria de manos enguantadas,
etc.).
Se deben usar placas estriles de contacto con agar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del
personal de preparacin magistral despus de vestirse, con el fin de evaluar la competencia en el uso de vestimenta, y despus
de completar la preparacin de llenado de medios (sin aplicar IPA estril al 70%) con el fin de evaluar si las prcticas aspticas
Captulos
El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda de instruccin multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conocimientos prcticos de los procedimientos de vestimenta, prcticas aspticas de trabajo, as como en la forma de conseguir y
mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y procedimientos de limpieza y desinfeccin. Esta capacitacin se
debe completar y documentar antes de que cualquier miembro del personal comience la elaboracin de PME. El personal de
preparacin magistral debe completar la capacitacin didctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a
evaluaciones de destreza usando herramientas de auditora de observacin y pruebas de llenado de medios (ver Apndices III
V).
Las pruebas de las destrezas para el trabajo asptico mediante el llenado de medios se efectan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y luego anualmente, al menos, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y
semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto.
El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o las auditoras de observacin o cuyos viales de prueba de llenado de medios tengan una o ms unidades que muestren contaminacin microbiana visible deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en preparacin magistral, para
asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica. El personal de preparacin magistral
debe aprobar todas las evaluaciones antes de reiniciar la prctica de preparacin magistral estril. Adems de la evaluacin
didctica y llenado asptico de medios, el personal de preparacin magistral debe demostrar competencia en la higiene apropiada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza.
En caso de que el personal de apoyo (p.ej., personal de limpieza/mantenimiento y servicios ambientales institucionales) efecte tambin procedimientos de limpieza y desinfeccin, un experto calificado en preparacin magistral asptica debe capacitarlos en la higiene de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza y desinfeccin. Despus de terminar la capacitacin, el personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluacin de desempeo en la higiene apropiada de las manos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfeccin, que llevar a cabo un experto calificado en preparacin
magistral asptica.
Captulos
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de trabajo son adecuadas, antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano y para que el personal ms
experimentado mantenga su calificacin en el proceso mencionado.
Evaluacin de Competencia en Uso de Vestimenta y GuantesEl personal de preparacin magistral debe ser inspeccionado visualmente durante los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta (ver Limpieza y Vestimenta del Personal en Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica, arriba). La inspeccin visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas
con la Vestimenta del Personal de Preparacin Magistral (ver Apndice III) y mantenerse para tener un registro permanente y evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos EnguantadosTodo el personal de preparacin magistral debe completar exitosamente una evaluacin inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero
ufc) no menos de tres veces antes de que se le permita comenzar a elaborar PME para uso humano. Inmediatamente despus
de que el empleado de preparacin magistral complete la higiene de las manos y el procedimiento de vestimenta (p.ej., calzado de guantes estriles antes de cualquier desinfeccin con IPA estril al 70%), el evaluador recolectar una muestra de las
puntas de los dedos y pulgares enguantados de ambas manos del empleado en placas de agar apropiadas, presionando ligeramente el agar con cada dedo. Las placas se incubarn durante un perodo de incubacin apropiado a la temperatura adecuada
(ver Perodo de Incubacin). Despus de completar la evaluacin inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, una
vez al ao, como mnimo, se debe hacer una reevaluacin de la competencia de todo el personal de preparacin magistral que
elabore PME de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestralmente al personal que elabore PME de nivel de riesgo alto, usando
una o ms muestras recolectadas durante cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios, antes de que se les permita continuar elaborando PME para uso humano.
No se deben desinfectar los guantes con IPA estril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. La desinfeccin
de los guantes inmediatamente antes de la toma de muestras proporcionar resultados falsos negativos. Cuando se tomen
muestras de las puntas de los dedos del personal se usarn placas que contengan agar nutritivo con agentes neutralizantes
como lecitina y polisorbato 80. El personal debe tocar el agar con las puntas de los dedos de ambas manos en placas separadas, de manera que se cree una ligera impresin en el agar. Despus de la toma de muestras, los guantes se deben desechar
de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar como se estipula a
continuacin (ver Perodo de Incubacin). Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha). El nivel de accin de ufc para las manos enguantadas estar basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
Perodo de IncubacinAl final del perodo de muestreo indicado para las actividades de evaluacin de la competencia
del personal de preparacin magistral (superficie o personal), se recuperan las placas de agar, se aseguran sus tapas y luego se
invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El TSA con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 48 a 72 horas.
Evaluacin de la Competencia en Manipulacin AspticaDespus de completar exitosamente una Evaluacin de Competencia en Higiene de las Manos y Vestimenta, todo el personal de preparacin magistral debe someterse una evaluacin de
su competencia en la tcnica asptica y prcticas relacionadas, inicialmente durante el Procedimiento de Prueba de Llenado de
Medios y en los subsiguientes Procedimientos de Prueba de Llenado de Medios, anual o semestralmente. Los registros de estas
evaluaciones se mantendrn usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de Tcnicas Aspticas y Prcticas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral (ver Apndice IV) y se conservarn para tener un registro permanente de
la evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Procedimiento de Prueba de Llenado de MediosLa destreza del personal para preparar PME aspticamente se debe evaluar
usando la verificacin de llenado de medios de cultivos bacterianos lquidos y estriles (es decir, transferencia de un medio de
cultivo bacteriano estril por medio de una jeringa y aguja estriles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
prctica asptica del personal de preparacin magistral. Las pruebas de llenado de medios deben representar las condiciones
ms exigentes o difciles con las que el personal puede encontrarse durante la elaboracin de PME de nivel de riesgo bajo y
mediano y durante la esterilizacin de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafo de llenado de medios se usan tambin para verificar la aptitud del ambiente de preparacin magistral y de los procesos para producir una preparacin estril.
Por lo general, se usa un medio lquido de cultivo estril disponible comercialmente, como el Medio de Digerido de Casena
y Soja (ver Pruebas de Esterilidad 71), que sea capaz de promover la colonizacin exponencial de las bacterias que el personal
de preparacin magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Para PME de nivel de riesgo alto se puede usar un Medio de
Digerido de Casena y Soja no estril, disponible comercialmente, para preparar una solucin al 3%. Se deben imitar los pasos
de procesamiento normales, incluyendo la esterilizacin por filtracin. Los viales llenados con medios deben incubarse a una
temperatura de 20 a 25 o de 30 a 35 durante 14 das como mnimo. Si se usan dos temperaturas para la incubacin de
muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos debern incubarse durante al menos 7 das a cada temperatura
(ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116). Si cualquiera de las unidades llenas de
medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 das, significa que no se ha pasado la prueba. Se pueden considerar
otros mtodos recomendados por un microbilogo competente para mejorar el tiempo de recuperacin y la sensibilidad para
detectar contaminacin microbiana (ver ejemplos de procedimientos de llenado de medios en Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME).
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MUESTREO Y EVALUACIN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIN DE SUPERFICIES
Niveles de Accin, Documentacin y Evaluacin de Datos

El monitoreo microbiano viable de las puntas de los dedos enguantados y de las superficies de los componentes, as como
del ambiente de preparacin magistral adquieren valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una prctica de
trabajo inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el
control general del ambiente de preparacin magistral. Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiologa.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin (ver Tabla 4) debe dar lugar a una reevaluacin de la
aptitud de las prcticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtracin de aire dentro de las instalaciones de preparacin magistral asptica. Se debe investigar la fuente de la contaminacin. Las posibles fuentes de contaminacin incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA daados y cambios en la vestimenta o
prcticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el rea afectada y tomar nuevas muestras.
Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de accin despus de la
incubacin apropiada, se debe efectuar y documentar una revisin de los procedimientos de higiene de las manos y de vestimenta, as como de los procedimientos de desinfeccin de guantes y superficies y prcticas de trabajo. Puede ser necesario
capacitar al empleado para corregir la fuente del problema.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de accin se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 4 deben usarse slo como gua. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la instalacin de preparacin magistral, las acciones correctivas futuras se tomarn de acuerdo con la identificacin de los microorganismos recuperados (al menos el gnero), hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc,
usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patgenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben
PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbilogo competente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial.
Captulos
La toma de muestras de superficies es un componente importante del mantenimiento de un ambiente microbiolgicamente

controlado para elaboracin de PME, especialmente si se considera que la transferencia de contaminacin microbiana a partir
del contacto inadvertido por parte del personal de preparacin magistral con superficies desinfectadas inadecuadamente, puede ser una fuente potencial de contaminacin para las PME. Adems, se considera til para evaluar los procedimientos de limpieza y desinfeccin de las instalaciones y superficies de trabajo, as como la competencia de los empleados en las prcticas de
trabajo como la desinfeccin de superificies de componentes/viales. En todas las reas ISO se deben tomar muestras de las
superficies en forma peridica. Los muestreos se pueden hacer usando placas de contacto o hisopos y se deben realizar al terminar la preparacin magistral. Se deben definir los lugares en donde se van a tomar muestras en un plan o formulario de
muestreo. El tamao de la placa que se va a usar para cada lugar muestreado tiene, por lo general, entre 24 y 30 cm2. Las
placas de contacto se llenan con medio agar slido de crecimiento general y agentes neutralizantes por encima del borde de la
placa y se usan para tomar muestras de superficies parejas o planas. Se pueden usar hisopos para tomar muestras de superficies irregulares, especialmente para equipos (ver Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico
1116).
Evaluacin de Competencia en Limpieza y DesinfeccinSe debe inspeccionar visualmente al personal de preparacin
magistral y dems personal responsable de la limpieza durante la realizacin de los procedimientos de limpieza y desinfeccin,
durante la capacitacin inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y
despus de la terminacin de cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios (ver Limpieza y Desinfeccin del rea de
Preparacin Magistral).
La inspeccin visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluacin de Procedimientos
de Limpieza y Desinfeccin (ver Apndice V) y conservarse para tener un registro permanente y la evaluacin a largo plazo de la
competencia del personal.
Mtodos de Recoleccin en la SuperficiePara tomar muestras usando una placa de contacto, se debe tocar suavemente
el rea de muestreo con la superficie del agar y deslizar la placa sobre la superficie a muestrear. La placa de contacto dejar un
residuo de medio de crecimiento; por lo tanto, inmediatamente despus de tomar la muestra con la placa de contacto, el rea
muestreada se debe limpiar cuidadosamente con un pao que no desprenda partculas, empapado en IPA estril al 70%.
Si se toma una muestra con el mtodo del hisopo, la recoleccin de la muestra se hace con los procedimientos apropiados
que determinen un rea superficial equivalente a la de la placa de contacto. Despus de pasar los hisopos por la superficie
muestreada, los hisopos se colocan en un diluyente apropiado y una alcuota se siembra en el agar nutritivo especificado. Los
resultados se deben informar como ufc por unidad de rea superficial.
USP 38
Tabla 4. Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana*

Muestra de las Puntas
de los Dedos
Clasificacin
Muestra de Superficie (Placa de Contacto)

(ufc por placa)
ISO Clase 5
>3
>3
ISO Clase 7
N/D
>5
ISO Clase 8 o menor calidad
N/D
> 100
* Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme (PIC/S) Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes PE 009-6, 5 de abril de 2007.
Captulos
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTNDARES (POE) SUGERIDOS

La instalacin de preparacin magistral debe tener POE escritos y debidamente aprobados, diseados para asegurar la calidad del entorno en el que se elabora la PME. Se recomienda adoptar los siguientes procedimientos:
1. Restringir el acceso a la zona amortiguadora a personal calificado con responsabilidades especficas o tareas asignadas en
el rea de preparacin magistral.
2. Descontaminar en el rea todos los materiales empacados, retirndolos de sus cajas y limpindolos o rocindolos con un
agente desinfectante que no deje residuos, mientras se los transfiere a un carro limpio y adecuadamente desinfectado o a
otro medio de transporte para su introduccin en la zona amortiguadora. Se seguirn las instrucciones del fabricante o los
datos publicados para el tiempo mnimo de contacto. No es necesario limpiar los materiales que vienen en bolsas individuales estriles, ya que las bolsas pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la zona amortiguadora.
3. Los suministros requeridos con frecuencia o que deben tenerse a mano pero que no son necesarios para las operaciones
programadas en un determinado turno deben descontaminarse y almacenarse en los estantes de la antesala.
4. Los carros usados para llevar materiales desde la sala de almacenamiento no pueden desplazarse ms all de la lnea de
demarcacin de la antesala y aquellos usados en la zona amortiguadora no pueden llevarse ms all de la lnea de demarcacin a menos que se limpien y desinfecten antes de volverlos a introducir.
5. Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones programadas en cada turno deben limpiarse con un agente
desinfectante apropiado y llevarse a la zona amortiguadora, preferiblemente en uno o ms carros mviles. Los materiales
de reserva o de uso general para las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en la zona amortiguadora,
pero debe evitarse la acumulacin excesiva de materiales.
6. Los objetos no esenciales que desprendan partculas no pueden llevarse a la zona amortiguadora, incluyendo lpices, cajas
de cartn, toallas de papel y artculos de algodn (p.ej., compresas de gasa).
7. Los productos esenciales a base de papel (p.ej., envolturas de papel de las jeringas, registros de trabajo guardados en una
funda protectora), se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado antes de llevarlos a la zona amortiguadora.
8. Debe reducirse al mnimo el flujo de trfico hacia y desde la zona amortiguadora.
9. El personal que se prepara para entrar a la zona amortiguadora debe retirarse todas las prendas personales externas, cosmticos (porque desprenden escamas y partculas) y todas las joyas de manos y muecas, as como otras joyas y accesorios visibles que puedan interferir con la eficacia del EPP.
10. El personal que entra en la antesala debe vestir la ropa descrita en Limpieza y Vestimenta del Personal y Capacitacin del
Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin.
11. El personal deber luego lavarse cuidadosamente las manos y los antebrazos hasta el codo con agua y jabn, por lo menos durante 30 segundos. Despus de lavarse, se debe usar un secador de aire o toallas desechables que no desprendan
partculas para secarse las manos y los antebrazos.
12. El personal que entra en la zona amortiguadora debe efectuar la limpieza antisptica de manos con un exfoliante quirrgico exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente, antes de calzarse guantes estriles.
13. No se puede ingresar con goma de mascar, bebidas, golosinas ni ningn tipo de alimentos a la zona amortiguadora ni a
la antesala. Los materiales expuestos en reas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca deben introducirse en reas
en las que hayan presentes componentes e ingredientes para la elaboracin de PME.
14. Al comienzo de cada sesin de preparacin magistral, y siempre que se derrame un lquido, las superficies del ambiente
directo de preparacin magistral deben limpiarse primero con Agua Purificada USP para eliminar los residuos hidrosolubles. Inmediatamente despus, se desinfectan las mismas superficies con un agente que no deje residuos, usando un pao
que no suelte pelusa.
15. Los controles de ingeniera primarios deben estar en funcionamiento continuo durante la actividad de preparacin magistral. Cuando el sistema ventilador est apagado, y antes de que ingrese otro personal para realizar actividades de preparacin magistral, slo una persona debe ingresar en la zona amortiguadora a los efectos de encender el ventilador (durante
al menos 30 minutos) y desinfectar las superficies de trabajo.
16. El trfico en el rea directa de preparacin magistral (ADP) debe reducirse al mnimo y controlarse.
17. Se deben juntar los materiales a usar en el ADP para los procedimientos planificados y luego descontaminarse limpiando o
rociando la superficie externa de los mismos con solucin de IPA al 70% o retirando el envoltorio externo en el lmite del
ADP a medida que se introduce el artculo en el rea asptica de trabajo.
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18. Los materiales deben disponerse en el ADP de manera tal que se evite su acumulacin y que se logre el flujo de trabajo
ms eficiente y ordenado posible.
19. Despus de introducir en forma correcta en el ADP nicamente los materiales requeridos para las operaciones asignadas,
deben organizarse de manera tal que un flujo ininterrumpido transparente de aire filtrado por HEPA bae todos los sitios
crticos en todo momento durante los procedimientos planificados. Es decir, no se debe colocar ningn objeto entre el
primer aire de los filtros HEPA y un sitio crtico expuesto.
20. Todos los procedimientos deben realizarse de manera tal de reducir al mnimo el riesgo de contaminacin por contacto.
Los guantes deben desinfectarse con la frecuencia necesaria con un desinfectante aprobado, como IPA estril al 70%.
21. Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de las ampollas se desinfectan pasndoles un pao con IPA
estril al 70% durante al menos 10 segundos antes de usarlos para preparar PME.
22. Despus de la preparacin de cada PME, el contenido del envase se debe mezclar bien y luego inspeccionar para asegurarse de que no tenga partculas, signos de incompatibilidad u otros defectos.
23. Una vez finalizados los procedimientos, se retiran las jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, pero con un mnimo de salidas y entradas al ADP para reducir al mnimo las probabilidades de introducir contaminacin en el espacio
asptico de trabajo.
ELEMENTOS DE CONTROL DE CALIDAD
Ingredientes y Dispositivos
El personal de preparacin magistral debe establecer que los ingredientes utilizados en la elaboracin de las PME tengan la
identidad y calidad correctas, utilizando la siguiente informacin: etiquetas del proveedor, etiquetado del producto, certificados de anlisis, anlisis qumico directo y conocimiento de las condiciones de almacenamiento de las instalaciones de preparacin.
INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS ESTRILES
Los productos farmacuticos estriles disponibles comercialmente y los envases y dispositivos estriles listos para usar son
ejemplos de componentes estriles. Debe seguirse un procedimiento escrito para la inspeccin fsica de cada unidad antes de
su uso para asegurarse de que estos componentes sean estriles, estn libres de defectos y sean adecuados para el uso al que
estn destinados.
INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS NO ESTRILES
Si se usan componentes no estriles, incluyendo envases e ingredientes, para elaborar una PME, dicha PME debe ser de alto
riesgo. Los ingredientes activos y sustancias agregadas o excipientes no estriles utilizados en la elaboracin de PME deben ser
preferentemente artculos que cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan ingredientes no oficiales,
deben estar acompaados por certificados de anlisis de sus proveedores para que el personal de preparacin magistral pueda
evaluar su identidad, calidad y pureza en relacin con el uso que se les dar en cada PME. Es necesario realizar una inspeccin
fsica del envase de los ingredientes para asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el contenido no tenga
ninguna desviacin en relacin con el aspecto, aroma y textura esperados.
Las sustancias farmacuticas a granel, o no formuladas, y las sustancias agregadas o excipientes deben almacenarse en envases hermticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, humedad e iluminacin indicadas en las monografas oficiales o aprobadas por los proveedores. La fecha de recepcin en la instalacin de preparacin magistral debe estar clara e indeleblemente marcada en cada envase del ingrediente. Una vez recibidos por la institucin responsable de la preparacin magistral, los envases de ingredientes que no tienen una fecha de caducidad del proveedor no podrn utilizarse despus de transcurrido un ao, a menos que una inspeccin o anlisis apropiado indique que el ingrediente ha conservado su pureza y calidad
para su uso en la elaboracin de PME.
Debern considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de ingredientes no estriles, especialmente cuando la PME ha
de administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o en los ojos.
Captulos
En cada centro debe desarrollarse una descripcin por escrito del programa de capacitacin especfica y de evaluacin del
desempeo para todo el personal que utiliza tcnicas aspticas en la preparacin de productos estriles. Este programa debe
preparar al personal otorgndole los conocimientos apropiados y la instruccin necesarias en el desarrollo de las habilidades
requeridas para realizar las tareas asignadas. Cada una de las personas asignadas al rea asptica para la preparacin de productos estriles debe completar con xito un curso de capacitacin especializado en tcnicas aspticas y prcticas del rea
asptica antes de poder elaborar PME (ver la seccin Capacitacin y Evaluacin del Personal en Tcnicas de Manipulacin Asptica
y Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin).
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La persona a cargo de la preparacin magistral debe realizar una inspeccin visual de cada lote de frmaco o excipiente a
granel recibido que se utilizar en la elaboracin de las PME para detectar cualquier deterioro, otras caractersticas de calidad
inaceptable o identificacin errnea. La inspeccin visual de la sustancia farmacutica o excipiente a granel debe realizarse peridicamente segn se describe en el protocolo escrito correspondiente.
Equipos
Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en la preparacin magistral de una PME funcionen correctamente en todo momento y dentro de los lmites de tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito, y seguirse, los procedimientos de calibracin del equipo, mantenimiento anual, monitoreo de funcionamiento correcto, y procedimientos controlados para el uso del equipo, as como las frecuencias especficas para todas estas actividades. En estos POE se deben describir el
mantenimiento de rutina y las frecuencias. Los resultados de la calibracin de los equipos, informes de mantenimiento anual y
mantenimiento de rutina deben conservarse en los archivos durante toda la vida til del equipo. Se prepara al personal mediante una combinacin apropiada de capacitacin especfica y experiencia, para hacer funcionar o manipular cualquier equipo, aparato o dispositivo que pudieran tener que usar para la elaboracin de PME. La capacitacin debe incluir los conocimientos necesarios para determinar si un equipo determinado est funcionando correctamente o si tiene algn desperfecto.
Captulos
VERIFICACIN DE DISPOSITIVOS AUTOMATIZADOS DE PREPARACIN MAGISTRAL (DAP) PARA

NUTRICIN PARENTERAL
Los DAP para la preparacin de mezclas para nutricin parenteral son ampliamente utilizados por los farmacuticos en hospitales y otros mbitos de atencin de la salud. Estn diseados para agilizar los procesos ms engorrosos requeridos para la
preparacin magistral de estas formulaciones de varios componentes, administrando automticamente los componentes nutricionales individuales en una secuencia predeterminada bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas para nutricin
parenteral contienen 20 o ms aditivos individuales que representan hasta 50 o ms componentes individuales (p.ej., 15 a 20
aminocidos cristalinos, dextrosa monohidrato y lpidos; 10 a 12 sales electrolticas; 5 a 7 oligominerales y 12 vitaminas). En
consecuencia, los DAP pueden mejorar la exactitud y precisin del proceso de preparacin magistral en comparacin con los
mtodos de preparacin magistral manuales tradicionales.
Exactitud
La exactitud de un DAP puede determinarse de varias maneras para asegurar que se suministren las cantidades correctas de
nutrientes, electrlitos u otros componentes nutricionales al envase de infusin final. Inicialmente, debe evaluarse el DAP para
verificar la exactitud del volumen y peso. Para verificar la exactitud del volumen, debe programarse el DAP para administrar un
volumen adecuado de Agua Estril para Inyeccin USP, que represente un volumen tpico de aditivo (p.ej., 40 mL para un
intervalo de volumen pequeo de 1 a 100 mL; o 300 mL para un intervalo de volumen grande de 100 a 1000 mL) y administrarse al recipiente volumtrico apropiado. Luego, el personal de preparacin magistral debe consultar en la seccin Aparatos
Volumtricos 31 los parmetros apropiados para evaluar el desempeo volumtrico del DAP. Para verificar la exactitud gravimtrica, debe evaluarse la balanza utilizada junto con el DAP, usando diferentes tamaos de pesas que representen las cantidades normalmente usadas para administrar los diferentes aditivos. El personal de preparacin magistral debe consultar en la seccin Pesas y Balanzas 41 las tolerancias aceptables de las pesas usadas. Adems, debe pesarse posteriormente el mismo volumen de Agua Estril para Inyeccin usado para evaluar la exactitud volumtrica en la balanza usada con el DAP. Por ejemplo, si
se utilizaron 40 mL de agua en la evaluacin volumtrica, su peso correspondiente debera ser de aproximadamente 40 g (suponiendo que la densidad relativa del agua es de 1,0). Adems, durante el uso del DAP, tambin pueden probarse ciertos aditivos, como cloruro de potasio (corregido segn las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada durante el
proceso.
Por ltimo, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el
volumen final de la mezcla para nutricin parenteral. Por lo general, los departamentos de una farmacia no tienen la capacidad
para realizar en forma rutinaria anlisis qumicos, como anlisis de concentraciones de dextrosa o electrlitos. En consecuencia,
es posible que los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de realizar estas pruebas de garanta de calidad. No obstante, los mtodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseados para sistemas biolgicos, no farmacuticos. En consecuencia, debe verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los requisitos USP especificados en la
monografa individual correspondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en Dextrosa, Inyeccin, se especifica
lo siguiente: Contiene no menos de 95,0% y no ms de 105,0% de la cantidad declarada de C6H12O6 H2O. Los laboratorios
de qumica de la institucin u hospital pertinente deben validar sus mtodos para aplicarlos a este intervalo y corregirlos segn
su medicin tpica de dextrosa anhidra en relacin con dextrosa monohidrato. Existen intervalos y cuestiones similares, por
ejemplo, para las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio. El punto crtico es el uso de
referencias USP y posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.
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Precisin
La precisin intermedia del DAP puede determinarse teniendo en cuenta las variaciones diarias en los resultados de las mediciones de exactitud. En consecuencia, el personal de preparacin magistral debe llevar un registro diario de las evaluaciones de
exactitud antes descritas y revisar los resultados a lo largo del tiempo. Esta revisin debe realizarse al menos cada semana para
evitar errores acumulativos clnicamente significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con un ndice teraputico estrecho, como el cloruro de potasio.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS

Las siguientes mediciones de calidad se deben efectuar para todas las PME antes de dispensarlas o administrarlas.
Inspeccin de Formas Farmacuticas en Solucin y Revisin de los Procedimientos de Preparacin

Magistral
Todas las PME que se preparan como soluciones deben examinarse visualmente para asegurarse de que no contengan partculas y, en caso afirmativo, no deben administrarse ni dispensarse. Antes de administrar o dispensar las PME de cualquier nivel
de riesgo de contaminacin, se deben inspeccionar las recetas, los procedimientos escritos de preparacin magistral, los registros de preparacin y los materiales usados en su elaboracin, para verificar las identidades y cantidades correctas de sus ingredientes, el mezclado asptico y esterilizacin, el envasado, etiquetado y aspecto fsico esperado.
Despus de su preparacin magistral, las PME terminadas deben inspeccionarse en forma individual, segn los procedimientos por escrito. Si no se distribuyen de inmediato, estas PME deben inspeccionarse en forma individual justo antes del momento en que abandonan el rea de almacenamiento. Las PME que no se distribuyen de inmediato deben almacenarse en un lugar
apropiado segn se describe en los procedimientos escritos. Inmediatamente despus de su preparacin magistral y como
condicin para su liberacin, se debe inspeccionar cada unidad de PME, siempre que sea posible, contra un fondo blanco o
negro iluminado, o ambos, para asegurarse de que no contenga partculas visibles ni otras materias extraas. La inspeccin
previa a la liberacin tambin incluye la inspeccin de la integridad del sistema de envase-cierre y cualquier otro defecto visual
evidente. Las PME que presenten defectos deben desecharse de inmediato o marcarse y aislarse de los productos aceptables de
manera que evite su administracin. Cuando las PME no se distribuyan de inmediato despus de su preparacin, debe realizarse una inspeccin previa a la distribucin para asegurarse de que una PME con defectos como precipitado, turbidez y prdidas,
que pueden desarrollarse entre el momento de su liberacin y su distribucin, no sea liberada.
Controles de Exactitud de la Preparacin Magistral

Deben seguirse los procedimientos por escrito para verificar la exactitud de la preparacin magistral de cada PME durante su
preparacin e inmediatamente antes de su liberacin. El sistema de doble verificacin debe cumplir con las reglamentaciones
estatales e incluir la exactitud de la informacin incluida en la etiqueta y de la adicin de todos los productos farmacuticos o
ingredientes usados para preparar el producto terminado, as como sus volmenes o cantidades. Los envases de los aditivos
usados y, en el caso de aditivos para los que no se consumi la totalidad del envase, las jeringas usadas para medir el aditivo
deben dejarse en cuarentena con los productos finales hasta haber terminado el control del producto final. El personal de preparacin magistral debe confirmar visualmente que los ingredientes medidos en las jeringas coincidan con los indicados en la
receta escrita que se est preparando. Preferentemente, una persona que no sea la que realiz la preparacin magistral debe
verificar que se hayan medido correctamente los volmenes de ingredientes utilizados en la elaboracin de cada PME. Por
ejemplo, el personal de preparacin magistral debera colocar de nuevo el mbolo de la jeringa en el volumen medido.
En aquellos casos en que sea factible, debe confirmarse la exactitud de las mediciones, pesando un volumen del lquido medido y calculando luego ese volumen, dividiendo el peso por el valor exacto de la densidad, o peso especfico, del lquido medido. Debe confirmarse que los valores de densidad o peso especfico programados en los DAP, que miden segn el peso
usando el cociente del volumen programado dividido por la densidad o peso especfico, sean exactos antes y despus de administrar los volmenes de los lquidos asignados a cada canal o puerto. Estos controles de exactitud del volumen y los siguientes controles adicionales de seguridad y exactitud que se describen en esta seccin deben incluirse en el manual de POE de la
institucin responsable de la elaboracin de PME.
Pruebas de Esterilidad
Todas las PME de nivel de riesgo alto que se preparan en grupos de ms de 25 envases individuales monodosis idnticos
(p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administracin a mltiples pacientes o que estn
expuestos por ms de 12 horas a temperaturas entre 2 y 8 y por ms de 6 horas a temperaturas superiores a 8 antes de ser
Captulos
INSPECCIN FSICA
USP 38
esterilizados deben cumplir con la prueba de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad 71) antes de ser dispensadas o administradas. El mtodo de Filtracin por Membrana es el mtodo preferido en los casos en que sea factible (p.ej., cuando los componentes son compatibles con la membrana). Puede usarse un mtodo no descrito en la USP si los resultados de la verificacin
demuestran que la alternativa es al menos tan eficaz y confiable como el mtodo de Filtracin por Membrana USP o el mtodo
de Inoculacin Directa del Medio de Cultivo USP cuando el mtodo de Filtracin por Membrana no es factible.
Cuando las PME de nivel de riesgo alto se dispensan antes de que los resultados de sus pruebas de esterilidad estn disponibles, debe haber un procedimiento escrito que exija la observacin diaria de las muestras de prueba en incubacin y el retiro
inmediato de la PME dispensada cuando exista evidencia de crecimiento microbiano en las muestras de prueba. Adems, el
paciente al que se pudo haber administrado una PME contaminada, y su mdico, deben ser notificados acerca del riesgo potencial. Si los resultados de la prueba de esterilidad son positivos, debe realizarse una investigacin inmediata y sistemtica de
la tcnica asptica, control ambiental y otros controles de garanta de esterilidad para identificar las fuentes de contaminacin
y solucionar los problemas existentes en los mtodos o procesos.
Captulos
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirgenos)

Todas las PME de nivel de riesgo alto, excepto las destinadas a inhalacin o administracin oftlmica, que se preparan en
grupos de ms de 25 envases individuales monodosis idnticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis
(VMD) para administracin a mltiples pacientes o que estn expuestos por ms de 12 horas a temperaturas entre 2 y 8 y
por ms de 6 horas a temperaturas superiores a 8 antes de ser esterilizados deben examinarse para garantizar que no contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 y Prueba de Pirgenos 151). En caso de
que no se indique un lmite de endotoxinas bacterianas en la monografa oficial o en otra fuente de la formulacin de la PME,
aquel no deber exceder la cantidad de Unidades USP de Endotoxinas (Unidades por hora por kg de peso corporal o metros
cuadrado de superficie corporal) especificadas en Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85, mencionada anteriormente, segn la
va de administracin apropiada.
Verificacin de la Identidad y Concentracin de los Ingredientes

La institucin responsable de la elaboracin de preparaciones magistrales debe contar como mnimo con los siguientes procedimientos escritos para verificar la identidad y calidad de las PME antes de dispensarlas y administrarlas:
1. Que las etiquetas de las PME tengan los nombres y cantidades o concentraciones de ingredientes correctos, el volumen
total, la FLU, las vas de administracin apropiadas, las condiciones de almacenamiento y otra informacin para su uso
seguro.
2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean correctas, comparando la receta original con el registro de
preparacin magistral escrito de la PME.
3. Que se han obtenido los volmenes de llenado correctos en las PME y las cantidades correctas de unidades llenadas de las
PME. Cuando no se puede confirmar que el contenido de las PME terminadas es exacto, segn las tres inspecciones que
se describen ms arriba, las PME deben valorarse utilizando mtodos especficos para los ingredientes activos.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LMITE DE USO

Por lo general, las FLU para preparaciones magistrales se asignan basndose en la experiencia profesional, que debera incluir
la cuidadosa interpretacin de las fuentes de informacin apropiadas para las mismas formulaciones u otras formulaciones similares (ver Criterio de Estabilidad y Fechado de Lmite de Uso en Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795). Las
fechas lmite de uso de las PME rara vez se basan en los resultados de valoraciones qumicas especficas a cada preparacin, las
cuales se usan con la ecuacin de Arrhenius para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias y Requisitos Generales)
de productos fabricados. La mayora de las PME son soluciones acuosas en las que la reaccin de degradacin qumica ms
comn es la hidrlisis de los ingredientes disueltos. El grado de hidrlisis y otras reacciones de degradacin catalizadas por
calor en cualquier momento en particular de la vida til de una PME representan la suma termodinmica de las temperaturas y
duraciones de exposicin. Dicha exposicin de la estabilidad de la vida til del producto est representada en el clculo de la
temperatura cintica media (ver Clculos Farmacuticos en la Preparacin Magistral de Prescripciones 1160). Las velocidades de
hidrlisis de los frmacos aumentan en forma exponencial con el aumento aritmtico de la temperatura; en consecuencia, la
exposicin de una solucin de un antibitico beta-lactmico durante un da a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales) tendr un efecto equivalente sobre el grado de hidrlisis de aproximadamente 3 a 5 das a temperaturas fras (ver Advertencias y Requisitos Generales).
El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar las PME debe almacenarlas estrictamente conforme a las condiciones especificadas en la etiqueta de los ingredientes y PME terminadas. Cuando se sabe que las PME han estado expuestas a
temperaturas superiores al lmite declarado o a temperaturas por encima de 40 (ver Advertencias y Requisitos Generales) durante ms de 4 horas, dichas PME deberan desecharse a menos que se verifique su estabilidad a travs de la documentacin apropiada o una valoracin directa.
USP 38
Determinacin de las Fechas Lmite de Uso
Captulos
Las fechas lmite de uso y fecha de caducidad no son lo mismo (ver Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas de caducidad para la estabilidad qumica y fsica de los productos estriles fabricados comercialmente se determinan a partir de los resultados de rigurosas pruebas analticas y de desempeo y son especficas de una formulacin en particular en su envase y a las
condiciones de exposicin indicadas de iluminacin y temperatura. Cuando las PME se desvan de las condiciones indicadas en
el etiquetado aprobado de los productos fabricados contenidos en las PME, el personal de preparacin magistral puede solicitar al fabricante del producto en cuestin asesoramiento sobre la asignacin de FLU basada en parmetros de estabilidad qumica y fsica. Las FLU de las PME que se preparan estrictamente conforme al etiquetado del producto del fabricante deben ser
las especificadas en dicho etiquetado o deben basarse en la literatura apropiada o en pruebas directas. Las FLU para las PME
que carecen de justificacin proveniente de fuentes de literatura apropiadas o de pruebas directas se deben asignar segn se
describe en Criterios de Estabilidad y Fechas Lmite de Uso en Preparacin MagistralPreparaciones No Estriles 795.
El personal de preparacin magistral podr tambin consultar las publicaciones pertinentes para obtener informacin acerca
de la estabilidad, compatibilidad y degradacin del frmaco o de frmacos similares. Al asignar una fecha lmite de uso, el personal de preparacin magistral debera consultar la documentacin y literatura especficas sobre la estabilidad en general y la
del frmaco en particular en aquellos casos en que se cuente con ellas, y debera considerar la naturaleza del frmaco y su
mecanismo de degradacin, el envase en el que est contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la duracin
prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Lmite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales). La
informacin de estabilidad debe interpretarse cuidadosamente en relacin con la formulacin preparada y sus condiciones de
almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en otra evidencia como publicaciones, cuadros, tablas slo permiten obtener
fechas lmite de uso tericas. El fechado de lmite de uso estimado en forma terica est sujeto a diferentes grados de hiptesis
y, en consecuencia, a una probabilidad de error o al menos de inexactitud. El grado de error o inexactitud dependera del
grado de las diferencias entre las caractersticas de la PME (p.ej., composicin, concentracin de ingredientes, volumen de llenado o tipo y material del envase) y las caractersticas de los productos de los que deben extrapolarse los datos o informacin
de estabilidad. Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas lmite de uso estimadas en forma terica, mayor ser la necesidad de determinar el fechado de perodos en forma experimental. Las fechas lmite de uso estimadas en forma terica deberan considerarse con cuidado para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no estriles
que tienen actividad teraputica, especialmente en aquellos casos en que se prev que la preparacin de la PME se realizar en
forma rutinaria. Cuando las PME son para distribucin y administracin en domicilios particulares y no en centros de salud, al
asignar las FLU debe tenerse en cuenta el efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no controladas y no vigiladas. Debe establecerse que las PME no estn expuestas a temperaturas clidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos
que la institucin responsable de la preparacin magistral tenga evidencia que justifique la estabilidad de las PME a esas temperaturas.
Debe reconocerse que la nica evidencia vlida de estabilidad para predecir el fechado de lmite de uso puede obtenerse
solamente a travs de estudios experimentales especficos con cada producto. Los procedimientos semicuantitativos, como
una cromatografa en capa delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No obstante, los ensayos cuantitativos
indicadores de estabilidad, como las valoraciones por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), seran ms apropiados
para ciertas PME, como por ejemplo aquellas con un ndice teraputico reducido, en las que se requiere un monitoreo o valoracin estrictos de las dosis para asegurar su eficacia teraputica y evitar la toxicidad; aquellas en que el perodo de fechado de
lmite de uso estimado en forma terica slo es avalado por evidencia marginal, o en aquellos casos en que no se puede verificar un margen significativo de seguridad para el perodo de fechado de lmite de uso propuesto. En sntesis, debido a que los
perodos de fechado de lmite de uso establecidos a partir de datos especficos de un producto obtenidos mediante anlisis
con instrumental apropiado son sin duda ms confiables que los determinados en forma terica, se recomienda enfticamente
utilizar el primer enfoque para avalar los perodos que superen los 30 das.
Para asegurar prcticas constantes en la determinacin y asignacin de fechas lmite de uso, la instalacin de preparacin
magistral debe contar con normas y procedimientos escritos para la determinacin de las fechas lmite de uso para todos los
productos preparados magistralmente. Cuando se intente predecir una fecha lmite de uso terica, un producto preparado o
mezclado magistralmente debe considerarse como un sistema nico que tiene propiedades fsicas y qumicas y caractersticas
de estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las propiedades antioxidantes, de amortiguacin o antimicrobianas de un vial estril para inyeccin (VEI) pueden perderse al diluirlo y podran afectar seriamente la estabilidad qumica
del ingrediente activo del VEI o la estabilidad fsica o microbiolgica de la formulacin de dicho vial. En consecuencia, por lo
general no puede esperarse que las propiedades estabilizadas en la formulacin del VEI se trasladen al producto preparado o
mezclado magistralmente. Se prefieren los protocolos de evaluacin de datos de estabilidad determinados en forma experimental para cada preparacin, en lugar de la informacin sobre estabilidad publicada.
Cuando se carece de resultados de valoraciones qumicas directas, el personal de preparacin magistral que asigna fechas
lmite de uso a PME debe interpretar y evaluar en forma crtica las fuentes de informacin disponibles ms apropiadas para
determinar una FLU conservadora y segura. El manual de POE de la institucin responsable de la preparacin magistral y los
registros de formulacin de cada PME deben describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la asignacin de
la FLU y las condiciones de almacenamiento.
Cuando se usan viales multidosis (ver Envases Multidosis en Conservacin, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales) de ingredientes estriles fabricados comercialmente en la elaboracin de PME, se inspecciona
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la integridad fsica de los tapones de los VMD y se desinfectan frotndolos con un hisopo empapado en IPA estril al 70%
antes de cada penetracin con un dispositivo estril para retirar el contenido. Cuando se sospechan u observan contaminantes
o propiedades anormales en un VMD, ste deber descartarse. La FLU despus de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 das (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 51), a menos que el fabricante especifique algo distinto.
Sistemas de Bolsas y Viales de Propiedad Exclusiva

Las fechas lmites de uso para la estabilidad, esterilidad y almacenamiento de pares de envases de productos farmacuticos
para administracin intravascular (p.ej., ADD-Vantage, Mini Bag Plus) conectados y activados (activado significa que se produjo el contacto entre el diluyente y el frmaco que estaban separados previamente) se deben aplicar segn lo indica el fabricante. Es decir, se deben seguir las instrucciones del fabricante para manipular y almacenar los productos ADD-Vantage, Mini
Bag Plus, Add A Vial, Add-Ease y cualquier otro.
Captulos
Monitoreo de reas de Almacenamiento Controladas

Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etiqueta, el personal de preparacin magistral debe monitorear las reas de almacenamiento de frmacos dentro de las instalaciones
de preparacin magistral. Las reas de temperatura controlada en las instalaciones de preparacin magistral incluyen temperatura ambiente controlada, entre 20 y 25 con temperatura cintica media de 25; temperatura fra controlada, entre 2 y 8
con temperatura cintica media de 8; temperatura fra, entre 2 y 8; temperatura de congelacin, entre 25 y 10 (ver
Advertencias y Requisitos Generales) si se necesita alcanzar la congelacin, y el intervalo de temperatura especfico del medio
para medios de cultivo microbianos. Un rea de temperatura controlada se debe monitorear al menos una vez al da, documentando los resultados en una bitcora de temperatura. Asimismo, el personal de preparacin magistral debe observar la
temperatura de almacenamiento al colocar el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin de controlar
cualquier desvo en la temperatura. Los dispositivos de registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de
registro continuo calibrado o un termmetro calibrado segn las normas del National Institute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnologa, NIST) que tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propsito al
que est destinado y sea calibrado correctamente a intervalos adecuados. Si la instalacin de preparacin magistral usa un dispositivo continuo de registro de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al da que dicho dispositivo est
funcionando correctamente.
Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en forma adecuada en el rea de almacenamiento de temperatura controlada para que reflejen de forma exacta su temperatura real. Asimismo, la instalacin de preparacin magistral debe
seguir procedimientos apropiados para todas las reas de almacenamiento controlado, para asegurar que dichos espacios no
estn sometidos a fluctuaciones de temperatura significativamente prolongadas como las que podran ocurrir, por ejemplo, al
dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado tiempo.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y

DISTRIBUIDAS
Esta seccin resume las responsabilidades de las instalaciones de preparacin magistral para mantener la calidad y el control
de las PME que se dispensan y administran dentro de sus organizaciones matrices de salud.
El personal de preparacin magistral debe garantizar el adecuado almacenamiento y la seguridad de las PME preparadas o
dispensadas por la instalacin de preparacin magistral hasta que se alcance su FLU o sean administradas a los pacientes. Como parte de esta responsabilidad general, la instalacin de preparacin magistral es responsable del envasado, manipulacin,
transporte y almacenamiento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la enseanza, capacitacin y supervisin apropiadas del personal de preparacin magistral asignado a dichas funciones. La instalacin de preparacin magistral debera colaborar en la enseanza y capacitacin del personal ajeno a la preparacin magistral responsable de llevar a cabo cualquier aspecto de estas funciones.
La instalacin de preparacin magistral tambin tiene la responsabilidad de establecer, mantener y asegurar el cumplimiento
de las polticas y procedimientos escritos relacionados con dichas responsabilidades. Cuando se asigna personal que no es de
preparacin magistral a tareas que involucran cualquiera de estas responsabilidades, las polticas y procedimientos que abarcan
estas tareas deben ser desarrolladas por los supervisores de preparacin magistral. Las actividades de calidad y control relacionadas con la distribucin de las PME se resumen en las cinco subsecciones siguientes. Las actividades o asuntos que debe atender la instalacin de preparacin magistral como parte de dichas responsabilidades son los que se indican a continuacin.
Envasado, Manipulacin y Transporte

Los procesos o tcnicas inapropiados relacionados con el envasado, manipulacin y transporte pueden afectar adversamente
la calidad y la integridad del envase de las PME. Aunque el personal de preparacin magistral realiza en forma rutinaria muchas
de las tareas asociadas con estas funciones, algunas de ellas, como el transporte, manipulacin y almacenamiento, pueden rea-
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Uso y Almacenamiento
La instalacin de preparacin magistral es responsable de asegurar que las PME que se encuentran en el entorno en que se
prestan cuidados al paciente mantengan su calidad hasta el momento de su administracin. El etiquetado inmediato del envase de la PME debe mostrar en forma prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y su fecha de caducidad. El personal de suministro y del entorno de cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar la PME
en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas y no utilizadas deben devolverse a la instalacin de preparacin
magistral para su eliminacin.
Debe contarse con POE para asegurar que las condiciones de almacenamiento en el entorno en que se prestan cuidados al
paciente sean adecuadas para los requisitos especficos de cada PME. Estos procedimientos incluyen la supervisin y documentacin diaria de los refrigeradores de almacenamiento de las preparaciones de frmacos para asegurarse de que mantienen una
temperatura entre 2 y 8 y la inspeccin mensual de todos los lugares de almacenamiento de preparaciones de frmacos por
el personal de preparacin magistral. Las inspecciones deben confirmar el cumplimiento de las condiciones de almacenamiento apropiadas, la separacin de frmacos y alimentos, el uso correcto de VMD y que no se usen productos monodosis como
VMD. Las PME, as como todos los dems productos farmacuticos, deben almacenarse en el rea en donde se prestan cuidados al paciente de tal manera que el personal no autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos.
Preparacin para Administracin

Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del producto, especialmente su esterilidad, al preparar una
PME para su posterior administracin, incluyen el lavado apropiado de las manos, el uso de tcnica asptica, el cuidado del
sitio y el cambio de los equipos de administracin. Tambin pueden ser fundamentales otros procedimientos adicionales para
ciertas PME, dispositivos o tcnicas, por ejemplo, en la filtracin en lnea, la operacin de dispositivos de control de infusin
automticos y la reposicin de PME en los reservorios de bombas de infusin implantables o porttiles. Cuando es probable
que las PME se expongan a temperaturas superiores a 30 por ms de 1 hora durante su administracin a pacientes, se debe
confirmar que mantengan su esterilidad y estabilidad, bien sea por medio de fuentes confiables y relevantes o por pruebas
directas.
Captulos
lizarlas personal ajeno a la preparacin magistral que no se encuentra bajo el control administrativo directo de la instalacin de
preparacin magistral. En estos casos, la instalacin de preparacin magistral deber establecer POE apropiados, en colaboracin con los departamentos o servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas relacionadas con las PME en
las que la instalacin de preparacin magistral tiene un inters directo. Se debe controlar el desempeo del personal ajeno a la
preparacin magistral para asegurarse de que cumpla con las polticas y procedimientos establecidos.
Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y necesarios para asegurar la calidad de la PME y la integridad
del envase se deben tratar por escrito en POE. Por ejemplo, deberan especificarse tcnicas para evitar el empuje de los mbolos de las jeringas o que las puntas de las jeringas se salgan durante su manipulacin y transporte. Adems, debe evitarse la
desconexin de los componentes de un sistema (p.ej., cuando las PME se dispensan con equipos de administracin conectados a estas) hasta la FLU de la PME. Los insertos o rellenos de espuma resultan particularmente tiles cuando las PME deben
transportarse mediante sistemas de tubos neumticos. Independientemente de los mtodos usados, la instalacin de preparacin magistral debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la proteccin utilizada. La evaluacin debera ser continua, por
ejemplo, mediante un sistema de vigilancia, incluyendo un sistema de reporte de problemas a la instalacin de preparacin
magistral.
El transporte y la manipulacin inapropiados pueden afectar adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de
estabilidad nicos. Por ejemplo, la agitacin fsica que puede tener lugar durante el transporte mediante tubo neumtico, o la
exposicin indebida al calor o a la luz, debe tratarse en cada preparacin de forma especfica. Podran ser necesarios modos de
transporte alternativos o medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la calidad de estas PME. El uso de cierres
y sellos que evidencian alteracin intencional en los puertos de las PME puede ser una medida adicional de seguridad para
asegurar la integridad del producto independientemente del mtodo de transporte usado.
Las PME quimiotxicas u otras PME peligrosas requieren salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mnimo el
potencial de exposicin de estos productos al entorno y al personal que podra entrar en contacto con ellos. El transporte por
tubo neumtico no es recomendable debido a posibles roturas y contaminacin. Los requisitos especiales asociados con el envasado, transporte y manipulacin de estos agentes incluyen la prevencin de exposicin o derrame accidentales y la capacitacin del personal en caso de una exposicin o derrame. Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes incluyen las
estrategias de reduccin de la exposicin, como el uso de jeringas con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en
los puertos de los envases, bolsas plsticas selladas, envases resistentes a los impactos y etiquetas con las precauciones pertinentes.
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Redispensacin de PME
La instalacin de preparacin magistral debe tener toda la autoridad de determinar cundo se pueden volver a dispensar las
PME devueltas, sin abrir. Las PME devueltas pueden volverse a dispensar slo cuando el personal responsable de la preparacin
magistral estril pueda garantizar que dichas PME son estriles, puras y estables (contienen la concentracin de ingredientes
declarada). Puede considerarse que una PME brinda dicha garanta si: la PME se mantuvo bajo refrigeracin continua y protegida de la luz, de ser necesario, y no presenta evidencia de alteracin intencional ni de ninguna preparacin para el uso fuera
de la instalacin de preparacin magistral. La asignacin de nuevas fechas de almacenamiento y fechas lmites de uso que excedan las fechas originales para las PME devueltas se permite tan slo cuando existe evidencia de respaldo proveniente de
pruebas de esterilidad y valoracin cuantitativa de los ingredientes. En consecuencia, la preparacin inicial y los tiempos de
descongelacin deben documentarse y realizarse mediciones confiables para evitar y detectar cualquier alteracin intencional.
El cumplimiento con todos los procedimientos asociados con el mantenimiento de la calidad del producto es fundamental. Las
PME no deben volver a dispensarse si no puede asegurarse de manera satisfactoria que se mantuvieron en forma continua la
calidad de la preparacin y la integridad del envase (incluyendo las conexiones de los dispositivos, cuando corresponda) entre
el momento en que la PME egres de la instalacin de preparacin magistral y el momento en que volvi a ella. Asimismo, las
PME no deben volver a dispensarse si la redispensacin no puede respaldarse con la FLU originalmente asignada.
Captulos
Educacin y Capacitacin
La garanta de calidad de la PME y de la integridad del envasado depende en gran medida de que todo el personal cumpla
con los POE pertinentes. El personal de preparacin magistral debe disear, implementar y mantener un programa formal de
enseanza, capacitacin y evaluacin de competencia que cubra todas las funciones y tareas descritas en las secciones anteriores y que incluya a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este programa incluye la evaluacin y documentacin de incumplimientos del procedimiento, errores de administracin, efectos colaterales, reacciones alrgicas y complicaciones asociadas con la dosificacin o administracin, como la extravasacin. Este programa debe coordinarse con los programas de informe de eventos adversos e incidentes de la institucin responsable.
Envase y Transporte de PME

Las siguientes secciones describen cmo mantener la esterilidad y estabilidad de las PME hasta que sean entregadas en los
sitios de atencin del paciente para su administracin.
EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE
Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones en las que se preparan, el personal de preparacin magistral debe seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la integridad fsica, esterilidad y estabilidad de las PME
durante su transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME contra daos, prdidas, contaminacin y degradacin y, al mismo tiempo, que proteja de posibles lesiones al personal a cargo de transportarlas. El manual de POE de la institucin responsable de la preparacin magistral describe especficamente los envases de embalaje y los materiales de aislamiento
y relleno apropiados, segn las especificaciones del producto, la informacin de los proveedores y la experiencia del personal
de preparacin magistral. Se proporcionan instrucciones escritas a los pacientes y otros destinatarios que explican claramente
cmo abrir en forma segura los envases de las PME embaladas.
TRANSPORTE DE PME
Las instituciones responsables de la preparacin magistral que envan PME a otros lugares deben seleccionar modos de
transporte que permitan entregarlas debidamente embaladas sin que sufran daos, y en condiciones estriles y estables a sus
destinatarios.
El personal de preparacin magistral debe verificar que las temperaturas de las PME durante el transporte por el medio seleccionado no excedan las temperaturas ms altas especificadas en el intervalo de temperatura de almacenamiento indicado en
las etiquetas de las PME. Se recomienda que el personal de preparacin magistral se comunique directamente con la empresa
de transporte para conocer la duracin del transporte y las condiciones de exposicin que pueden encontrar las PME.
El personal de preparacin magistral debe incluir instrucciones de manipulacin y exposicin especficas en la parte externa
de los embalajes que contienen las PME que se deben transportar, y debe obtener una garanta razonable de cumplimiento de
dichas condiciones por parte de los transportistas. El personal de preparacin magistral debe evaluar peridicamente el desempeo de las empresas de transporte para verificar que las PME se estn transportando en forma eficiente y apropiada.
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Almacenamiento en Sitios Fuera de las Instalaciones de Preparacin Magistral

Las instituciones responsables de la preparacin magistral que envan PME a pacientes y otros destinatarios que se encuentran en otros lugares deben verificar o garantizar, segn sea apropiado, lo siguiente:
1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en forma claramente legible las FLU, instrucciones de almacenamiento e instrucciones de eliminacin para las unidades vencidas.
2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y
congelador que funcionen adecuadamente si el etiquetado indica que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento.
CAPACITACIN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
Captulos
Debe proporcionarse un programa de capacitacin formal a fin de que el paciente o la persona encargada de su cuidado
pueda entender y cumplir con las numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene en cuanto al almacenamiento,
manipulacin y administracin de PME. Los objetivos instructivos del programa de capacitacin incluyen todas las responsabilidades del cuidado domiciliario de la PME que se espera que asuma el paciente o la persona encargada del cuidado de ste y
deben especificarse en trminos de competencias del paciente o de la persona encargada de su cuidado.
Al terminar el programa de capacitacin, el paciente o la persona encargada de su cuidado debera estar en condiciones de
hacer lo siguiente, en forma correcta y consistente:
1. Describir la terapia en cuestin, incluyendo la enfermedad o trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la
terapia, el resultado teraputico esperado y los efectos colaterales potenciales de la PME.
2. Inspeccionar todos los productos farmacuticos, PME, dispositivos, equipos y materiales en el momento de recibirlos para
asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas durante el transporte y que los artculos recibidos no presentan evidencia de deterioro o defectos.
3. Manipular, almacenar y controlar todos los productos farmacuticos, PME y materiales y equipos relacionados en la casa,
incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con ellos.
4. Inspeccionar visualmente todos los productos farmacuticos, PME, dispositivos y otros elementos que el paciente o la persona encargada de su cuidado debe utilizar inmediatamente antes de la administracin, en una forma que garantice que
todos los elementos estn en condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben estar libres de prdidas, grietas en
los envases, partculas, precipitado, turbidez, decoloracin u otras desviaciones respecto de su aspecto normal esperado y
los envases inmediatos de los dispositivos estriles deben estar completamente sellados sin que haya evidencia de deterioro de la integridad del envase.
5. Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administracin para asegurar que se trate del medicamento, la dosis, el
paciente y el momento de administracin correctos.
6. Limpiar el rea de preparacin en el domicilio, lavar y refregar las manos, usar la tcnica asptica apropiada y manipular
todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y materiales usados para la administracin.
7. Emplear todas las tcnicas y precauciones asociadas con la administracin de PME, por ejemplo, preparacin de materiales y equipos, manipulacin de dispositivos, preparacin de las tuberas e interrupcin de una infusin.
8. Cuidar los catteres, cambiar vendajes y mantener la patencia del sitio segn lo indicado.
9. Monitorear y detectar las ocurrencias de complicaciones teraputicas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio electroltico y mala colocacin del catter.
10. Responder de inmediato a situaciones de emergencia o crticas, como rotura o salida de su lugar del catter, desconexin
de una tubera, formacin de cogulos, bloqueo del flujo y mal funcionamiento de equipos.
11. Saber cundo y cmo recurrir a servicios de emergencia profesional o asesoramiento profesional.
12. Manipular, contener y eliminar el material desechado, como agujas, jeringas, dispositivos, derrames o residuos que constituyan un riesgo biolgico y sustancias infecciosas.
Los programas de capacitacin deben incluir demostraciones prcticas y la prctica con elementos reales que el paciente o la
persona encargada de su cuidado debern utilizar, como envases de PME, dispositivos y equipos. El paciente o la persona encargada de su cuidado debe practicar las tcnicas aspticas y de inyeccin bajo la observacin directa del profesional de la
salud.
La instalacin de preparacin magistral, junto con el personal de enfermera o mdico, es responsable de asegurar inicialmente y en forma continua que el paciente o la persona encargada de su cuidado comprenda, domine y est en condiciones y
dispuesto a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas con el cuidado domiciliario. Esto se logra a travs de un
programa de evaluacin formal por escrito. Todas las competencias especificadas en el programa de capacitacin del paciente
o la persona encargada de su cuidado deben evaluarse de manera formal. El paciente o la persona encargada de su cuidado
debe demostrar al personal pertinente del cuidado de la salud su dominio de las actividades asignadas antes de que se le permita administrar la PME sin la supervisin de un profesional de la salud.
El material impreso, como listas de control o instrucciones proporcionadas durante la capacitacin, pueden servir como refuerzo del aprendizaje despus de la capacitacin o como recordatorio de las responsabilidades especficas del paciente o la
persona encargada de su cuidado. Tambin puede utilizarse peridicamente el asesoramiento oral despus de la capacitacin,
segn sea apropiado, para reforzar la capacitacin y asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabilidades.
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MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS

Las instituciones responsables de la preparacin magistral deben monitorear clnicamente a los pacientes tratados con PME
segn las reglamentaciones y guas establecidas por las juntas reguladoras del ejercicio de la medicina de su respectivo estado
o las normas de prctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparacin magistral deben proporcionar a los pacientes y otros destinatarios de PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e informar cualquier inquietud que
pudieran tener en relacin con las PME y sus dispositivos de administracin.
Los manuales de POE de la institucin responsable de la preparacin magistral deben describir las instrucciones especficas
para recibir, acusar recibo y fechar los informes recibidos, y para registrar, o archivar, y evaluar los informes de eventos adversos y de la calidad de la preparacin asociada con las PME. Los informes de eventos adversos con PME deben ser analizados de
inmediato y a fondo por los supervisores de preparacin magistral para tomar medidas correctivas y evitar que se vuelvan a
repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparacin magistral que participe en los programas de informe de eventos
adversos y defectos de productos de la FDA y la USP.
Captulos
PROGRAMA DE GARANTA DE CALIDAD

Un proveedor de PME debe implementar un programa formal de garanta de calidad destinado a ofrecer un mecanismo para monitorear, evaluar, corregir y mejorar las actividades y procesos descritos en este captulo. El nfasis del programa de garanta de calidad debe centrarse en mantener y mejorar la calidad de los sistemas y la provisin de cuidados al paciente. Adems, el programa de garanta de calidad asegura que cualquier plan enfocado a corregir los problemas identificados incluya
tambin el seguimiento apropiado para garantizar que se tomaron las acciones correctivas eficaces.13
Un plan de garanta de calidad debe incluir las siguientes caractersticas:
1. Formalizacin por escrito;
2. Consideracin de todos los aspectos de las preparaciones y dispensacin de los productos segn se describe en este captulo, incluyendo las pruebas ambientales y los resultados de la verificacin;
3. Descripcin de las actividades especficas de monitoreo y evaluacin;
4. Especificacin de cmo se deben informar y evaluar los resultados;
5. Identificacin de los mecanismos de seguimiento apropiados cuando se exceden los lmites o umbrales de accin; y
6. Descripcin de las personas responsables de cada aspecto del programa de garanta de calidad.
Al desarrollar un plan especfico, debe ponerse nfasis en establecer indicadores objetivos y mensurables para las actividades
de monitoreo y los procesos considerados de alto riesgo, de volumen elevado o propensos a problemas. En general, la seleccin de indicadores y la eficacia del programa de garanta de calidad deben reevaluarse anualmente.
ABREVIATURAS Y ACRNIMOS
ADP
rea directa de preparacin magistral
IPA
alcohol isoproplico
ALARA
tan bajo como sea razonablemente posible
ASHRAE
American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers
CACI
aislador asptico de contencin para preparacin magistral
CAI
aislador asptico para preparacin magistral
CAPH
cambios de aire por hora
CDC
Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades
CETA
Controlled Environment Testing Association
CFL
cabina de flujo laminar
CIP
control de ingeniera primario
CSB
cabina de seguridad biolgica
CSTD
dispositivo de sistema cerrado para transferencia de

vial
HVAC
calefaccin, ventilacin y aire acondicionado
DAP
dispositivo automatizado de preparacin magistral
EPP
equipo protector para el personal
FDA
Food and Drug Administration (Administracin de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos)
FLU
fecha lmite de uso
HEPA
alta eficiencia para partculas areas
HICPAC
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee
13 El uso de recursos adicionales, tales como el Accreditation Manual for Home Care de la Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, pueden
resultar tiles en el desarrollo de un plan de garanta de calidad.
USP 38
IB
indicador biolgico
ISO
International Organization for Standardization (Organizacin Internacional para la Normalizacin)
MMWR
Morbidity and Mortality Weekly Report
NIOSH
Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional
NIST
National Institute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnologa)
PME
preparacin magistral estril
psi
libras por pulgada cuadrada
QA
garanta de calidad
POE
procedimiento operativo estndar
PET
tomografa por emisin de positrones
TSA
agar tripticasa de soja
UE
Unidad de Endotoxina
ufc
unidad(es) formadora(s) de colonias
USP
Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (United States Pharmacopeia)
VDE
vial para desafo de endotoxinas
VEI
vial estril para inyeccin
VMD
viales multidosis
APNDICES
apndice tabular resume y condensa selectivamente el texto completo del captulo 797 slo para referencia rpida. El personal de preparacin magistral es responsable de leer, comprender y cumplir con el texto completo y toda la terminologa, contenido y condiciones oficiales de la
USP.
NOTAEste
INTRODUCCIN
El propsito del captulo consiste en evitar daos y muerte a pacientes tratados con PME.
El captulo se refiere a la preparacin, el almacenamiento y el transporte de PME, mas no a su administracin.
Personal e instituciones a las cuales se aplica el 797; por lo tanto, para quin y para las cules puede ser ejecutable por las autoridades reglamentarias y de acreditacin.
Los tipos de preparaciones diseadas como PME segn sus formas fsicas y los sitios y rutas de administracin a los pacientes.
El personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar la contaminacin por contacto de las PME,
tanto dentro como fuera de las reas ISO Clase 5.
ORGANIZACIN
Todo el personal que participa en la elaboracin de PME tiene la responsabilidad de comprender las prcticas y precauciones fundamentales que se
encuentran en el captulo 797 de la USP, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos procedimientos y la calidad de la PME final para evitar daos.
DEFINICIONES
Se definen veintiocho trminos que forman parte integral del cumplimiento con el captulo 797 de la USP.
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIN MAGISTRAL
Las prcticas y garantas de calidad requeridas para preparar, almacenar y transportar PME que son estriles y aceptablemente precisas, puras y estables.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIN MICROBIANA EN LAS PME
La capacitacin apropiada y la evaluacin del personal, la limpieza y vestimenta adecuada del personal, la limpieza y desinfeccin adecuada de los
ambientes de trabajo de preparacin magistral y el mantenimiento y monitoreo apropiados de las instalaciones de ambiente controlado (todas las
cuales se detallan en sus respectivas secciones).
PME de Nivel de Riesgo Bajo
Manipulaciones aspticas dentro de un ambiente ISO Clase 5 usando tres, o menos de tres, productos estriles y entradas en cualquier envase.
En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no ms de 48 horas a temperatura ambiente controlada, 14 das a temperatura fra y 45 das en
estado congelado slido entre 25 y 10 o ms fro.
Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos
Cumplir totalmente con los cuatro criterios especficos.
Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP ISO Clase 5.
Los lavabos deben estar separados del rea inmediata del CIP ISO Clase 5.
Captulos
Apndice I.
Competencias Principales, Condiciones, Prcticas y Garantas de Calidad que se requieren ( deben) y se recomiendan ( debieran) en el Captulo 797 de la USP
USP 38
Apndice I. (Continuacin)
PME de Nivel de Riesgo Mediano
Manipulaciones aspticas dentro de un ambiente ISO Clase 5, usando mezclado y transferencia prolongados y complejos, ms de tres productos
estriles y entradas dentro de cualquier envase, y combinacin de ingredientes de mltiples productos estriles para preparar mltiples PME.
Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
PME de Nivel de Riesgo Alto
Presencia confirmada de ingredientes y dispositivos no estriles, o exposicin confirmada o sospechada de ingredientes estriles por ms de una
hora a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 antes de la esterilizacin final.
Mtodo de esterilizacin verificado para conseguir la esterilidad para la cantidad y tipo de envases.
Cumplir los lmites permisibles para endotoxinas bacterianas.
Mantener la concentracin y pureza aceptables de los ingredientes y la integridad de los envases involucrados despus de la esterilizacin.
Prueba de llenado de medios al menos semestralmente, hecha por el personal de preparacin magistral.
CAPACITACIN Y EVALUACIN DEL PERSONAL EN TCNICAS DE MANIPULACIN ASPTICA
Captulos
Inicialmente, aprobar la evaluacin didctica y prctica de destrezas y llenado de medios, seguida por una evaluacin anual para preparacin magistral de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestral para preparacin magistral de nivel de riesgo alto.
El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonizacin
microbiana profusa, deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una nueva evaluacin a cargo de personal experto en preparacin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de prctica asptica.
PME DE USO INMEDIATO
Cumplir totalmente con los seis criterios especificados.
ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS
Fecha lmite de uso de 28 das, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases multidosis de cierre sellado, despus de la apertura o
entrada inicial.
Fecha lmite de uso de 6 horas, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases monodosis de cierre sellado en aire ISO Clase 5 o
ms limpio, despus de la apertura o entrada inicial.
Fecha lmite de uso de 1 hora para envases monodosis de cierre sellado despus de su apertura o entrada bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase
5.
No se permite el almacenamiento de ampollas monodosis abiertas.
FRMACOS PELIGROSOS COMO PME
Equipo protector apropiado para el personal.
Los controles de ingeniera primarios apropiados (CSB y CACI) se usan para la proteccin simultnea del personal y la exposicin de sitios crticos.
Los frmacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminacin y la exposicin del personal.
Presin negativa al menos de 0,01 pulgadas de columna de agua y 12 cambios de aire por hora en cuartos no limpios en donde se ubiquen los
CACI.
Los frmacos peligrosos se deben manejar con precaucin en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepcin,
distribucin, aprovisionamiento, inventariado, preparacin para administracin y eliminacin.
Los frmacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5, con controles de ingeniera protectores y siguiendo las prcticas aspticas
especificadas para los niveles de riesgo de contaminacin apropiados.
El acceso a reas de elaboracin de preparaciones de frmacos debe estar limitado al personal autorizado.
Se debe instalar un indicador de presin que pueda monitorear fcilmente la presurizacin del cuarto, que se documenta diariamente.
Documentacin anual para la capacitacin completa del personal en lo que respecta a almacenamiento, manipulacin y eliminacin de frmacos
peligrosos.
Si se usa un CSTD, ste se emplear en un dispositivo de control de ingeniera primario ISO Clase 5.
Se requiere presin negativa de al menos 0,01 pulgadas de columna de agua para la preparacin magistral de frmacos peligrosos.
La zona amortiguadora de presin negativa no se requiere para preparaciones magistrales de bajo volumen cuando se usa un CSTD en una CSB o
un CACI.
El personal de preparacin magistral que est en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los frmacos
peligrosos.
La eliminacin de todos los desechos de frmacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales.
Salida externa total de los controles de ingeniera primarios.
Ensayo de muestras de frotacin de superficies cada 6 meses.
PREPARADOS RADIOFARMACUTICOS COMO PME
Tomografa de Emisin de Positrones se rige por el captulo 823 de la USP.
USP 38
Controles de ingeniera primarios apropiados y contencin y blindaje de radioactividad.
Los preparados radiofarmacuticos elaborados a partir de componentes estriles en recipientes estriles cerrados y con un volumen de 100 mL o
menos para inyeccin monodosis, o no ms de 30 mL tomados de envases multidosis se deben nombrar segn las normas para PME de nivel de
riesgo bajo y cumplir con ellos.
Los viales de preparados radiofarmacuticos destinados a mltiples usos, preparados con tecnecio 99m, expuestos a ambiente ISO Clase 5 y perforados por agujas, sin contaminacin directa, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante.
Ubicacin de controles de ingeniera primarios permitidos en un ambiente controlado ISO Clase 8.
Generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 usados de acuerdo con los requisitos federales, estatales y del fabricante.
Los preparados radiofarmacuticos como PME de nivel de riesgo bajo, con fecha lmite de uso de 12 horas o menos se deben preparar en un rea
segregada.
Los materiales y la vestimenta expuestos en el rea de atencin y tratamiento del paciente no deben cruzar una lnea de demarcacin dentro del
rea de preparacin magistral segregada.
Los generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 se deben eluir en condiciones ISO Clase 8.
El rea de preparacin magistral segregada se indicar con una lnea de demarcacin.
El almacenamiento y transporte de los viales debidamente blindados de PME radiofarmacuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado
sin una designacin especfica de clase ISO.
EXTRACTOS DE ALRGENOS COMO PME
VERIFICACIN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIN MAGISTRAL

Revisar etiquetas y documentar las mediciones, manipulaciones aspticas y procedimientos de esterilizacin correctos para confirmar la identidad,
pureza, concentracin de ingredientes y esterilidad de la PME.
Valorar las PME terminadas para confirmar la identidad correcta y/o concentracin de ingredientes.
Prueba de esterilidad para PME terminadas.
Mtodos de Esterilizacin
Verificar que los mtodos permiten lograr la esterilidad a la vez que mantienen el contenido, pureza, calidad e integridad del envase apropiados.
Probar la eficacia segn el captulo 71 de la USP, o mediante pruebas de esterilidad equivalentes o superiores.
Esterilizacin de PME de Nivel de Riesgo Alto por Filtracin
Membranas estriles de tamao nominal de poro de 0,2 mm que sean qumica y fsicamente compatibles con la PME.
Completar rpidamente sin reemplazar el filtro.
Someter el filtro a la prueba de integridad recomendada por el fabricante (p.ej., prueba del punto de burbuja) despus de filtrar la PME.
Esterilizacin de PME de Nivel de Riesgo Alto por Vapor
Probar hasta verificar que todos los envases que se van a esterilizar queden estriles despus del tiempo de exposicin seleccionado en el autoclave
particular.
Garantizar que el vapor vivo entre en contacto con todos los ingredientes y superficies que se van a esterilizar.
Pasar las soluciones a travs de un filtro de tamao nominal de poro de 1,2 mm o menor a los envases finales para retirar las partculas antes de la
esterilizacin.
El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a travs de la cmara, por medio de un ventilador.
El calor seco se debe usar slo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daa el material o ste es impermeable.
Se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulacin del aire caliente.
La descripcin de las condiciones y duracin de la esterilizacin por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institucin
responsable de la preparacin magistral. La eficacia de la esterilizacin por calor seco se debe verificar usando los indicadores biolgicos apropiados y
otros mtodos de confirmacin.
El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposicin.
Despirogenizacin por Calor Seco
La despirogenizacin por calor seco se debe usar para eliminar los pirgenos y los microbios viables de los artculos o envases de vidrio, como viales.
La descripcin del ciclo de despirogenizacin por calor seco y su duracin para una carga especfica de artculos debe estar documentada por escrito
en la institucin responsable de la preparacin magistral.
La eficacia del ciclo de despirogenizacin por calor seco se debe verificar usando viales para desafo de endotoxinas (VDE).
La prueba de endotoxinas bacterianas debe efectuarse en los VDE con el fin de verificar si el ciclo es capaz de conseguir una reduccin de 3 log en
endotoxinas.
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL
Exposicin de Sitios Crticos
Aire ISO Clase 5 o mejor.
Evitar la contaminacin por contacto directo (p.ej., tacto y secreciones).
Captulos
Los extractos de alrgenos como PME no estn sujetos a los requisitos descritos para personal, ambiente y almacenamiento de PME de todos los
Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana cuando se cumplen ciertos criterios.
USP 38
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas
Una zona amortiguadora es un rea provista con aire de calidad ISO Clase 7 como mnimo.
Nuevas representaciones de la distribucin de la instalacin.
Toda instalacin de preparacin magistral debe garantizar que cada fuente de ambiente ISO Clase 5 para exposicin de sitios crticos y esterilizacin
por filtracin est adecuadamente ubicada, manejada, mantenida, supervisada y verificada.
Los dispositivos (p.ej., computadoras e impresoras) y objetos (p.ej., carros y gabinetes) se pueden ubicar en zonas amortiguadoras y deben verificarse mediante pruebas o monitoreo.
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partculas Viables y No Viables
El muestreo ambiental se debe realizar como parte de un programa integral de gestin de la calidad y deber ocurrir como mnimo cuando existan
varias condiciones.
El programa de muestreo ambiental debe proporcionar informacin al personal y directivos para demostrar que los controles de ingeniera mantienen un ambiente dentro del rea de preparacin magistral que garantiza en forma constante concentraciones de partculas viables y no viables aceptablemente bajas.
Programa de Pruebas para Partculas Ambientales No Viables
Captulos
La certificacin y pruebas de los controles de ingeniera primarios (CFL, CSB, CAI y CACI) y secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) las debe
efectuar una persona calificada por lo menos cada seis meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique, altere o se haga una reparacin
importante a la instalacin. Se deben usar los procedimientos de certificacin, como aquellos sealados en Certification Guide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006) de CETA.
Recuento Total de Partculas
La certificacin por medio de la cual se certifica que cada rea con clasificacin ISO, (p.ej., ISO Clase 5, 6, 7 y 8) est dentro de las normas establecidas, se debe hacer por lo menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAI o el CACI se reubiquen o la estructura fsica de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren.
Las pruebas las deben efectuar operadores calificados, usando equipo electrnico de ltima tecnologa con resultados que cumplan con ISO Clase 5,
7 u 8, dependiendo de los requisitos de la zona.
El personal de supervisin y otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificacin para garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, presiones del cuarto y CAPH apropiados.
Monitoreo de la Presin Diferencial
Se debe instalar un manmetro o velocmetro para supervisar el diferencial de presin o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y
entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparacin magistral.
Los resultados debern revisarse y documentarse en un cuaderno de bitcora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mnima debe ser
diaria) o en un dispositivo de grabacin continua.
La presin entre el rea ISO Clase 7 y la zona general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua (w.c.)).
En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mnima de 0,2
metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.
Programa de Pruebas para Partculas Areas Ambientales ViablesPlan de Muestreo
Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partculas areas viables, basado en la evaluacin de riesgo de las actividades
de preparacin magistral efectuadas.
Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 y en las zonas ISO Clase 7 y 8, as como en las zonas
segregadas de preparacin magistral con ms alto riesgo de contaminacin (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5, mostradores
cerca de las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)).
El plan debe incluir: ubicacin de la muestra, mtodo de recoleccin, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del da, relativa a
la actividad de la zona de preparacin magistral, y niveles de accin.
Se recomienda que el personal de preparacin magistral consulte el Captulo Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116 de la USP y las Guidelines for Environmental Infection Control in Healthcare Facilities-2003 de los CDC para ms informacin.
Medio de Crecimiento
Se debe utilizar un medio de crecimiento microbiano como el Medio de Digerido de Casena y Soja (tambin conocido como caldo (TSB) o agar
(TSA) tripticasa de soja) para propiciar el crecimiento de bacterias.
En los ambientes de preparacin magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta (MEA) u otro medio que facilite el
crecimiento de hongos.
Los medios usados para el muestreo de superficies deben suplementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej.,
TSA con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partculas Areas Viables
La evaluacin de microorganismos areos usando mtodos volumtricos de recoleccin en los ambientes de aire controlado debe efectuarla personal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
El mtodo de impacto debe ser el mtodo preferido de muestreo volumtrico de aire.
Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contaminacin durante actividades de preparacin magistral y otras actividades como preparacin, etiquetado, vestimenta y limpieza.
Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la cabina de flujo laminar y otras reas en donde la turbulencia de reflujo de aire pueda ingresar en el rea de preparacin magistral.
USP 38
Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, el muestreo de aire se debe hacer en sitios dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras
reas que estn muy cerca del ambiente ISO Clase 5, durante la certificacin del control de ingeniera primario.
Debe considerarse el efecto general que el mtodo de muestreo escogido tendr sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de
preparacin magistral.
Dispositivos de Muestreo de Aire
Se deben seguir las instrucciones en el manual de usuario del fabricante en lo que respecta a la verificacin y uso de muestreadores elctricos de aire
que recolectan activamente volmenes de aire para evaluacin.
Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar de muestreo, con el fin de maximizar la sensibilidad.
Se recomienda que el personal de preparacin magistral consulte tambin el Captulo USP 1116 que puede proporcionar ms informacin sobre el
uso de muestreadores volumtricos de aire y el volumen de aire que debe tomarse para detectar variaciones en la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire
Como parte de la recertificacin de instalaciones y equipos, se debe efectuar el muestreo del aire al menos dos veces al ao (es decir, cada 6 meses)
en el rea donde estn ubicados los controles de ingeniera primarios.
Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrnico para muestreo de aire.
Cualquier construccin o reparacin de equipo en una instalacin puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Perodo de Incubacin
Las placas de medio para crecimiento microbiano usadas para recolectar muestreos ambientales se recuperan, se aseguran las tapas (p.ej., con cinta), se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos.
El TSA se debe incubar a una temperatura de 35 2 durante un perodo de 2 a 3 das.

MEA u otro medio apto para hongos se debe incubar a 28 2 durante 5 a 7 das.
Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparacin
magistral.
Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiologa.
Se debe investigar la fuente de la contaminacin.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin debe dar lugar a una reevaluacin de la idoneidad de las prcticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtracin de aire dentro de la instalacin de preparacin magistral asptica.
La tabla titulada Niveles de Accin Recomendados para Contaminacin Microbiana se debe usar slo como gua.
Diseo de la Instalacin y Controles Ambientales
Las instalaciones de preparacin magistral estn fsicamente diseadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contaminacin area con los sitios crticos.
Las instalaciones de preparacin magistral deben proporcionar un ambiente de trabajo cmodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20 o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparacin magistral mientras est ataviado con la vestimenta requerida para la preparacin magistral asptica.
Los controles de ingeniera primarios proporcionan aire HEPA unidireccional (es decir, laminar) a una velocidad suficiente para prevenir el contacto
de partculas areas con los sitios crticos.
En el rea crtica se debe realizar un anlisis del patrn de aire in situ por medio de estudios de humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y
la accin de barrido sobre el producto bajo condiciones dinmicas.
Las polticas y procedimientos para mantener y trabajar dentro del rea de control de ingeniera primario se deben poner por escrito y cumplir. Las
polticas y procedimientos estarn determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparacin magistral asptica utilizadas durante la preparacin de las PME.
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de preparacin magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas.
Los cuartos limpios para PME no peligrosas y no radioactivas se suministran con HEPA que entra desde el cielo raso, con ventilaciones de retorno en
la parte baja de las paredes, y proporciona no menos de 30 cambios de aire por hora.
Las zonas amortiguadoras mantienen una presin positiva de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua y no contienen lavabos ni drenajes.
La velocidad de aire de las zonas o cuartos amortiguadores a las antesalas es al menos 40 pies/minuto.
El control de ingeniera primario debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora, de tal manera que se eviten condiciones que podran afectar adversamente su funcionamiento.
El control de ingeniera primario debe ubicarse fuera del flujo de trfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no
causen perturbaciones.
El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso.
Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamao de partcula ms penetrante y someterlos a pruebas contra fugas en la fbrica,
y nuevamente in situ despus de la instalacin.
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente controlado.
Captulos
Se debe contar e informar el nmero de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de
monitoreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
USP 38
Al cuarto slo se deben llevar los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para las actividades de preparacin magistral que se
van a desempear.
Las superficies y el amoblado esencial en los cuartos o zonas amortiguadoras y en los cuartos limpios deben ser lisos, impermeables, limpiables,
resistentes a desinfectantes y no ser porosos ni desprender partculas.
Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas o rajaduras, y no deben desprender partculas para facilitar su limpieza y reducir al mnimo los espacios en los que podran acumularse microorganismos y otros contaminantes.
Las superficies deben ser resistentes a los daos causados por agentes desinfectantes.
Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formacin de grietas donde pueda acumularse
polvo.
Los paneles del cielo raso se deben enmasillar en todo su permetro para sellarlas al armazn de soporte.
La superficie externa de los artefactos de iluminacin embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso.
Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado.
La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con
materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plstico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fcilmente.
Captulos
Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plstico no poroso o planchas metlicas, con ruedas de buena calidad y fciles de limpiar para
facilitar su movilidad.
Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fciles de limpiar y desinfectar y, adems deben estar libres de grietas y no desprender partculas.
La cantidad, el diseo y la forma de instalacin de los artculos antes mencionados debe facilitar la limpieza y desinfeccin eficaces.
Si los cielos rasos tienen paneles incrustados, stos deben impregnarse con un polmero para hacerlos impermeables e hidrfobos.
Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberas de servicio que pasan por el techo o las repisas de las ventanas.
Los retornos de aire deben estar instalados en la parte inferior de la pared para crear una dilucin general de arriba hacia abajo del aire ambiental
con el aire filtrado por HEPA.
Colocacin de los Controles de Ingeniera Primario dentro de Zonas Amortiguadoras ISO Clase 7
Los controles de ingeniera primarios para PME no peligrosas y no radiactivas se colocan en las zonas amortiguadoras, excepto en el caso de CAI que
prueben mantener aire ISO Clase 5 cuando los recuentos de partculas se hacen entre 6 y 12 pulgadas ms arriba de las reas de exposicin del sitio
crtico durante la realizacin de la transferencia normal de materiales hacia adentro y afuera, y durante manipulaciones de preparacin magistral,
cuando dichos CAI se ubican bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 7.
Los procedimientos de preesterilizacin para las PME de alto riesgo, como el pesado y mezclado, se deben completar en un ambiente no inferior a
ISO Clase 8.
Los controles de ingeniera primarios deben ubicarse fuera de las vas de trfico y lejos de corrientes de aire que pudieran perturbar los patrones de
flujo de aire deseados del cuarto.
Cuando se usen aisladores para la preparacin magistral estril, el tiempo de recuperacin para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 se debe documentar y desarrollar los procedimientos internos para garantizar que se permita el tiempo de recuperacin adecuado despus de la transferencia de
materiales, antes y durante las operaciones de preparacin magistral.
Cuando las actividades de preparacin magistral requieran la manipulacin de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales biolgicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipos usados en las actividades de preparacin de PME y deben controlarse por medio de POE especficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas.
Alimentos, bebidas y artculos expuestos en las zonas de atencin de paciente, as como desempacar suministros a granel y actividades de aseo y
vestimenta del personal estn prohibidos en los cuartos o zonas amortiguadores.
Designacin de demarcacin entre cuartos o zonas amortiguadoras y antesalas.
Limpieza antisptica de manos y guantes estriles en los cuartos o zonas amortiguadoras.
Los suministros y componentes empacados para preparacin magistral, como agujas, jeringas, conjuntos de tubos y soluciones parenterales de pequeo y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estril al 70%) de ser posible en una
antesala de calidad de aire ISO Clase 8, antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras.
Limpieza y Desinfeccin del rea de Preparacin Magistral Estril
El personal capacitado escribe los procedimientos detallados que incluyen limpiadores, desinfectantes y materiales para refregar y trapear que no
desprenden partculas.
Las superficies de la CFL, la CSB, el CAI y el CACI se deben limpiar y desinfectar con frecuencia, incluyendo: al comenzar cada turno de trabajo, antes
de la preparacin de cada lote, cada 30 minutos durante los perodos continuos de preparacin de PME individuales, cuando haya derramamientos y
cuando se sepa o sospeche que la superficie est contaminada debido a fallas procedimentales.
El personal de preparacin magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en prctica los procedimientos de limpieza y
desinfeccin del rea directa de preparacin (ADP) escritos en los POE.
La limpieza y desinfeccin deben hacerse antes de la preparacin magistral. Se deben quitar todos los artculos de las reas a limpiar y a continuacin limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos slidos solubles en agua se quitan
con Agua Estril (para Inyeccin o Irrigacin) y paos que no desprendan partculas. Luego se pasa un pao con un agente desinfectante que no deje
residuos, como IPA estril al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparacin magistral.
USP 38
Las superficies de trabajo en zonas ISO Clase 7 y 8 y en las zonas de preparacin magistral segregadas se limpian al menos una vez al da.
El polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparacin magistral,
con un mtodo que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8.
Los pisos en las reas ISO Clase 7 y 8 se limpian diariamente cuando no hay preparacin magistral en proceso.
El IPA (alcohol isoproplico al 70%) permanece en las superficies que se van a desinfectar al menos durante 30 segundos antes de que se usen para
elaborar PME.
Los estantes vacos, las paredes y los cielos rasos en las antesalas se limpian y desinfectan al menos una vez al mes.
La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escritos.
Los agentes limpiadores y desinfectantes, sus cronogramas de uso y mtodos de aplicacin deben concordar con los POE escritos y el personal de
apoyo y/o el de preparacin magistral debe cumplirlos.
Todos los materiales de limpieza, como paos, esponjas y trapeadores deben ser del tipo que no desprenda partculas, de preferencia compuestos
por microfibras sintticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras, antesalas y reas segregadas de preparacin magistral, de las cuales no
deben retirarse a menos que sea para desecharlos.
Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basndose en las recomendaciones del fabricante) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y que el uso repetido no incrementa la biocarga del rea que se est limpiando.
Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estril al 70%), aplicado con un frasco rociador u otro mtodo de aplicacin adecuado.
Las compresas de gasa empapadas en IPA estril al 70% u otro material que desprenda partculas no se deben usar para desinfectar los puntos de
entrada estriles de paquetes y dispositivos.
Limpieza y Vestimenta del Personal
El personal debe ser tambin competente y estar muy motivado para desempear manipulaciones aspticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME.
El personal con prurito, quemaduras de sol, lceras exudantes, conjuntivitis, infeccin respiratoria activa y cosmticos tiene prohibido preparar PME.
El personal de preparacin magistral debe retirarse los atuendos personales exteriores, cosmticos, uas postizas, joyas de las manos, muecas y
cuerpo que puedan interferir con el uso de batas y guantes; tambin debe retirarse los pirsins visibles por encima del cuello.
Orden para asearse y vestir atuendo de preparacin magistral en la antesala: zapatos y cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran la barba, mscaras, limpieza de uas, lavado y secado de manos y antebrazos, bata que no desprende partculas.
Orden para asearse y calzarse los guantes en el cuarto o zona amortiguadora: lavado de manos con un producto de actividad persistente a base de
alcohol, dejar secar las manos, calzar guantes estriles.
Desinfectar rutinariamente los guantes con IPA estril al 70% despus de tocar objetos no estriles.
Inspeccionar los guantes para determinar que no estn agujereados y reemplazarlos cuando se detecten fallas.
El personal repite los procedimientos apropiados despus de exponerse a contaminacin por contacto directo o aire inferior a ISO Clase 8.
De estos requisitos estn eximidos las PME de uso inmediato y los CAI para los cuales los fabricantes proporcionan documentacin escrita, basada en
pruebas validadas, de que dichas prcticas no son necesarias para mantener la esterilidad en las PME.
Capacitacin del Personal y Evaluacin de la Competencia en Vestimenta, Prcticas Aspticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin
El personal encargado de la preparacin de las PME deber recibir capacitacin competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda
de instruccin multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios tericos y los conocimientos prcticos de los procedimientos de vestimenta, prcticas aspticas de trabajo, as como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 y procedimientos de limpieza y desinfeccin.
Esta capacitacin se debe completar y documentar antes de que ningn miembro del personal comience a elaborar PME.
El personal de preparacin magistral debe completar la capacitacin didctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a evaluaciones de destreza usando herramientas de auditora de observacin y pruebas de llenado de medios.
Las pruebas de las destrezas aspticas de trabajo mediante el llenado de medios se efectan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y al
menos anualmente, en adelante, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales
de nivel de riesgo alto.
El personal de preparacin magistral que no pase las pruebas escritas o las auditoras de observacin o cuyos viales de prueba de llenado de medios
tengan una o ms unidades que muestren contaminacin microbiana visible deber recibir de inmediato una nueva capacitacin y someterse a una
nueva evaluacin a cargo de personal experto en preparacin magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en prcticas
aspticas de trabajo.
El personal de preparacin magistral debe pasar todas las evaluaciones antes de reiniciar la prctica de preparacin magistral estril.
Adems de la evaluacin didctica y llenado asptico de medios, el personal de preparacin magistral debe demostrar competencia en higiene apropiada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza congruentes.
Cuando los procedimientos de limpieza y desinfeccin los efecta personal de apoyo, ste debe recibir de un experto calificado en preparacin
magistral asptica, capacitacin cuidadosa en procedimientos apropiados de higiene de las manos, vestimenta, limpieza y desinfeccin.
Captulos
Despus de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, se debe dejar secar y durante este tiempo el artculo no se debe usar para
USP 38
El personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluacin de desempeo en la apropiada higiene de las manos, vestimenta y todos los
procedimientos de limpieza y desinfeccin, la que llevar a cabo un experto calificado en preparacin magistral asptica.
Evaluacin de Competencia en Vestimenta y Prcticas Aspticas de Trabajo
El personal de preparacin magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboracin de PME y siempre que se efecte un llenado
de medios asptico, usando un Formulario para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparacin Magistral y los procedimientos de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal.
Evaluacin de la Prctica Asptica de Trabajo por Medio de Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal
El monitoreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin magistral se debe efectuar para todos los niveles de riesgo de
elaboracin de PME.
El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe utilizar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de
las manos y vestimenta, as como para educar al personal de preparacin magistral en las prcticas de trabajo apropiadas.
Todo el personal debe demostrar competencia en procedimientos apropiados de higiene de las manos y vestimenta, adems de las prcticas aspticas de trabajo.
Las placas estriles de contacto con agar se deben usar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparacin
magistral despus de vestirse para evaluar la competencia en el uso de vestimenta y despus de completar la preparacin de llenado de medios.
Los guantes no se deben desinfectar con IPA estril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras.
Evaluacin de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes
Captulos
El personal de preparacin magistral debe ser inspeccionado visualmente durante el proceso de higiene de las manos y uso de vestimenta.
La inspeccin visual debe documentarse en un Formulario para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del
Personal de Preparacin Magistral y conservarse para tener un registro permanente y una evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados
Inmediatamente despus de que el preparador magistral completa el procedimiento de higiene de las manos y vestimenta, el evaluador debe recolectar una muestra de la punta de los dedos y pulgar enguantados de ambas manos del preparador en placas de agar apropiadas, presionando ligeramente el agar con cada dedo.
Las placas se deben incubar durante un perodo de incubacin apropiado a la temperatura adecuada.
Todos los empleados deben completar exitosamente una evaluacin inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los
dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano.
Despus de completar la evaluacin inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, se debe hacer una reevaluacin de todo el personal
de preparacin magistral al menos anualmente para PME de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para PME de nivel de riesgo alto antes
de permitrsele continuar elaborando PME.
Los guantes no se deben desinfectar con IPA estril al 70% antes de la prueba.
Despus de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar
nutritivo se deben incubar como se estipula ms adelante.
El nivel de accin de ufc para las manos enguantadas estar basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha).
Perodo de Incubacin
Al final del perodo de muestreo designado, las placas de agar se recuperan, se aseguran las tapas, se invierten e incuban a una temperatura y por un
tiempo que conduzca a la multiplicacin de microorganismos. El agar tripticasa de soja (TSA) con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a 35 2
por 2 a 3 das.
Evaluacin de la Competencia en Manipulacin Asptica
Todo el personal de preparacin magistral deber someterse a la evaluacin de su competencia en tcnicas aspticas y prcticas relacionadas, inicialmente durante el procedimiento de prueba de llenado de medios, as como en los subsiguientes procedimientos de prueba de llenado de medios
anuales o semestrales, mediante el Formulario para Evaluacin de Tcnicas Aspticas y Prcticas relacionadas del Personal de Preparacin Magistral.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios
La destreza del personal en la elaboracin asptica de PME se debe evaluar por medio de una verificacin de llenado de medios lquidos de cultivo
bacteriano estril.
Los viales llenos de medio se deben incubar a 35 2 durante un perodo de 14 das.
Muestreo y Evaluacin de Limpieza y Desinfeccin de Superficies
La toma de muestras de superficies se debe hacer en todas las reas clasificadas ISO en forma peridica y por medio de placas de contacto y/o
hisopos, al momento de terminar la preparacin magistral.
Se deben definir los lugares donde se van a tomar muestras en un plano o formulario de muestreo.
Evaluacin de Competencia en Limpieza y Desinfeccin
Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparacin magistral y dems personal responsable de la limpieza durante el proceso de limpieza y
desinfeccin, durante la capacitacin inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y al terminar cualquier Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios.
La inspeccin visual debe documentarse en un Formulario para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin y conservarse para tener
un registro permanente y una evaluacin a largo plazo de la competencia del personal.
USP 38
Mtodos de Recoleccin en la Superficie
Inmediatamente despus de tomar la muestra de una superficie con la placa de contacto, el rea muestreada se debe frotar cuidadosamente con un
pao que no desprenda partculas, empapado en IPA estril al 70%.
Los resultados se deben informar como ufc por unidad de rea superficial.
Los datos de muestreo ambiental se deben recolectar y revisar en forma peridica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
Si una actividad muestra sistemticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar el personal competente de microbiologa.
Se debe investigar la fuente de la contaminacin.
Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de accin despus de la incubacin apropiada, se
debe efectuar y documentar una revisin de los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta, as como de los procedimientos de
desinfeccin de guantes y superficies y las prcticas de trabajo.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de accin debe dar lugar a una reevaluacin de la idoneidad de las prcticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtracin de aire dentro de las instalaciones en las que se elaboran preparaciones magistrales aspticas.
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTNDAR SUGERIDOS
Todas las instalaciones deben contar con los mismos y los procedimientos deben incluir al menos los puntos enumerados en esta seccin.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS
Revisar procedimientos y documentos para garantizar la esterilidad, pureza, identidades y cantidades de ingredientes correctas, y estabilidad.
Inspeccionar visualmente para determinar que no tenga partculas y color anormales, y que los envases y sellos estn intactos.
Pruebas de Esterilidad
PME de nivel de riesgo alto preparadas en lotes de ms de 25 envases idnticos o expuestas por ms de 12 horas entre 2 y 8 y 6 horas a ms de 8
antes de ser esterilizadas.
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirgenos)
PME de nivel de riesgo alto, excluyendo aquellas para administracin oftlmica o inhalacin, preparadas en lotes de ms de 25 envases idnticos o
expuestas por ms de 12 horas entre 2 y 8 y 6 horas a ms de 8 antes de ser esterilizadas.
Verificacin de la Identidad y Concentracin de los Ingredientes
Procedimientos escritos para verificar la identidad, calidad, cantidad y pureza correctas de los ingredientes usados en PME.
Procedimientos escritos para garantizar que las etiquetas de las PME contengan los nombres correctos y las cantidades o concentraciones de ingredientes, volmenes totales, fechas lmite de uso, condiciones de almacenamiento y vas de administracin.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LMITE DE USO
Determinacin de la Fecha Lmite de Uso
Usar los criterios generales del captulo 795 de la USP en ausencia de ensayos directos indicadores de estabilidad o literatura autorizada que respalde la duracin ms prolongada.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS.
Procedimientos escritos para envasado, almacenamiento y condiciones de transporte apropiados para mantener la esterilidad, calidad, pureza y contenido de las PME.
Redispensacin de PME
Cuando se pueden garantizar la esterilidad, pureza, contenido y calidad aceptables.
La asignacin de tiempos de almacenamiento en esterilidad y fechas lmite de uso en estabilidad posteriores a las de las PME originalmente dispensadas debe basarse en resultados de pruebas de esterilidad y valoracin cuantitativa de ingredientes.
Envase y Transporte de las PME
El envase mantiene la integridad fsica, esterilidad, estabilidad y pureza de las PME.
Modos de transporte que mantienen las temperaturas apropiadas y evitan daos a las PME.
CAPACITACIN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
Programa formal de capacitacin en mltiples componentes para garantizar que los pacientes y las personas encargadas de su cuidado entienden el
almacenamiento, manipulacin, uso y eliminacin apropiados para las PME.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS
Los procedimientos estndar escritos describen la manera en que los pacientes pueden preguntar e informar inquietudes y eventos adversos relacionados con PME y, en el caso de los supervisores de preparacin magistral, la forma de corregir y prevenir futuros problemas.
Los eventos adversos y los defectos de las PME se informan a los programas MedWatch de la FDA y a MEDMARX de la USP.
Captulos
Inspeccin de Formas Farmacuticas en Solucin y Revisin de los Procedimientos de Preparacin Magistral
USP 38
Apndice II.
Desinfectantes Comunes Usados en la Atencin de Salud para Superficies Inanimadas y
Dispositivos no Crticos y su Actividad Microbiana y Propiedades1
Categora Qumica del Desinfectante
Alcohol
isoproplico
Perxido
de
hidrgeno
acelerado
Amonio
Cuaternario (p.ej.,
cloruro de
dodecil dimetil amonio)
6095%
0,5%3
Bacterias
Virus lipoflicos
Virus hidroflicos
M.tuberculosis
Concentracin
Usada
Captulos
Inactivacin
Microbiana2
Propiedades
Fsicas &
Qumicas
Importantes
Fenlicos
Cloro
(p.ej., hipoclorito de
sodio)
Yodforos
(p.ej., povidona-yodo)
0,41,6%
aq
0,4
1,6% aq
1005000
ppm
3050
ppm
Agentes micticos (hongos)
Esporas Bacterianas
Vida til >1 semana
Efectos corrosivos o perjudiciales
Residuo no evaporable
Inactivado por materia orgnica
Irritante cutneo
Irritante ocular
Irritante respiratorio
Toxicidad sistmica
Clave para las abreviaturas y smbolos: aq = diluido en agua; ppm = partes por milln; + = s; = no; = resultados variables.
1 Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and related institutions, Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1995, pginas 227-245.
2 La inactivacin de los microorganismos ms comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de 1 minuto; la inactivacin de esporas requiere
tiempos de contacto ms prolongados (p.ej., 5 a 10 minutos para solucin de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. difficile). Referencia: Perez J, Springthorpe
VS, Sattar SA, Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium difficile: Relevance to environmental control, American Journal of Infection
Control, August 2005, pginas 320-325.
3 El perxido de hidrgeno acelerado pertenece a una nueva generacin de germicidas basados en perxido de hidrgeno en los cuales la potencia y el desempeo del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de cidos y detergentes apropiados.
Apndice III.
Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparacin Magistral
Nombre en letras de imprenta y cargo o ttulo de la persona evaluada:
Nombre de la institucin o instalacin:
Higiene de las Manos y Prcticas de la Vestimenta: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona
evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o N/O si la actividad no se observ.*
Se presenta aseado y con ropa limpia apropiada.
No usa cosmticos ni joyas (reloj, anillos, aretes, etc., incluidos pirsins) al entrar en las antesalas.
No lleva ni conserva alimentos o bebidas en las antesalas o zonas amortiguadoras.
Est consciente de la lnea de demarcacin que separa los lados limpios y sucios y observa las actividades requeridas.
Se pone el cubrecalzado o los zapatos destinados al rea limpia, uno a la vez, colocando el pie cubierto o calzado en el lado limpio de la
lnea de demarcacin, segn sea apropiado.
Utiliza mascarillas para cubrir la barba, de ser necesario.
Usa gorra y se asegura de que todo el cabello est cubierto.
Se pone mscara para cubrir el puente de la nariz e incluir la barbilla.
USP 38
Apndice III. (Continuacin)

Formulario de Muestra para Evaluacin de la Higiene de las Manos y Prcticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparacin Magistral
Efecta el procedimiento de higiene de manos humedeciendo las manos y antebrazos y lavndolos con agua tibia y jabn durante 30
segundos por lo menos.
Se seca las manos y los antebrazos con una toalla que no suelte pelusa o con un secador de manos.
Selecciona la bata de talla apropiada y revisa que no tenga agujeros, rasgones u otros defectos.
Se pone la bata y se asegura de que est bien cerrada.
Se desinfecta las manos de nuevo con un exfoliante quirrgico a base de alcohol, sin agua, y con actividad persistente, y las deja secar
completamente antes de ponerse los guantes estriles.
Calza guantes estriles del tamao apropiado, asegurndose que queden bien ajustados y no sobre material del guante en las puntas de
los dedos.
Examina los guantes, verificando que no tengan defectos, agujeros o rasgones.
Mientras desempea actividades de preparacin magistral estril, desinfecta peridicamente los guantes con IPA estril al 70% antes de
trabajar en el rea directa de preparacin magistral (ADP) y despus de tocar artculos o superficies que podran contaminar los guantes.
Se quita el EPP en el lado limpio de la antesala.
Se quita los guantes y se higieniza las manos.
Se quita la bata y la descarta o la cuelga en un gancho si la va a reutilizar el mismo da de trabajo.
Se quita y descarta la mscara, gorra y mascarilla que protege la barba (si la usa).
*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones especficas.
Firma de la Persona Evaluada
Nombre en letra de imprenta
Fecha
Firma del Evaluador Calificado
Fecha
Apndice IV.
Formulario de Muestra para Evaluacin de las Tcnicas Aspticas y Prcticas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral
Tcnica Asptica, Seguridad y Prcticas de Garanta de Calidad: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el
que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o
N/O si la actividad no se observ.*
Completa el Formulario de Evaluacin de Competencia en Higiene de Manos y Procedimientos de Vestimenta.
Efecta los procedimientos apropiados de higiene de manos, vestimenta y enguantado de acuerdo con los POE.
Desinfecta las superficies de los dispositivos ISO Clase 5 con un agente apropiado.
Desinfecta los componentes/viales con un agente apropiado antes de colocarlos en reas de trabajo ISO Clase 5.
Introduce slo los materiales esenciales en un orden apropiado en el rea de trabajo ISO Clase 5.
No interrumpe, obstaculiza o desva el flujo de primer aire a los sitios crticos.
Se asegura de que las jeringas, agujas y tubos permanezcan en su empaque individual y slo se abran en un rea de trabajo ISO Clase 5.
Efecta las manipulaciones slo en el ADP apropiada del dispositivo ISO Clase 5.
No expone los sitios crticos a contaminacin por contacto o aire de calidad infeior a ISO Clase 5.
Desinfecta los tapones, los puertos de inyeccin y los cuellos de las ampollas, frotndolos con IPA estril al 70% y los deja secar durante
el tiempo suficiente.
Fija las agujas a las jeringas sin contaminacin por contacto.
Perfora los tapones de viales y conecta los puertos de infusin sin contaminacin por contacto.
Etiqueta las preparaciones correctamente.
Captulos
Se quita el cubrecalzado o los zapatos, uno a la vez, asegurndose de colocar el pie descubierto en el lado sucio de la lnea de demarcacin y se higieniza las manos nuevamente. (Se quita y desecha los cubrecalzado todas las veces que sale del rea de preparacin magistral).
USP 38
Apndice IV. (Continuacin)

Formulario de Muestra para Evaluacin de las Tcnicas Aspticas y Prcticas Relacionadas del Personal de Preparacin Magistral
Desinfecta los guantes estriles en forma peridica, frotndolos con IPA estril al 70% durante manipulaciones de preparacin magistral
prolongadas.
Limpia, grada y calibra el dispositivo automatizado de preparacin magistral (p.ej., preparador magistral de NPT) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Desecha los elementos cortantes y desperdicios de acuerdo con las polticas institucionales o las guas reconocidas.
*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones especficas.
Fecha
Fecha
Apndice V.
Formulario de Muestra para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin
Captulos

Prcticas de Limpieza y Desinfeccin: El evaluador calificado pondr una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha
completado aceptablemente la actividad descrita, anotar N/A si la actividad no es aplicable a la sesin de evaluacin o N/O si la actividad no se
observ.*
Tareas Diarias:
Prepara la concentracin correcta de solucin desinfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Usa un envase apropiadamente etiquetado para el tipo de superficie que va a limpiar (piso, pared, tolvas de produccin, etc.).
Documenta la preparacin de solucin desinfectante.
Sigue los procedimientos de vestimenta cuando efecta cualquier actividad de limpieza.
Al comienzo de cada turno, limpia todos los dispositivos ISO Clase 5 antes de la preparacin magistral, en el siguiente orden: paredes,
barra IV, preparadores magistrales automatizados y superficies de trabajo.
Utiliza un pao que no suelte pelusa, empapado en IPA estril al 70% u otra solucin desinfectante aprobada y deja secar por completo.
Al final de cada turno, retira todos los componentes del preparador y limpia todas las reas ISO Clase 5 como se especific anteriormente.
Limpia todos los mostradores y superficies de trabajo fcilmente limpiables.
Friega pisos, usando los trapeadores etiquetados como pisos, comenzando en la pared opuesta a la puerta de entrada del cuarto, con
movimientos uniformes del trapeador, hacia el operador. Mueve los carros segn sea necesario para limpiar toda la superficie del piso.
El uso de un sistema de limpieza de microfibra es una alternativa aceptable a los trapeadores.
En la antesala, limpia los lavabos y todas las superficies de contacto; limpia el piso con una solucin desinfectante o usa un sistema de
limpieza de microfibra.
Tareas Mensuales:
Efecta la limpieza mensual en un da designado. Prepara una solucin desinfectante segn se especific en las tareas diarias, que es
apropiada para las superficies que se van a limpiar.
Limpia el cielo raso de las zonas amortiguadoras y las antesalas, las paredes y los estantes de almacenamiento con una solucin desinfectante y un trapeador o un sistema de limpieza de microfibra.
Una vez que el rea ISO Clase 5 est limpia, limpia el cielo raso del cuarto de preparacin magistral, seguido de las paredes y por ltimo
el piso. Usa los trapeadores o el sistema de limpieza de microfibra debidamente etiquetados.
Limpia todas las cajas y los estantes de almacenamiento de la zona amortiguadora, retirando el contenido y, usando un pao que no
suelte pelusa, empapado en detergente germicida, limpia las superficies internas de la caja y luego toda la superficie externa. Deja
secar las cajas. Antes de volver a poner el contenido dentro de las mismas, las frota con IPA estril al 70% para quitar el residuo de
desinfectante. Usa paos nuevos de ser necesario.
Limpia todos los carros de la zona amortiguadora, retirando el contenido y usando paos que no suelten pelusa empapados en detergente germicida, limpia todos los carros, comenzando desde el estante superior y la parte superior de la barra, avanzando hacia abajo,
hasta las ruedas. Limpia la parte de abajo de los estantes de la misma manera. Usa un pao nuevo para cada carro. Deja secar. Frota
los carros con un pao que no suelte pelusa, empapado en IPA estril al 70% para quitar cualquier residuo de desinfectante. Usa paos
nuevos de ser necesario.
Pruebas Fsicas / 801 Polarografa 657
USP 38
Apndice V. (Continuacin)
Formulario de Muestra para Evaluacin de Procedimientos de Limpieza y Desinfeccin
Limpia las sillas de la zona amortiguadora, el interior y exterior de los recipientes de basura, usando un pao que no suelte pelusa, empapado en solucin desinfectante.
Documenta todas las actividades de limpieza anotando quin las efectu, con fecha y hora.
*La persona evaluada es informada de inmediato de todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A
o N/O) y se le muestran e informan las correcciones especficas.
Nombre en letras de imprenta
Fecha
Fecha
801 POLAROGRAFA
Fig. 1. Polarograma tpico que muestra el cambio en el flujo de corriente en funcin del aumento del potencial aplicado al
electrodo de goteo de mercurio.
Captulos
La polarografa es un mtodo de anlisis electroqumico basado en la medicin del flujo de corriente resultante de la electrlisis de una solucin en un microelectrodo polarizable, en funcin de un voltaje aplicado. El polarograma (ver Figura 1) obtenido por esta medicin proporciona informacin cualitativa y cuantitativa de sustancias electro-reducibles y electro-oxidables. El
intervalo normal de concentraciones para las sustancias que se analizan es de 102 molar a 105 molar.
En la polarografa de corriente directa (cd), el microelectrodo es un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en
pequeas gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo capilar conectado a un reservorio de mercurio. El
electrodo de referencia ms comnmente empleado es un electrodo de calomel saturado (ECS) que posea una superficie extensa. El voltaje aplicado a la celda se aumenta gradualmente y slo fluye una corriente residual muy pequea hasta que la
sustancia que se valora experimenta reduccin u oxidacin. Al principio la corriente aumenta gradualmente, luego lo hace de
manera casi lineal con el voltaje y gradualmente alcanza un valor lmite, como se muestra en la Figura 1.
658 801 Polarografa / Pruebas Fsicas
USP 38
En la porcin ascendente inicial de la onda polarogrfica, el aumento del flujo de corriente provoca una disminucin en la
concentracin de las especies electroactivas en la superficie del electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la
concentracin de las especies reactivas disminuye an ms hasta alcanzar un valor mnimo en la superficie del electrodo. La
corriente queda limitada entonces por la velocidad de difusin de las especies reaccionantes desde el seno de la solucin hasta
la superficie del microelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por la reaccin del electrlito soporte. Esta
gran concentracin de electrlito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el anlisis e impide que las especies
reactivas alcancen el electrodo por migracin elctrica. De este modo, se asegura que la corriente limitante est controlada por
la difusin.
Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se renueva constantemente en forma cclica, la corriente aumenta
desde un valor pequeo, cuando la gota comienza a formarse, hasta alcanzar un valor mximo cuando la gota cae. Mediante
el empleo de un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el registro caracterstico con perfil dentado. La corriente limitante es la suma de las corrientes residual y de difusin. La corriente residual se resta de la corriente limitante para
obtener la altura de la onda.
Ecuacin de IlkovicLa relacin lineal entre la corriente de difusin (id) y la concentracin de especies electro-activas se
muestra por la ecuacin de Ilkovic:
Captulos
id = 708nD1/2Cm2/3t1/6
en la cual id es la corriente mxima en microamperios; n es el nmero de electrones requeridos por molcula de sustancia electro-activa; D es el coeficiente de difusin, en centmetros cuadrados por segundo; C es la concentracin, en milimoles por L; m
es la velocidad de flujo de mercurio del EGM, en mg por segundo; y t es el tiempo de cada de la gota, en segundos.
Los polargrafos modernos estn equipados con registradores capaces de determinar la corriente hasta la ltima porcin de
la vida de la gota; en consecuencia, registran la mxima fluctuacin de corriente. Cuando la corriente se mide slo al final de la
vida de la gota, la tcnica se denomina polarografa cd por muestreo. En este caso, slo se registran los mximos de corriente y
no se observan las oscilaciones debidas al crecimiento de la gota.
Para instrumentos equipados con galvanmetros para medir la corriente, o en el caso de los registradores operados en modalidad de curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la corriente promedio. En el ltimo caso, la medida de la corriente es el promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de esta manera, la id dada por la ecuacin de Ilkovic es la corriente promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en lugar de la corriente mxima, y entonces el coeficiente 708 se reemplaza por 607.
Control de la Corriente de DifusinLa ecuacin de Ilkovic identifica las variables que deben ser controladas para asegurar que la corriente de difusin sea directamente proporcional a la concentracin de material electro-activo. A 25 los coeficientes de difusin para soluciones acuosas de muchos iones y molculas orgnicas aumentan 1% a 2% por grado de aumento
en la temperatura. Por lo tanto, la temperatura de la celda polarogrfica debe controlarse en un margen de 0,5. Las cantidades m y t dependen de las dimensiones del capilar y de la altura de la columna de mercurio por encima del electrodo. Si bien
es posible comparar resultados obtenidos con capilares diferentes si se conoce el producto m2/3t1/6, es recomendable utilizar el
mismo capilar con una altura de mercurio constante durante una serie de anlisis. La corriente de difusin es proporcional a la
raz cuadrada de la altura de la columna de mercurio. Un reservorio de mercurio con un dimetro de ms de 4 cm previene
una disminucin significativa del nivel de mercurio durante una serie de determinaciones.
El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04 mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la
columna de mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior del depsito de mercurio, oscila entre 40
cm y 80 cm. La longitud exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de modo que el tiempo de cada
est entre 3 y 5 segundos con el circuito abierto y con el capilar inmerso en la solucin de prueba.
Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios
segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona con el nmero de gotas proporcionadas durante un cambio
de potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro ms rpido del polarograma.
La corriente que fluye a travs de la solucin de prueba durante el registro de un polarograma est en el orden de los microamperios. Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la solucin de prueba y es posible realizar
varios polarogramas con la misma solucin de prueba sin obtener diferencias significativas.
Potencial de Media OndaEl potencial de media onda (E1/2) tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distancia entre la corriente residual y la meseta de la corriente limitante. Este potencial es caracterstico de las especies electro-activas
y, por lo general, es independiente de su concentracin o del capilar empleado para obtener la onda. Depende de la composicin de la solucin y puede cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o con la adicin de agentes formadores de complejos. El potencial de media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificacin cualitativa de una
sustancia.
El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al electrodo de referencia despus de la correccin para la cada iR (el
potencial necesario para pasar la corriente, i, a travs de la solucin con una resistencia R). Resulta especialmente importante
hacer esta correccin para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta resistencia, si se necesita un potencial exacto
para el EGM. No se necesita la correccin del potencial de media-onda para el anlisis cuantitativo. A menos que se indique de
otro modo, se entiende que los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS.
Eliminacin del Oxgeno DisueltoPuesto que el oxgeno se reduce en el EGM en dos pasos, primero a perxido de hidrgeno y despus a agua, interfiere cuando los polarogramas deben realizarse a potenciales ms negativos que aproximada-
USP 38
Pruebas Fsicas / 801 Polarografa 659
Fig. 2. Polarografa de Corriente Directa (cd).

Esta corriente se compone de dos elementos. El primero, la corriente de difusin (faradaica), que se produce por la sustancia
que experimenta la reduccin u oxidacin en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional a la concentracin de esta
sustancia. El segundo elemento es la corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa electroqumica). Ambas
corrientes cambian a medida que vara el tamao de la gota de mercurio. Estos cambios producen las oscilaciones presentes
en los tpicos polarogramas de cd.
En la polarografa de pulso normal, se aplica un pulso de potencial al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la
gota, manteniendo el potencial inicial durante el perodo de crecimiento de la gota (ver Figura 3).
Captulos
mente 0 voltio en funcin de ECS, y por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse introduciendo burbujas de nitrgeno libre de oxgeno a travs de la solucin durante 10 a 15 minutos inmediatamente antes de registrar la onda; el nitrgeno
primero debe pasarse a travs de una porcin separada de la solucin para acondicionarlo y de este modo reducir al mnimo
los cambios debidos a la evaporacin.
Es necesario que la solucin est en reposo y libre de vibraciones durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de asegurar que la corriente dependa solamente de la difusin. Por lo tanto, el burbujeo con nitrgeno debe detenerse y el gas se
debe dirigir para que fluya sobre la superficie de la solucin antes de registrar un polarograma.
En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para eliminar el oxgeno, siempre que el reactivo no reaccione con
otros componentes del sistema.
Medicin de la Altura de la OndaPara usar un polarograma cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda.
Como sta es una medida de la magnitud de la corriente de difusin, se mide verticalmente. Para compensar la corriente residual, el segmento de la curva que precede al aumento de la onda se extrapola ms all del ascenso en la onda. Para una onda
bien formada donde esta extrapolacin es paralela a la meseta de la corriente limitante, la medicin no es ambigua. Para ondas no muy bien definidas, puede utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo difrente en la monografa individual. Se extrapolan con lneas rectas tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se muestra en
el grfico (Figura 1). La altura de la onda se toma como la distancia vertical entre las lneas extrapoladas medida a nivel del
potencial de media onda.
Procedimiento[PrecaucinEl vapor de mercurio es txico y el mercurio metlico tiene una presin de vapor significativa a
temperatura ambiente. El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de
mercurio derramada pueda recuperarse completamente con relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de mercurio
despus de cada uso del instrumento. Trabajar en un laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier derrame de
mercurio.] Transferir una porcin de la dilucin final de la sustancia valorada a una celda polarogrfica apropiada inmersa en un
bao de agua regulado a 25 0,5. Pasar una corriente de nitrgeno a travs de la solucin durante 10 a 15 minutos para
eliminar el oxgeno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde el capilar, insertar el capilar en la solucin de prueba y
ajustar la altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrgeno de modo que pase sobre la superficie de la solucin
y registrar el polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografa individual, empleando un registrador o galvanmetro de sensibilidad adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la onda y, a menos que se indique de
otro modo en la monografa, compararla con la altura de la onda obtenida con el Estndar de Referencia USP apropiado, medida bajo las mismas condiciones.
Polarografa de PulsosEn la polarografa de cd convencional, la corriente se mide continuamente mientras se aplica un
potencial como una rampa lineal (ver Figura 2).
660 801 Polarografa / Pruebas Fsicas
USP 38
Fig. 3. Polarografa de pulso.
Captulos
A cada gota siguiente se le aplica un pulso ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada por la velocidad
de barrido seleccionada. La corriente se mide al final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y, por lo
tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver Figura 4).
Fig. 4 Grfico de corriente en funcin del tiempo en polarografa de pulso.

Adems, como el pulso que se aplica es de corta duracin, la capa de difusin no se agota tanto como en la polarografa de
cd, y se obtienen niveles de corriente ms elevados para concentraciones equivalentes. Se pueden medir concentraciones de
tan slo 106 M, lo que permite una sensibilidad aproximadamente 10 veces mayor que la polarografa de cd. Los valores de la
corriente limitante se miden ms fcilmente, dado que las ondas estn libres de oscilaciones.
La polarografa de pulso diferencial es una tcnica mediante la cual se aplica un pulso de altura fija al final de la vida de cada
gota, superpuesta a una corriente directa aumentada linealmente (ver Figura 5).
Pruebas Fsicas / 811 Finura de Polvos 661
USP 38
Fig. 5. Polarografa de pulso diferencial.

El flujo de corriente se mide justo antes de la aplicacin del pulso y nuevamente al final del pulso. La diferencia entre estas dos
corrientes se mide y se representa en el registrador. Dicha seal diferencial proporciona una curva que se aproxima a la derivada de la onda polarogrfica y presenta un pico. El potencial del pico es equivalente a:
E1/2 DE/2
811 FINURA DE POLVOS

La distribucin del tamao de partcula se debe calcular mediante Estimacin de la Distribucin del Tamao de Partcula por
Tamizado Analtico 786 o aplicando otros mtodos, cuando resulte conveniente. En este captulo, se proporciona una clasifi-
Captulos
en donde DE es la altura del pulso. La altura del pico es directamente proporcional a la concentracin a velocidades de barrido
constantes y a alturas de pulso constantes. Esta tcnica es especialmente sensible (pueden determinarse concentraciones de
107M) y proporciona mejor resolucin entre ondas poco espaciadas.
Voltamperometra de Redisolucin AndicaLa voltamperometra de redisolucin andica es una tcnica electroqumica
por la cual se concentran (reducen) vestigios de sustancias en solucin sobre un electrodo y luego se redisuelven (oxidan) en la
solucin barriendo andicamente el voltaje aplicado. La medicin del flujo de corriente como una funcin de este voltaje y la
velocidad de barrido proporcionan informacin cualitativa y cuantitativa sobre dichas sustancias. El paso de concentracin permite realizar anlisis a concentraciones de 107M a 109M.
El instrumental bsico incluye un generador de rampa de voltaje, un conjunto de circuitos para medicin de corriente, una
celda con electrodos de trabajo, electrodos de referencia y contraelectrodos, y un registrador u otro dispositivo de lectura. Los
instrumentos que tienen capacidades polarogrficas de cd o de pulso generalmente son muy adecuados para aplicacin en
redisolucin. El electrodo de trabajo comnmente utilizado es el electrodo de gota de mercurio colgante (EGMC), si bien el
electrodo de capa fina de mercurio (ECFM) ha sido aceptado. Para el anlisis de metales como por ejemplo plata, platino y
oro, cuyos potenciales de oxidacin son ms positivos que los del mercurio, y del mercurio mismo, se requiere el uso de electrodos slidos como por ejemplo platino, oro y carbn. Un electrodo de calomel saturado o un electrodo de platacloruro de
plata sirve como electrodo de referencia excepto para el anlisis de mercurio o de plata. Como contraelectrodo se suele utilizar
un alambre de platino.
Las muestras que contienen el electrlito adecuado se colocan con pipeta en la celda. El oxgeno disuelto se elimina haciendo burbujear nitrgeno en la celda durante 5 a 10 minutos.
En general, se aplica un potencial de electrlisis equivalente a 200 a 300 mV ms negativo que el potencial de media onda
del material que se debe analizar (aunque este potencial se debe determinar experimentalmente), con agitacin durante 1 a
10 minutos. Para obtener resultados reproducibles, hay que mantener condiciones constantes (a saber, tiempo de deposicin,
velocidad de agitacin, temperatura, volumen de la muestra y tamao de la gota, si se utiliza EGMC).
Despus de la deposicin, la agitacin se suspende y la solucin y el electrodo se dejan equilibrar durante un breve perodo.
El potencial luego se barre andicamente con rapidez (10 mV/segundo o ms en polarografa de cd y 5 mV/segundo en polarografa de pulso diferencial). Al igual que en la polarografa, la corriente limitante es proporcional a la concentracin de las
especies (altura de la onda en cd y pulso, altura del pico en pulso diferencial), mientras que el potencial de media onda (cd,
pulso) o el potencial de pico (pulso diferencial) identifica la especie. Para obtener un desempeo satisfactorio, es fundamental
elegir cuidadosamente el electrlito de soporte. Por lo general, la cuantificacin se logra por el mtodo de adicin del estndar
o por calibracin.
Esta tcnica es apropiada para el anlisis de vestigios de metales pero tiene un uso limitado en las determinaciones orgnicas, dado que muchas de estas reacciones son irreversibles. Al analizar sustancias tales como el cloruro, se puede emplear voltamperometra de redisolucin catdica. La tcnica es la misma que la voltamperometra de redisolucin andica, excepto en
que la sustancia se deposita andicamente y luego se redisuelve mediante un barrido de voltaje catdico.
662 811 Finura de Polvos / Pruebas Fsicas
USP 38
cacin de finura de polvos, en trminos descriptivos y sencillos. La medida de la finura de los polvos se realiza, por motivos
prcticos, mediante tamices. El tamizado es el mtodo ms adecuado si la mayora de las partculas superan aproximadamente
los 75 mm, aunque tambin se puede usar para algunos polvos cuyos tamaos de partcula son inferiores, cuando el mtodo se
pueda validar. La difraccin de luz es otra tcnica que tambin se utiliza ampliamente para medir el tamao de una gran variedad de partculas.
Clasificacin de Finura de PolvosCuando la distribucin acumulativa se determina mediante tamizado analtico u otros
mtodos, la finura de los polvos se puede clasificar de la siguiente manera:
x90 = dimensin de partcula correspondiente al 90% de la distribucin acumulativa de partculas de tamao inferior al
esperado
x50 = mediana de la dimensin de partcula (es decir, 50% de las partculas son de menor tamao y 50% de las partculas
son de mayor tamao)
x10 = dimensin de partcula correspondiente al 10% de la distribucin acumulativa de partculas de tamao inferior al
esperado
Se reconoce que el smbolo d tambin se utiliza ampliamente para designar estos valores. Por tanto, se pueden emplear los
smbolos d90, d50 y d10.
Los siguientes parmetros se pueden definir basndose en la distribucin acumulativa. QR(x) = distribucin acumulativa de
partculas con una dimensin menor o igual a x, donde el subndice R representa el tipo de distribucin.
Captulos
Tipo de Distribucin
Nmero
Longitud
rea
Volumen
Por consiguiente, por definicin:

1. QR(x) = 0,90 cuando x = x90
2. QR(x) = 0,50 cuando x = x50
3. QR(x) = 0,10 cuando x = x10
La tabla que figura a continuacin presenta un mtodo alternativo, aunque menos informativo, para clasificar la finura de los
polvos.
Clasificacin de los Polvos segn su Finura
Trmino
Descriptivo
Grueso
X50 (mm)
Distribucin Acumulativa
Basada en Volumen,
Q3(x)
>355
Q3(355) <0,50
Moderadamente Fino
180355
Q3(180) <0,50 y Q3(355) 0,50
Fino
125180
Q3(125) <0,50 y Q3(180) 0,50
125
Q3(125) 0,50
Muy Fino
821 RADIOACTIVIDAD
Los productos farmacuticos radioactivos requieren tcnicas especializadas para su manejo y anlisis para poder obtener resultados correctos y reducir al mnimo los riesgos para el personal. Todas las operaciones deben ser llevadas a cabo o supervisadas por personal capacitado en el manejo de materiales radioactivos.
Por lo general, las instalaciones para la produccin, uso y almacenamiento de productos farmacuticos radioactivos estn
sujetas a la obtencin de una licencia que otorga la Comisin de Reglamentacin Nuclear Federal (Nuclear Regulatory Commission), aunque en ciertos casos esta atribucin ha sido delegada a agencias estatales. El Departamento de Transporte, en el
orden federal, reglamenta las condiciones del transporte de materiales radioactivos. Las agencias estatales y locales suelen aplicar reglamentaciones especiales adicionales. Todos los fabricantes o usuarios deben conocer exhaustivamente las reglamentaciones federales aplicables de la Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosmticos (Food, Drug, and Cosmetic Act), as como
los requisitos adicionales del Servicio de Salud Pblica de los Estados Unidos (U. S. Public Health Service) y de los organismos
estatales y locales relativos a los artculos en cuestin.
En este captulo se establecen definiciones, consideraciones especiales y procedimientos relativos a las monografas de la Farmacopea sobre medicamentos radioactivos.
Pruebas Fsicas / 821 Radioactividad 663
USP 38
CONSIDERACIONES GENERALES
Ley Fundamental de Desintegracin
La velocidad de desintegracin de una fuente radioactiva se describe por la ecuacin:
Nt = Noelt
en donde Nt es el nmero de tomos de la sustancia radioactiva en el tiempo transcurrido t, No es el nmero de tomos cuando t = 0 y l es la constante de transformacin o desintegracin, la cual tiene un valor caracterstico para cada radionucleido.
La vida media, T1/2, es el tiempo requerido para que una actividad dada de un radionucleido alcance la mitad de su valor inicial
y est relacionada con la constante de desintegracin por la ecuacin:
T1/2 = 0,69315/l
La actividad de una fuente radioactiva (A) est relacionada con el nmero de tomos radioactivos presentes, por la ecuacin:
A = lN
Figura 1. Grfica Normalizada de Desintegracin.

La actividad de un material radioactivo se expresa como el nmero de transformaciones nucleares por unidad de tiempo. La
unidad fundamental de radioactividad, el curio (Ci), se define como 3,700 1010 transformaciones nucleares por segundo. El
milicurio (mCi) y el microcurio (mCi) son subunidades de uso comn. El nmero de transformaciones nucleares por unidad de
tiempo es la suma de las velocidades de desintegracin de todos los modos de desintegracin concurrentes del nucleido de
origen. Antes de que la actividad de cualquier radionucleido en una muestra medida pueda expresarse en curios, suele ser necesario conocer las abundancias de las radiaciones emitidas y medidas.
Geometra
La validez de la calibracin y medicin relativas de radionucleidos depende de la reproducibilidad de la relacin de la fuente
con el detector y su entorno. Debe tenerse en cuenta la configuracin de la fuente.
Captulos
a partir de la cual puede calcularse el nmero de tomos radioactivos en el tiempo t y, por lo tanto, puede determinarse la
masa del material radioactivo.
La actividad de una sustancia radioactiva pura en funcin del tiempo puede obtenerse a partir de la ecuacin exponencial o
de tablas de desintegracin, o bien por medio de grficas basadas en la vida media (ver Grfica Normalizada de Desintegracin,
Figura 1).
664 821 Radioactividad / Pruebas Fsicas
USP 38
Radiacin de Fondo
Los rayos csmicos, la radioactividad presente en el detector y en los materiales de proteccin y la radiacin proveniente de
fuentes radioactivas que no cuentan con un blindaje adecuado y que estn en las inmediaciones del equipo de medicin son
factores que contribuyen al conteo de la radiacin de fondo. Todas las mediciones de radioactividad deben corregirse restando
el conteo de radiacin de fondo del conteo bruto de la muestra de prueba.
Estadsticas de Conteo
Dado que el proceso de desintegracin radioactiva es un fenmeno aleatorio, los eventos a contar tambin forman una secuencia aleatoria en funcin del tiempo. Por esta razn, el conteo durante un tiempo definido slo permite obtener una estimacin del conteo real. La precisin de esta estimacin, sujeta a fluctuaciones estadsticas, depende del nmero de cuentas
acumuladas en una medicin dada y puede expresarse en funcin de la desviacin estndar s. Una estimacin de s es
n
en donde n es el nmero de conteos acumulados en una medicin dada. La probabilidad de que una sola medicin se encuentre dentro de
100/n%
Captulos
con respecto a la media de una serie de mediciones es 0,68. Es decir, si se realizara una serie de mediciones de un nmero n
de conteos cada una, aproximadamente dos tercios de las observaciones se encontraran dentro de
100/n%
de la media y el resto quedara fuera.
Debido a la naturaleza estadstica de la desintegracin radioactiva, el conteo repetido de una fuente no alterada en un dispositivo para conteo produce valores de conteo que se ajustan a la frecuencia de una distribucin normal. Las desviaciones de
estos valores respecto de la distribucin normal responden a la prueba de c2. Por este motivo, suele aplicarse la prueba de c2
para determinar el rendimiento y correcto funcionamiento de un dispositivo para conteo. En la seleccin de instrumentos y
condiciones para la valoracin de fuentes radioactivas, debe maximizarse la cifra del valor e2/B (en donde e = eficiencia del
contador = velocidad observada de conteo/velocidad de desintegracin de la muestra y B = velocidad de conteo de radiacin
de fondo).
Prdidas en el Conteo
El tiempo mnimo requerido para que el contador resuelva dos pulsos de seal consecutivos se denomina tiempo muerto.
Por lo general, el tiempo muerto vara entre unos microsegundos, en el caso de contadores proporcionales y de centelleo, hasta cientos de microsegundos, en el caso de contadores de Geiger-Mller. Los eventos nucleares producidos durante el tiempo
muerto del contador no se registrarn. Para obtener la velocidad de conteo corregida, R, a partir de la velocidad de conteo
observada, r, es necesario emplear la frmula:
R = r/(1 rt)
en donde t es el tiempo muerto. La frmula de correccin anterior supone un tiempo muerto no prolongable. Por lo tanto,
para la validez general, el valor de rt no debe exceder de 0,1. La velocidad de conteo observada, r, se refiere a la velocidad de
conteo bruto de la muestra y no se debe corregir por la radiacin de fondo antes de su uso en la ecuacin anterior.
Estndares de Calibracin
Realizar todas las valoraciones de radioactividad empleando sistemas de medicin calibrados con estndares de radioactividad debidamente certificados. Estos estndares de calibracin pueden adquirirse directamente del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls) o de otras fuentes con valores rastreables al Instituto Nacional de Normas y
Tecnologa mediante su participacin en un programa de mediciones intercomparadas. En aquellos casos en que estos estndares de calibracin no se encuentren disponibles, la Farmacopea proporciona los datos de desintegracin nuclear requeridos
para la calibracin. Estos datos, as como los valores de vida media, se obtienen del Archivo de Datos sobre Estructura Nuclear
Evaluada del Proyecto de Datos Nucleares de Oak Ridge (Evaluated Nuclear Structure Data File of the Oak Ridge Nuclear Data
Project) y reflejan los ltimos valores disponibles a la fecha de publicacin.
Transportador
La masa total de tomos o molculas radioactivas en una fuente radioactiva dada es directamente proporcional a la actividad
del radionucleido para una vida media dada y, por lo general, la cantidad presente en los preparados radiofarmacuticos es
USP 38
demasiado pequea para ser medida por mtodos qumicos o fsicos comunes. Por ejemplo, la masa de 131I con una actividad
de 100 mCi es 8 107 g. Como cantidades tan pequeas de material se comportan qumicamente de manera anmala, se
pueden agregar istopos no radioactivos del mismo radionucleido para actuar como transportadores durante el procesamiento
para facilitar su manipulacin. En muchos casos, la adsorcin puede impedirse simplemente aumentando la concentracin de
iones hidrgeno en la solucin. Sin embargo, las cantidades de este material deben ser lo suficientemente pequeas como
para que no se produzcan efectos fisiolgicos indeseables. La expresin sin transportador se refiere nicamente a preparaciones radioactivas donde no hay istopos no radioactivos del radionucleido. Esto implica que los preparados radiofarmacuticos
producidos a travs de (n, g) reacciones no pueden considerarse exentas de transportador.
La actividad por unidad de volumen o peso de un medio o vehculo que contiene un radionucleido, ya sea con o sin transportador, se denomina concentracin radioactiva, en tanto que el trmino actividad especfica se refiere a la actividad de un
radionucleido por gramo de su elemento.
Pureza Radioqumica
Pureza Radionuclidica
La pureza radionuclidica de una preparacin radiofarmacutica se refiere a la proporcin de radioactividad debida al radionucleido deseado en la radioactividad total medida. La pureza radionuclidica es importante para la estimacin de la dosis de
radiacin recibida por el paciente cuando se le administra la preparacin. Las impurezas radionuclidicas pueden surgir de impurezas en los materiales originales, diferencias en los valores de diferentes secciones cruzadas de produccin competentes y
funciones de excitacin a la energa o energas de las partculas bombardeantes durante la produccin.
Trminos y Definiciones
La fecha de fabricacin es la fecha en la cual se completa el ciclo de fabricacin del producto terminado.
La fecha de valoracin es la fecha (y hora, si fuera aplicable) en la cual se realiza la valoracin concreta de la radioactividad.
La fecha de calibracin es una fecha y hora arbitrariamente asignadas, momento en el que se calcula la radioactividad del
producto para la comodidad del usuario.
La fecha de caducidad es la fecha lmite para el uso del producto. El perodo de caducidad (es decir, el tiempo transcurrido
entre la fecha de fabricacin y la fecha de caducidad) se basa en el conocimiento de las propiedades radioactivas del producto
y los resultados de los estudios de estabilidad de la forma farmacutica terminada.
Etiquetado
Las monografas correspondientes a cada producto radiofarmacutico indican la fecha de caducidad, la fecha de calibracin
y la advertencia PrecaucinMaterial Radioactivo. El etiquetado indica que, al realizar los clculos de dosificacin, deben
hacerse las correcciones necesarias por desintegracin radioactiva y asimismo indica cul es la vida media radioactiva del radionucleido. Los artculos que son Inyecciones deben cumplir con los requisitos de Etiquetado en Inyectables 1, mientras que los
que son Productos Biolgicos deben cumplir con los requisitos de Etiquetado en Productos Biolgicos 1041.
Captulos
La pureza radioqumica de una preparacin radiofarmacutica se refiere a la fraccin del radionucleido declarado presente
en la forma qumica declarada. Las impurezas radioqumicas en preparados radiofarmacuticos pueden ser el resultado de la
descomposicin y de procedimientos de preparacin indebidos. La radiacin causa la descomposicin del agua, uno de los
ingredientes principales de la mayora de los preparados radiofarmacuticos, lo cual produce tomos reactivos de hidrgeno y
radicales hidroxilo, electrones hidratados, hidrgeno, iones hidrgeno y perxido de hidrgeno. Este ltimo se forma en presencia de radicales oxgeno, los cuales se originan a partir de la descomposicin radioltica del oxgeno disuelto. Muchos preparados radiofarmacuticos tienen mejor estabilidad si se excluye el oxgeno. La radiacin tambin puede afectar al preparado
radiofarmacutico en s mismo, produciendo un aumento de iones, radicales y estados excitados. Estas especies se pueden
combinar entre s o con las especies activas formadas a partir del agua. La descomposicin por radiacin puede reducirse al
mnimo mediante el uso de agentes qumicos que captan electrones o radicales. Los electrones atrapados en slidos provocan
un cambio de color debido a la formacin de centros F y un ejemplo del caso es el oscurecimiento de los envases de vidrio que
contienen preparados radiofarmacuticos. La pureza radioqumica de los preparados radiofarmacuticos se determina por cromatografa en columna, papel o en capa delgada u otras tcnicas apropiadas de separacin analtica, segn se especifique en
la monografa individual correspondiente.
USP 38
IDENTIFICACIN Y VALORACIN DE RADIONUCLEIDOS

Instrumental
Captulos
CMARAS DE IONIZACIN
Una cmara de ionizacin es un instrumento donde se aplica un campo elctrico a travs de un volumen de gas con el propsito de recoger los iones producidos por un campo de radiacin. Los iones positivos y los electrones negativos migran a lo
largo de las lneas de fuerza del campo elctrico y se captan en electrodos, produciendo una corriente de ionizacin. En una
cmara de ionizacin de tipo pozo adecuadamente diseada, la corriente de ionizacin no debe depender demasiado de la
posicin de la muestra radioactiva y el valor de la corriente por unidad de actividad, conocido como factor de calibracin, es
caracterstico de cada radionucleido emisor de rayos gamma.
La corriente de ionizacin producida en una cmara de ionizacin est relacionada con la energa media de la radiacin emitida y es proporcional a la intensidad de la radiacin. Si se emplean fuentes estndar de velocidad de desintegracin conocida
para calibrar la eficiencia, se puede utilizar la cmara de ionizacin para determinaciones de actividad entre algunos microcurios y varios cientos de milicurios o ms. Por lo general, el lmite superior de actividad que puede medirse en una cmara de
ionizacin no est definido con exactitud y puede estar limitado por consideraciones relativas a la saturacin, la capacidad del
amplificador y el diseo de la cmara en s. Deben revisarse los datos suministrados u obtenidos de un instrumento especfico
para evaluar los intervalos tiles de energas e intensidades del dispositivo.
Se puede alcanzar fcilmente una reproducibilidad con un margen de aproximadamente un 5% en alrededor de 10 segundos, con una cmara de pozo profundo re-entrante. La forma ms comnmente empleada de cmara de ionizacin para medir las actividades de preparados radiofarmacuticos se conoce como calibrador de dosis.
Aunque el factor de calibracin para un radionucleido puede interpolarse a partir de la curva de respuesta a la energa de la
cmara de ionizacin, en este procedimiento hay varias fuentes posibles de error. Por lo tanto, se recomienda que todas las
calibraciones de la cmara de ionizacin se lleven a cabo con el uso de fuentes autnticas de referencia de los radionucleidos
individuales, segn se describe ms adelante.
La calibracin de un calibrador de dosis debe mantenerse relacionando la respuesta medida de un estndar con la de un
estndar de larga vida, como es el caso del radio 226 en equilibrio con sus productos de desintegracin. El instrumento debe
verificarse diariamente con 226Ra u otra fuente para evaluar su estabilidad durante un perodo prolongado. Esta verificacin debe incluir lecturas del estndar de funcionamiento en todas las posiciones de radionucleido empleadas. Para obtener la actividad (Ax) del radionucleido medido, emplear la relacin:
Ax = RxR/Rn
en donde Rn es la nueva lectura para el radio u otra fuente, Rx es la lectura para la misma fuente obtenida durante el procedimiento de calibracin inicial y R es la lectura observada para la muestra del radionucleido. Obviamente, primero hay que aplicar las correcciones necesarias por desintegracin radioactiva de la fuente de referencia. El uso de este procedimiento debe
reducir al mnimo cualquier efecto debido a la desviacin en la respuesta del instrumento. La actividad recomendada del 226Ra
u otro indicador usado en el procedimiento descrito anteriormente es entre 75 mCi y 150 mCi. Se recomienda tambin verificar
la reproducibilidad o estabilidad de instrumentos de intervalos mltiples para todos los intervalos con el uso de estndares
apropiados.
El tamao y la forma de una fuente radioactiva pueden afectar la respuesta de un calibrador de dosis y suele ser necesario
realizar una pequea correccin cuando se mide una muestra voluminosa.
DETECTORES DE CENTELLEO Y DETECTORES SEMICONDUCTORES
Cuando se disipa la totalidad o parte de la energa de la radiacin beta o gamma dentro de los centelladores, se producen
fotones de intensidad proporcional a la cantidad de energa disipada. Un fototubo multiplicador de electrones detecta estos
pulsos y los convierte en pulsos elctricos, que posteriormente se analizan con un analizador de altura de pulso para obtener
un espectro de altura de pulso relacionado con el espectro de energa de la radiacin emitida por la fuente. En general, un
espectro de altura de pulso por centelleo de partculas beta se aproxima al espectro verdadero de energa beta, siempre que la
fuente de partculas beta est preparada de tal manera que la autoabsorcin se reduzca al mnimo. Se pueden obtener espectros de rayos beta utilizando fluoruro de calcio o antraceno como centellador, mientras que los espectros de rayos gamma
suelen obtenerse con un cristal de yoduro de sodio activado con talio o con un detector semiconductor de gran volumen de
germanio desplazado por litio. Los espectros de partculas cargadas tambin pueden obtenerse empleando detectores semiconductores de silicio y/o contadores proporcionales de gas. Los detectores semiconductores son, en esencia, cmaras de ionizacin de estado slido, pero la energa requerida para crear un par electrn-hueco o para elevar un electrn desde la capa de
valencia a la capa de conduccin en el semiconductor es aproximadamente de un dcimo de la energa requerida para crear
un par inico en una cmara de ionizacin llena de gas o un contador proporcional y es mucho menor que la requerida para
producir un fotn en un cristal NaI(Tl) de centelleo. En la espectrometra de rayos gamma, un detector de Ge(Li) puede producir una resolucin de energa de 0,33% para rayos gamma de 1,33 MeV provenientes de 60Co, mientras que un cristal de
USP 38
CONTADORES DE CENTELLEO LQUIDO
Los radionucleidos emisores de radiacin alfa y beta pueden analizarse con un sistema de detectores de centelleo lquido. En
el lquido de centelleo, la energa de radiacin se transforma finalmente en cuantos de luz que son detectados generalmente
por dos fototubos multiplicadores preparados para contar slo radiacin de coincidencia. El lquido de centelleo es una solucin constituida por un disolvente, solutos primarios y secundarios, y aditivos. La partcula cargada disipa su energa en el disolvente y una fraccin de esta energa se transforma en fluorescencia en el soluto primario. La funcin del soluto secundario
es desplazar la radiacin de fluorescencia a longitudes de onda ms largas que son detectadas ms eficientemente por los fototubos multiplicadores. Los disolventes empleados con ms frecuencia son tolueno y p-xileno; los solutos primarios son 2,5-difeniloxazol (PPO) y 2-(4-terc-butilfenil)-5-(4-bifenilil)-1,3,4-oxadiazol (butil-PBD) y los solutos secundarios son 2,2-p-fenilenbis[4-metil-5-feniloxazol] (dimetil-POPOP) y p-bis(o-metilestrilil)benceno (bis-MSB). Para lograr compatibilidad y miscibilidad
con muestras acuosas a analizar, se incorporan tambin en el centellador muchos aditivos, tales como agentes tensoactivos y
agentes de solubilizacin. Para una determinacin exacta de la radioactividad de la muestra se debe prestar atencin al preparar una muestra verdaderamente homognea. La presencia de impurezas o color en la solucin disminuye la produccin de
fotones del centellador, lo cual se denomina extincin. Una medicin exacta de la radioactividad requiere una correccin por
prdida de velocidad de conteo debida a extincin.
La velocidad de desintegracin de una fuente de partculas beta puede determinarse mediante un procedimiento que consiste en medir el conteo total de la muestra en funcin del umbral discriminador de la altura de pulso y la velocidad de emisin
se obtiene luego extrapolando a un umbral de cero. Los emisores de partculas alfa energticas pueden medirse de forma similar utilizando este mtodo.
Identificacin
Un radionucleido puede identificarse por su modo de desintegracin, su vida media y las energas de sus emisiones nucleares.
La vida media radioactiva se determina fcilmente mediante el conteo sucesivo de una fuente dada del radionucleido durante un perodo ms prolongado que su vida media. La respuesta del dispositivo para conteo cuando se emplea para la medicin
de la desintegracin de radionucleidos de larga vida debe supervisarse con una fuente de referencia de vida an ms larga
para evaluar y compensar errores que surjan de la derivacin electrnica del aparato. Para radionucleidos de vida corta, cuando el perodo de conteo es una fraccin significativa de la vida media del radionucleido, la velocidad de conteo registrada debe corregirse al tiempo en que se inicia el conteo, del siguiente modo:
Rt = rlt/(1 elt)
Captulos
NaI(Tl) de 3 3 pulgadas (7,6 7,6 cm) permite obtener un valor de 5,9% para la misma energa de rayos gamma. La resolucin de energa es una medida de la capacidad para distinguir la presencia de dos rayos gamma estrechamente espaciados en
energa y se define por convencin como el ancho total del fotopico a la mitad de su altura mxima (FWHM por sus siglas en
ingls), expresado como porcentaje de la energa del fotopico.
Los espectros de rayos gamma presentan uno o ms fotopicos ntidos tpicos o picos de energa total, como resultado de la
absorcin total en el detector de la energa completa de radiaciones gamma provenientes de la fuente; estos fotopicos son
tiles para fines de identificacin. Otros picos secundarios se observan como consecuencia de retrodispersin, radiacin de aniquilacin, suma de coincidencia, rayos X fluorescentes, etc., acompaados por una banda amplia conocida como el efecto
continuo Compton que surge de la dispersin de los fotones en el detector y de los materiales circundantes. Dado que la respuesta del fotopico vara con la energa del rayo gamma, la calibracin de un espectrmetro de rayos gamma debe realizarse
con estndares de radionucleidos que tengan energas de rayos gamma y velocidades de emisin conocidas. La forma del espectro de rayos gamma depende de la forma y tamao del detector y los tipos de materiales de blindaje empleados.
Para verificar la identidad de un radionucleido por espectrometra de rayos gamma, es necesario hacer una comparacin del
espectro de la muestra con el de una muestra de pureza conocida del mismo radionucleido obtenida con parmetros instrumentales idnticos e idntica geometra de muestra. Cuando los radionucleidos emiten radiaciones coincidentes X o gamma, el
carcter de la distribucin de la altura de pulso suele cambiar drsticamente debido al efecto de suma de estas radiaciones
coincidentes en el detector a medida que aumenta la eficiencia de la deteccin (por ejemplo, al acercar la fuente al detector).
Este efecto es particularmente evidente en el caso del yodo 125. Entre las aplicaciones ms tiles de la espectrometra de rayos
gamma estn aquellas que sirven para la identificacin de radionucleidos y la determinacin de impurezas radionuclidicas.
Cuando no es posible confirmar la identidad de un radionucleido dado a travs de una comparacin directa con el espectro
de una muestra del mismo radionucleido de pureza conocida, la identidad del radionucleido en cuestin debe establecerse
con el siguiente mtodo. Deben medirse dos o ms de los siguientes parmetros del esquema de desintegracin nuclear de la
muestra del radionucleido que se desea identificar, los cuales deben concordar dentro de 10%: (1) vida media, (2) energa de
rayos gamma o rayos X emitidos, (3) la abundancia de cada emisin y (4) el Emx para aquellos radionucleidos que se desintegren con emisin de partculas beta. Estas mediciones deben realizarse segn se indica en las secciones Identificacin y Valoracin de este captulo. La coincidencia de dos o ms de los parmetros medidos con los datos correspondientes publicados del
esquema de desintegracin nuclear constituye la confirmacin de la identidad del radionucleido.
Captulos
USP 38
en donde Rt es la velocidad de conteo al comienzo de un perodo de conteo, r es la velocidad del conteo observada a travs
del perodo total de conteo, t es la duracin del perodo total de conteo, l es la constante de desintegracin del radionucleido
y e es la base del logaritmo natural. Cuando t es pequeo en comparacin con la vida media del radionucleido en anlisis, de
tal modo que lt < 0,05, (1 elt) se aproxima a lt y no se necesita correccin.
La energa de emisiones nucleares suele determinarse por el intervalo mximo de penetracin de la radiacin en la materia
(en el caso de partculas alfa y beta) y por el pico o fotopico de energa total en el espectro de rayos gamma (en el caso de
rayos X y rayos gamma). Puesto que las partculas beta son emitidas con un espectro de energa continuo, la energa beta
mxima, Emx, es un ndice nico para cada radionucleido emisor beta. Adems del intervalo mximo y del espectro de energa
de las partculas beta, el coeficiente de absorcin, cuando se obtiene bajo condiciones de conteo reproducibles, puede servir
como un ndice confiable para la identificacin de un emisor beta. Fortuitamente, las partculas beta se absorben en la materia
de una manera aproximadamente exponencial y la grfica del logaritmo de la velocidad de conteo de partculas beta en funcin del espesor del absorbente se conoce como la curva de absorcin. La porcin inicial de la curva de absorcin muestra
linealidad, a partir de la cual puede obtenerse el coeficiente de absorcin. El intervalo mximo est determinado por el uso de
absorbentes de espesor variable y el espectro de energa se mide por espectrometra de centelleo de rayos beta.
La absorcin de rayos gamma en la materia es estrictamente exponencial pero las capas de valor medio de atenuacin no
han sido muy tiles para la caracterizacin de radionucleidos. Los rayos gamma de cada transicin isomrica son monoenergticos; su energa puede ser medida directamente por espectrometra de rayos gamma. Debido a su resolucin de alta energa,
los detectores de estado slido [Ge(Li)] son muy superiores a los detectores de centelleo [NaI(Tl)] en la espectrometra de rayos
gamma.
Las actividades de las soluciones radiofarmacuticas suelen aproximarse a los milicurios por mL. Por lo general, estas soluciones deben diluirse considerablemente antes de que puedan valorarse con exactitud. El diluyente debe ser compatible con el
preparado radiofarmacutico en lo que se refiere a factores como pH y potenciales redox, para que no ocurra ninguna hidrlisis o cambio en el estado de oxidacin con la dilucin, lo que podra conducir a adsorcin y separacin del radionucleido de la
solucin.
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA
Procedimiento del Coeficiente de Absorcin de MasaDepositar y secar una alcuota de la solucin de fsforo 32 radioactivo sobre una pelcula plstica delgada para reducir al mnimo la retrodispersin y colocar la alcuota bajo un contador
apropiado. Determinar sucesivamente las velocidades de conteo, empleando no menos de seis espesores diferentes de aluminio, cada uno entre 20 mg/cm2 y 50 mg/cm2 y un solo absorbente de espesor no mayor de 800 mg/cm2, que se emplea
para medir la radiacin de fondo. (Los absorbentes se insertan entre la muestra de prueba y el contador pero se colocan ms
cerca de la ventana del contador para reducir al mnimo la dispersin.) El conteo neto de partculas beta se obtiene despus de
restar la velocidad de conteo hallada con el absorbente de espesor de 800 mg/cm2 o mayor. Graficar el logaritmo de la velocidad neta de conteo de partculas beta en funcin del espesor total del absorbente. El espesor total del absorbente es el
espesor de los absorbentes de aluminio ms el espesor de aire equivalente (la distancia en centmetros entre la muestra y
la ventana del contador multiplicada por 1,205 mg/cm3 a 20 y 76 cm de mercurio), expresado en mg/cm2. El resultado es
una lnea aproximadamente recta.
Elegir dos espesores totales del absorbente que difieran en 20 mg/cm2 o ms y que caigan sobre la grfica lineal y calcular
el coeficiente de absorcin de masa, m, por medio de la ecuacin:
m = 1/(t2 t1) ln (Nt1/Nt2) = (2,303/(t2 t1)) (log Nt1 log Nt2)
en donde t1 y t2 representan el total de los espesores, en mg/cm2, siendo t2 el absorbente de mayor espesor; y Nt1 y Nt2 son
las velocidades de conteo neto de partculas beta con los absorbentes t1 y t2, respectivamente.
Para la caracterizacin del radionucleido, el coeficiente de absorcin de masa debe estar dentro de un 5% del valor encontrado para una muestra pura del mismo radionucleido cuando se determina bajo condiciones idnticas de conteo y geometra.
Otros Mtodos de IdentificacinOtros mtodos para la determinacin de la identidad de un emisor beta tambin dependen de la determinacin de la Emx. Se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, (1) mediante la utilizacin de
relaciones de intervalos de energa entre partculas beta en un absorbente o (2) mediante la determinacin de Emx a partir de
un espectro de partculas beta obtenido con un espectrmetro para radiacin beta calibrado por energa empleando una fuente delgada del radionucleido (ver Detectores de Centelleo y Detectores Semiconductores en este captulo).
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA
El espectro de rayos gamma de un radionucleido es una herramienta valiosa para la identificacin cualitativa de radionucleidos emisores de rayos gamma. Se identifica el pico de energa total, o el fotopico, por la energa de transicin de rayos gamma
que se libera en el esquema de desintegracin del radionucleido.
Para determinar la pureza e identidad de un radionucleido, se obtiene el espectro de rayos gamma de una sustancia radioactiva por medio de un cristal de NaI(Tl) o un detector semiconductor de Ge(Li). La resolucin de este ltimo es mayor en ms
de una orden de magnitud que el anterior y es el preferido para fines analticos. El espectro obtenido es idntico en forma al
USP 38
de una muestra del radionucleido puro, medido con el mismo sistema de deteccin y en la misma geometra. El espectro de
rayos gamma del producto radiofarmacutico deber contener slo fotopicos identificables por las energas de transicin de
los rayos gamma encontrados en el esquema de desintegracin del mismo radionucleido. En el caso de eficiencias geomtricas
bajas, las reas bajo los fotopicos, despus de corregir por la eficiencia de medida del detector, son proporcionales a la abundancia o velocidad de emisin de los respectivos rayos gamma en el radionucleido.
IMPUREZAS RADIONUCLIDICAS
Valoracin
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA
ProcedimientoLa velocidad de desintegracin (A) de una muestra emisora de partculas beta se obtiene mediante el conteo de una alcuota cuantitativamente depositada en una geometra fija segn la frmula:
A = R/(e fr fb fs)
en donde e es la eficiencia del contador, fr es el factor de correccin por tiempo muerto del contador, fb es el factor de correccin por retrodispersin y fs es el factor de correccin por autoabsorcin. La velocidad de conteo para un absorbente cero se
obtiene por extrapolacin de la porcin lineal inicial de la curva de absorcin a un espesor cero del absorbente, considerando los mg/cm2 de espesor de cubierta de la muestra, la ventana del contador y el espacio de aire presente entre la muestra y
la ventana del contador. La eficiencia del contador, e, se determina mediante el uso de un estndar secundario de larga vida
con caractersticas espectrales similares. RaD + E se ha utilizado con frecuencia para la calibracin de eficiencia de los contadores para fsforo 32. Mediante el uso de condiciones de medicin idnticas para la muestra y el estndar (y extrapolacin a
absorbente cero), el cociente entre los valores de fr, fb y fs para el estndar y la muestra se acerca a la unidad.
La relacin anterior es vlida tambin cuando se ha calibrado el contador con un estndar del radionucleido que se va a
analizar. En este caso, sin embargo, no se requieren las extrapolaciones a espesor cero del absorbente para la muestra y el
estndar, ya que las dos correcciones para absorcin se cancelan para una geometra dada.
Otro mtodo til que se emplea con frecuencia para la determinacin de la velocidad de desintegracin de radionucleidos
emisores de rayos beta es el conteo por centelleo lquido, que tambin utiliza una extrapolacin del conteo de la muestra a un
umbral cero para el discriminador de altura de pulso.
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA
Se proporcionan tres mtodos para la valoracin de radionucleidos emisores de rayos gamma. La seleccin del mtodo preferido depende de la disponibilidad de un estndar de calibracin del radionucleido a analizar y la pureza radionuclidica del
producto en s.
Se requiere la comparacin directa con un estndar de calibracin si el estndar de calibracin del radionucleido a analizar
est disponible y si se ha determinado que el lmite superior de error aceptable en la determinacin de las actividades debido a
la presencia de impurezas radionuclidicas es menos de 3%. Cuando el estndar de calibracin requerido no es fcil de obtener, como probablemente sea el caso para un radionucleido de vida corta, pero ha estado disponible en algn momento previo a la ejecucin de la valoracin para determinar la eficiencia del sistema de conteo del radionucleido a analizar, emplear un
sistema de conteo calibrado siempre que el contenido de impurezas radionuclidicas de la muestra cumpla los requisitos establecidos para el mtodo de comparacin directa. Si los requisitos de cualquiera de los dos primeros mtodos no se pueden
cumplir, emplear el mtodo para determinacin de la actividad a partir de una curva de calibracin.
Captulos
Debido a que los nucleidos emisores de rayos alfa son sumamente txicos, debe limitarse su uso en preparaciones radiofarmacuticas. Los procedimientos para la identificacin de radionucleidos activos gamma y beta, segn se ha indicado previamente, se aplican a la deteccin de contaminantes gamma y, comnmente, contaminantes beta.
La actividad bruta de partculas alfa en preparaciones radiofarmacuticas puede medirse mediante el uso de un contador
proporcional sin ventanas o un detector de centelleo que emplee un detector fosforescente de sulfuro de cinc activado por
plata o por las tcnicas de conteo de centelleo lquido.
La gran ionizacin causada por partculas alfa facilita la medicin de radionucleidos emisores de rayos alfa en presencia de
grandes cantidades de nucleidos beta y gamma activos mediante el uso de tcnicas apropiadas para diferenciar la amplitud de
los pulsos de seal. En el conteo proporcional, la regin de voltaje operativo para conteo de partculas alfa denominada meseta alfa es considerablemente menor que la meseta beta para conteo de radiaciones beta y gamma. La calibracin de voltaje
tpica para la meseta alfa y la meseta beta con gas de conteo P-10 es de 900 voltios a 1300 voltios y de 1600 voltios a
2000 voltios, respectivamente.
Cuando se emplean detectores fosforescentes de sulfuro de cinc activado por plata para la deteccin de partculas alfa, stas
pueden distinguirse de otras radiaciones de interferencia por la diferenciacin de la altura de pulso. Se debe tomar la precaucin de reducir al mnimo la autoabsorcin en la fuente cuando se preparan las muestras para el conteo de partculas alfa.
USP 38
Captulos
Con excepcin del primer mtodo, se realiza un seguimiento de los sistemas de conteo empleados para verificar la estabilidad. Este requisito se cumple mediante verificaciones diarias con una fuente de larga vida para verificar el funcionamiento y
verificaciones semanales con al menos tres fuentes que cubran una gama amplia de energas de emisin de rayos gamma (por
ejemplo, 57Co, 137Cs y 60Co). Si se encuentra una discrepancia en cualquiera de las medidas antedichas, recalibrar completamente el sistema o reparar y recalibrar el sistema antes de volver a usarlo.
Valoracin por Comparacin Directa con un Estndar de CalibracinPara este procedimiento no se requiere un sistema de medicin selectiva de energa (por ejemplo, un analizador de altura de pulso). Se emplea una cmara de ionizacin o
un sistema integral de conteo con un detector de NaI(Tl). Para obtener resultados exactos es esencial un factor de geometra
reproducible de manera constante de muestra a muestra. Tomando precauciones adecuadas, la exactitud de este mtodo se
aproxima a la exactitud con la cual se determina la velocidad de desintegracin del estndar de calibracin.
Determinar la velocidad de conteo del sistema de detectores para un estndar de calibracin del radionucleido a valorar (por
ejemplo, suficientemente activo para dar estadsticas confiables de medicin dentro de un lapso razonable, pero no tan activo
como para causar problemas graves de tiempo muerto), seleccionando un estndar que permita una exactitud ptima con el
equipo especfico utilizado. Colocar una alcuota exactamente medida de la muestra desconocida a valorar (diluida, si fuera
necesario) en un recipiente idntico al usado para el estndar y medir la muestra aproximadamente al mismo tiempo y bajo las
mismas condiciones geomtricas que el estndar. Si el tiempo transcurrido entre las mediciones del estndar de calibracin y
la muestra excede las 12 horas, verificar la estabilidad del sistema de medicin dentro de las 8 horas a partir del momento en
que se midi la muestra, con una fuente de larga vida para verificacin del funcionamiento. Registrar la respuesta del sistema
con respecto a la misma fuente de verificacin en el momento de la calibracin y, si las verificaciones posteriores exceden la
respuesta original registrada en ms de 3%, recalibrar el sistema. Corregir ambas determinaciones de actividad por radiacin
de fondo y calcular la actividad, en mCi por mL, por la frmula:
SD(g/b)
en donde S es la concentracin mCi del estndar; D es el factor de dilucin; y g y b son los valores medidos de la velocidad de
conteo para la muestra y el estndar, respectivamente.
Valoracin con un Sistema de Conteo Integral CalibradoSe aplican el procedimiento y las precauciones mencionadas
para el mtodo anterior de comparacin directa, excepto que se debe determinar y registrar la eficiencia del sistema de detectores para cada radionucleido que se desea analizar, en lugar de registrar simplemente la velocidad de conteo del estndar. Por
lo tanto, la eficiencia para un radionucleido determinado, x, se determina por ex = bx/sx, en donde bx es la velocidad de conteo, corregida por radiacin de fondo y tiempo muerto, para el estndar de calibracin del radionucleido, x, y sx es la actividad
correspondiente al estndar de calibracin certificado en transformaciones nucleares por segundo. Para valoraciones posteriores de la muestra, la actividad est dada por la frmula:
Ax = Dgx/ex
en donde D es el factor de dilucin, gx es la velocidad de conteo de la muestra (corregida por la radiacin de fondo y el tiempo muerto) y ex es la eficiencia correspondiente para el radionucleido.
Determinacin de la Actividad a Partir de una Curva de CalibracinLa versatilidad en las mediciones de intensidad
absoluta de rayos gamma puede lograrse mediante un anlisis de altura de pulso en canales mltiples. La eficiencia de un sistema de deteccin para fotopicos puede determinarse como una funcin de la energa de los rayos gamma a travs de una serie
de muestras de estndares de emisores de rayos gamma; la velocidad de emisin de rayos gamma de un radionucleido para el
cual no se disponga de ningn estndar puede determinarse por la interpolacin en la curva de eficiencia. Sin embargo, es
necesario definir la curva de eficiencia para el sistema de deteccin adecuadamente sobre la regin total de inters, usando un
nmero suficiente de puntos de calibracin a lo largo del eje de energa del fotopico.
Seleccin de un Equipo de ConteoPara la identificacin de radionucleidos que emiten rayos X o gamma en su desintegracin se emplea un espectrmetro de rayos gamma. Los requisitos para un equipo apropiado para la identificacin y valoracin
de los radionucleidos empleados en productos radiofarmacuticos son: (a) que la resolucin del detector basada en el fotopico
de 137Cs-137mBa de 662-keV sea 8,0% o mejor, (b) que el detector cuente con un soporte de muestra diseado para facilitar la
repeticin exacta de la geometra de conteo y (c) que el analizador de altura de pulso tenga canales suficientes para delinear
claramente el fotopico bajo observacin.
ProcedimientoLos requisitos mnimos para el mantenimiento de las calibraciones del instrumento son verificaciones semanales de funcionamiento con una fuente apropiada de referencia y una recalibracin semestral completa. Si la verificacin de
funcionamiento semanal se desva del valor determinado en el momento de la calibracin en ms de 4,0%, debe recalibrarse
totalmente el instrumento.
Este mtodo se divide en tres pasos bsicos: la integracin del fotopico, la determinacin de la curva de eficiencia para fotopicos y el clculo de la actividad de la muestra.
INTEGRACIN DEL FOTOPICOEl mtodo para determinar el rea de un fotopico utiliza una aproximacin gausiana para el
ajuste del fotopico. Puede obtenerse una fraccin fija del nmero total de conteos del fotopico tomando el ancho del pico, a, a
una fraccin del mximo donde se ha determinado experimentalmente que la forma es muy cercana a la gausiana y multiplicndolo por el canal de conteo mximo, P, despus de corregir por contribuciones por el efecto Compton y la radiacin de
fondo. Por lo general, esta radiacin de fondo puede determinarse correctamente mediante una interpolacin lineal. Este procedimiento se ilustra en la Figura 2.
USP 38
Fig. 2 Espectro Tpico de Rayos Gamma que muestra la Seleccin del Canal de Conteo Mximo, P, despus de la Correccin
por Contribuciones por el Efecto Compton y la Radiacin de Fondo.
a = D D + [(d 0,606P)/(d c)] + [(d 0,606P)/(d c)]

en donde c y d y tambin c y d son los canales de conteo individuales a cada lado de 0,606P y D y D son los nmeros de los
canales (ubicacin) de d y d, respectivamente. La posicin de las variables requeridas sobre el fotopico se ilustra en la Figura 3.
Fig. 3 Ubicacin de las Variables Requeridas para la Determinacin del Ancho del Pico, a, a 0,606P.
A partir de los valores conocidos de velocidad de conteo P en el canal de conteo mximo del fotopico y el ancho del pico
0,606P, a, se obtiene una fraccin calibrada del rea del fotopico a partir del producto, (aP).
Para resumir los procedimientos utilizados para obtener una fraccin calibrada del rea del fotopico empleando este mtodo, las etapas o clculos necesarios se detallan paso a paso a continuacin:
(1) Restar del fotopico que se desea medir cualquier contribucin por efecto Compton y radiacin de fondo.
(2) Determinar la velocidad de conteo P del canal de conteo mximo (mxima velocidad de conteo del canal despus de
restar el valor Compton y la radiacin de fondo).
(3) Multiplicar P por 0,606 y ubicar la lnea horizontal correspondiente al ancho del pico, a.
(4) Obtener el ancho del pico, a, asignando los valores de las variables (obtenidos segn se muestra en la figura precedente)
en la ecuacin correspondiente para calcular a.
(5) La fraccin calibrada del rea del pico es igual al producto de a por P o F = aP, en donde F es un rea fraccionaria del
pico proporcional a la velocidad de emisin de la fuente.
Captulos
La curva del fotopico adopta una forma cercana a una lnea recta a 0,606P y la contribucin al valor de a de los canales
fraccionarios puede calcularse exactamente por interpolacin. Calcular a por la ecuacin:
USP 38
Este mtodo proporciona un medio rpido y exacto para determinar la velocidad de emisin de los rayos gamma de las
fuentes mientras que evita, en gran medida, las estimaciones subjetivas de la forma detallada de las colas de los picos. El error
debido al empleo de la mxima velocidad de conteo del canal, en lugar del canal de conteo mximo terico, es del orden de
1,0% si a es 6 o mayor.
CALIBRACIN DE LA EFICIENCIA DEL FOTOPICOLos radionucleidos como los listados en la tabla siguiente junto con algunos de
sus datos de desintegracin nuclear, se encuentran disponibles como estndares certificados de referencia.* Debe seleccionarse
un nmero suficiente de fuentes radioactivas de referencia estndar para obtener la curva de calibracin en el intervalo deseado. En lo posible, se deben incluir fuentes estndar de los radionucleidos que se desean analizar.
Propiedades Nucleares de los Estndares de Calibracin Seleccionados(1,2)
Energa
(ke V)
Fotones
por 100
Desintegraciones
Ka1
30,97
63,4
Ka2
30,62
34,2
Kb
35,0
22,8
g1
53,15
2,14
g2
79,62
2,55
g3
80,99
33,0
g6
276,39
6,9
g7
302,83
17,8
g8
356,0
60,0
g9
383,85
8,7
Emisiones de Fotones Principales
Captulos
133Ba
(T1/2 = 10,5 aos)
137Cs137mBa
(T1/2 = 30,17 aos)

Ka1
32,19
3,82
Ka2
31,82
2,07
Kb
36,4
1,39
Media Ponderada(4)
(32,9)
(7,28)
g1
661,6
89,98
hn
511
179,80(5)
g1
1274,54
99,94
22Na
60Co
57Co
(T1/2 = 2,60 aos)
(T1/2 = 5,27 aos)

g1
1173,2(6)
100,0
g2
1332,5(6)
100,0
SXK
7,0
56,0
g1
14,4
9,5
85,51
(T1/2 = 270,9 das)
g2
122,06
g3
136,47
10,60
Media Ponderada
(125,0)
(96,11)
(g2 + g3)(4)
54Mn
(T1/2 = 312,7 das)
109Cd109Ag
SXK
6,0
25,0
g1
834,83
99,98
22,16
35,3
(T1/2 = 464 das)

Ka1
(1)
En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoracin, la radiacin fluorescente de blindaje de plomo (especficamente, rayos X ~76 ke V por
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiacin; una manera satisfactoria
de absorber esta radiacin es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
(2) Por lo general, slo se incluyen aquellas emisiones del fotn que tienen 1% de abundancia.
(3) La notacin K se refiere a emisiones de rayos X.
(4) Se proporcionan las energas medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de NaI(Tl).
(5) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
(6) Cascada.
* Se pueden obtener estos estndares de referencia certificados del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, por sus siglas en ingls), Washington, DC
20234.
USP 38
Propiedades Nucleares de los Estndares de Calibracin Seleccionados(1,2) (Continuacin)
Emisiones de Fotones Principales
Energa
(ke V)
Fotones
por 100
Desintegraciones
Ka2
21,99
18,6
Kb
24,9
11,4
Media Ponderada(4)
63,5
g1
129I
(T1/2 = 1,57
88,0
107
3,72
aos)
Ka1(3)
29,78
37,0
Ka2
29,46
20,0
Kb
13,2
37,0
g1
39,58
7,52
Media Ponderada(4)
(31,3)
(77,80)
Calcular la velocidad de emisin de rayos gamma por la ecuacin:

G = Asb
en donde As es la actividad, en desintegraciones por segundo, del estndar usado y b es el nmero de rayos gamma por desintegracin a ese nivel de energa. Medir con exactitud cantidades de soluciones estndar de cada radionucleido en recipientes
idnticos y determinar el rea fraccionaria del fotopico (F) para cada uno de los estndares.
Empleando la ecuacin ep = F/G, calcular la eficiencia del fotopico, ep y construir una grfica loglog de ep en funcin de la
energa de rayos gamma como se muestra en la Figura 4.
Fig. 4. Curvas Tpicas de Calibracin de la Eficiencia de Fotopicos para Varios Detectores de NaI(Tl).
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA MUESTRADe la misma manera que en la preparacin de la curva de calibracin, determinar el rea fraccionaria (F) del fotopico principal de la muestra valorada o una alcuota medida con exactitud ajustada al
mismo volumen en un recipiente idntico al usado para los estndares. A partir de la curva de calibracin, determinar el valor
de ep para este radionucleido. Empleando la ecuacin G = F/ep, calcular la velocidad de emisin de los rayos gamma (G). Calcu-
Captulos
(1) En mediciones de rayos gamma (o rayos X), a los fines de la valoracin, la radiacin fluorescente de blindaje de plomo (especficamente, rayos X ~76 ke V por
K de plomo) puede interferir con los resultados cuantitativos. Debe tenerse en cuenta para estos efectos, o debe suprimirse la radiacin; una manera satisfactoria
de absorber esta radiacin es cubrir el plomo expuesto con una hoja de cadmio de 0,06 a 0,08 pulgadas (1,5 a 2 mm) de espesor y luego cubrir el cadmio con
cobre de 0,02 a 0,04 pulgadas (0,5 a 1 mm) de espesor.
(2) Por lo general, slo se incluyen aquellas emisiones del fotn que tienen 1% de abundancia.
(3) La notacin K se refiere a emisiones de rayos X.
(4) Se proporcionan las energas medias ponderadas e intensidades totales para grupos de fotones que no se resuelven mediante un detector de NaI(Tl).
(5) Para que esta intensidad de fotones pueda ser utilizable, se deben eliminar todos los positrones emitidos en el material de origen.
(6) Cascada.
USP 38
lar la actividad (A), en desintegraciones por segundo, de la muestra empleando la ecuacin A = (G/b)(D), en donde b es el
nmero de rayos gamma por desintegracin y D es el factor de dilucin. Para obtener la actividad, en mCi o mCi, dividir A por
3,7 104 3,7 107, respectivamente. La relacin anterior es igualmente vlida para la obtencin de la actividad de una
muestra no diluida o una cpsula; en este caso, el factor de dilucin, D, es la unidad.
823 FRMACOS PARA TOMOGRAFA DE EMISIN DE POSITRONES

PARA USO EN PREPARACIONES MAGISTRALES, INVESTIGACIN
CLNICA Y ESTUDIOS CIENTFICOS
Captulos
INTRODUCCIN
Los radionucleidos usados para la tomografa de emisin de positrones (TEP) a menudo tienen vidas medias fsicas cortas,
T1/2 (p.ej., T1/2 de 15O = 2,03 min, 62Cu = 9,67 min, 13N = 9,96 min, 11C = 20,4 min, 68Ga = 67,7 min, 18F = 109,8 min, 64Cu =
12,7 h). Como resultado, estos radionucleidos a menudo se obtienen mediante tcnicas de aceleracin de partculas (p.ej.,
ciclotrones) o en generadores, y luego se procesan para fabricar el producto farmacutico terminado para TEP, muy cerca del
sitio donde se llevar a cabo el procedimiento de TEP.
Las cortas vidas medias de los radionucleidos para TEP derivan en limitaciones nicas para la preparacin y anlisis de productos farmacuticos para TEP. Este captulo describe guas para la elaboracin y anlisis de productos farmacuticos para TEP,
basndose en las siguientes limitaciones:
No es posible completar todo el anlisis antes de usar los productos farmacuticos para TEP.
Un solo vial puede contener una partida o subpartida completa de producto farmacutico para TEP. Las muestras retiradas para el anlisis de control de calidad (CC) son representativas de toda la partida o subpartida.
Una partida o subpartida completa puede administrarse a un nico paciente.
La masa del frmaco para TEP en un producto farmacutico para TEP a menudo se encuentra en cantidades que varan
desde nanogramos hasta microgramos.
Los productos farmacuticos para TEP no entran en una cadena de distribucin de medicamentos tradicional, sino que
estos se usan internamente o se entregan en el lugar de uso por servicios de distribucin especializados.
Las instalaciones de produccin a pequea escala para la preparacin de productos farmacuticos para TEP cuentan con
personal y recursos limitados, los cuales requieren lo siguiente:
Facilitar la realizacin de operaciones mltiples en un rea con controles adecuados;
Facilitar la fabricacin y el anlisis de mltiples productos farmacuticos para TEP usando equipo compartido;
Requerimientos apropiados para operaciones aspticas;
Requerimientos apropiados para la aptitud del equipamiento y dems actividades en el da de uso;
Requisitos de control de calidad para componentes, materiales e insumos;
Autoverificacin de etapas importantes en la produccin de radionucleidos, produccin de frmacos para TEP o preparacin magistral y anlisis; y
Supervisin de la produccin y preparacin magistral, revisin de registros de partida y autorizacin para la liberacin por parte de una sola persona.
El alcance de este captulo incluye la produccin y preparacin magistral de productos farmacuticos para TEP para administracin en humanos para su uso (a) de conformidad con la prctica mdica y farmacutica regulada por el estado, (b) de conformidad con una solicitud de nuevo frmaco en investigacin aprobada (IND, por sus siglas en ingls) (ver el Ttulo 21 del
CFR 312) y (c) de conformidad con los requisitos para uso en estudios cientficos bajo la supervisin de un Comit de Estudios
Cientficos para Frmacos Radioactivos (Radioactive Drug Research Committee o RDRC; ver el Ttulo 21 del CFR 361). El alcance de este captulo no incluye actividades de dispensacin conforme a lo definido en otros captulos generales de la USP.
DEFINICIONES
Las siguientes definiciones se aplican a los trminos y frases empleados en este captulo.
Actividad Especfica: La radioactividad de un radionucleido por unidad de masa del elemento o compuesto. La unidad de
actividad especfica se expresa en unidades de radioactividad por unidad de masa en gramos o en moles, (p.ej., mCi/mg
[MBq/mg], Ci/mmol [GBq/mmol]).
Certificacin del Fabricante: Documentacin que incluye, entre otros, certificados de anlisis, certificados de cumplimiento o certificados de calidad obtenidos del fabricante, proveedor o vendedor de un material o componente, el cual
describe las caractersticas de calidad crticas usadas para determinar la aceptabilidad de uso.
USP 38
Pruebas Fsicas / 823 Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones 675
PERSONAL
Se debe contar con un nmero suficiente de personal con educacin, capacitacin y experiencia apropiadas para la preparacin y anlisis de productos farmacuticos para TEP. El nmero depende del tamao y la complejidad de las operaciones efectuadas en cada instalacin.
Requisitos de Capacitacin: Se debe capacitar al personal antes de que comience a fabricar y a analizar productos farmacuticos para TEP. La capacitacin se puede llevar a cabo mediante diversos mtodos, que incluyen la instruccin presencial, la
instruccin audiovisual y el estudio de publicaciones. La capacitacin debe tratar, pero no limitarse a, tcnicas de produccin
de radionucleidos, mtodos de sntesis y purificacin, materiales, componentes, reactivos, soluciones madre, aparatos automatizados y manuales usados para fabricar productos farmacuticos para TEP, as como mtodos de cc, incluyendo equipos, software y documentacin. La capacitacin se debe documentar.
Capacitacin en Operaciones Aspticas: La capacitacin debe tratar las manipulaciones aspticas y las tcnicas y equipos
usados para lograr y mantener las condiciones ambientales Clase 5 de la International Organization for Standardization (ISO). La
capacitacin tambin debe tratar todas las operaciones aspticas, incluyendo el ensamble de componentes estriles, la preparacin magistral y el filtrado. Las manipulaciones de soluciones estriles deben ser llevadas a cabo por operadores calificados
para el uso de tcnicas aspticas (ver Instalaciones y Equipo a continuacin).
Captulos
Concentracin: La concentracin de radioactividad del frmaco para TEP en el producto farmacutico para TEP por unidad de volumen, determinada al momento de la calibracin. La unidad de concentracin es la cantidad de radioactividad
por unidad de volumen al momento de la calibracin (p.ej., mCi/mL [MBq/mL]).
Control de Calidad (CC): Sistema para analizar la calidad de los componentes, materiales, insumos y productos farmacuticos para TEP mediante procedimientos, pruebas, mtodos analticos y criterios de aceptacin.
Frmaco para TEP: Sustancia radioactiva (ingrediente farmacutico activo) que presenta ncleos inestables de desintegracin espontnea mediante la emisin de positrones y que se incorpora en un producto farmacutico para TEP para producir un efecto directo en el diagnstico o seguimiento de una enfermedad o manifestacin de una enfermedad en humanos, o para el seguimiento del tratamiento de una enfermedad o procedimientos teraputicos (p.ej., terapia para tumores).
Fuera de la Especificacin (OOS, por sus siglas en ingls): Resultado de la prueba de control de calidad para un producto farmacutico para TEP que no cumple con los criterios de aceptacin establecidos.
Garanta de Calidad (GC): Sistema planeado para asegurar, mediante procedimientos, pruebas y mtodos analticos,
que un producto farmacutico para TEP posee la identidad, concentracin, calidad y pureza requeridos para el propsito
esperado.
Liberacin Condicionada Final: Se refiere a una liberacin final para administracin en pacientes antes de haber completado las pruebas requeridas debido a una falla del equipo analtico.
Liberacin de Lnea: Segregacin y limpieza de diferentes reas de procesamiento y trabajo para evitar la contaminacin
cruzada y las mezclas entre la produccin y/o la preparacin magistral de diferentes productos farmacuticos para TEP.
Lote: Cantidad de materiales (p.ej., reactivos, disolventes, gases, columnas de purificacin y dems materiales auxiliares)
que tienen un carcter y calidad uniformes dentro de los lmites especificados y que se usan para fabricar un producto
farmacutico para TEP.
Partida: Cantidad de producto farmacutico para TEP que se supone tiene un carcter y calidad uniformes, dentro de los
lmites especificados, y que se prepara en un solo ciclo operativo de acuerdo con una o ms rdenes de produccin.
Preparacin Magistral: Conforme a lo descrito en la Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos, (Food, Drug and
Cosmetic Act) (1997) Captulo II, Seccin 121 (a) (ii) (1) (B), se refiere a la prctica de sintetizar o formular un producto
farmacutico para TEP, por parte o por orden de un profesional acreditado por un Estado para preparar magistralmente o
para ordenar la preparacin magistral de un producto farmacutico para TEP, y que se prepara magistralmente de conformidad con la ley de dicho Estado, para un paciente o con propsitos de estudios cientficos, de enseanza o de control de
calidad.
Producto Farmacutico para TEP: Forma farmacutica terminada que contiene un frmaco para TEP, sin importar si se
encuentra o no en asociacin con uno o ms ingredientes.
Produccin: Proceso de sntesis o formulacin de un producto farmacutico para TEP que incluye procesamiento, envasado, etiquetado, reprocesamiento y anlisis para investigacin mdica o estudios cientficos.
Subpartida: Cantidad de producto farmacutico para TEP con carcter y calidad uniformes, dentro de los lmites especificados, que se produce durante una sucesin de irradiaciones mltiples, usando una operacin de sntesis o purificacin
determinada. Un grupo de subpartidas forman colectivamente una partida que se supone cuenta con un carcter y calidad uniformes, dentro de los lmites especificados. Las subpartidas pueden ser necesarias para productos farmacuticos
para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas (p.ej., 13N y 15O) debido a que no es posible completar las pruebas de
control de calidad antes de su uso.
Validacin: Confirmacin mediante evidencia documental de que un mtodo, proceso o sistema cumple con los requisitos de desempeo esperados.
Verificacin: Confirmacin de que un mtodo, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptacin predeterminados.
676 823 Frmacos para Tomografa de Emisin de Positrones / Pruebas Fsicas
USP 38
Se debe evaluar peridicamente al personal implicado en operaciones aspticas mediante simulaciones aspticas en las que
se utilice medio de crecimiento microbiolgico para evaluar la calidad de la operacin asptica. Las simulaciones aspticas deben cumplir con lo siguiente:
Incluir todas las manipulaciones requeridas para el montaje asptico del ensamble del vial de producto farmacutico para
TEP (p.ej., vial, filtro y ensamble de jeringa, entre otros).
Representar los casos ms extremos para operaciones aspticas.
Deben realizarse por triplicado para calificar a un nuevo operador. Cada operador debe someterse anualmente a una recalificacin mediante por lo menos un llenado de medios.
Se debe realizar siempre que se presenten cambios significativos en los procedimientos.
Despus del proceso de simulacin, los medios deben estar exentos de contaminacin despus de la incubacin a una temperatura adecuada durante 14 das. Un operador que no apruebe las evaluaciones escritas o cuyas simulaciones aspticas presenten crecimiento microbiano deber ser inmediatamente reinstruido y reevaluado a fin de asegurar la correccin de las deficiencias en su prctica asptica.
Captulos
GARANTA DE CALIDAD
La GC es un concepto amplio que abarca todos los aspectos que influyen en la identidad, concentracin, calidad y pureza
de un producto farmacutico para TEP. El control de calidad es un subconjunto de la GC que trata el anlisis de materiales y de
productos farmacuticos para TEP para determinar si cumplen con los criterios de aceptacin. La funcin de la GC por lo general consiste en actividades de supervisin, mientras que la funcin del control de calidad se basa en actividades de ejecucin.
Las funciones del control de calidad incluyen lo siguiente.
Evaluar cada lote de material entrante para asegurar que cumple con las especificaciones establecidas antes de su uso en
la preparacin o anlisis de productos farmacuticos para TEP.
Evaluar cada partida de un producto farmacutico para TEP para asegurar que sta cumple con las especificaciones establecidas antes de autorizar su liberacin final.
Las funciones de supervisin relacionadas con la GC incluyen lo siguiente:
Revisar los registros de partida una vez completos para verificar su exactitud y que estn completos.
Aprobar procedimientos, especificaciones, procesos y mtodos.
Asegurar que el personal est apropiadamente capacitado y calificado, segn corresponda.
Asegurar que los productos farmacuticos para TEP posean una identidad, concentracin, calidad y pureza suficientemente definidos.
Asegurar que los cambios en la calidad de los componentes, proveedores, cambios en los procedimiento de produccin y
los cambios en los procedimientos de anlisis y especificaciones sean apropiados y que se implementen de manera correspondiente.
Investigar errores y asegurar que se tomen las acciones correctivas y de prevencin correspondientes para prevenir su recurrencia.
Gestin de quejas.
Asegurar que la produccin, anlisis, etiquetado, liberacin y distribucin de los productos farmacuticos para TEP se lleven a cabo de conformidad con los procedimientos y prcticas establecidos en la instalacin para productos farmacuticos para TEP.
Llevar a cabo auditoras peridicas para monitorear el cumplimiento de los procedimientos y prcticas establecidos para
productos farmacuticos para TEP.
El personal de la instalacin puede ejercer funciones tanto de GC como de CC.
INSTALACIONES Y EQUIPO
Las instalaciones deben ser adecuadas para la produccin, preparacin magistral y anlisis de productos farmacuticos para
TEP. Las reas de trabajo deben mantenerse organizadas para evitar contaminacin cruzada, mezclas y errores, especialmente
en las reas usadas para la fabricacin de mltiples productos farmacuticos para TEP. El personal debe limpiar las reas de
trabajo peridicamente para prevenir la contaminacin de equipos, materiales, componentes o productos farmacuticos para
TEP o aquellas condiciones del entorno, que pudieran tener un impacto negativo sobre la calidad del producto farmacutico
para TEP. Estos requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio rutinario de
los mismos.
Controles Ambientales para Productos Farmacuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacuticos parenterales para TEP se obtienen despus de la liberacin, las instalaciones y
equipos deben salvaguardar la esterilidad de un producto farmacutico para TEP.
Estacin de Trabajo AspticaEl control ambiental primario para operaciones aspticas es un filtro de partculas del aire de alta
eficiencia (HEPA, por sus siglas en ingls) capaz de producir aire con un nivel de limpieza ISO Clase 5. Esto se puede lograr con
una estacin de trabajo con flujo de aire laminar, aislador asptico, cabina de seguridad biolgica u otro dispositivo adecuado
(reciben el nombre genrico de estaciones de trabajo aspticas). La estacin de trabajo asptica debe estar protegida de fuentes de contaminacin microbiana y se debe situar en un rea en la que el trnsito de personal sea limitado. El rea circundante
USP 38
Captulos
a la estacin de trabajo asptica no debe usarse para el almacenamiento de materiales que desprendan grandes cantidades de
partculas (p.ej., cajas corrugadas).
La operacin adecuada de la estacin de trabajo asptica se debe certificar midiendo las partculas en el aire, analizando la
integridad del filtro HEPA, analizando la presin diferencial, o por otros medios. Las pruebas especficas a realizar dependen del
tipo de estacin de trabajo asptica. La certificacin debe llevarse a cabo al inicio de las operaciones y, posteriormente, por lo
menos una vez al ao o despus de reparar o reemplazar el filtro HEPA. Estos requisitos reemplazan cualquier otro requisito
provisto en los captulos de informacin general de la USP (p.ej., Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asptico 1116).
El rea de trabajo dentro de la estacin de trabajo asptica debe estar limpia. Las superficies internas deben ser fciles de
limpiar y desinfectar. Las superficies internas se deben limpiar y desinfectar usando desinfectantes apropiados esterilizados por
filtracin o con certificacin de esterilidad demostrada mediante certificado del fabricante.
Pruebas MicrobiolgicasSe deben llevar a cabo pruebas microbiolgicas del ambiente para evaluar la calidad del aire y la desinfeccin de la superficie de las reas aspticas. Esto se puede lograr mediante placas de muestreo por sedimentacin o con
placas activas para muestreo de aire. La desinfeccin de superficies crticas (p.ej., la superficie de trabajo de la estacin de trabajo asptica o los dedos del operador) se debe evaluar con un hisopo o placas de contacto. Para el anlisis microbiolgico de
la estacin de trabajo asptica, se debe analizar el aire como parte de la calificacin de la estacin de trabajo (p.ej., semestralmente), mientras que la superficie se debe evaluar (usando un hisopo o placas de contacto) despus de su uso, cada da de
uso. Los recuentos de partculas no viables se pueden determinar con menor frecuencia despus de la certificacin de la Estacin de Trabajo Asptica (ver anteriormente).
Se deben establecer lmites de alerta e intervencin para muestras obtenidas durante las pruebas microbiolgicas. Los niveles
de alerta tpicos se establecen a menos de tres unidades formadoras de colonias (ufc) por placa. Ms de tres ufc requieren
acciones correctivas que pueden incluir la recapacitacin del operador, recertificacin de la estacin de trabajo asptica u otras
acciones. Los resultados de las pruebas microbiolgicas tambin deben usarse para la investigacin de pruebas de esterilidad
positivas.
Equipo: El equipo usado para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP debe ser apropiado para el propsito al
que se destina y se debe instalar, limpiar y mantener de la manera correspondiente. El equipo debe ser capaz de producir resultados uniformes.
Los siguientes requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio de los mismos.
1. Instalacin de Equipo NuevoEl equipo recin instalado debe ser calificado con suficiente detalle antes de usarlo en la fabricacin o anlisis de productos farmacuticos para TEP, basndose en la complejidad del equipo. Todas las actividades
de calificacin deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llev a cabo la calificacin. Para equipos ms complejos, la calificacin consiste en tres fases:
Calificacin de la Instalacin (CI)La CI es una verificacin de los puntos requeridos para la instalacin apropiada del
equipo, los cuales incluyen ubicacin fsica, servicios e insumos requeridos, interfases y condiciones ambientales. La
CI debe describir el procedimiento de instalacin para el equipo.
Calificacin Operativa (CO)La CO es una verificacin de las especificaciones operativas del equipo, las cuales incluyen configuracin del equipo, pruebas de funcionalidad de subsistemas y la operacin general adecuada. La CO debe describir los procedimientos operativos para el equipo.
Calificacin del Desempeo (CD)La CD demuestra que el equipo es capaz de realizar las tareas requeridas para la
fabricacin y anlisis de productos farmacuticos para TEP en el ambiente operativo y que el equipo proporciona los
resultados pretendidos. La CD debe describir las tareas que el equipo debe desempear.
2. Calibracin del EquipoLa calibracin del equipo analtico se debe llevar a cabo antes de su uso, segn corresponda. Se
debe desarrollar un programa de recalibracin que cuente con una frecuencia suficiente para asegurar resultados exactos.
Las actividades de calibracin deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona
que llev a cabo la calibracin.
3. Mantenimiento Preventivo del EquipoSe debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo para equipo importante de produccin y anlisis, incluyendo mdulos de anlisis qumicos automatizados, cromatgrafos de gases, cromatgrafos de lquidos de alta resolucin, entre otros. El programa debe contar con una frecuencia suficiente para minimizar
el tiempo de inactividad del equipo. Las reparaciones serias pueden requerir recalibracin y recalificacin. Las actividades
de mantenimiento preventivo deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha de la accin y el nombre
de la persona que la llev a cabo.
Limpieza de Equipos y Componentes: El equipo usado en la produccin o preparacin magistral de productos farmacuticos para TEP incluye dispositivos automatizados controlados por computadoras, as como aparatos de operacin manual. Antes de su uso en la fabricacin de productos farmacuticos para TEP, el equipo debe limpiarse de manera apropiada para asegurar que el producto farmacutico para TEP resultante cumpla con las especificaciones establecidas de identidad, concentracin, calidad y pureza (ver Controles y Criterios de Aceptacin para Productos Farmacuticos para TEP Terminados a continuacin).
Una vez limpio, el equipo debe mantenerse en dicho estado antes de su uso.
Es posible utilizar el equipo para fabricar mltiples partidas de uno o ms productos farmacuticos para TEP. Por lo que se
debe demostrar mediante estudios documentados la efectividad de los procesos de limpieza entre partidas. Se deben controlar
todas las impurezas a niveles que cumplan con las especificaciones establecidas para identidad, concentracin, calidad y pure-
Captulos
USP 38
za. Los procedimientos escritos para la liberacin de lneas entre partidas de diferentes productos farmacuticos para TEP deben describir la realizacin de los procesos de limpieza.
Verificaciones en el Da de Uso: Son necesarias ciertas verificaciones en el da de uso para asegurar el funcionamiento apropiado del equipo de procesamiento. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las verificaciones en el da de
uso. Estos procedimientos deben estar diseados para verificar parmetros clave al inicio de cada ciclo de operaciones (p.ej.,
temperatura, integridad de la presin, suministro de gas, suministro de vaco, seleccin de lnea de entrega apropiada, volmenes de entrega de reactivos, velocidades de flujo de gases, monitores de radiacin y dems sensores del proceso). Algunos
parmetros pueden verificarse peridicamente como parte de los programas de calibracin y mantenimiento preventivo, segn se describi anteriormente.
Aptitud del Sistema para Equipo de CC: Las pruebas de aptitud del sistema para el equipo de CC son necesarias para asegurar que el conjunto de equipo, sus componentes y el personal operador (es decir, el sistema considerado como un todo)
funcionen apropiadamente para ejecutar el mtodo analtico deseado. Las pruebas de aptitud del sistema se deben realizar
antes de usar el equipo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos
para las pruebas de aptitud del sistema, y se deben documentar los resultados de dichas pruebas.
Las pruebas de aptitud del sistema requeridas para mtodos cromatgraficos incluyen factor de asimetra, inyecciones repetidas y resolucin. Cuando el cromatograma de prueba usado para la aptitud del sistema contiene un nico pico, entonces el
factor de asimetra, las inyecciones repetidas y la eficiencia de la columna (platos tericos) son suficientes. Para estas determinaciones, es necesario el uso de estndares internos o externos con una concentracin conocida. Los estndares deben prepararse a partir de materiales bien caracterizados o materiales certificados por el fabricante. A continuacin se presentan dos enfoques aceptables que se pueden usar para mtodos cromatogrficos:
1. Crear una curva de calibracin a partir de una serie de estndares en un intervalo de concentraciones conocidas. Las concentraciones de los estndares deben comprender las condiciones de uso para el mtodo cromatogrfico. La curva de calibracin se debe utilizar durante un periodo adecuadamente especificado (p.ej., seis meses), despus del cual se debe
crear una nueva curva de calibracin. Se debe crear una nueva curva de calibracin cada vez que se altere el sistema cromatogrfico. La aptitud del sistema de rutina para inyecciones repetidas consiste en una sola inyeccin de un estndar
conocido y una medicin de la concentracin basada en la curva de calibracin. Si la concentracin medida concuerda
con la concentracin conocida dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10% para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas) esto demuestra la aptitud del sistema en inyecciones repetidas y asegura que la curva de calibracin es apropiada para su uso en inyecciones de muestra subsiguientes. El factor de asimetra y la resolucin (o eficiencia de la columna, segn corresponda) se deben determinar a partir del mismo cromatograma.
2. Al inicio de cada ciclo de anlisis, crear una calibracin de un solo punto, a partir de dos inyecciones de un estndar conocido. El rea medida de los picos para estas inyecciones debe concordar dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10%
para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas). Posteriormente, los resultados se promedian y utilizan
con la concentracin estndar para proporcionar un factor de calibracin que se usa en inyecciones de muestra subsiguientes para ese da. El factor de asimetra y la resolucin (o eficiencia de la columna, segn corresponda) se deben determinar a partir de uno de los dos cromatogramas.
Otros parmetros cromatogrficos, tales como la relacin seal-ruido, el lmite de deteccin y el lmite de cuantificacin, se
pueden determinar como parte de un anlisis rutinario de la aptitud del sistema.
Las pruebas de aptitud del sistema tambin pueden ser apropiadas para otro equipo de CC, incluyendo calibradores de dosis, escneres para radiocromatografa en capa delgada (radioTLC) y analizadores multicanal. Cuando se utilizan, estas pruebas deben realizarse al momento de instalar, reubicar y, posteriormente, en intervalos apropiados. En estas pruebas, se deben
usar estndares conocidos para demostrar el funcionamiento apropiado del equipo, por ejemplo:
1. Calibrador de DosisLa exactitud, geometra y linealidad se deben evaluar al momento de la instalacin y, posteriormente, en intervalos apropiados. El instrumento debe calibrarse de conformidad con estndares reconocidos a nivel nacional o
con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificacin de constancia con una fuente de radionucleidos de alta energa adecuada.
2. Escner para RadioTLCLa unformidad, exactitud posicional, linealidad del detector y resolucin se deben evaluar con
una fuente de radionucleido adecuada. La prueba de aptitud del sistema de rutina debe incluir verificaciones para estos
parmetros.
3. Analizador MulticanalLa sensibilidad y la resolucin se deben evaluar al momento de la instalacin y, posteriormente, en
intervalos apropiados. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificacin de constancia con una
fuente de radionucleidos de alta energa adecuada.
CONTROL DE COMPONENTES, MATERIALES E INSUMOS

Se deben controlar los componentes, materiales e insumos que se usan en la preparacin de productos farmacuticos para
TEP para evitar la contaminacin, mezclas y errores. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas
actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de exmenes y pruebas completados para
componentes, materiales e insumos se deben conservar durante un ao despus de su vencimiento o durante un ao despus
de la liberacin del lote, lo que represente el periodo ms largo. Es necesario establecer y llevar a cabo las siguientes actividades:
USP 38
CONTROLES DE PROCESO Y OPERATIVOS

Controles de Proceso: Los siguientes controles de proceso deben establecerse y resumirse en una frmula maestra para el
producto farmacutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada.
1. Se deben establecer criterios de aceptacin escritos para la identidad, concentracin, calidad y pureza de cada producto
farmacutico para TEP. Para productos farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral, las especificaciones deben incluir esterilidad y endotoxinas bacterianas. Cuando existe una monografa de la USP o cuando existen especificaciones previamente aceptadas por la agencia reglamentaria correspondiente (p.ej., FDA), entonces estos estndares, si corresponde, pueden utilizarse como los criterios de aceptacin mnimos.
2. Los procedimientos escritos para la preparacin de cada producto farmacutico para TEP deben incluir lo siguiente:
Incorporar, para cada producto farmacutico para TEP destinado para administracin parenteral, filtracin por membrana estril (0,22 mm) o esterilizacin por vapor;
Incorporar, para cada producto farmacutico para TEP destinado para inhalacin, filtracin de partculas (0,45 mm);
Describir procedimientos de limpieza de rutina para el equipo y las instalaciones;
Describir componentes, materiales e insumos usados para fabricar productos farmacuticos para TEP, incluyendo precursores, estndares, reactivos, soluciones madre y artculos relacionados;
Describir el proceso y los pasos empleados para fabricar el producto farmacutico para TEP;
Describir el proceso de formulacin, incluyendo el uso de estabilizadores, soluciones amortiguadoras y otros agentes;
Describir los clculos realizados para parmetros cuantitativos relacionados con la fabricacin y el anlisis de CC del
producto farmacutico para TEP (p.ej., incluir rendimiento radioqumico, pureza radioqumica, actividad especfica,
cantidades de disolvente, etc.);
Describir pruebas de control de calidad para el producto farmacutico final para TEP (ver Controles y Criterios de Aceptacin para Productos Farmacuticos para TEP Terminados a continuacin), incluyendo un programa que defina las
pruebas que se deben realizar para cada partida y que indique si los resultados deben estar completados al momento
de la liberacin.
Captulos
1. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de ingredientes, reactivos, materiales diana y gases.
2. Establecer especificaciones escritas para la identidad y calidad de viales vacos estriles, lneas de transferencia, llaves de
paso estriles, agujas estriles, filtros de membrana estriles y otros componentes usados en el ensamble del vial del producto farmacutico para TEP.
3. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de insumos analticos (p.ej., disolventes, columnas cromatogrficas y estndares autnticos), medios de pruebas de esterilidad y reactivos para pruebas de
endotoxinas usados en el anlisis de productos farmacuticos para TEP.
4. Establecer condiciones de almacenamiento apropiadas (basadas en calor, luz, humedad y otros factores) para componentes, materiales e insumos usados para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP.
5. Almacenar componentes, materiales e insumos en un rea con acceso controlado, de acuerdo con las condiciones de almacenamiento establecidas. Segregar componentes, materiales e insumos, segn corresponda, para evitar mezclas y errores.
6. Anotar cada lote de envo de componentes, materiales e insumos, y registrar la fecha de recepcin, cantidad recibida,
fabricante, nmero de lote del fabricante y fecha de caducidad. Si el fabricante no designa una fecha de caducidad, asignar una basndose en el conocimiento de sus propiedades fsicas y qumicas y en la experiencia de uso previa. Para sustratos orgnicos y reactivos que son potencialmente susceptibles a la degradacin o a cambios en su composicin, la fecha
de caducidad se debe basar en la estabilidad del material.
7. Determinar que cada lote de componentes, materiales e insumos cumple con las especificaciones escritas establecidas. El
cumplimiento de las especificaciones se puede demostrar inspeccionando el etiquetado o inspeccionando la certificacin
del fabricante. La identidad de cada lote de componentes, materiales e insumos debe ser verificada mediante procedimientos y pruebas definidas, o con la certificacin documentada del fabricante, segn corresponda. Realizar una prueba
de identidad para precursores (p.ej., determinacin del punto de fusin u otras pruebas adecuadas). Como alternativa, se
puede usar la certificacin del fabricante como el nico criterio de aceptacin para un precursor, si se asegura mediante el
anlisis del producto farmacutico para TEP que se ha utilizado el precursor correcto. Los estndares de referencia usados
en los procedimientos cromatogrficos deben contar con documentacin adecuada sobre identidad y pureza. Se pueden
aceptar otros componentes basndose nicamente en la certificacin del fabricante.
8. Los filtros de membrana usados con productos farmacuticos parenterales para TEP deben contar con la certificacin del
fabricante. Examinar la certificacin del fabricante para cada lote a fin de asegurar el cumplimiento de la especificaciones
escritas.
9. Los medios usados en las pruebas de esterilidad de productos farmacuticos para TEP se pueden obtener de fuentes comerciales. Si los medios se obtienen de fuentes comerciales, entonces la prueba de promocin de crecimiento que emplea
una sola especie de organismo adecuada se debe llevar a cabo durante la calificacin inicial del proveedor y, en adelante,
peridicamente (p.ej., trimestralmente).
Captulos
USP 38
3. Se debe verificar la calidad de cada partida de un producto farmacutico para TEP, mediante el anlisis del producto terminado total, antes de su uso para asegurar que el producto cumple con todas las especificaciones.
4. Para los casos en los que no sea posible o prctico llevar a cabo el anlisis descrito en el prrafo anterior, la calidad de un
producto farmacutico para TEP tambin se puede asegurar mediante estudios de validacin documentados, en lugar de
pruebas previas a la liberacin. Estos estudios deben cumplir con lo siguiente:
Demostrar que el proceso es uniforme y adecuado para la preparacin del producto farmacutico para TEP deseado;
Realizarse en tres partidas fabricadas de acuerdo con la frmula maestra, en donde todas estas partidas deben cumplir con los criterios de aceptacin;
Incluir la evaluacin de identidad y pureza radioqumica, identidad y pureza radionuclidica, actividad especfica, esterilidad (para productos farmacuticos parenterales para TEP), endotoxinas bacterianas (para productos farmacuticos parenterales para TEP), pH, apariencia, pureza estereoqumica (para compuestos aplicables), disolventes residuales, otros productos qumicos txicos que pudieran haberse usado durante el procedimiento de sntesis o purificacin, concentracin efectiva de un estabilizante (si lo hubiere), pureza qumica del producto farmacutico para TEP y
equivalencia de subpartidas iniciales y finales (ver la seccin anterior, Definiciones);
Repetirse si el proceso y los pasos descritos en la frmula maestra han sido alterados de alguna manera que pudiera
cambiar la identidad, concentracin, calidad o pureza del producto farmacutico para TEP;
5. Los procesos y pasos descritos en la frmula maestra deben actualizarse segn se requiera y revisarse anualmente para
asegurar su vigencia. Antes de implementar cualquier actualizacin, ser necesario llevar a cabo y aprobar una validacin
y/o verificacin.
Los controles apropiados de los equipos controlados por computadora deben asegurar que los cambios en el proceso sean
instituidos nicamente por personal autorizado y que tales cambios sean documentados y verificados. Es indispensable crear
copias de seguridad y controlar los mtodos de produccin, preparacin magistral y anlisis para evitar el uso accidental de
mtodos desactualizados. En lo que respecta a procesos o mtodos de prueba de un proveedor que se usan sin alteraciones, es
aceptable basarse en la certificacin del proveedor para la verificacin del software y la operacin adecuada.
Controles Operativos: Los controles operativos siguientes deben establecerse y resumirse en un registro de partida que es
una parte de la frmula maestra para el producto farmacutico para TEP. El registro de partida debe documentar de manera
adecuada el proceso de rutina para la fabricacin del producto farmacutico para TEP. Se debe designar a una persona como
responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de partida
completados y la documentacin relacionada deber conservarse durante un ao despus de la liberacin de partida.
1. Se deben ejecutar los procedimientos de liberacin de lnea adecuados para evitar mezclas y contaminacin cruzada, que
incluyan la inspeccin de reas usadas para fabricar y analizar productos farmacuticos para TEP y la inspeccin de la limpieza y aptitud de todo el equipo antes de su uso. Retirar materiales y etiquetas que no correspondan a la partida de estas
reas y equipos.
2. Asegurar la identidad, concentracin, calidad y pureza correctos de componentes, materiales e insumos usados en la preparacin del producto farmacutico para TEP. Etiquetar componentes segn corresponda para propsitos de identidad y
rastreabilidad.
3. Ejecutar procedimientos de limpieza de rutina para los equipos e instalaciones.
4. Preparar el producto farmacutico para TEP de acuerdo con la frmula maestra vigente y mantener un registro de partida
para cada partida. Los registros de partida pueden constar de documentacin en papel, registros electrnicos o una combinacin de los mismos. Se deben verificar las planillas de clculo y dems herramientas electrnicas para conservacin de
registros, a fin de asegurar la rastreabilidad, integridad de los datos, exactitud de resultados para clculos, entre otros. El
registro de partida debe incluir lo siguiente:
Los nmero de lote u otros identificadores nicos para todos los componentes, materiales e insumos usados para fabricar el producto farmacutico para TEP;
Una descripcin de los procedimientos individuales realizados;
Las iniciales, firma u otro identificador del individuo responsable de confirmar que se hayan completado los pasos y
procesos crticos usados para fabricar y analizar el producto farmacutico para TEP;
El rendimiento porcentual calculado con respecto a la cantidad conocida o esperada del radionucleido inicial que se
incorpora sintticamente al producto farmacutico para TEP;
Los datos analticos brutos de cada partida de producto farmacutico para TEP;
Etiquetado para el producto farmacutico para TEP (ver Etiquetado a continuacin);
Clculos para parmetros clave definidos en la frmula maestra;
Resultados obtenidos de las pruebas de control de calidad del producto farmacutico para TEP, incluyendo cromatogramas, listados impresos y dems datos de prueba;
Las iniciales del analista que realiz cada prueba de control de calidad;
Indicacin del resultado de cada prueba de control de calidad, indicando si el resultado cumple o no con los criterios
de aceptacin;
La fecha y hora de la liberacin y la firma del individuo que asume la responsabilidad general y el cumplimiento con
los procedimientos definidos para fabricar la partida y que autoriza la liberacin de la partida para administracin en
humanos; y
Documentacin de las desviaciones del proceso en el registro de partida, cuando corresponda.
USP 38
ESTABILIDAD
Se deben establecer especificaciones escritas para la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada producto farmacutico para TEP. La fecha de caducidad debe basarse en los resultados de las pruebas de estabilidad (y en requisitos de actividad especficos, segn corresponda). Las pruebas de estabilidad del producto farmacutico para TEP se deben llevar a cabo a la concentracin ms alta del producto farmacutico para TEP y en el vial o envase final previsto. Se deben almacenar por lo menos tres partidas del producto farmacutico para TEP de acuerdo con las condiciones propuestas y debern
examinarse una vez transcurrido un periodo equivalente a la vida til propuesta. Asimismo, el producto farmacutico para TEP
debe cumplir con los criterios de aceptacin para pureza radioqumica, apariencia (color y claridad), pH y efectividad del estabilizante (segn corresponda) y pureza qumica al momento de la caducidad. Los mtodos analticos deben ser confiables, significativos y especficos. Los estudios de estabilidad deben repetirse si se presenta un cambio en la concentracin, en el contenido de estabilizante (o conservante) que pudiera afectar la estabilidad, el vial o envase final, las condiciones de almacenamiento o la fecha de caducidad. Se deben documentar los resultados de las pruebas de estabilidad.
Captulos
Las entradas en los registros de partida se deben realizar inmediatamente despus de haber llevado a cabo la actividad y
deben incluir las iniciales, firma u otro identificador de la persona que registra la entrada. Las correcciones a las entradas en
papel deben incluir fechas e iniciales, firmas o anotaciones con un identificador de la persona que efecta las correcciones pero
dejando la entrada original legible.
Operaciones Aspticas para Productos Farmacuticos Parenterales para TEP: Debido a que los resultados de las pruebas
de esterilidad para productos farmacuticos parenterales para TEP se obtienen despus de la liberacin para administracin en
humanos, las operaciones y procedimientos aspticos deben asegurar de manera adecuada la esterilidad del producto farmacutico para TEP estril. Todos los productos farmacuticos para TEP preparados aspticamente para administracin parenteral
se deben filtrar a travs de un filtro de membrana estril con un tamao de poro de 0,22 mm o menor en un vial o envase
cerrado estril o esterilizado mediante esterilizacin por vapor. Aunque la sntesis qumica de un producto farmacutico parenteral para TEP se puede llevar a cabo en un aparato abierto o cerrado, la filtracin por membrana del producto farmacutico
para TEP se debe realizar en un sistema cerrado posterior al filtro de membrana. Este sistema se debe ensamblar aspticamente, usando componentes preesterilizados, disponibles comercialmente.
ComponentesLos componentes estriles usados en el aparato ensamblado aspticamente, por lo general, consisten en un vial
vaco, agujas, filtros de membrana, agujas de venteo, jeringas, sistemas de tubos, llaves de paso, entre otros. Todos los componentes deben ser artculos preesterilizados disponibles comercialmente y de un solo uso. Si los componentes del aparato ensamblado aspticamente se esterilizan en la instalacin donde se lleva a cabo la TEP, se deben verificar los procesos de esterilizacin. La configuracin exacta del ensamble del vial de producto farmacutico para TEP depende de cada proceso. Un ejemplo tpico es un vial vaco, estril, con un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,22 mm, unido a una aguja que se
inserta a travs del septo del vial para filtracin, un filtro de membrana con un tamao de poro de 0,22 mm unido a una aguja
que se inserta a travs del septo del vial para ventear el vial durante la filtracin, y una jeringa con una aguja insertada a travs
del septo del vial para retirar la muestra de control de calidad despus de completar la filtracin.
Ensamble del Vial de Producto Farmacutico para TEPSe deben usar tcnicas aspticas en el ensamblaje del vial de producto
farmacutico para TEP, especialmente en el ensamble de todos los componentes subsiguientes al filtro de esterilizacin por
membrana. Estas operaciones deben llevarse a cabo en un ambiente ISO Clase 5 (ver la seccin anterior, Instalaciones y Equipo).
Despus de ensamblar el vial de producto farmacutico para TEP en el ambiente ISO Clase 5, el ensamble puede ser retirado
hacia otra localizacin para filtracin. Esta ubicacin puede ser un ambiente no controlado siempre que no se comprometa
durante el proceso la integridad del ensamble del vial de producto farmacutico para TEP. Todo ensamble de vial de producto
farmacutico para TEP cuya integridad se vea comprometida durante dicho proceso, deber ser desechado.
Tcnicas AspticasCualquier componente estril posterior al filtro de membrana que entre en contacto con el producto farmacutico para TEP, deber manipularse usando tcnicas aspticas adecuadas, dentro de la estacin de trabajo asptica. Durante las operaciones aspticas, los operadores deben usar vestimentas adecuadas, que incluyen una bata de laboratorio limpia, mangas para antebrazos, cubre cabello, guantes higienizados que cubran las muecas y cubrebarbas/bigote (segn corresponda). Durante un solo ciclo operativo asptico es posible preparar mltiples ensambles de viales de productos farmacuticos para TEP. Las condiciones de almacenamiento y el tiempo de ensamble de los viales debe basarse en datos obtenidos de
simulaciones aspticas.
Inoculaciones para Pruebas de EsterilidadSe deben llevar a cabo pruebas de esterilidad para evaluar la calidad de los productos
farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral. La inoculacin de los medios para pruebas de esterilidad se
debe realizar de tal manera que se ajuste a los requisitos de exposicin del personal a la radiacin, al tiempo que minimice el
riesgo de falsos positivos ocasionados por contaminacin adventicia durante el proceso de inoculacin. Para tubos de medios
con abertura mediante tapa de rosca, la inoculacin se debe realizar en la estacin de trabajo asptica. Los tubos de medios
con una tapa de septo se pueden inocular en un rea blindada que no contenga un filtro HEPA.
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Captulos
CONTROLES Y CRITERIOS DE ACEPTACIN PARA PRODUCTOS FARMACUTICOS PARA TEP

TERMINADOS
Se deben establecer especificaciones escritas para la identidad, concentracin, calidad y pureza de cada producto farmacutico para TEP. Para productos farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral, se deben incluir especificaciones sobre esterilidad y endotoxinas bacterianas.
Se deben desarrollar procedimientos escritos para pruebas de control de calidad. Se deben establecer requisitos sobre control de calidad y documentacin para cada partida o subpartida de un producto farmacutico para TEP (ver la seccin anterior,
Controles de Proceso y Operativos). Todas las pruebas de control de calidad deben ser ejecutadas por personal calificado y capacitado de acuerdo con los procedimientos escritos.
La corta vida media de los radionucleidos para TEP con frecuencia impide completar todas las pruebas de control de calidad
antes del envo del producto farmacutico para TEP, lo que genera dos niveles de liberacin, uno para distribucin y el otro
para administracin en humanos. Lo anterior es aceptable siempre y cuando las pruebas de control de calidad requeridas para
la liberacin del producto farmacutico para TEP para administracin en humanos (ver a continuacin) se completen antes de
la administracin. Los controles usados en la liberacin para distribucin debern establecerse previamente por escrito y documentarse de manera rutinaria. No es necesario conservar muestras de reserva de productos farmacuticos para TEP.
Cuando se usa un procedimiento farmacopeico de la USP, ste deber ser verificado para demostrar que la prueba funciona
en las condiciones de uso reales. Los procedimientos de prueba no farmacopeicos usados para analizar un producto farmacutico para TEP deben ser confiables y especficos. Los datos que respaldan todos los mtodos analticos deben estar documentados. Algunas pruebas de control de calidad se pueden omitir basndose en datos obtenidos de controles realizados durante el
proceso o de estudios realizados sobre el proceso. Un ejemplo de este tipo de procedimiento es la exencin de la determinacin de clorodesoxiglucosa cuando se analiza [18F]fludesoxiglucosa. Se deben documentar los controles durante el proceso y
los datos que respaldan los estudios realizados sobre los procesos.
Pruebas de Control de Calidad: Las siguientes pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo en cada partida antes
de su liberacin para adminstracin:
1. Apariencia mediante inspeccin visual del color y transparencia (ausencia de partculas) para formas farmacuticas parenterales.
2. Medicin del pH para formas farmacuticas parenterales.
3. Determinacin de la pureza radioqumica e identidad para todas las formas farmacuticas.
4. Determinacin de la identidad radionuclidica de todas las formas farmacuticas por medicin de vida media.
5. Determinacin de la concentracin.
6. Determinacin de la actividad especfica de productos farmacuticos para TEP cuya localizacin sea dependiente de la
masa o cuya toxicidad sea preocupante.
7. Determinacin de disolventes residuales usados en los procesos de sntesis o purificacin.
8. Determinacin de la pureza qumica y compuestos residuales usados en los procesos de sntesis o purificacin (p.ej., el
criptando [2.2.2]).
9. Determinacin de conservante o estabilizante, si estuvieran presentes.
Para productos farmacuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, preparar una subpartida inicial para control
de calidad que sea representativa de las subpartidas subsiguientes que se preparan en un ciclo operativo definido. Las pruebas
de control de calidad descritas en el prrafo anterior se deben tomar en cuenta para la subpartida de control de calidad antes
de la liberacin de subpartidas subsiguientes para administracin en humanos. Para partidas subsiguientes de formas farmacuticas parenterales y de inhalacin, se debe llevar a cabo una inspeccin visual antes de la administracin en humanos. En
algunos casos, puede ser apropiado realizar un anlisis limitado de cada subpartida antes de su administracin (p.ej., determinacin de pH en el caso de [13N]amonaco producido por la aleacin de Devarda).
Pruebas Peridicas Indicadoras de Calidad: En todos los productos farmacuticos para TEP, se debe medir peridicamente
la pureza radionuclidica de muestras desintegradas del producto, a fin de evaluar la presencia de radionucleidos de vida larga
producidos durante el bombardeo con el acelerador de partculas. En productos farmacuticos para TEP marcados con ciertos
radionucleidos (p.ej., 94mTc, 124I, 64Cu, 76Br, entre otros), se deber considerar la medicin de pureza radionuclidica mediante
espectrometra por emisin de rayos gamma. Las pruebas peridicas indicadoras de calidad de productos farmacuticos para
TEP tambin incluyen impurezas no txicas de bajo nivel (p.ej., disolventes residuales Clase 3). Las pruebas peridicas deben
llevarse a cabo en intervalos predeterminados en lugar de partida por partida.
Pruebas Microbiolgicas para Productos Farmacuticos para TEP Estriles: Para productos farmacuticos para TEP destinados para administracin parenteral, realizar las siguientes pruebas de control de calidad, adems de las descritas anteriormente:
1. Determinar la integridad del filtro de membrana. Las unidades de filtro usadas para esterilizar productos farmacuticos
para TEP deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como por ejemplo, la prueba de
punto de burbuja. La prueba de integridad del filtro se realiza despus de completar la filtracin y antes de liberar el producto farmacutico para TEP para administracin en humanos. En el caso de productos farmacuticos para TEP con
T1/2 < 10 minutos, el producto farmacutico para TEP se puede liberar para administracin en humanos antes de completar la prueba de integridad del filtro. En este caso, la prueba debe completarse lo ms pronto posible, despus de la liberacin.
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PRODUCTOS FARMACUTICOS PARA TEP QUE NO CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES

Cuando el resultado de una prueba de control de calidad para un producto farmacutico para TEP no cumple con los criterios de aceptacin establecidos, el resultado se considera fuera de la especificacin. Un resultado fuera de la especificacin no
necesariamente significa que el producto farmacutico para TEP es fallido y que debe rechazarse, sino que se debe llevar a
cabo una investigacin para resultados fuera de la especificacin a fin de determinar si dicho resultado indica una falla real o
un error analtico.
Si la investigacin de los resultados fuera de especificacin determina que dicho resultado fue ocasionado por un error analtico, se debe invalidar la prueba original. Si hay una impresin de los resultados de la prueba, se debe marcar dicho resultado
impreso como invlido, conservarlo en el registro de partida y repetir la prueba.
Si la investigacin de los resultados fuera de especificacin determina que dicho resultado fue una falla real, la partida deber ser rechazada y no se podr liberar para administracin en humanos. Segregar la partida para evitar que sea utilizada. Investigar todas las fallas y documentar los resultados de acuerdo con los procedimientos escritos. La investigacin debe incluir, entre otros elementos, la evaluacin de procesos, operaciones y registros de partidas previas, as como quejas y dems fuentes de
informacin pertinentes. De ser posible, se debe asignar una causa real o probable a la falla, adems de documentar las acciones correctivas tomadas como resultado de la investigacin. Dependiendo de la naturaleza de la falla, el producto farmacutico para TEP puede reprocesarse de acuerdo con los procedimientos escritos preestablecidos (ver la seccin Reprocesamiento a
continuacin).
Captulos
2. Efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas en cada partida o subpartida de control de calidad de un producto farmacutico para TEP. La prueba se puede llevar a cabo usando los procedimientos reconocidos en la USP (ver Prueba de
Endotoxinas Bacterianas 85). Independientemente de la prueba que se utilice, sta debe iniciarse antes de la liberacin de
cada partida para administracin en humanos. Para productos farmacuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy
cortas, completar la prueba en la subpartida de control de calidad antes de la liberacin de subpartidas subsiguientes para
administracin en humanos. Luego de haber registrado el xito de una prueba de endotoxinas bacterianas en un producto farmacutico para TEP en particular, slo ser necesario analizar la primera partida de cada da para dicho producto.
3. Efectuar una prueba de esterilidad en cada partida o en cada subpartida de control de calidad. La prueba de esterilidad
consiste en la inoculacin e incubacin de una muestra en cada uno de dos medios: caldo tripticasa de soja y tioglicolato
lquido. El volumen inoculado se puede ajustar para evitar prdidas excesivas debidas a la prueba de esterilidad (p.ej., 0,1
mL inoculados en 10 mL de medio). El periodo de incubacin para pruebas de esterilidad debe comenzar dentro de las
30 horas posteriores a la filtracin por membrana. Las muestras se pueden inocular inmediatamente despus de completar la filtracin por membrana, o se puede dejar que se deterioren en un rea blindada durante un mximo de 30 horas
antes de la inoculacin. Se permite exceder el periodo de 30 horas debido a fines de semana o das feriados siempre y
cuando se demuestre que dicha extensin no reduce de manera significativa la viabilidad de un organismo indicador adecuado en la muestra. La prueba de esterilidad se puede llevar a cabo usando otros procedimientos reconocidos en la USP
(ver Pruebas de Esterilidad 71). Las muestras deben analizarse individualmente y no se pueden combinar. Una vez que se
haya establecido el registro de una prueba de esterilidad exitosa para un producto farmacutico para TEP en particular,
slo ser necesario analizar la primera partida preparada cada da para dicho producto farmacutico para TEP.
Pruebas de Liberacin Condicionada Final: Puede ser apropiado liberar condicionalmente una partida cuando no sea posible completar una prueba de control de calidad requerida para un producto farmacutico para TEP debido a una falla en el
equipo de anlisis. Los productos farmacuticos para TEP no pueden ser liberados sin determinar su identidad y pureza radioqumicas. La partida puede liberarse siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
1. Revisar los datos histricos de control de calidad para evaluar la frecuencia de resultados fuera de la especificacin o fallas
relacionadas con la prueba de control de calidad. La liberacin condicionada es apropiada nicamente cuando los datos
histricos develan un registro de culminacin exitosa de la prueba de control de calidad.
2. Confirmar que los criterios de aceptacin se cumplen para todas las dems pruebas de control de calidad para la partida.
3. Conservar una muestra de la partida que es objeto de liberacin condicionada.
4. Corregir lo antes posible la falla del equipo de prueba.
5. Completar la prueba de control de calidad omitida en la muestra lo ms pronto posible, despus de que se haya corregido la falla. Este ltimo paso no ser necesario si el resultado del control de calidad omitido es intrascendente una vez que
el producto farmacutico para TEP se haya desintegrado.
6. Si la muestra no pasa la prueba de control de calidad omitida, notificar inmediatamente al mdico o a la instalacin receptora que orden el producto farmacutico para TEP.
7. Documentar todas las acciones relacionadas con la liberacin condicionada del producto farmacutico para TEP, incluyendo la justificacin de la liberacin, los resultados de la prueba completada, as como cualquier notificacin y accin correctiva y preventiva que haya resultado del incidente.
Adems de la prueba de control de calidad terminada, otras determinaciones de laboratorio apropiadas pueden implicar lo
siguiente: anlisis durante el proceso de un atributo que sea equivalente al anlisis del producto terminado de dicho atributo;
monitoreo estadstico continuo del proceso; o una combinacin de estos procedimientos con el anlisis concluido de cada producto farmacutico para TEP.
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Cuando una prueba de esterilidad de un producto farmacutico para TEP presenta seales de crecimiento microbiano, el
resultado de la prueba se considera fuera de especificacin, por lo que deber ser investigado. Una vez completada la investigacin, notificar de inmediato a todas las instalaciones receptoras si el producto no cumple con el criterio de esterilidad, incluyendo los hallazgos microbiolgicos de la investigacin.
REPROCESAMIENTO
Si un producto farmacutico para TEP es rechazado debido a una falla real, la partida podra reprocesarse de acuerdo con los
procedimientos establecidos. Aunque resulta imposible describir todas las operaciones de reprocesamiento, a continuacin se
presentan algunos ejemplos:
Ajuste de pH;
Cuando se presente una prueba de integridad del filtro fallida, un segundo pasaje a travs de un filtro de membrana; y
Un segundo pasaje por una columna de purificacin para eliminar una impureza.
Cuando se reprocesa un producto farmacutico para TEP, la partida reprocesada debe someterse a pruebas para asegurar
que cumple con los criterios de aceptacin establecidos para el producto farmacutico para TEP antes de su liberacin para
administracin en humanos.
Captulos
ETIQUETADO
La siguiente informacin debe aparecer en la etiqueta adherida al envase final del producto farmacutico para TEP:
El nombre del producto farmacutico para TEP, incluyendo la forma farmacutica;
El nmero de partida asignado; y
Declaraciones o smbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigacin clnica, radioactivo).
La siguiente informacin debe aparecer en el blindaje del producto farmacutico para TEP:
El nombre del producto farmacutico para TEP, incluyendo la forma farmacutica;
El nmero de partida asignado;
La fecha y hora de la calibracin;
Declaraciones o smbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigacin clnica, radioactivo);
La radioactividad total en MBq (o mCi) o la concentracin en MBq/mL (o mCi/mL) al momento de la calibracin, segn
corresponda;
Fecha y hora de caducidad;
Sustancias agregadas (p.ej., ingredientes inactivos del estabilizante);
El nombre del establecimiento productor donde se fabric el producto farmacutico para TEP o el nombre del distribuidor;
Cualquier otra advertencia aplicable (p.ej., No usar si presenta turbidez o si contiene partculas o etiquetado para uso
en investigacin clnica); y
Cualquier otra informacin relevante (si se requiere), como por ejemplo, condiciones de almacenamiento y vida media.
831 NDICE DE REFRACCIN

El ndice de refraccin (n) de una sustancia es la relacin entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la
sustancia. Es valioso en la identificacin de sustancias y en la deteccin de impurezas.
La temperatura estndar en las determinaciones farmacopeicas es 25 pero a menudo las especificaciones en las monografas
individuales indican que es necesario calcular el valor del ndice de refraccin a 20. Es necesario ajustar y mantener la temperatura cuidadosamente ya que el ndice de refraccin vara considerablemente con la temperatura.
Los valores del ndice de refraccin indicados en esta Farmacopea son para la lnea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6
nm). La mayora de los instrumentos disponibles estn diseados para usarse con luz blanca pero estn calibrados para expresar el ndice de refraccin con respecto a la lnea D de la luz de sodio.
El refractmetro Abb mide la gama de ndices de refraccin de los materiales farmacopeicos para los cuales se indican dichos valores. Se pueden utilizar otros refractmetros de igual o mayor precisin.
Para lograr la exactitud terica de 0,0001, es necesario calibrar el instrumento contra un estndar suministrado por el fabricante y comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del instrumento mediante la determinacin del ndice de refraccin de agua destilada, cuyos valores son 1,3330 a 20 y 1,3325 a 25.
Pruebas Fsicas / 841 Peso Especfico 685
USP 38
841 PESO ESPECFICO

A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, la determinacin del peso especfico slo se aplica a
lquidos y, a menos que se especifique algo diferente, se calcula como el cociente entre el peso de un lquido en el aire a 25 y
el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si en la monografa individual se indica una temperatura, el peso
especfico es el cociente entre el peso del lquido en el aire a la temperatura indicada y el de un volumen igual de agua a la
misma temperatura. Si la sustancia es un slido a 25, determinar el peso especfico del material fundido a la temperatura indicada en la monografa individual y referirse al agua a 25.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, la densidad se define como la masa de una unidad
de volumen de la sustancia a 25, expresada en kilogramos por metro cbico o en gramos por centmetro cbico (1 kg/m3 =
103 g/cm3). Cuando se conoce la densidad, la masa se puede convertir a volumen o viceversa, mediante la frmula: volumen
= masa/densidad.
A menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, usar el Mtodo I.
MTODO I
MTODO II
El procedimiento incluye el uso del densmetro transductor oscilante. El aparato consiste en lo siguiente:
un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, que contiene el lquido que se va a examinar;
un sistema de excitacin magnetoelctrico o piezoelctrico que hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una
frecuencia caracterstica que depende de la densidad del lquido que se va a examinar;
un medio para determinar el perodo de oscilacin (T), que el aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de
densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a travs de las constantes A y B descritas ms adelante; y
un medio para determinar y/o controlar la temperatura del transductor oscilante que contenga el lquido que se va a probar.
El perodo de oscilacin es una funcin de la constante del resorte (c) y de la masa del sistema:
T2 = {(M/c) + [(r V)/c]} 4p2
en donde r es la densidad del lquido que se va a analizar, M es la masa del tubo y V es el volumen del tubo lleno.
La introduccin de dos constantes A = c/(4p2 V) y B = (M/V), lleva a la ecuacin clsica del transductor oscilante:
r = A T2 B
El peso especfico del lquido se provee mediante la frmula:
r(L)/r(W)
en donde r(L) y r(W) son las densidades del lquido y del agua, respectivamente, ambas determinadas a 25, a menos que se
especifique algo diferente en la monografa individual.
CalibracinLas constantes A y B se determinan al operar el instrumento con el tubo en forma de U llenado con dos muestras diferentes con densidad conocida (p.ej., agua desgasificada y aire). Llevar a cabo las mediciones de control diariamente
usando agua desgasificada. Los resultados mostrados para la medicin de control usando agua desgasificada no se desvan del
valor de referencia (r25 = 0,997043 g/cm3) ms all del error especificado. La precisin es una funcin de la capacidad de repeticin y de la estabilidad de la frecuencia del oscilador. Los densmetros pueden obtener mediciones con un error del orden de
1103 g/cm3 a 1105 g/cm3 y una capacidad de repeticin de 1104 g/cm3 a 1106 g/cm3. Por ejemplo, un instrumento
especificado a 1104 g/cm3 debe mostrar 0,9970 0,0001 g/cm3 para poder usarse en mediciones posteriores o, de lo contrario, necesitar un ajuste. Se debe llevar a cabo la calibracin regular con materiales de referencia certificados.
ProcedimientoSeguir las instrucciones del fabricante para llevar a cabo mediciones empleando el mismo procedimiento
utilizado para la Calibracin. Si fuera necesario, equilibrar el lquido que ser examinado a 25 antes de introducirlo en el tubo
para evitar la formacin de burbujas y reducir el tiempo necesario para obtener la medicin. Los factores que afectan la precisin incluyen los siguientes:
Captulos
ProcedimientoSeleccionar un picnmetro escrupulosamente limpio y seco que haya sido previamente calibrado mediante la determinacin de su peso y el peso de agua recin hervida contenida en l a 25. Ajustar la temperatura del lquido aproximadamente a 20 y llenar el picnmetro. Ajustar la temperatura del picnmetro lleno a 25, retirar todo exceso de lquido y
pesar. Cuando la monografa especifique una temperatura diferente a 25, los picnmetros llenos deben elevarse a la temperatura de la balanza antes de ser pesados. Restar el peso de tara del picnmetro del peso llenado.
El peso especfico del lquido es el cociente que se obtiene al dividir el peso del lquido contenido en el picnmetro por el
peso del agua contenida en ste, ambos determinados a 25, a menos que en la monografa individual se especifique algo
diferente.
686 841 Peso Especfico / Pruebas Fsicas
USP 38
uniformidad de la temperatura en todo el tubo,

falta de linealidad en un rango de densidad,
efectos resonantes parsitos, y
viscosidad, si los densmetros transductores oscilantes empleados no proporcionan compensacin automtica para la influencia de la viscosidad de la muestra.
846 REA SUPERFICIAL ESPECFICA

INTRODUCCIN
El rea superficial especfica de un polvo se determina mediante la adsorcin fsica de un gas sobre la superficie del slido,
calculando la cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomolecular en la superficie. La adsorcin fsica es el
resultado de fuerzas relativamente dbiles (fuerzas de van der Waals) entre las molculas del gas adsorbato y la superficie adsorbente del polvo de prueba. Generalmente, la determinacin se lleva a cabo a la temperatura del nitrgeno lquido. La cantidad de gas adsorbido puede medirse por un procedimiento volumtrico o de flujo continuo.
Captulos
TEORA DE BRUNAUER, EMMETT Y TELLER (BET) Y DETERMINACIN DE REA ESPECFICA

Medicin de Mltiples Puntos
Los datos se tratan segn la ecuacin de la isoterma de adsorcin de Brunauer, Emmett y Teller (BET):
1/[Va((Po/P) 1)] = [(C 1)/(VmC)] (P/Po) + (1/VmC)
(1)
presin parcial de vapor de gas adsorbato en equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de ebullicin del nitrgeno lquido),
en Pa,
Po
presin de saturacin del gas adsorbato, en Pa;
Va
volumen de gas adsorbido a temperatura y presin estndar (STP, por sus siglas en ingls) [273,15 K y presin atmosfrica de
(1,013 105 Pa)], en mL;
Vm
volumen de gas adsorbido a STP que produce una monocapa aparente en la superficie de la muestra, en mL;
una constante adimensionada relacionada con la entalpa de adsorcin del gas adsorbato sobre la muestra de polvo.
Se mide un valor de Va en cada uno de no menos de tres valores de P/Po.

Luego, el valor BET
1/[Va((Po/P) 1)]
se grafica en funcin de P/Po, conforme a la ecuacin (1). Este grfico debe producir una lnea recta en el intervalo de presin
relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran aceptables si el coeficiente de correlacin, r, de la regresin lineal
no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de la grfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a
(C 1)/VmC y la interseccin, que es igual a 1/VmC, se evalan por anlisis de regresin lineal. A partir de estos valores, Vm se
calcula como 1/(pendiente + interseccin), mientras que C se calcula como (pendiente/interseccin) + 1. A partir del valor de Vm
as determinado se calcula el rea especfica, S, en m2 g1, por la ecuacin:
S = (VmNa)/(m 22 400)
(2)
constante de Avogadro (6,022 1023 mol1),
rea efectiva de seccin transversal de una molcula de adsorbato, en nanmetros cuadrados (0,162 nm2 para el nitrgeno y 0,195 nm2 para el criptn),
masa de polvo de prueba, en g
22 400
volumen, en mL, ocupado por 1 mol de gas adsorbato a STP, admitiendo pequeas desviaciones del estado ideal.
Es necesario un mnimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad
a un valor P/Po cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo con valores P/Po por debajo de 0,05, no se recomiendan los valores en esta regin. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y el clculo del rea superficial especfica de la muestra se han descrito anteriormente.
USP 38
Pruebas Fsicas / 846 rea Superficial Especfica 687
Medicin con un nico Punto

Normalmente se necesitan como mnimo tres mediciones de Va, cada una a distintos valores de P/Po, para determinar el rea
superficial especfica mediante la tcnica de la adsorcin de gas por flujo dinmico (Mtodo I) o mediante la tcnica volumtrica de adsorcin de gas (Mtodo II). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias que se describen a continuacin, puede ser aceptable determinar el rea superficial especfica de un polvo con un nico valor de Va medido a un nico valor de P/Po como por
ejemplo 0,300 (correspondiente a 0,300 moles de nitrgeno o a una fraccin molar de criptn de 0,001038), empleando la
siguiente ecuacin para calcular Vm :
Vm = Va[1 (P/Po)]
(3)
Luego se calcula el rea superficial especfica a partir del valor de Vm con la ecuacin (2) indicada anteriormente.
El mtodo de un nico punto puede emplearse directamente para una serie de muestras de polvo de un material dado
cuando la constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas circunstancias pueden verificarse por comparacin de
los valores de rea especfica determinados por el mtodo de un nico punto con los valores determinados por el mtodo de
puntos mltiples para una serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores obtenidos con un nico punto y
con mltiples puntos sugiere que 1/C se aproxima a cero.
El mtodo de un nico punto puede emplearse indirectamente para una serie de muestras de polvo similares de un material
dado cuando la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que no vara. En estas circunstancias, el error
asociado al mtodo de un nico punto puede reducirse o eliminarse empleando el mtodo de puntos mltiples para evaluar C
para una de las muestras de las serie a partir del grfico de BET, en el cual C se calcula como (1 + pendiente /interseccin).
Luego se calcula Vm a partir del valor nico de Va medido a un nico valor de P/Po, por la ecuacin:
(4)
Luego se calcula el rea especfica a partir del valor de Vm con la ecuacin (2) antedicha.
TCNICAS EXPERIMENTALES
Esta seccin describe los mtodos que se utilizan para la preparacin de la muestra, la tcnica de adsorcin de gas por flujo
dinmico (Mtodo I) y la tcnica volumtrica de adsorcin de gas (Mtodo II).
DESGASIFICACIN
Antes de determinar el rea superficial especfica de la muestra, es necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos fsicamente en la superficie despus de la fabricacin y durante el tratamiento, manipulacin y almacenamiento. Si no se logra la
desgasificacin, el rea superficial especfica podra reducirse o variar, puesto que parte de la superficie estara cubierta con
molculas de los gases o vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificacin son de vital importancia para
obtener la precisin y la exactitud requeridas de las mediciones de rea especfica de sustancias farmacuticas debido a la sensibilidad de la superficie de los materiales.
Se debe demostrar que las condiciones de desgasificacin proporcionan grficos BET reproducibles, un peso constante de
polvo de prueba y ningn cambio fsico o qumico detectable en el polvo de prueba.
Las condiciones de desgasificacin definidas por la temperatura, la presin y el tiempo deben elegirse de tal modo que la
superficie original del slido se reproduzca lo ms posible. Con frecuencia, la desgasificacin de muchas sustancias se logra
mediante la aplicacin de vaco o purgando la muestra en una corriente de un gas no reactivo, seco o aplicando un mtodo
de ciclos de desorcin y adsorcin. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican temperaturas elevadas para aumentar
la velocidad de eliminacin de los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando se desgasifiquen muestras
de polvo con temperaturas elevadas, con el fin de evitar la degradacin de la muestra.
Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificacin recomendados deben ser tan bajos como sea posible para
lograr mediciones de rea superficial especfica reproducibles dentro de un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensibles, se pueden emplear otros mtodos de desgasificacin, tal como el mtodo de los ciclos de desorcin y adsorcin.
ADSORBATO
La tcnica estndar es la adsorcin de nitrgeno de calidad analtica a la temperatura del nitrgeno lquido.
Para polvos de rea superficial especfica pequea (< 0,2 m2g1), la proporcin adsorbida es pequea. En tales casos, se prefiere usar criptn a la temperatura del nitrgeno lquido porque su baja presin de vapor reduce el error en gran medida. El
uso de cantidades mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a reas totales de 1 m2 o mayores empleando nitrgeno), pueden compensar los errores para determinar reas pequeas.
Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad.
Captulos
Vm = Va[(Po/P) 1] [(1/C) + ((C 1)/C) (P/Po)]
688 846 rea Superficial Especfica / Pruebas Fsicas
USP 38
CANTIDAD DE MUESTRA
Medir con exactitud una cantidad de polvo de prueba desgasificado de forma tal que el rea de la superficie total sea como
mnimo de 1 m2 cuando el adsorbato es nitrgeno y de 0,5 m2 cuando el adsorbato es criptn.
Se pueden emplear cantidades menores de muestra despus de la validacin correspondiente.
Mediciones
Como la cantidad de gas adsorbido a una presin dada tiende a aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones
de adsorcin por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullicin del
nitrgeno lquido.
Mtodo I: Mtodo de Flujo Dinmico
Captulos
PRINCIPIO
En el mtodo de flujo dinmico (ver Figura 1), el gas adsorbato recomendado es criptn o nitrgeno secos, mientras que se
emplea helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones recomendadas.
Se requiere un mnimo de tres mezclas del gas adsorbato apropiado con helio dentro de un intervalo de P/Po entre 0,05 y
0,30.
El detector de gas-integrador debe proporcionar una seal que sea aproximadamente proporcional al volumen de gas que
lo atraviesa en condiciones definidas de presin y temperatura. Con este fin, entre los distintos tipos de dispositivos adecuados
se cuenta un detector de conductividad trmica con un integrador electrnico. Se determina un mnimo de tres puntos dentro
del intervalo recomendado de 0,05 a 0,30 de P/Po.
Figura 1. Diagrama esquemtico del aparato para el mtodo por flujo dinmico.
PROCEDIMIENTO
Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general nitrgeno y helio, a travs de una celda de conductividad trmica, nuevamente a travs de la muestra, a travs de la celda de conductividad trmica y posteriormente hasta un potencimetro registrador.
La celda de muestra se sumerge en nitrgeno lquido y la muestra adsorbe nitrgeno de la fase mvil. Esto desequilibra la
celda de conductividad trmica y se genera un pulso en la grfica del registrador.
Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de desorcin igual en rea y en direccin opuesta al pico de
adsorcin. Debido a que ste est mejor definido que el pico de adsorcin, es el que se emplea para la determinacin.
Para efectuar la calibracin, se inyecta en el sistema una cantidad conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un
pico de magnitud similar al pico de desorcin y se obtiene la proporcin de volumen de gas por unidad de rea de pico.
Para una determinacin en un nico punto se emplea una mezcla de nitrgeno y helio; y para la determinacin de puntos
mltiples se usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de gas.
Los clculos son los mismos que en el mtodo volumtrico.
Pruebas Fsicas / 846 rea Superficial Especfica 689
USP 38
Mtodo II: Mtodo Volumtrico

PRINCIPIO
En el mtodo volumtrico (ver Figura 2), el gas adsorbato recomendado es nitrgeno, que puede acceder al espacio vaco
ubicado encima de la muestra de polvo previamente desgasificada para proporcionar una presin de equilibrio definida, P, del
gas. El empleo de un gas diluyente, tal como helio, es por lo tanto innecesario, a pesar de que el helio puede emplearse para
otros fines, como por ejemplo para medir el volumen muerto.
Dado que se emplea solamente gas adsorbato puro, en lugar de una mezcla de gases, al emplear este mtodo se evitan los
efectos de interferencia de la difusin trmica.
Captulos
Figura 2.
Diagrama esquemtico del aparato para el mtodo volumtrico.

PROCEDIMIENTO
Colocar una cantidad pequea de nitrgeno seco en el tubo de la muestra para evitar la contaminacin de la superficie limpia, retirar el tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra. Conectar el tubo de la muestra al aparato
volumtrico. Cuidadosamente aplicar vaco sobre la muestra a la presin especificada (por ejemplo, entre 2 Pa y 10 Pa). Alternativamente, algunos instrumentos se operan aplicando vaco a una velocidad definida de cambio de presin (por ejemplo,
menos de 13 Pa/30 s) y mantenindola durante un perodo de tiempo antes de comenzar el siguiente paso.
Si el principio de operacin del instrumento requiere la determinacin del volumen muerto en el tubo de la muestra, por
ejemplo, mediante la admisin de un gas no adsorbido, tal como helio, este procedimiento se lleva a cabo en este momento,
seguido de la aplicacin de vaco a la muestra. La determinacin del volumen muerto se puede evitar usando mediciones diferenciales: es decir, por medio de tubos de referencia y de muestra conectados mediante un transductor diferencial. Luego se
mide la adsorcin de nitrgeno gaseoso como se describe a continuacin.
Elevar el vaso Dewar que contiene nitrgeno lquido a 77,4 K hasta un punto definido en la celda de muestra. Dejar entrar
una cantidad suficiente de gas adsorbato para proporcionar la presin relativa deseada ms baja. Medir el volumen adsorbido,
Va. Para mediciones de mltiples puntos, repetir la medicin de Va a valores P/Po sucesivamente mayores. Cuando se utiliza
nitrgeno como gas adsorbato, los valores de P/Po de 0,10; 0,20 y 0,30 son a menudo adecuados.
Materiales de Referencia
Verificar peridicamente el funcionamiento del aparato empleando materiales de referencia apropiados de reas conocidas
que tengan un rea superficial especfica similar a la de la muestra que se debe examinar.
690 851 Espectrofotometra y Dispersin de Luz / Pruebas Fsicas
USP 38
851 ESPECTROFOTOMETRA Y DISPERSIN DE LUZ
Captulos
MEDICIONES EN EL ULTRAVIOLETA, VISIBLE, INFRARROJO, ABSORCIN ATMICA,

FLUORESCENCIA, TURBIDIMETRA, NEFELOMETRA Y RAMAN
La espectrofotometra de absorcin es la medicin de una interaccin entre una radiacin electromagntica y las molculas o
tomos de una sustancia qumica. Las tcnicas que se emplean frecuentemente en el anlisis farmacutico incluyen la espectroscopia de absorcin atmica, en el espectro UV, en el visible y en el IR. La medicin espectrofotomtrica en la regin visible
anteriormente se denominaba colorimetra; sin embargo, es ms preciso emplear el trmino colorimetra slo en aquellos casos en que se considera la percepcin humana del color.
La Espectrofotometra de Fluorescencia es la medicin de la emisin de luz de una sustancia qumica cuando se expone a la
radiacin UV, visible u otra radiacin electromagntica. Por lo general, la luz emitida por una solucin fluorescente tiene una
intensidad mxima a una longitud de onda mayor que la de la radiacin de excitacin, por lo general en aproximadamente 20
30 nm.
La Dispersin de Luz implica la medicin de la luz dispersada debido a inhomogeneidades submicroscpicas de densidad ptica de las soluciones y es til para la determinacin de pesos moleculares promedio de sistemas polidispersos en el intervalo
de pesos moleculares que varan desde 1000 a varios cientos de millones. Dos de estas tcnicas utilizadas en el anlisis farmacutico son la turbidimetra y la nefelometra.
La Espectroscopia Raman (dispersin de luz inelstica) es un proceso de dispersin de luz en el que la muestra a examinar se
irradia con luz monocromtica intensa (generalmente luz lser) y luego se analiza la luz dispersada por la muestra para detectar cambios de frecuencia.
El intervalo de longitud de onda disponible para estas mediciones se extiende desde las longitudes de onda corta del UV
hasta el IR. Por conveniencia, este intervalo espectral est aproximadamente dividido en el UV (190 a 380 nm), el visible (380 a
780 nm), el IR cercano (780 a 3000 nm) y el IR (2,5 a 40 mm o 4000 a 250 cm1).
UTILIDAD COMPARATIVA DE INTERVALOS ESPECTRALES

En el caso de muchas sustancias farmacuticas, las mediciones pueden hacerse con mayor exactitud y sensibilidad en las
regiones del UV y visible del espectro que en las del IR cercano e IR. Cuando se observan soluciones en celdas de 1 cm, las
concentraciones de aproximadamente 10 mg de muestra por mL a menudo producen absorbancias entre 0,2 y 0,8 en el UV o
la regin de luz visible. En el IR e IR cercano, pueden ser necesarias concentraciones de 1 a 10 mg por mL y de hasta 100 mg
por mL, respectivamente, para que se produzca una absorcin suficiente; para estos intervalos espectrales, se utilizan celdas
con longitudes de 0,01 mm a ms de 3 mm.
Por lo general, los espectros UV y visible de las sustancias no tienen un alto grado de especificidad. Sin embargo, son muy
apropiados para realizar valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son tiles como medios adicionales de
identificacin.
Se ha observado un creciente inters en el uso de la espectroscopia del IR cercano en anlisis farmacuticos, especialmente
para la identificacin rpida de un gran nmero de muestras y tambin para la determinacin del agua.
La regin del IR cercano es especialmente apropiada para la determinacin de grupos OH y NH, como por ejemplo agua
en alcohol, OH en presencia de aminas, alcoholes en hidrocarburos y aminas primarias y secundarias en presencia de aminas
terciarias.
El espectro IR es nico para cualquier compuesto qumico dado, con la excepcin de los ismeros pticos que tienen espectros idnticos. Sin embargo, en algunas ocasiones, el polimorfismo puede ser responsable de una diferencia en el espectro IR
de un compuesto en estado slido. Con frecuencia, pequeas diferencias en la estructura producen diferencias significativas en
los espectros. Debido al gran nmero de valores mximos en un espectro de absorcin IR, a veces es posible medir cuantitativamente los componentes individuales de una mezcla con una composicin cualitativa conocida sin separacin previa.
El espectro Raman y el espectro IR proporcionan datos similares, aunque las intensidades de los espectros estn gobernadas
por diferentes propiedades moleculares. La espectroscopia Raman y la IR muestran diferentes sensibilidades relativas para diferentes grupos funcionales; por ejemplo, la espectroscopia Raman es particularmente sensible a enlaces mltiples CS y CC y
algunos compuestos aromticos se identifican ms fcilmente mediante sus espectros Raman. El agua tiene un espectro de absorcin IR muy intenso, pero un espectro Raman particularmente dbil. En consecuencia, el agua tiene nicamente ventanas
limitadas en el IR, que se pueden utilizar para examinar solutos acuosos, mientras que su espectro Raman es casi completamente transparente y til para la identificacin de solutos. Las dos limitaciones principales de la espectroscopia Raman son que
la concentracin mnima detectable de la muestra generalmente es de 101 M a 102 M y que las impurezas presentes en muchas sustancias son fluorescentes e interfieren con la deteccin de la seal Raman dispersada.
Las mediciones de reflectancia ptica proporcionan informacin espectral similar a la obtenida por mediciones de transmisin. Dado que las mediciones de reflectancia investigan slo la composicin superficial de la muestra, las dificultades asociadas con el espesor ptico y las propiedades de dispersin de luz de la sustancia se eliminan. De esta manera, frecuentemente
es ms sencillo realizar mediciones de reflectancia en materiales que absorben intensamente la radiacin. Una tcnica particu-
USP 38
Pruebas Fsicas / 851 Espectrofotometra y Dispersin de Luz 691
larmente comn empleada para las mediciones de reflectancia IR se denomina reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas
en ingls), tambin conocida como reflectancia interna mltiple (MIR, por sus siglas en ingls). En la tcnica de ATR, el haz del
espectrmetro IR se hace pasar a travs de una ventana construida con un material apropiado para la radiacin IR (por ejemplo, KRS-5, una mezcla eutctica de TlBr-TlI), que est cortado con un ngulo tal que el haz IR atraviesa la primera superficie
de la ventana (frente) pero se refleja totalmente cuando incide en la segunda superficie (posterior); es decir, el ngulo de incidencia de la radiacin sobre la segunda superficie de la ventana excede el ngulo crtico para ese material. Mediante la construccin de ventanas adecuadas es posible obtener muchas reflexiones internas del haz IR antes de que ste se transmita fuera
de la ventana. Si una muestra se coloca en contacto con la ventana a lo largo de los lados que reflejan totalmente el haz IR, la
intensidad de la radiacin reflejada se reduce con cada longitud de onda (frecuencia) que absorbe la muestra. De este modo,
la tcnica de ATR proporciona un espectro de reflectancia que se ha incrementado en intensidad, en comparacin con una
medicin de reflectancia sencilla, el nmero de veces que el haz IR se refleja dentro de la ventana. La tcnica de ATR proporciona una sensibilidad excelente, pero produce mala reproducibilidad y no es una tcnica cuantitativa confiable a menos que
cada muestra de prueba se mezcle muy bien con un estndar interno.
La Espectrofotometra de Fluorescencia es a menudo ms sensible que la espectrofotometra de absorcin. En mediciones de
absorcin, se compara la transmitancia de la muestra con la de un blanco y a concentraciones bajas, ambas soluciones proporcionan seales altas. Por el contrario, en la espectrofotometra de fluorescencia, el blanco de disolvente tiene emisiones bajas
en vez de altas, de manera que la radiacin de fondo, que puede interferir con las determinaciones a concentraciones bajas, es
mucho menor. Debido a que pocos compuestos pueden determinarse de manera conveniente mediante absorcin de luz a
concentraciones por debajo de 105M, no es inusual emplear concentraciones de 107 M a 108M en la espectrofotometra de
fluorescencia.
La potencia de un haz de luz radiante disminuye en relacin con la distancia que recorre en un medio de absorcin. Tambin disminuye en relacin a la concentracin de molculas o iones absorbentes con los que se encuentra en ese medio. Estos
dos factores determinan la proporcin de la energa incidente total que emerge. La disminucin de la potencia de una radiacin monocromtica que atraviesa un medio de absorcin homogneo se determina cuantitativamente mediante la ley de
Beer, log10(1/T) = A = abc, en donde los trminos son los definidos a continuacin.
Absorbancia [Smbolo: A]Es el logaritmo, en base 10, del recproco de la transmitancia (T). [NOTALos trminos descriptivos empleados anteriormente incluyen densidad ptica, absorbencia y extincin.]
Absortividad [Smbolo: a]Es el cociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentracin de la sustancia (c), expresada en g por L, y la longitud de paso de absorcin (b) en cm. [NOTANo debe confundirse con el ndice de
absorbancia, la extincin especfica o el coeficiente de extincin.]
Absortividad Molar [Smbolo: e]Es el cociente de la absorbancia (A) dividido por el producto de la concentracin de la
sustancia, expresado en moles por L y la longitud de paso de absorcin en cm. Tambin es el producto entre la absortividad (a)
y el peso molecular de la sustancia. [NOTALos trminos empleados anteriormente incluyen el ndice de absorbancia molar, el
coeficiente de extincin molar y el coeficiente de absorcin molar.]
Para la mayora de los sistemas empleados en espectrofotometra de absorcin, la absortividad de una sustancia es una constante independiente de la intensidad de la radiacin incidente, la longitud interna de las celdas y la concentracin, por lo cual
la concentracin puede determinarse fotomtricamente.
La ley de Beer no da indicaciones del efecto de la temperatura, la longitud de onda o el tipo de disolvente. Para la mayora
de los trabajos analticos, los efectos de la variacin normal de la temperatura son inapreciables.
Las desviaciones de la ley de Beer pueden ser causadas por variables qumicas o instrumentales. Una falla aparente de la ley
de Beer puede ser el resultado de un cambio de concentracin en las molculas de soluto debido a la asociacin entre las molculas de soluto o entre el soluto y las molculas del disolvente, o debido a disociacin o ionizacin. Otras desviaciones pueden estar causadas por efectos instrumentales, como por ejemplo la radiacin policromtica, los efectos de ancho de rendija o
de luz espuria.
Incluso a una temperatura fija en un disolvente dado, es posible que la absortividad no sea verdaderamente constante. Sin
embargo, en el caso de muestras que tienen un solo componente absorbente, no es necesario que el sistema de absorcin se
ajuste a la ley de Beer para utilizarlo en anlisis cuantitativos. La concentracin de una sustancia desconocida se puede determinar mediante la comparacin con una curva estndar determinada experimentalmente.
Aunque, en el sentido ms estricto, la ley de Beer no es aplicable en la espectrofotometra de absorcin atmica debido a la
falta de propiedades cuantitativas de la longitud de la celda y la concentracin, el proceso de absorcin que tiene lugar en la
llama bajo condiciones de aspiracin reproducibles, en principio, se ajusta a la relacin de Beer. Especficamente, el logaritmo
negativo de la transmitancia, o de la absorbancia, es directamente proporcional al coeficiente de absorcin y, por consiguiente, es proporcional al nmero de tomos absorbentes. Sobre esta base, pueden elaborarse curvas de calibracin para permitir
la evaluacin de valores de absorcin desconocidos en funcin de la concentracin del elemento en solucin.
Espectro de AbsorcinEs una representacin grfica de la absorbancia, o cualquier funcin de absorbancia, en funcin
de la longitud de onda o a una funcin de la longitud de onda.
Transmitancia [Smbolo: T]Es el cociente entre la potencia radiante transmitida por una muestra y la potencia radiante
incidente sobre la muestra. [NOTALos trminos empleados anteriormente incluyen la transmitancia y la transmisin.]
Captulos
TEORA Y DEFINICIONES
Captulos
USP 38
Intensidad de Fluorescencia [Smbolo: I]Es una expresin emprica de la actividad fluorescente, comnmente expresada
en funcin de unidades arbitrarias proporcionales a la respuesta del detector. El espectro de emisin de fluorescencia es una representacin grfica de la distribucin espectral de la radiacin emitida por una sustancia activada, que muestra la intensidad
de la radiacin emitida como la ordenada y la longitud de onda como la abscisa. El espectro de excitacin de fluorescencia es
una representacin grfica del espectro de activacin, que muestra la intensidad de la radiacin emitida por una sustancia activada como la ordenada y la longitud de onda de la radiacin incidente (activante) como la abscisa. Como en la espectrofotometra de absorcin, las regiones importantes del espectro electromagntico abarcadas por la fluorescencia de compuestos orgnicos son el UV, el visible y el IR cercano; es decir, la regin de 250 a 800 nm. Despus de que una molcula ha absorbido
radiacin, la energa puede perderse como calor o puede liberarse en forma de radiacin de la misma longitud de onda que la
absorbida o mayor. Tanto la absorcin como la emisin de radiacin se deben a las transiciones de electrones entre diferentes
niveles de energa, u orbitales, de la molcula. Existe una demora de tiempo entre la absorcin y la emisin de luz; este intervalo, la duracin del estado de excitacin, se ha medido y dura aproximadamente de 109 segundos a 108 segundos para la
mayora de las soluciones fluorescentes orgnicas. La corta vida de la fluorescencia distingue este tipo de luminiscencia de la
fosforescencia, que es una posluminiscencia que excede el tiempo de excitacin y que puede durar de 103 segundos hasta
varios minutos.
Turbidancia [Smbolo: S]Es el efecto de dispersin de luz causado por partculas en suspensin. La cantidad de materia
en suspensin se puede medir mediante la observacin de la luz transmitida (turbidimetra) o de la luz dispersada (nefelometra).
Turbidez [Smbolo: t]En mediciones de dispersin de luz, la turbidez es la medida de la disminucin de intensidad del
haz incidente por unidad de longitud de una suspensin dada.
Actividad Dispersante RamanEs la propiedad molecular (expresada en unidades de cm4 por g) que gobierna la intensidad de una banda observada en el espectro Raman para una muestra orientada aleatoriamente. La actividad dispersante se
determina a partir de la derivada de la polarizabilidad molecular en lo que se refiere al movimiento molecular que eleva la
banda desplazada de Raman. En general, la intensidad de la banda Raman es linealmente proporcional a la concentracin del
analito.
USO DE ESTNDARES DE REFERENCIA

Con pocas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotomtricas Farmacopeicas requieren una comparacin con un
Estndar de Referencia USP. Esto tiene como propsito asegurar la medicin en condiciones idnticas para la muestra de prueba y la sustancia de referencia. Estas condiciones incluyen el ajuste de la longitud de onda, el ajuste del ancho de rendija, la
ubicacin y correccin de las celdas y los niveles de transmitancia. Debe observarse que las celdas que presentan una transmitancia idntica a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en transmitancia a otras longitudes de onda.
Cuando sea necesario, se deben establecer y emplear correcciones apropiadas para las celdas.
Las expresiones preparacin similar y solucin similar, tal como se emplean en las pruebas y valoraciones relacionadas
con la espectrofotometra, indican que la muestra de referencia, generalmente un Estndar de Referencia USP, debe prepararse
y observarse de manera idntica, para todos los propsitos prcticos, a la que se emplee para la muestra de prueba. Generalmente, al preparar la solucin del Estndar de Referencia especificado, se prepara una solucin de aproximadamente la concentracin deseada (por ejemplo, con una aproximacin del 10%) y se calcula la absortividad con respecto a la cantidad de
sustancia exactamente pesada; si no se ha utilizado un Estndar de Referencia previamente secado, la absortividad se calcula
con respecto a la sustancia anhidra.
Las expresiones, determinar concomitantemente y medido concomitantemente, tal como se emplean en las pruebas y
valoraciones relacionadas con la espectrofotometra, indican que las absorbancias de la solucin que contiene la muestra de
prueba y la solucin que contiene la muestra de referencia, en relacin con el blanco especificado en la prueba, se medirn en
sucesin inmediata.
APARATOS
Estn disponibles muchos tipos de espectrofotmetros. Fundamentalmente, la mayora de ellos, excepto los empleados para
espectrofotometra IR, proporcionan un pasaje de energa radiante esencialmente monocromtica a travs de una muestra en
forma adecuada y una medicin de la fraccin de la intensidad que se transmite. Los espectrofotmetros IR por transformada
de Fourier emplean una tcnica interferomtrica mediante la cual la radiacin policromtica pasa a travs del analito y llega a
un detector que genera datos de intensidad en funcin del tiempo. Los espectrofotmetros UV, visibles e IR dispersivos comprenden una fuente de energa, un dispositivo de dispersin (por ejemplo, un prisma o red de difraccin), ranuras para seleccionar la banda de longitud de onda, una celda o un soporte para la muestra de prueba, un detector de energa radiante,
amplificadores asociados y dispositivos de medicin. En los espectrofotmetros con red de diodos, la energa de la fuente atraviesa la muestra de prueba y luego se dispersa a travs de un retculo, incidiendo sobre varios cientos de diodos sensibles a la
luz y cada uno de estos diodos genera a su vez una seal proporcional al nmero de fotones dentro de un pequeo intervalo
de longitudes de onda. Luego, estas seales pueden ser computadas a intervalos de tiempo cortos, seleccionados para obtener
un espectro completo. Los sistemas IR por transformada de Fourier utilizan un interfermetro en lugar de un dispositivo de
dispersin y una computadora digital para procesar los datos del espectro. Algunos instrumentos se operan manualmente,
USP 38
A = 2 log10 (100 % absorcin)

o:
A = 2 log10 (% transmitancia)
Dependiendo del tipo de aparatos que se empleen, el dispositivo de lectura puede ser un medidor, un contador digital, un
registrador o una impresora. Existen en el comercio instrumentos de haz simple y de haz doble y cualquiera de los dos tipos es
adecuado.
La medicin de intensidad de fluorescencia puede hacerse con un simple fluormetro de filtro. Este instrumento consta de
una fuente de radiacin, un filtro primario, una cmara para muestras, un filtro secundario y un sistema de deteccin de fluorescencia. En la mayora de estos fluormetros, el detector se coloca en un eje a 90 con respecto al haz de excitacin. Esta
geometra de ngulo recto permite que la radiacin excitante pase a travs de la muestra de prueba y no contamine la seal
de salida recibida por el detector de fluorescencia. Sin embargo, el detector recibe inevitablemente algo de la radiacin de
excitacin como resultado de las propiedades de dispersin inherentes a las soluciones, o si estn presentes, polvo u otros slidos. Se utilizan filtros para eliminar esta dispersin residual. El filtro primario selecciona la radiacin de longitud de onda corta
capaz de excitar la muestra de prueba, mientras que el filtro secundario es normalmente un filtro de corte agudo que permite
que la fluorescencia de longitud de onda ms larga se transmita pero que bloquea la excitacin dispersada.
La mayora de los fluormetros emplean tubos fotomultiplicadores como detectores; estn disponibles diferentes tipos de
estos fluormetros, cada uno con caractersticas especiales en lo que se refiere a la regin espectral de mxima sensibilidad,
ganancia y ruido elctrico. La fotocorriente se amplifica y se lee en un medidor o registrador.
La diferencia entre un espectrofluormetro y un fluormetro de filtro es que en el espectrofluormetro los filtros son reemplazados por monocromadores, ya sea un prisma o una red de difraccin. Para fines analticos, el espectrofluormetro es superior
al fluormetro de filtro en lo que respecta a la selectividad de la longitud de onda, flexibilidad y conveniencia, de la misma
manera en que un espectrofotmetro es superior a un fotmetro de filtro.
Se dispone de muchas fuentes de radiacin. Las lmparas de mercurio son relativamente estables y emiten energa principalmente a longitudes de onda discretas. Las lmparas de tungsteno proporcionan energa continua en la regin visible. La lmpara de arco de xenn de alta presin a menudo se emplea en espectrofluormetros porque es una fuente de alta intensidad
que emite energa continua desde el UV al IR.
En los espectrofluormetros, los monocromadores estn equipados con ranuras. Una ranura estrecha proporciona alta resolucin y pureza espectral, mientras que una ranura grande proporciona alta sensibilidad en detrimento de los parmetros anteriores. La eleccin de la dimensin de la ranura se determina por la separacin entre la longitud de onda de excitacin y la
longitud de onda de emisin, as como por el grado de sensibilidad necesario.
Las celdas para muestras que se emplean en mediciones de fluorescencia pueden ser tubos circulares o celdas rectangulares
similares a las utilizadas en espectrofotometra de absorcin, excepto que en este caso se pulen las cuatro caras verticales. El
tamao de muestra de prueba adecuado para la medicin es de 2 a 3 mL, pero algunos instrumentos pueden equiparse con
Captulos
mientras que otros proporcionan un registro automtico y continuo. Los instrumentos que estn conectados por interfaz a una
computadora digital tambin tienen la capacidad de combinar y almacenar espectros, permitiendo la comparacin de espectros y la realizacin de tcnicas de espectroscopia diferencial (con el uso de un mtodo de substraccin digital de absorbancia).
Existen instrumentos disponibles que se pueden utilizar en la regin visible del espectro; en las regiones visible y UV del espectro; en las regiones visible, UV e IR cercano del espectro; y en las regiones IR del espectro. La eleccin del tipo de anlisis
espectrofotomtrico y del instrumento a emplear depender de factores tales como la composicin y cantidad de la muestra
de prueba disponible, el grado de exactitud, sensibilidad y selectividad deseado y la manera en la que se manipula la muestra.
Los aparatos empleados en espectrofotometra de absorcin atmica tienen varias caractersticas exclusivas. Para cada elemento a determinar, debe seleccionarse una fuente especfica que emita la lnea espectral a ser absorbida. La fuente es generalmente una lmpara de ctodo hueco y el ctodo de esta lmpara est diseado para emitir la radiacin deseada cuando se
lo excita. Dado que la radiacin a ser absorbida por el elemento de la muestra de prueba tiene generalmente la misma longitud de onda que la lnea de emisin, el elemento de la lmpara de ctodo hueco ser el mismo elemento que se desea determinar. El aparato est equipado con un aspirador para introducir la muestra de prueba en una llama que generalmente est
generada por una mezcla de aireacetileno, aire-hidrgeno o en el caso de materiales refractarios, xido nitrosoacetileno. La
llama, en efecto, es una cmara de calentamiento para la muestra. Se emplea un detector para leer la seal de la cmara. La
radiacin interferente producida por la llama durante la combustin puede ser anulada mediante el uso de una lmpara que
emita una seal intermitente a una frecuencia definida. El detector debe ajustarse a esta frecuencia de corriente alterna de manera que la seal de corriente continua que surge de la llama se ignore. El sistema de deteccin, en consecuencia, lee slo el
cambio en la seal de la fuente de ctodo hueco, que es directamente proporcional al nmero de tomos a determinar en la
muestra de prueba. Para los fines Farmacopeicos, generalmente se necesita un aparato que proporcione las lecturas directamente en unidades de absorbancia. Sin embargo, los instrumentos que proporcionan lecturas en porcentajes de transmisin,
porcentaje de absorcin o concentracin pueden emplearse si las frmulas de clculo proporcionadas en las monografas individuales se revisan, en la medida que sea necesario, para producir los resultados cuantitativos requeridos. El porcentaje de absorcin o el porcentaje de transmitancia pueden convertirse en absorbancia, A, mediante las dos ecuaciones siguientes:
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celdas pequeas que contienen de 100 a 300mL o con un soporte capilar que requiere una cantidad an ms pequea de
muestra.
Existen instrumentos para la medicin de la dispersin de luz y por lo general consisten en una lmpara de mercurio con
filtros para las lneas espectrales verdes o azules fuertes, un obturador, un conjunto de filtros neutros con transmitancia conocida y un fotomultiplicador sensible, montado en un brazo que puede rotarse alrededor de la celda con la solucin y fijarse en
cualquier ngulo de 135 a 0 a +135 mediante un comando exterior al receptculo hermtico. Las celdas para la solucin
son de diversas formas: cuadradas para mediciones de dispersin a 90; semioctagonales para mediciones de dispersin a 45,
90 y 135 y cilndricas para mediciones de dispersin en todos los ngulos. Dado que la determinacin del peso molecular
requiere una medida precisa de la diferencia de ndice de refraccin entre la solucin y el solvente [(n n0)/c], se necesita un
segundo instrumento, un refractmetro diferencial, para medir esta pequea diferencia.
Los espectrmetros Raman incluyen los siguientes componentes principales: una fuente de radiacin monocromtica intensa
(invariablemente un rayo lser); un sistema ptico para recoger la luz dispersada por la muestra de prueba; un monocromador
(doble) para disipar la luz dispersada y rechazar la frecuencia incidente intensa; y un sistema apropiado para la deteccin y
amplificacin de luz. La medicin Raman es sencilla ya que la mayor parte de las muestras se examinan directamente en capilares para punto de fusin. Debido a que la fuente lser puede concentrarse en un punto, se necesitan solamente unos pocos
microlitros de muestra.
PROCEDIMIENTO
Captulos
Espectrofotometra de Absorcin
Los fabricantes proporcionan instrucciones detalladas para operar los espectrofotmetros. Para lograr resultados significativos y vlidos, el operador de un espectrofotmetro debe conocer los lmites de ste y las fuentes potenciales de error y variacin. El manual de instrucciones debe seguirse con suma atencin en lo que se refiere al cuidado, limpieza y calibracin del
instrumento y las tcnicas de manipulacin de las celdas de absorcin, as como tambin las instrucciones para la operacin.
Se debe poner un nfasis especial en los siguientes puntos.
Controlar la exactitud de la calibracin del instrumento. Cuando se emplee una fuente de energa radiante continua, se debe prestar atencin tanto a la longitud de onda como a la escala fotomtrica; en el caso de que se emplee una fuente con una
lnea espectral, slo se necesitar controlar la escala fotomtrica. Hay varias fuentes de energa radiante que tienen lneas espectrales de intensidad adecuada, espaciadas apropiadamente en todo el intervalo espectral seleccionado. La mejor fuente de
espectros de calibracin de UV y visible es el arco de cuarzo-mercurio, del cual pueden emplearse las lneas a 253,7; 302,25;
313,16; 334,15; 365,48; 404,66 y 435,83 nm. El arco de vidrio-mercurio es igualmente til por encima de 300 nm. Tambin
se pueden emplear las lneas a 486,13 nm y 656,28 nm de una lmpara de descarga de hidrgeno. La escala de longitud de
onda puede calibrarse tambin a travs de filtros de vidrio apropiados, que tengan bandas de absorcin tiles a travs de las
regiones visible y UV. Se han empleado ampliamente vidrios estndar que contienen didimio (una mezcla de praseodimio y
neodimio), a pesar de que los vidrios que contienen holmio se consideran superiores. Recientemente, la solucin de xido de
holmio estndar ha reemplazado el empleo del vidrio con holmio.1 Las escalas de longitud de onda de los espectrofotmetros
IR e IR cercano se controlan fcilmente mediante el uso de bandas de absorcin proporcionadas por pelculas de poliestireno,
dixido de carbono, vapor de agua o amonaco gaseoso.
Para verificar la escala fotomtrica se encuentran disponibles diferentes filtros de vidrio inorgnico estndar, as como soluciones estndar de transmitancias conocidas, como por ejemplo el dicromato de potasio.2
Por lo general, las mediciones cuantitativas de absorbancias se realizan en soluciones de la sustancia colocadas en celdas para contener lquidos. Como el disolvente y la ventana de la celda absorben luz, debe hacerse un ajuste para compensar esta
contribucin a la absorbancia medida. Comercialmente se pueden obtener celdas iguales para comparacin para espectrofotometra UV y visible, para las cuales no se necesita ninguna correccin de celda. Sin embargo, en los procedimientos con espectrofotometra IR, por lo general se deben realizar correcciones por causa de las diferencias de los valores de las celdas. En tales
casos, se llenan pares de celdas con el disolvente seleccionado y se determina la diferencia en sus absorbancias a la longitud de
onda seleccionada. La celda que presenta una mayor absorbancia se emplea para la solucin de la muestra de prueba y la
absorbancia medida se corrige restando la diferencia entre las celdas.
Esta correccin no es necesaria cuando se usa un sistema IR por transformada de Fourier computarizado, ya que la misma
celda puede emplearse tanto para el blanco de disolvente como para la solucin de prueba. Sin embargo, es necesario asegurarse de que las propiedades de transmisin de la celda sean constantes.
Una muestra de prueba se podr comparar mejor con un Estndar de Referencia en un pico de absorcin espectral para el
compuesto relevante. Las valoraciones que prescriben el uso de espectrofotometra proporcionan la longitud de onda comnmente aceptada para los picos de absorcin espectral de la sustancia en cuestin. Se sabe que diferentes espectrofotmetros
pueden mostrar una variacin pequea en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prcticas requieren que las
1 National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD 20899: Spectral Transmittance Characteristics of Holmium Oxide in Perchloric Acid,
J. Res. Natl. Bur. Stds. 90, No. 2; 115 (1985). Se debe verificar el rendimiento de un filtro no certificado por comparacin con un estndar certificado.
2 Para ms detalles referentes a la verificacin de la escala fotomtrica de un espectrofotmetro, consultar las siguientes publicaciones del NIST: J. Res. Nalt. Bur.
Stds. 76A, 469 (1972) [re: SRM 93l, Liquid Absorbance Standards for UV and Visible Spectrophotometry y tambin la informacin referente a los patrones de
cromato de potasio y dicromato de potasio]; NIST Spec. Publ. 260116 (1994) [re: SRM 930 and SRM 1930, Glass Filters for Spectrophotometry.
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comparaciones se lleven a cabo a la longitud de onda en la que ocurra un pico de absorcin. Si esto difiriere en ms de 1 nm
de la longitud de onda especificada en la monografa individual, se puede requerir la recalibracin del instrumento.
PREPARACIN DE PRUEBA
Captulos
En las determinaciones que utilizan espectrofotometra UV o visible, la muestra usualmente se disuelve en un disolvente. A
menos que se indique otra cosa en la monografa, las determinaciones se hacen a temperatura ambiente empleando una longitud de paso de 1 cm. Hay muchos disolventes apropiados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hidrocarburos de cadena corta, teres y soluciones diluidas de cidos y lcalis fuertes. Se deben tomar precauciones para utilizar
disolventes libres de contaminantes que absorban en la regin espectral que se utiliza. Por lo general, es aconsejable emplear
como disolvente metanol o alcohol libre de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adicin de metanol pero que no contenga benceno u otras impurezas que interfieran con la prueba. Existen en el comercio disolventes de calidad espectrofotomtrica especial que garantizan la ausencia de contaminantes. Otros disolventes orgnicos de grado reactivo analtico pueden
contener trazas de impurezas que tienen alto grado de absorcin en la regin UV. Deber verificarse la transparencia de lotes
nuevos de estos disolventes y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparacin de la solucin de
prueba, la solucin estndar y el blanco.
Ningn disolvente con un espesor apreciable es completamente transparente en todo el espectro IR cercano e IR. El tetracloruro de carbono (hasta 5 mm de espesor) es prcticamente transparente a 6 mm (1666 cm1). El disulfuro de carbono (1 mm
de espesor) es adecuado como disolvente a 40 mm (250 cm1) con la excepcin de la regin de 4,2 mm a 5,0-mm (2381 cm1 a
2000 cm1) y de la regin de 5,5 mm a 7,5 mm (1819 cm1 a 1333 cm1), donde presenta una fuerte absorcin. Otros disolventes tienen regiones relativamente estrechas de transparencia. Otra condicin adicional para que un disolvente se considere
apropiado para espectrofotometra IR es que no debe afectar el material del que est hecha la celda (generalmente cloruro de
sodio). La muestra de prueba tambin se puede preparar dispersando en aceite mineral la muestra slida reducida a polvo fino
o mezclndola muy bien con una sal de haluro alcalino previamente secada (por lo general bromuro de potasio). Las mezclas
con sales de haluros alcalinos pueden examinarse directamente o como discos transparentes o perlas obtenidos mediante la
compresin de dichas mezclas en una matriz. Las condiciones de secado tpicas para el bromuro de potasio son 105 al vaco
durante 12 horas, aunque existen grados comercialmente disponibles que no requieren secado. Es preferible la microscopa de
infrarrojo o una dispersin en aceite mineral cuando haya una desproporcin entre el haluro alcalino y la muestra de prueba.
En el caso de materiales adecuados, la muestra de prueba se puede preparar pura como una muestra delgada para microscopa IR o puede suspenderse pura como una pelcula delgada para dispersin en aceite mineral. La mayora de los disolventes
ms comunes son apropiados para la espectrometra Raman, en la cual pueden emplearse celdas normales de vidrio (no fluorescente). La regin IR del espectro electromagntico se extiende desde 0,8 hasta 400 mm. La regin de 800 a 2500 nm (0,8 a
2,5mm) se considera generalmente como la regin IR cercano (NIR, por sus siglas en ingls); la regin de 2,5 a 25 mm, (4000 a
400 cm1) se considera generalmente como la regin intermedia (mid-IR, por sus siglas en ingls); y la regin de 25 a 400 mm
es considerada la regin de IR lejano (FIR, por sus siglas en ingls). A menos que se indique otra cosa en la monografa individual, se debe utilizar la regin de 3800 a 650 cm1 (2,6 a 15 mm) para asegurar el cumplimiento con las especificaciones de la
monografa para absorcin IR.
Cuando se proporcionan los valores de los picos del espectro IR en una monografa individual, las letras s, m y w significan
absorcin fuerte, mediana y dbil, respectivamente; sh significa un hombro, bd significa una banda y v significa "muy". Los
valores pueden variar tanto como 0,1 mm o 10 cm1, segn el instrumento especfico empleado. El polimorfismo aumenta las
variaciones en los espectros IR de muchos compuestos en estado slido. En consecuencia, cuando se realicen pruebas de absorcin IR, si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estndar, disolver en volmenes iguales de un disolvente apropiado porciones iguales de la sustancia en anlisis y del estndar, evaporar las soluciones hasta sequedad en envases
similares bajo condiciones idnticas y repetir la prueba con los residuos.
En la espectroscopa NIR la mayor parte del inters actual est centrado en la facilidad del anlisis. Se pueden analizar muestras en polvo o, mediante tcnicas de reflectancia, con poca o ninguna preparacin. El cumplimiento de las especificaciones
internas del laboratorio puede determinarse mediante una comparacin computarizada de los espectros previamente obtenidos a partir de materiales de referencia. Muchos de los materiales farmacuticos muestran poca absortividad en esta regin del
espectro, lo que permite que la radiacin del IR cercano incidente penetre las muestras ms profundamente que la radiacin
UV, visible o IR. La espectrofotometra NIR se puede emplear para observar modificaciones en las matrices y con una calibracin apropiada se puede usar en anlisis cuantitativos.
En la espectrofotometra de absorcin atmica se debe prestar especial atencin a la naturaleza del disolvente y la concentracin de slidos. Un disolvente ideal es aquel que interfiere en grado mnimo en la absorcin o en los procesos de emisin y
que produce tomos neutros en la llama. Si hay una diferencia significativa entre la tensin en la superficie o la viscosidad de la
solucin de prueba y la solucin estndar, las soluciones se aspiran o atomizan a velocidades diferentes, lo que causa diferencias significativas en las seales generadas. La concentracin de cidos de las soluciones tambin afecta a los procesos de absorcin. As, los disolventes empleados en la preparacin de la muestra de prueba y el estndar deben ser los mismos, o tan
parecidos como sea posible, y deben producir soluciones que se aspiren fcilmente a travs del tubo de muestra del mecheroaspirador. Dado que los slidos no disueltos presentes en las soluciones pueden producir interferencias de matriz o de volumen, el contenido total de los slidos no disueltos en todas las soluciones debe mantenerse, en lo posible, debajo de 2%.
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CLCULOS
Por lo general, la aplicacin de la espectrofotometra de absorcin en una valoracin o una prueba requiere el uso de un
Estndar de Referencia. Cuando tal medicin se especifica en una valoracin, se proporciona una frmula para permitir el clculo del resultado deseado. Con frecuencia, se incluye en la frmula una constante numrica. La siguiente derivacin se proporciona para introducir un enfoque lgico a la deduccin de las constantes que aparecen en las frmulas en las valoraciones
de muchas monografas.
La ley de Beer es vlida para las soluciones tanto del Estndar de Referencia (S) como de la muestra de prueba (U):
AS = abCS
(1)
AU = abCU
(2)
en donde AS es la absorbancia de la Solucin estndar de concentracin CS; y AU es la absorbancia de la solucin de la muestra

de prueba de concentracin CU. Si CS y CU se expresan en las mismas unidades y las absorbancias de ambas soluciones se miden en celdas iguales que tienen las mismas dimensiones, la absortividad, a, y el espesor de la celda, b, son iguales; entonces,
las dos ecuaciones pueden combinarse y volver a enunciarse para hallar el valor de CU:
Captulos
CU = CS(AU/AS)
(3)
La cantidad de la muestra de prueba slida que se debe tomar para el anlisis se especifica generalmente en mg. En la valoracin se proporcionan instrucciones para la dilucin y, como se utilizan soluciones diluidas para las mediciones de absorbancia, por lo general las concentraciones se expresan por conveniencia en unidades de mg por mL. Si se toma una cantidad, en
mg, de una muestra de prueba de un frmaco o una forma farmacutica slida para su anlisis, se entiende que un volumen
(VU), en L, de una solucin de concentracin CU se puede preparar a partir de la cantidad de muestra de prueba que contiene
una cantidad WU, en mg, del frmaco [NOTACU es numricamente igual, ya sea que se exprese como mg por mL o mg por
L], de manera que:
WU = VUCU
(4)
La forma en la cual la frmula aparece en la valoracin en una monografa para un artculo slido se puede derivar mediante
la sustitucin de CU de la ecuacin (3) en la ecuacin (4). En resumen, el uso de la ecuacin (4), considerando debidamente
cualquier conversin de unidades necesaria para lograr la igualdad en la ecuacin (5), permite calcular el factor constante (VU)
que figura en la frmula final:
WU = VUCS(AU/AS)
(5)
La misma derivacin se aplica a las frmulas que aparecen en las monografas para artculos lquidos que son valorados por
espectrofotometra de absorcin. Para formas farmacuticas lquidas, los resultados de los clculos se expresan, en general, en
funcin de la cantidad, en mg, de frmaco en cada mL del artculo. Por lo tanto es necesario incluir en el denominador un
trmino adicional, el volumen (V), en mL, de la preparacin de prueba tomada.
Las valoraciones en la regin visible requieren generalmente la comparacin concomitante entre la absorbancia producida
por la Preparacin de valoracin y la producida por una Preparacin estndar que contiene aproximadamente una cantidad
igual de un Estndar de Referencia USP. En algunas situaciones, se admite la omisin del uso de un Estndar de Referencia.
Esto es as en el caso de valoraciones espectrofotomtricas con frecuencia rutinaria y cuando se dispone de una curva estndar
apropiada, preparada con el Estndar de Referencia USP respectivo y cuando la sustancia analizada se ajusta a la ley de Beer
dentro de un intervalo de aproximadamente entre 75% y 125% de la concentracin final usada en la valoracin. En estas circunstancias, la absorbancia determinada en la valoracin se puede interpolar en la curva estndar y el resultado de la valoracin se calcula a partir de esa interpolacin.
Tales curvas estndar deben confirmarse con frecuencia y cada vez que se emplee un espectrofotmetro nuevo o lotes nuevos de reactivos.
En las valoraciones espectrofotomtricas que indican la preparacin y uso de una curva estndar, es permisible y preferible,
cuando la valoracin se realiza con poca frecuencia, no emplear la curva estndar y hacer la comparacin directamente en
funcin de una cantidad de Estndar de Referencia aproximadamente igual a la cantidad de muestra tomada y que ha sido
tratada de manera similar.
Espectrofotometra de Fluorescencia
La medicin de la fluorescencia es una tcnica analtica til. La fluorescencia es la luz emitida por una sustancia en estado
excitado que se ha alcanzado mediante la absorcin de energa radiante. Se dice que una sustancia es fluorescente si puede
emitir fluorescencia. Muchos compuestos se pueden valorar mediante procedimientos que se basan en su fluorescencia inherente o la fluorescencia de derivados adecuados.
Las muestras de prueba preparadas para espectrofotometra de fluorescencia por lo general estn de un dcimo a un centsimo ms concentradas que las que se emplean en espectrofotometra de absorcin, por los motivos que se indican a conti-
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Dispersin de Luz
La turbidez puede medirse con un espectrofotmetro o un fotmetro de filtro fotoelctrico estndar, preferentemente con
iluminacin en la porcin azul del espectro. Las mediciones nefelomtricas requieren un instrumento con una fotoclula situada para recibir la luz dispersada en lugar de la luz transmitida; esta geometra se aplica tambin a los fluormetros, de manera
que, en general, los fluormetros pueden emplearse como nefelmetros, mediante la seleccin de filtros adecuados. Un turbidmetro de relacin combina la tecnologa de la nefelometra a 90 y la de la turbidimetra: contiene fotoclulas que reciben y
miden la luz dispersada a un ngulo de 90 de la muestra as como tambin reciben y miden la dispersin directa frente a la
muestra; tambin mide la luz transmitida directamente a travs de la muestra. La linealidad se obtiene al calcular la relacin
entre la medicin de la luz dispersada a un ngulo de 90 y la suma de la medida de la luz dispersada directa y la medida de la
luz transmitida. La ventaja de emplear un sistema de turbidimetra de relacin es que la medida de la luz perdida es inapreciable.
En la prctica, es aconsejable asegurarse de que la sedimentacin de las partculas que sern medidas sea inapreciable. Generalmente esto se logra incluyendo un coloide protector en el medio de suspensin lquido. Es importante que los resultados
sean interpretados mediante comparacin de lecturas con las de un material en suspensin de concentracin conocida, producidas exactamente bajo las mismas condiciones.
La turbidimetra o nefelometra puede ser til para la medicin de precipitados formados por la interaccin de soluciones
altamente diluidas de reactivos u otras partculas, como por ejemplo suspensiones de clulas bacterianas. Para que puedan lograrse resultados consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. En los casos en los que dicho control sea
posible, se pueden medir suspensiones sumamente diluidas.
La muestra se disuelve en el disolvente a varias concentraciones diferentes conocidas con exactitud, la eleccin de las concentraciones depende del peso molecular del soluto y vara desde 1% para Mw = 10 000 a 0,01% para Mw = 1 000 000. Cada
solucin debe limpiarse muy cuidadosamente antes de la medicin mediante filtracin repetida a travs de filtros finos. Una
partcula de polvo en la solucin vicia la intensidad de la luz dispersada medida. Un criterio para una solucin transparente es
que la disimetra, la relacin de intensidad dispersada a 45/135, haya alcanzado un mnimo.
Se miden la turbidez y el ndice de refraccin de las soluciones. A partir de la ecuacin general de dispersin de luz a 90, se
traza un grfico de HC/t en funcin de C y se extrapola a dilucin infinita y se calcula el peso molecular promedio, M, a partir
de la interseccin, 1/ M.
Captulos
nuacin. En las aplicaciones analticas, es preferible que la seal de fluorescencia est relacionada linealmente con la concentracin; pero si una muestra de prueba estuviera demasiado concentrada, una parte significativa de la luz entrante ser absorbida
por la muestra ms prxima a la superficie de la celda y la luz que llega al centro se reduce. Es decir, la misma muestra acta
como un filtro interno. Sin embargo, la espectrofotometra de fluorescencia es intrnsicamente una tcnica de alta sensibilidad y, con frecuencia, se emplean concentraciones de 105 M a 107 M. Para cualquier procedimiento analtico, es necesario
realizar una curva de trabajo de intensidad de fluorescencia en funcin de la concentracin para establecer una relacin lineal.
Todas las lecturas deben corregirse para un blanco de disolvente.
Las mediciones de fluorescencia son sensibles a la presencia de polvo y otras partculas slidas en la muestra de prueba. Tales
impurezas pueden reducir la intensidad del haz de excitacin o proporcionar lecturas errneamente altas debido a los reflejos
mltiples en la celda de la muestra. Por lo tanto, es conveniente eliminar las partculas slidas mediante centrifugacin; tambin se puede emplear la filtracin, aunque algunos papeles de filtro contienen impurezas fluorescentes.
A menudo, la regulacin de la temperatura es importante en la espectrofotometra de fluorescencia. Para algunas sustancias,
la eficiencia de la fluorescencia puede reducirse hasta entre 1% y 2% por grado de ascenso de temperatura. En tales casos, si
se desea mayor precisin, es conveniente el uso de celdas para muestra con temperatura controlada. Para los anlisis de rutina,
puede ser suficiente realizar las mediciones con la rapidez necesaria como para que la muestra no se caliente demasiado debido a la exposicin a la fuente de iluminacin intensa. Muchos compuestos fluorescentes son fotosensibles. Expuestos en un
fluormetro, pueden ser fotodegradados en productos ms o menos fluorescentes. Dichos efectos pueden detectarse a travs
de la observacin de la respuesta del detector en relacin al tiempo y pueden reducirse atenuando la fuente de iluminacin
con filtros o pantallas.
Los cambios de disolvente pueden afectar notablemente la intensidad y distribucin espectral de la fluorescencia. Por lo tanto, no es aconsejable alterar el disolvente especificado en los mtodos establecidos sin una cuidadosa investigacin preliminar.
Muchos compuestos son fluorescentes en disolventes orgnicos pero prcticamente no son fluorescentes en agua; por lo tanto, se deben probar varios disolventes antes de que se decida si un compuesto es o no fluorescente. En muchos disolventes
orgnicos, la intensidad de la fluorescencia aumenta mediante la eliminacin del oxgeno disuelto, que ejerce un fuerte efecto
de extincin. El oxgeno puede eliminarse mediante burbujeo de un gas inerte, como por ejemplo nitrgeno o helio, a travs
de la muestra de prueba.
Una medida semicuantitativa de la fuerza de la fluorescencia est dada por el cociente entre la intensidad de fluorescencia
de una muestra de prueba y la de un estndar obtenido con los mismos parmetros de ajuste de los instrumentos. Frecuentemente, se emplea como estndar de referencia una solucin de concentracin conocida de quinina en cido sulfrico 0,1 N o
de fluorescena en hidrxido de sodio 0,1 N.
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Comparacin Visual
Cuando se indica una comparacin de color o una comparacin de turbidez, deben utilizarse tubos para comparacin de
color que sean tan idnticos como sea posible en dimetro interno y en cualquier otra caracterstica. Para la comparacin de
color, los tubos deben observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con la ayuda de una fuente de iluminacin dirigida
desde debajo de la parte inferior de los tubos, mientras que para la comparacin de turbidez los tubos deben observarse horizontalmente, contra un fondo oscuro, con la ayuda de una fuente de iluminacin lateral.
Al realizar pruebas de lmites que incluyan una comparacin de color en dos recipientes iguales (por ejemplo, tubos para
comparacin de color iguales), podr utilizarse un instrumento apropiado, en lugar de realizar una observacin visual directa.
852 ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA
Captulos
INTRODUCCIN
La espectroscopa de absorcin atmica (AA) es un mtodo analtico para la identificacin y/o la cuantificacin de elementos. Para estas aplicaciones, el mtodo de AA se utiliza en procedimientos que miden la absorbancia de radiacin a una longitud de onda caracterstica por parte de un vapor compuesto de tomos en estado fundamental. Un instrumento tpico consta
de una fuente de energa primaria que produce el espectro del elemento en anlisis, un monocromador y un detector adecuado.
Para obtener informacin sobre teora y principios de mediciones, ver el captulo Espectroscopa de Absorcin AtmicaTeora
y Prctica 1852, recurso que puede ser til, aunque no es obligatorio.
CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS DE ABSORCIN ATMICA

La calificacin de un espectrofotmetro de AA puede dividirse en tres elementos: calificacin de la instalacin (IQ, por sus
siglas en ingls), calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y calificacin de desempeo (PQ, por sus siglas en ingls);
ver tambin el captulo de informacin general Calificacin de Instrumentos Analticos 1058.
Los requisitos de calificacin de la instalacin proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuadamente en el lugar deseado.
En la calificacin operativa, se caracteriza el desempeo de un instrumento usando estndares con propiedades espectrales
conocidas para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones esperadas (ver la Tabla 1 y la Tabla 2). El propsito
de la calificacin operativa es demostrar que el desempeo del instrumento es adecuado. La calificacin operativa es una verificacin de los parmetros operativos clave que se realiza despus de la instalacin y despus de las reparaciones y/o el mantenimiento.
Las pruebas de calificacin operativa discutidas en las secciones siguientes son ejemplos tpicos. Se pueden usar otras pruebas y muestras para establecer las especificaciones para la calificacin operativa. Los proveedores de instrumentos a menudo
proveen muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Instalacin/Calificacin Operativa.
Tabla 1. Prueba de Calificacin Operativa y Criterios de Aceptacin para Espectrofotmetros de AA a la Llama
Prueba
Procedimiento
Sensibilidad
Aspirar un estndar de Zn de 0,3 mg/mL y registrar la absorbancia.
20% de UAa especificada por el fabricante del instrumento
Linealidad
Aspirar el blanco y estndares de Zn de 0,05; 0,075; 0,10;

0,25 y 0,50 mg/mL. Generar una curva de calibracin y registrar el coeficiente de correlacin (R).
Coeficiente de correlacin, no menos de 0,995
a
b
UA = unidad de absorbancia.
%RSD = desviacin estndar relativa porcentual.
Pruebas Fsicas / 852 Espectroscopa de Absorcin Atmica 699
USP 38
Tabla 1. Prueba de Calificacin Operativa y Criterios de Aceptacin para Espectrofotmetros de AA a la Llama (Continuacin)
Prueba
Precisin
a
b
Procedimiento
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estndar

de Zn de 0,10 mg/mL en funcin de la curva estndar generada para la prueba de Linealidad. Calcular la %RSD de los 5
resultados en mg/mL.
%RSDb, no ms de 3%
UA = unidad de absorbancia.
%RSD = desviacin estndar relativa porcentual.
Tabla 2. Prueba de Calificacin Operativa y Criterios de Aceptacin para Espectrofotmetros de AA con Horno de Grafito
Prueba
Procedimiento
Sensibilidad
Preparar un estndar de Cu y medir la masa caracterstica segn 20% de masa caracterstica de Cu segn lo especificado
lo descrito por el fabricante.
por el fabricante
Coeficiente de correlacin, no menos de 0,995
Linealidad
Generar una curva de calibracin a partir de un blanco y estndares de Cu de 25; 50; 75 y 100 mg/L. Inyectar cada estndar
por triplicado y registrar la %RSD.
%RSD para 5 determinaciones repetidas, no ms de 3%
Precisin
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estndar

de Cu de 50 mg/L en funcin de la curva estndar generada
para la prueba de Linealidad. Inyectar cada determinacin repetida por triplicado.
%RSD para inyecciones por triplicado de cada estndar de

Cu, no ms de 5% (sin incluir el blanco)
%RSD para inyecciones por triplicado, no ms de 5%
Calificacin de Desempeo
PROCEDIMIENTO
Evaluar y seleccionar el tipo de material de fabricacin, y mtodos de pretratamiento y limpieza del material de laboratorio
analtico usado en los anlisis de AA. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicacin especfica, resistente a disolventes custicos, cidos u orgnicos. Para algunos anlisis, se debe tomar adecuada precaucin para prevenir la adsorcin de
analitos en la superficie del recipiente, especialmente en los anlisis a nivel de ultratraza. La contaminacin de las soluciones de
muestra derivada de metales e iones presentes en el recipiente tambin puede generar resultados inexactos.
Para el anlisis de un elemento ubicuo, a menudo resulta necesario usar el grado ms puro disponible de un reactivo o disolvente. Verificar todas las soluciones (diluyentes, soluciones modificadoras de matriz, soluciones para supresin de ionizacin,
reactivos y otros) para detectar contaminacin elemental antes de usarlas en un anlisis.
Solucin Estndar
Preparar segn se indica en la monografa individual. [NOTASe pueden usar soluciones estndar de elementos individuales
o multielementos disponibles comercialmente, rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnologa) (National Institute of
Standards and Technology o a una organizacin de metrologa nacional equivalente, para la preparacin de las soluciones estndar.] Las soluciones estndar, en especial aqullas usadas en el anlisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida til limitada. Las soluciones estndar deben conservarse durante no ms de 24 horas, a menos que su estabilidad se demuestre experimentalmente.
Asimismo, se puede usar el mtodo de estndar agregado. Este mtodo implica agregar a la muestra una concentracin conocida del elemento analito a no menos de dos niveles de concentracin con respecto a una preparacin de la muestra sin el
agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en funcin de la concentracin del elemento analito agregado y se traza una lnea de regresin lineal con los puntos correspondientes a los datos. La concentracin del analito
de la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x-por el factor de dilucin que
corresponda.
Captulos
La calificacin de desempeo determina que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin.
Dependiendo del uso tpico, las especificaciones de calidad de desempeo pueden diferir de las especificaciones del fabricante. Para mtodos validados, las pruebas de calidad de desempeo especficas, tambin conocidas como pruebas de aptitud
del sistema, se pueden usar en lugar de los requisitos de calificacin de desempeo.
Los procedimientos especficos, criterios de aceptacin e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeo de un espectrofotmetro de AA dependen del instrumento y de la aplicacin para la que se utiliza. Demostrar el desempeo estable del
instrumento durante periodos prolongados provee cierta garanta de que se pueden tomar mediciones confiables a partir de
los espectros de la muestra de prueba usando procedimientos validados de AA.
700 852 Espectroscopa de Absorcin Atmica / Pruebas Fsicas
USP 38
Solucin Muestra
Preparar segn se indica en la monografa individual.
Pueden indicarse diversas tcnicas de digestin para disolver la muestra. stas pueden incluir digestiones en placa caliente o
digestiones asistidas por microondas, y mediante aproximaciones con recipiente abierto o cerrado. Debe tomarse en cuenta
que la digestin en recipientes abiertos por lo general no se recomienda en los anlisis de metales voltiles, p.ej., selenio y
mercurio.
Captulos
Anlisis
Seguir el procedimiento segn se indica en la monografa individual con respecto a los parmetros instrumentales.
El instrumento debe estandarizarse para cuantificacin al momento de su uso. La absorbancia de las soluciones estndar que
abarcan la concentracin esperada se determina en funcin de un blanco apropiado. La respuesta del detector se grafica como
una funcin de la concentracin del analito. Al realizar un anlisis en el lmite de deteccin o en su cercana, no siempre es
posible usar un estndar que abarque la concentracin esperada (bracketing standard). Esto es aceptable para pruebas cualitativas, pero no para pruebas cuantitativas. El anlisis de regresin de la grfica estndar debe usarse para evaluar la linealidad de
la respuesta del detector, y las monografas individuales pueden establecer criterios para el error residual de la lnea de regresin.
Para demostrar la estabilidad de la estandarizacin inicial del sistema, se debe volver a valorar una solucin usada en la curva
estndar inicial como un estndar de verificacin en intervalos apropiados durante todo el anlisis del conjunto de muestras. A
menos que se indique de otro modo en la monografa individual, el estndar nuevamente analizado debe concordar con su
valor esperado con una aproximacin de 3% para una valoracin, o de 20% para un anlisis de impurezas.
Las concentraciones de la muestra se calculan en funcin de la curva de calibracin que se genera graficando la respuesta
del detector en funcin de la concentracin del analito en las soluciones estndar.
Validacin
La validacin es necesaria cuando un mtodo de AA se destina para su uso como una alternativa al procedimiento oficial
para el anlisis de un artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un procedimiento de AA es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito previsto, incluyendo la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o medicamento (valoraciones de Categora I), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora II) y las pruebas de identificacin (Categora IV). [NOTAPara definiciones sobre las diversas categoras, ver el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
1225.] Dependiendo de la categora de la prueba, la validacin del procedimiento analtico para AA puede requerir el anlisis
de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la
robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a mtodos con estndar externo y a mtodos de estndar
agregado.
El captulo de informacin general 1225 provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al
usuario criterios especficos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.
EXACTITUD
Para valoraciones de Categora I o pruebas de Categora II, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperacin con la matriz apropiada adicionada con concentraciones conocidas del elemento a analizar. Tambin es una prctica
aceptable comparar los resultados de la valoracin obtenidos usando el procedimiento de AA que se est validando con aqullos de un procedimiento analtico establecido. En los mtodos de estndar agregado, la evaluacin de la exactitud se basa en
la concentracin final calculada a partir de la ordenada al origen, y no en la recuperacin calculada a partir de las adiciones de
estndar individuales.
Criterios de validacin: 95,0%105,0% de recuperacin media para la valoracin del frmaco y la valoracin del medicamento, y 70,0%150,0% de recuperacin para el anlisis de impurezas. Estos criterios se aplican a todo el intervalo previsto.
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Pruebas Fsicas / 852 Espectroscopa de Absorcin Atmica 701
Precisin
REPETIBILIDAD
El procedimiento analtico debe evaluarse midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera
independiente al 100% de la concentracin de la prueba de valoracin. Alternativamente, se pueden usar tres determinaciones
repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentraciones. En este caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptacin. Si se valida un procedimiento
usando el mtodo de estndar agregado, el criterio de precisin se aplica al resultado experimental final, no a la exactitud de
los niveles individuales de estndar agregado.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 5,0% para la valoracin del frmaco, no ms de 5,0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 20% para el anlisis de impurezas.
PRECISIN INTERMEDIA
ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequvocamente cada analito elemental en presencia de componentes que se
espera encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de validacin: Se demuestran mediante el cumplimiento con el requisito de exactitud.
El lmite de cuantificacin (QL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de
seis mediciones repetidas de una solucin blanco, dividida por la pendiente de una curva estndar y multiplicando por 10. Si
se valida un procedimiento usando el mtodo de estndar agregado, se usa la pendiente de los estndares aplicados a una
solucin del material de prueba. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el captulo 1225).
Se debe llevar a cabo una medicin de una solucin de prueba, preparada a partir de una matriz de muestra representativa
a la que se le han agregado cantidades conocidas, a la concentracin de lmite de cuantificacin para confirmar la exactitud. Si
se valida un procedimiento usando el mtodo de estndar agregado, el criterio de validacin se aplica al resultado experimental final, no a la recuperacin de cantidades agregadas conocidas de los niveles de adicin de estndar individuales.
Criterios de validacin: El procedimiento analtico debe ser capaz de determinar el analito con precisin y exactitud a un
nivel equivalente al 50% de la especificacin.
LINEALIDAD
Se prepara una curva de respuesta entre la concentracin del analito y la absorbancia, a partir de no menos de cinco soluciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin de prueba. Posteriormente, la curva estndar se evala usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mnimos.
Para experimentos que no generen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta de AA, se deben aplicar mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Criterios de validacin: Coeficiente de correlacin (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categora I y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categora II.
INTERVALO
El trmino intervalo se refiere al rango entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel adecuado de
precisin, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisin y exactitud.
Criterios de validacin: Para pruebas de Categora I, el intervalo de validacin para criterios de aceptacin centrados en
100,0% es 80,0%120,0%. Para criterios de aceptacin no centrados, el intervalo de validacin es 10,0% por debajo del lmite
Captulos
Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento. Las variables
tpicas incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o ms analistas realicen el mtodo.
Como mnimo, el procedimiento analtico debe evaluarse realizando la prueba de repetibilidad en cualquiera de las condiciones mencionadas previamente (con un total de 12 mediciones).
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 8,0% para la valoracin del frmaco, no ms de 8,0%
para la valoracin del medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.
702 852 Espectroscopa de Absorcin Atmica / Pruebas Fsicas
USP 38
inferior hasta 10,0% por encima del lmite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validacin es 70,0%
130,0%. Para pruebas de Categora II, el intervalo de validacin abarca 50,0%120,0% de los criterios de aceptacin.
ROBUSTEZ
La confiabilidad de una medicin analtica se demuestra mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales.
Para la AA esto puede incluir, entre otros, las etapas de preparacin de la muestra y los programas de calentamiento, incluyendo el tiempo de espera de atomizacin o la temperatura de atomizacin. Se debe tener cuidado al cambiar los flujos de combustible y gas de oxidacin as como las partes del mechero, ya que podran crearse condiciones de retroceso de la llama.
Captulos
Verificacin
Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USPNF, no estn obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En vez de esto, los usuarios simplemente deben verificar
su aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin del procedimiento de AA es demostrar que el usuario puede llevar a cabo el procedimiento,
segn se describe en la monografa especfica, con una exactitud, especificidad, linealidad y precisin adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226, si la verificacin del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografa, no resulta exitosa, el procedimiento
puede no ser adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencia Generales 6.30.
La verificacin de los mtodos farmacopeicos de AA deben, como mnimo, incluir la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, linealidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validacin.
USP38
853 ESPECTROSCOPA DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCIN
La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorcin de luz a una longitud de onda especfica (excitacin)
seguida de emisin de luz, por lo regular a una longitud de onda mayor. La emisin de luz se denomina fluorescencia.
El tipo ms comn de muestra fluorescente es una solucin transparente submicromolar que absorbe la luz siguiendo la Ley
de LambertBeerBouguer y emite fluorescencia con una intensidad que es directamente proporcional a la concentracin, a la
absortividad y al rendimiento cuntico de fluorescencia de las especies fluorescentes o del fluorforo.
A diferencia de la espectroscopa de absorcin, en donde la desviacin de la linealidad es la excepcin, la linealidad de la
fluorescencia puede verse afectada por una variedad de efectos relacionados con la muestra. Para obtener informacin adicional, ver el captulo Espectroscopa de FluorescenciaTeora y Prctica 1853.
Los mtodos de fluorescencia tambin se denominan exentos de fondo debido a la poca luz de excitacin que alcanza el detector. Esta caracterstica hace que la deteccin de fluorescencia sea altamente sensible, hasta el punto de lograr la deteccin
de una sola molcula en algunos casos. La deteccin de fluorescencia tambin puede ser altamente especfica debido a que un
fluorforo tiene un patrn de emisin caracterstico. La especificidad y la sensibilidad son dos de los puntos fuertes ms importantes de los mtodos de fluorescencia.
CALIFICACIN DE INSTRUMENTOS DE FLUORESCENCIA

Los analistas aseguran la aptitud de un instrumento especfico para un procedimiento dado usando una evaluacin paso a
paso para la aplicacin deseada, desde la seleccin, hasta el retiro del instrumento: calificacin del diseo (DQ, por sus siglas
en ingls); calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls); una calificacin inicial del desempeo con respecto a la
especificacin, tambin conocida como calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls); y una continua calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para obtener informacin adicional, ver el captulo general Calificacin de Instrumentos
Analticos 1058.
La calificacin del diseo y la calificacin de la instalacin quedan fuera de la consideracin de este captulo. El propsito de
esta seccin es proveer mtodos de prueba y criterios de aceptacin para asegurar que el instrumento es adecuado para su uso
Pruebas Fsicas / 853 Espectroscopa de Fluorescencia 703
USP 38
previsto (calificacin operativa) y que continuar funcionando adecuadamente durante periodos extensos (calificacin del desempeo).
Al igual que con cualquier dispositivo espectromtrico, se debe calificar la exactitud y precisin de la longitud de onda (eje
x) y la intensidad relativa (eje y o eje de seal) de un espectrofluormetro. Asimismo, se debe establecer la sensibilidad. La
calificacin operativa debe abarcar los intervalos de operacin requeridos para las escalas de intensidad y de longitud de onda.
Calificacin Operativa de Instrumentos

Las tolerancias provistas en la calificacin de la operacin y del desempeo del instrumento son aplicables para su uso general. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analtico
usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo ponen a disposicin muestras y
parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Instalacin/Calificacin Operativa.
Siempre que sea posible, para las etapas que se detallan a continuacin, deben usarse materiales de referencia certificados
para propsitos de calibracin en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Cuando los materiales de referencia certificados se obtengan de una fuente acreditada reconocida, debern tener asignaciones de valores rastreables y verificados de
manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas.
En este captulo se diferencian dos tipos generales de mediciones instrumentales: espectrales (es decir, aqullas que miden la
intensidad en funcin de la longitud de onda) y fijas (es decir, aqullas que miden la intensidad a una longitud de onda y
ancho de banda fijos).
CONTROL DE LONGITUDES DE ONDA
ESPECTROS DE LNEAS ATMICAS
Este procedimiento se describe como la aplicacin primaria debido a que las lneas de emisin producidas a partir de una
lmpara de descarga son caractersticas del elemento fuente y, como estndar fsico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no ms de 0,01 nm. En la espectrofluorometra en solucin, el sesgo de la longitud de onda requerida raramente excede de 1,0 nm. Por estas razones, los valores del estndar atmico de lnea se citan sin la
incertidumbre. La lmpara debe colocarse en la posicin de la fuente del espectrofluormetro.
Una lmpara de mercurio de baja presin comnmente empleada tiene una variedad de lneas intensas que abarcan una
gran parte del intervalo UV y visible. Los fabricantes usan a menudo dos lneas de xenn a partir de la fuente a 260,5 y 541,9
nm como una verificacin interna de la calibracin, debido a que es posible verificar la exactitud de los monocromadores de
excitacin y de emisin y usarla para propsitos de diagnstico (ver la Tabla 1).1
Tabla 1. Longitudes de Onda de Espectros de Lneas de Elementos
Elemento
Longitud de Onda
(nm)
Hg
253,7
Xe
260,5
Hg
296,7
Hg
365,0
Hg
404,7
Hg
435,8
Xe
541,9
Los valores redondeados se toman de la Norma E388-04 (2009) de la ASTM.
Captulos
El nivel de confianza de las posiciones observadas de los picos se define mediante la exactitud de la longitud de onda para
mediciones espectrales. La determinacin de la exactitud de una gran cantidad de longitudes de onda a lo largo del intervalo
de longitud de onda deseado demuestra si es necesaria la calibracin adicional en ms de un solo punto. La calibracin en
mltiples puntos implica medir los sesgos de la longitud de onda a mltiples longitudes de onda y corregir por la dependencia
de la longitud de onda del sesgo. A menudo, se puede aplicar una calibracin en un solo punto al eje de la longitud de onda
en el software de un instrumento antes de recopilar los datos, pero una calibracin en mltiples puntos puede requerir que se
aplique la correccin a los espectros despus de recopilarlos.
Para mediciones fijas, la posicin de la longitud de onda y el ancho de banda deben ser reproducibles. Para la seleccin de
longitudes de onda basadas en filtros, se requiere nicamente usar el mismo filtro al comparar datos a lo largo del tiempo. Si
se debe usar un filtro distinto (p.ej., cuando los datos se comparan entre instrumentos y laboratorios), entonces deben compararse las curvas de transmisin de los filtros.
La precisin de la longitud de onda debe determinarse sobre el intervalo de operacin usando al menos seis mediciones
repetidas. La desviacin estndar no debe exceder de 1 nm.
704 853 Espectroscopa de Fluorescencia / Pruebas Fsicas
USP 38
Tabla 1. Longitudes de Onda de Espectros de Lneas de Elementos (Continuacin)

Elemento
Longitud de Onda
(nm)
Hg
546,1
Hg
577,0
Hg
579,1
USO DE SOLUCIONES DE XIDOS DE TIERRAS RARAS
Este procedimiento emplea una solucin de xido de tierras raras que se prepara mediante disolucin en medio cido. La
ms frecuente est compuesta de xido de holmio en cido perclrico en combinacin con un reflector difuso localizado en la
posicin de la muestra. Se encuentran disponibles comercialmente materiales de referencia certificados adecuados.2 Se debe
retirar el selector de longitud de onda que no est siendo escaneado; si no resulta prctico retirarlo, se deber ajustar a orden
cero (en esta posicin una red de difraccin se comporta como un espejo que refleja todas las longitudes de onda). El reflector
difuso se escanea con y sin la muestra de tierra rara en posicin, y se calcula el cociente entre las dos intensidades para obtener
un espectro de transmitancia efectiva. Los mnimos en el cociente entre las intensidades corresponden a los picos de absorcin
de la muestra. Para una solucin al 4% (p/p) de xido de holmio en cido perclrico a un ancho de banda espectral de 1,0 nm
y una longitud de paso de 1 cm, estos mnimos se encuentran en la Tabla 2.3
Tabla 2
Captulos
Longitud de Onda
(nm)
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3
451,4
467,8
485,2
536,6
640,5
Si el intervalo operativo del espectrofotmetro se encuentra fuera de 240650 nm, se usan otros xidos de tierras raras certificados u otras soluciones.
El didimio (una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estndar rastreable en presentaciones
tanto en solucin como vidrio. El didimio es similar en su preparacin a los materiales de holmio y tiene caractersticas de pico
tiles en la regin de 730870 nm. Los picos tiles se encuentran en la solucin de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0;
794,1; 799,0 y 864,4 nm.
USO DE REFERENCIAS DOPADAS CON POLIMETILMETACRILATO
Este procedimiento usa materiales de referencia slidos fabricados mediante la polimerizacin de una variedad de compuestos activos fluorescentes de anillo aromtico en una matriz de polimetilmetacrilato (PMMA) inerte. Estos materiales se proveen
en forma de bloques pulidos para su uso en un portacubetas estndar (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Datos de Dopante, Excitacin y Emisin para Materiales de Referencia Seleccionados
Excitacin l
(nm)
Emisin l
(nm)
p-Terfenilo
295
338
Ovaleno
342
482
Tetrafenilbutadieno
348
422
Dopante
2
3
La norma NIST SRM 2034 ya no est disponible.

Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorcin estndar a la longitud de onda intrnseca provistos en Travis et al. J Phys Chem Ref Data
2005; 34(1):41. La incertidumbre de la medicin del 95% del mximo es 0,06 nm.
USP 38
Tabla 3. Datos de Dopante, Excitacin y Emisin para Materiales de Referencia Seleccionados (Continuacin)
Dopante
Antraceno
Excitacin l
(nm)
Emisin l
(nm)
360
402
Verificacin del Desempeo

Los resultados obtenidos del anlisis diario de estndares de intensidad fotoestable se usan para verificar el desempeo de
un instrumento. Si la intensidad medida no cambia con respecto a la observada al momento de calificar el instrumento, entonces se considera que el desempeo del instrumento no ha cambiado y contina en estado calificado. Usar dichos estndares
para determinar una escala de intensidad casi absoluta o basada en artefactos permite que las intensidades y la sensibilidad de
los instrumentos medidas puedan compararse con el paso del tiempo o entre instrumentos. Las mediciones de las intensidades
deben estar dentro del intervalo lineal del sistema de deteccin del instrumento antes de que los analistas intenten realizar
comparaciones de las intensidades, y se vern afectadas por cualquier efecto instrumental directamente relacionado con la seal de fluorescencia, p.ej., cambios en la intensidad de la fuente, respuesta del detector, entre otros.
Para instrumentos con seleccin de longitud de onda basada en filtros, se usan estndares de fluorescencia para correccin
espectral a fin de determinar las diferencias esperadas entre intensidades ocasionadas por filtros con diversos perfiles de transmisin. Mediante la compensacin de estas diferencias de intensidad debidas a la falta de correspondencia espectral, es posible determinar una escala de intensidad casi absoluta para dichos instrumentos. Los analistas deben abordar las comparaciones
entre instrumentos con particular precaucin debido a que las incertidumbres implicadas son relativamente grandes y difciles
de cuantificar.
La banda Raman del agua se usa para medir las relaciones seal-ruido en instrumentos de fluorescencia. La banda Raman del
agua es inherentemente reproducible y no se degrada con el tiempo. El agua es conveniente de obtener en un estado puro y
permite realizar comparaciones entre laboratorios con un alto nivel de confianza. No se requiere preparacin o dilucin. La
banda Raman es una seal de bajo nivel que provee una buena prueba para los componentes pticos y electrnicos de un
sistema instrumental.
La banda Raman del agua no se debe a un fenmeno de fluorescencia, sino que es el resultado de la dispersin Raman. Para
el agua, la banda Raman siempre presenta un desplazamiento hacia el rojo de 3382 cm1 con respecto a la excitacin.4 Esta
banda por lo regular se mide mediante excitacin a 350 nm, lo que resulta en un pico Raman a 397 nm, aunque tambin se
puede usar radiacin de hasta 500 nm como longitud de onda de excitacin, y el pico de emisin correspondiente es 602 nm.
USO DE ESTNDARES DE INTENSIDAD
Se encuentran disponibles diversos materiales fluorescentes dopados con slidos.5 Estos polmeros o materiales vtreos permiten la correccin espectral relativa y la calificacin diaria del desempeo de instrumentos de fluorescencia a lo largo de las
regiones UV, visible e infrarrojo cercano de 320 a 830 nm. La alta fotoestabilidad de los materiales los hace particularmente
tiles como estndares de intensidad para uso diario, incluso cuando no se requiere la correccin espectral o cuando la longitud de onda de excitacin difiere de la usada para certificacin. Se provee un espectro de emisin en estado estacionario certificado con cada material de referencia certificado, junto con las incertidumbres totales estimadas. La referencia est disponible
en forma de cubeta de vidrio slido, de tamao estndar (12,5 mm 12,5 mm 45 mm) con tres caras largas pulidas para
deteccin a 90 y una cara larga esmerilada para deteccin de cara frontal o de epifluorescencia.
Como alternativa, se pueden usar soluciones de fluorforos que hayan demostrado ser estables.6,7
MEDICIONES CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS DE FLUORESCENCIA

Por lo regular se llevan a cabo dos clases de procedimientos de medicin generales mediante espectrometra de fluorescencia: cualitativa y cuantitativa.
4
5
El valor de desplazamiento hacia el rojo se toma de Parker CA. Raman spectra in spectrofluorimetry. Analyst. 1959; 84:446453.
Disponibles a travs de proveedores comerciales y en el NIST como SRMs 2940 (emisin naranja), 2941 (emisin verde), 2942 (emisin UV), 2943 (emisin azul)
y 2944 (emisin roja/IR).
6 Los proveedores comerciales proporcionan una solucin de 1 mg/L de sulfato de quinina deshidratado en cido perclrico 0,105 M que ha sido completamente
caracterizada por el NIST como SRM 936a.
7 Se encuentra disponible una serie de Estndares de Intensidad para uso diario en el Instituto Federal Alemn para Investigacin y Anlisis de Materiales (BAM, por
sus siglas en alemn).
Captulos
USO DE AGUA DE BAJA CONDUCTIVIDAD (18 MW)
USP 38
Mediciones Cualitativas de Fluorescencia

Las mediciones cualitativas de fluorescencia se usan para detectar la presencia de analitos particulares y brindar una respuesta positiva o negativa. Las longitudes de onda de excitacin y de emisin a menudo se seleccionan en el mximo del pico del
fluorforo que se va a detectar. Se debe considerar la cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultado positivo
que asegure que el mtodo es apropiado para la aplicacin particular. La observacin de fluorescencia en la posicin del pico
por encima del lmite de deteccin (generalmente 3 veces el nivel de ruido) indica un resultado positivo.
Mediciones Cuantitativas de Fluorescencia

Las mediciones cuantitativas de fluorescencia se usan para determinar las cantidades o concentraciones de analitos en muestras desconocidas. Estas cantidades pueden determinarse en unidades absolutas, tales como moles o moles por L, o en unidades relativas, tales como el cociente entre las concentraciones de dos analitos fluorescentes contenidos en una sola solucin
desconocida. Dichas determinaciones usan la siguiente proporcionalidad, que relaciona la seal de fluorescencia (S) con la
concentracin de analito fluorescente (c) en un par dado de longitudes de onda de excitacin y de emisin (lex, lem) :
Captulos
S /0 W Rd a F c
/0 = intensidad del haz de excitacin
W = fraccin de la fluorescencia recolectada por el sistema de deteccin
Rd = capacidad de respuesta del sistema de deteccin
a = coeficiente de absorcin
F = rendimiento cuntico de fluorescencia
c = concentracin del analito fluorescente
Esta proporcionalidad lineal con la concentracin se aplica a muestras pticamente diluidas (p.ej., soluciones con una absorbancia de menos de 0,05 a una longitud de paso de 1 cm).
BUENA PRCTICA ESPECTROSCPICA

La mejor manera de realizar comparaciones de una muestra de prueba con un Estndar de Referencia es en un pico de emisin espectral para el compuesto de inters. Los ensayos basados en espectrofluorometra proveen las longitudes de onda comnmente aceptadas para la excitacin y para la emisin de pico espectral de la sustancia de inters. Espectrofluormetros
diferentes pueden presentar variaciones menores en la longitud de onda aparente de este pico. Las comparaciones deben realizarse a la longitud de onda en la que ocurre el pico de emisin. Si sta difiere de la longitud de onda especificada en la monografa en ms de 1 nm en el intervalo de 200400 nm o en ms de 2 nm en el intervalo de 400800 nm, puede ser una
indicacin de la necesidad de recalibrar el instrumento.
Uso de Estndares de Referencia

Salvo algunas excepciones, los procedimientos espectrofluoromtricos farmacopeicos proveen resultados mediante comparacin contra un Estndar de Referencia USP. Esto asegura una medicin en condiciones idnticas para la muestra de prueba y
el Estndar de Referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la seleccin del ancho de banda
espectral, la colocacin y correccin de la celda, y los niveles de intensidad. Las celdas que presentan caractersticas de fluorescencia ptica idnticas a una longitud de onda especfica pueden diferir considerablemente a otras longitudes de onda. Se
deben establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando as se requiera.
Los trminos preparacin similar y solucin similar en pruebas y valoraciones que implican espectrofluorometra indican que el
Estndar de Referencia debe prepararse y observarse de una manera idntica a la usada para la muestra en anlisis. Por lo regular, cuando se prepara una solucin del Estndar de Referencia especificado a (es decir, dentro del 10% de) la concentracin
deseada, la intensidad de fluorescencia se calcula basndose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una
muestra previamente secada del Estndar de Referencia, esta intensidad deber corregirse con respecto a la sustancia anhidra.
Las expresiones determinar concomitantemente y medidos(as) concomitantemente segn se usan en los procedimientos que
implican espectrofluorometra indican que la fluorescencia de la solucin muestra y de la solucin estndar, con respecto al
blanco de prueba especificado, deben medirse de manera sucesivamente inmediata.
Preparacin de la Solucin Muestra

Para determinaciones en las que se usa espectrofluorometra UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A menos que se indique de otro modo en la monografa, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente usando una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hidrocarburos pequeos, teres y soluciones diluidas de cidos fuertes y lcalis. Los disolventes deben estar libres de
contaminantes que emitan fluorescencia en la regin espectral que se est analizando. Para el disolvente, se debe usar metanol
USP 38
o alcohol exentos de agua, o alcohol que se haya desnaturalizado mediante la adicin de metanol, pero que no contenga benceno u otras impurezas interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotomtrica que garantizan estar exentos de contaminantes estn disponibles comercialmente de diversos proveedores, pero algunos disolventes analticos orgnicos de grado
reactivo pueden contener trazas de impurezas que emiten una fuerte fluorescencia en la regin UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparacin de la solucin muestra, de la solucin estndar y del blanco. Se deben usar disolventes que no tengan una seal de fluorescencia interferente a las longitudes de onda de inters. En el uso normal, la intensidad de la lnea base de fluorescencia no
debe ser ms del 2% de la seal de la medicin esperada a menos que se haya justificado previamente un valor mayor.
Las valoraciones en la regin visible por lo regular exigen comparar concomitantemente las intensidades de fluorescencia
producidas por la solucin muestra con la producida por una solucin estndar que contenga una cantidad aproximadamente
igual de un Estndar de Referencia USP. En algunos casos, se puede permitir la omisin del uso de un Estndar de Referencia.
Lo anterior es posible cuando las valoraciones espectrofluoromtricas se llevan a cabo con una frecuencia de rutina, cuando
hay una curva estndar adecuada disponible, preparada con el Estndar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia
valorada cumple con la Ley de LambertBeerBouguer dentro del intervalo de aproximadamente 75%125% de la concentracin final usada en la valoracin. En estas circunstancias, la intensidad de fluorescencia encontrada en la valoracin se puede
interpolar en la curva estndar y se puede calcular el resultado de la valoracin. Dichas curvas estndar deben ser confirmadas
con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofluormetros o nuevos lotes de reactivos.
Validacin
EXACTITUD
Para procedimientos de Categora I , Categora II y Categora III, la exactitud se determina realizando estudios de recuperacin agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de
la valoracin obtenidos usando el procedimiento de fluorescencia que se est validando con aqullos de un procedimiento
analtico establecido.
Criterios de validacin: 98,0%102,0% de recuperacin media para un frmaco, 95,0%105,0% de recuperacin media
para la valoracin de un medicamento y 80,0%120,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios
deben cumplirse en todo el intervalo previsto.
Precisin
REPETIBILIDAD
La repetibilidad del procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, la repetibilidad puede
evaluarse midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente similares para que la repetibilidad sea similar en
todo el intervalo de concentracin. Si esto se lleva a cabo, la repetibilidad en las tres concentraciones se puede combinar para
compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para la valoracin de un frmaco, no ms de
2,0% para un medicamento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
Captulos
La validacin es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento basado en espectroscopa de fluorescencia como alternativa al procedimiento oficial. El objetivo de una validacin es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito deseado, lo cual incluye lo siguiente: la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o un medicamento
(valoraciones de Categora I), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora II) y las pruebas de
identificacin (Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (para informacin adicional, ver la Tabla 2 del captulo
Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225), el proceso de validacin del procedimiento analtico para fluorescencia requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la robustez. Estas caractersticas de desempeo analtico se aplican a procedimientos con estndar externo y a aqullos que emplean estndar agregado. El captulo 1225 provee definiciones y pautas generales sobre la validacin de procedimientos analticos sin indicar criterios de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es
proveer al usuario criterios especficos de validacin que representan las expectativas mnimas para la tecnologa de fluorescencia. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.
USP 38
Precisin Intermedia
Se debe evaluar el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del procedimiento. Las variables tpicas
incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveern una estimacin de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 3,0% para la valoracin de un medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.
ESPECIFICIDAD
En las mediciones de fluorescencia, la especificidad se asegura mediante el uso de un Estndar de Referencia siempre que sea
posible y se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
Criterios de validacin: Se demuestran cumpliendo con los requisitos de exactitud.
LMITES DE DETECCIN
Captulos
El lmite de deteccin (DL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de seis
mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviacin estndar puede determinarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o demostrando que la relacin seal-ruido es >3,3.
Adems, se debe confirmar el lmite de deteccin estimado analizando muestras a la concentracin calculada.
seis mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 10. Como alternativa, la desviacin estndar puede determinarse a partir del error en la ordenada al origen de una curva de calibracin o demostrando que la relacin seal-ruido es
>10.
Para confirmar una sensibilidad suficiente y una precisin adecuada, se mide una solucin de muestra preparada a partir de
una matriz de muestra representativa a la que se le han agregado cantidades conocidas a la concentracin del lmite de cuantificacin requerido. La relacin seal-ruido observada en el lmite de cuantificacin requerido debe ser >10.
Criterios de validacin: Para considerar que el lmite de cuantificacin estimado es vlido, la concentracin medida debe ser
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificacin.
LINEALIDAD
Se prepara una curva de respuesta entre la concentracin del analito y la seal de fluorescencia a partir de no menos de
cinco Soluciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin muestra. Posteriormente, se debe evaluar la linealidad de la curva estndar usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de
cuadrados mnimos. La desviacin de la linealidad pude derivarse de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles aceptables mediante la reduccin de la concentracin del analito y, por consiguiente, de los valores de
absorbancia relacionados.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categora I y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categora II.
INTERVALO
El intervalo de operacin de un instrumento analtico (y el procedimiento analtico en su totalidad) es el intervalo entre las
concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la funcin de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad.
ROBUSTEZ
Se debe demostrar la confiabilidad de una medicin analtica mediante cambios deliberados en los parmetros experimentales. En el caso de la fluorescencia, estos cambios pueden incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de
almacenamiento especificadas, la variacin del pH, la eliminacin del oxgeno y la adicin de posibles muestras interferentes,
Pruebas Fsicas / 854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio 709
USP 38
por citar algunos ejemplos. Los analistas deben determinar la robustez de manera simultnea usando un diseo experimental
adecuado.
Verificacin
Los procedimientos analticos descritos en los compendios USPNF no requieren validacin. En vez de esto, se usa una verificacin para determinar la aptitud de un procedimiento en condiciones reales de uso.
Por lo tanto, el objetivo de la verificacin del procedimiento de fluorescencia es demostrar la aptitud de un procedimiento
de prueba en condiciones reales de uso. Las caractersticas de desempeo que verifican la aptitud de un procedimiento de
fluorescencia son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analtico. Para informacin adicional, el captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226 incluye un anlisis sobre los principios generales aplicables. La verificacin debe
realizarse usando material de referencia y una matriz bien definida. La verificacin de los procedimientos farmacopeicos de
fluorescencia deben, como mnimo, incluir la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, exactitud, precisin
y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validacin.
Requisitos para Mediciones Indirectas
USP38
854 ESPECTROSCOPA EN EL INFRARROJO MEDIO
INTRODUCCIN
La espectroscopa en el infrarrojo medio es un mtodo instrumental que se usa para medir la absorcin de la radiacin electromagntica sobre el intervalo de nmero de onda entre 4000 y 400 cm1 (correspondiente a longitudes de onda entre 2,5 y
25 mm). A menos que se especifique algo diferente en una monografa u otro procedimiento validado, se debe usar la regin
de 3800 a 650 cm1 (correspondiente a longitudes de onda de 2,6 a 15 mm) para asegurar el complimiento con las especificaciones de la monografa para absorcin IR. La absorcin de fotones ocasiona la promocin de molculas de un estado fundamental de su modo vibratorio a un estado vibratorio excitado.
Los modos vibratorios se definen por el movimiento de todos los tomos en una molcula. Cuando las molculas contienen
ciertos grupos funcionales, la absorcin IR a menudo ocurre en intervalos espectrales estrechos especficos. En estos casos, los
nmeros de onda en los que ocurren dichas transiciones se conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un modo vibratorio implica movimientos atmicos de ms de unos pocos tomos, las frecuencias ocurren en intervalos espectrales
ms amplios y no son caractersticos de un grupo funcional particular, sino que son ms caractersticos de las molculas en
conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de huella dactilar. Todas las bandas fuertes que absorben a nmeros de
onda por encima de 1500 cm1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de 1500
cm1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de huella dactilar.
Para obtener informacin sobre la teora y principios de las mediciones, ver Espectroscopa en el Infrarrojo MedioTeora y
Prctica 1854, que puede ser un recurso til aunque no es obligatorio.
CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS IR
La calificacin de espectrofotmetros en el infrarrojo medio se divide en tres componentes: Calificacin de la Instalacin (IQ,
por sus siglas en ingls), Calificacin Operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y Calificacin del Desempeo (PQ, por sus siglas en
ingls). Para obtener informacin adicional, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos 1058.
Captulos
Algunos procedimientos de fluorescencia emplean reacciones cromognicas. Por lo general, se deben usar los requisitos para
los parmetros de desempeo analtico. En algunos casos, puede no ser posible conseguir la exactitud y la precisin requeridas
para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisin pueden ampliarse hasta un 50%.
Sin embargo, cualquier ampliacin de este tipo debe justificarse con bases cientficas y pruebas documentadas. En tales casos,
podra incrementarse la cantidad de repeticiones requeridas para producir un valor de informe cientficamente slido.
710 854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio / Pruebas Fsicas
USP 38
Debido a que la mayora de los espectros de IR medio se miden mediante espectrofotmetros IR por transformada de Fourier (FTIR, por sus siglas en ingls), este captulo nicamente trata de dichos instrumentos. [NOTAEste captulo no incluye
valores recomendados para la relacin seal-ruido o estabilidad de la lnea al 100% debido a que pueden variar dependiendo
del fabricante, modelo y edad del instrumento.]
EXACTITUD DEL NMERO DE ONDA
El estndar de nmero de onda de uso ms comn para espectrofotometra IR es una pelcula de poliestireno mate de aproximadamente 35 mm de espesor. El espectro de dicha pelcula presenta varias bandas pronunciadas a 3060,0; 2849,5; 1942,9;
1601,2; 1583,0; 1154,5 y 1028,3 cm1. La banda que se selecciona con mayor frecuencia para la determinacin de la exactitud del nmero de onda se encuentra a 1601,2 cm1. Usando una pelcula de poliestireno adecuada u otro estndar de nmero de onda bien caracterizado, barrer nmeros de onda desde 3800 hasta 650 cm1 y comparar el nmero de onda de la respuesta mxima de la banda seleccionada, usando el centro de gravedad, el procedimiento de polinomios spline u otros algoritmos de seleccin de picos, con el nmero de onda de absorcin conocido del estndar. La tolerancia aceptable para el nmero de onda medido es 1,0 cm1.
Captulos

cumplir con los requisitos del usuario para todos los parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin.
PROCEDIMIENTO
Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisin, reflexin externa, reflexin interna (a menudo
denominada reflexin atenuada total), reflexin difusa y espectroscopa fotoacstica. Se encuentran disponibles diversas tcnicas de preparacin de la muestra para dichas opciones. A continuacin se presentan las tcnicas ms comunes de preparacin
de muestra.
Discos de Bromuro de Potasio (KBr)

Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y yoduro de cesio se fusionan a alta
presin y pueden formar discos autoportantes que son transparentes a la radiacin en el infrarrojo medio. El haluro alcalino
que se usa ms comnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a una radiacin en el
infrarrojo medio por encima de 400 cm1.
Se encuentran disponibles prensas y matrices comerciales en una variedad de dimetros para la preparacin de discos de
haluros alcalinos y similares.
Suspensiones de Aceite Mineral

Un procedimiento tpico para preparar una suspensin es colocar 1020 mg de la muestra en un mortero de gata y luego
moler la muestra hasta obtener un polvo con un tamao fino de partcula aplicando un movimiento rotatorio y vigoroso con la
mano del mortero. Se agrega una pequea gota del agente de suspensin al mortero. El movimiento rotatorio de la mano del
mortero se usa para mezclar los componentes hasta formar una pasta uniforme, la cual se transfiere al centro de una ventana
limpia y transparente para IR (p.ej., bromuro de potasio, cloruro de sodio, bromuro de plata o yoduro de cesio). Se coloca una
segunda ventana igual, que calce sobre la parte superior de la suspensin y se aplica presin a la suspensin para formar una
pelcula delgada y translcida libre de burbujas.
El agente de suspensin ms usado para la regin del infrarrojo medio es aceite mineral de hidrocarburos saturados (parafina
lquida, Nujol).
Pelculas de Polmero Autoportantes

En ocasiones, el espectro de transmisin en el infrarrojo medio de muchos polmeros usados como materiales de envasado
se registra a partir de muestras preparadas a manera de pelculas delgadas autoportantes usando moldeado por compresin en
calor o microtoma.
USP 38
Pruebas Fsicas / 854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio 711
Pelculas Capilares
Los lquidos no voltiles pueden examinarse sin diluirlos, usando una capa delgada colocada entre dos ventanas iguales que
sean transparentes a la radiacin en el infrarrojo medio. La capa de lquido debe estar exenta de burbujas y cubrir completamente el dimetro del haz del infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.
Lquidos y Soluciones en Celdas de Transmisin

Para examinar muestras lquidas y en solucin, se encuentran disponibles comercialmente montajes de celdas de transmisin
que constan de un par de ventanas, un espaciador, puertos de llenado y un soporte, en configuraciones para macro y micro
muestras.
Para aplicaciones de laboratorio, los espaciadores por lo regular estn hechos de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o poli(etiln
tereftalato) y, dependiendo de los materiales del espaciador, se pueden ofrecer en longitudes de paso con espesores estndar
que van de aproximadamente 6 mm hasta 1 mm o ms.
Gases
Reflexin Total Atenuada

La espectroscopa de reflectancia total atenuada se basa en el fenmeno ptico de la radiacin pasando a travs de un medio con un alto ndice de refraccin a un cierto ngulo de incidencia que se refleja totalmente de manera interna en un borde
que est en contacto con un material con un ndice de refraccin ms bajo. El medio con alto ndice de refraccin tambin se
conoce como elemento de reflexin interna.
La muestra en anlisis debe colocarse en contacto cercano con el elemento de reflexin interna, por ejemplo, diamante, germanio, selenuro de cinc u otro material adecuado con un alto ndice de refraccin. El contacto cercano y uniforme entre la
sustancia y toda la superficie de cristal debe asegurarse mediante la aplicacin de presin para las muestra slidas o disolviendo la sustancia en el disolvente apropiado y luego cubriendo el elemento de reflexin interna con la solucin y evaporndola
hasta sequedad.
Reflexin Difusa
La forma ms importante y de uso comn para la preparacin de muestras para reflexin difusa es diluir la muestra mezclndola ntimamente con diluyentes transparentes al infrarrojo al 90%99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio
reducidos a polvo fino. Diluir la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de las bandas de absorcin
hasta un nivel apropiado.
Muestreo Microscpico
Acoplar un microscopio de luz a un espectrofotmetro de infrarrojo medio permite obtener espectros a partir de muestras
muy pequeas. Esto generalmente se aplica a modos de transmitancia o reflectancia y provee, por ejemplo, una herramienta
poderosa para obtener datos espectroscpicos de contaminantes en muestras farmacuticas.
Validacin
La validacin es necesaria cuando se pretende usar un mtodo IR como alternativa al procedimiento oficial para analizar un
artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un mtodo IR es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito deseado, el cual
incluye la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o medicamento (valoraciones de Categora I), la
determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora II) y las pruebas de identificacin (Categora IV, ver la
Tabla 2 en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225). Dependiendo de la categora de la prueba, la validacin del
proceso para IR puede requerir el anlisis de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisin, el lmite de
Captulos
Las celdas de transmisin de infrarrojo medio para muestreo esttico o en flujo de gases y vapor estn disponibles en una
amplia variedad de materiales que se ajustan a la aplicacin, desde escalas de laboratorio hasta escalas de proceso. En el laboratorio, la celda tradicional para gas ha sido un cilindro de 10 cm de largo hecho de vidrio de borosilicato o acero inoxidable
con una apertura de aproximadamente 40 mm en cada extremo. Cada extremo abierto est cubierto con una tapa que contiene una ventana transparente para infrarrojo medio hecha de, por ejemplo, bromuro de potasio, selenio de cinc o fluoruro
de calcio.
712 854 Espectroscopa en el Infrarrojo Medio / Pruebas Fsicas
USP 38
deteccin, el lmite de cuantificacin y la robustez. Si el procedimiento IR emplea un modelo quimiomtrico calculado en funcin de la respuesta de otra tecnologa analtica (p.ej., HPLC), entonces se debern aplicar los principios del captulo Espectroscopa en el Infrarrojo Cercano 1119, especficamente la seccin Validacin del Mtodo.
de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios especficos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.
EXACTITUD
Para procedimientos de Categora I y II, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperacin agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Tambin es una prctica aceptable comparar los resultados de la
valoracin obtenidos usando el procedimiento IR que se est validando con aqullos obtenidos de un procedimiento analtico
alternativo establecido.
Criterios de validacin: 98,0%102,0% de recuperacin media para frmacos, 95,0%105,0% de recuperacin media para
la valoracin de un medicamento y 70,0%150,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.
Captulos
PRECISIN
Repetibilidad: El procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis preparaciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, se puede basar en mediciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentracin. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 2,0% para un medicamento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
Precisin intermedia: Es necesario evaluar el efecto de la precisin analtica ocasionado por cambios en las variables tales
como realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores en un total de seis experimentos proveern una estimacin
de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para un frmaco, no ms de 3,0% para la valoracin de un medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.
ESPECIFICIDAD
Para las pruebas de Categora IV, se debe asegurar la identidad del analito. Con respecto a los procedimientos de Categora I
y II, el requisito de exactitud tambin demuestra la especificidad para los analitos esperados.
En el caso de las pruebas de identificacin, se debe demostrar la capacidad de seleccionar entre compuestos cuyas estructuras estn estrechamente relacionadas y que probablemente estarn presentes. Esto debe confirmarse obteniendo resultados
positivos (quizs mediante comparacin con un material de referencia conocido) a partir de muestras que contengan el analito, junto con resultados negativos obtenidos de muestras que no contengan el analito y confirmando que los materiales con
estructura similar o estrechamente relacionados con el analito no generan una respuesta positiva.
El lmite de cuantificacin se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de 6 mediciones repetidas de
una solucin blanco, dividida por la pendiente de la lnea de calibracin y multiplicando por 10. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el captulo 1225). Se debe llevar a cabo una medicin de una matriz de muestra representativa a la
concentracin de lmite de cuantificacin estimada para confirmar la exactitud.
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificacin.
LINEALIDAD
Una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta del espectro IR se demuestra preparando no menos de 5
preparaciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la preparacin de prueba. Posteriormente, la curva estndar debe evaluarse usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mnimos. Para experimentos que no generen una relacin lineal entre la concentracin de analito y la respuesta del espectro IR, se
deben aplicar mtodos estadsticos apropiados para describir la respuesta analtica.
Pruebas Fsicas / 857 Espectroscopa UV-Vis 713
USP 38
Criterios de validacin: Coeficiente de correlacin (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categora I y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categora II
INTERVALO
Este parmetro se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisin y exactitud.
ROBUSTEZ
Para el infrarrojo medio, esto puede incluir cambios en el procedimiento de preparacin de la muestra o cambios en la configuracin del hardware, entre otros.
Verificacin
USP38
857 ESPECTROSCOPA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
INTRODUCCIN
Los espectros en el ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtienen cuando la interaccin entre la radiacin incidente y la nube de
electrones en un cromforo resulta en una transicin de electrones, la cual implica la promocin de uno o ms de los electrones de la capa externa o de unin de un estado fundamental a un estado de energa ms elevado. Las bandas de los espectros
UV y visibles de las sustancias por lo general son amplias y sin un alto grado de especificidad para identificacin de compuestos. Sin embargo, son adecuados para valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son tiles como formas
adicionales de identificacin.
En la ley de LambertBeer, la absorbancia (Al) de una solucin a una longitud de onda dada, l, se define como el logaritmo
en base 10 de la inversa de la transmitancia (Tl):
Il = intensidad de la radiacin transmitida a la misma longitud de onda l

Il0 = intensidad de la radiacin incidente a la longitud de onda l
Ante la ausencia de cualquier otro factor fsico o qumico, Al es proporcional a la longitud del paso o camino ptico, b, a
travs del cual pasa la radiacin, y a la concentracin, c, de la sustancia en la solucin de acuerdo con lo siguiente:
Captulos
Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USPNF, no estn obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificacin del procedimiento IR es demostrar que el mtodo, segn se describe en las monografas especficas, se est ejecutando con una exactitud, sensibilidad y precisin adecuadas. El captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226 indica que si la verificacin del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografa, no resulta exitosa, el
procedimiento no es adecuado para su uso con el artculo en anlisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
Aunque no se requiere una revalidacin completa de un procedimiento farmacopeico, la verificacin del procedimiento farmacopeico de infrarrojo medio incluye la ejecucin de ciertos parmetros crticos. Cuando el mtodo que se est verificando
sea para propsitos de identificacin, el nico parmetro requerido ser la especificidad. Para aplicaciones cuantitativas, se estudian parmetros de validacin adicionales, los cuales, por lo general, incluyen exactitud, precisin y lmite de cuantificacin,
conforme a lo indicado en Validacin.
714 857 Espectroscopa UV-Vis / Pruebas Fsicas
USP 38
Al = elcb
el = absortividad molar
c = concentracin de soluto (mol/L)
b = longitud de paso (cm)
Si la concentracin, c, se expresa en g/L, la constante el se vuelve al, la cual se denomina absortividad.
La expresin
que representa la absorbancia especfica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorbancia de una solucin de 10 g/L (al 1%
m/v) en una celda de 1 cm medida a una longitud de onda definida, de modo que:
M = concentracin molar de la solucin

Cuando se miden soluciones en celdas de 1 cm, las concentraciones de aproximadamente 10 mg de la muestra por mL a
menudo producen absorbancias de 0,20,8 en la regin UV o visible.
Para obtener informacin sobre teora y principios de mediciones, ver el captulo de informacin general Espectroscopa Ultravioleta-VisibleTeora y Prctica 1857, el cual no es un recurso obligatorio.
Captulos
CALIFICACIN DE ESPECTROFOTMETROS UV-VIS

La aptitud de un instrumento especfico para un procedimiento dado se asegura usando una evaluacin paso a paso del
ciclo de vida para la aplicacin deseada desde la seleccin hasta el retiro del instrumento: calificacin del diseo (DQ, por sus
siglas en ingls); calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls); una calificacin inicial del desempeo con respecto
a la especificacin, tambin conocida como calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls); y una calificacin continua del
desempeo (PQ, por sus siglas en ingls). Para ms detalles, ver el captulo Calificacin de Instrumentos Analticos 1058.
El propsito de este captulo es proveer mtodos de prueba y criterios de aceptacin para asegurar que el instrumento es
adecuado para su uso previsto (calificacin operativa) y que continuar funcionando adecuadamente durante periodos extensos como parte de la calificacin del desempeo. Al igual que con cualquier dispositivo espectromtrico, se debe calificar la
exactitud y precisin de la longitud de onda (eje x) y fotomtrica (eje y o eje de seal) de un espectrofotmetro UV-Vis, adems de que se deben establecer los parmetros fundamentales de luz espuria y de resolucin. La calificacin operativa debe
abarcar los intervalos operativos requeridos en el laboratorio para las escalas de absorbancia y de longitud de onda.
Los criterios de aceptacin para parmetros crticos del instrumento que establecen la aptitud para su propsito se verifican durante la calificacin de la instalacin y la calificacin operativa. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analtico usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo proveen muestras y parmetros de prueba como parte del paquete de Calificacin de la Instalacin/Calificacin Operativa.
Siempre que sea posible para los procedimientos detallados a continuacin, se deben usar materiales de referencia certificados (CRM, por sus siglas en ingls) en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Dichos materiales de referencia certificados deben obtenerse de una fuente acreditada reconocida, y deben incluir asignaciones de valores rastreables y verificados
de manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas. Los materiales de referencia certificados deben mantenerse limpios y libres de polvo. La recertificacin debe llevarse a cabo peridicamente para mantener la validez de la certificacin.
Control de Longitudes de Onda

Se debe asegurar que la exactitud del eje de la longitud de onda (eje x) en todo el intervalo operativo deseado sea correcto
dentro de los lmites aceptables.
Para instrumentos sin detectores de arreglo de diodos, la exactitud y la precisin de la longitud de onda se determinan en
todo el intervalo operativo usando al menos seis mediciones repetidas. Para la exactitud de la longitud de onda, la diferencia
entre el valor medio medido y el valor certificado del CRM no debe exceder 1 nm en la regin UV (200400 nm), mientras
que en la regin visible (400700 nm) no debe exceder 2 nm. Para la precisin de la longitud de onda, la desviacin estndar
USP 38
de la media no debe exceder 0,5 nm. Para instrumentos con arreglo de diodos, se requiere nicamente la medicin de la exactitud de una longitud de onda, y no es necesario realizar la determinacin de la precisin. La diferencia entre el valor certificado y el medido del material de referencia certificado no debe exceder 1 nm en la regin UV (200400 nm), mientras que en
la regin visible (400700 nm) no debe exceder 2 nm.
ESPECTROS DE LNEAS ATMICAS
Este procedimiento se describe como la aplicacin primaria debido a que las lneas de emisin producidas a partir de una
lmpara de descarga son caractersticas del elemento fuente y, como estndar fsico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no ms de 0,01 nm. En la espectrometra en solucin, la exactitud de la longitud de onda requerida raramente excede 0,5 nm. Por estas razones, los valores del estndar de lneas atmicas se citan sin la
incertidumbre. La lmpara debe colocarse en la posicin de la fuente del espectrofotmetro; por lo tanto, slo se puede usar
en espectrofotmetros que puedan operarse en un modo de simple haz y en la prctica, slo debe implementarse en un sistema diseado para acomodar dichas fuentes, por ejemplo, como un accesorio.
Las lmparas de mercurio de baja presin comnmente empleadas tienen una variedad de lneas intensas que abarcan una
gran parte de los espectros UV y visibles. Los fabricantes usan a menudo dos lneas de deuterio de la fuente a 486,0 y 656,1
nm como una verificacin interna de la calibracin y se pueden usar para propsitos de diagnstico (ver la Tabla 1).1
Tabla 1. Lneas Atmicas Recomendadas a partir de Lmparas de Mercurio y Deuterio de Baja Presin para Calibracin de
Longitudes de Onda
nm
Hg
253,7
Hg
296,7
Hg
365,0
Hg
404,7
Hg
435,8
D2
486,0
Hg
546,1
Hg
577,0
Hg
579,1
D2
656,1
SOLUCIONES DE XIDOS DE TIERRAS RARAS
Este procedimiento emplea soluciones de xidos de tierras raras que se preparan mediante disolucin en medios cidos. La
ms utilizada est compuesta de xido de holmio en cido perclrico. La solucin de xido de holmio ha sido aceptada internacionalmente como un estndar de longitud de onda intrnseco, y se encuentran disponibles comercialmente materiales de
referencia certificados.2 Los mximos de picos observados se determinan usando el modo de barrido normal en el espectrofotmetro. Los mximos de picos para una solucin al 4% m/v de xido de holmio en cido perclrico a un ancho de banda
espectral de 1,0 nm y una longitud de paso de 1 cm se presentan en la Tabla 2.3
Tabla 2. Mximos de Picos Recomendados a partir de una Solucin al 4% de xido de Holmio en cido Perclrico para Calibracin
de Longitudes de Onda
nm
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3
451,4
1
2
3
Los valores redondeados se toman de la Norma E275-08 de la ASTM.

La norma NIST SRM 2034 ya no est disponible.
Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorcin estndar a la longitud de onda intrnseca disponibles en: Travis JC, Acosta JC, Andor G, et
al. Intrinsic wavelength standard absorption bands in holmium oxide solution for UV/visible molecular absorption spectrophotometry. J Phys Chem Ref Data.
2005;34(1):4157. La incertidumbre mxima de la medicin al 95% es 0,06 nm.
Captulos
Elemento
USP 38
Tabla 2. Mximos de Picos Recomendados a partir de una Solucin al 4% de xido de Holmio en cido Perclrico para Calibracin
de Longitudes de Onda (Continuacin)
nm
467,8
485,2
536,6
640,5
Si el intervalo operativo del espectrofotmetro se encuentra fuera del intervalo de 240650 nm, se pueden usar otros xidos
de tierras raras certificados u otras soluciones siempre que sean rastreables a un estndar nacional o internacional. El didimio
(una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estndar rastreable tanto en solucin como en vidrio. El didimio es similar en su preparacin a los materiales de holmio y tiene picos caractersticos tiles en la regin de 730
870 nm. Los picos tiles se encuentran en la solucin de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0; 794,1; 799,0 y 864,4 nm.
MATERIALES VTREOS DE TIERRAS RARAS
Captulos
Este procedimiento usa vidrios que se fabrican fundiendo el xido de tierra rara en una matriz vtrea base. El material de uso
ms frecuente es el holmio, cuyas longitudes de onda de referencia han sido bien definidas. Aunque la fabricacin puede ocasionar variacin entre las partidas de estos vidrios, pueden utilizarse materiales de referencia certificados comercialmente disponibles. Los valores tpicos para vidrio de holmio usando un ancho de banda espectral de 1,0 nm son los siguientes: 241,5;
279,2; 287,5; 333,8; 360,9; 418,8; 445,8; 453,7; 460,2; 536,5 y 637,7 nm.
Control de Absorbancia
Para establecer la exactitud, la precisin y la linealidad de la transmitancia de un sistema dado, es necesario verificar la exactitud de la absorbancia de un sistema a lo largo de su intervalo operativo usando los siguientes procedimientos segn corresponda para los intervalos requeridos de longitud de onda y absorbancia.
SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO CIDO EN CIDO PERCLRICO 0,001 M
En el intervalo de 0200 mg/L, las soluciones de dicromato de potasio proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de
absorbancia a uno de los valores certificados de 235; 257; 313 350 nm. Estas soluciones estn disponibles como materiales
de referencia certificados o se pueden preparar de acuerdo con el estndar SRM 935a del NIST. Cuando se usan soluciones de
dicromato de potasio, la exactitud de la absorbancia debe ser 1%A (para valores por encima de 1,0A) o 0,010A (para valores
por debajo de 1,0A), lo que sea mayor. La precisin de la absorbancia se puede determinar como la desviacin estndar de al
menos seis mediciones repetidas en dos o ms niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviacin estndar
no debe exceder 0,5%A (para valores por encima de 1,0A) o 0,005A (para valores por debajo de 1,0A), lo que sea mayor.
FILTROS DE VIDRIO DE DENSIDAD PTICA NEUTRA
Estos filtros de vidrio grises se fabrican con vidrio dopado y tienen un espectro nominalmente plano en la regin de las longitudes de onda de calibracin. Adems, proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de absorbancia a los valores certificados de 440; 465; 546,1; 590 y 635 nm. Estos filtros estn disponibles como materiales de referencia certificados que son
rastreables a los estndares SRM 930e, 1930 y 2930 del NIST. Se pueden usar otras soluciones estndar o filtros pticos certificados siempre que sean rastreables a un estndar nacional o internacional. Cuando se usan filtros grises, la exactitud de la
absorbancia debe ser 0,8%A (para valores por encima de 1,0A) o 0,0080A (para valores por debajo de 1,0A), lo que sea
mayor. La precisin de la absorbancia se puede determinar como la desviacin estndar de al menos seis mediciones repetidas
en dos o ms niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviacin estndar no debe exceder 0,5%A (para
valores por encima de 1,0A) o 0,005A (para valores por debajo de 1,0A), lo que sea mayor.
Lmite de Luz Espuria (Energa Radiante Espuria)

Aunque la medicin de absorbancia o transmitancia es una medicin de cocientes de intensidades y, por lo tanto, es tericamente independiente de la fuente intensidad monocromtica, la presencia de radiacin no deseada llamada energa radiante
espuria o luz espuria afecta las mediciones en la prctica. Adems, el efecto adverso de la luz espuria se incrementa con el
envejecimiento de los componentes pticos y lmparas de un espectrofotmetro. Los efectos son ms pronunciados en los
extremos de los intervalos operativos del detector y de la lmpara. Se debe monitorear el nivel de luz espuria a las longitudes
de onda apropiadas como parte de la calificacin del desempeo. La luz espuria puede detectarse a una longitud de onda
dada con un filtro lquido adecuado. Estas soluciones estn disponibles como materiales de referencia certificados o se pueden
preparar a las concentraciones presentadas en la Tabla 3 usando materiales de grado reactivo.
USP 38
Tabla 3. Intervalos Espectrales de Materiales Seleccionados para Monitoreo de Luz Espuria

Intervalo Espectral
(nm)
Lquido o Solucin
190205
Cloruro de potasio acuoso (12 g/L)
210259
Yoduro de sodio o yoduro de potasio acuosos (10 g/L)
250320
Acetona
300385
Nitrito de sodio acuoso (50 g/L)
Cuando se usa una celda con longitud de paso de 5 mm (rellena con el mismo filtro) como celda de referencia y luego se
mide la celda de 10 mm en todo el intervalo espectral requerido, es posible calcular el valor de luz espuria a partir de la absorbancia mxima observada, usando la frmula:
Sl = 0,25 102Al
Resolucin
Si se deben llevar a cabo mediciones de absorbancia exactas en compuestos bencenoides u otros compuestos con bandas
de absorbancia pronunciadas (ancho medio de banda natural de menos de 15 nm), el ancho de banda espectral del espectrofotmetro usado no debe ser mayor que 1/8 del ancho medio de banda natural de la absorcin del compuesto.
Determinar la resolucin del espectrofotmetro usando el procedimiento siguiente. Medir el cociente de absorbancias de
una solucin al 0,020% (v/v) de tolueno en hexano (de grado UV) en el mximo y el mnimo a aproximadamente 269 y 266
nm, respectivamente, usando hexano como referencia. El cociente de absorbancias obtenido depende del ancho de banda
espectral del instrumento. Para la mayora de los propsitos cuantitativos farmacopeicos, es suficiente un ancho de banda espectral de 2 nm y el criterio de aceptacin para el cociente es no menos de 1,3.
El efecto que tienen el ancho de banda espectral y la temperatura de medicin sobre el cociente se presenta en la Tabla 4.4
Tabla 4. Ancho de Banda Espectral y Temperatura de Medicin
Ancho de Banda Espectral
Temperatura de
Medicin
0,5 nm 0,1 nm
1,0 nm 0,1 nm
1,5 nm 0,1 nm
2,0 nm 0,2 nm
3,0 nm 0,2 nm
20 1
2,42,5
2,02,1
1,61,7
1,31,4
1,01,1
25 1
2,32,4
1,92,0
1,61,7
1,31,4
1,01,1
30 1
2,12,2
1,81,9
1,51,6
1,31,4
1,01,1
Tambin se pueden usar materiales de referencia certificados adecuados para esta medicin. Como alternativa, se puede barrer una lnea atmica adecuada en el modo de haz individual y se puede determinar el ancho del pico a la altura media del
pico. Este ancho del pico a la altura media del pico es igual al ancho de banda del espectrofotmetro.

cumplir con los requisitos del usuario para todos los parmetros que pueden afectar la calidad de la medicin y asegurar que
ste funcionar adecuadamente durante periodos extensos.
PROCEDIMIENTO
Salvo algunas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotomtricas farmacopeicas requieren una comparacin contra un Estndar de Referencia USP. Esto ayuda a asegurar una medicin en idnticas condiciones para la muestra de prueba y
la sustancia de referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la seleccin del ancho de banda
4
ASTM E958 2011.
Captulos
Al = mxima absorbancia observada

Criterios de aceptacin: Sl es 0,01. Al 0,7A.
El procedimiento simplemente requiere contrastar la medicin de la celda de 10 mm con la de la celda de 5 mm (rellena
con el mismo filtro) y, por lo tanto, se puede lograr mediante referencia espacial o cronolgica en cualquier tipo de espectrofotmetro. Como alternativa, se puede medir la absorbancia de los filtros especificados en la Tabla 3 contra la referencia apropiada y registrar el valor de mxima absorbancia. (Un valor de Sl de 0,01 se produce con un valor Al de 0,7A, lo cual corresponde
a un valor de mxima absorbancia de 2A, medida usando este procedimiento alternativo.) [NOTAPara algunos instrumentos
en los que no es posible informar directamente los valores de absorbancia mayores a 3A, este procedimiento puede requerir un
proceso de dos etapas en el que el haz de la muestra se atena inicialmente usando un filtro de 1 a 2A, cuyo valor se mide y
registra. Despus de ajustar a cero el instrumento con este filtro colocado, medir el filtro de luz espuria y registrar nuevamente
el valor de absorbancia. El valor de luz espuria estimado es ahora la suma de estas dos lecturas de absorbancia.]
USP 38
Captulos
espectral, la colocacin y correccin de la celda y los niveles de transmitancia. Las celdas que presentan caractersticas de
transmitancia idnticas a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en otras longitudes de onda. Se deben
establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando as se requiera.
La mejor manera de realizar comparaciones entre una muestra de prueba y un estndar de referencia es en un mximo de
absorcin espectral para el compuesto de inters. Las valoraciones que se realizan mediante espectrofotometra proveen la longitud de onda comnmente aceptada para el pico de absorcin espectral de la sustancia en cuestin. Diferentes espectrofotmetros pueden presentar una variacin menor en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prcticas requieren
que las comparaciones se realicen a la longitud de onda en la que ocurre el pico de absorcin. Si sta difiere de la longitud de
onda especificada en la monografa individual en ms de 1 nm (en el intervalo de 200400 nm) o 2 nm (en el intervalo de
400800 nm), puede ser una indicacin de la necesidad de recalibrar el instrumento.
Los trminos preparacin similar y solucin similar, segn se usan en pruebas y valoraciones que implican espectrofotometra, indican que la referencia para comparacin, que es por lo regular un Estndar de Referencia USP, debe prepararse y
observarse, para todos los propsitos prcticos, de una manera idntica a la usada para la muestra de prueba. Generalmente,
al preparar una solucin del estndar de referencia especificado, se prepara una solucin de aproximadamente (es decir, dentro del 10% de) la concentracin deseada y se calcula la absortividad basndose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se
haya usado una muestra del estndar de referencia previamente secada, la absortividad se calcula con respecto a la sustancia
anhidra. Las expresiones determinar concomitantemente y medir concomitantemente, segn se usan en las pruebas y valoraciones que implican espectrofotometra, indican que las absorbancias de la solucin que contiene la muestra de prueba y la
solucin que contiene la muestra de referencia, con respecto al blanco de prueba especificado, deben medirse en sucesin
inmediata.
Preparacin de la Solucin Muestra

Para determinaciones usando espectrofotometra UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A menos que se indique de otro modo en la monografa, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente, usando una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, hidrocarburos
pequeos, teres y soluciones diluidas de cidos y lcalis fuertes. Se debe tener cuidado de usar disolventes que estn exentos
de contaminantes que absorban en la regin espectral que se est analizando. Para el disolvente, se utiliza tpicamente metanol o alcohol exentos de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adicin de metanol pero sin benceno u otras impurezas
interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotomtrica especial, que garantizan estar exentos de contaminantes, estn
disponibles comercialmente de diversos proveedores. Algunos otros disolventes analticos orgnicos de grado reactivo pueden
contener trazas de impurezas que absorben fuertemente en la regin UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes
de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparacin de la solucin de prueba,
de la solucin estndar y del blanco. La mejor prctica consiste en usar disolventes que tengan una transmitancia de no menos
de 40% (39,9%T = 0,399A) a la longitud de onda de inters.
Las valoraciones en la regin visible por lo regular exigen comparar concomitantemente la absorbancia producida por la
preparacin de valoracin con la producida por una preparacin estndar que contenga una cantidad aproximadamente igual
de un Estndar de Referencia USP. En algunas situaciones, se puede omitir el uso de un estndar de referencia (p.ej., cuando
las valoraciones espectrofotomtricas se llevan a cabo rutinariamente) cuando se dipone de una curva estndar adecuada, preparada con el Estndar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley de LambertBeer dentro del intervalo de aproximadamente 75%125% de la concentracin final usada en la valoracin. En estas circunstancias, la
absorbancia medida en la valoracin se puede interpolar en la curva estndar y se puede calcular el resultado de la valoracin.
Dichas curvas estndar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofotmetros o
nuevos lotes de reactivos.
Validacin
La validacin es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento UV-Vis como alternativa al procedimiento oficial para
analizar un artculo oficial.
El objetivo de una validacin de un procedimiento UV-Vis es demostrar que la medicin es adecuada para su propsito previsto, el cual incluye la determinacin cuantitativa del componente principal en un frmaco o un medicamento (valoraciones
de Categora I), la determinacin cuantitativa de impurezas o pruebas de lmite (Categora II) y las pruebas de identificacin
(Categora IV). Dependiendo de la categora de la prueba (ver la Tabla 2 del captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225), el proceso de validacin del mtodo analtico para UV-Vis requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud,
la especificidad, la precisin, el lmite de deteccin, el lmite de cuantificacin y la robustez. Estas caractersticas de desempeo
analtico se aplican a procedimientos con estndar externo y a mtodos de estndar agregado.
de validacin especficos para cada parmetro. La intencin de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios especfi-
USP 38
cos de validacin representativos de las expectativas mnimas para esta tecnologa. Para cada aplicacin particular, pueden requerirse criterios ms estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.
EXACTITUD
Para procedimientos de Categora I, II y III, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperacin agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de la valoracin
obtenidos usando el procedimiento de UV-Vis que se est validando con aqullos de un procedimiento analtico establecido.
Criterios de validacin: 98,0%102,0% de recuperacin media para frmacos, 95,0%105,0% de recuperacin media para
la valoracin de un medicamento y 80,0%120,0% de recuperacin media para el anlisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.
Precisin
REPETIBILIDAD
PRECISIN INTERMEDIA
Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisin analtica del mtodo. Las variables tpicas
incluyen realizar el anlisis en das diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o ms analistas realicen el mtodo. Como
mnimo, cualquier combinacin de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveer una estimacin
de la precisin intermedia.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,5% para el frmaco, no ms de 3,0% para la valoracin del medicamento y no ms de 25,0% para el anlisis de impurezas.
ESPECIFICIDAD
En las mediciones UV-Vis, la especificidad se asegura mediante el uso de un estndar de referencia siempre que sea posible y
se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
LMITES DE DETECCIN
El lmite de deteccin (DL, por sus siglas en ingls) se puede estimar calculando la desviacin estndar de no menos de 6
mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviacin estndar puede determinarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o determinando que la relacin seal-ruido es
>3,3. Adems, se debe confirmar el lmite de deteccin estimado analizando muestras a la concentracin calculada.
6 mediciones repetidas de una solucin blanco y multiplicando por 10. Como alternativa, la desviacin estndar puede determinarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibracin o determinando que la relacin seal-ruido es
>10.
Se debe llevar a cabo una medicin de una solucin de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa a
la que se han agregado cantidades conocidas a la concentracin del lmite de cuantificacin requerida para confirmar una sensibilidad y exactitud suficientes. La relacin seal-ruido observada en el lmite de cuantificacin requerido debe ser >10.
[NOTALa norma ASTM 1657-98 (2006) Standard Practice for the Testing of Variable-Wavelength Photometric Detectors Used in
Liquid Chromatography provee un procedimiento adecuado para medir la relacin seal-ruido.]
exacta y precisa a un nivel 50% de la especificacin.
Captulos
La repetibilidad del procedimiento analtico se evala midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentracin de prueba de la valoracin. Alternativamente, se puede evaluar midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo
de concentraciones. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de
aceptacin.
Criterios de validacin: La desviacin estndar relativa es no ms de 1,0% para el frmaco, no ms de 2,0% para la valoracin del medicamento y no ms de 20,0% para el anlisis de impurezas.
USP 38
LINEALIDAD
Se debe demostrar una relacin lineal entre la concentracin del analito y la respuesta UV-Vis preparando no menos de cinco soluciones estndar con concentraciones que abarquen la concentracin anticipada de la solucin de prueba. Posteriormente, la curva estndar se evala usando mtodos estadsticos apropiados, tales como la regresin de cuadrados mnimos. La desviacin de la linealidad es el resultado de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles aceptables mediante la reduccin de la concentracin del analito y, por consiguiente, de los valores de absorbancia relacionados.
Criterios de validacin: El coeficiente de correlacin (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categora I y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categora II.
INTERVALO
El intervalo operativo de un instrumento analtico (y el procedimiento analtico en su totalidad) es el intervalo entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la funcin de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad.
Captulos
ROBUSTEZ
En el caso de la UV-Vis, esto puede incluir la medicin de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, la variacin del pH y la adicin de posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La robustez se determina
de manera paralela usando un diseo adecuado para el procedimiento experimental.
REQUISITOS PARA MEDICIONES INDIRECTAS
Para ciertos procedimientos UV-Vis, se emplean reacciones cromognicas. Por lo general, se usan los requisitos para las caractersticas de desempeo analtico. En algunos casos, puede que no sea posible cumplir con los criterios de exactitud y precisin requeridos para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisin pueden ampliarse
hasta un 50%. Cualquier ampliacin de este tipo debe justificarse con bases cientficas y pruebas documentadas. Puede ser
necesario incrementar la cantidad de determinaciones repetidas requeridas para producir un valor de informe cientficamente
slido.
Verificacin
Las reglamentaciones de las Buenas Prcticas de Fabricacin Vigentes para los EE.UU. [Ttulo 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los procedimientos analticos, segn se describen en los compendios USPNF, no estn obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografa. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificacin del procedimiento de UV-Vis es demostrar la aptitud de un procedimiento de prueba en condiciones reales de uso. Las caractersticas de desempeo que verifican la aptitud de un procedimiento de UV-Vis son similares a
las requeridas para cualquier procedimiento analtico. El captulo Verificacin de Procedimientos Farmacopeicos 1226 incluye un
anlisis sobre los principios generales aplicables. La verificacin por lo general se realiza usando un material de referencia y una
matriz bien definida. La verificacin de los mtodos farmacopeicos de UV-Vis incluye como mnimo la ejecucin de los parmetros de validacin para especificidad, exactitud, precisin y lmite de cuantificacin, cuando resulte apropiado, conforme a lo
indicado en Validacin.
USP38
861 SUTURASDIMETRO
El calibrador para determinar el dimetro de las suturas es del tipo de peso muerto, mecnico o elctrico, y est equipado
con un dial de lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador
ms pequeo. El yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de dimetro y el pie compresor es de 12,70 0,02
mm de dimetro. El pie compresor y las partes mviles conectadas a ste se gradan de manera que se aplique una carga total
Pruebas Fsicas / 871 SuturasSujecin de Agujas 721
USP 38
de 210 3 g a la muestra. Las superficies del pie compresor y del yunque son planas, con desviaciones no mayores de 0,005
mm, y paralelas entre s con una aproximacin de 0,005 mm. Para medir el dimetro de las suturas de 0,4 y menor tamao
mtrico, retirar el peso adicional del pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de 60 g.
Sutura Quirrgica Absorbible de ColgenoDeterminar el dimetro inmediatamente despus de haberla retirado del envase primario y sin estirarla. Colocar el hilo a travs del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta
que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir el dimetro de cada hilo en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su longitud.
Sutura Quirrgica Absorbible SintticaProceder segn se indica para Sutura Quirrgica No Absorbible.
Sutura Quirrgica No AbsorbibleColocar el hilo a travs del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el
pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir las suturas no absorbibles, ya sea que estn envasadas en seco o en
lquido, inmediatamente despus de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos.
Medir el dimetro de la sutura en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos
de su longitud. En el caso de suturas trenzadas de tamaos mayores de 3-0 (tamao mtrico 2), hacer dos mediciones en cada
punto, una en ngulo recto respecto de la otra, y emplear el promedio como el dimetro observado en ese punto.
Cuando se midan suturas de multifilamento, fijar una porcin de la seccin designada del hilo en una pinza fija, de manera
que el hilo pase a travs del centro del yunque. Mientras se sostiene el hilo en el mismo plano que la superficie del yunque,
someter el hilo a tensin por medios adecuados, como por ejemplo, pasando el extremo libre del hilo alrededor de un cilindro
o polea y uniendo dicho extremo libre a una pesa de aproximadamente la mitad del lmite de nudo-traccin para la sutura de
Clase I no esterilizada del tamao en cuestin, con cuidado de no dejar que el hilo, si fuera retorcido, pierda la torsin. Medir
el dimetro en los puntos designados en el hilo y calcular el dimetro promedio segn las indicaciones dadas.
Captulos
871 SUTURASSUJECIN DE AGUJAS

Las suturas quirrgicas absorbibles (de colgeno) y las no absorbibles con Sujecin de Aguja Estndar tienen las agujas sujetas
firmemente y estn diseadas para que stas no se desprendan. Las suturas suministradas con sujecin de agujas sin ojo corresponden a las categoras de suturas con Sujecin de Aguja Estndar o con Sujecin de Aguja Desprendible. La Sujecin de Aguja
Desprendible, tanto de las suturas quirrgicas absorbibles como de las no absorbibles, permite separar la aguja a voluntad con
un simple tirn. Ambos tipos de sujecin son sometidos a pruebas con un equipo, segn se especifica en Resistencia a la Tensin 881.
ProcedimientoTomar 5 suturas y colocar una por una en el tensimetro, sujetando la aguja con la pinza fija, dejando
toda la parte embutida expuesta, y en la misma direccin de la fuerza que ejerce la pinza mvil sobre la sutura. Determinar la
fuerza necesaria para desprender la sutura de la aguja. En el caso de suturas con Sujecin de Aguja Estndar, la sutura puede
romperse sin desprenderse de la aguja.
Sujecin de Aguja EstndarCumple con los requisitos si ni el promedio de los 5 valores ni ningn valor individual es inferior
al lmite fijado para el tamao especificados en la Tabla 1.
Tabla 1. Sujecin de Aguja Estndar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamao Mtrico (Calibre N)
Sutura
Absorbible de
Colgeno
0,4
Sutura No Absorbible y Absorbible Sinttica
Lmites de la Sujecin de Aguja
Tamao USP
Promedio
(en kgf) (Mn.)
Individual
(en kgf) (Mn.)
Promedio
(en N) (Mn.)
Individual
(en N) (Mn.)
0,1
11-0
0,007
0,005
0,069
0,049
0,2
10-0
0,014
0,010
0,137
0,098
0,3
9-0
0,021
0,015
0,206
0,147
0,5
0,4
8-0
0,050
0,025
0,490
0,245
0,7
0,5
7-0
0,080
0,040
0,784
0,392
0,784
0,7
6-0
0,17
0,08
1,67
1,5
5-0
0,23
0,11
2,25
1,08
1,5
4-0
0,45
0,23
4,41
2,25
3-0
0,68
0,34
6,67
3,33
3,5
2-0
1,10
0,45
10,8
4,41
3,5
1,50
0,45
14,7
4,41
1,80
0,60
17,6
5,88
6 y superior
5 y superior
2 y superior
1,80
0,70
17,6
6,86
722 871 SuturasSujecin de Agujas / Pruebas Fsicas
USP 38
Sujecin de Aguja DesprendibleCumple con los requisitos si los valores individuales de las 5 suturas se encuentran dentro de
los lmites establecidos en la Tabla 2. [NOTAPara ambos tipos de sutura, si no ms de uno de los valores individuales se encuentra fuera de los lmites establecidos, repetir la prueba con 10 suturas adicionales: cumple con los requisitos si ninguno de
los 10 valores adicionales se encuentra fuera de los requisitos del lmite individual.]
Tabla 2. Sujecin de Aguja Desprendible para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamao Mtrico (Calibre)
Captulos
Sutura
Absorbible de
Colgeno
Lmites de la Sujecin de Aguja
Sutura No Absorbible y Absorbible Sinttica
Tamao USP
Mnimo
(en kgf)
Mximo
(en kgf)
Mnimo
(en N)
Mximo
(en N)
1,5
5-0
0,028
1,59
0,274
15,6
1,5
4-0
0,028
1,59
0,274
15,6
3-0
0,028
1,59
0,274
15,6
3,5
2-0
0,028
1,59
0,274
15,6
3,5
0,028
1,59
0,274
15,6
0,028
1,59
0,274
15,6
0,028
1,59
0,274
15,6
881 RESISTENCIA A LA TENSIN

Los dispositivos para la medicin de la resistencia a la tensin empleados en los Estados Unidos pueden calibrarse en unidades del sistema ingls de medidas. Las siguientes instrucciones se dan en unidades mtricas con la comprensin de que pueden emplearse los equivalentes ingleses correspondientes.
Sutura Quirrgica
Determinar la resistencia a la tensin de las suturas quirrgicas en una mquina a motor para medir la resistencia a la tensin, que tenga pinzas adecuadas para sostener la muestra con firmeza, y emplear el principio de velocidad de carga constante
sobre la muestra o el principio de velocidad de elongacin constante de la muestra, segn se describe a continuacin. El aparato tiene dos pinzas para sostener el hilo de la sutura. Una de estas pinzas es mvil. Las pinzas estn diseadas para que la
sutura que se va a probar pueda ser fijada sin posibilidad de que se deslice. La longitud calibrada de prueba se define como la
distancia interior entre las dos pinzas. Para longitudes calibradas de prueba entre 125 y 200 mm, la pinza mvil es accionada a
una velocidad de elongacin constante de 30 5 cm por minuto. Para longitudes calibradas de menos de 125 mm, la velocidad de elongacin por minuto se ajusta para que equivalga a 2 veces la longitud calibrada por minuto. Por ejemplo, si la longitud es de 5 cm, la velocidad de elongacin ser de 10 cm por minuto.
Determinar la resistencia a la tensin de la sutura, ya sea que est envasada en seco o con lquido, inmediatamente despus
de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Sujetar uno de los extremos de la sutura a la pinza
del extremo de carga de la mquina, pasar el otro extremo a travs de la pinza opuesta, aplicando tensin suficiente para que
la muestra quede tirante entre las pinzas, y cerrar la segunda pinza. Realizar tantas rupturas como se especifiquen en la monografa individual. Si la ruptura ocurre en la pinza, descartar la lectura de la muestra.
Procedimiento para una mquina que opera por el principio de velocidad de carga constante sobre la muestraEsta
descripcin se aplica a la mquina conocida como Comprobador de Plano Inclinado ("Incline Plane Tester").
El carro empleado en cualquier prueba es de un peso tal que al ocurrir la ruptura, la posicin de la pluma registradora sobre
la grfica queda entre el 20% y el 80% de la capacidad que pueda registrarse en la grfica. La friccin en el carro es suficientemente baja como para permitir que la pluma registradora se aparte de la lnea cero de la grfica en un grado que no exceda
de 2,5% de la capacidad de la grfica cuando no haya ninguna muestra sujeta en las pinzas.
Para suturas quirrgicas de tamaos intermedios y ms grandes, la pinza para sostener la muestra es del tipo rodillo, con
una superficie de sujecin plana. El rodillo tiene un dimetro de 19 mm y la superficie de sujecin plana no es menor de 25
mm de longitud. La longitud de la muestra, una vez que se inserta en las pinzas, es de por lo menos 127 mm de un extremo a
otro. La velocidad de inclinacin del plano del comprobador es tal que alcanza su inclinacin mxima de 30 sobre la horizontal en 20 1 segundos desde el comienzo de la prueba.
Para suturas quirrgicas de tamaos pequeos, la pinza apropiada tiene una superficie de sujecin plana de no menos de 13
mm de longitud. La velocidad de inclinacin del plano es tal que alcanza su inclinacin mxima de 30 sobre la horizontal en
60 5 segundos desde el comienzo de la prueba.
Excepto cuando en la monografa de la sutura se indique traccin recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba realizando un nudo de cirujano con una vuelta de sutura, alrededor de un tubo de goma flexible con un dimetro interno de 6,5
Pruebas Fsicas / 891 Anlisis Trmico 723
USP 38
mm y un espesor de pared de 1,6 mm. El nudo de cirujano es un nudo cuadrado en el cual el extremo libre se pasa primero
dos veces por el lazo, en lugar de una vez, y se ajusta tirante, luego se pasa una vez por un segundo lazo y se tensan los extremos de manera que quede un nudo sencillo superpuesto a un nudo doble. Comenzar el primer nudo con el extremo izquierdo
sobre el extremo derecho, ejerciendo tensin suficiente para atar el nudo con firmeza. Cuando la muestra de prueba incluya
un nudo, colocar la muestra en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas.
Dejar el tubo de goma flexible en su lugar mientras dure la prueba.
Procedimiento para una mquina que opera por el principio de velocidad de elongacin constante de la muestra
Esta descripcin se aplica a cualquier mquina adecuada para determinar la resistencia a la tensin que opera segn el principio de velocidad constante de elongacin de la muestra.
Excepto cuando en las monografas de las suturas se indique traccin recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba
por medio de un nudo simple, colocando un extremo del hilo, sostenido con la mano derecha, por encima del otro extremo,
sostenido con la mano izquierda, pasando un extremo sobre el hilo y a travs del lazo que se form y luego ajustando el nudo
con firmeza. La muestra se coloca en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas.
Telas Textiles y Pelculas
891 ANLISIS TRMICO

INTRODUCCIN
Los sucesos termodinmicos determinados con precisin, como por ejemplo un cambio de estado, pueden indicar la identidad y la pureza de los frmacos. Desde hace mucho tiempo se han venido estableciendo normas farmacopeicas para las temperaturas de fusin y de ebullicin de las sustancias. Estas transiciones ocurren a temperaturas caractersticas y de esta manera
las normas farmacopeicas contribuyen a la identificacin de las sustancias. Dado que las impurezas afectan a estos cambios de
manera predecible, las mismas normas farmacopeicas contribuyen al control de la pureza de las sustancias.
El anlisis trmico, en el sentido ms amplio, es la medicin de las propiedades fsicas y qumicas de los materiales en funcin de la temperatura. Los mtodos instrumentales han suplantado, en gran medida, a mtodos ms antiguos, que dependan de la inspeccin visual y de mediciones bajo condiciones fijas o arbitrarias, debido a que los mtodos instrumentales son
objetivos, proporcionan ms informacin, generan registros permanentes, y por lo general son ms sensibles, precisos y exactos. Adems, pueden suministrar informacin sobre la desolvatacin, la deshidratacin, la descomposicin, la perfeccin del
cristal, el polimorfismo, la temperatura de fusin, la sublimacin, las transiciones vtreas, la evaporacin, la pirlisis, las interacciones slido-slido y la pureza. Tales datos resultan tiles para la caracterizacin de sustancias en lo que respecta a la compatibilidad, estabilidad, envasado y control de calidad. A continuacin se describen las mediciones que se utilizan con mayor frecuencia en el anlisis trmico, es decir, temperaturas de transicin y punto de fusin mediante calorimetra diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en ingls), anlisis termogravimtrico, microscopa de platina caliente y anlisis de impurezas eutcticas.
TEMPERATURAS DE PUNTO DE FUSIN Y DE TRANSICIN

Cuando se calienta una muestra, se pueden observar las transiciones usando DSC, anlisis trmico diferencial (DTA, por sus
siglas en ingls), o microscopa de platina caliente (hot-stage microscopy). La DSC por flujo de calor (heat-flux DSC) sirve para
determinar el diferencial de calor entre la muestra y el material de referencia. En la DSC por compensacin de calor (power
compensation DSC), la muestra y los materiales de referencia se mantienen a la misma temperatura, usando elementos de calentamiento individuales, y se registra la diferencia en el consumo de energa de los dos calentadores. La DTA monitorea la
diferencia de temperaturas entre la muestra y la referencia. Las transiciones que se pueden observar incluyen aquellas que se
Captulos
Determinar la resistencia a la tensin de las telas textiles, incluyendo la cinta adhesiva, en un aparato comprobador de velocidad constante o de tipo pndulo, con la siguiente descripcin general.
Las pinzas para sostener la muestra son mordazas lisas, planas y paralelas, de no menos de 25 mm de longitud en paralelo a
la direccin de aplicacin de la carga. Cuando el ancho de la tira a probar no excede de 19 mm, las mordazas de la pinza
deben tener al menos 25 mm de ancho. Si el ancho de la tira es mayor de 19 mm y no mayor de 44 mm, el ancho de las
mordazas de la pinza debe ser de no menos de 50 mm. Si el ancho de la muestra es ms de 44 mm, cortar una tira de 25 mm
y usar una pinza con mordazas de no menos de 50 mm de ancho. Redondear todos los bordes que puedan tener una accin
cortante sobre la muestra hasta un radio de 0,4 mm. Las mordazas tienen una separacin entre s de 76,2 mm al comienzo de
la prueba y se separan a una velocidad de 30,5 cm 13 mm por minuto. La mquina tiene una capacidad tal que cuando se
produce la ruptura, la desviacin del pndulo de la vertical est entre 9 y 45.
724 891 Anlisis Trmico / Pruebas Fsicas
USP 38
presentan en la Tabla 1 a continuacin. En el caso de la fusin, puede determinarse en forma objetiva y reproducible tanto el
inicio como el pico de temperatura, a menudo con una aproximacin de unas pocas dcimas de grado. Aunque estas
temperaturas son tiles para la caracterizacin de sustancias y la diferencia entre las dos temperaturas es un indicador de pureza, los valores no pueden compararse directamente con valores de "intervalos de fusin" o de "punto de fusin" visuales ni con
constantes tales como el punto triple del material puro.
Asimismo, se debe tener cuidado al comparar los resultados obtenidos a travs de diferentes mtodos de anlisis. Los mtodos pticos pueden medir el punto de fusin como la temperatura en la que se funde la ltima traza de material slido. Por el
contrario, los puntos de fusin medidos con DSC pueden referir a la temperatura de inicio o a la temperatura en la que se
observ la velocidad de fusin mxima (vertex). No obstante, el vertex es sensible al peso de la muestra, a la velocidad de
calentamiento y a otros factores, mientras que la temperatura de inicio se ve menos afectada por tales factores. Cuando se
emplean tcnicas trmicas, es necesario considerar las limitantes de la formacin de soluciones slidas, la insolubilidad en la
fusin, el polimorfismo y la descomposicin durante el anlisis.
Tabla 1
Slido a lquido
Fusin
Endotrmica
Lquido a gas
Vaporizacin
Endotrmica
Congelacin
Exotrmica
Cristalizacin
Exotrmica
Sublimacin
Endotrmica
Lquido a slido
Captulos
Slido a gas
Slido a slido
Transicin vtrea
Evento de segundo orden
Desolvatacin
Endotrmica
Amorfo a cristalino
Exotrmica
Polimorfo
Endotrmica o Exotrmica
Informe de Resultados de Mtodos InstrumentalesCada termograma debera estar acompaado por una descripcin
completa de las condiciones empleadas, incluyendo la marca y el modelo del instrumento; el registro de la ltima calibracin;
el tamao y la identificacin de la muestra (incluyendo el historial trmico); el envase; la identidad, la velocidad de flujo y la
presin de la atmsfera gaseosa; la direccin y la velocidad de cambio de temperatura; y la sensibilidad del instrumento y del
registrador.
DETERMINACIN DE TEMPERATURA DE TRANSICIN (TEMPERATURA DE INICIO DE FUSIN)

Y TEMPERATURA DE PUNTO DE FUSIN
AparatoUsar instrumental para DTA o DSC equipado con un dispositivo de programacin de temperatura, detector(es)
trmico(s) y un sistema de registro que se pueda conectar a una computadora, a menos que la monografa individual para la
que se emplea el captulo indique algo distinto.
CalibracinCalibrar el instrumental para cambios de temperatura y entalpa usando indio u otro material adecuado certificado. La calibracin de la temperatura se lleva a cabo calentando un estndar a travs de la transicin de fusin y comparando el inicio extrapolado del punto de fusin del estndar con el inicio certificado de punto de fusin. La calibracin de la temperatura se debera realizar a la misma velocidad de calentamiento que el experimento. La calibracin de la entalpa se lleva a
cabo calentando un estndar a travs de la transicin de fusin y comparando el calor de fusin calculado con el valor terico.
ProcedimientoPesar con exactitud una cantidad apropiada de la sustancia a examinar en el receptculo de la muestra
(sample pan), segn se describe en la monografa especfica. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento, la
direccin del cambio de temperatura y la temperatura final segn se especifica en la monografa. Si no se especifican en la
monografa, estos parmetros se determinan segn se indica a continuacin: realizar un anlisis preliminar sobre un amplio
intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposicin, o aproximadamente 10 a 20 por encima del punto de fusin) y sobre un amplio intervalo de velocidades de calentamiento (1 a 20
por minuto) para evidenciar cualquier efecto inesperado. Posteriormente, determinar una velocidad de calentamiento ms baja
de modo que se minimice la descomposicin y que no se comprometa la temperatura de transicin. Determinar un intervalo
de temperatura que comprenda la transicin de inters de modo que la lnea base se pueda extender hasta intersectar con la
tangente de la fusin (ver Figura 1).
Pruebas Fsicas / 891 Anlisis Trmico 725
USP 38
Figura 1. Termograma.
ANLISIS TERMOGRAVIMTRICO
El anlisis termogravimtrico incluye la determinacin de la masa de una muestra como una funcin de la temperatura, o
del tiempo de calentamiento, o ambos. Por lo general se usa para investigar los procesos de deshidratacin/desolvatacin y la
descomposicin de compuestos. Cuando la termogravimetra se aplica apropiadamente, sta suministra informacin de mayor
utilidad que la prdida por secado a temperatura fija, que frecuentemente se realiza durante un tiempo fijo y por lo general en
una atmsfera mal definida. Por lo general, la prdida de disolvente absorbido en la superficie puede distinguirse del disolvente en la red cristalina y de las prdidas por degradacin. Las mediciones pueden llevarse a cabo en atmsferas con una humedad y una concentracin de oxgeno controladas para revelar interacciones con el frmaco, entre frmacos y entre sustancias
activas y excipientes o materiales del envase.
AparatoMientras que los detalles dependen del fabricante, las caractersticas esenciales del equipo son una balanza que
registra los pesos y una fuente de calor programable. Los equipos difieren en la capacidad para manejar muestras de diversos
tamaos, la manera en que se registra la temperatura de la muestra y el intervalo de control de la atmsfera.
CalibracinSe requiere una calibracin para todos los sistemas; es decir, la balanza se calibra usando pesas estndar, y la
calibracin de temperatura implica el uso de materiales estndar, puesto que se asume que la temperatura de la muestra es la
temperatura del horno. La calibracin de peso se lleva a cabo midiendo la masa de una pesa certificada o estndar y comparando la masa medida con el valor certificado. La calibracin de la temperatura se lleva a cabo analizando un estndar magntico de alta pureza, tal como nquel, para determinar su temperatura de Curie y comparando el valor medido con el valor terico.
ProcedimientoAplicar el mtodo a la muestra, empleando las condiciones descritas en la monografa, y calcular la ganancia o prdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje. Alternativamente, colocar una cantidad adecuada
de material en el portamuestras y registrar el peso. Debido a que la atmsfera de anlisis es crtica, se especifica la presin o
velocidad de flujo y la composicin del gas. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento y la temperatura final
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e iniciar el aumento de temperatura. Alternativamente, analizar el termograma
sobre un amplio intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposicin, o 10 a 20 por encima del punto de fusin a una velocidad de calentamiento de 1 a 20 por minuto). Calcular la
ganancia o prdida de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje.
MICROSCOPA DE PLATINA CALIENTE

La microscopa de platina caliente es una tcnica analtica que implica el monitoreo de las propiedades pticas de la muestra
como una funcin de la temperatura usando un microscopio. La microscopa de platina caliente se puede usar como tcnica
complementaria de otras tcnicas de anlisis trmico, tales como DSC, DTA y difraccin de rayos X de temperatura variable
para polvos, para la caracterizacin del estado slido de compuestos farmacuticos. Resulta de utilidad para confirmar transiciones tales como fusiones, recristalizaciones y transformaciones al estado slido usando una tcnica visual. El microscopio de
platina caliente debe someterse a una calibracin de temperatura.
Captulos
Al examinar materiales cristalinos puros, pueden ser apropiadas velocidades tan bajas como 1 por minuto, mientras que
para materiales polimricos y dems materiales semicristalinos resultan ms apropiadas velocidades de hasta 20 por minuto.
Comenzar el anlisis y registrar la curva del anlisis trmico diferencial con la temperatura en el eje x y el cambio de energa en
el eje y. La temperatura de fusin (temperatura de inicio de fusin) es la interseccin (188,79) de la extensin de la lnea base
con la tangente al punto de mayor pendiente (punto de inflexin) de la curva (ver Figura 1). El vrtice es la temperatura en el
pico de la curva (190,31). La entalpa del evento es proporcional al rea bajo la curva despus de aplicar una correccin de la
lnea base.
726 891 Anlisis Trmico / Pruebas Fsicas
USP 38
ANLISIS DE IMPUREZAS EUTCTICAS
Captulos
La base de cualquier mtodo de pureza calorimtrica es la relacin entre la disminucin del punto de fusin y de congelacin y el nivel de impurezas. La fusin de un compuesto est caracterizada por la absorcin del calor latente de fusin, DHf, a
una temperatura especfica, To. En teora, una transicin de fusin para un compuesto cristalino totalmente puro debe ocurrir
dentro de un intervalo infinitamente estrecho. Una ampliacin del intervalo de fusin, debido a impurezas, proporciona un
criterio de pureza sensible. El efecto es evidente mediante el examen visual de termogramas de muestras que difieren por unas
pocas dcimas de porcentaje en el contenido de impurezas. Un material con 99% de pureza se funde aproximadamente en un
20% a una temperatura de 3 por debajo del punto de fusin del material puro (ver Figura 2).
Figura 2. Termogramas superpuestos en los que se muestra el efecto de las impurezas sobre la forma del pico de fusin en
una DSC.
Los parmetros de fusin (intervalo de fusin, DHf y la pureza eutctica calculada) se obtienen fcilmente a partir del termograma de un solo evento de fusin empleando una muestra de prueba pequea y el mtodo no requiere mediciones mltiples
de temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se convierten directamente a transferencia de calor, en milicaloras por segundo.
El descenso del punto de congelacin en soluciones diluidas por molculas de tamao casi igual se expresa mediante la ecuacin de van't Hoff modificada:
en donde T = temperatura absoluta en grados Kelvin; X2 = fraccin molar del componente menor (soluto; impureza), DHf =
calor molar de fusin del componente principal en Joules por mol: R = constante de gases en Joules por mol grados Kelvin; y
KD = cociente de distribucin del soluto entre la fase slida y la fase lquida.
Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeo y que no se forman slidos en solucin (KD = 0), la integracin de la
ecuacin de van't Hoff proporciona la siguiente relacin entre la fraccin molar de la impureza y la disminucin del punto de
fusin:
en donde To = punto de fusin del compuesto puro, en grados Kelvin, y Tm = punto de fusin de la muestra de prueba, en
grados Kelvin.
Sin formacin de slidos en la solucin, la concentracin de la impureza en la fase lquida, a cualquier temperatura durante
la fusin, es inversamente proporcional a la fraccin fundida a esa temperatura y la disminucin del punto de fusin es directamente proporcional a la fraccin molar de la impureza. Un grfico de la temperatura observada de la muestra de prueba, Ts,
frente al recproco de la fraccin fundida, 1/ F, a una temperatura Ts, debe producir una lnea recta con una pendiente igual a
la disminucin del punto de fusin (To Tm). El punto de fusin terico del compuesto puro se obtiene mediante extrapolacin a 1/F = 0:
USP 38
Pruebas Fsicas / 905 Uniformidad de Unidades de Dosificacin 727
905 UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIN

Este captulo de pruebas generales ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y la Farmacopea Japonesa. Los textos del captulo que son textos USP de aplicacin nacional y que no forman parte del texto armonizado
estn marcados con los smbolos () para indicar esta situacin.
NOTAEn este captulo, los trminos unidad y unidad de dosificacin son sinnimos.
Para garantizar la uniformidad de las unidades de dosificacin, cada unidad en un lote debe tener un contenido de frmaco
dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada. Las unidades de dosificacin se definen como formas farmacuticas que contienen una nica dosis o parte de una dosis de un frmaco en cada unidad. Para suspensiones, emulsiones
o geles en envases de dosis nica destinadas para administracin externa o cutnea no se aplica la especificacin de uniformidad de unidades de dosificacin.
El trmino uniformidad de unidades de dosificacin se define como el grado de uniformidad en el contenido del frmaco
entre las unidades de dosificacin. Por lo tanto, los requisitos de este captulo son aplicables a cada frmaco incluido en unidades de dosificacin que contengan uno o ms frmacos, a menos que se especifique algo diferente en otra parte de esta Farmacopea.
La uniformidad de las unidades de dosificacin se puede demostrar mediante uno de los siguientes mtodos, Uniformidad de
Contenido o Variacin de Peso (ver la Tabla 1). La prueba de Uniformidad de Contenido para preparaciones que se presentan en
unidades de dosificacin se basa en la valoracin individual del contenido de un frmaco o frmacos en un nmero de unidades de dosificacin para determinar si el contenido individual se encuentra dentro de los lmites fijados. El mtodo de Uniformidad de Contenido se puede aplicar en todos los casos.
La prueba de Variacin de Peso es aplicable para las siguientes formas farmacuticas:
(W1)
Soluciones contenidas en envases de dosis nica y en cpsulas blandas;
(W2)
Slidos (incluidos los polvos, grnulos y slidos estriles) envasados en envases unitarios y que no contienen sustancias activas o
inactivas agregadas;
(W3)
Slidos (incluidos los slidos estriles) envasados en envases unitarios, con o sin sustancias activas o inactivas agregadas, que
hayan sido preparados por liofilizacin a partir de soluciones verdaderas en sus envases finales y que declaran este mtodo de
preparacin; y
Captulos
La sustitucin de los valores obtenidos en forma experimental para To Tm, DHf y To en la ecuacin (2) produce la fraccin
molar de la impureza eutctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el porcentaje molar de impurezas eutcticas
totales.
Las desviaciones del grfico lineal terico tambin pueden ser producto de la formacin de soluciones slidas (KD 0), por lo
tanto se debe prestar atencin al interpretar estos datos.
Para observar el efecto lineal de la concentracin de impurezas sobre la disminucin del punto de fusin, la impureza debe
ser soluble en la fase lquida o la fase fundida del compuesto, pero insoluble en la fase slida, es decir, no se forma ninguna
solucin slida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son necesarias algunas semejanzas qumicas. Por
ejemplo, la presencia de compuestos inicos en compuestos orgnicos neutros y la descomposicin trmica quiz no se reflejen en las estimaciones de pureza. El alcance de estas limitaciones tericas se ha estudiado slo en forma parcial.
Las impurezas presentes provenientes de la ruta sinttica a menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay
generalmente ningn problema de solubilidad en el material fundido. Las impurezas compuestas por molculas de igual forma, tamao y carcter que las del componente principal pueden acomodarse en la matriz del componente principal sin modificar la retcula, formando soluciones slidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables por DSC. En tales casos, las estimaciones de pureza son demasiado altas. Esto es ms comn con cristales menos ordenados, segn lo indican los valores bajos
de calor de fusin.
Adems, el mtodo es confiable cuando la pureza del componenete principal es mayor de 98,5 mol% y los materiales no se
descomponen durante la fase de fusin.
Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas son reproducibles y generalmente confiables con una aproximacin de 0,1% para compuestos ideales.
Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse en la determinacin de pureza a menos que el compuesto se convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el DTA son intrnsicamente tiles para detectar y en consecuencia realizar el seguimiento del polimorfismo.
ProcedimientoEl procedimiento vigente y los clculos a emplear para el anlisis de impurezas eutcticas dependen del
instrumento especfico usado. Consultar la tcnica ms apropiada para un instrumento dado en la bibliografa del fabricante
y/o en la bibliografa de anlisis trmico. De todas formas, es imperativo recordar las limitaciones de formacin de soluciones
slidas, la insolubilidad en el material fundido, el polimorfismo y la descomposicin durante el anlisis.
728 905 Uniformidad de Unidades de Dosificacin / Pruebas Fsicas
(W4)
USP 38
Cpsulas duras, tabletas sin cubierta o tabletas recubiertas con pelculas que contengan 25 mg o ms de un frmaco que corresponda al 25% o ms, en peso, de la unidad de dosificacin o, en el caso de cpsulas duras, el contenido de las cpsulas,
excepto que se demuestre la uniformidad de otros frmacos presentes en proporciones menores en cumplimiento de los requisitos de Uniformidad de Contenido.
La prueba de Uniformidad de Contenido se requiere para todas las formas farmacuticas que no cumplen las condiciones enumeradas anteriormente para la prueba de Variacin de Peso.1
Tabla 1. Aplicacin de las Pruebas de Uniformidad de Contenido (UC) y Variacin de Peso (VP) para Formas Farmacuticas
Dosis y
Proporcin de
Frmaco
Forma
Farmacutica
Tabletas
Tipo
Sin cubierta
Recubiertas
Cpsulas
Subtipo
VP
UC
VP
UC
Otras
UC
UC
Suspensin, emulsin o
gel
Captulos
Soluciones
Slidos en envases
unitarios
VP
UC
UC
UC
VP
VP
VP
VP
Solucin liofilizada en envase final
VP
VP
Otros
Componente nico
Varios componentes
<25 mg
o <25%
Pelcula
Duras
Blandas
25 mg
y 25%
UC
UC
Soluciones en envases de dosis nica y

en cpsulas blandas
VP
VP
Otros
UC
UC
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO
Seleccionar no menos de 30 unidades y proceder segn se indica a continuacin para cada forma farmacutica especificada.
Cuando se utilizan procedimientos diferentes para la valoracin de la preparacion y para la prueba de Uniformidad de Contenido, puede ser necesario establecer un factor de correccin que deber aplicarse a los resultados de esta ltima.
Formas Farmacuticas Slidas

Valorar 10 unidades individualmente usando un mtodo analtico apropiado. Calcular el valor de aceptacin (ver la Tabla 2).
Formas Farmacuticas Lquidas o Semislidas

Valorar 10 unidades individualmente usando un mtodo analtico apropiado. Realizar la valoracin sobre la cantidad de material bien mezclado que se retira de un envase individual en condiciones normales de uso y expresar los resultados como la
dosis entregada. Calcular el valor de aceptacin (ver la Tabla 2).
Clculo del Valor de Aceptacin

Calcular el valor de aceptacin, por la frmula:
en donde los trminos se definen en la Tabla 2.
1 Textos
de la Farmacopea Europea y la Farmacopea Japonesa no aceptados por la Farmacopea de los Estados Unidos: Como alternativa, para los productos listados en el punto (4) anterior que no cumplen con el lmite de umbral de 25 mg/25%, se puede analizar la uniformidad de las unidades de dosificacin mediante
Variacin de Masa en lugar de la prueba de Uniformidad de Contenido si la desviacin estndar relativa (RSD) de la concentracin del frmaco en las unidades de
dosificacin finales no es ms de 2%, basndose en los datos de validacin del proceso y en los datos de desarrollo, y si existiese una aprobacin reglamentaria
para dicho cambio. La RSD de la concentracin es la RSD de la concentracin por unidad de dosificacin (p/p o p/v), en donde la concentracin por unidad de
dosificacin es igual al resultado de la valoracin por unidad de dosificacin dividido por el peso de la unidad de dosificacin individual. Ver la frmula para la RSD
en la Tabla 2.
Pruebas Fsicas / 905 Uniformidad de Unidades de Dosificacin 729
USP 38
Tabla 2
Variable
Definicin
Valor
Contenido individual de las unidades analizadas, expresado como porcentaje de la

cantidad declarada
Tamao de la muestra (nmero de unidades en una muestra)
Constante de aceptabilidad
Desviacin estndar de la muestra
RSD
Desviacin estndar relativa (la desviacin

estndar de la muestra expresada como
porcentaje de la media)
M (caso 1) a aplicar cuando

T 101,5
Valor de referencia
Si n = 10, entonces k =
2,4
Si n = 30, entonces k =
2,0
100s/X
Si 98,5% X 101,5%,
entonces
M = X (AV = ks)
Si X <98,5%, entonces
M = 98,5%
(AV = 98,5 X + ks)
Si X >101,5%,
entonces
M = 101,5%
(AV = X 101,5 + ks)
Si 98,5 X T,
entonces
M=X
(AV = ks)
Valor de referencia
Si X <98,5%, entonces
Si X >T, entonces
Valor de aceptacin (AV)
M = 98,5%
(AV = 98,5 X + ks)
M = T%
(AV = X T + ks)
Frmula general:
(Ms arriba se especifican clculos

para cada uno de los casos.)
L1
Mximo valor de aceptacin permitido
L2
Mximo intervalo permitido para la desviacin de cada unidad de dosificacin analizada a partir del valor calculado de M
Contenido deseado por unidad de dosificacin al momento de la fabricacin, expresado como porcentaje de la cantidad declarada. A menos que se indique de otro
modo, T es 100,0% o T es el contenido
deseado aprobado por el fabricante por
unidad de dosificacin.
L1 = 15,0 a menos que se especifique algo diferente

Para los valores inferiores, ninL2 = 25,0 a menos que se especifign resultado de unidad de
que algo diferente
dosificacin puede ser menor
de [1(0,01)(L2)]M, mientras
que para los valores superiores,
ningn resultado de unidad de
dosificacin puede ser mayor
de [1 + (0,01)(L2)]M. (Esto est basado en un valor de L2 de
25,0.)
VARIACIN DE PESO
Llevar a cabo una valoracin del (de los) frmaco(s) en una muestra representativa del lote usando un mtodo analtico
apropiado. Este valor es el resultado A, expresado como porcentaje de la cantidad declarada (ver Clculo del Valor de Acepta-
Captulos
c1, c2, , cn
M (caso 2) a aplicar cuando

T >101,5
Condiciones
Media de los contenidos individuales (c1,

c2, , cn), expresados como el porcentaje de la cantidad declarada
730 905 Uniformidad de Unidades de Dosificacin / Pruebas Fsicas
USP 38
cin). Se debe asumir que la concentracin (peso del frmaco por peso de unidad de dosificacin) es uniforme. Seleccionar no
menos de 30 unidades de dosificacin y proceder segn se indica a continuacin para la forma farmacutica designada.
Tabletas sin Cubierta o Recubiertas con Pelcula

Pesar con exactitud 10 tabletas individualmente. Calcular el contenido, expresado como porcentaje de la cantidad declarada, a partir del peso de la tableta individual y del resultado de la Valoracin. Calcular el valor de aceptacin.
Cpsulas Duras
Pesar con exactitud 10 cpsulas individualmente, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cpsula. Retirar el contenido de cada cpsula por un medio adecuado. Pesar individualmente con exactitud las cubiertas vacas y calcular para cada
cpsula el peso neto de su contenido restando el peso de la cubierta del peso bruto respectivo. Calcular el contenido de
frmaco de cada cpsula a partir del peso neto del contenido de la cpsula individual y del resultado de la Valoracin. Calcular el valor de aceptacin.
Captulos
Cpsulas Blandas
Pesar con exactitud 10 cpsulas intactas individualmente para obtener sus pesos brutos, teniendo cuidado de preservar la
identidad de cada cpsula. Luego cortar y abrir las cpsulas con ayuda de un instrumento cortante seco, limpio y adecuado,
como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido lavando con un disolvente adecuado. Dejar que el
disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos,
tomando precauciones para evitar la absorcin o la prdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el contenido neto. Calcular el contenido de frmaco en cada cpsula a partir del peso del producto retirado de la cpsula individual y
del resultado de la Valoracin. Calcular el valor de aceptacin.
Formas Farmacuticas Slidas Diferentes de Tabletas y Cpsulas

Proceder segn se indica para Cpsulas Duras, tratando cada unidad como all se describe. Calcular el valor de aceptacin.
Formas Farmacuticas Lquidas

Pesar con exactitud la cantidad de lquido que se retira de cada uno de 10 envases individuales en condiciones normales de
uso. Si fuera necesario, calcular el volumen equivalente despus de determinar la densidad. Calcular el contenido de frmaco
en cada envase a partir de la masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la Valoracin. Calcular el
valor de aceptacin.
Clculo del Valor de Aceptacin

Calcular el valor de aceptacin como se muestra en Uniformidad de Contenido con la excepcin de que el contenido individual de las unidades se reemplaza por el contenido estimado individual, como se define a continuacin.
c1, c2,..., cn
w1, w2,..., wn
contenido estimado individual de las unidades analizadas, en donde ci = wi A / W,

pesos
contenido de frmaco (% de la cantidad declarada) obtenido usando un mtodo analtico

apropiado
media de pesos individuales

(w1, w2,..., wn)
individuales de las unidades analizadas
CRITERIOS
Aplicar los siguientes criterios, a menos que se especifique algo diferente.
Formas Farmacuticas Slidas, Lquidas y Semislidas

Se cumple con los requisitos de uniformidad de dosificacin si el valor de aceptacin de las primeras 10 unidades de dosificacin es menor o igual a L1%. Si el valor de aceptacin es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el
valor de aceptacin. Se cumple con los requisitos si el valor de aceptacin final de las 30 unidades de dosificacin es menor o
igual a L1%, y si el contenido individual de ninguna unidad de dosificacin es menor de [1 (0,01)(L2)]M ni mayor de [1 +
Pruebas Fsicas / 911 ViscosidadMtodos Capilares 731
USP 38
(0,01)(L2)]M como se especifica en Clculo del Valor de Aceptacin en Uniformidad de Contenido o en Variacin de Peso. A
menos que se especifique algo diferente, L1 es 15,0 y L2 es 25,0.
911 VISCOSIDADMTODOS
USP38
CAPILARES
Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una
viscosidad que es independiente de la velocidad de corte o cizallamiento. [NOTAPara ms informacin, ver el captulo Reometra 1911.]USP38
MTODO I. VISCOSMETRO CAPILAR DE NIVEL SUSPENDIDO (O TIPO UBBELOHDE)USP38
Aparato: La determinacin se puede llevar a cabo con un viscosmetro capilar de nivel suspendidoUSP38 (Figura 1). USP38
Captulos
Figura 1. Viscosmetro capilar de nivel suspendido (o tipo Ubbelohde).USP38

Se pueden usar otros viscosmetros, siempre que la exactitud y la precisin no sean menores que las obtenidas con los
viscosmetros descritos en este captulo.USP38
Procedimiento: Llenar el viscosmetro a travs del tubo (L) con una cantidad suficiente del fluido muestra, que sea apropiada para el viscosmetro en uso, o siguiendo las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo el experimento con el tubo en
posicin vertical. Llenar el bulbo (A) con el lquido y asegurarse tambin de que el nivel del lquido en el bulbo (B) est por
debajo de la salida al tubo de venteo (M). Sumergir el viscosmetro en un bao de agua o aceite estabilizado a la temperatura especificada en la monografa individual y controlar la temperatura a 0,1, a menos que se especifique algo distinto
en la monografa individual. Mantener el viscosmetro en posicin vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos
para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel del lquido en el
tubo (N) hasta un nivel de aproximadamente 8 mm por encima de la marca (E h1). Mantener el lquido a este nivel cerrando el tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el tubo (N) y medir el tiempo requerido para que el nivel del lquido baje
desde la marca (E h1) hasta la marca (F h2), usando un dispositivo apropiado para la medicin exacta del tiempo.
[NOTAEl tiempo de flujo mnimo debe ser 200 segundos.USP38]
732 911 ViscosidadMtodos Capilares / Pruebas Fsicas
USP 38
Calibracin: Calibrar cada viscosmetro a la temperatura de prueba usando fluidos con viscosidades conocidas de estndares de viscosidad apropiados para determinar la constante del viscosmetro, k. Los valores de viscosidad de los estndares
de calibracin deben abarcar el valor de viscosidad esperado del fluido muestra. USP38
Calcular la constante del viscosmetro, k, en mm2/s2:
k = h/(r t)
h
= viscosidad conocida del lquido (mPa s)

r
= densidad del lquido (g/mL)
t
= tiempo de flujo requerido para que el lquido pase desde la marca superior hasta la marca inferior (s)
Clculo de las viscosidades cinemtica y newtoniana del fluido muestra: Seleccionar un viscosmetro capilar de modo
que el tiempo de flujo, t, sea no menos de 200 segundos;USP38 y la correccin de energa cinemtica sea, por lo regular,
menos de 1%. Si se conoce la constante de viscosidad, k, usar la siguiente ecuacin para calcular la viscosidad cinemtica,
v, en mm2/s, a partir del tiempo de flujo, t, en segundos.
v=kt
Si se conoce la densidad del fluido a la temperatura de la medicin de la viscosidad, entonces la viscosidad newtoniana, h,
en mPa s, se calcula:
Captulos
h=vr
r
= densidad del fluido (g/mL)
El tiempo de flujo del fluido en anlisis es la media de no menos de tres determinaciones consecutivas. El resultado es vlido si la desviacin estndar relativa porcentual (%RSD) para las tres lecturas es no ms de 2,0%.
MTODO II. VISCOSMETRO CAPILAR SIMPLE DE TUBO EN FORMA DE U (O TIPO OSTWALD)USP38
Aparato: La determinacin se puede llevar a cabo con un viscosmetro capilar simple de tubo en forma de UUSP38 (Figura
2).
Figura 2. Viscosmetro capilar simple de tubo en forma de U (o tipo Ostwald).USP38

Las variables y los nmeros de las lneas en la Figura 2 se definen como:
Lnea 1 = marca superior en el tubo
V
= volumen dado del fluido (m3)
Lnea 2 = marca inferior en el tubo
L
= longitud del tubo capilar (m)
USP 38
Pruebas Fsicas / 912 ViscosidadMtodos Rotatorios 733
Se pueden usar otros viscosmetros, como los viscosmetros capilares tipo Ostwald modificados,1 siempre que la exactitud y
la precisin no sean menores que las obtenidas con los viscosmetros descritos en este captulo.USP38
Procedimiento: Llenar el tubo con una cantidad de la muestra que sea apropiada para el viscosmetro en uso o siguiendo
las instrucciones del fabricante. El volumen de fluido usado debe ser tal que el bulbo inferior no se vace completamente
cuando el fluido se direcciona hacia arriba a travs del tubo capilar hasta la marca de graduacin ms alta. Llevar a cabo el
experimento con el tubo en posicin vertical. Sumergir el viscosmetro en un bao de agua o aceite estabilizado a la temperatura especificada en la monografa individual y controlar la temperatura a 0,1, a menos que se especifique algo distinto en la monografa individual. Mantener el viscosmetro en posicin vertical durante un periodo de no menos de 30
minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Usando succin, direccionar hacia arriba el
fluido a travs del tubo capilar hasta que el menisco alcance el nivel de la graduacin ms alta. Con el tubo de llenado y el
tubo capilar abiertos a la presin atmosfrica, registrar el tiempo, en segundos, requerido para que el lquido fluya desde la
marca superior hasta la marca inferior en el tubo capilar. [NOTAEl tiempo de flujo mnimo debe ser 200 segundos.]
Calibracin y Clculo de las viscosidades cinemtica y newtoniana del fluido muestra: Proceder segn se indica en el
Mtodo I. Para ciertos viscosmetros capilares simples de tubo en forma de U, determinar la constante del viscosmetro a la
misma temperatura que el lquido de muestra en anlisis.USP38
912 VISCOSIDADMTODOS ROTATORIOSUSP38

MTODO I. VISCOSMETROS DE ROTORUSP38
Aparato: En el viscosmetroUSP38 de rotor, la viscosidad aparente se determina haciendo girar un rotor con forma de cilindro o disco, segn se muestra en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente, sumergido en un gran volumen de lquido.
Figura 1. Rotores con forma de cilindro.
1 Por ejemplo, el viscosmetro capilar Cannon-Fenske es uno de los viscosmetros capilares simples de tubo en forma de U y tambin se conoce como viscosmetro
capilar tipo Ostwald modificado.
Captulos
El principio del mtodo se basa en medir la fuerza (torque) que acta sobre un rotor cuando ste rota a una velocidad angular
constante o velocidad de rotacinUSP38 en un lquido. Los remetros o viscosmetros rotatorios se usan para medir la viscosidad de fluidos newtonianos y no newtonianos.USP38 Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad
de fluidos newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. La viscosidad calculada de los fluidos newtonianos debe ser la misma (dentro del error experimental), independientemente de la velocidad de corte (o velocidad de rotacin). Dada la dependencia de la viscosidad con respecto a la temperatura, la temperatura de la sustancia que se est midiendo se debe controlar dentro de 0,1, a menos que se especifique algo distinto en la monografa individual. [NOTA
Para ms informacin, ver el captulo Reometra 1911.]USP38
734 912 ViscosidadMtodos Rotatorios / Pruebas Fsicas
USP 38
Figura 2. Rotores con forma de disco.

No se puede calcular una viscosidad absoluta debido a la gran distancia existente entre el rotor y la pared del recipiente,
o a la geometra del rotor. El torque empleado para mantener una velocidad angular dada proporciona una medida de la
resistencia del lquido a fluir, pero a menudo esto se describe como una viscosidad aparente.
Se pueden usar otros tipos de viscosmetros de rotor, siempre que la exactitud y la precisin no sean menores que las obtenidas con los viscosmetros descritos en este captulo.USP38
Procedimiento: Cuando la medicin de la viscosidad se realiza en un vaso de precipitados o vaso, y debido a que la velocidad de corte es desconocida, para poder conseguir reproducibilidad entre laboratorios que miden la viscosidad usando
instrumentos diferentes, deben informarse los siguientes parmetros junto con la medida de la viscosidad:USP38
1. Tamao y especificaciones geomtricas del rotor
2. Velocidad angular o velocidad de rotacinUSP38 del rotor
3. Temperatura de la sustancia de prueba
El rotor debe sumergirse a la profundidad recomendada, manteniendo al menos 1 cm de distancia con el fondo y con las
paredes del recipiente.USP38
La preparacin de la muestra de prueba, incluyendo la equilibracin de temperatura, se especifica en cada monografa individual. Seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento con respecto a la carga de la muestra, la seleccin del
rotor y la operacin del viscosmetro.USP38
Comprobacin de la
Comprobar la calibracin de la configuaracin de un viscosmetro particular a
USP38 calibracin:
la temperatura de prueba, usando uno o ms fluidos de viscosidad conocida (estndares de viscosidad newtoniana). Los
valores de viscosidad de los estndares de calibracin deben contener el valor de viscosidad esperado del lquido de muestra. [NOTAPara ayudar a verificar la linealidad del aparato, se sugiere realizar mediciones de un estndar de viscosidad
newtoniana a distintas velocidades de rotacin a la temperatura de prueba.]USP38
Se considera que un viscosmetroUSP38 est calibrado cuando las viscosidades aparentes medidas estn dentro de 5% de
los valores indicados.
En general, la calibracin, operacin y limpieza del viscosmetroUSP38 se deben llevar a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante del instrumento.
Captulos
MTODO II. REMETROS DE CILINDROS CONCNTRICOS
Aparato: En los remetros de cilindros concntricos, la viscosidad aparente se determina colocando el lquido en el espacio
entre el cilindro interno y el cilindro externo. Los remetros rotatorios de tensin controlada y de velocidad controlada estn disponibles comercialmente en configuraciones con especificaciones geomtricas absolutas (p.ej., espacios anulares
muy pequeos entre los cilindros concntricos) que permiten calcular las viscosidades aparentes de fluidos no newtonianos. Los remetros de tensin de corte controlada miden las velocidades de corte resultantes al aplicar una fuerza o torque
dado (la tensin). Los remetros de velocidad de corte controlada miden la tensin de corte (del torque sobre el eje del
rotor) resultante de la aplicacin de una velocidad de corte dada (o velocidad de rotacin).USP38 Los remetros rotatorios
de cilindros concntricos en ocasiones reciben el nombre de remetros de vaso y cilindro (cup-and-bob). El uso de estos
remetros implica consideraciones adicionales de diseo, dependiendo de si lo que gira es el cilindro externo (el vaso) o el
cilindro interno (el cilindro). Los remetros de vaso rotatorio reciben el nombre de sistemas Couette, mientras que los remetros de cilindro interno rotatorio se denominan sistemas Searle, segn se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, respectivamente.
Las variables en la Figura 3 y la Figura 4 se definen como:
= torque que acta sobre la superficie del cilindro (N m)
M
R0
= radio del cilindro externo (m)
R1
= radio del cilindro interno (m)
USP 38
h
= altura de inmersin del cilindro interno en el medio lquido (m)
w
= velocidad angular (radianes/s)
h
= viscosidad (Pa s)
v
= velocidad (m/s)USP38
Procedimiento: Colocar una cantidad suficiente de fluido de pruebaUSP38 en el remetro y dejar que la muestra alcance
el equilibrio trmico, segn se indica en la monografa individual. Poner en funcionamiento el remetro siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante del instrumento. Para sistemas no newtonianos, la monografa indica el tipo de
remetro que se debe usar y las velocidades de corte a las que se deben realizar las mediciones. Determinar las viscosidades aparentes, cambiando la velocidad de corte (o la tensin de corte, si se usa un remetro de tensin de corte controlada) en un intervalo apropiado para el uso del material en anlisis. A partir de una serie de este tipo de mediciones de viscosidad, se puede obtener la relacin entre la velocidad de corte y la tensin de corte de un lquido no newtoniano.USP38
Captulos
Figura 3. Sistema de cilindros concntricos Couette para reometra rotacional.
USP 38
Captulos
Figura 4. Sistema de cilindros concntricos Searle para reometra rotacional.

MTODO III. REMETROS DE CONO Y PLACA
Aparato: En los remetros de cono y placa, el lquido se introduce en el espacio fijoUSP38 entre un disco o placa planos y
un cono los cuales forman un ngulo definido. El ngulo del cono garantiza una velocidad de corte constante debido al
aumento del espacio y de la velocidad lineal conforme aumenta la distancia desde el origen.USP38 La medicin de viscosidad se puede realizar haciendo girar el cono o la placa, segn se muestra en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente.
[NOTAPuesto que el volumen de muestra es pequeo, incluso una pequea prdida absoluta de disolventes puede ocasionar un gran cambio porcentual en la viscosidad. Dicha prdida tiene una importancia particularmente relevante para
disolventes voltiles pero puede ser significativa incluso para disolventes no voltiles como el agua.]
USP 38
Figura 6. Remetro rotatorio de cono y placa con placa giratoria.

Las variables en la Figura 5 y la Figura 6 se definen como:
w
M
= torque que acta sobre la superficie de la placa plana o del cono (N m)
a
= ngulo entre la placa plana y el cono (radianes)
R
= radio del cono (m)USP38
Procedimiento: Proceder segn se indica en el Mtodo II. Remetros de Cilindros Concntricos.
USP38
MTODO IV. REMETROS DE PLACAS PARALELAS (O DE DISCOS PARALELOS)
Aparato: Los remetros de placas paralelas son similares a los remetros de cono y placa, salvo que la muestra que se va
medir se introduce en el espacio entre las dos placas o discos planos paralelos. Las mediciones se realizan normalmente
manteniendo la placa o disco inferior estacionario mientras que la placa o disco superior rota a una velocidad angular constante, w (Figura 7).
Captulos
Figura 5. Remetro rotatorio de cono y placa con cono giratorio.
Captulos
USP 38
Figura 7. Remetro rotatorio de placas paralelas.

Las variables en la Figura 7 se definen como:
w
R
= radio de la placa (m)
h
= distancia entre las dos placas paralelas (m)
A diferencia de lo que ocurre con el remetro de cono y placa, la velocidad de corte entre las placas paralelas aumenta con
la distancia desde el origen del eje de rotacin debido a que las velocidades lineales aumentan para una velocidad angular
dada con un espacio constante. De esta manera, se obtiene una velocidad de corte promedio. A pesar de esto, algunas de
las ventajas del remetro de placas paralelas incluye la facilidad de carga de la muestra (especialmente para lquidos muy
viscosos o semislidos blandos) y su aptitud para suspensiones de partculas. Para suspensiones, el espacio debe fijarse a
una altura suficiente para evitar que las partculas se muelan entre las placas. El usuario puede definir el espacio entre las
placas paralelas (dentro de lmites prcticos) y por lo tanto, ante la ausencia de partculas grandes, se pueden usar espacios ms estrechos. Al igual que con los remetros de cono y placa, la prdida de disolvente por evaporacin puede afectar en gran medida la viscosidad de la muestra, por lo que deben tomarse precauciones para minimizar la prdida de
disolvente.
Procedimiento: Proceder segn se indica en Mtodo II. Remetros de Cilindros Concntricos.USP38
913 VISCOSIDADMTODO DE BOLA RODANTE
USP38
El siguiente procedimiento se usa para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosidad que es independiente de la tensin o velocidad de corte. [NOTAPara ms informacin, ver el captulo Reometra
1911.] USP38
Aparato: Ver la Figura 1.
El diseo bsico de un viscosmetro de bola rodante consiste en un tubo (o capilar) que contiene el lquido de muestra en
anlisis y una bola cuyo tiempo de rodado deber ser al menos 20 segundos en el ngulo de medicin en el lquido de muestra.
USP 38
Pruebas Fsicas / 913 ViscosidadMtodo de Bola Rodante 739
Figura 1. Diseo bsico para un viscosmetro de bola rodante.

Principio de medicin: La medicin de viscosidad por medio de la bola rodante se basa en la Ley de Stokes y se ve influenciada por el ngulo de inclinacin del tubo (o capilar). Calcular la viscosidad newtoniana, h, en mPa s:
h = [(r1 r2) g r2 sinq]/v
h = k (r1 r2) t
k = constante de calibracin del instrumento (mm2/s2) a un ngulo y temperatura de medicin especificados
r1 = densidad de la bola usada (g/mL)
r2 = densidad del lquido de muestra (g/mL)
t = tiempo de rodado de la bola (s)
Calibrar cada combinacin de tubo (o capilar) y bola a la temperatura y ngulo de prueba usando fluidos con viscosidades y
densidades conocidas (estndares de viscosidad) para determinar la constante del sistema de medicin, k. [NOTAAlgunos viscosmetros automatizados emplean una funcin polinmica para determinar la calibracin para diversos ngulos y temperaturas.] Los valores de viscosidad de los estndares de calibracin deben contener el valor de viscosidad esperado del lquido de
muestra.
Las calibraciones son especficas para el radio y densidad de la bola, la temperatura y el ngulo de prueba. Siempre que se
cambie alguno de estos parmetros ser necesaria una recalibracin.
Cuando no se dispone de valores de referencia a la temperatura de prueba requerida, se deben seguir las instrucciones del
fabricante para aplicar las correcciones matemticas a la funcin de calibracin. Cuando los materiales de la bola y el tubo no
son similares, se deben aplicar correcciones calculadas usando los coeficientes de expansin trmica lineal de los materiales.
Captulos
r1 = densidad de la bola usada (g/mL)

r2 = densidad del lquido de muestra (g/mL)
g = constante gravitacional (mm/s2)
r = radio de la bola (mm)
q = ngulo de inclinacin del tubo (o capilar)
v = velocidad terminal de la bola (mm/s)
Determinar la viscosidad del lquido, observando el tiempo de rodado de una esfera slida (bola) bajo la influencia de la
gravedad en un tubo cilndrico inclinado relleno del lquido de muestra. Medir el tiempo que la bola tarda en recorrer la distancia establecida entre dos marcas de anillo o sensores de medicin. Para cada uno de los tiempos de rodado medidos, la
viscosidad resultante se puede expresar como viscosidad dinmica (mPa s) o como viscosidad cinemtica (mm2/s) para una
muestra con una densidad conocida.
Procedimiento: Seleccionar un sistema de medicin [combinacin de tubo (o capilar) y bola] dentro del intervalo anticipado
de viscosidad del lquido de muestra. Calentar el tubo limpio y seco y la bola del viscosmetro a la temperatura especificada en
la monografa individual y controlar la temperatura a 0,1 segn sea necesario, a menos que se especifique algo distinto en la
monografa individual. Seleccionar un ngulo de medicin para obtener un tiempo de rodado mnimo de 20 segundos. Llenar
el tubo con el lquido de muestra, procurando evitar la formacin de burbujas. Cerrar el tubo y colocarlo en el instrumento.
Para un viscosmetro de bola rodante con un tubo de dimetro grande, dejar que se equilibre a la temperatura especificada
durante no menos de 15 minutos. Para un viscosmetro de microbola rodante, seguir las instrucciones del fabricante con respecto al equilibrio de la temperatura. Soltar la bola y registrar el tiempo requerido para que la bola ruede desde la marca de
anillo superior hasta la marca de anillo inferior (o sensor de medicin). Repetir la prueba al menos cuatro veces.
El tiempo de rodado en el fluido en anlisis es la media de no menos de cuatro determinaciones consecutivas. El resultado es
vlido si la desviacin estndar relativa porcentual (%RSD) para las cuatro lecturas es no ms de 2,0%.
Clculo y calibracin: Calcular la viscosidad newtoniana, h, en mPa s:
740 921 Determinacin de Agua / Pruebas Fsicas
USP 38
921 DETERMINACIN DE AGUA

Numerosos artculos farmacopeicos son hidratos o contienen agua en forma adsorbida. Como consecuencia, la determinacin del contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con las normas farmacopeicas. Por lo general, en
cada monografa se exige uno de los mtodos que se describen a continuacin, en funcin de la naturaleza del artculo. En
algunos casos poco comunes se permite elegir entre dos mtodos. Si el artculo contiene agua de hidratacin, se utiliza el
Mtodo I (Volumtrico), el Mtodo II (Azeotrpico) o el Mtodo III (Gravimtrico), segn se indica en la monografa individual, y el
requisito se especifica bajo el encabezado Agua.
El encabezado Prdida por Secado (ver Prdida por Secado 731) se utiliza en aquellos casos en los que la prdida por calentamiento puede no ser totalmente de agua.
MTODO I (VOLUMTRICO)
Determinar el agua mediante el Mtodo Ia, a menos que se especifique algo diferente en la monografa individual.
Captulos
Mtodo Ia (Valoracin Volumtrica Directa)

PrincipioLa determinacin volumtrica del agua est basada en la reaccin cuantitativa del agua con una solucin anhidra de dixido de azufre y yodo en presencia de una solucin amortiguadora que reacciona con los iones hidrgeno.
En la solucin volumtrica original, conocida como Reactivo de Karl Fischer, el dixido de azufre y el yodo se disuelven en
piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse con el Reactivo directamente o el anlisis puede realizarse mediante
un procedimiento de valoracin residual. La estequiometra de la reaccin no es exacta y la reproducibilidad de la determinacin depende de factores tales como las concentraciones relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente
inerte utilizado para disolver la muestra de prueba y la tcnica utilizada en la determinacin en cuestin. Por lo tanto, para
conseguir la exactitud deseada se utiliza una tcnica empricamente estandarizada. La precisin del mtodo depende en gran
parte de la medida en que la humedad atmosfrica es eliminada del sistema. Normalmente la valoracin de agua se realiza
utilizando metanol anhidro como disolvente para la muestra de prueba. En algunos casos pueden utilizarse otros disolventes
adecuados para muestras de prueba especiales o no habituales. En estos casos, se recomienda la adicin de al menos 20% de
metanol u otro alcohol primario.
AparatoPuede utilizarse cualquier aparato que garantice una exclusin de la humedad atmosfrica y una determinacin
del punto final adecuadas. En el caso de una valoracin directa de una solucin incolora, el punto final se puede observar visualmente como un cambio de color de amarillo canario a mbar. El caso inverso se observa cuando se realiza una valoracin
residual de una muestra de prueba. Sin embargo, de forma ms habitual el punto final se determina de forma electromtrica
utilizando un aparato con un circuito elctrico simple que genera un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV entre
un par de electrodos de platino sumergidos en la solucin que se desea valorar. En el punto final de la valoracin un ligero
exceso de reactivo aumenta el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios durante un perodo de 30 segundos a 30 minutos, dependiendo de la solucin que se est valorando. Este perodo es menor en el caso de sustancias que se disuelven en
el reactivo. En algunos valoradores volumtricos automticos el cambio abrupto de corriente o de potencial en el punto final
hace cerrar una vlvula operada por solenoide que controla la bureta que suministra la solucin volumtrica. Los aparatos disponibles comercialmente comprenden por lo general un sistema cerrado que consta de una o dos buretas automticas y un
vaso de valoracin cubierto hermticamente equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magntico. El aire en el
sistema se mantiene seco con un desecante adecuado y el vaso de valoracin puede purgarse mediante una corriente de nitrgeno seco o de aire seco.
ReactivoPreparar el Reactivo de Karl Fischer segn se indica a continuacin. Agregar 125 g de yodo a una solucin que
contenga 670 mL de metanol y 170 mL de piridina, y enfriar. Colocar 100 mL de piridina en una probeta graduada de 250 mL
y, manteniendo la piridina fra en un bao de hielo, introducir dixido de azufre seco hasta alcanzar un volumen de 200 mL.
Agregar lentamente esta solucin a la mezcla de yodo enfriada, agitando. Agitar hasta disolver el yodo, transferir la solucin al
aparato y dejar la solucin en reposo durante la noche antes de estandarizar. Un mL de esta solucin recientemente preparada
equivale aproximadamente a 5 mg de agua; como esta solucin se deteriora gradualmente, se recomienda estandarizarla dentro de un perodo de 1 hora antes de su uso o diariamente si su uso es continuo. Proteger la solucin de la luz mientras se est
utilizando. Almacenar el reactivo preparado a granel en un recipiente con tapn de vidrio adecuadamente sellado, totalmente
protegido de la luz y refrigerado. Para determinar agua en cantidades de trazas (menos de 1%), es preferible usar un Reactivo
con un factor de equivalencia de agua de no ms de 2,0, el cual generar el consumo de un volumen ms significativo de
solucin volumtrica.
Puede utilizarse una solucin estabilizada de reactivo de tipo Karl Fischer disponible comercialmente. Tambin pueden utilizarse reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al
metanol. stos pueden ser soluciones individuales o reactivos formados in situ combinando los componentes de los reactivos
presentes en dos soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas monografas debe diluirse de acuerdo con las
Pruebas Fsicas / 921 Determinacin de Agua 741
USP 38
instrucciones del fabricante. Como diluyente puede utilizarse metanol u otro disolvente adecuado, como el ter monometlico
de etilenglicol.
Preparacin de PruebaA menos que se especifique algo diferente en la monografa individual, utilizar una cantidad pesada o medida con exactitud de la muestra en anlisis con un contenido de agua estimado de 2250 mg. La cantidad de agua
depende del factor de equivalencia de agua del Reactivo y del mtodo de determinacin del punto final. En la mayora de los
casos, se puede estimar la cantidad mnima de la muestra, en mg, por la frmula:
FCV/KF
W/V
en donde W es el peso, en mg, del agua contenida en la alcuota de estndar usado; y V es el volumen, en mL, del Reactivo
usado en la valoracin. Para tartrato de sodio dihidrato, agregar rpidamente 20125 mg de tartrato de sodio dihidrato
(C4H4Na2O6 2H2O), pesados con exactitud por diferencia, y valorar hasta el punto final. El factor de equivalencia de agua F, en
mg de agua por mL de reactivo, se calcula por la frmula:
W/V (36,04/230,08)
en donde 36,04 es dos veces el peso molecular de agua y 230,08 es el peso molecular de tartrato de sodio dihidrato; W es el
peso, en mg, del tartrato de sodio dihidrato; y V es el volumen, en mL, del Reactivo consumido en la segunda valoracin. Tomar en cuenta que la solubilidad del tartrato de sodio dihidrato en metanol es tal que podra necesitarse metanol nuevo para
valoraciones adicionales del estndar de tartrato de sodio dihidrato.
1 Considerar una configuracin en la que el factor de equivalencia del reactivo sea de 5 mg/mL y el volumen de la bureta sea de 5 mL, as como un punto final
instrumental. Se pueden usar cantidades de estndar equivalentes a entre 2,5 mg y 22,5 mg de agua (10%90% de la capacidad de la bureta) basndose en la
bureta y el factor de equivalencia del reactivo. El lmite superior de este intervalo implicara una cantidad excesiva de tartrato de sodio dihidrato. Si se pesa Agua
Purificada o un estndar, se requiere una balanza analtica apropiada para la cantidad pesada.
Captulos
en donde F es el factor de equivalencia de agua del Reactivo, en mg por mL; C es el volumen usado, en porcentaje, de la capacidad de la bureta; V es el volumen de la bureta, en mL; y KF es el lmite o contenido razonable de agua esperado en la muestra, en porcentaje. C est generalmente entre 30% y 100% para la valoracin manual, y entre 10% y 100% para el mtodo
instrumental de determinacin del punto final. [NOTASe recomienda que el producto de FCV sea mayor o igual a 200 para el
clculo, a fin de asegurar que la cantidad mnima de agua valorada sea mayor o igual a 2 mg.]
Si la muestra en anlisis es un aerosol con propelente, conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el
envase y analizar 10,0 mL de la muestra bien mezclada. Para valorar la muestra, determinar el punto final a una temperatura
de 10 o mayor.
Si la muestra en anlisis son cpsulas, utilizar una porcin del contenido mezclado de no menos de 4 cpsulas.
Si la muestra en anlisis son tabletas, utilizar el polvo de no menos de cuatro tabletas molidas hasta polvo fino en una atmsfera con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no afectan los resultados.
En los casos en los que la monografa especifique que la muestra en anlisis es higroscpica, colocar una porcin del slido,
pesada con exactitud, en un vaso de valoracin, procediendo inmediatamente y procurando evitar la absorcin de humedad
atmosfrica. Si la muestra est constituida por una cantidad definida de slido como producto liofilizado o polvo dentro de un
vial, utilizar una jeringa seca para inyectar un volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, en un recipiente tarado y agitar hasta disolver la muestra. Con la misma jeringa, retirar la solucin del recipiente y transferirla a un vaso de valoracin preparado segn se indica en Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porcin
de metanol u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, agregar este lavado al vaso de valoracin y valorar inmediatamente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una porcin de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado
para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, segn se indica en Estandarizacin de la Solucin de Agua para
Valoraciones Volumtricas Residuales, y restar este valor del contenido de agua, en mg, obtenido en la valoracin de la muestra
en anlisis. Secar el recipiente y su cierre a 100 durante 3 horas, dejar que se enfren en un desecador y pesar. Determinar el
peso de la muestra analizada a partir de la diferencia en peso con respecto al peso inicial del recipiente.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conectado al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrgeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formacin de agua como resultado de la deshidratacin debida a la descomposicin de los componentes de la muestra, lo cual
puede invalidar este mtodo.
Estandarizacin del ReactivoColocar una cantidad suficiente de metanol o de otro disolvente adecuado en el vaso de
valoracin para cubrir los electrodos y agregar suficiente Reactivo para obtener el color caracterstico del punto final, o
100 50 microamperios de corriente continua con un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV.
Se puede usar Agua Purificada, tartrato de sodio dihidrato, un Estndar de Referencia USP, o estndares comerciales con un
certificado de anlisis rastreable hasta un estndar nacional para estandarizar el Reactivo. El factor de equivalencia del reactivo,
el volumen de valoracin recomendado, el tamao de la bureta y la cantidad de estndar que se va a medir son factores a
considerar al momento de seleccionar el estndar y la cantidad que se va a usar.1 Para Agua Purificada o estndares de agua,
agregar rpidamente el equivalente a entre 2 y 250 mg de agua. Calcular el factor de equivalencia del agua, F, en mg de agua
por mL de reactivo, por la frmula:
USP 38
ProcedimientoA menos que se especifique algo diferente, transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoracin asegurndose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 3040 mL) y
valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar presente. (No
tomar en cuenta el volumen consumido, ya que no se utiliza en los clculos). Agregar rpidamente la Preparacin de Prueba,
mezclar, y volver a valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual. Calcular el contenido de agua de la
muestra tomada, en mg, por la frmula:
SF
en donde S es el volumen, en mL, del Reactivo consumido en la segunda valoracin; y F es el factor de equivalencia de agua
del Reactivo.
Captulos
Mtodo Ib (Valoracin Volumtrica Residual)

PrincipioVer la informacin que figura en la seccin Principio en Mtodo Ia. En la valoracin residual se agrega un exceso
de Reactivo a la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para que se complete la reaccin y se valora el Reactivo no
consumido con una solucin estndar de agua en un disolvente como el metanol. El procedimiento de valoracin residual se
aplica de forma general y evita los problemas que pueden surgir en la valoracin directa de sustancias en las que el agua unida
se libera lentamente.
Aparato, Reactivo y Preparacin de PruebaUsar el Mtodo Ia.
Estandarizacin de la Solucin de Agua para Valoraciones Volumtricas ResidualesPreparar una Solucin de Agua diluyendo 2 mL de agua con metanol u otro disolvente adecuado hasta 1000 mL. Estandarizar esta solucin valorando 25,0 mL
con el Reactivo, previamente estandarizado segn se indica en Estandarizacin del Reactivo. Calcular el contenido de agua, en
mg por mL, de la Solucin de Agua tomada, por la frmula:
VF/25
en donde V es el volumen del Reactivo consumido y F es el factor de equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el contenido de agua de la Solucin de Agua semanalmente y estandarizar peridicamente el Reactivo contra ste segn sea necesario.
ProcedimientoSi la monografa individual especifica que el contenido de agua debe ser determinado por el Mtodo Ib,
transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoracin, asegurndose de que el volumen sea suficiente
para cubrir los electrodos (aproximadamente 3040 mL) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electromtrico o visual.
Agregar rpidamente la Preparacin de Prueba, mezclar y agregar un exceso, medido con exactitud, de Reactivo. Esperar un
tiempo suficiente para que se complete la reaccin y valorar el Reactivo no consumido con la Solucin de Agua estandarizada
hasta el punto final electromtrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la frmula:
F(X XR)
en donde F es el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X es el volumen, en mL, del Reactivo agregado despus de introducir la muestra; X es el volumen, en mL, de la Solucin de Agua estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consumido; y R es el cociente, V/25 (mL de Reactivo/mL de Solucin de Agua), determinado a partir de la Estandarizacin de la Solucin de Agua para Valoraciones Volumtricas Residuales.
Mtodo Ic (Valoracin Culombimtrica)

PrincipioPara la determinacin culombimtrica del agua se utiliza la reaccin de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se
agrega en forma de solucin volumtrica sino que se obtiene por oxidacin andica en una solucin que contiene yoduro. La
celda de reaccin consta normalmente de un amplio compartimiento andico y de un pequeo compartimiento catdico, separados entre s por un diafragma. Tambin pueden utilizarse otros tipos adecuados de celdas de reaccin (p.ej., sin diafragma). Cada compartimiento tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a travs de la celda. El yodo, que se produce en el electrodo andico, reacciona inmediatamente con el agua que est presente en el compartimiento. Cuando se ha
consumido toda el agua, se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta electromtricamente, lo que indica el
punto final. La humedad se elimina del sistema mediante pre-electrlisis. No es necesario cambiar la solucin de Karl Fischer
despus de cada determinacin ya que las diferentes determinaciones pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solucin reactivo. Un requisito de este mtodo es que cada componente de la muestra de prueba sea compatible con los dems
componentes y que no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las muestras son transferidas al vaso en forma de
solucin mediante la inyeccin a travs de un septo. Los gases se pueden introducir en la celda utilizando un tubo de entrada
de gas adecuado. La precisin del mtodo depende fundamentalmente del grado de eliminacin de la humedad atmosfrica
en el sistema; por tanto, la introduccin de slidos en la celda puede requerir precauciones tales como trabajar en una cmara
cerrada con guantes en una atmsfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede efectuar midiendo la deriva de la
lnea base, lo cual no excluye la necesidad de una correccin con un blanco cuando se usa como vehculo de introduccin de
la muestra. Este mtodo es especialmente adecuado para sustancias qumicas inertes como hidrocarburos, alcoholes y teres.
En comparacin con la valoracin volumtrica de Karl Fischer, la culombimetra es un micromtodo.
USP 38
Pruebas Fsicas / 921 Determinacin de Agua 743
MTODO II (AZEOTRPICODESTILACIN CON TOLUENO)

AparatoUtilizar un matraz de vidrio de 500 mL, A, conectado mediante una trampa, B, a un condensador de reflujo, C,
usando juntas de vidrio esmerilado (ver la Figura 1).
Figura 1. Aparato para Determinacin Azeotrpica con Tolueno

Las dimensiones crticas de las piezas del aparato son las siguientes. El tubo de conexin, D, tiene un dimetro interno de 9
11 mm. La trampa tiene una longitud de 235240 mm. El condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud aproximada de 400 mm y un dimetro interior de no menos de 8 mm. El tubo receptor, E, tiene una capacidad de 5 mL y su parte
cilndrica, con una longitud de 146156 mm, est graduada en subdivisiones de 0,1 mL, de forma que el error de lectura no es
mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de calor es preferiblemente un calentador elctrico con control
de restato o un bao de aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexin pueden estar aislados.
Captulos
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conectado al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrgeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formacin de agua como resultado de reacciones de descomposicin por la deshidratacin de los componentes de la muestra,
lo cual puede invalidar este mtodo.
AparatoResulta adecuado cualquier aparato comercialmente disponible que conste de un sistema absolutamente hermtico equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magntico. El microprocesador del instrumento controla el procedimiento analtico y muestra los resultados. No es necesario calibrar el instrumento ya que la corriente consumida puede medirse de forma absoluta.
ReactivoVer las recomendaciones del fabricante.
Preparacin de PruebaCuando la muestra sea un slido soluble, se puede disolver una cantidad apropiada, pesada con
exactitud, en metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
Cuando la muestra sea un slido insoluble, se puede extraer una cantidad apropiada, pesada con exactitud, usando un disolvente anhidro adecuado y se puede inyectar en la solucin del anolito. Alternativamente, se puede usar una tcnica de evaporacin en la que el agua se libere y evapore por calentamiento de la muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco.
El gas pasa luego al interior de la celda.
Cuando la muestra se va a usar directamente sin disolver en un disolvente anhidro adecuado, se puede introducir una cantidad apropiada, pesada con exactitud, directamente en la cmara.
Cuando la muestra es un lquido y es miscible con metanol anhidro u otros disolventes adecuados, se puede agregar una
cantidad apropiada, pesada con exactitud, al metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
ProcedimientoUsando un dispositivo seco, inyectar o agregar directamente en el anolito una cantidad, medida con
exactitud, de la muestra o de la preparacin de la muestra que se estima contiene entre 0,5 y 5 mg de agua, o la cantidad
recomendada por el fabricante del instrumento, mezclar, y llevar a cabo la valoracin culombimtrica hasta el punto final electromtrico. Leer el contenido de agua de la Preparacin de Prueba lquida directamente de la pantalla del instrumento y calcular el porcentaje presente en la sustancia. Realizar una determinacin con un blanco, segn sea necesario, y realizar las correcciones necesarias.
USP 38
Limpiar el tubo receptor y el condensador con un limpiador adecuado, enjuagar exhaustivamente con agua y secar en un
horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar agitando con una pequea cantidad de agua, separando el exceso de agua y
destilando el tolueno.
ProcedimientoColocar en un matraz seco una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud al centgramo ms prximo, para obtener de 24 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar sobre una lmina metlica ovalada con un tamao que pase justo a travs del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al ingresar la sustancia se produzcan proyecciones, agregar una cantidad suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o una serie de tubos capilares de
punto de fusin, con una longitud aproximada de 100 mm, sellados por el extremo superior. Colocar aproximadamente 200
mL de tolueno en el matraz, conectar el aparato y llenar el tubo receptor, E, con tolueno vertido a travs de la parte superior
del condensador. Calentar el matraz suavemente durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir, destilar a una
velocidad de aproximadamente dos gotas por segundo hasta que la mayor parte del agua haya sido arrastrada y despus de
aumentar la velocidad de destilacin aproximadamente a cuatro gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya destilado
toda el agua, enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno mientras se cepilla el tubo en forma descendente con
un cepillo para tubos fijado a un alambre de cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilacin durante cinco minutos;
luego retirar la fuente del calor y dejar que el tubo receptor se enfre a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua adheridas a las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con un cepillo formado por una cinta de goma envuelta alrededor
de un alambre de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el tolueno se hayan separado totalmente, leer el
volumen de agua y calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia.
Captulos
MTODO III (GRAVIMTRICO)

Procedimiento para Sustancias QumicasProceder segn se indica en la monografa individual preparando la sustancia
qumica segn se indica en Prdida por Secado 731.
Procedimiento para Sustancias BiolgicasProceder segn se indica en la monografa individual.
Procedimiento para Artculos de Origen BotnicoColocar en una cpsula de evaporacin tarada aproximadamente
10 g del frmaco, pesados con exactitud, y preparados segn se indica (ver Mtodos de Anlisis en Artculos de Origen Botnico
561). Secar a 105 durante 5 horas y pesar. Continuar el secado y la pesada a intervalos de 1 hora hasta que la diferencia
entre dos pesadas sucesivas no sea mayor de 0,25%.
941 CARACTERIZACIN DE SLIDOS CRISTALINOS Y

PARCIALMENTE CRISTALINOS POR DIFRACCIN DE RAYOS X SOBRE
POLVO (DRXP)
INTRODUCCIN
Toda fase cristalina de una sustancia determinada produce un patrn caracterstico de difraccin de rayos X. Los patrones de
difraccin (o difractogramas) se pueden obtener a partir de un polvo cristalino orientado aleatoriamente, compuesto de cristalitos o fragmentos de cristal de tamao finito. En esencia, de un patrn de difraccin de un polvo se pueden obtener tres tipos
de informacin: la posicin angular de las lneas de difraccin (dependiendo de la geometra y el tamao de la celda unidad),
las intensidades de las lneas de difraccin (dependiendo principalmente del tipo y arreglo de los tomos y de la orientacin de
las partculas dentro de la muestra) y los perfiles de las lneas de difraccin (dependiendo de la resolucin instrumental, el tamao de los cristalitos, la tensin y el espesor de la muestra).
Los experimentos que arrojan posiciones angulares e intensidades de las lneas se pueden utilizar para aplicaciones como el
anlisis cualitativo de las fases (p.ej., la identificacin de las fases cristalinas) y el anlisis cuantitativo de las fases de materiales
cristalinos. Tambin se puede hacer un clculo de las fracciones amorfas y cristalinas.1
El mtodo de difraccin de rayos X sobre polvo (DRXP) ofrece una ventaja sobre otros mtodos de anlisis pues por lo general es de naturaleza no destructiva (para garantizar una muestra orientada aleatoriamente, la preparacin de la muestra se limita habitualmente a una molienda). Las investigaciones por DRXP se pueden efectuar tambin bajo condiciones in situ en muestras expuestas a condiciones no ambientales, tales como temperatura y humedad bajas o altas.
1 Existen muchas otras aplicaciones de la tcnica de difraccin de rayos X sobre polvo que se pueden aplicar a las sustancias farmacuticas cristalinas, como son la
determinacin de las estructuras cristalinas, el refinamiento de las estructuras cristalinas, la determinacin de la pureza cristalogrfica de las fases cristalinas y la
caracterizacin de la textura cristalogrfica. Estas aplicaciones no se describen en este captulo.
USP 38
Pruebas Fsicas / 941 Difraccin de Rayos X sobre Polvo 745
PRINCIPIOS
La difraccin de rayos X resulta de la interaccin entre los rayos X y las nubes de electrones de los tomos. Dependiendo del
ordenamiento atmico, pueden surgir interferencias de los rayos X dispersados. Estas interferencias son constructivas cuando la
diferencia de recorrido entre dos ondas difractadas de rayos X es un mltiplo entero de la longitud de onda. Esta condicin
selectiva est descrita por la ecuacin de Bragg, llamada tambin ley de Bragg (ver la Figura 1).
2dhkl senqhkl = nl
Captulos
Figura 1. Difraccin de rayos X por un cristal, de acuerdo con la ley de Bragg.

La longitud de onda, l, de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia entre planos sucesivos de la red
cristalina, o dhkl (tambin llamada espaciamiento d). qhkl es el ngulo entre el rayo incidente y la familia de planos reticulares y
sen qhkl es inversamente proporcional a la distancia entre planos cristalinos sucesivos o espaciamiento d.
La direccin y espaciado de los planos con referencia a los ejes de la celda unidad estn definidos por los ndices de Miller
{hkl}. Estos ndices son los recprocos, reducidos al nmero entero inmediatamente inferior, de las intersecciones que realiza un
plano con los ejes de la celda unidad. Las dimensiones de la celda unidad estn dadas por los espaciamientos a, b y c, y los
ngulos entre ellos a, b y g.
El espaciado interplanar para un conjunto especfico de planos paralelos hkl se indica por dhkl. Cada una de estas familias de
planos puede presentar rdenes de difraccin mayores cuando los valores d para las familias de planos relacionados nh, nk, nl
son reducidos por el factor 1/n (siendo n un nmero entero: 2, 3, 4, etc.).
Cada conjunto de planos en un cristal tiene un ngulo de difraccin de Bragg correspondiente, qhkl, asociado con l (para
una l especfica).
Se supone que una muestra de polvo es policristalina, de manera que en cualquier ngulo qhkl hay siempre cristalitos en una
orientacin que permite la difraccin de acuerdo con la ley de Bragg.2 Para una longitud de rayos X determinada, las posiciones de los picos de difraccin (tambin conocidos como lneas, reflexiones o reflexiones de Bragg) son caractersticas de
la red cristalina (espaciamientos d), sus intensidades tericas dependen del contenido de la celda unidad cristalogrfica (naturaleza y posiciones de los tomos) y los perfiles de las lneas dependen de la perfeccin y extensin de la red cristalina. Bajo
estas condiciones, el pico de difraccin tiene una intensidad finita que depende del arreglo atmico, tipo de tomos, desplazamiento trmico e imperfecciones estructurales, as como de las caractersticas del instrumento.
La intensidad depende de muchos factores como la estructura, la temperatura, la cristalinidad, la polarizacin, la multiplicidad y el factor de Lorentz.
Las principales caractersticas de los perfiles de las lneas de difraccin son: posicin 2q, altura del pico, rea del pico y forma
del pico (caracterizada, por ejemplo, por el ancho o asimetra del pico, o por una funcin analtica o representacin emprica).
Un ejemplo del tipo de patrones de polvo obtenidos para cinco fases slidas diferentes de una sustancia se presenta en la
Figura 2.
2 Un polvo ideal para experimentos de difraccin consta de un gran nmero de cristalitos pequeos, esfricos, orientados aleatoriamente (dominios cristalinos que
difractan coherentemente). Si este nmero es suficientemente grande, siempre habr suficientes cristalitos en cualquier orientacin difractante para producir patrones de difraccin reproducibles.
USP 38
Captulos
746 941 Difraccin de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Fsicas
Figura 2. Patrones de difraccin de rayos X sobre polvo obtenidos para cinco fases slidas diferentes de una sustancia (las
intensidades estn normalizadas).
Adems de los picos de difraccin, un experimento de difraccin de rayos X genera tambin un ruido de fondo ms o menos uniforme sobre el cual se superponen los picos. Aparte de la preparacin de la muestra, otros factores contribuyen al ruido
de fondo, por ejemplo, el portamuestras, la dispersin difusa del aire y el equipo, y otros parmetros instrumentales como el
ruido del detector y la radiacin general del tubo de rayos X. La relacin pico-ruido puede aumentarse minimizando el ruido
de fondo y escogiendo tiempos de exposicin prolongados.
INSTRUMENTO
Configuracin del Instrumento
Los experimentos de difraccin de rayos X generalmente se efectan usando difractmetros de polvo o cmaras de polvo.
Un difractmetro de polvo por lo general consta de cinco partes principales: una fuente de rayos X; el sistema ptico del haz
incidente, el cual puede efectuar la monocromatizacin, filtrado, colimacin y/o enfoque del haz; un gonimetro; el sistema
ptico del haz de difraccin, que puede incluir monocromatizacin, filtrado, colimacin y enfoque o paralelizacin del haz; y
un detector. Tambin se requieren sistemas de recoleccin y procesamiento de datos, que por lo general estn incluidos en los
equipos modernos de medicin de difraccin.
Dependiendo del tipo de anlisis que se va a efectuar (identificacin de fases, anlisis cuantitativo, determinacin de los parmetros de la red, etc.) se requieren diferentes configuraciones y niveles de desempeo del instrumento de DRXP. Los instrumentos ms simples para medir los patrones de difraccin de polvo son las cmaras de polvo. El reemplazo de la pelcula fotogrfica, como mtodo de deteccin, por los detectores fotnicos ha llevado al diseo de difractmetros en los cuales el arreglo
geomtrico del sistema ptico no hace un enfoque real sino un paraenfoque, tal como en la geometra de Bragg-Brentano. La
configuracin de paraenfoque de Bragg Brentano es la ms usada actualmente y por lo tanto se describe aqu brevemente.
Un instrumento dado puede proporcionar una geometra q/2q horizontal o vertical o una geometra q/q vertical. Para ambas
geometras, el haz incidente de rayos X forma un ngulo q con el plano de superficie de la muestra y el haz de rayos X difractado forma un ngulo 2q con la direccin del haz de rayos X incidente (un ngulo q con el plano de superficie de la muestra). En
la Figura 3 se representa el arreglo geomtrico bsico. El haz de radiacin divergente del tubo de rayos X (llamado haz prima-
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rio) pasa a travs de un conjunto de colimadores de placas paralelas y de una ranura de divergencia e ilumina la superficie
plana de la muestra. Todos los rayos difractados por cristalitos adecuadamente orientados en la muestra en un ngulo 2q convergen en una lnea en la ranura receptora. Un segundo set de colimadores de placas paralelas y una ranura de dispersin se
puede colocar bien sea detrs o delante de la ranura receptora. Los ejes del foco de la lnea y de la ranura receptora estn a
igual distancia del eje del gonimetro. Los cuantos de rayos X se cuentan con un detector de radiacin, por lo general un
contador de centelleo, un contador proporcional de gas sellado o un detector de estado slido sensible a la posicin, tal como
una placa de imgenes o un detector de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en ingls). El montaje de la ranura receptora y el detector se ensamblan juntos y se mueven tangencialmente al crculo de enfoque. Para barridos q/2q el gonimetro
hace rotar la muestra sobre el mismo eje que el detector, pero a la mitad de la velocidad de rotacin, en un movimiento q/
2q.La superficie de la muestra permanece de esa manera tangencial al crculo de enfoque. El colimador de placas paralelas
limita la divergencia axial del haz y por lo tanto controla parcialmente la forma del perfil de la lnea difractada.
Captulos
Figura 3. Arreglo geomtrico de la geometra de paraenfoque de BraggBrentano.

Tambin se puede usar un difractmetro en modo de transmisin. La ventaja de esta tecnologa es que disminuye los efectos debidos a la orientacin preferencial. Tambin se puede usar un capilar de aproximadamente 0,5 a 2 mm de espesor para
cantidades pequeas de muestra.
Radiacin de Rayos X
En el laboratorio, los rayos X se obtienen bombardeando un nodo metlico con electrones emitidos por efecto termoinico
y acelerados en un campo elctrico fuerte (usando un generador de alto voltaje). La mayor parte de la energa cintica de los
electrones se convierte en calor, lo cual limita la potencia de los tubos y requiere un enfriamiento eficaz del nodo. Con el uso
de nodos rotatorios y sistemas pticos de rayos X se puede obtener un aumento de 20 a 30 veces en brillantez. Como alternativa, se pueden producir fotones de rayos X en instalaciones a gran escala (sincrotrn).
El espectro emitido por un tubo de rayos X que funciona a un voltaje suficiente consta de un fondo continuo de radiacin
policromtica y una radiacin caracterstica adicional que depende del tipo de nodo. Solo esta radiacin caracterstica se usa
en experimentos de difraccin de rayos X. Las fuentes principales de radiacin usadas para difraccin de rayos X son tubos de
vaco que usan cobre, molibdeno, hierro, cobalto o cromo como nodos; los rayos X del cobre, molibdeno o cobalto se emplean ms comnmente para sustancias orgnicas (el uso de un nodo de cobalto puede preferirse especialmente para separar
distintas lneas de rayos X). La eleccin de la radiacin que se va a usar depende de las caractersticas de absorcin de la muestra y la posible fluorescencia de los tomos presentes en la muestra. Las longitudes de onda usadas en la difraccin de polvos
generalmente corresponden a la radiacin Ka del nodo. Por consiguiente, resulta ventajoso hacer que el haz de rayos X sea
monocromtico, eliminando todos los dems componentes del espectro de emisin. Esto puede conseguirse parcialmente
con filtros Kb , es decir, con filtros metlicos seleccionados por tener una discontinuidad de absorcin entre las longitudes de
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onda Ka y Kb emitidas por el tubo. Dicho filtro usualmente se inserta entre el tubo de rayos X y la muestra. Otra forma ms
comnmente usada para obtener un haz de rayos X monocromtico consiste en usar un cristal monocromador grande (denominado por lo general monocromador). Este cristal se coloca delante o detrs de la muestra y difracta los diferentes picos
caractersticos del haz de rayos X (es decir, Ka y Kb ) a diferentes ngulos, de forma que slo uno de ellos puede seleccionarse
para ingresar al detector. Incluso es posible separar las radiaciones Ka1 y Ka2 usando un monocromador especializado. Desafortunadamente, la ganancia producida por la obtencin de un haz monocromtico al usar un filtro o un monocromador se contrarresta por una prdida en intensidad. Otra forma de separar longitudes de onda Ka y Kb consiste en usar espejos curvos
para rayos X que puedan simultneamente monocromar y enfocar o paralelizar el haz de rayos X.
PROTECCIN CONTRA LA RADIACIN
La exposicin de cualquier parte del cuerpo humano a los rayos X puede ser nociva para la salud. Por lo tanto, siempre que
se use equipo de rayos X es fundamental tomar las precauciones adecuadas para proteger al operador y a cualquier persona
que se encuentre cerca. La prctica recomendada para protegerse de la radiacin, as como los lmites de los niveles de exposicin a los rayos X son los establecidos por la legislacin nacional de cada pas. Si no existieran reglamentaciones o recomendaciones oficiales en un pas, se deben aplicar las recomendaciones ms recientes de la Comisin Internacional de Proteccin
Radiolgica.
Captulos
PREPARACIN Y MONTAJE DE LA MUESTRA

La preparacin del material en polvo y el montaje de la muestra en un soporte adecuado son pasos crticos en muchos mtodos analticos, en particular para el anlisis por difraccin de rayos X sobre polvo, puesto que pueden afectar en gran medida
la calidad de los datos que se van a recolectar.3 Las principales fuentes de error debido a la preparacin y montaje de la muestra se discuten brevemente en la siguiente seccin para instrumentos que operan en la geometra de paraenfoque de Bragg-Brentano.
En general, la morfologa de muchas partculas cristalinas tiende a dar una muestra que presenta cierto grado de orientacin
preferencial en el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los cristales en forma de aguja o de placa cuando
la reduccin de tamao proporciona agujas o plaquetas ms finas. La orientacin preferencial en la muestra influye sobre la
intensidad de las diversas reflexiones, de forma que algunas son ms intensas y otras menos intensas, comparado con lo que se
esperara de una muestra completamente aleatoria. Se pueden emplear diversas tcnicas para mejorar la aleatoriedad en la
orientacin de los cristalitos (y por lo tanto para minimizar la orientacin preferencial), pero una reduccin mayor del tamao
de la partcula es a menudo el mejor y ms simple de los mtodos. La cantidad ptima de cristalitos depende de la geometra
del difractmetro, la resolucin requerida y la atenuacin del haz de rayos X por la muestra. En algunos casos, tamaos de
partculas tan grandes como 50 mm pueden proporcionar resultados satisfactorios en la identificacin de las fases. Sin embargo, una molienda excesiva (tamaos de cristalitos de menos de aproximadamente 0,5 mm) puede ocasionar un ensanchamiento de las lneas y cambios significativos en la muestra misma, tales como:
contaminacin de la muestra por partculas desprendidas de los instrumentos de molienda (mortero, mano de mortero,
bolas, etc.),
reduccin del grado de cristalinidad,
transicin del estado slido a otro polimorfo,
descomposicin qumica,
introduccin de tensin interna, y
reacciones en estado slido.
Por lo tanto, es aconsejable comparar el patrn de difraccin de la muestra sin moler con el patrn correspondiente a una
muestra de tamao de partcula ms pequeo (p.ej., una muestra molida). Si el patrn de difraccin de rayos X sobre polvo es
de la calidad adecuada teniendo en cuenta el uso previsto, entonces es posible que la molienda no sea necesaria.
Cabe anotar que si una muestra contiene ms de una fase y si se usa el tamizado para aislar partculas de un tamao especfico, se puede alterar la composicin inicial.
3 De manera similar, pueden ocurrir cambios en la muestra durante la recoleccin de datos, en el caso de muestras que no estn en equilibrio (temperatura,
humedad).
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Montaje de la Muestra
EFECTO DEL DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA
Una superficie de muestra compensada por D con referencia al eje de rotacin del difractmetro causa errores sistemticos
que son muy difciles de evitar totalmente; para el modo de reflexin, esto produce desplazamientos absolutos D cosq4 en las
posiciones 2q (por lo general del orden de 0,01 en 2q en los ngulos inferiores
para un desplazamiento D = 15 mm) y ensanchamiento asimtrico del perfil hacia valores 2q bajos. El uso de un estndar interno apropiado permite la deteccin y correccin de este efecto simultneamente con el efecto debido a la transparencia de la
muestra. Este efecto constituye la mayor fuente de errores en los datos recolectados con difractmetros bien alineados.
EFECTO DEL ESPESOR Y TRANSPARENCIA DE LA MUESTRA

El gonimetro y el sistema ptico correspondiente del haz de rayos X incidente y difractado tienen muchas partes mecnicas
que necesitan ajuste. El grado de alineacin o desalineacin influye directamente sobre la calidad de los resultados de una investigacin por DRXP. Por lo tanto, los diferentes componentes del difractmetro se deben ajustar cuidadosamente (sistemas
pticos y mecnicos, etc.) para minimizar adecuadamente los errores sistemticos a la vez que se optimizan las intensidades
recibidas por el detector. La bsqueda de intensidad y resolucin mximas es siempre antagnica cuando se alinea un difractmetro. Por ello, se debe buscar el mejor equilibrio entre ambas cuando se efecta el procedimiento de alineacin. Existen muchas configuraciones diferentes y los equipos de cada proveedor requieren procedimientos de alineacin especficos. El desempeo general del difractmetro se debe examinar y monitorear peridicamente usando materiales de referencia certificados
adecuados. Dependiendo del tipo de anlisis, tambin se pueden emplear otros materiales de referencia bien definidos, aunque se prefiere el uso de materiales de referencia certificados.
ANLISIS CUALITATIVO DE LAS FASES (IDENTIFICACIN DE FASES)

La identificacin de la composicin de las fases de una muestra desconocida por DRXP por lo general se basa en la comparacin visual o asistida por computadora, de una porcin de su patrn de difraccin de rayos X con el patrn experimental o
calculado de un material de referencia. Idealmente, estos patrones de referencia se obtienen de muestras monofsicas bien
caracterizadas. Este mtodo permite, en la mayora de los casos, identificar una sustancia cristalina por sus ngulos de difraccin 2q o espaciamientos d y por sus intensidades relativas. La comparacin asistida por computadora del patrn de difraccin
de la muestra desconocida con los datos de referencia se puede basar bien sea en un intervalo 2q ms o menos extendido del
patrn de difraccin total o en un conjunto de datos reducidos derivados del patrn. Por ejemplo, la lista de espaciamientos d
y de las intensidades normalizadas, Inorm, llamada lista (d, Inorm) extrada del patrn, es la huella cristalogrfica del material y
puede compararse con listas (d, Inorm) de muestras monofsicas compiladas en bases de datos.
Para la mayora de los cristales orgnicos, al usar radiacin Cu Ka, resulta apropiado registrar el patrn de difraccin en un
intervalo 2q desde lo ms cerca posible a 0 hasta por lo menos 40. La concordancia en los ngulos de difraccin 2q entre la
muestra y la referencia est dentro de 0,2 para la misma forma cristalina, mientras que las intensidades relativas entre la muestra y la referencia pueden variar considerablemente debido a los efectos de la orientacin preferencial. Por su misma naturaleza, se sabe que los hidratos y solvatos variables tienen dimensiones de celda unidad variables y por esa razn ocurren desplazamientos en las posiciones de los picos de los patrones de DRXP medidos para estos materiales. En estos materiales exclusivos,
no es inesperada una discrepancia en las posiciones 2q mayores de 0,2. Por esa razn, las variaciones dentro de 0,2 en la
posicin del pico no son aplicables a estos materiales. Para otros tipos de muestras (p.ej., sales inorgnicas), puede ser necesa-
4 Cabe anotar que un desplazamiento en la alineacin en cero del gonimetro ocasionara un desplazamiento constante en todas las posiciones 2q observadas; es
decir, todo el patrn de difraccin se mueve en este caso por una desviacin de Z en 2q.
5 En el caso de una muestra delgada con baja atenuacin, se pueden hacer mediciones exactas de las posiciones de las lneas con configuraciones de enfoque del
difractmetro en geometra de transmisin o de reflexin. Las mediciones exactas de las posiciones de las lneas sobre muestras con baja atenuacin se hacen
preferiblemente con difractmetros que tengan sistemas pticos de haces paralelos. Esto ayuda a reducir los efectos del espesor de la muestra.
Captulos
Cuando el mtodo de DRXP se aplica en modo de reflexin, a menudo es preferible trabajar con muestras de espesor infinito. Para minimizar el efecto de transparencia, es aconsejable usar un sustrato no difractante (soporte con ruido de fondo nulo); por ejemplo, una placa de silicio monocristalino cortada en paralelo a los planos reticulares 510.5 Una ventaja del modo de
transmisin es que los problemas relacionados con la altura y transparencia de la muestra son menos importantes.
El uso de un estndar interno apropiado permite la deteccin y correccin de este efecto simultneamente con el efecto
debido al desplazamiento de la muestra.
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rio ampliar el barrido de la regin 2q hasta bastante ms all de los 40. Por lo general es suficiente hacer un barrido de las 10
reflexiones ms fuertes identificadas en las bases de datos de difraccin de rayos X sobre polvo monofsico.
En ocasiones es difcil o incluso imposible identificar fases en los siguientes casos:
sustancias no cristalizadas o amorfas,
los componentes a identificar estn presentes en bajas fracciones de masa respecto a las cantidades del analito (generalmente menos de 10% m/m),
efectos de orientacin preferencial pronunciados,
la fase no est archivada en la base de datos usada,
la formacin de soluciones slidas,
la presencia de estructuras desordenadas que alteran la celda unidad,
la muestra comprende demasiadas fases,
la presencia de deformaciones de la red cristalina,
la similitud estructural de diferentes fases.
Captulos
ANLISIS CUANTITATIVO DE LAS FASES

Si la muestra bajo investigacin es una mezcla de dos o ms fases conocidas, de las cuales no ms de una es amorfa, en
muchos casos se puede determinar el porcentaje (en volumen o masa) de cada fase cristalina y de la fase amorfa. El anlisis
cuantitativo de las fases se puede basar en las intensidades integradas, en las alturas de los picos de varias lneas de difraccin
individuales6 o en el patrn de difraccin completo. Estas intensidades integradas, alturas de los picos o datos del patrn completo se comparan con los valores correspondientes de los materiales de referencia. Estos materiales de referencia deben ser
monofsicos o una mezcla de fases conocidas. Las dificultades encontradas durante el anlisis cuantitativo se deben a la preparacin de la muestra (la exactitud y precisin de los resultados requieren, en particular, homogeneidad de todas las fases y una
distribucin apropiada del tamao de partculas en cada fase) y a los efectos de la matriz.
En casos favorables, en matrices slidas se pueden determinar cantidades de fases cristalinas tan pequeas como 10%.
Muestras Polimrficas
Para una muestra compuesta de dos fases polimrficas a y b, se puede usar la siguiente expresin para cuantificar la fraccin
Fa de la fase a:
Fa = 1/[1 + K(Ib/Ia)]
La fraccin se obtiene midiendo la relacin de intensidad entre las dos fases, si se conoce el valor de la constante K. K es la
relacin de las intensidades absolutas de las dos fases polimrficas puras Ioa/Iob. Su valor puede determinarse midiendo muestras del estndar.
Mtodos que Usan un Estndar

Los mtodos ms comnmente usados para el anlisis cuantitativo son:
el mtodo del estndar externo,
el mtodo del estndar interno, y
el mtodo de adicin (tambin llamado a menudo mtodo de adicin de estndar o mtodo de estndar agregado).
El mtodo del estndar externo es el ms general y consiste en comparar el patrn de difraccin de rayos X de la mezcla, o
las intensidades de las lneas respectivas con las medidas de una mezcla de referencia o con las intensidades tericas de un
modelo estructural, si se conoce totalmente.
Para limitar errores debidos a los efectos de la matriz, se puede usar un material de referencia interno que tenga un tamao
de cristalitos y un coeficiente de absorcin de los rayos X comparables con los de los componentes de la muestra y un patrn
de difraccin que no se solape en absoluto con el de la muestra que se va a analizar. Una cantidad conocida de este material
de referencia se agrega a la muestra a analizar y a cada una de las mezclas de referencia. Bajo estas condiciones existe una
relacin lineal entre la intensidad de las lneas y la concentracin. Esta aplicacin, llamada el mtodo del estndar interno, requiere mediciones precisas de las intensidades de difraccin.
En el mtodo de adicin (o mtodo de adicin de estndar), parte de la fase pura a se agrega a la mezcla que contiene la
concentracin desconocida de a. Se hacen mltiples adiciones para preparar una grfica de intensidad en funcin de la concentracin en donde la interseccin negativa del eje x es la concentracin de la fase a en la muestra original.
6 Si se conocen las estructuras cristalinas de todos los componentes, se puede usar el mtodo de Rietveld para cuantificarlas con una buena exactitud. Si no se
conocen las estructuras cristalinas de los componentes se puede usar el mtodo de Pawley o el mtodo de cuadrados mnimos parciales (PLS, por sus siglas en
ingls).
USP 38
CLCULO DE LAS FRACCIONES AMORFAS Y CRISTALINAS

En una mezcla de fases amorfas y cristalinas se pueden calcular las fracciones amorfas y cristalinas de varias maneras. La eleccin del mtodo usado depende de la naturaleza de la muestra:
Si la muestra consta de fracciones cristalinas y una fraccin amorfa de composiciones qumicas diferentes, las cantidades
de cada una de las fases cristalinas individuales puede calcularse usando sustancias estndar apropiadas, segn se describi anteriormente. La fraccin amorfa se deduce luego indirectamente por sustraccin.
Si la muestra consta de una fraccin amorfa y una cristalina, bien sea como una mezcla de 1 fase o 2 fases, con la misma
composicin elemental, la cantidad de la fase cristalina (el grado de cristalinidad) se puede calcular midiendo tres reas
del difractograma:
A = rea total de los picos que surgen de la difraccin de la fraccin cristalina de la muestra,
B = rea total por debajo del rea A,
C = rea de ruido de fondo (debido a dispersin del aire, fluorescencia, equipo, etc.).
Una vez medidas estas reas, el grado de cristalinidad se puede calcular en forma aproximada como:
% de cristalinidad = 100A/(A + B C)
Debe mencionarse que este mtodo no arroja un grado absoluto de valores de cristalinidad y por lo tanto se usa generalmente
para propsitos comparativos nicamente. Tambin se cuenta con mtodos ms sofisticados, como el de Ruland.
ESTRUCTURA DEL MONOCRISTAL

Captulos
En general, la determinacin de las estructuras cristalinas se efecta a partir de los datos de difraccin de los rayos X obtenidos usando monocristales. Sin embargo, el anlisis de la estructura cristalina de los cristales orgnicos es una tarea exigente,
puesto que los parmetros de la red son comparativamente grandes, la simetra es baja y las propiedades de dispersin son
normalmente muy bajas. Para cualquier forma cristalina dada de una sustancia, el conocimiento de la estructura cristalina permite el clculo del patrn correspondiente de DRXP, proporcionando en consecuencia un patrn de referencia de DRXP exento de orientacin preferencial, el cual se puede usar para la identificacin de las fases.
752 1005 Emisin Acstica / Informacin General
USP 38
Captulos Generales
Informacin General
Captulos
Informacin General
Los captulos de esta seccin son de carcter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especificaciones de cumplimiento obligatorio para ningn artculo farmacopeico, a excepcin de las citas de Leyes y reglamentos federales que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta seccin debido a que no son de la
autora de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten al contenido de estas citas se publicarn en los Suplementos de los compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artculos farmacopeicos
se establecen en las Advertencias Generales, las monografas individuales y en los captulos referentes a Pruebas y Valoraciones
Generales de esta Farmacopea.
1005 EMISIN ACSTICA

INTRODUCCIN
Las tcnicas ultrasnicas se pueden categorizar en dos tipos especficos: emisin acstica (modo pasivo) y espectroscopa
ultrasnica (modo activo). Ambas tcnicas tienen muchas aplicaciones.
La tcnica de emisin acstica se basa en la deteccin y anlisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia
esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo estn muy por encima de las frecuencias
que el odo humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente.
En el caso de la espectroscopa ultrasnica, el instrumento est diseado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo
de frecuencia definido. Estas ondas viajan a travs de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer
una analoga con la espectroscopa UV visible o la espectroscopa IR, por cuanto el espectro ultrasnico detectado refleja cambios en la velocidad o atenuacin del sonido debido a la interaccin con una muestra a travs de un intervalo de frecuencias.
Sin embargo, puesto que el alcance de este captulo se limita a la emisin acstica, no discutiremos en detalle la espectroscopa ultrasnica.
La emisin acstica es bien conocida en el estudio de la mecnica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los
cientficos de materiales. Tambin se usa mucho como una tcnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria
para la inspeccin de alas de aviones, recipientes de presin, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisin acstica tambin se usa en ingeniera para monitorear el desgaste de mquinas.
En trminos de aplicaciones farmacuticas, la dependencia de la medicin de la emisin acstica de propiedades fsicas como el tamao de las partculas, la resistencia mecnica y la cohesin de los materiales slidos permite el uso de esta tcnica
para el control y deteccin del punto final de procesos como la granulacin de alta velocidad, secado en lecho fluido, molienda y micronizacin.
Principios Generales
Las emisiones acsticas se pueden propagar por diferentes modos. En slidos, los modos compresionales y de corte o transversales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad ms alta y por lo tanto alcanzan el detector acstico
(o transductor de emisin acstica) primero. Sin embargo, en la mayora de las aplicaciones de emisin acstica en procesos,
existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energa; por consiguiente, los diferentes modos no se
pueden resolver fcilmente. Por ejemplo, la seal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas
de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagacin.
USP 38
Informacin General / 1005 Emisin Acstica 753
INSTRUMENTACIN
Por lo general, los sensores piezoelctricos se usan para detectar y cuantificar las seales acsticas producidas por un proceso. Los transductores piezoelctricos se fabrican a partir de slidos cristalinos piezoelctricos conectados a circuitos de control
de transductores por contactos elctricos. Cuando est configurado como un detector, una onda acstica que incide sobre el
elemento piezoelctrico se transforma en una seal elctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura
como generador acstico, una seal elctrica aplicada al elemento piezoelctrico por el circuito de control genera una onda
acstica que puede propagarse por el medio al cual est conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detectores de emisin acstica pueden funcionar tambin como generadores de ondas acsticas y esta caracterstica se usa para
garantizar el buen desempeo del sensor segn se describe ms adelante (ver Calificacin y Verificacin de Instrumentos de Emisin Acstica).
En las aplicaciones generales de emisin acstica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.ej.,
70 y 190 kHz, aunque frecuencias ms altas podran ser ms apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que comprenden varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sensores,
se genera una seal elctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energa (amplitud) de las ondas de sonido incidentes.
Estas seales se procesan por medio de:
(1) un preamplificador (que incluye filtrado de seales),
(2) un convertidor RMS a CC,
(3) un amplificador de ganancia variable y
(4) una terminal de recoleccin de datos conectada a una computadora, la cual cuenta tambin con un software de control.
El equipo de emisin acstica por lo general permite usar varios sensores simultneamente, con la incorporacin de mltiples canales electrnicos en un solo instrumento.
Procesamiento de la Seal
La seal de un transductor resonante se asemeja a una seal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de resonancia del transductor, la seal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodular la seal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la seal o envolvente de modulacin.
El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa
habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.
FACTORES QUE AFECTAN LA MEDICIN

Los siguientes factores pueden afectar los datos acsticos obtenidos y deben tenerse en consideracin al instalar un sistema
de emisin acstica.
Captulos
En las interfases, dependiendo de la impedancia acstica relativa de los dos materiales, mucha de la energa se refleja de
vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acsticas slo sern detectadas a partir de partculas que
impacten directamente las paredes del lecho prximas al transductor.
Un mtodo conveniente de estudiar la emisin acstica de los procesos es usar el nivel medio de seal. Se puede usar un
convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en ingls) para convertir la
seal portadora de amplitud modulada (AM) en una seal de corriente continua (CC) que vara ms lentamente. Esto se conoce como nivel medio de seal (ASL, por sus siglas en ingls). El ASL puede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a
una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrnicamente para el procesamiento adicional de
la seal.
La forma ms sencilla de estudiar los datos acsticos consiste en examinar cambios en el ASL. Sin embargo, se puede recabar
otra informacin al examinar el espectro de potencia del ASL. El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado complejo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rpida de Fourier (TRF) sobre el registro de
datos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un clculo confiable de la densidad espectral de potencia o para obtener una huella digital (fingerprint) de un rgimen de proceso particular. La interpretacin del espectro de potencia se complica por el hecho de que la seal acstica originada en el sistema se distorsiona por varios factores, incluyendo la transmisin, reflexin y caractersticas de la seal de transferencia.
La forma del espectro de potencia en el registro del ASL es una funcin de la dinmica del proceso. Los procesos peridicos
(p.ej., mezclado mecnico o burbujeo peridico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discretas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente proporcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud
del espectro de potencia tambin se ve afectada por la energa de las emisiones acsticas producidas por el proceso. Por ejemplo, si se est procesando un material duro, la emisin acstica producida por el impacto de las partculas ser mayor que la
producida por un material blando.
Captulos
USP 38
1. Falla o Dao FsicoAl igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisin acstica pueden fallar con el tiempo o como resultado de dao fsico. Es importante verificar la funcin del sensor como parte del mantenimiento de rutina
del instrumento. Si se instalan mltiples sensores en el mismo recipiente, se puede generar una seal activa desde un sensor y sta se puede usar para verificar la deteccin en otro sensor. Este ejercicio debera garantizar que los sensores estn
detectando las seales acsticas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe determinar y monitorear tambin la seal acstica aceptable mnima para los sensores, que sea estadsticamente vlida, con
el fin de garantizar el desempeo de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de
experimentos rutinarios de la seal de mantenimiento o basndose en los datos histricos de los sensores.
2. Problemas de Interfase del SensorLos sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el
proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes).
Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unin del sensor al recipiente. La verificacin de la integridad de la instalacin debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado
anteriormente, se puede usar una seal activa para garantizar la unin apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual
ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acstica.
3. Influencia del Ruido MecnicoEl uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribucin del ruido mecnico a la
seal acstica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se
analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la seal acstica detectada es una funcin del ruido mecnico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias ms altas. Es importante reconocer y considerar la contribucin del ruido mecnico, no importa qu tan reducido sea, a medida que los motores envejecen o se reemplazan.
4. Influencia de las Caractersticas de la Pared del RecipienteDado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior
del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la seal detectada. Si el recipiente est encamisado,
la amplitud de la seal acstica se puede reducir. Si se agregan ms sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de
la seal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la seal si se colocan sensores en un lugar donde exista contacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que bsicamente proporciona una gua de onda entre el sensor y la fuente de sonido. Las guas de onda se pueden incluir tambin en el diseo del equipo de fabricacin para permitir el monitoreo de la emisin acstica. Es necesario efectuar la validacin apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente
el desempeo del equipo.
5. Efecto de las Propiedades de los MaterialesDurante el funcionamiento, la seal acstica recolectada es una suma de diversos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la seal acstica generada cuando las partculas golpean la pared en
un granulador es una funcin de las propiedades materiales de los grnulos (es decir, densidad, tamao, porosidad). Por
lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parmetros pueden afectar la seal acstica y la calidad de la
prediccin resultante.
6. Influencia de Factores Relacionados con el ProcesoEn forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades
relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar
tambin la seal acstica y la calidad de la prediccin resultante.
7. Impacto de las Condiciones AmbientalesPor ltimo, tambin se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambientales (es decir, temperatura, humedad).
Los datos de emisin acstica recolectados son especficos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un
modelo generado en otro, porque la informacin acstica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los
puntos 3, 4 y 5.
Calificacin y Verificacin de Instrumentos de Emisin Acstica

Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeo del instrumento, estableciendo la ptima configuracin de las mediciones y comparando despus el desempeo del instrumento con los valores obtenidos durante
el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls).
Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analticos en lnea, los transductores pueden ubicarse ptimamente y conectarse para recibir la seal mxima sin modificacin del
recipiente.
Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una seal se debe
muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia ms alto en la seal. Se debe usar un filtro de paso bajo
para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de
Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing).
Debido a la naturaleza de los transductores piezoelctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades naturales de los cristales, no es necesario analizar la variacin (reproducibilidad) o derivar en el dominio de frecuencia. Esto puede ser
necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrar como un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto est cubierto por los anlisis de
intensidad de potencia.
Las dos reas principales para la verificacin del desempeo del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporizacin. Cualquier cambio en la intensidad de la seal afectar la seal cruda y el ASL y, por lo tanto, afectar tambin el espectro
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Informacin General / 1005 Emisin Acstica 755
ANLISIS DE LOS DATOS

La emisin acstica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisin acstica continua. La emisin acstica continua es afsica (es decir, la seal no tiene comienzo ni interrupcin). Esto significa que no es necesario usar las tcnicas
de procesamiento de la seal que preservan la fase. El anlisis espectral de potencia es una tcnica til para procesar las seales
de emisin acstica. La informacin en los espectros de potencia, a diferencia de las seales crudas de emisin acstica, es
coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la seal. Esto proporciona un mejor clculo de la densidad espectral de
potencia que el proporcionado por un nico espectro de potencia.
Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p.ej., punto final de granulacin o secado) es apropiado un modelo multivariado cualitativo (p.ej., PCA o SIMCA). Efectuar la siguiente secuencia de operaciones:
(1) Entrenamiento o CalibracinObtener los espectros de emisin acstica que sean representativos del punto final.
(2) ModeladoCrear un modelo multivariado que describa la distribucin de las seales de emisin acstica en el punto final.
(3) PrediccinComparar los espectros de emisin acstica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por
lo general en trminos de un nmero de desviaciones estndar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el
ajuste mejora y se establece la finalizacin del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El
modelo de prediccin se genera a partir de los espectros de emisin acstica obtenidos del proceso funcionando en condiciones normales. Las perturbaciones (p.ej., la aglomeracin indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan observando las desviaciones estadsticamente vlidas con respecto al modelo.
El modelado adaptativo tambin se ha propuesto para la deteccin de perturbaciones. Esto implica generar continuamente modelos multivariados a medida que se adquieren las seales de emisin acstica. La desviacin inusual de la seal
de emisin acstica indica la ocurrencia de una perturbacin del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es
necesario efectuar un paso de calibracin por separado.
Captulos
de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p.ej., variacin en dureza o humedad en las partculas que
impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conduccin acstica del proceso al transductor se pueden presentar
cambios en la intensidad de la potencia.
La reproducibilidad de la conduccin acstica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o
ping en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la seal y puede usarse en clculos del lmite de deteccin (LOD, por sus siglas en ingls) y el lmite de cuantificacin (LOQ, por sus siglas en
ingls), donde LOD se define como tres veces el ruido de la seal y LOQ es diez veces el ruido de la seal. El ruido a nivel de la
seal de fondo (en la emisin acstica, esta seal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a
partir de veinte valores secuenciales de ASL adquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta
prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadsticamente similares en ambos canales.
La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la
conduccin acstica en el tiempo o, ms especficamente, de los cambios causados por el proceso (p.ej., variaciones en las
propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir
mientras se ejecutan los parmetros normales de procesamiento (usando un recipiente vaco) y se debe calcular la deriva en el
ASL. Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la seal (debido a la variacin normal en los
parmetros del proceso) no impacte los modelos quimiomtricos usados para la determinacin del punto final. Para los grficos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadsticamente significativa; caso contrario, se deber corregir la
deriva. Los valores de ruido, deriva y ASL absoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al
equipo de procesamiento o al sistema de emisin acstica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los meses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conduccin acstica est intacta y cualquier cambio a la intensidad
de la seal se puede aislar y atribuir al proceso mismo.
Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida
del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados
tanto durante el uso previo como durante la instalacin. El impacto de la desviacin con respecto a valores previos depender
del modelo de prediccin y se debe considerar mediante la validacin del mtodo.
Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar tambin para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activacin del
pulso y la recepcin de la seal estn sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a travs del
recipiente. Esta es una buena indicacin de la medicin electrnica, as como de la condicin general de la conduccin acstica. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medicin de la condicin del sistema y se debe ejecutar slo si
se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisin acstica, o cada 6 meses. La correlacin de los tiempos
medidos con los histricos debe ser estadsticamente vlida. De no ser as, esto es un indicador de que el sistema de emisin
acstica puede necesitar recalificacin por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la conduccin acstica.
Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acstico generado elctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas
antes mencionadas se puede atribuir a la generacin misma de la seal. Se recomienda que el sistema de generacin de pulsos
elctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estndares rastreables al Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa
(NIST, por sus siglas en ingls) cada 12 meses.
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Captulos
GLOSARIO
AmplitudLa magnitud o potencia de una forma de onda variable.
Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en ingls)Es un dispositivo electrnico que convierte una seal alterna a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la seal.
Densidad Espectral de PotenciaLa medida de la potencia de emisin acstica en cada elemento de resolucin del espectro de potencia.
Emisin Acstica ContinuaSeales de emisin acstica que no se pueden separar en el tiempo y son tpicas de procesos
farmacuticos tales como granulacin y secado en lecho fluido.
Espectro de PotenciaEl espectro de potencia de una seal es una representacin de la potencia de la seal en funcin de
la frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la seal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Transformada Rpida de Fourier (TRF). Resulta til estudiar las seales de emisin acstica en el dominio espectral o de frecuencia,
ya que a menudo el espectro es caracterstico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relacin seal-ruido al promediar un nmero de espectros de potencia, ya que estos son coherentes.
Filtrado de SealFiltrar una seal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisin
acstica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relacin seal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda
del sensor. El filtrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias ms altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el
solapamiento.
Frecuencia NyquistLa frecuencia Nyquist est definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia ms
alta que se puede reproducir confiablemente.
Frecuencia ResonanteLa frecuencia a la cual es ms sensible un sensor de emisin acstica. Los sensores de emisin acstica resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias.
GananciaEl factor de amplificacin para un componente, expresado generalmente en trminos de decibeles (dB).
Ganancia en dB = 20 log10 (Voltajede salida Voltajede entrada).
Impedancia AcsticaLa impedancia acstica (Z) se define como Z = rv (donde r es la densidad y v es la velocidad del
sonido). Es un dato importante que informa la proporcin de la energa del sonido transmitida de un medio a otro y la cantidad de energa reflejada en la interfase.
Modelado AdaptativoEs un mtodo que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente
(es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibracin previos).
Modo CompresionalUn modo longitudinal de transmisin acstica encontrado en slidos, lquidos y gases.
Modo de Corte (Cizalladura)Un modo transverso de transmisin acstica que se presenta solo en slidos.
Modo TransversalUn modo de propagacin de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la direccin de la propagacin. Estos modos slo se encuentran en materiales slidos.
Nivel Medio de Seal (ASL)Una medida de la potencia promedio en una seal de emisin acstica.
Paso de BandaEl intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente.
PiezoelctricoUn material que al comprimirse genera un campo elctrico. Los materiales piezoelctricos se usan en la
construccin de sensores de emisin acstica. Un material comn es el titanato de circonio y plomo (PZT).
Propiedades de Tipo Parpadeante (flicker noise)Un tipo de seal asociada con muchos procesos naturales. Las caractersticas del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la seal y tiene aproximadamente una
distribucin de densidad espectral de 1/f (f = frecuencia).
Ruido BlancoEl ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y est asociado
con procesos puramente aleatorios.
Solapamiento (aliasing)Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la seal y son en realidad frecuencias por encima de la frecuencia Nyquist.
Transductor de Emisin AcsticaUn dispositivo en estado slido que incorpora por lo general un elemento piezoelctrico
para convertir la onda de emisin acstica a una seal elctrica.
1010 DATOS ANALTICOSINTERPRETACIN Y TRATAMIENTO

INTRODUCCIN
Este captulo proporciona informacin acerca de las prcticas aceptables para el anlisis e interpretacin uniforme de los datos obtenidos de los anlisis qumicos y otros anlisis. Se describen adems algunos mtodos estadsticos bsicos para la evaluacin de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparacin de mtodos analticos.
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Informacin General / 1010 Datos Analticos 757
PREREQUISITOS PARA LAS PRCTICAS Y PRINCIPIOS DE LABORATORIO

La correcta aplicacin de los principios estadsticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de
forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son tiles las prcticas siguientes.
Mantenimiento Adecuado de Registros

Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse
ms decimales que los requeridos en la especificacin y las cifras slo deben redondearse una vez realizados los clculos finales,
conforme a lo establecido en las Advertencias y Requisitos Generales.
Consideraciones Relativas al Muestreo

Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluacin de un atributo de calidad de una poblacin. El objetivo del
muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la poblacin. La manera en que
se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo general, un proceso aleatorio se considera la manera ms adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una
muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones vlidas acerca de las propiedades de la poblacin. La generacin de una muestra no aleatoria o de conveniencia conlleva el riesgo de que las estimaciones estn sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio ms directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un proceso en el
que cada unidad de la poblacin tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este
mtodo de seleccin de muestra aleatoria no es ptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relacin con todos
los factores (es decir, tiempo, lugar, mquina) que podran influir en las propiedades crticas de la poblacin. Por ejemplo, si se
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el
proceso de produccin, no sera adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la produccin ya que no se puede
garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada perodo del proceso de 12 horas. En estos casos
es mejor tomar una muestra aleatoria sistemtica, seleccionando al azar una unidad del proceso de produccin a intervalos o
en lugares sistemticamente seleccionados (p.ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese
perodo) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricacin. Se requerir otro
Captulos
NOTANo debe inferirse que las herramientas de anlisis mencionadas en este captulo conforman una lista exhaustiva. Pueden utilizarse otros mtodos estadsticos igualmente vlidos a criterio del fabricante y dems usuarios de este
captulo.
La garanta de calidad de los productos farmacuticos se logra combinando una serie de prcticas, que incluyen un diseo
robusto de la formulacin, validacin, anlisis de materias primas, anlisis durante el proceso y pruebas del producto final. Cada una de estas prcticas depende de mtodos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y validan
procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estn perfectamente caracterizados. Las pruebas del
producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces y que cumplen con sus especificaciones.
Las mediciones son intrnsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biolgicas desde hace mucho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biolgicas, por ejemplo, se
trata en el captulo Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111. Las mediciones de anlisis qumicos comnmente utilizadas para productos farmacuticos tambin son intrnsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biolgicas.
No obstante, en muchos casos los criterios de aceptacin son proporcionalmente ms estrictos y, en consecuencia, debe tenerse en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analticos. Si no se
caracteriza ni especifica la variabilidad de una medicin junto con el resultado obtenido, los datos slo pueden interpretarse en
el sentido ms limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por dos
laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 10%, la interpretacin es limitada en cuanto a la importancia de
dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
Este captulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretacin cientficamente aceptables de los datos. Se describen adems las herramientas estadsticas que pueden resultar tiles para la interpretacin de los datos analticos. Muchas
estadsticas descriptivas, como la desviacin estndar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadsticas, como
las pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes mtodos cientficamente vlidos, de los cuales
tambin se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmacopeica se describe en detalle en Resultados de las Pruebas, Estadsticas y Normas en Advertencias y Requisitos Generales. En el
Apndice F al final de este captulo, se incluye una seleccin de referencias tiles para obtener informacin adicional sobre las
herramientas estadsticas aqu descritas. La USP no avala especficamente las referencias citadas, que no constituyen una lista
exhaustiva. Puede encontrarse informacin adicional sobre cualquiera de los mtodos citados en este captulo en la mayora de
los textos de estadstica.
758 1010 Datos Analticos / Informacin General
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tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro mquinas
de llenado diferentes. En este caso, sera importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las mquinas de
llenado. Una muestra aleatoria estratificada, mtodo que consiste en tomar una muestra al azar del mismo nmero de viales en
cada una de las cuatro mquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p.ej.,
prueba de liberacin de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cmo se debe obtener la
muestra para asegurar que sea representativa de toda la poblacin y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida.
La estrategia de muestreo ptima depende del conocimiento de los procesos de fabricacin y medicin analtica. Una vez definido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de seleccin aleatoria. Por ltimo, debe obtenerse una cantidad de muestra suficiente para el anlisis original, los anlisis de verificacin subsiguientes y otros anlisis. Se recomienda
consultar a un estadstico para identificar la estrategia de muestreo ptima.
Las pruebas que se describen en el resto de este captulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.
Uso de Estndares de Referencia

Cuando se especifica el uso de un Estndar de Referencia USP, debe utilizarse el Estndar de Referencia USP o un estndar
secundario rastreable al Estndar de Referencia USP. Debido a que la asignacin de un valor a un estndar es uno de los factores ms importantes de la exactitud de un anlisis, es fundamental hacerlo correctamente.
Captulos
Verificacin del Desempeo del Sistema

La verificacin de un nivel del desempeo aceptable de un sistema analtico que se utiliza en forma rutinaria o continua puede ser una prctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando
otros factores, como la variacin entre estndares, las relaciones seal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del
parmetro medido, por ejemplo graficando los resultados del anlisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios
en el desempeo que requieren el ajuste del sistema analtico. El Apndice A proporciona un ejemplo de una grfica de control.
Validacin de Mtodos
Todos los mtodos deben validarse segn se especifica en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225. Los mtodos
publicados en la USPNF se han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de Buenas Prcticas de Fabricacin vigentes establecidos en el Cdigo de Reglamentos Federales. Los mtodos validados pueden utilizarse para analizar una nueva
formulacin (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificacin o producto intermedio de un proceso) nicamente despus de verificar que la nueva formulacin no interfiere con la exactitud, linealidad ni precisin del mtodo. No puede suponerse que un mtodo validado puede medir correctamente el ingrediente activo de una formulacin que es diferente a la utilizada para establecer la validez original del mtodo. [NOTA sobre terminologaLa definicin de exactitud en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225 y en ICH Q2 corresponde nicamente a insesgadez. Para el Vocabulario Internacional de Metrologa (VIM) y la documentacin de la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO, por sus siglas en ingls), exactitud
tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los conceptos de ausencia de sesgo (denominada certeza) y precisin. Este captulo sigue a la definicin del captulo 1225, que corresponde nicamente a veracidad.]
PRINCIPIOS DE MEDICIN Y VARIACIN

Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real (verdadero o aceptado), ya que contienen una variabilidad aleatoria (tambin denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemtico (sesgo). En consecuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrnseca de la medicin. Si un conjunto de mediciones consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse mtodos estadsticos para estimar propiedades
informativas de la totalidad y otras pruebas estadsticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplen con
los requisitos establecidos. Los anlisis estadsticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de medicin, as como la variabilidad de la entidad que se est midiendo. Las mediciones estadsticas usadas para evaluar la direccin
y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviacin estndar y expresiones derivadas de stas, como el coeficiente de
variacin porcentual (%CV, tambin denominado desviacin estndar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada
puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o medidas de variabilidad, e intervalos de tolerancia que capturan una proporcin especificada de las mediciones individuales.
El uso de mediciones estadsticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo representativo. Los datos deberan ser congruentes con las suposiciones estadsticas usadas para el anlisis. Puede ser necesario el
uso de mtodos alternativos para la evaluacin de los datos si se considera que una o ms de estas suposiciones han sido violadas. En particular, la mayora de las mediciones estadsticas y pruebas citadas en este captulo suponen que la distribucin de
la poblacin total es una distribucin normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha poblacin.
La distribucin normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simtrica respecto de su centro y tiene ciertas caractersticas
requeridas para que estas pruebas sean vlidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribucin normal, pu-
USP 38
dindose requerir de una transformacin para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribuciones cuyo grfico muestra una cola ms larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pueden volverse aproximadamente normales mediante una transformacin logartmica. Un mtodo alternativo sera el uso de procedimientos estadsticos independientes de la distribucin o no paramtricos que no requieren que la poblacin tenga
una distribucin normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre
dos medias, por ejemplo, la suposicin de normalidad no es tan importante debido al teorema de lmite central. No obstante,
debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza vlidos para desviaciones estndar y relaciones
de desviaciones estndar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar lmites de tolerancia estadstica vlidos. En este ltimo caso, la normalidad es una suposicin fundamental. Los mtodos grficos simples, como grficos
de puntos, histogramas y grficos de probabilidad normales, son tiles para verificar esta suposicin.
Una medicin analtica simple puede ser til para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analticos son bien conocidos. El resultado analtico
obtenido puede condicionarse incluyendo una estimacin de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso
de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones
individuales. La opcin de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicacin de la medicin y su variabilidad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones mltiples con la misma alcuota de muestra, como en el caso de varias inyecciones de muestra en cromatografa lquida de alta resolucin, por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos,
por la razn que se mencion anteriormente.
La variabilidad se asocia con la dispersin de observaciones en torno al centro de una distribucin. El parmetro estadstico
ms comnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):
en donde xi es la medicin individual en un conjunto de n mediciones; y x es la media de todas las mediciones. A continuacin, se calcula la desviacin estndar relativa porcentual (%RSD) como:
y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformacin logartmica para lograr la normalidad (p.ej., para
valoraciones biolgicas), existen mtodos alternativos.2
Debe realizarse un estudio de precisin para obtener una mejor estimacin de la variabilidad del mtodo. El estudio de precisin puede disearse para determinar la precisin intermedia (que incluye los componentes de variabilidad entre anlisis e
intra-anlisis) y la repetibilidad (variabilidad intra-anlisis). Los estudios de precisin intermedia deben permitir cambios en
las condiciones experimentales que podran esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes preparaciones de
reactivos, diferentes das y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisin, la prueba debe repetirse varias veces.
Cada anlisis debe ser completamente independiente de los dems para obtener estimaciones exactas de los diferentes componentes de variabilidad. Adems, dentro de cada anlisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisin en el Apndice B.
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretacin de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios
datos usando la media (x) y la desviacin estndar de la muestra(s) segn la frmula:
1 Las mediciones mltiples (o, por equivalencia, los errores experimentales asociados con las mediciones mltiples) son independientes entre s cuando se puede
suponer que representan una muestra aleatoria de la poblacin. En estas muestras, la magnitud de una medicin no est influenciada por otra medicin ni influye
en la magnitud de ninguna otra medicin. La falta de independencia implica que las mediciones estn correlacionadas en funcin del tiempo o del espacio. Consideremos, por ejemplo, una placa de microtitulacin de 96 pocillos. Supongamos que, por causa desconocida, se produce un error experimental con valor bajo
(error negativo) en una muestra colocada en la primera columna, y que entonces esta misma causa produce un valor bajo para una muestra colocada en la segunda columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadsticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sera aleatorizar la
colocacin de las muestras en la placa.
2 Cuando los datos se han transformado logartmicamente (base e) para lograr la normalidad, la %RSD es:
Esto puede aproximarse razonablemente segn:
en donde s es la desviacin estndar de los datos transformados logartmicamente (base e).
Captulos
La variabilidad del mtodo puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluacin ms comn y til de la variabilidad
de un mtodo es la determinacin de la desviacin estndar basada en mediciones independientes repetidas1 de una muestra.
La desviacin estndar de la muestra, s, se calcula por la frmula:
USP 38
Captulos
en donde ta/2,n1 es un nmero estadstico que depende del tamao de la muestra (n), el nmero de grados de libertad (n 1)
y el nivel de confianza deseado (1 a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribucin t de Student.
El intervalo de confianza proporciona una estimacin del intervalo donde cae la media de la poblacin verdadera (m) y, adems, evala la confiabilidad de la media de la muestra como una estimacin de la media verdadera. Si se repitiera la misma
configuracin experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la
media verdadera, entonces se esperara que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, m. No se puede afirmar
con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos especficos obtenidos contiene m. No obstante,
suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre s generadas en forma aleatoria a partir de una poblacin normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de dichos intervalos de confianza contienen m. Debe tenerse en cuenta que es importante definir la poblacin apropiadamente para
capturar todas las fuentes de variacin pertinentes. [NOTA sobre terminologaLa documentacin de la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO) utiliza diferente terminologa para algunos de los conceptos aqu descritos. En la documentacin de la ISO, al trmino s/n, comnmente denominado como error estndar de la media, se le denomina incertidumbre
estndar. Asimismo, la ISO denomina al trmino ta/ 2, n1 S/n como incertidumbre expandida, mientras que a ta/2,n 1 lo llama
factor de cobertura. Cuando la desviacin estndar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas fuentes,
recibe el nombre de incertidumbre estndar combinada. Algunas de estas fuentes podran tener estimaciones no estadsticas
de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibracin de una balanza.]
RESULTADOS ABERRANTES
Ocasionalmente, los resultados analticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes,
anmalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, as como otros tipos de valores errticos, se denominan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar,
interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se est midiendo aunque diferentes de los
valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analtico, los resultados pueden no ser tpicos, aunque la
entidad que se mide sea tpica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemticas del
laboratorio y de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse al investigar un
resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentacin, error de clculo y deficiencias del producto
o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus componentes, pueden repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse la precisin y
exactitud del mtodo, el Estndar de Referencia, las tendencias del proceso y los lmites de la especificacin. Los datos pueden
considerarse no vlidos, segn esta investigacin documentada, y eliminarse de los clculos posteriores.
Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado
puede analizarse, como parte de toda la investigacin, para determinar si se trata de un resultado aberrante.
No obstante, se requiere una cuidadosa consideracin cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de
errores en las pruebas de resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en realidad
no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que s existen. Cualquier conclusin acerca de la aceptabilidad de los datos
en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretacin cuidadosa.
La designacin de resultado aberrante es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben investigarse con mtodos ms formales. La eleccin de la tcnica correcta para la identificacin de resultados aberrantes suele
depender del reconocimiento inicial del nmero y ubicacin de los valores. Frecuentemente, la designacin de resultado aberrante se hace visualmente con tcnicas grficas. La identificacin de resultados aberranteses el uso de pruebas de significancia estadstica para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadstico conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios farmacuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apndice C ejemplos ilustrativos de
tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviacin Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en ingls), la Prueba de Dixon y la Regla de Hampel.
La eleccin de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamao de la muestra y de las suposiciones de
distribucin. Muchas de estas pruebas (p.ej., la Prueba ESD) requieren la suposicin de que los datos generados por el laboratorio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una poblacin normalmente distribuida, posiblemente despus de
su transformacin. Si se realiza una transformacin de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transformados. Las transformaciones ms comunes incluyen tomar el logaritmo o la raz cuadrada de los datos. Existen otros mtodos
para la manipulacin de un resultado aberrante simple y un resultado mltiple que tambin pueden utilizarse, e incluyen pruebas que utilizan medidas robustas de dispersin y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviacin absoluta de
la mediana y mtodos de anlisis exploratorio de datos (EDA, por sus siglas en ingls). El Acomodamiento de resultados aberrantes es el uso de tcnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos
en lugar del valor real, para producir resultados que no estn adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes.
El uso de dichos mtodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificacin de resultados aberrantes.
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COMPARACIN DE MTODOS ANALTICOS

Con frecuencia es necesario comparar dos mtodos para determinar si hay una diferencia importante en sus resultados promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparacin de mtodos es generar datos que permitan evaluar
la equivalencia de los dos mtodos en toda una gama de concentraciones. En esta seccin se describen algunos de los factores
que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.
Precisin
La precisin es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el mtodo analtico se aplica
repetidamente a una muestra homognea. Para considerar que un mtodo alternativo tiene una precisin comparable a la
del mtodo vigente, su precisin (ver Caractersticas de Desempeo Analtico en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
1225) no debe ser peor que la del mtodo vigente en un valor considerado importante. Una disminucin en la precisin (o
aumento en la variabilidad) puede aumentar el nmero de resultados que no cumplen con las especificaciones requeridas. Por
el contrario, un mtodo alternativo que proporciona una precisin superior es aceptable.
Una manera de comparar la precisin de dos mtodos es estimando la varianza de cada mtodo (la varianza de la muestra,
s2, es el cuadrado de la desviacin estndar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unilateral para la
relacin de varianzas (verdaderas), en donde relacin se define como la varianza del mtodo alternativo dividida por la varianza del mtodo vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposicin en el Apndice D. El lmite de confianza superior unilateral debe compararse con un lmite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio analtico. Si el lmite de confianza superior unilateral es inferior a este lmite aceptable superior, la precisin del mtodo alternativo se considera aceptable,
ya que el uso del mtodo alternativo no llevar a una prdida importante de precisin. Debe tenerse en cuenta que si el lmite
de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el mtodo alternativo tiene una precisin superior a la
del mtodo vigente.
El mtodo de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la
significancia estadstica de la relacin de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relacin de varianzas calculada
con las muestras se compara con un valor crtico basado en los valores tabulados de la distribucin F para el nivel de confianza
deseado y el nmero de grados de libertad de cada varianza. La mayora de los textos de estadstica incluyen tablas con los
valores F. Si la relacin calculada excede este valor crtico, se dice que existe una diferencia estadsticamente significativa en la
precisin de los dos mtodos. No obstante, si la relacin calculada es inferior al valor crtico, esto no prueba que los mtodos
tengan la misma precisin o una precisin equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que existe una diferencia estadsticamente significativa.
Captulos
El rechazo de resultados aberrantes es la eliminacin efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos.
No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el nico medio para eliminar un resultado aberrante de los datos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar til como parte de la evaluacin de la significancia de ese
resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son vlidas en aquellos casos en que se est evaluando
la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolucin o la determinacin de la velocidad
de liberacin. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su anlisis futuro. Los
datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos histricos, por lo general no son tales sino que reflejan las
influencias de fuentes adicionales de variacin.
En resumen, el rechazo o la conservacin de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo.
Deben tenerse en cuenta las caractersticas de las pruebas, as como el conocimiento cientfico del proceso de fabricacin y el
mtodo analtico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante nunca
puede reemplazar una investigacin de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse nicamente cuando la investigacin no
es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricacin o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas estadsticas
indicaran que uno o ms valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La inclusin o exclusin de resultados aberrantes en los clculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de aceptacin debe
basarse en el juicio cientfico y en las normas internas del fabricante. Suele ser til realizar los clculos con y sin los resultados
aberrantes para evaluar su impacto.
Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medicin deben informarse (es decir, mediante una
nota al pie de pgina), pero no incluirse en los clculos estadsticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio
de aceptacin en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los lmites) es un
valor promedio, una medicin individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptacin se establece para un promedio,
entonces no es estadsticamente apropiado requerir que las mediciones individuales tambin cumplan con el criterio, ya que la
variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medicin individual.
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Captulos
Exactitud
La comparacin de la exactitud de los mtodos (ver Caractersticas de Desempeo Analtico en Validacin de Procedimientos
Farmacopeicos 1225) proporciona informacin til para determinar si el nuevo mtodo es equivalente, en general, al mtodo
vigente. Un mtodo sencillo para realizar esta comparacin es calcular un intervalo de confianza para la diferencia entre las
medias verdaderas, donde la diferencia se calcula restando la media del mtodo vigente de la media de la muestra obtenida
con el mtodo alternativo.
El intervalo de confianza debe compararse con un lmite inferior y un lmite superior considerados aceptables, a priori, por el
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos mtodos pueden considerarse equivalentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la prctica. El lmite inferior y el superior del intervalo de
confianza slo muestran el tamao de la posible diferencia real entre los dos mtodos y no si la diferencia se considera tolerable. Dicha evaluacin slo puede realizarse dentro del contexto cientfico adecuado.
El mtodo del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la aplicacin de una prueba t para evaluar la
significancia estadstica de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba t es calculando el intervalo de confianza y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos mtodos muestran una diferencia estadsticamente significativa en
promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadsticamente significativa puede no tener una
magnitud suficiente para tener importancia prctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o de
una muestra de un tamao mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadsticamente significativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el cero y, de todas maneras, no puede descartarse una diferencia
prctica importante. Esto podra ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tamao de la muestra es demasiado
pequeo. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estadsticamente
significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia prctica.
Determinacin del Tamao de la Muestra

La determinacin del tamao de la muestra se basa en la comparacin de la exactitud y precisin de los dos mtodos3 y es
similar al mtodo utilizado para evaluar la hiptesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, respectivamente, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es ,
ERR (01-jul-2014) la diferencia aceptable ms grande entre los dos mtodos que, si se logra, permite llegar a una conclusin de
equivalencia. Es decir, si los dos mtodos difieren en no ms de , ERR (01-jul-2014) en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La comparacin puede ser bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de ERR (01-jul-2014) en
cualquier direccin, como cuando se comparan medias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan
varianzas, en cuyo caso es deseable una reduccin en la variabilidad y se considera que los mtodos son equivalentes si la relacin entre las varianzas (mtodo nuevo/mtodo vigente) no es ms de 1,0 + . ERR (01-jul-2014) El investigador deber especificar
el ERR (01-jul-2014) basndose en el conocimiento del mtodo vigente y/o en su uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se
debe tener en cuenta cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es que el nuevo mtodo no debe diferir demasiado
del mtodo vigente para que no se generen resultados fuera de la especificacin. En estos casos, se elige un ERR (01-jul-2014)
que represente una baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distribucin de datos para el mtodo
vigente con los lmites de especificacin. Esto puede hacerse grficamente o usando un intervalo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo en el Apndice E. En general, la eleccin de ERR (01-jul-2014) depende de los requisitos cientficos del laboratorio.
Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podran llevar a una conclusin de similitud
cuando los mtodos son inaceptablemente diferentes (segn lo definido por el ERR (01-jul-2014)). Esto se llama falso positivo o
error de Tipo I. El error tambin podra darse en sentido opuesto, es decir, los mtodos podran ser similares pero los datos no
permiten esa conclusin. Esto se llama falso negativo o error de Tipo II. Con los mtodos estadsticos, no es posible eliminar
completamente la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamao de la muestra, la probabilidad de cada uno de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad mxima aceptable de un error de Tipo I
comnmente se denomina a y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad mxima
deseada de un error de Tipo II comnmente se denomina b . Con frecuencia, b se especifica indirectamente eligiendo un nivel
deseado de 1 b , que se denomina la potencia de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la
probabilidad de concluir correctamente que dos mtodos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del orden del
80% o 90% (correspondiente a un b de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el experimento
debe especificar el , ERR (01-jul-2014) el a y la potencia. El tamao de la muestra depende de todos estos componentes. Se incluye un ejemplo en el Apndice E. Aunque el Apndice E slo determina un valor nico, suele ser til determinar una tabla de
tamaos de muestras para diferentes opciones de , ERR (01-jul-2014) a y potencia. Dicha tabla permite una eleccin mejor fundamentada del tamao de la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente positivas).
En general, el tamao de muestra requerido para comparar la precisin de dos mtodos es mayor que el requerido para comparar su exactitud.
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APNDICE A: GRFICAS DE CONTROL
Fig. 1. Grfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media
de todas las muestras (X) es 102,0, el UCL es 106,5 y el LCL es 97,5.
en donde X es la media de la muestra y d2 es una constante comnmente usada para este tipo de grfica, que est basada en
el nmero de observaciones asociadas con el clculo del intervalo mvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como
aqu, d2 = 1,128. Para el ejemplo de la Figura 1, el MR era de 1,7:
Existen otros mtodos que permiten detectar mejor pequeas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa
(tambin conocida como CUSUM) y el intervalo mvil exponencialmente ponderado (EWMA).
APNDICE B: ESTUDIO DE PRECISIN

La Tabla 1 muestra datos obtenidos de un estudio de precisin. En este estudio se hicieron cinco anlisis independientes y,
dentro de cada anlisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
Un anlisis de varianza (ANOVA) con los datos de la Tabla 1 genera la tabla ANOVA (Tabla 1A). Como haba un nmero
igual de determinaciones repetidas por anlisis en el estudio de precisin, los valores de VarianzaAnlisis y VarianzaRep pueden
conseguirse directamente de la tabla ANOVA. Las siguientes ecuaciones calculan la variabilidad asociada con los anlisis y las
determinaciones repetidas, donde MSintra representa el cuadrado medio de error o intra-anlisis y MSentre representa el cuadrado medio entre anlisis.
VarianzaRep = MSintra = 0,102
[NOTAUna prctica comn consiste en utilizar un valor de 0 para VarianzaAnlisis cuando el valor calculado es negativo]. Las
estimaciones tambin pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las frmulas son ms complejas. Muchos programas de software estadstico pueden manejar fcilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estudiar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se disea e interpreta un estudio de precisin. El cono-
Captulos
La Figura 1 muestra una grfica de control para valores individuales. Existen varios mtodos diferentes para calcular el lmite
de control superior (UCL, por sus siglas en ingls) y el lmite de control inferior (LCL, por sus siglas en ingls). Un mtodo
utiliza el intervalo mvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas (xi xi1). Estos intervalos mviles se promedian (MR) y se usan en las siguientes frmulas:
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cimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del mtodo continuo y, lo ms importante, se
puede utilizar para asegurar que los mtodos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que estn destinados. Al definir
cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor informable), se est aprovechando el poder de promediar,
con lo que se puede lograr prcticamente cualquier precisin deseada. Esto significa que, al basar el valor de informe en un
promedio a travs de determinaciones repetidas y/o anlisis, en vez de en un solo resultado, es posible reducir la %RSD y hacerlo de manera predecible.
La Tabla 2 muestra la varianza computada y la %RSD de la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combinaciones de nmero de anlisis y nmero de determinaciones repetidas por anlisis, usando las siguientes frmulas:
Captulos
Por ejemplo, la Varianza de la media, Desviacin estndar de la media y %RSD de una prueba de dos anlisis y tres determinaciones repetidas por cada anlisis son 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, segn se indica a continuacin.
RSD = (0,769/100,96) 100% = 0,76%

en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 2, aumentar el nmero de
anlisis de uno a dos permite obtener una reduccin ms importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el
nmero de determinaciones repetidas por anlisis.
No se hicieron suposiciones de distribucin sobre los datos de la Tabla 1 ya que el propsito de este Apndice es mostrar los
clculos en un estudio de precisin.
APNDICE C: EJEMPLOS DE PRUEBAS DE RESULTADOS ABERRANTES PARA DATOS ANALTICOS

Considerando el siguiente conjunto de 10 mediciones: 100,0; 100,1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7
(media = 99,5, desviacin estndar = 1,369), hay algn resultado aberrante?
Prueba de Desviacin Estudentizada Extrema (ESD) Generalizada

Esta prueba es una versin modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un nmero previamente especificado, r,
de resultados aberrantes de una poblacin normalmente distribuida. Para la deteccin de un solo resultado aberrante (r = 1),
al procedimiento de ESD generalizado tambin se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para
la deteccin de mltiples resultados aberrantes. Supongamos que r es igual a 2 y que n es igual a 10.
Etapa 1 (n= 10)Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviacin
estndar (ver la Tabla 3).4
Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor mximo (R1 = 2,805), y compararlo con un valor crtico
tabulado, previamente especificado, l1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor mximo es ms grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores
l se incluyen en muchos textos de estadstica. Las tablas estadsticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las
notaciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla.
Etapa 2 (n= 9)Eliminar la observacin correspondiente al resultado normalizado absoluto mximo del conjunto de datos
originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviacin estndar (Tabla 3, las dos
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el mximo de los
valores absolutos de los 9 resultados normalizados (R2 = 1,905), y compararlo con l2 (2,215). El valor mximo no es mayor
que el valor tabulado.
ConclusinEl resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa,
99,5, no es un resultado aberrante.
4 La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existen otras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en
lugar de dividirse por la desviacin estndar, se divide por la desviacin estndar multiplicada por la raz cuadrada de n 1 dividido por n.
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Pruebas tipo Dixon

La prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que nicamente se considerarn resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la prueba de Dixon supone que los
datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola poblacin normal. Siguiendo la estrategia usada para la
prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisin a priori en relacin con uno de los lados y se utiliza
una Prueba de Dixon bilateral. A partir del anlisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos ms pequeos son los que
se examinarn como resultados aberrantes. La prueba de Dixon permite el anlisis de dos resultados aberrantes de manera
simultnea; sin embargo, estos procedimientos estn ms all del alcance de este Apndice. El procedimiento por pasos que se
discute a continuacin no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el
resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamao de la muestra tambin se reduce en la segunda
etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon.
Etapa 1 (n= 10)Los resultados se ordenan segn su magnitud (es decir, Xn es la observacin ms grande, Xn1 es la segunda observacin ms grande, etc., y X1 es la observacin ms pequea). Las relaciones de la prueba de Dixon se basan en el
tamao de la muestra (en este ejemplo, n = 10); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relacin, r11, segn la
frmula siguiente:
Regla de Hampel
Paso 1El primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de
cada dato y dividir la diferencia por la desviacin estndar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se
dividen por la MAD (ver a continuacin). El clculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de
cada dato. A continuacin, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas. Por
ltimo, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD.6
Paso 2El segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se declara como un resultado aberrante. La Tabla 4 resume los clculos.
El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los
ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.
APNDICE D: COMPARACIN DE MTODOSPRECISIN

El siguiente ejemplo muestra el clculo de un intervalo de confianza del 90% para la relacin de varianzas (verdaderas) a fin
de comparar la precisin de dos mtodos. Se supone que la distribucin subyacente de las mediciones de la muestra est bien
caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptar el mtodo alternativo si
su precisin (medida por la varianza) no es ms de cuatro veces mayor que la del mtodo vigente.
Para determinar el tamao de muestra adecuado para la precisin, existe un mtodo de tanteos sucesivos utilizando la siguiente frmula:
donde n es el tamao de muestra ms pequeo requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de
afirmar correctamente que el mtodo alternativo tiene una precisin aceptable cuando los dos mtodos realmente tienen la
misma precisin; a es el riesgo de afirmar errneamente que el mtodo alternativo tiene una precisin aceptable; y 4 es el
5
6
Los valores crticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apndice F, Pruebas de Resultados Aberrantes.
Suponiendo una distribucin normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviacin
estndar de la poblacin. Esto significa que a medida que aumenta el tamao de la muestra, MAD se acerca a la desviacin estndar de la poblacin.
Captulos
Se utilizara otra relacin si el dato ms grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r11 se compara con un valor
r11; 0,05 en una tabla de valores crticos. Si r11 es mayor que r11; 0,05, se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de
datos anterior, r11 = (99,5 95,7)/(100,2 95,7) = 0,84. Esta relacin es mayor que r11; 0,05, que es 0,52979 al nivel de significancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Las fuentes de los valores r11; 0,05 se incluyen en muchos textos de estadstica.5
Etapa 2Eliminar la observacin ms pequea del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la
misma ecuacin r11, pero se requiere un nuevo valor crtico r11; 0,05 para n = 9 (r11; 0,05 = 0,56420). Ahora r11 = (99,7 99,5)/
(100,2 99,5) = 0,29, que es menor que r11; 0,05 y no es significativo al nivel del 5%.
ConclusinPor lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante.
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lmite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comnmente disponibles de
valores crticos de la distribucin F. Fa,n1,n1 es el percentil a superior de una distribucin F con numerador n 1 y denominador de n 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad a. Supongamos inicialmente que el laboratorio
estim necesario un tamao de muestra de 11 por mtodo (10 grados de libertad para el numerador y el denominador); el
clculo de la potencia sera el siguiente:7
Captulos
Pr [F > 1/4 Fa,n-1,n-1] = Pr [F > 1/4 F0,05;10;10] = Pr [F > (2,978/4)] = 0,6751

En este caso, la potencia fue de slo 68%; es decir, aunque los dos mtodos tenan varianzas exactamente iguales, con slo 11
muestras por mtodo, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que permitan concluir
que la varianza ha aumentado no ms de cuatro veces. Lo ms comn es elegir un tamao de muestra que tenga una potencia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o ms. Para determinar el tamao de muestra adecuado, pueden probarse
diversos nmeros hasta encontrar una probabilidad que exceda el lmite aceptable (p.ej., potencia > 0,90). Por ejemplo, la determinacin de la potencia para tamaos de muestra de 1220 se muestran en la Tabla 6. En este caso, la suposicin inicial de
un tamao de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisin, pero 15 muestras por mtodo proporcionaran un
tamao de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por mtodo para una potencia del 90%.
Tpicamente, el tamao de la muestra para las comparaciones de precisin debe ser mayor que para las comparaciones de
exactitud. Si el tamao de la muestra para comparar la precisin es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio
en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la eleccin de un aumento permitido en la varianza.
Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamao de la muestra requerida para una potencia fija es ms pequeo.
Otra alternativa es planificar un anlisis intermedio con un tamao de muestra ms pequeo, con la posibilidad de continuar
con un tamao de muestra ms grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un
experto en estadstica.
Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla 7
basados en los datos generados con 20 anlisis independientes por mtodo.
Relacin = varianza del mtodo alternativo/varianza del mtodo vigente = 45,0/25,0 = 1,8
Lmite inferior del intervalo de confianza = relacin/F,05 = 1,8/2,168 = 0,83
Lmite superior del intervalo de confianza = relacin/F,95 = 1,8/0,461 = 3,90
Para esta aplicacin, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%.
Esta prueba es unilateral ya que slo importa el aumento en la desviacin estndar del mtodo alternativo. Hay que tomar
algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya que deben tener colas iguales (los intervalos ms comunes tienen esta propiedad). Como el lmite de confianza superior unilateral (3,90) es inferior al lmite permitido (4,0), el estudio ha demostrado que el mtodo alternativo tiene una precisin aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resultados de
un estudio con un tamao de muestra de 15como si se hubiera elegido una potencia del 80%el laboratorio no hubiera
podido concluir que el mtodo alternativo tiene una precisin aceptable (lmite de confianza superior de 4,47).
APNDICE E: COMPARACIN DE MTODOSDETERMINACIN DE LA MXIMA DIFERENCIA

ACEPTABLE, , ERR (01-jul-2014) ENTRE DOS MTODOS
Este Apndice describe un mtodo para determinar la diferencia, , entre dos mtodos (alternativo-vigente), diferencia que,
si se logra, tambin permite concluir que dos mtodos son equivalentes. Si no existe otra informacin previa que gue al laboratorio en la eleccin del , sta es una manera razonable de proceder. En este Apndice se describen los clculos del tamao
de la muestra en diferentes situaciones.
Determinacin del Intervalo de Tolerancia

Suponer que no se conocen la media ni la desviacin estndar del proceso, pero una muestra de tamao 50 produjo una
media y una desviacin estndar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los ltimos 50 resultados
generados por este mtodo especfico para una muestra (de control) en particular. Con esta informacin, pueden calcularse
los lmites de tolerancia segn la siguiente frmula:
x Ks
en donde x es la media, s es la desviacin estndar, y K se basa en el nivel de confianza, la proporcin de resultados a capturar
en el intervalo y el tamao de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el
7 Esto podra calcularse usando una planilla de clculo de computadora. Por ejemplo, en Microsoft Excel la frmula sera: FDIST((R/A)*FINV(alfa, n 1; n 1),
n 1; n 1), donde R es la relacin de varianzas a las que se determina la potencia (p.ej., R = 1, que fue el valor escogido en los clculos de potencia provistos en
la Tabla 6) y A es la relacin mxima para aceptacin (p.ej., A = 4). Alfa es el nivel de significancia, normalmente 0,05.
USP 38
valor de K requerido para incluir el 95% de la poblacin con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382.8 Los lmites
de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 2,382 2,0
en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).
Comparacin de los Lmites de Tolerancia con los Lmites de la Especificacin

Supongamos que el intervalo especificado para este mtodo es de (90,0; 110,0) y que la media y la desviacin estndar del
proceso no han cambiado desde que se estableci este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el lmite inferior
de la especificacin (LSL, por sus siglas en ingls) es 90,0; el lmite superior de la especificacin (USL, por sus siglas en ingls)
es 110,0; el lmite de tolerancia inferior (LTL, por sus siglas en ingls) es 94,7 y el lmite de tolerancia superior (UTL, por sus
siglas en ingls) es 104,3. Calcular la diferencia aceptable, ( ERR (01-jul-2014)), de la siguiente manera:
A = LTL LSL para LTL LSL
(A = 94,7 90,0 = 4,7);
B = USL UTL para USL UTL
(B = 110,0 104,3 = 5,7); y
ERR (01-jul-2014)
=mnimo (A, B) = 4,7
Con esta opcin de ERR (01-jul-2014) y suponiendo que los dos mtodos tienen una precisin comparable, el intervalo de
confianza para la diferencia en medias obtenidas con los dos mtodos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre 4,7 y
+4,7 para afirmar que no existe ninguna diferencia importante entre los dos mtodos.
Los laboratorios analticos de control de calidad a veces utilizan lmites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es
mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la poblacin con una confianza del 99%
para 50 muestras es de 3,390. Los lmites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:
99,5 3,390 2,0
El intervalo de tolerancia ms amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTL de 92,7 y UTL de
106,3 produciran un ERR (01-jul-2014) ms pequeo:
A = LTL LSL para LTL LSL
(A = 92,7 90,0 = 2,7);
B = USL UTL para USL UTL
(B = 110,0 106,3 = 3,7); y
ERR (01-jul-2014)
= mnimo (A, B) = 2,7
Aunque un fabricante puede elegir cualquier ERR (01-jul-2014) que funcione adecuadamente para la determinacin de equivalencia, la eleccin de un ERR (01-jul-2014) ms grande, an cuando lleva a un n ms pequeo, presenta el riesgo de una prdida
de capacidad para la discriminacin entre mtodos.
Tamao de la Muestra
Existen frmulas que pueden utilizarse para un ERR (01-jul-2014) especfico, suponiendo que se conocen las varianzas de la
poblacin y que son iguales, para calcular el nmero de muestras que se debe analizar por mtodo, n. El nivel de confianza y
la potencia tambin deben especificarse. [NOTAPotencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusin correcta de que
dos mtodos idnticos son equivalentes.] Por ejemplo, si ERR (01-jul-2014) = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel del 5%9 y una potencia del 80% (con los correspondientes
valores z de 1,645 y 1,282, respectivamente), el tamao de la muestra aproximado se calcula segn la siguiente frmula:
8
9
Existen tablas de factores de tolerancia que indican los valores aproximados y, en consecuencia, difieren ligeramente de los valores aqu informados.
Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
Captulos
Figura 2. Grfica de los valores calculados anteriormente.
Captulos
USP 38
En consecuencia, suponiendo que cada mtodo tiene una varianza poblacional, s2, de 4,0, el nmero de muestras, n, requerido para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos mtodos son equivalentes (el intervalo de confianza del 90%
para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre 4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idnticos (la diferencia de
medias verdadera es cero) es 4. Como se utiliz la distribucin normal en la frmula anterior, 4 es en realidad un lmite inferior
en el tamao de muestra requerido. Si es factible, podra convenir un tamao de muestra ms grande. Los valores de z para
niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla 8. La frmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la varianza usada
en el clculo del tamao de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que pueden tratarse
como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el anlisis del nuevo experimento, o el tamao de la muestra para
el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribucin normal sea una buena aproximacin a la
distribucin t; y 3) el laboratorio est seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el caso ms optimista. No es comn que se den estas tres suposiciones. La frmula anterior debe tratarse con ms frecuencia como una aproximacin inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamao de muestra ms grande.
En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los mtodos necesarios.
Cuando se requiere una transformacin logartmica para lograr la normalidad, la frmula de tamao de la muestra debe
ajustarse ligeramente segn se indica a continuacin. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la poblacin y la diferencia aceptable ms grande, , ERR (01-jul-2014) entre los dos mtodos, ahora se formula con respecto a la
%RSD de la poblacin y la diferencia proporcional aceptable ms grande entre los dos mtodos.
en donde
y r representa la diferencia proporcional aceptable ms grande entre los dos mtodos ((alternativo-vigente)/vigente) y se supone que las %RSDs de la poblacin son conocidas e iguales.
APNDICE F: FUENTES DE INFORMACIN ADICIONALES

Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadsticas para evaluar un conjunto de datos. Este captulo presenta varias
pruebas que permiten interpretar y manejar datos analticos, pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En este captulo simplemente se ilustra el anlisis de datos usando mtodos estadsticamente aceptables. Como se menciona en la
Introduccin, las pruebas especficas se incluyen con fines ilustrativos nicamente y USP no avala ninguna de estas pruebas como nico mtodo para el tratamiento de los datos analticos. Puede encontrarse informacin adicional y pruebas alternativas
en las referencias enumeradas a continuacin o en muchos textos de estadstica.
Grficas de Control:
1. Manual on Presentation of Data and Control Chart Analysis, 6a ed., American Society for Testing and Materials (ASTM), Philadelphia, 1996.
2. Grant, E.L., Leavenworth, R.S., Statistical Quality Control, 7a ed., McGraw-Hill, New York, 1996.
3. Montgomery, D.C., Introduction to Statistical Quality Control, 3a ed., John Wiley and Sons, New York, 1997.
4. Ott, E., Schilling, E., Neubauer, D., Process Quality Control: Troubleshooting and Interpretation of Data, 3a ed., McGraw-Hill,
New York, 2000.
Diferencias Detectables y Determinacin del Tamao de Muestra:
1. CRC Handbook of Tables for Probability and Statistics, 2a ed., Beyer W.H., ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1985.
2. Cohen, J., Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences, 2a ed., Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale, NJ, 1988.
3. Diletti, E., Hauschke, D., Steinijans, V.W., Sample size determination for bioequivalence assessment by means of confidence intervals, International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 1991; 29, 18.
4. Fleiss, J.L., The Design and Analysis of Clinical Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1986, pgs. 369375.
5. Juran, J.A., Godfrey, B., Juran's Quality Handbook, 5a ed., McGraw Hill, 1999, Seccin 44, Basic Statistical Methods.
6. Lipsey, M.W., Design Sensitivity Statistical Power for Experimental Research, Sage Publications, Newbury Park, CA, 1990.
7. Montgomery, D.C., Design and Analysis of Experiments, John Wiley and Sons, New York, 1984.
USP 38
Captulos
8. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, 1991 (reimpresin del texto original de agosto de 1963).
9. Kraemer, H.C., Thiemann, S., How Many Subjects?: Statistical Power Analysis in Research, Sage Publications, Newbury Park,
CA, 1987.
10. van Belle G., Martin, D.C., Sample size as a function of coefficient of variation and ratio of means, American Statistician
1993; 47(3): 165167.
11. Westlake, W.J., response to Kirkwood, T.B.L.: Bioequivalence testinga need to rethink, Biometrics 1981; 37:589594.
Estadstica General Aplicada a Datos Farmacuticos:
1. Bolton, S., Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical Applications, 3a ed., Marcel Dekker, New York, 1997.
2. Bolton, S., Statistics Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennaro, A.R., ed., Lippincott Williams
and Wilkins, Baltimore, 2000, pgs. 124158.
3. Buncher, C.R., Tsay, J., Statistics in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker, New York, 1981.
4. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg,
MD, 1991 (reimpresin del texto original de agosto de 1963).
5. Zar, J., Biostatistical Analysis, 2a ed., Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1984.
Estadstica General Aplicada a Datos de Laboratorio Analtico:
1. Gardiner, W.P., Statistical Analysis Methods for Chemists, The Royal Society of Chemistry, London, England, 1997.
2. Kateman, G., Buydens, L., Quality Control in Analytical Chemistry, 2a ed., John Wiley and Sons, New York, 1993.
3. Kenkel, J., A Primer on Quality in the Analytical Laboratory, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 2000.
4. Mandel, J., Evaluation and Control of Measurements, Marcell Dekker, New York, 1991.
5. Melveger, A.J., Statististics in the pharmaceutical analysis laboratory, Analytical Chemistry in a GMP Environment, Miller
J.M., Crowther J.B., eds., John Wiley and Sons, New York, 2000.
6. Taylor, J.K., Statistical Techniques for Data Analysis, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1990.
7. Thode, H.C., Jr., Testing for Normality, Marcel Dekker, New York, NY, 2002.
8. Taylor, J.K., Quality Assurance of Chemical Measurements, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, 1987.
9. Wernimont, G.T., Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods, Association of Official Analytical Chemists
(AOAC), Arlington, VA, 1985.
10. Youden, W.J., Steiner, E.H., Statistical Manual of the AOAC, AOAC, Arlington, VA, 1975.
Estadstica No Paramtrica:
1. Conover, W.J., Practical Nonparametric Statistics, 3a ed., John Wiley and Sons, New York, 1999.
2. Gibbons, J.D., Chakraborti, S., Nonparametric Statistical Inference, 3a ed., Marcel Dekker, New York, 1992.
3. Hollander, M., Wolfe, D., Nonparametric Statistical Methods, 2a ed., John Wiley and Sons, NY, 1999.
Pruebas de Resultados Aberrantes:
1. Barnett, V., Lewis, T., Outliers in Statistical Data, 3a ed., John Wiley and Sons, New York, 1994.
2. Bhrer, Armin, One-sided and Two-sided Critical Values for Dixon's Outlier Test for Sample Sizes up to
n = 30, Economic Quality Control, Vol. 23 (2008), No. 1, pgs. 513.
3. Davies, L., Gather, U., The identification of multiple outliers, Journal of the American Statistical Association (with comments), 1993; 88:782801.
4. Dixon, W.J., Processing data for outliers, Biometrics 1953; 9(1):7489.
5. Grubbs, F.E., Procedures for detecting outlying observations in samples, Technometrics 1969; 11:121.
6. Hampel, F.R., The breakdown points of the mean combined with some rejection rules, Technometrics, 1985; 27:95107.
7. Hoaglin, D.C., Mosteller, F., Tukey, J., eds., Understanding Robust and Exploratory Data Analysis, John Wiley and Sons, New
York, 1983.
8. Iglewicz B., Hoaglin, D.C., How to Detect and Handle Outliers, American Society for Quality Control Quality Press, Milwaukee, WI, 1993.
9. Rosner, B., Percentage points for a generalized ESD many-outlier procedure, Technometrics, 1983; 25: 165172.
10. Norma E-178-94: Standard Practice for Dealing with Outlying Observations, American Society for Testing and Materials
(ASTM), West Conshohoken, PA, septiembre de 1994.
11. Rorabacher, D.B., Statistical Treatment for Rejections of Deviant Values: Critical Values of Dixon's Q Parameter and Related Subrange Ratios at the 95% Confidence Level, Analytical Chemistry, 1991; 63(2): 139146.
Precisin y Componentes de Variabilidad:
1. Hicks, C.R., Turner, K.V., Fundamental Concepts in the Design of Experiments, 5a ed., Oxford University Press, 1999 (seccin
titulada Repeatability and Reproducibility of a Measurement System).
2. Kirk, R.E., Experimental Design: Procedures for the Behavioral Sciences, Brooks/Cole, Belmont, CA, 1968, pgs. 6163.
3. Kirkwood, T.B.L., Geometric means and measures of dispersion, Letter to the Editor, Biometrics, 1979; 35(4).
4. Milliken, G.A., Johnson, D.E., Analysis of Messy Data, Volumen 1: Designed Experiments, Van Nostrand Reinhold Company,
New York, NY, 1984, pgs. 1923.
5. Searle, S.R., Casella, G., McCulloch, C.E., Variance Components, John Wiley and Sons, New York, 1992.
6. Snedecor, G.W., Cochran, W.G., Statistical Methods, 8a ed., Iowa State University Press, Ames, IA, 1989.
7. Norma E-691-87: Practice for Conducting an Interlaboratory Study to Determine the Precision of a Test Method, ASTM, West
Conshohoken, PA, 1994.
USP 38
8. Hauck, W. W., Koch, W., Abernethy, D., Williams, R. Making Sense of Trueness, Precision, Accuracy, and Uncertainty,
Pharmacopeial Forum, 2008; 34(3).
Determinacin del Intervalo de Tolerancia:
1. Hahn, G.J., Meeker, W.Q., Statistical Intervals: A Guide for Practitioners, John Wiley and Sons, New York, 1991.
2. Odeh, R.E., Tables of two-sided tolerance factors for a normal distribution, Communications in Statistics: Simulation and
Computation, 1978; 7: 183201.
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisin
N del Anlisis
N de la Repeticin
100,70
99,46
99,96
101,80
101,91
101,05
99,37
100,17
102,16
102,00
101,15
99,59
101,01
102,44
101,67
101,86
Media
100,97
99,47
100,38
102,13
Desviacin Estndar
0,236
0,111
0,556
0,321
0,171
%RSD1
0,234%
0,111%
0,554%
0,314%
0,167%
%RSD (desviacin estndar relativa porcentual) = 100% (desviacin estndar/media)
Captulos
Tabla 1A. Tabla de Anlisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla 1
Fuente de
Variacin
Grados de Libertad
(df)
Suma de Cuadrados
(SS)
Cuadrados Medios1
(MS)
F =MSB/MSW
Entre Anlisis
14,200
3,550
34,886
Intra-anlisis
10
1,018
0,102
Total
14
15,217
Los Cuadrados Medios Entre (MSB) = SSEntre/dfEntre y los Cuadrados Medios Intra (MSW) = SSIntra/dfIntra
Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (N de Anlisis y N de Determinaciones Repetidas por Anlisis) sobre la Precisin
de la Media
N de
Determinaciones Repetidas por Anlisis
N de
Anlisis
Varianza
de la Media
Desviacin Estndar
de la Media
% RSD1
1,11
1,251
1,118
1,200
1,095
1,09
1,183
1,088
1,08
0,625
0,791
0,78
0,600
0,775
0,77
0,592
0,769
0,76
La %RSD se calcul utilizando un valor de la media de 100,96 (como el divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 1.
Tabla 3. Resultados de la Prueba RSD Generalizada

n = 10
n=9
Datos
Normalizados
Datos
Normalizados
100,3
+0,555
100,3
+1,361
100,2
+0,482
100,2
+0,953
100,1
+0,409
100,1
+0,544
100,0
+0,336
100,0
+0,136
100,0
+0,336
100,0
+0,136
100,0
+0,336
100,0
+0,136
99,9
+0,263
99,9
0,272
99,7
+0,117
99,7
1,089
99,5
0,029
99,5
1,905
95,7
2,805
Media =
99,54
99,95
SD =
1,369
0,245
USP 38
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel

n = 10
Mediana =
Datos
Desviaciones
de la
Mediana
Desviaciones
Absolutas
Normalizadas
Absolutas
100,3
0,3
0,3
1,35
100,2
0,2
0,2
0,90
100,1
0,1
0,1
0,45
100
100
100
99,9
0,1
0,1
0,45
99,7
0,3
0,3
1,35
99,5
0,5
0,5
2,25
95,7
4,3
4,3
19,33
100
0,15
MAD =
0,22
Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutilizando la Regla de Hampel
n=9
Desviaciones
Absolutas
Normalizadas
Absolutas
100,3
0,3
0,3
2,02
100,2
0,2
0,2
1,35
100,1
0,1
0,1
0,67
100
100
100
99,9
0,1
0,1
0,67
99,7
0,3
0,3
2,02
99,5
0,5
0,5
3,37
100
0,1
MAD =
0,14
Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaos de Muestras (Especficas para el Ejemplo del Apndice D)
Tamao de la Muestra
Pr[F >1/4 F0,05; n-1; n-1]
12
0,7145
13
0,7495
14
0,7807
15
0,8083
16
0,8327
17
0,8543
18
0,8732
19
0,8899
20
0,9044
Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Anlisis Independientes (Especficos para el Ejemplo del Apndice D)
Varianza
(desviacin estndar)
Tamao de la
Muestra
Grados de
Libertad
Alternativo
45,0 (6,71)
20
19
Vigente
25,0 (5,00)
20
19
Mtodo
Tabla 8. Valores Comunes para una Distribucin Normal Estndar

Valores z
Nivel de confianza
Unilateral (a)
Bilateral (a/2)
99%
2,326
2,576
Captulos
Mediana =
Datos
Desviaciones
con Respecto a la
Mediana
USP 38
Tabla 8. Valores Comunes para una Distribucin Normal Estndar (Continuacin)

Valores z
Nivel de confianza
Unilateral (a)
95%
1,645
Bilateral (a/2)
1,960
90%
1,282
1,645
80%
0,842
1,282
Captulos
1015 APARATOS AUTOMATIZADOS DE SNTESIS RADIOQUMICA

La preparacin y el control de calidad de radiofrmacos de diagnstico marcados con nucleidos de vida media muy corta
que emiten positrones (p.ej.,15O, 13N, 11C y 18F cuyas vidas medias son de 2, 10, 20 y 110 minutos, respectivamente), estn
sujetos a restricciones diferentes de las que se aplican a los frmacos de uso teraputico: (1) La sntesis debe ser rpida, aunque
se deben tomar medidas para proteger al qumico o al farmacutico de la excesiva exposicin a la radiacin. (2) Excepto en un
grado limitado para el 18F, la sntesis debe producirse en el momento del uso. (3) A excepcin del 18F, cada partida de radiofrmacos generalmente se dirige a una sola administracin.
Estos factores aumentan la importancia del control de calidad del producto farmacutico final con relacin a la validacin
del proceso de sntesis. Dado que cada dosis se prepara de forma individual, salvo contadas excepciones, lo ideal sera que
cada dosis fuera sometida a pruebas de control de calidad de pureza radioqumica y otros aspectos de calidad esenciales antes
de su administracin. Debido a que no es posible realizar el control de calidad de cada partida, se seleccionan partidas a intervalos regulares para establecer y caracterizar completamente su pureza radiofarmacutica. Esta prueba de calidad rutinaria y
rigurosa de las partidas seleccionadas constituye la base de la validacin del proceso, que es absolutamente esencial para la
evaluacin anticipada de la calidad y pureza de las partidas cuando se trata de radiofrmacos de vida media extremadamente
corta. Puesto que los radiofrmacos empleados en tomografa por emisin de positrones (TEP) se administran por va intravenosa o (en el caso de gases radioactivos) por inhalacin, la variabilidad entre partidas, en relacin con la biodisponibilidad, no
constituye un problema. Es ms, la sntesis en muy pequea escala de radiofrmacos (casi siempre menos de 1 miligramo y a
menudo dentro del rango de los microgramos) y el hecho de que los pacientes generalmente reciben slo una dosis nica de
frmaco radioactivo reducen al mnimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas de impurezas qumicas. Estas afirmaciones no intentan rebatir la necesidad del control de calidad en el manejo de equipos automatizados de sntesis, sino colocar
la fabricacin de radiofrmacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y enfatizar una vez ms la enorme importancia de la validacin anticipada de procesos y el control de calidad del producto terminado.
La sntesis de rutina de radiofrmacos puede exponer al personal a dosis innecesariamente altas de radiacin. Los dispositivos automatizados de sntesis radioqumica se han ideado, en parte, para cumplir con el concepto de reducir las exposiciones
del personal a la radiacin hasta el menor grado razonablemente posible (ALARA, del ingls as low as reasonably achievable). Estos dispositivos automatizados de sntesis pueden ser ms precisos y eficaces que los mtodos manuales existentes.
Dichos mtodos automatizados son particularmente tiles cuando una sntesis radioqumica requiere manipulaciones repetitivas y uniformes a diario.
Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosntesis deben cumplir los mismos criterios de garanta de calidad
que los productos obtenidos mediante sntesis manual convencional. En el caso de radiofrmacos que emiten positrones, estos
criterios incluyen muchas de las mismas determinaciones que se usan para los radiofrmacos utilizados en medicina nuclear
convencional, por ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se aplican muchas de las mismas limitaciones.
En general, no se pueden aplicar los procedimientos tpicos, como por ejemplo la espectroscopia, debido a que la cantidad de
producto es tan pequea que cae debajo del nivel de deteccin mnima del mtodo. En todos los casos, el mtodo farmacopeico aplicable es el rbitro decisivo (ver Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias Generales).
La preparacin de la Inyeccin de Fludesoxiglucosa F 18 y otros radiofrmacos que emiten positrones se puede adaptar fcilmente a la sntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los mtodos manuales es ms sencillo y menos costoso
que el que se emplea en los mtodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. Son de particular inters los mtodos relacionados con la validacin del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un procedimiento manual, la intervencin humana y la correccin mediante inspeccin pueden evitar muchos errores de procedimiento. En un sistema automatizado, la retroalimentacin eficaz tambin puede comenzar durante la sntesis. Por ejemplo, los detectores de radiacin pueden
controlar la actividad en varias etapas de la radiosntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se puede activar un sistema
de alarma que conduce a la intervencin humana.
Radioqumicos frente a RadiofrmacosSe debe establecer una distincin entre un radioqumico y el radiofrmaco correspondiente. En los centros de investigacin de TEP, los equipos automatizados se emplean para preparar compuestos marcados para experimentos con animales. Estos radioqumicos no se consideran radiofrmacos si (1) no estn preparados de
acuerdo a un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y garantice que la preparacin cumpla todos los
requisitos establecidos de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal calificado (farmacuticos y mdicos autorizados) de conformidad con los mtodos farmacopeicos publicados para los radiofrmacos individuales.
Equipo AutomatizadoLas consideraciones que se hacen en este captulo corresponden a la sntesis que se lleva a cabo
mediante robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos automatizados que se emplean en la sntesis de
USP 38
Informacin General / 1015 Aparatos Automatizados de Sntesis Radioqumica 773
Captulos
radioqumicos. El mtodo exacto de control de los dispositivos de sntesis es variable. Tanto los dispositivos de sntesis controlados electrnicamente como los controlados por programas informticos caen dentro de la designacin general y tienen un
espectro que vara desde el equipo manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, hasta dispositivos completamente automticos.
Elementos Comunes de Equipos Automatizados de SntesisPara manipular un aparato qumico que efecte la sntesis de un
radioqumico, es necesario controlar parmetros tales como el tiempo, la temperatura, la presin, el volumen y la secuencia.
Estos parmetros se pueden controlar y restringir para que estn dentro de ciertos lmites.
Garanta de Calidad del EquipoEl objetivo de la garanta de calidad es ayudar a asegurar que el radiofrmaco posterior
cumpla las normas farmacopeicas. Aunque los reglamentos sobre las buenas prcticas de fabricacin (21 CFR 820) no sean
aplicables, pueden resultar tiles para crear un programa de garanta de calidad. En la prctica, esto comprende la medicin y
el control documentados de todos los parmetros fsicos pertinentes controlados por los aparatos de sntesis.
Prueba de Control de Calidad de RutinaLa prueba de control de calidad de un equipo automatizado implica el examen
peridico de todos los parmetros certificados inicialmente durante la calificacin de garanta de calidad. La frecuencia de la
prueba puede ser diaria, dependiendo de la importancia y la estabilidad de los parmetros. Esta evaluacin del funcionamiento
del proceso se debe aumentar por medio de pruebas peridicas del producto final. Por ejemplo, se pueden aceptar las variaciones en la temperatura de un bao de aceite si el radioqumico (producto final) demuestra que cumple todos los criterios
pertinentes de la prueba.
Auditora de Verificacin de Calidad de los ReactivosLos materiales y reactivos utilizados para la sntesis de radiofrmacos deben ajustarse a las especificaciones y las pruebas establecidas de control de calidad. Se deben establecer los procedimientos para las pruebas, el almacenamiento y el uso de estos materiales. En este contexto, un reactivo se define como cualquier producto qumico utilizado en el procedimiento que conduce al producto radioqumico final, mientras que los materiales
se definen slo como suministros complementarios (tubos, materiales de vidrio, viales, etc.). Por ejemplo, en algunos procesos
se emplea nitrgeno comprimido para mover reactivos lquidos. En este caso, tanto el nitrgeno como los tubos deben cumplir las especificaciones establecidas.
Documentacin de Parmetros del AparatoSe deben identificar, controlar y documentar las variables fundamentales de
la sntesis. Estas caractersticas comprenden importantes atributos fsicos, qumicos, elctricos y de funcionamiento. Para microprocesadores y dispositivos controlados por computadora es particularmente importante un mtodo para especificar, probar y
documentar los programas y las piezas de la computadora. Este procedimiento debe incluir un anlisis general y peridico de
los componentes de la computadora. Adems, se debe examinar peridicamente el cdigo del programa informtico para determinar que no se haya modificado y que contina dando como resultado el producto final que cumple todas las especificaciones. La retroalimentacin durante el proceso es un medio para confirmar que la sntesis est bajo control. Los cambios de
cdigo en los programas deben incluir un procedimiento de autorizacin formal y se deben documentar.
Cada tipo de dispositivo de sntesis radioqumica requiere un conjunto de procedimientos especficos para probar y controlar
la confiabilidad y reproducibilidad de los diversos subsistemas que conforman el sistema total de sntesis.
Es esencial que la calibracin de cada uno de los componentes se confirme de acuerdo con un cronograma de mantenimiento establecido y que las mediciones o el control se realicen bajo las condiciones reales de sntesis.
Se deben medir los tiempos de entrega, los volmenes de reactivo, las temperaturas, las presiones de los gases y las velocidades de flujo y deben demostrar ser estables y reproducibles dentro de los lmites establecidos. El agregado de los reactivos y
disolventes se debe calibrar peridicamente. Otros componentes que se deben calibrar de forma rutinaria incluyen el sistema
de deteccin de radiaciones y los sensores y el sistema de control de procesos.
Como ejemplo, se indican a continuacin los elementos de validacin de los sistemas de varios componentes representativos
de un dispositivo automtico de sntesis:
Los recipientes de reaccin se pueden limpiar e inspeccionar mediante un mtodo establecido y documentado. Los recipientes se pueden enumerar y se puede hacer un seguimiento de su desempeo.
Los sistemas de calentamiento y enfriamiento (como por ejemplo los baos de aceite) se pueden controlar por medio de
termmetros o termocuplas. Las temperaturas se pueden registrar en una hoja de partida o se pueden imprimir automticamente como parte de un registro computarizado. El mantenimiento implica la calibracin peridica.
Los gases y el funcionamiento del sistema de entrega de gas se pueden controlar por medio de manmetros y flujmetros.
La pureza del gas se puede establecer por medio de certificados de anlisis emitidos por el proveedor o se puede verificar mediante una prueba independiente. El mantenimiento de los manmetros y flujmetros implica la calibracin peridica con estndares.
El desempeo motriz dependiente de la posicin se puede verificar por medio de interruptores de lmite. El mantenimiento
podra implicar la medicin real de la distancia recorrida y el tiempo transcurrido.
Las vlvulas solenoides se pueden controlar elctricamente, por medio de pruebas de flujo y presin.
El rendimiento del calentador se evidencia por medio de lecturas adecuadas de la termocupla. Otras pruebas podran incluir
determinaciones de resistencia.
Los reactivos se pueden aceptar sobre la base de los certificados de anlisis del proveedor. Como alternativa, el producto
qumico se podra analizar internamente o enviar a un laboratorio independiente. Segn el grado de estabilidad, puede ser
necesaria la repeticin peridica de pruebas.
774 1015 Aparatos Automatizados de Sntesis Radioqumica / Informacin General
USP 38
Los programas informticos se pueden probar mediante la documentacin del tiempo de sntesis transcurrido, con impresos
que verifiquen que se efectuaron todas las manipulaciones adecuadas, inclusive impresiones de los parmetros pertinentes como tiempos, temperatura, presiones y actividades.
Los patrones de distribucin de actividades, como por ejemplo la cantidad absoluta de producto, el porcentaje de rendimiento y los niveles individuales de actividad de las impurezas, brindan al usuario experimentado una oportunidad para localizar fallas del sistema.
Cambios en el Mtodo de SntesisAlgunos cambios en los aparatos de sntesis se pueden considerar no significativos. A
menudo, esta categora incluye cambios que no afectan a ninguno de los parmetros controlados. Sin embargo, es importante
tener cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios
en una lnea de comentario de un programa informtico pueden provocar un cambio inadvertido o la eliminacin de una instruccin importante. Cualquier cambio en los parmetros controlados puede cambiar el resultado del proceso. Si el radioqumico resultante no cumple con las especificaciones o si el radiofrmaco posterior no satisface los criterios farmacopeicos, el
cambio del proceso es inaceptable; se debe corregir la falla y volver a validar el proceso.
1024 SUERO BOVINO
Captulos
INTRODUCCIN
El suero bovino es la fraccin lquida de la sangre coagulada de buey (Bos taurus, entre otras especies), de la que se han
eliminado clulas, fibrina y factores de coagulacin. Desde la aparicin del cultivo celular moderno, los fabricantes de productos biolgicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composicin altamente nutricional de protenas, factores de crecimiento, hormonas, aminocidos, vitaminas, azcares, lpidos, oligoelementos y dems componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigacin y fabricacin comercial de vacunas, productos biolgicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biolgicos), tejidos obtenidos por ingeniera y otros productos celulares teraputicos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal
Bovino (FBS, por sus siglas en ingls) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigacin. El suero de
ternero (de animales recin nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sera ampliamente usado en la fabricacin comercial.
Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extraos en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtencin y anlisis, adems de estrictas guas de procesamiento y produccin para asegurar la calidad del suero bovino.
Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biolgicos producidos con suero bovino, y de mitigar
las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementacin con suero, lo que ha resultado en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones especficas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso
de suero bovino siempre que exista la opcin de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta tcnicamente
imposible o poco prctico.
Este captulo describe cuestiones relacionadas con la obtencin, produccin y caracterizacin de suero bovino para asegurar
su uso seguro. El Apndice 1 presenta una lista de guas y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y
los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biolgicos) deben considerar y aplicar, segn se requiera, los controles y
procedimientos establecidos en este captulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigacin
y fabricacin farmacutica.
Tipos de Suero Bovino

El suero fetal bovino (FBS) se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran
aptas para consumo humano mediante inspeccin ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se
recolecta en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.
El suero de ternero recin nacido (tambin conocido como suero de bovino recin nacido) se obtiene de animales con
una edad menor de 20 das en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.
El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 das y 12 meses en mataderos sujetos a inspeccin y
registro gubernamental.
El suero de bovino donante (tambin conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repetido de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspeccin y registro gubernamental. Los animales tienen entre 1236 meses de edad.
El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo
humano en mataderos sujetos a inspeccin y registro gubernamental.
USP 38
Informacin General / 1024 Suero Bovino 775
SUERO BOVINO: HISTORIA Y TIPOS DE USOS

Historia del Uso de Suero Bovino
Usos del Suero Bovino

El suero es una mezcla compleja de macromolculas requerida para el crecimiento celular y la produccin de virus, y su uso
como materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composicin lote a lote y el riesgo de contaminacin
por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnolgicas nuevas de fabricacin; sin embargo, muchas lneas celulares usadas en la fabricacin an no han sido adaptadas a estos
medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos cientficos por lo general vuelven poco prctico alterar los
procesos de fabricacin existentes en los que se usa suero como materia prima.
En ocasiones, el FBS es necesario para el bioprocesamiento de clulas y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de clulas
provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Adems, para algunos procesos biolgicos puede ser necesario mantener caractersticas celulares especficas durante el cultivo. El FBS a menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el
comportamiento biolgico de los tipos de clulas exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBS afecta la transcripcin de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresin gnica relacionada con la apoptosis, adems de que
proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo
de clulas en cultivo. Por lo tanto, el FBS seguir jugando un papel importante como suplemento para cultivos celulares en la
produccin de terapias celulares y de tejidos.
En la mayora de los procesos de fabricacin de vacunas de virus los medios usados para la expansin de cultivos celulares y
la infeccin/produccin de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el
suero bovino ayuda a generar una masa de clulas en un estado fisiolgico ptimo para una replicacin viral eficiente.
RECOLECCIN Y PRODUCCIN DE SUERO BOVINO

Recoleccin de Sangre
Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspeccin y registro gubernamental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedimientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recoleccin desechables para un slo uso o
equipo de recoleccin reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados.
SUERO DE BOVINO DONANTE

Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante
mediante registros de produccin y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes estn sujetos a
inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible
rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nue-
Captulos
El suero animal y dems materiales biolgicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 aos en el cultivo
de clulas de mamferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopcin de suero bovino como suplemento estndar
para el cultivo de tejidos. En comparacin con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene
fcilmente por lo que resulta ms econmico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales
debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recin nacido y de adulto que podran provocar
una reaccin cruzada con las clulas en cultivo y ocasionar lisis celular mediada por complemento. A fin de terminar con tales
inquietudes, se comenz a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS
realizados en la dcada de 1950 en el cultivo de clulas humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento
celular demostraron que (1) el componente albmina puede actuar como portador de molculas pequeas esenciales; (2) la
fetuna, una glicoprotena que se presenta en altos niveles en la fraccin alfa globulina, facilita la adhesin y extensin celular;
y (3) la fetuna inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteoltica puede jugar un papel en la capacidad de la
fetuna para estimular el crecimiento celular.
Durante las dcadas de 1960 y 1970, la suplementacin con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirti en una
prctica normal, lo que facilit tanto la investigacin biomdica como los primeros procesos de fabricacin de vacunas a gran
escala. La suplementacin con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de
clulas. Adems, se demostr que el FBS proporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptdicos. Presuntamente, la albmina promova el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar como protena portadora de molculas pequeas o lpidos, para unir iones metlicos, para servir como amortiguador del pH, y para proteger a las clulas de la
ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero como transferrina, hormonas y otros
factores de adhesin derivados del suero como fibronectina, vitronectina y laminina.
776 1024 Suero Bovino / Informacin General
USP 38
vos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspeccin y anlisis del animal
previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y anlisis veterinario durante el periodo de cuarentena y criterios de liberacin de los animales en cuarentena para la produccin del suero. Los recolectores no deben vacunar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB). Los recolectores deben someter los animales a anlisis para
determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.
SUERO DE TERNERO RECIN NACIDO, SUERO DE TERNERO Y SUERO DE BOVINO ADULTO

Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de produccin de suero deben asegurar que los fabricantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes
de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentacin del origen de los animales para sacrificio. La sangre
se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del pas de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem
como postmortem para verificar clnicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, adems de otros problemas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clnica de enfermedades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recoleccin sangunea que prevengan la contaminacin cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledao. El procedimiento de sacrificio estndar consiste en un mtodo aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado.
Captulos
SUERO FETAL BOVINO

Las especificaciones de producto y los procedimientos de anlisis para FBS se presentan en el captulo general propuesto
Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad 90. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre
fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras reproductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por
la autoridad competente del pas de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como
postmortem para verificar clnicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, adems de otros problemas o
condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clnica de enfermedades
infecciosas al momento del sacrificio. El tero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recoleccin de sangre
fetal bovina, en donde el personal de recoleccin sangunea evala el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen
hinchazn, decoloracin de la piel, olor, deformacin, y cada del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la
cantidad y la claridad del fluido amnitico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante
puncin cardaca en un sistema cerrado de recoleccin en condiciones diseadas para minimizar la contaminacin microbiana.
Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminacin cruzada con otros tejidos fetales y fluidos
corporales y el ambiente aledao.
Recoleccin y Procesamiento del Suero

La separacin (recoleccin) del suero y dems actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado
siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases
limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o ms tratamientos de inactivacin viral en el proceso de produccin, los
fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivacin viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda incluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en cualquier estudio de validacin viral debido a que este virus es ubicuo.
SEPARACIN Y RECOLECCIN DEL SUERO

El procesamiento de sangre bovina y la separacin (recoleccin) del suero deben realizarse en una manera que minimice la
contaminacin bacteriana y micoplasmtica, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El
procesamiento cuidadoso y rpido de la sangre ayuda a minimizar la hemlisis, lo que mejora an ms la calidad del producto
del suero. Despus de la recoleccin, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo especfico y en condiciones
controladas, y luego se centrifuga en una centrfuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del cogulo, generalmente
por centrifugacin, se combina y mezcla en un recipiente de combinacin, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a
menos que se esterilice inmediatamente por filtracin. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y realizar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recoleccin de muestras y las pruebas de control de calidad durante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
COMBINACIN DE SUEROS ANTES DEL FILTRADO

Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero
bruto de muchos animales para crear lotes de tamao comercial. Despus de descongelar el suero bruto y antes de la filtra-
USP 38
cin, el suero se combina en un recipiente de combinacin y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combinaciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales
de la manada. Los lotes de FBS pueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de combinacin de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelacin del suero, la
combinacin previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
FILTRACIN
El suero combinado se mezcla y se pasa aspticamente a travs de filtros con un tamao de poro de 0,2 mm o menor, dependiendo de la aplicacin prevista. Deben validarse los procesos de filtracin. Se ha demostrado que la filtracin triple usando
filtros con un tamao de poro de 0,1 mm resulta en un alto grado de eliminacin de micoplasmas. Aunque la filtracin puede
eliminar algunos virus de gran tamao y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por completo mediante esta tcnica. Adems, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopata espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en ingls). Despus de la filtracin, los fabricantes de suero llenan envases estriles con el
suero filtrado mediante procesamiento asptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de filtracin y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recoleccin de muestras de
suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
RADIACIN
TRATAMIENTO ULTRAVIOLETA (UV)

Los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben validar el proceso para demostrar su eficacia. Adems, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener
un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada
aplicacin, como deben hacerlo tambin los usuarios finales del suero.
INACTIVACIN CON CALOR

La inactivacin con calor implica elevar la temperatura del suero a >56 durante al menos 30 minutos para inactivar el complemento. La inactivacin con calor tambin puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto
adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones especficas. En comparacin con la radiacin, la inactivacin con calor proporciona una garanta de inactivacin significativamente menor.
ESTUDIOS DE DEPURACIN VIRAL

El captulo general Evaluacin de la Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal 1050 y otros documentos reglamentarios proporcionan guas sobre la realizacin de estudios de depuracin viral
que ayudan a validar los procesos de eliminacin/inactivacin. Los fabricantes de suero deben tambin realizar estudios formales con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con
virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.
TRATAMIENTO CON CARBN

Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbn/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.
Captulos
El tratamiento del suero por radiacin gamma es muy comn y representa uno de los mtodos ms efectivos de inactivacin
viral. La dosis mnima usada con ms frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos pases especifican requerimientos de dosis
mayores (>30 kGy) para suero importado. La radiacin gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios
finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiacin gamma no afecte negativamente sus aplicaciones especficas. La radiacin puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis.
La validacin de la radiacin gama presenta dos aspectos: (1) la administracin de la dosis en una configuracin de carga
definida y (2) la capacidad de inactivacin. Los parmetros crticos del proceso de radiacin incluyen la temperatura del producto (suero), el tamao y la configuracin del envasado, la distribucin de dosmetros y la dosis mnima/mxima definida de
radiacin recibida. Los dosmetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicacin de
radiacin. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, stas deben estar sustentadas mediante estudios de
inactivacin viral bien diseados por el mismo fabricante.
USP 38
DILISIS
Algunos fabricantes utilizan dilisis o diafiltracin para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.
LIMPIEZA Y ESTERILIDAD DEL EQUIPO

Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricacin de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para prevenir la contaminacin cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de
limpieza para la eliminacin e inactivacin de agentes de inters. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles
de proceso que verifiquen de manera rutinaria los ciclos de limpieza. La esterilizacin por vapor en el sitio (sterilization-inplace) es una tcnica de esterilizacin comn y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnologa deben validar los
ciclos de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pueden, alternativamente, usar sistemas desechables estriles que no requieren de validacin de limpieza.
Control de Calidad
Captulos
RASTREABILIDAD
Recoleccin en Mataderos
Los materiales recolectados en EE.UU. deben obtenerse de instalaciones registradas en el Departamento de Agricultura de
EE.UU. (USDA, por sus siglas en ingls). Los fabricantes de suero deben conservar documentacin que permita rastrear un
sublote de suero especfico hasta el matadero donde se recolect. Los mataderos mantienen registros del origen del animal. La
prctica industrial general es conservar esta informacin como parte del Registro Maestro del Dispositivo (DMR, por sus siglas
en ingls). Los requisitos generales de conservacin de registros en mataderos autorizados por el USDA se citan en el Ttulo 9
del Cdigo de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en ingls) 320.
Los materiales recolectados en pases aprobados por el USDA para la importacin de productos bovinos a EE.UU. deben
cumplir con los requisitos de la autoridad competente del pas de origen. Adems, los fabricantes de suero deben conservar
registros de anlisis de seguridad requeridos por el USDA para materiales importados (si fuera requerido) como parte de su
Registro Histrico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en ingls).
Los fabricantes de suero deben consultar el Ttulo 9 del CFR 309 y el Ttulo 9 del CFR 310 con respecto a los requisitos de
inspeccin de animales para diversas enfermedades antes y despus del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos
para materiales recolectados fuera de EE.UU.
Recoleccin en Manadas Donantes
Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de animales donantes en la que se recolect la
sangre de los animales donantes. En la mayora de los casos, los fabricantes de suero identifican de manera individual a los
animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamiento, lo que permite rastrear la recoleccin sangunea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con regularidad por un veterinario autorizado o individuo designado bajo la gua de un veterinario, quienes deben certificar que los animales estn libres de enfermedades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Ttulo 9 del CFR 309.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PRODUCTO

El suero debe almacenarse en estado de congelacin a una temperatura de 10 o menor. El suero se congela tan rpido
como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los
fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La
fecha de caducidad tpica para el suero bovino es de 5 aos a partir de la fecha de filtracin y envasado. El uso de cualquier
tipo de suero bovino despus de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicacin y el usuario del suero debe establecer la aptitud continua del producto para su uso.
Etiquetado
Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente informacin: descripcin del producto, nmero de lote,
condiciones de almacenamiento, nombre y direccin del fabricante y una declaracin que indique el uso previsto. Los materiales destinados para propsitos de investigacin estn exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Ttulo 21 del CFR 801).
Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Anlisis (COA, por sus siglas en ingls) especfico del
lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la seccin siguiente.
USP 38
Certificacin/Documentacin
CERTIFICADO DE ANLISIS
El COA debe proveer informacin sobre un lote de suero especfico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las
mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberacin del fabricante del suero), as como los identificadores crticos del
etiquetado tales como nmero de lote, nmero de catlogo, descripcin del tipo de suero bovino, pas de origen y fecha de
fabricacin o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del
pas de origen.
CERTIFICADO DE ORIGEN Y CERTIFICADO DEL ESTADO DE SALUD DEL ANIMAL

El Certificado de Origen establece el pas en el que se recolect la sangre bovina, as como la certificacin veterinaria de la
salud de los animales antes y despus de la recoleccin (Ttulo 9 del CFR 327.4).
DOCUMENTOS DE IMPORTACIN/EXPORTACIN
Los documentos de importacin/exportacin incluyen una certificacin formal del estado de las enfermedades animales en
el pas de origen y las disposiciones de certificacin negociadas/acordadas, las cuales varan de pas a pas. Cada pas define sus
requisitos de importacin/exportacin a fin de controlar la introduccin de enfermedades animales exticas y su impacto econmico, as como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigacin, diagnstico y/o beneficios teraputicos).
Los informes de produccin son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identificable y rastreable, mtodos de produccin (centrifugacin o filtracin) usados en la fabricacin, limpieza de equipo e instalaciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de
Origen o registros de produccin de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se us para crear el suero.
Cuando se usa suero como una materia prima para fabricacin, la documentacin del proceso tambin ayuda a demostrar la
fabricacin controlada del suero bovino.
EVALUACIN DE RIESGO DE BSE

A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en ingls) en el suero
bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU. e internacionales han desarrollado guas para ayudar a manejar y reducir an
ms los riesgos potenciales de transmisin. Ante la ausencia de mtodos de prueba apropiados para detectar al agente infeccioso en fluidos como la sangre, la recomendacin acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de
evaluacin de riesgos. Esta seccin del captulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los mtodos de deteccin vigentes; adems seala estrategias de evaluacin de riesgos y de reduccin de riesgos para prevenir potencialmente la
transmisin de la enfermedad a travs del uso de suero en la fabricacin de productos medicinales.
Descripcin de la Enfermedad
Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneracin del cerebro, relacionada con severos signos y sntomas neurolgicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE, las
cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pblica estn preocupados por el riesgo de infeccin de TSE,
incluida la posibilidad de transmisin de TSE por el uso de productos teraputicos que se fabrican usando suero bovino. Se han
encontrado titulos bajos en el fluido cerebroespinal, pulmn, tejido linftico, bazo, rin, hgado e leon del ganado bovino
infectado con BSE. Los estudios han demostrado que la transfusin sangunea a partir de una oveja infectada con BSE o prurito
lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infeccin. Aunque
siempre est presente el riesgo de contaminacin cruzada, a la fecha, ningn estudio ha demostrado que la enfermedad puede transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE. Los embriones de ganado bovino afectado por BSE no han
transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bovino afectado por BSE han sobrevivido por hasta 7 aos, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras
no afectadas y de sus cras no revelaron encefalopata espongiforme.
Estrategias de Deteccin
Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a
cabo la deteccin antemortem en animales asintomticos, aunque se encuentran en desarrollo mtodos analticos para la de-
Captulos
INFORMES DE PRODUCCIN
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teccin y cuantificacin en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clsica de diagnstico para TSE es el examen histolgico postmortem de tejido cerebral para confirmar la caracterstica degeneracin vacuolar. Otras opciones de anlisis incluyen pruebas inmunohistoqumicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformacin anormal especfica
para la enfermedad de la protena prinica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoqumicas como
transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con titulos altos o moderadamente altos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histolgico (68 horas vs. semanas, respectivamente) y
se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de stas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado
la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amgdalas o de la membrana nictitante
de animales infectados. Las pruebas inmunoqumicas requieren de una extensa recoleccin y preparacin de muestras y pueden ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
estrategias de diagnstico deben considerar la sensibilidad del anlisis en ciertos tejidos, as como la capacidad de la prueba
para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clnicos de enfermedad. Los resultados negativos no
aseguran la ausencia de infectividad. La deteccin de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales experimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodologa de deteccin de baja infectividad puede tomar desde meses hasta aos para arrojar un resultado positivo.
Captulos
Estrategias de Evaluacin y Reduccin de Riesgos

Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reduccin de riesgos para eliminar el peligro de contaminacin cruzada de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtencin apropiada de artculos de origen animal y el uso de prcticas
que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisin de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado
de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluacin de riesgos relacionada con su estrategia de obtencin
del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicacin, y deben realizar auditoras a los proveedores para asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados.
ORIGEN Y EDAD DE LOS ANIMALES

Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificacin del suero bovino, segn se describi previamente en las secciones Recoleccin y Procesamiento del Suero y Control de Calidad. Adems de la
rastreabilidad, la seleccin cuidadosa de materiales de origen es el criterio ms importante para la seguridad de los productos
medicinales. La certificacin de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta
informacin en sus archivos. Las recomendaciones de la Administracin de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA, por sus
siglas en ingls) prohben el uso en productos regulados por la FDA (con excepcin de la gelatina) de cualquier material bovino originario de pases con casos reportados de BSE autctona. La regla vigente propuesta califica al FBS como una fuente
improbable de material infeccioso de BSE, puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisin de BSE de la vaca al ternero es poco probable. La regla propuesta indica adems que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales
derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obtenido mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminacin con materiales de riesgo especificados. Para productos
biolgicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biolgicos Veterinarios del USDA
(USDA's Center for Veterinary Biologics o CVB) indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de pases sin o
con un riesgo bajo de BSE, segn lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU. y el Ttulo 9
del CFR 94.18.
Las fuentes de materiales ms satisfactorias provienen de pases con las siguientes caractersticas:
Sin casos reportados de BSE autctona
Notificacin obligatoria de pruebas positivas
Verificacin obligatoria clnica y en el laboratorio de casos sospechosos
Prohibicin de uso de harina de carne y huesos que contengan protenas de animales rumiantes como fuente alimentacin de animales rumiantes
Sin importacin de ganado bovino de pases donde se haya presentado una alta incidencia de BSE
Sin importacin de progenie de hembras afectadas
La infectividad de la BSE puede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de
bajo riesgo de transmisin de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras reproductoras menores de una edad mxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la
hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementacin de la prohibicin alimentaria en el pas de origen y
el periodo de incubacin de BSE a fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibicin
alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son especficas del lote, por lo que las auditoras
del proveedor de materia prima deben incluir una revisin de los registros.
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PROCESO DE PRODUCCIN
ANLISIS Y CONTROL DE AGENTES ADVENTICIOS

Introduccin
Los procedimientos de anlisis rigurosos, las guas estrictas de procesamiento y produccin, y las evaluaciones de riesgos
apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta seccin analiza pruebas especficas que
pueden detectar y controlar agentes adventicios.
Anlisis de Agentes Adventicios

Los anlisis de agentes adventicios requeridos para la evaluacin de siembras maestras, clulas maestras y productos brutos y
finales se describen en el Ttulo 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluacin de Productos
Medicinales (EMEA, por sus siglas en ingls) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los mtodos de anlisis sealados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos
mtodos de anlisis cumplen con los requisitos de la mayora de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero
deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El anlisis se realiza despus de la filtracin pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus.
La filtracin con filtros con un tamao de poro de 100 nm (0,1 mm) es un mtodo aceptado de eliminacin de micoplasmas,
mientras que la radiacin gamma (> 25 kGy cuando est congelado) y los tratamientos qumicos (p.ej. con betapropiolactona)
son mtodos aceptados de inactivacin de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramientas en las instalaciones de produccin y anlisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas
aplicaciones. Adems, los tratamientos no aseguran la eliminacin ni la inactivacin total de virus, pero pueden reducir significativamente el riesgo de actividad viral. La serie de anlisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovino generalmente incluye lo siguiente:
Anlisis de esterilidad bacteriana y fngica, segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 113.26
Anlisis de micoplasmas segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 113.28
Anlisis viral segn se describe en el Ttulo 9 del CFR 113.53
Los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad 71 confirman la ausencia de infeccin bacteriana y fngica. En lo que
respecta a virus, nicamente el cultivo usando clulas sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicacin viral. Aquellos que usan suero para investigacin o produccin deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios
de una manera que sea congruente con la aplicacin prevista del producto, teniendo en cuenta que el anlisis nicamente
indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los lmites de los procedimientos de anlisis usados.
Captulos
El usuario final debe contar con sistemas de fabricacin para monitorear el proceso de produccin y para delinear la partida
(definicin de partida, separacin de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminacin cruzada potencial con
material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la
mayora de los procedimientos de inactivacin, la obtencin controlada de materiales es el criterio ms importante para lograr
una seguridad aceptable del producto.
Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que terica o demostrativamente eliminen o inactiven
agentes durante la fabricacin del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre mtodos de eliminacin
e inactivacin para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminacin o inactivacin de agentes de TSE. Los fabricantes deben disear procesos de produccin usando mtodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inactivar o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposicin prolongada de tejidos a calor hmedo alto y pH elevado inactiva al
agente de BSE. No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extraccin de muchos otros tipos de artculos bovinos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destruccin del material. Los procedimientos convencionales qumicos y bioqumicos de extraccin y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Tcnicas
similares pueden ser efectivas para otros artculos bovinos. La investigacin adicional ayudar a desarrollar una comprensin de
la metodologa ms apropiada para los estudios de validacin. Las cuestiones a considerar durante la validacin de un proceso
para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente:
La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situacin natural
Diseo del estudio (incluyendo metodologas de reduccin de escala de los procesos)
Mtodo para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) despus de la contaminacin intencional y despus del tratamiento
Caracterizacin y estandarizacin de materiales de referencia para la contaminacin intencional
Tratamiento y anlisis de datos (ver Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111)
Debido a que ningn estudio ha validado con xito mtodos analticos para la deteccin de pequeas cantidades del agente
de TSE, los estudios de validacin para depuracin de TSE por lo general emplean la inyeccin intracraneal de material en proceso en roedores para la amplificacin y deteccin de infectividad residual potencial.
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Anlisis de Micoplasmas
Captulos
La contaminacin con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el
suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminacin cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contaminantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que
no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (>107 unidades formadoras de colonias/mL);
no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo;
no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilizacin individuales, aunque se puede lograr la eliminacin
a travs de una serie de tres filtros de 0,1 mm;
los antibiticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y
provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
El captulo Pruebas para Micoplasmas 63 describe la deteccin clsica de micoplasmas.
Adems de estos mtodos, los procedimientos de deteccin ms recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls). El captulo Tcnicas Basadas en cidos NucleicosAmplificacin
1127 describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una actividad enzimtica especfica de molicutes que convierte el difosfato de adenosina a trifosfato de adenosina mediante una reaccin de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequvocos y semicuantitativos. Los mtodos de PCR son rpidos y sensibles y
su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupacin en lo
que respecta a laboratorios de servicios de anlisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmticos
no infecciosos.
Anlisis Viral
Los procedimientos de anlisis viral para productos de suero se citan en el Ttulo 9 del CFR 113.52 y en el Ttulo 9 del CFR
113.53. Adems, existen otros documentos que pueden incluir anlisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/
CVMP/743/00-Rev.2 del Comit para Productos Medicinales Veterinarios (Committee for Veterinary Medicinal Products o
CVMP) Gua Revisada de Requisitos y Controles Aplicados al Suero Bovino Usado en la Produccin de Productos Medicinales Veterinarios Inmunolgicos (Revised Guideline on Requirements and Controls Applied to Bovine Serum Used in the Production of Immunological Veterinary Medicinal Products) y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comit para Productos Medicinales de Patente (Committee
for Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guas sobre el Uso de Suero Bovino en la Fabricacin de Productos Medicinales Biolgicos de Uso Humanos (Note for Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Products). Los fabricantes de suero deben realizar anlisis de virus que cumplan con esta reglamentacin, usando por lo menos
dos lneas de clulas detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el
cultivo de clulas detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21
das. Las clulas se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 das posteriores a la
inoculacin. Una vez terminado el ltimo subcultivo (despus de un total de al menos 21 das de incubacin), las clulas se
examinan para detectar signos generales de amplificacin del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la deteccin general de virus: examen microscpico celular para agentes citopatognicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa, tincin celular y examen microscpico para cuerpos de inclusin, y prueba de hemadsorcin para detectar agentes hemadsorbentes tales como PI-3. Adems de esta serie de anlisis y al finalizar el ltimo subcultivo (despus de un total de al
menos 21 das de incubacin), las clulas se tien con anticuerpos especficos fluorescentes contra los siguientes agentes virales especficos:
BVDV
Parvovirus bovino
Adenovirus bovino
Virus de la lengua azul
Virus respiratorio sincicial bovino
Reovirus
Virus de la rabia
Adems de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de
anlisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el anlisis completo del Ttulo 9 del CFR es suficiente y si se deben analizar otros agentes virales especficos. Ejemplos de virus especficos no
cubiertos por la gua de anlisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1), virus de la parainfluenza tipo 3 (PI-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, enterovirus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA) y peste bovina. El Apndice 2 proporciona una descripcin general
de estos virus, as como de aquellos para los que se requiere de anlisis. El anlisis de riesgos extensivo por parte del usuario
final del suero debe determinar el alcance del anlisis y las opciones para el tratamiento del suero.
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Estrategias de Evaluacin y Deteccin de Riesgos
Consideraciones de Seguridad
Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el
VDVB u otros agentes especficos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la produccin de
vacunas, en el anlisis de diagnstico, y en la preparacin de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas
de clulas maestras y de siembra. Se encuentran disponibles ms de 40 tipos de clulas para la produccin de productos biolgicos veterinarios, pero menos de 10 tipos de medios para su propagacin. Algunos investigadores han propuesto medios
exentos de suero como alternativa para propagar ciertas clulas y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos
de cultivo, lo que puede alterar las clulas y cambiar los resultados de produccin. Si se importan sueros nuevos o diferentes a
EE.UU., los usuarios finales del suero requerirn confirmacin de origen, especies y documentacin de origen de los sueros en
pases libres de FA y peste bovina.
CARACTERIZACIN DE SUERO BOVINO

Introduccin
Ante la ausencia de requisitos especficos del producto final, se debe analizar cada lote de FBS para confirmar que el suero
cumpla con los requisitos del captulo general propuesto Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
90. Esta seccin describe diversos procedimientos claves de caracterizacin para todos los dems tipos de suero. Estos procedimientos no son obligatorios pero representan guas que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales.
La tabla de la seccin Hemoglobina presenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.
Captulos
Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en
datos cientficos (p.ej. anlisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del
producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluacin de riesgos, aunque es posible incluir
otros elementos segn sea apropiado: pas de origen, regin del pas, estado de enfermedad animal del pas/regin de origen,
edad del animal, proceso de recoleccin sangunea, mtodo de aturdimiento del animal y mtodo de desangrado, proceso de
fabricacin del suero, tipo de sistema de calidad de produccin, controles de produccin durante el proceso, anlisis del producto final, inactivacin del virus, segregacin del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitacin del personal,
uso/aplicacin del suero, tipo de producto farmacutico y uso previsto.
La barrera de especies proporciona un grado de proteccin en contra de infecciones por algunos agentes etiolgicos animales. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacuticos se fabriquen nicamente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculacin
de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
Por lo tanto, un rgimen apropiado de anlisis del material del suero debe incluir exmenes para determinar la presencia de
contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar
agentes virales son un factor para establecer el rgimen de anlisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo
ms bajo de contaminacin se relaciona con materiales biolgicos que se esterilizan de manera terminal.
Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los regmenes de anlisis especficos en las especificaciones del producto, los cuales variarn dependiendo del tipo y origen del suero.
Por tanto, las pautas de deteccin descritas en este captulo nicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de
la deteccin de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre
el producto terminado o los materiales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes
tambin deben evaluar el efecto de dilucin en relacin con el lmite de deteccin del procedimiento de anlisis. La interferencia con el crecimiento o neutralizacin de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo especfico o
de ciertos factores inespecficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de
suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivacin
viral o aplicaciones de anlisis viral.
Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no
bovinos. Los fabricantes deben realizar anlisis de virus extraos en cultivos celulares apropiados (ver Mtodos de Pruebas Virolgicas 1237 para seleccionar adecuadamente las lneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera
necesario, se deben realizar estudios de seroconversin en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmune mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como mtodo de deteccin. Los estudios deben usar este procedimiento
despus de una etapa de inactivacin para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivacin viral.
Los procesos de fabricacin de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricacin
establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de produccin. Adems, la segregacin de equipo
(por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitacin de personal son elementos importantes en la evaluacin de riesgos del proceso.
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Identificacin de Especies
El suero bovino debe someterse a ensayos de identificacin tanto inter como intraespecies para confirmar la identidad de la
especie y la integridad de los productos del suero, as como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos.
El ensayo ms comnmente usado para la identificacin de la especie bovina se basa en el perfil electrofortico de protenas
especficas del suero. Con la electroforesis, las protenas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albmina,
alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas.
Otros procedimientos usados para la determinacin de especies bovinas incluyen la inmunodifusin radial (IDR) y el mtodo
de difusin doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de inmunoglobulina G en el suero. El mtodo por IDR se basa en la difusin de un antgeno desde un pocillo circular en un gel
homogneo que contiene un antisuero especfico para cada antgeno en particular. Se forma un crculo de antgeno y anticuerpo precipitados y contina creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los dimetros de los anillos son una funcin de concentracin de antgeno. El mtodo de Ouchterlony es una prueba de difusin doble en gel en la que el antgeno y el anticuerpo difunden uno hacia el otro en un medio semislido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentracin
ptima de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilndricosun pocillo de antgeno central de 8 mm de dimetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mmque posibilitan el monitoreo simultneo de
mltiples sistemas de antgenoanticuerpo y la identificacin de antgenos particulares en una preparacin. El captulo general
propuesto Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad 90 describe el procedimiento aceptado.
Captulos
Hemoglobina
La hemoglobina es una protena de subunidades mltiples que forma una unin inestable y reversible con el oxgeno en los
eritrocitos. La forma cargada de oxgeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no est cargada de oxgeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul prpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en
los eritrocitos.
El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicacin general de procesamiento rpido y cuidadoso de la sangre que se usar para el suero. Los eritrocitos son frgiles y se rompen fcilmente, liberando hemoglobina en el suero. La manipulacin brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos
en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar
dependiendo de la aplicacin prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotomtricos (ver
Espectrofotometra y Dispersin de Luz 851) segn se describe en el captulo general propuesto Suero Fetal BovinoAtributos de
Calidad y Pruebas de Funcionalidad 90.
Suero de
Ternero
Recin Nacido
FBS
Prueba de Esterilidad
No se detecta
crecimiento
No se detecta
crecimiento
Suero de Ternero
No se detecta
crecimiento
Suero
de Bovino
Donante
Suero de
Bovino
Adulto
No se detecta
crecimiento
No se detecta
crecimiento
Micoplasmas
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
Anlisis de virus
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
No se detectan
Hemoglobina (mg/dL)
<30
<30
<30
<30
<30
Protenas totales (g/dL)
3,04,5
3,56,0
5,08,0
5,08,0
6,010,0
pH
7,008,00
7,008,00
7,008,00
7,008,00
7,008,00
Osmolalidad (mOsmol/Kg)
280360
240340
240340
240340
240340
Perfil Qumico
El anlisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albmina, creatinina, bilirubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fsforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se considera un criterio para liberacin del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan anlisis de manera rutinaria sino nicamente como anlisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clnicos hospitalarios pueden llevar a cabo los anlisis.
Los niveles de estas sustancias qumicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar tambin para
evaluar la variabilidad de lote a lote.
Niveles de Endotoxinas
Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles aceptables en suero bovino varan dependiendo de la aplicacin prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia
de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en
ms de 30 actividades biolgicas, algunas de las cuales incluyen activacin de macrfagos, estimulacin mitognica y la induc-
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cin de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las
endotoxinas tambin pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activacin del complemento. Los mtodos ms comnmente
usados para la deteccin de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulacin con lisado de amebocitos de
Limulus y el mtodo cromognico cintico cuantitativo descritos en Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85. Tanto para el ensayo de coagulacin como el ensayo cromognico cintico, un ensayo vlido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado
por calor o dilucin a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un
control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por
calor o dilucin.
Osmolalidad
La prueba de osmolalidad est diseada para evaluar la concentracin de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias qumicas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, protenas y glucosa. Los fabricantes
de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del producto, usando equipos calibrados con estndares rastreables al Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (National Institute of Standards and Technology). El captulo Osmolalidad y Osmolaridad 785 describe la forma en que se determina la osmolalidad mediante disminucin del punto de congelamiento de la solucin de suero bovino. Los cientficos emplean por lo
menos dos estndares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de
agua del suero y se expresa en mOsmol/kg H2O.
Nivel de Protenas Totales
Propiedades de Crecimiento Celular

Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de lneas celulares especficas. Los
sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad,
los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las lneas celulares que usarn para este tipo de anlisis. Los usuarios finales deben disear procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promocin
del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarn del monitoreo de la promocin de crecimiento celular durante
varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfologa celular. Los fabricantes de suero usan distintos tipos de clulas, y los estudios de crecimiento y las lneas celulares usadas por los fabricantes
de suero tambin pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de crecimiento de una lnea celular especfica en respuesta a un lote especfico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en
cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promocin de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al
lote de suero para su uso previsto.
La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un mtodo preferido para analizar la capacidad de proliferacin y la supervivencia de clulas individuales en condiciones ptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la
velocidad de crecimiento dentro de la poblacin y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamao de las colonias) y la supervivencia de las clulas (nmero de las colonias). La cintica del crecimiento es otro aspecto importante en el diseo de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada lnea celular ayuda a definir condiciones de cultivo ptimas, debido a que la variacin en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre
los parmetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento.
Ante la ausencia de pruebas especficas diseadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a
las pruebas de funcionalidad descritas en el captulo general propuesto Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad 90 para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este captulo proporciona guas sobre
cmo realizar las pruebas de promocin de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.
Citotoxicidad In Vitro
Los fabricantes de suero deben usar una lnea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de
crecimiento a travs de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotxicos sobre las clulas. La eleccin de una lnea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad
deben realizarse en el lote final de suero despus de cualquier etapa de inactivacin viral o de cualquier procesamiento adicional.
Captulos
El nivel de protenas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones
del producto. El captulo Artculos Obtenidos por BiotecnologaValoracin de Protenas Totales 1057 describe dos procedimientos, los mtodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentracin de protena. El usuario final debe evaluar el
nivel aceptable de protena en el suero basndose en la aplicacin prevista.
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CONCLUSIN
Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricacin de muchos productos biolgicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero
bovino es intrnsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y
criterios de aceptacin adecuados para la introduccin de materiales en el proceso de una aplicacin particular que utilice suero. Lo anterior puede requerir el anlisis de mltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la
especificacin (ver la seccin Caracterizacin de Suero Bovino).
Los fabricantes de productos teraputicos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, as
como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Adems, es importante asegurar que el desempeo
de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricacin. El suero tambin puede interferir con la purificacin del producto
final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricacin a fin de entender el
efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por ltimo, es posible disminuir los riesgos a travs del diseo
de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilucin, separacin o inactivacin, as como el desarrollo de ensayos analticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y
en el producto teraputico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el material bovino en niveles de picogramos.
Captulos
APNDICE 1
El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricacin de productos biolgicos se encuentran
reglamentados en el contexto de Requisitos para Ingredientes de Origen Animal Usados en la Produccin de Productos Biolgicos
(Requirements for Ingredients of Animal Origin Used for the Production of Biologics), Ttulo 9 del CFR 113.53. En la actualidad,
cada fabricante de suero realiza estudios de deteccin para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercializacin internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes
pueden usar los documentos listados en este captulo como gua para la determinacin de contaminacin por agentes adventicios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y
los usuarios finales deben asegurar que el pas de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aunque en la actualidad ningn ensayo de desempeo celular demuestra la ausencia de BSE en el suero, los fabricantes de suero
deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los pases donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un
riesgo mnimo de infeccin por BSE/TSE.
Ms all de los captulos de USP pertinentes referidos en este captulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios
as como las mejores prcticas para el desarrollo, fabricacin, control de calidad y garanta de calidad del producto y los procesos.
CFR
Ttulo 9 del CFR 94.18 (CVB, 2001)
Ttulo 9 del CFR 113.46
Ttulo 9 del CFR 320
Ttulo 21 del CFR 211 Subparte E
FDA
FDA. Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). 2000. Letter to manufacturers of biological products (Carta a
los fabricantes de productos biolgicos). Disponible en http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/
ucm105877.htm
Use of materials derived from cattle in medicinal products intended for use in humans and drugs intended for use in ruminants (Uso de materiales derivados de ganado bovino en productos medicinales destinados para uso en humanos y medicamentos destinados para uso en animales rumiantes) (Regla propuesta). Federal Register (Registro Federal). 2007; 72(8):
15821619. Disponible en http://www.reginfo.gov/public/
Reglamentos Internacionales y Documentos Gua
CPMP/Biotechnology Working Party/EMEA (CPMP/BWP/EMEA). 1996. Note for guidance on virus validation studies (Nota
de orientacin sobre estudios de validacin de virus): the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses (diseo, contribucin e interpretacin de estudios para validar la inactivacin y eliminacin de
virus). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/026895en.pdf.
USP 38
CPMP/BWP/EMEA. 2003. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products (Nota de orientacin sobre el uso de suero bovino en la fabricacin de productos medicinales biolgicos para uso humano). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/179302en.pdf.
EMEA/CVMP/743/00-Rev.2 del Committee for Veterinary Medicinal Products (Comit para Productos Medicinales Veterinarios o CVMP). Revised guideline on requirements and controls applied to bovine serum used in the production of immunological veterinary medicinal products (Gua revisada sobre requisitos y controles aplicados al suero bovino usado en la produccin de
productos medicinales inmunolgicos para uso veterinario). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/vet/iwp/
074300en.pdf.
EMEA/CPMP/BWP/1793/02, del CPMP. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological
medicinal products (Nota de orientacin sobre el uso de suero bovino en la fabricacin de productos medicinales biolgicos para
uso humano). Disponible en http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/179302en.pdf.
CPMP/CVMP. Note for guidance on minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via human
and veterinary medicinal products (Nota de orientacin sobre la minimizacin del riesgo de transmisin de agentes de encefalopata espongiforme animal mediante productos medicinales para uso humano y veterinario). Disponible en http://
www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/TSE%20NFG%20410-rev2.pdf.
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Organizacin Mundial de Sanidad Animal. Cdigo sanitario para los animales
terrestres 2007. Disponible en http://www.oie.int/eng/normes/mcode/code2007/anc-en_summry.htm.
OMS. 2006. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies (Guas de la OMS
sobre la distribucin tisular de la infectividad de encefalopatas espongiformes transmisibles). http://www.who.int/bloodproducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf.
A continuacin se presenta una descripcin general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la ausencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona nicamente para propsitos de informacin general. La
lista de anlisis requeridos se proporciona en este captulo en la seccin Anlisis Viral.
AkabaneVirus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congnitas del sistema nervioso central de animales
rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabane ha sido reconocida en Australia, Israel, Japn y Corea. Se han encontrado
anticuerpos contra este virus en varios pases en el Sureste Asitico, el Medio Oriente y frica. La enfermedad afecta a los fetos
de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serolgicamente la infeccin asintomtica en caballos, bfalos y venados (aunque no en humanos ni cerdos) en reas endmicas.
Lengua AzulEnfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrpodos que afecta principalmente a animales
rumiantes domsticos y salvajes. La infeccin por el virus de la lengua azul es comn a nivel mundial pero por lo general es
subclnica o moderada. El virus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del gnero Orbivirus de la familia Reoviridae. Se
han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola rea geogrfica: p.ej., se han
reportado nicamente 5 serotipos (2, 10, 11, 13 y 17) en los EE.UU. La distribucin a nivel mundial es anloga a la distribucin
espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides, que representan el nico transmisor natural significativo del
virus.
Adenovirus bovinoSe relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirus bovino tipo 3 es el serotipo ms
comnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirus bovinos son virus de ADN que se han separado
en dos gneros: el Mastadenovirus o adenovirus mamfero y el Aviadenovirus o adenovirus aviar. El gnero Mastadenovirus comprende numerosos serotipos especficos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. Tambin se
han podido aislar adenovirus epiteliotrpicos de animales rumiantes que por lo general son clnicamente inaparentes. La enfermedad clnica est dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infeccin concurrente, el estrs, las condiciones
ambientales y las prcticas de manejo.
Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1)Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se
incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomielitis y mastitis. Las infecciones por VHB-1 estn muy extendidas en la poblacin de ganado bovino. La forma respiratoria es la
ms comn en el ganado bovino de engorde a corral.
Leucemia bovinaOncovirus exgeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del
ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfticos. La infeccin ocurre por la transferencia iatrognica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la infeccin en una manada puede ser elevada, slo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infeccin se propaga
por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado.
Reovirus bovinoVirus de cido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esfricos sin envoltura de 6080 nm
de dimetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas.
Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El
nombre del virus se deriva de su efecto citoptico caracterstico: la formacin de clulas sinciciales. Adems del ganado bovino, las ovejas y cabras tambin pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial humano (VRSH) es un patgeno respiratorio importante en infantes y nios pequeos. El VRSH comprende subtipos antignicos y la
evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antignicos de VRSB. El VRSB est distribuido por todo el mundo y es
Captulos
APNDICE 2
Captulos
USP 38
autctono de la poblacin de ganado bovino. Las infecciones por VRSB relacionadas con enfermedades respiratorias ocurren
predominantemente en ganado bovino joven para produccin de carne y leche.
Rotavirus bovinoVirin esfrico de ARNdc de 6080 nm de dimetro que carece de envoltura. Es la causa viral ms comn de diarrea en terneros y corderos.
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)Virus de ARN clasificado como Pestivirus de la familia Flaviviridae. El BDVB puede
atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresin, lo que permite el desarrollo de neumona bacteriana
secundaria. Se ha informado que el VDVB es el virus asociado con mayor frecuencia con mltiples infecciones virales del tracto
respiratorio en terneros.
Fiebre aftosa (FA)Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, bfalos y especies de
artiodctilos silvestres. En una poblacin susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad slo es fatal en raras ocasiones, excepto en animales jvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirus de la familia Picornaviridae. Se conocen siete serotipos inmunolgicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran nmero de cepas que presentan un espectro de
caractersticas antignicas.
Virus de la parainfluenza tipo 3 (PI-3)Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el PI-3 es capaz de
ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclnicas. El papel ms importante del
PI-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumona bacteriana secundaria. Las infecciones ocasionadas por PI-3 son comunes en el ganado bovino.
ParvovirusVirus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de dimetro que se
ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades.
RabiaEncefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnvoros y murcilagos, aunque puede afectar a cualquier
mamfero. La rabia es ocasionada por Lisavirus de la familia Rabdovirus. Aunque generalmente estn confinados a una especie
principal de reserva en un rea geogrfica, es comn la extensin a otras especies.
Peste bovinaMorbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampin. Las cepas
pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado
provoca una reaccin cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralizacin, aunque se han demostrado diferencias
antignicas menores. El virus es frgil y se inactiva rpidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos
en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endmica en muchos pases de Asia y frica. Histricamente, el virus se
ha distribuido en gran medida en Europa y frica, pero a la fecha no se ha establecido por s mismo en Norteamrica, Centroamrica, las Islas del Caribe, Sudamrica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades
transmisibles de la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un
potencial de propagacin muy rpida y seria, sin distincin de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias socioeconmicas o de salud pblica, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganaderos.
1027 CITOMETRA DE FLUJO

INTRODUCCIN
La citometra de flujo es un mtodo analtico que desempea un papel crtico en la evaluacin cuantitativa y cualitativa de
poblaciones de clulas en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometra de flujo se basa en su
aptitud para analizar de manera rpida y confiable mltiples atributos de clulas individuales dentro de poblaciones de clulas
heterogneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometra de flujo, validar el mtodo presenta desafosquizs ms que para otros mtodos analticosdebido a los errores y artefactos derivados de mltiples fuentes.
Aunque los mtodos de la citometra de flujo tambin se pueden usar para clasificar y aislar clulas como parte del proceso
de fabricacin para productos biolgicos derivados de clulas y tejidos, el alcance de este captulo se limita al uso de la citometra de flujo como mtodo analtico. Este captulo presenta los aspectos tcnicos del mtodo, incluyendo el instrumental, el
manejo y la tincin de muestras y el anlisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las caractersticas
tcnicas, y en consideraciones de control de calidad, garanta de calidad y normalizacin. Por ltimo, se presentan las aplicaciones actuales y principios de resolucin de problemas del ensayo. Para informacin adicional sobre los fundamentos y aspectos prcticos de la citometra de flujo, ver la edicin vigente de Practical Flow Cytometry (Citometra de Flujo Prctica) (Shapiro,
2003).
La citometra de flujo se usa ampliamente en la caracterizacin de productos derivados de clulas y tejidos, aunque la mayora de los mtodos de ensayo an no han sido normalizados. Adems de los aspectos relacionados con la complejidad tcnica,
se presentan desafos para la normalizacin de los mtodos de citometra de flujo para clases o tipos especficos de productos
en relacin con la naturaleza heterognea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricacin y usos clnicos similares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analticos, los algoritmos analticos y la automatizacin, mejoren las capacidades de la tecnologa, pero es poco probable que eliminen los desafos (p.ej., valoracin biolgica, pruebas de identificacin y otras aplicaciones).
Informacin General / 1027 Citometra de Flujo 789
USP 38
PRINCIPIOS DE OPERACIN, MTODOS, CALIDAD Y NORMALIZACIN

El proceso de citometra de flujo requiere que las clulas pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o ms lseres,
de manera que cada clula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus caractersticas tales como tamao,
granularidad y presencia de antgenos o molculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las clulas se suspenden
en un lquido en el que el movimiento se controla mediante el tamao y la configuracin de las conexiones de tubos, cmaras
y bombas especficas del instrumento de citometra de flujo. El patrn de las seales de luz producido a partir de la interaccin
de la luz lser con las clulas se captura mediante un sistema de deteccin, tambin especfico del instrumento, y las seales
detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras clulas en una muestra dada. Los
datos de una suspensin de clulas se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en
formatos numricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.
Instrumental de Citometra de Flujo

A continuacin se describen los citmetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de seales pticas, electrnicas y de fluidos.
FLUIDOS
Figura 1. Diagrama esquemtico de una celda de flujo.

PTICA
Cuando las clulas se tien con colorantes fluorescentes o con reactivos con anticuerpos fluorescentes, la luz emitida por el
lser interacciona con el colorante fluorescente para producir una emisin estimulada que presenta ondas coherentes (paralelas) de luz de longitud de onda, de fase y de polarizacin uniformes. Las seales de luz fluorescente generadas en la interaccin de la luz lser con las clulas se recolecta mediante un arreglo de detectores orientados en lnea directa y a 90 con respecto al rayo lser que ingresa. Los lseres para citmetros de flujo ms comunes disponibles comercialmente (con longitudes
de onda correspondientes) son el lser de argn azul (488 nm), el lser de diodos rojos (635 nm) y el lser violeta (405 nm).
Captulos
El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de clulas de manera que se forme una corriente de clulas individuales.
Dentro del citmetro de flujo, la suspensin de clulas individuales pasa a travs de una regin confinada en la que cada clula
es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observacin (punto de anlisis). La mayora de
los instrumentos emplean una cmara de flujo (celda de flujo) la cual, despus de que la muestra de clulas se introduce en la
punta de inyeccin de muestra, combina las clulas con fluido envolvente isotnico, usando un ensamble de boquilla cnica
diseado geomtricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura 1). La boquilla de salida de lquido por lo general
tiene un orificio de 50250 mm de dimetro, a travs del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferenciales entre la corriente de la muestra de clulas (presin ms baja) y la corriente envolvente (presin ms alta) trasladan las
clulas/partculas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la
corriente de la muestra en el punto de observacin es, por lo general, ligeramente ms grande que las clulas o partculas
contenidas en el interior. Un fabricante emplea, por lo menos, una metodologa alternativa en la que la estrategia de corriente
coaxial se reemplaza mediante el uso de microcapilares para enfocar y dirigir las clulas. Posteriormente, se mide y analiza la
seal de luz desviada o emitida por la clula.
790 1027 Citometra de Flujo / Informacin General
USP 38
PROCESAMIENTO DE SEALES ELECTRNICAS Y GENERACIN DE DATOS
Captulos
Cuando una clula pasa a travs del sistema ptico de un citmetro de flujo, los patrones de dispersin de luz o fluorescencia de cualquier fluorocromo sobre la clula o dentro de la misma son detectados por varios tipos de fotodetectores o tubos
fotomultiplicadores (PMT, por sus siglas en ingls) que transforman la informacin sobre las caractersticas de la clula en una
lectura computarizada. Cada clula analizada genera un evento en cada parmetro (dispersin frontal, dispersin lateral, fluorescencia) para el cual se mide. La Figura 2 presenta un ejemplo de una configuracin tpica de un citmetro de flujo de dos
colores. Los diferentes tipos de clulas presentan conjuntos distintivos de seales en los diversos parmetros. Por ejemplo,
cuando la clula pasa a travs de un haz de luz, a la luz deflectada en direccin frontal (por lo regular aproximadamente 20
de la direccin frontal del lser) se denomina dispersin frontal y se recolecta usando un detector conocido como canal de
dispersin frontal (FSC, por sus siglas en ingls). La cantidad de deflexin en el FSC es proporcional al tamao de la clula. La
luz deflectada a un ngulo de 90 se conoce como dispersin lateral y se recolecta mediante el canal de dispersin lateral (SSC,
por sus siglas en ingls). Este proporciona una medida de la complejidad estructural de la clula provocada por grnulos, rugosidad de la membrana o ncleo, los cuales se asocian con un SSC ms alto. La luz deflectada por otros PMT usando un filtro de
paso de banda especfico se recolecta mediante canales de fluorescencia especficos (FL1 y FL2 en la Figura 2). Los pulsos elctricos, que se originan de la luz detectada por los PMT, se procesan mediante una serie de amplificadores lineales y logartmicos. La amplificacin logartmica a menudo se usa para medir la fluorescencia de las clulas. Las Figuras 37 presentan histogramas para clulas teidas con anticuerpos conjugados con fluorocromos especficos (ver la Tabla 1). Los anticuerpos son especficos para algunos marcadores de grupos de diferenciacin (CD, por sus siglas en ingls) analizados en Inmunofenotipificacin (ver ms adelante).
Figura 2. Citmetro de flujo tpico de 2 colores con detectores para FSC, SCC y fluorescencia.
Tabla 1. Fluorocromos Usados Comnmente en Citometra de Flujo
Excitacin
Tpica
del Lser (nm)
Pico de
Emisin (nm)
Azul Cascada
375; 401
423
Azul Pacfico
403
455
480; 565
578
Fluorocromo
Ficoeritrina-R (R-PE, por sus siglas en ingls)

Conjugados PE-Cy5
480; 565; 650
670
Conjugados PE-Cy7
480; 565; 743
767
480; 565
613
Clorofil Peridina (PerCP, por sus siglas en ingls)
490
675
Fluorescena (FITC)
495
519
Aloficocianina (APC)
650
660
Conjugados APC-Cy7
650; 755
767
Rojo 613 (Rojo Texas)
La versatilidad de la citometra de flujo proviene de la capacidad de marcar con fluorescencia la superficie celular, el citoplasma o el ncleo o productos de la clula. Los marcadores fluorescentes unidos a la clula se pueden excitar usando lseres para
emitir luz con longitudes de onda especficas y, posteriormente, esta luz se detecta y analiza de la manera descrita con anterioridad. El tipo y la cantidad de fluorescencia detectada ofrece informacin cualitativa y cuantitativa sobre la clula.
Los fotodetectores convierten la luz en resultados analizables generando una pequea corriente cuyo voltaje tiene una amplitud proporcional a la cantidad de luz. El voltaje se amplifica y convierte en seales elctricas lo suficientemente grandes para
ser graficadas por la computadora de distintas maneras. De esta forma, el FSC, el SSC y los detectores fluorescentes recolectan
USP 38
la luz y la convierten en seales elctricas que pueden ser analizadas por la computadora. De esta manera, las seales derivadas de cada fotodetector se pueden medir por su intensidad (baja a alta) y clasificarse en canales. Los canales se disponen de
manera continua de tal forma que una poblacin de clulas con muchas clulas grandes tendrn una gran cantidad de eventos en los canales ms altos, y una con muchas clulas pequeas tendr una gran cantidad de evento en los canales ms bajos.
ANLISIS DE DATOS
Los datos generados por el citmetro de flujo pueden representarse de diversas maneras, de las cuales la ms bsica es el
histograma de un slo parmetro (Figura 3), en el que los eventos con intensidades de luz similares (dispersin frontal, dispersin lateral o fluorescencia) se recolectan en canales y posteriormente se grafican. Esta grfica demuestra el nmero de clulas
con caractersticas pticas similares. La Figura 4 es un ejemplo de grficas que presentan dos parmetros de medicin, una en
el eje x y una en el eje y, y el recuento de clulas como una grfica de densidad (puntos) o mapa acotado. Los parmetros
podran ser el SSC, el FSC o la fluorescencia. Estos parmetros se pueden recolectar en un canal.
Captulos
Figura 3. Histograma de un slo parmetro que presenta la expresin del antgeno celular CD3 en una mezcla de clulas.
Figura 4. Grfica de puntos de dos variables de clulas presentadas por el FSC y el SSC.
USP 38
Captulos
Una grfica de puntos presenta un punto para cada clula, mientras que las grficas de densidad y acotadas presentan un
mapa de calor o un mapa topogrfico lineal, respectivamente, basndose en el nmero relativo de clulas en cada canal. El
histograma de dispersin frontal y dispersin lateral es el mtodo ms comn para la identificacin de diferentes tipos de clulas hematopoyticas. La Figura 5 presenta una grfica acotada que es una representacin tridimensional del nmero relativo de
clulas en los diversos canales.
Figura 5. Grfica acotada de dos variables que presenta nmeros relativos de clulas presentes en cada canal que coexpresa
2 marcadores CD.
Cuando las clulas se tien con anticuerpos para epitopes diferentes que portan dos fluorocromos diferentes, los datos se
presentan como una grfica en la que los dos parmetros se grafican uno en funcin del otro. Se pueden establecer cursores
en cada eje para separar poblaciones positivas de poblaciones negativas para cada uno de los atributos. Esto resulta en una
representacin grfica de clulas que son positivas para ambos marcadores, negativas para ambos marcadores y positivas para
uno de los dos marcadores (Figura 6).
Figura 6. Presentacin esquemtica de un histograma de 2 parmetros.

El citmetro de flujo permite al usuario establecer lmites positivos y negativos para cada marcador. Los datos del citmetro
de flujo se recolectan en forma de lista, en la que cada seal electrnica de una clula respectiva se presenta en la secuencia en
la que se adquiri. Los archivos en modo de lista se pueden editar posteriormente para incluir o excluir algn evento. Una
USP 38
ventaja bsica de la citometra de flujo es la capacidad para separar los datos correspondientes a las clulas de inters del fondo y clulas muertas (p.ej., partculas o desechos no celulares) cuando se trata de dispersiones frontales y laterales y clulas de
otras poblaciones. El usuario debe decidir que seales son precisamente resultantes de la luz relacionada con las clulas, disear ventanas electrnicas y ordenar a la computadora que considere positivos nicamente los eventos que caigan dentro de
dicha ventana. Las poblaciones celulares pueden variar ampliamente dependiendo de la fuente de tejido o de clulas y las caractersticas del citmetro de flujo usado. El uso de ventanas permite al usuario determinar las seales que se deben considerar
eventos reales, por lo que este proceso es de primordial importancia para normalizar los datos de la citometra de flujo (Figura
7).
Captulos
Figura 7. Generacin de ventanas para una poblacin celular con dispersin lateral baja y dispersin frontal alta, la cual es
diferente de otras poblaciones celulares en la muestra.
USP 38
Captulos
Se puede usar una tcnica conocida como compensacin para separar superposiciones espectrales de fluorocromos con longitudes de onda similares. Para citmetros de flujo anlogos fabricados antes del final de la dcada de 1990, la compensacin
debe establecerse antes de la adquisicin de datos. En los instrumentos digitales modernos, la compensacin se puede establecer ya sea antes o despus de la adquisicin de datos. El ajuste de compensacin puede ser ms un arte que una ciencia, mientras que una gran parte de la literatura se ha enfocado en los mritos relativos de diversos mtodos para determinar la compensacin correcta para tipos celulares o condiciones experimentales. El analista debe contar con conocimientos considerables
acerca del tipo celular en anlisis a fin de evitar errores en la fenotipificacin que puedan resultar del ajuste inadecuado de
compensacin.
El nmero de eventos contados debe ser adecuado para generar confianza estadstica en los resultados. El instrumento se
puede ajustar de manera que la recoleccin de datos se lleve a cabo hasta que se haya medido cierto nmero de eventos en
un canal. Esta caracterstica permite al operador variar la duracin o el nmero de eventos de la muestra de modo tal que se
generen datos estadsticamente confiables. De esta manera, una muestra que mide un evento poco comn analizar ms clulas totales que una muestra que mide un evento comn. El uso de archivos en forma de lista, los archivos de datos electrnicos
que representan a la mayora de los datos no censurados, ofrece una ventaja debido a que estos archivos se pueden analizar
despus de la adquisicin de datos. Es necesario que los investigadores aseguren que todos los datos sin procesar, la documentacin, los protocolos, las muestras y los informes finales se archiven cuando concluye el estudio. Para asegurar la integridad y
calidad de los datos brutos recopilados, es necesario que los investigadores se apeguen a las Regulations for Good Laboratory
Practices (Reglamentaciones para Buenas Prcticas de Laboratorio o GLP) de la FDA de los EE.UU., conforme a lo prescrito en el
Ttulo 21 del CFR Parte 58, Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (Buenas Prcticas de Laboratorio para
Estudios de Laboratorio No Clnicos); y Parte 11, Electronic Records and Electronic Signatures (Registros y Firmas Electrnicos).
Citometra de Flujo: Elementos de un Procedimiento

Los mtodos de citometra de flujo incluyen la manipulacin, la preparacin y la tincin de la muestra; configuracin y operacin del instrumento; recopilacin, anlisis y almacenamiento de datos; y medidas de control de calidad asociadas.
MANIPULACIN Y TINCIN DE LAS MUESTRAS
Recoleccin, Manipulacin y Anticoagulacin de las Muestras

Con el objetivo de generar conclusiones exactas sobre el producto farmacutico derivado de clulas, el analista debe asegurar que las muestras de productos celulares sean lo ms representativas del producto completo. Las muestras de sangre, afresis y productos de suspensin celular se deben mezclar bien antes del muestreo y se debe tener cuidado de obtener volmenes
de muestra adecuados.
Las muestras celulares que contienen sangre/plasma humano deben someterse a un proceso de anticoagulacin. La heparina o los anticoagulantes basados en citrato (p.ej., Solucin Anticoagulante A de Citrato Dextrosa) se recomiendan ms que el
EDTA, ya que conservan de manera ptima las muestras que se deben manterner por ms de unas pocas horas. En lo que
respecta a muestras que deben mantenerse por plazos ms largos, pueden ser necesarios medios especficos de transporte/
almacenamiento, y se deben realizar estudios de validacin para asegurar que dichas muestras sean equivalentes a las muestras
preparadas en el momento de ser analizadas por citometra de flujo.
Las muestras destinadas a lisis de sangre entera y tincin de antgenos de superficie se deben transportar y almacenar, de
preferencia, en un mezclador de oscilacin lenta a temperatura ambiente. Las muestras fijadas o las preparaciones de clulas
vivas se deben almacenar a 4. Cuando existe la posibilidad de que la muestra sea expuesta a temperaturas extremas, pueden
ser necesarios materiales con control de temperatura (empaques para temperatura ambiente, empaques fros y aislamiento) y
se deben llevar a cabo estudios de validacin para garantizar la integridad de la muestra. Para muestras crticas o de alto valor,
pueden ser necesarios dispositivos de monitoreo de temperatura durante el transporte.
Una vez obtenidas las muestras, se deben analizar lo ms pronto posible. Resulta necesario prestar atencin especial a aquellas situaciones en las que la proliferacin celular y la deplecin metablica de fuentes de energa dentro del medio de transporte/almacenamiento puedan generar apoptosis. Cuando no se requiere un recuento exacto o cuando se sospecha la presencia de agentes infecciosos, se puede usar una solucin comercial para lisado/fijacin para aumentar el tiempo de almacenamiento y reducir el riesgo de transmisin de enfermedades. Para muestras separadas mediante centrifugacin en gradiente de
densidad, se recomienda el almacenamiento en una solucin de paraformaldehdo amortiguado (0,1% a 2,0%) despus de
que ha ocurrido el marcado de las clulas.
Procesamiento, Tincin y Fijacin de las Muestras
Los reactivos usados en el procesamiento, tincin y fijacin de las muestras deben calificarse para su uso previsto. El documento Q6B de la ICH, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptacin para Productos Biotecnolgicos/Biolgicos), proporciona pautas
adicionales. Cuando se emplean kits de reactivos, se deben seguir las instrucciones del fabricante para el procesamiento de las
muestras.
El procesamiento de las muestras que requiere centrifugacin, lavado, eliminacin o lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en
ingls), o separacin en gradiente de densidad, por lo general se usa en muchas de las aplicaciones de la citometra de flujo,
pero puede introducir errores y artefactos. Se encuentran disponibles diversas tcnicas y reactivos para la eliminacin y lisis de
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RBC. Para una calidad ptima, se recomiendan los reactivos de grado clnico [diagnsticos in vitro (IVD, por sus siglas en ingls) o especficos para analitos (ASR, por sus siglas en ingls)], aunque an pueden presentarse artefactos. La centrifugacin
en gradiente de densidad puede introducir errores relacionados con prdidas de clulas variables entre las subpoblaciones que
se estn midiendo. Estas fuentes de error y artefactos se pueden evitar analizando la sangre entera viva siempre que sea posible.
La mayora de las instrucciones para el lisado de la sangre entera recomiendan la tincin a temperatura ambiente y en la
oscuridad. Muchos mtodos incluyen una solucin fijadora diluida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internalizacin de fluorocromo. Por el contrario, las preparaciones de clulas (preparaciones de clulas en gradiente de densidad, muestras por afresis, cultivo de tejidos) se deben teir a 4, lavarse con solucin amortiguadora fra y almacenarse en fro hasta el
momento del anlisis.
La fijacin que tambin conserva los antgenos de la superficie celular se puede conseguir mediante conservantes de leucocitos comerciales o con formaldehdo o paraformaldehdo amortiguados. Existe muy poca informacin sobre la validacin de los
tiempos de almacenamiento, unin de anticuerpos o intensidad de fluorocromo. Cualquier laboratorio que considere el anlisis de partidas de muestras fijas debe validar estas tcnicas de manera cabal antes de implementarlas.
USO Y SELECCIN DE FLUOROCROMOS
La serie AlexaFluor (Sondas InVitrogen/Moleculares) o la serie Cy (GE Healthcare).
Captulos
Fluorocromos
Los fluorocromos se usan para la tincin directa de clulas o como agentes unidos a anticuerpos u otros reactivos para teir
antgenos celulares u otras estructuras. La Tabla 1 cita ejemplos de fluorocromos comunes usados en citometra de flujo y sus
longitudes de onda de excitacin y emisin. Las longitudes de onda (nm) pueden variar ligeramente, dependiendo del entorno. Tambin se encuentran disponibles sondas sintticas de fabricantes especficos.1 Los fluorocromos deben coincidir con el
intervalo espectral para los conjuntos de lseres y filtros especficos del citmetro de flujo del usuario.
Al momento de seleccionar fluorocromos para fenotipificacin multicolor, el operador debe referirse a los mtodos establecidos para el instrumento en particular. En general, los fluorocromos ms brillantes se deben usar para detectar antgenos de los
que se espera presenten una baja expresin en la superficie de la clula. El brillo de los colorantes en tndem tambin se puede reducir usando diversos fijadores, algunos de los cuales son menos problemticos que otros. Cuando se disea un procedimiento de flujo y de coloracin en tndem multicolor que no ha sido previamente validado, el operador debe consultar con el
servicio tcnico del fabricante, comparar las combinaciones de fijador y colorante en tndem y validar la combinacin de fluorocromo final para asegurar la uniformidad de muestra a muestra.
Los colorantes fluorescentes en tndem son molculas fluorescentes conjugadas duales. Cuando las dos marcas estn muy
cerca una de otra, la energa producida por el lser que excita al fluorocromo dador se transfiere al fluorocromo receptor, liberando un fotn a la longitud de onda de emisin del flor receptor (tambin conocido como transferencia de energa de resonancia de fluorescencia o FRET, por sus siglas en ingls). Por ejemplo, el PECy5 se excitar a la longitud de onda de excitacin
para PE (565 nm), transferir energa a Cy5 y emitir a la longitud de onda de emisin para Cy5 (670 nm).
Anticuerpos Marcados con Fluorescencia
La mayora de los anticuerpos disponibles comercialmente son monoclonales, pero puede haber disponibles reactivos policlonales, recomendados, para algunas aplicaciones. La calidad y especificidad de un anticuerpo puede variar ampliamente. Los
anticuerpos dirigidos a un antgeno dado pueden diferir en su especificidad de unin para diferentes epitopes de antgenos o
en la fuerza de unin al mismo epitope. De ser posible, emplear combinaciones de fluorocromoanticuerpo conjugadas de
grado IVD o ASR. La optimizacin de la concentracin de los anticuerpos para la poblacin de clulas deseada es especfica del
protocolo pero por lo general se consigue usando concentraciones de anticuerpos en aumento con un nmero fijo de clulas
para establecer el brillo ptimo entre la autofluorescencia y la extincin. La extincin es provocada por el fenmeno de prozona, que se presenta cuando un exceso de anticuerpos genera la inmunoprecipitacin y prdida de intensidad de la fluorescencia. Los manuales de mtodos tales como Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales de Inmunologa (Coligan et al.
1994), presentan detalles adicionales.
Tincin del Antgeno de la Superficie de la Clula
Las tcnicas de tincin del antgeno de la superficie varan dependiendo del tipo de muestra. Las tcnicas de lisis de sangre
entera por lo general requieren el marcado de la superficie a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1530 minutos,
seguido por lisis de eritrocitos (RBC, por sus siglas en ingls) y, si se desea, fijacin. Las tcnicas publicadas utilizan cloruro de
amonio (NH4Cl) para producir la lisis de sangre entera o muestras de mdula seguido por el lavado y posterior marcado de
anticuerpos para inmunofenotipificacin de leucemia. Las muestras de clulas mononucleares o de cultivo que se tien vivas
deben conservarse a 4 o en una solucin amortiguadora con azida para evitar el enmascaramiento (capping) y la internalizacin de anticuerpos.
Tincin Intracelular
Existen tambin diversos procedimientos normalizados para el marcado de antgenos intracelulares y citoquinas. El operador
debe consultar el protocolo del fabricante y los reactivos estandarizados para estos procedimientos. Debido a que los reactivos
permeabilizantes varan entre procedimientos y fabricantes, no se deben mezclar ni homologar reactivos. Para el marcado de
citoquinas, a menudo se requiere de una etapa de activacin y un bloqueo del Golgi para permitir que se acumule una canti-
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dad suficiente de citoquina para su deteccin. Si no se dispone de reactivos o procedimientos estandarizados por parte del
fabricante o si se requiere el anlisis de funciones especializadas, existe un gran nmero de procedimientos y tcnicas habituales en fuentes tales como Current Protocols in Immunology (Protocolos Actuales de Inmunologa) (Coligan et al., 1994).
Cuantificacin de Antgenos
Algunas aplicaciones requieren cuantificar el nmero promedio y la densidad de molculas de antgenos por clula para proveer una imagen ms completa del comportamiento inmunolgico de las clulas (p.ej. en estudios en los que los antgenos
extracelulares se expresan de forma diferencial en relacin con el estmulo de activacin). La intensidad de una preparacin de
clulas con anticuerpos marcados con fluorocromos se compara con la intensidad de un conjunto de estndares de microperlas de fluorescencia recolectados a la misma configuracin de voltaje del PMT. Los estndares se calibran en unidades de molculas de fluorescencia soluble (MESF, por sus siglas en ingls), de las que se puede determinar la relacin efectiva entre la fluorescencia y el anticuerpo (F/P), el nmero de molculas de antgeno por clula y la densidad de los sitios disponibles por clula.
Captulos
CONFIGURACIN Y OPERACIN DEL INSTRUMENTO
Compensacin
La mayora de de los fabricantes de instrumentos ofrecen software y reactivos de prueba (por lo regular perlas fluorescentes)
para configurar los PMT y la compensacin a fin de captar valores hallados con las pruebas clnicas ms comunes (p.ej., fenotipificacin de linfocitos, anlisis de CD34). Asimismo, el operador debe emplear un control biolgico tal como sangre conservada o clulas mononucleares, las cuales se encuentran disponibles comercialmente. La compensacin se debe establecer antes
de adquirir datos en instrumentos anlogos. Los PMT de los instrumentos digitales deben instalarse de manera correcta puesto
que los valores para estas configuraciones no podrn cambiarse una vez que haya sido generado el archivo en forma de lista.
Cuando se examinan eventos poco comunes y/o se usan colorantes intracelulares (p.ej., 7-amino actinomicina D [7-AAD], yoduro de propidio [PI, por sus siglas en ingls], Syto-16, entre otros.) en conjunto con anticuerpos marcados por fluorescencia,
el balance de voltaje de los PMT y la superposicin espectral debe monitorearse muy de cerca.
La autofluorescencia (AF) es fluorescencia por encima de la lnea base en ausencia de tincin con fluorocromo. Lo anterior se
presenta en algunas clulas, por lo regular en clulas mieloides (especialmente macrfagos alveolares) y en clulas primarias
cultivadas. Cuando resulte deseable o necesario, la AF puede medirse directamente en un voltaje de PMT fijo o se puede calcular a partir de un estndar de referencia de preparaciones de perlas fluorescentes (ver la seccin Cuantificacin de Antgenos
anterior). Evitar el uso de la longitud de onda de excitacin a 488 532 nm y la compensacin espectral subsiguiente de la AF
como un fluorocromo adicional.
Adquisicin de Datos y Estrategias para la Creacin de Ventanas
Siempre que sea posible, los eventos deben presentarse en modo de lista, es decir, sin la creacin de ventanas selectivas para
eventos. Las Ventanas vivas, definidas como la creacin de ventanas selectivas para eventos durante la adquisicin, se deben
emplear slo cuando el subconjunto deseado es lo suficientemente raro, y se deben analizar >2 millones de eventos totales
para contar un nmero de eventos significativo (100 o mayor) de la poblacin deseada. Los datos en forma de lista se pueden
adquirir sin compensar cuando se emplea instrumental digital, pero la mayora de los operadores indican que el anlisis es mucho menos difcil y ms rpido si los datos se encuentran en el intervalo de compensacin apropiado antes de su adquisicin.
Adems, a menudo se recomienda establecer umbrales para exclusin de desechos. Por ejemplo, si se establece un umbral de
dispersin frontal se excluyen eventos por debajo de un tamao predeterminado a fin de prevenir un archivo en forma de lista
de gran tamao, que podra formarse si se contaran estos eventos.
Uso de Controles
Las preparaciones de perlas conjugadas con fluorocromo se usan para estandarizar los PMT y la compensacin y para cuantificar la expresin de marcadores especficos. Asimismo, se recomienda ampliamente el uso de controles biolgicos. Se deben
teir las muestras de clulas con un control de isotipos y anticuerpos primarios y secundarios para evaluar la unin no especfica, a menos que el laboratorio haya determinado mediante procedimientos rigurosos de validacin que la unin no especfica
no interfiere con los resultados del ensayo.
Las poblaciones de clulas con antgenos positivos y negativos (preparadas y teidas de manera idntica a las de los artculos
de prueba) proporcionan estndares internos de aptitud del sistema. Tales poblaciones de clulas de control tambin permiten
al laboratorio evaluar variaciones entre lotes en preparaciones de anticuerpos y reactivos de tincin.
Uso de Colorantes y Ventanas para Viabilidad Celular
Los colorantes para viabilidad celular tales como 7-AAD, PI y yoduro TO-PRO se usan comnmente para determinar la proporcin de clulas muertas en un producto de terapia celular. Estos colorantes por lo general se excluyen de las clulas vivas,
pero pasan a travs de las membranas celulares de clulas muertas, tiendo su ADN. La coloracin para viabilidad de las clulas se puede combinar con la tincin intracelular o de la membrana de la superficie para evaluar subpoblaciones y la proporcin de clulas vivas y muertas teidas con un marcador determinado. La tincin para viabilidad tambin se puede usar en
conjunto con un colorante de membrana en ensayos de citotoxicidad usando citometra de flujo. Estos colorantes para viabilidad no deben confundirse con la gran cantidad de reactivos para deteccin de apoptosis disponibles en la actualidad. Las tcnicas de validacin para colorantes para viabilidad que no se usan en IVD implican la preparacin de una poblacin de clulas
muertas que se agregan diluidas en serie a un producto de clulas vivas y, posteriormente se evala la fidelidad de la mezcla
de clulas con respecto a la poblacin conocida tiendo con el colorante de inters.
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GESTIN DE DATOS Y CONSIDERACIONES ESTADSTICAS
Gestin y Almacenamiento de Datos

Los ensayos de control de calidad y los ensayos de anlisis de muestras (en forma de lista) se deben almacenar de tal manera
que se cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables al laboratorio. Lo anterior se puede lograr mediante transferencia a
discos duros, medios extrables o a un servidor tal como un sistema de informacin de laboratorio comercial. El almacenamiento de los resultados deber ser rastreable en todo momento hasta el archivo en forma de lista FCS, la configuracin del instrumento y los parmetros de control de calidad originales para la muestra en particular. Se debe crear un respaldo de datos para
evitar la prdida de archivos. Se deben establecer procedimientos de almacenamiento y respaldo para registros manuales (en
papel) que podrn ser usados para clculos y resumen de datos.
Anlisis de Datos y Consideraciones Estadsticas
Para la mayora de las aplicaciones de citometra de flujo, el anlisis de datos implica presentar los datos de los archivos en
forma de lista o de las ventanas en vivo mediante una grfica (grfica de histograma de un slo parmetro, grfica de puntos
de dos parmetros con regiones o grfica tridimensional) y medir la distribucin de eventos dentro de la grfica. El anlisis
adicional de datos dentro de poblaciones seleccionadas se puede llevar a cabo mediante ventanas para poblaciones de clulas
especficas. La descripcin de los datos por lo regular incluye el porcentaje de eventos dentro de la poblacin con una caracterstica dada (dispersin frontal, dispersin lateral, marcador fluorescente). El numerador es el nmero de eventos que presentan la caracterstica, mientras que el denominador puede ser el nmero de eventos totales contados o el nmero de eventos
contados que caen dentro de la ventana. Para grficas bidimensionales, el anlisis a menudo se lleva a cabo usando un software informtico que analiza e informa estadsticas regionales (p.ej., cuadrante). Debido a que los grupos de poblaciones de
clulas pueden cambiar de posicin en un archivo de datos con respecto al siguiente, se ha desarrollado un software para el
anlisis de grupos.
El anlisis estadstico de las aplicaciones cuantitativas de citometra de flujo difiere de las aplicaciones cualitativas en las que
una clula es considerada positiva o negativa para un marcador dado. Para una aplicacin cuantitativa tpica en la que se estima el nmero de molculas en la superficie celular, la intensidad de fluorescencia media o mediana de las clulas de la muestra
marcadas con un anticuerpo fluorescente, unido a la molcula de inters, se puede comparar con controles apropiados, incluyendo curvas estndar de clulas o partculas con cantidades conocidas de dicha molcula o anticuerpo.
Una consideracin prctica comn para el anlisis por citometra de flujo de productos de terapia celular, en especial los
productos autlogos y alognicos relacionados con el donante, es que el tamao de la muestra que se debe analizar a menudo
est restringido debido al contenido limitado de clulas del producto teraputico mismo. Esto genera desafos especiales cuando las clulas que contienen el marcador de inters se presentan como eventos poco comunes. En tales casos, antes de tomar
una decisin con respecto al tamao de la muestra, el usuario debe considerar las expectativas de deteccin de eventos poco
comunes dentro de un nmero dado de clulas totales (es decir, la prevalencia, variabilidad, y el error de muestreo) en relacin con la precisin deseada del estimado.
Captulos
Enumeracin de Clulas
El recuento celular absoluto, expresado como el nmero de clulas en un volumen de muestra dado, se puede determinar
por mtodos de plataforma doble o simple. El mtodo de plataforma doble se basa en un instrumento de recuento automatizado separado o en un mtodo de recuento manual para enumerar primero la poblacin de clulas. Despus, se determina el
porcentaje de subgrupos de inters mediante citometra de flujo, el cual se multiplica por el recuento celular y el resultado se
divide por 100. Los mtodos de plataforma simple enumeran la poblacin de clulas y del subgrupo directamente contando
las clulas de la muestra simultneamente con perlas de referencia que se han agregado al volumen de muestra en una concentracin conocida. Las perlas de referencia a menudo se ofrecen como suspensin de perlas que se agrega a la muestra. De
manera alternativa, se puede agregar un volumen dado de muestra a un nmero conocido de perlas de referencia provistas
como una matriz de fase slida en tubos de poliestireno. Estas metodologas estn sujetas a error de pipeteo, por lo que se
debe tener mucho cuidado para asegurar la exactitud y reproducibilidad.
Configuracin del Instrumento y Garanta de Calidad
Cada laboratorio debe tener un plan de calidad que defina los procedimientos operativos estndar para la configuracin y
calibracin del instrumento, as como el monitoreo, mantenimiento y limpieza regular del instrumento. Los registros del instrumento deben documentar estas actividades y a los operadores. En general, se debe seguir el programa del calidad del fabricante para el instrumento a menos que se haya establecido una alternativa adecuada.
Los parmetros del instrumento, como por ejemplo la corriente lser, el voltaje, la respuesta y los voltajes de PMT durante la
calibracin, deben ser monitoreados y registrados siempre que se utilice el instrumento. El monitoreo cuidadoso de los parmetros de configuracin del instrumento puede ser de utilidad para detectar tendencias y predecir fallas en el lser o el PMT.
Asimismo, los resultados de las pruebas de control biolgico deben monitorearse y registrarse para detectar y prevenir la deriva
del mtodo analtico.
El laboratorio tambin debe participar en un programa de anlisis de competencia que refleje su men de pruebas. Dependiendo de las necesidades, esto puede variar de un programa formal como el administrado por el College of American Pathologists (Colegio de Patlogos Estadounidenses o CAP) a compartir muestras y anlisis con otro laboratorio. Asegurar que los
operadores estn capacitados, calificados y que su competencia para realizar procedimientos especficos sea evaluada peridicamente ayudar a garantizar la uniformidad de las tcnicas y los controles.
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Calidad y Estandarizacin
La estandarizacin del uso de la citometra de flujo y de los equipos requiere de prcticas de validacin, garanta de calidad
(QA) y control de calidad (QC). Aunque la citometra de flujo se usa ampliamente tanto en la investigacin como en laboratorios clnicos, el anlisis de clulas para el desarrollo de aplicaciones de diagnstico clnico y teraputico se encuentra en crecimiento, lo que conlleva a requisitos reglamentarios ms amplios y al nfasis en la normalizacin. Por ejemplo, tradicionalmente, los operadores de citometra de flujo han empleado microesferas fluorescentes (perlas) o celdas para la configuracin del
instrumento y el QC, a menudo basndose en las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, no ha sido posible convenir
instrucciones uniformes para la aplicacin de estos estndares de control a la configuracin del instrumento y al QC.
Cuando se aplica de manera apropiada, la validacin proporciona evidencia documentada de que el proceso de de fabricacin o anlisis genera constantemente productos que cumplen con las especificaciones predeterminadas. Cuando se basa en
una comprensin cabal de los parmetros crticos del proceso, la validacin ayuda a definir la calidad del producto y a garantizar procesos de fabricacin o anlisis bien controlados y uniformes. La validacin de mtodos por citometra de flujo debe incluir la calificacin del instrumental, la validacin del mtodo analtico y la calificacin del operador.
Captulos
DOCUMENTACIN
Los procesos que cumplen con las BPL y las BPF requieren de documentacin adecuada tal como procedimientos operativos
estndar (SOP, por sus siglas en ingls) para todos los procesos del laboratorio. Los SOP deben ser actualizados peridicamente y aprobados para reflejar las prcticas vigentes. La capacitacin y la calificacin son indispensables para que el personal de
laboratorio tenga el nivel de competencia apropiado para su responsabilidad asignada. Las competencias del operador deben
ser revisadas y evaluadas de manera continua en relacin con las SOP y los reglamentos.
La integracin de procesos de calidad internos y externos es un elemento importante para la garanta de calidad. Dichos
procesos incluyen la validacin del equipo, los controles y lmites de fabricacin y las especificaciones del producto. Los procesos de validacin de procesos y equipo por lo general requieren de calificacin de la instalacin (IQ, por sus siglas en ingls), la
calificacin operativa (OQ, por sus siglas en ingls) y la calificacin del desempeo (PQ, por sus siglas en ingls).
CALIFICACIN DE EQUIPOS Y ENSAYOS
La IQ establece que el instrumento sea recibido con su diseo y especificaciones originales, y que sea instalado adecuadamente en un ambiente apropiado. Por lo general, esto significa verificar los requisitos fsicos y de la instalacin para determinar
si el citmetro de flujo se puede instalar adecuadamente. Los factores de calificacin verificados a menudo incluyen la temperatura, humedad, espacio y capacidades elctricas de las instalaciones en relacin con los requisitos del fabricante para el instrumento. Los procedimientos de IQ tambin garantizan que todos los componentes de hardware y software se instalen adecuadamente por el representante del fabricante del instrumento.
LA OQ demuestra que un instrumento funcionar de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Esto generalmente se
refiere al anlisis de niveles de componentes por parte del representante del fabricante del instrumento o usando los manuales
de validacin del fabricante que gua al usuario final para llevar a cabo esta funcin. Siempre que sea posible, estas pruebas
deben contar con especificaciones con lmites de control cuantitativos correspondientes. Este anlisis asegura que el hardware
y software del instrumento est en condiciones de operar comparndolos con las especificaciones del fabricante.
La PQ demuestra que tanto el instrumento como las pruebas tienen un desempeo conforme a las especificaciones. Para
citometra de flujo, estas especificaciones, por lo general, son determinadas por el laboratorio que realiza el anlisis por citometra de flujo y a menudo incluyen las especificaciones diarias del instrumento y de las pruebas de control de la valoracin. Para
valoraciones especficas, la PQ debe incorporar metodologa normalizada, configuracin y compensacin especfica para la
aplicacin y especificaciones de linealidad, precisin y exactitud de los resultados informados de la valoracin. En algunos citmetros de flujo digitales, puede ser necesario configurar la lnea base del instrumento a fin de determinar la configuracin ptima del instrumento para una valoracin dada.
DESEMPEO DEL INSTRUMENTO
Las especificaciones de desempeo pueden ser identificadas por el fabricante del citmetro de flujo y posiblemente no abarquen todos los requisitos especificados por el operador. Despus de identificar las especificaciones del fabricante, el laboratorio
debe establecer especificaciones que sean apropiadas para las configuraciones del hardware que se utilizarn, y se deben normalizar las especificaciones. Por ejemplo, el fabricante puede tener una especificacin base para un citmetro de flujo de doble
lser y cuatro colores. Si la especificacin base requiere un lser de diodo rojo estndar a 635 nm, pero se sustituye con un
lser de helionen enfriado con aire a 633 nm, la especificacin base deja de ser vlida para el sistema. De manera similar, si
las especificaciones se basan en el uso de un filtro de paso de banda a 660 nm pero se sustituye con un filtro de paso largo a
675 nm, la especificacin base deja de ser vlida debido a las diferencias en las caractersticas del filtro de emisin.
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MONITOREO DEL DESEMPEO
ESTNDARES
Los estndares de fluorescencia basados en microesferas para citometra de flujo han sido categorizados en base a su propsito:
Los estndares Tipo I son estndares de alineacin que se usan para realizar ajustes en la alineacin ptica del instrumento. Estos son usados generalmente por los ingenieros de servicio del campo y por los usuarios de sistemas ajustados por el
operador para verificar la alineacin de la seal ptica a fin de mejorar la sensibilidad del instrumento. Por lo regular, estas
partculas son pequeas ( 2 mm) y brillantes y proporcionan la iluminacin ms uniforme.
Los estndares Tipo II son perlas de referencia y son los estndares de perlas ms comnmente usados. Estos estndares
por lo general se usan a diario, tienen una intensidad de fluorescencia tenue a moderada y pueden obtenerse con varios
fluorforos insertados. Asimismo, se pueden usar para imitar clulas y, usando un software dedicado, determinar la sensibilidad relativa del instrumento.
Los estndares Tipo III se usan para calibrar la fluorescencia. Estos se usan para aplicaciones especializadas que requieren
la calibracin de uno o ms detectores de fluorescencia para cuantificacin de molculas de fluorocromo. La determinacin de la relacin entre los fluorforos y el anticuerpo (relacin F/P) permite el clculo subsiguiente del nmero de anticuerpos unidos por clula.
CONFIGURACIN DEL INSTRUMENTO Y GARANTA DE CALIDAD
La configuracin del instrumento y la garanta de calidad deben ser actividades independientes de la valoracin biolgica.
Muchas variables relacionadas con el instrumental pueden producir artefactos en los resultados de la valoracin biolgica. Para
garantizar la calidad instrumental se puede usar: la configuracin de la lnea base y la configuracin diaria.
Configuracin de la Lnea Base
En los instrumentos digitales ms novedosos, se recomienda establecer una configuracin de la lnea base en la configuracin del instrumento que provea una sensibilidad ptima. Esta configuracin no es un procedimiento diario, pero debe llevarse
a cabo si la configuracin del instrumento ha sido cambiada o si se ha dado servicio al instrumento. Debido a que los voltajes
del PMT y la configuracin del instrumento pueden afectar sobremanera la sensibilidad de ste ltimo, este mtodo debe usarse para generar objetividad y una sensibilidad mejorada. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea un CV menor (Figura 8). Estas configuraciones pueden ser usadas para la valoracin biolgica, aunque no aplica para todos
los casos.
Captulos
El desempeo del instrumento debe monitorearse a diario, usando perlas fluorescentes comercialmente disponibles. Los detectores de luz tales como PMT, fotodiodos (PD, por sus siglas en ingls) y fotodiodos en avalancha (APD, por sus siglas en
ingls) se usan en la mayora de los sistemas para detectar seales y sus ganancias se pueden cambiar para aumentar o disminuir la sensibilidad de los detectores. Por lo tanto, el monitoreo de las configuraciones de estos detectores es tan importante
como el monitoreo de las seales, y dichas configuraciones deben asociarse con cada archivo de datos sin procesar. La metodologa ms simple consiste en mantener diariamente la misma configuracin del detector del instrumento para medir la intensidad de las seales de fluorescencia. Esta metodologa debe implementarse para todos los parmetros que se deben validar
usando las perlas apropiadas. La sensibilidad del instrumento se basa en la capacidad del sistema de deteccin para resolver la
poblaciones de clulas o perlas con fluorescencia atenuada. Por esta razn, la medicin del coeficiente de variacin (CV) de
poblaciones de perlas con fluorescencia atenuada a moderadamente intensa es una forma de monitorear diariamente la sensibilidad de la fluorescencia. Se deben usar las recomendaciones del fabricante del instrumento para monitorear el desempeo.
La temperatura ambiente alta puede afectar el desempeo del lser y del PMT y tambin debe monitorearse a diario.
La compensacin incorrecta para la superposicin espectral puede afectar en gran medida a los datos durante el anlisis
multicolor. Se han establecido muchas metodologas para este propsito y se han usado algoritmos matemticos recientes en
lugar del circuito anlogo. Los algoritmos, tales como aqullos que emplean lgebra de matrices, permiten al operador o a los
investigadores aplicar criterios objetivos para compensar la superposicin espectral despus de haber recopilado todos los datos. En sistemas ms antiguos, la metodologa estndar ha consistido en compensar usando un ajuste de hardware de sustraccin para los datos preliminares observados, antes de que se hayan recopilado todos los datos. Esta metodologa puede ser
subjetiva y puede no generar resultados exactos como la compensacin por mtodos ms novedosos. Las perlas de captura
unidas a anticuerpos son herramientas valiosas de compensacin debido a que se pueden usar con los mismos colorantes de
anticuerpos y en tndem para todos los fluorforos que se usarn en las clulas. Se debe validar el uso de perlas en lugar de
celdas para propsitos de compensacin.
USP 38
Captulos
Figura 8. Los voltajes de PMT se pueden aumentar hasta un intervalo que provea una CV menor.
Configuracin Diaria
Se pueden usar estndares Tipo II, tales como partculas de referencia, para monitorear la intensidad de la seal, la separacin de partculas moderadamente brillantes y tenues y la resolucin de la seal. Las perlas con fluorforo homologado proporcionan una herramienta de compensacin y un medio para saber si el instrumento es capaz de detectar tales longitudes de
onda. Sin embargo, las perlas con fluorforo homologado no tienen la uniformidad de fluorescencia requerida para medir CV.
Basndose en el desempeo ptico del instrumento, los CV se miden mejor usando perlas duras teidas con brillo moderado y
tenue tales como micropartculas teidas con coumarina que se muestran fluorescentes en un intervalo espectral amplio.
Resulta fcil confundir los controles de valoracin con los controles instrumentales. Las perlas proveen una fluorescencia uniforme y constante que no es posible obtener con clulas y, por consiguiente, son tiles para monitorear el desempeo del
instrumento. Por esta razn, resulta mejor emplear una preparacin de clulas para control de proceso a fin de verificar la
compensacin y la aceptabilidad del fluorforo.
Los ajustes que se realizan al instrumento para configurarlo diariamente son, por lo general, los mismos que se usan para los
ensayos. No todas las valoraciones se pueden usar con la misma configuracin instrumental, y no siempre es necesario llevar a
cabo estas actividades para cada configuracin instrumental a menos que la validacin as lo requiera.
Las actividades diarias incluyen configurar el instrumento de manera uniforme da por da, usar una amplia variedad de perlas de intensidad tenue a moderada y monitorear parmetros clave, incluida la intensidad de fluorescencia de las perlas (absoluta y CV%), valores de PMT, temperatura, potencia y longitud de onda del lser.
CONTROL Y GARANTA DE CALIDAD DE LA VALORACIN
La configuracin instrumental para una valoracin especfica debe establecerse para demostrar que todas las poblaciones celulares pueden identificarse en grficas bivariables para fluorescencia y dispersin de luz. Es de suma importancia que las poblaciones positivas estn en escala y apropiadamente compensadas. Esto es crtico cuando las clulas se excitan con lseres
rojos, los cuales no provocan que las clulas generen autofluorescencia significativa. Por esta razn, es importante verificar que
la configuracin sea adecuada para que la poblacin positiva se encuentre en la parte superior de su escala de fluorescencia,
puesto que puede ser extremamente difcil identificar las clulas negativas.
La compensacin de fluorescencia es un ajuste crtico. Los instrumentos digitales ofrecen ajustes objetivos fuera de lnea durante el anlisis; asimismo, se encuentran disponibles instrucciones detalladas para la configuracin adecuada de la compensacin. El uso de clulas o perlas de captura teidas con un solo fluorocromo unido a anticuerpos es, por lo general, la mejor
metodologa, aunque las mezclas de perlas marcadas con fluorocromo especficas tambin pueden funcionar bien para compensar la adquisicin y el anlisis multicolor.
CONTROLES DE ISOTIPOS
Un control de isotipo es un control negativo de anticuerpo que no debe reaccionar con el antgeno de inters y que es el
mismo isotipo que el anticuerpo de prueba. La protena de mieloma o la inmunoglobulina que no tiene especificidad para las
especies que se analizan, tienen la misma clase y subclase de cadena Ig a medida que el anticuerpo de prueba se conjuga con
un fluorocromo idntico al del anticuerpo de prueba. Resulta ideal que la unin sea mnima o nula cuando se usa el control de
isotipo en paralelo con la prueba. Aunque la unin idiotpica no especfica ocurre con frecuencia, sta es independiente del
isotipo del anticuerpo. Esto muy probablemente se relaciona con otras diferencias en la qumica del anticuerpo y puede ser
especialmente problemtico con ensayos de deteccin de eventos poco comunes, tales como aquellos para ensayos de clulas
madre hematopoyticas en sangre perifrica.
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CONTROLES DE FLUORESCENCIA MENOS UNO
Los controles de fluorescencia menos uno (FMO, por sus siglas en ingls) se usan para controlar la tincin no especfica durante un ensayo multicolor. Despus de que sea establecida la compensacin, se analiza un tubo que contiene todos los anticuerpos marcados con fluorocromo, excepto por uno. Si la compensacin se ha establecido de manera apropiada, cualquier
fluorescencia positiva en el parmetro correspondiente al anticuerpo marcado con fluorocromo faltante es ocasionada por tincin no especfica y puede ser indicativa de un exceso de anticuerpos o la degradacin de los colorantes en tndem relacionados. Aunque los controles de FMO son muy tiles para estimar la sensibilidad de un detector particular en el contexto de otros
reactivos, los controles no toman en cuenta la unin especfica que puede presentarse con la adicin del anticuerpo de prueba.
El uso de los tubos de control de FMO es ms apropiado para resolver problemas o para establecer un nuevo cctel de reactivos multicolor.
CONTROLES DURANTE EL PROCESO
Los controles durante el proceso, tambin conocidos como estndares de aptitud del sistema, toman en cuenta la preparacin de la muestra y la adquisicin de datos. Estos pueden incluir clulas de control conservadas, lneas de clulas o lneas de
clulas comercialmente disponibles, tales como sangre perifrica comn. Asimismo, los controles durante el proceso se pueden
usar para analizar nuevos lotes de reactivos de anticuerpos contra lotes antiguos.
CONTROLES BIOLGICOS
APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO PARA MUESTRAS CELULARES Y PRODUCTOS DE

TERAPIA CELULAR
Se ha desarrollado una gran variedad de aplicaciones de citometra de flujo para investigacin, diagnstico clnico y monitoreo, desarrollo de frmacos y caracterizacin de productos celulares y evaluacin de su calidad (es decir, controles para la liberacin del lote). Las aplicaciones clnicas tradicionales incluyen el monitoreo de la enfermedad por VIH y el diagnstico y monitoreo de leucemia y linfoma. Los laboratorios de investigacin farmacutica y acadmica han ampliado la aplicacin de la citometra de flujo desde inmunofenotipificacin hasta ensayos celulares funcionales, as como ensayos multiplex basados en microesferas capaces de medir parmetros funcionales mltiples en clulas individuales. Los ensayos funcionales de la actualidad
incluyen ensayos que permiten el estudio directo del estado de activacin celular midiendo la produccin de citoquinas intracelulares o la secrecin de quimioquinas o citoquinas, usando un ensayo en emparedado de unin a ligandos en microesferas.
Inmunofenotipificacin
La citometra de flujo permite caracterizar subtipos de leucocitos marcando clulas con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos. El sistema de grupo de diferenciacin, CD, define anticuerpos monoclonales que reconocen antgenos
nicos en la superficie celular. Muchas aplicaciones clnicas toman ventaja de las capacidades de la citometra de flujo para
medir mltiples antgenos CD en miles de clulas individuales.
ENUMERACIN DE CD4
Al inicio de la dcada de 1980, los investigadores descubrieron que el VIH infecta las clulas T CD4 positivas y que el recuento de clulas T CD4 de la sangre perifrica del paciente es un indicador til del estado inmune. La enumeracin de CD4 se ha
convertido en la prueba de diagnstico ms comnmente usada en pacientes infectados con VIH para determinar la necesidad
de terapia antiretroviral (ARV) y para monitorear la efectividad de los frmacos ARV. Los recuentos de subconjuntos de clulas
T a menudo se expresan en trminos de clulas por microlitro y como porcentaje de linfocitos, usando un reactivo estandarizado, software y sistema de instrumentos.
LEUCEMIA Y LINFOMA
El anlisis por citometra de flujo multidimensional permite identificar poblaciones de clulas aberrantes en la mdula sea,
en el tejido linftico y en la sangre perifrica de pacientes con leucemia o linfoma. Esto se logra mediante ccteles de anticuerpos monoclonales pertinentes a la oncologa o para linajes especficos. Mediante fluorforos ptimos y configuraciones pti-
Captulos
Cuando se comparan clulas tratadas o estimuladas con clulas sin tratar o sin estimular, en ocasiones, las clulas sin tratar o
sin estimular pueden representar el control ms til para establecer un lmite positivo o negativo. No obstante, el uso de controles de isotipo tambin puede aplicarse a estas situaciones, debido a que la estimulacin puede llevar a la regulacin creciente de los receptores para Fc, lo que a su vez conlleva a un aumento en la tincin de fondo, cuya presencia puede dilucidarse
mediante un control de isotipo.
USP 38
cas/electrnicas mejoradas en instrumental de la citometra de flujo, se pueden detectar marcadores celulares adicionales para
identificar de manera ms precisa fenotipos de clulas de leucemia o linfoma y para mejorar la evaluacin del mdico sobre el
estado del paciente. Los mtodos de deteccin de eventos poco comunes han mejorado la capacidad de detectar enfermedades residuales mnimas.
CLULAS DENDRTICAS
Las clulas dendrticas (DC, por sus siglas en ingls) actan como clulas que presentan antgenos que pueden influenciar la
naturaleza y potencia de la respuesta inmune a antgenos especficos. Este hallazgo ha llevado al desarrollo de las DC como
terapias celulares para cncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Las DC tienen morfologas y fenotipificaciones diversas y se pueden derivar de diferentes tipos de clulas. Es posible segregar dos linajes de DC principales, conocidas como DC mieloides y plasmocitoides, basndose en su expresin de CD11c y CD123, respectivamente. Asimismo, la expresin de las molculas coestimulantes CD80 y CD86 se puede monitorear para determinar el estado de madurez de las DC.
Captulos
CLULAS MADRE Y PROGENITORAS
La expresin de CD34 a menudo se usa para caracterizar las clulas madre hematopoyticas (HSC, por sus siglas en ingls)
en sangre perifrica, sangre del cordn, mdula sea y preparaciones de HSC purificadas de estas fuentes. La identificacin y
enumeracin por citometra de flujo de HSC es posible mediante el uso de anticuerpos monoclonales especficos para el eptope CD34 clase III, junto con otros reactivos bien caracterizados, software de anlisis y protocolos. La combinacin de anticuerpos anti-CD45, anti-CD34 y un colorante de viabilidad tal como 7-AAD se usa ampliamente en aplicaciones clnicas. El creciente inters por el desarrollo de terapias celulares a partir de fuentes de tejido embrinico, fetal y adulto ha llevado al uso de una
amplia variedad de marcadores convencionales fenotpicos novedosos para caracterizar clulas de origen y su progenie ms
diferenciada. Se estn desarrollando ensayos por citometra de flujo como parte de bateras de ensayos para evaluar productos
celulares diferenciados derivados de fuentes de clulas madre pluripotentes. Estos ensayos ayudan a definir nmeros apropiados y tipos de poblaciones celulares deseadas, adems de que ayudan a detectar clulas no deseadas tales como clulas pluripotentes residuales que pueden ser tumorignicas en el receptor.
LEUCOCITOS
La leucoreduccin de hemoderivados es un proceso que se usa para producir hemoderivados con un contenido de leucocitos residuales de menos de 5 106 por unidad. Los datos clnicos sugieren que las reacciones febriles no hemolticas posteriores
a la transfusin se pueden evitar mediante leucodeplecin. La leucodeplecin tambin previene la aloinmunizacin a antgenos
HLA en pacientes que requerirn repetidamente transfusin de hemoderivados. La citometra de flujo se usa a menudo para
cuantificar la contaminacin leucocitaria en hemoderivados sometidos a leucodeplecin.
PLAQUETAS
La citometra de flujo es un mtodo til y rpido para diagnosticar muchos trombocitopatas primarias asociadas con defectos en glicoprotenas estructurales o funcionales (p.ej., expresin anormal de gpIIb/IIIa en trombastenia de Glanzmann o gpIb
en el sndrome de Bernard-Soulier). El uso de anaranjado de tiazol, un colorante fluorescente que se une al ARN, permite la
cuantificacin de plaquetas inmaduras (plaquetas reticuladas). El recuento de plaquetas reticuladas se puede usar para determinar la velocidad de trombopoyesis. Esta medicin puede separar las trombocitopenias inexplicables en aquellas con un aumento en la destruccin y aquellas con defectos en la produccin de plaquetas.
ERITROCITOS
Las mujeres Rhesus D negativo reciben inmunoglobulina Rh profilctica para prevenir la aloinmunizacin de eritrocitos (RBC)
Rh(D)+. Si se sospecha hemorragia fetomaterna, la sangre de la madre se analiza para determinar la presencia y cantidad de
RBC fetales, usando anticuerpos contra el antgeno Rh(D) o la hemoglobina F marcados con fluorescencia.
El recuento de reticulocitos ayuda a determinar si la mdula sea responde adecuadamente a la necesidad del cuerpo de
RBC y ayuda a clasificar diversos tipos de anemia. Los recuentos de reticulocitos se basan en la identificacin de ribosomas y
ARN residuales en los RBC inmaduros sin ncleo. La enumeracin de reticulocitos por citometra de flujo y su discriminacin de
RBC maduros emplea colorantes fluorescentes que se unen al ARN residual (p.ej., anaranjado de tiazol).
Inmunoensayos Basados en Perlas

Los ensayos por citometra de flujo basados en microesferas multiplex combinan una serie de partculas de tamao discreto
y/o intensidad de fluorescencia con pares de anticuerpos homologados que permiten la deteccin simultnea de analitos solubles mltiples en un citmetro de flujo. La capacidad del citmetro de flujo para discriminar partculas basndose en el tamao
USP 38
y color permite determinar mltiples resultados de un solo tubo o pocillo. Muchos investigadores emplean tales ensayos para
medir quimioquinas o citoquinas, kinasas, y anticuerpos anti-HLA secretados.
Ensayos de Proliferacin
INCORPORACIN DEL COLORANTE EN EL ADN
La Bromodesoxiuridina (BrdU) es un anlogo de timidina que se puede incorporar en el ADN de las clulas durante la fase S
y que se puede detectar posteriormente usando anticuerpos monoclonales marcados especficos. Mediante la aplicacin de
pulsos a un cultivo de clulas estimulado con BrdU, es posible identificar a las clulas que han proliferado (pasado a travs de
la fase S) durante el tiempo del pulso. Este ensayo se ha convertido en una alternativa til a la incorporacin de 3H-timidina
como una medicin de proliferacin debido a su radioactividad nula y a que puede identificar fenotipos de clulas que proliferan usando marcadores mltiples y citometra de flujo.
INCORPORACIN DEL COLORANTE EN PROTENAS CELULARES O EN LA MEMBRANA CELULAR
Ensayos Funcionales
EXPRESIN DE CITOQUINAS INTRACELULARES
Las tcnicas de marcado de superficies celulares e intracelulares han sido aplicadas a la identificacin de subconjuntos de
clulas con caractersticas funcionales especficas. Por ejemplo, una estimulacin breve de las clulas, tales como PBMC con
antgenos proteicos o peptdicos, puede resultar en la expresin de los marcadores y citoquinas de activacin, los cuales puede
medirse posteriormente junto con otros marcadores fenotpicos en la superficie de las clulas que responden. El uso de un inhibidor de secrecin tal como brefeldina A o monensina permite la acumulacin intracelular de citoquinas. Posteriormente, las
clulas se fijan, permeabilizan y detectan por un mtodo de citrometra de flujo. Dichos ensayos son tiles para monitorear
subpoblaciones de clulas T que responden a vacunas, agentes de enfermedades infeccionas o cncer. Las propiedades funcionales de otros tipos de clulas, incluidos monocitos, DC y clulas NK, tambin pueden monitorearse usando ensayos funcionales con estmulo apropiado.
QUINASAS
Los intermediarios fosforilados de la activacin celular se pueden identificar usando anticuerpos fosfoespecficos y citometra
de flujo. Estos reactivos son tiles para mapear mecanismos de sealizacin intracelulares, a menudo en el contexto de otros
marcadores fenotpicos de superficie celular. Por lo tanto, la citometra de flujo multicolor puede proveer una evaluacin de
clulas individuales en estados de activacin intracelular en poblaciones de clulas complejas. Estos ensayos pueden ser tiles
para la deteccin de estados de sealizacin alterados en clulas cancerosas o en la direccin terapias apropiadas basadas en
las propiedades de sealizacin de las clulas tumorales de un paciente.
APOPTOSIS
La apoptosis, comnmente descrita como muerte celular, es el proceso de muerte celular ocasionada por procesos fisiolgicos regulados. El proceso apopttico se presenta como una serie de cambios morfolgicos, bioqumicos y moleculares en la
clula y se puede iniciar mediante estmulos externos o internos. Un evento central durante la apoptosis es la activacin de
caspasas, una familia de enzimas proteolticas. Las caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas y se activan mediante
otras caspasas o molculas similares. stas forman una cascada que puede llevar a la ruptura de varias protenas citoplasmticas
o nucleares. Se ha informado que la caspasa-3 es crucial para el proceso apopttico, la cual se activa durante las etapas tempranas de la apoptosis.
Captulos
Loc colorantes para el rastreo de clulas tales como succinimidil ster de carboxifluorescena (CFSE, por sus siglas en ingls) y
PKH26 han demostrado ser tiles en la evaluacin de la proliferacin celular. El CFSE se une de manera covalente al citosol y a
las protenas de la membrana, mientras que el PKH26 se une de manera no covalente a las membranas celulares. Cuando las
clulas se dividen, el marcado con CFSE/PKH26 se divide equitativamente entre las clulas hijas, las cuales, por consiguiente,
tienen la mitad de fluorescencia que las clulas paternas. La fluorescencia de cada clula se divide adicionalmente por la mitad
con cada generacin subsiguiente. Esta propiedad hace de los ensayos con CFSE/PKH26 tiles, no solo para determinar la fraccin de clulas que han proliferado en un cultivo estimulado, sino tambin, en condiciones ideales, el nmero de generaciones
que han transcurrido. De esta manera, se pueden calcular las frecuencias precursoras de poblaciones pequeas que han proliferado durante varios das en cultivo.
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Los mtodos por citometra de flujo para detectar clulas apoptticas incluyen la medicin de la morfologa, cambios en la
estructura de la membrana, ruptura del ADN por endonucleasas y potencial de la membrana mitocondrial. Se han usado para
este propsito sustratos de caspasas naturales o artificiales o anticuerpos contra la forma activada de la enzima.
VIABILIDAD DE LA CLULA
La citometra de flujo a menudo se usa para discriminar clulas vivas de clulas muertas. El principio de exclusin con colorante de cido nucleico es la base de esta aplicacin. Un colorante de cido nucleico tal como PI o 7-AAD se agrega a las clulas en suspensin. Durante el anlisis por citometra de flujo, las clulas que muestran fluorescencia por encima del fondo se
consideran no viables debido a que no pueden excluir el colorante, el cual presenta fluorescencia cuando se une al ADN celular.
Ensayos de Inmunoglobulinas por Citometra de Flujo
Captulos
COMPATIBILIZACIN CRUZADA POR CITOMETRA DE FLUJO
Antes del transplante de rganos, se realiza la compatibilizacin cruzada por citometra de flujo (FCXM, por sus siglas en
ingls) en los receptores para detectar anticuerpos antiHLA que puedan ocasionar el rechazo. Los anticuerpos antiHLA se detectan incubando leucocitos con determinado HLA, lneas de clulas B o perlas recubiertas con antgenos HLA con la muestra
de suero, seguido por anticuerpos marcados con fluorescencia de inmunoglobulina antihumana. Los leucocitos se inmunotien para identificar clulas T y B para distinguir entre la actividad de clase I y II de anti-HLA, respectivamente. Adems, tambin ha aumentado el uso del anlisis de donaciones de sangre para detectar anticuerpos anti-HLA para identificar donantes
cuyos hemoderivados pueden presentar un mayor riesgo de ocasionar en los receptores lesiones pulmonares agudas relacionadas con la transfusin (TRALI, por sus siglas en ingls).
ANTICUERPOS NEUTRFILOS HUMANOS
Los anticuerpos contra neutrfilos humanos (anti-HNA, por sus siglas en ingls) pueden ocasionar neutropenia y se han relacionado con las TRALI. Las neutropenias autoinmunes se pueden desarrollar en pacientes con trastornos autoinmunes tales como sndrome de Felty, lupus eritematoso sistmico y tiroiditis de Hashimoto. La ausencia de anticuerpos anti-HNA estrecha el
diagnstico diferencial a causas no inmunes tales como deficiencia en la mdula sea, mielodisplasia o procesos de infiltracin
medular. La citometra de flujo puede detectar anticuerpos antineutrfilos y puede confirmar el origen de la neutropenia o las
TRALI.
ANTICUERPOS CONTRA PLAQUETAS HUMANAS
Los anticuerpos contra plaquetas humanas (anti-HPA, por sus siglas en ingls) se detectan mediante ensayos directos o indirectos de inmunoglobulinas asociadas con plaquetas basados en citometra de flujo. En la prpura trombocitopnica autoinmune, no se encuentran con tanta frecuencia anticuerpos libres circulantes (en el suero) como los anticuerpos unidos a plaquetas. En los casos de formacin de aloanticuerpos, los anticuerpos del suero se pueden detectar sin evidencia de anticuerpos
asociados con plaquetas.
RESOLUCIN DE PROBLEMAS EN ENSAYOS DE CITOMETRA DE FLUJO

Cuando se desarrolla un mtodo de citometra de flujo, se debe determinar primero el propsito final del ensayo. Para ensayos con propsitos de investigacin, puede ser difcil estandarizar las muestras de clulas, reactivos y protocolos. Los ensayos
destinados para diagnstico de pacientes o para calificar un producto celular para su liberacin antes de la administracin a un
paciente requieren de una estandarizacin ms estricta de ensayos y muestras. Los requisitos reglamentarios, el tipo y etapa de
investigacin clnica y el propsito final del ensayo determinan el nivel de rigor requerido para el ensayo.
El desarrollo de ensayos por citometra de flujo debe incluir el establecimiento y calificacin de los parmetros y lmites de
tincin, manipulacin, instrumental y anlisis. Si se asume que el mtodo ha sido desarrollado adecuadamente, que los operadores estn bien capacitados, que el instrumento se ha ajustado de manera adecuada, que se han aplicado los controles apropiados para el ensayo y el instrumental y, si fuera necesario, que se han llevado a cabo validaciones del instrumental y del
mtodo, los operadores pueden toparse con instancias en las que ser necesario resolver ciertas problemticas.
Los desafos ms comunes de la citometra de flujo son la alta fluorescencia o fondo con dispersin lateral, tasas anormales
de eventos, alta intensidad de fluorescencia y baja seal de fluorescencia. A continuacin se describen metodologas para disminuir estos problemas.
USP 38
Alto Contenido de Partculas de Fondo

La manipulacin de clulas en exceso (p.ej., demasiado vrtice), la fijacin inadecuada y la contaminacin bacteriana de las
clulas pueden incrementar las partculas de fondo. Asimismo, si el umbral frontal del instrumento se configura demasiado bajo, los desechos celulares se detectarn como eventos. La manipulacin suave de las clulas, los reactivos frescos y la configuracin adecuada del instrumental ayudan a garantizar perfiles de dispersin lateral uniformes.
Alta Fluorescencia de Fondo

La alta intensidad de la fluorescencia se puede atribuir a una concentracin de anticuerpos en exceso, al lavado inadecuado
de las clulas o al bloqueo inadecuado del receptor Fc. Adems, una ganancia inapropiadamente alta del instrumento PMT
puede resultar en un fondo elevado. La concentracin de anticuerpos y la densidad celular uniformes, el lavado y bloqueo adecuados y la configuracin apropiada del instrumento ayudarn a evitar una fluorescencia de fondo anormalmente elevada
Tasa Alta de Eventos

Las tasas anormalmente altas de eventos a menudo se atribuyen a densidades altas de clulas durante la tincin del anticuerpo o en la muestra de clulas finales. El mezclado inadecuado y la sedimentacin de la muestra de clulas puede resultar en
tasas altas de eventos celulares, al igual que el uso de ventanas inapropiadas o poco uniformes.
Tasa Baja de Eventos
Alta Intensidad de Fluorescencia

Al igual que con alta fluorescencia del fondo, una alta fluorescencia celular promedio puede resultar de una cantidad en exceso de anticuerpos marcados, del lavado de clulas inadecuado o poco uniforme o del bloqueo inadecuado. La inclusin de
detergente en la solucin amortiguadora de lavado, especialmente durante la tincin intracelular, puede ayudar a prevenir la
unin no especfica de anticuerpos.
Intensidad Dbil de Fluorescencia

Son muchos los factores que pueden generar una fluorescencia con intensidad dbil. Los parmetros del instrumento tales
como alineacin deficiente del lser, compensacin inadecuada, configuracin inapropiada, configuraciones de ganancia poco
uniformes y respuesta dbil del lser, pueden afectar negativamente la intensidad de la fluorescencia. Adems, las cuestiones
relacionadas con la fisiologa celular o la preparacin de reactivos, tales como concentracin insuficiente de anticuerpos, antgeno blanco lbil o secretado, reactivos de baja calidad o almacenados inadecuadamente (lo que resulta en decaimiento del
fluorocromo) o antgeno blanco inaccesible, pueden resultar en una seal dbil. El desarrollo adecuado de ensayos, el mantenimiento apropiado del instrumental y el cumplimiento con protocolos calificados pueden mejorar la intensidad de la seal de
fluorescencia.
La citometra de flujo permite a los investigadores analizar clulas para una gran cantidad de aplicaciones diversas. El nmero y alcance de los ensayos inmunofenotpicos y funcionales est en aumento. Es posible estudiar la presencia de protenas, as
como los procesos celulares y la deteccin de poblaciones poco comunes o anormales. El lector debe referirse a la literatura
tcnica para obtener detalles sobre la aplicacin y el mtodo.
REFERENCIAS
Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. Current Protocols in Immunology. Fourth ed. Hoboken, NJ:
John Wiley and Sons; 1994.
Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. Fourth ed. Hoboken, NJ; John Wiley and Sons; 2003.
Captulos
La aglomeracin celular, las densidades celulares finales bajas, los bloqueos en los fluidos del instrumento o el uso de ventanas inapropiadas pueden, generalmente, resultar en una deteccin anormalmente baja de eventos. La limpieza, el mantenimiento y la configuracin adecuadas del instrumento, as como los protocolos de tincin uniformes, pueden lograr resultados
uniformes con sensibilidad suficiente.
806 1030 Captulos de Valoraciones Biolgicas / Informacin General
USP 38
Captulos
1030 CAPTULOS DE VALORACIONES BIOLGICASINFORMACIN

GENERAL Y GLOSARIO
El compendio USPNF contiene cuatro captulos generales relacionados con el desarrollo, validacin y anlisis de valoraciones biolgicas: Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111, Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032, Validacin
de Valoraciones Biolgicas 1033 y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 1034. Este nuevo captulo propuesto, Captulos de Valoraciones BiolgicasInformacin General y Glosario 1030, provee informacin general y algo de material comn para los captulos 1032, 1033 y 1034, e incluye un glosario de trminos relacionados con valoraciones biolgicas.
El conjunto de captulos de la USP sobre valoraciones biolgicas se enfoca en valoraciones de potencia relativa. Estas valoraciones reconocen la variabilidad inherente en los sistemas de pruebas biolgicas (tanto en animales como en clulas) que se
puede observar entre laboratorios y de un da a otro, la cual compromete la confiabilidad de una medida absoluta de la potencia. En las valoraciones de potencia relativa, la actividad biolgica de un material de Prueba se compara con la actividad de un
Estndar en un sistema de valoracin en el que el uso de un Estndar reduce la influencia de la variabilidad inherente del sistema en la estimacin de la potencia relativa. Las valoraciones de potencia relativa tambin se enfocan en la variabilidad importante relacionada con la respuesta debida a las diferencias entre los materiales de Prueba y Estndar (si existiese dicha diferencia). Se espera que la Prueba se comporte como una dilucin o concentracin del Estndar y debe presentar la propiedad de
similitud. Aunque estn destinados para las valoraciones biolgicas de potencia relativa, los principios y prcticas desarrollados
en estos captulos pueden tener una aplicacin ms ampliapor ejemplo, en inmunoensayos y valoraciones por unin de receptorligando usadas para determinar la potencia relativa.
El captulo 1032 provee informacin para cientficos que se encuentren desarrollando una nueva valoracin biolgica. Conforme a lo mostrado en la Tabla 1, el captulo abarca una variedad de actividades realizadas durante el ciclo de vida de la valoracin, con nfasis en el desarrollo que lleva a la validacin, incluyendo la seleccin del sistema de prueba y las consideraciones
del diseo (p.ej., diseo de las placas (plate layout)). Asimismo, el captulo trata estrategias de anlisis de datos que deben
considerarse durante el desarrollo (antes de la validacin) pero que, de rutina, no se tratan posteriormente. Entre dichas estrategias est la seleccin de un esquema de ponderacin, transformacin de datos, si los hubiere, y la seleccin de un modelo
estadstico. Los detalles estadsticos que sustentan estas secciones del captulo 1032 se encuentran en el captulo 1034.
Tabla 1. Secciones Principales del captulo Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032
Seccin
1
Introduccin
1.1
1.2
Propsito y Alcance
Partes Interesadas
Aptitud de las Valoraciones Biolgicas para Su Uso Previsto
2.1
Desarrollo del Proceso
2.2
Caracterizacin del Proceso
2.3
Liberacin de Productos
2.4
Productos Intermedios del Proceso
2.5
Estabilidad
2.6
Calificacin de Reactivos
2.7
Integridad de los Productos
3.1
Valoraciones Biolgicas In Vivo
Aspectos Fundamentales de la Valoracin Biolgica

3.2
Valoraciones Biolgicas Ex Vivo
3.3
Valoraciones Biolgicas (Basadas en Clulas) In Vitro
3.4
Estndar
4.1
Datos
4.2
Suposiciones
Ttulo de la Seccin
Aspectos Estadsticos de los Elementos Fundamentales de las Valoraciones Biolgicas
4.3
Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin
4.4
Normalidad
4.5
Linealidad de los Datos de ConcentracinRespuesta
4.6
Modelos Comunes de Valoracin Biolgica
4.7
Anlisis de Aptitud
4.8
Valores Aberrantes
4.9
Efectos FIjos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas

Etapas del Proceso de Desarrollo de la Valoracin Biolgica
Informacin General / 1030 Captulos de Valoraciones Biolgicas 807
USP 38
Tabla 1. Secciones Principales del captulo Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032 (Continuacin)
Seccin
Ttulo de la Seccin
5.1
Diseo: Planificacin de la Valoracin, Distribucin por Bloques y Aleatorizacin
5.2
Desarrollo
5.3
Anlisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoracin
5.4
Validacin de la Valoracin Biolgica
5.5
Mantenimiento de Valoraciones Biolgicas
El captulo 1034 provee informacin sobre los anlisis de datos apropiados para las valoraciones biolgicas de potencia relativa comunes, incluyendo modelos de lneas paralelas, de cociente de pendientes, de curvas paralelas y cuantales. El captulo
incluye adems anlisis que sustentan la evaluacin de la aptitud del sistema y de la muestra, y mtodos para combinar resultados de valoraciones independientes (ver la Tabla 2). Este captulo es el ms avanzado estadsticamente de los tres captulos,
pero est diseado para su uso por parte de bilogos y estadsticos. El material conceptual requiere nicamente de experiencia
estadstica mnima. Las secciones sobre mtodos requieren una experiencia estadstica al nivel del captulo Datos Analticos
Interpretacin y Tratamiento 1010 y estar familiarizado con la regresin lineal.
Tabla 2. Secciones Principales del captulo Anlisis de Valoraciones Biolgicas 1034
Seccin
Ttulo de la Seccin
Introduccin
Aspectos Generales del Anlisis de los Datos de la Valoracin Biolgica
Modelos de Anlisis
Respuestas de Valoracin Cuantitativas y Cualitativas
3.2
Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas
3.3
Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
3.4
Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas
3.5
Modelos de ConcentracinRespuesta de Cociente de Pendientes
3.6
Valoraciones Dicotmicas (Cuantales)
Intervalos de Confianza
4.1
Combinacin de Resultados de Mltiples Valoraciones
4.2
Combinacin de Valoraciones Independientes (Mtodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras)
4.3
Mtodos Basados en Modelos
Fuentes Adicionales de Informacin
El propsito del captulo 1033 es dar continuacin a los captulos 1032 (desarrollo de valoraciones) y 1034 (desarrollo
de planos para el anlisis de datos). En otras palabras, el captulo 1033 supone una valoracin biolgica completamente desarrollada (incluyendo un plano para el anlisis de datos y al menos valores tentativos para los criterios de aptitud del sistema y
de la muestra, y el formato de la valoracin biolgica) y provee pautas sobre la validacin de dicha valoracin. El captulo trata
las caractersticas de validacin pertinentes a las valoraciones biolgicas de potencia relativa y provee mayores detalles sobre
los mtodos estadsticos usados en la validacin que el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225. Aunque los
principios y prcticas desarrollados en el captulo 1033 estn destinados para las valoraciones biolgicas de potencia relativa,
pueden tener una aplicacin ms amplia. El captulo enfatiza las metodologas de validacin que proveen flexibilidad para
adoptar nuevos mtodos de valoracin biolgica, nuevos medicamentos biolgicos, o ambos (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Secciones Principales del captulo Validacin de Valoraciones Biolgicas 1033
Seccin
1
Ttulo de la Seccin
Introduccin
Fundamentos de la Validacin de la Valoracin Biolgica

2.1
Protocolo de Validacin para Valoraciones Biolgicas
2.2
Documentacin de los Resultados de la Validacin de la Valoracin Biolgica
2.3
Diseo de Validacin para Valoraciones Biolgicas
2.4
Estrategias de Validacin de las Caractersticas de Desempeo de la Valoracin Biolgica
2.5
Criterios de Aceptacin Propuestos para la Validacin
2.6
Mantenimiento de la Valoracin
2.7
3
Consideraciones Estadsticas
Ejemplo de Validacin de una Valoracin Biolgica
3.1
Precisin Intermedia
3.2
Exactitud Relativa
3.3
Intervalo
Captulos
3.1
USP 38
Tabla 3. Secciones Principales del captulo Validacin de Valoraciones Biolgicas 1033 (Continuacin)
Seccin
Ttulo de la Seccin
3.4
Uso de los Resultados de la Validacin para Caracterizar una Valoracin Biolgica
3.5
Confirmacin de la Precisin Intermedia y Revalidacin
Fuentes Adicionales de Informacin
Apndice
Medidas de Localizacin y de Dispersin para Variables de Distribucin Logartmica Normal
Captulos
GLOSARIO
Este glosario corresponde a valoraciones biolgicas y provee una perspectiva farmacopeica que es congruente con el conjunto de captulos sobre valoraciones biolgicas del compendio USPNF; asimismo, se considera complementario al uso autorizado previo y ofrece un enfoque til para el contexto de las valoraciones biolgicas. En muchos casos, los trminos aqu citados
son de uso comn, aunque carezcan de documentacin, o se definen en el captulo Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
1225 y en la Pauta Q2(R1) de la International Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonizacin
o ICH), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Validacin de Procedimientos Analticos: Texto y Metodologa).1 (El captulo 1225 y la Pauta Q2(R1) de la ICH concuerdan en las definiciones.) Este Glosario pretende apegarse a estos
usos precedentes, y se proveen notas cuando exista alguna diferencia basada en el contexto de la valoracin biolgica. Las
definiciones del captulo 1225 y de la pauta Q2(R1) de la ICH se identifican, por ejemplo, mediante1225 si se tom tal
como se encuentra, o adaptado del captulo 1225 si se realiz alguna modificacin menor para su aplicacin en las valoraciones biolgicas. La mayora de las definiciones se acompaan con notas que proveen mayor detalle sobre el contexto de las
valoraciones biolgicas.
Los trminos se organizan alfabticamente dentro de cinco secciones por temas:
I. Trminos generales relacionados con las valoraciones biolgicas
II. Trminos relacionados con la realizacin de una valoracin biolgica
III. Trminos relacionados con la precisin y la exactitud
IV. Trminos relacionados con la validacin
V. Trminos relacionados con el diseo y anlisis estadstico
La Tabla 4 presenta cada trmino y la seccin del Glosario en la que se puede encontrar.
Tabla 4. Trminos listados en el Glosario
Trmino
Seccin
Trmino
Seccin
Exactitud
III
Modelo de efectos mixtos
Anlisis de varianza (ANOVA)
Generacin de modelos estadsticos
Procedimiento analtico [adaptado de Q2(R1)]
Anidado
Valoracin
Fuera de la especificacin (OOS, por sus siglas en ingls)
II
Conjunto de datos de la valoracin
Paralelismo (de las curvas de concentracin-respuesta)
Valoracin biolgica
Parcialmente cruzado
V
V
Valoracin biolgica
Estimacin puntual
Distribucin en bloques
Potencia [Ttulo 21 del CFR 600.3(s)]
Diseo completo por bloques
Precisin
III
Intervalo de confianza
Determinaciones pseudo-repetidas
Cruzado (y parcialmente cruzado)
Valor P (probabilidad de significancia)
Diseo de experimentos (DOE, por sus siglas en ingls)

[ICH Q8(R2)]
Lmite de cuantificacin (lmite inferior de cuantificacin;

adaptado del captulo 1225)
IV
Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo 1225)
IV
Efecto aleatorio
Valoraciones biolgicas directas
Error aleatorio
III
V
Prueba de equivalencia
Factor aleatorio
Tipos de errores
III
Aleatorizacin
Cuadrado medio esperado
Intervalo (adaptado del captulo 1225)
IV
Diseo experimental
Sesgo relativo
III
Unidad experimental
Potencia relativa
Factor
Repetibilidad (1225)
III
V
Diseo factorial
Determinaciones repetidas
Efecto fijo
Valor de informe
Factor fijo
Reproducibilidad 1225
III
1 Disponible en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf. Consultada el 29 de marzo de 2012.
USP 38
Tabla 4. Trminos listados en el Glosario (Continuacin)

Trmino
Seccin
Trmino
Seccin
Variabilidad del formato
III
Robustez (adaptado del captulo 1225)
Formato de la valoracin biolgica
II
Corrida
Diseo factorial fraccionado
Aptitud de la muestra
II
IV
Diseo factorial completo
Probabilidad de significancia
Modelo lineal general
Preparaciones similares
Coeficiente geomtrico de variacin
III
Similitud (algebraica)
Desviacin estndar geomtrica (GSD, por sus siglas en ingls)
III
Especificidad 1225
III
Diseo en bloques incompleto
Error estndar de estimacin
Independencia
Control estadstico del proceso
Valoraciones biolgicas indirectas
Aptitud del sistema
II
Interaccin
Error sistemtico
III
Precisin intermedia (adaptado del captulo 1225)
III
Determinaciones repetidas verdaderas
Nivel
Sesgo por truncado
III
Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo 1225)
IV
Error tipo I
Error tipo II
IV
Validacin de la valoracin
IV
Cuadrado medio
Anlisis de los componentes de la varianza
I. Trminos Generales Relacionados con las Valoraciones Biolgicas

Procedimiento analtico [adaptado de Q2(R1)]Descripcin detallada de las etapas necesarias para realizar el anlisis.
Notas: 1. El procedimiento puede incluir, entre otros, la preparacin de la muestra, el Estndar de Referencia y los reactivos;
el uso de equipo; la generacin de la curva estndar; el uso de frmulas para los clculos; etctera. 2. La Pauta de la FDA2
provee una lista de la informacin que, por lo general, se debe incluir en la descripcin de un procedimiento analtico.
ValoracinProcedimiento analtico para determinar la cantidad de uno o ms componentes o la presencia o ausencia de
uno o ms componentes.
Notas: 1. El trmino Valorar a menudo se usa como verbo sinnimo de analizar o evaluar, tal como en Voy a valorar (analizar, evaluar) la presencia de impurezas en el material. En este glosario, valoracin es un sustantivo y es sinnimo de procedimiento analtico (q.v.). 2. La frase correr la valoracin significa llevar a cabo el procedimiento analtico conforme a lo especificado. 3. En la prctica comn, valoracin y corrida (q.v.) a menudo se usan de manera intercambiable. Para propsitos de este
glosario, dichos trminos son diferentes. Adems, se puede consultar valoracin biolgica y conjunto de datos de la valoracin.
Conjunto de datos de la valoracinSe refiere al conjunto de datos usado para determinar una potencia o potencia relativa
nicas para todas las muestras incluidas en la valoracin biolgica.
Notas: 1. La definicin de un conjunto de datos de la valoracin se puede interpretar, segn sea necesario, como conjunto
mnimo. Puede ser posible determinar una potencia o potencia relativa a partir de un conjunto de datos, pero dicho proceso
podra no realizarse adecuadamente. Esta definicin no pretende dar a entender que un conjunto de datos de la valoracin es
el conjunto mnimo de datos que se pueden usar para determinar una potencia relativa. En la prctica, un conjunto de datos
de la valoracin debe incluir, por lo menos, datos suficientes para evaluar la similitud (q.v.). Tambin puede incluir datos suficientes para evaluar otras suposiciones. 2. Esta definicin tampoco implica que los conjuntos de datos de la valoracin usados
en conjunto para determinar un valor de informe (q.v.) sean necesariamente independientes el uno del otro, aunque podra
ser conveniente que lo fueran. Cuando una corrida (q.v.) consta de mltiples conjuntos de datos de la valoracin, se debe
evaluar la independencia de los conjuntos de la valoracin dentro de la corrida.
Biovaloracin, valoracin biolgica (En ingls, los trminos bioassay y biological assay se usan de manera intercambiable)
Anlisis (como el de un frmaco) para cuantificar la actividad/actividades biolgicas de uno o ms componentes mediante la
determinacin de su capacidad para producir una actividad biolgica esperada en un cultivo de clulas vivas (in vitro) o en
organismos de prueba (in vivo), la cual se expresa en trminos de unidades.
Notas: 1. Los componentes de una valoracin biolgica incluyen el procedimiento analtico, el diseo estadstico para la recoleccin de datos y el mtodo de anlisis estadstico que eventualmente genera la potencia estimada o la potencia relativa. 2.
Las valoraciones biolgicas pueden ser directas o indirectas.
Valoraciones biolgicas directasValoraciones biolgicas que miden la concentracin de una sustancia requerida para
obtener una respuesta especfica. Por ejemplo, la potencia de la digitalis se puede estimar directamente a partir de la concentracin requerida para detener el corazn de un gato. En una valoracin directa, la respuesta debe ser clara y sin ambi2 FDA. Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. 2000. Disponible en:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070489.pdf. Consultada el 27 de diciembre de 2011.
Captulos
Distribucin logartmica normal

Lmite inferior de cuantificacin (adaptado del captulo
1225)
Captulos
USP 38
gedades. La sustancia se debe administrar de tal manera que se pueda medir y registrar fcilmente la cantidad exacta
(umbral de concentracin) requerida para obtener una respuesta.
Valoraciones biolgicas indirectasValoraciones biolgicas que comparan la magnitud de las respuestas para concentraciones nominalmente iguales de las preparaciones de referencia y de prueba en lugar de las concentraciones de referencia y de prueba que son necesarias para lograr una respuesta especfica. La mayora de las valoraciones biolgicas en
los compendios USPNF son valoraciones indirectas que se basan en respuestas cuantitativas o cuantales (s/no).
Potencia [Ttulo 21 del CFR 600.3(s)]Habilidad o capacidad especfica del producto, segn se indica mediante pruebas de
laboratorio apropiadas o mediante datos clnicos adecuadamente controlados y obtenidos a travs de la administracin del
producto de la manera prevista, para provocar un resultado determinado.
Notas: 1. A diferencia de una muestra potente, una muestra impotente no tiene capacidad para producir la respuesta especfica esperada. Las muestras equipotentes producen respuestas iguales con dosis iguales. Por lo regular, la potencia se mide con
respecto a un Estndar de Referencia o preparacin a la que se le ha asignado un valor individual nico (p.ej., 100,0) para la
valoracin; ver potencia relativa. En ocasiones, se usan calificadores adicionales para indicar el estndar fsico empleado (p.ej.,
unidades internacionales). 2. Algunos productos biolgicos tienen usos mltiples y valoraciones mltiples. Para tales productos, pueden existir diferentes lotes de referencia que no presentan respuestas ordenadas uniformemente en toda una coleccin
de distintas valoraciones pertinentes. 3. [Ttulo 21 del CFR 610.10] Las pruebas para potencia consistirn en pruebas in vitro o
in vivo, o ambas, que habrn sido especficamente diseadas para cada producto para indicar su potencia de manera adecuada a fin de satisfacer la interpretacin de potencia provista por la definicin del Ttulo 21 del CFR 600.3(s).
Potencia relativaMedida que se obtiene a partir de la comparacin de una Prueba con un Estndar, basndose en la capacidad para producir la potencia esperada.
Notas: 1. Una perspectiva frecuentemente utilizada se centra en que la potencia relativa es el grado en el que se diluye o
concentra la preparacin de Prueba con respecto al Estndar. 2. La potencia relativa no tiene unidad y se proporciona en la
definicin de cualquier material de prueba, nicamente con respecto al material de referencia y a la valoracin.
Valor de informeValor que se comparar con un criterio de aceptacin.
Notas: 1. El criterio de aceptacin para la comparacin puede encontrarse en la monografa USP o haber sido establecido
por la compaa, p.ej., para la liberacin del producto. 2. El trmino valor de informe est inseparablemente vinculado con el
uso previsto de un procedimiento analtico. Las valoraciones se llevan a cabo en muestras para generar resultados que puedan usarse para evaluar algn parmetro. Las valoraciones pueden tener diferentes formatos o valores sumarios para diversos
propsitos (p.ej., liberacin del lote vs calibracin de un nuevo estndar de referencia). El valor de informe probablemente ser
diferente incluso si la mecnica misma de la prueba es idntica. La validacin es necesaria para sustentar las propiedades de
cada tipo de valor de informe. En la prctica, puede existir un documento fsico, que es el procedimiento analtico usado para
ms de una aplicacin, aunque dicho documento debe incluir por separado informacin detallada de cada aplicacin. Alternativamente, pueden existir documentos distintos para cada aplicacin. 3. Cuando la variabilidad inherente de una respuesta
biolgica, o la del logaritmo de la potencia, impide obtener con un solo conjunto de datos de la valoracin un valor lo suficientemente exacto y preciso como para cumplir con una especificacin, el formato de la valoracin puede cambiarse, segn
se requiera. El nmero de bloques o repeticiones completas requeridas depende de la exactitud y precisin inherentes de la
valoracin y del uso previsto del valor de informe. Resulta prctico mejorar la precisin de un valor de informe al informar la
potencia media geomtrica de mltiples valoraciones. El nmero de valoraciones usado se determina mediante la relacin entre la precisin requerida para el uso previsto y la precisin inherente del sistema de valoracin.
CorridaSe refiere a la realizacin del procedimiento analtico con el que se espera obtener precisin y veracidad uniformes;
generalmente, es la valoracin, es decir, el trabajo que puede llevar a cabo un solo analista en un tiempo establecido con un
conjunto determinado nico de factores de valoracin (p.ej., preparaciones estndar).
Notas: 1. La corrida no necesariamente est relacionada con el conjunto de datos de la valoracion (q.v.). El trmino corrida
es especfico para laboratorio y se relaciona con la capacidad fsica y el ambiente del laboratorio para realizar el trabajo de una
valoracin. Un ejemplo de corrida sera la valoracin simultnea de varias muestras por parte de un analista en un da de trabajo prctico. Durante el transcurso de una sola corrida, puede ser posible determinar mltiples valores de informe. Por el contrario, un solo valor de informe puede incluir datos de mltiples corridas. 2. Desde un punto de vista estadstico, una corrida es la
consecucin de los factores asociados con la precisin intermedia (q.v.). Por tanto, la variabilidad dentro de la corrida es la
repetibilidad. Se considera una buena prctica asociar las corridas con factores que representen fuentes significativas de variacin en la valoracin. Por ejemplo, si un nmero de pasajes celulares es una fuente importante de variacin en la respuesta
obtenida de la valoracin, entonces cada cambio en el nmero de pasajes celulares dar inicio a una nueva corrida. Si la varianza asociada con todos los factores que se pudieran asignar a las corridas fuera inapreciable, entonces se podra ignorar la
influencia de las corridas en el anlisis y el anlisis se podra enfocar en combinar conjuntos de datos de anlisis independientes. 3. Cuando una corrida incluye mltiples valoraciones, es necesario tomar precauciones con respecto a la independencia de
los resultados de las valoraciones. Los factores que por lo general se asocian a corridas y que pueden generar una falta de independencia incluyen preparaciones celulares, grupos de animales, analista, da, una preparacin de un material de referencia
comn y anlisis con otros datos de la misma corrida. Aunque se puede infringir un estricto sentido de independencia debido
a que los conjuntos de valoraciones dentro de una corrida comparten ciertos elementos, el grado en el que se compromete la
independencia puede tener una influencia insignificante sobre los valores de informe obtenidos, lo cual se debe verificar y monitorear.
USP 38
Preparaciones similaresSe refiere a la propiedad que indica que la Prueba y el Estndar contienen el mismo componente
efectivo, o los mismos componentes efectivos en proporciones fijas, y todos los dems componentes no tienen efecto en algn
contexto especfico de la valoracin.
Notas: 1. Contar con preparaciones similares a menudo se resume como la propiedad que indica que la Prueba se comporta
como una dilucin (o concentracin) del Estndar. 2. Las preparaciones similares son fundamentales en los mtodos para la
determinacin de la potencia relativa. El uso de preparaciones similares permite calcular, informar e interpretar una potencia
relativa. Ante la ausencia de preparaciones similares, no se puede informar ni interpretar una potencia relativa significativa. 3.
La consecuencia prctica de preparaciones similares es la similitud algebraica (q.v.). (Ver tambin Paralelismo, seccin V.)
Similitud (algebraica)Las curvas de concentracin-respuesta de la Prueba y el Estndar se relacionan algebraicamente de
manera constante con preparaciones similares.
Notas: 1. Entre los ejemplos de similitud se incluyen el paralelismo (q.v.) de las curvas de concentracinrespuesta y la igualdad de las ordenadas al origen en los modelos de cociente de pendientes. 2. El no poder demostrar estadsticamente la falta
de similitud entre una Referencia y una Prueba no se considera una demostracin de similitud. Resulta apropiado demostrar la
similitud en un enfoque de equivalencia; ver los captulos 1032 y 1034. 3. La similitud es por lo regular un criterio de aptitud de la muestra (q.v.). No obstante, se debe tomar en cuenta que la aptitud es una condicin necesaria, pero no suficiente,
para que las preparaciones sean similares. En la prctica, ante el desconocimiento de las diferencias entre los materiales de
Prueba y Estndar, la demostracin de similitud se acepta como la demostracin de preparaciones similares.
II. Trminos Relacionados con la Realizacin de una Valoracin Biolgica
III. Trminos Relacionados con la Precisin y la Exactitud

Exactitud 1225Expresin de la proximidad entre los resultados de prueba obtenidos por el procedimiento y el valor real.
Notas: 1. La ICH y la USP ofrecen la misma definicin de exactitud. No obstante, la ISO especficamente considera que la
exactitud tiene dos componentes, el sesgo y la precisin.3 Esto significa que, para lograr la exactitud conforme a ISO, una medicin debe estar dentro de la diana (tener poco sesgo) y ser precisa. Por el contrario, la pauta Q2(R1) de la ICH indica que la
exactitud, en ocasiones, se denomina veracidad, aunque no define dicho trmino. La ISO define veracidad como la proximi3 ISO. Norma Internacional 5725-1. Accuracy (Trueness and Precision) of Measurement Methods and ResultsPart 1: General Principles and Definitions. Geneva,
Switzerland; 1994.
Captulos
Configuracin de la valoracin biolgica (tambin conocido como formato de la valoracin)Estrategia de replicacin

dentro de la corrida y entre corridas para la replicacin de los conjuntos de datos de la valoracin que se han determinado por
anlisis de varianza para sustentar el uso de las valoraciones biolgicas.
Notas: 1. Las modificaciones al formato de la valoracin biolgica pueden ocurrir a medida que se dispone de nueva informacin sobre las fuentes de variabilidad. Dichas modificaciones no incluyen cambios en el esquema de dilucin de las muestras de Prueba o del Estndar ni en la estrategia de replicacin (parte de lo que en ocasiones se denomina configuracin de la
valoracin biolgica). La configuracin de la valoracin puede incluir dimensiones anidadas tales como diseo de la placa,
mltiples placas por da, placas individuales en mltiples das, entre otros. 2. La potencia relativa geomtrica media determinada a partir del formato de la valoracin biolgica es el valor de informe, el cual se puede usar para evaluar el cumplimiento con
las especificaciones o como un componente de anlisis subsiguiente (p.ej., evaluacin de la estabilidad).
Fuera de la especificacin (OOS, por sus siglas en ingls)Se refiere a la propiedad de un valor de informe que cae fuera de
su criterio de aceptacin especificado.
Nota: El trmino fuera de la especificacin no es una propiedad de la valoracin biolgica, sino de las muestras de Prueba. El
trmino se introduce en el captulo 1033 junto con el establecimiento de los criterios de aceptacin para la validacin que
limitan el riesgo de producir resultados de prueba fuera de la especificacin debido a las caractersticas de desempeo de la
valoracin biolgica.
Aptitud de la muestraUna muestra es apta (se puede usar en la estimacin de potencia) si su curva de respuesta cumple
con los lmites sobre propiedades crticas definidas en el procedimiento de la valoracin.
Nota: Las propiedades de la curva de respuesta se deben considerar desde un punto de vista general, es decir, incluyendo
valores aberrantes y variabilidad. La ms significativa de estas propiedades para las valoraciones biolgicas es la similitud (q.v.)
con la curva de respuesta del estndar. Asimismo, todos los sistemas de valoracin tienen lmites para el intervalo de valores
sobre los que pueden informar. En el caso de muestras que no cumple con uno o ms de los criterios de aptitud de la muestra
en una valoracin biolgica, no se debe usar la estimacin de potencia obtenida de dichas muestras como un valor de informe
o como un contribuidor para un valor de informe. Para ms informacin consultar tambin el trmino sesgo por truncado en
este Glosario, as como las secciones Aptitud de la Muestra e Intervalo en el captulo general 1032.
Aptitud del sistemaUn sistema de valoracin es adecuado para su uso previsto si es capaz de proveer mediciones legtimas
conforme a lo definido en el protocolo de la valoracin.
Nota: La aptitud del sistema se puede considerar como la evaluacin de la posibilidad de que exista evidencia acerca de un
problema en el sistema de valoracin. Un ejemplo seran controles positivos y negativos cuando los valores fuera de sus intervalos normales sugieren qu sistema de valoracin no trabaja adecuadamente.
Captulos
USP 38
dad de acuerdo entre el valor promedio obtenido a partir de una serie grande de resultados de prueba y un valor de referencia
aceptado e indica que la veracidad, por lo general, se expresa en trminos de sesgo. La pauta Guidance on Bioanalytical
Method Validation del ao 2001 de la FDA4 define el trmino exactitud en trminos de la proximidad de los resultados de
prueba medios, obtenidos por el mtodo, con el valor verdadero (concentracin) del analito (nfasis agregado) y es, por lo
tanto, uniforme con el uso de la ICH. Este glosario adopta el enfoque de USP/ICH. Por tanto, exactitud se define como el acuerdo entre la media (o los resultados esperados) de una valoracin y el valor verdadero, y emplea la frase exacto y preciso para
indicar un sesgo bajo (exacto) y una variabilidad baja (preciso). 2. Se recomienda tomar precauciones considerables durante la
lectura o uso del trmino exactitud. Adems de la falta de uniformidad entre la USP/ICH y la ISO, el uso comn tambin es
poco uniforme. 3. Para propsitos de validacin de una valoracin biolgica, los trminos exactitud y sesgo han sido reemplazados con exactitud relativa y sesgo relativo.
Tipos de erroresDos fuentes de incertidumbre que afectan los resultados de una valoracin biolgica son el error sistemtico y el error aleatorio.
Un error sistemtico es aqul que se presenta repetidamente con una magnitud similar y direccin uniforme. ste introduce un sesgo en la determinacin. El diseo experimental efectivo, que incluye aleatorizacin y/o divisin en bloques,
puede reducir el error sistemtico.
Un error aleatorio es aqul cuya magnitud y direccin varan sin un patrn. El error aleatorio es una variabilidad o incertidumbre inherente de la determinacin. La conversin de error sistemtico a aleatorio, a travs del diseo experimental o
la aleatorizacin, incrementa la robustez de una valoracin biolgica y permite un anlisis comparativamente simple de
los datos de la valoracin, aunque puede requerir un tamao de muestra mayor.
Variabilidad del formatoSe refiere a la variabilidad prevista para un formato de valoracin biolgica particular.
Coeficiente geomtrico de variacinDeterminado como antilog(S)1, donde S es la desviacin estndar determinada en la
escala logartmica.
Nota: El coeficiente geomtrico de variacin a menudo se informa como un porcentaje (%GCV, por sus siglas en ingls). Es
importante no confundir el %GCV con el %CV. El %GCV es una medicin de dispersin pertinente a los datos analizados en la
escala [Y = log(X)] transformada logartmicamente, mientras que el %CV es una medicin pertinente a los datos analizados en
la escala (X) original.
Desviacin estndar geomtrica (GSD, por sus siglas en ingls)Se refiere a la variabilidad de los valores transformados en
logaritmos de una respuesta logartmica normal expresada como porcentaje en la escala sin transformar. Se determina como
antilog(S), donde S es la desviacin estndar determinada en la escala logartmica.
Nota: Por ejemplo, si la desviacin estndar de la potencia logartmica es S usando logaritmo en base 2, la GSD de la potencia es 100 * 2S.
Precisin intermedia (adaptado del captulo 1225)Expresa la precisin dentro del laboratorio relacionada con los cambios en las condiciones operativas.
Notas: 1. Los factores que contribuyen a la precisin intermedia implican cualquier aspecto que pudiera cambiar dentro de
un laboratorio dado y que podran afectar la valoracin, e incluyen das distintos, analistas distintos, equipo distinto, entre
otros. Por consiguiente, la precisin intermedia tiene un alcance intermedio entre los extremos de repetibilidad (dentro de la
valoracin) y reproducibilidad (entre laboratorios). 2. Cualquier declaracin de precisin intermedia debe identificar los factores variables. Por ejemplo, La precisin intermedia asociada con los cambios de equipo y operador es. 3. Asimismo, podra
ser valioso identificar por separado la precisin asociada con cada fuente (p.ej., precisin entre analistas). Esto puede formar
parte del desarrollo y la validacin de la valoracin cuando tiene algn valor identificar aquellos factores que contribuyen de
manera importante a la precisin intermedia. 4. Cuando se informa la precisin intermedia, en particular para fuentes individuales, los analistas deben tener cuidado de distinguir entre la varianza de la precisin intermedia y los componentes de dicha
varianza. La varianza de la precisin intermedia incluye la repetibilidad y, por lo tanto, debe ser necesariamente al menos tan
grande como la varianza de repetibilidad. Un componente de la varianza, p.ej., para el analista, tambin forma parte de la varianza de la precisin intermedia para el analista, pero puede ser insignificante y quizs no requiera tener una magnitud mayor
que la varianza de repetibilidad.
Precisin (1225)Medicin del grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a mltiples muestreos de una muestra homognea.
Notas: 1. La precisin se puede considerar en tres niveles: repetibilidad (q.v.), precisin intermedia (q.v.) y reproducibilidad
(q.v.). 2. La precisin se debe investigar usando muestras autnticas y homogneas. No obstante, si no es posible obtener una
muestra homognea, la precisin puede investigarse usando muestras con cantidades agregadas conocidas que simulen una
muestra o solucin muestra verdaderas. 3. La precisin a menudo se expresa como la varianza, desviacin estndar, coeficiente
de variacin o coeficiente de variacin geomtrica.
Sesgo relativoMedicin del grado de diferencia entre el valor esperado (o medio) y el valor verdadero, expresado como
porcentaje del valor verdadero.
Repetibilidad (1225)Se refiere a la expresin de la precisin dentro de un laboratorio en las mismas condiciones operativas durante un intervalo corto de tiempo.
4 FDA. Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/UCM070107.pdf. Consultada el 7 de diciembee de 2011.
USP 38
IV. Trminos Relacionados con la Validacin

Linealidad de las diluciones (adaptado del captulo 1225)Se refiere a la capacidad (dentro de un intervalo determinado)
de una valoracin biolgica para obtener potencias relativas medidas que sean directamente proporcionales a la potencia relativa verdadera de la muestra.
Notas: 1. Para determinar la linealidad de las diluciones, en ocasiones denominada linealidad analtica de la valoracin biolgica, a travs de un intervalo conocido de valores de potencia relativa, los analistas examinan la relacin entre la potencia logartmica conocida y la potencia logartmica media observada. Si dicha relacin genera una lnea esencialmente recta con una
ordenada al origen de 0 y una pendiente de 1, la valoracin tiene una proporcionalidad directa. Si la grfica genera una lnea
esencialmente recta pero la ordenada al origen no es 0 o la pendiente no es 1, la valoracin tiene una respuesta lineal proporcional. 2. Evaluar si una pendiente es (cercana a) 1,0 requiere una equivalencia o intervalo de indiferencia a priori. Resulta inadecuado en la prctica estadstica analizar la hiptesis nula que indica que la pendiente es 1,0 contra la alternativa que indica
que no es 1,0 y concluir que una pendiente es 1,0 si esto no se rechaza. La linealidad analtica de la valoracin biolgica se
separa de la consideracin de la forma de la curva de concentracinrespuesta. La linealidad de la concentracinrespuesta no
es un requisito de la linealidad analtica de la valoracin biolgica debido a que sta ltima es posible independientemente de
la forma de la curva de concentracinrespuesta. 3. La linealidad de las diluciones se trata en mayor detalle en el captulo
1033.
Lmite de cuantificacin (lmite inferior de cuantificacin; adaptado del captulo 1225)Se refiere a la potencia relativa
conocida ms baja para la que la valoracin tiene una precisin y exactitud adecuadas.
Notas: 1. Esto se aplica a los resultados de valoracin (potencia logartmica) en lugar del valor de informe. 2. No es comn
determinar el lmite de cuantificacin para las valoraciones biolgicas de potencia relativa. Las valoraciones realizadas en animales con puntos finales de determinacin serolgicos son ejemplos de uso de este trmino.
Intervalo (adaptado del captulo 1225)El intervalo entre las potencias relativas conocidas superior e inferior (incluyendo
aquellas potencias relativas) por el que se demuestra que la valoracin biolgica tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad analtica.
Nota: Esto se aplica a valores de informe (tpicamente una media geomtrica) en lugar de los resultados individuales de la
valoracin.
Robustez (adaptado del captulo 1225)Se refiere a una medida de la capacidad de un procedimiento analtico para mantenerse intacto ante variaciones pequeas pero deliberadas en los parmetros del mtodo listados en la documentacin del
procedimiento.
Notas: 1. La robustez es una indicacin de la confiabilidad de la valoracin biolgica durante el uso normal. Por ejemplo, un
sistema de valoracin de cultivo celular que es robusto para el nmero de pasajes de clulas puede proveer valores de potencia
con exactitud y precisin aceptables en todo un intervalo uniforme de nmeros de pasajes. 2. La norma Q2(R1) de la ICH
indica que:
Captulos
Notas: 1. La pauta ICH Q2A indica que la repetibilidad tambin recibe el nombre de precisin intravaloracin. En el contexto de la valoracin biolgica, el mejor trmino es intra corrida, mientras que un intervalo corto de tiempo se usa para
describir dentro de la corrida. 2. La idea de un intervalo corto de tiempo puede ser problemtica con las valoraciones biolgicas. Si una corrida toma varias semanas y consta de un solo conjunto de valoraciones, entonces no sera posible determinar la
precisin intracorrida. Alternativamente, si una corrida consta de dos conjuntos de datos de las valoraciones y se puede llevar a
cabo en un solo da, sera posible evaluar la repetibilidad de la determinacin de la potencia relativa.
Reproducibilidad 1225Expresa la precisin entre laboratorios.
Notas: 1. La reproducibilidad incluye contribuciones derivadas de la repetibilidad y de todos los factores que contribuyen a
la precisin intermedia, as como cualquier contribucin adicional de las diferencias entre laboratorios. 2. La reproducibilidad
se aplica a estudios en colaboracin, tales como aqullos realizados para estandarizacin o portabilidad de la metodologa. Dependiendo del diseo del estudio en colaboracin, puede ser posible describir por separado los componentes de la varianza
asociados con las fuentes de variabilidad intra y entre laboratorios.
Especificidad 1225Se refiere a la capacidad de evaluar de manera inequvoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible.
Notas: 1. Por lo general, estos componentes pueden incluir impurezas, productos de degradacin, componentes de la matriz, entre otros. Ver el captulo 1225 para ms informacin. 2. Esta definicin tambin se relaciona con la selectividad en
otras pautas para mtodos analticos. 3. La especificidad puede significar la medicin del analito especfico de inters y no la
de otro analito similar.
Sesgo por truncadoSe refiere al sesgo que ocurre cuando no se observa o registra alguna porcin de la distribucin de las
respuestas.
Notas: 1. Cuando existe sesgo por truncado, la distribucin de observaciones registradas no se corresponde con la distribucin real de respuestas. 2. El sesgo por truncado puede ocurrir en una valoracin biolgica que no informa estimaciones de
potencia logartmica fuera de un intervalo de potencia establecido. Por ejemplo, se espera que una muestra con una potencia
real en un lmite de este intervalo no produzca (informe) una estimacin de potencia en aproximadamente la mitad de las
valoraciones en las que aparece. En este ejemplo, la media de las potencias observadas estar sesgada hacia la potencia logartmica 0.
USP 38
La evaluacin de robustez se debe considerar durante la fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento que se
est estudiando. sta debe mostrar la confiabilidad de un anlisis con respecto a las variaciones deliberadas en los parmetros del mtodo. Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analticas, stas ltimas se deben controlar adecuadamente o se debe incluir una declaracin precautoria en el procedimiento. Una consecuencia de la evaluacin
de la robustez deber ser que se establezca una serie de parmetros [q.v.] de aptitud del sistema (p.ej., prueba de resolucin) para asegurar que la validez del procedimiento analtico se mantiene cada vez que se usa.1
Validacin de la valoracinProceso mediante el cual se demuestra y documenta que las caractersticas de desempeo del
procedimiento y su mtodo subyacente cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista y que la valoracin es, por tanto,
adecuada para su uso previsto.
Nota: Las validaciones formales se realizan prospectivamente de acuerdo con un plan escrito que incluye criterios de aceptacin justificables sobre los parmetros de validacin. Ver el captulo 1033.
Captulos
V. Trminos Relacionados con el Diseo y Anlisis Estadstico

Anlisis de varianza (ANOVA)Herramienta estadstica usada para evaluar la contribucin de factores experimentales en la
variabilidad.
Distribucin en bloquesAgrupacin de unidades experimentales relacionadas en diseos experimentales.
Notas: 1. La distribucin en bloques a menudo se usa para reducir la variabilidad relacionada con un factor que no es de
inters primario. 2. Los bloques pueden consistir, por ejemplo, en grupos de animales (una jaula, una camada o un cargamento), placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas enteras de 96 pocilllos agrupadas por analista, da o partida de clulas. 3. El objetivo es aislar, mediante diseo y anlisis estadstico, un efecto sistmico, por ejemplo una
jaula, de modo que no obstruya las comparaciones de inters.
En un diseo completo por bloques todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoracin biolgica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentracin) se pueden aplicar a las unidades experimentales para dicho
factor dentro de un solo bloque. Se debe tomar en cuenta que los dos factores de tratamiento muestra y concentracin
pueden tener unidades experimentales diferentes. Por ejemplo, si a todos los animales dentro de una jaula se les asigna la
misma concentracin, pero se les asignan muestras nicas, entonces la unidad experimental para concentracin es la jaula
y la unidad experimental para la muestra es el animal; la jaula es un factor de divisin en bloque para la muestra.
En un diseo en bloques incompleto el nmero de niveles de un factor de tratamiento excede el nmero de unidades
experimentales para dicho factor dentro del bloque.
Intervalo de confianzaSe refiere a un intervalo aleatorio producido por un mtodo estadstico que contiene un valor parametral verdadero (fijo pero desconocido) con un nivel de confianza declarado en una aplicacin repetida del mtodo estadstico.
Nota: Ver el captulo 1010 para ms informacin.
Cruzado (y parcialmente cruzado)Se dice que dos factores estn cruzados (o completamente cruzados) si cada nivel de
cada factor aparece con cada nivel del otro factor. Dos factores estn parcialmente cruzados cuando no estn completamente
cruzados, pero mltiples niveles de un factor aparecen con un nivel comn del otro factor.
Notas: 1. Por ejemplo, en una valoracin biolgica en la que todas las muestras aparecen en todas las diluciones, las muestras y las diluciones estn (completamente ) cruzadas. En un experimento de validacin de valoracin biolgica en el que dos
de cuatro analistas llevan cada uno a cabo valoraciones con el mismo conjunto de muestras durante cada uno de seis das y se
usa un par diferente de analistas en cada da, los analistas estn parcialmente cruzados con los das. 2. Cada factor se puede
aplicar a diferentes unidades experimentales, y los factores pueden ser totalmente cruzados y anidados (q.v.), lo que genera un
diseo de unidad dividida o de grfica dividida (q.v.). 3. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con factores que
estn parcialmente cruzados para llevar a cabo anlisis adecuados. 4. Un diseo en bloques completo aleatorizado (q.v.) es un
diseo en el que un factor de bloque (que a menudo se trata como un factor aleatorio) se cruza con el factor de tratamiento
(que a menudo se trata como un efecto fijo).
Diseo de experimentos (DOE, por sus siglas en ingls) [ICH Q8(R2)]5Mtodo estructurado y organizado para determinar la relacin entre factores que afectan un proceso y el resultado de dicho proceso.
Nota: El DOE se usa en el desarrollo de valoraciones biolgicas y en la validacin; ver los captulos 1032 y 1033.
Prueba de equivalenciaSe refiere a una prueba para demostrar la equivalencia (p.ej., similitud o cumplimiento con los criterios de aceptacin de la validacin) de dos cantidades mediante el cumplimiento de un criterio de aceptacin para un intervalo.
Notas: 1. Una prueba de equivalencia difiere de las pruebas estadsticas ms comunes en la naturaleza de las hiptesis estadsticas. La mayora de las pruebas estadsticas comunes son pruebas de diferenciaes decir, la hiptesis nula estadstica es la
ausencia de diferencias y la alternativa es que existe alguna diferencia, sin importar la magnitud o la importancia de la misma.
La diferencia puede estar entre una caracterstica de dos poblaciones o entre una caracterstica de una sola poblacin y un
valor aceptado. En el anlisis de equivalencia, la hiptesis nula es que la diferencia no es lo suficientemente pequea, y la hiptesis alternativa es que la diferencia es lo suficientemente pequea para que no exista diferencia importante. En una prueba de
5 ICH. Guidance Q8(R2) Pharmaceutical Development. November 2009. Disponible en http://www.fda.gov/downloads/Drugs/
GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM073507.pdf. Consultado el 27 de diciembre de 2011.
USP 38
Captulos
diferencia estadstica comn, se puede concluir que no existen pruebas suficientes para establecer el incumplimiento con un
criterio de aceptacin. ste puede ser el resultado de un exceso de variabilidad y/o un diseo inadecuado. En una prueba de
equivalencia, se concluye que los datos cumplen con el criterio de aceptacin (p.ej., las pendientes son paralelas). 2. El procedimiento de pruebas doblemente unilaterales (TOST, por sus siglas en ingls) es un procedimiento estadstico comn usado
para las pruebas de equivalencia. 3. El criterio de aceptacin para el intervalo puede ser unilateral o bilateral. Un ejemplo de
intervalo unilateral es un criterio de aceptacin de validacin para una %GCV de no ms de XX%.
Cuadrado medio esperadoExpresin matemtica de las varianzas estimadas mediante un ANOVA de cuadrados medios.
Diseo experimentalSe refiere a la estructura de asignacin de tratamientos a unidades experimentales.
Notas: 1. La distribucin en bloques (q.v.), la aleatorizacin (q.v.), la replicacin (q.v.) y la seleccin especfica del diseo
(ver el captulo 1032) son algunos aspectos del diseo experimental. 2. Los componentes importantes del diseo experimental incluyen el nmero de muestras, el nmero de concentraciones y la forma en que se asignan las muestras y concentraciones a unidades experimentales y su agrupacin en bloques. 3. El diseo experimental influye en la seleccin de la metodologa
estadstica que se debe usar para lograr el objetivo analtico.
Unidad experimentalSe refiere a la unidad ms pequea a la que se asigna aleatoriamente un nivel de tratamiento distinto.
Notas: 1. La asignacin aleatoria de los factores de tratamiento a unidades experimentales es esencial en las valoraciones
biolgicas. 2. Los factores de tratamiento diferentes se pueden aplicar a unidades experimentales distintas. Por ejemplo, las
muestras se pueden asignar a las filas en una placa de 96 pocillos, y las diluciones se pueden asignar a las columnas de la placa.
En este caso, las hileras son las unidades experimentales para las muestras, las columnas son las unidades experimentales para
las concentraciones y los pocillos son las unidades experimentales para la interaccin entre muestra y concentracin. 3. Una
unidad experimental debe distinguirse de una unidad de muestreo, en cuya unidad ms pequea se registra una medicin
distinta (p.ej., un pocillo). Debido a que la unidad de muestreo es a menudo ms pequea que la unidad experimental, tratar
unidades de muestreo como si fueran unidades experimentales es un error fcil de cometer. Este error se demonina pseudo-replicacin (q.v.).
FactorParmetro de la valoracin o elemento operativo que puede afectar la respuesta de la misma y que vara en un experimento y entre experimentos.
Nota: En una valoracin biolgica, habr por lo menos dos factores de tratamiento: muestra y concentracin.
Un factor fijo (efecto fijo) es un factor que se controla y establece deliberadamente a niveles especficos en una valoracin biolgica. Se realiza inferencia en los niveles usados en el experimento o en los niveles intermedios. En una valoracin biolgica, la muestra y la concentracin son ejemplos de factores fijos.
Un factor aleatorio (efecto aleatorio) es aqul que por lo general no puede ser controlado y cuyos niveles representan
una demostracin de las formas en que dicho factor puede variar. En una valoracin biolgica, los organismos de prueba,
la placa y el da a menudo se consideran factores aleatorios. Tratar un factor como aleatorio o fijo depender del experimento y de las preguntas formuladas.
Diseo factorialSe refiere al diseo experimental en el que se encuentran mltiples factores, los cuales estn parcial o totalmente cruzados.
En un diseo factorial completo, cada nivel de un factor se presenta con cada combinacin de niveles de todos los dems factores. Por ejemplo, si los factores son la partida de reactivo y el tiempo de incubacin, para un diseo factorial
completo, se deben incluir todas las combinaciones de tiempo de incubacin y partida de reactivo.
Un diseo factorial fraccionado es un diseo reducido en el que cada nivel de un factor aparece nicamente con un
subconjunto de combinaciones de niveles de todos los dems factores, y algunos efectos de factores (efectos y/o interacciones principales) se confunden deliberadamente con otras combinaciones de efectos de factores. Se debe prestar especial cuidado al considerar los diseos factoriales fraccionados para propsitos de deteccin y optimizacin. Se considera
que este diseo no presenta riesgos de perder informacin para la validacin.
Modelo lineal generalModelo estadstico lineal que relaciona factores de estudio, que pueden ser continuos o discretos,
con respuestas experimentales.
IndependenciaPara que dos mediciones u observaciones A y B (datos brutos, conjuntos de valoraciones o potencias relativas) sean independientes, los valores de A no deben verse afectados por las respuestas de B y viceversa.
Nota: Una consecuencia de no reconocer la falta de independencia es la caracterizacin deficiente de la varianza. En la prctica, esto significa que si dos mediciones de potencia o de potencia relativa comparten un factor comn que podra influenciar
el resultado de la valoracin (p.ej., un analista, preparacin celular, incubadora, grupo de animales o alcuota de muestras estndar) entonces la suposicin inicial correcta es que estas mediciones de potencia relativa no son independientes. Lo mismo
sucede con la falta de independencia cuando se estiman en conjunto dos mediciones de potencia o de potencia relativa a partir del mismo modelo, o si se relacionan de alguna manera sin incluir en el modelo algn trmino que capture el hecho de que
hay dos o ms mediciones de potencia. A medida que se gana experiencia en las valoraciones, se puede establecer (y monitorear) un fundamento emprico razonable para tratar las mediciones de potencia como independientes incluso si comparten un
nivel comn de un factor. Este es el caso cuando se ha demostrado que un factor prcticamente no tiene efecto significativo
en los resultados a largo plazo de la valoracin biolgica.
InteraccinSe dice que dos factores interactan cuando la respuesta de un factor depende del nivel del otro.
NivelSe refiere a la ubicacin en la escala de medicin de un factor.
Notas: 1. Los factores tienen dos o ms niveles distintos. Por ejemplo, si un experimento de validacin de valoracin biolgica emplea tres valores de tiempo de incubacin y dos partidas de un reactivo clave, los niveles son las tres veces para el factor
Captulos
USP 38
tiempo de incubacin y las dos partidas para el factor partida. 2. Los niveles de un factor en una valoracin biolgica pueden ser
cuantitativos, tales como concentracin, o categricos, tales como muestra (es decir, de prueba y de referencia).
Distribucin logartmica normalDistribucin de valores (respuestas o potencias de la valoracin) en las que los logaritmos
de los valores tienen una distribucin normal.
Notas: 1. La mayora de las mediciones en la valoracin biolgica de potencia relativa presentan una distribucin logartmica
normal. 2. La distribucin logartmica normal es una distribucin sesgada que se caracteriza por un incremento en la variabilidad con un aumento en el nivel de respuesta.
Cuadrado medioClculo dentro del ANOVA que representa la variabilidad asociada con un factor experimental.
Modelo de efectos mixtosModelo estadstico que incluye efectos fijos y aleatorios.
Generacin de modelos estadsticosEspecificacin matemtica de la relacin entre ingresos (Xs) y salidas (Ys) de un proceso, p.ej., la relacin concentracinrespuesta en la valoracin biolgica o la generacin de un modelo de los efectos de fuentes
importantes de variacin en la medicin de potencia.
Notas: 1. La generacin de modelos incluye mtodos para capturar la dependencia que tiene la respuesta de las muestras, la
concentracin, unidades experimentales y los grupos o distribucin de factores en bloques en la configuracin de la valoracin. 2. La generacin de modelo para datos de la valoracin biolgica requiere tomar una gran cantidad de decisiones, algunas de las cuales se basan en el diseo de la valoracin y en los datos. Para datos continuos, se puede seleccionar entre modelos lineales o no lineales. Para datos discretos, se puede seleccionar entre modelos logit/log dentro de una familia ms grande
de modelos lineales generalizados. Existe literatura enfocada en la limitacin de valoraciones con diluciones en la que se aboga
por los modelos de Poisson y los modelos de binomios en cadena de Markov. Para los datos de la valoracin biolgica, se
pueden usar modelos de efectos fijos o modelos de efectos mixtos. Por un lado, existe una mayor disponibilidad de software
para modelos de efectos fijos cuya configuracin es menos exigente para los estadsticos. Por otra parte, los modelos mixtos
tienen algunas ventajas sobre los fijos: se acomodan ms a los datos faltantes y, lo ms importante, pueden permitir que cada
bloque tenga distintas pendientes, asntotas, concentraciones medias efectivas, requeridas para inducir un efecto del 50%
(EC50) o potencias relativas. En particular, cuando el analista emplea modelos de lneas rectas ajustados a respuestas no lineales
o en sistemas de valoracin en los que la curva de concentracinrespuesta vara entre bloques, el modelo mixto captura el
comportamiento del sistema de valoracin de manera ms realista e interpretable. 3. Resulta esencial que cualquier metodologa para la generacin de modelo para datos de la valoracin biolgica utilice todos los datos disponibles de manera simultnea para estimar la variacin (o, en un modelo mixto, cada una de varias fuentes de variacin). Puede ser necesario transformar las observaciones antes de generar el modelo; incluir un modelo de varianza; o ajustar un modelo de medias (en el que
existe un efecto previsto para cada combinacin de muestra y concentracin) para obtener estimaciones combinadas de variacin.
AnidadoSe dice que un factor A est anidado dentro de otro factor B si los niveles de A son diferentes para cada nivel de B.
Notas: 1. Por ejemplo, en un experimento de validacin de valoracin biolgica, dos analistas pueden cada uno llevar a cabo
valoraciones en cinco das. Si los das naturales para el primer analista son distintos de los del segundo analista, los das estn
anidados dentro del analista. 2. Los factores anidados tienen una relacin jerrquica. 3. Para que dos factores estn anidados,
deben cumplir con lo siguiente: a) aplicarse a unidades experimentales de diferentes tamaos; b) la unidad experimental ms
grande contiene ms de una de las unidades experimentales ms pequeas; y c) el factor aplicado a la unidad experimental
ms pequea no est totalmente cruzado (q.v.) con el factor aplicado a la unidad experimental ms grande. Cuando se cumplen las condiciones (a) y (b), y los factores estn parcialmente cruzados, entonces el experimento est parcialmente cruzado y
parcialmente anidado. Hay que prestar especial cuidado a los experimentos con esta estructura para llevar a cabo anlisis adecuados.
Paralelismo (de las curvas de concentracinrespuesta)Calidad en la que las curvas de concentracinrespuesta de la
muestra de Prueba y del Estndar de Referencia son idnticas en forma y presentan nicamente una diferencia horizontal que
es una funcin constante de la potencia relativa.
Notas: 1. Cuando las preparaciones de Prueba y de Referencia son similares (q.v.) y las respuestas de la valoracin se grafican
en funcin de los logaritmos de las concentraciones, la curva resultante para la preparacin de Prueba ser la misma que para
el Estndar pero desviada horizontalmente por una cantidad que es el logaritmo de la potencia relativa. Debido a esta relacin,
la similitud (q.v.) a menudo se equipara con paralelismo, pero son conceptos distintos. Ver la seccin 3.5, Modelos de ConcentracinRespuesta de Cociente de Pendientes, del captulo 1034, en los que las muestras con relaciones similares de concentracinrespuesta tienen una ordenada al origen comn (o casi comn) pero pueden diferir en sus pendientes. 2. En la prctica,
no es posible demostrar que las formas de dos curvas sean idnticas. En lugar de esto, las dos curvas demuestran tener una
forma algebraica los suficientemente similar (equivalente). Se debe tomar en cuenta que similar debe interpretarse como se
cuenta con evidencia de que las dos curvas son lo suficientemente cercanas en forma en lugar de no se cuenta con evidencia
de que las dos curvas sean diferentes en forma. 3. La evaluacin de paralelismo depende del tipo de funcin usada para ajustar la curva de respuesta. El paralelismo para una valoracin no lineal que usa un ajuste logstico de cuatro parmetros significa
que (a) las pendientes de las curvas de la Prueba y del Estndar de Referencia que cambian rpidamente (es decir, la pendiente
de la tangente con la curva, donde la primera derivada es un mximo) deben ser similares; y (b) las asntotas superior e inferior
de las curvas de la respuesta (mesetas) deben ser similares. Para anlisis de lneas rectas, las pendientes de las lneas deben ser
similares.
Estimacin puntualEstimacin de un valor individual obtenida a partir de clculos estadsticos.
USP 38
Captulos
Notas: 1. Los ejemplos son el sesgo relativo promedio, la %CVG y la potencia relativa. 2. La estimacin puntual puede ser
ms relevante con una estimacin de intervalo (intervalo de confianza; q.v.) que emplea un intervalo para expresar la incertidumbre en la determinacin de la estimacin puntual.
Determinaciones pseudo-repetidasSe refiere a la identificacin incorrecta de muestras obtenidas a partir de unidades experimentales como independientes y, por tanto, como determinaciones repetidas verdaderas cuando en realidad no son independientes.
Notas: Las determinaciones pseudo-repetidas resultan en inferencias errneas debido a la asignacin incorrecta de variabilidad y a la aparicin de un nmero de determinaciones repetidas aparentemente mayor al real. 2. El no reconocer las determinaciones pseudo-repetidas es peligroso puesto que se trata de un error fcil de cometer y sus consecuencias pueden ser serias.
Por ejemplo, las determinaciones pseudo-repetidas comnmente surgen cuando los analistas realizan una serie de diluciones
para cada muestra en tubos (la serie de diluciones se puede realizar mediante diluciones en serie, mediante diluciones de un
solo punto o mediante cualquier esquema de dilucin conveniente). Posteriormente, el analista transfiere cada dilucin de cada muestra a varios pocillos en una o ms placas de valoracin. Por consiguiente, los pocillos son determinaciones pseudorepetidas puesto que son simplemente alcuotas de un solo proceso de dilucin y por tanto no representan preparaciones independientes. 3. Una manera simple para analizar datos obtenidos de determinaciones pseudo-repetidas es promediar las determinaciones pseudo-repetidas (si se usa una transformacin de los datos observados, sta debe aplicarse antes de promediar
las determinaciones pseudo-repetidas) antes de ajustar cualquier tipo de modelo de concentracinrespuesta. En muchos sistemas de valoracin, promediar determinaciones pseudo-repetidas dejara a la valoracin sin ninguna determinacin repetida.
Una forma ms compleja de usar los datos que contienen determinaciones pseudo-repetidas consiste en emplear un modelo
mixto que trate las determinaciones pseudo-repetidas como un efecto aleatorio distinto. Aunque el valor de las determinaciones pseudo-repetidas es generalmente limitado, pueden ser tiles cuando se cumplen dos condiciones: (a) la variacin de las
determinaciones pseudo-repetidas (es decir, entre pocillos) es muy grande en comparacin con la variacin asociada con las
determinaciones repetidas y (b) el costo de las determinaciones pseudo-repetidas es mucho menor que el costo de las unidades experimentales repetidas.
Valor P (probabilidad de significancia)Se refiere a la probabilidad de observar, en ensayos repetidos, que el resultado experimental es tan o ms extremo que el observado si la hiptesis nula fuera verdadera.
Notas: 1. Ms extremo significa ms lejano a la hiptesis nula. 2. Comnmente, P < 0,05 se considera un umbral para indicar
las diferencias estadsticamente significativas, aunque se puede usar cualquier valor para el umbral. Las bases para seleccionar
el umbral son los riesgos (costos) de tomar decisiones errneas; ver error tipo I y error tipo II.
AleatorizacinProceso de asignacin para tratamiento de unidades experimentales basado en la probabilidad de que todos
los subgrupos de unidades de igual tamao tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado.
Notas: 1. El mecanismo de probabilidad puede ser un proceso fsico sin sesgo (tirar dados sin sesgo, lanzar una moneda,
sacar de una urna bien revuelta), tablas de nmeros aleatorios o nmeros aleatorizados generados por computadora. Se debe
tener cuidado con la seleccin y uso del mtodo. Resulta una buena prctica utilizar un generador de nmeros aleatorios computarizado validado. 2. El uso de aleatorizacin puede ayudar a prevenir que el error sistemtico se asocie con muestras particulares o con un patrn de dilucin y que ocasione sesgo. Por ejemplo, en valoraciones biolgicas de 96 pocillos, los efectos de
la placa pueden ser importantes y ocasionar sesgo en respuestas observadas o medidas sumarias. En estudios con animales,
son varios los factores relacionados con animales individuales que pueden influenciar las respuestas. Si no se demuestra de manera rutinaria que los factores extraos que influencian los estudios que usan placas o los estudios que usan animales han sido
eliminados o minimizados hasta un grado que los convierta en insignificantes, la aleatorizacin ser esencial para obtener datos sin sesgo requeridos para el clculo de la potencia verdadera. 3. La aleatorizacin es una buena prctica incluso cuando
existen pruebas de que factores operativos (p.ej., ubicacin, tiempo, lote de reactivo) tienen un efecto menor o nulo sobre el
sistema de valoracin. Aunque la aleatorizacin puede no proteger una valoracin individual (o quizs un bloque de una valoracin) de un factor operativo (quizs recientemente) importante, la aleatorizacin provee la seguridad de que los resultados
de un conjunto de valoraciones no presentan sesgo debido a factores operativos.
Determinaciones repetidasSe refiere al proceso en el que mltiples unidades experimentales independientes reciben el mismo nivel de un factor de tratamiento.
Notas: 1. El propsito de las determinaciones repetidas es minimizar los efectos de fuentes de variabilidad aleatoria incontrolables. 2. Las determinaciones repetidas pueden ocurrir completamente en bloques aleatorios o en todos los bloques. Por lo
general, las determinaciones repetidas dentro de bloques se denominan pseudo-replicacin (q.v.). 3. La determinacin repetida de factores que contribuyen en mayor medida a la variabilidad, o factores que estn en los niveles ms altos en un diseo
anidado, por lo general generan la reduccin ms efectiva de variabilidad aleatoria.
Determinaciones repetidas verdaderasSe refiere a las muestras basadas en unidades experimentales independientes.
Error estndar de estimacinSe refiere a una medicin de la incertidumbre de una estimacin de un valor de informe u
otro parmetro debida a la variacin del muestreo
Notas: 1. En las valoraciones biolgicas, el enfoque se centra en la precisin (error estndar) de la potencia relativa. 2. Los
errores estndar se pueden minimizar con determinaciones repetidas adicionales. 3. Tcnicamente, el error estndar de una
estimacin es la desviacin estndar de la distribucin de muestreo de la estimacin. El trmino error estndar se usa para distinguir entre este uso de desviacin estndar (que depende del tamao de la muestra) y el uso comn en el laboratorio en el
que la desviacin estndar (o coeficiente de variacin) se usa para caracterizar la precisin de mediciones individuales obtenidas de un procedimiento. Esta ltima precisin no depende del tamao de la muestra.
USP 38
Control estadstico del procesoConjunto de mtodos estadsticos empleados para monitorear desviaciones y tendencias en
un proceso.
Error tipo ISe refiere al error cometido al juzgar el anlisis de los datos, en el cual se acepta la hiptesis alternativa cuando
sta es falsa.
Nota: La probabilidad de un error tipo I por lo general se indica mediante a.
Error tipo IISe refiere al error cometido al juzgar el anlisis de los datos, en el cual se rechaza la hiptesis alternativa cuando
sta es verdadera.
Nota: La probabilidad de un error tipo II por lo general se indica mediante b .
Anlisis de los componentes de la varianzaAnlisis estadstico que separa las contribuciones a la variabilidad total de los
componentes asociados con los factores que influyen en la valoracin tales como el analista, el da o el instrumento.
Captulos
1031 BIOCOMPATIBILIDAD DE LOS MATERIALES USADOS EN

ENVASES DE MEDICAMENTOS, DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES
Este captulo proporciona pautas para la identificacin y realizacin de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad
de los envases de medicamentos, cierres elastomricos, dispositivos mdicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la
tendencia de estos productos a mantenerse biolgicamente inertes durante todo su perodo de contacto con el organismo.
Los procedimientos de prueba de biocompatibilidad nombrados en este captulo estn diseados para detectar las caractersticas no especficas de reactividad biolgica, fsicas o qumicas de los productos mdicos o de los materiales usados en su construccin. Junto con las pruebas qumicas, estos procedimientos biolgicos se pueden usar para detectar e identificar la toxicidad inherente o adquirida de los productos mdicos antes o durante su fabricacin y procesamiento.
En los siguientes captulos generales se hace referencia a los procedimientos de prueba preclnicos para evaluar la seguridad
de los elastmeros, plsticos u otros polmeros usados en la elaboracin de productos mdicos: Inyectables 1, Pruebas de
Reactividad Biolgica, In Vitro 87, Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88, Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos
Mdicos Similares 161, Tapones Elastomricos para Inyectables 381 y EnvasesPlsticos 661. Los procedimientos de prueba
in vitro e in vivo especficos para evaluar la biocompatibilidad de productos mdicos en pacientes se describen en Pruebas de
Reactividad Biolgica, In Vitro 87 y en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88.
Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un producto mdico o de los materiales empleados en su elaboracin se han categorizado como un panel de efectos biolgicos (procedimientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilizacin,
irritacin o reactividad intracutnea, toxicidad sistmica aguda, toxicidad subcrnica (repetida), genotoxicidad, implantacin,
hemocompatibilidad, toxicidad crnica (duracin de ms de 10% de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de
90 das), carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin.1 En la Tabla 1 se indican los captulos
generales de la USP referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categoras. Adems, la pirogenicidad, un tema de
toxicidad especial, se evala en Prueba de Pirgenos 151 y en Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85. Actualmente no existen
captulos generales que detallen los requisitos2 de las pruebas de toxicidad subcrnica, genotoxicidad, toxicidad crnica, carcinogenicidad, hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradacin.
Tabla 1. Procedimientos de Determinacin de Toxicidad en los Captulos Generales de la USP
Efecto Biolgico
Citotoxicidad
Sensibilizacin
Irritacin o reactividad intracutnea
Captulo General de la USP

Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87*
Pruebas de Sensibilizacin 1184
Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88
Toxicidad sistmica (toxicidad aguda)
Implantacin
* Los captulos generales adicionales que se refieren a este efecto biolgico incluyen Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos Similares 161,
Tapones Elastomricos para Inyectables 381 y EnvasesPlsticos 661.
Los captulos generales adicionales que se refieren a este efecto biolgico incluyen Inyectables 1, Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos
Similares 161, Tapones Elastomricos para Inyectables 381 y EnvasesPlsticos 661.
1
2
Documento ISO 10993-1:1997 (o versin actualizada) titulado Biological Evaluation of Medical DevicesPart 1: Evaluation and Testing.
Ver OECD Guidelines for Testing of Chemicals en www.oecd.org.
USP 38
Informacin General / 1031 Biocompatibilidad de los Materiales Usados 819
ENVASES DE MEDICAMENTOS
Biocompatibilidad de los Envases de Plstico y de Otros Polmeros para Medicamentos
Los envases farmacuticos consisten en un recipiente y un cierre. Los envases de plstico pueden estar formados por polmeros que tras su extraccin no alteran la estabilidad del producto que contienen ni muestran toxicidad. Los requisitos de la
prueba de biocompatibilidad para los envases de medicamentos se especifican en Inyectables 1 y EnvasesPlsticos 661.
Segn se indica en estos captulos, el plstico u otras porciones polimricas de estos productos se prueban segn los procedimientos definidos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87. Los plsticos u otros polmeros que no cumplan con los
requisitos de las Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 no son materiales adecuados para envases de medicamentos. Los
materiales que cumplen con los requisitos in vitro estn calificados como materiales biocompatibles sin la necesidad de pruebas adicionales y se pueden usar para fabricar envases de medicamentos. Si se desea una designacin de clase (clases IVI)
para los plsticos u otros polmeros, hay que realizar los procedimientos de prueba adecuados que se presentan en la seccin
Pruebas In Vivo y Designacin de Clase.
Cierres Elastomricos
DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES

Los dispositivos mdicos e implantes etiquetados como apirgenos, en contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular u otros tejidos blandos del cuerpo, cumplen con los requisitos descritos en Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos Similares 161. Los productos detallados en este captulo que cumplen con los criterios son equipos de administracin de soluciones, equipos de extensin, equipos de transferencia, equipos de administracin de sangre, catteres intravenosos, dializadores y tubos y accesorios para dilisis, equipos para transfusin e infusin y catteres para la administracin intramuscular de frmacos. Los criterios descritos no se aplican a los productos mdicos tales como productos ortopdicos, guantes
de ltex y apsitos para heridas.
Los requisitos de prueba descritos o a los que se hace referencia en Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos
Similares 161 incluyen los requisitos de Esterilidad, Endotoxinas bacterianas, Pirgenos y Otros requisitos. En Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 se define un procedimiento para evaluar la presencia de endotoxinas bacterianas y los lmites se definen
en Endotoxinas Bacterianas en Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos Similares 161. Para los dispositivos en
que no se puede realizar la Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 debido a caractersticas de promocin o inhibicin no eliminables, se aplica la Prueba de Pirgenos 151. Los procedimientos para evaluar dispositivos mdicos que contienen vas estriles
se definen en Dispositivos Estriles en Pruebas de Esterilidad 71. En la Prueba de Seguridad en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88 se define un procedimiento para evaluar la seguridad de los dispositivos mdicos.
Los componentes de plstico o de otros polmeros de los dispositivos mdicos cumplen con los requisitos especificados para
los plsticos y otros polmeros en EnvasesPlsticos 661; los fabricados con elastmeros cumplen con los requisitos en Tapones Elastomricos para Inyectables 381. Segn se indica en estos captulos, la biocompatibilidad de las porciones de plstico,
de otros polmeros y los elastmeros de estos productos se analizan conforme a los procedimientos descritos en Pruebas de
Reactividad Biolgica, In Vitro 87. Si tambin se requiere la designacin de clase para un plstico u otro polmero, se realizan
procedimientos de prueba adecuados descritos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88.
Al igual que para los cierres elastomricos, los materiales elastomricos que no cumplen con los requisitos in vitro pueden
estar calificados como materiales biocompatibles y usarse en la elaboracin de dispositivos mdicos si cumplen con los requisitos de la Prueba de Inyeccin Sistmica y la Prueba Intracutnea en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88. Al igual que
para los envases de medicamentos, los plsticos y otros polmeros que no cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no
son materiales aptos para ser utilizados en dispositivos mdicos.
Captulos
Los cierres elastomricos son cierres que se pueden perforar con una jeringa y mantener su integridad debido a sus propiedades elsticas. Los materiales elastomricos pueden estar compuestos de varias entidades qumicas, incluyendo materiales de
relleno, pigmentos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcanizantes y un polmero natural o sinttico. Estos
materiales se usan para la fabricacin de un producto que tenga las propiedades fsicas elastomricas deseadas y a menudo
demuestran reactividad biolgicadegeneracin y malformacin celularcuando se someten a pruebas con cultivos celulares
in vitro.
La biocompatibilidad de un material elastomrico se evala segn el protocolo de prueba de dos etapas especificado en
Procedimientos para Prueba Biolgica en Tapones Elastomricos para Inyectables 381. A diferencia de los plsticos u otros polmeros, un material elastomrico que no cumple con los requisitos de las pruebas de la primera etapa (in vitro) puede aceptarse
como material biocompatible si pasa las pruebas de la segunda etapa (in vivo) que son la Prueba de Inyeccin Sistmica y la
Prueba Intracutnea descritas en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88. No se hace distincin de clase ni de tipo entre los
materiales elastomricos que cumplen con los requisitos de las pruebas de la primera etapa y los aceptables como materiales
biocompatibles al cumplir con los requisitos de la segunda etapa. Los materiales elastomricos no reciben una designacin de
clase IVI.
820 1031 Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Informacin General
USP 38
PRUEBAS IN VITRO, PRUEBAS IN VIVO Y DESIGNACIN DE CLASE PARA PLSTICOS Y OTROS

POLMEROS
Los requisitos de prueba especificados en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 y Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88 estn diseados para determinar la reactividad biolgica de cultivos celulares de mamferos y la respuesta biolgica
de animales a los materiales elastomricos, plsticos y de otros polmeros que estn en contacto directo o indirecto con el paciente. La reactividad biolgica de estos materiales puede depender tanto de las caractersticas de sus superficies como de sus
componentes qumicos extrables. Los procedimientos de prueba detallados en estos captulos a menudo se pueden realizar
con el material o un extracto del material en anlisis, a menos que se especifique algo diferente.
Captulos
Preparacin de Extractos
La evaluacin de la biocompatibilidad de un producto mdico completo a menudo no es realista; por lo tanto, el uso de
porciones o extractos representativos de materiales seleccionados puede ser la nica alternativa prctica para realizar los ensayos. Cuando se usan porciones representativas de los materiales o extractos de los materiales en anlisis, es importante tener
en cuenta que las materias primas pueden sufrir cambios qumicos durante la fabricacin, el procesamiento y la esterilizacin
de un producto mdico. Si bien la prueba in vitro de materias primas puede servir como un procedimiento de examen inicial
importante, hay que hacer una evaluacin final de la biocompatibilidad de un producto mdico con porciones del producto
terminado y esterilizado.
Los extractos se preparan de acuerdo con los procedimientos expuestos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 y en
Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88. Las extracciones se pueden realizar a diversas temperaturas (121, 70, 50 o 37)
durante diferentes intervalos de tiempo (1 hora, 24 horas o 72 horas) y en medios de extraccin diferentes. La eleccin del
medio de extraccin para los procedimientos de las Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 incluye la Inyeccin de Cloruro
de Sodio (0,9% NaCl) o un medio de cultivo de tejidos con o sin suero. Cuando se usa un medio con suero, la temperatura de
extraccin no puede exceder de 37. El medio de extraccin in vivo incluye los medios descritos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88 o el disolvente al cual se expone el medicamento o dispositivo mdico.
Al elegir las condiciones de extraccin, hay que seleccionar las variables de temperatura, disolvente y tiempo que mejor simulen las condiciones de uso del producto. Se pueden realizar muchas pruebas en diferentes condiciones para simular variaciones en las condiciones de uso. Si bien la seleccin cuidadosa de las condiciones de extraccin permite la simulacin de las
condiciones de fabricacin y procesamiento en la prueba de materias primas, se realizar una prueba de la biocompatibilidad
del producto con el producto terminado y esterilizado.
Pruebas In Vitro
Los procedimientos descritos en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87 incluyen una Prueba de Difusin en Agar (prueba de contacto indirecto), una Prueba de Contacto Directo y una Prueba de Elucin (prueba de extraccin). La muestra es biocompatible si los cultivos celulares no muestran ms que una reactividad leve (Grado 2) al material de prueba, como se describe en Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87. La Prueba de Difusin en Agar est diseada para evaluar la biocompatibilidad de los materiales elastomricos. El material se coloca sobre una capa de agar superpuesta a la monocapa celular, que protege a las clulas contra el dao fsico debido al material y permite que las sustancias qumicas o materiales lixiviables difundan
desde el elastmero y entren en contacto con la monocapa celular. Los extractos de materiales elastomricos se analizan colocando papel de filtro saturado con un extracto del elastmero sobre la superficie del agar solidificado. La Prueba de Contacto
Directo est diseada para materiales elastomricos o plsticos que no daarn fsicamente las clulas con las que entren en
contacto directo. Toda sustancia qumica lixiviable difunde desde el material al medio de crecimiento suplementado con suero
y entra en contacto directo con la monocapa celular. La Prueba de Elucin est diseada para evaluar los extractos de materiales polimricos. El material se puede aplicar directamente al medio de cultivo de tejidos.
La realizacin de la Prueba de Difusin en Agar o la Prueba de Contacto Directo junto con la Prueba de Elucin es el protocolo
de prueba preferido. La extraccin del producto o los materiales para la Prueba de Difusin en Agar o la Prueba de Elucin se
efecta segn se describe en Preparacin de Extractos.
Pruebas In Vivo y Designacin de Clase

De acuerdo con los requisitos de inyeccin e implantacin especificados en la Tabla 1 en Pruebas de Reactividad Biolgica, In
Vivo 88, los plsticos y otros polmeros reciben una designacin de clase entre la clase I y la clase VI. Para obtener la designacin de clase de un plstico u otro polmero, se producen extractos del material de prueba en diversos medios segn los procedimientos especificados.
Para evaluar la biocompatibilidad, los extractos se inyectan por va sistmica e intracutnea en ratones y conejos o cobayos.
Segn los requisitos de inyeccin especificados, un plstico u otro polmero puede pertenecer inicialmente a la clase I, II, III o
V. Si adems de la prueba de inyeccin, se realiza una prueba de implantacin usando el material en s, el plstico u otro polmero puede clasificarse como clase IV o clase VI.
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BIOCOMPATIBILIDAD DE DISPOSITIVOS MDICOS E IMPLANTES

Adems de la evaluacin de productos mdicos para propsitos farmacopeicos segn los procedimientos especificados en
Inyectables 1, Esterilidad 71, Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87, Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88, Equipos para Transfusin e Infusin y Dispositivos Mdicos Similares 161, Tapones Elastomricos para Inyectables 381 y Envases
Plsticos 661, los dispositivos mdicos e implantes se evalan en cuanto a su capacidad de sensibilizacin, toxicidad subcrnica, genotoxicidad, hemocompatibilidad, toxicidad crnica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin segn lo exijan los organismos regulatorios.
Las pautas suministradas por los organismos regulatorios indican que el nmero de pruebas al que se somete un dispositivo
mdico o un implante depende de los siguientes factores: (1) la similitud y singularidad del producto con respecto a los productos previamente comercializados (comparables) segn se considera en el Diagrama de Flujo de Decisin; (2) la magnitud y
duracin del contacto entre el producto y el paciente, segn se describen en la Categorizacin de Dispositivos Mdicos; y (3) los
materiales que componen el producto segn se considera en los apartados Diagrama de Flujo de Decisin y Prueba In Vivo y
Designacin de Clase.
Diagrama de Flujo de Decisin
Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Use of International Standard ISO-10993. Biological Evaluation of Medical Devices-Part 1: Evaluation
and Testing.)
Captulos
Las pautas para la comparacin de un dispositivo mdico o un implante con productos previamente comercializados se proporcionan en el Diagrama de Flujo de Biocompatibilidad (ver la Figura 13) segn la adaptacin del Blue Book Memorandum
#G95-1 de la FDA. El propsito del diagrama de flujo es determinar si los datos disponibles de dispositivos previamente comercializados son suficientes para asegurar la seguridad del dispositivo en consideracin. Segn se indica en el diagrama de flujo,
los materiales de composicin y las tcnicas de fabricacin de un producto se comparan con aqullas de productos previamente comercializados para dispositivos que entran en contacto directo con el cuerpo. Adems, el diagrama de flujo exige una
evaluacin de la toxicidad de todo material especial que no se haya usado en dispositivos comparables. Las respuestas a las
preguntas formuladas en el diagrama de flujo llevan a la conclusin de si los datos disponibles son suficientes o si se necesitan
pruebas adicionales para asegurar la seguridad del producto. Cuando se necesitan pruebas adicionales, en la seccin Matriz de
Seleccin de Prueba se proporcionan las pautas para la identificacin de los procedimientos de prueba adecuados.
USP 38
Captulos
Fig. 1. Diagrama de flujo de biocompatibilidad
Categorizacin de Dispositivos Mdicos

Para facilitar la identificacin de los procedimientos de prueba adecuados, los dispositivos mdicos se dividen y subdividen
segn se muestra en la Tabla 2, de acuerdo con el tipo y grado de contacto con el cuerpo. Las principales categoras de dispositivos mdicos son los dispositivos de superficie, los dispositivos de comunicacin externa y los dispositivos de implante. stas
USP 38
a su vez se subcategorizan. En la Tabla 2 tambin se presentan algunos ejemplos de dispositivos mdicos e implantes pertenecientes a cada una de las subcategoras.
Tabla 2. Clasificacin y Ejemplos de Dispositivos Mdicos
Categora del
Dispositivo
Subcategora del
Dispositivo
Algunos Ejemplos
Dispositivos en contacto slo con la superficie de la piel intacta
Electrodos, prtesis externas, cintas de fijacin, vendas para compresin y monitores

de varios tipos
Membrana Mucosa
Dispositivos que se comunican con membranas mucosas intactas
Lentes de contacto, catteres urinarios, dispositivos intravaginales e intraintestinales

(tubos estomacales, sigmoidoscopios, colonoscopios, gastroscopios), tubos endotraqueales, broncoscopios, prtesis dentales, dispositivos de ortodoncia y dispositivos intrauterinos
Superficies Lesionadas o
Afectadas
Dispositivos en contacto con superficies

Dispositivos para curacin o apsitos para
corporales lesionadas o afectadas de algn lceras, quemaduras y tejido de granulamodo
cin, y parches oclusivos
Va Sangunea, Indirecta
Dispositivos en contacto con la va sangunea en un punto y que sirven de conducto

para ingresar al sistema vascular
Equipos para administracin de soluciones,

equipos de extensin, equipos de transferencia y equipos para administracin de
sangre
Dispositivos y materiales en comunicacin

con tejidos, hueso, o el sistema de pulpa y
dentina
Laparoscopios, artroscopios, sistemas de

drenaje, cementos dentales, materiales de
oclusin dental y grapas para piel
Dispositivos en contacto con sangre en circulacin
Catteres intravasculares, electrodos temporales de marcapasos, oxigenadores, tubos y accesorios de oxigenador extracorporeo, dializadores, tubos y accesorios para dilisis, hemoadsorbentes e inmunoadsorbentes
Dispositivos principalmente en contacto

con huesos o con tejidos y fluidos de tejidos
Ejemplos de los primeros son clavos ortopdicos, placas, articulaciones de reemplazo,

prtesis seas, cementos y dispositivos intraseos; ejemplos de los segundos son
marcapasos, dispositivos de administracin de frmacos, sensores y simuladores
neuromusculares, tendones de reemplazo,
implantes mamarios, laringes artificiales,
implantes subperiosteales y pinzas de ligadura
Dispositivos principalmente en contacto

con sangre
Electrodos de marcapasos, fstulas arteriovenosas artificiales, vlvulas cardacas, injertos vasculares, catteres internos de administracin de frmacos y dispositivos de
asistencia ventricular
Piel
Dispositivos de Superficie
En Comunicacin con TejiDispositivos Externos de Codo, Hueso o Dentina

municacin
Sangre en Circulacin
Dispositivos de Implante
Tejido o Hueso
Sangre
Matriz de Seleccin de Prueba

La matriz proporciona pautas para la identificacin de procedimientos apropiados de pruebas biolgicas para las tres categoras de dispositivos mdicos: pruebas para Dispositivos de Superficie (ver la Tabla 3), pruebas para Dispositivos Externos de Comunicacin (ver la Tabla 4) y pruebas para Dispositivos de Implante (ver la Tabla 5). Cada categora de dispositivos se subcategoriza
y luego se subdivide an ms segn la duracin del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. La duracin del contacto se define como (A) limitada (menos de 24 horas); (B) prolongada (de 24 horas a 30 das); o (C) permanente (ms de 30 das). Los
efectos biolgicos que se incluyen en la matriz son citotoxicidad, sensibilizacin, irritacin o reactividad intracutnea, toxicidad
sistmica, toxicidad subcrnica, genotoxicidad, implantacin, hemocompatibilidad, toxicidad crnica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biodegradacin. Los captulos generales que contienen el procedimiento de prueba de
toxicidad para estos efectos biolgicos se indican en la Tabla 1.
Cada subcategora de la matriz tiene un panel asociado de requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el
panel aumenta cuando aumenta la duracin del contacto entre el dispositivo y el cuerpo, y a medida que el dispositivo o implante est en contacto ms cercano con el sistema circulatorio. Dentro de varias subcategoras, la opcin de realizar pruebas
adicionales a las requeridas se deber considerar caso por caso. Para tomar decisiones con respecto a la inclusin de pruebas
reproductivas o de desarrollo, el fabricante deber tomar en cuenta situaciones especficas, como por ejemplo el uso de dispositivos de implante permanente o dispositivos externos de comunicacin para mujeres embarazadas y nios. En la matriz se
Captulos
Tipo o Grado de Contacto
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proporcionan las pautas para la identificacin de posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcategora de dispositivos mdicos.
PAUTAS PARA LA SELECCIN DE LA DESIGNACIN DE CLASE DEL PLSTICO U OTRO

POLMERO PARA UN DISPOSITIVO MDICO
Captulos
Para proporcionar pautas para la seleccin de la designacin de clase adecuada de un plstico u otro polmero para un dispositivo mdico, se asigna a cada subcategora de los Dispositivos de Superficie (ver la Figura 2)
Fig. 2. Requisitos de USP para la clase de plstico y otros polmeros para dispositivos de superficie.
Categorizacin basada en la duracin del contacto: limitadamenos de 24 horas; prolongadade 24 horas a 30 das; permanentems de 30 das.
Designacin de la Clase de Plstico segn la USP.
y los Dispositivos Externos de Comunicacin (ver la Figura 3)
Fig. 3. Requisitos de USP para la clase de plstico y otros polmeros para dispositivos externos de comunicacin.
Categorizacin basada en la duracin del contacto: limitadamenos de 24 horas; prolongadade 24 horas a 30 das; permanentems de 30 das.
Designacin de la Clase de Plstico segn la USP.
una designacin segn la Clase de Plstico de la USP (ver Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88). Si las pruebas para
cada designacin de clase de la USP no son suficientes para un dispositivo especfico, el fabricante o profesional debe desarrollar un conjunto de pruebas adecuado. El nmero de clase numrica indicado aumenta en relacin a la duracin (riesgo) del
contacto entre el dispositivo y el cuerpo. En la categora de Dispositivos de Implante es obligatorio usar exclusivamente la clase
VI. La asignacin de la designacin de la Clase de Plstico de la USP se basa en las matrices de seleccin de prueba ilustradas
en las Tablas 3, 4 y 5.
USP 38
La asignacin de una designacin de clase de plstico u otro polmero a una subcategora no est destinada a restringir el
uso de clases superiores de plsticos u otros polmeros. Si bien la clase asignada define la clase numrica ms baja de plstico u
otro polmero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso de una clase numrica superior de plstico es opcional. Cuando un dispositivo se puede definir como perteneciente a ms de una categora de dispositivo, el plstico u otro polmero debe cumplir con los requisitos de la clase numrica ms alta.
Captulos
Superficies
Lesionadas
o
Afectadas
Membrana
Mucosa
C
X
B
X
Sensibilizacin
Irritacin
o Reactividad Intracutnea
Toxicidad Sistmica
(Aguda)
Toxicidad Subcrnica
Genotoxicidad
Implantacin
Efecto Biolgicob
Hemocompatibilidad
Tabla 3. Matriz de Seleccin de Prueba para Dispositivos de Superficie*
Toxicidad Crnica
Leyenda: Alimitada (menos de 24 horas); Bprolongada (de 24 horas a 30 das); Cpermanente (ms de 30 das).
Leyenda: Xpruebas de evaluacin ISO a considerar; Opruebas adicionales que pueden ser aplicables.
* Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluacin Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluacin Suplementarias a Considerar).
a
b
Dispositivos
de Superficie
Piel
Contacto Corporal
Citotoxicidad
Duracin
del Contactoa
Categora del Dispositivo
Captulos
Carcinogenicidad
Toxicidad
Reproductiva o del
Desarrollo
Biodegradacin

USP 38
X
X
X
X
B
C
B
C
Sensibilizacin
Citotoxicidad
Irritacin
Toxicidad Sistmica
(Aguda)
Toxicidad
Subcrnica
Genotoxicidad
Implantacin
Efecto Biolgicob
Toxicidad Crnica
Hemocompatibilidad
X
X
X
X
X
X
Tabla 4. Matriz de Seleccin de Prueba para Dispositivos Externos de Comunicacin*
Captulos
a
b
Sangre en
Circulacin
En Comunicacin
con
Tejido,
Hueso o
Dentina
Va Sangunea,
Indirecta
Contacto Corporal
Dispositivos
Externos de
Comunicacin
Duracin
del Contactoa
Categoras del Dispositivo
Carcinogenicidad
Toxicidad
Reproductiva o del
Desarrollo
Biodegradacin
USP 38
X
X
X
X
X
X
A
B
C
A
B
C
Tejido o
Hueso
Sangre
Citotoxicidad
Sensibilizacin
Irritacin
Toxicidad Sistmica
(Aguda)
Toxicidad
Subcrnica
Genotoxicidad
Implantacin
Efecto Biolgicob
Hemocompatibilidad
Tabla 5. Matriz de Seleccin de Prueba para Dispositivos de Implante*
Toxicidad Crnica
Carcinogenicidad
a
b
Dispositivos
de Implante
Contacto Corporal
Duracin
del Contactoa
Categora del Dispositivo
Captulos
Toxicidad
Reproductiva o del
Desarrollo
Biodegradacin

USP 38
USP 38
Informacin General / 1032 Valoraciones Biolgicas 829
1032 DISEO Y DESARROLLO DE VALORACIONES BIOLGICAS

1 INTRODUCCIN
1.1 Propsito y Alcance
1.2 Partes Interesadas

Este captulo est dirigido tanto a expertos en estadstica, como a analistas dedicados a la prctica de valoraciones biolgicas, quienes participan en el desarrollo de una valoracin biolgica. Este captulo servir al analista como gua para implementar la estructura y metodologa de la valoracin biolgica a fin de alcanzar las metas analticas, a la vez que demuestra de manera fidedigna la actividad biolgica de inters; por otra parte, servir al estadista para obtener informacin relacionada con las
limitaciones biolgicas que pudieran ser difciles de equilibrar con una prctica rigurosa de estadstica.
2. APTITUD DE LAS VALORACIONES BIOLGICAS PARA SU USO PREVISTO

Para evaluar la aptitud de una valoracin para su uso previsto, el analista debe especificar claramente los propsitos con los
que se lleva a cabo la valoracin biolgica. Los usos comunes para una valoracin biolgica incluyen la liberacin de lotes de
frmacos (ingredientes farmacuticos activos) y productos farmacuticos; la evaluacin de estabilidad; la calificacin del Estndar y de otros reactivos crticos; la caracterizacin de productos intermedios del proceso y formulaciones; la caracterizacin de
contaminantes y productos de degradacin; y la validacin de los cambios en el proceso de produccin del producto. Los requisitos de exactitud relativa, especificidad, precisin y robustez pueden ser diferentes para cada uno de los usos potenciales.
Una buena estrategia consiste en desarrollar y validar una valoracin biolgica para sustentar mltiples usos previstos; por
ejemplo, una valoracin biolgica desarrollada principalmente para la liberacin de partidas puede servir para otros propsitos.
Las decisiones relacionadas con la aptitud de uso deben basarse en consideraciones cientficas y estadsticas, as como en consideraciones prcticas tales como costos, tiempo de culminacin del proceso y requisitos de rendimiento para la valoracin.
Cuando las valoraciones se usan para la liberacin de lotes, una valoracin biolgica de modelo lineal permitira evaluar la
similitud suficientemente. Para valoraciones biolgicas que se usan para sustentar la estabilidad, la comparabilidad, para calificar materiales de referencia o reactivos crticos, o que se relacionan con cambios en los procesos de produccin o valoracin,
generalmente resulta til evaluar la similitud usando la curva de concentracin-respuesta completa, incluyendo las asntotas (si
estuvieran presentes).
2.1 Desarrollo del Proceso

Las valoraciones biolgicas por lo general son necesarias para el desarrollo y la optimizacin de la fabricacin de productos,
incluidos los procesos de formulacin y aumento de la escala de produccin. Las valoraciones biolgicas pueden usarse para
Captulos
El captulo general Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032 presenta metodologas para el desarrollo de procedimientos de valoracin biolgica que cuentan con un diseo experimental slido, capaces de proporcionar datos que pueden
ser analizados mediante principios estadsticos bien fundamentados, y adecuados para su uso especfico.
El captulo general 1032 forma parte del grupo de cinco captulos generales enfocados en valoraciones de potencia relativa, en las cuales se cuantifica la actividad de un material de Prueba mediante su comparacin con la actividad de un material
Estndar. No obstante, muchos de los principios se pueden aplicar a otros sistemas de valoracin.
El propsito de este captulo general es servir como gua para el diseo y el desarrollo de una valoracin biolgica para un
frmaco o producto farmacutico destinado para su distribucin comercial. Aunque la adopcin de los mtodos recomendados en este captulo puede requerir de una importante inversin de recursos durante el desarrollo de la valoracin, su implementacin temprana puede generar beneficios. Finalmente, las perspectivas y los mtodos descritos en este captulo son los
recomendados entre una gran variedad de alternativas ofrecidas por la teora y prctica contemporneas de las valoraciones
biolgicas.
nfasis en la Potencia RelativaDebido a la variabilidad inherente de los sistemas de anlisis biolgicos (incluyendo aquellos
que emplean animales, clulas, instrumentos, reactivos y los que se emplean a diario y entre laboratorios), una medicin absoluta de la potencia es ms variable que una medicin de la actividad pertinente a un Estndar, lo cual ha llevado a la adopcin
de la metodologa de la potencia relativa. Para poder suponer que los materiales Estndar y de Prueba son similares biolgicamente, debera demostrarse una similitud estadstica (una consecuencia de la similitud del material de Prueba y del Estndar), y
se podra esperar que la muestra de Prueba se comporte como una concentracin o dilucin del Estndar. La potencia relativa
es una medida sin unidad que se obtiene a partir de la comparacin de las relaciones dosis-respuesta de las preparaciones farmacuticas de Prueba y Estndar. Para los fines de la comparacin relativa del material de Prueba con el Estndar, generalmente se asigna a la potencia del Estndar un valor de 1 (o 100%). El Estndar puede ser un material establecido como tal por una
organizacin nacional (p.ej., la USP) o internacional (p.ej., la OMS), o puede tratarse de un Estndar interno.
830 1032 Valoraciones Biolgicas / Informacin General
USP 38
evaluar las estrategias de purificacin, optimizar el rendimiento del producto y medir la estabilidad del mismo. Dado que las
muestras tomadas durante todo el proceso se analizan y comparan con regularidad, es necesario estudiar cuidadosamente los
efectos de la matriz de muestras que pudieran afectar la respuesta de la valoracin a fin de determinar la aptitud de una valoracin para su uso. Para las mediciones de potencia relativa, puede ser necesario diluir el material Estndar en una matriz adecuada para cuantificacin. La precisin y exactitud de la valoracin biolgica deben ser suficientes para medir el desempeo
del proceso o para evaluar y comparar la estabilidad de las formulaciones propuestas.
2.2 Caracterizacin del Proceso

Las valoraciones biolgicas pueden llevarse a cabo para evaluar los efectos sobre la potencia de la droga relacionados con las
diferentes etapas de la fabricacin del frmaco o con los cambios en el proceso de fabricacin (p.ej. para demostrar la equivalencia del producto antes y despus de aplicar cambios en el proceso). Las valoraciones biolgicas usadas en este tipo de aplicacin pueden ser cualitativas o cuantitativas.
Captulos
2.3 Liberacin de Productos

Las valoraciones biolgicas se usan para evaluar la potencia del frmaco antes de la liberacin del producto comercial. En la
medida de lo posible, la valoracin debe reflejar o imitar el mecanismo de accin conocido o esperado del producto. Cuando
la valoracin biolgica no incluye la biologa funcional directamente relacionada con el mecanismo de accin, puede ser necesario demostrar una relacin entre las determinaciones de la potencia estimada por la valoracin biolgica y las obtenidas con
alguna otra valoracin que refleje mejor o de manera distinta la actividad funcional hipottica.
Para las pruebas de liberacin del producto, las especificaciones del mismo se establecen para definir valores mnimos o intervalos de potencia aceptables para el producto. La precisin del valor de informe obtenido de la valoracin biolgica debe
sustentar el nmero de dgitos significativos establecidos en la especificacin (ver el captulo general Validacin de Valoraciones
Biolgicas 1033) y, junto con la exactitud relativa, sustentar el intervalo de la especificacin. A fin de cumplir con estas especificaciones, el control de calidad de la fabricacin deber contar con especificaciones para la liberacin del producto con lmites
lo suficientemente estrechos como para acomodar cualquier prdida de actividad por inestabilidad o incertidumbre en la valoracin de liberacin.
2.4 Productos Intermedios del Proceso

La evaluacin de la valoracin biolgica de los productos intermedios del proceso puede proveer informacin con respecto a
la especificidad. Las estrategias de formulacin y llenado pueden basarse en valoraciones biolgicas para asegurarse de que el
producto farmacutico, incluido aqul que se encuentra en el envase final, cumplir con las especificaciones establecidas. Por
ejemplo, se pueden retener los materiales a granel sin formular y evaluar su potencia. Basndose en los resultados de potencia,
se puede decidir si los materiales a granel se combinan con otros lotes de material a granel, si se diluyen, o si se someten a
reprocesamiento. Para estos tipos de aplicaciones, las valoraciones biolgicas deben ser capaces de medir la actividad del producto en diferentes matrices. En algunos casos, se puede preparar un material Estndar distinto y utilizarlo para calcular la potencia relativa del producto intermedio del proceso.
2.5 Estabilidad
Las valoraciones de potencia pueden usarse para evaluar la estabilidad de vacunas y productos obtenidos por biotecnologa.
La informacin derivada de los estudios de estabilidad realizados durante el desarrollo en condiciones de almacenamiento reales y/o aceleradas o sometidas a estrs, puede emplearse para establecer la duracin de la vida til, as como para identificar y
estimar velocidades y productos de degradacin. Asimismo, se pueden usar estudios de estabilidad posteriores al otorgamiento de la licencia, a fin de monitorear la estabilidad del producto. Es importante contar con conocimientos acerca de la variabilidad a corto y largo plazo de la valoracin biolgica para garantizar un nivel aceptable de incertidumbre en las medidas de
potencia obtenidas.
2.6 Calificacin de Reactivos

La caracterizacin cuantitativa de un nuevo Estndar requiere una medicin exacta y precisa de la actividad biolgica del
nuevo Estndar. Esta medicin se usa para establecer que el lote del nuevo Estndar es equivalente al lote previo o para asignarle una potencia declarada con la que se puedan comparar las muestras de Prueba. Adems, puede ser necesaria una determinacin repetida adicional (que va ms all del anlisis de rutina) para lograr una mayor precisin en la medicin de potencia
del nuevo material Estndar. Asimismo, la valoracin biolgica se puede usar para calificar un reactivo para cultivo celular tal
como suero fetal bovino. La aptitud de uso en dichos casos se vincula con la capacidad de la valoracin para examinar lotes de
reactivo y para asegurar el rechazo de lotes que pudieran generar sesgo o comprometer las mediciones de potencia relativa.
USP 38
2.7 Integridad de los Productos

Las vacunas, los productos obtenidos por biotecnologa y los productos biolgicos pueden contener una poblacin de material heterogneo, incluido el material que se espera predomine en el producto. Algunas impurezas del proceso y productos de
degradacin pueden ser activos, parcialmente activos, inactivos o antagnicos a la respuesta medida en la valoracin biolgica. Para variantes o derivados del producto cuyos cambios en la estructura o en la composicin relativa pudieran relacionarse
con cambios sutiles aunque caractersticos en la respuesta de la valoracin biolgica (p.ej., cambio en la pendiente o asntota),
la valoracin biolgica puede resultar til para detectar y medir dichos derivados o variantes. Los estudios que identifican cambios caractersticos asociados con variantes del producto esperado ayudan a garantizar el desempeo uniforme del producto.
Siempre que resulte prctico, la valoracin biolgica debe estar acompaada de mtodos ortogonales sensibles a las variantes
del producto, a las impurezas del proceso y/o a los productos de degradacin.
3. ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA VALORACIN BIOLGICA

3.1 Valoraciones Biolgicas In Vivo
3.2 Valoraciones Biolgicas Ex Vivo

Las clulas o tejidos de donantes humanos o animales se pueden cultivar en el laboratorio y usarse para evaluar la actividad
de una muestra de Prueba. En el caso de las citoquinas, la mayora de las valoraciones emplean clulas del sistema hematopoytico o subconjuntos de clulas hematopoyticas de sangre perifrica, tales como clulas mononucleares de la sangre perifri-
Captulos
Las valoraciones de potencia in vivo son valoraciones biolgicas en las que se administran grupos de diluciones de los materiales Estndar y de Prueba a animales, y donde las relaciones de concentracinrespuesta se usan para estimar la potencia.
Para algunas valoraciones con animales, el punto final es simple (p.ej., una valoracin de aumento de peso corporal de la rata
para la hormona de crecimiento humano o una valoracin de peso de los ovarios de la rata para la hormona estimulante del
folculo), pero otras requieren el procesamiento adicional de muestras recolectadas de los animales tratados (p.ej., recuento de
reticulocitos para eritropoyetina, esteroideognesis para gonadotropinas, recuento de neutrfilos para factor estimulante de
colonias de granulocitos o titulacin de anticuerpos despus de la administracin de vacunas). Con la llegada de lneas celulares especficas para el mecanismo fisiolgico de accin (MOA, por sus siglas en ingls) hipottico, el uso de animales para la
medicin de potencia ha disminuido de manera importante. Los costos, el bajo rendimiento, as como cuestiones ticas y de
otro tipo abogan contra el uso de valoraciones biolgicas con animales. Asimismo, las agencias reglamentarias han promovido
la limitacin responsable, siempre que sea posible, del uso de animales (ver The Interagency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods, Mission, Vision, and Strategic Priorities; Febrero de 2004). Cuando la actividad in vitro no
est plenamente asociada con la actividad in vivo (p.ej., EPO), la combinacin de valoraciones in vitro basadas en clulas y de
un mtodo fisicoqumico adecuado (p.ej., IEF, anlisis de glicanos) puede ser un reemplazo para las valoraciones in vivo. No
obstante, las valoraciones in vivo pueden continuar siendo necesarias cuando las valoraciones in vitro no son capaces de detectar diferencias crticas relacionadas con la funcin biolgica prevista o esperada del frmaco.
Las respuestas fisiolgicas de los animales a los frmacos biolgicos (incluyendo vacunas) pueden predecir las respuestas de
los pacientes. La seleccin de animales de prueba por especie, cepa, gnero y madurez o intervalo de peso debe guiarse por el
objetivo de desarrollar un modelo representativo y sensible con el cual se evale la actividad de las muestras de Prueba.
Algunos mtodos de valoracin se adaptan al uso de colonias, en lugar de animales que no hayan sido previamente expuestos. Por ejemplo, las pruebas de pirgenos e insulina se benefician del uso de conejos de colonias que han sido previamente
expuestas, los cuales proveen una capacidad de respuesta confiable. Si los animales introducidos de manera reciente en la colonia no responden segn lo esperado despus de administrarles varias veces un compuesto, se les deber separar de la colonia para que no provoquen futuros resultados de valoracin invlidos o indeterminados. No obstante, para la valoracin de
compuestos altamente antignicos para pirgenos, se deben usar animales que no hayan sido previamente expuestos, a fin de
evitar resultados inexactos o confusos. Otras ventajas de las colonias incluyen condiciones ambientales controladas (macro/
ambiente y micro/gradilla), programas de alimentacin, aprovisionamiento de agua y rutinas de crianza uniformes.
Se pueden usar datos histricos que incluyan registros de la colonia y datos de la valoracin para identificar factores que
pudieran influenciar el desempeo de la valoracin. Es posible reducir la influencia de factores que pudieran generar sesgo
mediante la aplicacin de principios de aleatorizacin tales como la distribucin de intervalos de peso a travs de grupos de
dosis, asignacin de grupos de los contenedores de transporte a jaulas distintas o uso de patrones generados por computadora
o de plataforma para inyeccin/dosificacin. Para que el animal de prueba sea adecuado para su uso en una valoracin biolgica, ste debe estar sano y se le debe dar tiempo para que se estabilice en su ambiente. Los factores que se combinan para
influenciar el estado de salud del animal incluyen una nutricin adecuada, hidratacin, exencin de factores de estrs fsicos y
sicolgicos, saneamiento adecuado del lugar donde se hospeda, ciclo de luz controlado (diurno/nocturno), manipulacin experimentada, inyecciones y sangrados diestros y ausencia de ruido o vibracin. La observacin diaria de los animales de prueba
es esencial para mantener su salud, adems de que se debe contar con cuidados veterinarios para evaluar cualquier cuestin
que pudiera comprometer la validez de los resultados de la valoracin biolgica.
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ca o linfocitos de la sangre perifrica. Para protenas que actan sobre tejidos slidos, como por ejemplo factores y hormonas
del crecimiento, el tejido especfico sobre el que actan puede ser extrado de animales, disociado y cultivado durante un periodo limitado, ya sea como clulas adherentes o semiadherentes. Aunque un sistema de valoracin ex vivo tiene la ventaja de
ser similar al ambiente natural, tambin puede sufrir de variabilidad importante entre donantes, as como dificultades relacionadas con la disponibilidad de clulas apropiadas.
Las valoraciones biolgicas que involucran el uso de tejidos o clulas de un animal (p.ej., el mtodo de glucagn en hepatocito de rata) requieren un procesamiento similar al de las valoraciones in vivo para minimizar la variabilidad de la valoracin y el
sesgo. El nivel de esfuerzo para manejar el sesgo (p.ej., mediante aleatorizacin) debe ser adecuado para los propsitos de la
valoracin. Los factores adicionales que podran afectar los resultados de la valoracin incluyen la hora del da, el peso o madurez del animal, el anestsico usado, los componentes de las soluciones amortiguadoras/reactivos, la temperatura y posicin del
bao de incubacin y la viabilidad de las clulas.
Captulos
3.3 Valoraciones Biolgicas (Basadas en Clulas) In Vitro

Resulta posible utilizar valoraciones biolgicas que empleen lneas celulares que respondan a ligandos o agentes infecciosos
especficos para las valoraciones de liberacin de lote. Estas lneas celulares pueden derivarse de tumores, inmortalizarse como
lneas celulares dependientes de factores o lneas celulares transfectadas con receptores adecuados obtenidas por ingeniera
gentica. Asimismo, tambin es posible utilzar lneas celulares no transformadas que se puedan mantener durante un nmero
suficiente de pasajes (p.ej., fibroblastos). Independientemente de la lnea celular, se espera una respuesta de potencia adecuadamente equivalente durante un nmero de pasajes continuos. Los avances en la tecnologa de ADN recombinante y el entendimiento de los mecanismos de sealizacin celular han permitido la generacin de lneas celulares modificadas por ingeniera
con respuesta mejorada, expresin estable de receptores y mecanismos de sealizacin, as como una estabilidad ms perdurable. Las respuestas celulares relacionadas con la protena de inters dependen del mecanismo de accin del frmaco y de la
duracin de la exposicin. Dichas respuestas incluyen la proliferacin celular, muerte celular, actividad antiviral, diferenciacin,
secrecin de citoquinas/mediador y activacin de enzimas. Para las valoraciones que implican estas respuestas puede ser necesario incubar las clulas durante varios das, tiempo en el cual puede presentarse contaminacin, evaporacin poco uniforme y
otros efectos de ubicacin. Las autoridades reglamentarias han aceptado las respuestas comparativamente rpidas basadas en
mecanismos de sealizacin intracelular, tales como mensajeros secundarios, activacin de protena kinasa o expresin gnica
del indicador. Finalmente, la mayora de las lneas celulares usadas para valoraciones biolgicas expresan receptores para mltiples citoquinas y factores de crecimiento. Es posible que dicha falta de especificidad no sea perjudicial si se demuestra la especificidad de la muestra de Prueba.
El diseo de la valoracin biolgica basada en clulas debe reflejar el conocimiento que se tiene sobre los factores que influyen sobre la respuesta de las clulas con respecto al analito activo. La variabilidad de la respuesta a menudo se refleja en parmetros tales como la pendiente, EC50 de la curva de concentracinrespuesta o el intervalo de respuesta (respuesta mxima
menos mnima). Aunque la metodologa de la potencia relativa minimiza los efectos de la variacin de estos parmetros entre
valoraciones y entre bloques dentro de una valoracin, en las estimaciones de la potencia relativa, dicha variabilidad de la respuesta puede ocasionar que una valoracin sea difcil de administrar (es decir, puede ser difcil evaluar la aptitud del sistema).
Por consiguiente, aunque el desarrollo de la valoracin se debe enfocar principalmente en las propiedades de potencia, tambin resultan adecuados los esfuerzos para identificar y controlar la variacin en la relacin concentracinrespuesta. En el caso
de valoraciones por bloques (p.ej., mltiples placas de cultivo celular en una valoracin) con variacin apreciable en la forma
de la curva entre bloques, un anlisis que no incluya apropiadamente los bloques generara estimaciones infladas de variacin
dentro de la valoracin, ocasionando que la evaluacin de la similitud sea particularmente difcil. Se dispone de dos estrategias
para tratar la variacin entre bloques: la primera es un esfuerzo del laboratorio para identificar y controlar fuentes de variacin,
y la segunda es un esfuerzo estadstico para construir y emplear un diseo y anlisis en bloques. La combinacin de estas estrategias puede resultar particularmente efectiva.
El desarrollo de una valoracin biolgica basada en clulas comienza con la seleccin o generacin de una lnea celular. Uno
de los primeros pasos importantes para desarrollar una valoracin basada en clulas para la evaluacin de un producto comercial consiste en verificar que el uso de la lnea celular de inters no se restrinja nicamente a investigacin. De ser posible, para
asegurar el abastecimiento adecuado y uniforme de clulas para el anlisis de productos, se debe generar un banco de clulas.
Resulta necesario documentar en la medida de lo posible la informacin relacionada con las caractersticas funcionales y genticas de la lnea celular de la valoracin biolgica, incluyendo detalles del historial de la lnea celular desde el origen hasta su
incorporacin al banco, por ejemplo, la informacin sobre una lnea celular recombinante que podra incluir la identificacin
de la fuente de la lnea celular madre (banco de clulas interno, almacn externo, etc.), de las secuencias de ADN usadas para
transfeccin, y del rgimen subsiguiente de seleccin y anlisis funcional que result en la seleccin de la lnea celular. Aunque
no siempre resulta prctico, es convienente contar con informacin suficiente que permita recrear una lnea celular similar en
caso necesario. La informacin pertinente puede incluir: identidad (p.ej., isoenzima, marcadores fenotpicos, anlisis gentico);
morfologa (p.ej., imgenes fotogrficas archivadas); pureza (p.ej., anlisis de deteccin de micoplasmas, bacterias, hongos y
virus); crioconservacin; condiciones de descongelacin y cultivo (p.ej., componentes de los medios, temperatura y mtodo
de descongelacin, mtodos de propagacin, densidades de siembra, condiciones de recoleccin); viabilidad de la descongelacin (inmediatamente despus de haber sido congelada y despus de un tiempo de almacenamiento); caractersticas de crecimiento (p.ej., tiempos de duplicacin de las clulas); y estabilidad funcional (p.ej., ploida).
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3.4 Estndar
El Estndar es un reactivo crtico en las valoraciones biolgicas debido a la necesidad de contar con un material de prueba
confiable contra el que se pueda comparar cuantitativamente una preparacin de Prueba. Se puede asignar al Estndar una
cantidad de unidades o actividad especfica que represente un material con una potencia total (100%). Siempre que sea posible, un Estndar debe ser representativo de las muestras que se van a analizar en la valoracin biolgica. El anlisis que se lleva
a cabo para calificar un Estndar puede ser ms riguroso que el anlisis de rutina usado para la liberacin del lote.
Un Estndar debe almacenarse en condiciones que ayuden a conservar toda su potencia durante el tiempo esperado de uso.
Con este propsito, el Estndar se puede almacenar en condiciones diferentes a las del almacenamiento normal del frmaco o
producto farmacutico. Esto puede incluir una temperatura diferente (p.ej., 70 o 20, en lugar de 28), un envase diferente (p.ej., viales de plstico en lugar de jeringas), una formulacin diferente (p.ej., formulacin liofilizable o la adicin de
protenas portadoras tales como albmina srica humana, estabilizantes, etc.). El material Estndar debe analizarse para determinar su estabilidad en intervalos apropiados. Los criterios de aptitud del sistema para la valoracin biolgica tales como respuesta mxima o de fondo, pendiente EC50 o potencia del control de la valoracin, pueden usarse para detectar cambios en la
actividad del Estndar. Se pueden realizar estudios de estabilidad acelerados para estimar las velocidades de degradacin y para establecer caractersticas reconocibles de inestabilidad del Estndar.
En las etapas posteriores del desarrollo clnico, el Estndar puede prepararse usando el proceso de fabricacin empleado en
los ensayos clnicos claves. Si la formulacin del Estndar es diferente de la usada en el proceso de fabricacin del producto
farmacutico, ser importante demostrar que la evaluacin de la similitud y la estimacin de la potencia realizadas en la valoracin no son afectadas por las diferencias en la formulacin. Un Estndar inicial puede recibir el nombre de Estndar Primario.
Los Estndares subsiguientes se pueden preparar usando procesos de fabricacin vigentes y se pueden denominar Estndares
de Trabajo. Puede ser necesario implementar distintos Procedimientos Operativos Estndares, a fin de establecer tales estndares para cada producto. En ocasiones, las mediciones de potencia pueden presentar sesgo si la actividad del Estndar cambia
gradualmente. Asimismo, se puede observar una prdida de similitud si, con el tiempo, el Estndar sufre cambios en la glicosilacin. Resulta prudente archivar alcuotas de cada lote de Estndar para evaluar la comparabilidad con Estndares posteriores
y para investigar cualquier desviacin en la valoracin.
4. ASPECTOS ESTADSTICOS DE LOS ELEMENTOS FUNDAMENTALES DE LAS VALORACIONES

BIOLGICAS
Los elementos estadsticos del desarrollo de valoraciones biolgicas incluyen el tipo de datos, la medicin de la respuesta a
concentraciones variadas, el diseo de la valoracin, el modelo estadstico, el tratamiento de los datos previo al anlisis, los
mtodos de anlisis de datos, la prueba de aptitud y el anlisis de valores aberrantes. Tales componentes forman el sistema de
valoracin biolgica que se utilizar para estimar la potencia de una muestra de Prueba.
Captulos
La caracterizacin de clulas y la vigilancia relacionada con cuestiones del desempeo de la valoracin que se reflejan en el
estado de las clulas son necesarias para asegurar la calidad y longevidad de los bancos de clulas que se usan en el entorno
de Control de Calidad. La salud general y el estado metablico de las clulas al momento de la valoracin biolgica puede
influir de manera importante sobre los resultados de las pruebas. Cuando una lnea celular ha sido caracterizada y est lista
para su inclusin en el banco, los analistas a menudo preparan un banco de dos niveles (Maestro y de Trabajo). El Banco de
Clulas Maestro se crea como fuente para el Banco de Clulas de Trabajo. El Banco de Clulas de Trabajo se obtiene a partir de
la expansin de uno o ms viales del Banco de Clulas Maestro. El tamao de los bancos depende de las caractersticas de
crecimiento de las clulas, del nmero de clulas requerido para cada valoracin y de la frecuencia con que se realizar la valoracin. Algunas clulas pueden ser sensibles a la crioconservacin, a la descongelacin y a las condiciones de cultivo, por lo
que los bancos se deben preparar y caracterizar cuidadosamente antes de usarlos en estudios de validacin y para su uso regular en el laboratorio de Control de Calidad.
Adems, existen factores que pueden afectar la respuesta de la valoracin biolgica y la evaluacin de la potencia, los cuales
son comunes en muchas valoraciones biolgicas basadas en clulas: tipo de clula (adherente o no adherente); descongelacin de las clulas; densidad de plaqueo (durante la descongelacin y durante el mantenimiento de la sucesin de siembra) y
confluencia (clulas adherentes); frascos de cultivo; crecimiento, montaje de placas y medios de valoracin; requisitos del suero (fuente, inactivacin con calor, irradiacin con rayos gamma); condiciones de incubacin (temperatura, CO2, humedad,
tiempos de cultivo desde la descongelacin); reactivos y tcnicas para recoleccin de clulas (para clulas adherentes, mtodo
de disociacin); separacin y clasificacin de clulas; recuento de clulas; determinacin de la salud de las clulas (velocidad de
crecimiento, viabilidad, rendimiento); nmero de pasajes de clulas y programa de pasajes; estabilidad de la lnea celular (a
nivel gentico, de receptor, de marcador, de expresin gnica); y etapas de inanicin o estimulacin. La lista anterior no es
definitiva, por lo que el desarrollo de la valoracin debe incluir analistas que cuenten con una amplia comprensin y experiencia con respecto a la lnea celular. Estos analistas experimentados deben identificar factores que podran influir en los resultados de la valoracin y, siempre que sea posible, establecer estrategias para un nivel de control adecuado.
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4.1 Datos
Existen, fundamentalmente, dos tipos de datos de valoracin biolgica: cuantitativos y cuantales (categricos). Los datos
cuantitativos pueden ser continuos (que no se limitan a observaciones discretas; p.ej., recopilados de un instrumento), de recuento (p.ej., unidades formadoras de placas) o discretos (p.ej., ttulos de dilucin determinados por punto final). Los datos
cuantales a menudo son dicotmicos; por ejemplo, vida/muerte en un modelo de respuesta animal o positivo/negativo en un
ensayo de infectividad basado en placa que resulte en la destruccin de una monocapa celular despus de la administracin de
un agente infeccioso. Los datos cuantitativos se pueden transformar en datos cuantales seleccionado un umbral que distinga
una respuesta positiva de una respuesta negativa. Dicho umbral se puede calcular a partir de datos obtenidos de un control
negativo, por ejemplo, sumando (o restando) una medida de incertidumbre (tal como dos o tres veces la desviacin estndar
de las respuestas de control negativo) al promedio del control negativo. Los analistas deben ser cuidadosos con respecto a la
transformacin de datos cuantitativos en datos cuantales, puesto que dicha operacin resulta en una prdida de informacin.
Captulos
4.2 Suposiciones
Una suposicin clave para el anlisis de la mayora de las valoraciones biolgicas es que las muestras Estndar y de Prueba
contienen el mismo analito efectivo o poblacin de analitos y, por consiguiente, se puede esperar que se comporten de manera similar en la valoracin biolgica. A esto se le denomina similitud. Tal como se presentar en mayor detalle en el captulo
general Anlisis de Datos de Valoraciones Biolgicas 1034 para modelos estadsticos especficos, la similitud biolgica implica la
presencia de similitud estadstica (para modelos de lneas paralelas y curvas paralelas, las curvas del Estndar y de la muestra de
Prueba son paralelas; para modelos de cociente de pendiente, las lneas del Estndar y de la muestra de Prueba tienen una
misma ordenada al origen). Cualquier afirmacin contraria es falsa. La similitud estadstica (lneas paralelas, curvas paralelas o
misma ordenada al origen, segn corresponda) no asegura la similitud biolgica. No obstante, incumplir con la similitud estadstica puede tomarse como evidencia contra la similitud biolgica. Por lo tanto, la existencia de un par Estndarmuestra de
Prueba que pase la evaluacin de similitud estadstica es una condicin necesaria, pero no suficiente, para cumplir con la suposicin clave de la similitud biolgica. En consecuencia, la similitud biolgica sigue siendo, inevitablemente, una suposicin. Las
desviaciones de la similitud estadstica que presenten valores constantes a travs de valoraciones repetidas pueden indicar efectos de la matriz o diferencias reales entre los materiales Estndar y de Prueba. Lo anterior resulta cierto incluso si la desviacin
de la similitud estadstica es lo suficientemente pequea como para sustentar la determinacin de una potencia relativa.
En muchas valoraciones, mltiples compuestos proporcionarn curvas de concentracinrespuesta similares, por lo que puede resultar razonable emplear un sistema de valoracin biolgica para describir o incluso comparar las curvas de respuesta de
diferentes compuestos. No obstante, no es apropiado informar la potencia relativa a menos que las muestras Estndar y de
Prueba contengan nicamente el mismo analito o poblacin de analitos activos. Los productos biolgicos a menudo presentan
variaciones entre lotes con respecto a la distribucin de analitos (es decir, la mayora de los productos biolgicos contienen un
producto de inters y, en niveles aceptablemente bajos, algunos contaminantes del proceso que pueden mostrarse activos en
la valoracin biolgica). Por lo tanto, la evaluacin de la similitud es, al menos en parte, una evaluacin que determina si la
distribucin de analitos en la muestra de Prueba es lo suficientemente cercana a la distribucin en la muestra Estndar como
para que la potencia relativa sea significativa; en otras palabras, la valoracin es una comparacin de caractersticas. Cuando
existe evidencia (derivada de mtodos diferentes a la valoracin biolgica) de que las muestras Estndar y de Prueba no contienen los mismos compuestos activos, no se cumple con la suposicin de similitud biolgica, por lo que no es apropiado informar la potencia relativa.
Otras suposiciones estadsticas comunes en el anlisis de valoraciones biolgicas cuantitativas son la varianza constante de
las respuestas alrededor de un modelo ajustado (ver la seccin 4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin
para un anlisis ms profundo), residuos normalmente distribuidos (un residuo es la diferencia entre una respuesta observada y
la respuesta prevista por el modelo) e independencia de los residuos.
La varianza constante, normalidad e independencia estn interrelacionadas en la prctica de la valoracin biolgica. Para valoraciones biolgicas con una respuesta cuantitativa, se puede usar una transformacin de datos bien seleccionada para obtener una varianza aproximadamente constante y una distribucin de residuos casi normal. Una vez que se ha impuesto la transformacin, queda pendiente tratar la suposicin de independencia reflexionando sobre la estructura del diseo de la valoracin biolgica en el modelo de anlisis. La independencia de los residuos es importante para evaluar la aptitud del sistema y de
la muestra.
4.3 Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin

Los anlisis simples de los datos de valoraciones biolgicas cuantitativas requieren que los datos presenten una distribucin
aproximadamente normal con una varianza casi constante cercana de un extremo a otro del intervalo de los datos. Para los
modelos de regresin lineal y no lineal, la varianza referida en este captulo es la varianza residual derivada del ajuste del modelo. A menudo, no se observa la varianza constante; la heterogeneidad de la varianza se puede manifestar como un incremento
en la variabilidad con un incremento en la respuesta. Si las varianzas no son iguales, pero los datos se analizan como si lo fueran, la estimacin de la potencia relativa an podra ser razonable; no obstante, si no se trata la varianza inconstante alrededor
del modelo de concentracinrespuesta ajustado se obtendr una estimacin poco confiable de la varianza dentro de la valora-
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Captulos
cin. Asimismo, la evaluacin de la similitud estadstica puede no ser exacta y no se deben usar los errores estndar ni los intervalos de confianza para todos los parmetros (incluyendo un intervalo para la potencia relativa basado en el Teorema de Fieller). Los intervalos de confianza para la potencia relativa que combinan estimaciones de potencia de mltiples valoraciones
pueden ser errneos si se usa el error dentro de la valoracin para calcular el intervalo de confianza.
La constancia de la varianza se puede evaluar mediante grficas de residuos, anlisis Box-Cox (o ley del poder) o la prueba
de Levene. Con la prueba de Levene, en lugar de basarse en el valor p, el cambio obtenido en la estadstica es til como fundamento para juzgar si se ha mejorado o deteriorado la homogeneidad. La varianza se evala mejor en un conjunto grande de
datos de valoracin. Resulta inapropiado usar nicamente la varianza entre determinaciones repetidas de la valoracin vigente,
debido a que existen muy pocos datos para determinar de manera adecuada varianzas verdaderamente representativas, especficas para cada concentracin. Los datos sobre la varianza son escasos durante el desarrollo; resulta prudente reevaluar la varianza durante la validacin y monitorearla peridicamente durante el uso continuo de la valoracin.
Dos mtodos usados para mitigar la heterogeneidad de la varianza son la transformacin y la ponderacin. La falta de varianza constante puede tratarse mediante una transformacin adecuada. Asimismo, la transformacin puede mejorar la normalidad de los residuos y el ajuste de algunos modelos estadsticos a los datos. Se debe seleccionar una transformacin para un
sistema de valoracin durante el desarrollo, verificarla durante la validacin, usarla de manera uniforme en las valoraciones de
rutina y verificarla peridicamente. Los datos de la valoracin biolgica comnmente se presentan con la concentracin transformada por logaritmo; las valoraciones de cociente de la pendiente se presentan con la concentracin en la escala original.
La transformacin se puede aplicar a los datos de la respuesta, as como a los datos de la concentracin. Las opciones comunes para una transformacin de la respuesta incluyen la transformacin logartmica, por raz cuadrada (para recuentos), recproca y, para el recuento de datos con asntotas conocidas, por logit del porcentaje de mxima respuesta. Las transformaciones logartmicas son de uso comn, debido a que convierten un segmento til de la relacin concentracinrespuesta en un
segmento casi lineal y debido a su facilidad para transformar de vuelta a la escala original para fines de interpretacin. Se puede llevar a cabo un ajuste loglog con datos que presentan un comportamiento no lineal. Asimismo, existen otras alternativas
disponibles, p. ej., los datos se pueden transformar mediante la inversa de la funcin del Poder de la Media (POM, por sus siglas
en ingls). Un coeficiente del Poder de la Media de k = 2 corresponde a una transformacin logartmica de los datos. Para un
anlisis ms extenso de las relaciones entre datos transformados por logaritmos y datos sin transformar, ver el Apndice del
captulo general Validacin de Valoraciones Biolgicas 1033.
Se debe tomar en cuenta que la transformacin de los datos requiere la reevaluacin del modelo usado para ajustar los datos. Desde el punto de vista estadstico, no existe nada especial con respecto a la escala original de medicin; resulta aceptable
cualquier transformacin que mejore la concordancia con las suposiciones. No obstante, los analistas deben reconocer que las
transformaciones, la seleccin del modelo estadstico y la seleccin del esquema de ponderacin estn interrelacionadas. El uso
de una transformacin puede afectar la seleccin del modelo estadstico, es decir, transformar la respuesta mediante un logaritmo o raz cuadrada, por ejemplo, puede cambiar la forma de la curva de respuesta y, para un modelo lineal, puede cambiar
el intervalo de concentraciones cuyas respuestas sean casi rectas y casi paralelas.
Para valoraciones con varianza no constante, una opcin razonable es la adopcin de un anlisis ponderado. Aunque la ponderacin no puede tratar la falta de normalidad residual, se considera una metodologa estadstica vlida para poner nfasis en
datos ms precisos. Idealmente, las ponderaciones se pueden basar en la inversa de la varianza prevista dentro de la valoracin
(o dentro de los bloques) de cada respuesta donde los factores que predicen la varianza son independentes de las respuestas
observadas en una valoracin especfica.
En la prctica, muchas valoraciones biolgicas presentan variaciones relativamente grandes en el logaritmo EC50 (en comparacin con la variacin en el logaritmo de la potencia relativa) entre valoraciones (y, en ocasiones, entre bloques dentro de la
valoracin). Cuando no se trata en el modelo de varianza, esta variacin en el logaritmo EC50 provoca lo que parece ser una
gran variacin en las respuestas cercanas a la media logartmica EC50, lo cual a menudo resulta en ponderaciones demasiado
bajas para las observaciones cercanas al EC50.
Si la valoracin es lo suficientemente estable (baja variabilidad en el EC50), la varianza puede considerarse alternativamente
como una funcin de la concentracin. Aunque no es lo ideal, podra ser razonable una metodologa que utiliza varianzas dependientes de la concentracin cuando las ponderaciones se estiman a partir de un gran nmero de valoraciones, las varianzas
son pequeas, cualquier desequilibrio en el nmero de observaciones de todas las concentraciones es tratado en el modelo de
varianza y no se presentan observaciones inusuales (valores aberrantes). Esta posibilidad se puede examinar graficando la varianza de la respuesta en cada concentracin (de preferencia, combinada a travs de mltiples valoraciones) en funcin de la
concentracin y luego contra una funcin de la concentracin (p.ej., concentracin cuadrada). La varianza ser proporcional a
la funcin de concentracin donde esta lnea trazada se aproxime a una lnea recta. La pendiente aparente de esta lnea es
informativa, debido a que una lnea horizontal indica que no es necesaria la ponderacin. Si se puede encontrar una funcin
que genere una grfica lineal, entonces las ponderaciones se consideran proporcionales a la recproca de dicha funcin. Dicha
funcin puede no existir, en particular si la variacin es mayor (o menor) en ambos extremos del intervalo de concentracin
estudiado.
Independientemente de si se emplea un modelo o datos histricos, el objetivo es capturar la variabilidad relativa en cada
concentracin. No es necesario asumir que el nivel de variabilidad absoluto de la valoracin en uso es idntico al de los datos
usados para determinar la ponderacin, sino que nicamente los intervalos de las varianzas entre concentraciones sean uniformes con los datos histricos o con los datos usados para determinar la funcin de la varianza.
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La capacitacin y experiencia apropiadas en mtodos estadsticos son esenciales para determinar una estrategia para generar
un modelo de varianza adecuada. Las fuentes de variabilidad pueden identificarse de manera errnea si se emplea el modelo
incorrecto de varianza. Por ejemplo, los datos pueden presentar una variacin constante a lo largo de una curva logstica de
concentracinrespuesta de cuatro parmetros, pero tambin puede tener una variacin apreciable en el parmetro EC50 entre
bloques dentro de la valoracin, o entre valoraciones. Si no se reconoce la variabilidad entre bloques o entre valoraciones, podra parecer que esta valoracin tiene una gran variacin en la respuesta para concentraciones cercanas al valor promedio a
largo plazo del EC50. Un modelo ponderado con ponderaciones bajas para concentraciones cerca del EC50 podra representar
errneamente una caracterstica principal del sistema de valoracin.
Captulos
4.4 Normalidad
Muchos mtodos estadsticos para el anlisis de respuestas cuantitativas suponen la normalidad de los residuos. Si no se
cumple la suposicin de normalidad, la estimacin de la potencia relativa y su error estndar pueden considerarse razonables,
pero las pruebas de aptitud y un intervalo de confianza para la estimacin de la potencia relativa podran ser invlidos. La mayora de los mtodos usados en este captulo son razonablemente robustos frente a desviaciones de la normalidad, por lo que
el objetivo es detectar anormalidades importantes. Durante el desarrollo de la valoracin, y con el objeto de descubrir desviaciones importantes de la normalidad, se pueden usar herramientas grficas tales como una grfica de probabilidad normal o
un histograma (o una herramienta similar como las grficas de tallo y hoja o de caja) de los residuos a partir del ajuste del
modelo. El histograma debe ser unimodal y simtrico. La grfica de probabilidad normal debe aproximase a una lnea recta;
una grfica de probabilidad normal que no es recta (p.ej., curva en un extremo, en ambos extremos, o en la parte media)
indica la presencia de anormalidad. Un patrn sobre una lnea recta es indicativo de anormalidad. El comportamiento anormal
puede deberse a mediciones que son logartmicas normales y presentan una variabilidad mayor a niveles ms altos de respuesta. Lo anterior se puede considerar un patrn cncavo en los residuos en una grfica normal.
Las pruebas estadsticas de normalidad pueden no ser tiles. De acuerdo con la discusin previa sobre anlisis estadstico de
la constancia de la varianza, cambiar el valor de una estadstica de la prueba de normalidad, en lugar de basarse en un valor p,
funciona para juzgar si la normalidad se ha mejorado o empeorado. En lo que respecta a la evaluacin de la varianza, se debe
evaluar la normalidad en un conjunto de datos tan grande como sea posible durante el desarrollo, reevaluarlos durante la validacin y monitorearlos peridicamente durante el uso de la valoracin. Las desviaciones importantes de la normalidad a menudo pueden mitigarse mediante una transformacin adecuada. La falta de evaluacin y mitigacin de desviaciones importantes de la normalidad conlleva el riesgo de inhabilitar la deteccin apropiada de valores aberrantes, as como una prdida en la
capacidad de obtener estimaciones confiables de variacin.
4.5 Linealidad de los Datos de ConcentracinRespuesta

Algunos anlisis de valoraciones biolgicas suponen que la forma de la curva de concentracinrespuesta es una lnea recta
o se aproxima a una lnea recta para un intervalo limitado de concentraciones. En dichos casos, se puede evaluar un modelo
de respuesta lineal para determinar si se justifica para los datos disponibles. Los mtodos de anlisis de diferencias para evaluar
la linealidad enfrentan los mismos problemas que los mtodos de anlisis de diferencias aplicados al paralelismoms datos y
una mejor precisin incrementan la posibilidad de detectar la falta de linealidad. Debido a que casi siempre la falta de linealidad afecta la estimacin de la potencia, los analistas deben evaluar las desviaciones de la linealidad de manera rutinaria si desean emplear un modelo de respuesta lineal para estimar la potencia.
Si el examen de una grfica revela claramente una desviacin de la linealidad, es suficiente para concluir la falta de linealidad. Sin embargo, una alta variabilidad de los datos puede ocultar una desviacin de la linealidad. Por consiguiente, una metodologa general para linealidad puede corresponder con la usada para la similitud, que se desarrolla de manera ms elaborada en la seccin 4.7 Anlisis de Aptitud y Aplicacin del Anlisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo).
(1) Especificar una medida de desviacin de la linealidad que se pueda combinar con todas las muestras o que sea especfica
para una muestra. Las posibilidades incluyen la suma de la falta de linealidad de coeficientes cuadrados o cuadrticos.
(2) Se puede emplear una de las cuatro metodologas del Paso 2 de Aplicacin del Anlisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo) para determinar, durante el desarrollo, un intervalo de valores aceptables (intervalo de aceptacin) para la medida
de la falta de linealidad.
(3) Determinar un intervalo de confianza bilateral del 90% en la medicin de la falta de linealidad, siguiendo el procedimiento de Pruebas Doblemente Unilaterales (TOST, por sus siglas en ingls) y comparar el resultado con el intervalo de aceptacin segn se determina en (2).
A menudo, se seleccionar un subconjunto de concentraciones medidas en la valoracin para establecer una curva lineal de
concentracinrespuesta, el cual puede identificarse grficamente. Las concentraciones en los extremos del intervalo deben ser
examinadas cuidadosamente, debido a que a menudo tienen un gran impacto sobre la pendiente y los clculos derivados de
la pendiente. Si la intencin en la valoracin final es usar nicamente concentraciones en el intervalo lineal, se debe seleccionar
un intervalo de concentraciones que genere lneas rectas paralelas para las potencias relativas esperadas durante el uso rutinario de la valoracin; de otro modo, la valoracin no pasar las pruebas de paralelismo cuando la potencia produzca valores de
respuesta de la valoracin que estn fuera del intervalo lineal de respuesta. Cuando la potencia est fuera del intervalo lineal,
podra resultar apropiado ajustar la concentracin de la muestra basndose en dicha potencia estimada y analizar de nuevo
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4.6 Modelos Comunes de Valoracin Biolgica

La mayora de las valoraciones biolgicas consisten en una serie de concentraciones o diluciones de una muestra de Prueba y
de un material Estndar. Un modelo matemtico se ajusta a los datos de concentracinrespuesta y, posteriormente, se puede
calcular una potencia relativa a partir de los parmetros del modelo. La seleccin del modelo puede depender de si se estn
analizando datos cuantitativos o cualitativos.
Para datos cuantitativos, los modelos que emplean perfiles de respuestas paralelas, los cuales sustentan la evaluacin comparativa para determinar la potencia relativa, pueden ofrecer ventajas estadsticas. Si se emplean dichos modelos, las concentraciones o diluciones por lo general se modifican usando una escala geomtrica, p.ej., en incrementos duplicativos, logartmicos
o de logaritmo medio. Si se usa el modelo de cociente de la pendiente, las concentraciones o diluciones se pueden espaciar de
igual manera en la concentracin, en lugar del logaritmo de la concentracin. Es posible usar diversas funciones para ajustar
un modelo de respuesta paralelo a datos cuantitativos, incluyendo una funcin lineal, una funcin polinmica de orden mayor,
una funcin logstica de cuatro parmetros (sigmoidea simtrica) y una funcin logstica de cinco parmetros para sigmoideas
asimtricas. Dichas funciones requieren un nmero suficiente de concentraciones o diluciones para ajustarse al modelo. Para
evaluar la falta de ajuste de cualquier modelo, es necesario contar con al menos una concentracin (o dilucin) preferiblemente varias ms que el nmero de parmetros que se estimarn en el modelo. Asimismo, por lo regular se usa por lo menos una concentracin de preferencia dos para sustentar cada asntota.
En ocasiones, se selecciona un modelo lineal debido a su eficiencia aparente y facilidad de procesamiento. Debido a que los
perfiles de respuesta de la valoracin biolgica son, por lo general, no lineales, el laboratorio puede realizar un experimento
con un amplio intervalo de concentraciones para identificar la regin aproximadamente lineal del perfil de concentracinrespuesta. Para datos que siguen un modelo logstico de cuatro parmetros, stas son las concentraciones cercanas al centro de la
regin de la respuesta, a menudo una respuesta de 20% a 80% cuando se modifica nuevamente la escala de los datos para las
asntotas. Se deben tomar precauciones apropiadas cuando se emplea un modelo lineal, debido a las diversas razones por las
que una regin aparentemente lineal podra cambiar. Es posible identificar una regin lineal estable despus de acumular suficiente experiencia con la valoracin y con la variedad de muestras que se espera analizar con la misma. Los datos que siguen la
funcin logstica de cuatro parmetros tambin se pueden linealizar mediante transformacin. La regin inferior de la funcin
es aproximadamente lineal cuando los datos se transforman con logaritmos (ajuste loglog).
Por lo regular, los datos cuantales se ajustan usando modelos matemticos ms complejos. Se puede utilizar un modelo de
probita o de logit para estimar un percentilo de la curva de respuesta (a menudo el percentilo 50) o, de manera ms directa, la
potencia relativa de la Prueba con respecto al Estndar. El anlisis Spearman-Krber es un mtodo sin modelo que se puede
emplear para la determinacin del percentilo 50 de una curva de concentracinrespuesta cuantal.
4.7 Anlisis de Aptitud

La evaluacin de la aptitud del sistema y de la aptitud de la muestra son necesarias para asegurar la calidad de los resultados
de la valoracin biolgica. La aptitud del sistema en la valoracin biolgica, al igual que en otros mtodos analticos, consta de
criterios previamente especificados mediante los cuales se evala la validez de una valoracin (o, posiblemente, una corrida
que contenga varias valoraciones). Los analistas pueden evaluar la aptitud del sistema determinando si algunos de los parme-
Captulos
para obtener un resultado de potencia vlido. Las valoraciones repetidas en conjunto con las valoraciones vlidas pueden generar una estimacin de potencia sesgada, debido al proceso selectivo de repetir valoraciones cuando la respuesta est en los
extremos de la curva de concentracinrespuesta.
El problema es ms complejo para valoraciones en las que existe incluso una modesta variacin en la forma o ubicacin de la
curva de concentracinrespuesta de corrida a corrida o entre bloques dentro de una valoracin. En tales valoraciones, puede
resultar apropiado seleccionar subconjuntos para cada muestra en cada valoracin, o incluso en cada bloque dentro de una
valoracin. Se debe tomar en cuenta que un modelo de efectos fijos eliminar la necesidad de subconjuntos diferentes en bloques diferentes, pero un modelo de efectos mixtos puede revelar y acomodar diferentes subconjuntos en diferentes bloques
(ver la seccin 4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas).
Las pautas adicionales con respecto a la seleccin de subconjuntos de datos para la estimacin de potencia relativa mediante
modelo lineal incluyen: usar al menos tres, y de preferencia cuatro, concentraciones adyacentes; que la pendiente del segmento lineal sea lo suficientemente pronunciada; que las lneas que se ajustan a las muestras Estndar y de Prueba sean rectas; y
que las lneas de regresin para el ajuste sean paralelas. Una forma de derivar un criterio de pronunciamiento es calcular una
estadstica t para evaluar si la pendiente es significativamente diferente de cero. Si la pendiente no es significativa, es posible
que la valoracin biolgica tenga un desempeo deficiente; lo anterior se puede observar como un aumento de variacin en
los resultados de potencia. Otro aspecto que sustenta el requisito de pronunciamiento adecuado de la pendiente es el uso de
algoritmos para la seleccin de subconjuntos. Sin un criterio de pronunciamiento de la pendiente, un algoritmo para la seleccin de subconjuntos, que busca identificar subconjuntos de tres o ms puntos de datos contiguos que sean rectos y paralelos,
podra seleccionar concentraciones en una asntota. Evidentemente, dichos subconjuntos son inapropiados para su uso en la
estimacin de la potencia. El pronunciamiento o la importancia del pronunciamiento de la pendiente deben depender de la
valoracin. Este criterio debe establecerse durante el desarrollo de la valoracin y, posiblemente, redefinirse durante la validacin de la valoracin.
Captulos
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tros de la respuesta del Estndar y algunas propiedades (p.ej., variacin residual) de los datos se encuentran en sus intervalos
habituales. A fin de obtener altas tasas de aceptacin en la valoracin, se recomienda aceptar grandes fracciones de estos intervalos habituales (99% o ms) y evaluar la aptitud del sistema usando nicamente unos pocos parmetros de respuesta del Estndar sin correlacin. La seleccin de los parmetros de aptitud del sistema y de sus intervalos tambin se puede informar
mediante estudios empricos o de simulacin que midan la influencia de los cambios sobre un parmetro en la estimacin de
la potencia.
La aptitud de la muestra en una valoracin biolgica se evala mediante criterios previamente especificados para la validez
de la estimacin de la potencia de una muestra de Prueba individual y, por lo regular, se enfoca en la evaluacin de la similitud. Es necesario establecer los criterios de aptitud del sistema y de la muestra durante el desarrollo de la valoracin biolgica y
antes de su validacin. Cuando se cuente con poca experiencia con respecto a la valoracin biolgica, dichos criterios pueden
considerarse provisionales.
Aptitud del SistemaLos parmetros de aptitud del sistema se pueden seleccionar basndose en el diseo y en el modelo
estadstico. No obstante, independientemente del diseo o modelo, los parmetros de aptitud del sistema debe estar directamente relacionados con la calidad de la valoracin biolgica. Dichos parmetros por lo regular se basan en muestras estndar
y de control. Por ejemplo, en las valoraciones de lneas paralelas, los valores bajos de la pendiente del Estndar a menudo generan estimaciones de potencia de baja precisin. En lugar de rechazar las valoraciones con pendientes bajas, el uso de valoraciones repetidas adicionales podra resultar ms efectivo para los analistas hasta que pueda mejorarse el sistema de valoracin
para generar estimaciones de potencia con una precisin ms alta de manera constante. El monitoreo del intervalo de niveles
de respuesta y ubicacin de las asntotas asociadas a controles o con la muestra del Estndar puede ser particularmente importante para establecer niveles de respuesta apropiados. Cualquier desviacin o tendencia en alguno de los criterios puede ser
indicativa de la degradacin de un reactivo crtico o del material Estndar. Se deben implementar mtodos de Control Estadstico de Procesos (SPC, por sus siglas en ingls) para detectar tendencias en los parmetros de aptitud del sistema.
Dos medidas comunes de aptitud del sistema son la evaluacin de la idoneidad del modelo (capacidad de ajuste) y de la
precisin. El uso de determinaciones repetidas en un diseo completamente aleatorizado permite separar un trmino de error
puro de la evaluacin de falta de ajuste. Se debe tener cuidado al derivar un criterio para la falta de ajuste; el uso de un trmino de error puro incorrecto puede provocar una evaluacin artificial. La falta de ajuste de la suma de cuadrados obtenida a
partir del ajuste del modelo al Estndar puede ser una medida til de idoneidad del modelo, dependiendo de las concentraciones usadas y de cmo difieran los datos obtenidos del modelo. Es posible establecer un umbral basndose en el anlisis de
sensibilidad (evaluacin de la sensibilidad de la valoracin a los cambios en el analito) y/o datos histricos, ms all de los cuales el valor de falta de ajuste indica que los datos no son adecuados. Se debe tomar en cuenta que los datos de Prueba no se
usan en esta parte; la idoneidad del modelo para la Prueba es parte de la aptitud de la muestra.
Existen dos alternativas a considerar para evaluar la precisin. Un mtodo emplea el error cuadrtico medio (varianza residual) a partir del ajuste del modelo con el Estndar nicamente. Dado que esta metodologa puede tener pocos grados de
libertad para la estimacin de la varianza, podra resultar ms til emplear un error cuadrado medio combinado a partir de
ajustes de modelos separados con el Estndar y la Prueba. Una vez que se haya seleccionado la medida, se usan datos histricos y anlisis de sensibilidad para determinar un umbral de aceptacin.
Aptitud de la MuestraLa aptitud de la muestra en la valoracin biolgica por lo general consiste en la evaluacin de la
similitud, la cual nicamente se puede realizar dentro del intervalo de valoracin. La potencia relativa se puede informar nicamente a partir de muestras que presenten una similitud con el Estndar, que tengan la calidad requerida para el ajuste del
modelo y que hayan sido diluidas para generar un EC50 (y potencia) dentro del intervalo del sistema de valoracin.
SimilitudEn el contexto de evaluacin de similitud, el anlisis de hiptesis clsico (diferencia) evala la hiptesis nula que
establece que una medida (un parmetro de no similitud que mide la diferencia entre las curvas de concentracin-respuesta
del Estndar y de la Prueba) es cero, con una hiptesis alternativa implcita que establece que la medida no es cero o que no se
han cumplido las suposiciones estadsticas. El criterio habitual (la prueba de diferencia) que indica que el valor p debe ser
mayor que cierto valor crtico para poder declarar que la muestra es similar a la referencia controla la probabilidad de que las
muestras sean falsamente declaradas como no similares; ste es el riesgo del productor, que muestras adecuadas sean rechazadas. El riesgo del consumidor (es decir, el riesgo de que muestras no similares se declaren similares) se controla mediante la
precisin de la medida de ausencia de similitud y la cantidad de determinaciones repetidas en la valoracin; por lo regular, la
evaluacin de stas es muy deficiente, dejando sin control el riesgo del consumidor.
En contraste con el anlisis de diferencias, el anlisis de equivalencia para similitud (es decir, evaluar si un intervalo de confianza del 90% para una medicin de ausencia de similitud est contenido dentro de los lmites de equivalencia especificados)
permite nicamente una probabilidad del 5% de que muestras con medidas de ausencia de similitud que estn fuera de los
lmites de equivalencia sean declaradas similares (controlando as el riesgo del consumidor). Con el anlisis de equivalencia,
resulta prctico examinar y administrar el riesgo del productor asegurando que la valoracin cuente con suficientes determinaciones repetidas para tener una buena precisin al estimar las medidas de ausencia de similitud.
Para la comparacin de pendientes, se han usado tradicionalmente las pruebas de diferencia para establecer el paralelismo
entre una muestra de Prueba y la muestra Estndar. No obstante, el uso de esta metodologa no permite al laboratorio concluir
que las pendientes sean iguales, puesto que los datos pueden ser demasiado variables o el diseo de la valoracin puede ser
demasiado dbil para establecer una diferencia. Sin embargo, el laboratorio puede concluir que las pendientes son lo suficientemente similares usando la metodologa del anlisis de equivalencia.
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Suma de paralelismo de cuadrados = RSSEp RSSEs RSSEt

donde los subndices p, s y t denotan el modelo Paralelo, el modelo Estndar y el modelo de Prueba, respectivamente.
Para cualquier medida compuesta, el analista debe considerar la ponderacin relativa implcita de la importancia de las
tres (o ms) regiones de la curva y si la ponderacin es apropiada para el problema en cuestin. Por ejemplo, para la suma
de paralelismo de cuadrados con modelos no lineales, la ponderacin provista a la comparacin de las asntotas depende
de la cantidad de datos en la valoracin en uso sobre y cerca de las asntotas.
Paso 2: Especificar un intervalo de valores aceptables, por lo regular denominado intervalo de equivalencia o zona de indiferencia, para la medida de falta de similitud.
El desafo de implementar un anlisis de equivalencia radica en establecer lmites de equivalencia apropiados para las medidas de ausencia de similitud. Idealmente, se cuenta con informacin disponible para vincular la variacin en las medidas
de similitud con diferencias significativas en la funcin biolgica (segn se miden con la valoracin biolgica). La informacin puede estar disponible a partir de la evaluacin de valoraciones ortogonales. Las cuatro metodologas siguientes pue-
Captulos
El anlisis de equivalencia presenta ventajas prcticas en comparacin con el anlisis de diferencias, incluyendo que una mayor cantidad de determinaciones repetidas resulta en una mejor precisin de la valoracin, la cual incrementar las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; que una menor cantidad de determinaciones repetidas o de
precisin de la valoracin reducir las probabilidades de que las muestras cumplan con los criterios de similitud; y que se obtienen metodologas slidas para combinar datos de mltiples valoraciones de la misma muestra para comprender de mejor manera si una muestra es verdaderamente similar al Estndar o no.
Debido a las ventajas asociadas con el uso del anlisis de equivalencia en la evaluacin de similitud, los analistas pueden
cambiar las valoraciones existentes a anlisis de equivalencia o pueden implementar mtodos de anlisis de equivalencia cuando se realizan cambios a las valoraciones existentes. Con este propsito, es conveniente examinar el riesgo de que la valoracin
no apruebe muestras adecuadas. Este riesgo depende de la precisin del sistema de valoracin, de la estrategia para determinaciones repetidas en el sistema de valoracin y de los valores crticos de los parmetros de similitud (esto constituye un anlisis de capacidad del proceso). Una metodologa para cambiar una valoracin establecida a partir del anlisis de diferencia a un
anlisis de equivalencia (para similitud) consiste en usar la capacidad de proceso de la valoracin para establecer valores crticos para parmetros de similitud. Esta metodologa resulta razonable para una valoracin establecida, debido a que los riesgos
(de declarar falsamente muestras como similares o no similares) son implcitamente aceptables, dado el historial de uso exitoso
de la valoracin.
Las medidas de similitud se pueden basar en los parmetros de la curva de concentracinrespuesta y pueden incluir la pendiente para una valoracin de lnea paralela recta; la ordenada al origen para una valoracin de cociente de la pendiente; la
pendiente y asntotas para una valoracin logstica de lneas paralelas de cuatro parmetros; o la pendiente, las asntotas y el
parmetro de falta de simetra en un modelo de sigmoideo de cinco parmetros. En algunos casos, estas medidas de similitud
tienen un significado interpretable y prctico en la valoracin; algunos cambios en la forma de la curva, por ejemplo, pueden
relacionarse con cambios especficos (tales como la presencia de un contaminante activo especfico) en el producto. Siempre
que sea posible, discutir dichos cambios y sus probables efectos ser de gran valor para establecer los lmites de equivalencia.
Aplicacin del Anlisis de Equivalencia para Similitud (paralelismo)Conforme a lo indicado anteriormente, muchos procedimientos estadsticos para evaluar la similitud se basan en una hiptesis nula que indica la presencia de similitud y en la hiptesis alternativa que indica un estado de ausencia de similitud. Posteriormente, la incapacidad para determinar que la similitud es
improbable desde el punto de vista estadstico se toma como una conclusin de similitud. Sin embargo, dicha incapacidad
para establecer un fundamento probabilstico de ausencia de similitud en realidad no prueba la existencia de similitud. El anlisis de equivalencia ofrece un mtodo para que el analista llegue a una conclusin (si los datos as lo requieren) de similitud
suficiente al tiempo que controla el riesgo de hacerlo inadecuadamente. A continuacin se proporciona una secuencia para el
proceso de aplicacin del anlisis de equivalencia.
Paso 1: Seleccionar una medida de ausencia de similitud.
Para el caso de lneas paralelas, sta puede ser la diferencia o el cociente de las pendientes. (El cociente de las pendientes
puede ser menos sensible al valor de la pendiente. Enmarcar la diferencia de la pendiente como un cambio proporcional a
partir del Estndar en lugar de usar unidades de pendiente absolutas tiene la ventaja de ser invariable a las unidades en los
ejes de concentracin y respuesta.) Para una valoracin de cociente de la pendiente, la medida de ausencia de similitud
puede ser la diferencia en las ordenadas al origen entre las muestras de Prueba y Estndar. Nuevamente, enmarcar esta
diferencia como una proporcin del intervalo de respuesta (posiblemente transformado) del Estndar para hacer que la
medida sea invariable a las unidades de la respuesta podra presentar ventajas.
La determinacin de similitud se puede basar en los parmetros individuales, de uno en uno; para el modelo logstico de
cuatro parmetros, la similitud entre las muestras Estndar y de Prueba se pueden evaluar de manera discreta para la asntota superior, la pendiente y la asntota inferior. Si se utilizan curvas sigmoideas con parmetros adicionales para ajustar
los datos de la valoracin biolgica, tambin es importante considerar el tratamiento de la similitud entre las preparaciones Estndar y de Prueba de los parmetros de curva adicionales (p.ej., parmetro de asimetra del modelo de cinco parmetros). Como alternativa, la evaluacin de similitud se puede basar en una sola medida compuesta de falta de paralelismo, tal como la suma de paralelismo de cuadrados. sta se determina como la diferencia en la suma residual de errores
cuadrados (RSSE, por sus siglas en ingls) entre el valor obtenido del ajuste de las curvas del Estndar y de la Prueba por
separado y el valor obtenido de la imposicin de paralelismo:
Captulos
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den usarse para determinar este intervalo. Si se han especificado lmites farmacopeicos para una medida definida de falta
de similitud, entonces la valoracin debe satisfacer dichos requisitos.
a. La primera metodologa consiste en compilar datos histricos que comparen el Estndar contra s mismo y usar dichos datos para determinar el intervalo de equivalencia como un intervalo de tolerancia para la medida de falta de
paralelismo. La ventaja de usar datos histricos radica en que dan control al laboratorio sobre la tasa de incumplimiento falso (la tasa de incumplimiento de una muestra que es en realidad una muestra aceptable). La desventaja es
que no hay control sobre la tasa de cumplimiento falso (la tasa de cumplimiento de una muestra que pudiera tener
una diferencia inaceptable en el desempeo con respecto al Estndar). La especificacin del intervalo de equivalencia
desarrollado de esta manera se basa nicamente en la capacidad de la valoracin. Los laboratorios que emplean esta
metodologa deben ser precavidos debido a que una valoracin imprecisa que requiera mejora podra generar un
intervalo de equivalencia tan amplio que no sera posible contar con una discriminacin til para ausencia de similitud.
b. La metodologa (a) es simple de implementar en la rutina y se puede emplear con diseos de valoraciones que no
ofrezcan estimaciones confiables de variacin dentro de la valoracin y, por ende, intervalos de confianza. No obstante, existe el riesgo de que las valoraciones con cantidades de variacin dentro de la valoracin, mayores a las habituales, puedan cumplir inapropiadamente. Por consiguiente, la alternativa preferida a la metodologa (a) es determinar un intervalo de tolerancia para el intervalo de confianza para la medida de falta de paralelismo. Lo siguiente resulta particularmente apropiado para cambiar una valoracin existente, con un conjunto importante de datos histricos sobre las muestras Estndar y de Prueba obtenidos a partir de una metodologa de anlisis de diferencia, a una
metodologa de equivalencia:
i. Para cada valor de la medida de falta de paralelismo obtenido a partir de los datos histricos, se debe determinar un intervalo de confianza de 95%, (m,n).
ii. Para cada intervalo de confianza, determinar su desviacin mxima del paralelismo perfecto. Esto es mx(|m|,
|n|) para diferencias, mx(1/m,n) para cocientes y simplemente n para cantidades que deben ser positivas, tales
como la suma de cuadrados.
iii. Determinar un intervalo de tolerancia para las desviaciones mximas obtenidas en (ii), el cual ser un intervalo
de tolerancia unilateral para estas cantidades necesariamente positivas. Se prefiere una metodologa de intervalo
de tolerancia no paramtrico.
iv. Se concluye que los nuevos datos son suficientemente paralelos si el intervalo de confianza para la medida de
falta de paralelismo cae completamente dentro del intervalo determinado en (iii).
Las metodologas (a) y (b), basndose en la capacidad del ensayo, controlan nicamente la tasa de incumplimiento
falso y pasan por alto la tasa de cumplimiento falso. La incorporacin de informacin de fuentes distintas a la evaluacin de la capacidad de la valoracin provee control sobre la tasa de cumplimiento falso. Las metodologas (c) y (d)
son medios que se pueden usar con este propsito.
c. La tercera metodologa comienza con datos histricos que comparan el Estndar consigo mismo y agrega datos que
comparan el Estndar con fallas conocidas, p.ej., muestras degradadas. Comparar los valores de la medida de ausencia de similitud para datos para los que sea apropiada una conclusin de similitud (Estndar contra s mismo) y para
datos para los que no sea apropiada una conclusin de similitud, p.ej., muestras degradadas. Basndose en esta comparacin, determinar un valor de la medida de ausencia de similitud que discrimine entre los dos casos. Si se emplea
esta metodologa, se debe utilizar un intervalo de muestras para el que no sea apropiada una conclusin de similitud,
incluyendo muestras con la ms mnima ausencia de similitud importante. Para modelos no lineales, esta comparacin tambin se puede usar para determinar aquellos parmetros que deben evaluarse; algunos pueden no ser sensibles a las fallas que pueden ocurrir con la valoracin especfica o con la recoleccin de muestras no similares.
d. La cuarta metodologa se basa en combinar un anlisis de sensibilidad de la curva de valoracin para parmetros de
ausencia de similitud con lo que se conozca acerca del producto y de la valoracin. Lo anterior es particularmente
til si se dispone de informacin que vincule un cambio en una o ms medidas de ausencia de similitud con las propiedades del producto. Estas medidas pueden ser directas (p.ej., cambios en la conformacin de una protena) o indirectas (p.ej., cambios en la eficiencia o seguridad de un modelo animal). Otra metodologa complementaria es un
anlisis de sensibilidad limitada, el cual combina el juicio del analista y del bilogo con respecto a la lectura de la
magnitud de los cambios en un parmetro de ausencia de similitud que sean significativos, mediante experimentos
de simulacin y/o en el laboratorio, para demostrar los umbrales para parmetros de similitud que ofrecen proteccin contra una ausencia de similitud importante. Asimismo, los anlisis de riesgo se pueden informar utilizando el
ndice teraputico del frmaco.
Paso 3. Examinar si el valor de la medida de falta de similitud se encuentra dentro del intervalo de equivalencia de valores aceptables.
Para las metodologas (a) y (b), comparar el valor obtenido de la medida de falta de paralelismo (a) o su intervalo de
confianza (b) con el intervalo obtenido al inicio del Paso 2. El valor debe estar dentro de los lmites si se utiliza (a), o el
intervalo de confianza debe estar completamente dentro de los lmites si se utiliza (b).
Una alternativa a la metodologa descrita anteriormente [para (a)] consiste en usar un valor promedio (histrico) para la
varianza del cociente o diferencia en un parmetro de similitudobtenido a partir de algn nmero de valoraciones individualespara calcular un intervalo de aceptacin para una estimacin puntual del parmetro de similitud. Esta metodo-
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4.8 Valores Aberrantes

Es necesario analizar los datos de la valoracin biolgica para detectar valores aberrantes antes del anlisis de la potencia
relativa. Los valores aberrantes pueden ser simples eventos aleatorios o una seal de un problema sistemtico en la valoracin
biolgica. El error sistemtico que genera valores aberrantes puede deberse a un error de dilucin en una o ms concentraciones de una muestra de Prueba o del Estndar, o debido a un error mecnico (p.ej., mal funcionamiento del sistema). Se pueden tener en cuenta diversas metodologas para detectar valores aberrantes. La inspeccin visual se utiliza con frecuencia, aunque se debe aumentar su alcance con una metodologa ms objetiva para prevenir un posible sesgo.
Un valor aberrante es un dato que aparentemente est fuera de lugar con respecto a los otros datos presentes. Un valor
aberrante puede tener una causa distinta e identificable, como por ejemplo, un error en la prctica, mal funcionamiento del
equipo o un error de registro de datos, o simplemente puede ser un valor inusual con respecto a la variabilidad comnmente
observada y puede aparecer sin una causa identificable. La pregunta esencial con respecto a un valor aberrante es: El valor
aberrante aparente se obtiene a partir de la misma poblacin que los otros datos menos discrepantes o forma parte de otra
poblacin? Si proviene de la misma poblacin y, por lo tanto, el dato es un valor inusual (aunque legtimo) obtenido de casualidad, entonces el dato debe mantenerse. Si proviene de otra poblacin y el valor inusual del dato se debe a un error humano
o al mal funcionamiento de un instrumento, entonces el dato debe omitirse de los clculos. En la prctica, a menudo se desconoce la respuesta a esta pregunta bsica y las investigaciones sobre las causas a menudo son inconclusas. La administracin de
valores aberrantes se basa en procedimientos y prcticas para generar la mejor respuesta posible a dicha pregunta esencial y
para guiar hacia una respuesta correcta.
Captulos
loga es ms simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseos de valoraciones que no sean capaces de
proveer estimaciones fidedignas de variacin dentro de la valoracin, aunque existe un precio. La metodologa de anlisis
de equivalencia que se basa en las mediciones de variacin especfica de la valoracin (dentro de la valoracin) (es decir,
los intervalos de confianza) presenta una postura conservadora en el sentido de que no aprobar la similitud de las muestras de valoraciones con cantidades mayores a las habituales de variacin dentro de la valoracin. El uso de una regin de
aceptacin para un parmetro de similitud en lugar de una regin de aceptacin para intervalos de confianza para el
parmetro de similitudpierde dicho conservadurismo y, por ende, no es la opcin preferida ante la existencia de alternativas.
Para la metodologa (c), se puede emplear una metodologa que esencialmente trate el paralelismo como un problema de
diferenciacin. La seleccin del punto de corte en la metodologa (c) debe tomar en cuenta las tasas de decisiones de
falsos positivos y falsos negativos (as como los riesgos aceptables para el laboratorio) y debe reflejar con precisin la variabilidad entre valoraciones. Por lo tanto, resulta razonable comparar la estimacin puntual de la medida de falta de paralelismo con el punto de corte y no usar intervalos de confianza. Esta metodologa es ms simple de implementar en la rutina y se puede usar con diseos de valoraciones que no son capaces de proveer estimaciones confiables de variacin dentro de la valoracin.
Para la metodologa (d), se debe demostrar que la medida de ausencia de similitud es significativamente mayor que el
punto final inferior del intervalo de aceptacin y significativamente menor que el punto final superior. (Si el intervalo de
aceptacin es unilateral, se realiza nicamente la prueba individual aplicable.) Este es el uso de la metodologa de Pruebas
Doblemente Unilaterales. En la mayora de los casos, la metodologa de Pruebas Doblemente Unilaterales se puede implementar de manera simple calculando un intervalo de confianza bilateral del 90%, que corresponde a una prueba de equivalencia del 5%. Si este intervalo de confianza cae totalmente dentro del intervalo de equivalencia especificado al inicio
del Paso 2, entonces se habr demostrado con suficiencia la similitud. Para modelos de lneas paralelas, se puede usar (1)
un intervalo de confianza basado en el valor de la diferencia de las pendientes k veces el error estndar de dicho valor o
(2) el Teorema de Fieller para el cociente de las pendientes. Para modelos de cociente de pendientes, se emplea el intervalo de confianza para la diferencia de las intersecciones. Para modelos no lineales, existe evidencia de que estos mtodos
simples de intervalo de confianza no alcanzan el nivel de confianza declarado, mientras que los mtodos basados en perfiles de probabilidad o remuestreo son ms apropiados.
IntervaloEl intervalo para una valoracin biolgica de la potencia relativa es el intervalo entre las potencias superior e inferior para las que la valoracin biolgica presenta niveles de precisin adecuados, exactitud relativa, linealidad del logaritmo de
potencia y tasas de xito para la aptitud del sistema y de la muestra. Resulta fcil determinar si una muestra, que es similar a
un Estndar, tiene o no una potencia relativa dentro del intervalo (validado) del sistema de valoracin. Para muestras que no
son similares de conformidad con los criterios establecidos, resulta ms complicado determinar si se puede obtener una estimacin de la potencia relativa para la muestra. En una valoracin no lineal de lneas paralelas, se puede suponer que una
muestra que no presenta datos sobre una asntota est fuera del intervalo de potencia de la valoracin. En una valoracin de
lnea recta paralela, una muestra que no tiene tres o ms puntos en la porcin pronunciada de la curva de respuesta puede
estar fuera del intervalo de potencia de la valoracin. Para muestras que no hayan mostrado similitud con la referencia, resulta
inapropiado informar la potencia o generar un cociente de los EC50 a partir de ajustes no restringidos. Puesto que dichas muestras pueden estar fuera del intervalo de la valoracin, podra ser til cambiar la dilucin de la muestra de prueba para una
valoracin subsiguiente, basndose en una estimacin de la actividad relativa. Esta actividad relativa estimada puede obtenerse
mediante el cociente entre las concentraciones del Estndar y la Prueba que genera respuestas que coinciden con la respuesta
de referencia en el EC50 de referencia.
Captulos
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El captulo general Interpretacin y Tratamiento de Datos Analticos 1010 trata la designacin, la identificacin y el rechazo
de valores aberrantes, e incluye mtodos estadsticos. Asimismo, el Captulo General 1010 cita fuentes adicionales de informacin que pueden ofrecer una revisin exhaustiva de la metodologa estadstica pertinente. El Captulo General 1010 no
ofrece comentarios explcitos con respecto al anlisis de valores aberrantes en regresiones lineales o no lineales. Se pueden usar
tcnicas de anlisis de valores aberrantes apropiadas para datos obtenidos de la regresin de la respuesta sobre la concentracin. Este captulo ofrece algunos comentarios sobre valores aberrantes para el contexto de valoraciones biolgicas a fin de
enfatizar o complementar la informacin del captulo 1010.
De todos los procedimientos empleados para el anlisis de compuestos farmacuticos y frmacos biolgicos, se puede esperar que la valoracin biolgica presente la mayor tendencia a producir datos aberrantes. La administracin de valores aberrantes es adecuada para los datos de valoracin biolgica en al menos dos niveles: cuando se puede verificar un dato individual o
un grupo de datos (p.ej., datos a una concentracin) en funcin de las respuestas esperadas para la muestra y la concentracin; y, por separado, cuando se pueden verificar la uniformidad de las estimaciones de potencia relativa de una valoracin en
funcin de otras estimaciones independientes de la potencia del mismo material.
Tres aspectos importantes de la administracin de valores aberrantes son la prevencin, la designacin y la identificacin.
La prevencin de valores aberrantes se prefiere por razones obvias, y se facilita mediante procedimientos que sean menos
propensos a errores y mediante verificaciones que sean sensibles a los tipos de errores que, dada la experiencia obtenida en el
desarrollo de la valoracin, podran esperarse. En efecto, el error nunca se convierte en un valor aberrante puesto que se prevee su ocurrencia.
Una buena prctica requiere examinar los datos para detectar valores aberrantes y designar (marcado) las observaciones
sobre aparentes valores aberrantes para su investigacin. Si la investigacin detecta una causa, entonces el dato aberrante se
puede excluir del anlisis. Debido a la presencia comn de variabilidad importante en la respuesta de las valoraciones biolgicas, es probable que una investigacin del laboratorio sobre la observacin de valores aberrantes no determine una causa. Sin
embargo, la falta de evidencia relacionada con la causa de un valor aberrante no es una indicacin clara de que se requiera un
anlisis estadstico de valores aberrantes. El conocimiento sobre el intervalo tpico de la variabilidad de la respuesta de la valoracin debe usarse como justificacin para utilizar anlisis estadsticos para valores aberrantes.
La identificacin de valores aberrantes consiste en utilizar reglas para confirmar que los valores no son uniformes con el modelo estadstico conocido o asumido. En el caso de valores aberrantes sin una causa determinada, resulta tentador el uso de
procedimientos estadsticos de identificacin de valores aberrantes para descartar valores inusuales. Descartar datos basndose
nicamente en consideraciones estadsticas debe realizarse con la menor frecuencia posible. El descarte falso de datos conlleva
a estimaciones de variabilidad demasiado optimistas y puede sesgar las estimaciones de potencia. El laboratorio debe monitorear la tasa de incumplimiento para su procedimiento de valores aberrantes y debe tomar acciones cuando sta sea significativamente ms alta de lo esperado.
Los procedimientos estadsticos para la identificacin de valores aberrantes depende de suposiciones con respecto a la distribucin de datos sin valores aberrantes. La identificacin de datos como valores aberrantes podra significar nicamente que la
suposicin con respecto a la distribucin es incorrecta. Si es comn la reduccin de valores aberrantes debido a consideraciones estadsticas, en particular si los valores aberrantes tienden a presentarse en valores o respuestas altos, entonces esto puede
indicar que los datos requieren de algn ajuste, por ejemplo una transformacin logartmica, como parte del procedimiento de
valoracin. Dos metodologas para la evaluacin estadstica de valores aberrantes estn basadas en determinaciones repetidas
y en modelos.
Metodologas Basadas en Determinaciones RepetidasCuando se llevan a cabo determinaciones repetidas en concentraciones de una muestra de Prueba y del Estndar, se puede emplear un criterio de variabilidad extra (EV, por sus siglas en
ingls) para detectar valores aberrantes. Los datos histricos pueden analizarse para determinar el intervalo en la variabilidad
comnmente observada entre determinaciones repetidas y dicha distribucin de intervalos se puede usar para establecer un
extremo en el intervalo que puede sealar un valor aberrante. Las mtricas que pueden emplearse incluyen el intervalo simple
(repeticin mxima menos repeticin mnima), la desviacin estndar, o el coeficiente de variacin o desviacin estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) entre determinaciones repetidas. No obstante, si la valoracin biolgica presenta heterogeneidad en la variabilidad, las suposiciones con respecto a la dispersin uniforme de datos son infundadas. Los analistas pueden
usar un criterio variable a travs de distintos niveles de la valoracin biolgica, o pueden transformar los datos a una escala que
produzca una variabilidad homognea. La transformacin se puede llevar a cabo con una metodologa de Poder de la Media,
segn se discuti con anterioridad. Cuando est presente la heterogeneidad, es muy probable que exista una falta de normalidad, por lo que se debe usar el intervalo en lugar de la desviacin estndar o la desviacin estndar relativa.
Las acciones tomadas al detectar un valor aberrante potencial dependen en parte del nmero de determinaciones repetidas.
Si se detecta una variabilidad extra dentro de un par (n = 2) a una concentracin de una muestra de Prueba o del Estndar, no
siempre resultar claro cul de las determinaciones repetidas es aberrante, por lo que el laboratorio deber eliminar la concentracin de cualquier otro procesamiento adicional. Cuando se llevan a cabo ms de dos determinaciones repetidas en cada
dilucin, el laboratorio puede optar por una estrategia que identifique cul de los extremos puede ser el valor aberrante. Como
alternativa, el laboratorio puede optar por eliminar la dilucin del procesamiento adicional.
Metodologas Basadas en ModelosLas metodologas basadas en modelos se pueden usar para detectar valores aberrantes
dentro de los datos de la valoracin biolgica. Estas metodologas emplean los residuos derivados del ajuste de un modelo
apropiado. En general, si se emplean mtodos basados en modelos para identificar valores aberrantes potenciales, los modelos
USP 38
usados pueden realizar menos suposiciones sobre los datos que los modelos usados para evaluar la aptitud y la potencia estimada. Por ejemplo, un modelo de regresin no paramtrico (suavizado) puede ser til.
Por ltimo, una alternativa para descartar datos aberrantes consiste en usar mtodos robustos que sean menos sensibles a la
influencia de observaciones de valores aberrantes. El uso de la mediana en lugar de la media para describir el centro de los
datos es un ejemplo de una perspectiva robusta. Asimismo, una regresin empleando el mtodo de cuadrados mnimos, que
sustenta muchos de los mtodos tratados en este captulo, no es robusta ante la presencia de valores aberrantes. El uso de
mtodos tales como una regresin robusta puede ser adecuado, pero no est cubierto en los captulos de valoraciones biolgicas de la USP.
4.9 Efectos Fijos y Aleatorios en Modelos de Respuesta de Valoraciones Biolgicas
5. ETAPAS DEL PROCESO DE DESARROLLO DE LA VALORACIN BIOLGICA

Dada la ubicuidad de las valoraciones basadas en clulas y la motivacin para emplear un sistema de valoracin biolgica
para ofrecer un contexto de discusin, el desarrollo de una valoracin biolgica basada en clulas se utilizar para ilustrar las
etapas del continuum del desarrollo de la valoracin biolgica.
Captulos
La eleccin de tratar factores como fijos o aleatorios es importante para el diseo de las valoraciones biolgicas, los experimentos de desarrollo, el anlisis estadstico de datos y la validacin de la valoracin biolgica. Los efectos fijos son factores
para los que todos los niveles, o todos los niveles de inters, se presentan discretamente, como muestra, concentracin, temperatura y duracin de la descongelacin, y tiempo de incubacin. Los datos para una respuesta a cierto nivel o a una combinacin de niveles de un factor fijo puede predecir respuestas futuras. Se espera que los efectos fijos ocasionen un cambio uniforme en las respuestas. Los analistas estudian los efectos fijos controlndolos en el diseo y examinando los cambios en las
medias a distintos niveles del factor.
Los efectos aleatorios son factores cuyos niveles en una corrida particular de una valoracin se consideran representativos de
los niveles que pudieran estar presentes. Es decir, no se espera que ningn valor especfico del factor aleatorio tenga influencia
sobre la respuesta, si no que dicho valor pueda variar dependiendo de cierta distribucin de valores esperada y que, por consiguiente, pueda ser una fuente de variabilidad. Por ejemplo, no se desea predecir la respuesta de la valoracin para un da especfico, pero existe inters en predecir la variacin en la respuesta relacionada con el factor da. Los ejemplos de los efectos
aleatorios incluyen el lote de reactivo, el operador o el da si no existe inters en lotes de reactivos, operadores o das especficos
como fuentes de variabilidad. Los analistas pueden estudiar los efectos aleatorios midiendo los componentes de varianza que
corresponden a cada efecto aleatorio. Los componentes de varianza slo se pueden estimar de manera adecuada si existe un
nmero apreciable de niveles de cada efecto aleatorio. Si, por ejemplo, se cuenta nicamente con dos o tres lotes de reactivo o
analistas presentes, la estimacin de la variacin asociada con dichos factores ser deficiente.
Realizar una seleccin correcta con respecto a la forma de tratar un factor como fijo o aleatorio es importante para el diseo
de la valoracin y para informar apropiadamente su precisin. Por ejemplo, tratar todos los factores como fijos conlleva a
subestimar la variabilidad de la valoracin, puesto que ignora todas las fuentes de variabilidad distintas a las determinaciones
repetidas. El objetivo es identificar las fuentes especficas de variabilidad que puedan ser controladas para incluir de manera
apropiada aquellos factores en el diseo y, posteriormente, incluir otros factores como aleatorios.
Si el factor puede cambiar de aleatorio a fijo o viceversa, el factor debe incluirse en el modelo generalmente como un efecto
aleatorio. Por ejemplo, cuando los lotes de reactivo no pueden ser controlados, por lo regular se considera que diferentes lotes
ocasionan variabilidad, por lo que el lote de reactivo se considerara un efecto aleatorio. No obstante, si se ha detectado un
gran cambio en los valores de respuesta en un lote determinado, se puede llevar a cabo una comparacin entre un conjunto
de lotes usando un lote de reactivo como efecto fijo. De manera similar, la secuencia o ubicacin dentro de la valoracin (p.ej.,
bloque, placa, fila de la placa, columna de la placa o pocillo) se puede considerar como una fuente de variacin aleatoria o una
fuente de un efecto constante (fijo).
Los diseos de valoraciones que constan de mltiples factores son eficientes, pero requieren de las tcnicas estadsticas correspondientes que incorporen los factores en el anlisis como efectos fijos o aleatorios. Cuando todos los factores son fijos, el
modelo estadstico recibe el nombre de modelo de efectos fijos. Si todos son aleatorios, se le denomina modelo de efectos
aleatorios. Si algunos factores son fijos y otros son aleatorios, se trata de un modelo de efectos mixtos. Se debe tomar en cuenta que los conceptos de efectos fijos y aleatorios aplican a modelos para respuestas cuantitativas, cualitativas e integrales. Para
diseos de valoracin que incluyan mltiples unidades experimentales (p.ej., muestras asignadas a conjuntos de tubos y concentraciones asignadas a tubos pre-placas), resulta particularmente efectivo un modelo de efectos mixtos en el que las unidades experimentales se tratan como efectos aleatorios. La presencia de diseos con efectos aleatorios cruzados (p.ej., cada operador us material de una o ms partidas de reactivo, pero muchas partidas de reactivos fueron empleadas por mltiples operadores) agrega todava ms complejidad. Esto puede ocasionar desafos metodolgicos y de clculo adicionales para el ajuste
del modelo, en especial cuando los diseos estn desequilibrados.
USP 38
5.1 Diseo: Distribucin de la Valoracin, Distribucin por Bloques y Aleatorizacin
Captulos
La mayora de las valoraciones basadas en clulas se llevan a cabo usando una placa de cultivo celular (placa de microtitulacin de 6; 12; 96 384 pocillos). Idealmente, una placa puede proporcionar un sustrato uniforme para tratamientos experimentales en todos los pocillos, incluyendo las etapas posteriores al lavado e incubacin. No obstante, independientemente de
las condiciones de la valoracin con las que se pretenda minimizar el potencial de sesgo (p.ej., buena tcnica del analista, calibracin cuidadosa de pipetas, tiempo de incubacin controlado y temperatura), se pueden observar gradientes sistemticos en
la placa, independientes de los tratamientos experimentales. Estos gradientes pueden ocurrir a travs de filas, columnas o desde el borde hacia el centro de la placa, y a menudo se denominan efectos de placa. Incluso los efectos de placa moderados o
inconsistentes deben tratarse durante el desarrollo de la valoracin, mediante estrategias de distribucin de placa, distribucin
por bloques, aleatorizacin y determinaciones repetidas.
Los efectos de placa se pueden evaluar en un ensayo de uniformidad en el que se usa en todos los pocillos de la placa un solo
tratamiento experimental, como por ejemplo una concentracin de valoracin seleccionada a partir de la seccin media de la
curva de concentracinrespuesta. La Figura 1 ofrece un ejemplo de lo que puede llegar a observarse; una tendencia de la
seal a disminuir de derecha a izquierda es evidente. En este caso, se descubri que la lavadora de placas estaba lavando de
manera ms enrgica el lado izquierdo de la placa y fue necesario ajustarla para proveer una intensidad de lavado uniforme y
eliminar el gradiente. Otro efecto de placa comn es un patrn de crecimiento celular diferencial en el que los pocillos externos de la placa cultivan clulas de tal manera que se atena la seal de la valoracin. ste es un problema tan persistente que a
menudo se opta por no utilizar los pocillos externos de la placa de valoracin. Debido a que los efectos de ubicacin son muy
comunes, se deberan evitar los diseos que emplean determinaciones repetidas (p.ej., de muestra por combinaciones de concentracin) en pocillos adyacentes.
Figura 1. Grfica de cambio en la respuesta de la valoracin a travs de la placa.

La Distribucin por Bloques es el agrupamiento de unidades experimentales relacionadas en diseos experimentales. Los bloques pueden consistir en placas individuales de 96 pocillos, secciones de placas de 96 pocillos o placas de 96 pocillos agrupadas por analista, por da o por partida de clulas. El objetivo es aislar cualquier efecto sistemtico de modo que no oscurezca
los efectos de inters. Un diseo completo en bloques ocurre cuando todos los niveles de un factor de tratamiento (en una valoracin biolgica, los factores de tratamiento primario son la muestra y la concentracin) se aplican a unidades experimentales
para dicho factor dentro de un solo bloque. Un diseo incompleto en bloques ocurre cuando el nmero de niveles de un factor
de tratamiento excede el nmero de unidades experimentales para dicho factor dentro del bloque.
La Aleatorizacin es un proceso de asignacin de tratamiento a unidades experimentales basado en probabilidad de tal manera que todas las unidades experimentales tengan la misma probabilidad de recibir un tratamiento determinado. Aunque resulta complicada en la prctica, la aleatorizacin de tratamientos experimentales ha sido defendida como la mejor metodologa para minimizar el sesgo de la valoracin o, ms precisamente, para proteger los resultados de la valoracin de fuentes conocidas y desconocidas de sesgo, convirtiendo el sesgo en varianza. Aunque la aleatorizacin de muestras y concentraciones
en pocillos individuales de placas puede no resultar prctico, la distribucin de la placa puede disearse para minimizar los
efectos de placa, alterando las posiciones de la muestra a travs de las placas y el patrn de diluciones dentro y a travs de las
placas. Cuando se requieren mltiples placas en una valoracin, el diseo de distribucin de la placa debe, por lo menos, alter-
USP 38
nar posiciones de muestras a travs de las placas dentro de una corrida de valoracin para evitar un posible sesgo introducido
por los analistas o el equipo en un da determinado. Resulta prudente emplear una rotacin equilibrada de distribuciones en
las placas de modo que la recoleccin de determinaciones repetidas (cada una de las cuales utiliza una distribucin distinta)
proporcione algo de proteccin contra fuentes problables de sesgo.
La Figura 2 presenta un diseo de valoracin en patrones que carece de aleatorizacin y es susceptible al sesgo. Las diluciones y las determinaciones repetidas de las preparaciones de Prueba (A y B) y del Estndar (R) se colocan juntas de manera
secuencial en la placa. El sesgo debido a un efecto de placa o incubadora puede influenciar parte o la totalidad de las concentraciones de una de las muestras. Se debe tomar en cuenta que en las Figuras 2 a 5 los pocillos exteriores de la placa se dejan
como blancos para proteger contra el efecto del borde.
Captulos
Figura 2. Placa con patrones muy marcados.

Una distribucin que ofrece algo de proteccin de los efectos de placa y que se puede realizar de forma manual es un diseo
de grfica en filas, que se presenta en la Figura 3. En dicha distribucin, las muestras se distribuyen aleatoriamente en filas de
una placa y se llevan a cabo series de diluciones en distintas direcciones en diferentes secciones (bloques) de la placa para
mitigar el sesgo a travs de las columnas de la placa. Una ventaja extra del diseo de grfica en tiras es su capacidad para
detectar efectos de ubicacin mediante la interaccin de la muestra y la direccin de la dilucin (de izquierda a derecha o
viceversa).
Figura 3. Diseo de una grfica en tiras

La Figura 4 presenta una alternacin de las posiciones de la Prueba (muestra de Prueba 1 = 1; muestra de Prueba 2 = 2)
y del Estndar (R) en mltiples placas, dentro de una sola corrida de valoracin; esto ofrece proteccin contra los efectos de
fila en la placa. Combinar los dos mtodos ilustrados en las Figuras 3 y 4 puede ayudar a convertir de manera efectiva el sesgo
de la placa en varianza de la valoracin. Posteriormente, se puede tratar la varianza de la valoracin, segn se requiera, mediante un nmero mayor de determinaciones repetidas de la valoracin (mayor nmero de placas en una valoracin).
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Figura 4. Valoracin de placas mltiples con posiciones de Prueba y Estndar variadas.
Captulos
El diseo de grfica dividida, una alternativa que asigna muestras a las filas de las placas de manera aleatoria y que distribuye
aleatoriamente las diluciones (concentraciones) dentro de cada fila, se presenta en la Figura 5. Dicha estrategia puede ser difcil
de implementar, incluso con el uso de instrumentos robticos.
Figura 5. Diseo de grfica dividida.

Estrategia de DilucinLas concentraciones de valoracin de una muestra de Prueba y del Estndar se pueden obtener de
diversas maneras. Los laboratorios a menudo llevan a cabo diluciones en serie, en las que cada dilucin se prepara a partir de
una dilucin previa, en sucesin. Como alternativa, el laboratorio puede preparar diluciones completamente independientes a
partir de la muestra de Prueba y del Estndar para obtener series de concentraciones independentes. Estas dos estrategias resultan en las mismas concentraciones nominales, pero tienen propiedades distintas con respecto al error. Las diluciones seriales
estn sujetas a la propagacin del error a travs de las series de diluciones y un error de dilucin cometido en una dilucin
temprana tendr como resultado observaciones correlacionadas no independientes. Las correlaciones tambin se pueden introducir empleando pipetas multicanal. Las diluciones independientes ayudan a mitigar el sesgo que resulta de los errores de
dilucin.
Es importante mencionar que cuando se trabaja para mejorar la precisin, las reducciones ms grandes de varianza se logran
mediante determinaciones repetidas en los niveles ms altos posibles de los efectos aleatorios anidados. Lo anterior resulta particularmente efectivo cuando dichos niveles altos son fuentes de variabilidad. Por ejemplo: llevar a cabo muchas determinaciones repetidas en un da para una valoracin que se sabe presenta una gran variacin entre das no es una forma efectiva de
mejorar la precisin de los valores de informe.
5.2 Desarrollo
Una meta del desarrollo de la valoracin biolgica es obtener una exactitud relativa de la valoracin biolgica y una precisin de la estimacin de potencia ptimas. Un punto final del desarrollo de la valoracin consiste en el desarrollo completo del
procedimiento de valoracin, un protocolo para la realizacin de la valoracin biolgica. El procedimiento debe incluir detalles
suficientes para que un laboratorio calificado con un analista capacitado pueda realizar el procedimiento de manera rutinaria.
Una parte estratgica del desarrollo es buscar que se mantenga el desempeo. Los procedimientos operativos estndar para
USP 38
5.3 Anlisis de Datos durante el Desarrollo de la Valoracin

El anlisis de los datos de la valoracin biolgica durante el desarrollo de la valoracin permite a los analistas tomar decisiones en relacin con el modelo estadstico que se utilizar para el anlisis de rutina, incluyendo la transformacin y/o la ponderacin de datos, as como el desarrollo de criterios de aptitud del sistema y de la muestra. El anlisis tambin ofrece informa-
Captulos
calificacin de reactivos y de tcnicos, as como para la calibracin del Estndar de trabajo, ayudan a completar el paquete de
desarrollo de la valoracin biolgica.
La Metodologa de Un Factor a la Vez contra el Diseo de ExperimentosEl desarrollo de la valoracin biolgica avanza a
travs de una serie de experimentos en los que las condiciones y los niveles de los factores de la valoracin se varan para identificar aqullos que sustentan una valoracin biolgica confiable y robusta, calificada para el uso rutinario. Dichos experimentos se pueden llevar a cabo mediante la metodologa de un factor a la vez (OFAT, por sus siglas en ingls), estudiando cada
parmetro por separado para identificar condiciones ideales, o mediante el uso de un diseo de experimentos de factores mltiples (DOE, por sus siglas en ingls). El diseo de experimentos de factores mltiples es una estrategia eficiente y efectiva para
desarrollar una valoracin biolgica y mejorar el desempeo de la misma, ayudando de esta manera a obtener un sistema de
medicin que cumple con los requisitos. En comparacin con la metodologa de un factor a la vez, el diseo de experimentos
de factores mltiples por lo regular requiere una menor cantidad de experimentos y tambin ofrece una perspectiva sobre las
interacciones de los factores que afectan el desempeo de la valoracin biolgica. El desarrollo de la valoracin mediante un
diseo de experimentos de factores mltiples puede proseguir a travs de una serie de etapas: mapeo del proceso y anlisis de
riesgos, examen, optimizacin de la respuesta y confirmacin.
Mapeo del Proceso y Anlisis de RiesgosLa optimizacin de la valoracin biolgica puede comenzar con un examen sistemtico y una evaluacin de riesgos para identificar aquellos factores que podran influenciar la respuesta de la valoracin biolgica. Resulta til visualizar factores de la valoracin biolgica empleando un mapa del proceso de la misma, como por ejemplo, un diagrama de causa y efecto o de espina de pescado. Mediante el uso del mapa de proceso como gua, el laboratorio
puede examinar los factores que podran afectar el desempeo de la valoracin, tales como pH de la solucin amortiguadora,
temperatura de incubacin y tiempo de incubacin. Histricamente, la experiencia con una o ms de las etapas de la valoracin biolgica, junto con un juicio cientfico fundamentado, pueden identificar factores claves que requieran de evaluacin adicional. Una herramienta que se puede emplear para priorizar factores es un anlisis del modo y los efectos de la falla. Los factores generalmente se contabilizan combinando su potencial para influenciar la respuesta de la valoracin y su probabilidad de
ocurrir. El laboratorio debe prestar atencin para reconocer interacciones potenciales entre los factores de la valoracin.
ExamenUna vez que se han identificado los factores claves mediante el mapeo del proceso y el anlisis de riesgos, el laboratorio puede llevar a cabo un experimento inicial para explorar los efectos para los que podra ser necesario aplicar controles.
Los diseos de examen como los de tipo factorial y factorial fraccional se emplean comnmente con este propsito. Existe software disponible para ayudar al practicante con la seleccin del diseo y el anlisis subsiguiente. No obstante, el analista debe
tener cuidado de comprender sus suposiciones sobre la seleccin del diseo y el anlisis para asegurar la identificacin exacta
de los factores experimentales.
Optimizacin de la RespuestaUn diseo de examen, por lo general, podr detectar unos cuantos factores importantes de
entre aqullos que se estudian. Dichos factores se pueden estudiar an ms en un diseo de optimizacin de la respuesta. Los
diseos de optimizacin de la respuesta, tales como los diseos centrales compuestos, se llevan a cabo para determinar las
configuraciones ptimas para las combinaciones de factores de la valoracin biolgica, a fin de obtener la respuesta adecuada.
La informacin obtenida a partir de la optimizacin de la respuesta se puede representar como una superficie de respuesta y
puede emplearse para establecer intervalos que provean un desempeo aceptable de la valoracin y que se incorporarn en el
procedimiento de la valoracin biolgica.
En el lenguaje de Calidad por Diseo (QbD, por sus siglas en ingls), la regin en la que los niveles combinados de variables de ingreso y parmetros del proceso han demostrado proveer un desempeo aceptable de la valoracin se describe como
el espacio del diseo para la valoracin biolgica. Establecer un verdadero espacio del diseo para una valoracin biolgica representa un desafo; no todos los factores y niveles de factores aleatorios se incluirn en el Diseo de Experimentos de Factores
Mltiples del desarrollo, y no existe certeza de que el espacio del diseo no sea sensible a factores aleatorios no estudiados. De
manera similar, no se puede asegurar del todo que la valoracin (espacio de diseo) sea robusta para factores aleatorios que se
estudian usando muestras pequeas (o muestras de niveles no aleatorias). Los elementos del Diseo de Experimentos de Factores Mltiples que se pueden considerar incluyen el uso de bloques; confusin deliberada entre interacciones que son de poco
inters o que no se consideran importantes; diseo robusto (diseos de superficie de respuesta con efectos aleatorios); y uso
de diseos de grfica dividida, grfica en tiras o lote dividido.
ConfirmacinEl modelo matemtico que representa el desempeo de la valoracin como una funcin de cambios en los
factores claves de la valoracin es una aproximacin; por consiguiente, se acostumbra a confirmar el desempeo en las configuraciones ideales de la valoracin biolgica. La confirmacin puede adquirir la forma de un ensayo de calificacin en el que
se lleva a cabo la valoracin, de preferencia en mltiples ocasiones independientes usando valores ptimos para factores. Alternativamente, el laboratorio puede determinar que la valoracin fue adecuadamente desarrollada y que se puede proseguir con
la validacin. La calificacin es una buena prctica, no un requisito reglamentario. La decisin de llevar a cabo corridas de calificacin confirmatorias o de proceder con la validacin depende de la fuerza de la informacin acumulada obtenida durante el
desarrollo.
Captulos
USP 38
cin relacionada con los elementos de la estructura del diseo que deberan usarse durante la deteccin de valores aberrantes
y el ajuste de un modelo completo. Lo anterior puede incluir adems un plan para seleccionar subconjuntos de datos, como
por ejemplo una porcin lineal para anlisis, o para valoraciones biolgicas no lineales, una estrategia de reduccin del modelo
para muestras similares al Estndar. Una vez que estas decisiones han sido tomadas y que se muestras slidas durante la validacin, no ser necesario volverlas a evaluar con cada desempeo de la valoracin. A continuacin se presenta una metodologa
de proceso para permitir la toma de dichas decisiones.
Paso 1: Seleccionar un modelo estadstico apropiado (ver tambin la seccin 4.6 Modelos Comunes de Valoracin Biolgica).
Debido a la complejidad de las valoraciones biolgicas y a la motivacin para emplear una metodologa que se considere
fidedigna, los modelos analticos adecuadamente estandarizados son comunes en el campo de los anlisis de valoraciones
biolgicas. No obstante, existen muchas consideraciones implcitas en la seleccin del modelo estadstico ms apropiado.
Primero, el modelo debe ser adecuado para el tipo de punto final de la valoracincontinuo, recuento o dicotmico.
Segundo, el modelo debe incorporar la estructura del diseo de valoracin. Para cualquier diseo distinto al completamente aleatorizado, existirn trminos en el modelo para los elementos estructurales. Por ejemplo, la distribucin en bloques dentro de las placas, la ubicacin de la jaula en la instalacin que alberga los animales, el da, entre otros. Una tercera consideracin, aplicable a los puntos finales continuos, implica decidir si se usa un modelo de regresin o un modelo
de media (un anlisis del modelo de varianza que se ajusta a una media distinta en cada nivel de dilucin de cada muestra
analizada), con trminos de error apropiados. Un modelo de media puede ser apropiado en esta etapa debido a que no
realiza ninguna suposicin sobre la forma de la curva de concentracinrespuesta.
Paso 2: Ajustar el modelo estadstico seleccionado a los datos sin la suposicin de paralelismo y posteriormente evaluar la distribucin de los residuos, examinndolos especficamente para detectar desviaciones de la normalidad y de la varianza constante.
Transformar los datos segn se requiera o, si fuera necesario, seleccionar un esquema de ponderacin (ver la seccin 4.3
Heterogeneidad de la Varianza, Ponderacin y Transformacin). Usar un cuerpo de datos de valoracin, a partir de valoraciones independientes, tan grande como sea posible. El objetivo primario es tratar cualquier desviacin de la normalidad y
de la varianza constante de las respuestas en todo el intervalo de concentraciones en la valoracin. El paso 2 probablemente alternar entre imponer una transformacin y evaluar la distribucin de los residuos.
Paso 3: Examinar para detectar valores aberrantes y eliminarlos de manera apropiada.
Esta etapa, por lo regular, sigue a la seleccin inicial de una transformacin adecuada y/o mtodo de ponderacin. El modelo usado para detectar valores aberrantes idealmente contiene los elementos importantes de la estructura del diseo de
la valoracin, permite curvas no similares y realiza menos suposiciones con respecto a la forma funcional de la curva de
concentracinrespuesta que el modelo usado para evaluar la similitud. Ver la Seccin 4.8. Valores Aberrantes y el captulo
general 1010 para informacin sobre la deteccin y eliminacin de valores aberrantes. En algunos casos, los valores aberrantes pueden ser tan severos que un modelo razonable podra no ajustarse, por lo que los residuos no estaran disponibles. En tales casos, resulta necesario examinar los datos brutos para detectar valores aberrantes antes de intentar el ajuste
del modelo.
Durante el desarrollo de la valoracin, se debe desarrollar una estrategia para la investigacin y tratamiento de una observacin de valores aberrantes, incluyendo cualquier lmite sobre la cantidad aceptable de valores aberrantes. Estas instrucciones deben incluirse en el Procedimiento Operativo Estndar de la valoracin. La buena prctica incluye registrar el proceso de una investigacin, las pruebas para valores aberrantes aplicadas y los resultados de las mismas. Se debe tomar en
cuenta que los procedimientos para valores aberrantes deben considerarse de manera independiente a la investigacin y
el tratamiento de un resultado fuera de la especificacin (OOS, por sus siglas en ingls) (valor de informe). Las decisiones
para eliminar un valor aberrante del anlisis de los datos no debe tomarse basndose en el efecto que sufrir el valor de
informe (p.ej., un resultado potencial fuera de la especificacin). La eliminacin de datos como valores aberrantes no debe practicarse con regularidad. Si se eliminan muchos valores como valores aberrantes de una corrida, dicha corrida se
debe considerar sospechosa.
Paso 4: Reajustar el modelo con la transformacin y/o ponderacin previamente impuesta (Paso 2) sin las observaciones identificadas como valores aberrantes (Paso 3) y volver a evaluar la idoneidad del modelo.
Paso 5: Cuando resulte necesario o deseable, seleccionar un esquema para identificar los subconjuntos de datos para su uso en
la estimacin de potencia, ya sea el modelo lineal o no lineal (ver la seccin 4.5 Linealidad de los Datos de ConcentracinRespuesta).
Paso 6: Calcular una estimacin de potencia relativa analizando los datos de la Prueba y del Estndar al mismo tiempo mediante un modelo que deber tener lneas o curvas paralelas o intersecciones idnticas.
5.4 Validacin de la Valoracin Biolgica

La validacin de la valoracin biolgica es un estudio basado en protocolos que demuestra que el procedimiento es adecuado para su uso. Se puede considerar una metodologa por etapas para la validacin, tal como en una validacin adecuada
para el uso pretendido para sustentar la liberacin de material de ensayo clnico, y una validacin final exhaustiva antes de
tramitar la Solicitud para Productos Biolgicos Teraputicos (BLA, por sus siglas en ingls) o la Solicitud para Autorizacin de
Comercializacin (MAA, por sus siglas en ingls). Se deben establecer y describir de manera clara los controles de aptitud del
sistema preliminar y de la muestra en el procedimiento de la valoracin; dichos factores se pueden determinar basndose en la
USP 38
experiencia adicional obtenida en el ejercicio de validacin. El captulo 1033 ofrece una discusin exhaustiva sobre la validacin de valoraciones biolgicas.
5.5 Mantenimiento de Valoraciones Biolgicas
1033 VALIDACIN DE VALORACIONES BIOLGICAS

1. INTRODUCCIN
Las Valoraciones Biolgicas forman una parte integral de la evaluacin de calidad requerida para la fabricacin y comercializacin de muchos productos biolgicos y de algunos medicamentos no biolgicos. Las valoraciones biolgicas que comnmente
se utilizan para estimar la potencia de un frmaco se pueden distinguir de las pruebas qumicas por su dependencia de un
sustrato biolgico (p.ej., animales, clulas vivas o complejos funcionales de receptores diana). Debido a los mltiples factores
operativos y biolgicos que surgen de su fundamento biolgico, por lo general presentan una mayor variabilidad que las pruebas qumicas.
Las valoraciones biolgicas representan una de las diversas pruebas fisicoqumicas y biolgicas con procedimientos y criterios
de aceptacin que controlan los atributos crticos de calidad de un medicamento biolgico. Conforme a lo descrito en las
Guas de la ICH titulada Specifications: Test Procedures And Acceptance Criteria For Biotechnological/Biological Products
(Q6B), seccin 2.1.2, las tcnicas de valoracin biolgica pueden medir la respuesta biolgica de un organismo al producto;
una respuesta bioqumica o fisiolgica a nivel celular; velocidades de reaccin enzimticas o respuestas biolgicas inducidas
mediante interacciones inmunolgicas; o unin de ligandos y receptores. A medida que surgen nuevos medicamentos biolgicos y nuevas tecnologas, es probable que aumente el alcance de las metodologas de valoracin biolgica. Por lo tanto, el
presente captulo general, Validacin de Valoraciones Biolgicas 1033 se centra en metodologas que ofrecen flexibilidad para
adoptar nuevos mtodos de valoracin biolgica, nuevos medicamentos biolgicos, o la combinacin de ambos para evaluar
la potencia del frmaco.
Las buenas prcticas de fabricacin requieren que los mtodos de prueba usados para evaluar el cumplimiento de los productos farmacuticos con los requisitos de calidad cumplan con los estndares apropiados de exactitud y confiabilidad. La validacin de la valoracin es el proceso de demostrar y documentar que las caractersticas de desempeo del procedimiento y de
Captulos
Aunque se trata de operaciones discretas, el desarrollo y la validacin de una valoracin biolgica llevan a la realizacin de
actividades continuas. Las mejoras de la valoracin se pueden implementar a medida que cambia la tecnologa, conforme el
laboratorio se vuelve ms versado con el procedimiento y los cambios a la metodologa de la valoracin biolgica requieran la
reevaluacin del desempeo de la misma. Algunos de estos cambios pueden ser respuestas a un desempeo inesperado durante el procesamiento de rutina. Se deben monitorear las acciones correctivas usando procedimientos de control rutinario.
Los cambios importantes pueden requerir de un estudio para verificar que la valoracin biolgica sigue siendo adecuada para
su uso. Se puede emplear una metodologa de anlisis de equivalencia para demostrar que el cambio ha generado un desempeo adecuado. Asimismo, se puede llevar a cabo un estudio de orientacin estadstica para demostrar que el cambio no compromete las caractersticas de desempeo de la valoracin previamente aceptables.
Transferencia de la ValoracinLa transferencia de la valoracin supone un uso pretendido conocido de la valoracin biolgica en el laboratorio receptor y la capacidad requerida asociada para el sistema de valoracin. Estos dos factores demarcan
implcitamente, aunque quizs no precisamente, los lmites relacionados con la cantidad de sesgo y la prdida de precisin
permitida entre laboratorios. Para utilizar dos laboratorios de manera intercambiable para sustentar un producto ser necesario
tomar en cuenta la variacin entre laboratorios, adems de la precisin intermedia para los requisitos de tamao de las muestras a fin de determinar la capacidad del proceso. Para informacin y ejemplos relacionados con la interrelacin entre sesgo,
capacidad del proceso y validacin, ver Ejemplo de Validacin de Valoraciones Biolgicas en el captulo general 1033.
Mejoramiento o Actualizacin de un Sistema de Valoracin BiolgicaUna nueva versin de una valoracin biolgica puede mejorar la calidad de sesgo, precisin, intervalo, robustez, especificidad, disminuir los costos de operacin u ofrecer otras
ventajas convincentes. Se puede utilizar un estudio puente al momento de mejorar o actualizar una valoracin biolgica para
comparar el desempeo de la nueva valoracin con la ya establecida. Adems, se puede usar una variedad de muestras (p.ej.,
liberacin del lote, estabilidad, sometidas a estrs, isoformas crticas) para demostrar la equivalencia de las potencias estimadas. Aunque los sistemas de valoracin pueden presentar algunas diferencias (p.ej, una valoracin biolgica en animales frente
a una valoracin biolgica basada en clulas), si las valoraciones emplean tanto el mismo Estndar como el mismo mecanismo
de accin, existe una expectativa razonable de obtener potencias comparables. Si la nueva valoracin emplea un Estndar diferente, el requisito mnimo para una comparacin aceptable es una pendiente de uno en la relacin logartimica lineal entre las
potencias estimadas. Un aspecto importante a considerar sobre esta recomendacin es que cualquier precisin deficiente o
valoracin con sesgo que se haya usado previamente podra tener un impacto duradero sobre los requisitos de las determinaciones repetidas, incluso si la valoracin se reemplaza posteriormente con una valoracin mejorada.
Captulos
USP 38
su mtodo de base cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista y que la valoracin es, por lo tanto, adecuada para su
uso previsto. El captulo general de la USP Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225 y la gua ICH Q2(R1) describen las
caractersticas (parmetros) de desempeo de la valoracin que se deben evaluar para procedimientos que sustenten productos farmacuticos de pequeas molculas. Aunque resulta fcil evaluar estos parmetros de validacin para muchos tipos de
medicamentos bien caracterizados por procesos qumicos, an no se ha delineado claramente su interpretacin y aplicabilidad
para algunos tipos de valoraciones biolgicas. Este captulo trata la validacin de valoraciones biolgicas desde el punto de
vista de la medicin de actividad, en lugar de mediciones de masa o fisicoqumicas, con el propsito de alinear las caractersticas del desempeo de la valoracin biolgica con los usos en la prctica de las valoraciones biolgicas.
La evaluacin del desempeo de las valoraciones biolgicas es un proceso continuo, pero debe realizarse una vez completado el desarrollo. La validacin de valoraciones biolgicas se gua por un protocolo de validacin que describe los objetivos y el
diseo del estudio de validacin. El captulo general 1033 ofrece objetivos de validacin relacionados con las valoraciones
biolgicas de la potencia relativa. Las valoraciones biolgicas de la potencia relativa se basan en una comparacin de las respuestas de la valoracin biolgica para una muestra de Prueba contra las de un Estndar designado y ofrecen una medida
cuantitativa de la actividad biolgica de la Prueba con respecto a la del Estndar.
Los parmetros de validacin discutidos incluyen exactitud relativa, especificidad, precisin intermedia e intervalo. Los laboratorios pueden usar la linealidad de las diluciones para verificar la exactitud relativa y el intervalo del mtodo. Aunque la robustez no
es un requisito de validacin, el presente captulo general 1033 recomienda evaluar la robustez de la valoracin biolgica
antes de la validacin. Asimismo, el captulo 1033 describe metodologas para el diseo de la validacin (seleccin de muestras y estrategia para determinaciones repetidas), criterios de aceptacin de la validacin, anlisis e interpretacin de datos y,
finalmente, monitoreo del desempeo de la valoracin biolgica a travs del control de calidad. Adems, se analiza la documentacin de los resultados de la validacin de la valoracin biolgica, con respecto a los experimentos previos a la validacin
que se llevan a cabo para optimizar el desempeo de la valoracin biolgica. Para los objetivos del presente captulo general
1033, el trmino valoracin biolgica deber interpretarse con el sentido de valoracin biolgica de la potencia relativa.
2. FUNDAMENTOS DE LA VALIDACIN DE LA VALORACIN BIOLGICA

El objetivo de la validacin de la valoracin biolgica radica en confirmar que las caractersticas operativas del procedimiento
sean las adecuadas para el uso previsto del procedimiento. Las cuestiones implicadas en el desarrollo de una valoracin biolgica se describen con mayor detalle en el captulo general 1032 y se asume que han sido resueltas al momento en que la
valoracin biolgica entra en la etapa de validacin. Dichas decisiones debern incluir una identificacin de los componentes
de una valoracin y de una corrida para la valoracin biolgica. Las diluciones (concentraciones) mltiples del Estndar y de
una o ms muestras de Prueba constituyen un conjunto de determinaciones repetidas (tambin conocido como conjunto mnimo), que contiene un sustrato de prueba (p.ej., un grupo de animales o frascos de clulas ) en cada dilucin para cada muestra (Pruebas y Estndar). Una corrida se identifica como el trabajo realizado durante un periodo en el que existe una expectativa razonable de que la exactitud (certeza) y la precisin en el sistema de valoracin se mantengan estables. En la prctica, una
corrida con frecuencia consiste en el trabajo realizado por un solo analista en un laboratorio, con un conjunto de equipo, en
un tiempo corto (tpicamente un da). Una valoracin es el conjunto de datos usados para evaluar la similitud y potencia estimada para cada muestra de Prueba relativa a un Estndar. Una corrida puede contener mltiples valoraciones, una sola valoracin o parte de una valoracin. Se pueden combinar mltiples valoraciones para generar un valor de informe para una muestra. El valor de informe es el valor que se compara con una especificacin de producto.
Para valoraciones que implican grupos en cada dilucin (p.ej., 6 muestras, cada una en 10 diluciones, en los pocillos no localizados en los bordes de cada una de las placas de cultivo celular de 96 pocillos usadas) los grupos (placas) constituyen bloques estadsticos que deben ser elementos en la valoracin y en los anlisis de validacin (los bloques se analizan en el captulo
1032). Las determinaciones repetidas dentro de los bloques para muestras de Prueba no son generalmente rentables. Este
captulo no proporciona un mayor anlisis sobre los bloques, pues ste se encuentra disponible en el captulo general 1032.
Inicialmente, se asigna un valor de 1,0 100% a la cantidad de actividad (potencia) del Estndar, y la potencia de la muestra de Prueba se calcula comparando las curvas de concentracinrespuesta para el par de la Prueba y el Estndar, cuyo resultado es una medida sin unidad, que es la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la potencia del Estndar. En
algunos casos, se asigna un valor al Estndar correspondiente a otra propiedad, como por ejemplo, la concentracin de protena. En dicho caso, la potencia de la muestra de Prueba es la potencia relativa multiplicada por el valor asignado del Estndar.
Una suposicin de las valoraciones biolgicas de lneas paralelas o de curvas paralelas (p.ej., logsticas de cuatro parmetros) es
que las curvas de dosisrespuesta generadas usando un Estndar y una Muestra de Prueba tienen una forma de curva similar
(paralela), que se diferencia nicamente por un cambio horizontal en la dosis logartmica. Para valoraciones biolgicas de cociente de pendientes, las curvas generadas para las muestras Estndar y la Muestra deben ser lineales, pasar a travs de una
misma ordenada al origen y diferir nicamente en sus pendientes. La informacin sobre cmo evaluar el paralelismo se proporciona en los captulos generales 1032 y 1034.
Para establecer la exactitud relativa y el intervalo de la valoracin biolgica, la validacin de las muestras de Prueba se puede
construir usando una serie de diluciones del Estndar para evaluar la linealidad de las diluciones (linealidad de la relacin entre
la potencia relativa conocida y la medida). Asimismo, el estudio de validacin debe generar una estimacin representativa de
la variabilidad de la determinacin de potencia relativa. Aunque los estudios de robustez por lo general se realizan durante el
desarrollo de la valoracin biolgica, se pueden incluir en la validacin factores claves de estos estudios, tales como el tiempo y
USP 38
la temperatura de incubacin y, para valoraciones biolgicas basadas en clulas, el nmero de pasajes de clulas y el nmero
de clulas, en particular si interactan con otro factor que se introduzca durante la validacin (p.ej., un reactivo sensible a la
temperatura cuya sensibilidad vara entre lotes). Debido a la potencial influencia sobre la valoracin biolgica de factores como
mltiples analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseo de la validacin de la valoracin biolgica debe considerar dichos factores. La variabilidad de la potencia causada por estos elementos combinados define la precisin intermedia
(IP, por sus siglas en ingls) de la valoracin biolgica. Un estudio adecuado de la variabilidad de los valores de potencia obtenidos, incluyendo el impacto de factores intravaloracin y entre corridas, puede ayudar al laboratorio a confirmar una estrategia de anlisis adecuada y a predecir la variabilidad inherente del valor de informe (que puede ser el promedio de mltiples
determinaciones de potencia). Las estimaciones de variabilidad tambin se pueden usar para establecer la magnitud de las diferencias que se pueden distinguir entre muestras analizadas en la valoracin biolgica. (Ver la seccin 3.4 Uso de los Resultados
de la Validacin para la Caracterizacin de Valoraciones Biolgicas.)
Para demostrar la especificidad (tambin conocida como selectividad) se requiere evidencia sobre la falta de influencia de los
componentes de la matriz tales como componentes del proceso de fabricacin o productos de degradacin, de modo que las
mediciones cuantifiquen nicamente la molcula diana. Otros mtodos analticos pueden complementar una valoracin biolgica mediante la medicin o identificacin de otros componentes en una mezcla.
2.1 Protocolo de Validacin para Valoraciones Biolgicas
2.2 Documentacin de los Resultados de la Validacin de la Valoracin Biolgica

Los resultados de la validacin de la valoracin biolgica deben documentarse en un informe de validacin. El informe de
validacin debe sustentar la conclusin que indica que el mtodo es adecuado para su uso o debe indicar una accin correctiva (tal como un incremento en la estrategia de determinaciones repetidas) que se llevar a cabo para generar resultados lo
suficientemente confiables como para conseguir que sea apto para uso. El informe debe incluir los datos brutos y los resultados
intermedios (p.ej., se deben proveer las estimaciones de los componentes de la varianza adems de la precisin intermedia
general) que facilitaran la reproduccin del anlisis de validacin de la valoracin biolgica por parte de un revisor independiente. Las estimaciones de los parmetros de validacin se deben informar para cada nivel y a nivel general, segn corresponda. Las desviaciones del protocolo de validacin deben documentarse con su respectiva justificacin. Las conclusiones obtenidas del estudio se deben describir claramente con referencias a las acciones de seguimiento, segn sea necesario. Las acciones
de seguimiento pueden incluir enmiendas en el sistema o en los criterios de aptitud del sistema o modificaciones a la estrategia
de determinaciones repetidas de la valoracin biolgica. Se pueden incluir referencias a experimentos de prevalidacin como
parte del informe del estudio de validacin. Los experimentos de prevalidacin pueden incluir experimentos de robustez, en
los que se hayan identificado los parmetros de la valoracin biolgica y se hayan establecido intervalos para parmetros significativos; asimismo, pueden incluir experimentos de calificacin, en los que se haya llevado a cabo el procedimiento final para
confirmar el desempeo satisfactorio durante la operacin de rutina. Las conclusiones derivadas de los experimentos de prevalidacin y calificacin realizados durante el desarrollo contribuyen a la descripcin de las caractersticas operativas del procedimiento de valoracin biolgica.
2.3 Diseo de Validacin para Valoraciones Biolgicas

La validacin de valoraciones biolgicas debe incluir muestras representativas de los materiales que se analizarn en la valoracin biolgica y debe establecer de manera efectiva las caractersticas de desempeo del procedimiento. Para evaluar la exac-
Captulos
Un protocolo de validacin para valoraciones biolgicas debe incluir el nmero y los tipos de muestras que se estudiarn en
la validacin; el diseo del estudio, incluyendo los factores entre corridas e intracorridas; la estrategia para determinaciones
repetidas; los parmetros de validacin predeterminados y los criterios de aceptacin diana justificados para cada parmetro; y
el plan propuesto para el anlisis de los datos. Se debe tomar en cuenta que, con respecto al cumplimiento de los criterios de
aceptacin, el no encontrar un efecto importante desde el punto de vista estadstico no representa una base adecuada para
definir un desempeo aceptable en una valoracin biolgica; el cumplimiento con los criterios de aceptacin se puede evaluar
de mejor manera usando una metodologa de equivalencia.
Asimismo, se deben especificar los criterios de aceptacin para la valoracin, corrida y muestra, tales como la aptitud del
sistema y la similitud, antes de realizar la validacin. Dependiendo del grado de desarrollo de la valoracin biolgica, los criterios se pueden proponer como tentativos y se pueden actualizar con los datos de la validacin. Los incumplimientos de la valoracin, de la corrida o de las muestras se pueden reevaluar de acuerdo con criterios definidos en el protocolo de la validacin
y, con justificacin slida, incluirse en la evaluacin general de la validacin. Pueden ser necesarios ensayos de validacin adicionales para sustentar cambios en el mtodo.
El protocolo de validacin de la valoracin biolgica debe incluir criterios de aceptacin diana para los parmetros de validacin propuestos. Los pasos a tomar cuando no se cumpla un criterio de aceptacin diana se deben especificar en el protocolo
de validacin y pueden resultar en un lmite en el intervalo de potencias que se puede medir en la valoracin biolgica o en
una modificacin de la estrategia de determinaciones repetidas en el procedimiento de la valoracin biolgica.
Captulos
USP 38
titud relativa, se deben usar los niveles de potencia relativa de la muestra que delimitan el intervalo de potencias y que son
susceptibles de anlisis en la valoracin biolgica. De tal manera, se pueden estudiar muestras que abarcan un amplio intervalo
de potencias para un medicamento o producto biolgico con un amplio intervalo de especificacin o para un producto con
una inestabilidad inherente, pero se puede usar un intervalo ms estrecho para un producto ms duradero. Se requiere un
mnimo de tres niveles de potencia, pero se recomiendan cinco para una evaluacin fidedigna. Si se cumplen los criterios de
valoracin para exactitud relativa y precisin intermedia, los niveles de potencia seleccionados constituirn el intervalo de la
valoracin biolgica. Como resultado, se obtendr un intervalo limitado a partir de los niveles que no cumplan con sus criterios de aceptacin diana. Tambin se pueden generar muestras para la validacin de la valoracin biolgica sometiendo una
muestra a un nivel de estrs que pudiera observarse en la prctica rutinaria (es decir, investigaciones de estabilidad). Asimismo,
las influencias de la matriz de la muestra (excipientes, constituyentes del proceso o componentes de combinacin) se pueden
estudiar estratgicamente variando de manera intencionada dichas influencias con el analito de inters, usando una metodologa multifactorial, lo cual a menudo habr de realizarse durante el desarrollo, antes de generar los datos de liberacin y estabilidad.
El diseo de la valoracin biolgica debe considerar todas las facetas del proceso de medicin. Las fuentes de variabilidad en
las mediciones de la valoracin biolgica incluyen la preparacin de la muestra, factores intracorridas y factores entre corridas.
La estimacin representativa de la variabilidad de la valoracin biolgica requiere tomar en cuenta dichos factores. La preparacin de la muestra de Prueba y del Estndar se deben llevar a cabo de manera independiente durante cada corrida de validacin.
La estrategia de determinaciones repetidas usada en la validacin debe reflejar el conocimiento adecuado de los factores que
pudieran influenciar la medicin de la potencia. La variabilidad intracorridas puede verse afectada: por los factores operativos
de la valoracin biolgica que por lo general se establecen durante el desarrollo (temperatura, pH, tiempos de incubacin,
etc.); por el diseo de la valoracin biolgica (nmero de animales, nmero de diluciones, determinaciones repetidas por dilucin, espaciado de diluciones, etc.); por los criterios de aceptacin de la valoracin y de la muestra; y por el anlisis estadstico
(cuando los puntos finales primarios son la evaluacin de similitud para cada muestra y las estimaciones de potencia para las
muestras de referencia). Las restricciones operativas y el diseo de la valoracin biolgica (frmulas dentro y entre corridas que
resultan en un valor de informe para un material de prueba) por lo general se especifican durante el desarrollo y pueden convertirse en una parte del procedimiento operativo de la valoracin biolgica. La precisin intermedia se estudia mediante corridas independientes del procedimiento, posiblemente mediante el uso de un diseo experimental que altera aquellos factores
que pueden impactar el desempeo del procedimiento. Los experimentos (incluyendo aqullos que implementan diseos formalizados de experimentos [DOE, por sus siglas en ingls]) con estructuras de diseo anidado o cruzado pueden revelar fuentes importantes de variabilidad en el procedimiento, as como asegurar una estimacin representativa de variabilidad a largo
plazo. Durante la validacin no es necesario emplear el formato requerido para obtener el valor de informe de una solucin de
Prueba. Un experimento de validacin bien diseado que combine fuentes de variabilidad entre corridas e intracorridas provee
estimaciones de componentes independientes de la variabilidad de la valoracin biolgica. Estos componentes se pueden usar
para verificar o pronosticar la variabilidad del formato de la valoracin biolgica.
Un anlisis extenso de los datos de validacin debe incluir resmenes grficos y estadsticos de los resultados de los parmetros de validacin y su cumplimiento con los criterios de aceptacin diana. El anlisis debe seguir las especificaciones del plan
de anlisis de datos descrito en el protocolo de validacin. En la mayora de los casos, el logaritmo de la potencia relativa debe
analizarse para cumplir con las suposiciones de los mtodos estadsticos (ver la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas, Escala
del Anlisis). Dichas suposiciones incluyen la normalidad de la distribucin a partir de la que se muestrearon los datos y la homogeneidad de la variabilidad a travs del intervalo de resultados observados en la validacin. Es posible explorar tales suposiciones usando tcnicas grficas tales como grficas de caja y grficas de probabilidad. La suposicin de normalidad se puede
investigar usando anlisis estadsticos de normalidad a travs de una coleccin de datos histricos de tamao adecuado. Se
deben buscar mtodos alternativos de anlisis cuando las suposiciones pudieran ser cuestionables. Los intervalos de confianza
deben calcularse para los parmetros de la validacin usando los mtodos descritos en este captulo y en el captulo general
Datos AnalticosInterpretacin y Tratamiento 1010.
2.4 Estrategias de Validacin de las Caractersticas de Desempeo de la Valoracin Biolgica

Los parmetros que deben verificarse en una valoracin biolgica son: exactitud relativa, especificidad, precisin intermedia
(que incorpora la repetibilidad) e intervalo. Otros parmetros discutidos en el captulo general 1225 y en la gua ICH Q2(R1),
tales como el lmite de deteccin y el lmite de cuantificacin, no han sido incluidos en este captulo debido a que, por lo
general, no son relevantes para una valoracin biolgica que informa la potencia relativa. No obstante, stos pueden ser relevantes para la validacin de una valoracin auxiliar, tal como la empleada para contabilizar los elementos que responden o
medir la respuesta en conjunto con una valoracin de potencia in vivo. Asimismo, la linealidad no forma parte de la validacin
de una valoracin biolgica, excepto por su relacin con la exactitud relativa (linealidad de las diluciones). A continuacin, se
presentan estrategias para tratar los parmetros de validacin de la valoracin biolgica.
Exactitud RelativaLa exactitud relativa de una valoracin biolgica de potencia relativa es la relacin entre la potencia relativa medida y la potencia relativa conocida. La exactitud relativa en la valoracin biolgica se refiere a una pendiente unitaria
(pendiente = 1) entre el logaritmo de la potencia relativa medida y el logaritmo de la potencia relativa conocida. La metodologa ms comn para demostrar la exactitud relativa para las valoraciones biolgicas de potencia relativa es mediante la cons-
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truccin de potencias diana a travs de la dilucin del material estndar o de una muestra de Prueba con una potencia conocida. Este tipo de estudio a menudo se denomina estudio de linealidad de las diluciones. Los resultados obtenidos de un estudio
de linealidad de las diluciones se deben evaluar usando el sesgo relativo estimado en niveles individuales y mediante una tendencia en el sesgo relativo a travs de los niveles. El sesgo relativo en niveles individuales se calcula de la manera siguiente:
que corresponden a la variacin intracorridas y entre corridas, y que se pueden usar para estimar la precisin intermedia de la
valoracin biolgica, as como la variabilidad del valor de informe para distintos formatos de valoraciones biolgicas (variabilidad del formato). La precisin intermedia expresada como el coeficiente geomtrico porcentual de variacin (%GCV, por sus
siglas en ingls) se obtiene con la siguiente frmula, usando para este caso el logaritmo natural de la potencia relativa en el
anlisis (ver la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas, Escala del Anlisis):
La variabilidad del valor de informe derivado del anlisis realizado con n conjuntos de determinaciones repetidas en cada una
de las k corridas (variabilidad del formato) es igual a:
Esta frmula se puede usar para determinar un formato de anlisis adecuado para varios usos de la valoracin biolgica (p.ej.,
anlisis de liberacin y evaluacin de la estabilidad).
Captulos
La tendencia en el sesgo se mide por la pendiente estimada del logaritmo de la potencia medida en funcin del logaritmo
de la potencia diana, el cual se debe ajustar a un criterio de aceptacin diana. Si no existe una tendencia en el sesgo relativo a
travs de los niveles, el sesgo relativo estimado en cada nivel se puede ajustar a un criterio de aceptacin diana previamente
especificado y definido en el protocolo de validacin (ver la seccin 3 Ejemplo de Validacin de una Valoracin Biolgica).
EspecificidadPara productos o productos intermedios asociados con matrices complejas, la especificidad implica demostrar
la ausencia de interferencia de componentes de la matriz o de componentes relacionados con el producto que se esperara
que estuvieran presentes. Lo anterior se puede evaluar mediante la dilucin paralela del Estndar con o sin la adicin de cantidades conocidas del compuesto potencialmente interferente. Si las curvas son similares y la potencia cumple con las expectativas de una comparacin entre Estndares, la valoracin biolgica es especfica para el compuesto. Para estas evaluaciones, tanto la similitud como la potencia se pueden evaluar usando anlisis de equivalencia apropiados.
La especificidad tambin se puede referir a la capacidad de la valoracin biolgica para distinguir entre molculas biofarmacuticas diferentes pero relacionadas. Se debe buscar un buen entendimiento con respecto a la molcula y a cualquier forma
relacionada, as como de las oportunidades de que molculas relacionadas se introduzcan en la valoracin biolgica.
Precisin IntermediaDebido a la potencial influencia sobre la valoracin biolgica de factores tales como analistas, instrumentos o procedencia de los reactivos, el diseo de la validacin de la valoracin biolgica debe considerar dichos factores. La
variabilidad general a partir de las mediciones tomadas en una variedad de condiciones normales de anlisis dentro de un laboratorio define la precisin intermedia de la valoracin biolgica. La precisin intermedia (IP, por sus siglas en ingls) es el
trmino usado por la ICH y la USP para referirse a lo que comnmente se conoce como variabilidad entre corridas. Las medidas de precisin intermedia analizan la influencia de factores que variarn con el tiempo despus de haber implementado la
valoracin biolgica. Dichas influencias, por lo general, son inevitables e incluyen factores tales como cambios de personal
(nuevos analistas), recepcin de lotes de nuevos reactivos, entre otros.
Cuando se ha planeado la valoracin usando un Diseo de Experimento multifactorial, se puede explorar el impacto de cada
factor grficamente para establecer contribuciones importantes a la variabilidad de la potencia. La identificacin de factores
importantes debe guiar hacia los procedimientos que buscan controlar sus efectos, como por ejemplo, ampliar las restricciones
para las condiciones operativas intravaloraciones o procedimientos de calificacin estratgicos para factores entre corridas tales
como analistas, instrumentos y lotes de reactivos.
Las contribuciones de los factores de estudio de la validacin a la precisin intermedia general de la valoracin biolgica se
pueden determinar mediante un anlisis de componentes de la varianza aplicado a los resultados de la validacin. La mejor forma de llevar a cabo el anlisis de componentes de la varianza es utilizar un software estadstico que sea capaz de realizar un
anlisis de modelo mixto con una estimacin de probabilidad mxima restringida (RMLE, por sus siglas en ingls).
Un anlisis de componentes de la varianza genera estimaciones de componentes de la varianza tales como
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IntervaloEl intervalo de la valoracin biolgica se define como las potencias verdadera o conocida para las que se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene un nivel adecuado de exactitud relativa y de precisin intermedia. El intervalo es
normalmente derivado del estudio de la linealidad de las diluciones y, por lo menos, debe cubrir el intervalo de especificacin
del producto para la potencia. Para los anlisis de estabilidad y para minimizar la necesidad de diluir o concentrar muestras de
Prueba con altas o bajas potencias para ajustarlas al intervalo de la valoracin biolgica, resulta beneficioso validar la valoracin
biolgica usando un intervalo ms amplio.
2.5 Validacin de los Criterios de Aceptacin Diana
Captulos
Se debe optar por una validacin de los criterios de aceptacin diana para minimizar los riesgos inherentes al tomar decisiones derivadas de las medidas de la valoracin biolgica y para que la capacidad de la tcnica sea razonable. Cuando existe una
especificacin de producto, los criterios de aceptacin deben justificarse basndose en el riesgo de que las medidas podran
caer fuera de la especificacin del producto. Se pueden usar las consideraciones derivadas de un ndice de capacidad del proceso (Cp, por sus siglas en ingls) para informar los lmites del sesgo relativo (RB, por sus siglas en ingls) y la precisin intermedia de la valoracin biolgica. Este captulo emplea el siguiente ndice de capacidad del proceso:
donde el Lmite de Especificacin Superior (USL, por sus siglas en ingls) y el Lmite de Especificacin Inferior (LSL, por sus
siglas en ingls) son la especificacin superior e inferior de liberacin, el sesgo relativo, (RB) es un lmite para el grado de sesgo
relativo en la valoracin
son la varianza del producto de inters (es decir, la variabilidad entre lotes) y la varianza de la valoracin de liberacin (RA, por
sus siglas en ingls) (con formato asociado) respectivamente. (Ver en la seccin 3, Ejemplo de una Validacin de Valoracin Biolgica, un ejemplo de determinacin de
y de la capacidad de procesamiento.) Esta formulacin requiere conocer con anticipacin la variabilidad diana del producto o
la inclusin de una seleccin aleatoria de lotes para estimar estas caractersticas como parte de la validacin. Debido al conocimiento limitado sobre el desempeo de la valoracin, del historial de fabricacin y de las especificaciones finales durante el
desarrollo, esta metodologa puede usarse simplemente como gua para definir los criterios de aceptacin de la validacin.
La seleccin de un lmite con respecto a la capacidad del proceso es una decisin empresarial. La proporcin de lotes que se
pronostica estarn fuera de sus lmites de especificacin es una funcin de la capacidad de proceso. Algunos laboratorios necesitan una capacidad de proceso correspondiente a un ndice de capacidad del proceso mayor o igual a 1,3. Esto corresponde a
una posibilidad aproximada de 1 en 10 000 de que un lote con potencia en el centro del intervalo de especificacin caiga por
fuera de los lmites de especificacin.
Cuando no se hayan establecido las especificaciones para un producto, se puede formular una restriccin para el sesgo relativo o la IP basndose en la capacidad de la tcnica de la metodologa de la valoracin biolgica. Por ejemplo, aunque las valoraciones qumicas y los inmunoensayos a menudo son capaces de obtener un porcentaje de coeficiente de variacin (%CV, por
sus siglas en ingls, o desviacin estndar relativa porcentual, %RSD) de casi un solo dgito, se puede establecer una restriccin
ms liberal a las valoraciones biolgicas, tales como valoraciones biolgicas de potencia en animales, que operan con una variabilidad mucho mayor (medida como %GCV, que se puede comparar con el %CV; ver el Apndice). En este caso, el objetivo
de la validacin puede ser la caracterizacin del mtodo, usando los resultados de la validacin para establecer un formato de
valoracin con el que se espera generar medidas de producto fidedignas. El protocolo de validacin debe incluir una justificacin slida para los criterios de aceptacin aceptables o para el uso de una caracterizacin.
2.6 Mantenimiento de la Valoracin

La implementacin de la valoracin biolgica se lleva a cabo una vez que sta ha sido validada. No obstante, resulta importante monitorear su comportamiento con el paso del tiempo, lo cual se logra fcilmente manteniendo diagramas de controles
estadsticos del proceso (SPC, por sus siglas en ingls) para parmetros adecuados de la curva de respuesta del Estndar y de la
potencia de las muestras de Control de Calidad de la valoracin. El propsito de estos diagramas es identificar en una etapa
temprana cualquier cambio o desvo en la valoracin biolgica. Si se observa una tendencia en cualquiera de los diagramas de
controles estadsticos del proceso, se deber identificar la razn de dicha tendencia. Si la resolucin requiere modificar la valo-
USP 38
racin biolgica o si se ha presentado una modificacin seria en la valoracin biolgica por otras razones (por ejemplo, un
cambio tecnolgico mayor), la valoracin biolgica deber revalidarse o vincularse a la valoracin biolgica original mediante
un estudio puente adecuadamente diseado con criterios de aceptacin que utilicen anlisis de equivalencia.
2.7 Consideraciones Estadsticas
Asimismo, las medidas recopiladas de la validacin se ven influenciadas por la escala logartmica normal. La respuesta pronosticada debe informarse como la media geomtrica de las mediciones individuales de potencia relativa, mientras que la variabilidad se expresa como %GCV. El GCV se calcula como el antilogaritmo de la desviacin estndar, Slog, de mediciones de potencia relativa transformadas. La frmula provista es:
GCV = antilog(Slog) 1
La variabilidad se expresa como GCV en lugar de RSD de la distribucin logartmica normal a fin de conservar la continuidad
usando la transformacin logartmica (ver la discusin adicional en el Apndice de este captulo). Los intervalos que pueden
calcularse a partir de la GCV sern uniformes con respecto a los intervalos calculados a partir de la media y de la desviacin
estndar de los datos transformados en logaritmos. La Tabla 1 presenta un ejemplo del clculo de la media geomtrica (GM,
por sus siglas en ingls) y el sesgo relativo asociado, con el %GCV para una serie de mediciones de potencia relativa realizadas
con muestras analizadas en el nivel 1,00. El logaritmo base e se usa en la ilustracin.
Tabla 1. Ilustracin de los Clculos de Media Geomtrica y %GCV
Potencia Relativa1
ln de la Potencia Relativa
1,1299
0,1221
0,9261
0,0768
1,1299
0,1221
1,0143
0,0142
1,0027
0,0027
1,0316
0,0311
1,1321
0,1241
1,0499
0,0487
Promedio
0,0485
GM = 1,0497
SD
0,0715
%GCV = 7,4%
RB = 4,97%
Captulos
Algunas consideraciones estadsticas se relacionan con el diseo de la validacin de una valoracin biolgica y con el anlisis
de los datos. Asimismo, se relacionan con las propiedades de las mediciones de la valoracin biolgica, as como con las herramientas estadsticas que se pueden usar para resumir e interpretar los resultados de validacin de la valoraciones biolgicas.
Escala del AnlisisLa escala del anlisis de la validacin de una valoracin biolgica, en la que los datos son las potencias
relativas de las muestras en el estudio de validacin, se debe tomar en cuenta para obtener conclusiones fidedignas del estudio. El presente captulo asume que se han establecido previamente mtodos apropiados para calcular la potencia relativa a
partir de los datos brutos de la respuesta de la valoracin biolgica (segn se indica en el captulo general 1034). Las mediciones de potencia relativa por lo general estn normalmente distribuidas en logaritmos. Las medidas distribuidas normalmente en
logaritmos presentan sesgo y se caracterizan por la heterogeneidad de la variabilidad, donde la desviacin estndar es proporcional al nivel de respuesta. Los mtodos estadsticos citados en este captulo requieren que los datos sean simtricos, aproximndose a una distribucin normal, aunque algunos otros procedimientos requieren de homogeneidad de la variabilidad en las mediciones a travs del intervalo de potencia. Por lo regular, el anlisis de potencia posterior a la transformacin logartmica genera datos que se acercan ms al cumplimiento de ambos requisitos. La base de la transformacin logartmica no es de importancia, siempre que se mantenga una base uniforme durante todo el anlisis. De esta forma, por ejemplo, si el logaritmo natural
(logaritmo en base e) se usa para transformar las mediciones de potencia relativa, los resultados recopilados se convierten de
nuevo a la escala de la valoracin biolgica utilizando la base e.
La distribucin de las mediciones de potencia deben evaluarse como parte del desarrollo de la valoracin biolgica (segn se
describe en 1032). Si se determina que las mediciones de potencia estn distribuidas con normalidad, la validacin se puede
llevar a cabo usando los mtodos descritos en el captulo general Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225.
Como consecuencia de la transformacin logartmica habitual (para valoraciones de lneas paralelas) de mediciones de potencia relativa, existen ventajas cuando los niveles seleccionados para el estudio de validacin se encuentran espaciados uniformemente en la escala logartmica. Un ejemplo con cinco niveles sera 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Los niveles intermedios se
obtienen como la media geomtrica (GM, por sus siglas en ingls) de dos niveles adyacentes. De esta forma, por ejemplo, el
nivel medio entre 0,50 y 1,0 se deriva de la manera siguiente:
USP 38
Tabla 1. Ilustracin de los Clculos de Media Geomtrica y %GCV (Continuacin)

Potencia Relativa1
1
ln de la Potencia Relativa
La potencia relativa es la media geomtrica de las potencias duplicadas medidas en las ocho corridas del ejemplo provisto en la Tabla 4.
En este ejemplo, la media geomtrica de las mediciones de potencia relativa se calcula como el antilogaritmo de las mediciones promedio del logaritmo de potencia relativa y luego se expresa como sesgo relativo, la desviacin porcentual a partir de la
potencia diana:
GM = ePromedio = e0,0485 = 1,0497
y el coeficiente de variacin geomtrico porcentual (%GCV) se calcula como:
Captulos
%GCV = 100 (eDesviacin Estndar 1)% = 100 (e0,0715 1)% = 7,4%

Se debe tomar en cuenta que el %GCV calculado para este ejemplo no es igual a la IP determinada en el ejemplo de validacin
de valoracin biolgica para el nivel 1,00 (8,5%); ver la Tabla 6. Este ejemplo utiliza el promedio de determinaciones repetidas
dentro de la corrida, mientras que la IP en el ejemplo de validacin representa la variabilidad de las determinaciones repetidas
individuales.
Informe de Resultados de Validacin Mediante Intervalos de ConfianzaLas estimaciones de los parmetros de validacin
de la valoracin biolgica deben presentarse como una estimacin puntual junto con un intervalo de confianza. Una estimacin
puntual es el valor numrico obtenido para el parmetro, como por ejemplo la media geomtrica GM o el %GCV. La interpretacin ms comn de un intervalo de confianza es en forma de un intervalo probable del valor verdadero del parmetro. El
ejemplo previo determina un intervalo de confianza de 90% para el logaritmo de la potencia relativa promedio, CIIn, segn se
indica a continuacin:
Para el sesgo relativo, esto significa que:
La constante estadstica (1,89) se deriva de una tabla t, con grados de libertad iguales al nmero de mediciones menos uno
(grados de libertad = 8 1 = 7). Se puede formular un intervalo de confianza para la IP o para la variabilidad del formato
usando mtodos para componentes de varianza; este captulo general no abarca dichos mtodos.
Evaluacin del Cumplimiento de los Criterios de AceptacinLos resultados de la validacin de la valoracin biolgica se
comparan con criterios de aceptacin diana a fin de demostrar que la valoracin biolgica es adecuada para su uso. El proceso
para establecer el cumplimiento de los parmetros de validacin con respecto a los criterios de aceptacin para la validacin
no debe confundirse con establecer el cumplimiento de las mediciones de potencia relativa para las especificaciones del producto. Las especificaciones del producto deben proveer informacin sobre el proceso para establecer criterios de aceptacin
para la validacin.
Una prctica comn consiste en aplicar criterios de aceptacin al parmetro de validacin estimado. Esto, sin embargo, no
se toma en cuenta para la incertidumbre en el parmetro de validacin estimado. Una solucin es mantener el intervalo de
confianza en el parmetro de validacin con respecto al criterio de aceptacin, lo cual es una metodologa estadstica estndar
que se usa para demostrar el cumplimiento con las expectativas y que recibe el nombre de anlisis de equivalencIa. No se debe
confundir con la prctica de realizar una prueba de significancia, como por ejemplo, una prueba t, que busca establecer una
diferencia a partir de algn valor diana (p.ej., sesgo relativo de 0%). Una prueba de significancia relacionada con un valor P
>0,05 (equivalente a un intervalo de confianza que incluye el valor diana para el parmetro) indica que no existe suficiente
evidencia para concluir que el parmetro es diferente al valor diana. Esto no es lo mismo que concluir que el parmetro cumple con el valor diana. El diseo del estudio puede tener muy pocas determinaciones repetidas, o los datos de validacin pueden
ser demasiado variables para descubrir una diferencia significativa del valor diana. Asimismo, una prueba de significancia puede detectar una pequea desviacin del valor diana que sea de poca importancia. Estos escenarios se ilustran en la Figura 1.
USP 38
Figura 1. Uso de intervalos de confianza para establecer que los resultados de validacin cumplen con un criterio de aceptacin.
donde ta,gl y tb ,gl son los puntos de distribucin de una distribucin t de Student; a y b son errores unilaterales tipo I y tipo II,
y representan los riesgos asociados con generar la conclusin errnea en la validacin; gl son los grados de libertad relacionados con el diseo del estudio (por lo general, n 1);
es una estimacin preliminar de precisin intermedia; y q es la desviacin aceptable (criterio de aceptacin diana).
Por ejemplo, si un criterio de aceptacin para sesgo relativo es 0,11 log (es decir, q = 0,11), la variabilidad de la valoracin
biolgica es
y a = b = 0,05,
Captulos
La lnea slida horizontal representa el valor diana (posiblemente un sesgo relativo de 0%) y las lneas punteadas forman los
lmites de aceptacin inferior (LAL) y superior (UAL). En el escenario a, el lmite de confianza incluye la diana y, por consiguiente, se puede concluir que no existe evidencia suficiente para establecer una diferencia con respecto a la diana (la metodologa
de la prueba de significancia). No obstante, aunque la estimacin puntual (el diamante slido) cae dentro del intervalo de aceptacin, el intervalo se extiende fuera del rango, lo que significa que el sesgo relativo verdadero puede estar fuera del intervalo
aceptable. En el escenario b, el intervalo cae dentro del intervalo de aceptacin, lo que significa que cumple con el criterio de
aceptacin. El intervalo en el escenario c tambin cae dentro del rango de aceptacin, pero excluye la diana. Por lo tanto, para
el escenario c, aunque la diferencia de la estimacin puntual a partir de la diana es estadsticamente significativa, c es aceptable
debido a que el intervalo de confianza cae dentro de los lmites de aceptacin diana.
Mediante el intervalo de confianza de 90%, calculado previamente, se puede establecer si la valoracin biolgica tiene un
sesgo relativo aceptable en el nivel 1,00 en comparacin con un criterio de aceptacin diana no mayor de, por ejemplo,
+12%. Debido a que el intervalo de confianza de 90% para el sesgo relativo porcentual (0,07%, 10,1%) cae dentro del intervalo (100*[(1/1,12) 1]%, 100*[(1,12/1) 1]%) = ( 11%, 12%), se puede concluir que existe un sesgo relativo aceptable en
el nivel 1,00. Se debe tomar en cuenta que un intervalo de confianza de 90% se usa en una prueba de equivalencia en lugar
de un intervalo de confianza convencional de 95%. Esto es una prctica comn y es igual que la metodologa de pruebas doblemente unilaterales (TOST, por sus siglas en ingls) usada en el anlisis de bioequivalencia farmacutica.
Riesgos Implcitos en la Toma de Decisiones y en el Nmero de Corridas de ValidacinLa aplicacin de anlisis estadsticos, incluyendo la evaluacin del cumplimiento de un parmetro de validacin con sus criterios de aceptacin, implica riesgos,
uno de stos es que el parmetro no cumpla con su criterio de aceptacin inclusive si la propiedad asociada con dicho parmetro es satisfactoria; mientras que el otro riesgo, por el contrario, consiste en que el parmetro cumpla con su criterio de
aceptacin aunque dicho parmetro sea verdaderamente insatisfactorio. Un aspecto relacionado con dichos riesgos es el tamao de la muestra.
Los dos tipos de riesgo se pueden controlar simultneamente mediante un diseo estratgico, incluyendo la seleccin del
nmero de corridas que se llevarn a cabo en la validacin. Especficamente, el nmero mnimo de corridas requeridas para
establecer el cumplimiento con un criterio de aceptacin para sesgo relativo se obtiene mediante la frmula siguiente:
Captulos
USP 38
Se debe tomar en cuenta que esta formulacin de tamao de la muestra asume la ausencia de sesgo intrnseco en la valoracin biolgica. Una solucin ms conservadora incluye algo de sesgo diferente a cero en la determinacin del tamao de la
muestra, lo cual resulta en un mayor tamao de la muestra para compensar el impacto del sesgo sobre las conclusiones de la
validacin. En el ejemplo actual, el tamao de la muestra se incrementa a 10 corridas, si se asume un sesgo intrnseco igual a
2%. Asimismo, debe tomarse en cuenta que este clculo representa una solucin recurrente (puesto que los grados de libertad
dependen de n) que requiere software estadstico o un algoritmo que emplee metodologa iterativa.
Adems, es necesario considerar que la seleccin de a y b debe justificarse basndose en los riesgos correspondientes de
generar una conclusin errnea a partir de la validacin.
Generacin de un Modelo para Resultados de Validacin Usando Modelos de Efectos MixtosMuchos anlisis relacionados con la validacin de una valoracin biolgica deben tomar en cuenta mltiples factores de diseo, tales como efectos fijos
(p.ej., nivel de potencia), as como efectos aleatorios (p.ej., analista, corrida y determinaciones repetidas). Los modelos estadsticos compuestos por efectos fijos y aleatorios reciben el nombre de modelos de efectos mixtos y, por lo general, requieren de
software estadstico sofisticado para su anlisis. Los resultados del anlisis se pueden resumir en una tabla de anlisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en ingls) o en una tabla de estimaciones de los componentes de la varianza. El objetivo principal
del anlisis es estimar parmetros crticos en lugar de establecer la significancia de un efecto. Los resultados de la generacin
del modelo ofrecen estimaciones de parmetros junto con sus errores estndar de estimaciones que se pueden emplear para
establecer el cumplimiento del criterio de aceptacin. De esta forma, el sesgo relativo promedio en cada nivel se obtiene como
una porcin del anlisis junto con su variabilidad asociada. stos constituyen un intervalo de confianza que se compara con el
criterio de aceptacin, conforme a lo descrito anteriormente. Cuando resulta posible combinar las varianzas de los niveles, la
generacin de un modelo estadstico tambin puede determinar el sesgo relativo general y la precisin intermedia, combinando la informacin obtenida a travs de los niveles utilizados en la validacin. De manera similar, los modelos de efectos mixtos
se pueden usar para obtener los componentes de la varianza para factores del estudio de validacin y para combinar los resultados a travs de las muestras y niveles del estudio de validacin.
Diseo EstadsticoLos diseos estadsticos, tales como el Diseo de Experimento multifactorial o anidado, pueden usarse
para organizar valoraciones y corridas en una validacin de valoracin biolgica. Resulta til incorporar aquellos factores que
se piense podran influenciar la respuesta de la valoracin biolgica y que varan durante el uso a largo plazo del procedimiento en estos diseos. Usando estos mtodos de diseo, es posible caracterizar las fuentes de variabilidad y se puede desarrollar
un plan de anlisis estratgico para administrar la variabilidad de la valoracin biolgica.
La Tabla 2 presenta un ejemplo de un Diseo de Experimento multifactorial que incorpora mltiples analistas, mltiples preparaciones de cultivo celular y mltiples lotes de reactivos en el plan de validacin.
Tabla 2. Ejemplo de un Diseo de Experimento Multifactorial con 3 Factores
Corrida
Analista
Preparacin de Clulas
Lote de
Reactivo
En este diseo, cada analista lleva a cabo la valoracin biolgica con ambas preparaciones de clulas y con ambos lotes de
reactivo. ste es un ejemplo de diseo factorial completo debido a que todas las combinaciones de factores se llevan a cabo en
el estudio de validacin. Para reducir el nmero de corridas en el estudio, se pueden emplear diseos factorial fraccionarios
cuando se hayan identificado ms de tres factores. Por ejemplo, si resultara prctico para un analista realizar cuatro valoraciones en una corrida, se podra usar un diseo de unidad dividida considerando a los analistas como el factor de la grfica completa y la preparacin de clulas y el lote de reactivo como los factores secundarios de la grfica. A diferencia de los experimentos de comprobacin, el diseo de validacin debe incorporar la mayor cantidad de factores en la mayor cantidad de niveles posible para obtener una estimacin representativa de la precisin intermedia. Siempre que sea posible, se debern emplear ms de dos niveles de un factor en el diseo. Lo anterior se puede lograr de una forma menos estructurada, sin relacin
alguna con el diseo factorial estricto. Las corridas de validacin se deben aleatorizar siempre que sea posible para mitigar las
influencias potenciales del orden o tiempo de corrida.
La Figura 2 presenta un ejemplo de validacin que emplea un diseo anidado (determinaciones repetidas anidadas dentro de
la placa; la placa anidada dentro del analista).
USP 38
Figura 2. Ejemplo de un diseo anidado usando dos analistas.
3. EJEMPLO DE VALIDACIN DE UNA VALORACIN BIOLGICA

A continuacin se presenta un ejemplo que ilustra los principios descritos en este captulo. La valoracin biolgica se utilizar
para sustentar un intervalo de especificacin de 0,71 a 1,41 para el producto. Usando la capacidad de proceso descrita en la
seccin 2.5 Validacin de Criterios de Aceptacin Diana, se deriva una tabla que muestra la tasa proyectada de resultados fuera
de la especificacin para diversas restricciones de sesgo relativo y precisin intermedia. La capacidad del proceso se calcula con
respecto a la variabilidad de un valor de informe usando tres corridas independientes de la valoracin biolgica (ver la discusin anterior sobre variabilidad del formato). Se asume que la variabilidad del producto es igual a 0 en los clculos. El laboratorio podra optar por incluir una variabilidad de producto diana. Se puede obtener una estimacin de la variabilidad del producto diana a partir de los datos de un producto que, por ejemplo, se fabrica usando un proceso similar.
El clculo se presenta para una precisin intermedia igual a 8% y un sesgo relativo igual a 12% (n = 3 corridas):
Probabilidad (resultados fuera de la especificacin) = 2 F(3 0,94) = 0,0048 (0,48%),

donde F representa la funcin de distribucin acumulativa normal estndar.
A partir de la Tabla 3, se puede esperar un desempeo aceptable (una probabilidad menor de 1% de obtener un resultado
fuera de la especificacin debido al sesgo y a la variabilidad de la valoracin biolgica), si la precisin intermedia es 8% y el
sesgo relativo es 12%. La frmula de tamao de la muestra provista en la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas, Riesgos de la
Toma de Decisiones y Nmero de Corridas de Validacin, se puede usar para derivar el nmero de corridas requeridas para establecer el cumplimiento con el criterio de aceptacin para un sesgo relativo igual a 12% (usando %GCVPrecisin Intermedia = 8%; a =
b = 0,05):
Tabla 3. Capacidad del Proceso y Probabilidad de Resultados Fuera de la Especificacin para Diversas Restricciones
de Sesgo Relativo y Precisin Intermedia
Lmite de Especificacin Inferior-Lmite de
Especificacin Superior
Precisin Intermedia
(%)
Sesgo
Relativo (%)
Capacidad del Proceso
Probabilidad (resultados fuera de la

especificacin)
(%)
0,711,41
20
20
0,54
10,5
0,711,41
12
0,94
0,48
0,711,41
10
1,55
0,0003
Captulos
Para estos dos tipos de diseos, as como para las combinaciones de los mismos, se pueden estimar componentes de variabilidad a partir de los resultados de la validacin. Estos componentes de variabilidad se pueden usar para identificar las fuentes
significativas de variabilidad, as como para derivar un formato de valoracin biolgica que cumpla con los requisitos de precisin del procedimiento. Se debe tomar en cuenta que las fuentes significativas de variabilidad podran haber sido identificadas
durante el desarrollo. En dicho caso, la validacin debe confirmar tanto el impacto de estos factores como el cumplimiento del
formato de la valoracin con los requisitos de precisin.
Cifras SignificativasEl nmero de cifras significativas en un resultado informado a partir de una valoracin biolgica se relaciona con la precisin de sta ltima. En general, una valoracin biolgica con un %GCV entre 2% y 20% sustentar dos cifras
significativas. El nmero de cifras significativas no debe confundirse con el nmero de lugares decimaleslos valores de informe iguales a 1,2 y 0,12 tienen el mismo nmero (dos) de cifras significativas. Este estndar de redondeo es adecuado para
mediciones en escala logartmica que presentan una variacin constante en la escala logartmica y una variabilidad proporcional, no aditiva, en la escala original (o en la escala usada originalmente para interpretacin). Se debe tomar en cuenta que el
redondeo se presenta al final de una serie de clculos cuando la medicin final se informa y se emplea para tomar decisiones,
tales como el cumplimiento con las especificaciones. De esta forma, si la medicin final es un valor de informe obtenido a
partir de mltiples valoraciones, el redondeo no debe realizarse antes de determinar el valor de informe. Asimismo, las especificaciones deben declararse con el nmero apropiado de cifras significativas.
USP 38
Por consiguiente, seran necesarias ocho corridas para tener un 95% de probabilidad de cumplir con el criterio de aceptacin diana para sesgo relativo si el sesgo relativo verdadero es cero. Tomar en cuenta que el clculo del tamao de la muestra
asume que se llevar a cabo un singulete de las muestras de validacin en cada corrida de validacin. El uso de mltiples conjuntos para determinaciones repetidas y/o mltiples valoraciones proporcionar informacin valiosa la cual permitir separar
las estimaciones para variabilidad intracorrida y entre corridas, y reducir el riesgo de incumplimiento de los criterios de aceptacin diana de la validacin.
En la validacin se estudian cinco niveles del analito diana: 0,50; 0,71; 1,00; 1,41 y 2,00. Dos analistas capacitados generan
dos corridas en cada nivel usando dos lotes de medios. Se pueden tomar en cuenta otros factores e incorporarlos en el diseo
usando una distribucin factorial fraccionaria. El laboratorio debe esforzarse para disear la validacin con la mayor cantidad
posible de niveles para cada factor a fin de obtener el mejor modelo para el desempeo a largo plazo de la valoracin biolgica. En este ejemplo, cada analista lleva a cabo dos corridas en cada nivel usando cada lote de medios. Una corrida consiste en
una serie de diluciones completas del Estndar, conforme a lo descrito en el procedimiento operativo de la validacin biolgica, junto con dos series de diluciones independientes de la muestra de Prueba. Lo anterior genera mediciones por duplicado
de la potencia relativa en cada corrida; ver la Tabla 4 para todas las observaciones de potencia relativa. Es necesario considerar
que las dos estimaciones de potencia en cada nivel de potencia en una corrida no son independientes debido a los analistas y
lotes de medios en comn.
Tabla 4. Ejemplo de Validacin de una Valoracin Biolgica con Dos Analistas, Dos Lotes de Medios
y Corridas por Nivel para cada Combinacin de Analista y Lote
Captulos
Lote de Medios/
Analista
1/1
1/2
2/1
2/2
Corrida
0,50
0,5215
0,4532
0,5667
0,5054
0,5222
0,5179
0,5314
0,5112
0,50
0,5026
0,4497
0,5581
0,5350
0,5017
0,5077
0,5411
0,5488
0,71
0,7558
0,6689
0,6843
0,7050
0,6991
0,7463
0,6928
0,7400
0,71
0,7082
0,6182
0,8217
0,7143
0,6421
0,6877
0,7688
0,7399
1,00
1,1052
0,9774
1,1527
0,9901
1,0890
1,0314
1,1459
1,0273
1,00
1,1551
0,8774
1,1074
1,0391
0,9233
1,0318
1,1184
1,0730
1,41
1,5220
1,2811
1,5262
1,4476
1,4199
1,3471
1,4662
1,5035
1,41
1,5164
1,3285
1,5584
1,4184
1,4025
1,4255
1,5495
1,5422
2,00
2,3529
1,8883
2,3501
2,2906
2,2402
2,1364
2,3711
2,0420
2,00
2,2307
1,9813
2,4013
2,1725
2,0966
2,1497
2,1708
2,3126
Figura 3. Grfica de los resultados de la validacin en funcin de los niveles de muestra.

Se utiliza una grfica para revelar cualquier irregularidad en los resultados experimentales. En particular, una grfica adecuadamente preparada puede revelar una falla en la concordancia de los resultados de la validacin con los niveles de validacin,
as como heterogeneidad de la variabilidad a travs de los niveles (ver la discusin sobre transformacin logartmica en la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas). La grfica del ejemplo de la Figura 3 incluye la lnea unitaria (lnea con una pendiente
igual a 1, la cual pasa por el origen). Los datos del analista 1 y del analista 2 se desalinearon deliberadamente con respecto a la
potencia esperada para permitir una visualizacin y comparacin claras de los conjuntos de datos obtenidos por cada analista.
USP 38
Se puede llevar a cabo un anlisis formal de los datos de validacin mediante el siguiente procedimiento: (1) una evaluacin
de la variabilidad (precisin intermedia) debe preceder a una evaluacin de la exactitud o especificidad de la potencia relativa
a fin de establecer que se cumple la suposicin de que se pueden combinar las varianzas a travs de los niveles de muestra; y
(2) se evala la exactitud relativa en niveles separados o mediante un anlisis combinado, dependiendo de qu tan bien se
puedan combinar los datos a travs de los niveles. Estas etapas se demuestran usando los datos de validacin del ejemplo,
junto con algunos detalles de los clculos para propsitos ilustrativos. Debe tomarse en cuenta que los clculos ilustrados en
las secciones siguientes son apropiados nicamente con un conjunto de datos equilibrados. Los diseos o conjuntos de datos
sin equilibrar y faltos de mediciones de potencia relativa deben analizarse usando un anlisis de modelo mixto con estimacin
de probabilidad mxima restringida (REML, por sus siglas en ingls).
3.1 Precisin Intermedia

Los datos en cada nivel se pueden analizar usando un anlisis de componentes de la varianza. Con datos equilibrados, como
en el ejemplo actual, se pueden medir los componentes de la varianza a partir de un ANOVA estndar de sentido nico. La
Tabla 5 presenta un ejemplo del clculo realizado en un solo nivel (0,50).
Tabla 5. Anlisis de Componentes de la Varianza Realizado a las Mediciones del Logaritmo de la Potencia Relativa en el Nivel 0,5
Fuente
gl*
Suma de Cuadrados
Cuadrado Medio
Cuadrado Medio Esperado
Corrida
0,055317
0,007902
Var(Error) + 2 Var(Corrida)
Error
0,006130
0,000766
Var(Error)
Corregida total
15
0,061447
Captulos
Estimaciones de los Componentes de la Varianza

Var(Corrida) = 0,003568
Var(Error) = 0,000766
* gl = grados de libertad
La parte superior de la tabla representa un ANOVA estndar. No han sido incluidos los analistas ni los lotes de medios debido al pequeo nmero de niveles (2 niveles) para cada factor. El factor Corrida en este anlisis representa las corridas combinadas a travs del analista mediante combinaciones de lotes de medios. El Cuadrado Medio Esperado es la combinacin lineal
de componentes de la varianza que genera el cuadrado medio (MS, por sus siglas en ingls) para cada fuente. Las estimaciones
de componentes de la varianza se derivan solucionando la ecuacin Cuadrado Medio Esperado = Cuadrado Medio para cada componente. Para comenzar, el cuadrado medio para estimaciones de Error Var(Error), el componente de variabilidad dentro de la corrida, es
Var(Error) = MS(Error) = 0,000766
De manera subsiguiente, se calcula el componente de variabilidad entre corridas, Var(Corrida), estableciendo el cuadrado medio por Corrida con la expresin matemtica para el cuadrado medio esperado y, posteriormente, resolviendo la ecuacin para
Var(Corrida) de la manera siguiente:
Estas estimaciones de los componentes de la varianza se combinan para establecer un valor de 0,50 a la precisin intermedia
general de la valoracin biolgica:
El mismo anlisis se realiz con cada nivel de la validacin y se presenta en la Tabla 6.

Tabla 6. Estimaciones de Componentes de la Varianza y Variabilidad General para Cada Nivel de Validacin y el Promedio
Nivel
Componente
0,50
0,71
1,00
1,41
2,00
Promedio
Var(Corrida)
0,003568
0,000648
0,003639
0,003135
0,002623
0,002723
Var(Error)
0,000766
0,004303
0,002954
0,000577
0.002258
0,002172
6,8%
7,3%
8,5%
6,3%
7,2%
7,2%
General
Captulos
USP 38
Se puede realizar un anlisis combinado si los componentes de la varianza son similares a travs de los niveles. Por lo general, se emplea el mtodo heurstico para esta evaluacin. Es posible mantener el cociente de la varianza mxima y la varianza
mnima a un valor no mayor de 10 (se usa 10 debido al nmero limitado de corridas realizadas en la validacin). En este ejemplo, los cocientes asociados con el componente de la varianza entre corridas, 0,003639/0,000648 = 5,6 y con el componente
dentro de la corrida, 0,004303/0,000577 = 7,5, cumple con el criterio de 10 veces. Si el cociente hubiese excedido de 10 y si
se hubiese debido a un exceso de variabilidad en uno o otro de los extremos en los niveles analizados, dicho extremo habra
de eliminarse de los anlisis adicionales y el intervalo tendra que limitarse para excluir dicho nivel.
El anlisis puede continuar usando un software estadstico capaz de aplicar un modelo de efectos mezclados a los resultados
de la validacin. Dicho anlisis debe tomar en cuenta cualquier desequilibrio en el diseo, los efectos aleatorios como el analista o el lote de medios y los efectos fijos, tales como cada uno de los niveles (ver la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas,
Generacin de un Modelo para los Resultados de la Validacin Usando Modelos de Efectos Mixtos). Los componentes de la varianza
se pueden determinar por separado para el analista y el lote de medios a fin de caracterizar sus respectivas contribuciones a la
variabilidad general de la valoracin biolgica.
En el ejemplo, se puede obtener el promedio de los componentes de la varianza a travs de niveles para informar la precisin intermedia de la valoracin biolgica. Este mtodo de combinacin de estimaciones es exacto nicamente, si un diseo
balanceado ha sido empleado en la validacin (p.ej., la misma estrategia para determinaciones repetidas en cada nivel). Se
emple un diseo balanceado para el ejemplo de validacin, de modo que la precisin intermedia se puede informar como
7,2% GCV.
Debido a la recomendacin para informar los resultados de la validacin con alguna medida de incertidumbre, se puede
calcular un lmite superior de confianza unilateral de 95% para la precisin intermedia de la valoracin biolgica. La literatura
contiene mtodos para calcular los lmites de confianza para componentes de la varianza. El lmite superior en la precisin intermedia para el ejemplo de valoracin biolgica es 11,8% GCV. El lmite superior de confianza no se calcul por separado en
cada nivel debido a la limitacin de datos un nivel individual con respecto al diseo general del estudio.
3.2 Exactitud Relativa

El anlisis puede proceder con una evaluacin de la exactitud relativa en cada nivel. La Tabla 7 presenta el promedio y el
intervalo de confianza de 90% de los resultados de la validacin en la escala logartmica, as como la potencia correspondiente
y el sesgo relativo.
Tabla 7. Potencia Promedio y Sesgo Relativo en Niveles Individuales
Logaritmo de Potencia
Potencia
Sesgo Relativo
na
Promedio
(90% Intervalo de Confianza)
0,6613
(0,7034, 0,6192)
0,52
0,71
0,3419
(0,3773, 0,3064)
0,71
(0,69; 0,74)
0,06%
(3,42; 3,67)
1,00b
0,0485
(0,0006, 0,0964)
1,05
(1,00, 1,10)
4,97%
(0,06; 10,12)
1,41
0,3723
(0,3331; 0,4115)
1,45
(1,40; 1,51)
2,91%
(1,04; 7,03)
2,00
0,7859
(0,7449; 0,8269)
2,19
(2,11; 2,29)
9,72%
(5,31; 14,32)
Nivel
0,50
a
b
Promedio
(90% Intervalo
de Confianza)
Promedio
(90% Intervalo
de Confianza)
(0,49; 0,54)
3,23%
(1,02; 7,67)
Anlisis realizado a los promedios de los duplicados de cada corrida.

Clculo ilustrado en la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas, Escala del Anlisis.
El anlisis se ha realizado al promedio de los duplicados de cada corrida (n = 8 corridas) puesto que las mediciones duplicadas se correlacionan dentro de una corrida mediante factores compartidos de precisin intermedia (analista, lote de medios y
corrida, para este caso). Se puede usar una grfica de sesgo relativo contra el nivel para examinar los patrones de los resultados
experimentales y para establecer el cumplimiento del criterio de aceptacin diana para sesgo relativo (12%).
Figura 4. Grfica de intervalos de confianza de 90% para sesgo relativo contra el criterio de aceptacin. Tomar en cuenta
que el criterio de aceptacin inferior es igual a 100 [(1/1,12) 1] = 11%.
La Figura 4 presenta un sesgo positivo promedio en todos los niveles de muestra (es decir, el sesgo relativo promedio es
positivo en todos los niveles). Esta uniformidad se debe en parte a la falta de independencia de los resultados de la valoracin
USP 38
biolgica en todos los niveles. Asimismo, no parece haber una tendencia en el sesgo relativo en todos los niveles. Esto ltimo
indicara que una comparacin de muestras con potencias relativas medidas de manera diferente (por ejemplo, muestras de
estabilidad) presenta sesgo, lo que posiblemente podra resultar en una conclusin errnea. El anlisis de tendencia se puede
llevar a cabo usando una regresin del logaritmo de la potencia relativa en funcin del logaritmo del nivel. Se puede considerar la introduccin de un criterio de aceptacin durante el desarrollo de la validacin de la valoracin biolgica para una tendencia en la exactitud relativa a travs del intervalo.
Despus de establecer que no existe una tendencia significativa en todos los niveles, el analista procede a realizar una evaluacin de la exactitud relativa en cada nivel. La valoracin biolgica presenta sesgo relativo aceptable en los niveles que van
de 0,50 a 1,41, produciendo lmites de confianza de 90% (equivalentes a una prueba t doblemente unilateral) que caen dentro
de la regin de aceptacin de sesgo relativo de 11% a 12%. El intervalo de confianza de 90% en 2,0 cae fuera de la regin
de aceptacin, lo que indica que el sesgo relativo puede exceder de 12%.
Se puede realizar un anlisis combinado usando un software estadstico capaz de aplicar un modelo de efectos mixtos a los
resultados de la validacin. El anlisis toma en cuenta exactamente el diseo del estudio de validacin. Asimismo, el anlisis
acomoda los efectos aleatorios tales como analista, lote de medios y corrida (ver la seccin 2.7 Consideraciones Estadsticas, Generacin de un Modelo para Resultados de Validacin Usando Modelos de Efectos Mixtos).
3.3 Intervalo
3.4 Uso de los Resultados de la Validacin para Caracterizar una Valoracin Biolgica
Cuando el estudio se ha realizado para estimar las caractersticas de la valoracin biolgica (caracterizacin), tambin se
pueden usar las estimaciones de los componentes de la varianza para predecir la variabilidad en diferentes formatos de valoracin
biolgica y determinar as un formato con el nivel de precisin deseado. La variabilidad pronosticada para k corridas independientes, con n series de diluciones individuales de la preparacin de prueba dentro de una corrida, se proporciona mediante la
frmula siguiente para variabilidad del formato:
Variabilidad del Formato= 100 (eVar(Corrida)/k + Var(Error)/(nk) 1)
Usando estimaciones de los componentes de la varianza entre corridas e intracorrida a partir de la Tabla 6 [Var(Corrida) =
0,002723 y Var(Error) = 0,002172], si la valoracin biolgica se realiza en tres corridas independientes, la variabilidad pronosticada del valor de informe (media geomtrica de los resultados de potencia relativa) es igual a:
Variabilidad del Formato = 100 (e 0,002723/3 + 0,002172/(1 3) 1) = 4,1%
Este clculo se puede expandir para que incluya diversas combinaciones de corridas y conjuntos mnimos (asumiendo que los
nmeros de muestras, diluciones y determinaciones repetidas en los conjuntos mnimos se mantengan constantes) dentro de
las corridas conforme a lo mostrado en la Tabla 8.
Tabla 8. Variabilidad del Formato para Diferentes Combinaciones de Nmero de Corridas (k) y Nmero de Conjuntos Mnimos
dentro de la Corrida (n)
Nmero de Corridas (k)
Determinaciones
Repetidas (n)
7,2%
5,1%
4,1%
2,9%
6,4%
4,5%
3,6%
2,6%
6,0%
4,2%
3,4%
2,4%
5,7%
4,0%
3,3%
2,3%
Resulta claro que el medio ms efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la potencia media geomtrica en
todas las corridas y conjuntos mnimos) es mediante corridas independientes del procedimiento de la valoracin biolgica. Asimismo, los lmites de confianza para los componentes de la varianza usados para derivar la precisin intermedia se pueden
usar para establecer la variabilidad del formato de la valoracin biolgica.
Las fuentes significativas de variabilidad deben incorporarse a corridas para lograr la reduccin de la varianza. Un anlisis
ms extenso del ejemplo de validacin de la valoracin biolgica incluira al analista y al lote de medios en el modelo estadstico. Las estimaciones de los componentes de la varianza obtenidos a partir de dichos anlisis se presentan en la Tabla 9.
Captulos
Las conclusiones derivadas de la evaluacin de la precisin intermedia y la exactitud relativa se pueden usar para establecer el
intervalo de la valoracin biolgica que demuestra un desempeo satisfactorio. Basndose en el criterio de aceptacin para
una precisin intermedia igual a 8% GCV (ver la Tabla 6) y para un sesgo relativo igual a 12% (ver la Tabla 7), el intervalo de
la valoracin biolgica es de 0,50 a 1,41. En este intervalo, el nivel 1,0 presenta una estimacin ligeramente mayor que la estimacin de precisin intermedia (8,5% contra el criterio de aceptacin diana 8,0%), lo cual se puede deber a la variabilidad
de la estimacin que resulta de un conjunto de datos pequeo. Debido a lo anterior y a otros resultados de la Tabla 6, se
puede concluir que se ha demostrado una precisin intermedia satisfactoria a lo largo del intervalo.
USP 38
Tabla 9. Estimaciones de Probabilidad Mxima Restringida de los Componentes de la Varianza Asociados con el Analista, el Lote de
Medios y la Corrida
Varianza
Estimado del Componente
Var(Lote de Medios)
0,0000
Var(Analista)
0,0014
Var(Analista*Lote de Medios)
0,0000
Var(corrida(Analista*Lote de Medios))
0,0019
Var(Error)
0,0022
Idealmente, la identificacin del analista como un factor significativo de la valoracin biolgica se debe tratar durante el desarrollo de la valoracin biolgica. Sin embargo, el laboratorio puede optar por tratar la contribucin aparente de la variabilidad entre analistas mediante capacitacin o usando mltiples analistas en el desarrollo del formato de la valoracin para el
desempeo de rutina de la valoracin biolgica.
Las estimaciones de variabilidad entre corridas e intracorrida tambin se pueden usar para determinar los tamaos de las
diferencias (nmero de diferencias) que se pueden distinguir entre las muestras analizadas de la valoracin biolgica. Para k
corridas, con n conjuntos mnimos dentro de cada corrida, usando un valor crtico bilateral aproximado, a partir de la distribucin normal estndar con z = 2, el nmero de diferencias crticas entre los valores de informe para dos muestras que se analizan en las mismas corridas de la valoracin biolgica se proporcionan mediante la frmula siguiente:
Captulos
Nmero de Diferencias Crticas = e2 Var(Corrida)/k+Var(Error)/(nk)

Cuando las muestras han sido analizadas en corridas diferentes de la valoracin biolgica (tales como muestras para estabilidad a largo plazo), el nmero de diferencias crticas se provee (asumiendo que se usa el mismo formato para analizar las dos
series de muestras) mediante:
Nmero de Diferencias Crticas = e2 2 [Var(Corrida)/k+Var(Error)/(nk)]
Para la comparacin de muestras, el laboratorio puede seleccionar un diseo (formato de valoracin biolgica) que cuente con
una precisin adecuada para detectar un nmero de diferencias significativo entre muestras.
3.5 Confirmacin de la Precisin Intermedia y Revalidacin

La estimacin de la precisin intermedia derivada de la validacin presenta una alta incertidumbre debido al pequeo nmero de corridas realizadas. Despus de que el laboratorio acumula experiencia adecuada con la valoracin biolgica, la estimacin puede ser confirmada o actualizada mediante el anlisis de las mediciones de las muestras de control, tal como la variabilidad de un control positivo. Dicho anlisis se puede llevar a cabo con el control preparado y analizado al igual que una muestra
de Prueba (es decir, una serie de diluciones y estrategia para determinaciones repetidas idnticas o similares). Esta evaluacin
se realizar despus de haber llevado a cabo suficientes valoraciones para obtener una estimacin alternativa de la precisin
intermedia de la valoracin biolgica, incluida la implementacin de cambios (p.ej., analistas diferentes, lotes de reactivos claves diferentes y preparaciones celulares diferentes) relacionados con el protocolo de valoracin estandarizado. La precisin intermedia de la valoracin biolgica se debe modificar a manera de enmienda en el informe de validacin en caso de que la
evaluacin revele una disparidad importante de los resultados.
La valoracin biolgica debe revalidarse siempre que se apliquen cambios sustanciales en el mtodo, los cuales incluyen, pero no se limitan a cambios tecnolgicos o cambios en la lectura. La revalidacin puede constar de una repromulgacin total de
la validacin de la valoracin biolgica o de un estudio puente que compare los mtodos actuales y los modificados.
4. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIN

Para informacin adicional y mtodos alternativos, se pueden consultar las referencias citadas a continuacin.
1. ASTM. Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine Conformance with Specifications, ASTM
E29-08. Conshohocken, PA: ASTM; 2008.
2. Berger R, Hsu J. Bioequivalence trials, intersection-union tests and equivalence confidence intervals. Stat Sci 1996;11(4):
283319.
3. Burdick R, Graybill F. Confidence Intervals on Variance Components. New York: Marcel Dekker; 1992:2839.
4. Haaland P. Experimental Design in Biotechnology. New York: Marcel Dekker; 1989;6466.
5. Schofield TL. Assay validation. In: Chow SC, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel
Dekker; 2003.
6. Schofield TL. Assay development. In: Chow SC, ed. Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics. 2nd ed. New York: Marcel
Dekker; 2003.
7. Winer B. Statistical Principles in Experimental Design. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1971:244251.
USP 38
APNDICEMEDIDAS DE UBICACIN Y DISPERSIN PARA VARIABLES NORMALMENTE

DISTRIBUIDAS EN LOGARITMOS
Tabla A-1. Comparacin de Mediciones de Ubicacin y Dispersin

Escala de Medicin
Transformada en Logaritmos (Y)
Medicin
Original (X)
Media geomtrica (GM)
Ubicacin
Media (promedio)
Dispersin
Desviacin estndar (SD)
Intervalos de confianza
(k es una constante apropiada
basada en la distribucin t o
una aproximacin grande
de la muestra z)
Coeficiente de variacin
porcentual (%CV)
Desviacin estndar geomtrica

(GSD) = eSD
Inferior
Promedio k SD/n
GM/GSDk/n
Superior
Promedio + k SD/n
GM GSDk/n
Tamao
ancho (superior inferior)

= 2 k SD/n
Cociente(superior/inferior)
= GSD2k/n
%GCV = 100 (GSD 1)
La media geomtrica (GM, por sus siglas en ingls) no debe malinterpretarse como una estimacin de la media de la variable de la escala original (X), sino que es una estimacin de la mediana de X. La mediana es una medicin ms apropiada de
ubicacin para variables con distribuciones de error sesgadas tales como las distribuciones normales logartmicas, as como las
distribuciones de error simtricas, donde la mediana es igual a la media.
De manera similar, la desviacin estndar geomtrica (GSD, por sus siglas en ingls) no se debe malinterpretar como la desviacin estndar de la variable de la escala original (X). Sin embargo, la desviacin estndar geomtrica es un factor multiplicativo til para obtener intervalos de confianza en la escala original (X), que se correspondan con los de la escala transformada
en logaritmos (Y), segn lo presentado en la tabla anterior. Una desviacin estndar geomtrica con un valor de 1 corresponde
a una ausencia de variacin (desviacin estndar con un valor de Y = 0). El cociente entre los lmites de confianza Superior e
Inferior, en la escala no transformada (X), ser igual a la GSD2k/n, segn se aprecia en la Tabla A-1.
Captulos
Los procedimientos estadsticos comunes, tales como ANOVA o la estimacin del intervalo de confianza, presentan dos suposiciones: (1) la variacin en la respuesta de la valoracin biolgica alrededor de su media est normalmente distribuida y (2)
la desviacin estndar de los valores de la respuesta observados es constante en un intervalo de respuestas que son de inters.
Se dice que dichas respuestas tienen una distribucin normal y una estructura de error sumatorio. Cuando no se cumplen
estas dos condiciones, podra resultar til considerar una transformacin antes de emplear procedimientos estadsticos comunes.
A menudo se determina que la variacin en las respuestas de la valoracin biolgica son anormales (sesgadas hacia valores
ms altos) con una desviacin estndar aproximadamente proporcional (o casi) a la respuesta media. Dichas respuestas por lo
regular tienen una estructura de error multiplicativo y siguen una distribucin normal logartmica con un coeficiente de
variacin porcentual (%CV) que es constante en todo el intervalo de respuesta de inters. En tales casos, se encontrar que
una transformacin logartmica de la respuesta de la valoracin biolgica es aproximadamente normal con una desviacin estndar casi constante en el intervalo de respuesta. Despus de aplicar la transformacin logartmica, se cumplen las dos suposiciones y se pueden llevar a cabo procedimientos estadsticos comunes con la respuesta transformada en logaritmos. La siguiente discusin asume una distribucin normal logartmica para la respuesta de la valoracin biolgica.
Esto se refiere a un valor de respuesta de valoracin biolgica observado, X, que se encuentra en la escala original de medicin y a una respuesta transformada en logaritmos, Y = log(X), que se encuentra en la escala transformada en logaritmos.
Aunque los procedimientos estadsticos comunes pueden ser apropiados nicamente en la escala transformada en logaritmos,
se pueden recopilar las respuestas de la valoracin biolgica estimando las mediciones de ubicacin (p.ej., media o mediana),
las mediciones de dispersin (p.ej., desviacin estndar) o intervalos de confianza en cualquiera de las escalas de medicin,
siempre que se indique la escala que se est utilizando. El %CV es til en la escala original cuando es constante en el intervalo
de respuesta. Por la misma razn, la desviacin estndar (SD, por sus siglas en ingls) es relevante en la escala transformada en
logaritmos. Informar los resmenes estadsticos basndose en la escala transformada en logaritmos (Y) ofrece ventajas. No obstante, a menudo se puede obtener informacin importante al transformar de nuevo las medidas informadas a su escala original de medicin (X).
Para cualquier valor dado de X, slo existe un valor nico de Y = log(X), y viceversa. Algo similar ocurre con las mediciones
de ubicacin y dispersin, en donde existe una correspondencia nica entre cada medicin de ubicacin y dispersin obtenidas en la escala original y transformada en logaritmos. Adems, as como existe una relacin simple entre X e Y = log(X), existen relaciones simples que permiten la conversin entre las medidas correspondientes de cada escala, segn se indica a continuacin en la Tabla A-1. En dicha tabla, Promedio y Desviacin Estndar, siempre que aparezcan, harn referencia a mediciones calculadas en la escala transformada en logaritmos (Y).
USP 38
El coeficiente de variacin geomtrica porcentual (%GCV) se aproxima al %CV en la escala original (X) cuando el %CV es
menos de 20%. Es importante no confundir estas mediciones de dispersin. El %GCV es una medida relevante para la escala
transformada en logaritmo (Y) y el %CV es una medida relevante para la escala original (X). Dependiendo del marco de referencia preferido, puede ser til una o incluso ambas mediciones.
APNDICE DE FUENTES DE INFORMACIN
Captulos
1. Limpert E, Stahel WA, Abbt M. (2001) Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. BioScience 51(5):
341252.
2. Kirkwood TBL. (1979) Geometric means and measures of dispersion. Biometrics 35: 908909.
3. Bohidar NR. (1991) Determination of geometric standard deviation for dissolution. Drug Development and Industrial
Pharmacy 17(10): 13811387.
4. Bohidar NR. (1993) Rebuttal to the Reply. Drug Development and Industrial Pharmacy 19(3): 397399.
5. Kirkwood TBL. (1993) Geometric standard deviationreply to Bohidar. Drug Development and Industrial Pharmacy
19(3): 395396.
6. 1010 Datos Analticos Interpretacin y Tratamiento. USP 34. En: USP34NF 29. Volmen 1. Rockville (MD): Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica; c2011. p. 419.
7. Tan CY. (2005) RSD and other variability measures of the lognormal distribution. Pharmacopeial Forum 31(2): 653655.
1034 ANLISIS DE VALORACIONES BIOLGICAS

1. INTRODUCCIN
Aunque los avances en la caracterizacin qumica han reducido el uso de las valoraciones biolgicas para valorar muchos
productos, stas continan siendo esenciales para la determinacin de la potencia y para garantizar la actividad de una gran
cantidad de protenas, vacunas, mezclas complejas y productos de terapia celular y gnica, adems de su importante papel en
el seguimiento de la estabilidad de productos biolgicos. El captulo general Anlisis de Valoraciones Biolgicas 1034 pretende
abarcar las pautas para el anlisis de los resultados de las valoraciones biolgicas descritas en la Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP) y de las valoraciones biolgicas no pertenecientes a la USP, pero que intentan cumplir con las pautas de
calidad de los anlisis de valoracin biolgica recomendados por la USP. Se debe tomar en cuenta que el nfasis del diseo y la
validacin de los anlisis se tratan en los captulos complementarios (Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032 y
Validacin de Valoraciones Biolgicas 1033, respectivamente).
Los temas tratados en el captulo 1034 incluyen conceptos y mtodos estadsticos de anlisis para el clculo de la potencia
y de los intervalos de confianza para una variedad de valoraciones biolgicas de potencia relativa, incluyendo aqullos citados
en la USP. El captulo 1034 est destinado para su uso principalmente por parte de aqullos que no cuentan con una capacitacin o conocimientos extensos en estadstica, as como estadsticos que no cuentan con experiencia en el anlisis de valoraciones biolgicas. Las secciones que presentan principalmente conceptos requieren una mnima base de conocimiento de estadstica. No obstante, la mayor parte del captulo y todas las secciones de mtodos requieren que aqullos que no sean expertos en estadstica posean conocimientos mnimos al nivel tratado en el captulo general de la USP Datos AnalticosInterpretacin y Tratamiento 1010 y de regresin lineal. La mayor parte de las secciones 3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas y 3.6 Valoraciones Dictomas (Cuantales) requieren una base de conocimiento de estadstica ms extensa y, por consiguiente, est dirigido principalmente a estadsticos. Asimismo, el captulo 1034 introduce mtodos selectos complejos cuya
implementacin requiere la gua de un estadstico experimentado.
Aunque se reconoce la posibilidad de uso de procedimientos alternativos, se recomienda emplear las metodologas del presente captulo 1034. Asimismo, la informacin del captulo 1034 se presenta asumiendo el uso de computadoras y software
adecuado para el anlisis de datos. Dicha perspectiva no libera al analista de su responsabilidad ni de las consecuencias relacionadas con la seleccin del diseo y anlisis de una valoracin biolgica.
2. ASPECTOS GENERALES DEL ANLISIS DE LOS DATOS DE LA VALORACIN BIOLGICA

A continuacin se presenta una lista de pasos a seguir que ayudarn a guiar el anlisis de una valoracin biolgica. La presente seccin asume que se ha utilizado un conjunto de pasos similares en la toma de decisiones durante el desarrollo y posterior verificacin durante la validacin y por lo tanto, no es necesario seguir estos pasos rutinariamente. Dichas etapas y decisiones se tratan en el captulo de informacin general Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032. La Seccin 3, Modelos
de Anlisis, ofrece informacin detallada para los diversos modelos considerados.
1. Como parte del anlisis elegido, se debe seleccionar el subconjunto de datos que se utilizar para determinar la potencia
relativa, usando el esquema previamente especificado. Se deben excluir nicamente aquellos datos que se sepa provienen
USP 38
Informacin General / 1034 Anlisis de Valoraciones Biolgicas 867
3. MODELOS DE ANLISIS
Se puede utilizar con xito una variedad de funciones matemticas para describir una relacin de concentracinrespuesta.
La primera consideracin tenida en cuenta al seleccionar un modelo es la naturaleza de la respuesta de la valoracin. Se refiere a un nmero, un recuento o a una categora, como por ejemplo, Vivo/Muerto? La naturaleza identificar los posibles modelos que podrn tomarse en consideracin.
Las dems consideraciones para la seleccin de un modelo incluyen la necesidad de incorporar elementos del diseo en el
modelo y los posibles beneficios de los modelos de medias en comparacin con los modelos de regresin. Con el propsito de
presentar los puntos esenciales de las opciones de modelos, la seccin 3, Modelos de Anlisis asume un diseo completamente
aleatorio, de modo que no contempla elementos del diseo, y presenta los modelos en su forma de regresin.
Captulos
de problemas tcnicos conocidos, tales como pocillos contaminados, curvas de concentracinrespuesta no monotnicas,
etc.
2. Es necesario ajustar el modelo estadstico para detectar valores aberrantes potenciales, conforme a lo seleccionado durante el desarrollo, incluyendo cualquier ponderacin y transformacin. Esto se lleva a cabo primeramente sin asumir similitud alguna entre las curvas de la Prueba y del Estndar, pero se deben incluir elementos importantes de la estructura de
diseo, idealmente empleando un modelo que realice menos suposiciones acerca de la naturaleza de la funcin de la respuesta que el modelo usado para evaluar la similitud.
3. Se debe determinar cules de los valores aberrantes potenciales se van a eliminar y se debe ajustar el modelo que se va a
emplear para la evaluacin de la aptitud. Por lo general, antes de eliminar valores aberrantes, se lleva a cabo una investigacin de sus causas. Algunos sistemas de valoracin pueden emplear una regla estadstica de eliminacin de valores aberrantes (no investigativa), aunque la eliminacin de valores aberrantes mediante dicho mtodo no debe usarse con regularidad. Una metodologa para valores aberrantes extraos consiste en seleccionar la regla para valores aberrantes de
modo que el nmero esperado de identificaciones de valores aberrantes falsos positivos no sea mayor de uno; p.ej., utilizar una prueba al 1% si el tamao de la muestra es aproximadamente 100. Si se encuentra un gran nmero de valores
aberrantes por encima del esperado a partir del uso de la regla, se debe cuestionar inmediatamente la valoracin.
4. Se debe evaluar la aptitud del sistema. La aptitud del sistema evala si la preparacin Estndar de la valoracin y cualquier
control usado se comportaron de manera uniforme con respecto al desempeo anterior de la valoracin. Si una valoracin (o una corrida) no cumple con la aptitud del sistema, se debe descartar toda la valoracin (o corrida) y no se debe
informar ningn resultado excepto la falla de la valoracin (o corrida). La evaluacin de la aptitud del sistema por lo regular incluye la idoneidad del ajuste del modelo usado para evaluar la similitud. Para los modelos lineales, la idoneidad del
modelo puede incluir la evaluacin de la linealidad de la curva del Estndar. Si no se cumple el criterio de aptitud para
linealidad del Estndar, la exclusin de una o ms concentraciones de los extremos podra resultar en el cumplimiento
con dicho criterio. Otros ejemplos de posibles criterios de aptitud del sistema incluyen blanco, controles positivos, mx/
mn, mx/fondo, pendiente, IC50 (o EC50) y variacin alrededor del modelo ajustado.
5. Se debe evaluar la aptitud de la muestra para cada muestra de Prueba. Esto se hace para confirmar que los datos para
cada muestra de Prueba cumplen con las suposiciones necesarias. Si una muestra de Prueba no cumple con la aptitud de
la muestra, los resultados de dicha muestra se informan como No Cumple con la Aptitud de la Muestra. No obstante,
an se pueden informar las potencias relativas para otras muestras de Prueba de la valoracin. La similitud es el ms prominente de los criterios de aptitud de la muestra, como el paralelismo en modelos paralelos o la equivalencia de las ordenadas al origen para modelos de cociente de pendiente. Para modelos no lineales, la evaluacin de la similitud implica
todos los parmetros de la curva distintos a EC50 (o IC50).
6. Para aquellas muestras de Prueba en la valoracin que cumplen con el criterio de similitud con el Estndar (es decir, curvas de concentracinrespuesta lo suficientemente similares o subconjuntos de concentraciones lineales similares), se deben calcular las estimaciones de potencia relativa asumiendo la similitud entre la Prueba y el Estndar, es decir, analizando
los datos de la Prueba y del Estndar de manera conjunta usando un modelo limitado para tener lneas o curvas exactamente paralelas u ordenadas al origen idnticas.
7. Por lo regular, una sola valoracin no es suficiente para obtener un valor de informe, mientras que los resultados de potencia de mltiples valoraciones se pueden combinar en una sola estimacin de potencia. Repetir los pasos 16 la cantidad de veces especificada en el protocolo de valoracin o en la monografa, antes de determinar una estimacin final de
potencia y un intervalo de confianza.
8. Generar una estimacin de la varianza y una medicin de incertidumbre de la estimacin de potencia (p.ej., intervalo de
confianza). Ver la seccin 4, Intervalos de Confianza.
Un paso no mostrado es el reemplazo de datos faltantes. La metodologa estadstica y el software ms modernos no requieren nmeros iguales en cada combinacin de concentracin y muestra, por lo que, a menos que se indique algo distinto en la
monografa especfica, el analista no se ver obligado a reemplazar los valores faltantes.
868 1034 Anlisis de Valoraciones Biolgicas / Informacin General
USP 38
Captulos
3.1 Respuestas de Valoracin Cuantitativas y Cualitativas

Los trminos cuantitativa y cualitativa se refieren a la naturaleza de la respuesta de valoracin usada en la construccin del
modelo de concentracinrespuesta. Se pueden usar valoraciones con respuestas cuantitativas o cualitativas para cuantificar la
potencia del producto. Se debe tomar en cuenta que las respuestas de la valoracin en las concentraciones medidas no son la
potencia relativa de la valoracin biolgica. Los analistas deben comprender las diferencias entre respuestas, las funciones de
concentracinrespuesta y la potencia relativa.
Una respuesta cuantitativa produce un nmero en una escala continua. Los ejemplos comunes incluyen las respuestas espectrofotomtricas y de luminiscencia, los pesos y medidas corporales y los datos calculados relativos a la curva estndar (p.ej.,
concentracin de citoquina). Los modelos para respuestas cuantitativas pueden ser lineales o no lineales (ver las secciones 3.2
3.5).
Una medicin cualitativa resulta en una respuesta clasificable en categoras. Para la valoracin biolgica, las respuestas cualitativas son generalmente cuantales, lo que significa que conllevan a dos posibles categoras tales como Positiva/Negativa, 0/1,
o Muerto/Vivo. Las respuestas cuantales se pueden informar como proporciones (p.ej., la proporcin de animales en un grupo
que presentan una propiedad). Los modelos cuantales se presentan en la seccin 3.6. Las respuestas cualitativas pueden tener
ms de dos categoras posibles, tales como las determinaciones de ttulo por punto final. Los modelos para ms de dos categoras no se consideran en este captulo general.
Las respuestas de la valoracin tambin pueden ser recuentos, tales como el nmero de placas o colonias. Las respuestas a
manera de recuentos en ocasiones se tratan como cuantitativas, en otras ocasiones como cualitativas y en algunas ms se utilizan modelos especficos para nmeros enteros. La seleccin a menudo se basa en el intervalo de recuentos. Si el recuento es
en su mayora 0 y en raras ocasiones es mayor de 1, la valoracin se puede analizar como cuantal y la respuesta es Alguna/
Ninguna. Si los recuentos son grandes y abarcan un intervalo amplio, tal como de 500 a 2500, entonces la valoracin se puede analizar como cuantitativa, posiblemente despus de aplicar una transformacin a los recuentos. Para dichos anlisis, a menudo resulta til una transformacin cuadrtica del recuento, a fin de cumplir de mejor manera con la homogeneidad de las
varianzas. Si el intervalo de recuentos incluye o es cercano a 0, pero 0 no es el valor preponderante, puede ser preferible emplear un modelo especfico para las respuestas de nmeros enteros. La regresin de Poisson y los modelos de regresin de
binomios negativos representan a menudo buenas opciones. El presente captulo general no proporciona informacin adicional sobre modelos especficos para nmeros enteros.
Las valoraciones con respuestas cuantitativas se pueden convertir en respuestas cuantales. Por ejemplo, lo que podra importar es definir si se excedi algn umbral definido. Entonces, el modelo podra ser cuantalde umbral excedido o no. En general, los sistemas de valoracin presentan estimaciones ms precisas de potencia cuando el modelo emplea toda la informacin
en la respuesta. El uso de un umbral superior o inferior, en lugar de las respuestas cuantitativas medidas, podra subestimar el
desempeo de una valoracin.
3.2 Generalidades de los Modelos para Respuestas Cuantitativas

En las valoraciones cuantitativas, la medicin es un nmero en una escala continua. Los valores de densidad ptica obtenidos en las valoraciones basadas en placas son dichas mediciones. Los modelos para valoraciones cuantitativas pueden ser lineales o no lineales. Aunque ambos presentan una diferencia aparente en los niveles de complejidad, los modelos de lneas paralelas (lineales) y de curvas paralelas (no lineales) comparten muchos aspectos en comn. Debido a la forma diferente de sus
ecuaciones, las valoraciones de cociente de pendiente se consideran por separado (seccin 3.5 Modelos de ConcentracinRespuesta de Cociente de Pendientes).
SuposicionesLos modelos bsicos de lneas paralelas, curvas paralelas y cociente de pendiente comparten algunas suposiciones. Todos incluyen un trmino residual, e, que representa el error (variabilidad), el cual se asume que es independiente de
medicin a medicin y que tiene una varianza constante de concentracin a concentracin y de muestra a muestra. A menudo, se asume que el trmino residual tambin sigue una distribucin normal. Las suposiciones de independencia e igualdad de
varianzas a menudo se infringen, por lo que el objetivo del anlisis es incorporar la falta de independencia y la desigualdad de
las varianzas en el modelo estadstico o en el mtodo de estimacin.
A menudo, la falta de independencia surge a causa del diseo o la realizacin de la valoracin. Por ejemplo, si la valoracin
consiste en respuestas obtenidas de mltiples placas, es probable que las observaciones de la misma placa compartan alguna
influencia en comn que no se comparte con las observaciones de otras placas. ste es un ejemplo de correlacin intraplacas.
Una metodologa simple para tratar esta falta de independencia es incluir un trmino de bloque en el modelo estadstico para
placas. Con tres o ms placas, ste debe ser un trmino de efectos aleatorios de modo que se obtenga una estimacin de la
variabilidad entre placas.
En general, el modelo debe reflejar en detalle el diseo. Las ecuaciones bsicas del modelo provistas en las secciones 3.33.5
se aplican nicamente a diseos completamente aleatorizados. Cualquier otro diseo requerir trminos adicionales en el modelo estadstico. Por ejemplo, si las placas o porciones de las placas se usan como bloques, sern necesarios los trminos para
bloques.
Clculo de la PotenciaUna suposicin primaria subyacente de los mtodos que se usan para el clculo de la potencia relativa es la suposicin de la similitud. Dos preparaciones son similares si contienen el mismo componente efectivo o los mismos
componentes efectivos en las mismas proporciones. Si esta condicin se mantiene, la preparacin de Prueba se comporta co-
USP 38
mo una dilucin (o concentracin) de la preparacin Estndar. La similitud se puede representar matemticamente de la manera siguiente: FT es la funcin de concentracinrespuesta para la Prueba y FS es la funcin de concentracinrespuesta para
el Estndar. El modelo matemtico subyacente para la similitud es:
FT(z) = FS(r z),
[3.1]
donde z representa la concentracin y r representa la potencia relativa de la muestra de Prueba con respecto a la muestra
Estndar.
Los mtodos para estimar r en algunos de los modelos de concentracinrespuesta comunes se analizan ms adelante. Para
modelos lineales, la distincin entre modelos de lneas paralelas (seccin 3.3 Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas) y modelos de cociente de pendiente (seccin 3.5 Modelos de ConcentracinRespuesta de Cociente de Pendientes) se basa en si ajustar las lneas rectas al logaritmo de concentracin o a la concentracin generar un mayor alineamiento entre el
modelo y los datos en un intervalo de concentraciones de inters.
3.3 Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas
y = a + b log(z) + e = a + b x + e,
donde e es el residuo o trmino de error y la interseccin, a, y la pendiente, b , diferirn entre la Prueba y el Estndar. Con la
suposicin de paralelismo (pendientes iguales), el modelo se vuelve
yS = a + b log(z) + e = aS + b x + e
[3.2]
yT = a + b log(rz) + e = [a + b log(r)] + b x + e = aT + b x + e,
donde S es el Estndar, T es la Prueba, aS = a es la ordenada al origen para el Estndar y aT = a + b log(r) es la ordenada al

origen para la Prueba (ver la Figura 3.1).
Figura 3.1. Ejemplo de un modelo de lneas paralelas.

Cuando las lneas de concentracinrespuesta son paralelas, segn se muestra en la Figura 3.1, una separacin o desplazamiento horizontal indica una diferencia en el nivel de actividad biolgica que se est valorando. Esta diferencia horizontal es
Captulos
En esta seccin, un modelo lineal se refiere a una relacin de concentracinrespuesta. El logaritmo de la concentracin, x, y
la respuesta, y, sigue una funcin de lnea recta (lineal). y puede ser la respuesta en la escala conforme se mida o una transformacin de la respuesta. La forma funcional de esta relacin es y = a + bx. Los ajustes de lneas rectas se pueden usar para
porciones de las curvas de concentracinrespuesta no lineales, aunque esto requiere de un mtodo para seleccionar las concentraciones a usar para cada una de las muestras de Prueba y Estndar (ver el captulo general 1032).
Modelo de Medias contra RegresinUn modelo lineal de concentracinrespuesta casi siempre se analiza mediante la regresin de cuadrados mnimos. Dicho anlisis genera estimaciones de los coeficientes desconocidos (ordenadas al origen y pendiente) y sus errores estndar, as como mediciones de la aptitud del ajuste [p.ej., R2 y error cuadrtico medio (RMSE, por sus
siglas en ingls)].
La regresin lineal funciona mejor cuando se pueden usar todas las concentraciones y existe una curvatura inapreciable en
los datos de concentracinrespuesta. Otro mtodo estadstico para analizar las curvas de concentracinrespuesta lineales es
el modelo de medias. ste es un mtodo de anlisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en ingls) que ofrece algunas ventajas,
particularmente cuando no se usan una o ms concentraciones de una o ms muestras para estimar la potencia. Puesto que el
modelo de medias incluye una media distinta para cada combinacin nica de muestra y dosis (as como un bloque u otros
efectos asociados con la estructura del diseo) es equivalente a un modelo de regresin polinmica saturado. Por consiguiente, un modelo de medias provee una estimacin del error que es independiente de la falta de ajuste de la regresin. Por el
contrario, una estimacin de error basada en la regresin residual es una mezcla del error de la valoracin, segn se estima en
el modelo de medias, combinada con la falta de ajuste del modelo de regresin. Al menos en este sentido, el error del modelo
de medias es una mejor estimacin de la variacin del error residual en el sistema de valoracin.
Modelos de ConcentracinRespuesta de Lneas ParalelasSi el modelo general de concentracinrespuesta (3.1 Respuestas
de Valoracin Cuantitativas y Cualitativas) se puede hacer lineal en x = log(z), entonces la ecuacin resultante es:
USP 38
numricamente log(r), el logaritmo de la potencia relativa, y se encuentra como la distancia vertical entre las lneas aT y aS
dividida por la pendiente, b . La potencia relativa es entonces
Estimacin de Modelos de Lneas ParalelasLos modelos de lneas paralelas se ajustan usando el mtodo de cuadrados mnimos. Si se mantiene la suposicin de varianzas iguales, se seleccionan los parmetros de la ecuacin [3.2] para minimizar
Captulos
donde los acentos circunflejos representan estimaciones. sta es una regresin lineal con dos variables independientes, T y x,
donde T es una variable que es igual a 1 para observaciones a partir de la Prueba y 0 para observaciones a partir del Estndar.
La sumatoria en la ecuacin [3.3] es para todas las observaciones de la Prueba y del Estndar. Si la suposicin de varianzas
iguales no se mantiene, pero se sabe que la varianza es inversamente proporcional a un valor, w, que no depende de las respuestas en curso, es decir, las y, y se puede determinar para cada observacin, entonces el mtodo se pondera con cuadrados
mnimos
La ecuacin 3.4 es apropiada nicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los datos
en curso (ver el captulo 1032 para pautas para la determinacin de ponderaciones). En las ecuaciones [3.3] y [3.4] b es
igual que la b de la ecuacin [3.2] y ERR (01-jul-2014) = aT aS = b log r. Por tanto, la estimacin de la potencia relativa, r, es
El software estadstico y las hojas de clculo comnmente disponibles ofrecen rutinas para cuadrados mnimos. No todo el
software disponible puede proveer anlisis ponderados.
Ver la seccin 4 para informacin sobre mtodos para obtener un intervalo de confianza para la potencia relativa estimada.
Para un intervalo de confianza basado en la combinacin de las estimaciones de la potencia relativa de mltiples valoraciones,
se deben usar los mtodos de la seccin 4.2. Para un intervalo de confianza a partir de una sola valoracin, usar el Teorema de
Fieller (seccin 4.3) aplicado a
.
Medicin de Falta de ParalelismoEl paralelismo para modelos lineales se evala considerando la diferencia o el cociente de
las dos pendientes. Para la diferencia, esto se puede llevar a cabo ajustando el modelo de regresin,
y = aS + T
ERR (01-jul-2014)
+ b Sx + gxT + e
donde ERR (01-jul-2014) = aT aS, g = b T b S, y T = 1 para los datos de Prueba y T = 0 para los datos del Estndar. Posteriormente, se emplea el intervalo de confianza de distribucin t estndar para g. Para el cociente de las pendientes, se ajusta
y = aS + T
ERR (01-jul-2014)
+ b Sx(1 T) + b TxT + e
y se usa el Teorema de Fieller, ecuacin [4.3], para obtener un intervalo de confianza para b T/b S.
3.4 Modelos No Lineales para Respuestas Cuantitativas

Los modelos no lineales de concentracinrespuesta son, por lo regular, funciones con forma de S y se presentan cuando el
intervalo de concentraciones es lo suficientemente amplio como para que las respuestas sean limitadas por asntotas superiores
e inferiores. El ms comn de estos modelos es la funcin logstica de cuatro parmetros provista a continuacin.
y representa la respuesta observada, mientras que z denota la concentracin. Una forma del modelo logstico de cuatro parmetros es
Una forma alternativa, pero equivalente, es
Las dos formas se corresponden de la manera siguiente:

Asntota inferior: D = a0
Asntota superior: A = a0 + d
USP 38
Pendiente: B = M (en relacin con la pendiente de la curva en el EC50)

Concentracin efectiva al 50% (EC50): C = antilog(b) (tambin se puede denominar ED50).
Resulta adecuada cualquier base logartmica conveniente; a menudo conviene trabajar con logaritmo en base 2, en particular cuando las concentraciones estn en serie duplicativa.
La curva logstica de cuatro parmetros es simtrica al rededor del EC50 cuando se grafica en funcin del logaritmo de concentracin, debido a que las velocidades de acercamiento de las asntotas superior e inferior son las mismas (ver la Figura 3.2).
Para valoraciones en las que no se mantiene dicha simetra, se podran aplicar las funciones del modelo asimtrico. Estos modelos no se analizan en mayor medida en este captulo general.
Figura 3.2. Ejemplos de sigmoides simtricos (logsticos de cuatro parmetros) y asimtricos.
Figura 3.3. Ejemplo de curvas paralelas de un modelo no lineal.

Las ecuaciones correspondientes a la figura (con el trmino de error, e, agregado) son
Captulos
En muchos casos, el analista tiene que tomar algunas decisiones estratgicas durante el desarrollo de la valoracin (ver Diseo y Desarrollo de Valoraciones Biolgicas 1032). Por ejemplo, las respuestas se pueden transformar y ajustar a un modelo de
curva logstica de cuatro parmetros o se pueden ponderar y ajustar a una curva sigmoidea asimtrica. Asimismo, a menudo
resulta importante incluir trminos en el modelo (por lo general efectos aleatorios) para tratar la variacin en las respuestas (o
parmetros de la respuesta) asociados con bloques o unidades experimentales en el diseo de la valoracin. Para valoraciones
simples en las que las observaciones son independientes, estas decisiones estratgicas son bastante sencillas. Para valoraciones
realizadas con diluciones agrupadas (como en el caso de pipetas multicanal), valoraciones con diluciones en serie o diseos de
valoracin que incluyen bloques (como en el caso de mltiples placas por valoracin), ignorar la estructura del diseo a menudo se considera una violacin seria de las suposiciones estadsticas. Para dichas valoraciones, una buena metodologa implica
una transformacin que aproxime una solucin a una varianza no constante, a una falta de normalidad y a una asimetra, combinada con un modelo que capture las partes importantes de la estructura del diseo.
Modelos de ConcentracinRespuesta de Curvas ParalelasEl concepto de paralelismo no se restringe a modelos lineales. Para
curvas no lineales, paralelas o medias similares, las curvas de concentracinrespuesta se pueden superponer siguiendo un desplazamiento horizontal de una de las curvas, segn se muestra en la Figura 3.3 para curvas logsticas de cuatro parmetros. En
trminos de los parmetros de la ecuacin [3.5], esto significa que los valores de A, D y B para la Prueba son los mismos que
para el Estndar.
USP 38
Log r es el logaritmo de la potencia relativa y la distancia horizontal entre las dos curvas, al igual que para el modelo de
lneas paralelas. Puesto que el EC50 del estndar es antilog(b) y el de la Prueba es antilog(b log r) = antilog(b)/r, la potencia
relativa es el cociente de EC50 (estndar sobre Prueba) cuando se mantiene el modelo de curvas paralelas.
Estimacin del Modelo de Curvas ParalelasLa estimacin de modelos de curvas paralelas no lineales es similar a la de los
modelos de lneas paralelas, posiblemente despus de la transformacin de la respuesta y posiblemente con la ponderacin.
Para el modelo logstico de cuatro parmetros, las estimaciones de los parmetros se determinan minimizando:
Captulos
sin ponderacin, o
con ponderacin. (Al igual que para la ecuacin [3.4], la ecuacin [3.6] es apropiada nicamente si las ponderaciones se determinan sin usar las respuestas, es decir las y, de los datos en curso.) En cualquiera de los casos, la estimacin de r es la estimacin del logaritmo de la potencia relativa. Para algunos paquetes de software, podra ser ms fcil trabajar con d = A D.
Los parmetros de la funcin logstica de cuatro parmetros y aqullos de los modelos sigmoideos asimtricos no son posibles de calcular mediante rutinas de regresin de cuadrados mnimos ordinarias (lineales). Se deben usar programas informticos con tcnicas de estimacin no lineales.
Los analistas no deben usar el ajuste de regresin no lineal para evaluar el paralelismo o estimar la potencia si se presenta
alguno de los siguientes casos: a) se dispone de informacin inadecuada sobre las asntotas; o b) una comparacin de los errores combinados de una regresin no lineal con los errores combinados de un modelo de medias determina que el modelo no
lineal no se ajusta de manera adecuada; o c) otras medidas apropiadas de aptitud del ajuste determinan que el modelo no
lineal no es apropiado (p.ej., las grficas de residuos presentan evidencia de un gancho).
se deben usar los mtodos de la seccin 4.2. Para un intervalo de confianza de una sola valoracin, se requieren tcnicas avanzadas, tales como perfiles de probabilidad o mtodo de remuestreo (bootstrapping), para obtener un intervalo de confianza
para el logaritmo de la potencia relativa, r.
Medicin de Falta de ParalelismoEvaluar el paralelismo de un modelo logstico de cuatro parmetros significa evaluar el
parmetro de la pendiente y las dos asntotas. Durante el desarrollo (ver el captulo 1032), se debe tomar una decisin con
respecto a qu parmetros son importantes y la forma en que se medir la falta de paralelismo. Tal como se analiza en el captulo 1032, la medida de falta de similitud puede ser una medida compuesta que considere todos los parmetros juntos en
una sola medicin, tal como la suma de cuadrados de paralelismo (ver el captulo 1032), o se puede considerar cada parmetro por separado. En el ltimo caso, la medida puede consistir en funciones de los parmetros, tal como una asntota dividida
por la diferencia de asntotas o el cociente de las asntotas. Para cada parmetro (o funcin de parmetros), los intervalos de
confianza se pueden calcular mediante mtodos de remuestreo o de perfil de probabilidad. Dichos mtodos no se presentan
en este captulo general.
3.5 Modelos de ConcentracinRespuesta de Cociente de Pendientes

Cuando una regresin lineal se ajusta bien a los datos de concentracinrespuesta no transformados, se puede usar un modelo de cociente de pendientes. Las ecuaciones para el modelo de cociente de pendientes cuando se asume la similitud son:
y S = a + b z + e = a + b Sz + e
[3.7]
yT = a + b (rz) + e = a + b Srz + e = a + b Tz + e
Una caracterstica que identifica el modelo de concentracinrespuesta de cociente de pendientes, la cual se puede observar
en los resultados de un estudio de intervalos, es que las lneas para diferentes potencias de un estudio de intervalos tienen la
misma ordenada al origen y diferentes pendientes. Por consiguiente, una grfica para el estudio de intervalos tiene forma de
abanico. La Figura 3.4 presenta un ejemplo de un modelo de concentracinrespuesta de cociente de pendientes. Se debe
tomar en cuenta que la ordenada al origen comn no necesariamente est en el origen.
USP 38
Figura 3.4. Ejemplo de un modelo de cociente de pendientes.

Una valoracin con un modelo de concentracinrespuesta de cociente de pendientes para medir la potencia relativa consta, como mnimo, de una muestra Estndar y una muestra de Prueba, cada una medida en una o ms concentraciones y, por
lo general, una respuesta medida sin muestra (concentracin cero). Debido a que las concentraciones no se transforman en
logaritmos, a menudo se espacian equitativamente sobre la escala original, en lugar de la escala logartmica. El modelo consiste en una ordenada al origen comn, una pendiente para los resultados de la muestra de Prueba y una pendiente para los
resultados de la muestra Estndar como en la ecuacin [3.7]. La potencia relativa se determina entonces a partir del cociente
de las pendientes:
Suposiciones y Estimacin para Modelos de Cociente de PendientesLas suposiciones para el modelo de cociente de pendientes son las mismas que para los modelos de lneas paralelas: Los trminos residuales son independientes, tienen una varianza
constante y podra ser necesario que tuvieran una distribucin normal. El mtodo de estimacin tambin es el de cuadrados
mnimos. Esto se puede implementar con o sin ponderacin, segn se demuestra en las ecuaciones [3.8] y [3.9], respectivamente.
La ecuacin [3.9] es apropiada nicamente si las ponderaciones se determinan sin usar la respuesta, es decir las y, de los
datos en curso. sta es una regresin lineal con dos variables independientes, z(1 T) y zT, donde T = 1 para los datos de la
Prueba, y T = 0 para los datos del Estndar. bT es la pendiente estimada para la Prueba, bS es la pendiente estimada para el
Estndar y, por tanto, la estimacin de la potencia relativa es
Puesto que el modelo de cociente de pendiente es un modelo de regresin lineal, se pueden usar la mayora de los programas estadsticos y hojas de clculo para obtener la estimacin de la potencia relativa. En algunos sistemas de valoracin, en
ocasiones resulta apropiado omitir la concentracin cero (p.ej., si los controles sin dosis se manejan de manera distinta en la
valoracin) y algunas veces una o ms de las concentraciones altas (p.ej., si existe un efecto de gancho en el que las concentraciones ms altas no contienen las respuestas ms altas). La discusin sobre el uso de un modelo de medias y la seleccin de
subconjuntos de concentraciones para valoraciones biolgicas de lneas rectas paralelas se aplica tambin a las valoraciones de
cociente de pendientes.
Medicin de Falta de SimilitudPara modelos de cociente de pendientes, la similitud estadstica corresponde a ordenadas al
origen iguales para el Estndar y la Prueba. Para evaluar la suposicin de similitud, es necesario contar con al menos dos concentraciones diferentes a cero para cada muestra. Si las ordenadas al origen no son iguales, la ecuacin [3.7] se convierte en
yS = aS + b Sz + e
yT = aT + b Tz + e
Captulos
Potencia Relativa=
Pendiente de la muestra de Prueba/Pendiente de la muestra Estndar =
b r/b = r
USP 38
Las desviaciones de la similitud a menudo se miden mediante la diferencia de las ordenadas al origen, aT aS. Una manera
fcil de obtener un intervalo de confianza es ajustar el modelo,
y = aS + T
donde = aT aS y usar para
ERR (01-jul-2014)
ERR (01-jul-2014)
+ b Sz(1 T) + b TzT + e,
el intervalo de confianza estndar basado en la distribucin t.
Captulos
3.6 Valoraciones Dictomas (Cuantales)

Para valoraciones cuantales, la medicin de la valoracin tiene un resultado dicotmico o binario, p.ej., en valoraciones con
animales, el animal est muerto o vivo, o se puede observar o no cierta respuesta fisiolgica. Para valoraciones celulares, la
respuesta cuantal puede relacionarse con la aparicin o no de una respuesta ms all de algn umbral en la clula. En una
titulacin viral basada en clulas o en valoraciones de formacin de colonias, la respuesta cuantal puede ser un lmite de respuesta en nmero entero, como por ejemplo un nmero entero de partculas o colonias. Cuando es posible determinar fcilmente la presencia de algunas partculaspero no su nmero realentonces la valoracin se puede analizar como cuantal.
Cabe tomar en cuenta que si la reaccin se puede cuantificar en una escala continua, por ejemplo, con una densidad ptica,
entonces la valoracin no es cuantal.
Modelos Para Anlisis CuantalesLa clave para los modelos de respuestas cuantales es trabajar con la probabilidad de una
respuesta (p.ej., probabilidad de muerte), al contrario de las respuesta cuantitativas en las que el modelo es para la respuesta
misma. Para cada concentracin, z, un animal tratado, por ejemplo, tiene una probabilidad de responder a dicha concentracin, P(z). A menudo, la curva P(z) se puede aproximar a una curva sigmoidea cuando se grafica en funcin del logaritmo de
concentracin, segn se muestra en la Figura 3.5. Esta curva muestra que la probabilidad de respuesta se incrementa con la
concentracin. La concentracin que corresponde a una probabilidad de 0,5 es el EC50.
Figura 3.5. Ejemplo de curva sigmoidea para P(z).

El modelo de la curva sigmoidea a menudo se genera basndose en la distribucin normal o en la distribucin logstica. Si se
emplea la distribucin normal, el anlisis resultante se denomina anlisis de probitas, y si se emplea la distribucin logstica, el
anlisis se denomina anlisis logit o logstico. Los modelos de probitas y logit son prcticamente indistinguibles, por lo que
cualquiera representa una opcin aceptable. La seleccin de uno u otro se puede basar en la disponibilidad de software que
satisfaga las necesidades de anlisis e informe del laboratorio. Debido a que los modelos logsticos cuentan con una disponibilidad de software mayor (a menudo denominado de regresin logstica) la presente discusin se enfocar en el uso e interpretacin del anlisis logit. Las consideraciones discutidas en esta seccin para el anlisis logit (usando una transformacin logstica)
tambin se aplican a los anlisis de probitas (usando una transformacin con probitas).
Modelo LogitEl modelo logit para la probabilidad de respuesta, P(z), se puede expresar en dos formas equivalentes. Para la
cruva sigmoidea,
donde log(ED50) = b 0/b 1. Una forma alternativa presenta la relacin con los modelos lineales:
La forma lineal a menudo se presenta usando logaritmos naturales y es til recordar que muchas de las consideraciones, en
particular la linealidad y el paralelismo, analizadas para los modelos de lneas paralelas en la seccin 3.3 Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas tambin se aplican a los modelos cuantales.
Para un anlisis logit con preparaciones Estndar y de Prueba, T representa una variable que toma el valor 1 para animales
que reciben la preparacin de Prueba y 0 para animales que reciben el Estndar. Entonces, asumiendo el paralelismo de las
curvas de Prueba y Estndar, el modelo logit para estimar la potencia relativa es:
USP 38
El logaritmo de la potencia relativa de la Prueba en comparacin con la preparacin Estndar es, por lo tanto, b 2/b 1. Las
dos curvas de la Figura 3.6 son sigmoideas paralelas del Estndar y de la Prueba. (Si se presentaran las formas lineales correspondientes de la ecuacin [3.10], stas seran dos lneas rectas paralelas.) El logaritmo de la potencia relativa es la distancia
horizontal entre las dos curvas, de la misma forma que para los modelos lineales y logsticos de cuatro parmetros provistos
para respuestas cuantitativas (secciones 3.3 Modelos de Lneas Paralelas para Respuestas Cuantitativas y 3.4 Modelos No Lineales
para Respuestas Cuantitativas).
Figura 3.6. Ejemplo de Curvas Sigmoideas Paralelas.
. El intervalo de confianza para la potencia relativa es, por lo tanto [antilog(L), antilog(U)],
donde [L, U] es el intervalo de confianza para el logaritmo de la potencia relativa.
SuposicionesLas suposiciones para los modelos cuantales tienen dos partes. La primera se relaciona con las suposiciones
subyacentes con respecto a la probabilidad de respuesta de cada animal o unidad en la valoracin biolgica. stas son suposiciones difciles de verificar que dependen del diseo de la valoracin. La segunda parte concierne a las suposiciones para el
modelo estadstico para P(z). Las ms importantes de stas son el paralelismo y la linealidad. Estas suposiciones se pueden verificar de buena manera al igual que los anlisis de lneas paralelas para respuestas cuantitativas.
En la mayora de los casos, los anlisis cuantales asumen un modelo de probabilidad binmico estndar, que es una seleccin comn para la distribucin de datos dicotmicos. Las suposiciones claves del binomio se basan en que a una concentracin dada, cada animal tratado a dicha concentracin, tiene la misma probabilidad de responder y los resultados para cualquier animal son independientes de los de los otros animales. Este conjunto bsico de suposiciones se puede infringir de muchas maneras. La ms destacada de stas es la presencia de efectos de la camada, donde los animales de la misma camada
tienden a presentar una respuesta ms parecida entre ellos que los animales de diferentes camadas. Los efectos de la jaula, en
los que las condiciones ambientales o el cuidado dado a cualquier jaula especfica hace que los animales de dicha jaula sean
ms o menos propensos a responder al tratamiento experimental, violan las suposiciones de idntica probabilidad y de independencia. Estas violaciones de las suposiciones y otras similares (que podran ser una seleccin deliberada del diseo) no impiden el uso de modelos logit o de probitas. No obstante, son indicaciones de que podra requerirse una metodologa ms compleja para el anlisis que la presentada en este captulo (ver el captulo 1032).
Verificacin de las SuposicionesEl modelo estadstico para P(z) asume linealidad y paralelismo. Para evaluar el paralelismo,
se puede modificar la ecuacin [3.10] de la manera siguiente:
En este caso, b 3 es la diferencia de pendientes entre la Prueba y el Estndar y debe ser lo suficientemente pequea. [El trmino
T*log(z) se conoce como un trmino de interaccin en la terminologa estadstica.] La medicin de falta de paralelismo tambin
Captulos
Estimacin de los Parmetros del Modelo y de la Potencia RelativaSe encuentran disponibles dos mtodos para estimar los
parmetros de los modelos logit y de probitas: la probabilidad mxima y los cuadrados mnimos ponderados. La diferencia no
tiene importancia prctica y el laboratorio puede aceptar la seleccin realizada por el software. Lo siguiente asume un programa de software de regresin logstica general. El software especializado debe ser similar.
Tomando en cuenta la forma de la ecuacin [3.10], se observa una similitud con la regresin lineal. Existen dos variables
independientes, x = log(z) y T. Para cada animal, existe una variable dependiente s/no, para la que a menudo se usa el cdigo
1 para s o respuesta y 0 para no o sin respuesta. Aunque las valoraciones biolgicas a menudo se disean con nmeros iguales
de animales por concentracin, esto no es un requisito de anlisis. Utilizando los parmetros estimados por el software, los
cuales incluyen b 0, b 1 y b 2 y sus errores estndar, se obtiene la estimacin del logaritmo natural de la potencia relativa:
Captulos
USP 38
se puede expresar en trminos del cociente de las pendientes, (b 1 + b 3)/b 1. Para intervalos de confianza basados en modelos
para estas mediciones de falta de paralelismo, se recomiendan los mtodos de remuestreo o de probabilidad del perfil. Dichos
mtodos no se presentan en este captulo general.
Para evaluar la linealidad, resulta una buena prctica comenzar con un examen grfico. De acuerdo con la ecuacin [3.10],
sta sera una grfica de log[(y + 0,5)/(n y + 0,5)] en funcin del log(concentracin), donde y es el nmero total de respuestas en la concentracin y n es el nmero de animales en dicha concentracin. (Las correcciones 0,5 mejoran las propiedades
de este clculo como una estimacin de log[P/(1 P)].) Las lneas para el Estndar y la Prueba deben ser lneas rectas paralelas,
al igual que en el modelo lineal en valoraciones cuantitativas. Si la relacin es monotnica pero no parece ser lineal, entonces
el modelo de [3.10] se puede expandir con otros trminos. Por ejemplo, se puede agregar un trmino cuadrtico en log(concentracin): [log(concentracin)]2. Si fuera necesario transformar la concentracin en algo distinto del logaritmo de la concentracin, entonces el anlogo del modelo cuantal de las valoraciones de cociente de pendientes es una opcin. Esto ltimo es
posible; sin embargo, debido a que no se usa con frecuencia, no se analizar en mayor profundidad en el presente captulo
general.
Valores AberrantesLa evaluacin de valores aberrantes es ms difcil en las valoraciones cuantales que en las valoraciones
cuantitativas. Debido a que la respuesta de la valoracin slo puede ser s o no, ninguna respuesta individual puede ser inusual.
Lo que parece caer dentro de la categora de valor aberrante es una sola respuesta a una concentracin baja o una sola falta de
respuesta a una concentracin alta. Asumiendo que no se ha encontrado ninguna causa (p.ej., incapacidad de administrar
adecuadamente el frmaco al animal), no existe fundamento estadstico para distinguir un valor aberrante de un evento extrao.
Mtodos AlternativosSe pueden aceptar alternativas a los anlisis cuantales simples aqu descritos, dependiendo de la naturaleza del desafo analtico. Uno de esos desafos es la falta de independencia entre unidades experimentales, segn se puede
apreciar en los efectos de la camada en valoraciones con animales. Algunas de las metodologas que se pueden emplear son
las Ecuaciones de Estimacin Generalizadas (GEE, por sus siglas en ingls), los modelos lineales generalizados y los modelos de
efectos mixtos lineales generalizados. Un Anlisis con Ecuaciones de Estimacin Generalizadas producir errores estndar e intervalos de confianza cuya validez no depender del cumplimiento de la suposicin de independencia.
Adems, existen mtodos que no realizan ninguna eleccin particular de la ecuacin del modelo para la curva sigmoidea.
Un ejemplo que se aprecia comnmente es el mtodo SpearmanKrber.
4. INTERVALOS DE CONFIANZA
El informe del resultado de una valoracin debe incluir una medicin de la incertidumbre de dicho resultado. Esto es, a menudo, un error estndar o un intervalo de confianza. Un intervalo (c, d), en el que c es el lmite de confianza inferior y d es el
lmite de confianza superior, es un intervalo de confianza de 95% para un parmetro (p.ej., la potencia relativa) si el 95% de
tales intervalos al repetir el experimento incluyeron el valor real del parmetro. Un intervalo de confianza se puede interpretar
como valores indicativos del parmetro que son uniformes con respecto a los datos. Esta interpretacin de un intervalo de confianza requiere satisfacer diversas suposiciones. Las suposiciones tambin deben cumplirse cuando en una monografa se utiliza
el ancho o el ancho medio [(d-c)/2] como una medida para determinar si existe la precisin adecuada para informar una potencia. El ancho del intervalo en ocasiones se emplea como un criterio de aptitud sin la interpretacin de confianza. En tales
casos, no es necesario cumplir con las suposiciones.
Los intervalos de confianza pueden ser basados en modelos o basados en muestras. Un intervalo basado en modelos se basa
en los errores estndar para cada una o ms de las estimaciones del logaritmo de la potencia relativa que provienen del anlisis
de un modelo estadstico particular. Los intervalos basados en modelos no debern usarse cuando sea posible utilizar intervalos
basados en muestras. Los intervalos basados en modelos requieren que el modelo estadstico incorpore correctamente todos
los efectos y correlaciones que influencian la estimacin de precisin del modelo. stos incluyen, pero no se limitan a diluciones en serie y efectos de placa. La seccin 4.3 Mtodos Basados en Modelos describe el Teorema de Fieller, un intervalo basado
en modelo de uso comn.
Los mtodos basados en muestras combinan estimaciones independientes del logaritmo de la potencia relativa. Pueden surgir mltiples valoraciones debido a que la necesidad de dicho mtodo se determin durante el desarrollo y la validacin, o
debido a que el procedimiento de valoracin fija un ancho mximo aceptable del intervalo de confianza y podran ser necesarias dos o ms valoraciones independientes para cumplir con el requisito de ancho especfico. Algunos mtodos basados en
muestras no requieren que el modelo estadstico incorpore correctamente todos los efectos y correlaciones. No obstante, esto
no debe interpretarse como un descarte del valor de tratar las correlaciones y dems factores que influencian la precisin dentro de la valoracin. La precisin dentro de la valoracin se emplea en la evaluacin de la similitud y es una porcin de la
variabilidad, la cual es el fundamento para los intervalos basados en muestras. Por lo tanto, es importante minimizar la variabilidad dentro de la valoracin hasta donde resulte prctico. Los intervalos basados en muestras se discuten en la seccin 4.2
Combinacin de Valoraciones Independientes (Mtodos para Intervalos de Confianza Basados en Muestras).
4.1 Combinacin de Resultados de Mltiples Valoraciones

A fin de mitigar los efectos de la variabilidad, resulta adecuado llevar a cabo determinaciones repetidas de valoraciones biolgicas independientes y combinar sus resultados para obtener un valor de informe nico. Posteriormente, dicho valor de in-
USP 38
4.2 Combinacin de Valoraciones Independientes (Mtodos para Intervalos de Confianza Basados

en Muestras)
Los analistas pueden usar diversos mtodos para combinar los resultados de valoraciones independientes. Un mtodo simple
descrito a continuacin (Mtodo 1) asume una distribucin comn de las potencias relativas en todas las valoraciones, por lo
que es un mtodo recomendable. Asimismo, se proporciona un segundo procedimiento que puede ser til si se puede documentar la homogeneidad de la potencia relativa en todas las valoraciones. Se ofrece una tercera alternativa que puede ser til
si no se cumplen las suposiciones para los Mtodos 1 y 2. La alternativa de analizar todas las valoraciones juntas usando un
modelo de efectos mixtos lineal o no lineal no se discute en este captulo general.
Mtodo 1Resultados de Valoraciones Independientes a partir de una Distribucin de Valoraciones ComnEl siguiente es un
mtodo simple que asume la independencia de las valoraciones. Se asume que los resultados de la valoracin individual (logaritmos de las potencias relativas) se derivan de una distribucin normal comn con algo de varianza diferente a cero. Esta suposicin de distribucin comn requiere que todas las valoraciones que se van a combinar hayan usado el mismo diseo y
procedimientos de laboratorio. Queda implcito que las potencias relativas pueden diferir entre las valoraciones. Por lo tanto,
este mtodo captura la variabilidad entre valoraciones con respecto a la potencia relativa. Se debe tomar en cuenta que las
potencias relativas individuales no deben redondearse antes de combinar los resultados.
Suponiendo que Ri es el logaritmo de la potencia relativa de la ima valoracin de N resultados de valoraciones que se van a
combinar. Para combinar los N resultados, la media, la desviacin estndar y el error estndar de la Ri se calculan de la manera
usual:
Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 a)% como

R tN 1,a/2SE,
Captulos
forme nico (y no los resultados individuales de la valoracin) se compara con cualquier criterio de aceptacin aplicable. Durante el desarrollo y validacin de la valoracin, los analistas deben evaluar si sera til combinar los resultados de dichas valoraciones y, en caso afirmativo, la forma en que se va a proceder.
Existen dos preguntas principales que se deben tratar cuando se considera la forma de combinar los resultados de mltiples
valoraciones:
Son mutuamente independientes las valoraciones?
Un conjunto de valoraciones se puede considerar mutuamente independiente cuando las respuestas de alguna de stas
no depende en ninguna forma de la distribucin de las respuestas de las valoraciones restantes. Esto implica que los errores aleatorios en todos los factores esenciales que influencian el resultado (por ejemplo, diluciones del estndar y de la
preparacin que se va a examinar o la sensibilidad del indicador biolgico) en una valoracin debe ser independiente de
los errores aleatorios correspondientes de las otras valoraciones. Por consiguiente, las valoraciones en das sucesivos que
emplean las diluciones originales y reservadas del Estndar no son valoraciones independientes. De manera similar, si las
respuestas, en particular la potencia, dependen de otros reactivos compartidos por las valoraciones (p.ej., preparaciones
celulares), las valoraciones podran no ser independientes.
Las valoraciones no necesitan ser independientes para que los analistas combinen los resultados. Sin embargo, los mtodos para valoraciones independientes son mucho ms simples. Asimismo, combinar resultados de valoraciones dependientes puede requerir suposiciones sobre la forma de la correlacin entre los resultados de las valoraciones que, en el
mejor de los casos, podran ser difciles de verificar. Existen mtodos estadsticos disponibles para valoraciones dependientes, aunque no se presentan en este captulo general.
Son homogneos los resultados de las valoraciones?
Los resultados homogneos slo presentan diferencias debidas a errores aleatorios dentro de las valoraciones. Cualquier
contribucin de factores asociados con la precisin intermedia impide la homogeneidad de los resultados. Los factores de
precisin intermedia son aqullos que varan entre las valoraciones dentro de un laboratorio y pueden incluir analistas,
equipo y condiciones ambientales. Existen pruebas estadsticas para heterogeneidad, pero la falta de heterogeneidad estadsticamente significativa no se toma como una garanta de homogeneidad, por lo que no se recomienda prueba alguna.
Si los analistas emplean un mtodo que supone la homogeneidad, sta debe ser evaluada durante el desarrollo, documentada durante la validacin y monitoreada durante el uso continuo de la valoracin.
Adems, antes de que se puedan combinar los resultados de las valoraciones, los analistas deben considerar la escala en la
que se llevar a cabo dicha combinacin. En general, la combinacin se debe realizar usando la escala en la que las estimaciones de parmetros se distribuyen aproximadamente de manera normal. As, para las potencias relativas basadas en un mtodo
de lneas paralelas, de curvas paralelas o cuantal, las potencias relativas se combinan en la escala logartmica.
USP 38
Captulos
donde tN 1,a/2 es el punto porcentual superior a/2 de una distribucin t con N 1 grados de libertad. La cantidad
tN 1,a/2SE es la incertidumbre expandida de R. El nmero, N, de valoraciones que se van a combinar es, por lo general, pequeo, y, por consiguiente, el valor de t es a menudo grande.
Puesto que los resultados se combinan en la escala logartmica, el resultado combinado se puede informar en la escala sin
transformar como un intervalo de confianza para la potencia media geomtrica, estimada mediante antilog(R),
Mtodo 2Resultados de Valoraciones Independientes y Suposicin de HomogeneidadEste mtodo se puede usar siempre
que se cumplan las siguientes condiciones:
(1) Las estimaciones de potencia individual forman un conjunto homogneo con respecto a la potencia que se est estimando. Se debe tomar en cuenta que esto significa documentar (a menudo durante el desarrollo y la validacin) que los factores de precisin intermedia no contribuyen a la variabilidad entre valoraciones. Los resultados individuales deben parecer uniformes con respecto a la homogeneidad. En particular, las diferencias entre stos debe ser uniforme con respecto a
sus errores estndar.
(2) Las estimaciones de potencia se derivan de valoraciones independientes.
(3) El nmero de grados de libertad de los errores residuales individuales no es pequeo. Esto es necesario para determinar
de manera adecuada todas las ponderaciones.
Cuando no se cumplen estas condiciones, no es posible aplicar este mtodo, por lo que deber usarse el Mtodo 1, el Mtodo 3 o algn otro mtodo. Adems, se debe tomar en cuenta que el Mtodo 2 (debido a que asume la ausencia de variabilidad entre valoraciones) a menudo resulta en intervalos de confianza ms estrechos que el Mtodo 1, pero esto no es justificacin suficiente para usar el Mtodo 2 ante la falta de cumplimiento de las condiciones citadas anteriormente.
Clculo de Coeficientes de PonderacinSe asume que los resultados de cada una de las N valoraciones han sido analizados
para proporcionar N estimaciones del logaritmo de potencia con lmites de confianza asociados. Para cada valoracin, i, el intervalo logartmico de confianza para el logaritmo de potencia o el logaritmo de la potencia relativa y un valor Li se obtienen
restando el lmite de confianza inferior del lmite de confianza superior. (Esta frmula, usando el Li, acomoda intervalos de confianza asimtricos tales como el Teorema de Fieller, seccin 4.3 Mtodos Basados en Modelos). Un peso Wi para cada valor del
logaritmo de la potencia relativa, Ri, se calcula de la manera siguiente, donde ti tiene el mismo valor que el usado en el clculo
de los lmites de confianza en la ima valoracin:
Clculo de la Media Ponderada y de los Lmites de ConfianzaLos productos WiRi se forman para cada valoracin y su suma se
divide por el peso total para todas las valoraciones para proporcionar el logaritmo de la potencia relativa media ponderada y
su error estndar de la manera siguiente:
Posteriormente, se determina un intervalo de confianza del 100(1 a)% en la escala logartmica como
R tk,a/2SE
[4.2]
donde tk,a/2 es el punto porcentual superior a/2 de una distribucin t con grados de libertad, k, igual a la suma del nmero de
grados de libertad para el error de cuadrados medios en las valoraciones individuales. Posteriormente, este intervalo de confianza puede transformarse nuevamente a la escala original, al igual que en el Mtodo 1.
Mtodo 3Resultados de Valoraciones Independientes Sin la Suposicin de una Distribucin de Valoraciones ComnEl Mtodo
3 es un mtodo aproximado que se puede considerar cuando no se cumplen las condiciones del Mtodo 1 (distribucin de
valoraciones comn) o el Mtodo 2 (homogeneidad).
La variacin observada tiene entonces dos componentes:
la variacin intravaloracin para la valoracin i:
la variacin entre valoraciones:
Posteriormente, se calcula un coeficiente de ponderacin para cada valoracin como
USP 38
el cual reemplaza Wi en la ecuacin [4.1] y donde t en la ecuacin [4.2] a menudo se aproxima mediante el valor 2.
4.3 Mtodos Basados en Modelos

Muchos intervalos de confianza son del tipo:
Intervalo de confianza = valor k veces el error estndar de dicho valor.
en donde
y t es el valor desviado apropiado de t que depender del tamao de la muestra y del nivel de confianza seleccionado (por lo
general 95%). Si g > 1, esto significa que el denominador, b, no presenta una diferencia estadsticamente significativa a 0 y el
uso del cociente no es sensible para dichos datos.
Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no guardan una correlacin estadstica (Cov = 0), la frmula del
intervalo de confianza se simplifica a
5. FUENTES ADICIONALES DE INFORMACIN

Se pueden usar una variedad de mtodos estadsticos para analizar los datos de las valoraciones biolgicas. Este captulo presenta diversos mtodos, pero tambin se pueden emplear muchos otros mtodos similares. Es posible encontrar informacin
adicional, as como procedimientos alternativos en las referencias citadas a continuacin y en otras fuentes.
1. Bliss CI. The Statistics of Bioassay. New York: Academic Press; 1952.
2. Bliss CI. Analysis of the biological assays in U.S.P. XV. Drug Stand. 1956;24:3367.
3. Bhrer A. One-sided and two-sided critical values for Dixons outlier test for sample sizes up to n = 30. Econ Quality Control. 2008;23:513.
4. Brown F, Mire-Sluis A, eds. The Design and Analysis of Potency Assays for Biotechnology Products. New York: Karger; 2002.
5. Callahan JD, Sajjadi NC. Testing the null hypothesis for a specified differencethe right way to test for parallelism. Bioprocessing J. 2003:2;7178.
6. DeLean A, Munson PJ, Rodbard D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological doseresponse curves. Am J Physiol. 1978;235:E97E102.
7. European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia, Chapter 5.3, Statistical Analysis. Strasburg, France: EDQM; 2004:473
507.
8. Finney DJ. Probit Analysis. 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press; 1971.
9. Finney DJ. Statistical Method in Biological Assay. 3rd ed. London: Griffin; 1978.
10. Govindarajulu Z. Statistical Techniques in Bioassay. 2nd ed. New York: Karger; 2001.
Captulos
Para tales casos, siempre que se pueda determinar fcilmente el multiplicador k (p.ej., a partir de una tabla de distribucin
t), informar el error estndar e informar el intervalo de confianza sern altamente equivalentes, puesto que se podr determinar fcilmente el intervalo de confianza a partir del error estndar. No obstante, los logaritmos de las potencias relativas para
modelos de lneas paralelas y algunas parametrizaciones de modelos no lineales, as como las potencias relativas de los modelos de cocientes de pendientes, son cocientes. En tales casos, los intervalos de confianza no son simtricos alrededor del logaritmo de la potencia relativa o de la potencia estimadas, por lo que se requiere el Teorema de Fieller. Para estos casos asimtricos, se debe informar el intervalo de confianza, puesto que el error estndar por s mismo, no captura la asimetra.
El Teorema de Fieller es la frmula para el intervalo de confianza para un cociente. Suponiendo que R = a/b es el cociente
para el que se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones de a y b, se cuenta con sus respectivos errores estndar, SEa y SEb, y con una covarianza entre ellos, denominada Cov. (La covarianza es una medicin del grado de relacin de las
estimaciones de a y b, y es proporcional a la correlacin entre las estimaciones de a y b.) La covarianza puede ser 0, al igual
que para algunas parametrizaciones de anlisis de lneas paralelas estndares, aunque no es un requisito. Posteriormente, el
intervalo de confianza para R es segn se indica a continuacin:
USP 38
11. Hauck WW, Capen RC, Callahan JD, et al. Assessing parallelism prior to determining relative potency. PDA J Pharm Sci Technol. 2005;59:127137.
12. Hewitt W. Microbiological Assay for Pharmaceutical Analysis: A Rational Approach. New York: Interpharm/CRC; 2004.
13. Higgins KM, Davidian M, Chew G, Burge H. The effect of serial dilution error on calibration inference in immunoassay. Biometrics. 1998;54:1932.
14. Hurlbert, SH. Pseudo replication and the design of ecological field experiments. Ecological Monogr. 1984;54:187211.
15. Iglewicz B, Hoaglin DC. How to Detect and Handle Outliers. Milwaukee, WI: Quality Press; 1993.
16. Nelder JA, Wedderburn RWM. Generalized linear models. J Royal Statistical Soc, Series A. 1972;135:370384.
17. Rorabacher DB. Statistical treatment for rejection of deviant values: critical values of Dixons Q parameter and related subrange ratios at the
95% confidence level. Anal Chem. 1991;63:3948.
Captulos
1035 INDICADORES BIOLGICOS PARA ESTERILIZACIN

En trminos generales, un indicador biolgico se define como una preparacin caracterizada de microorganismos especficos
resistentes a un proceso especfico de esterilizacin. Los microorganismos ampliamente reconocidos como indicadores biolgicos adecuados son las bacterias formadoras de esporas, debido a que estos microorganismos son mucho ms resistentes que la
microflora normal frente a la mayora de los procesos de esterilizacin, excepto los que emplean radiaciones ionizantes. Un
indicador biolgico se puede utilizar en la calificacin del desempeo de un equipo de esterilizacin, y en el desarrollo y establecimiento de un proceso de esterilizacin validado para un artculo especfico. Los indicadores biolgicos se emplean en procesos que dan como resultado un producto estril en su empaque o envase final, al igual que en la esterilizacin de equipos,
materiales y componentes de envases que se utilizan en procesos aspticos. Tambin se pueden utilizar indicadores biolgicos
para controlar ciclos de esterilizacin establecidos y en revalidaciones peridicas de procesos de esterilizacin. Adems, se pueden usar indicadores biolgicos para evaluar la capacidad de procesos empleados para descontaminar aisladores o ambientes
aspticos de cuartos limpios.
Los principios y requisitos de estas aplicaciones se describen en Esterilizacin y Garanta de Esterilidad de Artculos Farmacopeicos 1211.
TIPOS DE INDICADORES BIOLGICOS

Hay al menos tres tipos de indicadores biolgicos. Cada tipo de indicador incorpora una especie conocida de un microorganismo con resistencia conocida a una forma especfica de esterilizacin. Algunos indicadores biolgicos tambin pueden contener dos especies diferentes de microorganismos en concentraciones distintas.
Una forma de indicador biolgico consiste en esporas que se disponen sobre un transportador (un disco o tira de papel de
filtro, vidrio, plstico u otro material) y se envasa de manera que se mantenga la integridad y viabilidad del transportador inoculado.
Los transportadores y los envases primarios no deben tener ningn tipo de contaminacin (fsica, qumica ni microbiana)
que afecte de manera adversa el desempeo ni las caractersticas de estabilidad del indicador biolgico. El proceso especfico
de esterilizacin no debe degradar al transportador ni al envase primario, pero se debe usar de manera que afecte el desarrollo
del indicador biolgico. El transportador debe resistir el transporte en el envase primario y secundario y la manipulacin en el
lugar de uso. El diseo del transportador y del envase primario debe reducir al mnimo la prdida del inculo original durante
el transporte, la manipulacin y la vida til durante el almacenamiento.
Otra forma de indicador biolgico es una suspensin de esporas que se inocula a unidades representativas del producto que
se va a esterilizar. Esto constituye un producto inoculado; aunque tambin se puede inocular un producto simulado si no resulta prctico inocular el producto real. Un producto simulado es una preparacin que difiere en uno o varios aspectos del producto real, pero que se comporta como el producto real en condiciones de prueba o durante el proceso real de esterilizacin
del producto. Se deben usar suspensiones de esporas con un valor D conocido para inocular el producto real o simulado. Si se
usa un producto simulado, se debe demostrar que dicho producto no disminuir la resistencia a la esterilizacin del indicador
biolgico. El diseo fsico del producto real o simulado puede tener influencia sobre la resistencia de las suspensiones de esporas inoculadas. En el caso de productos lquidos inoculados, con frecuencia es conveniente determinar el valor D y el valor z del
microorganismo indicador especfico en el producto lquido especfico. Se debe determinar la poblacin, el valor D, el valor z
cuando corresponda, y el tiempo de muerte final del producto real o simulado.
Una tercera forma de indicador biolgico es un indicador autocontenido. Un indicador autocontenido est diseado para
incubar el envase primario luego del proceso de esterilizacin, y contiene el medio de crecimiento para la recuperacin de los
microorganismos expuestos al proceso. Esta forma de indicador biolgico, junto con el medio de cultivo autocontenido, se
pueden considerar un sistema. En el caso de indicadores biolgicos autocontenidos, todo el sistema ofrece resistencia al proceso de esterilizacin.
Si el indicador biolgico es una tira de papel o un disco en un envase autocontenido que incluye un medio de cultivo, el
envase debe estar diseado para ser fcilmente penetrable por el agente esterilizante. Para considerar la demora del agente
esterilizante en llegar a los microorganismos contenidos en el sistema, se debe caracterizar el valor D, el tiempo de muerte final
USP 38
Informacin General / 1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin 881
del proceso y el tiempo de supervivencia para todo el sistema y no solamente para la tira de papel en la unidad autocontenida.
Despus del tratamiento de esterilizacin, se manipula el sistema para sumergir la tira o disco de papel con las esporas en el
medio de cultivo autocontenido y lograr el contacto entre ambos.
Los indicadores biolgicos autocontenidos adems pueden constar de una suspensin de esporas en su propio medio y con
frecuencia tambin contienen un colorante para indicar si hubo crecimiento positivo o negativo despus de la incubacin. La
resistencia del sistema autocontenido depende de la penetracin del agente esterilizante en el envase. El fabricante puede regular la penetracin variando los diseos y la composicin del envase, ampolla o recipiente del indicador biolgico autocontenido. Los indicadores biolgicos autocontenidos en ampollas se pueden incubar directamente despus de haberse expuesto al
proceso de esterilizacin. Despus se incuba todo el sistema en las condiciones especificadas. El crecimiento o la ausencia de
crecimiento de las esporas tratadas se determina visualmente (ya sea mediante un cambio de color especfico de un indicador
incorporado al medio o por turbidez) o mediante el examen microscpico del medio inoculado.
Las caractersticas de resistencia del sistema autocontenido tambin deben cumplir con lo establecido en la etiqueta del sistema autocontenido y en la monografa referente al indicador biolgico pertinente. El sistema de indicador biolgico autocontenido debe soportar el transporte en el envase secundario y la manipulacin en el lugar de uso sin romperse. El sistema autocontenido se debe disear para disminuir al mnimo la prdida del inculo original de microorganismos durante el transporte y
la manipulacin. Durante o despus del proceso de esterilizacin, los materiales utilizados en el sistema autocontenido no deben retener ni liberar ninguna sustancia que pueda inhibir el crecimiento de un bajo nmero de microorganismos indicadores
supervivientes en el cultivo. Se deben tomar las medidas adecuadas para demostrar que el medio de recuperacin ha conservado las caractersticas que sustentan el crecimiento despus de la exposicin al proceso de esterilizacin.
Preparacin
Seleccin de Indicadores para Procesos de Esterilizacin Especficos

La seleccin de un indicador biolgico requiere el conocimiento de la resistencia del sistema indicador biolgico con respecto al proceso de esterilizacin especfico. Se debe establecer que el sistema indicador biolgico ofrece una mayor resistencia al
proceso de esterilizacin que la correspondiente a la carga microbiana natural presente en el producto.
El uso eficaz de indicadores biolgicos en el ciclo de desarrollo, proceso y validacin del producto y en el control de la produccin de rutina de un proceso de esterilizacin requiere un profundo conocimiento del producto que se va a esterilizar y de
sus componentes (materiales y envase). En el desarrollo o la validacin de un proceso de esterilizacin slo se deben usar los
indicadores biolgicos ampliamente reconocidos en la monografa del indicador biolgico especfico. Esto garantizar que el
indicador biolgico seleccionado represente un desafo mayor para el proceso de esterilizacin que la biocarga presente en el
producto. Es posible que algunos usuarios necesiten indicadores biolgicos con caractersticas que difieran de las que poseen
los que estn disponibles comercialmente. En dichos casos, los usuarios pueden desarrollar sus propios cultivos de esporas con
el propsito expreso de preparar indicadores biolgicos para su uso interno especfico. En dicho caso, se aconsejar al usuario
que utilice microorganismos ya descritos en publicaciones cientficas como microorganismos indicadores y el usuario debe tener la capacidad de determinar los valores D y z de los indicadores biolgicos de uso interno. Cuando los indicadores biolgicos se preparan internamente, los usuarios deben confirmar la poblacin, la pureza y la vida til del indicador biolgico para
asegurar la validez de cualquier prueba que se lleve a cabo con el indicador interno. Cuando se emplea un diseo de un proceso de esterilizacin basado en la biocarga, son esenciales los datos que comparan la resistencia del indicador biolgico con la
resistencia de la biocarga. Adems, se requiere el recuento del contenido de la biocarga de los artculos que se esterilizan. El
proceso puede dar como resultado una letalidad verificada desde el punto de vista biolgico suficiente para lograr que la probabilidad de obtener una unidad no estril sea menos de una en un milln.
Como alternativa, se puede usar el mtodo de sobremuerte en el diseo de un proceso de esterilizacin. En este caso, se
hacen presunciones especficas con respecto a la resistencia presupuesta al establecer los requisitos de letalidad del proceso de
esterilizacin. En general, todos los procesos de sobremuerte se elaboran basndose en la suposicin de que la biocarga es
igual a un milln de microorganismos y que los microorganismos son muy resistentes. En consecuencia, para lograr la probabilidad requerida de una unidad no estril menor de uno en un milln, se necesita como mnimo un proceso 12 D. Un proceso
12 D se define como un proceso lo suficientemente letal como para provocar una reduccin de 12 unidades logartmicas, lo
Captulos
Todas las operaciones vinculadas a la preparacin de indicadores biolgicos se controlan mediante un sistema de calidad
documentado. Se mantiene la rastreabilidad de todos los materiales y componentes incorporados o que entran en contacto
directo con la suspensin de microorganismos, el transportador inoculado o el indicador biolgico.
La preparacin de suspensiones madre de esporas de los microorganismos seleccionados que se emplean como indicadores
biolgicos requiere el desarrollo de procedimientos adecuados, entre los que se incluyen cultivos en masa, recoleccin, purificacin y conservacin de las suspensiones de esporas. La suspensin madre debe contener principalmente esporas latentes (no
germinativas) que se mantienen en un lquido no nutritivo.
El producto terminado (suspensin microbiana, transportadores inoculados o indicadores biolgicos) suministrado por los
fabricantes para uso comercial no debe tener otros microorganismos diferentes a los microorganismos de prueba, en un nmero tal que afecte al producto de manera adversa. Se debe validar, monitorear y registrar el sistema usado para reducir al
mnimo la presencia en el producto de microorganismos distintos de los que constituyen el indicador biolgico.
Captulos
882 1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin / Informacin General
USP 38
que equivale a 12 veces un valor D para microorganismos con una resistencia suficientemente ms alta que la resistencia media de la biocarga. Puesto que se da por sentado que la biocarga es un milln, en la prctica real, un proceso de sobremuerte
dar como resultado una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 106. El diseo y la evaluacin del proceso de sobremuerte pueden diferir segn el proceso de esterilizacin en anlisis. El uso de un diseo de sobremuerte y un enfoque de validacin pueden minimizar o evitar la necesidad del recuento e identificacin de la biocarga.
Calor HmedoEn procesos de esterilizacin por calor hmedo, con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de
Bacillus stearothermophilus que estn disponibles comercialmente como indicadores biolgicos. Tambin se han utilizado otros
microorganismos formadores de esporas, resistentes al calor, como Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans
en el desarrollo y validacin de procesos de esterilizacin por calor hmedo.
Calor SecoEn la esterilizacin por calor seco, algunas veces se emplean esporas de Bacillus subtilis spp. para validar el
proceso. Durante la validacin de los procesos de esterilizacin por calor seco, frecuentemente se llevan a cabo estudios de
despirogenacin de endotoxinas en lugar de estudios de inactivacin microbiana durante el establecimiento de ciclos de esterilizacin, debido a que la inactivacin de las endotoxinas es ms difcil que la velocidad de inactivacin de las esporas de
Bacillus subtilis. En la prctica, una reduccin del ttulo de endotoxinas en tres o ms unidades logartmicas dar como resultado un proceso que logra una probabilidad de no esterilidad mucho menor de 106.
Radiacin IonizanteLas esporas de Bacillus pumilus se han usado para controlar los procesos de esterilizacin que emplean radiacin ionizante; sin embargo, esta prctica se est abandonando. Para establecer procesos de radiacin se han utilizado ampliamente mtodos de ajuste de dosis de radiacin que no usan indicadores biolgicos. Adems, ciertos microorganismos de la biocarga pueden presentar mayor resistencia a la radiacin que Bacillus pumilus.
xido de EtilenoEn la esterilizacin por xido de etileno, habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Bacillus subtilis (Bacillus subtilis var. niger). Generalmente se emplean los mismos sistemas indicadores biolgicos para la esterilizacin por xido de etileno al 100% y para sistemas de xido de etileno con un gas transportador.
Perxido de Hidrgeno en Fase de Vapor (VPHP, por sus siglas en ingls)Este proceso ha demostrado ser eficaz para
esterilizar o descontaminar superficies. El VPHP puede lograr la esterilizacin (probabilidad de no esterilidad menor de uno en
un milln) cuando las condiciones del proceso as lo requieran y si el objeto de la esterilizacin est adecuadamente configurado. Sin embargo, el VPHP tambin se emplea habitualmente como agente descontaminante de superficies en el tratamiento
de pruebas de esterilidad, contencin qumica y biolgica, fabricacin de aisladores y cuartos limpios.
La descontaminacin de superficies es un proceso distinto de la esterilizacin de materiales que entran en contacto con el
producto, sistemas de envase-cierre o producto. Es un proceso ideado para dejar un entorno libre de microorganismos detectables o recuperables. Los indicadores biolgicos se utilizan frecuentemente para verificar la eficacia del proceso de descontaminacin. Sin embargo, en el caso de la descontaminacin, un valor de tres a cuatro unidades de reduccin logartmica de
esporas es adecuado, porque el objetivo es la descontaminacin ms que la esterilizacin.
Bacillus stearothermophilus es el indicador biolgico ms utilizado para validar el proceso VPHP. Otros microorganismos que
pueden resultar tiles como indicadores biolgicos en procesos VPHP son las esporas de Bacillus subtilis y Clostridium sporogenes. Se pueden considerar otros microorganismos si sus reacciones al VPHP son similares a las de los microorganismos citados
anteriormente.
Estas esporas se pueden inocular en la superficie de varios sistemas transportadores impermeables a los gases cuyas superficies sean de vidrio, metal o plstico. Las superficies muy absorbentes, como por ejemplo los sustratos fibrosos o cualquier otro
sustrato que absorba fcilmente VPHP o humedad, pueden influir de manera adversa sobre la concentracin de VPHP disponible para inactivar los microorganismos inoculados. No se usan sustratos de papel porque el VPHP degrada los materiales que
contienen celulosa.
Para conocer las caractersticas representativas de indicadores biolgicos disponibles comercialmente, ver la Tabla 1.
Tabla 1. Caractersticas Tpicas de Sistemas de Indicadores Biolgicos Suministrados Comercialmente
Modo de
Esterilizacin
Calor secoa
Ejemplo de valor D Tpico (minutos)

1,9
160
Intervalo de valores D para

Seleccionar un Indicador
Biolgico Adecuado
(minutos)
Lmites de Resistencia Adecuada (dependiendo del valor D especfico [minutos])

Tiempo de
Supervivencia
Tiempo de
Muerte
Mn. 1,0
Mn. 4,0
10,0
Mx. 3,0
Mx. 14,0
32,0
Mn. 2,5
Mn. 10,0
25,0
Mx. 5,8
Mx. 27,0
68,0
xido de etilenob
600 mg por L
3,5
54
60% de humedad relativa
Calor hmedoc
1,9
121
a Para 1,0 106 a 5,0 106 esporas por transportador.
b Para 1,0 106 a 5,0 107 esporas por transportador.
c Para 1,0 105 a 5,0 106 esporas por transportador.
Mn. 1,5
Mn. 4,5
13,5
Mx. 3,0
Mx. 14,0
32,0
USP 38
Informacin General / 1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin 883
El indicador biolgico tambin puede estar envasado individualmente en un envase primario envuelto adecuadamente para
que no afecte de manera adversa el resultado del indicador y sea penetrable por VPHP. Se ha demostrado que los materiales
de poliolefina hilados son adecuados para envolver indicadores biolgicos destinados a la evaluacin de procesos VPHP. El material de envoltura puede facilitar la manipulacin de los indicadores biolgicos en el laboratorio despus de la exposicin a
VPHP. Adems, se debe evaluar cuidadosamente el material de envoltura, para asegurar que no queden residuos de perxido
de hidrgeno en el material del envase despus de la exposicin a VPHP, lo que posiblemente inducira una bacteriostasis durante los pasos de recuperacin. Los valores D microbiolgicos se vern influidos en cuanto a la velocidad de inactivacin por
la presencia del material de envoltura del indicador biolgico y la posible presencia de residuos de VPHP. En los casos en que
se empleen indicadores biolgicos (transportadores inoculados) sin el envase primario, se requiere el estricto cumplimiento de
las tcnicas aspticas.
EVALUACIN DEL DESEMPEO

Responsabilidad del Fabricante
Responsabilidad del Usuario

Producto ComercialCuando se adquieran indicadores biolgicos de una fuente comercial, se debe establecer su aptitud
para el uso en un proceso de esterilizacin especfico mediante la realizacin de estudios de esterilizacin a menos que se disponga de datos que respalden su uso en el proceso. El usuario debe establecer normas internas de aceptacin para los lotes de
indicadores biolgicos y considerar su rechazo cuando el lote no cumpla con los estndares de desempeo establecidos. Se
debe obtener un Certificado de Desempeo de cada lote de indicadores y el usuario debe llevar a cabo peridicamente inspecciones de los procesos y las instalaciones del fabricante. Si no se obtienen certificados ni se realizan inspecciones, o si los indicadores biolgicos se van a usar sin tener en cuenta las declaraciones establecidas en la etiqueta del fabricante, es necesaria la
verificacin y documentacin del desempeo en las condiciones de uso.
Cuando el usuario recibe por primera vez el indicador biolgico de un proveedor comercial, debe verificar la pureza y la
morfologa de los microorganismos del indicador biolgico adquirido. Es conveniente que por lo menos se verifique el gnero.
Adems se debe realizar un recuento microbiano para determinar el recuento promedio por unidad de indicador biolgico. Se
deben observar y tomar nota de los comentarios del fabricante respecto del intervalo del valor D, las condiciones de almacenamiento, la fecha de caducidad y la estabilidad del indicador biolgico. El usuario tiene la opcin de llevar a cabo evaluaciones
para verificar el valor D antes de aceptar el lote. Los laboratorios que tengan la capacidad de realizar determinaciones del valor
D pueden realizarlas mediante uno de los tres mtodos citados en el captulo de pruebas generales Indicadores Biolgicos
Pruebas de Resistencia 55 y en las monografas pertinentes de la USP sobre indicadores biolgicos. Es de particular importancia la verificacin del valor D y la estabilidad del recuento del sistema de indicador biolgico si se emplea el almacenamiento a
largo plazo.
En el caso de que el cultivo de esporas se mantenga durante ms de 12 meses en condiciones de almacenamiento documentadas, se debe llevar a cabo tanto un recuento de esporas como un anlisis de la resistencia, salvo que el desempeo del
cultivo madre original se haya validado durante un perodo de almacenamiento ms prolongado. Los resultados de ambas valoraciones deben estar dentro del intervalo de aceptabilidad establecido en la aceptacin inicial de la partida del cultivo de
esporas.
Producto No ComercialUn usuario de sistemas de indicadores biolgicos puede optar por cultivar microorganismos para
desarrollar indicadores biolgicos de uso interno con el propsito de establecer o validar procesos de esterilizacin. En el caso
de que un usuario se convierta en fabricante de indicadores biolgicos, se debe cumplir con ciertos requisitos de desempeo
1 Ver Aparatos en Indicadores BiolgicosPruebas de Resistencia 55. Estos aparatos han sido diseados para proporcionar condiciones fsicas uniformes aplicables a
la caracterizacin de indicadores biolgicos. Tambin se indican las caractersticas de desempeo requeridas.
Captulos
La responsabilidad inicial de determinar y proporcionar a los usuarios las caractersticas de desempeo de un lote de indicadores biolgicos1 recae sobre el fabricante del indicador. El fabricante debe suministrar un certificado de anlisis con cada lote
de indicadores biolgicos, el cual debe confirmar la validez de las aseveraciones sobre el desempeo del indicador biolgico
que se indican en la etiqueta del mismo o en la informacin adjunta al envase. El fabricante debe definir el proceso de esterilizacin para el cual se destina el indicador biolgico. El fabricante del indicador biolgico debe realizar la caracterizacin inicial
que establece las bases de las declaraciones de la etiqueta de cada indicador biolgico mediante el uso de aparatos especializados y estandarizados en condiciones definidas y precisas.1 El fabricante adems debe proporcionar informacin sobre el valor
D, el mtodo por el cual se determin el valor D, y el recuento microbiolgico y la estabilidad de la resistencia del indicador
biolgico durante toda la vida til del indicador declarada en la etiqueta. El fabricante debe proveer condiciones ptimas de
almacenamiento, incluidas la temperatura, la humedad relativa y cualquier otro requisito para almacenamiento controlado. Los
datos obtenidos de las diversas valoraciones de desempeo requeridas se deben citar en el prospecto adjunto o en la etiqueta
del envase del indicador biolgico. El fabricante debe proporcionar instrucciones de uso, entre las que se incluyen el medio y
las condiciones que se deben emplear para la recuperacin de los microorganismos despus de la exposicin al proceso de
esterilizacin. Adems, el fabricante debe suministrar las instrucciones de eliminacin del indicador biolgico.
884 1035 Indicadores Biolgicos para Esterilizacin / Informacin General
USP 38
para indicadores biolgicos. Si el sistema indicador biolgico se emplea para desarrollar nuevos procesos de esterilizacin o
para la validacin de los ya existentes, se deben seguir los mismos criterios de desempeo descritos para los fabricantes comerciales de indicadores biolgicos.
Preparacin del Cultivo de Esporas

Debido a que la mayora de los indicadores biolgicos emplean esporas microbianas, los productores de indicadores biolgicos, comerciales o no comerciales, deben mantener registros precisos de la identificacin del cultivo de esporas. Estos registros
deben incluir anotaciones referentes a la fuente del cultivo inicial, identificacin, rastreabilidad del cultivo madre de esporas,
frecuencia de subcultivos, medios utilizados para la esporulacin, cambios en la preparacin de los medios y cualquier observacin sobre contaminacin de cultivos y datos previos y posteriores al choque trmico. Se deben mantener registros respecto al
uso del cultivo de esporas y su resistencia a la esterilizacin (concretamente, los valores D y z cuando corresponda).
Captulos
Instrumentacin
La instrumentacin que se usa para evaluar la resistencia a la esterilizacin de los cultivos de esporas debe cumplir los estndares2 que se refieren a la evaluacin del desempeo de los sistemas de indicadores biolgicos.
El equipo para la determinacin de los valores D de microorganismos expuestos a VPHP debe poder ejercer un control estricto sobre los parmetros de operacin del equipo como se describe para otros sistemas de indicadores biolgicos en Indicadores
BiolgicosPruebas de Resistencia 55. Es de particular importancia asegurar una concentracin de VPHP reproducible, entregada dentro de un perodo definido y mantenida dentro de un intervalo especfico de concentracin o de presin de VPHP
durante incrementos de tiempo definidos. La introduccin de indicadores biolgicos en condiciones de una concentracin estabilizada de VPHP se debe efectuar mediante un sistema que permita introducir y retirar rpidamente las unidades de prueba
de la cmara. Adems, el diseo de la cmara de prueba debe ser tal que se pueda alcanzar el estado estacionario de concentraciones y presiones de VPHP, o se pueda usar una cantidad definida de pies cbicos de VPHP fluyendo libremente a presin y
temperatura normalizadas. Actualmente, el uso de dispositivos que determinan la concentracin de VPHP no est muy difundido. Por lo tanto, puede ser necesario basar las condiciones de exposicin en el mantenimiento de las presiones de VPHP en
estado estacionario o en las velocidades de flujo resultantes de un peso inicial de perxido de hidrgeno conocido que entra
en la cmara en una unidad de tiempo definida. Esta informacin, junto con el volumen fijo conocido del entorno de la cmara, permite calcular la concentracin aproximada de VPHP. Si las condiciones se mantienen constantes a lo largo de cada corrida de evaluacin del valor D, se pueden determinar fcilmente comparaciones de resistencia relativa entre diferentes lotes de
indicadores biolgicos.
USO PARA VALIDACIN DURANTE EL PROCESO

Independientemente del modo de esterilizacin, el nmero de microorganismos de la poblacin inicial, su resistencia a la
esterilizacin, y el sitio de inoculacin dentro o sobre el producto pueden influir en la velocidad de inactivacin del indicador
biolgico.
Durante las exposiciones del producto a los microorganismos, se deben inocular varios lugares del producto con indicadores
biolgicos. Si, por ejemplo, se esteriliza un envase con su sistema de cierre, se debe exponer tanto la solucin del producto
como el sistema de cierre para asegurar que se logre la esterilizacin equivalente a un nivel de garanta de esterilizacin (SAL,
por sus siglas en ingls) de 106 (una probabilidad en un milln de que haya una unidad no estril) en la solucin y el cierre.
Puede ser necesario determinar mediante estudios de laboratorio si los componentes del producto son ms difciles de esterilizar por separado que, por ejemplo, una solucin o un frmaco contenidos dentro del producto. Dependiendo de la localizacin de los componentes del producto ms difciles de esterilizar, pueden intervenir diferentes parmetros del proceso para
garantizar la inactivacin microbiana hasta un nivel SAL de 106. Durante la fase de calificacin de desempeo del producto se
deben identificar los parmetros del proceso con mayor influencia en la inactivacin de microorganismos en los sitios ms difciles de esterilizar. En la validacin durante el proceso del producto, los parmetros fundamentales previamente determinados
se deben ajustar por debajo de las condiciones establecidas en las especificaciones del proceso. La supervivencia del indicador
biolgico se puede predecir basndose en su resistencia y la poblacin. Por lo tanto, no siempre se requiere una poblacin de
106 de un indicador biolgico para demostrar un SAL de 106. Es adecuado usar indicadores biolgicos para confirmar que los
parmetros del proceso desarrollado den como resultado el SAL deseado. En la esterilizacin por calor hmedo, el indicador
biolgico se emplea para verificar biolgicamente la letalidad determinada fsicamente. Indicadores biolgicos con altos valores D y poblaciones significativamente menores de 106 son adecuados para validar muchos procesos de esterilizacin y descontaminacin. Es importante que los usuarios puedan justificar cientficamente su seleccin de un indicador biolgico.
Vigentes para Recipientes de Vapor/BIER, Estndares Nacionales de los Estados Unidos (American National Standards), ANSI/AAMI ST45:1992.
USP 38
Informacin General / 1041 Productos Biolgicos 885
1041 PRODUCTOS BIOLGICOS
Captulos
Algunos productos como por ejemplo antitoxinas, antivenenos, sangre, hemoderivados, antisueros, elementos auxiliares para el diagnstico inmunolgico, toxoides, vacunas y artculos relacionados que se producen bajo licencia en conformidad con
los trminos de la Ley federal de Servicios de Salud Pblica (Estat. 58 682) aprobada el 1 de julio de 1944 como enmienda, se
han conocido durante mucho tiempo como productos biolgicos. Sin embargo, en la Tabla III, Parte F de la Ley, el trmino
productos biolgicos se aplica al grupo de productos autorizados en conjunto. A los efectos de esta Farmacopea, el trmino
productos biolgicos hace referencia a aquellos productos que deben estar autorizados segn la Ley y cumplir con el Reglamento sobre Alimentos y MedicamentosCdigo de Reglamentos Federales, Ttulo 21, Partes 600-680, relativas al control federal de estos productos (excepto ciertos elementos de diagnstico), segn la administracin del Centro de Investigacin y
Evaluacin de Productos Biolgicos (Center for Biologics Evaluation and Research) o, en el caso de los elementos auxiliares de
diagnstico pertinentes, del Centro de Dispositivos y Radiologa (Center for Devices and Radiological Health) de la Administracin Federal de Alimentos y Medicamentos.
Cada lote de un producto biolgico autorizado est aprobado para su distribucin cuando se ha determinado que el lote
cumple con los requisitos de control especficos para dicho producto segn establezca la Administracin. El otorgamiento de
licencias incluye la aprobacin de una serie especfica de pasos de produccin y de pruebas de control durante el proceso, as
como especificaciones sobre el producto final que deben cumplirse lote por lote. Estos pasos slo pueden alterarse despus de
la aprobacin del Centro de Investigacin y Evaluacin de Productos Biolgicos y con el apoyo de la informacin apropiada
que demuestre que el cambio generar un producto final con una seguridad, pureza, potencia y eficacia iguales o superiores.
Ningn lote de un producto biolgico autorizado ser distribuido por el fabricante antes de completar las pruebas especificadas. Las disposiciones generalmente aplicables a los productos biolgicos incluyen pruebas de potencia, seguridad general, esterilidad, pureza, agua (humedad residual), pirgenos, identidad y materiales constituyentes (Artculos 610.10 a 610.15 y ver
Pruebas de SeguridadProductos Biolgicos en Pruebas de Reactividad Biolgica In Vivo 88, Pruebas de Esterilidad 71, Determinacin de Agua 921, Prueba de Pirgenos 151 y Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85). Los materiales constituyentes incluyen ingredientes, conservantes, diluyentes y adyuvantes (los cuales generalmente deben cumplir con las normas farmacopeicas), vacunas producidas en cultivos celulares de protena extraa (la cual se excluye si no origina suero) y antibiticos diferentes de la penicilina agregados al sustrato de produccin de vacunas virales (para las cuales hay disponibles monografas oficiales sobre antibiticos y sustancias antibiticas). Tambin es necesario realizar pruebas de seguridad adicionales especficas en
vacunas vivas y algunos otros elementos. Cuando el Centro de Investigacin y Evaluacin de Productos Biolgicos (Apartado
610.20) pone a disposicin las preparaciones estndar, dichas preparaciones se especifican para la comparacin de potencia o
pruebas de virulencia. El Estndar de Opacidad de los EE.UU. se utiliza para calcular la concentracin bacteriana de ciertas vacunas bacterianas y para evaluar cultivos de desafo en las pruebas realizadas a dichas sustancias. (Ver tambin Unidades de
Potencia en las Advertencias Generales.)
Las Monografas Farmacopeicas cumplen la Reglamentacin sobre Alimentos y Medicamentos al cubrir los aspectos de identidad, calidad, pureza, potencia, envasado y almacenamiento, que resultan de particular inters para los farmacuticos y mdicos responsables de la compra, el almacenamiento y el uso de productos biolgicos. Las revisiones de los requisitos federales
que afectan a las monografas de la USP sern los temas centrales de los Suplementos de la USP tan pronto como sea factible.
Vehculos y Sustancias AgregadasLos vehculos y las sustancias agregadas adecuados para productos biolgicos son los
que se enumeran en la Reglamentacin sobre Alimentos y Medicamentos.
Envases para InyeccionesLos envases para productos biolgicos que deban ser administrados por va inyectable cumplen con los requisitos de Envases para Inyecciones en Inyectables 1.
Volumen en EnvaseLos volmenes de los envases de productos biolgicos que deban ser administrados por va inyectable cumplen con los requisitos de Contenido del Envase en Inyectables 1.
EtiquetadoLos productos biolgicos que deban ser administrados por va inyectable cumplen con los requisitos de Etiquetado en Inyectables 1. Adems, la etiqueta del envase final para cada producto biolgico indica lo siguiente: el ttulo o
nombre propio (el nombre con el cual el producto fue autorizado segn la Ley de Servicios de Salud Pblica), el nombre, la
direccin y el nmero de licencia del fabricante, el nmero de lote, la fecha de caducidad y la dosis individual recomendada
para envases multidosis. La etiqueta del envase incluye todo lo mencionado anteriormente, con la siguiente adicin: el conservante utilizado y la cantidad; el nmero de envases, si hubiera ms de uno; la cantidad de producto contenida en el envase; la
temperatura de almacenamiento recomendada; una leyenda, si fuera necesario, que indique que debe evitarse la congelacin;
y cualquier otra informacin semejante requerida por la Reglamentacin sobre Alimentos y Medicamentos.
Envasado y AlmacenamientoEl etiquetado indica la temperatura de almacenamiento recomendada (ver Advertencias Generales). Cuando los productos cuya etiqueta indica que deben almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 estn almacenados en un refrigerador, se deben tomar precauciones para asegurarse de que no se congelen. Los diluyentes envasados con
productos biolgicos no deben congelarse. Algunos productos (como se define en el Apartado 600.15) deben mantenerse a
temperaturas especificadas durante el transporte.
Fecha de CaducidadPara los artculos farmacopeicos, la fecha de caducidad identifica el tiempo durante el cual se puede
esperar que el artculo cumpla con los requisitos de la monografa Farmacopeica, siempre que se almacene en las condiciones
de almacenamiento prescritas. Esta fecha limita el tiempo durante el cual el producto puede ser dispensado o utilizado (ver
886 1041 Productos Biolgicos / Informacin General
USP 38
Advertencias Generales, pgina 1). Sin embargo, para los productos biolgicos, la fecha indicada en cada lote determina el perodo de vigencia, que comienza en la fecha de fabricacin (Apartado 610.50) y ms all de la cual existen dudas razonables
de que el producto pueda generar los resultados especficos y conserve la seguridad, pureza y potencia requeridas (Apartado
300.3 (1) y (m)). Dicho periodo de vigencia puede comprender un periodo de almacenamiento en fbrica durante el cual se
mantiene en las condiciones prescritas en el almacenamiento del fabricante, seguido de un periodo tras ser retirado de all. Las
monografas individuales suelen indicar este ltimo perodo y tambin (entre parntesis) el perodo de almacenamiento en fbrica permisible. Si el producto se conserva en el almacenamiento del fabricante durante un periodo superior al indicado (entre parntesis), la fecha de caducidad se determina reduciendo en la proporcin correspondiente el periodo de vigencia despus de la salida del almacenamiento del fabricante.
1043 MATERIALES AUXILIARES PARA PRODUCTOS CELULARES,

GNICOS Y DE INGENIERA TISULAR
Captulos
INTRODUCCIN
La fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular requiere de una amplia variedad de reactivos y materiales, muchos de los cuales son nicos o complejos. Estos materiales incluyen productos provenientes del plasma o del suero,
extractos biolgicos, antibiticos, citocinas, medios de cultivo, anticuerpos, matrices polimricas, dispositivos de separacin,
medios de gradiente de densidad, toxinas, medios condicionados suministrados por capas de clulas de alimentacin, sustancias qumicas puras, enzimas y soluciones amortiguadoras de procesamiento. Muchos de estos artculos se usan para asegurar la supervivencia y favorecer la proliferacin de determinadas poblaciones celulares, aunque su mecanismo de accin puede
no estar completamente elucidado. Algunos ejemplos son el suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en ingls) y diversos suplementos de medios. Otros artculos, como la toxina del clera altamente purificada, se introducen en el flujo de procesamiento
durante la fabricacin para ejercer un efecto bioqumico especfico y se eliminan por lavado inmediatamente en pasos subsiguientes del procesamiento para evitar la toxicidad posterior no deseada. Los productos biolgicos terminados elaborados en
estos procesos a menudo son mezclas complejas que, en algunos casos, no se pueden caracterizar totalmente. Es necesario
examinar cuidadosamente los materiales utilizados en la elaboracin, para evitar la introduccin de agentes adventicios o impurezas txicas, y para garantizar la mxima seguridad, eficacia y uniformidad del producto final.
En la fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular, a estos reactivos y materiales se los conoce colectivamente como materiales auxiliares (AM, por sus siglas en ingls). Los AM tambin se conocen como productos auxiliares, reactivos auxiliares, coadyuvantes del proceso ("processing aids") y reactivos de procesos. Los AM se trataron por primera vez bajo el
sinnimo de productos colaterales en la Notificacin de la Administracin de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, Application of Current Statutory Authorities to Human Somatic Cell Therapy Products and Gene Therapy Products (Reglamentacin Vigente para Productos de Terapia Celular Somtica Humana y Productos de Terapia Gnica) (Diario Oficial
58(197), 14 de octubre de 1993 ((Federal Register 58(197), Oct. 14, 1993) pginas 5324853251). Este documento estableci la autoridad de la FDA para reglamentar productos de terapia celular somtica humana y productos de terapia gnica. AM
tambin es sinnimo de materiales de proceso que fueron definidos en 21 CFR Parte 1271, Current Good Tissue Practice
for Manufacturers of Human Cellular and Tissue-based Products; Inspection and Enforcement; Proposed Rule (Buenas Prcticas
Vigentes para Fabricantes de Productos Tisulares y de Clulas Humanas; Inspeccin y Ejecucin; Norma Propuesta (Diario Oficial 66(5), 8 de enero de 2001 ((Federal Register 66(5), January 8, 2001) pginas 15081559). Los AM pueden ser anlogos a
componentes, y en algunos casos, envases segn se describe en las reglamentaciones sobre las buenas prcticas de fabricacin vigentes (cGMP, por sus siglas en ingls) para productos farmacuticos terminados segn se define en 21 CFR 211.80 a
211.94 y 211.101(b) y (c).
La propiedad que define a los AM es que no estn destinados a estar presentes en el producto final. Son materiales que se
usan como ayuda en el procesamiento y la purificacin o agentes que ejercen su efecto sobre la sustancia teraputica. Los materiales o componentes destinados a estar en la forma farmacutica del producto final (por ejemplo, materiales genticos, soportes biopolimricos, soluciones amortiguadoras fisiolgicas) no son AM. Los bancos de clulas y los bancos de virus tampoco
se consideran AM; hay una serie de guas que describen los requisitos para su certificacin. Sin embargo, los virus auxiliares y
plsmidos auxiliares se pueden considerar AM cuando no estn destinados a formar parte del producto final.
La calidad de un AM puede afectar la estabilidad, seguridad, potencia y pureza de un producto celular, gnico o de ingeniera tisular. Por ejemplo, se puede desconocer el mecanismo mediante el cual un AM ejerce su efecto y puede no comprenderse
el impacto que tiene la variacin normal de un AM sobre la calidad y seguridad del producto teraputico. Otra posibilidad es
que los AM de origen humano o animal podran presentar un riesgo de transmisin de una enfermedad infecciosa. Otros AM,
si se administran a seres humanos, pueden provocar una reaccin inmunitaria. Finalmente, un AM con propiedades txicas
que se introduzca en un proceso de fabricacin y no se elimine de manera satisfactoria en pasos subsiguientes del proceso,
expondr al paciente a una sustancia txica y puede alterar la eficacia de la entidad teraputica. Estos riesgos que afectan la
calidad y seguridad del producto teraputico frecuentemente aumentan en el caso de productos celulares, gnicos y de inge-
USP 38
Informacin General / 1043 Materiales Auxiliares 887
niera tisular, como consecuencia de la capacidad limitada de llevar a cabo pruebas exhaustivas en proceso y de liberacin. Por
ejemplo, la falta de pasos de retencin en proceso o vida til limitada pueden crear la necesidad de administrar los productos
celulares, gnicos o de ingeniera tisular antes de obtener los resultados de las pruebas en proceso o de liberacin finales. En
otros casos, la escasez de tejido donante adecuado o la compleja logstica en el transporte de materiales biolgicos puede limitar la cantidad de material disponible para efectuar pruebas. Para minimizar estos riesgos, cuando sea posible hay que implementar rigurosos procedimientos de calificacin de los materiales y aplicar con prudencia controles del proceso de fabricacin.
Con frecuencia, estos nuevos productos teraputicos se crean utilizando procesos biolgicos complicados. Los AM empleados en estos procedimientos se pueden seleccionar principalmente por sus contribuciones funcionales o efectos biolgicos especiales. Cuando sea posible, es preferible que los AM sean productos teraputicos aprobados o autorizados porque estn bien
caracterizados, poseen un perfil toxicolgico establecido y estn fabricados segn procedimientos controlados y documentados. Por otra parte, el AM puede estar destinado al uso en investigacin y por lo tanto puede carecer del nivel de calificacin
necesario para su uso en la produccin de un producto teraputico. En cada caso, el fabricante del producto celular, gnico o
de ingeniera tisular debe elaborar protocolos de calificacin amplios y cientficamente vlidos para garantizar la rastreabilidad,
consistencia, aptitud, pureza y seguridad del AM. En los casos en que los AM sean productos aprobados para su uso con fines
teraputicos, el nivel de calificacin probablemente sea menos amplio que el de un material destinado a fines de investigacin.
No obstante, an es necesario determinar su aptitud en el proceso de fabricacin cuando el AM se utiliza de forma distinta al
uso previsto o a lo indicado en el etiquetado. El propsito de este captulo es ofrecer una gua para elaborar programas de
calificacin apropiados para AM que se empleen en la fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular.
CALIFICACIN DE MATERIALES AUXILIARES
Identificacin
El primer paso de cualquier programa de calificacin es listar todos los AM que se emplean en la fabricacin de un producto
determinado e indicar en qu parte del proceso de fabricacin se van a utilizar. Se debe establecer el origen y el uso previsto
de cada material y se debe determinar la cantidad o concentracin necesaria de cada material. Adems se deben identificar
fuentes alternativas de cada material.
Seleccin y Aptitud para el Uso

Quienes desarrollan productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular deben establecer y documentar los criterios de seleccin de AM y los criterios de calificacin para cada proveedor al principio de la fase de diseo del desarrollo del producto. Los
criterios de seleccin deben incluir evaluaciones de pureza microbiolgica y qumica, identidad y actividad biolgica pertinentes al proceso de fabricacin especfico. Es importante abordar estos temas al principio del desarrollo del producto porque la
calificacin de ciertos AM, que inicialmente pueden ser considerados necesarios, puede ser imposible o demasiado costosa,
justificando de este modo la investigacin de productos alternativos o sustitutos. Entre los ejemplos se encuentran algunos materiales de origen animal o humano que en algunos casos tienen fuentes alternativas (como por ejemplo, de origen vegetal o
por sntesis qumica).
Los AM de origen animal o humano se deben seleccionar cuidadosamente debido a los posibles riesgos de enfermedades
infecciosas o zoonticas asociadas a estos materiales. Hay que seleccionar proveedores que puedan proporcionar documentacin sobre el pas de donde provienen los AM de origen animal para responder a las inquietudes respecto a la encefalopata
espongiforme bovina y otras enfermedades de inters agrcola, como tuberculosis y brucelosis. En muchos casos, se debe documentar la cadena de custodia de los AM de origen animal (es decir, matadero centro de procesamiento intermedio
Captulos
La calificacin es el proceso de obtener y evaluar datos para establecer el origen, la identidad, la pureza, la seguridad biolgica y la aptitud general de un AM especifico. La responsabilidad de la calificacin del AM recae en quien desarrolla o fabrica el
producto celular, gnico o de ingeniera tisular. Esta seccin resume a grandes rasgos las bases para que un fabricante pueda
establecer programas razonables y cientficamente vlidos para calificar los AM, aunque la amplia naturaleza de los productos
celulares, gnicos y de ingeniera tisular, al igual que la de los AM empleados para producir estos productos hacen difcil recomendar pruebas o protocolos especficos para un programa de calificacin. La documentacin completa y rigurosa es la piedra
angular de cualquier programa de calificacin.
Un programa de calificacin bien diseado se torna ms amplio a medida que progresa el desarrollo del producto. En las
primeras etapas de desarrollo del producto, el enfoque principal es respecto a la seguridad. En las etapas posteriores, se deben
desarrollar actividades de produccin y calificacin del AM en forma amplia para respaldar la consiguiente concesin de la licencia del producto celular, gnico o de ingeniera tisular. En algunas ocasiones, es posible que no hayan proveedores de sustancias complejas o nicas que han demostrado ser esenciales para el control del proceso o la produccin y que las producen
de conformidad con las cGMP. En estas situaciones, el fabricante debe elaborar una estrategia cientficamente vlida para la
calificacin. Un programa de calificacin para los AM que se utilicen en la fabricacin de productos celulares, gnicos y de
ingeniera tisular debe cubrir los siguientes aspectos: (1) identificacin, (2) seleccin y aptitud para usarlos en la fabricacin,
(3) caracterizacin, (4) calificacin del proveedor y (5) control y garanta de calidad.
Captulos
888 1043 Materiales Auxiliares / Informacin General
USP 38
centro de procesamiento final). Los proveedores de AM de origen humano deben poder proporcionar documentacin respecto a la rastreabilidad del material. Por ejemplo, los AM obtenidos de plasma humano deben provenir de establecimientos autorizados que controlen el conjunto de donantes y examinen a los donantes individuales para verificar que no padezcan enfermedades infecciosas humanas importantes. En algunos casos, los proveedores de AM de origen animal y humano suministran
diferentes categoras de materiales, siendo algunas ms adecuadas para usar en la fabricacin de productos celulares, gnicos y
de ingeniera tisular que otras categoras. Por ejemplo, se puede obtener FBS que haya sido procesado para reducir el riesgo de
contaminacin viral bovina sometindolo a procesos validados de irradiacin y nanofiltracin. Adems, muchos componentes
obtenidos de animales y de plasma humano se someten a tratamientos qumicos (tratamiento con detergentes o disolventes) o
fsicos (exposicin al calor durante perodos prolongados) que, mediante exhaustivos estudios de validacin, han demostrado
reducir significativamente el riesgo de contaminacin microbiana o viral adventicia asociada a los AM iniciales. Se prefiere utilizar dichos AM en procesos de fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular porque reducen significativamente los riesgos asociados al material original.
Se puede reducir la complejidad de la evaluacin del riesgo mediante el empleo de uno de varios mtodos cuantitativos o
semicuantitativos, como el anlisis de los efectos en modo de falla (FMEA, por sus siglas en ingls), el despliegue de la funcin
de calidad (QFD, por sus siglas en ingls), o el anlisis de riesgos y punto crtico de control (HACCP, por sus siglas en ingls).
Estos programas generalmente asignan un valor puntual a cada parmetro de riesgo de un AM, que da como resultado puntajes acumulativos que facilitan darle prioridad al esfuerzo y los recursos para disminuir los riesgos asociados a los AM. Por ejemplo, un AM que tenga un fuerte perfil de seguridad y se utilice en cantidades mnimas en los pasos iniciales del proceso de
fabricacin y se lave minuciosamente para eliminarlo del sistema acumula un puntaje bajo. Por el contrario, un AM que se sepa
que es txico y se emplee en las etapas finales del proceso presenta ms posibilidades de aparecer como residuo en el producto final y se le debe asignar un puntaje ms alto. Tambin se pueden asignar puntos segn la clasificacin del riesgo (ver
Clasificacin del Riesgo).
Caracterizacin
Es necesario desarrollar o adoptar e implementar pruebas especficas de caracterizacin de control de calidad para cada AM.
El conjunto de pruebas para cada AM debe evaluar diversos atributos de calidad, entre los que se incluyen la identidad, pureza, funcionalidad y ausencia de contaminacin microbiana o viral. El nivel de prueba apropiado para cada AM proviene de su
perfil de evaluacin de riesgos y del conocimiento obtenido durante el desarrollo. Se deben establecer especificaciones de
prueba para cada AM, para asegurar la uniformidad y el funcionamiento del proceso de fabricacin. Los criterios de aceptacin
se deben establecer y justificar sobre la base de datos obtenidos a partir de lotes utilizados en estudios preclnicos y estudios
clnicos iniciales, de lotes empleados para demostrar la uniformidad de la fabricacin y de datos pertinentes del desarrollo, como los que surgen del desarrollo de procedimientos analticos y estudios de estabilidad.
Algunos AM de naturaleza biolgica pueden ser difciles de caracterizar totalmente. Como estos materiales ejercen su influencia a travs de acciones biolgicas complejas y las pruebas bioqumicas pueden no predecir el desempeo de los AM en el
proceso, puede ser necesario realizar pruebas funcionales o de desempeo. La variabilidad en el desempeo de dichos materiales puede tener un efecto perjudicial sobre la potencia y la uniformidad del producto teraputico final. Algunos ejemplos de
pruebas complejas de funcionalidad de los AM son las pruebas de promocin del crecimiento de lotes individuales de FBS en la
lnea celular utilizada en la fabricacin, pruebas de desempeo de preparaciones de enzimas digestivas y valoraciones in vitro
de citotoxicidad en cultivo de tejidos (ver aspectos de Pruebas de Desempeo).
Calificacin del Proveedor

Se debe calificar a los proveedores de AM lo antes posible. Una auditora temprana de las instalaciones de fabricacin del
proveedor, incluyendo sus GMP y su programa de prueba de AM, son elementos bsicos de un programa de calificacin de un
proveedor. Para poder considerar confiable a un proveedor es esencial revisar los procedimientos de procesamiento y del programa de documentacin del proveedor. Adems, los proveedores certificados por medio de un programa de inspeccin ISO
o auditados por otros organismos gubernamentales suelen contar con sistemas de calidad robustos. Los informes de auditoras
anteriores de proveedores de EE.UU. obtenidos a travs de la Ley de Libertad de Informacin (FOI, por sus siglas en ingls)
pueden mejorar el proceso de calificacin.
Es importante establecer una buena relacin de trabajo con un proveedor. En algunos casos, el proveedor puede ofrecer
normas de fabricacin ms exigentes, servicios de formulacin de acuerdo a las especificaciones del cliente o sustitucin de
componentes de calidad inferior previa solicitud, con o sin costos adicionales. Una buena relacin es esencial si se justifica una
investigacin ms extensa de proveedores de AM. Adems es crtico asegurar que el proveedor tome las medidas correspondientes para evitar la contaminacin cruzada entre sus productos durante la fabricacin. Los proveedores deben estar familiarizados con los principios de validacin, especialmente la validacin de limpieza, al igual que la validacin de inactivacin viral y
la validacin de esterilizacin. Finalmente, se deben establecer sistemas para que los proveedores suministren a los clientes certificacin por escrito de cambios de procesamiento o de origen, mucho antes de la puesta en prctica de los cambios, de modo que los clientes puedan evaluar sus consecuencias posibles.
USP 38
Control de Calidad y Garanta de Calidad

Como los componentes del programa de calificacin tienen varios aspectos y deben cumplir con las cGMP, deben ser controlados por una unidad de garanta de calidad y control de calidad (QAU, por sus siglas en ingls). Las acciones tpicas de
QAU comprenden los siguientes sistemas o programas: (1) recepcin de entrada, separacin, inspeccin y liberacin de materiales antes de su uso en la fabricacin, (2) auditora y certificacin del proveedor, (3) pruebas de verificacin del certificado de
anlisis, (4) polticas y procedimientos formales para materiales que no cumplen con las especificaciones, (5) prueba de estabilidad y (6) almacenamiento de muestras de archivo.
CLASIFICACIN DEL RIESGO
1 La mayora de los proveedores realizan pruebas para detectar agentes adventicios de conformidad con 9 CFR 113, establecido por el Centro de Productos Biolgicos Veterinarios, Servicio de Inspeccin Sanitaria Animal y Vegetal (Center for Veterinary Biologics, Animal and Plant Health Inspection Service) del Departamento
de Agricultura de Estados Unidos. Estas pruebas pueden diferir de las utilizadas para analizar productos desarrollados para uso humano (por ejemplo, micoplasma).
Captulos
Se debe crear un programa de calificacin racional y cientficamente vlido para cada AM, que tome en cuenta su origen y
los procesos empleados en su fabricacin. Cuando estn disponibles, se prefieren los AM que sean productos teraputicos
aprobados o autorizados porque estn bien caracterizados con un perfil toxicolgico probado y estn fabricados segn procedimientos controlados y documentados. Los productos biolgicos autorizados, frmacos aprobados y dispositivos mdicos o
materiales implantables aprobados o autorizados que han sido incorporados en procesos de fabricacin de productos celulares, gnicos o de ingeniera tisular presentan un perfil de seguridad conocido o ms favorable para el paciente que las versiones no aprobadas o no autorizadas. Los programas de calificacin para estos AM deben reflejar la inspeccin amplia y minuciosa de estos artculos durante su desarrollo y fabricacin. En consecuencia, se debe poner mayor nfasis en la investigacin del
impacto de la variabilidad inherente de estos AM sobre la funcin del producto final. Por ejemplo, un fabricante puede utilizar
seroalbmina humana, destinada a ser administrada a seres humanos, como suplemento para un medio de cultivo celular para
un producto celular. Debido a que el producto celular se comercializa como un producto biolgico autorizado, no es necesario
repetir todas las pruebas realizadas por el proveedor como parte de la calificacin del material. Por otra parte, el efecto de la
variabilidad de un lote a otro sobre la velocidad de crecimiento celular o el mantenimiento de una propiedad celular diferenciada puede ser una rea de investigacin aconsejable. Como alternativa, la estabilidad de este material a la concentracin empleada en el procesamiento o su potencial de interaccin con otros componentes del proceso, tambin pueden ser reas que
vale la pena investigar. En consecuencia, estos criterios respecto a la calificacin de AM se concentran en los AM como una
fuente potencial de variabilidad que puede influir en la potencia y seguridad del producto final. Los programas de calificacin
para estos AM deben ser amplios para minimizar el riesgo al consumidor y garantizar la deteccin de lotes inaceptables o adulterados.
El programa de calificacin tambin debe tener en cuenta la cantidad de AM empleado en la fabricacin, al igual que su
punto de introduccin en el proceso de fabricacin. Un ejemplo pertinente es el uso de FBS como suplemento de un medio de
cultivo de tejidos empleado para aumentar una poblacin de clulas madre de un tejido especfico para su eventual administracin a un paciente (ver Perspectiva General de la Fabricacin en Productos de Terapia Gnica y Celular 1046). Un programa
de calificacin para tal AM debe incluir (a) la garanta de que el suero proviene de un pas o regin que est libre de encefalopata espongiforme bovina (BSE, por sus siglas en ingls); (b) la garanta de que el ganado de origen se controla y que los
resultados de las pruebas de deteccin de enfermedades importantes en el correspondiente entorno agrcola son negativos
(por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, fiebre aftosa); (c) el anlisis del suero para verificar su esterilidad, detectar micoplasma,
contenido de endotoxinas y virus adventicios bovinos vinculados a este material;1 (d) la revisin y archivo del certificado de
anlisis del fabricante; (e) la evaluacin entre lotes de la aptitud del suero para aumentar de manera uniforme una poblacin
celular representativa utilizando una valoracin de control de calidad estandarizada para el cultivo de clulas; y (f) la auditora
del proveedor en su establecimiento para asegurar que la proveniencia y el procesamiento del material sean aceptables segn
una unidad QA responsable.
Para ayudar a los fabricantes y a aquellos que desarrollan el producto en el diseo de sus programas de calificacin para una
variedad de AM, en las Tablas 14 se presentan niveles de categoras de riesgo de muestra, que se proporcionan como una
gua. El riesgo tambin depende de la cantidad y la etapa en la que se usa el AM en el proceso de fabricacin. Las Tablas 14
no consideran el efecto de la cantidad ni la etapa de uso.
Nivel 1Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales altamente calificados muy adecuados para usar en la fabricacin. El AM es un producto biolgico, un frmaco aprobado, un dispositivo mdico aprobado o autorizado o est destinado al
uso como material biolgico implantable. En general, estos componentes o materiales se obtienen como un sistema de envasado estril o forma farmacutica para el uso que se indica en su etiqueta, pero en vez de esto se emplean para un uso no
indicado en la etiqueta en el proceso de fabricacin del producto celular, gnico o de ingeniera tisular.
Nivel 2Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales bien caracterizados y muy adecuados para usar en la fabricacin. Estn destinados para usarse en la fabricacin de frmacos, productos biolgicos o dispositivos mdicos, incluyendo los
productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular como AM, y se producen con las cGMP pertinentes. La mayora de materiales de origen animal estn excluidos de esta categora.
USP 38
Captulos
Nivel 3Estos AM son materiales que presentan un riesgo moderado y que requieren un nivel ms alto de calificacin que
los anteriores. Frecuentemente, se producen para uso diagnstico in vitro y no estn destinados a la produccin de productos
celulares, gnicos o de ingeniera tisular. En algunos casos, puede ser necesario mejorar los procesos de fabricacin del AM
para emplearlo en la fabricacin de estos productos (por ejemplo, modificacin del proceso de produccin de un anticuerpo
monoclonal de grado diagnstico para incluir pasos robustos de eliminacin de virus en la purificacin).
Nivel 4Este es el mayor nivel de riesgo de AM. Es necesario efectuar una exhaustiva calificacin antes de emplearlos en la
fabricacin. El material no se produce de conformidad con las cGMP. Los AM no estn destinados para la produccin de productos celulares, gnicos o de ingeniera tisular. Este nivel de riesgo comprende sustancias txicas con mecanismos biolgicos
de accin conocida y tambin incluye materiales lquidos ms complejos, de origen animal, que no se someten a procedimientos de eliminacin o inactivacin de virus adventicios. Estos materiales pueden requerir (a) un mejoramiento de los procesos de
fabricacin del AM; (b) tratamiento del AM para inactivar o eliminar agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes especficos (por ejemplo, priones, virus animales); (c) anlisis de cada lote de material para asegurar la
ausencia de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes especficos; (d) validacin del proceso
de fabricacin del producto celular, gnico o de ingeniera tisular para evaluar la uniformidad en la eliminacin de una sustancia txica conocida o pruebas de liberacin de lote capaces de demostrar niveles de reduccin seguros; o (e) validacin del
proceso de fabricacin del producto celular, gnico o de ingeniera tisular para evaluar la uniformidad en la eliminacin o inactivacin de agentes adventicios, sustancias causantes de enfermedades o contaminantes especficos asociados al material. Los
encargados de desarrollar el producto deben evaluar en las etapas iniciales de desarrollo la necesidad de estos materiales e
investigar sustancias o fuentes alternativas.
Tabla 1. Riesgo del AM Nivel 1
Materiales de Riesgo Bajo, Altamente Calificados, Destinados a Usarse como Frmaco Teraputico o Producto Biolgico,
Dispositivo Mdico o Material Implantable
Ejemplo
Uso Comn en la Fabricacin de

Productos Celulares, Gnicos
y de Ingeniera Tisular
Insulina recombinante para inyeccin
Aditivo para medio de cultivo de clulas
Lquido conservador de rganos
Lquido biolgico de proceso empleado en el

transporte o procesamiento de tejidos
Seroalbmina humana para inyeccin
Medio de cultivo de clulas
Lquidos estriles para inyeccin
Lquido biolgico de proceso empleado en transporte de tejidos, procesamiento de clulas, purificacin
Materiales biolgicos implantables (estructuras de

colgeno formado, silicona, poliuretano destinadas a implantacin quirrgica)
Armazones, matrices para cultivo de clulas inmovilizadas
Desoxirribonucleasa recombinante para inhalacin

o inyeccin
Enzima de proceso empleada en la fabricacin de

vectores virales, procesamiento de clulas madre
Antibiticos para inyeccin3
Aditivo de lquido de transporte de medio de cultivo celular y biopsia para reducir el riesgo de contaminacin bacteriana
Anticuerpos monoclonales inyectables
Accin inmunolgica dirigida a poblaciones celulares especficas para su seleccin o eliminacin
Citocinas inyectables
Medio de cultivo de clulas
Vitaminas para inyeccin; nutrientes, sustancias

qumicas o excipientes definidos para inyeccin
Aditivo de medio de cultivo de clulas empleado

en la expansin de clulas, la diferenciacin celular controlada y pasos de activacin o fabricacin
de un vector viral
Bolsas IV, tuberas y equipos de transferencia, bolsas para crioconservacin, jeringas, agujas
Sistemas de cierre de recipientes de almacenamiento, sistemas cerrados de transferencia asptica
1
2
Acciones de
Calificacin o Reduccin del Riesgo
Referencia cruzada del DMF (cuando sea
posible o prctico)
Certificado de anlisis
Evaluar el efecto de un lote a otro sobre el
funcionamiento del proceso1
Evaluar la eliminacin en el producto final
Evaluar la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usar en la fabricacin2
Ver Pruebas de Desempeo.

A menudo los AM se conservan en alcuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservacin de la actividad del AM en las
condiciones que sean especficas a su uso en la fabricacin.
3 No se deben usar antibiticos beta lactmicos como AM, debido al riesgo de hipersensibilidad del paciente.
USP 38

Materiales de Riesgo Bajo, Bien Caracterizados, Destinados a Usarse como AM, Producidos de Conformidad con las GMP
Ejemplo
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas1
Uso Tpico en la Fabricacin

de Producto Celular, Gnico
o de Ingeniera Tisular
Aditivo de medio de cultivo de clulas
Acciones de Calificacin o
Reduccin del Riesgo
posible o prctico)
Separacin inmunomagntica de clulas
Evaluacin del efecto de un lote a otro sobre el funcionamiento del proceso2
Progesterona, estrgeno, vitaminas, sustancias qumicas purificadas (grado USP)
Aditivos de medio de cultivo de clulas, agentes de

induccin, componentes de soluciones amortiguadoras
Evaluacin de la eliminacin en el producto

final
Soluciones amortiguadoras para procesos estriles

transporte de tejidos, procesamiento de clulas,
purificacin
Evaluacin de la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usarse en la fabricacin3
Polmeros, armazones e hidrogeles biocompatibles
Cuando sea pertinente, confirmar los resultados de la prueba del certificado de anlisis que sean esenciales para el producto
(podra incluir la valoracin funcional)
Enzimas proteolticas
Enzima de proceso
Auditora al proveedor
Medios de cultivo de tejidos
Anticuerpos monoclonales
Medios de gradiente de densidad
Separacin de clulas por centrifugacin
Estos AM se deben producir a partir de fuentes recombinantes, que no sean de mamferos (es decir, desarrollados microbiolgicamente en ausencia de componentes de origen animal en los medios de cultivo).
2 Ver Pruebas de Desempeo.
3 A menudo los AM se conservan en alcuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservacin o actividad del AM bajo las

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente producidos para su uso en diagnstico in vitro o materiales grado reactivo)
Ejemplo
Factores de crecimiento recombinantes, citocinas

de Productos Celulares, Gnicos o de
Ingeniera Tisular
Reduccin del Riesgo
posible o prctico)
Evaluacin del efecto de un lote a otro sobre el funcionamiento del proceso1
Evaluacin de la eliminacin en el producto
final
Evaluacin de la estabilidad del AM mientras se almacena antes de usarse en la fabricacin2
Cuando sea pertinente, confirmar los resultados del certificado de anlisis que sean
esenciales para el producto (podra incluir
la valoracin funcional)
Medios de cultivo de tejidos
Auditora al proveedor
Anticuerpos monoclonales (de grado diagnstico

producidos en cultivo de clulas)
Mejorar el proceso de fabricacin del material segn las GMP
Soluciones amortiguadoras de proceso

transporte de tejidos, procesamiento celular, purificacin
Elaborar especificaciones internas estrictas
Nuevos polmeros, armazones, hidrogeles
1
2
Determinar si son necesarias las pruebas de

biocompatibilidad, citotoxicidad o deteccin de agentes adventicios, de un lote a
otro

A menudo los AM se conservan en alcuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservacin o actividad del AM bajo las
Captulos
Perlas inmunomagnticas
Suero humano AB
USP 38

Materiales de Riesgo Moderado, No Destinados a Usarse como AM
(frecuentemente producidos para su uso en diagnstico in vitro o materiales grado reactivo) (Continuacin)
Ejemplo

de Productos Celulares, Gnicos o de
Ingeniera Tisular
Enzimas proteolticas
Enzima de proceso
Sustancias qumicas purificadas (grado reactivo)
Aditivos de medio de cultivo, agentes de induccin, componentes de soluciones amortiguadoras
Reduccin del Riesgo
1
2

A menudo los AM se conservan en alcuotas o se almacenan en diferentes concentraciones, en distintas soluciones amortiguadoras o bajo condiciones diferentes a las establecidas en la etiqueta o validadas previamente. Hay que generar datos que demuestren la estabilidad y conservacin o actividad del AM bajo las

Materiales de Alto Riesgo
Captulos
Ejemplo
Uso Tpico en un Producto Celular, Gnico,

o de Ingeniera Tisular
FBS
Extractos de origen animal (incluyendo humano)
Polmeros, armazones e hidrogeles de origen animal
Enzimas purificadas
Enzima de proceso
Anticuerpos o protenas derivados de ascitis
Clulas humanas o animales utilizadas como capas

de alimentacin
Sustrato de cultivo de clulas o fuente de componentes de medios
Entidades qumicas con toxicidad conocida (p.ej.

Agentes de seleccin utilizados en cultivo de clumetotrexato, toxina de clera, hemolisina formalas para mejorar o mantener la expresin transgdora de poros de Staphylococcus aureus; enterotonica, aumentar la proliferacin celular, mejorar la
xinas A y B de Staphylococcus, toxina del sndrome supervivencia celular durante la crioconservacin,
de shock txico)
superantgenos para la activacin de linfocitos T
Reduccin del Riesgo
Igual que en Tabla 3, ms
Verificar la rastreabilidad al pas de origen

Asegurar que el pas de origen est calificado como seguro con respecto a enfermedades animales pertinentes a la fuente, incluida TSE (por sus siglas en ingls)
Pruebas de deteccin de agentes adventicios para detectar virus pertinentes a la
fuente de origen animal
PRUEBA DE DESEMPEO
En los casos en que los AM se eligen por su capacidad para proporcionar una cierta funcin biolgica en la elaboracin del
producto teraputico, la prueba de desempeo se torna un componente fundamental de su calificacin general. Esto es particularmente cierto cuando el AM desempea un papel crtico en la modulacin de un efecto bioqumico complejo y ejerce un
gran impacto sobre el rendimiento de la fabricacin del producto, su pureza o la potencia del producto final. Estos AM tienden
a ser sustancias o mezclas complejas, frecuentemente de origen biolgico y pueden presentar gran variabilidad entre lotes.
Como resultado, estos AM en general no tienen una prueba de identidad simple, ni pueden ser fcilmente caracterizados por
pruebas fsicas o qumicas. El desarrollo de valoraciones de desempeo bien definidas para AM complejos no slo asegura la
reproducibilidad del proceso y la calidad del producto final, sino que en muchos casos tambin cumple con los criterios de
pruebas de identidad conforme a 21 CFR 211.84(d).
En algunos casos, la calificacin inicial de un AM para usarse en la fabricacin debe ser la investigacin del efecto que tiene
la cantidad del AM sobre la respuesta deseada (aumento del rendimiento, pureza o potencia del producto teraputico). La
cantidad de AM empleada en la fabricacin debe ser seleccionada para que produzca el efecto deseado de manera uniforme, a
la vez que minimice los problemas mediante la eliminacin del AM en los pasos subsiguientes del procesamiento. Dicha prueba a menudo evala el atributo funcional importante que se espera del AM en un proceso de fabricacin a escala reducida o
simulado. A continuacin se indican algunos ejemplos:
Si un AM se agrega a los medios de cultivo porque favorece la proliferacin celular o la secrecin de un agente teraputico esencial, la valoracin podra demostrar que cada lote de AM produce la velocidad o cantidad esperada de proliferacin celular o el nivel esperado de agente teraputico segregado.
Si se usa un anticuerpo monoclonal para purificar un cierto tipo de clula, se podra demostrar que el nuevo lote de anticuerpo monoclonal purifica la poblacin celular con la recuperacin y pureza esperada para el tipo de clula deseado.
Si se usa una desoxirribonucleasa para descomponer el ADN celular, se podran analizar los nuevos lotes para verificar la
capacidad de la desoxirribonucleasa para descomponer el ADN.
Si se usa un tipo especial de gradiente de densidad para purificar un vector o clula, se podra demostrar que los nuevos
lotes del material utilizado para obtener el gradiente pueden purificar el vector o clula hasta un grado satisfactorio.
Si se usa un plsmido o vector viral en la produccin de un vector de terapia gnica (por ejemplo, funcin auxiliar), se
podra demostrar que los nuevos lotes del vector auxiliar producen las cantidades esperadas del vector de terapia gnica.
Si se produce terapia celular en un biorreactor de fibra hueca, se podra demostrar que los nuevos lotes del biorreactor
producen la cantidad prevista de producto celular.
USP 38
La valoracin usada podra evolucionar a medida que el proceso de fabricacin se desarrolla y las relaciones crticas entre el
AM y el producto final se comprendan mejor.
Debido a que la mayora de las pruebas de desempeo producen resultados relativos, a menudo resulta til valorar un lote
nuevo de AM conjuntamente con un lote aprobado de AM o un estndar de referencia oficial, si se dispone de alguno. La
comparacin simultnea ayuda a reducir la variabilidad debida a diferentes lotes de clulas o vectores y ayuda a distinguir la
variabilidad asociada a los diferentes lotes de AM. Si la prueba de desempeo implica valoraciones para demostrar que el nuevo lote de AM no afecta el perfil de impurezas del producto teraputico final, ya sea generando nuevas impurezas o aumentando el nivel de impurezas existentes, es til valorar ambos respecto al nivel de impurezas totales, al igual que buscar la presencia
de nuevas impurezas. Un anlisis de inmunodeteccin en general puede evaluar solamente el nivel de impurezas totales. Por
ejemplo, un Western blot del producto de terapia gnica que se investiga tanto con anticuerpos del producto como con anticuerpos de protenas de clulas anfitrionas, es til para detectar nuevas especies de protenas y aumentos significativos de los
niveles de impurezas de las clulas anfitrionas. Esta calificacin inicial se incrementa por medio de una valoracin de desempeo que tiene una lectura cuantitativa con un cambio marcado en la seal cuando se introduce en la valoracin un cambio
importante en la cantidad de AM (por ejemplo, respuesta de dosis). Una respuesta tipo umbral (es decir, hay dos niveles de
respuesta para el AM y la respuesta no cambia ni con cambios grandes en el AM por debajo de una dosis determinada ni por
encima de una dosis determinada) puede hacer ms difcil seleccionar una concentracin de AM que d como resultado el
efecto deseado de manera uniforme y minimice los niveles residuales del AM en el producto teraputico final.
EVALUACIN Y ELIMINACIN DEL NIVEL RESIDUAL DE MATERIALES AUXILIARES

Captulos
Los AM no estn destinados a estar presentes en la forma farmacutica final en los productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular. Su presencia en el producto final podra provocar efectos indeseables en la persona que los reciba o tener un efecto
perjudicial en la potencia del producto. Los efectos indeseables en seres humanos consisten en la toxicidad directa del AM o en
una respuesta inmunognica no deseada. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente:
Al generar una vacuna contra un tumor utilizando una biopsia de tumor de un paciente como material inicial, se introduce una entidad qumica para desnaturalizar las protenas de la superficie celular y los antgenos del tumor para aumentar
su antigenicidad. Se sabe que la entidad qumica es muy txica.
Se pueden agregar antibiticos a una solucin de transporte para clulas humanas para contrarrestar la contaminacin
microbiana asociada con el procedimiento de obtencin. Los niveles residuales del antibitico pueden afectar la capacidad de proliferacin del producto celular final producido por bioingeniera. Los antibiticos residuales tambin pueden
provocar una respuesta anafilctica en algunos individuos.
El FBS, empleado en el cultivo de un injerto de piel humana realizado mediante bioingeniera, puede provocar una respuesta de anticuerpos humorales contra las protenas bovinas.
Las inmunoglobulinas aglomeradas de ratn, una traza de impureza en una preparacin purificada de anticuerpo monoclonal de ratn dirigido contra una poblacin celular para inmunoseleccin, pueden ser inmungenas.
Una citocina empleada como inmunomodulador en la creacin de una vacuna autloga contra tumores producida por
modificacin gnica, puede provocar una reaccin grave en el receptor.
La toxina del clera, empleada como parte de un medio de cultivo celular para un producto de terapia celular destinado a
la administracin intravenosa, resultar sumamente txica para el receptor si no se elimina durante el procesamiento.
Estos riesgos se pueden mitigar si se disean procesos que incluyen pasos de eliminacin satisfactoria del AM, mediante dilucin, separacin o inactivacin, y se desarrollan valoraciones de deteccin analtica para evaluar los niveles de AM durante el
procesamiento y en el producto teraputico final. Las estrategias de evaluacin y eliminacin de AM residuales se deben considerar en las fases iniciales del desarrollo del proceso. Hay dos mtodos diferentes para evaluar los niveles de AM residual en el
producto teraputico final: (1) Los estudios de validacin pueden demostrar que el proceso es capaz de eliminar ms del AM
de lo que estara presente en el peor caso hipottico. (2) Los niveles residuales de un AM se pueden medir en cada lote en un
paso apropiado durante el proceso de fabricacin.
La validacin de un AM con frecuencia se realiza mejor agregando al producto impuro con el peor caso o niveles superiores de AM y demostrando que el proceso de purificacin es capaz de eliminar el AM hasta niveles no detectables. De este
modo se pueden generar factores de depuracin para cada paso de purificacin de manera anloga a la realizada en estudios
de depuracin viral. Al disear los estudios de validacin se deben incluir los tres factores siguientes: (1) La valoracin debe ser
capaz de cuantificar con exactitud el AM en cada matriz de muestra. (2) Si la validacin se lleva a cabo a una escala menor que
la utilizada en la produccin de lotes de rutina, es necesario demostrar la comparabilidad entre este proceso en pequea escala
y el proceso completo. En general esto significa que el proceso en pequea escala se realiza con los mismos parmetros crticos
que el proceso completo y que el producto generado en cada paso tiene una pureza y rendimiento similares. (3) Igual que con
cualquier tipo de estudio con muestras adicionadas, se debe demostrar que el nivel adicional ms alto de AM no ha afectado el
proceso de purificacin. Si se emplea el segundo mtodo de medicin de niveles residuales de AM en cada lote, la especificacin de la cantidad mxima de AM en el producto teraputico final se basa en la cantidad de AM en los lotes utilizados en
estudios toxicolgicos o clnicos o en datos toxicolgicos conocidos.
El desarrollo de valoraciones analticas sensibles y reproducibles para AM es otro componente importante de un mtodo de
reduccin del riesgo. Dos tipos de valoraciones son tiles en la evaluacin de los niveles de impurezas residuales de AM: una
prueba lmite y una prueba cuantitativa. Ambas pruebas deben ser exactas, precisas, robustas y tener un lmite de deteccin
USP 38
Captulos
bajo. Se pueden llevar a cabo valoraciones para detectar AM residuales en el producto antes de formularlo (por ejemplo, en el
frmaco) para evitar cualquier tipo de interferencia de los componentes empleados en la formulacin con la valoracin de AM
residuales o en el producto farmacutico final. En dichas valoraciones a menudo se incluyen controles de recuperacin de cantidades agregadas conocidas para demostrar que la matriz de muestra no inhibe la deteccin del AM. Preferentemente, las
valoraciones se deben disear para que detecten todas las formas de AM, entre las que se incluyen aglomerados, fragmentos o
conjugados. Se ha demostrado que las protenas aglomeradas son especialmente inmungenas.
Las valoraciones inmunolgicas como ELISA son las ms comnmente usadas para evaluar niveles residuales de AM. Se ha
empleado un ELISA para seroalbmina bovina (BSA) para evaluar niveles residuales de FBS. La tecnologa de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls), se ha utilizado para evaluar los niveles residuales de ADN de clulas anfitrionas. El marcado de clulas con 3H timidina o la ejecucin de PCR para una secuencia gnica especfica de clulas de soporte
son dos maneras de evaluar los niveles residuales de clulas de soporte. Si el lavado del AM se logra mediante una minuciosa
dilucin asociada a otras acciones de procesamiento, puede resultar til calcular el factor de dilucin para el AM durante este
proceso. En algunos casos, es suficiente asegurar que el AM se redujo a niveles seguros para el desarrollo clnico inicial. Durante el desarrollo clnico posterior se deben obtener datos que permitan confirmar la eliminacin por lavado del AM en los pasos
esperados. Este mtodo es particularmente til cuando ya se conocen los niveles teraputicos y la toxicidad del AM. En otros
casos, se debe obtener informacin sobre la seguridad y tolerancia del AM (en estudios preclnicos de toxicologa o posteriormente con estudios clnicos en seres humanos) para determinar los niveles seguros o no txicos que se deben lograr. Estos
datos pueden ser necesarios incluso para un AM que est aprobado para usar con fines teraputicos si se va a utilizar de una
forma diferente a la que establece su uso indicado o su etiquetado o si la va de administracin o nivel de dosificacin del AM
puede presentar riesgos que previamente no se han encontrado o considerado.
CONCLUSIN
Si bien se emplean muchos tipos de AM durante la fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular, se les
ha dado menos importancia que a los productos finales. Sin embargo, no se puede exagerar la importancia de la calidad del
AM para la calidad del producto final. Las diferentes partidas de AM de buena calidad deben cumplir uniformemente con las
caractersticas de desempeo indicadas, si se seleccionan cuidadosamente y se usan como corresponde. Los AM de calidad
insuficiente afectan la calidad y la eficacia del producto final y ponen en peligro la salud de los pacientes. En consecuencia, la
implementacin de un programa de calificacin de AM que considere los riesgos asociados al AM, la etapa de fabricacin en la
que se use y la cantidad de AM utilizado durante la fabricacin, asegurar la seguridad y eficacia del producto final.
APNDICE
Los AM utilizados en productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular se regularn en el contexto del proceso de fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular. Algunos AM pueden ya estar aprobados para usos diferentes a la
fabricacin de productos celulares, gnicos y de ingeniera tisular. Se prefiere obtener AM que sean productos teraputicos
aprobados cuando estn disponibles porque estn bien caracterizados con un perfil toxicolgico establecido y fabricados segn procedimientos controlados y documentados. La siguiente lista de documentos ofrece una gua normativa pertinente y
una descripcin de las mejores prcticas en el desarrollo de productos y procesos, fabricacin, control de calidad y garanta de
calidad:
Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87
Artculos Obtenidos por Biotecnologa 1045
Productos de Terapia Gnica y Celular 1046
Artculos Obtenidos por BiotecnologaAnlisis de Aminocidos 1052
Electroforesis Capilar 1053
Artculos Obtenidos por BiotecnologaIsoelectroenfoque 1054
Artculos Obtenidos por BiotecnologaMapeo de Pptidos 1055
Artculos Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida 1056
Artculos Obtenidos por BiotecnologaValoracin de Protenas Totales 1057
21 CFR 211 Subparte E, 211.80 a 211.94 y 211.101
21 CFR 312
21 CFR 314
21 CFR 801.109 (b) (1)
21 CFR 807.81 a 21 CFR 807.97
21 CFR 812
21 CFR 814
Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) Draft Guidance for Monoclonal Antibodies Used as Reagents in Drug Manufacturing (1999)
Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA (CBER) Points to Consider in the Characterization of Cell Lines
Used to Produce Biologicals (1993)
USP 38
Informacon General / 1044 Crioconservacin de Clulas 895
Center for Devices and Radiological Health de la FDA (CDRH) Class II Special Controls Guidance Document: Tissue
Culture Media for Human ex vivo Tissue and Cell Culture Processing Applications; Final Guidance for Industry and FDA
Reviewers (16 de mayo de 2001)
CDRH Blue Book Memorandum G95-1
ISO 10993-1: 1997 Evaluacin Biolgica de Dispositivos MdicosParte 1: Evaluacin y Anlisis Biological Evaluation of
Medical DevicesPart 1: Evaluation and Testing
Conferencia Internacional de Armonizacin (ICH, por sus siglas en ingls) Q5A Guidance for Viral Safety Evaluation of
Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human and Animal Origin
Conferencia Internacional de Armonizacin (ICH) Q5D Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products
Public Health Service Guideline on Infectious Diseases Issues in Xenotransplantation (18 de octubre de 2000)
1044 CRIOCONSERVACIN DE CLULAS

INTRODUCCIN
PRINCIPIOS DE LA CRIOCONSERVACIN
Es crtico entender el papel del agua y la necesidad de eliminarla adecuadamente de las clulas o anular su capacidad para
formar cristales de hielo, los cuales daan la membrana celular, para lograr una crioconservacin exitosa. Cuando las clulas se
congelan en suspensin acuosa, a menudo son destruidas. No obstante, en la dcada de 1940, Polge y otros cientficos descubrieron las propiedades crioprotectoras del glicerol. Desde entonces, se han identificado diversos qumicos que se denominan
genricamente agentes crioprotectores. El mecanismo de accin de los agentes crioprotectores es complejo y no se ha podido
entender en su totalidad. Sin embargo, de acuerdo con la teora comnmente aceptada de la accin coligativa, los agentes
crioprotectores incrementan la concentracin de soluto tanto dentro como fuera de la clula, con lo que se suprime la formacin de hielo. Para este propsito, los denominados agentes crioprotectores de penetracin (o intracelulares) [p.ej., dimetilsulfxido (DMSO), glicerol, propanodiol y metanol] deben ser capaces de cruzar la membrana celular con facilidad y penetrar la
clula sin presentar una toxicidad significativa. Existe tambin un grupo de agentes crioprotectores no penetrantes (o extracelulares) (p.ej., sacarosa y trehalosa) cuyo mecanismo de accin parece estar relacionado, al menos en parte, con su interaccin
estabilizante con las membranas celulares. Esta propiedad tambin puede explicar las actividades crioprotectoras de algunos
compuestos de alto peso molecular tales como almidn hidroxietlico y polivinilpropileno. Los modelos tericos de crioproteccin por lo general evocan la teora coligativa, pero an no se ha establecido una explicacin completa de la accin de los
agentes crioprotectores.
Una forma alternativa de conservacin celular, comnmente denominada vitrificacin, mediante la cual la suspensin de clulas se carga de altos niveles de agentes crioprotectores de penetracin (a menudo varios agentes combinados), induce un
estado similar al vtreo en el que el agua celular y extracelular no puede formar cristales de hielo con facilidad. Cuando las
Captulos
La crioconservacin es el proceso de enfriar y almacenar clulas, tejidos u rganos a temperaturas muy bajas para mantener
su viabilidad. El propsito de la crioconservacin es almacenar clulas por largos periodos para permitir su uso futuro en aplicaciones in vitro o in vivo, procurando que luego de la descongelacin su funcin sea suficientemente representativa de la funcin previa a la congelacin de las clulas. La crioconservacin tambin minimiza los riesgos de mutacin gentica o desarrollo
de subpoblaciones debidos a la replicacin celular. Dependiendo de la aplicacin, luego de la crioconservacin se debe realizar
una suficiente evaluacin de la capacidad de divisin, proliferacin, diferenciacin, expresin de genes o produccin de protenas u otra propiedad funcional especfica.
Este captulo presenta las mejores prcticas para la crioconservacin, el mantenimiento y el uso de un amplio rango de clulas, productos de terapia celular y bancos de clulas derivadas de una variedad de fuentes, incluyendo cultivos humanos, animales y microbianos (el captulo tambin contiene un Apndice con documentos de gua adicionales que son tiles para tipos
de clulas y aplicaciones particulares). Las clulas crioconservadas proveen una fuente disponible de clulas viables que se pueden usar, directa o indirectamente, para los propsitos de pruebas de diagnstico, terapia, fabricacin de medicamentos y vacunas, y para valoraciones biolgicas que se usan para evaluar la potencia de frmacos y vacunas teraputicos. En algunos casos, las clulas mismas, despus de la crioconservacin y la descongelacin, constituyen una terapia para pacientes y, en otros
casos, las clulas se propagan o manipulan de otra manera ex vivo para generar el producto (p.ej., una terapia celular de expansin de cultivo, una protena teraputica, un anticuerpo monoclonal o una vacuna). En todos los casos, la crioconservacin
apropiada es esencial para conservar las propiedades celulares requeridas y, como objetivo final, para su aplicacin en pro del
avance de las terapias para pacientes.
896 1044 Crioconservacin de Clulas / Informacon General
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suspensiones de clulas preparadas de esta manera se enfran posteriormente con mucha rapidez (velocidades de enfriamiento
de 1001000/minuto o superiores) la viscosidad extrema evita la smosis y las molculas de agua son incapaces de formar
hielo. Este procedimiento se ha usado ampliamente para estructuras complejas, incluyendo una variedad de tejidos humanos,
vegetales y animales, y puede ayudar a conservar aquellas preparaciones celulares con grados variables de permeabilidad celular o cuando la crioproteccin estndar no es capaz de entregar el rango de condiciones requerido para conservar la viabilidad
en todos los tipos de clulas que componen los tejidos.
Los agentes crioprotectores tienen actividades biolgicas que van ms all de sus propiedades crioprotectoras. Algunos
agentes, como el DMSO, pueden afectar la membrana celular, el citoesqueleto y la expresin gentica, y pueden ser txicos
para las clulas despus de una exposicin prolongada. Por lo tanto, durante el desarrollo de nuevos protocolos de crioconservacin, los analistas deben realizar un ensayo de toxicidad en el que las clulas se expongan al agente crioprotector durante un
rango de intervalos de tiempo para evaluar la prdida de viabilidad o la alteracin de su funcionalidad.
Elementos Clave de la Prctica de Crioconservacin

El desarrollo del mtodo para cualquier muestra celular o producto teraputico que se va a crioconservar debe tratar los siguientes elementos:
Captulos
PROCESAMIENTO Y CARACTERIZACIN PREVIOS A LA CONGELACIN
Es crtico optimizar la condicin de las clulas inmediatamente antes de la crioconservacin para lograr un resultado exitoso.
El carcter y el grado del procesamiento previo a la congelacin depende del estado de las clulas originales extradas para su
conservacin, de la composicin de la suspensin de clulas y de las etapas de procesamiento especficas que llevan a la crioconservacin. El procesamiento previo a la congelacin puede incluir la seleccin de subpoblaciones, la expansin ex vivo o la
incubacin con factores de activacin o cebado.
Se deben establecer las caractersticas previas a la crioconservacin y la identidad de las clulas durante las etapas tempranas
del desarrollo del proceso. Particularmente para los bancos de clulas, se debe documentar el estado de las clulas y las condiciones ptimas de crecimiento, las caractersticas y la autenticidad, y se debe contar con un historial bien documentado (con
rastreabilidad a un banco de clulas calificado o una fuente aceptable). El estado y el historial de las clulas por lo general se
describen en trminos del carcter y el nmero de manipulaciones y pasajes de cultivo a partir de las clulas primarias o del
aislado original. Las clulas finitas o primarias a menudo se crioconservan en un pasaje temprano para mantener la integridad
del tejido original, aunque se pueden clonar y expandir lneas celulares continuas, con lo que se asegura una poblacin de
clulas homognea. Se recomienda preparar bancos de clulas a partir de una preparacin individual o poblacin expandida
de clulas, puesto que a menudo resulta necesario combinar las clulas de mltiples vasos de cultivo para su congelacin. No
se deben combinar clulas de cultivos con diferentes historiales de pasaje ni, evidentemente, de diferentes donantes. En ambos
casos, los analistas deben mantener registros detallados de los procedimientos.
Con el fin de preparar la crioconservacin de clulas cultivadas, las clulas deben recolectarse durante la fase exponencial o
ms rpida de crecimiento y antes de que el cultivo entre en la fase estacionaria. La recoleccin de clulas durante esta fase
asegura que las clulas sean ms viables y uniformes. La concentracin ptima de clulas depender del tipo de clula, del
propsito y de la mejor recuperacin posible. Por lo regular, esto se encuentra entre 106 y 107/mL para bancos de clulas de
fabricacin, pero puede ser diferente para otros propsitos. Tambin puede ser beneficioso completar la renovacin del medio
de crecimiento un da antes de recolectar las clulas. Adems, la mayora de las suspensiones de clulas se benefician del lavado por centrifugacin y de la resuspensin en un medio isotnico hasta alcanzar una concentracin celular especfica. El procesamiento previo a la congelacin no debe resultar en clulas que estn bajo estrs antes del inicio del proceso de congelacin
o las prdidas celulares durante la congelacin o despus de la descongelacin sern mayores que las esperadas.
Es importante optimizar las condiciones de crecimiento de una lnea celular o de clulas primarias para mantener una alta
viabilidad de las clulas en el cultivo. Por lo regular, las clulas que crecen de manera activa y en una fase exponencial presentan una relacin baja entre citoplasma y volumen nuclear, lo que lleva a la crioconservacin exitosa con crioprotectores de
penetracin. Las condiciones de cultivo inapropiadas o por debajo de las condiciones ptimas pueden generar una viabilidad
menor y estados celulares que sern menos robustos para la conservacin y la recuperacin. Se debe optimizar el medio de
cultivo y usar el mismo medio durante todos los experimentos; asimismo, se debe calificar cada partida de materiales derivados de animales (p.ej., suero) y dems reactivos de cultivo (p.ej., ver la gua de la OMS 2010 y la gua de la FDA 2010 referidas
en el Apndice). Si fuera posible, se recomienda no usar componentes derivados de animales en el medio de cultivo, en particular para clulas usadas para terapia o como sustratos de fabricacin.
De conformidad con la gua de la OMS 2010 y basndose en una evaluacin de riesgos, se debe analizar el Banco Maestro
de Clulas o el Banco de Clulas de Trabajo para determinar la presencia de agentes adventicios. Idealmente, se deben analizar
muestras de clulas para determinar la presencia de agentes adventicios antes de la congelacin. El rgimen especfico de anlisis para determinar la presencia potencial de contaminacin microbiana o viral de las clulas depende de la fuente donante,
del historial del cultivo y del uso previsto. Se deben mantener registros detallados del historial de las clulas como fundamento
para una evaluacin de riesgos apropiada a fin de dirigir cualquier anlisis suplementario que pueda ser requerido (p.ej., exposicin a virus bovinos en albmina srica bovina). Los requisitos reglamentarios especficos para el anlisis de clulas, o donantes de las clulas, para productos destinados para un uso en particular (p.ej., terapias celulares o fabricacin de vacunas) se
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basan en experiencias anteriores relacionadas con agentes clave que deben incluirse o considerarse. El captulo general de la
USP Productos Derivados de Clulas y Tejidos 1046 contiene guas sobre requisitos de anlisis de esterilidad y seguridad para
productos de terapia celular.
REACTIVOS Y ENVASES
ADICIN DE SOLUCIN CRIOPROTECTORA
Las soluciones crioprotectoras por lo general son hipertnicas y no son fisiolgicas. Por ejemplo, una solucin de DMSO al
10% usada comnmente en la conservacin celular tiene una concentracin aproximadamente 1,4 osmolar (Osmol/L). Las clulas introducidas en este tipo de solucin se deshidratan rpidamente a medida que el agua abandona la clula para reducir la
diferencia de potencial osmtico entre el interior y el exterior de la clula. El DMSO permea lentamente la clula para lograr el
reequilibrio, lo cual puede ocasionar variaciones en el volumen que pueden resultar en una prdida de viabilidad celular. Por
ende, las soluciones de crioconservacin comnmente se agregan a una suspensin de clulas en adiciones por etapas o gradualmente (p.ej., usando una bomba con jeringa) o dispensando lentamente por la pared del envase para evitar prdidas como resultado del estrs por smosis. El mtodo para introducir o eliminar una solucin de crioconservacin debe desarrollarse
y evaluarse tomando en cuenta su impacto sobre la viabilidad y la funcionalidad celular.
En el caso del DMSO, una entalpa latente elevada del mezclado resulta en el calentamiento de la muestra al mezclar las dos
soluciones. Este calentamiento puede ser lo suficientemente elevado para daar las clulas, por lo que las soluciones que contienen DMSO comnmente se enfran antes de mezclarlas. El preenfriamiento de la solucin reduce el calentamiento asociado
con el mezclado de la solucin, reduce los cambios en el volumen osmtico que experimentan las clulas y reduce las prdidas
celulares asociadas con la exposicin al DMSO. El tiempo que las clulas se exponen al crioprotector antes de la congelacin
debe limitarse, mientras que el tiempo mximo permisible, sin efectos nocivos, debe determinarse durante el trabajo de desarrollo para el uso de rutina.
ENFRIAMIENTO
Por lo general, se usan dos tipos distintos de congelacin para las clulas: enfriamiento a velocidad controlada (usando congeladores programables) y enfriamiento pasivo (que incluyen el uso de envases con aislamiento). Las fuentes de nitrgeno lquido se equipan con congeladores a velocidad controlada. La temperatura de la cmara debe controlarse incrementando o
reduciendo el flujo de gas de nitrgeno fro en la cmara de acuerdo con una etapa preprogramada. Los protocolos de congelacin a velocidad controlada generalmente implican diversas etapas, cada una de las cuales debe ser evaluada y calificada para un tipo especfico de clulas.
El uso de congelacin a velocidad controlada provee un control ms preciso del entorno de congelacin y, por ende, puede
proveer una recuperacin posterior a la descongelacin ms uniforme (y mayor) para clulas que pueden tener un rango ms
estrecho de velocidades de enfriamiento asociadas con la supervivencia mxima o clulas que son sensibles a la temperatura a
la que se forma el hielo en la solucin extracelular. Las sondas de temperatura colocadas cerca de las clulas que se estn congelando, o en una suspensin simulada de clulas que se somete simultneamente a crioconservacin, se usan para monitorear el proceso de congelacin y para proveer un control del proceso. Si la liberacin de calor latente de la fusin se retarda o
Captulos
Todos los crioprotectores, envases, entre otros, deben ser adecuados para su propsito, conforme a lo indicado en las pautas
reglamentarias pertinentes. Por lo regular, se usan bolsas, crioviales y pajuelas de plstico desechables y estriles para un solo
uso en crioconservacin. Las especificaciones del fabricante deben ser revisadas cuidadosamente para asegurar que el material
usado para fabricar el crioenvase es apropiado para su uso a la temperatura de almacenamiento, que es qumicamente compatible con el contenido, que minimiza el potencial de lixiviables y extrables, y que asegura la integridad del cierre del envase.
Cuando se usen pajuelas, entonces la contencin primaria o secundaria durante el almacenamiento ser importante para prevenir el contacto directo de las clulas conservadas con el nitrgeno lquido. Los crioviales deben seleccionarse basndose en
su capacidad para proveer al banco de clulas una integridad adecuada.
La conservacin de clulas por lo general requiere el uso de soluciones especializadas que contienen una base (por lo general una solucin salina isotnica) con los agentes crioprotectores (con mayor regularidad, DMSO, pero en ocasiones glicerol) y
en ocasiones protenas (suero fetal bovino, suero o plasma humano, medio acondicionado o albmina humana). Puede ser
necesario determinar la composicin ptima para los diferentes tipos de clulas.
Los tipos de viales, etiquetas, tinta o marcadores usados deben tolerar las temperaturas extremas del nitrgeno lquido. Las
marcas en la etiqueta deben ser legibles y, de ser posible, contar con cdigo de barras. La informacin mnima que se debe
incluir en la etiqueta es el nombre o la descripcin de la poblacin celular, la fecha de crioconservacin, el nmero de lote y el
nmero de pasajes, si fuera necesario. Puesto que la mayora de las crioetiquetas son muy pequeas, se puede incluir informacin adicional en la documentacin relacionada. En algunas aplicaciones, tambin puede ser necesario numerar los viales de
manera secuencial dentro de un solo lote como parte de la informacin mnima de la etiqueta a fin de permitir un mejor control sobre el movimiento de los viales de un banco individual, y para identificar sectores del banco que pudieran haberse sometido a condiciones diferentes de crioconservacin.
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no se controla adecuadamente, las clulas que se someten a crioconservacin pueden resultar daadas y pueden presentar
una disminucin en la viabilidad despus de la descongelacin.
Pueden ocurrir interrupciones en la congelacin a velocidad controlada durante el protocolo las cuales, por lo general, son
ocasionadas por fallas en una vlvula del congelador o aparato de criogenia de velocidad controlada. Se deben preparar protocolos para manejar las interrupciones durante el proceso de congelacin as como planes de respaldo.
La congelacin pasiva implica colocar un producto en un congelador (aproximadamente 80 o 150) y permitir que la
muestra se enfre descontroladamente. Se usa un aislante o cajas especialmente diseadas para reducir la velocidad de enfriamiento de la muestra. Se debe evaluar y calificar la velocidad de enfriamiento promedio lograda para la mayora de los procesos as como la uniformidad de las curvas de congelacin para los propsitos deseados. En general, el control del entorno trmico durante la congelacin resulta en una mejor recuperacin posterior a la descongelacin, aunque ciertas clulas presentan
una recuperacin posterior a la descongelacin comparable cuando se enfran de manera pasiva.
Captulos
ALMACENAMIENTO, SEGURIDAD Y TRANSPORTE CRIOGNICOS
Despus de completar el proceso de congelacin, los productos son transferidos de congeladores a velocidad controlada o
mecnicos a unidades de almacenamiento criognico. Algunos cultivos celulares microbianos pueden mantenerse adecuadamente en congeladores mecnicos, aunque esto debe demostrarse. Se debe minimizar el entibiamiento de la muestra al transferir el producto celular del dispositivo de congelacin al lugar de almacenamiento. Se pueden usar mesas fras o dispositivos
de transferencia con aislamiento para minimizar el entibiamiento durante la transferencia. Las clulas que acaban de ser crioconservadas por lo regular se colocan en una unidad de almacenamiento criognico para cuarentena antes de completar el
anlisis para detectar la presencia de agentes adventicios. Despus del anlisis, las clulas que arrojan resultados negativos en
la determinacin de agentes adventicios pueden ser liberadas para su transferencia a unidades de almacenamiento criognico
a largo plazo.
El sistema de inventario (o depsito) para el mantenimiento de las clulas crioconservadas debe tener un diseo de fcil acceso que minimice la manipulacin de las muestras, adems de que se debe limitar el nmero de accesos por da a un depsito puesto que la exposicin a temperaturas ms altas puede comprometer la viabilidad celular y, por consiguiente, la estabilidad a largo plazo. Los bancos de clulas (p.ej., bancos maestros de clulas) u otros cultivos celulares a los que se accede con
poca frecuencia deben almacenarse por separado de los bancos de clulas de trabajo o de otros cultivos celulares a los que se
accede con mayor regularidad. La recuperacin frecuente a partir del banco/cultivo celular puede ocasionar cambios en la
temperatura. Esta actividad no debe comprometer la estabilidad a largo plazo ni el desempeo del banco/cultivo celular usado
con poca frecuencia. Asimismo, resulta valioso dividir un banco y almacenarlo en sitios mltiples para reducir los riesgos debidos a un evento catastrfico en un sitio particular.
Al almacenar clulas crioconservadas, los analistas deben asegurar que la temperatura de almacenamiento no se eleve por
encima de una temperatura crtica denominada temperatura de transicin vtrea. Para el almacenamiento a largo plazo de
muestras que requieren de atencin y cuidados especiales tales como lneas celulares y cultivos celulares primarios, esta temperatura crtica no es superior a 130 para muestras no clnicas y no es superior a 150 para material clnico (para proveer un
margen de error adecuado) en la fase de vapor del congelador de nitrgeno lquido. Los congeladores de nitrgeno lquido
son propensos a gradientes de temperatura en la fase de vapor basndose en la forma y el diseo del congelador y el nivel de
nitrgeno lquido. Aunque el almacenamiento de clulas crioconservadas en nitrgeno lquido prolonga su longevidad, los
riesgos asociados con el uso de envases inadecuados (p.ej., explosin de viales o ruptura de bolsas) han derivado en un mayor
uso del almacenamiento en fase de vapor de nitrgeno. La fase de vapor de nitrgeno lquido provee un entorno ms conveniente y seguro para la recuperacin de viales. Cuando el congelador de nitrgeno lquido se configura adecuadamente, la
temperatura de trabajo en la fase de vapor es, por lo regular, 150 o menor. Se debe calificar el congelador de nitrgeno
lquido, adems de que se debe verificar de manera rutinaria la temperatura de la fase de vapor para asegurar que dicha temperatura no sobrepase los 130 para lneas celulares u otro material congelado, o sobrepase los 150 para material usado en
aplicaciones clnicas (p.ej., terapias celulares).
Los sistemas de monitoreo de temperatura deben permitir el registro y el almacenamiento del historial de temperaturas para
propsitos de control de calidad. Las unidades de almacenamiento deben estar conectadas a alarmas y a los sistemas de monitoreo de la instalacin. Las unidades de almacenamiento crtico deben equiparse con un sistema de alarma de niveles mltiples
para asegurar el respaldo del monitoreo y de la respuesta. Las unidades de almacenamiento deben monitorearse de manera
rutinaria para detectar fallas en la temperatura ocasionadas por interrupciones elctricas y cualquier otro fallo potencial. En caso de fallas del equipo o elctricas, se debe contar con refrigeracin de respaldo.
La operacin apropiada de un depsito requiere monitorear la temperatura, los niveles de nitrgeno lquido y el llenado automtico. Asimismo, se recomienda contar con un respaldo para enfriamiento de emergencia (p.ej., almacenamiento criognico de respaldo vaco) en caso de que falle el congelador.
nicamente el personal capacitado para este propsito debe tener acceso a los productos o las muestras crioconservadas. En
algunos casos, la verificacin por parte de una segunda persona ser necesaria para propsitos de rastreabilidad de la fuente. El
personal designado para la implementacin de los protocolos debe estar capacitado en procedimientos operativos estndar
(POE). Los sistemas de rastreo de muestras que incorporan software y en ocasiones cdigos de barras para identificacin, registro y rastreo de muestras congeladas son particularmente tiles para los depsitos grandes de muestras y pueden facilitar la
recuperacin rpida de muestras y minimizar el tiempo que el depsito completo se expone al riesgo de desviaciones de tem-
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peratura. Adems, se recomienda que todos los cambios a los inventarios del crioalmacenamiento se registren en bitcoras
cercanas a la unidad de almacenamiento.
Los productos y muestras tales como clulas primarias, lneas celulares y productos de terapia celular por lo regular se transportan entre sitios de recoleccin, procesamiento, almacenamiento y uso. Las clulas crioconservadas por lo regular se transportan en transportadores de vapor de nitrgeno lquido con sistemas de monitoreo de temperatura para asegurar que la temperatura de la unidad no sobrepase los 130 para lneas celulares ni los 150 para material clnico durante el proceso de
transporte. Los contenedores para transporte estn sujetos a vibraciones y tensiones mecnicas importantes durante el transporte y se deben evaluar de manera regular para asegurar su funcionamiento ptimo. Los estudios de validacin del transporte
deben abarcar las condiciones ms exigentes e incluir los datos de monitoreo de temperatura para materiales crticos.
Las clulas crioconservadas, independientemente de si se transportan dentro del pas o internacionalmente, deben transportarse cumpliendo con las reglamentaciones para el correo local, del US Department of Transportation (Departamento del
Transporte de EE.UU.) y de la International Air Transport Association (Asociacin de Tansporte Areo Internacional). Los empaques tambin deben cumplir con los dems requisitos reglamentarios para cuarentenas, prevencin y seguridad biolgica. Las
clulas crioconservadas deben recuperarse, envasarse y transportarse de una manera que no interfiera con la integridad de las
clulas. Para la mayora de las clulas crioconservadas, puede ser adecuado el transporte en hielo seco durante periodos cortos,
pero se debe validar el proceso de transporte y demostrar que no tiene un impacto adverso sobre las clulas, adems de que
se deben incluir monitores de temperatura. No obstante, algunas clulas pueden requerir de transporte en fase de vapor de
nitrgeno lquido (Dewars). Puede ser necesaria la validacin previa de los mtodos de transporte para determinar la mejor
opcin y se debe realizar una evaluacin de riesgo previa a la validacin incluso si se est considerando una sola opcin de
transporte. Con el envo, los transportistas deben incluir instrucciones para el almacenamiento apropiado al recibir las clulas.
Las clulas que se congelan usando mtodos convencionales (congelacin a velocidad controlada o pasiva) o mediante vitrificacin, se deben descongelar con la mayor rapidez posible y el proceso de descongelacin inicia tan pronto como la muestra
congelada se retira del almacenamiento. Las velocidades lentas de entibiamiento generan daos por recristalizacin o exposicin de las clulas a altas concentraciones extracelulares de agentes crioprotectores, los cuales pueden producir muerte celular.
Se debe desarrollar el procedimiento de descongelacin ms apropiado (temperatura, gradiente y tiempo) para cada producto
de terapia celular y lnea celular. Estos productos y lneas celulares por lo general se descongelan en un bao de agua tibia, o
en el caso de preparaciones celulares teraputicas, en un bao de perlas o termobloque. El bao de agua debe limpiarse con
regularidad y debe contener agua estril o Agua para Inyeccin. La temperatura del bao tambin debe monitorearse. Muchos
laboratorios clnicos emplean bolsas de plstico para envolver y contener el envase primario durante la descongelacin rpida
a fin de reducir el riesgo de contaminacin del producto en caso de que se comprometiera la integridad del envase interno.
Como alternativa, se pueden usar baos de perlas tibios (por lo general a aproximadamente 37) para reducir los riesgos de
contaminacin. Las velocidades de descongelacin deben ser lo ms rpidas posible (>1/s para la mayora de las clulas de
mamferos). El aumento de las temperaturas del bao por encima de 42 para incrementar la velocidad de entibiamiento se
debe realizar con extremo cuidado debido a que las temperaturas hipertrmicas pueden daar las clulas, induciendo necrosis
o apoptosis.
PROCESAMIENTO Y EVALUACIN POSTERIOR A LA DESCONGELACIN
Puesto que las soluciones para crioconservacin no son fisiolgicas, es normal llevar a cabo algunos procesos posteriores a la
descongelacin. Para clulas conservadas en DMSO, las clulas por lo general se lavan o diluyen inmediatamente despus de la
descongelacin debido a que este agente crioprotector es daino, en particular para las clulas congeladas y descongeladas.
Las clulas son ms sensibles a expandirse que a contraerse, por lo que los protocolos de eliminacin o dilucin del agente
crioprotector deben optimizarse cuidadosamente para prevenir prdidas celulares derivadas de la dilucin o eliminacin.
La cuantificacin de la viabilidad de las clulas despus de la congelacin es importante y puede realizarse usando una variedad de mtodos, dependiendo de los requisitos de las clulas posteriores a la congelacin. Se deben establecer lmites mnimos de viabilidad basndose en la experiencia, adems de que se deben desechar los productos descongelados con viabilidades por debajo de los lmites establecidos. Los procesos de crioconservacin someten a las clulas a tensiones importantes que
pueden alterar la funcin metablica, la estructura de la membrana, entre otros. Por lo tanto, resultan crticos el desarrollo y la
validacin de ensayos adecuados posteriores a la descongelacin. La funcin posterior a la descongelacin generalmente se
evala usando la integridad fsica (p.ej., integridad de la membrana), la actividad metablica, la actividad mecnica (acoplamiento o contraccin), la actividad mittica o el potencial de injerto. La seleccin del ensayo depende en gran medida de la
funcin deseada de la clula despus de la descongelacin. La integridad de la membrana es la que se usa con mayor frecuencia. Hoy en da, los colorantes como el azul de tripn se usan con menos regularidad para medir la integridad fsica posterior a
la descongelacin debido a que el colorante es difcil de validar en clulas congeladas y descongeladas. El mtodo para analizar la viabilidad debe seleccionarse y calificarse con cuidado para el tipo de clula en particular que se est midiendo con un
protocolo que especifique los diluyentes y el tiempo. El uso de colorantes fluorescentes es cada vez ms frecuente para determinar la integridad fsica de las clulas posterior a la descongelacin. Los mtodos rigurosos de evaluacin posterior a la descongelacin generalmente implican mltiples mediciones de la viabilidad celular y, en particular, al menos dos ensayos inde-
Captulos
DESCONGELACIN
Captulos
USP 38
pendientes para medir la viabilidad posterior a la descongelacin. Por ejemplo, la adherencia al sustrato y la proliferacin posterior a la descongelacin se usan comnmente para evaluar la viabilidad. A medida que aumenta la complejidad de la funcin
celular deseada despus de la descongelacin, tambin crece la necesidad de una evaluacin posterior a la misma. Por ejemplo, la evaluacin posterior a la descongelacin de clulas madre puede requerir la valoracin de la integridad de la membrana
as como de la proliferacin y de la capacidad de las clulas para diferenciarse en linajes diferentes despus de la congelacin.
Los ensayos posteriores a la descongelacin deben desarrollarse y validarse cuidadosamente para evitar sesgos en las mediciones. Una cierta fraccin de clulas se lisarn durante la congelacin y los mtodos para medir la recuperacin celular deben
incluir una evaluacin completa de las prdidas celulares (clulas que se han lisado as como cluas que estn intactas pero que
no son viables). La estabilidad de las clulas crioconservadas se puede asegurar mediante la descongelacin y el anlisis peridicos de un vial de las clulas (ver tambin la pauta ICH Q5D).
El anlisis de agentes adventicios despus de la preparacin de los bancos maestros de clulas y de los bancos de clulas de
trabajo debe ser parte de la rutina, y los captulos generales de la USP Evaluacin de la Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal 1050 y Mtodos de Pruebas Virolgicas 1237 proveen guas de
anlisis adicionales (ver tambin la gua de la FDA 2010 citada en el Apndice). El anlisis de contaminacin micobacteriana,
que podra no ser detectada en un anlisis de esterilidad estndar, tambin se puede considerar para algunos sustratos celulares. Se deben recuperar y analizar viales representativos para determinar la presencia de contaminacin (bacterias, hongos,
Micoplasmas y virus). Se encuentra disponible una gran cantidad de mtodos bien establecidos para detectar Micoplasmas en
cultivos celulares (ver el captulo general de la USP Pruebas para Micoplasmas 63).
El registro de las partidas debe ser detallado e incluir el historial de las clulas y de todas las actividades, desde la recepcin
hasta la liberacin de los bancos celulares o de los productos para su uso. El registro debe incluir informacin detallada sobre el
proceso de crioconservacin, incluyendo el procedimiento, el equipo usado (con un identificador nico) y un registro impreso
del perfil de congelacin. La viabilidad de las clulas crioconservadas deben monitorearse con el paso del tiempo para confirmar la efectividad del proceso de congelacin y de las condiciones de almacenamiento. La informacin registrada en cada archivo de partida de una lnea celular debe ser rastreable a la fuente original y todos los documentos deben mantenerse y actualizarse de acuerdo con el sistema de gestin de calidad en uso.
CRIOCONSERVACIN DE PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR DERIVADOS DE CLULAS

HUMANAS
Los mtodos de conservacin de clulas se utilizan para asegurar la estabilidad del producto durante las etapas de retencin,
almacenamiento y transporte para un amplio rango de productos basados en clulas humanas (el captulo 1046 ofrece informacin adicional). Las clulas se pueden conservar en suspensin lquida durante unos cuantos das, pero invariablemente
ocurrirn cambios cuantitativos y cualitativos en el producto celular con el paso del tiempo. Aunque la conservacin en estado
de congelacin tambin afecta al producto celular, sta permite una conservacin de las caractersticas especficas del producto ms predecible durante intervalos de tiempo mucho ms prolongados.
Para cualquier producto celular determinado, la decisin de usar la crioconservacin depende principalmente del tiempo de
la administracin del producto final en relacin con la recoleccin a partir de la fuente de las clulas y de las etapas de fabricacin del producto. Muchos productos autlogos y alognicos para pacientes especficos se mantienen en suspensin lquida,
sin crioconservacin, desde la fuente inicial de las clulas hasta la formulacin final, y se liberan como productos frescos despus de un tiempo relativamente corto. No obstante, muchas aplicaciones clnicas requieren la crioconservacin de la fuente
de las clulas, de los productos intermedios o del producto final. En estos casos, la crioconservacin puede permitir la optimizacin del flujo de trabajo durante la fabricacin, la culminacin del anlisis de liberacin de lotes, el mantenimiento y gestin
de un inventario de productos, el transporte del producto al sitio clnico y la coordinacin de la administracin del producto
con el rgimen mdico o quirrgico del paciente. Por ejemplo, la sangre del cordn umbilical se crioconserva y almacena en
bancos pblicos para su transporte subsiguiente y almacenamiento temporal en centros de transplante clnicos, en donde se
descongela inmediatamente antes de su infusin en un paciente.
El desarrollo de un proceso de crioconservacin para una terapia celular clnica debe considerar las consecuencias para el
producto, para el paciente y para la viabilidad general de la terapia. Para el producto celular, el fabricante debe asegurar que
las prdidas celulares esperadas debidas a la crioconservacin y la descongelacin ocurran de una manera que sea razonablemente predecible y debe asegurar que el producto final que se administra al paciente cumplir con las especificaciones de nmero, viabilidad y caractersticas funcionales de las clulas.
Para el paciente, la crioconservacin puede afectar la eficacia y la seguridad del producto final. Por ejemplo, el DMSO crioprotector se asocia con el riesgo de toxicidades predecibles gastrointestinales, cardiovasculares y neurolgicas que dependen
de la dosis que generalmente se adscriben a la liberacin de histamina. Se debe estimar o medir el DMSO residual en el producto final. El DMSO est categorizado por la ICH como un disolvente o excipiente Clase 3 (de riesgo relativamente bajo) en
productos farmacuticos, y se consideran aceptables sin justificacin cantidades de hasta 50 mg/da o menos (ver la norma
ICH Q3C). Los productos celulares crioconservados con frecuencia contienen 1020 veces esta cantidad, a menos que se laven
despus de la descongelacin. Pueden presentarse incluso cantidades mayores de DMSO con la administracin de mltiples
productos crioconservados, lo que ocurre comnmente con el transplante de clulas madre autlogas de la sangre perifrica.
Por lo regular se usa un lmite de DMSO de 1 g/kg peso del receptor/da en la prctica de la terapia celular clnica. Asimismo se
deben tomar en cuenta los procedimientos para prevenir la toxicidad del DMSO. Resulta una prctica clnica comn premedi-
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car a pacientes con difenhidramina u otros agentes antihistamnicos para prevenir la toxicidad del DMSO. Asimismo, se pueden considerar mtodos de lavado del producto ya sean manuales (centrifugacin) o automticos, aunque deben validarse para asegurar una recuperacin y funcin celular posteriores al lavado adecuadas.
El uso de productos de terapia celular crioconservados puede requerir que el sitio clnico reciba, almacene, descongele y lleve a cabo otras etapas de preparacin finales en el producto crioconservado. La evaluacin de viabilidad requiere tomar en
cuenta las capacidades del sitio con respecto al personal especializado, capacitacin, equipo e instalaciones para llevar a cabo
dichas tareas.
Si la crioconservacin se planea como parte del proceso de fabricacin, los equipos de desarrollo deben considerar el efecto
de la crioconservacin sobre el nmero y las caractersticas de las clulas y debe requerir mtodos confiables de enumeracin
celular y de evaluacin de la viabilidad y la funcin de las clulas. Durante las corridas de desarrollo, a menudo se realizan ms
ensayos que los que sern eventualmente requeridos para los anlisis durante el proceso y del producto final. Esto se hace para
evaluar los efectos que tiene cada manipulacin sobre el producto. Debido a que algunas clulas pueden ser ms susceptibles
que otras a los daos por congelacindescongelacin, estos estudios deben incluir la evaluacin de prdidas selectivas de
subpoblaciones celulares importantes dentro del producto.
Tal como se describe en la Introduccin, el resultado de un protocolo de crioconservacin se ve afectado por diversos procesos crticos. A continuacin se tratan brevemente cuestiones exclusivas de las terapias celulares.
Procesamiento Previo a la Congelacin
Reactivos y Envases
Se deben usar reactivos y envases de grado clnico siempre que sea posible (ver Materiales Auxiliares para Productos Celulares,
Gnicos y de Ingeniera Tisular 1043). Resulta una prctica comn usar bolsas o crioviales de plstico desechables y estriles de
un solo uso que han sido calificados para el proceso de crioconservacin y las condiciones de almacenamiento subsiguientes
especficos. Los medios de crioconservacin para productos de terapia celular por lo regular consisten en soluciones isotnicas
basadas en sales con uno o ms crioprotectores, por lo regular el DMSO crioprotector intracelular a una concentracin final del
5%10% con o sin un crioprotector extracelular como almidn hidroxietlico. Resulta comn el uso de aditivos de protenas de
origen humano tales como albmina srica humana, suero o plasma, aunque pueden requerir de calificacin extensa, por lo
que se deben evitar cuando sea posible y evaluarse otras alternativas. En ocasiones se utilizan aditivos tales como heparina derivada de animales, anticoagulantes basados en citratos y ADNasa. Muchos centros formulan sus propios medios de crioconservacin, pero el uso de medios de crioconservacin comerciales, que por lo regular incluyen DMSO al 5%10% y otros componentes de patente, se ha incrementado entre los fabricantes de terapias celulares para eliminar la variabilidad y la necesidad
de actividades de calificacin adicionales relacionadas con la formulacin local.
Adicin de Solucin Crioprotectora y Enfriamiento

Los procedimientos para la introduccin o eliminacin de una solucin de crioconservacin debe evaluarse antes de la congelacin para asegurar que las prdidas celulares resultantes de esta etapa se mantengan al mnimo. El medio de crioconservacin por lo general se agrega a la suspensin de clulas en etapas o gradualmente (p.ej., usando una bomba con jeringa) para
evitar prdidas como resultado del estrs por smosis. Resulta comn preenfriar el medio de crioconservacin y mantener la
suspensin de clulas y la mezcla fras usando compresas fras, una frazada fra o una superficie de trabajo fra para prevenir
dao celular relacionado con el calor durante la adicin del DMSO. Una vez que se agrega el medio de crioconservacin, la
suspensin de clulas por lo general se transfiere a la cmara preenfriada de un congelador de velocidad controlada. Durante
el proceso de congelacin, se genera un registro, o curva de congelacin, de la temperatura de la cmara y del producto con
el paso del tiempo para su inclusin en el registro de produccin. Las temperaturas del producto se pueden registrar usando
una sonda colocada en la superficie externa de la bolsa del producto o desde el interior de un producto comparable en una
bolsa o vial de simulacin que se somete a congelacin de manera paralela.
Captulos
Si las clulas se recolectan en presencia de plasma, las muestras deben procesarse adecuadamente con un anticoagulante
para prevenir la coagulacin. Adems, algunas clulas son propensas a aglutinarse o a agregarse al ser centrifugadas, y algunos
productos celulares pueden presentar daos o prdidas excesivas de una o ms poblaciones dentro del producto. Las clulas
recolectadas de cultivos adherentes o no adherentes pueden incluir cantidades importantes de clulas muertas o frgiles. Por
ende, las etapas de centrifugacin y lavado deben ser optimizadas y tambin especficas para el contenido del producto celular, el volumen de suspensin, el medio de suspensin y el envase, junto con una evaluacin apropiada del producto celular
antes y despus de estas manipulaciones. El procesamiento previo a la congelacin no debe resultar en clulas que estn estresadas (p.ej., clulas que presenten marcadores apoptticos tempranos o respuestas por golpe de temperatura elevados) antes
del inicio del proceso de congelacin, o las prdidas celulares sern mayores que las esperadas.
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Almacenamiento y Transporte
Captulos
Los productos de terapia celular crioconservados por lo regular se almacenan y transportan a temperaturas de 150 o menores. La FDA requiere la deteccin y el anlisis de evidencia de enfermedades transmisibles slo para donantes alognicos de
productos de terapia celular y no para donaciones autlogas. Sin embargo, cuando sus productos deben ser almacenados,
muchos centros analizan donantes autlogos y productos segregados derivados de donantes autlogos quienes se sabe que
padecen enfermedades transmisibles. Un informe sobre contaminacin cruzada con hepatitis B de productos celulares dentro
de un tanque de almacenamiento de nitrgeno lquido llev a las prcticas actualmente vigentes de almacenamiento en la fase
de vapor de nitrgeno lquido y al uso de bolsas para envoltorio para reforzar la contencin del producto. El almacenamiento
en fase de vapor de nitrgeno lquido se puede asociar con gradientes de temperatura verticales: los productos en la parte
superior del tanque de almacenamiento pueden estar expuestos a una temperatura ms clida que los almacenados en la parte inferior del mismo. Los gradientes de temperatura deben ser monitoreados y se deben minimizar los gradientes de temperatura verticales, p.ej., mediante el uso de deflectores metlicos de calor. Las bolsas para envoltorio pueden reducir la velocidad
de entibiamiento de la muestra si se usan durante el proceso de descongelacin subsiguiente y su uso debe calificarse como
parte de la validacin general del proceso de crioconservacin.
El transporte de productos de terapia celular crioconservados a menudo se logra usando contenedores criognicos secos que
contienen material absorbente que se puede cargar con nitrgeno lquido para mantener temperaturas de fase de vapor por
un plazo de hasta 2 semanas cuando se cargan adecuadamente. Se deben usar registradores de datos para documentar el
historial de temperatura durante el transporte. Adems, dichos contenedores y procedimientos de transporte deben validarse
antes de transportar los productos de terapia celular para uso clnico en los envases.
Entibiamiento (Descongelacin)
Aunque la descongelacin de los productos de terapia celular en el rea adyacente a la cama de un paciente antes de la
infusin se ha considerado una prctica clnica comn, hoy en da el uso de personal capacitado en un ambiente de laboratorio controlado se reconoce como el mtodo preferido para la descongelacin debido a que permite un proceso ms estandarizado y un grado mayor de control cuando el personal debe responder a una falla en el envase, lo cual puede requerir la recuperacin de producto en un entorno ms estril. La descongelacin del producto por lo regular se realiza mediante inmersin
en baos de agua a 37 usando bolsas para envoltorio a fin de minimizar la prdida de producto y la contaminacin en caso
de fallas en el envase primario. Las bolsas pueden amasarse suavemente durante la descongelacin para reducir los gradientes
de temperatura en toda la bolsa y para acelerar la descongelacin. El producto se retira del bao de agua cuando todava hay
algo de hielo presente en el producto pero la mayora del producto se ha descongelado.
Procesamiento Posterior a la Descongelacin

El DMSO es txico para las clulas en suspensin lquida. La toxicidad puede reducirse diluyendo o lavando la suspensin de
clulas antes de la infusin o de la manipulacin adicional. Debido a que las clulas crioconservadas descongeladas son ms
sensibles a la expansin volumtrica cuando las clulas pasan de una solucin hipertnica a una solucin isotnica, las soluciones y mtodos de dilucin y lavado deben disearse y validarse cuidadosamente. El lavado de clulas usando una centrfuga
convencional o un dispositivo automtico puede resultar en tensin mecnica adicional para las clulas, por lo que las prdidas
celulares deben evaluarse con un mtodo apropiado antes de implementar un mtodo especfico en la prctica clnica.
Prcticas de Control de Calidad

La gestin de calidad de la crioconservacin, el almacenamiento y la descongelacin de productos de terapia celular clnica
deben incorporar elementos del sistema de calidad que se adhieran a las Buenas Prcticas para Tejidos (BPTv) y a las Buenas
Prcticas de Fabricacin (BPFv) vigentes, incluyendo calificacin del personal, controles de la instalacin, control de documentos, control de equipo y materiales, control de etiquetas y uso de Procedimientos Operativos Estndar validados (Ttulo 21 del
CFR 1271, 210 y 211). Las prcticas de control de calidad especficas para la crioconservacin incluyen por lo regular la evaluacin y documentacin de curvas de congelacin para todos los productos, la retencin de segmentos del sistema de tubos y
viales para anlisis subsiguiente y el monitoreo regular de la calidad del producto despus de la descongelacin. Las prcticas
requeridas por las Buenas Prcticas para Tejidos vigentes y que se aplican a todos los productos basados en clulas y tejidos
humanos incluyen medidas para asegurar registros y etiquetados exactos y completos, a fin de asegurar que el paciente reciba
el producto correcto y para permitir el rastreo del producto celular desde la recoleccin hasta la infusin. Las implicaciones
prcticas de estos requisitos son que el etiquetado y los registros, incluyendo los sistemas de inventario, para productos crioconservados deben disearse para prevenir errores en la identificacin de productos. Las verificaciones de la identidad de los
productos que se trasladan dentro y fuera del almacenamiento crioconservado se llevan a cabo de manera rutinaria, p.ej., con
dos personas verificando la etiqueta del producto contra los registros. Si fuera necesario para la verificacin adicional de la
identidad del producto, el contenido de un segmento del sistema de tubos acoplado a la bolsa de producto puede descongelarse y analizarse antes de descongelar todo el producto. La gua ISBT 128, un sistema internacionalmente reconocido de eti-
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quetado de productos sanguneos y de terapia celular, incorpora el uso de nomenclatura de productos y cdigos de barras
uniformes para productos desde su obtencin de la fuente donante hasta su administracin (ver el Apndice).
CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS
CLULAS MADRE MESENQUIMTICAS

La investigacin sobre el uso clnico de clulas madre mesenquimticas ha aumentado rpidamente desde mediados de la
dcada de 1990. Los mtodos confiables, seguros y eficientes de crioconservacin y almacenamiento tienen una importancia
crtica, en especial para los productos de clulas madre mesenquimticas alognicas estandarizados y de propiedades definidas, fabricados en mltiples dosis de producto para el tratamiento de un gran nmero de pacientes con una variedad de indicaciones clnicas.
Debido a que las clulas madre mesenquimticas se han generado en cultivos que contienen suero fetal bovino, los medios
de crioconservacin para dichas clulas han incorporado con regularidad suero fetal bovino. En la actualidad, se encuentra en
exploracin diversas alternativas al suero fetal bovino irradiado con rayos gamma para la expansin de cultivos antes de la crioconservacin, adems de que la crioconservacin ha resultado ser exitosa en medios que contienen DMSO al 5%10% y otros
componentes sin fuentes bovinas de protena. Aunque no existe un mtodo uniforme de procesamiento de las clulas posterior a la descongelacin, algunos protocolos incluyen la dilucin o el lavado de las clulas para mitigar los efectos del DMSO.
Las aplicaciones clnicas emergentes para las clulas madre mesenquimticas pueden requerir la dosificacin repetida del producto celular, lo cual es una prctica que requiere atencin a la inmunogeicidad potencial de los componentes del medio de
crioconservacin, p.ej., suero fetal bovino u otras protenas.
La evaluacin posterior a la descongelacin de las clulas madre mesenquimticas por lo regular ha incluido el uso de colorantes para evaluar la integridad de la membrana tales como azul triptano, expresin de antgenos de la superficie y evidencia
de que las clulas son capaces de diferenciarse en mltiples linajes. Debido a que el mecanismo de accin de las clulas madre
mesenquimticas puede implicar las propiedades inmunomoduladoras o trficas de las clulas, la evaluacin posterior a la descongelacin tambin debe incluir la funcin celular pertinente.
CLULAS LINFOIDES
Los linfocitos se usan para una variedad de aplicaciones clnicas incluyendo inmunoterapia para tratar cncer, infecciones
virales y enfermedades autoinmunes. La terapia basada en linfocitos puede constar de poblaciones mezcladas de linfocitos o
subpoblaciones de linfocitos que han sido seleccionadas o activadas ex vivo, p.ej., clulas T reguladoras, clulas asesinas naturales y clulas T activadas. Al igual que con las clulas hematopoyticas, los linfocitos por lo general se crioconservan usando
una solucin de DMSO al 10% y una velocidad de enfriamiento controlado de 1/minuto.
Los linfocitos pueden experimentar una extensa apoptosis despus de la descongelacin, la cual puede influir sobre la eficacia clnica de las clulas. Las poblaciones altamente purificadas de linfocitos pueden presentar niveles ms altos de apoptosis
posterior a la descongelacin que las poblaciones mezcladas de linfocitos. Se han utilizado estrategias tales como la inhibicin
de caspasa y el rescate con citoquina para disminuir la apoptosis de los linfocitos posterior a la descongelacin.
Captulos
Los estudios sobre las respuestas de las clulas madre hematopoyticas a la congelacin comenzaron en la dcada de 1950,
y las clulas madre hematopoyticas crioconservadas se han usado ampliamente en la prctica clnica durante los ltimos 30
aos. El mtodo ms comn de crioconservacin de clulas madre hematopoyticas para aplicaciones clnicas implica el uso
de DMSO al 10% y un congelador de velocidad controlada ajustado a una velocidad de enfriamiento de 1/minuto. Otro mtodo, de uso menos comn, implica el uso de congelacin pasiva del producto de clulas madre hematopoyticas en un congelador mecnico a 80 y el uso de una solucin de DMSO al 5% + almidn hidroxietlico al 6%. Las clulas por lo regular se
congelan a densidades de 3050 106 clulas/mL. Se ha demostrado que el exceso de citocritos en un 20% (v/v) reduce la
recuperacin celular. La evaluacin posterior a la descongelacin de la muestra consiste en la enumeracin de clulas nucleadas, clulas CD34+ viables y unidades formadoras de colonias hematopoyticas, junto con el clculo subsiguiente de recuperaciones a partir de valores de precongelacin correspondientes.
Las clulas madre hematopoyticas crioconservadas para uso clnico se pueden obtener a partir de la mdula sea, la sangre
perifrica movilizada o la sangre de cordn umbilical. Cada fuente tiene requisitos nicos para su conservacin. Por ejemplo,
los productos de clulas progenitoras de sangre perifrica contienen un mayor nmero de clulas y se pueden congelar en
bolsas mltiples con concentraciones celulares relativamente altas. Los protocolos para la conservacin de clulas de cordn
umbilical pueden incluir el uso de bombas con jeringas para introducir soluciones de crioconservacin mientras se minimiza el
estrs por smosis. Para clulas de cordn umbilical, las soluciones especializadas a menudo se usan despus de la descongelacin para diluir o eliminar el DMSO al tiempo que se minimiza el estrs por smosis para las clulas.
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Captulos
CONSERVACIN DE LNEAS DE CLULAS MADRE PLURIPOTENTES HUMANAS

Las clulas madre pluripotentes son clulas que parecen tener la capacidad de (1) autorrenovarse y replicarse indefiidamente
y (2) generar clulas que son representativas de los tres tejidos de la capa germinal necesarias para crear todas las clulas del
cuerpo humano como ha quedado demostrado por su capacidad de generar teratomas en ratones inmunodeficientes. Los dos
tipos predominantes de lneas de clulas madre usadas para la investigacin in vitro en el laboratorio son las clulas madre
embrionarias humanas y las clulas madre pluripotentes inducidas humanas. Las clulas madre embrionarias humanas se derivan de blastocistos excedentes donados mediante aislamiento y cultivo de la masa celular interna del blastocisto (el tejido que
habra evolucionado para formar el embrin). Las clulas madre pluripotentes inducidas humanas se crean mediante reprogramacin artificial de clulas somticas (mediante la liberacin de factores de reprogramacin usando una variedad de mtodos)
para producir clulas que expresen las propiedades crticas de las clulas madre pluripotentes citadas anteriormente. Las clulas madre pluripotentes inducidas humanas se pueden derivar de una variedad de tipos de clulas somticas usando una variedad creciente de mtodos para asegurar la expresin de ciertos factores de reprogramacin. Se sabe que una variedad de cultivos derivados de tejidos albergan poblaciones de clulas madre in vitro (p.ej., grasa subcutnea, mdula sea, cordn y sangre
de ombligo fetal, clulas germinales primordiales de la cresta neural fetal y cultivos de esferoides de clulas madre neurales)
que han demostrado tener una capacidad limitada para la replicacin in vitro y que no se han establecido como lneas de clulas madre diploides pluripotentes estables. Dichos cultivos no se tratan en este captulo; las siguientes secciones abarcan especficamente lneas de clulas madre embrionarias humanas y las clulas madre pluripotentes inducidas humanas.
Las lneas de clulas madre pluripotentes son cultivos celulares complejos de componentes mltiples y pueden contener una
variedad de poblaciones celulares distintas con grados mayores o menores de diferenciacin o compromiso de linaje. No obstante, se debe mantener la autorrenovacin, que es la propiedad clave de un cultivo de clulas madre. Asimismo, las clulas
deben conservar su capacidad de experimentar divisin asimtrica para generar dos clulas hijas diferentes: una que sea una
clula madre idntica a la clula progenitora y otra con un grado reducido de potencia (es decir, la capacidad de generar linajes celulares diferentes).
Desarrollo de Metodologas Actuales para Clulas Madre Pluripotentes

En la actualidad, cada laboratorio tiene una metodologa preferida, por lo que no existe un enfoque dominante para el uso
rutinario, y parece posible obtener niveles aceptables de viabilidad posterior a la descongelacin y recuperacin, ya sea por
vitrificacin o por crioconservacin a velocidad lenta controlada; sin embargo, en esta seccin se describe un mtodo comn
que resulta en una mejor recuperacin celular. En resumen, esta tcnica implica colocar colonias de clulas madre embrionarias humanas en una solucin de vitrificacin compuesta de DMSO al 20% + etilenglicol al 20% (EG) + sacarosa 0,5 mol/L
despus de equilibrar con soluciones de DMSO + EG de menor concentracin. Las colonias se cargan en pajuelas y se sumergen en nitrgeno lquido. Otro mtodo comn implica colocar colonias en una solucin que consta de DMSO al 10% (v/v) y
usando un dispositivo de congelacin pasiva o un congelador de velocidad controlada diseado para lograr una velocidad de
enfriamiento promedio de aproximadamente 1/minuto.
Las muestras de clulas madre pluripotentes inducidas o de clulas madre embrionarias humanas tienen requisitos especiales
de almacenamiento y transporte. Todas las muestras crioconservadas o vitrificadas deben almacenarse a temperaturas por debajo de la temperatura de transicin vtrea de la muestra, y para las muestras vitrificadas esta temperatura es mucho ms baja
(p.ej., 150) que para las muestras de clulas crioconservadas de manera comn. Asimismo, las fluctuaciones en las temperaturas durante el almacenamiento o transporte pueden llevar a la cristalizacin y, por ende, a la degradacin de la muestra.
Debido a que las muestras vitrificadas son sensibles a estas fluctuaciones de la temperatura, se deben transportar a temperaturas de nitrgeno lquido y no transportarse en hielo seco.
Los desafos para la conservacin confiable y reproducible de lneas de clulas madre pluripotentes recaen no slo en el proceso de conservacin mismo, sino tambin en los procesos de preparacin, crioproteccin y recuperacin. Especficamente, los
mtodos de recoleccin y manipulacin antes de la crioconservacin pueden resultar en prdidas celulares importantes. Los
procedimientos de procesamiento deben ser tan reproducibles como sea posible y adems debe usarse un Procedimiento
Operativo Estndar para mejorar la reproducibilidad de los resultados de la conservacin. Adems, la generacin efectiva de
bancos de lneas de clulas madre pluripotentes enfrenta los desafos impuestos por los mtodos mediante los cuales las clulas
regularmente se exponen a pasajes y se recolectan para conservacin (es decir, colonias individuales disecadas y transferidas
como pequeos fragmentos de colonia a matraces para cultivos frescos para su expansin o a un medio de conservacin para
su congelacin). Primero, para evitar la prdida extensa de viabilidad en las clulas recolectadas con anterioridad, los cultivos
usados para crear un banco pueden, en efecto, requerir conservacin en partidas pequeas durante un da de trabajo. Segundo, la preparacin de bancos de clulas madre pluripotentes que comprenden combinaciones ms pequeas de fragmentos
de colonias celulares no solo es larga y laboriosa, sino que tambin imposibilita la homogeneizacin de la preparacin de las
clulas antes de preparar las alcuotas en los viales, tal como sucedera con mtodos ms tradicionales de conservacin de lneas de clulas. Por ende, se ve comprometida la uniformidad entre viales de lneas de clulas madre pluripotentes. Tercero,
congelar clulas madre pluripotentes como fragmentos de colonias conserva las uniones de brechas que se forman entre las
clulas, lo que potencialmente lleva a la propagacin intercelular de cristales de hielo y la prdida extensa de viabilidad.
Para evitar algunos de estos problemas, los analistas pueden usar la desagregacin enzimtica de colonias para simplificar y
acelerar la recoleccin de clulas y para mejorar la crioconservacin de suspensiones de una sola clula ms homogneas antes
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de la conservacin. Como medida precautoria, algunos laboratorios eligen realizar la desagregacin enzimtica nicamente
antes de la crioconservacin, pero no para el cultivo de rutina. Siempre que sea posible, los analistas deben usar agentes enzimticos que no provengan de fuentes animales para la disociacin celular. Otra caracterstica importante de las lneas de clulas madre pluripotentes es la variable pero comn incidencia de diferenciacin no dirigida que ocurre dentro de las colonias y
que puede variar considerablemente a lo largo de muchas colonias en un cultivo. Las colonias con una alta proporcin de clulas diferenciadas deben desecharse debido a que las clulas diferenciadas son un componente indeseable de un cultivo de clulas madre pluripotentes y pueden afectar las propiedades de las clulas no diferenciadas dentro de la colonia.
Puntos a Considerar para la Conservacin de Lneas de Clulas Madre Pluripotentes

Los analistas deben considerar una variedad de factores importantes durante la conservacin de lneas de clulas madre pluripotentes que se deben tratar en los niveles de preparacin, recoleccin, generacin de bancos y anlisis de inventarios crioconservados.
EVALUACIN Y RECOLECCIN
Los analistas deben observar los cultivos celulares de manera regular. Se deben desechar los cultivos que presentan altos niveles de clulas diferenciadas. Un investigador o instalacin individual de generacin de bancos debe contar con un programa
de control de calidad que evale la diferenciacin de cultivos de manera regular, adems de desarrollar niveles de umbral de
diferenciacin aceptable en un cultivo. El protocolo de recoleccin, seguido del equilibrio de la muestra con agentes crioprotectores se debe llevar de manera expedita para minimizar las prdidas celulares debidas a la recoleccin.
Los procedimientos convencionales de generacin de bancos de clulas requieren el desarrollo de un banco de clulas maestro y de un banco de clulas de trabajo. Las clulas del banco de clulas maestro deben conservarse a un nmero de pasajes
temprano (P10P20) para que el trabajo experimental y de desarrollo de la lnea celular se lleve a cabo en clulas al menor
nmero de pasajes posible. El primer banco de clulas de trabajo debe establecerse con el nmero mnimo de pasajes para
lograr el nmero de clulas requerido. Posteriormente, a fin de promover la uniformidad, los bancos de clulas de trabajo se
pueden volver a colocar en el mismo nivel de pasaje usando clulas del banco maestro segn se requiera.
VIABILIDAD
Determinar la viabilidad y la funcin posterior a la descongelacin de las clulas madre pluripotentes puede ser complicado
y a menudo se lleva a cabo de manera incorrecta. El mtodo ms comn de evaluacin posterior a la descongelacin es el uso
de un colorante para evaluar la integridad de la membrana. Como una medida de la viabilidad, la fraccin de clulas con
membranas intactas se compara con aqullas que presentan membranas afectadas. Otro mtodo relativamente comn es
cuantificar las formaciones de colonias de clulas madre pluripotentes, en el cual se cuenta el nmero total de colonias sembradas en una placa antes y despus de un cierto tiempo de incubacin. Este mtodo tambin evala otras caractersticas funcionales de las clulas, tales como su capacidad para adherirse y proliferar. Se debe tomar en cuenta que los procedimientos
tales como la recoleccin y la crioconservacin pueden inducir la apoptosis. La tincin para marcadores apoptpicos tempranos (fosfatidilserina en la superficie celular) o tardos (Anexina VI) puede proveer informacin sobre la salud general de los cultivos congelados o descongelados.
HOMOGENEIDAD
Tal como se describi con anterioridad, la conservacin de fragmentos de colonias por vitrificacin puede exacerbar la carencia de homogeneidad entre viales o pajuelas de clulas. Cuando se establecen bancos ms grandes de clulas madre pluripotentes, los analistas deben analizar viales de prueba desde las posiciones tempranas, medianas y tardas en la secuencia de
llenado del banco de clulas para determinar la viabilidad, la velocidad de crecimiento y los marcadores clave segn se indica
en Viabilidad.
CUALIDAD DE LA CLULA MADRE
Para verificar que una lnea de clulas madre pluripotentes no ha perdido ninguna de sus caractersticas de clula madre
durante la conservacin, los analistas deben verificar la expresin de un nmero de marcadores clave relacionados con las clulas madre. Un estudio extenso analiz 59 lneas de clulas embrionarias humanas y un panel de 94 genes y resolvi cinco molculas relacionadas con clulas madre para las cuales el ARNm se expres de manera constante en las clulas embrionarias
humanas. Estos genes hoy en da se incluyen en las tarjetas de genes de microfluidos comercialmente disponibles que se disean especficamente para la investigacin de poblaciones de clulas madre. Resulta crucial demostrar que las clulas madre
Captulos
PROCESO DE GENERACIN DE BANCOS
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pluripotentes han conservado su pluripotencia, posteriormente se puede realizar una variedad de pruebas de caracterizacin,
incluyendo la formacin de teratoma en ratones inmunodeficientes, la formacin de cuerpos embrionarios trilaminares y la diferenciacin dirigida para demostrar que el cultivo puede producir representantes de cada uno de los tres tejidos de capa germinal que son necesarios para formar todas las clulas del cuerpo humano.
ESTABILIDAD GENTICA
En ambas lneas de clulas madre pluripotentes inducidas y de clulas madre embrionarias humanas, resulta comn el surgimiento de clones de cariotipo anormal en el pasaje extendido y el sobrecrecimiento del cultivo. Por ende, los analistas deben
monitorear los cultivos para detectar dichas clulas anormales. Tradicionalmente, esto se ha llevado a cabo mediante estudios
cariotpicos de clulas en metafase usando tincin con Giemsa. La ocurrencia de clulas no diploides, incluso a una incidencia
muy baja, puede ser problemtica. Los documentos gua tales como la 2009 International Stem Cell Banking Initiative (Iniciativa Internacional para la Generacin de Bancos de Clulas Madre) son tiles para determinar si dichos cultivos deben desecharse. No obstante, los procedimientos ms recientes tales como la hibridacin de arreglo de genoma comparativo y el arreglo de
polimorfismo de un solo nucletido proveen anlisis mucho ms detallados de estabilidad gentica y se pueden usar en paralelo con bandeo con Giemsa para proveer una mayor confianza en trminos de estabilidad gentica.
Captulos
MEJORES PRCTICAS
Adems de seguir las buenas prcticas para cultivos celulares, los analistas deben tomar en cuenta la disponibilidad de una
gua especfica que contenga principios y mejores prcticas para la adquisicin, generacin de bancos, anlisis y almacenamiento de clulas madre embrionarias humanas para propsitos de investigacin (ver la referencia a la ISCB 2009 en el Apndice). Esta gua es til para las lneas de clulas madre pluripotentes inducidas y de clulas madre embrionarias humanas.
SUSTRATOS CELULARES USADOS EN LA PRODUCCIN Y CARACTERIZACIN DE PRODUCTOS

TERAPUTICOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGA Y PRODUCTOS TERAPUTICOS
BIOLGICOS
Una amplia variedad de clulas recombinantes y no recombinantes se crioconservan y usan en la produccin y caracterizacin de productos biolgicos y obtenidos por biotecnologa humanos (se encuentra disponible ms informacin en la gua ICH
Q5D Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Biotechnological/Biological Products [Derivacin y Caracterizacin
de Sustratos Celulares Usados Para Productos Biotecnolgicos/Biolgicos]). Los grupos principales incluyen lneas de clulas derivadas de mamferos (incluyendo humanos), insectos (principalmente polillas) y cepas seleccionadas de bacterias y levaduras.
Los sustratos microbianos ms comunes usados para la produccin de productos humanos obtenidos por biotecnologa son
cepas recombinantes de Escherichia coli, Pichia pastoris o Saccharomyces spp. (levaduras). Independientemente del alto grado
de diversidad entre los tipos de clulas usadas para fabricar productos biolgicos y obtenidos por biotecnologa, existe un sorprendente grado de uniformidad entre las prcticas de crioconservacin, y los mismos principios se aplican a clulas usadas
para la fabricacin y a aqullas usadas en pruebas para determinar la presencia de agentes adventicios y potencia de los productos.
Por lo regular, se usa un sistema de generacin de bancos de clulas de dos o tres niveles para el mantenimiento de lneas
de clulas de fabricacin o cepas microbianas. Para aqullos que usan un sistema de tres niveles, el banco del primer nivel
puede denominarse banco de investigacin, de siembra, de inventario, de adquisicin, banco previo al banco de clulas maestro o banco de clulas parentales. La fuente del banco de clulas previo al banco de clulas maestro puede ser un laboratorio
de investigacin o desarrollo, o las clulas pueden adquirirse en un depsito comercial. Es recomendable caracterizar el banco
de clulas parentales antes de usarlo en la clonacin. El banco de clulas maestro o inventario de clulas maestro del segundo
nivel (o primer nivel en un sistema de dos niveles) se prepara directamente de este banco de clulas parentales con mnimos
pasajes o generaciones celulares. El banco de clulas maestro o el inventario de clulas maestro se analiza extensamente para
confirmar la pureza, el fenotipo, el genotipo, la expresin de protenas u otros atributos importantes. El banco de clulas de
trabajo o inventario de clulas de trabajo se deriva a partir de viales del banco de clulas maestro despus de pasajes sucesivos
en cultivo. El banco de clulas de trabajo es el sustrato de clulas de fabricacin cuyo tamao se incrementa a travs de subcultivos repetidos para sembrar el biorreactor de produccin final, el fermentador o el lote de vasos de cultivo (p.ej., frascos rodantes). En cada nivel del sistema de banco de clulas, la crioconservacin adecuada es primordial para el xito del desarrollo
del producto y de la fabricacin. En algunos casos, las clulas del final de produccin tambin se puede acumular en bancos
para propsitos de anlisis como parte de la calificacin del banco de clulas.
Lneas Celulares de Mamferos e Insectos

Las lneas celulares de mamferos son los sustratos celulares preferidos para la produccin de molculas de protenas complejas. Las clulas de mamferos poseen la maquinaria biolgica intrnseca necesaria para la glicosilacin postranslacional de protenas que a menudo es crtica para la estabilidad y bioactividad en humanos. Ambas lneas celulares diploides y heteroploides
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(incluyendo hibridomas) se usan para la produccin de productos teraputicos obtenidos por biotecnologa. Las lneas celulares diploides son sustratos de vacunas comunes [p.ej., WI-38 y MRC-5 (lneas celulares de fibroblastos humanos), BHK-21 (lnea
celular de rin de hamster beb) y MDCK (rin canino Madin-Darby)]. Adems, la lnea celular Vero de mono verde africano
(una lnea de clulas heteroploides) se usa para varias vacunas autorizadas en EE.UU. Hoy en da, las lneas celulares heteroploides de uso comn incluyen varias lneas celulares recombinantes de Ovario de Hmster Chino y de rin embrionario humano.
Los mtodos de crioconservacin estn bastante bien estandarizados para estas lneas celulares. No obstante, puede resultar
til para los investigadores investigar la toxicidad de los diversos crioprotectores y concentraciones al usar un nuevo sustrato
celular.
Las lneas celulares de insectos han probado su capacidad para producir diversos polipptidos recombinantes. Las lneas celulares ms comunes se derivan de las polillas Spodotera frugiperda y Trichoplusia ni, y sus lneas celulares establecidas se denominan Sf9 y Tn5 (o High Five), respectivamente. La produccin de protenas recombinantes emplea la infeccin por baculovirus recombinante para la transferencia de genes heterlogos. Aunque las lneas celulares de insectos requieren diferentes factores nutricionales, temperaturas de incubacin ms bajas y mayor osmolaridad que sus contrapartes mamferas, los mismos
elementos esenciales de crioconservacin se aplican a ambos grupos.
Adems de las guas provistas en la seccin Elementos Clave de la Prctica de Crioconservacin, se deben tomar en cuenta
estos puntos adicionales para sustratos de lneas celulares animales:
PROCESAMIENTO PREVIO A LA CONGELACIN
AGENTES CRIOPROTECTORES Y CRIOENVASES
El agente crioprotector de membrana permeable preferido es el DMSO al 5%10% (v/v) diluido en medio de cultivo fresco.
Para algunas lneas celulares sensibles, el medio acondicionado para cultivo de clulas se puede agregar para complementar el
medio de crioconservacin. El DMSO debe ser estril y de grado para cultivo de tejidos (pureza >99%). El crioenvase ms
apropiado es un vial con tapa de rosca de polipropileno preesterilizado diseado para almacenamiento criognico en fase de
vapor de nitrgeno lquido.
INTRODUCCIN DEL MEDIO DE CRIOCONSERVACIN
Inmediatamente despus de la centrifugacin de las clulas, el medio de crecimiento se elimina de los pellets de clulas y las
clulas se resuspenden suavemente mediante la adicin lenta de medio de crioconservacin que a menudo se enfra previamente para muchos tipos de clulas. La suspensin de clulas se diluye inmediatamente con un volumen apropiado de medio
de crioconservacin basndose en el recuento de clulas viables y la densidad celular deseada (por lo regular, los bancos de
clulas se producen a una densidad de clulas viables de aproximadamente 1 107 clulas/mL). Tal como se mencion en la
seccin anterior, el medio de crioconservacin es altamente hipertnico, por lo que se debe limitar el tiempo de exposicin. La
suspensin de clulas final se transfiere a un vaso en el que las clulas se pueden mezclar suavemente durante el llenado del
vial para facilitar la uniformidad del banco de clulas.
ENFRIAMIENTO, CONGELACIN Y ALMACENAMIENTO CONTROLADOS
Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una mquina de llenado automtico de viales. En cualquier caso, los viales a menudo se refrigeran a medida que el llenado progresa para minimizar los
efectos txicos potenciales del DMSO a temperaturas ms altas. Se deben establecer lmites de tiempo para todo el proceso de
llenado y registrarse en el registro de partida. Inmediatamente despus de llenar los viales, los analistas deben transferirlos a un
congelador de velocidad controlada o, como alternativa, en un congelador esttico ultrafro (p.ej., 80) usando un envase
aislado y diseado para el enfriamiento controlado. Cualquier sistema de congelacin controlada debe calificarse adecuadamente para asegurar que las velocidades de enfriamiento esperadas se apliquen para todos los viales dentro de la carga. Al usar
un congelador de velocidad controlada, los analistas determinan programas de enfriamiento ptimos de manera emprica, pero una velocidad en el intervalo de 15/minuto despus de la transicin a travs del calor de la fusin debe ser aceptable
para la mayora de las lneas celulares (en temperaturas ms fras que aproximadamente 40, la velocidad se puede incrementar, p.ej., 10/minuto). Despus de que los viales se hayan congelado hasta una temperatura de aproximadamente 80 o menor en el sistema de congelacin, se transfieren lo ms pronto posible a unidades de almacenamiento en fase de vapor de
nitrgeno lquido.
Captulos
Los analistas deben asegurar que las clulas no estn contaminadas y que an son viables. Para clulas diploides, los analistas
deben fomentar el crecimiento hasta un nivel de pasaje que mantenga la diploida y est por debajo del nivel previsto para su
uso. Los analistas combinan cultivos celulares y realizan un recuento de clulas para determinar el nmero de clulas viables
disponibles para la generacin de bancos. Las clulas recolectadas se centrifugan a una velocidad relativamente baja durante
un tiempo corto, p.ej., 100200 g durante 510 minutos, de preferencia usando una centrfuga refrigerada.
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ENTIBIAMENTO Y DESCONGELACIN DEL VIAL
En general, las clulas congeladas a una velocidad de congelacin lenta deben descongelarse a la mayor velocidad posible
para maximizar la viabilidad celular. Para asegurar la uniformidad de la temperatura, los viales deben transferirse directamente
desde el almacenamiento en fase de vapor de nitrgeno lquido a un transportador en fase de vapor (seco) porttil para su
transporte al laboratorio. En ocasiones, cuando no se cuente con un dispositivo Dewar de nitrgeno lquido, los viales pueden
empacarse en hielo seco, pero se debe demostrar que este proceso es adecuado debido a que puede resultar en cambios de
pH perjudiciales. Despus de transferirlos al laboratorio, los viales se colocan directamente en un bao de agua tibia (p.ej., a
37, asegurando que las tapas no queden sumergidas), en un bao de perlas o en un termobloque. Se debe tomar en cuenta
que las lneas celulares de insectos deben descongelarse a 2730. Los viales deben agitarse para facilitar la descongelacin
uniforme de las clulas. Inmediatamente despus de la descongelacin, los viales deben transferirse a la cabina de seguridad
biolgica e higienizarse antes de abrirlos. Por lo regular, el medio de crecimiento se agrega lentamente a las clulas descongeladas mientras se agita a fin de diluir el DMSO y reducir lentamente la osmolaridad del entorno posterior a la descongelacin a
un nivel fisiolgico.
PROCESAMIENTO POSTERIOR A LA DESCONGELACIN
Captulos
Esta etapa se puede lograr con diversos mtodos, pero los analistas deben conseguir una dilucin suficiente del DMSO y
devolver a las clulas a su ambiente isotnico de crecimiento normal. Se debe minimizar la manipulacin de las clulas inmediatamente despus de la descongelacin debido a las tensiones inducidas por el proceso de congelacindescongelacin. Por
ejemplo, se debe minimizar el pipeteo y la centrifugacin.
Cepas Microbianas: E. Coli, Levadura y Cepas de Vacunas Bacterianas

Las cepas de E. coli recombinantes cuentan con un registro de rastreo comprobado para la produccin de una variedad de
productos obtenidos por biotecnologa comercialmente disponibles, incluyendo anlogos de insulina recombinantes, hormona
de crecimiento humana y hormona paratiroidea. En comparacin con sus contrapartes mamferas y derivadas de insectos, las
cepas de E. coli recombinantes son relativamente simples de cultivar e incrementar el tamao de los cultivos de produccin
hasta volmenes grandes de, p.ej., 40 000 L. No obstante, las bacterias carecen de la sofisticada maquinaria celular para construir molculas de protenas ms complejas que requieren modificaciones postranslacionales tales como la glicosilacin. Las levaduras son clulas eucariticas unicelulares que se pueden manipular genticamente para producir un amplio rango de protenas recombinantes y pptidos con complejidad limitada. A pesar de las distancias evolucionarias entre los sustratos celulares
mamferos y microbianos, se aplica el mismo conjunto de elementos esenciales para la crioconservacin descritos con anterioridad, con los siguientes puntos especficos:
PROCESAMIENTO PREVIO A LA CONGELACIN
Los cultivos deben propagarse en matraces para agitacin hasta una fase logartmica tarda o estacionaria temprana usando
condiciones de crecimiento especficas para la cepa.
AGENTES CRIOPROTECTORES Y CRIOENVASES
El crioprotector de pared celular o de membrana celular permeable preferido es el glicerol (aunque tambin se usa en ocasiones el DMSO) a concentraciones que por lo general van de 5%10% (v/v). El glicerol sinttico se debe usar para el registro
de productos comerciales junto con otras materias primas exentas de componentes de origen animal.
INTRODUCCIN EN EL MEDIO DE CRIOCONSERVACIN
Debido a que las clulas microbianas poseen paredes celulares para la proteccin y el sustento del contenido citoplsmico, la
manipulacin fsica y los cambios osmticos no tienen el mismo impacto negativo observado en las lneas celulares animales.
Inmediatamente despus de la centrifugacin, los pellets de clulas se resuspenden vigorosamente en medio de crioconservacin (hasta una dilucin basada en los requisitos del banco de clulas para el nmero de viales y las unidades formadoras de
colonias viables/mL). Esta etapa de dilucin se puede basar en la medicin activa de la densidad ptica del cultivo u otros ensayos de enumeracin celular. La suspensin de clulas final se transfiere a un vaso en el que las clulas pueden mezclarse durante el llenado de envases finales para facilitar la uniformidad del banco de clulas. Debido a la potencial toxicidad, los analistas deben limitar el tiempo de exposicin al glicerol, independientemente de la robustez relativa de las clulas microbianas.
Los viales pueden llenarse manualmente usando un dispositivo de pipeteo manual o usando una mquina de llenado automtico de viales.
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Informacin General / 1045 Artculos Obtenidos por Biotecnologa 909

ENFRIAMIENTO, CONGELACIN Y ALMACENAMIENTO CONTROLADOS
Una vez ms, debido a su robustez inherente, las clulas microbianas no requieren un control tan estricto de la velocidad de
enfriamiento como las lneas celulares animales. Por consiguiente, la eleccin del sistema o mtodo de congelacin tiene un
efecto menor sobre la viabilidad del banco de clulas. Los crioenvases llenos simplemente pueden ser transferidos a un congelador a aproximadamente 80 durante toda la noche seguido de una transferencia a la fase de vapor de nitrgeno lquido.
Como alternativa, podra omitirse el almacenamiento de los bancos de clulas microbianas en nitrgeno lquido y almacenarlos a una temperatura de aproximadamente 80. Sin embargo, si se dispone de almacenamiento en nitrgeno lquido, ste se
prefiere para el almacenamiento a largo plazo (p.ej., aos). Si se utiliza un congelador de velocidad controlada, entonces debe
someterse a una calificacin completa para asegurar que provea una velocidad de enfriamiento uniforme que est dentro de
un intervalo esperado, p.ej., 15/minuto.
ENTIBIAMIENTO Y DESCONGELACIN DEL ENVASE
El control de las velocidades de enfriamiento y entibiamiento resulta menos crtico para las clulas microbianas, aunque tambin se deben descongelar lo ms rpido posible usando un bao de agua tibia (p.ej., 3035). Las temperaturas se pueden
ajustar a la temperatura de incubacin de la cepa.
PROCESAMIENTO POSTERIOR A LA DESCONGELACIN
APNDICE
FDA. Guidance for industry: characterization and qualification of cell substrates and other biological materials used in the
production of viral vaccines for infectious disease indications. 2010. http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf. Consultado el 24 de septiembre de
2012.
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Consultado el 01 de octubre de 2012.
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www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q5D/Step4/Q5D_Guideline.pdf. Consultado el
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Andrews PW, Arias-Diaz J, Auerbach J, et al. Consensus guidance for banking and supply of human embryonic stem cell
lines for research purposes: International Stem Cell Banking Initiative. Stem Cell Rev. 2009; 5(4):301314.
WHO. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for characterization of cell banks. 2010. http://www.who.int/biologicals/Cell_Substrates_clean_version_18_April.pdf. Consultado el 26 de julio de 2013.
1045 ARTCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGA

Las sustancias macromoleculares se pueden obtener mediante varios mtodos, entre ellos la extraccin desde fuentes naturales, la modificacin de protenas de origen natural, el cultivo in vitro o in vivo de clulas de mamferos, la produccin mediante microorganismos y la sntesis qumica. Desde el punto de vista de la Farmacopea, los artculos constituidos por macromolculas que se obtienen a partir de procesos biotecnolgicoso ms especficamente a partir de la tecnologa de ADN recombinante (ADNr), la tecnologa de hibridomas y lneas celulares continuas transformadasson artculos que tienen nombres
oficiales y normas pblicas oficiales para establecer su identidad, contenido (potencia), calidad y pureza. Los avances logrados
en gentica y en las aplicaciones de la ingeniera gentica han permitido que la produccin de artculos macromoleculares
existentes y nuevos sea tecnolgica y econmicamente factible.
Captulos
Se agrega medio de crecimiento para diluir las clulas descongeladas hasta un nivel deseado de unidades formadoras de
colonias/mL y para inducir la eliminacin del glicerol intracelular.
Todas las clulas se crean de manera distinta y son divergentes por naturaleza. Los sustratos celulares usados para la fabricacin de productos biolgicos y obtenidos por biotecnologa humanos estn separados por un amplio periodo evolutivo. Afortunadamente para las personas dedicadas a los cultivos celulares industriales, las estrategias de crioconservacin se renen en
un conjunto de principios y mtodos compartidos que se traducen a lo largo de las vas evolutivas.
Captulos
910 1045 Artculos Obtenidos por Biotecnologa / Informacin General
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Se han documentado ampliamente las tecnologas utilizadas para producir una protena mediante procesos biotecnolgicos
y el gobierno federal ha establecido pautas generales. Los productos biotecnolgicos pueden reglamentarse como frmacos,
productos biolgicos o de diagnstico, segn su origen, su composicin y el uso al que estn destinados. La biotecnologa
permite nuevos enfoques que pueden dificultar la aplicacin de las definiciones clsicas de estas categoras; por consiguiente,
la FDA ha aconsejado a los fabricantes que soliciten aclaraciones en las primeras etapas de desarrollo, para determinar cmo se
reglamentar un producto cuando no es obvia su clasificacin.1 El esquema regulatorio general para los productos obtenidos
mediante biotecnologa es el mismo que para los productos de la misma categora producidos por mtodos de fabricacin
tradicionales, con la adicin de requisitos especficos adecuados para los productos obtenidos por biotecnologa. Los requisitos
generales se describen principalmente en las partes correspondientes del Cdigo de Reglamentaciones Federales, Ttulo 21.
Los Institutos Nacionales de la Salud (National Institutes of Health o NIH) han publicado pautas relativas a la investigacin de
ADNr que son obligatorias para cualquier investigacin, tanto de carcter pblico como privado, subvencionada por los NIH.
Estas pautas tienen amplia aceptacin y es frecuente que instituciones y empresas que no se encuentran especficamente bajo
su jurisdiccin las cumplan voluntariamente.2 Las prcticas de seguridad para laboratorios, en particular la proteccin contra
materiales potencialmente infecciosos, son un motivo de preocupacin.3 La produccin de artculos macromoleculares mediante procesos biotecnolgicos consiste inicialmente en la clonacin de un gen especfico en el laboratorio, o en la construccin de un gen sinttico, con su posterior insercin en una clula anfitriona y su subclonacin en un microorganismo o cultivo
celular; luego, se lleva a cabo un desarrollo de proceso a escala piloto para optimizar su rendimiento y calidad y, finalmente,
tienen lugar la fermentacin o los procesos de cultivo celular a gran escala. El paso siguiente, que es el ms importante en el
desarrollo de las monografas farmacopeicas, es la purificacin de las protenas macromoleculares. Luego siguen pruebas en
animales, pruebas clnicas, la aprobacin reglamentaria y la comercializacin del producto.
Por lo general, el desarrollo de normas pblicas adecuadas para estos artculos macromoleculares est estrechamente vinculado a la tecnologa de procesamiento empleada y a las caractersticas fisicoqumicas y biolgicas de un frmaco especfico. En
las caracterizaciones de estos artculos para asegurar su seguridad, pureza y actividad se deben incorporar tcnicas clsicas as
como mtodos especficos a esa tecnologa. Existe siempre la posibilidad de que estos artculos puedan causar efectos secundarios en los pacientes que los emplean debido a una sensibilizacin inmunolgica como resultado de una nica (o mltiple)
modificacin molecular. Esta posibilidad requiere una caracterizacin precisa de estas sustancias. Aunque tericamente es posible elaborar normas pblicas para un artculo macromolecular, no es posible desarrollar normas especficas que contemplen
todos los mtodos de produccin. La perspectiva de la Farmacopea es elaborar normas pblicas que puedan aplicarse a un
producto final y que aseguren el mantenimiento de su seguridad, identidad, contenido, calidad y pureza aun cuando no exista
un conocimiento total de los detalles de su produccin.
Las pruebas de identidad, pureza y actividad normalmente requieren el uso de Estndares de Referencia USP. Es necesario
tener en cuenta qu Estndares de Referencia USP podran requerirse y cul podra ser su pertinencia con respecto al mtodo
de produccin y su relacin con las caractersticas de un producto final. Estas decisiones deben tomarse en forma individual
segn cada producto. Se considera deseable el uso de Estndares de Referencia USP representativos de los productos especficos que se han evaluado mediante pruebas clnicas y que estn plenamente caracterizados.
Aunque la temprana incorporacin de mtodos generales de anlisis de frmacos macromoleculares en la USP podra conducir a una rpida estandarizacin de los mtodos, la tecnologa y los procedimientos analticos estn evolucionando muy rpidamente. Los procedimientos analticosqumicos, fsicos, microbiolgicos e inmunolgicosse incluyen en las monografas
especficas de cada producto.
EL ALCANCE DE LA BIOTECNOLOGA EN EL DESARROLLO DE ARTCULOS FARMACOPEICOS

Definicin de BiotecnologaPerspectiva Histrica
En su definicin ms amplia, la biotecnologa se refiere al uso de organismos vivos, incluyendo clulas aisladas de mamferos,
para la elaboracin de productos beneficiosos. Esta definicin colocara al alcohol, la produccin de antibiticos y el procesamiento de lcteos, por ejemplo, dentro del espectro de la biotecnologa. Sin embargo, el inters generado en la actualidad por
la biotecnologa es fundamentalmente el resultado de dos importantes avances. El primero fue el desarrollo de la tecnologa de
ADNr, que permite trasplantar genes de una especie a otra. De esta manera, el gen que codifica la expresin de una protena
deseada (generalmente humana) podra insertarse en una clula anfitriona procaritica o eucaritica de manera que la clula
anfitriona exprese posteriormente cantidades utilizables de la protena deseada. El segundo gran avance fue el desarrollo de
tcnicas para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (es decir, anticuerpos provenientes de un solo linfocito).
La biotecnologa dentro de la industria farmacutica se refiere, en general, a la elaboracin de productos proteicos empleando tcnicas de ADNr o a la produccin de anticuerpos monoclonales. Otras tecnologas, como por ejemplo los animales y las
1 Existe una serie de documentos titulados Points to Consider (Puntos a Tener en Cuenta) que pueden solicitarse al Director de la FDA a la siguiente direccin:
Director, FDA Center for Biologics Evaluation and Research, HFB-1, 8800 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892.
2 Estas pautas se publicaron originalmente en el Diario Oficial (Federal Register), Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules (Pautas para la Investigacin de Molculas de ADN Recombinante) 1986; 51 (88): 16957-16985. Se pueden obtener copias en: Office of Recombinant DNA Activities, 12441 Parklawn
Drive, Suite 58, Rockville, MD 20852.
3 Existen unas pautas integrales, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Bioseguridad en Laboratorios Microbiolgicos y Biomdicos), que pueden
solicitarse a: Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office, Washington, DC 20402, N 107-040-000508-3.
USP 38
plantas transgnicos, la terapia gnica y el ADN con una secuencia en direccin antiparalela (de antisentido), podran tener
consecuencias para la industria farmacutica en el futuro pero no estn dentro del alcance de este captulo.
Tecnologa ADNr
Anticuerpos Monoclonales
Los anticuerpos son protenas producidas por linfocitos B diferenciados. Cada linfocito produce un anticuerpo de especificidad definida (es decir, la molcula de anticuerpo reconoce un sitio especfico o eptopo en el antgeno). Los anticuerpos que se
producen en animales inmunizados se forman a partir de muchos clones diferentes de linfocitos B, de donde deriva el trmino
anticuerpos policlonales. Dado que al tomar sangre de estos animales se obtienen, por definicin, mezclas de anticuerpos policlonales, los antisueros tienen sitios de reconocimiento de eptopos mltiples con una amplia variedad de constantes de unin
(avidez) y, en consecuencia, varan de un lote a otro. Los anticuerpos que se producen a partir de lneas de clulas inmortalizadas (hibridomas) provenientes de una nica clula B se denominan anticuerpos monoclonales. La cosecha de estos cultivos
conduce a un anticuerpo de reconocimiento especfico de un eptopo con una constante de unin homognea.
Los linfocitos B tienen una vida finita en cultivo y es necesario inmortalizarlos para permitir la produccin continua de anticuerpos monoclonales. En la actualidad, el procedimiento ms comn es mediante la fusin qumicamente provocada de una
clula esplnica de ratn con una clula de mieloma de ratn. La clula hibridoma ratn-ratn resultante hereda de la clula
del mieloma la capacidad de replicarse continuamente en cultivo y de la clula esplnica, la capacidad de producir el anticuerpo monoclonal deseado. Los bancos de clulas de la lnea de clulas hibridoma pueden emplearse para producir un suministro
continuo del anticuerpo monoclonal, ya sea in vivo (es decir, mediante la inyeccin en ratones seguida de la recoleccin del
lquido asctico) o in vitro (es decir, mediante tcnicas de cultivo celular convencionales). Cabe mencionar que los recientes
avances en gentica molecular han llevado al desarrollo de transfectomas y esquemas de produccin basados en E. coli y bacterifagos que pueden ofrecer ventajas en la produccin futura de anticuerpos monoclonales.
La validacin de procesos, la purificacin y las observaciones analticas para anticuerpos monoclonales son conceptualmente
similares a las empleadas en los productos de ADNr. Esto se debe a que ambos tipos de productos son protenas y, en consecuencia, requieren un manejo y un procedimiento de valoracin similares. Como los anticuerpos monoclonales son el producto de lneas de clulas inmortalizadas, es importante excluir o desactivar eficazmente los posibles contaminantes del cido nucleico viral durante los procesos de fabricacin, como en el caso de los productos recombinantes de lneas celulares continuas.
Las aplicaciones comerciales de anticuerpos monoclonales incluyen el uso teraputico y de diagnstico. En algunos casos, el
anticuerpo monoclonal se acopla a otra sustancia (por ejemplo, un agente oncoltico, un radionucleido o una toxina), resultando un anticuerpo conjugado que es el producto final de inters. En este caso, tanto el anticuerpo intermedio como el producto
final requieren un extenso desarrollo de procesos y caracterizacin analtica.
En este captulo, el alcance de la biotecnologa se limitar a los productos farmacuticos de anticuerpos monoclonales y
ADNr.
Captulos
En esta seccin se describen los pasos principales para la aplicacin de la tecnologa ADNr a la produccin de una protena
deseada. El primer paso crtico es la identificacin de la protena que se desea producir y, luego, el aislamiento del gen correspondiente (es decir, la secuencia de ADN que codifica la protena deseada). Una vez aislado y caracterizado totalmente, este
gen se inserta en un vector apropiado, como por ejemplo un plsmido, que es un segmento extracromosmico de ADN que
suele encontrarse en determinadas bacterias. A continuacin, se inserta el plsmido en la clula anfitriona. Se aslan los clones
de la lnea celular anfitriona transformada y aquellos que producen la protena de inters en las cantidades deseadas se conservan como un banco de clulas bajo condiciones apropiadas. A medida que las necesidades de fabricacin aumentan, se puede
aumentar la cantidad de clulas clonadas mediante un proceso de fermentacin o de cultivo celular para obtener el producto
proteico.
Aunque el proceso de ADNr se describe ms detalladamente en otra parte de este captulo, se debe prestar atencin a los
siguientes puntos clave. El vector (plsmido) contiene, en general, un marcador que se puede emplear para identificar las clulas que contienen este gen. Este se incluye adems del gen codificador de la protena de inters y las secuencias de nucletidos
regulatorias necesarias para la replicacin del plsmido y la transcripcin del ARN mensajero (ARNm) (el primer paso en la sntesis de protenas). La seleccin de las clulas deseadas se simplifica dado que slo las clulas correctamente transformadas que
contienen el gen marcador seleccionable sobrevivirn bajo las condiciones de cultivo usadas para identificar y reproducir las
clulas transformadas. Por lo general, los marcadores bacterianos y eucariticos seleccionables pueden incluir la resistencia a
antibiticos y genes que complementan una mutacin auxotrfica de la clula anfitriona. Hay numerosos ejemplos de ambos
tipos de marcadores en cada sistema.
Existen diferencias significativas entre las clulas procariticas y eucariticas en el proceso de produccin de ADNr. En general, las clulas bacterianas expresan una mayor concentracin de producto proteico y requieren medios relativamente sencillos.
Sin embargo, las clulas procariticas no realizan muchas modificaciones importantes posteriores a la traduccin, como por
ejemplo la glicosilacin e, histricamente, no ha sido posible expresar protenas grandes en E. coli. Estas limitaciones requieren,
en muchos casos, el uso de clulas eucariticas. Las diferencias de produccin entre las clulas anfitrionas eucariticas y procariticas tienen repercusiones importantes que se reflejan en los requisitos para la validacin de procesos, la purificacin y la
metodologa analtica. Estos requisitos se tratan ms adelante en este captulo.
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PROCESOS DE PRODUCCIN CARACTERSTICOS

La principal diferencia entre los productos obtenidos por biotecnologa y otros productos farmacuticos consiste en los medios de produccin para generar el producto. La biotecnologa emplea organismos vivos genticamente modificados para producir protenas o productos peptdicos. Esta afirmacin es vlida tanto para productos derivados de ADNr como para productos derivados de anticuerpos monoclonales. En consecuencia, los productos obtenidos por biotecnologa se diferencian fcilmente de las protenas o los pptidos que se han obtenido por aislamiento de materiales de origen natural, como por ejemplo
plasma, suero o tejido, o por sntesis qumica.
Los productos obtenidos por biotecnologa no son significativamente diferentes de otros frmacos proteicos despus del
proceso de purificacin de protenas. Por lo tanto, los requisitos bsicos para la validacin de procesos, el control ambiental, la
fabricacin asptica y los sistemas de control de calidad y garanta de calidad son fundamentalmente los mismos para todos
los productos farmacuticos. Sin embargo, la complejidad de estos sistemas suele ser mayor para los productos obtenidos por
biotecnologa ya que su produccin requiere, por lo general, procesos de propagacin de clulas altamente desarrollados, mtodos de purificacin complicados y un control analtico para asegurar su homogeneidad, uniformidad entre lotes y seguridad.
Esta seccin describe con cierto detalle slo aquellos factores significativos caractersticos del procesamiento de productos
obtenidos por biotecnologa. Entre ellos se encuentran las descripciones de los distintos sistemas de produccin biolgicos utilizados actualmente y un anlisis de los problemas relacionados con la purificacin.
Captulos
Produccin de ADNr
En la actualidad, los productos de ADNr se generan en sistemas procariticos (bacterias) o eucariticos (por ejemplo, levaduras o cultivo de clulas de mamferos). Por lo general, la eleccin del organismo de produccin depende directamente de la
complejidad molecular de la protena que se va a producir, as como de la economa y eficiencia de la fermentacin o el cultivo
celular. Los primeros productos obtenidos por biotecnologa se produjeron en E. coli debido a la amplia comprensin de su
biologa molecular. En los ltimos aos, sin embargo, el uso del cultivo de clulas eucariticas a gran escala se ha vuelto relativamente comn.
PRODUCCIN EN CLULAS PROCARITICAS (BACTERIAS)
La produccin bacteriana de productos obtenidos por biotecnologa ofrece varias ventajas caractersticas, as como ciertas
desventajas. Como se ha sealado antes, se ha estudiado y documentado ampliamente la biologa bacteriana y el uso seguro y
eficaz de E. coli como organismo anfitrin en la produccin. Por lo tanto, la expresin de una protena nueva en E. coli, cuando
es posible, suele ser ms fcil que en otros sistemas de expresin tericamente ms apropiados. Esta ventaja puede verse atenuada, sin embargo, por el hecho de que E. coli produce protenas generalmente en un estado qumicamente reducido. Para
plegarse adecuadamente, tales protenas requieren la produccin de uniones disulfuro intramoleculares por oxidacin. Una segunda desventaja es que todas las protenas de E. coli empiezan su secuencia con un residuo de N-formil-metionina que no
siempre puede eliminarse con los sistemas proteolticos de E. coli, por lo cual posiblemente se produzca un derivado metionilo
de la protena natural deseada. Una tercera desventaja de la expresin en E. coli es la posibilidad de que el producto se deteriore debido a trazas de impurezas de proteasa. Una cuarta desventaja es el requisito de eliminacin de endotoxinas durante la
purificacin. A pesar de estas limitaciones, la facilidad de uso de E. coli y sus rendimientos de expresin generalmente altos
para la mayora de las protenas han propiciado el uso preferencial continuado de esta bacteria siempre que sea posible.
Como se describi anteriormente, el elemento clave en la tecnologa de ADN recombinante es el plsmido recombinante,
que contiene el gen que codifica la protena de inters. Los plsmidos son segmentos extracromosmicos circulares, sencillos y
pequeos de ADN bacteriano que se aslan de una bacteria y que se autorreplican. La tecnologa bsica emplea el corte enzimtico especfico de un plsmido mediante el empleo de endonucleasas, seguido de la insercin de una nueva pieza de ADN
que contiene el gen de inters. El plsmido recombinante resultante se considera la materia prima clave de la tecnologa de
ADNr. El plsmido recombinante se introduce en el organismo anfitrin mediante un proceso llamado transformacin, por el
cual transmite su nueva informacin gentica y genera el producto proteico. El crecimiento a gran escala de organismos recombinantes puede realizarse en fermentadores comerciales de ms de 100 000 L, lo que hace que estos tipos de sistemas de
produccin sean sumamente econmicos. Existen, sin embargo, una serie de problemas que complican el uso de los sistemas
de fermentacin de E. coli. En algunos casos, el producto protenico expresado puede causar toxicidad celular y/o ser sumamente difcil de recuperar o purificar ya que puede quedar atrapado en cuerpos de inclusin bacteriana como grandes aglomerados semisolubles. Los recientes avances en la biologa molecular de E. coli han permitido expresar protenas en el espacio
periplsmico, facilitando la eliminacin de grupos metionina N-terminales no deseados y la obtencin de protenas ms fciles
de purificar.
PRODUCCIN EN CLULAS EUCARITICAS (CLULAS DE MAMFEROS Y LEVADURAS)
El uso del cultivo de clulas eucariticas para la produccin de vacunas se ha establecido hace tiempo en la industria farmacutica y se ha desarrollado una extensa base de datos para asegurar la aptitud del uso de tales productos proteicos en seres
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PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse de dos maneras principales, dependiendo de si son de origen humano o
murino (ratn). En el caso de los anticuerpos de origen murino, los linfocitos apropiados se seleccionan de los bazos de ratones
o ratas previamente inoculados. La clula se fusiona luego con una lnea celular transformada, como por ejemplo una lnea de
clulas de mieloma, lo cual produce una clula hibridoma. A continuacin, se seleccionan las clulas hibridomas por clonacin
y se emplean para generar productos de anticuerpos monoclonales. En el caso de los anticuerpos de origen humano, los linfocitos B humanos pueden seleccionarse por clonacin segn la especificidad de unin entre el hapteno y los anticuerpos resultantes; estas clulas seleccionadas luego pueden inmortalizarse mediante la infeccin con un virus. La clula resultante fusionada o transformada puede proliferar indefinidamente en un entorno de cultivo celular o en un biorreactor o bien puede inyectarse en ratones de cuyo lquido asctico puede extraerse la protena. El anticuerpo se produce segn lo indica la informacin
cromosmica que reside en la clula o que se adquiri durante la fusin y se secreta en el medio, a partir del cual puede purificarse fcilmente. Las clulas hibridoma se deben analizar y caracterizar exhaustivamente de la misma manera que un banco de
clulas ADNr. El banco de clulas resultantes se emplea para la elaboracin del producto por cultivo celular a gran escala o
mediante la recoleccin de lquido asctico de ratones inoculados con clulas transformadas.
Control de los Procesos de Fermentacin y Cultivo de Clulas

Como el proceso de produccin a travs de un sistema vivo es la base fundamental de la biotecnologa, es necesario considerar los problemas que implica el control de los procesos biotecnolgicos. Las principales preocupaciones para la produccin
de protenas en bacterias, por ejemplo, involucran el desarrollo de sistemas que permitan asegurar la estabilidad gentica, un
rendimiento uniforme del producto y la evidencia de que no existe contaminacin por microorganismos adventicios. Estas
mismas preocupaciones valen para el cultivo de clulas eucariticas a gran escala, donde, como se ha indicado anteriormente,
tambin existen problemas importantes relacionados con el uso de lneas celulares inmortalizadas, como por ejemplo la presencia putativa de ADN y ARN oncognico e impurezas de protenas de los medios.
FERMENTACIONES (BACTERIAS Y LEVADURAS)
Se han acumulado muchos conocimientos sobre la produccin de protenas recombinantes en bacterias y levaduras; en consecuencia, los principales problemas del proceso de fermentacin suelen resolverse mediante la demostracin de que existe
uniformidad en las condiciones de fermentacin. Las fermentaciones con bacterias y levaduras se realizan generalmente durante perodos breves y bien definidos para vigilar y controlar la velocidad de crecimiento y las condiciones de expresin del producto. Se puede detectar la presencia de organismos contaminantes extraos por sus efectos sobre la velocidad del crecimiento, la pureza del cultivo, el perfil de cidos grasos, etc.; esta presencia es razn suficiente para terminar la fermentacin. La
estabilidad gentica del plsmido producido por bacterias puede controlarse mediante el aislamiento y el anlisis de la secuencia de nucletidos o mediante el mapeo del ADN con enzimas de restriccin. Estos resultados pueden verificarse por mapeo de
Captulos
humanos. La extensin de esta tecnologa a los productos de ADNr fue principalmente una respuesta a las limitaciones en el
uso de E. coli. En particular, en lo que se refiere a protenas o glicoprotenas grandes, la expresin de clulas eucariticas es una
alternativa atractiva a un sistema bacteriano, ya que las clulas eucariticas pueden secretar protenas que se pliegan adecuadamente y cuya estructura primaria, secundaria y terciaria es idntica a la de la protena humana natural. La preocupacin por
los aspectos econmicos de este sistema de produccin obstaculiz en un principio su desarrollo. Sin embargo, los recientes
avances en la obtencin de mejores niveles de expresin, en el cultivo celular a gran escala mediante el empleo de clulas de
Ovario de Hmster Chino (CHO, por sus siglas en ingls) y en la formulacin de medios de crecimiento ms definidos han
mejorado mucho la factibilidad econmica de los sustratos de clulas eucariticas. El nmero de pasajes celulares requeridos
para la clonacin, seleccin, amplificacin y la creacin de bancos celulares antes de la produccin requiere, en general, el uso
de lneas de clulas inmortales, ya que las cepas no inmortalizadas (es decir, los cultivos diploides) no pueden propagarse suficientemente como para proporcionar tiempos econmicamente convenientes en la etapa de produccin. Las dudas iniciales
en lo referente a la seguridad de estas lneas de clulas inmortales reflejaban una preocupacin por la presencia de posibles
oncogenes y una posible contaminacin viral y retroviral. Estas preocupaciones se han disipado considerablemente gracias al
anlisis y caracterizacin exhaustivos de bancos de clulas maestras para determinar agentes adventicios (introducidos accidentalmente), mediante estudios eficaces de la validacin de procesos y datos de seguridad obtenidos hasta la fecha para productos elaborados con este mtodo. El banco de clulas maestras resultante y completamente caracterizado se emplea para la
produccin a gran escala. Otras lneas de clulas eucariticas, como por ejemplo las provenientes de clulas de insectos, pueden ser tiles para lograr muchas de las ventajas de conformacin y postraduccionales que se han descrito para el cultivo de
clulas de mamferos.
Se ha explorado ampliamente el uso de cepas de levaduras, como por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, para la produccin.
La produccin de protenas en levaduras ofrece muchas ms ventajas tericas con respecto al uso de E. coli, aunque plantea
nuevas preocupaciones. Al igual que E. coli, las levaduras pueden mantener plsmidos estables en forma extracromosmica; sin
embargo, a diferencia de E. coli, las levaduras tienen la capacidad de producir glicoprotenas.
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pptidos de la protena expresada en cada lote del producto elaborado. Es muy importante optimizar las condiciones de fermentacin para limitar o evitar el procesamiento proteoltico de la protena objetivo. El procesamiento proteoltico suele ser un
problema en las fermentaciones de E. coli y puede producir dificultades en la recuperacin y un bajo rendimiento del producto. Finalmente, el proceso de fermentacin debe contemplar la conformacin de la protena y sus posibles efectos sobre la
potencia.
Captulos
CULTIVOS DE CLULAS EUCARITICAS
Las tcnicas de cultivo celular a gran escala para la elaboracin de productos obtenidos por biotecnologa se remontan a la
produccin de vacunas. Ciertos avances, como el cultivo de clulas en suspensin a gran escala usando organismos recombinantes que secretan la protena deseada hacia el medio de cultivo, han tenido una importante repercusin en la biotecnologa.
En la actualidad, pueden producirse grandes protenas glicosiladas en cantidades suficientes para el mercado. Sin embargo, el
uso de cultivos de clulas eucariticas se complica por aspectos tales como la estabilidad gentica, el plegado de protenas y
las condiciones del cultivo, incluyendo la viabilidad de las clulas y su velocidad de crecimiento. La estabilidad gentica de los
cultivos celulares, por ejemplo, no puede controlarse tan fcilmente como en el caso de las fermentaciones de E. coli con tcnicas como el anlisis de las secuencias del plsmido, ya que el gen que codifica el producto se incorpora al genoma de las clulas y no se recupera fcilmente. Una alternativa es el mapeo de pptidos de la protena expresada, que requiere una suficiente
resolucin y sensibilidad para detectar mutaciones sutiles.
La ausencia de organismos adventicios en cultivos celulares es crtica. Adems de demostrar que no hay bacterias, levaduras
ni hongos presentes en los cultivos de clulas, el fabricante debe proporcionar evidencia, para cada cultivo, de que no hay
micoplasmas ni virus adventicios. Es importante tener en cuenta que algunos hibridomas usados para la produccin de anticuerpos monoclonales pueden contener retrovirus endgenos. Sin embargo, debe demostrarse que cualquier virus presente en
el cultivo es eliminado del producto final. Esto exige el desarrollo de tcnicas analticas apropiadas que aseguren la ausencia de
contaminacin por micoplasmas o virus adventicios humanos y animales.
El grado y tipo de glicosilacin pueden ser importantes para el diseo de las condiciones de cultivo celular necesarias para la
produccin de protenas glicosiladas. El grado de glicosilacin puede afectar la vida media del producto in vivo as como su
potencia y antigenicidad. Aunque el estado de glicosilacin de un producto de cultivo celular es difcil de determinar, puede
comprobarse su uniformidad si las condiciones de cultivo son altamente reproducibles.
Proceso de Recuperacin y Purificacin

Por lo general, la recuperacin de productos proteicos obtenidos a partir de fermentacin o cultivo celular se basa en tcnicas eficientes de separacin proteica, como las listadas en la Tabla 1. El proceso de recuperacin comienza con el aislamiento
de la protena deseada del medio de fermentacin o de cultivo celular, a menudo en una forma muy impura. La ventaja del
cultivo celular y de los productos obtenidos a partir de levaduras es que muchas de estas protenas se secretan directamente
hacia el medio y, por lo tanto, slo requieren la separacin de las clulas para obtener una purificacin significativa. En el caso
de productos obtenidos a partir de E. coli, suele requerirse la lisis de las bacterias para recuperar la protena deseada. Es importante en cada caso lograr una rpida purificacin de la protena deseada ya que las proteasas liberadas por los organismos
lisados pueden escindir el producto deseado. Estas trazas de proteasas adquieren especial importancia durante la purificacin
de productos obtenidos mediante biotecnologa, ya que pueden ser muy difciles de eliminar, pueden complicar el proceso de
recuperacin y pueden afectar considerablemente la estabilidad del producto final.
Tabla 1. Mtodos de Purificacin Cromatogrficos Empleados para Productos Obtenidos por Biotecnologa
Cromatografa focalizada
Cromatografa en fase reversa
Cromatografa de interaccin hidrofbica
Cromatografa por transferencia de carga
Cromatografa de exclusin por tamao (tamizado molecular)
Cromatografa de intercambio inico
Aninico
Catinico
Cromatografa de afinidad
Qumica
Receptores celulares
Colorante/Ligando
Quelatos metlicos
Por lo general, el proceso de recuperacin est diseado para una elevada purificacin del producto final. El requisito de
pureza para un producto depende de muchos factores, aunque puede exigirse que los productos de uso continuo tengan una
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pureza mucho mayor que aquellos concebidos para un solo uso. Los productos biotecnolgicos contienen ciertas impurezas
que los procesos de recuperacin estn especficamente diseados para eliminar o reducir al mnimo. Estas impurezas incluyen
cantidades detectables de ADN, factores de crecimiento, protenas residuales del anfitrin, endotoxinas y protenas celulares
residuales provenientes de los medios. Las impurezas ms comunes de inters y los mtodos de valoracin apropiados para
detectarlas se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnologa
Impurezas o Contaminantes
Mtodo de Deteccin
Impurezas
Endotoxinas
Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85, Prueba de Pirgenos 151
Protenas de clulas anfitrionas
SDS-PAGEa, Valoraciones inmunolgicas
Otras impurezas proteicas (medios)
SDS-PAGE, HPLCb, Valoraciones inmunolgicas
ADN
Hibridacin de ADN, Espectrofotometra UV, Unin a protenas
Protenas mutantes
Mapeo de pptidos, HPLC, IEFc, MSd
Formil-metionina
Mapeo de pptidos, HPLC, MS
Metioninas oxidadas
Mapeo de pptidos, anlisis de aminocidos, HPLC, anlisis de degradacin de Edman, MS
Escisin proteoltica
IEF, SDS-PAGE (reducido), HPLC, anlisis de degradacin de Edman
Protenas aglomeradas
SDS-PAGE, HPSECe
IEF, HPLC, MS, anlisis de degradacin de Edman
SDS-PAGE, valoraciones inmunolgicas
Sustituciones de aminocidos
Anlisis de aminocidos, mapeo de pptidos, MS, anlisis de degradacin de Edman
Contaminantes
Microbianos (bacterias, levaduras, hongos)
Pruebas de Recuento Microbiano 61, Pruebas de Microorganismos Especficos 62, Pruebas de Esterilidad
71, pruebas microbiolgicas
Micoplasmas
Mtodo del 21 CFR Modificadof, DNAFg
Virus (endgenos y adventicios)
CPEh y HAdi (virus exgenos exclusivamente), actividad de transcriptasa reversa, MAPj
a Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio.

b Cromatografa lquida de alta resolucin.
c Isoelectroenfoque.
d Espectrometra de masas.
e Cromatografa de alta resolucin de exclusin por tamao.
f Borradores de lineamientos relativos al Cdigo de Reglamentaciones
g Fluorocromo de unin con ADN.
h Efecto citoptico.
i Hemoadsorcin.
j Produccin de anticuerpos murinos.
Federales, Ttulo 21.
La cromatografa focalizada y la cromatografa en fase reversa son mtodos de purificacin que emplean productos qumicos, ya sea en la fase estacionaria (unida) o en la fase mvil, que pueden convertirse en impurezas en el producto final. Como
sucede con cualquier tecnologa nueva, la responsabilidad de la validacin (es decir, de demostrar la supresin de productos
qumicos potencialmente nocivos) recae en el fabricante. La validacin es necesaria cuando se estn aislando los anticuerpos
monoclonales del producto final o empleando una tcnica que contiene una etapa de purificacin de anticuerpos monoclonales. El proceso debe probar que se han eliminado los fragmentos de anticuerpos o anticuerpos lixiviados. Es necesario asegurar
la ausencia de agentes adventicios, como por ejemplo virus y micoplasmas, en la lnea celular de origen de los anticuerpos
monoclonales. La principal preocupacin es la posibilidad de contaminacin del producto con una sustancia antignica que
podra ser perjudicial para los pacientes. Es necesario un continuo control del proceso para evitar o limitar tal contaminacin.
El problema de la antigenicidad relacionada con las protenas activas y con las protenas anfitrionas es caracterstico de los productos obtenidos por biotecnologa, en contraste con los frmacos tradicionales. Los mtodos de fabricacin que emplean
ciertos disolventes deben controlarse si son capaces de provocar reordenamientos qumicos que alteraran el perfil antignico
del ingrediente activo. El fabricante tambin est obligado a comprobar la uniformidad en el funcionamiento de las nuevas
columnas cromatogrficas. Las consideraciones para los productos de un solo uso, como por ejemplo las vacunas, pueden diferir ya que no se administran continuamente y su antigenicidad es deseable. Por otro lado, es necesario validar la eliminacin de
la contaminacin con protenas extraas o ligandos. A diferencia de los frmacos de origen natural, los fabricantes de productos obtenidos mediante biotecnologa deben validar la eliminacin de los cidos nucleicos durante la purificacin. Como ya se
ha sealado, las vacunas pueden diferir en este aspecto debido a los antecedentes clnicos acumulados sobre estos productos.
CONTROL DE CALIDAD
En general, los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnologa son muy similares a los utilizados
rutinariamente en productos farmacuticos tradicionales en reas tales como pruebas y liberacin de materias primas, documentacin de control de proceso y fabricacin, y procesamiento asptico. Los sistemas de control de calidad de productos
obtenidos por biotecnologa incorporan algunas de las mismas filosofas aplicadas al anlisis de productos farmacuticos de
Captulos
Desamidacin
Captulos
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bajo peso molecular, como el uso de estndares de referencia qumicos y mtodos validados, para evaluar un amplio espectro
de impurezas del producto conocidas y/o potenciales, as como posibles productos de descomposicin. Los sistemas de control de calidad para productos obtenidos mediante biotecnologa suelen ser anlogos a los establecidos para productos biolgicos tradicionales en lo que se refiere a la determinacin de la esterilidad del producto, la seguridad del producto para animales de experimentacin y la potencia del producto. Consultar por ejemplo, Inyectables 1, pH 791, Partculas en Inyectables
788, Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 e Impurezas en Artculos Oficiales 1086.
La diferencia fundamental entre los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnologa y productos
farmacuticos tradicionales reside en el tipo de mtodos que se emplean para determinar la identidad del producto, su uniformidad, su pureza y el perfil de las impurezas. Adems, en el control de calidad biotecnolgico, frecuentemente es necesario
combinar pruebas para el producto final y pruebas durante el proceso validadas, y la validacin del proceso para asegurar la
eliminacin de impurezas no deseadas reales o posibles, hasta alcanzar los niveles sugeridos por los organismos reguladores.
Por lo general, los productos obtenidos por biotecnologa requieren una caracterizacin detallada del organismo de produccin (clula), una evaluacin completa de los medios de crecimiento y propagacin de las clulas y un anlisis explcito del
proceso de recuperacin del producto final.
La complejidad de los sistemas de control de calidad para productos obtenidos por biotecnologa se relaciona con el tamao
y con las caractersticas estructurales del producto y el proceso de fabricacin. En general, los sistemas de control de calidad
requeridos por los productos elaborados en clulas procariticas son menos complejos que los sistemas requeridos para los
elaborados en clulas eucariticas. Entre los sistemas de control de calidad para los organismos de produccin procariticos
generalmente se encuentran la documentacin del origen de la cepa productora y las pruebas tradicionales para la deteccin
de organismos adventicios, cariologa, caracterizacin del fenotipo y resistencia a los antibiticos. Adems, pueden ser tiles
otras tcnicas nuevas, como el mapeo por restriccin de ADN, el anlisis de secuencias de ADN y el control de rutina, que
puede incluir la medicin de concentraciones de ADN de plsmido o ARNm. El control de calidad del banco de clulas maestras y el banco de clulas de trabajo para organismos eucariticos de produccin incluye, por lo general, pruebas para deteccin de organismos adventicios, cariologa, identidad y el control de la estabilidad. Todas las lneas de clulas eucariticas (excepto las levaduras) suelen analizarse para detectar la presencia de retrovirus, marcadores de actividad retroviral y tumorigenicidad, aunque muchas de estas pruebas pueden tener un valor limitado.
FORMULACIN DE PRODUCTOS
Los productos biotecnolgicos son protenas y pptidos que son molculas relativamente inestables comparadas con la mayora de las sustancias farmacuticas orgnicas. En la mayora de los procesos biotecnolgicos hay una transferencia de protenas desde un amortiguador de pH estabilizante o solubilizante a otro durante la purificacin. En ltimo trmino, la protena se
transfiere a una solucin en su forma farmacutica final, donde se logra su estabilidad a largo plazo. Adems, estos productos
requieren a menudo la liofilizacin para lograr una estabilidad a largo plazo, debido a su tendencia a degradarse mediante una
variedad de mecanismos, entre ellos, la desamidacin, aglomeracin, oxidacin y posible protelisis causada por trazas de proteasas de las clulas anfitrionas. Por lo general, la forma farmacutica final de la protena contiene compuestos estabilizantes
que proporcionan el pH ptimo y las condiciones de solucin necesarias para la estabilidad a largo plazo del producto y/o las
propiedades deseadas para su administracin (tonicidad). Entre estos compuestos se encuentran las protenas, alcoholes polihdricos, aminocidos, carbohidratos, agentes de volumen, sales inorgnicas y agentes tensoactivos no inicos. Adems, estos
excipientes pueden ser necesarios para la obtencin de un liofilizado estable. Existen requisitos especiales para los productos
liofilizados, como por ejemplo el control de la humedad, que, en general, se definen en la monografa USP de cada producto y
que pueden ser importantes para su estabilidad. Vale notar que la evaluacin de la estabilidad proteica suele exigir mltiples
mtodos analticos, cada uno de los cuales puede emplearse para evaluar una modalidad especfica de degradacin proteica.
Muchas de estas valoraciones se describen en la siguiente seccin. El uso de estudios de estabilidad acelerada para predecir la
vida til de formulaciones proteicas a veces se complica por los efectos de la temperatura sobre la conformacin de las protenas, producindose un comportamiento que no se ajusta a la teora de Arrhenius. Por lo tanto, suelen requerirse con frecuencia estudios de estabilidad en las condiciones de almacenamiento recomendadas en tiempo real para establecer la fecha de
caducidad de los productos obtenidos mediante biotecnologa.
METODOLOGA ANALTICA
El anlisis de los productos obtenidos mediante biotecnologa depende en gran medida de mtodos analticos sofisticados
para demostrar la identidad estructural y la homogeneidad de las protenas y para evaluar su vida til o estabilidad. Esta seccin trata sobre la exactitud, la precisin, el contenido informativo y la aplicabilidad general de los mtodos ms comnmente
utilizados. Algunos mtodos, como por ejemplo la valoracin de impurezas de la clula anfitriona y los procedimientos para
ADN residual, pueden ser muy especficos para el producto y para el proceso en particular; por lo tanto, deben incluirse en
cada monografa.
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Consideraciones sobre Estndares de Referencia
Metodologa Caracterstica
Existen varios mtodos analticos especficos para productos obtenidos mediante biotecnologa. Muchas de las valoraciones
y pruebas descritas pueden realizarse de diferentes maneras y, como algunas pueden ser tambin especficas para un determinado producto, se necesitan normas claras sobre la aplicacin de mtodos especficos en cada situacin en particular. Ver los
captulos Diseo y Anlisis de Valoraciones Biolgicas 111 y Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225 para informacin
general sobre la metodologa.
CONTENIDO PROTEICO
Las valoraciones de contenido proteico se emplean para determinar cuantitativamente la cantidad de protenas en un producto dado obtenido por biotecnologa. La determinacin del contenido proteico suele ser una de las mediciones ms difciles
y frecuentemente requiere una verificacin independiente mediante mtodos alternativos. Siempre que sea pertinente, pueden
emplearse mtodos tales como la espectrofotometra UV con una absortividad vlida y el anlisis de nitrgeno por Kjeldahl
para determinar las cantidades absolutas de protena independientemente de los estndares de referencia. Sin embargo, otros
mtodos, como Lowry, Biuret y el anlisis cuantitativo de aminocidos, que requieren el uso de sustancias de referencia, tambin permiten obtener valores exactos. Las valoraciones de contenido proteico se encuentran entre los mtodos ms importantes para estos productos ya que los resultados de otros tipos de valoraciones, como por ejemplo la potencia, tambin dependen de ellos.
Existen varios mtodos comunes de valoracin para determinar el contenido proteico. Estos mtodos de valoracin pueden
emplearse en distintos puntos del proceso de elaboracin de un determinado producto obtenido por biotecnologa. En el caso
de protenas de alta pureza, el mtodo ms sencillo para evaluar el contenido proteico se basa en la determinacin espectrofotomtrica de la absorbancia en el UV de una solucin de protenas. La absorbancia se determina al mximo de absorcin y se
calcula la concentracin proteica empleando una absortividad determinada empricamente. Esta tcnica se aplica a protenas
que contienen los residuos aromticos triptofano, tirosina, y/o fenilalanina. A menudo, la longitud de onda de absorcin empleada es de 280 nm. El coeficiente de extincin, o absortividad molar, debe determinarse en el mismo disolvente usado para
la muestra que se va a medir. Si fuera necesario, el producto puede diluirse antes de analizarlo para obtener soluciones con
valores de absorbancia en el intervalo lineal de deteccin. Los aglomerados y partculas de mayor peso molecular pueden dispersar la luz, que artificialmente aumenta la absorbancia. Los excipientes que tienen absorbancia significativa a 280 nm tambin interfieren. La espectrofotometra UV es nica entre los mtodos de valoracin de contenido proteico, ya que es una medida absoluta de concentracin de una protena especfica que no requiere calibracin con estndares.
Un mtodo general comnmente utilizado para medir el contenido proteico es la valoracin de Lowry. Este mtodo se basa
en la reaccin de Biuret de protenas con cobre (II) en una solucin bsica y la reduccin del cido fosfomolbdico-fosfotngstico de Folin-Ciocalteu a azul de heteropolimolibdeno mediante la oxidacin catalizada por cobre de los aminocidos aromticos tirosina, triptofano y fenilalanina en la protena. Los productos de reaccin son azules y se cuantifican en forma espectrofotomtrica en la regin visible entre 540 y 560 nm. Esta reaccin es lineal para microgramos de protena. La valoracin, sin
embargo, es susceptible de interferencias de varias sustancias, como por ejemplo alcoholes, azcares y detergentes. En algunos
Captulos
El uso de estndares y materiales de referencia apropiados es sumamente importante para el anlisis de los productos obtenidos por biotecnologa. Estos estndares pueden ser materiales naturales o protenas producidas por ingeniera gentica. Muchos productos obtenidos por biotecnologa requieren estndares de referencia exactamente caracterizados disponibles de
fuentes internacionalmente reconocidas, como por ejemplo la USP (ver Estndares de Referencia USP 11), OMS, NIH y FDA.
Actualmente, los estndares de referencia de algunos productos biolgicos con unidades de actividad definidas se obtienen en
dichas organizaciones. Los fabricantes emplean estos estndares para probar o calibrar estndares secundarios aplicando muchas de las valoraciones descritas en esta seccin. El valor de potencia del estndar de referencia se obtiene por estudios colaborativos que, cuando se evalan estadsticamente, permiten determinar el valor de potencia mxima asignado al estndar de
referencia. El estndar secundario puede emplearse para determinar la cantidad declarada del frmaco o la potencia definida
en la etiqueta del producto. Por lo tanto, la USP aprueba y proporciona los estndares o materiales de referencia para productos obtenidos mediante biotecnologa utilizados con los fines analticos descritos en las monografas USP correspondientes. En
una situacin ideal, estos estndares de referencia deberan utilizarse mundialmente y siempre deberan estar calibrados en
comparacin con el estndar de los EE.UU. que el fabricante entrega a la FDA para productos autorizados por la FDA. Esto
asegura la determinacin exacta y uniforme de la actividad, contenido y pureza de estos productos. Debido a diversas caractersticas especiales de los productos obtenidos por biotecnologa, como por ejemplo la especificidad del proceso y del producto, es posible que otros productos similares necesiten estndares de referencia diferentes. Adems, la USP realiza el desarrollo
minucioso y la recalibracin de los estndares de referencia para reemplazar estndares agotados o caducos a fin de asegurar
que no cambien las indicaciones en las etiquetas de los productos farmacuticos. Un punto que se debe considerar en la asignacin de la potencia al estndar primario mediante estudios colaborativos es que las unidades de actividad definidas slo son
significativas cuando se comparan en una sola valoracin exacta y bien descrita. Si se intenta comparar actividades obtenidas
con valoraciones que son ligeramente diferentes, es probable que se obtengan resultados marcadamente distintos.
Captulos
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casos, sustancias de interferencia o el producto pueden extraerse antes del anlisis, por ejemplo mediante su precipitacin.
Adems, la preparacin de controles que contienen sustancias interferentes presentes en el producto farmacutico puede permitir la correccin. Aunque histricamente se ha empleado la albmina srica bovina para preparar la curva estndar, se sabe
que cada protena puede reaccionar con una intensidad diferente y por lo tanto se debe emplear un material de referencia del
mismo producto para la calibracin. La valoracin del cido bicinconnico (BCA) es una alternativa til a la valoracin de
Lowry, ya que es menos sensible a sustancias interferentes. El reactivo de trabajo es una solucin de BCA-cobre (II). El complejo
de cobre (II) se reduce a cobre (I) en presencia de protenas y el color morado puede cuantificarse por espectrofotometra a
aproximadamente 560 nm.
Tambin pueden emplearse otras valoraciones colorimtricas. El mtodo de Bradford, por ejemplo, emplea la unin del colorante Azul de Coomassie Brillante a la protena en un medio cido. La concentracin de la protena en la solucin se determina mediante la comparacin de la absorbancia a 595 nm con una curva estndar de un material de referencia.
Los mtodos de fluorescencia empleados se basan normalmente en fluorescamina o en o-ftaldialdehdo (OPA). La principal
ventaja de estas valoraciones es su mayor sensibilidad. Otra ventaja es su uso con protenas hidrfobas. La fluorescamina y el
OPA reaccionan con aminas primarias en el extremo N-terminal del polipptido y en las cadenas laterales de aminocidos tales
como la lisina.
El mtodo de Kjeldahl para nitrgeno, Determinacin de Nitrgeno 461, es una determinacin exacta y precisa de la concentracin proteica y suele emplearse en la determinacin de absortividades UV de protenas. La valoracin se realiza en dos
etapas. En primer lugar, la muestra se descompone con cido sulfrico producindose sulfato de amonio, dixido de carbono
y agua. La descomposicin se realiza al punto de ebullicin del cido sulfrico en matraces de cuello largo con forma de pera.
Estos matraces sirven para condensar el vapor de agua e impedir la prdida de material. Segn la eficiencia de la descomposicin, se pueden agregar diversas sales, como por ejemplo sulfato de potasio, para aumentar el punto de ebullicin de la solucin de cido sulfrico. Tambin se han empleado agentes oxidantes, como por ejemplo cido perclrico o permanganato de
potasio, para mejorar la descomposicin. La segunda etapa de la valoracin incluye la determinacin directa del amonaco. En
la mayora de las macrodeterminaciones, el amonaco se destila por corriente de vapor a partir de la mezcla despus de la
alcalinizacin con hidrxido de sodio. Por lo general, el amonaco destila cuantitativamente de la mezcla en 5 a 20 minutos y
se absorbe cuantitativamente en una solucin cida estandarizada, de volumen y normalidad conocidas. El exceso de cido se
retrovalora volumtricamente con una base estandarizada. Para las determinaciones de protena bruta, el valor del amonaco
(y, por lo tanto, del contenido de nitrgeno) se multiplica por un factor de 6,25 mg de protena por mg de nitrgeno, que
corresponde a un contenido de nitrgeno de 16%. El valor proteico obtenido de esta forma es generalmente vlido para la
mayora de las protenas. Si se requiere un valor ms exacto, como en una medicin de absortividad, entonces el factor de
conversin debe calcularse para el contenido de nitrgeno de cada protena pura a partir de su composicin aminoacdica. En
el caso de las glicoprotenas que contienen aminoazcares, el valor calculado produce un valor atificialmente alto a menos que
se aplique una correccin.
El anlisis de aminocidos se emplea en la determinacin de la absortividad apropiada de la protena y tambin puede emplearse cuantitativamente para la determinacin del contenido proteico. Este procedimiento, aunque es ms complicado que
los descritos anteriormente, tambin produce resultados exactos.
ANLISIS DE AMINOCIDOS
El anlisis de aminocidos es un mtodo qumico clsico para determinar la composicin de aminocidos en protenas y
pptidos. El mtodo consiste en la hidrlisis completa de una protena o pptido hasta sus aminocidos componentes, que
luego se separan por cromatografa y se cuantifican. Por consiguiente, el anlisis de aminocidos puede emplearse para determinar la composicin de un producto (es decir, la identidad) y la cantidad de protenas totales presente. El mtodo tiene algunas dificultades inherentes (como por ejemplo la destruccin total o parcial de algunos aminocidos) que pueden evitarse empleando la metodologa analtica apropiada. El aminocido triptofano se destruye por hidrlisis con cido clorhdrico 6 N y, por
lo tanto, requiere otras condiciones de hidrlisis. Los aminocidos serina y treonina pueden destruirse parcialmente, mientras
que las uniones peptdicas entre residuos hidrfobos voluminosos tales como la valina y la isoleucina pueden ser ms resistentes a la hidrlisis, proporcionando en ambos casos valores inferiores a los reales. En consecuencia, se puede emplear el anlisis
de muestras a lo largo de la hidrlisis para compensar estos factores. La cistena y la metionina pueden requerir la oxidacin
previa a cido cisteico y metionina sulfona, respectivamente, para su cuantificacin exacta. Cada protena especfica puede requerir un procedimiento de hidrlisis en condiciones optimizadas para el anlisis de sus aminocidos a fin de obtener buenos
resultados.
El anlisis de aminocidos se realiza en dos etapas. La primera etapa es la hidrlisis de la protena que genera sus aminocidos componentes. Esta hidrlisis se realiza normalmente con cido clorhdrico 6 N a aproximadamente 110 durante 24 horas.
Algunas protenas pueden requerir condiciones de hidrlisis ms largas o ms enrgicas. La segunda etapa es la separacin y
cuantificacin de los aminocidos individuales mediante alguna forma de cromatografa que se pueda realizar por derivatizacin anterior o posterior al paso por la columna. Se dispone de varios procedimientos de derivatizacin anteriores al paso por
la columna, como por ejemplo con OPA, fenilisotiocianato (PITC) y fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Estos derivados se separan luego mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en fase reversa (FR) y se cuantifican por deteccin en el UV
o por fluorescencia. Dentro de los mtodos de derivatizacin posteriores al paso por la columna se encuentran la separacin
en componentes aminoacdicos por cromatografa de alta resolucin de intercambio inico (HPIEC), seguida por una reaccin
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postcolumna con un cromforo tal como la ninhidrina, y la cuantificacin mediante la deteccin en la regin UV/visible. Todos
estos mtodos son apropiados para anlisis de aminocidos y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Los derivados
de OPA son muy fciles de preparar y sensibles y slo requieren una pequea cantidad de muestra, pero son inestables y tienen que pasar a la cromatografa de inmediato una vez preparados. Por otro lado, los derivados del feniltiocarbamilo (PTC)
son relativamente ms estables. La derivatizacin con ninhidrina postcolumna a menudo se realiza a baja presin y tiene la
ventaja de la estabilidad del hidrolizado. Sus desventajas son la necesidad de deteccin dual a 440 y 570 nm y el equipo necesario para la derivatizacin postcolumna.
SECUENCIACIN DE PROTENAS
MAPEO DE PPTIDOS POR HPLC
El mapeo de pptidos cumple dos propsitos principales en relacin con las protenas de uso farmacutico: es un mtodo de
identidad altamente especfico y, en el caso de los productos obtenidos mediante biotecnologa, puede servir como una confirmacin de la estabilidad gentica. Este mtodo se emplea para comparar la estructura proteica de un lote especfico de material con la de un material o estndar de referencia apropiado o con la estructura de lotes anteriores para verificar si la estructura primaria es correcta y comprobar la uniformidad de la estructura primaria en cada lote (dentro de los lmites de esta tcnica). Por lo general, los grupos amino-terminales y carboxi-terminales de los pptidos, y de los pptidos que contienen carbohidratos se pueden separar e identificar. Estos ltimos son valiosos en los mapeos de los pptidos de protenas glicosiladas tales
como los anticuerpos monoclonales. Los mapas de pptidos pueden emplearse para determinar la presencia de aminocidos
incorrectos simples o mltiples como resultado de una mutacin puntual o errores en la traduccin de la secuencia de ADNc.
El procedimiento implica la fragmentacin selectiva de la protena, formndose pptidos diferenciados que se separan por
alguna tcnica cromatogrfica. La fragmentacin se logra con endoproteasas tales como la tripsina, quimotripsina, termolisina,
proteasa V8, o mediante la degradacin qumica selectiva con bromuro de ciangeno, que divide la molcula en sitios especficos. La seleccin de la endoproteasa apropiada depende de la secuencia primaria de la protena. La tripsina escinde los residuos bsicos de lisina y arginina en su extremo C-terminal; la quimotripsina escinde despus de los residuos aromticos a
Captulos
La secuenciacin de protenas es til para el control de calidad de productos biolgicos proteicos ya que puede proporcionar
informacin sobre su estructura primaria, es decir, la estructura amino-terminal y carboxi-terminal. En el caso de productos
biolgicos provenientes del ADNr, esta metodologa tambin sirve para confirmar la secuencia aminoacdica predicha por el
ADN complementario (ADNc), la homogeneidad de la protena y el nmero potencial de cortes proteolticos. En cuanto a los
anticuerpos monoclonales, esta tcnica se emplea para determinar su homogeneidad proteica. La secuenciacin de protenas
se divide en aplicaciones y procedimientos de secuenciacin amino-terminal y carboxi-terminal.
Secuenciacin Amino-TerminalEl anlisis de la secuencia amino-terminal es una tcnica qumica clsica que proporciona
informacin importante sobre la estructura primaria (secuencia), la homogeneidad y la presencia de escisiones conocidas o
desconocidas en el polipptido. El anlisis de las secuencias N-terminales se realiza con varios secuenciadores de pptidos automticos comercialmente disponibles. El mtodo se basa en la reaccin de acoplamiento del residuo amino-terminal de una
protena o de un pptido con PITC. El derivado aminocido-PTC resultante se separa de la protena con un cido orgnico
perfluorado (por lo general cido trifluoroactico o heptafluorobutrico), que expone el aminocido adyacente. Este aminocido adyacente sirve como un nuevo N-terminal y se derivatiza en el siguiente ciclo de acoplamiento y escisin. Este proceso se
repite hasta extraer un nmero apropiado, normalmente de 8 a 10 aminocidos. Por lo general, el residuo aminocido modificado resultante del ciclo de escisin (anilinotiazolinona [ATZ]) se convierte en un feniltiohidanton-aminocido (PTH-AA) en
presencia de cido y calor. Luego, el PTH-AA puede determinarse mediante un anlisis por RP-HPLC. Cualquier escisin dentro
de la cadena, as como la heterogeneidad de los terminales N (por ejemplo, metionina N-terminal) en el polipptido, tambin
se secuencian simultneamente. Esto da lugar a picos ms pequeos en el cromatograma y permite la cuantificacin relativa
de los terminales N y la identificacin del lugar de escisin en el polipptido. Este procedimiento para la secuenciacin de protenas tambin puede realizarse manualmente. Las limitaciones del mtodo de secuenciacin con PITC son que es solamente
semicuantitativo (es decir, la cantidad de terminales N slo puede estimarse) y que los derivados PTH de la serina y la treonina
se pueden degradar mucho, lo cual dificulta su determinacin. Para determinar los residuos de cistena es necesario modificarlos, por ejemplo mediante alquilacin. Adems, los aminocidos glicina y prolina se reordenan lentamente, lo que presenta un
pequeo problema para su determinacin.
Secuenciacin Carboxi-TerminalLa secuenciacin de protenas a partir del extremo carboxi-terminal tambin proporciona valiosa informacin sobre la estructura primaria as como posibles escisiones de C-terminales. La degradacin secuencial de
una protena desde el extremo C-terminal puede realizarse mediante mtodos qumicos o enzimticos. Se puede usar la reaccin de hidrazina, tiocianato de amonio o bromuro de ciangeno con una protena para degradar secuencialmente la protena
en el extremo C-terminal o en sus proximidades. Se ha extendido el uso de la reaccin de tiocianato de amonio para protenas
acopladas a soportes slidos. Los aminocidos C-terminales pueden escindirse secuencialmente en forma enzimtica usando
exopeptidasas tales como las carboxipeptidasas. Las limitaciones de las carboxipeptidasas son la posible contaminacin con
endopeptidasas, su inherente dificultad y la naturaleza impredecible de la secuenciacin. La espectrometra de masas puede
emplearse ya sea directamente en digeridos de protenas o junto con el mapeo de pptidos por HPLC para identificar el extremo C-terminal de la protena. Sin embargo, estos mtodos son solamente semicuantitativos.
Captulos
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fenilalanina, tirosina y triptofano; la termolisina escinde despus de los residuos hidrfobos a leucina, isoleucina y valina; la proteasa V8 escinde despus los residuos de cido glutmico y cido asprtico; y, finalmente, el bromuro de ciangeno escinde
los residuos metionilo. Tambin se pueden emplear otras enzimas, como por ejemplo clostripana (arginina) y endoproteinasa
lis-C (lisina) y mtodos qumicos tales como el cido 2-nitro-5-tiocianobenzoico (cistena). Cada uno de estos mtodos tiene
sus propias ventajas y desventajas. Una desventaja comn a todas estas tcnicas es que, en cierta medida, se producen escisiones no especficas. Es importante que los pptidos generados por la digestin sean lo suficientemente grandes para proporcionar informacin estructural sobre la protena y a la vez lo suficientemente pequeos para permitir su anlisis y separacin mediante una tcnica del tipo RP-HPLC. Por este motivo y como la escisin con esta enzima es casi cuantitativa, la tripsina es la
enzima de aplicacin general para la mayora de las protenas. En el caso de protenas grandes de ms de 60 000 daltons
(aproximadamente 520 aminocidos), la escisin con tripsina podra producir demasiados fragmentos y, por lo tanto, puede
elegirse otra endoproteasa. Normalmente, se emplea la tripsina tratada con L-TPCK (tosil-L-fenilalanina clorometil cetona), ya
que el TPCK inhibe la accin de la quimotripsina, un contaminante presente en muchas preparaciones de tripsina. Aunque la
reaccin con bromuro de ciangeno escinde en los residuos de metionilo, las protenas no contienen muchos de estos residuos. Por lo tanto, se obtienen relativamente pocos pptidos y es posible que sean demasiado grandes o excesivamente hidrfobos para la separacin por HPLC.
Una vez terminada la digestin, los pptidos suelen separarse por RP-HPLC y HPIEC. La seleccin de la columna apropiada es
emprica y depende del tipo de protenas. Para el RP-HPLC, funcionan bien los soportes que tienen un tamao de poro de 100
y 300 y la seleccin del soporte de slice puede ser un criterio importante para una separacin ptima. Para los pptidos
ms pequeos generados por estas digestiones, se ha comprobado que las fases estacionarias C8 y C18 son en general ms
eficientes que los soportes C4. Los disolventes ms comunes empleados para separaciones en fase reversa son agua y acetonitrilo con una cantidad constante (~0,1%) de cido trifluoroactico. Las fases mviles amortiguadas que contienen fosfato tambin ofrecen una excelente selectividad segn su pH. Al examinar el efecto del pH entre 3,0 y 5,0 se produce un desplazamiento en los pptidos que contienen los residuos cido glutmico y cido asprtico. Hay menos informacin disponible para
las separaciones de intercambio inico, pero son tiles los soportes de slice, as como los polimricos con soporte estacionario
de intercambio inico dbil y fuerte. Como muchos pptidos son ligeramente hidrfobos, puede requerirse la adicin de pequeas cantidades de disolventes orgnicos en la fase mvil, por ejemplo 5% a 10% de metanol o acetonitrilo. Una posible
desventaja del anlisis HPIEC para mezclas de pptidos es que, a veces existe la posibilidad de no retener en la columna los
pptidos neutros o los que tienen la misma carga que el soporte y, por lo tanto, este mtodo quizs no permita separarlos o
identificarlos.
VALORACIONES INMUNOLGICAS
Las valoraciones inmunolgicas se emplean para identificar y cuantificar la protena de inters en ingredientes farmacuticos
activos o para detectar y cuantificar las impurezas proteicas conocidas provenientes de la clula anfitriona. Dado que estas impurezas proteicas pueden representar un gran nmero de trazas de impurezas posibles en lugar de una sola impureza, las valoraciones inmunolgicas deben ser sensibles y selectivas para detectar la mayor cantidad posible de estas impurezas. Se han
desarrollado valoraciones inmunolgicas capaces de medir estas impurezas en concentraciones muy bajas en las protenas de
E. coli (ECP) y CHO. Adems, las valoraciones inmunolgicas pueden servir como valoraciones de la potencia para anticuerpos
monoclonales con el empleo de un antgeno apropiado.
Las valoraciones inmunolgicas incluyen un gran grupo de valoraciones basadas en interacciones especficas anticuerpo: antgeno de alta afinidad del complejo, tales como los radioinmunoanlisis (anlisis RIA) y las pruebas de inmunoabsorcin enzimtica (prueba ELISA). Los anlisis RIA se realizan en fase lquida o slida con un anticuerpo no marcado dirigido contra la
protena radiomarcada de inters. Este anlisis consiste en comparar la inhibicin de la unin de un antgeno marcado a un
anticuerpo no marcado con la inhibicin mediante estndares conocidos, lo cual permite la cuantificacin de la protena de
inters.
Las valoraciones inmunorradiomtricas (IRMA) o los anlisis RIA de fase doble utilizan dos preparaciones de anticuerpos entre las que se coloca la protena de inters. El primer anticuerpo no est marcado y est dirigido contra la protena; el segundo
anticuerpo est radiomarcado y puede estar dirigido contra la protena o el primer anticuerpo. El complejo anticuerpo:antgeno se asla en su totalidad y se determina la radioactividad y, en consecuencia, la protena de inters. El desarrollo de un anlisis RIA o una valoracin IRMA para un producto obtenido por biotecnologa requiere una cuidadosa atencin a la produccin
de los antisueros, a la preparacin del trazador marcado, a la preparacin de un estndar de referencia apropiado y a los mtodos para la separacin del antgeno libre a partir del antgeno unido.
El formato de prueba ELISA para el anlisis de trazas de impurezas ms utilizado es la prueba ELISA de fase doble, que emplea dos preparaciones de anticuerpos en forma similar a las valoraciones IRMA, pero sin marca radioactiva. El primer anticuerpo no est marcado y al segundo anticuerpo se le ha agregado una enzima, como por ejemplo peroxidasa de rbano (HRP) o
fosfatasa alcalina. A grandes rasgos, la prueba ELISA consiste en aplicar una capa de anticuerpos purificados a las protenas de
las clulas anfitrionas sobre placas de microtitulacin, seguida del producto proteico. Se agrega el conjugado anticuerpo:enzima y se deja que se una a las protenas de las clulas anfitrionas unidas al anticuerpo. Se agrega un substrato apropiado para
que se desarrolle un color, que se analiza con un lector de placas por espectrofotometra. Un ELISA multiantgeno de tales caractersticas requiere una preparacin de estndares de referencia apropiados representativos de las impurezas proteicas de las
clulas anfitrionas, para as servir como el inmungeno en la preparacin de los anticuerpos que se emplean en la valoracin.
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Estos estndares de referencia generalmente se preparan mediante un proceso de fabricacin que proporciona todas las protenas esperadas de las clulas anfitrionas excepto la protena producto. Es necesaria la ausencia total de la protena producto en
esta preparacin para evitar la produccin de anticuerpos contra el propio producto cuando el estndar de referencia se emplea como inmungeno. Debido a la diversa afinidad de los anticuerpos policlonales con las preparaciones multiantignicas,
no se puede garantizar la exactitud absoluta de los mtodos multiantgeno ni la capacidad de detectar todos los antgenos
posibles.
ELECTROFORESIS
Captulos
Los mtodos electroforticos se encuentran entre las valoraciones ms comunes y potentes empleadas para la evaluacin de
la pureza y homogeneidad proteica. Son valiosas no slo para la evaluacin inicial y la separacin de productos obtenidos mediante biotecnologa sino tambin como mtodos indicadores de estabilidad para detectar cambios moleculares o qumicos en
la molcula, debidos a la desnaturalizacin, aglomeracin, oxidacin, desamidacin, etc. Se facilita el uso de estos mtodos
dada su sencillez y el hecho de que slo requieren microgramos de muestra. Los dos tipos de valoraciones electroforticas ms
frecuentemene usadas para productos obtenidos por biotecnologa son la electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato
de sodio (SDS-PAGE) y el isoelectroenfoque (IEF).
El mtodo SDS-PAGE separa protenas principalmente segn su peso molecular ya que, en presencia del detergente aninico
Dodecil Sulfato de Sodio, se forma un complejo protena-Dodecil Sulfato de Sodio con carga neta negativa. En primer lugar, se
desnaturaliza la muestra en el detergente, que rompe las uniones no covalentes intra e intermoleculares que le dan estructura
a las protenas y a continuacin se somete a electroforesis en un soporte de gel de poliacrilamida. La migracin de las protenas a travs del gel es proporcional a su tamao; las protenas ms pequeas migran ms rpido que las grandes a travs del
gel. Con frecuencia, las muestras se separan electroforticamente bajo condiciones reducidas y no reducidas para determinar
la existencia de impurezas con el mismo peso molecular o escisiones proteolticas intramoleculares de la protena de inters.
Aunque la SDS-PAGE no reductora se emplea normalmente para estimar el estado de aglomeracin o de oligomerizacin de la
protena de inters, este mtodo slo permite observar aglomerados u oligmeros estables en presencia del Dodecil Sulfato de
Sodio y en las condiciones usadas para la preparacin y electroforesis de la muestra. Las protenas que constan de cadenas
mltiples unidas por uniones disulfuro se descomponen y se dividen en cadenas polipeptdicas individuales. La deteccin de la
muestra despus de la electroforesis puede ser cuantitativa mediante un anlisis densitomtrico de tincin con Azul Brillante
Coomassie o cualitativa, pero con mayor sensibilidad cuando la muestra est presente en cantidades de nanogramos si se realiza la tincin con plata. El SDS-PAGE con tincin con plata tambin puede llevarse a cabo cuantitativamente bajo condiciones
apropiadas. Con una validacin adecuada, se puede usar la tincin con Azul Coomassie Brillante y la densitometra para obtener una determinacin cuantitativa de nanogramos de polipptidos. El SDS-PAGE junto con la tincin con Azul de Coomassie
Brillante se emplean para determinar cuantitativamente la pureza de la muestra con respecto a dmeros y aglomerados y fragmentos peptdicos covalentes ms grandes. Cuando el mtodo se combina con la tcnica de tincin con plata, se puede hacer
una evaluacin de niveles bajos o de trazas de una nueva impureza al comparar directamente la muestra sometida a electroforesis con el material o el estndar de referencia sometido a electroforesis en condiciones reducidas y no reducidas. En general,
la tincin con plata se emplea cualitativamente porque podra haber una variacin importante en la unin con plata entre una
protena y otra debido a una tincin de fondo heterognea en ensayos de rutina. Se puede estimar la cantidad de una impureza mediante la electroforesis de una cantidad conocida de un estndar interno, como por ejemplo la albmina srica bovina, o
mediante diluciones menores de la protena de inters en otros carriles del mismo gel. La separacin SDS-PAGE de una protena puede combinarse con un mtodo inmunolgico, como por ejemplo la inmunotransferencia (immunoblotting). La transferencia Western (Western blot) resultante se emplea para identificar las bandas electroforticas (es decir, la impureza relacionada con el producto o con las protenas de las clulas anfitrionas). Despus de la electroforesis, se transfieren las protenas separadas a una membrana de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y se hacen reaccionar con el anticuerpo de
inters. La visualizacin del complejo se realiza con un anticuerpo marcado enzimticamente o radiomarcado.
El mtodo IEF separa protenas segn su carga en un campo elctrico. Las cargas en una protena provienen de distintos
sitios en la cadena de aminocidos, tales como grupos amino protonados, grupos carboxilo no protonados, grupos sulfhidrilo
no protonados, residuos de tirosina no protonados, residuos de cistena oxidados y residuos desamidados. Sin embargo, existe
un pH para cada protena en el cual la protena es isoelctrica y estas cargas se anulan mutuamente, siendo la carga neta efectivamente cero. El IEF se realiza con protenas nativas en un soporte de poliacrilamida de poros grandes o de gel de agarosa
con anfolitos (iones anfteros de bajo peso molecular) que establecen un gradiente de pH debido a su migracin dentro de la
matriz del soporte cuando se aplica un campo elctrico. Simultneamente, en presencia del campo elctrico, las protenas con
carga positiva migran hacia el ctodo y las protenas con carga negativa migran hacia el nodo. La migracin finaliza cuando
cada protena alcanza el valor de pH en el gradiente del soporte, donde su carga neta es cero. Este es el punto pI o isoelctrico
aparente de la protena. Como la migracin de una protena depende de su composicin de aminocidos, las formas alteradas
de la protena y otras protenas migrarn a diferentes puntos en el soporte. Los geles IEF pueden teirse para visualizar las protenas con colorante Azul Brillante Coomassie o plata. El IEF se emplea para identificacin o para asegurar la homogeneidad de
una protena (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales) como se demuestra mediante el patrn de bandas en el intervalo de
pI correcto. Tambin se puede emplear el mtodo para evaluar la estabilidad de un producto biolgico. La desamidacin proteica (es decir, la desamidacin de la glutamina o de la asparagina), con el tiempo, produce nuevos cidos carboxlicos que
generan molculas con un pI ms cido. El IEF puede proporcionar informacin sobre el estado de glicosilacin de glicoprote-
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nas tales como anticuerpos monoclonales, que pueden aparecer como muchas bandas debido a cambios en la carga aparente
de la molcula proteica como resultado de los grupos de cido silico. La interpretacin de los resultados del gel de IEF suele
ser ms difcil que los de SDS-PAGE y pueden exigir muchas suposiciones o juicios subjetivos.
Se est investigando exhaustivamente la electroforesis capilar de alta resolucin (HPCE), debido a recientes avances en la
tecnologa, ya que ofrece las ventajas potenciales de una alta resolucin de las protenas.
Captulos
Durante mucho tiempo, se han empleado mtodos cromatogrficos para determinar la pureza de molculas orgnicas y
protenas pequeas, tales como la insulina (ver Cromatografa 621) y para determinar la concentracin de ingredientes activos y/o excipientes de productos farmacuticos. Los mtodos cromatogrficos tambin son muy eficaces para la determinacin de la pureza de productos farmacuticos obtenidos por la tcnica de recombinacin. Sin embargo, la cromatografa de
protenas es mucho ms difcil debido a las mltiples modalidades de interaccin con el soporte cromatogrfico producidas
por el tamao y la forma, la carga y la hidrofobicidad de las protenas. Los mtodos cromatogrficos comnmente empleados
para aislar y caracterizar protenas recombinantes son el RP-HPLC, HPIEC, cromatografa de exclusin por tamao (HPSEC) y
cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC). Estos mtodos incluyen la separacin de protenas y se emplean para determinar la pureza de los ingredientes farmacuticos activos, as como los niveles de impurezas o productos de degradacin conocidos. Una complicacin en todos los mtodos cromatogrficos por columna es la determinacin del equilibrio de masas entre la
carga de la columna y el eluato. Sin embargo, las tcnicas de HPLC son valiosas cuando es necesario determinar la pureza y la
potencia de los productos farmacuticos proteicos.
Los anlisis RP-HPLC ms comunes se llevan a cabo en columnas que contienen una fase estacionaria C4 o C8 sobre un soporte de slice o un soporte polimrico. Tambin se utilizan fases estacionarias C18, pero ms frecuentemente con pptidos
ms pequeos en aplicaciones como el mapeo de pptidos. Se prefieren soportes con poros de un tamao de al menos 300
para protenas con un peso molecular mayor de 10 000. En la mayora de los anlisis RP-HPLC, las protenas se eluyen con
gradientes de acetonitrilo acuoso y se mantiene constante el cido trifluoroactico en 0,1%. Tambin se emplean otros amortiguadores del pH, como por ejemplo fosfato o Tris [tris(hidroximetil)aminometano], donde el pH puede ajustarse para aumentar la selectividad y lograr separaciones ptimas.
El HPIEC es un mtodo importante para la determinacin de la pureza. Estas separaciones se basan en cambios en la carga
de la molcula y son tiles para identificar y cuantificar impurezas comunes en protenas de uso farmacutico, tales como formas oxidadas (principalmente metionina oxidada) y desamidadas (glutamina y la asparagina) y formas fragmentadas o truncadas. Pueden emplearse fases estacionarias de intercambio inico fuertes o dbiles en soportes de slice o polimricos. La cromatografa de intercambio catinico puede realizarse en resinas de tipo sulfopropilo y se usa para productos de oxidacin y desamidacin. Por lo general, las protenas se cargan sobre una columna equilibrada con agua o una solucin amortiguadora dbil
y se eluyen con una gradiente salina, tal como cloruro de sodio de 0 a 1 M.
El HPSEC es una tcnica que puede proporcionar informacin sobre la cantidad de aglomeracin y fragmentacin de las
protenas de uso farmacutico. Segn la informacin que se necesite, la fase mvil puede mantener la protena nativa y contener un amortiguador de pH acuoso tal como fosfato 100 mM, pH 7, o bien puede desnaturalizar la protena con concentraciones bajas de un agente caotrpico o detergente tal como Dodecil Sulfato de Sodio al 0,1%. Los anlisis se realizan isocrticamente, con una lectura caracterstica entre 210 y 220 nm segn el amortiguador de pH usado. Tambin puede emplearse la
deteccin a 280 nm pero es menos sensible. La cromatografa de exclusin por tamao clsica se lleva a cabo en soportes
polimricos blandos tales como dextranos, poliacrilamida o agarosa entrecruzados. Estos, sin embargo, son ms adecuados para aplicaciones a baja presin. Como resultado, se han desarrollado varios soportes de mayor resistencia mecnica. Actualmente, es comn el uso de soportes basados en slice y agarosa, entrecruzados disponibles en el mercado. Tambin se utiliza el
HPSEC para la determinacin de fragmentos de protenas. Las cadenas fragmentadas suelen permanecer unidas a travs de
uniones disulfuro de residuos de cistena. El tratamiento de la muestra con un agente reductor tal como ditiotreitol o mercaptoetanol rompe la unin disulfuro y separa las cadenas. Por consiguiente, las cadenas fragmentadas pueden separarse de formas no fragmentadas mediante el HPSEC.
El HIC separa protenas en base a diferencias en su hidrofobicidad bajo condiciones de adsorcin y elucin moderadas que
impiden en general la desnaturalizacin y posterior prdida de actividad biolgica. Una fase estacionaria moderadamente hidrfoba se emplea con una fase mvil acuosa de amortiguador de pH y una concentracin inicial de sal alta para adsorber la
protena, la cual luego se eluye selectivamente empleando una gradiente salina decreciente. Se producen interacciones entre
los residuos aminoacdicos no polares expuestos en la superficie de la protena y los grupos hidrfobos presentes en la matriz
cromatogrfica. Para su uso en el HIC se han desarrollado varios soportes polimricos y de slice combinados con ligandos ligeramente hidrfobos tales como politeres, teres de fenilo o cadenas alqulicas cortas. Esta tcnica puede emplearse en el anlisis, purificacin y caracterizacin de protenas hidrfobas ms lbiles. Se puede modificar la selectividad y la retencin de la
protena mediante el control de variables tales como el tipo y la concentracin de sal, el pH y efectos selectivos de iones, temperatura y diseo degradiente, as como mediante una cuidadosa seleccin de la fase estacionaria.
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VALORACIONES CUANTITATIVAS
DETERMINACIN DE ADN
El ADN residual de las clulas anfitrionas es una posible impureza especfica del proceso en un producto obtenido mediante
biotecnologa. El ADN residual es diferente en cada producto ya que depende del organismo anfitrin y del procedimiento de
recuperacin utilizado para elaborar el producto. Aunque no se han detectado efectos perjudiciales para la salud en productos
biolgicos debido a su contenido de ADN, las agencias reglamentarias han pedido a los fabricantes que se aseguren un nivel
de reducido a bajo de ADN en productos obtenidos por biotecnologa.
La tcnica de hibridacin de ADN (anlisis de transferencia de punto, o dot blot) es la valoracin de ADN ms sensible y
rutinaria disponible para determinar el contenido de ADN en los productos. Sirve para valorar el proceso de purificacin para
demostrar que se ha logrado un nivel bajo de ADN en la etapa inicial de la fabricacin. El mtodo se basa en la hibridacin del
ADN celular de la muestra con sondas de ADN especficamente marcadas con 32P o qumicamente modificadas obtenidas del
ADN de la clula anfitriona. Primero se aisla el ADN residual en la muestra mediante un procedimiento que puede incluir la
hidrlisis de la protena, cromatografa, extracciones orgnicas y precipitacin en alcohol. Luego, se desnaturaliza el ADN aislado y se aplica a una membrana de nitrocelulosa o nailon junto con un grupo de estndares diluidos progresivamente de ADN
anfitrin. A continuacin, se aplican controles de ADN positivos y negativos y la membrana se introduce en un horno aproximadamente a 80 o se la coloca bajo luz UV para as completar la unin del ADN a la membrana. Luego, se prepara una sonda
de ADN mediante desplazamiento de mella (nick translation), sntesis de iniciador aleatoria o por modificacin qumica de un
Captulos
Las valoraciones biomimticas (valoraciones que imitan el efecto biolgico del producto) son de suma importancia en la
consideracin de las valoraciones para productos obtenidos mediante biotecnologa. Estas valoraciones miden la actividad del
producto y aseguran su eficacia. A grandes rasgos, existen tres tipos principales de valoraciones cuantitativas: las valoraciones
en modelos animales, valoraciones basadas en cultivos de clulas y los ensayos in vitro (fisicoqumicos). Cada una de estas valoraciones tiene una aplicacin en el control de productos biolgicos. Independientemente del tipo de valoracin cuantitativa
empleada, es deseable y a veces necesario emplear una valoracin biomimtica.
Valoraciones en Modelos AnimalesLas valoraciones biomimticas en modelos animales se han desarrollado para su uso
rutinario. Aunque el uso de estas valoraciones tiene una historia relativamente larga, presentan varias desventajas importantes
tales como la necesidad de un gran nmero de animales, instalaciones apropiadas y personal idneo para el manejo de los
animales, el alto costo del anlisis, su larga duracin (de varios das a semanas) y la mala reproducibilidad de los resultados. A
pesar de todo, se utilizan principalmente porque no se ha desarrollado una valoracin en cultivo de clulas o in vitro o no se
ha demostrado que estas tcnicas sean de igual o mayor valor. Un ejemplo de tal valoracin es la empleada para determinar la
actividad de la hormona humana del crecimiento (somatrem y somatropina). La potencia de la hormona humana del crecimiento se determina mediante un ensayo biolgico que mide el aumento de peso en ratas. Se controla el aumento de peso de
varias ratas hembras hipofisectomizadas durante 11 das, despus de una serie de inyecciones diarias de hormona humana del
crecimiento. La potencia relativa de la muestra de prueba se obtiene por comparacin estadstica de la actividad de la muestra
con la de un material o estndar de referencia. Los modelos animales se pueden emplear como pruebas de identidad biolgica
en caso de que se desarrollen valoraciones biolgicas in vitro o fisicoqumicas para medir la potencia de los productos.
Valoraciones Biolgicas Basadas en Cultivo de ClulasEste grupo de valoraciones es comparativamente ms fcil de
llevar a cabo, permite obtener resultados con ms rapidez (1 a 3 das), es mucho menos costoso y utiliza ms eficientemente
los recursos que las valoraciones en modelos animales. Las valoraciones biolgicas basadas en cultivo de clulas proporcionan
informacin sobre el efecto del producto biolgico en un sistema vivo, pero son imprecisas debido a las variaciones propias de
las clulas vivas, aunque no tanto como las valoraciones en modelos animales. Sin embargo, pueden automatizarse y en consecuencia pueden repetirse con suficiente frecuencia para proporcionar resultados relativamente reproducibles y exactos. Un
ejemplo de este tipo de valoracin es la medicin de la actividad antiviral de a-interfern humano en una lnea de clulas diploides de prepucio humano o en una lnea de clulas de carcinoma de pulmn humano (A549). Esta valoracin se realiza en
placas de microtitulacin por incubacin de clulas con a-interfern seguida de la exposicin al virus de la encefalomiocarditis.
Las clulas que sobreviven se detectan por unin a un colorante y se calcula la dilucin de a-interfern en la cual se produce la
proteccin en un 50% de la monocapa.
Valoraciones in Vitro (Fisicoqumicas)Este grupo de valoraciones no depende de un modelo vivo, sino que se basa generalmente en la accin qumica de un producto biolgico. Estos mtodos son bastante sencillos, rpidos, precisos y exactos.
La actividad del activador plasmingeno tipo tisular (alteplasa), por ejemplo, puede determinarse con una valoracin in vitro
de lisis del cogulo que puede automatizarse y proporcionar los resultados requeridos en cuestin de horas. Se forma un cogulo de fibrina sinttica en presencia del plasmingeno como resultado de la accin de la enzima trombina sobre el fibringeno. Cuando se agrega alteplasa, el plasmingeno se convierte en la enzima activa plasmina, que luego lisa el cogulo sinttico.
El punto final de la valoracin se sigue en forma espectrofotomtrica o visualmente mediante la observacin de la liberacin de
burbujas de aire atrapadas. Otra ventaja de este tipo de valoracin, debido a su precisin y exactitud, es que puede emplearse
para proporcionar estimaciones confiables de la estabilidad del producto. Tambin se han desarrollado ejemplos de valoraciones biolgicas in vitro basadas en las interacciones anticuerpo:antgeno y protena:ligando (receptor) para aplicaciones especficas. La aplicacin de estos tipos de valoraciones ofrece muchas ventajas para determinar la potencia de los anticuerpos monoclonales u otras protenas muy especficas para un ligando cuya reactividad incluye un paso de enlace.
USP 38
extracto de ADN de la clula anfitriona. Se purifica la sonda de ADN y se desnaturaliza trmicamente a 95. Luego se agrega a
la membrana tratada en el horno o con UV y se deja que se hibride con el ADN de las muestras aproximadamente a 42 en
presencia de formamida o a temperaturas mayores sin formamida durante 24 a 48 horas. A continuacin se coloca la membrana entre dos placas radiogrficas y se expone para producir una autorradiografa o se desarrolla por medios inmunoqumicos
empleando un sistema conjugado enzimtico/sustrato similar a la prueba ELISA y/o al mtodo de Western blot. Se estima el
ADN de la muestra por comparacin visual de la intensidad del punto de la muestra con los estndares de ADN diluidos. Tambin se puede explorar el autorradiograma por densitometra ptica. Se determina la sensibilidad de la valoracin, es decir de
10 a 250 pg, por el lmite de deteccin visual por encima del fondo producido por estndares de ADN diluidos en serie.
Se han desarrollado otros mtodos para determinar ADN por tecnologa de sensores biolgicos, o biosensores. En la actualidad, esta metodologa determina las impurezas totales de ADN y cido nucleico ms que el ADN especfico de las clulas anfitrionas. Esta tecnologa podra ser muy valiosa en el futuro, especialmente cuando se desarrollen mtodos de unin a ADN ms
especficos. Finalmente, la tecnologa de la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) recientemente desarrollada, que consiste
en la amplificacin del ADN, puede resultar til para detectar e identificar el ADN contaminante. Sin embargo, el uso cuantitativo de esta tecnologa an debe perfeccionarse.
Captulos
DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS
Una de las posibles modificaciones posteriores a la traduccin que aparecen en las protenas es la unin covalente de cadenas de oligosacridos. La glicosilacin es una caracterstica de protenas recombinantes expresadas en lneas celulares eucariticas. Aunque la cadena polipeptdica de una glicoprotena se sintetiza bajo el control directo del cdigo gentico, los oligosacridos no son productos primarios de los genes, sino que son sintetizados por enzimas conocidas como glicosiltransferasas. Esta
sntesis da lugar a la microheterogeneidad de las cadenas de carbohidratos. Adems, la glicosilacin depende de las lneas celulares, por lo que las glicoprotenas con cadenas polipeptdicas idnticas sintetizadas en distintas lneas celulares pueden tener
estructuras de carbohidratos considerablemente diferentes. Los azcares ms comunes en las glicoprotenas incluyen los azcares neutros (D-galactosa, D-manosa y L-fucosa), los aminoazcares (N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina) y el azcar
acdico conocido como cido silico.
Se pueden aplicar dos enfoques principales para determinar los azcares covalentemente unidos a la glicoprotena. Ambos
aceptan que la microheterogeneidad es un fenmeno comn entre las glicoprotenas y que la informacin obtenida representa
la composicin promedio o la estructura representativa.
El primer enfoque es la determinacin de la composicin de azcares en una glicoprotena, que puede realizarse mediante
varios mtodos. Se pueden determinar los azcares neutros y el cido silico por pruebas colorimtricas sencillas. El total de
azcares neutros puede determinarse mediante la reaccin con fenol y cido sulfrico y midiendo la absorbancia de la solucin
a 490 nm, comparada con una curva estndar. Luego de una hidrlisis ligeramente cida y la oxidacin con peryodato, se
puede determinar el contenido de cido silico libre, utilizando cido tiobarbitrico y la absorbancia de la solucin aproximadamente a 550 nm comparada con una curva estndar. Los azcares neutros individuales pueden determinarse despus de la
hidrlisis cida, por varios mtodos. Si no estn derivatizados, se pueden separar mediante HPIEC a un pH alto y se pueden
cuantificar por deteccin amperomtrica de pulsos. Tambin se pueden convertir en peracetatos de alditol usando anhdrido
actico o en acetatos de aldononitrilo utilizando clorhidrato de hidroxilamina y piridina antes de la peracetilacin, y los compuestos derivatizados se pueden separar por cromatografa de gases.
El segundo enfoque para determinar la composicin de carbohidratos consiste en liberar y separar las estructuras de oligosacridos individuales unidas covalentemente a la glicoprotena. Esto requiere el conocimiento de los tipos de estructuras unidas.
La unin de azcares a las protenas puede ocurrir principalmente de dos maneras: mediante una unin O-glicosdica que incluye el grupo hidroxilo de la serina, treonina o aminocidos modificados tales como la hidroxilisina o la hidroxiprolina, o mediante la unin N-glicosdica de la asparagina. Los oligosacridos unidos en O pueden liberarse de la protena por eliminacin
beta en condiciones alcalinas y la reduccin de los azcares terminales reductores con borohidruro de sodio. Los oligosacridos
unidos en N pueden liberarse qumicamente por la hidrazinlisis o enzimticamente usando una variedad de glicosidasas especficas tales como endo H, endo F, o pptido-N-glicanasa. Los oligosacridos se pueden separar por HPIEC a un pH alto y se
pueden cuantificar mediante una deteccin amperomtrica por pulsos. Esto produce un mapa de oligosacridos o carbohidratos anlogo al mapa de pptidos para la protena.
DETECCIN DE AGENTES ADVENTICIOS Y ENDGENOS
Las valoraciones especficas de la biotecnologa se centran en la deteccin de bacterias, hongos, micoplasmas y virus. stos
son ejemplos de los posibles contaminantes que pueden aparecer en la fermentacin bacteriana y en el cultivo de clulas de
mamferos. Se ejerce control de varias maneras, incluyendo la caracterizacin del banco de siembra maestro y los bancos de
clulas de trabajo para asegurar la ausencia de estos contaminantes, la evaluacin de materias primas, el diseo y funcionamiento de sistemas de fabricacin cerrados, el anlisis de lotes de produccin y la validacin de procesos de fabricacin especficos para asegurar la inactivacin o la eliminacin de posibles contaminantes.
La ausencia de bacterias y hongos en las formas farmacuticas estriles finales se evala por lo general mediante pruebas de
esterilidad segn se describe en Pruebas de Esterilidad 71. Las valoraciones de micoplasmas se realizan mediante mtodos de
cultivo estndar, empleando la incubacin aerbica y anaerbica en medios slidos en placas y caldos semislidos en tubos de
Informacin General / 1046 Productos Derivados de Clulas y Tejidos 925
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ensayo y deben cumplir con el Cdigo de Reglamentaciones Federales (21 CFR 610.12). Adems, los micoplasmas no cultivables se detectan microscpicamente por el mtodo de tincin con bisbenzimida de Hoechst.
Entre los diversos mtodos empleados para detectar la contaminacin por virus adventicios en lneas celulares se encuentran
la inoculacin de lneas celulares indicadoras seleccionadas porque permiten la reproduccin de una amplia gama de virus y su
control para detectar indicadores de infeccin viral tales como la citopatologa, hemoadsorcin, hemoaglutinacin e inmunofluorescencia; la inoculacin de animales no infectados y el seguimiento de la patologa y muerte; la inoculacin de animales y,
despus de cuatro semanas, la recoleccin y evaluacin del suero para detectar anticuerpos contra virus especficos de importancia; y valoraciones inmunolgicas especficas o sondas genticas para detectar algunos virus importantes que no se pueden
detectar mediante los otros mtodos indicados.
La expresin de genes de retrovirus endgenos es muy variable en diferentes clulas y lneas celulares de mamferos. La naturaleza impredecible de su manifestacin y la diversidad de sus propiedades bioqumicas y biolgicas hacen imposible el uso
de una sola prueba y exigen una estrategia de pruebas combinadas. Los mtodos de prueba generalmente empleados incluyen la microscopa electrnica de transmisin de las clulas del banco de siembra maestro y de sedimentos obtenidos por ultracentrifugacin de medios de cultivos post-cosecha y exentos de clulas, diversas valoraciones de retrovirus infecciosos que
emplean lneas de clulas indicadoras susceptibles a retrovirus; la actividad de transcriptasa reversa; y la induccin de retrovirus
en las clulas del banco de clulas maestras usando sustancias qumicas que inducen los retrovirus. Adems de los mtodos
virolgicos clsicos, tambin se estn comenzando a emplear otras tcnicas ms novedosas tales como la hibridacin de sondas moleculares.
INTRODUCCIN
Este captulo general proporciona una visin cabal sobre los aspectos a considerar para el desarrollo de productos derivados
de clulas y tejidos. El Glosario de Trminos y Definiciones proporciona una lista de trminos comnmente usados en este campo. Las terapias celulares y tisulares emplean productos mdicos que contienen clulas humanas o animales que se administrarn en humanos para reparar, reemplazar, regenerar o aumentar una clula, tejido u rganos enfermos, lesionados o disfuncionales de un receptor. Las clulas o tejidos pueden ser recolectados para su uso sin manipulacin o se pueden propagar, expandir, tratar farmacolgicamente o alterar de otra manera sus caractersticas biolgicas ex vivo antes de la administracin. La diversidad de indicaciones clnicas y tipos de productos derivados de clulas y tejidos se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Celular
Indicacin
Producto
Transplante de clulas madre hematopoyticas despus de la

terapia de ablacin
Clulas madre y progenitoras hematopoyticas que se han recolectado, propagado, seleccionado y/o tratado para eliminar clulas contaminantes mediante
dispositivos y/o reactivos
Cncer
Clulas T, clulas asesinas naturales (o Clulas NK, por sus siglas en ingls), clulas dendrticas o macrfagos expuestos a pptidos especficos del cncer para producir una respuesta anticancergena; clulas cancerosas autlogas o alognicas modificadas gentica o bioqumicamente e irradiadas para producir
una respuesta anticancergena
Diabetes
Clulas b de los islotes pancreticos encapsuladas
Infarto de miocardio
Clulas madre/progenitoras autlogas o alognicas; miocitos del msculo esqueltico; clulas madre cardiacas
Enfermedad del injerto contra el anfitrin
Clulas madre mesenquimales alognicas
Cicatrizacin de heridas
Queratinocitos autlogos o fibroblastos drmicos alognicos en un andamiaje

biocompatible
Defectos focales en el cartlago de la rodilla
Condrocitos autlogos o alognicos con o sin andamiaje biocompatible
Reparacin sea
Clulas madre mesenquimales en un andamiaje biocompatible
Enfermedades neurodegenerativas
Clulas progenitoras neuronales derivadas de tejidos embrionarios, fetales o

adultos; clulas modificadas genticamente para secretar factores neurotrficos, con o sin encapsulacin
Enfermedad infecciosa
Clulas T activadas
Enfermedad autoinmune
Clulas T reguladoras (Treg)
Lesin de la mdula espinal
Clulas progenitoras neuronales
Reparacin o regeneracin de rganos
Clulas autlogas o alognicas en biomateriales biocompatibles (geles) o estructura de andamiaje en 3 dimensiones
Captulos
1046 PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS Y TEJIDOS
926 1046 Productos Derivados de Clulas y Tejidos / Informacin General
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Captulos
Los productos de terapia celular se pueden modificar mediante tratamiento con materiales genticos de integracin o no
integrados (ADN, ARN, ARN pequeo de interferencia, etc.) con el objetivo de cambiar el patrn de expresin gentica. Por lo
general, se extraen clulas de un paciente, se modifican fuera de su cuerpo y luego se retornan al paciente. Las agencias reglamentarias consideran al producto celular modificado genticamente ex vivo como un producto de terapia gnica. Una gran
parte de la informacin de este captulo general es pertinente al procesamiento, caracterizacin, fabricacin y administracin
de clulas modificadas genticamente. Sin embargo, la informacin detallada acerca del uso de varios sistemas de transferencia de genes, consideraciones para el monitoreo del paciente, anlisis gentico y dems consideraciones pertinentes a productos de terapia gnica, se tratan en el captulo general Productos de Terapia Gnica 1047.
Este captulo general describe aspectos relacionados con la fabricacin, la obtencin de componentes y la caracterizacin de
productos derivados de clulas y tejidos para asegurar su seguridad y eficacia. El Apndice presenta una lista de guas y documentos reglamentarios relevantes. Los fabricantes de productos derivados de clulas y tejidos deben considerar y aplicar los
controles y procedimientos descritos en este captulo para asegurar el uso seguro de los productos en humanos. Se estn desarrollando y validando continuamente nuevas metodologas, las cuales sern incluidas en la Farmacopea de los Estados Unidos
(USP) a medida que se encuentren disponibles. Las monografas de USP para productos tisulares especficos y derivados de tejidos describen las especificaciones de prueba con las que debe cumplir el producto durante toda su vida en el mercado. El
trmino producto celular se refiere a clulas o tejidos de humanos o animales vivos que han sido manipulados o que se usan de
modo tal que se reglamentan como terapias celulares somticas, conforme a lo definido por la US Food and Drug Administration (Administracin de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. o FDA). El trmino producto derivado de tejidos se refiere a tejidos
humanos que se reglamentan de conformidad con las buenas prcticas para tejidos (GTP, por sus siglas en ingls). El trmino
productos de combinacin se refiere a clulas combinadas con dispositivos mdicos, tales como un andamiaje natural o sinttico.
Consideraciones para la Incorporacin de Conceptos del Sistema de Calidad en las Etapas

Tempranas del Desarrollo de Productos Derivados de Clulas y Tejidos
Los requisitos reglamentarios vigentes y futuros continuarn presentando desafos a los que desarrollan productos derivados
de clulas y tejidos en lo que respecta a incorporar atributos robustos de calidad en etapas tempranas de la fase de diseo para
asegurar el nfasis en la seguridad del paciente mediante un alto grado de entendimiento del proceso. Los sistemas de calidad
modernos que armonizan las Buenas Prcticas de Fabricacin vigentes (BPFv) con otros sistemas reglamentarios farmacuticos
generados fuera de EE.UU. [tales como la International Conference on Harmonization (Conferencia Internacional sobre Armonizacin o ICH) y la International Organization for Standardization (Organizacin Internacional para la Estandarizacin o ISO)]
y el sistema de calidad para dispositivos mdicos de la FDA se reconocen como las nuevas normas mundiales. Estas nuevas
normas incluyen conceptos para desarrollo de producto tales como Calidad por Diseo (QbD, por sus siglas en ingls) y Tecnologa Analtica de Procesos (PAT, por sus siglas en ingls). Asimismo, estos sistemas de calidad integran mtodos para el mejoramiento continuo y la gestin de riesgos que promueven la adopcin de los avances cientficos ms recientes y de tecnologas innovadoras de fabricacin.
El uso de los principios de Gestin de Riesgo de Calidad (QRM, por sus siglas en ingls) en etapas tempranas del desarrollo
del producto puede ser til para la identificacin de reas de riesgo que pueden mitigarse antes de que sean incorporadas al
proceso de fabricacin y afecten la seguridad y eficacia del producto. Los que desarrollan productos derivados de clulas y
tejidos deben emplear tcnicas de gestin y evaluacin de riesgos como componentes claves de sus sistemas de calidad. La
gestin de riesgos se define como un proceso sistemtico para la identificacin, evaluacin y control de riesgos a favor de la
calidad del producto derivado de clulas o tejidos durante todo el ciclo de vida del producto. El uso de tcnicas de QRM puede ayudar a conseguir productos seguros y eficaces mediante la evaluacin de riesgos para el paciente, la determinacin de
lmites en el espacio de diseo o el ranking de atributos de calidad. La QRM tambin ayuda a establecer y mantener un estado
de control mediante el uso de gestin de riesgos para conducir el control del proceso. Por ltimo, la QRM se puede usar para
facilitar el mejoramiento continuo dando prioridad a las oportunidades de mejoramiento. El nivel de esfuerzo, formalidad y
documentacin del proceso de gestin de riesgos debe ser acorde al nivel de riesgo, debe basarse en conocimientos cientficos
y, finalmente, debe estar vinculado con la proteccin del paciente.
Los elementos de gestin de riesgo se han convertido en un paradigma aceptado y se pueden encontrar fcilmente en documentos gua reglamentarios de la FDA e internacionales, especialmente el documento ICH Q9. Para facilitar esta evaluacin,
se han desarrollado diversas herramientas, las cuales proporcionan medios cuantificables para priorizar riesgos de manera que
se puedan identificar y corregir los elementos de ms alto riesgo de un proceso.
Dependiendo del objetivo del programa de gestin de riesgo, los anlisis de riesgo pueden presentar un grado mayor o menor de formalidad. De manera preliminar, los anlisis de riesgo menos formales entran en accin cuando es necesario acelerar
una evaluacin de riesgos, por ejemplo para la resolucin de un incumplimiento de fabricacin. Resulta necesario un sistema
de evaluacin de riesgos ms formal para el desarrollo de procesos o productos, lo cual es especialmente importante cuando
se deben priorizar recursos limitados. Los sistemas formalizados se integran en herramientas bien establecidas que pueden
cuantificar riesgos en cada fase o etapa de la fabricacin. Estos sistemas tambin se pueden usar para la evaluacin de opciones de materias primas, establecimiento de prioridades de validacin, alteraciones en las instalaciones, cambios de equipo y
deliberaciones sobre servicios.
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Las herramientas formales de anlisis de riesgos incluyen el mapeo del proceso, el anlisis preliminar de riesgos, el Anlisis de
Riesgo y Puntos Crticos de Control (HACCP, por sus siglas en ingls), el Anlisis de Riesgo y Operabilidad (HAZOP, por sus
siglas en ingls), el Anlisis por rbol de Fallas (FTA, por sus siglas en ingls), el Anlisis de Modo y Efecto de Fallas (FMEA, por
sus siglas en ingls) y el Anlisis de Modo, Efecto y Criticidad de Fallas (FMECA, por sus siglas en ingls).
En lo que respecta a productos derivados de clulas y tejidos, el FMEA se ha usado comnmente para identificar, cuantificar
y priorizar riesgos. El FMEA puede asignar una clasificacin numrica en una de tres categoras:
Severidad, que es la consecuencia de una falla;
Ocurrencia, que es la probabilidad de que ocurra la falla basndose en experiencias o incumplimientos anteriores; y
Deteccin, que se basa la capacidad para detectar la falla.
Se asigna una clasificacin numrica a cada categora (por lo regular del 1 al 5 o del 1 al 10) que corresponde a la severidad de
la variacin con respecto al intervalo del parmetro operativo, la probabilidad de una variacin y la posibilidad de detectar una
variacin antes de que afecte el producto. Los nmeros menores denotan una probabilidad remota de deteccin, mientras que
los nmeros ms altos denotan la posibilidad de una falla o efecto de riesgo. El producto de los valores de severidad, ocurrencia y deteccin representa un Nmero de Prioridad de Riesgo (RPN, por sus siglas en ingls). Durante el proceso de evaluacin
de riesgos se priorizan los RPN y se puede dirigir la solucin ms inmediata a las reas de riesgo ms elevado.
COMPONENTES USADOS EN LA FABRICACIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS Y

TEJIDOS
Introduccin
Calificacin de las Fuentes de Clulas y Tejidos

Diversas clulas y tejidos derivados de humanos y animales sirven como material de origen para productos derivados de clulas y tejidos. Las clulas de donantes que se pueden utilizar en los productos de terapia celular provienen de diferentes fuentes:
1. Las clulas propias del paciente (productos celulares autlogos)
2. Las clulas de otro ser humano (productos celulares alognicos)
3. Las clulas derivadas de animales (productos celulares xenognicos)
El origen de las clulas usadas para una terapia celular o tisular determinada depende en gran medida de la compatibilidad,
pureza y disponibilidad. El uso de clulas autlogas presenta la ventaja de un mnimo nivel de inquietudes con respecto al rechazo inmunolgico. No obstante, no siempre se cuenta con una fuente autloga o o sta no siempre es apropiada cuando el
tipo de clula es disfuncional, maligna, difcil de obtener o si est contaminada.
La alternativa es una fuente de clulas alognicas compatibles que est fcilmente disponible. La incompatibilidad inmunolgica representa la principal preocupacin con respecto al uso de fuentes de clulas alognicas pues puede llevar al rechazo de
la terapia celular o tisular administrada. En receptores inmunocomprometidos, las clulas de donante pueden reaccionar con
las clulas del paciente, lo que puede resultar en la enfermedad del injerto contra el anfitrin, poniendo en riesgo la vida del
paciente. A pesar de las potenciales complicaciones del uso de clulas o tejidos de donantes alognicos y ante la ausencia de
otras alternativas, la relacin riesgo-beneficio es a menudo favorable. Existen diversas metodologas que sortean con xito las
barreras inmunolgicas para el uso de fuentes alognicas. Los frmacos inmunosupresores desarrollados para el transplante de
rganos slidos, as como los avances en la induccin de tolerancia inmune se aplican cada vez ms al transplante de clulas.
Algunas clulas alognicas desencadenan reacciones inmunolgicas mnimas, incluso en receptores HLA incompatibles. Los
ejemplos incluyen clulas madre mesenquimales, algunas clulas drmicas y epidrmicas y fibroblastos.
Pese a los avances en la derivacin de nuevos tipos de clulas teraputicas, particularmente clulas madre (clulas de adulto,
fetales, embrionarias y de pluripotencia inducida), la capacidad de generar ciertos tipos de clulas o tejidos an est muy lejos
de ser alcanzada. Por consiguiente, los procesos actuales usan clulas y tejidos xenognicos para tratar diversas enfermedades
Captulos
Los fabricantes de productos derivados de clulas y tejidos deben asegurarse de que todos los componentes usados en la
fabricacin sean adecuadamente calificados. Los ejemplos de componentes usados en la fabricacin de productos de terapia
celular o tisular incluyen clulas y tejidos de origen; biomateriales naturales o sintticos; materiales auxiliares requeridos durante la fabricacin pero que no estn destinados a aparecer en el producto teraputico final; y excipientes usados en la formulacin de productos de terapia celular o tisular.
La calificacin es el proceso de adquisicin y evaluacin de datos para establecer el origen, identidad, pureza, seguridad biolgica y aptitud general de un componente especfico para garantizar la calidad. La diversidad de productos de terapia celular
y tisular y de los materiales usados para producirlos dificulta recomendar pruebas o protocolos especficos para un programa
de calificacin. Por lo tanto, se deben desarrollar programas racionales y cientficamente slidos para cada componente.
Las actividades de calificacin de materiales cambiarn a medida que los productos pasen de la etapa de estudios clnicos a
la de obtencin de autorizaciones y comercializacin. Un programa de calificacin bien diseado se hace ms exhaustivo a
medida que progresa el desarrollo del producto. Durante las etapas tempranas del desarrollo del producto, las cuestiones de
seguridad deben ser el foco principal de un plan de calificacin de materiales. En las etapas posteriores, las actividades de calificacin de materiales deben desarrollarse completamente y cumplir con las BPFv.
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o condiciones en los seres humanos. El uso de clulas xenognicas debe atender inquietudes relacionadas con el rechazo inmunolgico y la transmisin de virus animales a los seres humanos (ver Fuentes Animales de Clulas y Tejidos, ms adelante).
Algunos principios generales para la obtencin de tejidos incluyen lo siguiente: (1) los sistemas deben permitir la rastreabilidad retrospectiva del material hasta el donante, mientras se cumple la legislacin sobre privacidad; (2) deben tomarse medidas
para prevenir la transmisin de enfermedades infecciosas del donante al receptor; y (3) la obtencin y el procesamiento aspticos deben garantizar la seguridad del producto final, debido a que no es posible la esterilizacin terminal de productos que
contienen clulas y tejidos vivos. La FDA ha promulgado un conjunto de reglamentos especficos, referidos como Buenas Prcticas para Tejidos (GTP), que tratan especficamente la necesidad de obtener y procesar tejidos de una manera tal que evite la
transmisin de una enfermedad transmisible. Se deben seguir las GTP y/o BPF para productos de terapia celular o tisular, dependiendo del origen de la clula y de su lugar en el ciclo de vida del producto.
Captulos
ELEGIBILIDAD DEL DONANTE
La FDA ha promulgado un conjunto integral de reglamentos que rigen el uso de tejidos y clulas humanos destinados para
implantes, transplantes, infusin o transferencia a un receptor humano. Se hace referencia a estos materiales como clulas y
tejidos o productos derivados de clulas y tejidos humanos (HCT/P, por sus siglas en ingls). El cumplimiento con los requisitos
de elegibilidad de donantes es de suma importancia para la obtencin de HCT/P para uso mdico, debido a que estos instruyen que es obligatorio revisar los registros mdicos pertinentes de un donante para evaluar los factores de riesgo y la evidencia
clnica de agentes infecciosos transmisibles. Esto incluye la obtencin de un historial mdico y la realizacin de un examen
fsico al donante para detectar enfermedades transmisibles. Asimismo, los donantes deben someterse a anlisis de laboratorio
adecuados usando kits de prueba autorizados o aprobados por la FDA para enfermedades y agentes de enfermedades especficos relevantes (RCDAD, por sus siglas en ingls). El examen de deteccin de enfermedades requerido ser cada vez ms amplio
a medida que se identifiquen nuevos RCDAD y se encuentren disponibles kits de prueba aprobados o autorizados por la FDA.
Dos fuentes de informacin sobre el examen de deteccin de enfermedades transmisibles son: la Guidance on Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (Gua sobre la Determinacin de Elegibilidad de
Donantes de Clulas y Tejidos y Productos Derivados de Clulas y Tejidos Humanos) de la FDA y la Circular of Information (Circular
Informativa) de la AABB (http://www.aabb.org/Content/About_Blood/Circulars_of_Information/aabb_coi.htm). No se requiere
determinar la elegibilidad de donante para HCT/P autlogos.
CLULAS Y TEJIDOS O PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS O TEJIDOS HUMANOS
Los HCT/P se pueden obtener de donantes comunes sanos, donantes cadavricos o pacientes enfermos, por ejemplo, de
cncer. Se debe evaluar la aptitud del tejido obtenido de pacientes con cncer y otras enfermedades antes de la recoleccin
para asegurar la seguridad y el funcionamiento adecuados del producto de terapia celular final. Asimismo, la reglamentacin
del Ttulo 45 del CFR Parte 46 se aplica a todas las investigaciones en humanos financiadas por el gobierno federal. Esta reglamentacin requiere que el uso de cualquier tejido extrado de donantes humanos sea examinado y aprobado por una Junta de
Revisin Institucional. Asimismo, esta reglamentacin incluye consideraciones especiales para la investigacin en presos, nios,
mujeres embarazadas o tejidos gestacionales. En todos los casos, se debe obtener el consentimiento adecuado, por escrito, del
donante o del pariente ms cercano, que incluya una descripcin del tejido a extraer y del uso previsto.
Se debe minimizar el riesgo de transmisin de enfermedades al operador de la fabricacin mediante capacitacin adecuada
sobre la manipulacin de materiales potencialmente infecciosos y mediante el uso de equipo y vestimenta de proteccin. Los
tejidos deben obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperacin asptica con un alto grado
de seguridad.
Las clulas progenitoras hematopoyticas (HPC, por sus siglas en ingls) son uno de los tipos de clula ms utilizados para el
transplante humano. Estas clulas se pueden obtener de la mdula sea, de la sangre perifrica o de la sangre del cordn umbilical. El origen de las clulas depende del paciente, la enfermedad y el protocolo clnico. Los mtodos de procesamiento de
las clulas son similares, independientemente de su origen. Las HPC se pueden obtener de donantes saludables o pacientes
con trastornos hematolgicos. Adems de las reglamentaciones sobre HCT/P de la FDA, la American Association of Blood
Banks (Asociacin Estadounidense de Bancos de Sangre o AABB) , la Foundation for the Accreditation of Hematopoietic Cell
Therapy (Fundacin Para la Acreditacin de la Terapia de Clulas Hematopoyticas) y el National Marrow Donor Program (Programa Nacional de Donantes de Mdula o NMDP) han publicado guas y normas aplicables a la recoleccin y el procesamiento de estos materiales.
Para fuentes de clulas o tejidos obtenidos de muestras quirrgicas o de donantes cadavricos, se aplican las prcticas corrientes de salas de operacin de hospitales. La calidad del aire en una sala de operacin con acceso limitado tpica es adecuada para dichos procedimientos. El personal de recoleccin debe tener la capacitacin adecuada en todos los aspectos relativos
a la recuperacin de tejidos: lavado quirrgico, vestimenta, comportamiento dentro de la sala de operacin, anatoma, preparacin del sitio de intervencin y tcnica asptica. Se requiere especial cuidado cuando la obtencin de tejidos u rganos requiera la manipulacin prolongada del intestino, lo cual conlleva el riesgo de que se produzca una puncin involuntaria del
intestino. Si el tejido contiene flora microbiana (p.ej., la piel), puede ser desinfectado adecuadamente en el momento de la
extraccin con agentes antimicrobianos o bactericidas y un lavado minucioso.
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FUENTES ANIMALES DE CLULAS Y TEJIDOS
SISTEMA DE BANCOS DE CLULAS
Un banco de clulas es un conjunto de clulas obtenidas de clulas combinadas o derivadas de un nico clon celular o tejido
de donante que se almacena en bolsas o viales en condiciones definidas que mantienen la estabilidad genotpica y fenotpica.
El sistema de bancos de clulas por lo general se compone de un banco maestro de clulas (MCB, por sus siglas en ingls) y un
banco de clulas de trabajo (WCB, por sus siglas en ingls), aunque es posible emplear otras metodologas. El MCB se produce
Captulos
Resultara ideal que los productos de terapia celular constaran de clulas humanas fabricadas con una mnima exposicin a
materiales derivados de animales. Sin embargo, en la actualidad, importantes necesidades mdicas no satisfechas pueden ser
potencialmente tratadas mediante productos de terapia celular de clulas o tejidos animales, tales como los islotes pancreticos destinados al tratamiento de la diabetes. Las fuentes humanas de islotes pancreticos estn disponibles nicamente de
pncreas donados al momento de la muerte. La calidad de los islotes del donante de rganos es variable y el suministro disponible es inadecuado para satisfacer la potencial demanda. Un mtodo consiste en obtener islotes pancreticos de fuentes animales apropiadamente calificadas para su uso subsiguiente en humanos (xenotransplante).
Los desarrolladores que pretenden usar clulas o tejidos animales en un producto de terapia celular deben tratar adecuadamente las cuestiones de salud pblica y deben desarrollar metodologas para reducir el riesgo potencial de introduccin y propagacin de agentes infecciosos zoonticos en la poblacin general humana. La PHS Guideline on Infectious Disease Issues in
Xenotransplantation (Gua sobre Cuestiones Relacionadas con Enfermedades Infecciosas en Xenotransplantes del Servicio de Salud Pblica de EE.UU.) (enero de 2001) describe riesgos potenciales. La gua de la FDA Source Animal, Product, Preclinical, and
Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans (Aspectos sobre Fuentes Animales, Productos, Preclnicos y Clnicos Relacionados con el Uso de Productos de Xenotransplante en Humanos) (abril 2003) presenta mtodos y
expectativas actuales para minimizar los riesgos de los productos celulares xenognicos.
El uso de tejido animal en la fabricacin de productos de terapia celular requiere que el tejido se obtenga de una manera
controlada y documentada y que provenga de animales libres de patgenos designados, que hayan sido criados en cautiverio
en pases o regiones geogrficas con sistemas adecuados de prevencin y control de enfermedades. Asimismo, el cuidado y
uso de animales debe ser aprobado por una comisin institucional acreditada para el cuidado y uso de animales. Los animales
donantes deben tener un linaje documentado, provenir de manadas o colonias cerradas y estar en programas de mantenimiento y control de salud. Las instalaciones para albergar a estos animales deben estar certificadas por el USDA (Departamento
de Agricultura de los Estados Unidos) (para animales vertebrados grandes) o por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Asociacin para la Evaluacin y la Acreditacin del Cuidado de Animales de Laboratorio; AAALAC, por sus siglas en ingls) (para animales vertebrados pequeos) y deben cumplir con las recomendaciones establecidas por la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996) (Gua para el Cuidado y la
Utilizacin de Animales de Laboratorio del Consejo de Investigacin Nacional, 1996), que se puede obtener a travs de la AAALAC (www.aaalac.org). Estas instalaciones deben contar con veterinarios y dems personal capacitado que garantice la salud
de los animales y la prevencin de enfermedades. Los procedimientos empleados en las instalaciones deben estar documentados y se deben guardar registros. Los programas de mantenimiento y control de salud deben basarse en la atencin veterinaria
estndar para cada especie, incluyendo exmenes fsicos, monitoreo, pruebas de diagnstico de laboratorio y vacunaciones.
Un mtodo de partidas sucesivas o de ingresos y egresos totales (all-inall-out) para trasladar a los animales en las instalaciones
puede minimizar el potencial de transmisin de agentes infecciosos.
Los componentes alimenticios deben estar documentados y excluir material reciclado o procesado a fin de reducir el riesgo
de enfermedades prinicas.
Para garantizar al mximo la seguridad del producto, tanto los donantes animales como sus tejidos deben ser examinados
en varias etapas del proceso para descartar la presencia de agentes microbianos. Estas pruebas de control deben emplear ensayos que sean lo suficientemente sensibles y especficos para detectar bacterias, micoplasma, hongos o virus de inters. Los animales donantes deben someterse a estudios de deteccin de enfermedades pertinentes antes de la extraccin del tejido. Las
necropsias posteriores a la recuperacin de tejidos, los programas de animales centinela y el archivo de rganos, tejidos, sangre y otras muestras de donantes tambin garantizan la seguridad del tejido animal para aplicaciones de terapia celular.
En general, se aplican condiciones de extraccin asptica similares en la obtencin de tejido animal y humano. El tejido debe
obtenerse usando controles y condiciones ambientales que permitan la recuperacin asptica con un alto grado de seguridad.
Se deben utilizar instalaciones especialmente diseadas para la extraccin de tejidos, por lo general, en estrecha relacin con la
instalacin que alberga a los animales. Las caractersticas y atributos recomendados para las instalaciones de extraccin de tejido animal deben incluir lo siguiente: (1) organizacin de etapas tales como afeitado, sedacin y preparacin para la sala de
operaciones en salas diferentes con controles ambientales apropiados; (2) filtracin de partculas del aire de alta eficiencia (HEPA, por sus siglas en ingls); (3) instalaciones contiguas pero separadas para continuar con el procesamiento de tejidos; y (4)
reas destinadas al retiro de cadveres. Todo lo relacionado a la capacitacin del personal, la manipulacin y la puncin del
intestino, y la desinfeccin se aplican a la extraccin quirrgica tanto de tejidos humanos como animales (ver la seccin Clulas
y Tejidos o Productos Derivados de Clulas y Tejidos Humanos anterior). Cuando los investigadores establecen lneas celulares animales para su uso como capa de clulas alimentadoras, es necesario crear, analizar y caracterizar bancos de clulas, segn se
indica en la siguiente seccin.
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de acuerdo con las BPFv y, preferentemente, se obtiene de una fuente calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y documentados. Las clulas y tejidos humanos se deben obtener mediante un contratista autorizado para
adquisicin de tejidos con un programa de calificacin de donante que cumpla con el Ttulo 21 del CFR 1271. El WCB se obtiene o produce mediante la expansin de uno o ms viales del MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se convierte
en la fuente de clulas para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos de clulas contribuyen en gran
medida a la uniformidad en la produccin de partidas debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. No obstante, no siempre es posible o factible crear un banco de clulas, de modo que se pueden usar clulas primarias apropiadamente
analizadas y calificadas en lugar de crear bancos de clulas. Como mnimo, el MCB y el WCB deben analizarse para determinar
su identidad, esterilidad, pureza, viabilidad y la presencia de virus y micoplasma.
Captulos
CALIFICACIN DE BANCOS DE CLULAS
El anlisis de seguridad y la caracterizacin de bancos de clulas son etapas importantes para obtener un producto final uniforme que mantenga una uniformidad de lote a lote y que se mantenga exento de agentes adventicios. La norma ICH Q5A,
Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin (Evaluacin de Seguridad
Viral de Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal) proporciona recomendaciones
especficas para el anlisis de bancos de clulas para agentes virales. Aunque esta gua no est especficamente destinada para
los productos derivados de clulas o tejidos, por lo general se pueden aplicar las mismas pruebas. Pueden ser necesarios anlisis de virus adicionales dependiendo del predominio de enfermedades virales endmicas en la poblacin donante. Los anlisis
para calificar los MCB se realizan una sola vez y se pueden hacer con una alcuota del material del banco o con cultivos de
clulas derivados del banco de clulas. Se deben establecer especificaciones de manera prospectiva para la calificacin del
MCB. Es importante documentar los antecedentes del MCB, los mtodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones de almacenamiento. Todos los materiales auxiliares requeridos para la produccin de los bancos, tales como medios,
sueros, citoquinas, factores de crecimiento y enzimas tambin deben ser calificados, documentados y analizados de manera
apropiada.
ANLISIS DE SEGURIDAD DE LOS MCB Y WCB
Banco Maestro de Clulas (MCB)El anlisis de seguridad para calificar el MCB incluye anlisis para demostrar la ausencia
de agentes adventicios y virus endgenos. Los anlisis de agentes adventicios deben incluir pruebas de deteccin de bacterias,
hongos, micoplasma y virus. La ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando sistemas de prueba tanto in vitro
como in vivo y pruebas adecuadas especficas para la especie.
Banco de Clulas de Trabajo (WCB)El anlisis de seguridad para el WCB es menos extenso y por lo general se enfoca en
el potencial de introduccin de virus adventicios o en la activacin de virus latentes durante el cultivo adicional requerido para
crear el WCB. Asimismo, se debe llevar a cabo el anlisis de seguridad del final de la produccin (EOP, por sus siglas en ingls)
para asegurar que las clulas se puedan expandir en un nmero mximo conocido de generaciones, a la vez que continen
generando un producto aceptable. Para informacin acerca de los tipos de anlisis de virus adventicios que deben realizarse a
las clulas del MCB, del WCB y EOP, consulte el captulo Evaluacin de la Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos Obtenidos
de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal 1050.
CARACTERIZACIN DE LOS MCB Y WCB
La caracterizacin de los MCB y WCB incluye el anlisis de identidad para establecer el origen de las especies, p. ej., anlisis
de isoenzimas para confirmar el origen humano de las clulas. No obstante, la caracterizacin de los bancos de clulas debe
incluir evaluaciones adicionales como las que se mencionan a continuacin:
Cintica de crecimiento y tiempo de duplicacin de la poblacin
Evaluacin morfolgica
Porcentaje de confluencia en el pasaje
Conteos de clulas
Viabilidad (pre y poscrioconservacin)
Expresin fenotpica de tipos celulares deseados e indeseados (pre y poscrioconservacin)
Monitoreo de marcadores bioqumicos nicos (pre y poscrioconservacin)
Evaluaciones de actividad funcional (pre y poscrioconservacin)
Anlisis de expresin gnica y proteica (pre y poscrioconservacin)
Expresin de antgenos de histocompatibilidad inmunologica (HLA/MHC)
Identificacin gentica molecular
Estabilidad cromosmica
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Materiales para Andamiajes Biocompatibles
Calificacin de Materiales Auxiliares

Los productos auxiliares incluyen una amplia variedad de materias primas y componentes usados en la fabricacin. Pueden
incluir materiales relativamente simples o sustancias complejas como medios de cultivo, amortiguadores, factores de crecimiento, citoquinas, componentes de cultivo y procesamiento, anticuerpos monoclonales y dispositivos de separacin de clulas.
Los materiales auxiliares no estn destinados a estar presentes en el producto teraputico final. Por lo general, las formulaciones de medios definidos incluyen componentes como la albmina y la transferrina, purificadas a partir de fuentes humanas
o animales. La purificacin, el procesamiento y el anlisis exhaustivo de estos componentes minimizan an ms el riesgo de
contaminacin viral o microbiana, si bien no lo eliminan. Las cantidades residuales de materiales auxiliares usados en el proceso de fabricacin, incluyendo protenas recombinantes u otros componentes de medios definidos, pueden ser potencialmente
antignicos por lo que se debe evaluar su eliminacin del producto final y se deben establecer lmites apropiados cuando sea
necesario.
Los riesgos conocidos se asocian con el uso de materiales auxiliares en la produccin de productos de terapia celular. La
calidad de los materiales auxiliares utilizados en la elaboracin de un producto de terapia celular puede influir en la seguridad,
potencia y pureza del producto. Idealmente, cada uno de los materiales auxiliares empleados en la fabricacin de un producto
de terapia celular o tisular debe elaborarse en condiciones que cumplan con las BPFv. No obstante, las sustancias complejas o
nicas que resultan esenciales para el control de procesos o la produccin pueden no estar disponibles a travs de proveedores
que las producen de acuerdo con las BPFv. En este caso, el fabricante de productos de terapia celular o tisular debe desarrollar
Captulos
La mayora de los materiales para andamiajes naturales o sintticos se reglamentan como dispositivos mdicos, aunque los
andamiajes derivados de tejidos humanos, tales como la dermis se reglamentan como HCT/Ps. Siempre que sea posible, se
deben usar andamiajes que hayan sido previamente aprobados para otros usos clnicos, pues dichos materiales deberan haber
sido sometidos previamente a anlisis exhaustivos de seguridad y calidad. Para aplicaciones en productos derivados de clulas
o tejidos, el material de andamiaje debe permitir la unin, proliferacin y migracin de clulas, y por lo regular resulta deseable una alta porosidad para facilitar la siembra de clulas dentro del material. El andamiaje debe proveer una difusin adecuada de nutrientes para la salud de las clulas y la liberacin de productos excretados por las clulas. El material debe contar con
una resistencia mecnica adecuada y debe ser susceptible a la manipulacin, modificacin qumica y fabricacin. El material
del andamiaje debe ser biocompatible, relativamente inerte e inmunolgicamente benigno.
Por lo general, los andamiajes se pueden clasificar como duros o blandos. Los andamiajes duros se usan en aplicaciones que
requieren una forma especfica, tales como la formacin de un vaso sanguneo o una vejiga. Los andamiajes blandos se usan
en aplicaciones en las que es necesario que el producto se amolde flexiblemente con una forma existente del cuerpo.
Los materiales del andamiaje pueden ser polmeros sintticos o naturales, biodegradables o permanentes. La biodegradacin
permite la reabsorcin o eliminacin del andamiaje por parte del cuerpo sin manipulacin. La velocidad de degradacin del
andamiaje debe coincidir con la velocidad de formacin o regeneracin del tejido. La estructura del andamiaje natural debe
reemplazar al andamiaje que se degrada de tal manera que mantenga la integridad estructural del tejido u rgano que se est
regenerando. Por ejemplo, un vaso sanguneo recientemente formado debe tolerar tanto la presin sangunea interna como
las fuerzas mecnicas externas.
El polmero biodegradable sinttico que se usa de manera ms comn es el cido poligliclico (PGA, por sus siglas en ingls). El cido Polilctico (PLA, por sus siglas en ingls) tambin se usa ampliamente, en ocasiones en combinacin con el PGA.
Estos polmeros se degradan dentro del cuerpo, se eliminan fcilmente antes de la degradacin y tienen un extenso historial de
uso en materiales de sutura. La policaprolactama (PCL), que presenta una velocidad de degradacin menor a la del PLA o el
PGA, se usa en aplicaciones que requieren de una larga presencia en el cuerpo.
La matriz extracelular (ECM, por sus siglas en ingls) y sus derivados son materiales naturales que se usan para andamiajes
en la fabricacin de productos de combinacin de clulas y biomateriales. Las protenas tales como el colgeno o la fibrina y
los polisacridos como el quitosano o los glicosaminoglicanos (GAG) tambin han sido usados en el crecimiento de clulas
para fabricar productos de combinacin. El colgeno es por mucho el sustrato ms popular para clulas y ha sido moldeado en
andamiajes para una variedad de productos, principalmente en aplicaciones para la piel de ingeniera tisular. Los agentes de
entrecruzamiento tales como el glutaraldehdo y las carbodiimidas solubles en agua se han usado para mejorar la fuerza de los
andamiajes naturales. Dependiendo del origen del material, los andamiajes naturales pueden ser inmunognicos.
Cuando las clulas deben proliferar despus de la siembra, el andamiaje y el sistema de cultivo de apoyo debe permitir el
intercambio de nutrientes y productos de desecho. Una matriz gruesa e impermeable conducir a zonas de tejido necrtico.
Muchos dispositivos de tejido estn diseados de tal manera que puedan ser eventualmente retirados del paciente.
Se debe establecer la seguridad y biocompatibilidad del andamiaje y de los materiales que entran en contacto con el producto. Se debe llevar a cabo una batera completa de las pruebas recomendadas por los captulos Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vitro 87, Pruebas de Reactividad Biolgica, In Vivo 88, y los documentos ISO 10993 o el FDA Blue Book (Libro Azul de
la FDA) G95-1. Los residuos del proceso y los productos de degradacin derivados de la preparacin del andamiaje deben
cuantificarse y se deben establecer lmites. Es necesario establecer condiciones de estabilidad y almacenamiento de los materiales del andamiaje.
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una estrategia cientficamente slida para calificar la materia prima. Un programa de calificacin de materiales auxiliares utilizados en la fabricacin de productos de terapia celular y tisular debe incluir los siguientes puntos: (1) identificacin y seleccin,
(2) aptitud para uso en la fabricacin, (3) caracterizacin y criterios de aceptacin, (4) calificacin del proveedor y (5) garanta
de calidad. Se deben generar archivos histricos de los lotes para cada material auxiliar.
El cumplimiento con las especificaciones establecidas se debe comparar con los datos provistos en el Certificado de Anlisis.
La rastreabilidad es esencial y se deben anotar los nmeros de lote para cada material auxiliar en los registros de produccin
del producto derivado de clulas. Se debe consultar el captulo de informacin general de USP Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Gnicos y de Ingeniera Tisular 1043 para informacin especfica sobre la implementacin de un programa de
calificacin apropiado para estos materiales. Otros captulos de USP tratan aspectos que se deben considerar con respecto a la
calificacin de materiales auxiliares especficos (p.ej., Suero Bovino 1024, Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad 90 y Factores de Crecimiento y Citoquinas Usados en la Fabricacin de Productos de Terapia Celular 92).
Captulos
Calificacin de Excipientes
Durante las etapas finales del proceso de fabricacin, es posible incluir excipientes o sustancias que incrementan la estabilidad de las clulas teraputicas. Los ejemplos de excipientes incluyen medios de cultivo, solucin salina USP u otras soluciones
de electrolitos aprobadas para inyeccin, protenas exgenas tales como albmina srica humana o crioprotectores tales como
dimetil sulfxido (DMSO). Los excipientes no estn destinados a ejercer un efecto teraputico directo sobre el paciente, sino
que estn destinados a contribuir con el mantenimiento de los atributos de calidad del producto celular final. Debido a que los
excipientes se administrarn al paciente junto con las clulas, se debe poner especial atencin a su calificacin. En general,
siempre que sea posible, deben usarse excipientes que ya hayan sido aprobados por la FDA para uso humano. Si se usan excipientes no aprobados, debe realizarse una evaluacin de la seguridad completa. Para los excipientes novedosos, tales como
soluciones para crioconservacin, pueden ser necesarios estudios de seguridad preclnicos apropiadamente diseados.
FABRICACIN DE PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS O TEJIDOS

Introduccin
La fabricacin de productos derivados de clulas o tejidos requiere de diversas de operaciones y manipulaciones por parte de
individuos bien capacitados en tcnicas de procesamiento asptico. La competencia tcnica del personal es fundamental para
la seguridad y eficacia del producto. Los productos autlogos presentan ms retos para el procesamiento celular y tisular puesto que deben desarrollarse procedimientos para segregacin de lotes, autorizacin de lnea y procesos operativos a fin de reducir las posibilidades de confundir lotes para pacientes especficos (ver Consideraciones sobre el Diseo y la Operacin de Instalaciones a continuacin).
Aislamiento y Seleccin de Clulas

Los principios generales para el procesamiento de tejidos humanos o animales despus de su extraccin asptica son independientes del origen de la clula o tejido. La fabricacin de productos celulares puede llevarse a cabo en una instalacin de
fabricacin ubicada en las inmediaciones del sitio clnico o en una instalacin de fabricacin de productos celulares central distante. El material celular o tisular de origen debe ser envasado en envases estriles a prueba de fugas y transportado desde el
rea de extraccin al lugar de procesamiento en condiciones controladas que mantengan la viabilidad de las clulas. El medio
lquido en el cual se sumergen las muestras durante el transporte debe ser ptimo para mantener la viabilidad de clulas y
tejidos. Este medio de transporte puede complementarse con antibiticos. Los niveles de antibitico en los amortiguadores del
proceso deben disminuirse y, finalmente, eliminarse durante las etapas subsiguientes del procesamiento, de modo que los antibiticos no estn presentes en el producto celular final. En el caso de productos sanguneos o de tejidos con gran cantidad de
sangre, el medio de transporte o solucin amortiguada de electrolitos debe contener un anticoagulante.
AISLAMIENTO
Por lo general, se realiza una diseccin de rganos o tejidos slidos para dejar expuesta la regin deseada. Este material se
puede usar tal como est para transplante o se puede someter a procesamiento adicional. Si se desean organoides multicelulares (por ejemplo, los islotes de Langerhans) o suspensiones de clula nica, el tejido se puede someter a disgregacin mecnica o enzimtica. La disgregacin fsica se puede lograr con instrumentos que homogeneizan el material impartiendo grandes
fuerzas de corte o dividiendo el tejido en partes ms pequeas. Alternativamente, el material se puede comprimir o pasar a
travs de tamices con tamaos de malla determinados.
La digestin enzimtica de tejido conectivo extracelular es otro mtodo comn para disociar el tejido slido, en la cual se
usan diversas enzimas, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papana y quimotripsina. Se pueden
agregar enzimas con actividad nucleasa, como la desoxirribonucleasa, para contribuir en la digestin de los cidos nucleicos
liberados de las clulas daadas y evitar la aglomeracin excesiva de las clulas. Al final de la incubacin, la suspensin de clu-
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las puede ser sometida a una accin de bombeo leve para dividir an ms los cmulos multicelulares hasta lograr el tamao o
la composicin deseados. Habitualmente, los mtodos de disgregacin enzimtica y fsica se combinan para lograr el resultado
deseado.
Debido a que las clulas sanguneas o de mdula sea son intrnsecamente suspensiones, la manipulacin mecnica por lo
general se limita a la extraccin de plasma y agregados, lo cual se consigue mediante centrifugacin y filtracin.
Las actividades de aislamiento de clulas y tejidos que implican etapas abiertas de manipulacin deben llevarse a cabo en
una cabina de seguridad biolgica ISO 5 (clase 100). El entorno de la cabina de seguridad biolgica debe ser adecuado para
mantener operaciones de procesamiento asptico. Para HCT/P que sufren una manipulacin mnima en sistemas cerrados, estos entornos pueden estar controlados pero sin clasificacin. No obstante, para productos de terapia celular y tisular que se
manipulan y fabrican de conformidad con las BPFv, el entorno de la cabina de seguridad biolgica debe estar controlado y
clasificado, por lo general como un cuarto limpio ISO 7 (clase 10 000). Se deben tomar precauciones para segregar los aislados tisulares y celulares especficos del paciente.
SELECCIN
Expansin y Diferenciacin de Clulas Ex Vivo

EXPANSIN EX VIVO
Un aspecto fundamental para los fabricantes de productos celulares y tisulares es la capacidad de producir y administrar al
paciente una dosis teraputicamente relevante de la poblacin celular requerida. Segn la aplicacin de que se trate, el producto puede ser de un tipo celular puro y homogneo, o una mezcla de diferentes tipos celulares funcionales. Hay muchas
poblaciones de clulas blanco presentes en bajos niveles o baja pureza en los tejidos complejos de fuentes primarias. En estos
Captulos
Por lo general, las suspensiones de clulas son una mezcla de tipos celulares que pueden requerir procesamiento adicional, a
fin de aislar una poblacin celular de inters y para reducir el nivel de tipos celulares no deseados, tales como clulas tumorales
potencialmente contaminantes. Diversas tcnicas de aislamiento y separacin de clulas proporcionan un alto rendimiento de
poblaciones celulares puras.
Las poblaciones celulares se pueden enriquecer selectivamente variando la fuerza y la duracin del centrifugado. La separacin tambin se puede lograr mediante centrifugacin isopcnica, donde la suspensin de clulas se centrifuga en un medio de
gradiente que abarca todas las densidades de las clulas de la muestra. Las centrfugas de elutriacin de flujo continuo especialmente diseadas separan poblaciones celulares sometiendo una suspensin de clulas a fuerzas centrfugas y de corriente
lquida opuestas en una cmara especial dentro del mecanismo del rotor. Las poblaciones celulares se separan dentro del rotor
segn sus tamaos y densidades y se eluyen selectivamente fuera de la cmara del rotor al aumentar la fuerza de corriente
lquida. Finalmente, otros mtodos implican la adicin de agentes de alta densidad como el almidn hidroxietlico a la suspensin celular. Los procedimientos de concentracin y separacin como estos con frecuencia ocasionan la prdida de clulas debido a la aglomeracin y agregacin.
La separacin celular tambin se puede lograr aplicando tcnicas que toman ventaja de las caractersticas citolgicas o bioqumicas nicas de distintas poblaciones celulares. La aglutinina de soja agrega clulas que contienen un grupo particular de
carbohidratos que se expresa en clulas maduras de la sangre pero no en clulas madre, permitiendo el enriquecimiento de las
clulas madre. Los linfocitos poseen el antgeno CD2 que acta como receptor de eritrocitos ovinos. Al agregar eritrocitos ovinos a la mezcla de clulas, los linfocitos forman rosetas alrededor de los eritrocitos ovinos y posteriormente se separan mediante centrifugacin diferencial. Algunas aplicaciones aprovechan la capacidad de ciertas poblaciones de clulas de adherirse a la
superficie de sustratos slidos especficos, como el plstico para cultivo de tejidos, materiales revestidos de colgeno y los andamiajes de polmeros naturales y sintticos. El tipo celular unido especficamente se recupera selectivamente en la superficie y
se retira de la suspensin de clulas inicial.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra protenas especficas de superficie de clulas se pueden usar tanto para la seleccin positiva como para la seleccin negativa de clulas. Por ejemplo, una poblacin celular unida con anticuerpos monoclonales puede ser retirada de la suspensin celular despus de su exposicin a partculas magnticas recubiertas con anticuerpos antimonoclonales. Las partculas magnticas y sus clulas unidas se retiran de la suspensin celular magnticamente. Las
suspensiones de clulas no marcadas se pueden verter o incubar sobre superficies, como matraces de plstico o microesferas
recubiertas de anticuerpos monoclonales para aislar poblaciones celulares particulares. Adems, se pueden separar diferentes
tipos de clulas, utilizando un clasificador de clulas activado por fluorescencia (FACS, por sus siglas en ingls), mediante la
unin de anticuerpos con marcadores fluorescentes a un tipo de clula particular.
Otras tcnicas enriquecen poblaciones de clulas destruyendo clulas no deseadas. Por ejemplo, algunos anticuerpos monoclonales unidos a clulas son capaces de fijar y activar el complemento que se agrega exognicamente, provocando lisis celular. Algunos procedimientos utilizan agentes citotxicos o inhibidores mitticos para destruir selectivamente clulas no deseadas. Estos mtodos por lo regular se dirigen a subpoblaciones celulares con altas tasas de crecimiento, tales como las clulas
tumorales. Finalmente, un anticuerpo se puede conjugar con un grupo txico, como la ricina, y permitir que el agente citotxico alcance la poblacin celular deseada. La mayora de estos procedimientos requieren varias etapas de lavado para garantizar la eliminacin de las clulas muertas, fragmentos de clulas y agentes citotxicos del producto celular final.
Captulos
USP 38
casos, la produccin de una dosis teraputica se puede lograr slo mediante el enriquecimiento y la expansin ex vivo especficos de las clulas requeridas.
La expansin ex vivo de clulas se puede presentar en cultivos en suspensin (p.ej., clulas T o clulas madre hematopoyticas y progenitoras), cultivos adherentes (p.ej., clulas madre mesenquimales, clulas madre embrionarias, clulas madre pluripotentes inducidas, clulas madre neuronales o fibroblastos drmicos) o una mezcla de ambos (p.ej., expansin del estroma
medular). Existen numerosas tecnologas para el cultivo de clulas. Las clulas se pueden propagar en matraces de cultivo de
tejidos (matraces T), frascos tipo rodantes, andamiajes polimricos o bolsas flexibles, permeables a gases, por lo general, dentro de incubadoras con control de temperatura, humedad y composicin gaseosa. Los sistemas para cultivo de clulas multicapa de alta capacidad compuestos por sistemas de bolsas mltiples de plstico para cultivo de tejidos y biorreactores que emplean microportadores permiten llevar a cabo la expansin, recoleccin y formulacin en un sistema cerrado. Las unidades de
fermentacin de pequea escala tradicionales se pueden usar para la expansin de clulas en cultivos en suspensin. Asimismo, es posible expandir clulas adherentes en esas unidades ya sea proporcionado una superficie de adherencia (microportadores, perlas recubiertas o discos) o adaptando las clulas para propagarlas en un cultivo en suspensin. Algunos sistemas de
cultivo se disean especficamente para la propagacin de clulas para aplicaciones teraputicas. Estos por lo general, son sistemas cerrados que usan cartuchos desechables para el biorreactor en unidades de procesamiento automtico con control directo de temperatura, composicin gaseosa y velocidad de perfusin de medios. En algunas ocasiones el software automatizado permite el rastreo de pacientedonante, as como documentar las condiciones de cultivo y las manipulaciones. Estas caractersticas son tiles en el diseo e implementacin de los programas de Control de Calidad (QC) de liberacin de producto y
para la documentacin de Garanta de Calidad (QA) de corridas de procesamiento.
En cultivos adherentes, las clulas por lo general se recolectan de la superficie en la que se han expandido. Los mtodos de
liberacin incluyen la agitacin fsica, la ruptura enzimtica, la quelacin de iones metlicos y la inhibicin competitiva de molculas de adhesin o de matriz. Como se describi anteriormente, debe tenerse en cuenta la fuente, la seguridad, la toxicologa y el anlisis de residuos para cualquier reactivo utilizado para liberar clulas adherentes durante la fabricacin. Algunos sistemas especficos para ciertos productos no requieren la liberacin de clulas adherentes. Las clulas se expanden en un andamiaje sinttico o natural biocompatible que luego se aplica en forma tpica (por ejemplo, sustitutos de piel modificados por
ingeniera) o las clulas se cultivan dentro o fuera de fibras para perfusin ex vivo (por ejemplo, hepatocitos en dispositivos de
fibra hueca para tratar hepatopatas).
En todos los casos, se deben optimizar los parmetros estndar de cultivo de clulas para maximizar la eficiencia del proceso.
Tales parmetros incluyen la composicin del material celular de origen, la densidad de siembra inicial, la composicin de los
medios, la velocidad de recambio de los medios, la temperatura, la composicin gaseosa, el pH y la velocidad de entrega. Segn la naturaleza del producto, es necesario definir el efecto potencial de los parmetros del proceso sobre la potencia y la
funcin de las clulas blanco.
BiorreactoresSe requieren biorreactores y dispositivos especializados para la fabricacin de productos de combinacin tridimensionales. Estos biorreactores sostienen los andamiajes/matrices biocompatibles para la fabricacin de la construccin.
Aunque el biorreactor puede proporcionar un sistema cerrado para la fabricacin de construcciones, ste genera el reto de
acceder al andamiaje para la siembra de clulas y durante la obtencin de muestras para el anlisis de liberacin de producto
mientras se mantiene la esterilidad. Los biorreactores son, por lo general, dispositivos de un solo uso, con lo cual se evita la
contaminacin cruzada entre productos. De preferencia, el producto no ser reenvasado para su transporte y entrega. Por
ejemplo, los biorreactores tambin pueden servir como envase final para el transporte del producto.
La prueba de envasecierre se debe llevar a cabo en todos los sistemas de envasecierre finales. Se debe verificar la compatibilidad para la esterilizacin del biorreactor y del andamiaje y el proceso de esterilizacin debe ser validado para cada configuracin de producto. Los productos lixiviables y extrables de los materiales en contacto con el producto tales como biorreactores y componentes de envasado deben cuantificarse y se deben establecer lmites.
En los sistemas cerrados de biorreactores puede ser difcil observar o muestrear clulas. La medicin de parmetros metablicos puede servir de mtodo sustituto susceptible de validacin con el que se puede evaluar la tasa de proliferacin y predecir el
momento de la recoleccin del producto celular. Debe definirse bien la relacin entre tales parmetros y la viabilidad, la potencia y la funcin del producto celular. Puede ser necesaria la purificacin y el enriquecimiento de las clulas blanco despus de
la expansin mediante mtodos como los descritos anteriormente.
DIFERENCIACIN
Algunos productos de terapia celular requieren diferenciacin de linaje o funcional de las clulas de origen. Por ejemplo, a
travs de los procesos de expansin de clulas madre hematopoyticas, normalmente se generan productos que contienen
una mezcla de clulas madre multipotentes, clulas progenitoras comprometidas hacia un linaje y clulas diferenciadas hacia
un linaje. La composicin de estos productos se puede manipular mediante diversas combinaciones de factores de crecimiento
y citoquinas durante el proceso de expansin. Lo opuesto se aplica a los procesos en los que las clulas maduras son desdiferenciadas para permitir que luego vuelvan a comprometerse hacia un linaje determinado (por ejemplo, los condrocitos en la reparacin de cartlago). Algunos ejemplos especficos de la manipulacin ex vivo son la produccin de clulas T especficas para
antgenos destinados a tratar determinadas enfermedades o la obtencin de tipos de clulas teraputicas a partir de clulas
madre embrionarias. Antes de su liberacin para uso clnico, las clulas blanco diferenciadas resultantes deben ser completamente caracterizadas. Puede ser necesario evaluar el potencial de desdiferenciacin de clulas multipotentes que hayan sido
USP 38
sometidas a diferenciacin para garantizar la seguridad del producto. Cuando las clulas hayan sido expandidas y subsiguientemente diferenciadas, se puede llevar a cabo el anlisis de cariotipo o ensayos de transformacin in vitro para demostrar que
las clulas son aceptables para uso clnico.
MANIPULACIN GENTICA EX VIVO
Formulacin de Productos Derivados de Clulas y Tejidos

Las metodologas para formular productos derivados de clulas y tejidos dependen en gran medida del tiempo de almacenamiento planeado para las clulas antes de la administracin al paciente. Para algunos productos derivados de clulas, el tiempo
entre el fin de la fabricacin y la administracin al receptor previsto puede medirse en el orden de horas a das. Otros productos derivados de clulas pueden crioconservarse para extender su vida til. Una metodologa distinta para formular productos
derivados de clulas y tejidos puede implicar la adicin de un andamiaje natural o sinttico que pueda facilitar el manejo, la
proteccin de las clulas de la respuesta inmune y la creacin de una forma especfica que contribuya con el efecto teraputico. Las consideraciones para formular cada uno de estos tipos de productos derivados de clulas y tejidos se analizan a continuacin.
PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS Y TEJIDOS NO CRIOCONSERVADOS
Los productos que constan de suspensiones de clulas para administracin en pacientes dentro de las horas posteriores a su
fabricacin con frecuencia se formulan en soluciones amortiguadas estriles, adecuadas para administracin directa. Para otros
productos derivados de clulas y tejidos no crioconservados, es posible extender la vida til de horas a das, usando soluciones
que contengan nutrientes y antioxidantes apropiados. En la mayora de los casos, estos excipientes no estn destinados para su
administracin directa a pacientes. Por consiguiente, puede ser necesario eliminar los excipientes antes de la administracin al
paciente (ver Preparacin y Administracin del Sitio Clnico). Cuando se va a administrar un amortiguador para formulacin no
aprobado a pacientes, se debe llevar a cabo un anlisis toxicolgico preclnico.
PRODUCTOS DERIVADOS DE CLULAS Y TEJIDOS CRIOCONSERVADOS
La mayora de las formulaciones de medios de crioconservacin de clulas se suplementan con DMSO del 5% al 10% con o
sin almidn hidroxietlico (por lo general al 6%) y una protena plasmtica como albmina srica humana del 4% al 10% en
una solucin salina balanceada. El DMSO previene la deshidratacin al alterar la concentracin aumentada de soluciones extra-
Captulos
La modificacin gentica de clulas ex vivo es un procedimiento comn de procesamiento que se usa para alterar el patrn
de expresin gnica en una poblacin definida. La introduccin de materiales genticos integrantes o no integrantes (ADN,
ARN, ARN pequeo de interferencia) se lleva a cabo a fin de inducir la expresin de nuevos genes y productos o para inhibir la
expresin gnica endgena. La modificacin gentica ex vivo en entornos de transplante autlogo implica la manipulacin de
una poblacin de clulas recolectada o expandida de un paciente y la readministracin subsiguiente de las clulas al donante.
En un entorno de transplante alognico comn, una poblacin de clulas estable y modificada genticamente que ha sido
caracterizada y de la cual se ha generado un banco, se administra a una amplia poblacin de pacientes. Con el propsito de
controlar la enfermedad del injerto contra el anfitrin en transplantes alognicos de mdula sea, las clulas T de donantes
seleccionadas han sido tratadas con genes letales, como el de la timidina quinasa, que hacen que las clulas sean susceptibles
al tratamiento con ganciclovir despus del transplante. Entre los ejemplos de productos de terapia celular autlogos genticamente modificados se incluye la transduccin de clulas tumorales con citoquina u otros genes inmunomoduladores, linfocitos
transducidos con receptores para antgenos tumorales y la introduccin en linfocitos recolectados de un vector de ribozima
antiviral como una estrategia para tratar la infeccin por virus de inmunodeficiencia humana. Entre los ejemplos de productos
alognicos de terapia celular se incluyen lneas de clulas tumorales genticamente modificadas e irradiadas que se usan como
vacunas contra tumores y clulas encapsuladas transfectadas con un gen para expresar un factor neurotrfico para una administracin localizada de protena teraputica en el sistema nervioso central.
Las clulas genticamente modificadas ex vivo se consideran productos de terapia gnica. Las cuestiones relacionadas con
los productos de terapia gnica se tratan en detalle en el captulo general Productos de Terapia Gnica 1047, en especial lo
referente a la produccin del vector o material gentico usado para conseguir la transferencia gnica, las estrategias de pruebas analticas, la seguridad del paciente y el monitoreo. La fabricacin, procesamiento de clulas y las metodologas de control
de procesos tratadas con anterioridad se pueden aplicar a los procedimientos usados para manipulacin gentica. Con frecuencia, las poblaciones celulares genticamente modificadas se aslan y expanden o seleccionan antes de la introduccin del
material gentico. Se cuenta con equipo y procesos especializados para la introduccin de material gentico el cual debe ser
validado y monitoreado. Las cuestiones relacionadas con la generacin de bancos de clulas y estabilidad aplican a lneas de
clulas usadas en productos alognicos de terapia celular que se establecen y crioconservan en MCB y WCB. Por ltimo, las
cuestiones relacionadas con el anlisis y la administracin de la poblacin de clulas genticamente modificadas se analizan
ms adelante en este captulo.
USP 38
celulares no penetrantes durante la formacin de hielo. La solucin polimrica de hidroxietilo de alto peso molecular protege a
las clulas de la deshidratacin puesto que el agua se incorpora en cristales de hielo extracelulares. El uso de protenas, a menudo, determina una recuperacin y viabilidad mximas de clulas despus de descongelar. En ocasiones se usa suero (de 5%
a 90%) en lugar de protenas especficas. Algunas formulaciones para crioconservacin estn completemente exentas de protena.
La concentracin ptima de clulas para crioconservacin depende del tipo de clula y debe determinarse empricamente,
pero por lo general oscila entre 106 y 107 clulas por mL. La homogeneidad y viabilidad de la poblacin de clulas que se
crioconservan tambin puede diferir despus de la descongelacin y se debe evaluar cuidadosamente. En los casos en los que
el producto final derivado de clulas o tejidos est destinado para descongelacin y administracin inmediata, la presencia de
DMSO en el amortiguador de la formulacin somete al paciente a un nivel incrementado de toxicidad relacionada con la infusin, aunque esto se relaciona con el volumen administrado y con la concentracin final del crioconservante. Referirse a la seccin Preparacin y Administracin del Sitio Clnico para consideraciones adicionales.
Captulos
CLULAS COMBINADAS CON ANDAMIAJES BIOCOMPATIBLES
Muchos productos de terapia celular y tisular se administran en conjunto con un andamiaje biocompatible. Por ejemplo, los
productos para cicatrizacin de heridas o sustitutos de piel contienen clulas sembradas en un andamiaje. La estructura bioqumica y fsica del andamiaje y el mtodo para combinar clulas con el andamiaje son especficos para cada producto.
Las clulas se pueden cargar en un dispositivo de membrana semipermeable para administracin. Por lo regular, el tamao
de poro de la membrana es lo suficientemente grande para permitir que los factores teraputicos secretados por las clulas
pasen, pero es lo suficientemente pequeo para evitar que las inmunoglobulinas y las clulas anfitrionas entren en contacto,
destruyan o monten una respuesta inmune con las clulas teraputicas. El dispositivo puede ser una fibra hueca o una cpsula
semipermeable con clulas en el interior que secretan compuestos teraputicos o bien puede formar parte de un sistema ms
grande de bombas y filtros, como mdulos de fibra hueca con hepatocitos para tratar hepatopatas.
Las clulas se pueden sembrar en un andamiaje tridimiensional y se les permite propagarse y formar una estructura parecida
al tejido. En el producto resultante, las clulas se orientan de una manera nica, que es importante para el uso previsto del
producto (p.ej., substitutos de piel).
Las clulas se pueden encapsular en un gel o solucin de polmero entrecruzable y la estructura implantable resultante puede funcionar como vaso de cultivo, como un medio para proteger a las clulas del sistema inmune del anfitrin, o como una
manera de moldear las clulas en una forma definida. Algunos de los polmeros utilizados son alginato, cido hialurnico, colgeno, quitina o polmeros sintticos. Se han implantado clulas b de los islotes pancreticos encapsuladas en pacientes para
tratar la diabetes. Para tratar la incontinencia urinaria, se han mezclado condrocitos con alginato a fin de formar una estructura
al inyectarlos.
Las clulas se pueden adherir a andamiajes con formas definidas que posteriormente se implantan. Algunos ejemplos incluyen clulas precursoras osteognicas en andamiajes de hueso humano cadavrico desmineralizado, cermica de hidroxiapatita,
cermica de hidroxiapatitafosfato triclcico o vidrio biodegradable, que se pueden usar en la reparacin de defectos seos.
MTODOS ANALTICOS
La complejidad y el alcance de las terapias celulares se reflejan en la amplia variedad de mtodos analticos que se usan para
establecer controles durante el proceso y criterios de liberacin del producto final. Se deben seleccionar especificaciones de
calidad para productos celulares y tisulares para confirmar la calidad, seguridad y potencia del producto. Las pruebas seleccionadas deben ser especficas para cada producto y deben contar con criterios de aceptacin adecuados a fin de garantizar parmetros de calidad uniformes y dentro de los lmites aceptables de variacin biolgica, prdida de actividad, cambios fisicoqumicos o degradacin durante la vida til del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos
celulares y tisulares deben respetar los principios descritos en el documento de la ICH Q6B Specifications: Test Procedures and
Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptacin
para Productos Biotecnolgicos/Biolgicos).
Las especificaciones se establecen a partir de una caracterizacin minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y un
entendimiento del proceso y su capacidad. La caracterizacin debe incluir mediciones de las propiedades fisicoqumicas, la seguridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad.
Los fabricantes deben desarrollar especificaciones para cada producto desarrollado a partir de esta informacin mediante la
aplicacin de mtodos estadsticos apropiados. Los datos deben incluir lotes usados en los estudios preclnicos y clnicos, y deben incluir adems datos de validacin de ensayo y proceso que pueden estar correlacionados con la evaluacin de estabilidad, seguridad y eficacia.
Los controles durante el proceso y las especificaciones para el producto deben estar sustentadas usando un estndar de referencia apropiado. Un producto autlogo puede basarse en un estndar de referencia generado a partir de clulas o tejidos de
procesamiento de un donante saludable o de una fuente que proporciona clulas y tejidos a instituciones de investigacin. El
estndar de referencia garantiza que el proceso, segn se mide en los ensayos de liberacin, no cambie de manera importante
USP 38
con el tiempo y que verifique que una prueba produzca resultados aceptables, es decir, que se cumplen los requisitos de aptitud del sistema. El estndar de referencia se fabrica a partir de un lote producido en condiciones controladas y cumple con
todas las pruebas de proceso y de liberacin final. Adems, este estndar de referencia est sujeto a un nivel adicional de caracterizacin, que incluye pruebas que no se suelen realizar para la liberacin de productos. No es necesario que el estndar de
referencia est almacenado en la misma dosis, formulacin o temperatura que el producto final. Sin embargo, se debe determinar la estabilidad del estndar de referencia.
Alternativamente, se puede usar un estndar de trabajo. En ese caso, debe comportarse en la prueba de forma similar al
estndar de referencia. El cambio a un nuevo estndar de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben realizar paralelamente al estndar de referencia existente. Se debe evaluar, con sumo cuidado, el impacto de cualquier cambio en
las propiedades del nuevo estndar de referencia antes de adoptarlo. Una opcin de estndar de referencia para un producto
celular con una vida til corta, o para una aplicacin autloga o especfica para un paciente, puede ser un banco de clulas
donantes normales del tipo celular apropiado. Este banco de clulas se puede utilizar para asegurar que el proceso de fabricacin es capaz de generar un producto uniforme.
Controles durante el Proceso
Especificaciones de Liberacin de Producto Final

Las terapias celulares reglamentadas como productos biolgicos deben cumplir con las secciones aplicables del Ttulo 21 del
CFR 211 y del Ttulo 21 del CFR 610 para garantizar que cumplan con su identidad, pureza, potencia, seguridad microbiolgica y dems atributos esenciales, tales como la viabilidad.
Debido a que no es posible emplear la esterilizacin terminal de un producto celular vivo, esencialmente se requiere que
todos los productos derivados de clulas cumplan con los criterios de aceptacin para pruebas de producto tales como esterilidad, micoplasma y endotoxinapor lo general, un resultado negativo o la falta de crecimiento demuestran la esterilidad y la
ausencia de micoplasma; asimismo, los productos deben demostrar <5 unidades de endotoxina (UE) por kilogramo de peso
corporal del paciente. En el caso de las inyecciones intratecales, el lmite de endotoxina especificado es ms estricto 0,2 UE
por kilogramo de peso corporal del paciente. El anlisis de virus adventicios se realiza en contadas ocasiones en el producto de
terapia celular final debido a que las clulas o bancos de clulas de origen y los materiales auxiliares de origen biolgico ya han
sido sometidos a anlisis para detectar agentes virales de inters antes de la fabricacin.
Captulos
Los procesos de fabricacin deben contar con criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, en etapas
clave durante el proceso. Los controles durante el proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad
y la cantidad del producto en proceso sean suficientes para fabricar un producto final aceptable. Entre los ejemplos de controles durante el proceso se incluyen:
Enumeracin y viabilidad
Microbiolgicos (esterilidad, endotoxinas, micoplasma)
Expresin de marcadores fenotpicos o genotpicos
Verificacin de morfologa contra estndares de referencia visuales
Produccin de una sustancia bioactiva deseada
Determinacin de duplicaciones de poblacin, nmero de pasaje, edad del cultivo
Valoraciones de impurezas potenciales del proceso
Monitoreo de parmetros del sistema de cultivo (% CO2, humedad relativa %, pH, glucosa, lactato, etc.)
Pruebas funcionales tales como unidades formadoras de colonias (UFC) y expresin de protenas especficas de las clulas.
La razn principal para establecer pruebas de control durante el proceso es garantizar que se obtenga el producto correcto
con calidad y desempeo especficos. La razn secundaria para la realizacin de pruebas durante el proceso consiste en recolectar datos de caracterizacin del proceso y del producto tiles en la evaluacin del impacto de los cambios o desviaciones en
el proceso. El material intermedio en proceso que no cumple con los criterios de control durante el proceso no debe usarse
para la fabricacin adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El
material reprocesado debe cumplir con las especificaciones originales durante el proceso y se debe definir el efecto del reprocesamiento sobre otros atributos de calidad, tales como la estabilidad, antes de que el material pueda someterse a fabricacin
adicional. Cuando se van a combinar varios sublotes (p.ej., clulas recolectadas de diversos vasos de cultivo) para procesamiento adicional, los sublotes que no cumplen con los criterios especificados no deben incluirse en la combinacin, incluso si la
combinacin que contenga estos sublotes no aprobados cumpliese con los criterios de valoracin en proceso.
Durante el desarrollo del proceso clnico, los ensayos para calidad y desempeo del producto deben realizarse despus de la
mayora de las etapas de procesamiento para determinar los pasos crticos as como los ensayos ms sensibles a las desviaciones en el proceso. Se deben usar controles de proceso estadsticos y parmetros crticos para establecer lmites para validaciones de proceso e investigaciones de fabricacin. Se deben usar herramientas de muestreo estadstico para asegurar un tamao
de muestra vlido. Los controles durante el proceso deben llevarse a cabo para procesos totalmente validados para asegurar
que estos continen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un anlisis de tendencia y se deben tomar medidas para corregir los problemas cuando stos surjan.
USP 38
Para casi todos los dems criterios de liberacin de producto final, tales como aquellos para identidad, pureza y potencia, los
procedimientos analticos con mtodos y criterios de aceptacin son especficos para el producto derivado de clulas individual. La Tabla 2 ofrece una visin general de las pruebas de liberacin de producto final previstas para productos de terapia
celular y lista ejemplos de metodologas que se usan para cumplir con los requisitos de las pruebas.
Tabla 2. Visin General de Anlisis de Liberacin de Producto Final
Captulos
Prueba de Liberacin
Ejemplos
Criterios
Esterilidad
USP 71
Negativo
Micoplasma
Mtodo de cultivo directo e indirecto (FDA Points to Consider[Puntos a

Considerar])
Negativo; no detectado
Endotoxina
USP 85
<5 UE/kg (0,2 UE/kg intratecal)
Identidad
Determinacin de marcador de superficie

Anlisis de isoenzimas
Identificacin gentica
Morfologa
Bioensayo
Marcador bioqumico
Especfico del producto
Pureza
Porcentaje de clulas viables

Porcentaje de marcadores especficos de expresin de clulas
Lmites para tipos no deseados de clulas
Lmites para contaminantes del proceso (p.ej., suero)
Potencia
Nmero de clulas viables

Ensayo de formacin de colonias
Cambio en la expresin de genes especficos
Secrecin de macromolculas deseadas
Induccin de efecto secundario (p.ej., antgenos leucocitarios
humanos (HLA))
Evidencia de actividad metablica
Evidencia de funcin celular
Especfico el producto
Dosis

Enumeracin de poblacin de clulas especficas
ADN total
Protena total
Otros
Apariencia
Morfologa
Tamao
Especfico del Producto
ESTERILIDAD
Los productos derivados de clulas deben cumplir con los requisitos de las pruebas de liberacin del producto final, incluyendo la esterilidad. Asimismo, las pruebas de esterilidad con frecuencia se llevan a cabo durante el proceso para establecer la
pureza microbiana de las clulas que requieren de mayor tiempo de cultivo. Las pruebas de esterilidad adecuadas incluyen la
prueba descrita en el Ttulo 21 del CFR 610.12 y en el Captulo de pruebas generales de USP Pruebas de Esterilidad 71. Estos
mtodos de prueba basados en cultivos requieren de 14 das y, por consiguiente, nicamente son adecuados para productos
de terapia celular con vidas tiles prolongadas (p.ej., despus de la crioconservacin). Muchos productos de terapia celular
tienen vidas tiles cortas y deben administrarse a los pacientes antes de que los resultados de la prueba de 14 das estn disponibles. En tales casos, la FDA ha identificado una metodologa que permitir la administracin de productos derivados de clulas a pacientes en dicha situacin [ver Guidance for FDA Reviewers and Sponsors : Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)] (Gua para
Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisin de Informacin Qumica, de Fabricacin y Control (CMC) para Nuevas Aplicaciones Farmacolgicas Investigativas (IND) de Terapia Celular Somtica en Humanos):
Prueba de esterilidad durante el proceso de una muestra tomada de 48 a 72 horas antes de la recoleccin final o despus
de la ltima adicin de medio a los cultivos.
Una prueba rpida de deteccin microbiana, como por ejemplo, tincin de Gram u otro procedimiento en el producto
final formulado.
Prueba de esterilidad que cumpla con el Ttulo 21 del CFR 610.12 en el producto final formulado.
Cuando se usa esta metodologa alternativa, los criterios de liberacin para esterilidad se basan en un resultado negativo de
la tincin de Gram y en resultados que demuestren la ausencia de crecimiento en la prueba de esterilidad durante el proceso
de 48 a 72 horas. En caso de que la prueba de esterilidad de 14 das arroje resultados positivos despus de que el producto
haya sido administrado al sujeto, el fabricante deber informar sobre la falla en la esterilidad, los resultados de la investigacin
de la causa, as como cualquier accin correctiva a manera de enmienda a la IND dentro de los 30 das hbiles posteriores a la
recepcin inicial del resultado de prueba de cultivo positivo.
Debido a las inquietudes relacionadas con la sensibilidad de una tincin de Gram y a la incapacidad para obtener resultados
completos de esterilidad durante 14 das despus de la administracin al paciente, existe un extenso inters en el uso de mto-
USP 38
dos microbiolgicos rpidos como alternativa al mtodo de cultivo de 14 das. Esto se analiza en Mtodologas de Prueba Alternativas.
MICOPLASMA
ENDOTOXINAS
Las endotoxinas ejercen diversos efectos biolgicos en la membrana celular de los mamferos y pueden afectar la secrecin y
produccin de citoquinas, pueden provocar fiebre en los receptores o pueden servir como mitgenos poderosos. Debido a la
posibilidad de los ampliamente variados efectos biolgicos de las endotoxinas sobre los cultivos de clulas y tejidos, se deben
evaluar las materias primas y los componentes usados para la fabricacin de productos derivados de clulas para determinar la
presencia de endotoxinas como parte del proceso de calificacin de materias primas. El control de endotoxinas en la fabricacin de productos de terapia celular es un elemento esencial de cualquier programa de control de calidad.
La presencia de endotoxinas en productos administrados a pacientes representa una preocupacin de seguridad importante.
El captulo de pruebas generales de USP Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85 describe una variedad de mtodos para la medicin de endotoxinas que se basan en el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus. Este ensayo se puede validar para una
amplia gama de productos biofarmacuticos. Una caracterstica importante de la valoracin con respecto a los productos de
terapia celular es la capacidad de realizar el ensayo antes de la liberacin de productos con vidas tiles cortas.
IDENTIDAD
El anlisis de liberacin de lote para productos celulares debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba se emplea claramente para identificar al producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto especfico y de la gama de productos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo anlisis ms extensos y rigurosos para un producto de terapia celular autlogo en una instalacin de fabricacin en la que se preparan mltiples productos para pacientes, comparando con un
producto de terapia celular alognico que es el nico producto fabricado en una instalacin.
Las pruebas de identidad para productos derivados de clulas deben ser pertinentes al tipo de clula y a las manipulaciones
realizadas durante el procesamiento. Con frecuencia, se usan marcadores de superficie diferenciales para determinar la identidad del producto. Los inmunoensayos por citometra de flujo son los mtodos ms comunes para detectar y cuantificar estos
marcadores. La identificacin y cuantificacin de subgrupos individuales de clulas se realiza mediante anlisis multiparamtrico, por lo general, segn el tamao y la granularidad, y de uno o ms marcadores de identidad. Otros ejemplos de pruebas de
identidad incluyen anlisis isoenzimticos para confirmar las especies de origen, los cuales seran preferibles si el producto
constara de clulas xenognicas. Se puede emplear la morfologa celular para distinguir tipos de clulas especficas. Existe una
creciente tendencia al uso de tecnologas de identificacin gentica tales como repeticiones cortas en tndem para establecer
la identidad de lneas celulares (p.ej., clulas madre embrionarias humanas usadas para derivar tipos de clulas teraputicas).
PUREZA
Los mtodos de pureza cuantifican especficamente los componentes activos deseados del producto. Las impurezas son contaminantes residuales relacionados con el producto o el proceso que se pueden detectar en el producto final. El requisito de
Captulos
El Micoplasma y el ureaplasma son los microorganismos libres vivientes ms pequeos. El micoplasma carece de pared celular rgida y su tamao oscila entre 0,2 y 0,3 mm. Se puede observar el micoplasma con una forma redonda o filamentosa en un
cultivo de clulas usando un microscopio de campo oscuro o de contraste de fases. En agar slido, el dimetro de las colonias
de micoplasma puede variar de aproximadamente 15 a 300 mm, mientras que las colonias ms grandes se distinguen por una
tpica apariencia de huevo frito.
El micoplasma es ubicuo y se puede aislar de prcticamente cualquier mamfero. El micoplasma ha representado histricamente uno de los principales problemas de contaminacin de cultivos de tejidos, debido a que tiende a ser difcil de controlar
y requiere de cidos nucleicos preformados provistos por componentes de los medios. Estos componentes pueden encontrarse
fcilmente en los materiales de cultivo de clulas que se usan durante la fabricacin. El micoplasma puede surgir de componentes de cultivo bovinos o de otros animales, de materiales de clulas o tejidos de pacientes asintomticos, o posiblemente
de operadores que lo liberan durante la fabricacin.
Se recomienda llevar a cabo el anlisis de micoplasma para todas las materias primas de origen humano o animal y es indispensable como ensayo de liberacin de lote para productos derivados de clulas. La FDA ha publicado un documento (Points
to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals [Puntos a Considerar durante la Caracterizacin de
Lneas Celulares Usadas para Producir Productos Biolgicos) que describe en detalle los mtodos aceptados para el cultivo y
aislamiento de micoplasma. Los mtodos para la deteccin de micoplasma tambin se describen en el captulo de pruebas
generales de USP Pruebas para Micoplasma 63. Debido a que los ensayos clsicos requieren un mes de anlisis para su culminacin, se estn desarrollando y validando mtodos alternativos para la deteccin rpida de micoplasma. Esto se analiza en
Mtodologas de Prueba Alternativas.
USP 38
Captulos
analizar una impureza particular para la liberacin de un lote depender de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabricacin y purificacin para eliminar o inactivar la impureza mediante la validacin del proceso y (2) el potencial de toxicidad o
el impacto funcional sobre el producto asociado con la impureza.
Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con productos de terapia celular se incluyen los componentes residuales del medio de produccin (p.ej., suero, antibiticos o citoquinas exgenas), materiales auxiliares usados en
el procesamiento subsiguiente (downstream processing) (p.ej., nucleasas o proteasas) y lixiviables (p.ej., plastificantes de tuberas o plsticos para cultivo). Las impurezas pueden ser bioactivas (p.ej., citoquinas u hormonas) o inmunognicas (p.ej., agregados, productos de degradacin o protenas derivadas de animales). Las impurezas pueden tener otros efectos perjudiciales,
dependiendo de la dosis del producto.
Las impurezas relacionadas con el producto son especficas a cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen restos celulares,
presencia de clulas no diferenciadas en un producto derivado de clulas que debe contener tipos especficos de clulas teraputicas diferenciadas; niveles inaceptables de clulas no viables; clulas competentes para la replicacin en un producto celular que debe contener clulas mitticamente inactivadas; o cambios en la composicin de clulas funcionales posteriores a la
crioconservacin y descongelacin. Las metodologas analticas para evaluar la pureza requieren la cuantificacin de las impurezas o su separacin fsica del producto. Se debe hacer hincapi en demostrar la uniformidad del perfil de impurezas del producto. Puede ser posible valorar el proceso de fabricacin al grado que se pueda limitar el anlisis de liberacin de lote especfico para impurezas.
El anlisis de impurezas es a menudo extenso durante la caracterizacin del producto y la validacin del proceso cuando se
est demostrando la uniformidad de la fabricacin y del proceso de purificacin. El anlisis de impurezas como parte del anlisis de liberacin del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para eliminar sistemticamente tal impureza.
POTENCIA
La potencia se define, de conformidad con el Ttulo 21 del CFR 600.3(s), como la capacidad especfica del producto, conforme a lo indicado por pruebas de laboratorio apropiadas o por datos clnicos adecuadamente controlados obtenidos mediante la administracin del producto en la forma prevista, para generar un resultado determinado. Junto con la dosis, la potencia define la actividad biolgica de cada lote (ver Ensayos para Determinacin de Dosis, a continuacin). La relacin entre las
mediciones de potencia del producto durante el desarrollo y la fabricacin con la seguridad y eficacia clnicas es clave para su
uso en la liberacin de partidas. La potencia se puede evaluar mediante valoraciones biolgicas in vitro o in vivo o una combinacin de stas. Es comn que estas valoraciones tengan coeficientes de variacin entre 30% y 50%. Estas valoraciones requieren un material de referencia representativo, bien definido, que se pueda utilizar como control positivo para la valoracin. El
control positivo sirve para calificar el rendimiento de una valoracin individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia
debe centrarse en la caracterizacin y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisin son herramientas eficaces
para controlar la calidad del producto. La informacin relacionada con la variabilidad de la valoracin de potencia se debe incorporar en el diseo de estudios de estabilidad y la metodologa estadstica propuesta para asignar la fecha de caducidad (ver
Estabilidad ms adelante).
Los tipos de valoraciones que se pueden emplear para establecer la potencia de un producto derivado de clulas son muy
variados y dependen de las caractersticas nicas y la vida til del producto. Para algunos productos derivados de clulas tales
como clulas progenitoras hematopoyticas, las valoraciones de potencia del producto han sido correlacionadas con la eficacia
clnica. En este caso, el ensayo tradicional por formacin de colonias que cuantifica clulas progenitoras tales como las unidades formadoras de coloniasgranulocito-macrfago (UFC-GM) ha sido relacionado con los resultados clnicos de injerto en algunos estudios. Para otros productos derivados de clulas, se han usado los modelos de enfermedades de animales in vivo
para establecer la potencia del producto. Si el producto derivado de clulas libera una macromolcula bioactiva, la valoracin
de potencia se puede basar en unidades de actividad liberada. Por ejemplo, la produccin de insulina como respuesta a los
cambios en los niveles de glucosa puede ser la base de un ensayo de potencia para clulas destinadas para el tratamiento de
diabetes.
Los productos especficos para pacientes tales como las inmunoterapias autlogas presentan retos relacionados con la demostracin de la actividad teraputica en un sistema de ensayo in vitro o in vivo. Las metodologas novedosas para medir la
potencia, como la correlacin de la evolucin clnica con otras pruebas de caracterizacin, como las pruebas de identidad,
pueden ser apropiadas y deben ser analizadas con las autoridades reglamentadoras en las primeras etapas del desarrollo. Por
ejemplo, la capacidad de determinar marcadores especficos de identidad de superficie celular empleando tcnicas de citometra de flujo o tinciones vitales puede ser una medicin aceptable de la potencia, si est validada adecuadamente y se correlaciona con el resultado clnico. La FDA ha emitido pautas que analizan la posibilidad de uso de una matriz de ensayos biolgicos y no biolgicos, incluyendo tanto ensayos cualitativos como cuantitativos, para establecer la potencia del producto. La informacin contenida en estas pautas es particularmente importante para productos derivados de clulas con una vida til corta o mecanismos de accin complejos o actividades biolgicas mltiples (ver Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and
Gene Therapy Products [Gua para la Industria: Pruebas de Potencia para Productos de Terapia Celular y Gnica).
Por lo general, se requiere de una valoracin de potencia validada antes de la aprobacin reglamentaria. Durante los estudios clnicos investigativos, las autoridades reglamentarias por lo general requieren que, antes de iniciar los ensayos clnicos
claves, se cuente con una valoracin o valoraciones bien definidas destinadas a establecer la potencia del producto. Se reco-
USP 38
mienda ampliamente la implementacin temprana de una o ms valoraciones candidatas destinadas a establecer la potencia
del producto. Los datos de estas valoraciones candidatas de potencia o funcionales pueden ser particularmente importantes al
evaluar cambios propuestos en la fabricacin, durante la transferencia de tecnologa y para determinar la estabilidad del producto.
ENSAYOS DE DETERMINACIN DE DOSIS
Consideraciones para el Anlisis de Liberacin de Construcciones de Clulas y Biomateriales

Para algunos productos derivados de clulas tales como clulas combinadas con biomateriales para formar productos de
combinacin, puede no ser factible analizar directamente la construccin de clulas y biomateriales. Con frecuencia se da este
caso cuando estn implicadas clulas autlogas y la construccin de clulas y biomateriales consta de una sola unidad y no es
factible el muestreo de la construccin. En tales casos, los componentes individuales se analizan antes de ser combinados y la
construccin final no se somete a anlisis directo. Las medidas indirectas tales como el muestreo del medio de cultivo se pueden emplear para tratar los requisitos reglamentarios. Se debe establecer la calidad y estabilidad de la construccin de clulas y
biomateriales formulada, as como la importancia de las medidas indirectas mediante estudios de validacin durante el desarrollo del producto.
Consideraciones sobre el Muestreo

Conforme a lo requerido por las BPF, se deben conservar muestras de producto despus de haber completado el anlisis de
liberacin. Cuando se emplean estrategias de liberacin rpida, es posible que los fabricantes deban conservar muestras adicionales de manera que pueda reevaluarse la calidad del producto mediante metodologas de prueba alternativas o tradicionales,
si fuera necesario.
El muestreo para el anlisis de liberacin de lote debe basarse en la distribucin potencial del parmetro analizado. Ver Desarrollo del Protocolo de Estabilidad (ms adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote
ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida til del producto sea muy
breve, se pueden utilizar estas muestras retenidas para detectar impurezas y otras sustancias. La necesidad de un diseo adecuado del plan de muestreo requiere de consideracin especial. En estos casos, la validacin del proceso ayudar a determinar
el diseo apropiado de muestreo estadsticamente fundamentado.
Captulos
El ensayo que mide, con precisin, la cantidad de producto se denomina ensayo de determinacin de dosis y se selecciona
basndose en su exactitud y precisin. Un ensayo que mide la actividad teraputica de un producto recibe el nombre de valoracin de potencia y se disea para medir la funcin del producto. Este tipo de valoracin es diferente al ensayo de determinacin de dosis. El diseo del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de medicamentos, las valoraciones que miden la
cantidad de frmaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. Para estos medicamentos, las dosis de producto se pueden
definir como la concentracin o cantidad del producto final administrado al paciente y por lo general se mide como masa de
producto. Para productos derivados de clulas, los atributos tales como el nmero viable de clulas teraputicas a menudo se
usan para definir la dosis del producto.
Los productos de terapia celular se pueden dosificar con base en la enumeracin de una o ms poblaciones de clulas.
Cuando el producto se encuentra en una suspensin homognea de clula nica, el ensayo ms utilizado es el nmero de
clulas viables. Estos ensayos pueden incluir la enumeracin de todas las clulas, clulas nucleadas totales u otro subgrupo celular. Los ensayos de viabilidad por lo general se basan en la capacidad de las clulas de excluir un colorante supravital, como
el azul de tripn. Los resultados se expresan como el nmero de clulas que excluyen el colorante y, por lo tanto, se consideran viables. Los compuestos fluorescentes que se unen a las protenas nucleares y que son excluidos por las clulas viables pueden incorporarse a mtodos de citometra de flujo para la determinacin simultnea de viabilidad y marcadores de identidad
de las clulas.
El conteo de clulas se puede llevar a cabo rpidamente por mtodos manuales o automatizados. El recuento manual por
enumeracin visual de clulas en una cmara hematocitomtrica es una tcnica de fcil acceso, de exactitud aceptable, pero
de menor precisin que la mayora de los mtodos automatizados. Los instrumentos habituales para el recuento celular automtico proporcionan una enumeracin reproducible de clulas no nucleadas (eritrocitos y plaquetas) y de clulas nucleadas y
un recuento diferencial de clulas anteriormente nucleadas en poblaciones de leucocitos mononucleares y polimorfonucleares.
Una discriminacin mayor de poblaciones celulares especficas, por lo general, requiere el anlisis de fenotipos de superficie
celular por citometra de flujo u otros mtodos (ver la seccin Identidad anterior). La proporcin de una subpoblacin celular
especfica puede determinarse por FACS o por citometra de flujo. Un ejemplo de ensayo de enumeracin de clulas es la enumeracin de clulas progenitoras hematopoyticas CD34 positivas (CD34+).
Para productos que contienen clulas en una suspensin no homognea, tales como clulas que se combinan con un biomaterial (p.ej., un andamiaje), se han usado medidas alternativas para la enumeracin de clulas, incluyendo el rea total de
una capa de clulas, el peso hmedo, las protenas totales y el ADN total. Si se emplean estas medidas para determinar la dosis
del producto, se deben llevar a cabo pruebas complementarias para establecer la importancia.
USP 38
Captulos
Mtodos de Prueba Alternativos

Conforme a lo indicado en Especificaciones para la Liberacin de Producto Final (anteriormente), los productos de terapia celular deben someterse a pruebas de esterilidad, micoplasma y endotoxina. Antes del uso clnico, se deben cumplir criterios de
aceptacin adicionales para el anlisis relacionado con la identidad, pureza, potencia, dosis y dems caractersticas pertinentes.
Excepto por la esterilidad, micoplasma y endotoxinas, la mayora de los procedimientos de prueba y sus mtodos centrales
usados para garantizar que el producto final cumple con los criterios de aceptacin para liberacin son nicos para el producto
y se pueden adaptar para cumplir con las caractersticas y aplicaciones especficas del producto derivado de clulas. En general,
se deben desarrollar mtodos de prueba basndose en los mejores criterios cientficos disponibles y deben ser adecuados para
su uso en un ambiente de fabricacin que cumpla con las BPM. Las valoraciones deben ser robustas, confiables y susceptibles
de validacin y deben proporcionar resultados antes de la liberacin para uso clnico. El captulo Validacin de Procedimientos
Farmacopeicos 1225 proporciona consideraciones bsicas para la validacin de mtodos.
Para algunos productos de terapia celular, el tamao de la muestra y el volumen de material requerido para el anlisis, o el
tiempo necesario para obtener resultados de prueba puede consumir cantidades significativas del producto final o el tiempo
requerido para obtener resultados puede exceder la vida til del producto o ambos. Esto crea problemas con el suministro
disponible de producto para tratar pacientes y en otras situaciones, descarta la posibilidad de obtener resultados antes de su
administracin en pacientes, lo cual es un problema particular para la prueba de esterilidad farmacopeica as como para el
mtodo de cultivo en caldo-agar para micoplasma, recomendado por la FDA. Por consiguiente, tanto la industria como las
autoridades reglamentarias han mostrado un inters considerable en facilitar el desarrollo de mtodos de prueba alternativos
para estabilidad y micoplasma.
Las reglamentaciones de la FDA para productos biolgicos tratan especficamente el uso de mtodos equivalentes siempre
que garanticen que la seguridad, pureza, potencia y eficacia del producto biolgico sean iguales o mayores a las garantas provistas por el mtodo especfico (Ttulo 21 del CFR 610.9). A continuacin se describen algunos de los mtodos de prueba alternativos disponibles para esterilidad y micoplasma.
Existe una amplia variedad de tecnologas disponibles que contina en desarrollo por parte de diseadores de ensayos para
su uso en la industria de las terapias celulares. Los atributos que deben incluirse en cualquier revisin de tecnologa propuesta
incluyen la exactitud para el propsito destinado, la velocidad de productividad, los costos, la aceptabilidad por parte de la
comunidad cientfica y las agencias reglamentarias, la simplicidad de la operacin, los requisitos de capacitacin y reactivos, la
reputacin del proveedor, los servicios tcnicos provistos por el vendedor y, finalmente, los requisitos de servicios y espacio.
La validacin de estos mtodos de prueba y la demostracin de equivalencia, segn se describen en el Ttulo 21 del CFR
610.9, son obligatorias al momento de solicitar la autorizacin para productos biolgicos (BLA, por sus siglas en ingls) o una
aprobacin previa a la comercializacin (PMA, por sus siglas en ingls).
ESTERILIDAD
Las plataformas de deteccin para mtodos microbiolgicos alternativos por lo general se han basado en el crecimiento, viabilidad, artefactos o cidos nucleicos. Las tecnologas basadas en el crecimiento emplean medidas bioqumicas o fisiolgicas
que reflejan el crecimiento de microorganismos. Las muestras de prueba se transfieren a formulaciones de medio tradicionales
o mejoradas que estimulan la proliferacin microbiana, y el crecimiento microbiano se detecta qumica o espectromtricamente. La ventaja primaria de estos sistemas es la naturaleza automatizada de los resultados de prueba y la recuperacin de microorganismos para investigaciones de fallas y otras metodologas de caracterizacin microbiana. La FDA ha publicado pautas para validacin de mtodos microbiolgicos rpidos basados en crecimiento (Guidance for Industry: Validation of Growth-Based
Rapid Microbiological Methods for Sterility Testing of Cellular and Gene Therapy Products, CBER, 2008 [Gua para la Industria: Validacin de Mtodos Microbiolgicos Rpidos Basados en Crecimiento para Pruebas de Esterilidad de Productos de Terapia Celular y Gnica). Los principios de validacin de mtodos microbiolgicos alternativos tambin se describen en el captulo de
USP Validacin de Mtodos Microbiolgicos Alternativos 1223.
Las tecnologas basadas en la viabilidad no requieren de crecimiento celular. Estas tecnologas se basan en detectar la presencia de contaminantes vivos individuales mediante colorantes vitales, tintes o marcadores de superficie celular. Las clulas
marcadas con un sustrato metablico de fluorocromo especfico se recolectan en una membrana de deteccin.
Las tecnologas basadas en artefactos analizan componentes celulares o sondas moleculares que se designan especficamente
para una especie microbiana particular. Por ejemplo, las especies individuales se pueden caracterizar mediante patrones nicos
de composicin de cidos grasos despus de que se han saponificado muestras de clulas enteras para inducir la formacin de
steres metlicos. Otras tecnologas emplean espectrometra de masas por tiempo de vuelo.
Las tecnologas de cidos nucleicos (NAT, por sus siglas en ingls) se basan en la amplificacin de ADN mediante reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR), tipificacin de ARNr 16s 23s y secuenciacin gnica. Algunas tecnologas identifican microorganismos mediante la secuenciacin de una porcin del cromosoma de un organismo desconocido y comparando la secuencia de ARNr 16s con una base de datos. Esta tecnologa es capaz de identificar hongos, micoplasma y bacterias, incluyendo elementos de lento crecimiento y no fermentadores. Para ms detalles sobre los mtodos basados en PCR, ver el captulo
de USP Tcnicas Basadas en cidos NucleicosAmplificacin 1127.
USP 38

MICOPLASMAS
Las metodologas de anlisis farmacopeico para micoplasma se desarrollan basndose en cultivos en agar y caldo y requieren
por lo menos 28 das para controlar adecuadamente la presencia de contaminacin por micoplasma. Debido a esta limitante,
se han desarrollado una variedad de tecnologas de anlisis rpido de micoplasma basadas en tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos tales como PCR, as como ensayos de hibridacin de cidos nucleicos no amplificados, ELISA y ensayos basados
en enzimas.
SISTEMAS DE CALIDAD
Captulos
Los sistemas de calidad entrelazan los diversos aspectos de la fabricacin. Los programas de control de calidad (QC) y de
garanta de calidad (QA) deben ejercer control sobre las instalaciones y los procesos de fabricacin, los procesos de validacin
y las pruebas de las materias primas, los materiales en proceso, los productos a granel y el producto formulado final. Los programas de capacitacin y certificacin representan el ncleo para contar con personal de fabricacin tcnicamente competente. Se debe implementar un programa de documentacin para sustentar todas las operaciones de fabricacin, capacitacin,
validacin y calidad. Los cambios en los procesos y procedimientos deben seguir un programa formal basado en principios
bien establecidos de control de cambios.
Cuando se usan clulas o tejidos humanos alognicos como material de origen para la fabricacin de productos derivados
de clulas o tejidos, los donantes de clulas o tejidos deben ser sometidos a anlisis de deteccin y pruebas adecuadas (ver la
seccin Eligibilidad de Donantes anterior). En todos los casos, las clulas y tejidos humanos de origen deben manipularse de
conformidad con las Buenas Prcticas para Tejidos (GTP) segn se describe en el Ttulo 21 del CFR 1271.
Adems de las GTP, se aplican las BPFv conforme a lo descrito por la FDA en el Ttulo 21 del CFR 210, 211, 600s (en especial
en el Ttulo 21 del CFR 610) y 820 a la fabricacin de productos derivados de clulas y tejidos que estn sujetos a la aprobacin previa a su comercializacin. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricacin, al igual que las materias primas, sistemas de calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv se aplican al proceso
y a la planta de fabricacin a lo largo de todo el desarrollo clnico. El grado de control se incrementa a medida que progresa el
desarrollo clnico y se espera el cumplimiento cabal con las BPFv al momento de iniciar los ensayos clnicos Fase III.
Es indispensable monitorear los datos obtenidos del anlisis durante el proceso y de liberacin del producto final. Los resultados fuera de especificacin (OOS, por sus siglas en ingls), o incluso aquellos que estn fuera de la tendencia, se deben investigar antes de desechar el material. La Guidance for Industry: Investigating Out of Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production (octubre de 2006) [Gua para la Industria: Investigacin de Resultados de Pruebas Fuera de Especificacin en la
Produccin Farmacutica] de la FDA ofrece un enfoque sistemtico para llevar a cabo una investigacin. El resultado de un
ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de clculo o fallo
del equipo. Si la investigacin determina que los resultados de las pruebas del producto no cumplen con los criterios de aceptacin especificados, el lote debe ser rechazado. En algunas situaciones, especialmente con productos autlogos o alognicos
especficos del paciente, puede ser necesario administrar un producto que no cumpla con todas las especificaciones o que presenta nicamente resultados de prueba incompletos como medida para salvar la vida de un paciente. Sin embargo, se debe
contar con procedimientos que rijan la comunicacin de resultados OOS al mdico o a la persona responsable de tomar la
decisin del uso del producto y para proporcionar instrucciones para todas las pruebas de seguimiento, monitoreo del paciente y comunicacin de dichos resultados a todas las partes, incluyendo autoridades reglamentarias.
Conforme a lo descrito con anterioridad, un enfoque de gestin de riesgos efectivo en las etapas tempranas de desarrollo
del producto puede asegurar la ms alta calidad de un producto derivado de clulas al proveer una medida proactiva para
identificar y mitigar problemas potenciales de calidad. La probabilidad de falla en los productos de terapia celular puede surgir
de una variedad de fuentes, incluyendo errores del personal, fallas en el procesamiento asptico, fallas de los equipos, fallas de
las instalaciones y servicios, limpieza, desinfeccin y fallas en los componentes y materias primas. Un entendimiento proactivo
del riesgo puede ayudar a tomar mejores decisiones al momento de presentarse un problema de calidad. La gestin efectiva
de riesgos puede facilitar la toma de decisiones ms informadas y adecuadas y puede ofrecer a las autoridades reglamentarias
una mayor garanta de la capacidad de un desarrollador para tratar riesgos potenciales. Dicha garanta puede afectar el grado
y nivel de supervisin reglamentaria directa. La gestin de riesgos de calidad se puede integrar en partes claves del sistema de
calidad tales como la gestin de cambios, la Accin Correctiva y Preventiva (CAPA, por sus siglas en ingls), las BPFv, la validacin, entre otras, y se puede usar para establecer especificaciones coherentes y Parmetros Crticos del Proceso (CPP, por sus
siglas en ingls) para asegurar el cumplimiento de los atributos de calidad.
El anlisis de riesgos es de naturaleza cualitativa. Se puede lograr usando experiencia y conocimientos sobre el proceso para
definir las categoras para la evaluacin de riesgo que pueden formar la base de un sistema de evaluacin y mitigacin de riesgos despus de identificar errores de fabricacin. Por ejemplo, resulta una prctica comn desarrollar categoras de riesgo de
incumplimento o desviaciones que puedan incorporarse a un procedimiento de investigacin de incumplimiento o fallas. Las
categoras son particularmente tiles cuando es necesario acelerar la evaluacin de riesgos para facilitar una CAPA. A continuacin se definen, a manera de ejemplo, los Niveles de Riesgo 1 a 4 los cuales se pueden adoptar como un medio para llevar a
cabo una evaluacin preliminar de riesgos:
Nivel de riesgo 1: Aspectos TcnicosNo presenta ningn riesgo para el paciente y no impacta la seguridad y efectividad
del producto. Ejemplo: Falta de una firma en el registro de partida.
USP 38
Nivel de riesgo 2: AlertaPuede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o puede tener un impacto potencial
en la seguridad y eficacia del producto. Se debe volver a establecer el cumplimiento mediante justificacin apropiada para
proceder despus de su entrega a QA para su revisin y aprobacin. Ejemplo: El tiempo de digestin de procesamiento de
biopsia est fuera del intervalo definido.
Nivel de riesgo 3: No enviar/rechazar el lotePuede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o afectar la eficacia del producto incluso despus de tomar acciones correctivas. No se permite su envo. Ejemplo: Los cultivos no demuestran un crecimiento celular adecuado.
Nivel de riesgo 4: Evento posterior a la distribucinPuede presentar un riesgo para la seguridad del paciente o un impacto potencial en la seguridad, potencia o pureza del producto. La seal de seguridad se identifica despus de la distribucin del producto. Ejemplo: La prueba de esterilidad fallida se conoce despus de la distribucin del producto.
Captulos
DISEO DE LAS INSTALACIONES Y CONSIDERACIONES OPERATIVAS

Las instalaciones de fabricacin para productos de terapia celular y tisular deben ser cuidadosamente diseadas para mantener las operaciones de procesamiento asptico de acuerdo con las BPF, al tiempo que abarca aspectos nicos del producto. Las
clulas o tejidos recibidos pueden tener biocarga u otros contaminantes por lo que puede ser necesario recibirlas y procesarlas
en un rea segregada en cuarentena para evitar comprometer a la instalacin principal. Asimismo, el procesamiento de tejido
para obtener clulas de inters puede requerir de equipo y procesos especializados que deben considerarse durante el diseo y
las operaciones subsiguientes de la instalacin. Para fabricar productos de combinacin que implican andamiajes biocompatibles, puede ser necesario que la instalacin sea capaz de manejar operaciones que impliquen procesamientos, manipulaciones
y eliminaciones qumicas. Esto puede presentar restricciones en el diseo de la instalacin, especialmente para los sistemas de
manejo de aire en ambientes de cuartos limpios.
Aunque el principal hincapi en la fabricacin de un producto derivado de clulas o tejidos se relaciona con la proteccin del
producto de contaminacin involuntaria, es necesario evaluar y reducir los riesgos para el operador de fabricacin mediante
capacitacin adecuada en el manejo de patgenos transmitidos por la sangre y en el uso de equipo/vestimenta de proteccin.
La proteccin del operador y el procesamiento asptico son complementarios e incluyen el uso de cabinas de seguridad biolgica certificadas y de vestimenta de proteccin asptica que consta de batas, guantes, mangas, mscaras quirrgicas, proteccin para los ojos y cubiertas para la cabeza. El tejido humano debe obtenerse en condiciones y controles ambientales que
proporcionen un alto grado de garanta de recuperacin asptica.
El grado de control requerido para operaciones de procesamiento de clulas y tejidos depende de una variedad de factores,
incluyendo la complejidad de los procesos de fabricacin asptica, el sitio primario de fabricacin y la vida til del producto
final. Los procesos de fabricacin que implican la manipulacin abierta de clulas, incluso en una cabina de seguridad biolgica, tienen mayor riesgo de contaminacin que los procesos que se llevan a cabo en biorreactores cerrados o sistemas de bolsas, que utilizan dispositivos estriles de conexin y de sellado de tubos. Por lo regular, los cuartos limpios ISO 7 (clase 10 000)
y las cabinas de seguridad biolgica ISO 5 (clase 100) son componentes esenciales para procesos de fabricacin de productos
de terapia celular, especialmente aquellos que implican manipulaciones abiertas.
El ambiente controlado de un cuarto limpio, cuidadosamente diseado, construido, validado y mantenido puede minimizar
los riesgos de contaminacin ambiental durante el procesamiento asptico y reducir la posibilidad de contaminacin cruzada
de productos especficos para un solo paciente. Las presiones diferenciales entre la fabricacin clasificada deben cumplir con el
documento gua de septiembre de 2004, Sterile Drug Products Produced by Aseptic ProcessingCurrent Good Manufacturing
Practice (Medicamentos Estriles Producidos Mediante Procesamiento AspticoBuenas Prcticas de Fabricacin Vigentes). Se
debe monitorear la calidad del aire en las instalaciones y las reas de procesamiento de manera tal que se provea un alto nivel
de condiciones aspticas durante el procesamiento. Para pautas relacionadas con este tema, ver el captulo Control Microbiolgico y Monitoreo de Ambientes para Procesamiento Asptico 1116.
La limpieza de las instalaciones, la segregacin de componentes y productos, as como los procedimientos de desinfeccin,
deben llevarse a cabo para evitar contaminacin microbiana y contaminacin cruzada entre lotes producidos en las instalaciones.
Los productos celulares o tisulares basados en clulas autlogas representan un nivel de complejidad adicional para el diseo
y la operacin de las instalaciones de fabricacin. Para productos autlogos, se fabrica un lote de producto para cada persona
y se requiere de segregacin completa durante la fabricacin. A diferencia de los diseos de instalaciones para productos alognicos, los cuales se basan en volumen en gran escala para lograr la mxima eficiencia de fabricacin, las instalaciones para
productos autlogos requieren de una unidad de ampliacin (a escala), lo cual debe considerarse durante el diseo y la operacin de las instalaciones. La automatizacin puede emplearse de manera efectiva para gestionar la manipulacin manual repetitiva de clulas. Es posible que la escala inicial de operacin no justifique una inversin de capital inicial para automatizacin,
pero se debera considerar a medida que aumenta el tamao de las operaciones de fabricacin.
La segregacin del producto en las instalaciones es otro punto clave a tomar en cuenta durante el diseo y la operacin. La
supervisin del etiquetado y de QA se usan generalmente para el rastreo y la segregacin. Tcnicas tales como los cdigos de
barra y las etiquetas de frecuencia radial (FR) pueden usarse para el rastreo y la segregacin del producto. Para obtener pautas
sobre este tema, ver el Ttulo 21 del CFR 211.42, 211.113, 1271 y la Guidance for Industry: Sterile Drug Products Produced by
Aseptic ProcessingCurrent Good Manufacturing Practice (Gua para la Industria: Medicamentos Estriles Producidos Mediante
Procesamiento AspticoBuenas Prcticas de Fabricacin Vigentes) de la FDA, septiembre 2004.
USP 38
El equipo de fabricacin debe ser robusto, proveer productos uniformes y permitir la calibracin peridica y el mantenimiento preventivo. La calificacin es necesaria para el equipo del cual se derivan parmetros o mediciones crticas del proceso. En la
mayora de los casos, esto incluye el software que controla las operaciones del equipo o sistemas. Los equipos crticos, como
las incubadoras o los congeladores, deben contar con sistemas de alarma capaces de emitir seales de falla de manera remota.
Asimismo, el equipo crtico debe estar conectado a un generador de respaldo para emergencias, el cual debe probarse peridicamente para verificar su estado operativo.
CONSIDERACIONES SOBRE LA VALIDACIN Y CALIFICACIN
PREPARACIN Y ADMINISTRACIN DEL SITIO CLNICO

Antes de llevar a cabo la administracin de algunos productos derivados de clulas o tejidos, puede ser necesario realizar
modificaciones al producto o etapas de preparacin. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento
de la administracin y, por lo tanto, quedan fuera del control de fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones depende, en gran medida, de las caractersticas del producto.
Captulos
Los principios de validacin recomendados por los documentos gua de la FDA y de la ICH, as como los captulos de USP
1225 y Validacin de Recuperacin Microbiana de Artculos Farmacopeicos 1227 aplican a los productos derivados de clulas y
tejidos. La variacin biolgica en las clulas y tejidos de origen usados para fabricar la mayora de los productos de terapia
celular o tisular pueden afectar los esfuerzos de la validacin.
Las actividades de validacin deben incluir la evaluacin de riesgos, la capacitacin y calificacin del personal, la calificacin
del equipo e instalaciones, la validacin de mtodos analticos, el procesamiento asptico, el proceso de fabricacin y la limpieza.
La validacin del proceso debe tomar en cuenta la seguridad, la uniformidad (rendimiento del proceso y por etapas, eliminacin de impurezas), la robustez (operador a operador, da a da) y la calidad del producto final (identidad, pureza, potencia).
Es necesario evaluar o calificar de manera apropiada los mtodos analticos usados para evaluar el proceso.
La validacin de procesos para productos especficos del paciente como los productos autlogos celulares y tisulares presenta problemas excepcionales. Primero, los materiales de partida para productos especficos del paciente por lo general se obtienen de materiales del paciente o de un donante que corresponda, tales como material de biopsia, productos obtenidos por
afresis, tejidos de desecho de procedimientos quirrgicos y rganos de cadveres que no califican para transplan`te. El proceso puede requerir que los fabricantes acepten cierto intervalo en lo que respecta a la calidad y la cantidad del material de partida, al tiempo que deben seguir produciendo un producto final que satisfaga los anlisis de liberacin. En segundo lugar, el
procesamiento manual de clulas y tejidos presenta un grado de variabilidad inherente. Se deben desarrollar etapas de procesamiento que resulten de manera exitosa y uniforme en componentes de proceso y productos finales apropiados, incluso si el
proceso se basa en materiales tisulares no estndares o variables. La validacin del proceso debe tomar en cuenta dicha variabilidad y debe garantizar que los puntos finales y crticos de la fabricacin y del anlisis cumplan en todo momento con las
especificaciones.
Las validaciones de procesos aspticos se deben llevar a cabo usando medios microbiolgicos que demuestren que el personal de fabricacin puede realizar los procedimientos y producir un producto libre de contaminacin microbiana. Los procedimientos destinados a mantener la segregacin durante la fabricacin se deben someter a desafo para verificar que la probabilidad de contaminacin cruzada o confusin entre lotes de producto para diferentes pacientes sea mnima.
Dependiendo de la variabilidad de las clulas o tejidos de origen y de la complejidad del proceso de fabricacin, puede ser
necesario fabricar ms de tres lotes de calificacin para verificar la uniformidad y la robustez del proceso de fabricacin. No
todos los esfuerzos de fabricacin sern exitosos para productos de terapia autlogos y especficos del paciente. Sin embargo,
se debe establecer la tasa de xito y realizar un seguimiento que permita a los fabricantes detectar cualquier reduccin en dicha tasa y, en tal caso, tomar las medidas necesarias para corregir el problema. Las clulas primarias bien caracterizadas de un
banco de clulas se pueden utilizar en la validacin del proceso si el perfil de los donantes se encuentra dentro del intervalo
deseado para la poblacin de pacientes. Tambin puede ser apropiado un anlisis de tendencia de un nmero de administraciones de producto estadsticamente aceptable.
Deben realizarse validaciones sobre la limpieza del equipo y las instalaciones a fin de demostrar la eficacia de los agentes de
limpieza sobre contaminantes estndar microbianos y fngicos, as como contaminantes aislados de la planta de fabricacin.
La medicin de los residuos de los agentes de limpieza debe tratarse en las validaciones de limpieza del equipo. Deber evaluarse el equipo, las instalaciones y los sistemas electrnicos de monitoreo y control, tales como los sistemas de monitoreo de
edificios y de control de inventarios.
El equipo y los mtodos analticos y de fabricacin deben ser validados siguiendo los procedimientos descritos en el captulo
1225, adems de los documentos gua emitidos por la ICH (ver Q2 R1). Se deben establecer planes de capacitacin y se
deben llevar a cabo calificaciones del personal. Se deben realizar validaciones para el transporte de tejidos y el envo de productos.
USP 38
Las etapas de preparacin incluyen la descongelacin, el lavado o filtrado para eliminar clulas o sustancias acumuladas durante el almacenamiento, la transferencia a una solucin infusible o la formulacin con un vehculo o material estructural tal
como un andamiaje. Asimismo, las consideraciones sobre el paciente, tales como la necesidad de preparar dosis o modificar el
producto de acuerdo con la estructura anatmica, peso o volumen sanguneo del paciente, pueden afectar dichas etapas.
Se deben establecer en el sitio clnico procedimientos adicionales y controles de proceso para todos los intervalos de almacenamiento de producto, etapas de transporte y modificaciones, comenzando con una definicin clara de puntos de control crticos. Los requisitos operativos incluyen la designacin de un espacio fsico adecuado para la manipulacin asptica, como por
ejemplo una cabina de seguridad biolgica ISO 5 (clase 100), personal capacitado, procedimientos operativos estndar detallados y supervisin de la calidad. La naturaleza nica e irremplazable de muchos productos derivados de clulas o tejidos incrementa la necesidad de contar con procedimientos bien establecidos para preparacin y administracin en el sitio clnico.
Captulos
Manipulacin del Producto

Antes de administrar productos mdicos que contienen clulas, la preparacin en el sitio puede implicar una o ms manipulaciones. Las manipulaciones tpicas incluyen lo siguiente:
Cambio en el Envase FinalEl producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase y es posible que necesite ser transferido a un envase diferente para su administracin.
Cambio del Estado Fsico o TemperaturaPuede ser necesario descongelar o entibiar el producto.
Cambio en Solucin o SuspensinPuede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un lquido.
Combinacin con un Material BiolgicoPuede ser necesario combinar las clulas teraputicas con un material de andamiaje tal como hojas de matriz extracelular descelularizadas, geles, tapones, cpsulas, esponjas, partculas o grnulos.
En otros casos, puede ser necesario agregar las clulas a un dispositivo mdico existente tal como una unidad de filtracin
de fibras huecas antes de su uso.
Mezclado o Preparacin MagistralPara algunos productos celulares, puede ser necesario el mezclado o la preparacin
magistral en el sitio clnico.
Filtracin o LavadoLa presencia de materiales no deseados en el producto fabricado, tales como partculas, desechos
celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas, puede requerir de etapas de lavado o filtracin.
MuestreoPuede ser necesario llevar a cabo un muestreo del producto final antes de su administracin para probar la
formulacin final.
Consideraciones sobre las Instalaciones del Sitio Clnico

Los requisitos de las instalaciones para llevar a cabo las etapas de preparacin en el sitio o la administracin de productos de
terapia celular dependen de los productos y de las manipulaciones requeridas. El principal determinante de las caractersticas
de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminacin microbiana relacionado con cada paso. Ver Preparacin Magistral
Preparaciones Estriles 797 para obtener pautas relacionadas con el tipo de manipulacin y los niveles de control ambiental
requeridos para garantizar el manejo asptico.
Descongelacin de Productos Derivados de Clulas

La descongelacin se lleva a cabo rpidamente. Si se va a reinfundir o trasplantar una pequea cantidad de clulas, no es
necesario extraer el DMSO de la suspensin, porque la mayora de las preparaciones celulares pueden ser concentradas adecuadamente para mantener la concentracin de DMSO dentro de lmites tolerables. El uso de DMSO ejerce dos efectos sobre
las clulas despus de la descongelacin: Se pueden agrupar si estn daadas y el DMSO reduce la viabilidad celular en minutos. Si se debe extraer el DMSO o concentrar las clulas para la administracin, por lo general, se diluye la suspensin de clulas descongelada de forma seriada (para evitar el choque osmtico) y se la vuelve a suspender en un medio con protenas. La
viabilidad y potencia de las clulas se puede monitorear despus de la descongelacin, pero a menudo, la informacin es slo
para propsitos de recoleccin de datos y no una especificacin que se debe cumplir para el uso clnico del producto celular.
Algunos productos de terapia celular necesitan ser transportados frescos (es decir, sin congelar). En algunas situaciones, los
componentes celulares se almacenan congelados pero se descongelan y aplican a los andamiajes en el sitio de fabricacin a
temperatura ambiente o de refrigeracin, justo antes de ser transportados. Es posible que los productos de combinacin compuestos por clulas en un andamiaje requieran ser transportados a temperaturas superiores a las temperaturas de refrigeracin
(es decir, temperatura ambiente) para evitar que las clulas se desprendan del andamiaje. Debido a que el producto preparado
recientemente (fresco) es metablicamente activo, el envase para transporte debe estar diseado y validado para mantener la
actividad metablica del producto, adems de cumplir con las pruebas de validacin estndar de transporte. El metabolismo
puede lentificarse disminuyendo la temperatura de transporte, pero esto requiere de un control de temperatura confiable durante el transporte. Debido a que los envases para transporte dependen en cierta medida de la temperatura exterior, estos
deben ser validados para mantener un estricto control de la temperatura en cualquier condicin climtica.
USP 38
Pruebas Adicionales de Liberacin de Productos Celulares Manipulados en el Sitio Clnico

Los productos de terapia celular que se someten a etapas de preparacin o a manipulaciones en los sitios clnicos deben
someterse a controles o pruebas apropiadas que garanticen el cumplimiento de todas las especificaciones de calidad antes de
la liberacin para su administracin en pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determina la necesidad de
aplicar requisitos de liberacin o especificaciones crticas adicionales a las requeridas inmediatamente despus de la fabricacin
inicial.
Por lo general, las pruebas previas a la liberacin incluyen lo siguiente:
Inspeccin fsica del producto, incluyendo apariencia del producto (color, turbidez, partculas o materia extraa), integridad del envase, temperatura y exactitud y conveniencia del etiquetado
Revisin de los registros de proceso y/o certificado de anlisis
Para productos especficos del paciente, verificacin del etiquetado del producto y de los registros relacionados con la
identidad del receptor
Los productos de alto riesgo (definidos en el captulo 797) deben someterse a pruebas adicionales. Para todos los productos de alto riesgo, se debe evaluar la necesidad de valoraciones de calidad adicionales de identidad, potencia y pureza de los
ingredientes activos y llevarlas a cabo cuando sea apropiado. Para productos de alto riesgo en la Categora II, llevar a cabo
pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
Administracin a Pacientes
ADMINISTRACIN DE TERAPIAS CELULARES A PACIENTES
Algunos productos de terapia celular o tisular son especficos del paciente debido a que se fabrican a partir de clulas, tejidos
o fuentes de tejido autlogos o alognicos. Ciertos productos especficos del paciente tienen un potencial definido para el beneficio o dao por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administracin de un producto de este
tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procedimientos similares a aquellos usados en la administracin de hemoderivados humanos por lo que al menos dos personas deben verificar la identidad del paciente y del producto
especfico del paciente inmediatemente antes de la administracin.
Los productos de terapia celular y tisular se pueden administrar a travs de una variedad de rutas que incluyen las rutas parenterales comunes (intravenosa, subcutnea, intramuscular e intraarterial) y el tracto respiratorio o gastrointestinal. Otras posibilidades son su aplicacin directa en la vasculatura regional, rganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catteres o bien despus de la exposicin quirrgica del tejido. Aunque la administracin parenteral se puede llevar a cabo en instalaciones habituales para pacientes ambulatorios o internados, las otras vas pueden exigir lugares especializados, como una sala
Captulos
Es posible que, dependiendo de la aplicacin especfica de la terapia celular o tisular, el personal para el cuidado del paciente requiera llevar a cabo algunas etapas para preparar al paciente. Estas etapas ayudan a asegurar que el producto emitir los
resultados teraputicos esperados y ayudan a minimizar el riesgo de efectos adversos.
La determinacin de la aptitud del paciente para la terapia, incluyendo la evaluacin de histocompatibilidad, por lo general
ocurre antes de la preparacin del producto. El estado clnico de un paciente puede cambiar despus de la recoleccin de tejidos (debido a fiebre, infeccin, recurrencia o diseminacin de tumores, o mal funcionamiento de rganos), por lo que se deben revisar la condicin general del paciente y su aptitud para la terapia antes de la administracin del producto. Esta evaluacin puede incluir la historia clnica del paciente, una exploracin fsica y estudios de laboratorio tales como hemogramas y
anlisis qumicos. Asimismo, se pueden llevar a cabo mediciones funcionales y fsicas basales, anlisis de laboratorio o estudios
de diagnstico por imgenes pertinentes.
Puede ser necesario preparar al paciente antes del tratamiento, dependiendo de la ruta de administracin. Para terapias celulares que requieren de administracin intravenosa, puede ser necesario colocar un catter venoso central a pacientes con circulacin perifrica deficiente. Cuando se implantan en el paciente clulas o tejidos combinados con materiales estructurales, es
necesaria la preparacin del sitio, para lo cual puede ser necesario establecer un acceso quirrgico al sitio, eliminando tejido
degenerado o daado, cortando el tejido adyacente para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario
para sujetar o sostener el implante. Por ejemplo, si se implantan productos celulares para la cicatrizacin de heridas, el sitio
para el injerto debe estar libre de infecciones y el lecho de la herida debe estar bien preparado. Para clulas de reparacin de
defectos en cartlagos, es necesario preparar el sitio daado. Antes de realizar la administracin teraputica en un sistema de
rganos (p.ej., el sistema broncoalveolar) o en una red vascular (p.ej., las arterias coronarias), puede ser necesario generar un
acceso en el paciente para el catter mediante ciruga, endoscopa o dirigido por radiografas.
Para todos los casos, se debe evaluar cuidadosamente la necesidad la anestesia y medicacin previa adecuadas. Por ejemplo,
cuando el DMSO se va a conservar en un producto celular crioconservado descongelado, puede ser necesario administrar un
antihistamnico al paciente antes de la administracin. El examen previo a la administracin tambin debe evaluar los tratamientos concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia celular o tisular y modificar sus efectos. Algunos
tratamientos pueden ser auxiliares de la terapia celular o tisular, tales como las citoquinas que promueven la proliferacin o la
diferenciacin del tejido infundido o implantado. Se deben evaluar los posibles efectos de otros frmacos usados comnmente,
tales como antibiticos, antineoplsicos, anticoagulantes y agentes antiinflamatorios.
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de operaciones o sala de endoscopia aspticas. Con frecuencia se emplea una variedad de sistemas de administracin tales
como catteres, jeringas y lneas IV para administrar las clulas a los pacientes. Antes del uso clnico, los fabricantes deben asegurarse que los componentes de estos dispositivos mdicos sean compatibles con las clulas y con las soluciones de la formulacin. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estndar y un programa de calidad para garantizar que el
producto se administre de la manera prevista.
MONITOREO POSTERIOR A LA ADMINISTRACIN
Se debe contar con polticas y procedimientos escritos para monitorear los resultados del paciente, as como para informar y
gestionar los eventos adversos. Los exmenes de evolucin del paciente deben incluir indicadores capaces de detectar errores
o problemas relacionados con todo el proceso de fabricacin, y se debe poner especial atencin a las manipulaciones, al almacenamiento o al transporte despus de la fabricacin. La gestin de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos
para asegurar el examen mdico rpido y el tratamiento de pacientes, adems de un sistema para informar y evaluar los efectos adversos que puedan identificar posibles defectos en el producto. Los informes incluirn informacin requerida por los programas de monitoreo de eventos adversos federales o estatales.
ESTABILIDAD
Captulos
La estabilidad de los productos celulares o tisulares y de los componentes usados para su fabricacin variar dependiendo de
la naturaleza del producto, de su uso clnico previsto, de sus atributos especficos y de las condiciones de almacenamiento,
envasado y transporte. Por esta razn, generalmente no es posible generar pautas integrales que abarquen una amplia gama
de productos. De cualquier modo, el estudio de estabilidad siempre debe disearse basndose en principios cientficamente
slidos, as como en un conocimiento cabal del producto teraputico final y su uso previsto. Los fabricantes tambin deben
evaluar la estabilidad de las etapas de retencin durante el proceso, bancos de clulas, materias primas crticas y estndares de
referencia. Un programa de estabilidad bien diseado y ejecutado ofrece un alto grado de garanta de que el producto ser
estable durante su vida til especificada.
Cuando sea factible, se deben llevar a cabo anlisis de estabilidad, de conformidad con los principios descritos en las pautas
ICH Q5C, presentadas en el captulo Calidad de Productos Biotecnolgicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnolgicos o
Biolgicos 1049. Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para materiales a granel y en proceso que se almacenan
antes del procesamiento y llenado final.
Dependiendo de la formulacin usada y de las condiciones de almacenamiento, la vida til puede variar de horas a aos.
Para los casos en los que el producto tiene una vida til corta o cuando se debe eliminar el estabilizador del producto, puede
ser necesario preparar la formulacin final en el sitio clnico, justo antes de su administracin. A menudo, la inestabilidad se
observa en forma de agregacin en productos celulares y como falta de uniformidad estructural en productos tisulares. Se debe establecer la estabilidad del producto celular o tisular final mediante estudios de validacin durante el desarrollo.
Para algunos productos celulares o tisulares, tales como productos celulares autlogos o especficos del paciente, los lotes
finales tienden a constar de volmenes pequeos con una vida til de apenas unas pocas horas o das. En dichos casos, los
protocolos de estabilidad deben basarse en materiales de donantes mltiples. En los estudios de estabilidad para validar el almacenamiento, transporte y fecha de caducidad, y debido a que a menudo resulta difcil obtener suficientes clulas o tejidos
de productos autlogos o especficos del paciente, se pueden usar clulas o tejidos de diversas fuentes tales como donantes
normales, repositorios tisulares para investigacin, fuentes cadavricas o clulas primarias de bancos bien caracterizados. No
obstante, los resultados obtenidos con tales clulas o tejidos sustitutos deben interpretarse con cuidado y de manera conservadora hasta que los datos confirmen que las clulas autlogas o especficas del paciente en cuestin presentan perfiles de
estabilidad similares a los de las clulas o tejidos sustitutos.
Para productos de combinacin que incluyen clulas y biomateriales, se debe considerar la estabilidad de ambos componentes. Cuando se encuentran presentes materiales de andamiaje biodegradables, se debe tomar en cuenta la degradacin del
andamiaje para determinar la estabilidad y la vida til del producto de combinacin.
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad

Los estudios formales de estabilidad para respaldar la obtencin de la autorizacin y la recopilacin de informacin de estabilidad del producto en etapas tempranas deben detallarse en un plan por escrito que describa la forma en que se deben recolectar y analizar los datos sobre la estabilidad para sustentar la fecha de caducidad. Los protocolos deben seguir el formato
recomendado en las pautas reglamentarias existentes y deben incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento y el nmero de lotes a analizar, el programa de anlisis, los ensayos, el anlisis de datos y las especificaciones del producto. Todo
ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorizacin debe ser validado antes de comenzar el
estudio. El diseo especfico del estudio debe tomar en cuenta los desafos razonablemente previstos que pueden surgir para el
producto. Por ejemplo, si la formulacin del producto final se realiza en el sitio clnico, se deben realizar estudios de estabilidad
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en esta formulacin final para determinar el intervalo de tiempo y las condiciones de su conservacin. Para clulas o tejidos
crioconservados, la estabilidad debe establecerse despus de la crioconservacin del producto final, de productos intermedios
del proceso o de cualquier etapa de retencin.
Los estudios de estabilidad deben verificar que las condiciones de almacenamiento mantengan los atributos de calidad del
producto de manera que ste ltimo cumpla con las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las
especificaciones de liberacin, pero deben tratar la potencia del producto. Medir y calcular el deterioro de la actividad del producto empleando metodologas estadsticas puede requerir de muestreos frecuentes durante un periodo prolongado, adems
del anlisis de mltiples lotes de produccin para compensar la variabilidad de las valoraciones o productos.
Se deben llevar a cabo estudios iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administracin al
primer paciente. Estos estudios tambin son tiles para determinar qu valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir,
los indicadores ptimos de degradacin del producto. Debido a que los mtodos farmacopeicos existentes no tratan las caractersticas nicas de todos los productos celulares y tisulares, los fabricantes deben desarrollar valoraciones que abarquen estas
caractersticas nicas.
Las validaciones de transporte representan un tipo especial de estudio de estabilidad con protocolos predeterminados, requisitos de prueba y criterios de aceptacin. Por lo regular, el producto se envasa y transporta en condiciones normales y extremas, y el material se analiza antes y despus del transporte para garantizar que an cumple con los requisitos de liberacin de
producto. Conforme a lo descrito en Almacenamiento y Transporte (a continuacin), se debe poner especial atencin a las condiciones especficas de estrs trmico, mecnico y radiolgico que podran afectar a los productos.
Condiciones de Desafo de la Estabilidad
ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE
Las condiciones de almacenamiento se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las especificaciones del producto durante el almacenamiento, transporte y manipulaciones en el sitio clnico. Antes del uso en ensayos clnicos, deben realizarse estudios iniciales para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manipulacin son aceptables. Se deben especificar las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad del producto. No es
necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comercial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto ms all de la fecha de caducidad inicialmente
propuesta. Una vez que se hayan desarrollado los mtodos indicadores de estabilidad y que se hayan seleccionado las condiciones del cierre del envase final, almacenamiento y transporte, dichas condiciones deben ser valoradas, conforme a lo tratado
en la seccin Estabilidad (anterior).
Para productos con vidas tiles cortas, se deben tomar en cuenta las condiciones de almacenamiento y transporte en conjuntoincluso dentro de un solo sitio clnico debido a que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacenamiento despus de la fabricacin. El producto debe ser colocado en un envase a prueba de fugas y resistente a la luz, con un
soporte fsico adecuado, que garantice la estabilidad y la prevencin de fugas durante las condiciones normales de transporte.
Captulos
El perfil indicador de la estabilidad de un producto celular o tisular puede variar con el tiempo por la influencia de una amplia variedad de condiciones ambientales, incluyendo temperatura, estrs mecnico y luz. En el desarrollo de un programa que
investigue los efectos de estos parmetros sobre la estabilidad de los productos, se deben considerar vas de degradacin multifactoriales. Los estudios, basndose en la evaluacin de riesgos, deben incluir condiciones que superen los intervalos de almacenamiento especificados, es decir, condiciones de desafo como las encontradas durante perodos de almacenamiento, transporte o manipulacin anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fallas de la incubadora o del almacenamiento en fro, perodos de fluctuaciones trmicas extremas ocasionadas por el transporte
hacia climas calurosos o fros, condiciones hipobricas en el sector de carga de una aerolnea comercial o temperaturas previsibles en la sala de ciruga.
Una exposicin breve a una condicin ambiental muy alejada de un lmite establecido y una exposicin prolongada a un
ambiente que apenas exceda el lmite establecido pueden ser igualmente dainas. Si se aplican condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y constante de degradacin del producto a una temperatura especfica puede aumentar. Si
existe una justificacin cientfica, se debe investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar
especial atencin a los productos almacenados en fluidos que contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz
los cuales pueden dar origen a subproductos citotxicos.
Los estudios anlogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad
farmacutica tambin son tiles para caracterizar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores
de la estabilidad. Por ejemplo, si un producto derivado de clulas se va a conservar en refrigeracin (46) hasta su uso, entonces los estudios realizados durante la etapa de retencin del producto durante periodos prolongados a temperatura ambiente (25) pueden ofrecer informacin til sobre la integridad del producto as como de los mtodos analticos usados. Estos
tipos de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que los estudios formales incorporen en el protocolo los ensayos indicadores de estabilidad validados.
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Se debe poner especial atencin a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte, especialmente si el producto de terapia celular se almacena o transporta usando hielo seco o nitrgeno lquido.
Captulos
Almacenamiento
Para cada tipo de producto de terapia celular, el fabricante debe establecer especificaciones de almacenamiento del producto y condiciones de almacenamiento aceptables que incluyan el intervalo de temperatura o el nivel de nitrgeno lquido. Las
unidades de almacenamiento requieren de un sistema que monitoree y registre continuamente la temperatura y/o los niveles
de nitrgeno lquido. Esto incluye un sistema de alarma para notificar inmediatamente al personal del laboratorio sobre condiciones de almacenamiento inaceptables. La estabilidad del producto durante el almacenamiento de rutina debe monitorearse
mediante un programa de estabilidad (ver la seccin Estabilidad anterior).
La crioconservacin es el principal modo de almacenamiento a largo plazo para clulas. Los productos celulares se crioconservan usando procedimientos de congelacin a velocidad controlada o equivalentes que mantengan la viabilidad. Se debe
monitorear y documentar la temperatura de los productos durante la congelacin y el almacenamiento de conformidad con
las polticas de la instalacin. Asimismo, se debe valorar la estabilidad del producto en condiciones de retencin tanto en la
instalacin de fabricacin como en el sitio clnico.
La velocidad de enfriamiento para soluciones celulares durante la crioconservacin es importante debido a las lesiones mecnicas y por deshidratacin que resultan de la formacin y crecimiento de cristales de hielo. Las temperaturas ideales dependen
del tipo de clulas y de la concentracin del crioconservante. La velocidad de enfriamiento ptima para la mayora de las clulas est entre 1 y 3 por minuto. Los congeladores con velocidad controlada que pueden duplicar de manera reproducible
esta velocidad de enfriamiento ptima son fundamentales cuando se congela un gran nmero de viales o grandes volmenes
de clulas en bolsas. Una vez enfriadas por debajo del punto de congelacin, las clulas deben almacenarse a temperaturas por
debajo de 130. Esto se puede conseguir mediante congeladores elctricos o con nitrgeno lquido.
El almacenamiento de clulas en la fase de vapor de un congelador de nitrgeno lquido reduce el riesgo de contaminacin
cruzada con otros materiales en el congelador. Se debe validar el equipo congelador y se debe mapear la temperatura de modo que las clulas no estn sujetas a temperaturas por encima de 130 a medida que el nitrgeno lquido se evapora o durante la apertura del congelador. Algunas clulas se pueden almacenar a 80 si se pretende usarlas dentro de unas pocas semanas. Asimismo, es posible prevenir la contaminacin cruzada usando envoltorios sellados para cubrir las criobolsas.
Una gran cantidad de productos derivados de clulas no pueden ser crioconservados. Debido a que las clulas mantienen su
metabolismo durante el almacenamiento, su perodo de caducidad es cortoen el orden de horas o das. La fecha de caducidad se puede extender si se aumenta el volumen del medio de almacenamiento, si se ajusta la temperatura de almacenamiento o si se conecta una serie de bolsas o compartimientos que permitan cambiar el medio sin violar la esterilidad del sistema.
Adems, se deben definir y monitorear las condiciones de almacenamiento en el sitio clnico. Aunque los centros de procesamiento de clulas o los centros mdicos implicados en el transplante de mdula sea por lo general cuentan con congeladores
de nitrgeno lquido, la mayora de las farmacias clnicas no cuentan con estos equipos. Las temperaturas y caractersticas de
almacenamiento deben definirse para cada producto. Es posible que el sitio clnico deba retener el producto en el envase para
transporte hasta que ste pueda administrarse al paciente. Cuando el descongelamiento y la administracin del producto derivado de clulas se llevan a cabo en el centro mdico, el laboratorio que almacena o transporta las clulas debe colaborar estrechamente con el sitio clnico debido a que las clulas en una suspensin concentrada slo pueden sobrevivir durante unas pocas horas.
Transporte
Los envases para transporte y los procedimientos de transporte deben asegurar que las temperaturas se mantengan dentro
de los intervalos aceptables de duracin del transporte y en condiciones de uso real. Estas condiciones incluyen temperaturas
dentro del envase para transporte, extremos de temperaturas en el exterior del envase para transporte (como las temperaturas
en la pista caliente de un aeropuerto o en el fro sector de carga de un avin) y dems desafos de transporte (tales como rayos
x o vibracin mecnica). Durante el desarrollo del producto, se deben realizar estudios de transporte para identificar las condiciones adversas que podran afectar a los productos. De manera subsiguiente, se deben seleccionar y validar los materiales de
refuerzo y aislamiento para armar un sistema de embalaje que proteja contra temperaturas extremas y condiciones mecnicas
adversas.
La mayora de los productos se transportan mediante transportadores o sistemas de correo comerciales. En ocasiones, los
productos crticos son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales deben obtener permisos
especiales para evitar las revisiones con equipo de rayos x en los aeropuertos. Se debe poner especial atencin a las etiquetas
del envase para transporte ya que puede ser necesario mostrar informacin sobre riesgo biolgico y especfica del paciente en
reas especficas del embalaje. Las validaciones de transporte deben llevarse a cabo usando protocolos definidos con criterios
de aceptacin predeterminados para asegurar que el producto cumpla con las especificaciones de calidad (incluyendo la potencia) una vez que alcance su destino final.
Los productos derivados de clulas crioconservados por lo regular se envan a sitios clnicos usando hielo seco o en transportadores secos de nitrgeno lquido. Se prefieren estos ltimos, porque resulta ms fcil mantener y monitorear la temperatura,
y permiten el monitoreo continuo de la temperatura del transportador, la cual puede ser recabada y registrada hasta 14 das.
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El hielo seco y el nitrgeno lquido son materiales considerados peligrosos durante el transporte por lo que se deben etiquetar
adecuadamente.
ETIQUETADO
CONSIDERACIONES PARA LA TRANSFERENCIA DE TECNOLOGA

La transferencia de habilidades, conocimiento, tecnologas y mtodos de fabricacin necesarios para crear un producto derivado de clulas o tejidos son esenciales para garantizar que los desarrollos cientficos y tecnolgicos sean accesibles a usuarios
Captulos
El etiquetado de productos de terapia celular est regulado por la FDA de conformidad con el Ttulo 21 del CFR 201, 601,
610 y 1271. En lo que respecta a productos biolgicos, el Ttulo 21 del CFR 610 Subparte G describe los requisitos de etiquetado de envase y embalaje. Siempre que sea posible, se debe adjuntar una etiqueta completa al envase del producto. sta incluye el nombre propio del producto obtenido del US Adopted Names (USAN) Council (Consejo de Nombres Adoptados en los
EE.UU.); el nombre, direccin y nmero de autorizacin del fabricante; el nmero de lote; la fecha de caducidad; para envases
multidosis, la dosis individual recomendada; la leyenda Solamente Rx para productos de venta bajo receta; instrucciones para el dispensador para que proporcione, cuando se requiera, una Gua de Medicacin a cada paciente; y si el envase no est
contenido en un empaque, todos los puntos requeridos para una etiqueta del empaque. Si la etiqueta es demasiado pequea
para incluir toda esta informacin, se puede usar una etiqueta parcial, pero la siguiente informacin debe aparecer en dicha
etiqueta: el nombre expresado como nombre propio o nombre USAN; el nmero de lote y el nombre del fabricante; y para
envases multidosis, la dosis individual recomendada. Cuando se usan etiquetas parciales, el envase debe colocarse en un empaque que tenga una etiqueta que incluya todos los puntos requeridos para la etiqueta del empaque. Para los envases que no
pueden incluir ninguna etiqueta, el envase debe colocarse en un empaque que incluya toda la informacin requerida para una
etiqueta del empaque. Adems, cuando la etiqueta se coloca en el envase, sta no debe impedir la inspeccin del contenido.
Para productos con vidas tiles muy cortas, la fecha de caducidad debe ajustarse y corregirse a los husos horarios para proporcionar al usuario una evaluacin exacta de la vida til.
La etiqueta del empaque debe contener el nombre propio o USAN del producto, el nombre, direccin y nmero de autorizacin del fabricante, el nmero de lote, la fecha de caducidad, el conservante usado y su concentracin, o las palabras Sin
conservante si fuera apropiado, el nmero de envases, si contiene ms de uno, la cantidad de producto en el envase, la temperatura de almacenamiento recomendada, las palabras Agitar Bien, No Congelar u otras instrucciones segn se indique,
la dosis individual recomendada para envases multidosis, la va de administracin, las sustancias sensibilizantes conocidas, el
tipo y la cantidad de antibiticos agregados durante la fabricacin, los ingredientes inactivos si representan un factor para la
seguridad, el coadyuvante, el origen del producto cuando represente un factor para la administracin segura, la potencia mnima expresada en trminos del estndar oficial de potencia o la declaracin No Existe un Estndar de Potencia de EE.UU. y,
finalmente, la declaracin Solamente Rx para productos de venta bajo receta. Los reglamentos del Ttulo 21 del CFR 610.62
tratan la posicin y prominencia del nombre propio o USAN con respecto a un nombre comercial.
Los requisitos adicionales de etiquetado son aplicables puesto que el Ttulo 21 del CFR 1271.90 considera a los productos de
terapia celular como HCT/P. Para productos de terapia celular autlogos, el fabricante est exento de los requisitos para determinar la elegibilidad del donante. No obstante, si no se realiza el anlisis recomendado para contaminantes patgenos o microbianos antes de la liberacin, la etiqueta debe contener la leyenda SLO PARA USO AUTLOGO o NO EVALUADO PARA SUSTANCIAS INFECCIOSAS. La etiqueta debe contener la leyenda para Peligro Biolgico (Biohazard) mostrada en el Ttulo
21 del CFR 1271.3(h) con la leyenda ADVERTENCIA: Explicar a los pacientes los riesgos de enfermedades transmisibles. Para
productos especficos del paciente, el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinacin de los mismos debe aparecer en el etiquetado para garantizar que el producto se administre al paciente apropiado.
Asimismo, los reglamentos rigen el contenido y formato del etiquetado para productos farmacuticos para prescripcin en
humanos (incluyendo productos biolgicos), tambin conocido como prospecto del empaque. Estos reglamentos, que aplican
a productos teraputicos aprobados, entraron en vigor el 30 de junio de 2006. Los detalles sobre el contenido y el formato se
pueden encontrar en el Ttulo 21 del CFR 201.56 y 201.57. Estos cambios fueron diseados para mejorar la capacidad de los
profesionales de la salud para acceder, leer y usar el etiquetado de medicamentos bajo receta. El principal cambio es la adicin
de una seccin de media pgina de informacin ms relevante. La mayora de los dems cambios implican la reorganizacin
de las secciones para trasladar al frente la informacin ms crtica para la prescripcin.
Adems de los requisitos reglamentarios especficos de la FDA, diversos grupos han diseado la ISBT 128, una norma para
uniformar el etiquetado de productos de terapia celular, en la que ISBT son las siglas de la International Society of Blood Transfusion (Sociedad Internacional de Transfusin Sangunea) y el 128 refleja la seleccin de la simbologa de cdigo de barras
conocida como Cdigo 128. La ISBT 128 define las estructuras de los datos y la colocacin de cdigos de barras y su texto
correspondiente, legible a la vista, que aparece debajo del cdigo de barras. Asimismo, la norma proporciona clasificaciones
para diferentes tipos de productos celulares, texto modificador para procesamiento de clulas, texto de manipulacin para la
forma en que se fabrican las clulas, texto crioprotector para productos celulares congelados, as como otros textos diversos
que deben incluirse en las etiquetas. Aunque esta norma voluntaria cumple con los requisitos de diferentes organizaciones para
el etiquetado de productos celulares, actualmente no cumple con los requisitos reglamentarios de la FDA. Por consiguiente, las
etiquetas que cumplen con la ISBT 128 deben complementarse con informacin adicional requerida por la FDA.
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que puedan desarrollarlos an ms y convertir la tecnologa en nuevos productos, procesos, aplicaciones, materiales o servicios. A continuacin se resumen algunas consideraciones generales para las actividades de transferencia de tecnologa.
El proceso para desarrollar un producto de terapia celular o tisular es complejo y a menudo implica varias rondas de transferencia de tecnologa durante el ciclo de vida del producto. Algunos ejemplos de actividades de transferencia de tecnologa
incluyen: desde la investigacin de campo hasta la investigacin traslacional; transferencia desde la investigacin y el desarrollo
hasta la fabricacin que cumpla con las BPF; y cambio en la instalacin de fabricacin (por ejemplo, de la fabricacin interna al
fabricante contratista).
Los fabricantes deben anticipar la necesidad de transferir tecnologa durante la etapa de investigacin y desarrollo de un
proceso de terapia celular o tisular. Lo anterior debe resultar en buenas prcticas de documentacin para investigacin y desarrollo del producto, incluyendo procedimientos de anlisis. Los datos y resultados deben conservarse en forma de informes de
desarrollo o informes tcnicos para proporcionar informacin histrica que pueda usarse como referencia y para solicitudes
reglamentarias. Asimismo, las materias, procedimientos y equipos crticos deben identificarse durante la transferencia de tecnologa. El progreso de desarrollo del producto y del proceso debe monitorearse en funcin de hitos establecidos como parte
de la evaluacin de riesgos y la identificacin de brechas en el plan de transferencia de tecnologa. La Tabla 3 proporciona una
visin general de las etapas relacionadas con la transferencia de tecnologa.
Captulos
Tabla 3: Transferencia de TecnologaEtapas Fundamentales
Preparacin
Definir el alcance, la estrategia y los riesgos asociados con el proyecto que ser transferido
Identificar brechas generales y la capacidad de transferencia del proceso
Evaluar la disponibilidad de documentacin tal como los procedimientos de fabricacin y anlisis, planes de muestreo, datos y especificaciones del producto en proceso y final, especificaciones de material
(incluyendo el origen, requisitos de anlisis y cantidades requeridas para un procedimiento de fabricacin
o de prueba), especificaciones de equipo, requisitos de capacitacin especializados, requisitos de la instalacin y requisitos de infraestructura
Establecer un rgano de administracin formado por lderes, expertos y mentores por parte del que
transfiere y del que recibe la tecnologa; determinar responsabilidades para cada grupo e individuo
Definir canales de comunicacin e informacin
Identificar mediciones de desempeo, hitos y secuencias
Desarrollo e
Implementacin
Establecer un plan de gestin de riesgos

Establecer un plan maestro de transferencia de tecnologa
Desarrollar un plan de capacitacin
Establecer documentos en el centro receptor (especificaciones, SOP, registros de partidas y mtodos de
prueba estndar)
Operaciones de capacitacin, calidad y apoyo del personal para la sostenibilidad
Calificar materiales y proveedores
Establecer y ejecutar protocolos de comparabilidad/aptitud del equipo
Calibrar el equipo en el centro receptor
Calificar al personal, al equipo y las instalaciones en el centro receptor (incluye la ejecucin de validaciones de procesamiento asptico, llenado de medios estriles y validaciones de limpieza)
Establecer y ejecutar calificaciones de mtodos/valoraciones
Establecer un programa de estabilidad de producto
Realizar pruebas de ingeniera y uniformidad/calificacin
Evaluar la necesidad de establecer la comparabilidad y preparar solicitudes reglamentarias
Establecer y ejecutar calificaciones de transporte
Mantenimiento
Recolectar y establecer tendencias de datos de procesos/producto

Monitorear la estabilidad del producto
Gestionar el control de cambios
Capacitar y volver a calificar al personal
Recalibrar y volver a calificar el equipo
Actualizar las solicitudes reglamentarias
El objetivo final de la transferencia de tecnologa se centra en que el receptor reproduzca un proceso de manera uniforme
para producir productos comparables que cumplan con los reglamentos. Es comn que los fabricantes desarrollen e implementen mejoras en el proceso durante las etapas tempranas de transferencia de tecnologa para respaldar la ampliacin y la
fabricacin para los ensayos clnicos de las Fases I/II. Sin embargo, durante la transferencia de tecnologa para estudios de la
Fase III, ensayos claves o fabricacin comercial, se deben evitar cambios en el proceso o productos debido a que pueden requerir de estudios clnicos adicionales y afectar negativamente el tiempo hasta su comercializacin.
REGLAMENTACIONES Y ESTNDARES
La Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos o Ley FD&C) y la Public
Health Service Act (Ley de Servicios de Salud Pblica o Ley PHS) ofrecen el marco legal para la reglamentacin de la FDA para
productos biolgicos, incluyendo productos de terapia celular. La Tabla 4 presenta una lista de trminos de uso frecuente en la
reglamentacin de productos de terapia celular. En 1993, la FDA notific que tena la intencin de reglamentar los productos
de terapia celular y gnica como productos biolgicos (Registro Federal 1993;58:53248
53251). La FDA defini productos de terapia celular somticos como clulas autlogas (es decir, obtenidas del mismo sujeto),
alognicas (es decir, intraespecies) o xenognicas (es decir, interespecies) que han sido propagadas, expandidas, selecciona-
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Tabla 4. Trminos de Uso Frecuente en la Reglamentacin de Productos de Terapia Celular

TRMINO
DEFINICIN
351 productos
Regulados con base en la Seccin 351 de la Ley PHS
361 productos
Regulados con base en el Ttulo 21 del CFR 1271, Clulas, Tejidos y Productos Derivados
de Clulas y Tejidos Humanos
BLA
Solicitud de Autorizacin para Productos Biolgicos
CBER
Centro para la Evaluacin e Investigacin de Productos Biolgicos
Captulos
das, tratadas farmacolgicamente o alteradas de otro modo ex vivo para su administracin en humanos para la prevencin,
tratamiento, cura, diagnstico o mitigacin de enfermedades o lesiones. Para otros productos y medicamentos biolgicos, se
deben realizar ensayos clnicos que impliquen productos de terapia celular somticos con base en una solicitud para nuevo
medicamento en investigacin (IND). Despus de que el patrocinador presente evidencia suficiente sobre la seguridad del producto y de la eficacia clnica, se puede obtener la aprobacin de la FDA para la comercializacin a travs de una solicitud de
autorizacin para Productos biolgicos (BLA) o PMA.
Conforme a lo definido por la FDA, los productos de terapia celular se consideran medicamentos y productos biolgicos,
pero tambin HCT/P reglamentados con base en la Seccin 351 y/o Seccin 361 de la Ley PHS. Esto significa que los productos de terapia celular estn sujetos a las BPFv (Ttulo 21 del CFR 210 y 211), a los reglamentos para Productos Biolgicos (Ttulo 21 del CFR 610) y a los reglamentos para productos elaborados con clulas o tejidos humanos (Ttulo 21 del CFR 1271)
incluyendo las Buenas Prcticas para Tejidos vigentes.
En aos recientes, la FDA ha emitido diversas reglamentaciones y documentos gua para productos celulares y tisulares humanos (HCT/P) (ver el Apndice y www.fda.gov/cber/). Las reglamentaciones del Ttulo 21 del CFR 1271 son de particular importancia pues establecen un enfoque gradual basado en el riesgo de productos elaborados con clulas o tejidos humanos
(HCT/P). Dentro de este marco reglamentario, una gran cantidad de clulas o tejidos humanos convencionales no estn sujetos a la aprobacin previa a la comercializacin y nicamente tienen que cumplir con las Buenas Prcticas para Tejidos vigentes, incluyendo los requisitos de elegibilidad del donante. Este nivel ms bajo de supervisin reglamentaria tiene como propsito prevenir la introduccin, transmisin o diseminacin de enfermedades transmisibles. Cuando las clulas o tejidos humanos
son el material de partida para la creacin de un producto derivado de clulas novedoso, se aplican requisitos reglamentarios
adicionales. Este nivel ms alto de supervisin reglamentaria incluye el cumplimiento con las BPFv, las normas para productos
biolgicos y la aprobacin previa a la comercializacin (ver el Ttulo 21 del CFR 1271.10). Para casi todas las instancias, los
productos derivados de clulas descritos en este captulo general deben cumplir con el nivel ms alto de supervisin reglamentaria.
Adems de las reglamentaciones y pautas especficas de terapia celular, resultan importantes y aplicables una gran cantidad
de pautas tales como aquellas relacionadas con el procesamiento asptico, las expectativas de las BPF durante el desarrollo y la
validacin del proceso, entre otras (ver www.fda.gov). Asimismo, la ICH ha emitido documentos gua para la calificacin de
productos derivados de clulas y tejidos (ver el Apndice y www.ich.org). Algunas de las pautas y conceptos en estos documentos se reproducen en los compendios USPNF.
La va reglamentaria para productos de terapia celular es paralela a la de los productos farmacuticos y, a medida que el
producto se traslada de la investigacin temprana a los ensayos clnicos claves y finalmente hasta su aprobacin para comercializacin, el grado de control de fabricacin aumenta en rigurosidad. Lo anterior tiene implicaciones para la unidad de fabricacin y puede requerir que el sitio sea trasladado. Las organizaciones para el establecimiento de normas fomentan el uso de una
unidad de calidad plenamente funcional para supervisar el progreso de la fabricacin. La informacin se encuentra disponible
en el sitio Web de la FDA, junto con referencias a los grupos a cargo de guiar a la comunidad mdica y a la unidad de fabricacin durante el desarrollo.
Adems de los captulos generales y monografas de USP para productos de terapia celular y tisular, diversas organizaciones
profesionales para el establecimiento de normas (ver la Tabla 5 y el Apndice) han trabajado estrechamente con las autoridades
reglamentarias para desarrollar normas y prcticas. Estas organizaciones garantizan que las normas se mantengan actualizadas
y que cumplan con las reglamentaciones gubernamentales. Estas normas representan una fuente complementaria de conocimiento en relacin con la identificacin de donantes, la seleccin y el anlisis de donantes, las recolecciones de productos, el
procesamiento de productos celulares, la administracin, el informe de eventos adversos y el seguimiento posterior al tratamiento. El AATB ha elaborado pautas para obtener tejido alognico. Con el paso de los aos, diversas organizaciones han intentado armonizar normas, as como el desarrollo de circulares comunes que puedan compararse con los prospectos del empaque. Sin embargo, en la actualidad, cumplir con las normas de una organizacin no garantiza el cumplimiento con las normas de otras organizaciones.
Los programas de normas voluntarias generan una gran cantidad de beneficios para las instalaciones de fabricacin que participan de estos programas. Las organizaciones profesionales para el establecimiento de normas participan en talleres educativos y diseminan informacin sobre asuntos operativos. Asimismo, mantienen una vigilancia estrecha sobre las actividades de la
FDA y la capacitacin de inspectores. Adems, la FDA confa en la acreditacin mediante el programa de normas voluntarias;
asimismo, las inspecciones no anunciadas de la FDA han llevado al aumento en el nivel de cumplimiento por parte de las instalaciones de laboratorio y clnicas, lo que sin lugar a dudas ha incrementado la seguridad del paciente. Los terceros responsables de los pagos y los servicios de clasificacin de hospitales han comenzado a usar informes de acreditacin en su evaluacin
de programas de calidad.
USP 38
Tabla 4. Trminos de Uso Frecuente en la Reglamentacin de Productos de Terapia Celular (Continuacin)

TRMINO
CDRH
DEFINICIN
Centro para Dispositivos y Salud Radiolgica
BPF
Buenas Prcticas de Fabricacin
GTP
Buenas Prcticas para Tejidos, Ttulo 221 del CFR 1271, Clulas, Tejidos y Productos Derivados
de Clulas y Tejidos Humanos
IDE
Exencin de Investigacin de Dispositivos.

Una exencin de investigacin de dispositivos (IDE, por sus siglas en ingls) permite el uso del dispositivo bajo investigacin en un estudio clnico a fin de recolectar datos de seguridad y eficacia requeridos
para respaldar la solicitud de Aprobacin Previa a la Comercializacin (PA) o la entrega de una Notificacin Previa a la Comercializacin [510(k)] a la FDA.
IND
Nuevo Frmaco en Investigacin (IND, por sus siglas en ingls).

Un IND es una solicitud de autorizacin presentada ante la FDA para administrar un medicamento en
investigacin a humanos. Las reglamentaciones para IND se pueden encontrar en el Ttulo 21 del CFR
312.
PMA
Aprobacin Previa a la Comercializacin

Tabla 5. Organizaciones para el Establecimiento de Normas para Productos de Terapia Celular
AATB
La American Association of Tissue Banks (Asociacin Estadounidense de Bancos de Tejidos) es una organizacin educativa y cientfica, exenta de impuestos, que facilita el
abastecimiento de tejidos transplantables de alta calidad para satisfacer las necesidades de la nacin. La AATB publica normas para asegurar que las actividades de los
bancos de tejidos cumplan con las normas aceptables de desempeo tcnico y tico.
La AATB lleva a cabo un programa de acreditacin para establecimientos que recolectan, procesan, almacenan o distribuyen tejido humano para transplante. El personal
del banco de tejidos se somete a un programa de certificacin para asegurar que las
actividades de bancos de tejidos se lleven a cabo de manera profesional, cumpliendo
constantemente con las normas de la asociacin.
http://www.aatb.org/
ASTM
La ASTM International (ASTM), conocida originalmente como la American Society for

Testing and Materials (Asociacin Estadounidense para Anlsis y Materiales), es una
de las organizaciones voluntarias para el desarrollo de estndares ms grandes del
mundo y proporciona normas tcnicas para materiales, productos, sistemas y servicios. Las normas de la ASTM International se usan en la infraestructura de informacin que gua el diseo, la fabricacin y la comercializacin en la economa global.
http://www.astm.org/
FACT
La Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (Fundacin para la Acreditacin de Terapias Celulares) es una organizacin sin fines de lucro fundada conjuntamente por la International Society for Cellular Therapy (Sociedad Internacional para
Terapias Celulares o ISCT) y la American Society of Blood and Marrow Transplantation (Sociedad Estadounidense de Transplante De Mdula y Sanguneo o ASBMT) para la inspeccin y acreditacin voluntaria en el campo de la terapia celular.
http://www.factwebsite.org/
NMDP
El National Marrow Donor Program (Programa Nacional de Donantes de Mdula) es

una organizacin sin fines de lucro que opera el registro de donantes de clulas hematopoyticas y de unidades sanguneas de cordn umbilical, auspiciado por el gobierno federal, en los Estados Unidos.
http://www.nmdp.org/
ICCBBA
El International Council for Commonality in Blood Banking Automation (Consejo Internacional sobre Aspectos Comunes de Automatizacin de Bancos de Sangre) se estableci con el objetivo de implementar y gestionar la norma ISBT 128, un sistema de
identificacin, etiquetado y procesamiento de sangre, tejido y productos de terapia
celular humanos que emplean un sistema internacionalmente normalizado.
http://www.iccbba.org/
Captulos
AABB
La AABB, anteriormente conocida como la American Association of Blood Banks (Asociacin Estadounidense de Bancos de Sangre), es una asociacin internacional que representa a individuos e instituciones implicadas en actividades relacionadas con la
http://www.aabb.org/
transfusin y las terapias celulares, incluyendo medicamentos de transplante.
APNDICE:
Las terapias celulares y los componentes de las terapias celulares estn reglamentados por la FDA como productos biolgicos. Los requisitos generales se listan en la legislacin nacional y en las guas internacionales. En los Estados Unidos, los requisitos nacionales se codifican en diferentes secciones del Ttulo 21 del CFR, mientras que los documentos gua de la FDA proporcionan recomendaciones adicionales. Los documentos gua internacionales se encuentran disponibles en la ICH, en la European Agency of Medicines (Agencia Europea de Medicamentos o EMA) y en la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Aunque el presente captulo general hace una buena referencia a los documentos gua de la ICH, no ocurre lo mismo con los documentos de la OMS y de la EMEA, por lo que se recomienda a los fabricantes de productos derivados de clulas y tejidos
destinados a mercados fuera de los Estados Unidos referirse a las pautas pertinentes de las naciones correspondientes. De manera complementaria a los captulos de USP referidos en este captulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios y
las mejores prcticas de desarrollo de productos y procesos, fabricacin, control de calidad y garanta de calidad:
USP 38
GLOSARIO DE TRMINOS Y DEFINICIONES

AfresisProcedimiento de extraccin de sangre de un donante, retirando componentes seleccionados (p.ej., plaquetas o leucocitos) y retransfusin del remanente al donante.
Agente AdventicioAgente extrao que se introduce inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la contaminacin microbiana, qumica o bioqumica de una sustancia purificada).
AlognicoDe un integrante no emparentado de la misma especie pero con un genotipo diferente.
Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos derivados de un nico clon celular.
Antgenos Leucocitarios Humanos (HLA, por sus siglas en ingls)Protenas controladas por el complejo principal de histocompatibilidad. Estas protenas tienen un papel preponderante en la determinacin de la compatibilidad para trasplantes.
AutlogoQue se obtiene del organismo propio.
BioensayoMedicin de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o clulas en comparacin con una preparacin estndar. (Ver tambin Potencia.)
Captulos
Cdigo de Reglamentos Federales (CFR)

Ttulo 21 del 210
Ttulo 21 del CFR 211
Ttulo 21 del CFR 46
Documentos Gua de la FDA
Draft Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)
Draft Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products
Draft Guidance for Industry: Current Good Tissue Practice (cGTP) and Additional Requirements for Manufacturers of Human
Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps)
Guidance for Industry: Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products
(HCT/Ps), February 2007. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Tissue/ucm073964.htm
Guidance for Industry: Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans, April 2003. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Xenotransplantation/ucm074354.htm
PHS Guideline on Infectious Disease Issues in Xenotransplantation, January 2001. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Xenotransplantation/ucm074727.htm
Guidance for Industry: Investigating Out-of-Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production, October 2006.
www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070287.pdf
Guidance for Industry: Validation of Growth-Based Rapid Microbiological Methods for Sterility Testing of Cellular and Gene-Therapy Products, CBER, 2008. http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072612.htm
FDA Blue Book G95-1, http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/
ucm080735.htm
Documentos Reglamentarios Nacionales e Internacionales
The United States Consensus Standard for the Uniform Labeling of Cellular Therapy Products using ISBT 128, disponible
en: http://www.iccbba.org/usconsensusstandard_cellulartherapy.pdf
ISO 10993-1:2003, Biological evaluation of medical devicesPart 1: Evaluation and testing, disponible en: http://
www.iso.org
ICH Q2(R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, disponible en: http://www.ich.org
ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
ICH Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, disponible en:
http://www.ich.org
ICH Q9: Quality Risk Management, disponible en: http://www.ich.org
Naming Scheme for Cell Therapies by the United States Adopted Names (USAN) Council, available at: http://www.amaassn.org/
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996), disponible en: http://
www.nap.edu/
Captulos
USP 38
BiotecnologaToda tcnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar
plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos especficos. La definicin ms nueva se refiere al uso industrial y
farmacutico del ADN recombinante, fusin celular, nuevas tcnicas de bioprocesamiento y terapia gnica.
BPFvAbreviatura para Buenas Prcticas de Fabricacin vigentes.
CD34Cmulo del marcador 34 de la superficie celular. El CD34 es una protena que distingue a las clulas madre y progenitoras de clulas sanguneas ms maduras.
Clula DendrticaClula que sensibiliza las clulas T a los antgenos.
Clula MadreClula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de clulas especializadas. Se supone que
cada sistema de tejidos importante tiene su propia clula madre.
Clula ProgenitoraClula madre o ancestral generalmente ya comprometida a diferenciarse en un tipo o linaje celular especfico.
Clulas AlimentadorasClulas usadas en cocultivo para mantener clulas madre pluripotentes. Para hESC, las capas alimentadoras tpicas incluyen fibroblastos embrionarios de ratn o humanos tratados para evitar su divisin.
Clulas Asesinas Naturales (Clulas NK)Linfocitos citotxicos que constituyen un componente principal del sistema inmune innato.
Clulas de la Mdula seaUna variedad de clulas indiferenciadas (clulas madre) y diferenciadas (linfocitos, granulocitos,
eritrocitos y plaquetas) que se encuentran en las cavidades internas de los huesos o la mdula sea.
Clulas de los IslotesClulas de los islotes b del pncreas que secretan insulina.
Clulas EndotelialesClulas epiteliales de origen mesodrmico que recubren las cavidades internas del cuerpo como el corazn y los vasos sanguneos y linfticos.
Clulas EpitelialesClulas del revestimiento de distintos rganos. Ejemplos: clulas epiteliales respiratorias, intestinales o vasculares.
Clulas Madre de Sangre del Cordn UmbilicalClulas madre obtenidas de la sangre que se conserva en la placenta y en
el cordn umbilical que se mantienen unidos despus del alumbramiento.
Clula Madre Embrionaria Humana (hESC, por sus siglas en ingls)Clula madre derivada de la masa celular interna del
blastocisto.
Clulas Madre HematopoyticasClulas madre que dan origen a todos los leucocitos, eritrocitos y plaquetas.
Clulas Madre MesenquimalesClulas madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de clulas.
Clulas Madre NeuronalesClulas madre encontradas en el tejido neuronal que pueden dar origen a neuronas y clulas
gliales.
Clulas No DiferenciadasClulas que no se han desarrollado en un tipo de clula o tejido especializado.
Clulas OsteognicasProvenientes del hueso o que participan en el crecimiento o reparacin sea.
Clulas SomticasClulas que no son clulas germinales.
Clulas TLinfocitos que adquieren su repertorio de funciones y su capacidad de discriminacin autloga en el timo, y son
responsables de la inmunidad mediada por clulas. Hay varios subgrupos de clulas T (clulas T colaboradoras, clulas T supresoras y clulas T citotxicas).
CitoquinaTodo factor que acta sobre las clulas; por lo general, una protena que favorece el crecimiento.
CitoplasmaMaterial celular contenido entre la membrana celular y el ncleo.
CitotxicoCapaz de causar la muerte celular.
Clasificador de Clulas Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en ingls)Equipo que clasifica clulas basndose
en marcadores fluorescentes unidos a las clulas.
ClonalGenes, clulas u organismos enteros derivados de y genticamente idnticos a un nico gen, clula u organismo ancestral comn.
Colorante SupravitalColorante que tie clulas vivas solamente.
CondrocitosClulas que producen los componentes del cartlago.
Cultivo en SuspensinClulas capaces de crecer en suspensin sin la necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para
generar la divisin celular.
DiferenciacinProceso de cambios bioqumicos y estructurales mediante el cual las clulas adquieren forma y funcin especializadas.
ELISAEnzimoinmunoensayo. Inmunoensayo que utiliza un antgeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la
unin de una molcula a una matriz slida.
Enfermedad del Injerto Contra el AnfitrinRechazo del tejido transplantado por parte del anfitrin. Es la causa principal de
muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alognico mal compatibilizado con el receptor.
Ensayo ClonognicoProcedimiento basado en la capacidad de producir un clon de clulas.
EpidrmicoPerteneciente a la capa ms externa y avascular de la piel, derivada del ectoderma embrionario.
Ex VivoProcedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Se refiere al procedimiento mdico en el que un
rgano, clulas o tejido se toman de un cuerpo vivo para un tratamiento o procedimiento y posteriormente se devuelven al
cuerpo vivo.
Exento de sueroSe refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes sricos.
Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrfagos (GM CSF, por sus siglas en ingls)Hormona natural que
estimula la produccin de leucocitos, especialmente granulocitos y monocitos.
USP 38
Captulos
Factores de CrecimientoFactores responsables de regular la proliferacin, funcin y diferenciacin celular.

FibroblastosClulas de tejido conectivo capaces de producir colgeno.
FormuladoPreparado de acuerdo con condiciones o mtodos prescritos.
GranulocitoUno de los tres tipos de leucocitos. Estas clulas digieren bacterias y otros parsitos.
HemacitmetroDispositivo usado para el recuento manual de clulas.
HematopoyticoPerteneciente o con influencia sobre la formacin de clulas sanguneas.
HepatocitosClulas predominantes del hgado, que cumplen una funcin importante en el metabolismo y son productoras
de protenas sricas. Por lo general, estas clulas no estn en divisin pero si se daan, se pueden dividir y regenerar hasta
reponer las clulas daadas.
In VivoProcedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo.
In VitroEn el laboratorio (fuera del organismo). Lo contrario de in vivo (en el organismo).
InjertoProceso mediante el cual se implantan o trasplantan clulas, tejidos u rganos en otro organismo. Se refiere tanto a
los procesos mecnicos como biolgicos necesarios para obtener un injerto plenamente funcional.
InmunoensayoTcnica para identificar sustancias basndose en el uso de anticuerpos.
InmunofluorescenciaTcnica que combina una estrategia de deteccin de anticuerpos con un marcador fluorescente para
visualizacin que por lo general se usa en combinacin con la clasificacin de clulas por microscopa o activacin por fluorescencia.
InmunognicoSustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria; una forma de antgeno que induce una respuesta inmunitaria, contrario a un tolergeno, que induce tolerancia.
Linaje (Clulas Progenitoras Comprometidas, Clulas Diferenciadas)Va especfica de diferenciacin celular que se puede
rastrear hasta una clula nica de origen.
Lneas CelularesClulas que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u rganos. Estas lneas celulares pueden tener una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente).
Linfocitos B (Clulas B)Una clase de linfocitos provenientes de la mdula sea que producen anticuerpos.
MacrfagoCualquiera de las diversas formas de fagocitos mononucleares que se encuentran en los tejidos y que surgen de
las clulas madre hematopoyticas en la mdula sea.
Materiales auxiliaresComponentes usados durante la fabricacin que no deben estar presentes en el producto final. Ejemplos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separacin de clulas y componentes de
medios.
Medicina RegenerativaCampo interdisciplinario de investigacin y aplicaciones clnicas emergente que se centra en la reparacin, reemplazo o regeneracin de clulas, tejidos u rganos para restaurar funciones deficientes usando una combinacin
de mtodologas que incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, el uso de molculas solubles, terapia gnica, transplante de clulas madre, ingeniera tisular y reprogramacin de tipos de clulas y tejidos.
Medio de CultivoLquido que cubre las clulas en un vaso de cultivo y que contiene ingredientes para nutrir y sustentar las
clulas. El medio de cultivo tambin puede incluir factores de crecimiento que se agregan para producir cambios deseados en
las clulas.
MiocitosClulas fundamentales del tejido muscular. Clulas blanco para la insercin de genes que codifican protenas secretoras.
PasajeProceso en el que las clulas son desasociadas, lavadas y sembradas en nuevos cultivos despus de una ronda de crecimiento y proliferacin celular. El nmero de pasajes es una buena indicacin de la edad de los cultivos y de la estabilidad
esperada.
PotenciaMedicin cuantitativa de la actividad biolgica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades biolgicas relevantes.
Producto BiolgicoCualquier virus, suero teraputico, toxina, antitoxina o producto anlogo aplicable a la prevencin, tratamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (El trmino producto anlogo indica que incluye esencialmente productos obtenidos por biotecnologa y procedimientos que incluyen terapia gnica, productos transgnicos y terapia celular somtica.)
Productos de CombinacinProductos teraputicos que combinan frmacos, dispositivos y/o productos biolgicos.
QueratinocitosClulas epidrmicas diferenciadas que constituyen la capa superior de las clulas de la piel.
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls)Tcnica para amplificar una secuencia especfica de
nucletidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geomtricos en el nmero de copias.
Terapia CelularTerapia que utiliza clulas completas para tratar una enfermedad, afeccin o lesin.
Transplante de Mdula seaTransplante de clulas de la mdula sea capaces de mantener las funciones hematolgicas
indefinidamente. Tcnica empleada en el tratamiento de trastornos inmunitarios (deficiencias inmunitarias combinadas graves,
tales como la deficiencia de ADA), trastornos hematolgicos (anemia), metablicos (enfermedad de Gaucher) y enfermedades
malignas (leucemia, linfoma o tumor slido).
Validacin del ProcesoMtodo para suministrar documentacin probatoria de que el proceso de fabricacin est controlado, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas.
XenognicoDe una especie diferente.
XenotransplanteTransplante de rganos de una especie a otra (por ejemplo, de cerdos a seres humanos).
958 1047 Productos de Terapia Gnica / Informacin General
USP 38
1047 PRODUCTOS DE TERAPIA GNICA

INTRODUCCIN
Los productos de terapia gnica permiten la administracin de cidos nucleicos para modificar el material gentico de las
clulas. Los productos de terapia gnica son ampliamente clasificables con base en la metodologa de administracin e incluyen lo siguiente: (1) vectores virales [virus que transportan los genes de inters pero, generalmente, sin el mecanismo de autorreplicacin in vivo]; (2) cidos nucleicos en una formulacin simple (ADN desnudo); y (3) cidos nucleicos formulados con
agentes tales como los liposomas, que mejoran su capacidad para penetrar en la clula. Cuando la introduccin del cido nucleico se lleva a cabo ex vivo, la poblacin de clulas que se administra se convierte en el producto de terapia gnica. Las pautas especficas para la fabricacin, el procesamiento, la caracterizacin y la administracin de productos derivados de clulas se
proporcionan en el captulo Productos Derivados de Clulas y Tejidos 1046.
La toma de decisiones con respecto a un vector gnico puede ser compleja (ver Consideraciones de Diseo para Vectores Gnicos en Fabricacin de Productos de Terapia Gnica). Los virus ms comnmente utilizados incluyen retrovirus murinos, adenovirus humanos y virus humanos asociados a adenovirus (VAA). La definicin de terapia gnica de este captulo considera inherentemente que la administracin de cidos nucleicos mediante transduccin se expresa como ARN y posteriormente como
protena. En la Tabla 1 se incluyen ejemplos de productos de terapia gnica.
Captulos
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Gnica

Categoras o Estrategias
Indicacin: Producto Administrado
Reemplazo de genes
Corto plazo
Largo plazo
Enfermedad cardiovascular: vector de factor de crecimiento en un andamiaje biocompatiblea

Fibrosis qustica: vector para la regulacin de la conductancia transmembrana
Hemofilia: vector para el factor VIII IX
Destruccin directa de clulas
Cncer: virus oncolticos recombinantes
Inmunoterapia
Cncer: clulas tumorales autlogas, transducidas con genes para citoquinas u otros genes inmunomoduladores; linfocitos transducidos con receptores para antgenos tumorales
Artritis: linfocitos autlogos modificados genticamente
Genes condicionalmente letalesb
Cncer (tumor slido): vector que inserta el gen de timidina quinasa (TK) o citosina desaminasa
(CD) en las clulas tumorales
Enfermedad del injerto contra el anfitrin (GVHD, por sus siglas en ingls): Vector que transduce el
gen de TK o CD en las clulas T de donantes
Alteracin del gen mediante ARN antisentidos,

ribozimas y ARN inhibitorios expresados mediante un vector
Cncer: vector con antioncogen

Retinitis por citomegalovirus: vector antiviral
Virus de inmunodeficiencia humana (VIH): linfocitos autlogos transducidos con vector con ribozima antiviral
Intracuerpos
Cncer o VIH: vector que codifica anticuerpo monocatenario contra una protena tumoral o viral,
respectivamente
a Este producto favorece la formacin de nuevos vasos sanguneos.

b Las clulas con genes condicionalmente letales, as como sus clulas
vecinas, se destruyen despus de la administracin de un segundo frmaco in vivo. Para la

timidina quinasa (TK, por sus siglas en ingls), el frmaco es ganciclovir. Para la citosina desaminasa (CD, por sus siglas en ingls), el frmaco es 5-fluorocitosina.
Propsito y Organizacin del Captulo

Los usos clnicos de los productos de terapia gnica, sus procesos de fabricacin y los esquemas analticos para determinar la
identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad estn evolucionando a gran velocidad y son tan diversos como los productos
mismos. Este captulo sintetiza las mejores prcticas vigentes y cuestiones inherentes a la fabricacin, pruebas y administracin
de productos de terapia gnica. Por lo general, los captulos de USP se concentran en los materiales disponibles comercialmente. Sin embargo, este captulo no solamente analiza productos con aplicaciones comerciales, sino que tambin est dirigido a
la produccin de materiales para ensayos clnicos. Cuando usan diferentes enfoques para el material utilizado en ensayos clnicos, en comparacin con aquellos utilizados en productos comerciales, as se indica.
Cuando resulte apropiado, se hace referencia a las pautas aplicables incluyendo las pautas de calidad de la International
Conference on Harmonization (Conferencia Internacional de Armonizacin, ICH) debido a que los principios aplican incluso si
los productos de terapia gnica estuvieran fuera del alcance oficial. El Apndice presenta una lista de documentos reglamentarios y guas aplicables a la terapia gnica, a la par de una lista de trminos de uso comn en el campo de la terapia gnica. La
perspectiva farmacopeica tradicional es desarrollar normas pblicas que puedan aplicarse a un producto final en particular sin
proporcionar detalles de la produccin. Este captulo tiene como propsito identificar las situaciones en las que se pueden
adaptar las metodologas o normas tradicionales.
La amplitud de este captulo se deriva de la diversidad de los productos y de las consideraciones especiales que requieren. La
fabricacin se ha dividido en dos secciones: la primera analiza los aspectos generales de la fabricacin y del desarrollo del proceso, mientras que la segunda analiza el diseo de vectores y temas sobre clases especficas. La Preparacin y Administracin In
Situ aparece despus de las secciones sobre fabricacin, ya que el manejo de estos productos en la clnica requiere una infraes-
USP 38
Informacin General / 1047 Productos de Terapia Gnica 959
tructura y experiencia profesional que no se encuentran comnmente en un hospital convencional. Las otras secciones relacionadas con la fabricacin incluyen: Mtodos Analticos; Estabilidad; Almacenamiento y Transporte; y Etiquetado. La seccin Reglamentaciones y Normas resume las pautas existentes y resalta la necesidad de desarrollar y validar nuevas metodologas para
evaluar la calidad del producto. El Glosario de Trminos presenta y define los trminos y abreviaturas usados en este captulo y
aquellos usados comnmente en este campo.
ASPECTOS GENERALES DE LA FABRICACIN

Introduccin
Materiales Auxiliares
Se puede utilizar una amplia variedad de materias primas, incluyendo materiales auxiliares, en la fabricacin de los productos. Las materias primas pueden incluir sustancias complejas tales como clulas, tejidos, fluidos biolgicos, factores de crecimiento y anticuerpos monoclonales. Algunos de estos materiales pueden mantenerse en el producto teraputico final como
sustancias activas, crioconservantes o excipientes. Un material auxiliar tiene un efecto sobre el material teraputico (por ejemplo, una citoquina puede activar una poblacin de clulas) pero no est destinado a estar presente en el producto teraputico
final. La calidad de las materias primas usadas en la elaboracin de un producto de terapia gnica puede influir en la seguridad, potencia y pureza del producto. Por lo tanto, es necesario calificar este tipo de materiales para garantizar la uniformidad y
la calidad de todos los productos de terapia gnica. Las actividades relacionadas con la calificacin de materias primas cambiarn a medida que los productos avancen por las diferentes etapas de desarrollo clnico hacia la obtencin de la autorizacin y
su comercializacin. La amplitud de un programa de calificacin bien diseado se extiende a medida que progresa el desarrollo del producto. Un programa de calificacin de materias primas utilizadas en la fabricacin de productos de terapia gnica
debe tratar cada una de las siguientes reas: (1) identificacin y seleccin, (2) aptitud para uso, (3) caracterizacin, (4) componentes derivados de animales y (5) garanta de calidad. Se debe considerar para todas las materias primas el momento y la
etapa en la que se usa cada una dentro del proceso de fabricacin debido a que puede ser til para definir criterios de seleccin. Se debe consultar el captulo de USP, Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Gnicos y de Ingeniera Tisular 1043,
para informacin especfica sobre la implementacin de un programa de calificacin apropiado para estos materiales. Otros
captulos de USP proveen informacin que se debe tomar en cuenta con respecto a la calificacin y normas de materiales auxiliares especficos (p.ej., Suero Bovino 1024, Suero Fetal BovinoAtributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad 90 y Factores
de Crecimiento y Citoquinas Usados en la Fabricacin de Productos de Terapia Celular 92).
Caracterizacin de Bancos de Clulas y de Virus

BANCOS DE CLULAS
Un banco de clulas es un conjunto de viales que contienen clulas almacenadas en condiciones definidas, con una composicin uniforme y obtenidas a partir de clulas combinadas derivadas de un nico clon celular. El sistema de bancos de clulas,
por lo general, se compone de un banco maestro de clulas (MCB, por sus siglas en ingls) y un banco de clulas de trabajo
(WCB, por sus siglas en ingls), aunque existen otras categorizaciones posibles. El MCB se produce de acuerdo con las BPFv y,
Captulos
La fabricacin de productos de terapia gnica se ha dividido en dos secciones. Esta seccin, Aspectos Generales de la Fabricacin, analiza cinco temas que se aplican a la fabricacin de todos los productos de terapia gnica: (1) materias primas, (2) caracterizacin de materiales de bancos, (3) controles durante el proceso, (4) especificaciones y (5) validacin. La segunda seccin, Fabricacin de Productos de Terapia Gnica, trata la fabricacin de vectores de terapia gnica, tanto virales como no virales, y analiza en detalle el diseo de vectores gnicos.
Todos los principios generales de las buenas prcticas de fabricacin vigentes (BPFv) establecidas por la FDA en el Ttulo 21
del CFR 210, 211, 600s (en especial el Ttulo 21 del CFR 610) y 820, y en otros captulos de USP aplican a la fabricacin de
productos de terapia gnica. Las instalaciones, equipos y procesos de fabricacin, al igual que las materias primas, sistemas de
calidad y personal capacitado son algunos de los elementos fundamentales de las BPFv. Las BPFv aplican durante todo el desarrollo clnico. Por lo regular, el nivel de control aumenta a medida que avanza el desarrollo clnico y, para el momento de iniciar la fabricacin como respaldo de la Fase III de los ensayos clnicos, se espera un cumplimiento total de las BPFv. Las instalaciones y el equipo deben disearse, edificarse y validarse cuidadosamente para sustentar el proceso de fabricacin y para mantener la segregacin requerida del producto/instalacin. El mantenimiento preventivo y la calibracin se deben llevar a cabo
de manera rutinaria en el equipo crtico. Las incubadoras, biorreactores y congeladores deben contar con sistemas de alarma
capaces de emitir seales de falla de manera remota. Se deben establecer sistemas de calidad para garantizar que la fabricacin sea uniforme y controlada. Los sistemas incluyen, de manera enunciativa mas no limitativa, lo siguiente: control de cambios, control de documentos, monitoreo del medio ambiente, capacitacin, planes maestros de validacin, anlisis y liberacin
de materias primas, aprobacin de proveedores, anlisis y liberacin de productos, pruebas de estabilidad y accin correctiva/
preventiva (CAPA, por sus siglas en ingls).
USP 38
preferentemente, se obtiene de una fuente repositoria calificada (exenta de agentes adventicios) con antecedentes conocidos y
documentados. El WCB se obtiene o produce mediante la expansin de uno o ms viales del MCB. El WCB, o el MCB en los
ensayos iniciales, se transforma en la fuente de clulas para cada partida producida para uso humano. Los sistemas de bancos
de clulas contribuyen en gran medida a la uniformidad en la elaboracin de partidas de productos clnicos o autorizados,
debido a que el material celular inicial es siempre el mismo. Los bancos de clulas usados para la preparacin de bancos de
virus o del producto clnico se deben caracterizar adecuadamente antes de su uso. Los aspectos relacionados con la elaboracin de bancos de clulas y su validacin se analizan en los captulos Productos Derivados de Clulas y Tejidos 1046, Calidad de
Productos Biotecnolgicos: Anlisis de la Construccin Expresable en Clulas Usadas para la Produccin de Productos Protenicos Obtenidos con ADN Recombinante 1048 y Evaluacin de la Seguridad Viral en Productos Biotecnolgicos Obtenidos de Lneas Celulares de Origen Humano o Animal 1050.
BANCOS DE VIRUS
Captulos
El banco de virus maestro (MVB, por sus siglas en ingls) es similar al concepto del MCB puesto que se deriva de un ciclo de
produccin nico y su composicin es uniforme. El banco de virus de trabajo (WVB, por sus siglas en ingls) deriva directamente del MVB. Tal como sucede con los bancos de clulas, el propsito de un banco de virus es contar con una fuente de
virus uniforme, libre de agentes adventicios, para su uso en la produccin de partidas clnicas o de productos. De acuerdo con
las reglamentaciones de las BPFv, las pruebas para los bancos de clulas que se utilizarn en la produccin de bancos de virus,
incluidas las pruebas de garanta de calidad, deben completarse antes de usar este banco de clulas para la produccin de
bancos de virus.
CALIFICACIN
La caracterizacin de los bancos de clulas y de virus es un paso importante para la obtencin de un producto final uniforme, manteniendo la coherencia entre lotes y la ausencia de agentes adventicios. Las pruebas para calificar los MCB o MVB se
realizan una vez y se pueden hacer con una alcuota del material del banco o con cultivos de clulas derivados del banco de
clulas. Se deben establecer especificaciones para la calificacin del MCB o MVB. Es importante documentar el historial del
MCB o MVB, los mtodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones de almacenamiento. Todas las materias
primas requeridas para la produccin de los bancoslos medios, los sueros, la tripsina y similarestambin deben someterse
a pruebas para descartar la presencia de agentes adventicios.
CALIFICACIN DEL BANCO MAESTRO DE CLULAS

La Guidance for Industry: Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy (Gua para la Industria: Terapia Celular Somtica Humana y Terapia Gnica) de la FDA (marzo 1998) proporciona recomendaciones especficas para la calificacin de los MCB. El
documento ICH Q5D ofrece pautas adicionales. Se requiere de una descripcin e historial de la lnea celular, junto con una
descripcin del proceso de congelamiento, condiciones de almacenamiento y nmero de viales preparados. La identidad de
las clulas debe analizarse usando marcadores genotpicos y/o fenotpicos. Para MCB que contienen secuencias de vectores, se
debe demostrar la presencia y la integridad del vector usando ensayos moleculares (mapeo de endonucleasa de restriccin y/o
secuenciacin de cidos nucleicos) y/o medicin de expresin gnica del vector. La pureza se debe analizar para determinar la
ausencia de contaminacin bacteriana, micoplsmica, fngica y viral (diferentes a las secuencias de vectores). La ausencia de
virus adventicios debe comprobarse utilizando pruebas de virus tanto in vitro como in vivo y pruebas adecuadas especficas
para la especie, como la prueba de produccin de anticuerpos murinos (MAP, por sus siglas en ingls). Se debe poner especial
atencin a la deteccin del virus competente para la replicacin (VCR) que surge de la recombinacin del vector y las secuencias virales. El MCB se califica adicionalmente llevando a cabo pruebas en clulas (obtenidas del MCB o del WCB) expandidas
hasta el lmite de la edad celular para produccin in vitro.
CALIFICACIN DEL BANCO DE VIRUS MAESTRO

Las pruebas para el MVB son similares a las del MCB y deben incluir pruebas para determinar la ausencia de agentes adventicios en general (tales como bacterias, hongos, micoplasmas o virus) y para organismos especficos de la lnea celular de produccin, incluyendo VCR. Las pruebas de identidad del MVB deben establecer las propiedades del virus y la estabilidad de estas propiedades durante la fabricacin.
CALIFICACIN DE BANCO DE CLULAS O DE VIRUS DE TRABAJO

La caracterizacin del WCB o del WVB generalmente es menos exhaustiva y requiere lo siguiente: (1) pruebas para determinar la ausencia de agentes adventicios que puedan haber sido introducidos durante la elaboracin del WCB, (2) pruebas para
determinar la presencia de VCR, si corresponde, (3) pruebas de identidad de rutina para verificar la contaminacin cruzada de
la lnea celular y (4) demostracin de que las alcuotas pueden ser utilizadas sistemticamente para la elaboracin del producto
USP 38
final. Con esto se asume que el WCB y el WVB se prepararon en un ambiente controlado usando medios y equipos analizados
adecuadamente para determinar la ausencia de agentes adventicios. En caso contrario, es necesario realizar pruebas de liberacin adicionales.
Controles Durante el Proceso
Tabla 2. Ejemplos de Aplicaciones de Controles Durante el Proceso

Tipo de Producto
Atributo a Controlar
Terapia gnica viral
Cantidad de virus despus del cultivo del virus

Actividad especfica de virus en fracciones obtenidas despus de una cromatografa en
columna
Cantidad de ADN de clulas anfitrionas en fracciones obtenidas despus de una cromatografa en columna
Terapia gnica no viral
Densidad ptica o cambio en el consumo de oxgeno durante el cultivo

Cantidad y forma de plsmido antes de la recoleccin del cultivo
Cantidad y forma de plsmido despus de las etapas de extraccin
Cantidad de pirgenos o endotoxinas despus de las etapas de extraccin en la combinacin de plsmidos
Especificaciones
La seleccin de especificaciones para un producto de terapia gnica debe centrarse en garantizar la seguridad y eficacia del
producto antes de su uso. Las pruebas seleccionadas deben ser especficas para cada producto y deben contar con criterios de
aceptacin adecuados a fin de garantizar parmetros de calidad uniformes y dentro de los niveles aceptables de variacin biolgica, prdida de actividad, cambios fisicoqumicos o degradacin durante la vida til del producto. El desarrollo y el establecimiento de especificaciones para productos celulares y gnicos deben respetar los principios descritos en el documento ICH
Q6B y deben cumplir con lo establecido en la Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) (Gua para Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisin de Informacin Qumica, de Fabricacin y Control (CMC, por sus siglas
en ingls) para Nuevas Aplicaciones Farmacolgicas Investigativas (IND, por sus siglas en ingls) de Terapia Gnica en Humanos) de la FDA.
El establecimiento de especificaciones para un frmaco y medicamento forma parte de una estrategia general de control de
fabricacin que incluye el control de materias primas, excipientes y bancos de clulas y virus; anlisis durante el proceso; evaluacin y validacin del proceso; pruebas de estabilidad; y anlisis de uniformidad de lotes. Al combinarse estos elementos se
tiene la garanta de que el proceso est controlado y que se mantienen los atributos clave de calidad del producto. Las especificaciones adecuadas se establecen a partir de una caracterizacin minuciosa del producto durante la fase de desarrollo y de la
comprensin del proceso y su capacidad. La caracterizacin incluye mediciones de las propiedades fisicoqumicas, la seguridad, la pureza, las impurezas derivadas del proceso y del producto, la potencia, la viabilidad, la esterilidad y la cantidad. Las
especificaciones para cada producto y sus ingredientes se deben desarrollar a partir de esta informacin mediante la aplicacin
de mtodos estadsticos apropiados. La informacin debe incluir lotes utilizados en estudios preclnicos y clnicos, adems de
datos de validacin de procesos y valoraciones, que pueden guardar correlacin con las evaluaciones de seguridad y eficacia.
Las especificaciones deben incluir las variabilidades inherentes mostradas por el proceso de produccin y las valoraciones. Para
estos tipos de productos, puede ser necesario volver a examinar algunas de las especificaciones de liberacin de lotes que por
lo general se aplican a productos biolgicos.
Captulos
Los procesos de fabricacin deben incluir criterios bien definidos para decidir si se avanza o no se avanza, que se aplican a
los productos intermedios clave del proceso y se utilizan para combinar el material que ha atravesado una etapa del proceso
en varios sublotes. La calidad debe incorporarse al producto adems de probarse durante la liberacin de la partida. Los controles en proceso son valoraciones o pruebas realizadas para garantizar que la calidad y la cantidad del producto intermedio en
proceso sean suficientes para fabricar un producto final de buena calidad. En la Tabla 2 se incluyen ejemplos de controles durante el proceso. Los controles durante el proceso se realizan principalmente para asegurar la obtencin del producto correcto
con la calidad y el rendimiento previstos. El material intermedio del proceso que no cumple con los criterios de control durante
el proceso no debe usarse para la fabricacin adicional. Este material se puede reprocesar cuando se cuenta con procedimientos para tales actividades. El material reprocesado debe cumplir con las especificaciones de proceso originales antes de que
pueda usarse para fabricacin adicional. Si se van a combinar varios sublotes para procesamiento adicional, los sublotes que no
cumplan con los criterios no se podrn incluir, an si la combinacin que contiene esos sublotes cumpliera con los criterios de
los ensayos de proceso. Durante el desarrollo clnico, los ensayos de calidad y rendimiento del producto se deben efectuar despus de la mayora de los pasos del procesamiento a efectos de determinar cules son los pasos crticos y cules los ensayos
ms sensibles a desviaciones del proceso. La informacin as obtenida tambin se utiliza para establecer los criterios para los
ensayos seleccionados. Los controles de proceso se realizan para la validacin completa de los procesos y para asegurar que
continen bajo control. Los resultados de estos ensayos deben someterse a un anlisis de tendencia y se deben tomar medidas
para corregir los problemas cuando stos surjan.
Captulos
USP 38
Los procedimientos en una especificacin para el producto se sustentan mediante estndares de referencia apropiados. El
estndar de referencia para el producto garantiza que ste ltimo, segn lo determinado por los ensayos de liberacin, no
cambie significativamente con el tiempo. El estndar de referencia se fabrica usando el mismo proceso que para la produccin
clnica y se somete a todas las pruebas durante el proceso y de liberacin final. Asimismo, el estndar de referencia se somete a
caracterizacin adicional que no se lleva a cabo comnmente como parte de la liberacin del lote. El estndar de referencia no
requiere ser almacenado en la misma dosis, formulacin o temperatura que el producto, aunque es necesario determinar su
estabilidad. El estndar de referencia verifica que una prueba produzca resultados aceptables (que cumpla con las pruebas de
aptitud del sistema). Es posible usar un estndar de valoracin especfico (estndar de trabajo) en la prueba; sin embargo, debe calibrarse en funcin del estndar de referencia y su comportamiento debe ser similar. El cambio a un nuevo estndar (lote)
de referencia debe incluir muchas pruebas y todas ellas se deben realizar paralelamente al estndar de referencia existente. Se
debe evaluar cuidadosamente el impacto de cualquier cambio en las propiedades del nuevo estndar de referencia antes de
ser adoptado.
Pueden ser necesarias especificaciones adicionales para producir un producto de terapia gnica seguro y efectivo. Dichas especificaciones pueden relacionarse con algunos de los controles y lmites de accin usados para mantener los estndares y la
uniformidad de materias primas, excipientes y del proceso de fabricacin (ver Materiales Auxiliares y Controles Durante el Proceso). Se deben establecer especificaciones para permitir la aceptacin de las materias primas y excipientes utilizados en la formulacin final del producto. Asimismo, deben realizarse pruebas en las etapas de fabricacin que requieren tomar decisiones
crticas o en etapas en las que la informacin obtenida sirve para confirmar la uniformidad del proceso. Deben establecerse
especificaciones de liberacin para cada control del proceso. La heterogeneidad puede resultar del proceso de fabricacin o
almacenamiento del producto. Por lo tanto, el fabricante debe definir el patrn de heterogeneidad dentro del producto y debe
establecer lmites que mantengan la eficacia teraputica y la seguridad del producto.
En algunos casos, se pueden establecer especificaciones para liberacin del lote as como para la vida til. Conforme a lo
analizado en el documento ICH Q5C y en el captulo Calidad de Productos Biotecnolgicos: Pruebas de Estabilidad de Productos
Biotecnolgicos o Biolgicos 1049, el uso de diferentes especificaciones se debe respaldar con informacin suficiente para demostrar que el rendimiento clnico no resulta afectado. Los criterios de aceptacin se deben establecer y justificar a partir de
los datos obtenidos de lotes usados en estudios preclnicos y clnicos, y de lotes utilizados para demostrar la uniformidad en la
fabricacin, y a partir de datos de desarrollo pertinentes, como los surgidos de procedimientos analticos validados y estudios
de estabilidad. Los criterios de aceptacin se deben correlacionar con evaluaciones de seguridad y eficacia.
Una vez que se han establecido las especificaciones, los resultados de prueba deben someterse a un anlisis de tendencias.
Los resultados fuera de especificacin (OOS, por sus siglas en ingls)o incluso aqullos que estn fuera de la tendencia
deben ser investigados antes de considerar el material para procesamiento adicional. El objeto de esta investigacin es determinar la causa del resultado discordante. El documento Guidance for Industry: Investigating Out of Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production [Gua para la Industria: Investigacin de Resultados de Pruebas Fuera de Especificacin en la
Produccin Farmacutica] de la FDA ofrece un enfoque sistemtico para llevar a cabo una investigacin. Un resultado de ensayo puede rechazarse cuando se confirma que se ha presentado un error, tal como un error del analista, de clculo o fallo del
equipo. Si la investigacin determina que el producto est fuera de la especificacin, el lote debe ser rechazado. En situaciones
excepcionales, es posible que se deba administrar a un paciente un producto que no cumpla con todas las especificaciones.
No obstante, deben existir procedimientos establecidos para la comunicacin de los resultados OOS al mdico o a la persona
responsable de decidir si se utiliza o no el producto, y para dar indicaciones sobre pruebas de seguimiento, monitoreo del paciente y comunicacin de dichos resultados.
Consideraciones de Validacin
El potencial para producir una amplia variacin biolgica en productos de terapia gnica, particularmente en tratamientos
para pacientes especficos, afecta el proceso de validacin. No obstante, los principios bsicos de validacin del proceso para
cualquier producto biolgico, incluidas las recomendaciones de la ICH, de los documentos gua de la FDA, de los captulos
Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225 y Validacin de Recuperacin Microbiana de Artculos Farmacopeicos 1227,
aplican a la validacin de la mayora de los productos de terapia gnica. Las pautas para la validacin de vacunas virales pueden ser pertinentes para los procesos de terapia gnica que producen vectores virales. Las etapas de retencin en un proceso
de fabricacin deben ser validadas para garantizar que los productos intermedios del proceso estn dentro de la especificacin
y que sea posible mantener los atributos de calidad del producto final. Es necesario validar los ensayos de liberacin del producto antes de producir los materiales para los ensayos clnicos clave de la Fase III.
La validacin del proceso demuestra que las operaciones unitarias del proceso de fabricacin se llevan a cabo de manera
uniforme y pueden generar un producto de calidad que cumpla con las especificaciones. Debido a que los procesos biolgicos
son propensos a variaciones, la uniformidad y robustez del proceso de fabricacin deben determinarse validando el proceso en
al menos tres lotes. Los aspectos relacionados con la validacin del proceso relevantes para los productos derivados de clulas
se tratan en el captulo 1046.
Siempre que sea posible, se debe validar el proceso con respecto a la depuracin del virus de acuerdo con los principios
discutidos en el documento ICH Q5A. Si lo anterior se complica debido a la naturaleza del vector para terapia gnica (p.ej.
virus con envoltura), se debe considerar la caracterizacin adicional de clulas y componentes derivados de animales usados en
el proceso de produccin. Cuando el producto de terapia gnica se elabora en una instalacin en la que se fabrican productos
USP 38
mltiples, se debe validar la limpieza del equipo y de los cuartos para productos mltiples, a fin de demostrar la efectividad de
los agentes de limpieza para inactivar o eliminar virus.
FABRICACIN DE PRODUCTOS DE TERAPIA GNICA

Introduccin
Los principios de fabricacin de productos farmacuticos o biolgicos tambin son pertinentes al desarrollo de vectores de
terapia gnica para uso en seres humanos. Se aplican los mismos requisitos de la BPFv para garantizar la administracin al paciente de un producto de alta calidad. Debido a la naturaleza de los sistemas de fabricacin de productos de terapia gnica, la
mayora de los fabricantes se enfrentan con problemas de desarrollo tales como la capacidad de produccin en escala, el rendimiento, la rentabilidad y la estabilidad del producto.
La mayora de los vectores para terapia gnica se producen nicamente en partidas relativamente pequeas, necesarias para
satisfacer las necesidades de los ensayos clnicos iniciales que se llevan a cabo en un pequeo nmero de pacientes. No obstante, la promisoria aplicacin de terapia gnica en poblaciones ms grandes de pacientes ha generado el progreso de la produccin a escala y de la tecnologa de purificacin. Esta seccin se enfoca en el diseo de vectores para terapia gnica, as
como en la seleccin de tecnologas de produccin adecuadas.
Consideraciones de Diseo para Vectores Gnicos

TIPOS DE VECTORES
Tabla 3. Tipos de Vectores Gnicos

Viral
Familia
Retroviridae
Ejemplos de
especies
Virus de
la Leucemia Murina
No viral
Adenoviridae
Parvoviridae
Herpesviridae
Togaviridae
Poxviridae
Sindbis
Poxvirus
(Vaccinia)
Plsmido
derivado
5 kb
2550 kb
12 kb
No
S, pero a muy
baja frecuencia
Transitorio
Transitorio
Estable o transitorio
VIH
Adenovirus
VAA
Virus del
Herpes
Simple
8 kb
4,334 kb
45 kb
40150 kb
No,
episomal
Puede ser inte- Puede ser integrado o epigrado o epiNo

somal
somal
Estable
Caractersticas del Vector

Lmite de tamao de insercin
Integracin al
cromosoma
Expresin teraputica
8 kb
S
Estable
Estable
Localizacin del
vector
Ncleo
Ncleo
Ncleo
Ncleo
Ncleo
Citoplasma
Citoplasma
Ncleo
Tipos de clulas
transducidas
nicamente
en divisin
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
En divisin y
quiescentes
Eficiencia de la
transferencia
gnica
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Alta
Baja
Captulos
Un vector de terapia gnica por lo general consta de: (1) el esqueleto del vector; (2) un promotor; (3) el gen teraputico, ya
sea como ADNc o secuencia genmica; y (4) una seal de poliadenilacin. Se ha desarrollado una amplia variedad de virus
incluidos los retrovirus murinos y humano, adenovirus, parvovirus tales como el VAA, virus del herpes, poxvirus, virus toga y
sistemas de terapia con plasmidos no virales para aplicaciones de terapia gnica. Estos vectores (ver la Tabla 3) tienen capacidades muy diferentes en lo que respecta al transporte de material gentico y la duracin de la expresin. Algunos vectores
virales se dirigen, por preferencia, a clulas en divisin, mientras que otros son capaces de transducir clulas en divisin o clulas que no estn en divisin. Existen algunas variaciones importantes en la capacidad transgnica (es decir, se presentan limitaciones en cuanto al tamao del fragmento extrao de ADN que se puede incorporar al genoma del vector). La magnitud, el
momento y la duracin de la expresin gnica requeridos para un producto de terapia gnica dependen de la indicacin clnica. Para algunas enfermedades como la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA) o la hemofilia tipo A o tipo B, puede ser
necesaria una expresin gnica prolongada de bajo nivel. La expresin breve de alto nivel puede ser ms apropiada para el
cncer, cuando se emplean genes que inducen la apoptosis o para enfermedades cardiovasculares cuando la prevencin de la
hiperproliferacin de clulas musculares lisas puede impedir la reestenosis de injertos de vena safena.
USP 38
Tabla 3. Tipos de Vectores Gnicos (Continuacin)

Viral
Familia
Retroviridae
Ejemplos de
especies
Virus de
la Leucemia Murina
No viral
Adenoviridae
Parvoviridae
Herpesviridae
Togaviridae
Poxviridae
Sindbis
Poxvirus
(Vaccinia)
Plsmido
derivado
No
VIH
Adenovirus
VAA
Virus del
Herpes
Simple
No
S, a menos que
se supriman
los genes virales
No
Caractersticas del Vector

Expresin de
protenas virales
Otros
No
Se puede usar
como un sistema de terapia con plsmidos
El tropismo se puede alterar

mediante seudotipificacin
Captulos
CRITERIOS PARA EL DISEO DE VECTORES

Se estn desarrollando muchos tipos de vectores para terapia gnica y el vector seleccionado para una aplicacin clnica en
particular depende del estado de la enfermedad, de la clula blanco y de la va de administracin prevista. Conforme a lo mostrado en la Tabla 3, la capacidad depende del tipo de vector, por lo que las aplicaciones clnicas que requieren de una gran
cantidad de material gentico limitarn la seleccin del sistema de vectores. La carga til de un sistema de vectores adquiere
mayor importancia cuando se disean vectores con ADN genmico o un vector que contiene secuencias reguladoras extensivas.
Los vectores tambin se seleccionan basndose en la duracin pretendida de la expresin y de la clula blanco. Por ejemplo,
los vectores retrovirales se integran de manera estable en las clulas blanco y, por lo tanto, se adaptan bien a las clulas madre
o linfocitos que se espera experimentarn una divisin celular extensiva. Por el contrario, los vectores adenovirales y plasmdicos son episomales y se pueden perder durante la divisin celular. No obstante, los vectores adenovirales son atractivos para el
desarrollo de vacunas y en aplicaciones contra el cncer cuyo objetivo es eliminar las clulas tumorales. Otros vectores tales
como el VAA, no presentan una integracin de alta eficacia, pero se pueden expresar a largo plazo en clulas que no estn en
divisin, como por ejemplo neuronas o hepatocitos.
El tipo de clula blanco tambin tiene un papel importante en la seleccin de un sistema de vectores apropiado (ver Transduccin Dirigida). Por ejemplo, el adenovirus Coxsackie B y receptor de adenovirus (CAR, por sus siglas en ingls) se expresa
pobremente en tejidos hematopoyticos, lo cual limita la utilidad del sistema de vectores para clulas hemoderivadas. Los vectores basados en retrovirus murinos requieren del ciclo celular y no se ajustan bien a la transduccin de clulas que no estn en
divisin tales como las neuronas.
El sistema inmune puede dirigir tanto a los componentes virales del vector como al transgn expresado. La presencia de
anticuerpos preexistentes o inmunidad celular para ciertos sistemas de vectores pueden limitar su utilidad. Los vectores pueden
desencadenar una respuesta inmune innata que podra reducir la eficacia de la transferencia gnica e inducir un evento adverso severo. Existe un gran nmero de metodologas de terapia gnica actuales que buscan limitar la toxicidad y la respuesta
inmune mediante la administracin del vector a clulas ex vivo. Sin embargo, la mayora de las enfermedades aptas para terapia gnica requerirn la aplicacin in vivo, mientras que la investigacin en curso busca vectores con reconocimiento inmune
limitado.
La va de administracin y la manipulacin de la dosis total del vector son estrategias que se pueden usar para compensar
algunas limitaciones de sistemas de vectores especficos. Adems, existen ventajas y desventajas para la fabricacin de cada
uno de los diferentes sistemas de vectores que se deben considerar al momento de planear una aplicacin clnica. La uniformidad de la produccin favorece a los sistemas de fermentacin o cultivo bien definidos, tales como vectores plasmdicos, retrovirales o adenovirales. Para los sistemas de vectores virales que requieren funciones colaboradoras (ver ms adelante), una lnea
celular racionalmente diseada puede superar las limitaciones de la capacidad de produccin en escala y de la uniformidad
impuestas por las cotransfecciones. El empleo de una lnea celular que se adapte al cultivo en suspensin puede influir sobre la
capacidad de produccin en escala y la rentabilidad.
TRANSDUCCIN DIRIGIDA
Para que un vector sea eficaz, en primer lugar, tiene que hallar y transducir su clula blanco. Los virus poseen una gama de
anfitriones naturales que est muy influenciada por los niveles de expresin de receptores especficos en la superficie celular, la
fase actual del ciclo celular y la va de administracin. Las integrinas son una clase de receptores de adhesin celular que inter-
USP 38
INFLUENCIA DEL COMPLEMENTO Y DEL SISTEMA INMUNE HUMORAL

Una de las barreras ms importantes para la transferencia gnica eficaz es la respuesta inmune humoral hacia el vector. Independientemente de la va de administracin, de la clula blanco prevista y de la dosis, es probable que el vector encuentre
algn componente del sistema inmunitario. En el caso de los vectores virales, el sistema inmunitario humoral no puede distinguir con facilidad entre infecciones por virus salvajes y vectores virales recombinantes, porque la respuesta humoral est dirigida contra protenas en la envoltura o cpside viral. Las formulaciones de vectores no virales que contienen protenas tambin
pueden desencadenar una respuesta inmunitaria humoral. Se pueden presentar respuestas humorales especficas o de reaccin
cruzada preexistentes debido a la exposicin natural a versiones salvajes de vectores virales o bien pueden desencadenarse durante la administracin, y la respuesta de los anticuerpos puede variar en cuanto a la capacidad para disminuir la transduccin
gnica en ciertos pacientes. Como la capacidad neutralizadora suele aumentar con las dosis mltiples, la administracin repetida tambin puede ser problemtica. Algunos de estos problemas se pueden remediar mediante el uso de sistemas no virales.
Sin embargo, el nivel de eficacia de transduccin de estos vectores actualmente no es suficiente para muchas de las aplicaciones de transferencia gnica. La eficiencia de transduccin de todos los vectores tambin se ve comprometida de manera importante por el sistema de complementos. Muchas protenas de complemento tienen una afinidad natural por las protenas de
Captulos
actan con la base del pentn o la protena de la fibra de los adenovirus. Las protenas de la fibra y de la base del pentn de
adenovirus median la unin al CAR, al CD46 y a las integrinas. Los virus asociados a adenovirus interactan primeramente con
receptores de heparn sulfato proteoglicano y cido silico en la superficie de las clulas. Sin embargo, es necesaria la interaccin con los receptores secundarios tales como integrinas, laminina y factores de crecimiento para el ingreso eficiente de las
clulas y el trfico de partculas de virus hacia el ncleo. Una variante anfotrpica del virus de la leucemia murina (VLM) comnmente usada para aplicaciones de terapia gnica, emplea la molcula transportadora de fosfato dependiente de sodio
RAM-1 para ingresar a blancos celulares. Los niveles de expresin de cada uno de estos receptores varan de acuerdo con el
tipo de tejido, el cual dictamina la eficiencia de transduccin del vector.
La gama de anfitriones y tejidos se puede modificar o dirigir mediante manipulacin bioqumica y gentica del vector. A lo
largo de la seudotipificacin gentica, se llevan a cabo muchas alteraciones en la especificidad celular y tisular de retrovirusy
particularmente lentivirus. Durante este proceso, las protenas de envoltura que dictaminan la unin e ingreso de virus mediante un receptor celular especfico de un virus se reemplazan con la protena de envoltura de otro retrovirus o con una protena
de un virus totalmente distinto tal como la glucoprotena del virus de la estomatitis vesicular. La complejidad relativa de las
cpsides de adenovirus y de virus asociados con adenovirus permite modificarlas genticamente de diferentes maneras. La sustitucin de una protena de un solo virus (p.ej., fibra de adenovirus o AVV VP1, por sus siglas en ingls) por una de otro serotipo dentro de la misma familia es muy parecida al proceso de seudotipifiacin para retrovirus. No obstante, las partculas de
virus en mosaico que se crean intercalando protenas de cpsides individuales de varios serotipos virales distintos en un virin,
y las partculas quimricas creadas por protenas de cpsides de dos serotipos distintivamente diferentes en una partcula de
algn otro serotipo (p.ej., pentn de adenovirus 35 en fibra de adenovirus 41 en una partcula de adenovirus 5) pueden cambiar efectivamente los tipos de clulas y tejidos que puede transducir un vector. Aunque esta metodologa puede parecer sencilla, algunas modificaciones de protenas de la cpside viral a nivel gentico no facilitan la formacin de partculas virales. A
pesar de que la mayora de las modificaciones mejoran la captacin de virus en un blanco celular especfico, tambin pueden
incrementar la captacin en algunos otros tejidos en los que no es deseable la transferencia gnica. Por consiguiente, se debe
considerar y analizar cuidadosamente la seleccin de protenas y ligandos en modelos preclnicos de enfermedades antes de
que estos vectores puedan usarse ampliamente.
Las protenas del revestimiento viral y los vectores no virales se pueden modificar qumicamente para dirigirlos hacia receptores mediados por ligandos. Se pueden conjugar con ligandos dirigidos a las clulas mediante interacciones anticuerpovirus
con anticuerpos biespecficos. Los puentes moleculares como los complejos de biotinaavidina y los entrecruzadores qumicos
tales como polietilenglicol (PEG) bifuncional ligados a protenas unidas al receptor especficas de la clula se conjugan fcilmente con partculas virales y a menudo se incorporan en estrategias de direccin. Estas metodologas se pueden combinar
y/o intercambiar fcilmente con modificaciones genticas y con los dems para crear vectores dirigidos efectivamente a varios
receptores. Aunque la metodologa bioqumica evita complicaciones funcionales en la introduccin de dominios extraos en
las protenas virales, cada lote de vector se debe modificar puesto que la progenie del virus se restaurar a su tropismo original
codificado genticamente. Los procesos bioqumicos tambin requieren el uso de mltiples reactivos, lo que puede complicar
la transferencia al sitio clnico.
Otra estrategia comn y efectiva para dirigir vectores virales a clulas tumorales toma ventaja del ciclo de replicacin del
virus. La supresin de genes crticos para la toma de los puntos de control de clulas funcionales para respaldar la replicacin
normal de virus permite que el virus se replique nicamente en clulas cancerosas cuando aquellos puntos de control son defectuosos o inactivos. Este efecto se puede mejorar an ms creando pequeas mutaciones en genes para replicacin de virus
dirigidos por promotores especficos para ciertos tumores y tejidos. Con respecto al ciclo celular, los adenovirus y los virus asociados con adenovirus infectan fcilmente clulas quiescentes y en divisin, mientras que los vectores retrovirales basados en el
virus de la leucemia murina son eficaces slo cuando transducen clulas en divisin rpida. Los vectores lentivirales pueden
infectar clulas quiescentes, como las de origen neuronal. En general, los vectores no virales pueden entrar a clulas en divisin
y que no estn en divisin pero tienen una eficacia de transduccin menor que los vectores virales. La eficacia de transduccin
de vectores no virales se puede mejorar mediante la formulacin e inyeccin directa en el tejido de inters.
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Captulos
la cpside viral. Esta interaccin inicia la liberacin de citoquinas y quimiocinas que facilitan la rpida eliminacin del vector de
la circulacin sistemtica. La afinidad por lo general se eleva (especialmente en el caso de retrovirus) cuando las protenas celulares no humanas y los componentes de cultivo (p.ej., suero fetal bovino) se incorporan y/o recubren la partculas del virus
durante la produccin a gran escala. El uso de lneas de clulas productoras de origen humano y de condiciones de cultivo
exentas de suero ha disminuido la inactivacin de vectores mediante complemento.
Se han desarrollado diversas estrategias para mitigar y evitar la respuesta inmune humoral y la inactivacin del complemento. Incrementar la dosis de vector para compensar la actividad neutralizante de los anticuerpos y alterar los regmenes de dosificacin para que coincidan con periodos de bajos ttulos de anticuerpos son las opciones lgicas, pero la posible toxicidad
asociada con altas dosis de virus y la variabilidad individual de la respuesta inmune son consecuencias negativas potenciales de
esta metodologa. Como alternativa, los vectores virales se pueden disear de modo que eludan el sistema inmunitario. Una
metodologa consiste en aumentar la expresin de genes virales especficos que permiten al virus evadir la respuesta humoral
del anfitrin. Los virus recombinantes construidos de serotipos con velocidades de exposicin limitadas tales como el adenovirus simiano 7 pueden evitar la neutralizacin en aquellos expuestos previamente a serotipos ms comunes. Los virus del mosaico y quimricos tambin pueden evitar la neutralizacin. Ambas metodologas tratan efectivamente los aspectos de la transferencia gnica eficaz en aquellos con inmunidad preexistente, aunque ambas requieren de investigacin adicional en respuesta
a las inquietudes relacionadas con la seguridad y la produccin a gran escala as como la induccin de respuestas inmunes en
poblaciones de pacientes que no han sido previamente sometidos a infeccin. La unin covalente de polietilenglicol (PEGilacin) a la cpside viral puede proteger a los virus de la neutralizacin y cortar la respuesta inmune. Los mtodos farmacuticos
tales como fijacin de vectores virales en matrices de polmero y la administracin de vectores a la mucosa (oral y nasal) tambin pueden proteger a los vectores virales de la respuesta inmune humoral.
INFLUENCIA DE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR

Una vez iniciada la expresin transgnica, la respuesta inmune celular elimina rpidamente clulas transducidas por vectores
virales y no virales. Esto reduce la efectividad teraputica general de la transferencia gnica de dosis de vector bajas a moderadas y puede ser altamente txico cuando se administran dosis mayores. No se requiere de sntesis de protena activa para la
respuesta inmune celular a protenas de la cpside viral. Por ejemplo, las protenas de la cpside de vectores de VAA recombinante han mostrado longevidad, lo cual genera una respuesta inmune retardada y la eliminacin de clulas transducidas por
vectores. La sntesis de novo de productos gnicos virales tambin puede exacerbar las respuestas celulares del anfitrin. Se
han diseado vectores virales con supresiones especficas del esqueleto para eliminar la expresin de genes de estructura viral y
reducir este efecto. Entre los ejemplos de dichos vectores se incluyen adenovirus sin genes virales (gutless), virus del herpes y
los virus asociados con adenovirus en los que todos los genes virales han sido suprimidos, lo que los vuelve dependientes de
otro virus colaborador para su replicacin posterior. Algunas secuencias de plsmidos, en especial aquellas con dinucletidos
CpG no metilados, pueden desencadenar una fuerte respuesta inmune celular y se han usado como adyuvantes en algunas
vacunas basadas en ADN. La amplificacin de plsmidos en bacterias que expresan la metilasa CpG (M.SssI), la eliminacin de
secuencias CpG mediante mutagnesis dirigida y la eliminacin de secuencias procariticas innecesarias para crear plsmidos
mnimos han reducido la incidencia de respuestas celulares indeseadas. Una metodologa no molecular para minimizar la respuesta celular contra el vector implica el uso de inmunosupresores (ciclosporina, sirolimus, dacluzumab) al momento de la administracin inicial del vector, adems de los mtodos para reducir la respuesta humoral (uso de vectors quimricos, PEGilacin) descritos anteriormente.
ANTIGENICIDAD DEL PRODUCTO DE TERAPIA GNICA

En muchos casos, el producto de terapia gnica, los promotores asociados y los elementos mejoradores son antignicos en
algunos blancos celulares. Cuando se utilizan protenas que son retenidas en la clula blanco, las respuestas celulares pueden
eliminar la clula blanco. Si se necesita una expresin proteica sostenida, la respuesta inmune celular puede disminuir la eficacia de la terapia o abolirla por completo. En lo que respecta al tratamiento de enfermedades genticas, los pacientes con mutacin nula que nunca han visto el producto transgnico, pueden presentar un mayor riesgo de respuesta inmune que los pacientes que producen una protena defectuosa Asimismo, truncar un gen, como el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR, por sus siglas en ingls) para alojarlo en un vector elegido puede resultar en la creacin de un
antgeno distinto.
En otras aplicaciones, el producto transgnico es una protena extraa, p.ej., timidina kinasa derivada del virus del herpes
simple (VHS) y que, por lo tanto, puede desencadenar una respuesta inmune. En algunos casos, ste es el efecto teraputico
deseado, particularmente en la inmunoterapia antignica contra el cncer o una enfermedad viral. Los esfuerzos para minimizar la respuesta inmune contra los elementos asociados con el casete transgnico incluyen el diseo de vectores con la capacidad de realizar secuencias humanizadas de longitud completa para el transgn en cuestin, as como la administracin de inmunosupresores en la dosis inicial y en otros intervalos a lo largo del protocolo de tratamiento.
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LOCALIZACIN DEL VECTOR DENTRO DE LA CLULA BLANCO

Una vez que el vector llega a la clula blanco, varios factores pueden alterar la magnitud y la duracin de la expresin gnica
teraputica; estos factores rigen la eleccin de un sistema apropiado de vectores para una indicacin clnica especfica. La localizacin del genoma del vector dentro de la clula, la fuerza de los elementos de control de la expresin gnica, la estabilidad
del mensaje y la estabilidad de la protena traducida influyen en el efecto teraputico. Los vectores basados en Alfavirus, como
los que provienen del virus Sindbis o el virus del bosque Semliki, residen en el citoplasma y normalmente presentan un nivel
muy alto de expresin gnica. Los vectores retrovirales, adenovirales o de otros virus otorgan ventajas en la administracin
gnica, con sus mecanismos naturales para la distribucin nuclear del gen teraputico y niveles razonables de expresin gnica
a partir de promotores virales o de otro tipo. Los vectores plasmdicos no virales son episomales y, con frecuencia, susceptibles
a la degradacin del ADN cuando se introducen en los endosomas celulares. Sin embargo, algunos sistemas no virales incorporan seales que los dirigen hacia el ncleo con el propsito de incrementar la eficiencia de la transcripcin gnica teraputica.
EXPRESIN ESPECFICA DE TEJIDOS
IMPACTO DEL ESTADO DE REPLICACIN DEL VECTOR

El estado de replicacin es otra consideracin importante para el diseo y la seleccin del vector. Los vectores virales suelen
construirse de modo que presenten una replicacin incompetente o defectuosa para limitar su propagacin descontrolada y su
patogenicidad. No obstante, la capacidad para replicarse y propagarse dentro de una poblacin de clulas especfica, p.ej.,
dentro de un tumor o en sitios metastticos, puede significar una ventaja teraputica importante sobre las clulas de tipo especfico blanco de vectores con replicacin incompetente o defectuosa. La replicacin se puede modificar mediante ingeniera
para condicionarla cuando, por ejemplo, interacciones especficas de genes virales se corresponden con los objetivos de la va
intracelular por medio de supresiones dirigidas y/o cambios en el control de transcripcin o translacin. Cuando estas vas intracelulares son defectuosas o estn ausentes, como en las clulas cancerosas, el virus se puede replicar en ellas, pero cuando la
clula funciona normalmente, la replicacin viral est reprimida. Entre los virus que han sido modificados por ingeniera gentica para replicacin oncoltica selectiva se incluyen: adenovirus, VHS, vaccinia, virus de sarampin, picornavirus, virus de la influenza, virus Coxsackie y virus Sendai. Algunos virus que no se modifican genticamente son inherentemente oncolticos en
clulas humanas, p.ej., reovirus y el virus de la enfermedad de Newcastle.
Uno de los riesgos inherentes en el uso de vectores virales que se replican condicionalmente es que dichos sistemas pueden
presentar fugas, es decir, que el crecimiento del virus no se encuentra absolutamente restringido a un slo tipo de clulas.
Adems, las rondas subsiguientes de viremia se vuelven aspectos a considerar durante la evaluacin de la distribucin/exposicin y desprendimiento del tejido. La promisoridad teraputica de estas metodologas depende de la confiabilidad con la que
se pueda seleccionar o modificar por ingeniera la condicionalidad de la replicacin. Este potencial teraputico podr lograrse
nicamente si se equilibra con etapas para controlar los riesgos potenciales para pacientes (asociados con la competencia de la
replicacin de los virus/vectores virales) y para tratar los problemas relacionados con el desprendimiento por exposicin a terceros y las consideraciones ambientales.
Una contribucin proactiva con el perfil de seguridad, y que al mismo tiempo toma ventaja de la informacin cientfica y
clnica actualmente disponible, consiste a menudo en usar como esqueleto del vector las cepas de virus que han sido usadas
para vacunas humanas. No obstante, debido a que el producto es competente para la replicacin, presenta desafos tcnicos
especficos para anlisis de agentes adventicios y caracterizacin del producto.
Los vectores no virales normalmente se disean como sistemas no replicantes, pero algunos grupos estn realizando experimentos con plsmidos no virales replicantes para incrementar los niveles de expresin gnica (debido a la baja eficacia de
transduccin de la mayora de los sistemas no virales) y para incrementar la duracin de la expresin gnica. Se necesitan ms
estudios preclnicos para establecer la seguridad de estos sistemas. Asimismo, se han diseado cromosomas artificiales para
aprovechar los mecanismos normales a fin de conservar la expresin gnica en clulas blanco que se dividen rpidamente.
Captulos
Otra manera de controlar la expresin gnica es la incorporacin de promotores especficos de tejidos para estimular o limitar la expresin del gen teraputico. Lamentablemente, muchos promotores especficos para tejidos no proveen altos niveles
de expresin gnica y la incorporacin de estas secuencias en vectores virales puede resultar en la prdida de especificidad o
en una expresin de bajo nivel en clulas que el promotor normalmente no expresa. Marcar el vector con secuencias reconocidas por el sistema de microARN tambin ha permitido la expresin especfica de tejidos y puede ofrecer un control ms estrecho que el comnmente obtenido con sistemas de promotores especficos de tejidos.
En la actualidad, se usan promotores que responden a frmacos para controlar la expresin gnica. Se han utilizado sistemas
de seleccin (teton) con rapamicina, mifepristona y tetraciclina para reprimir la expresin gnica. Este tipo de regulacin es
particularmente til cuando la expresin constitutiva del transgn vector es txica.
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INTEGRACION DEL VECTOR

La duracin de la expresin gnica tambin es una funcin de la persistencia del genoma del vector en clulas blanco. Los
vectores retrovirales pueden integrarse de manera estable al genoma de las clulas anfitrionas, lo que provee una expresin
prolongada. Los adenovirus y los vectores plasmdicos no virales, p.ej., aquellos que no se administran usando electroporacin,
no se integran y la expresin por lo general decae con el tiempo. Los vectores de VAA recombinante por lo regular no se integran, y cuando llegan a hacerlo, esto no ocurre en sitios especficos. Sin embargo, se han observado episomas estables en algunos tipos de clulas, tales como clulas musculares.
La integracin especfica de sitio puede ser una caracterstica deseable para vectores destinados a corregir trastornos genticos. El control del sitio de integracin es conveniente para prevenir la mutagnesis por insercin, aunque en la actualidad, esto
no tiene la eficacia suficiente para ser considerado til. La mutagnesis por insercin posee el potencial de matar una clula si
un gen de funcionamiento crtico se inactiva, o de predisponer la clula a una transformacin maligna si un gen supresor de
tumores est inactivado. Los elementos promotores o mejoradores con vectores pueden conllevar la activacin de oncogenes
celulares y se han asociado con la transformacin maligna en nios que estn siendo sometidos a transferencia gnica retroviral para inmunodeficiencia combinada severa entrecruzada.
El xito de cualquier producto de terapia gnica depende de la relacin entre el sistema de administracin de vectores y los
requisitos de la enfermedad con respecto al sitio, nivel y duracin de expresin gnica teraputica. En la actualidad resulta
improblable un vector universal, por lo que el desafo se centra en ajustar uno de varios vectores posibles a la enfermedad y al
gen que se va a administrar.
Captulos
Estrategias de Fabricacin y Purificacin

CONSTRUCCIN DEL VECTOR
Los vectores de transferencia de genes virales y no virales se construyen mediante protocolos estndar de biologa molecular.
Para los vectores virales, el esqueleto del vector consiste en secuencias de ARN o ADN viral de las que se han suprimido las
regiones que codifican genes con estructura viral o las regiones para replicacin. La regin suprimida del vector por lo regular
se modifica con sitios especficos de endonucleasa de restriccin que permiten la insercin del gen de inters. Para los vectores
no virales, el esqueleto del ADN plasmdico contiene mltiples sitios de restriccin para clonacin, as como los elementos bacteriales necesarios para produccin de plsmidos. Los esqueletos de los vectores pueden albergar inserciones de genes nicas o
mltiples, segn la cantidad mxima de secuencia que puedan llevar. El promotor que facilita la transcripcin del gen insertado puede ser un promotor viral relacionado, tal como una repeticin terminal larga del virus de la leucemia murina (MuLV
LTR) o un promotor heterlogo que es especfico del tejido, como el promotor alfa del cristalino (del ojo), o constitutivo, como
el promotor gnico tardo de citomegalovirus (CMV). Por ejemplo, en una construccin de vectores retrovirales que contiene
dos insertos de genes, la transcripcin de un inserto se regula a partir de la secuencia del promotor LTR 5 y un segundo inserto de gen se puede ligar a un promotor heterlogo interno del virus simiano 40 (SV40).
EL ADN complementario (ADNc) que contiene el gen teraputico de inters, incluyendo sus intrones, se escinde de su fuente usando enzimas de restriccin y se inserta en el sitio de clonacin mltiple del vector de transferencia de genes. La seal de
poliadenilacin se puede extraer de mltiples fuentes, como el virus SV40 o el gen de la hormona de crecimiento humana. La
caracterizacin y las pruebas de vectores para terapia gnica se describen en Mtodos Analticos.
SISTEMAS QUE COLABORAN CON LA FUNCIN

A menudo, los vectores virales recombinantes se modifican para que tengan una replicacin defectuosa, una condicin creada por supresin o modificacin de los genes virales requeridos para la replicacin y produccin de virus infecciosos. Debido a
que a los vectores se les retiran algunos o todos los genes virales, se debe desarrollar un sistema para proveer protenas virales
y para encapsular el vector en una partcula viral. Por lo general, esto se logra mediante dos mtodos: transfeccin transitoria o
lneas celulares empaquetadoras estables.
En el mtodo de transfeccin transitorio, se genera una serie de plsmidos diferentes, incluyendo un plsmido que contiene
el vector y otro vector que contiene los genes virales. Por ejemplo, los vectores retrovirales se pueden generar usando un sistema de tres plsmidos: (1) el vector plasmdico que contenga el transgn; (2) un plsmido que contenga la regin gnica viral
gag/pol; y (3) un plsmido que contenga el virus con envoltura. Los trs plsmidos se transfectan a clulas, p.ej., HEK293 o
HT1080, y los viriones que contienen vectores se recolectan despus de dos o tres das. La separacin del vector y de los genes
virales en plsmidos diferentes, junto con los diseos del vector que minimizan la homologa entre el vector y las secuencias
virales, reducen la probabilidad de recombinacin y regeneracin de virus competente para la replicacin. Se pueden emplear
metodologas similares para la mayora de los sistemas de vectores virales.
El mtodo de transfeccin transitoria tiene como ventaja un tiempo de produccin rpida y la flexibilidad para cambiar los
componentes del vector o de las construcciones virales. No obstante, este mtodo puede ser complejo al momento de ampliarlo para fabricacin y se debe tener especial cuidado para obtener resultados de produccin constantes. El uso de lneas
celulares empaquetadoras de vectores es un mtodo alternativo. En este caso, los genes virales se introducen de manera esta-
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VECTORES DE TERAPIA GNICA VIRAL

Los vectores retrovirales y adenovirales por lo regular han sido producidos a escala de laboratorio que no se ajusta a las BPF a
travs de mtodos de cultivo tradicionales para lneas celulares dependientes de suero y anclaje empleando matraces, bandejas
y frascos tipo roller. Inicialmente, los vectores de terapia gnica se producan con estos mtodos porque no se necesitaban
grandes volmenes del producto para los primeros estudios clnicos. Los sistemas de bancos de clulas se emplean como fuente de clulas y los bancos de virus, como fuente de virus para la produccin clnica. En la mayora de los casos, el sobrenadante
se recolecta, clarifica y se almacena congelado en bolsas a 70. En muchos ensayos clnicos tempranos, el sobrenadante no
purificado ha sido usado para la transferencia gnica ex vivo.
Se ha informado sobre mtodos de produccin en etapas iniciales a gran escala los cuales se usan comnmente. Estos incluyen mtodos de cultivo en suspensin, en biorreactor y en lecho fijo o microtransportador. Algunos grupos han informado que
adaptan sus clulas de proceso a condiciones de cultivo sin suero. Las clulas se cosechan y lisan o se recolecta el sobrenadante. La recoleccin se clarifica y purifica para eliminar los restos de clulas anfitrionas, el ADN de la clula anfitriona y dems
contaminantes derivados del proceso.
Tradicionalmente, los virus se purifican usando ultracentrifugacin en gradiente, aunque esto demanda mucho tiempo y no
es adecuado para propsitos de produccin a gran escala. La seleccin de pasos en procesos subsiguientes y su secuencia est
determinada por la naturaleza del virus en s mismo y las etapas iniciales del proceso utilizado para fabricar el virus. Con el
desarrollo de procesos para la fabricacin de vectores de terapia gnica, se ha informado sobre una gran cantidad de etapas
diferentes de purificacin, las cuales incluyen cromatografa de intercambio inico y en celulosa sulfonada, cromatografa de
afinidad de iones cinc y cromatografa de exclusin por tamao. Por lo regular, los tratamientos con ADNasa y otras nucleasas
se usan en el proceso a fin de reducir el ADN de la clula anfitriona o del plsmido. La produccin de VAA y lentivirus se complica por la necesidad de transfeccin o cotransfeccin transitoria del plsmido o del virus colaborador. En general, estos pro-
Captulos
ble en una lnea celular inmortalizada que produce una expresin persistente de genes virales. Al igual que con la transfeccin
transitoria, los genes virales por lo general se expresan a partir de diferentes plsmidos para reducir el riesgo de recombinacin. Debido a que la integracin de los plsmidos es poco frecuente, se requiere de tiempo y esfuerzo considerables para
aislar una lnea celular empaquetadora con alto ttulo y para generar un MCB. Las construcciones de vectores se pueden introducir a las clulas del MCB; asimismo, los investigadores pueden permitir el aislamiento de una lnea celular estable que genere
el vector de inters analizando por la presencia de un clon de alto ttulo. Estas lneas celulares por lo general se expanden a
grandes nmeros y a menudo producen vectores durante un periodo de hasta una semana a la vez, lo que facilita la ampliacin a escala del vector y la uniformidad del producto.
Los sistemas tpicos que colaboran con la funcin son los siguientes:
Sistemas de Vectores RetroviralesLas clulas empaquetadoras iniciales se basaban en la lnea celular de fibroblasto murino NIH 3T3. La lnea celular PG13 (que expresa la envoltura del Virus de la Leucemia del Mono Gibbon) se ha usado ampliamente con una baja incidencia de eventos de recombinacin que conllevan al VCR. En tiempos recientes, se han modificado
las lneas celulares humanas HEK293 y HT1080 para servir como lneas celulares empaquetadoras para retrovirus. El uso de una
lnea celular humana reduce la eliminacin de partculas de vector por parte del sistema de complementos humanos (aunque
por lo general esto no representa una preocupacin para vectores usados en protocolos ex vivo).
Sistemas de Vectores AdenoviralesLas clulas HEK293 se usan ampliamente para proveer la funcin E1, necesaria para
replicacin adenoviral eficaz que se suprime de los vectores adenovirales de primera generacin. Asimismo, se han creado
otras lineas celulares complementarias, tales como las clulas A549 modificadas con E1 (carcinoma pulmonar humano) y la
lnea celular PER.C6 (retinoblasto embrionario humano), para proveer E1 u otras funciones ausentes. La PER. C6 contiene la
regin E1 bajo el control de un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK, por sus siglas en ingls) y no posee secuencias adenovirales flanqueadas, a fin de eliminar la produccin de adenovirus competentes para la replicacin (ACR).
Sistemas de Vectores de VAAClsicamente, utilizan lneas celulares HEK293 infectadas por adenovirus, transitoriamente
transfectadas con plsmido colaborador de VAA que contiene los genes rep y cap necesarios para la replicacin del VAA y la
formacin de la cpside, respectivamente, y que son suprimidos del vector de VAA. En algunos sistemas de produccin de
VAA, el adenovirus salvaje ha sido eliminado del proceso usando transfeccin triple de plsmidos que expresan genes tempranos Ad, rep y cap, y el transgn del vector. La lnea celular HeLa (del carcinoma crvico uterino humano) tambin se ha empleado como sistema de produccin transitorio. En tiempos recientes, ambas lneas celulares han sido utilizadas para establecer
lneas celulares empaquetadoras transfectadas de manera estable que expresan los genes rep y cap y, en algunos casos, expresan las funciones adenovirales necesarias para la replicacin del VAA cuando hay genes rep y cap (ARN de VA, E1a, E1b, E2a y
E4). Tambin se han desarrollado sistemas de produccin de VAA que usan VHS recombinante y Baculovirus.
Adenovirus Sin Genes Virales (Gutless)Los sistemas de fabricacin iniciales para el vector de adenovirus, tambin llamados adenovirus sin genes virales (gutless) eran similares a los sistemas de fabricacin de vector de VAA clsicos debido a que las
clulas HEK293 se transfectaban transitoriamente con plsmido colaborador que contena las funciones adenovirales requeridas. El desarrollo de virus colaboradores que hospedan una seal de empaquetamiento flanqueada por sitios loxP y que complementa a las lneas celulares HEK293 que expresan la recombinasa Cre del bacterifago P1 de sitio especfico ha mejorado de
sobremanera el rendimiento del virus sin genes virales. Esta tecnologa reduce notoriamente la cantidad de contaminacin de
virus colaborador previniendo el empaquetado del genoma del virus colaborador al tiempo que le permite replicarse y respaldar la replicacin y encapsidacin del vector sin genes virales.
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cesos han requerido lneas de clulas que necesitan anclaje, que son difciles de producir a gran escala. El desarrollo de lneas
celulares transfectadas establemente permitira la produccin a gran escala.
Captulos
MTODOS DE PURIFICACIN: VECTORES VIRALES

RetrovirusA la fecha, la purificacin de preparaciones de retrovirus para ensayos clnicos de la fase I ha sido mnima, es
decir, la concentracin simple de sobrenadantes de cultivo es insuficiente para cumplir con las estrictas normas de calidad requeridas para terapia in vivo. Las tcnicas de centrifugacin y microfiltracin son muy tiles para clarificar sobrenadantes de
cultivo y para eliminar desechos celulares. Asimismo, las tcnicas de cromatografa de intercambio inico, de exclusin por
tamao y de afinidad han sido empleadas para eliminar el exceso de sal, suero y contaminantes de bajo peso molecular tambin concentrados con el virus.
AdenovirusLos vectores adenovirales recombinantes a menudo se purificaban mediante ultracentrifugacin de equilibrio
en un gradiente de densidad con cloruro de sodio. Este proceso an se emplea para preparaciones de escala investigativa, aunque no es posible aumentar su escala ni es eficiente para cantidades ms grandes de virus de grado clnico. Los mtodos de
purificacin ms recientes que permiten aumentar la escala usan cromatografa de intercambio aninico debido a la fuerte afinidad de partculas de virus intactas para la resina con respecto a la de las protenas de la cpside celular e individual. Las estimaciones de carga publicados para resinas de intercambio aninico pueden variar entre 0,5 1012 y 5 1012 partculas de virus/mL de resina o entre 0,14 mg de virus y 1,4 mg de virus/mL de resina. La filtracin en gel y la cromatografa de afinidad de
metales inmovilizados a menudo se usan en las etapas de refinamiento siguiendo la purificacin de intercambio aninico de
productos derivados de adenovirus recombinantes.
Virus Asociados con AdenovirusLa toxicidad de cloruro de cesio, el agregado de partculas de VAA y el hecho de que el
adenovirus no se elimina por completo despus de una extensa centrifugacin complican la purificacin de VAA mediante ultracentrifugacin de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de cesio. Otro medio de separacin de densidad, el
yodixanol, que es menos txico que el cloruro de cesio y que previene la agregacin de VAA, se ha empleado en una sola
etapa de centrifugacin. El pasaje de la fraccin de VAA por una columna de afinidad que consiste en una matriz de soporte
heparinizada o en anticuerpos monoclonales producidos contra VAA2 aument en gran medida la pureza e infectividad de las
preparaciones finales. Estos mtodos son apropiados nicamente para serotipos de VAA especficos. La cromatografa de intercambio inico es el mtodo ms potente y verstil de purificacin de VAA, aunque la solucin amortiguadora de pH, la concentracin de detergente y el medio de la columna se deben ajustar para cada serotipo de VAA. La infectividad y pureza de las
preparaciones obtenidas de estas estrategias de purificacin son comparables a las obtenidas por mtodos cromatogrficos de
afinidad y se completan en un periodo de tres horas.
PLSMIDOS O VECTORES NO VIRALES

Los plsmidos son molculas de ADN de doble cadena circular que existen en bacterias, como molculas extracromosmicas
autorreplicantes. Se han modificado para servir de sistemas de clonacin, para contar con mltiples sitios de reconocimiento
por endonucleasas de restriccin para la insercin del transgn clonado y para tener marcadores genticos seleccionables para
identificar las clulas que portan el vector recombinante. Los vectores no virales basados en plsmidos se suelen utilizar como
sistemas de suministro de genes, tanto en terapias gnicas in vivo como ex vivo. Estos vectores se encuentran en forma de
ADN desnudo o se complejan con lpidos u otros agentes que facilitan la transferencia a travs de la membrana celular y el
transporte al ncleo de la clula sin degradacin. Una ventaja del sistema de vector plasmdico es la produccin eficiente de
grandes cantidades del vector que se caracteriza fcilmente y evita el riesgo de VCR asociado con muchos sistemas virales.
Los vectores no virales por lo regular se producen usando un sistema bacteriano de Escherichia coli. Los plsmidos son transfectados en E. coli y se selecciona y expande una colonia bacteriana nica apropiada para crear un MCB. Despus de volver a
seleccionar una colonia a partir de una placa bacteriana inoculada del MCB, se asla el ADN del plsmido a partir de cultivos
cuyo tamao vara entre 1 litro, a escala de laboratorio, y cientos de litros, en fermentadores bacterianos. El ADN plasmdico
puede ser purificado por varios mtodos, como la cromatografa de afinidad o de intercambio inico y los gradientes de densidad de cloruro de cesiobromuro de etidio. Estos ltimos no se recomiendan para producir material de grado clnico.
PRODUCCIN Y PROCESAMIENTO DE VECTORES NO VIRALES

Un beneficio de los vectores no virales para la transferencia gnica es que el proceso de produccin es en realidad genrico y
se puede aplicar a cualquier preparacin plasmdica independientemente de la composicin o aplicacin. Puesto que la dosis
humana promedio vigente de ADN plasmdico para transferencia gnica y para vacunacin es aproximadamente 1 mg, el desafo primario asociado con la produccin de plsmidos a gran escala consiste en desarrollar un proceso econmico y que se
pueda aumentar en escala. Por consiguiente, el desarrollo del proceso para vectores derivados de plsmidos permanece como
un rea activa de investigacin y desarrollo. Un proceso estndar de produccin a gran escala de plsmidos de ADN recombinante consta de las cinco operaciones unitarias siguientes.
FermentacinLos procesos de fermentacin deben respaldar el crecimiento de bacterias transformadas y maximizar la
cantidad de plsmido producido por cada clula. La E. coli es la cepa ms comn empleada para la produccin de plsmidos.
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Tabla 4
Nivel
Aceptable del
Producto Final
Tipo de Ensayo
Problemtica
Determinado mediante
Identidad
Contaminacin cruzada con otros

productos
Digestin por restriccin/electroforesis en gel
ADN cromosmico bacteriano residual
PCR en tiempo real
<2 mg/mg ADN
ARN residual
HPLC analtica
<0,2 mg/mg ADN
Protena bacteriana residual
Ensayo BCA [(Valoracin de protenas por el mtodo de BCA (cido

bicinconnico)]
<3 mg/mg ADN
Endotoxina
Ensayo de LAL
<10 EU/mg ADN
Esterilidad
(bacteriana y fngica)
Mtodo descrito en el Ttulo 21 del

CFR 610.12
Sin crecimiento
Apariencia
Inspeccin visual
Solucin transparente exenta de

partculas
pH
Medidor de pH
Fisiolgico (7,07,4), pero puede

ser especfico del producto
Confirmacin de plsmidos (ccc vs

oc)
HPLC o CGE
>97% ccc
Dosis declarada
In vitro
ELISA
FACS
RT-PCR
Absorbancia de luz (A260)
Transgn/especfico del plsmido
Pureza
Potencia
No disponible
Introduccin de Material Gentico en ClulasClulas Modificadas Genticamente

Una extensin comn de la terapia celular implica la introduccin de material gentico, por lo general ADN, en clulas para
alterar su patrn de expresin gnica. Aunque la discusin se centra en el ADN, el ARN o un derivado del ADN pueden ser
sometidos a procesos similares, excepto que la estabilidad y la solubilidad de cada cido nucleico puede exigir la modificacin
de ciertos pasos. El proceso general se suele denominar terapia gnica ex vivo, ya que las clulas se extraen del paciente o del
Captulos
Los aminocidos, nuclesidos y la relacin entre el nitrgeno y carbono de los compuestos presentes en una formulacin de
medio rico mejoran de gran manera el rendimiento de los plsmidos.
RecoleccinLas clulas bacterianas se recolectan mediante centrifugacin o microfiltracin. La centrifugacin en condiciones que cumplan con las BPF puede ser costosa, lo que hace de la microfiltracin el mtodo aceptado de recoleccin celular. Asimismo, la microfiltracin permite eliminar los medios usados, los subproductos metablicos, los desechos extracelulares
y las impurezas antes de la purificacin.
LisisLas clulas bacterianas se deben lisar para liberar los plsmidos recombinantes. ste es uno de los pasos ms crticos
en el proceso de produccin debido a que puede afectar significativamente la cantidad de formas de ADN usables [circular
cerrado en forma covalente (ccc, por sus siglas en ingls)] y no usable [cortado, parcialmente desnaturalizado y circular abierto
(oc, por sus siglas en ingls)] en una preparacin. El mtodo de lisis ms usado para fabricacin a escala clnica es el tratamiento con detergente alcalino y la precipitacin de desechos celulares con acetato. Este mtodo elimina una gran fraccin de impurezas celulares generadas del lisado, al tiempo que incrementa la sensibilidad de los plsmidos para el mezclado y las concentraciones localizadas de detergente, las cuales son difciles de manipular a gran escala. La lisis de clulas mediante exposicin al calor tratan este problema y desnaturaliza de manera efectiva las protenas celulares y el ADN bacteriano.
Asilamiento y PurificacinAlgunos procesos incluyen etapas adicionales para eliminar desechos celulares y dems contaminantes derivados de los lisados bacterianos crudos mediante precipitacin con detergentes, polietilenglicol o sal. Estos reactivos afectan la estabilidad plasmdica y se eliminan mediante cromatografa en columna. La cromatografa de exclusin por
tamao puede separar de manera eficaz el ADN plasmdico del ARN, protenas y dems molculas pequeas presentes en el
lisado liberado. El grado de separacin de ADN plasmdico de los contaminantes depende en gran medida del tipo y la concentracin de sal en la solucin amortiguadora de corrida. Las resinas usadas en la cromatografa de intercambio aninico tienen una alta afinidad para ADN plasmdico y proporcionan una concentracin de muestra mxima. La cromatografa de interaccin hidrfoba y tioflica aromtica son los mtodos preferidos para la separacin selectiva de isoformas de ADN plasmdico
diferente y la reduccin de endotoxina.
Preparacin a GranelDespus de la purificacin, el plsmido a granel se coloca en una solucin amortiguadora adecuada y se formula mediante ultrafiltracin usando una membrana con un tamao de poro de 50100 kDa.
Los plsmidos para uso clnico se deben someter a una caracterizacin de alto nivel. Se tiene amplio conocimiento de las
impurezas derivadas de las etapas de produccin y procesamiento. Las pruebas necesarias para confirmar la identidad, pureza
y potencia de un producto derivado de plsmido estn bien establecidas y se consideran de rutina. La Tabla 4 resume estas
pruebas y la especificaciones vigentes establecidas por la FDA y la Organizacin Mundial de la Salud.
Captulos
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donante y la introduccin del material gentico se lleva a cabo con las clulas fuera del cuerpo. A continuacin, las clulas
modificadas genticamente son administradas al paciente. El material gentico introducido puede causar la expresin de nuevos genes y productos o inhibir la expresin de genes y productos ya expresados. Esta ltima posibilidad representa un tipo de
terapia antisentido. Este material gentico se puede introducir con la misma variedad de reactivos implicados en la terapia gnica: vectores virales, cido nucleicos en una formulacin simple (ADN desnudo) o cidos nucleicos formulados con agentes
tales como liposomas que mejoran su capacidad de penetrar la clula. La mayora de los pasos y consideraciones analizados se
aplican tambin a la introduccin ex vivo de material gentico en las clulas. El objetivo principal de la terapia ex vivo es desarrollar procesos robustos que funcionen con la mayora de las clulas de los pacientes o de los donantes, lo cual requiere de un
esfuerzo considerablemente mayor para las lneas celulares.
El mtodo para introducir nuevo material gentico en las clulas depende de la biologa del sistema y la estabilidad deseada
de expresin gnica. Si un vector retroviral simple, como por ejemplo el virus de la leucemia murina de Molony, se usa para la
transduccin, las clulas deben estar en divisin activa, ya que el ADN del vector slo se integra al ADN celular durante la
replicacin. Esto, habitualmente, conduce a una expresin prolongada del producto gnico deseado. Los vectores adenovirales, el ADN desnudo o el ADN formulado se pueden introducir en las clulas que no estn en divisin. No obstante, la expresin gnica ser transitoria debido a que el ADN introducido por lo general ser extracromosmico.
El desafo principal en la terapia gnica ex vivo consiste en lograr una transduccin o transfeccin eficiente, introduciendo
suficiente ADN en la clula antes de que se degrade el ADN. En el caso de la transduccin por vectores retrovirales simples, las
clulas son estimuladas por reactivos que las colocan en la fase S (replicacin) en el momento de aplicacin del vector. En un
cultivo de clulas, la mayora de los vectores retrovirales permanecen estables durante algunas horas. Dado que la difusin es
mnima, slo una pequea fraccin de partculas virales entra en contacto con las clulas durante este perodo. Las siguientes
tcnicas se pueden usar para incrementar el nmero de partculas virales que entran en contacto con la clula en un periodo
determinado:
1. Maximizacin de la concentracin de partculas virales y minimizacin del volumen de los medios durante la etapa de
transduccin
2. Aplicaciones mltiples del virus
3. Centrifugacin de partculas de virus en las clulas
4. Colocacin de las clulas en un filtro y arrastre lento de los medios virales a travs del filtro
5. Adicin de polmeros que mejoran la unin a los medios. [NOTANo se recomienda cocultivar las clulas blanco con el
productor viral. Esta tcnica aumenta las posibilidades de recombinacin y de produccin de VCR. Asimismo, cualquier
producto para el que se utilice el cocultivo para transducir clulas humanas sera considerado un xenotrasplante si las clulas productoras no son de origen humano. El segundo tipo celular, ya sea humano o no, puede ocasionar inflamacin.]
Cada una de estas tcnicas tiene su propio conjunto de consideraciones que se deben tratar a fin de desarrollar un proceso
robusto. En la tcnica 1, la reduccin del volumen durante la transduccin provoca un rpido agotamiento del medio, por lo
que debe agregarse medio suplementario pocas horas ms tarde. En la tcnica 2, las clulas pueden no estar ya en la fase
correcta del ciclo celular durante aplicaciones posteriores o pueden haberse tornado refractarias por transformacin improductiva durante la aplicacin anterior. Las tcnicas 3 y 4 pueden funcionar bien en una escala muy pequea, pero es posible que el
nmero de clulas que se puede transducir sea insuficiente para obtener una dosis eficaz. En la tcnica 5, es posible que los
polmeros no provean ningn beneficio debido a que la unin del virus puede requerir de receptores especficos cuya densidad
superficial puede ser un factor limitante.
Consideraciones y tcnicas similares pueden aplicarse a otras preparaciones de virus o de ADN. El problema de la difusin
lenta es an ms marcado en el caso de preparaciones de ADN. Factores como el tipo de clula donde se ha producido el
vector viral, los medios utilizados para la produccin del vector y la pureza del vector pueden tener un efecto significativo sobre la eficacia de la transduccin. Aunque algunos mtodos pueden no requerir que las clulas se encuentren en ciclo activo,
en la prctica, la mayora de los procesos requieren que las clulas sean capaces de replicacin debido a las siguientes consideraciones:
1. Las consideraciones de seguridad pueden instruir que slo las clulas que expresan el ADN nuevo sean devueltas al paciente, lo cual requiere la seleccin de estas clulas. Conforme a lo descrito anteriormente, el mtodo de seleccin ms
comn emplea un gen resistente a los antibiticos que se cointroduce con el nuevo material gentico.
2. Puede ser necesaria la propagacin adicional para lograr la dosis teraputica de clulas.
3. Las cuestiones econmicas, biolgicas o tcnicas pueden dictar que la etapa de introduccin del ADN se lleve a cabo a un
nmero celular bajo y que la poblacin celular deseada se expanda a la dosis requerida.
Por lo tanto, para casi todos los casos, se deben desarrollar condiciones que permitan a la clula mantener su capacidad de
proliferacin. La biologa de las clulas, la tecnologa disponible y la economa de procesos determinarn si las clulas se propagarn antes, despus o durante la introduccin del nuevo material gentico. De hecho, la mayora de los procesos expanden la poblacin despus de la introduccin del nuevo gen.
La posible administracin a pacientes de clulas que no expresan productivamente el gen depende de la biologa de la aplicacin, de la dosis requerida en comparacin con la capacidad de manejo del sistema de fabricacin y, principalmente, de la
toxicidad de la poblacin de clulas no productivas. La seleccin de la poblacin de clulas modificadas genticamente, por lo
general, se lleva a cabo utilizando un gen marcador de resistencia a antibiticos, como la neomicina, que se introduce en la
clula junto con el material gentico nuevo. Para la seleccin por neomicina, las clulas en cultivo se tratan con el antibitico
G418, a una concentracin y durante un perodo que han demostrado ser capaces de matar las clulas de expresin no pro-
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ductiva, mientras permiten la proliferacin de clulas de expresin productiva. De esta manera, se asume que las clulas que
son resistentes al antibitico tambin expresan el ADN de inters. Esta expresin se debe analizar como un requisito de liberacin de lote o se debe verificar en una serie de simulacro de pruebas. Debido a que la mayora de los antibiticos reducen la
proliferacin celular, puede ser necesario optimizar la composicin de los medios de cultivo para la seleccin y propagacin
eficientes de las clulas modificadas genticamente.
Despus de la etapa de seleccin de antibiticos, puede ser necesaria una segunda fase de propagacin celular exenta de
antibiticos a fin de lograr la dosis deseada y para enjuagar el G418 residual fuera del sistema. El medio seleccionado y el tiempo total que las clulas estn en cultivo pueden ser crticos para mantener la expresin deseada de las funciones diferenciadas
originales. Otro problema relacionado con la seleccin de marcadores es que, generalmente, son genes no humanos. La expresin de estos genes suele inducir una respuesta inmunitaria. El desarrollo del proceso suele realizarse con clulas de donantes sanos. Es preciso tener en cuenta que en pacientes muy enfermos, puede ser difcil obtener clulas sanas que puedan ser
estimuladas de modo que se repliquen en forma eficiente y sostenida.
La fabricacin, el procesamiento celular y las cuestiones relacionadas con las pruebas analticas relevantes para productos
derivados de clulas se analizan en el captulo 1046.
Formulacin de Productos de Terapia Gnica
PREPARACIN Y ADMINISTRACIN IN SITU

Pueden ser necesarias una o ms modificaciones del producto o etapas preparativas antes de la administracin del producto
de terapia gnica al paciente. Estas modificaciones o etapas a menudo se realizan cerca del momento de la administracin y,
por lo tanto, se llevan a cabo en condiciones que quedan fuera del control del fabricante original. La naturaleza de estas modificaciones depende en gran medida de las caractersticas del producto en relacin con una aplicacin particular. Estas incluyen
Captulos
Las formulaciones finales para productos de terapia gnica an se encuentran en etapas tempranas de desarrollo y, en la
actualidad, la mayora de los vectores de transferencia gnica se almacenan en solucin a temperaturas ultra bajas. La formulacin exitosa de candidatos para transferencia gnica se basa en un entendimiento cabal de las caractersticas fisicoqumicas y
biolgicas nicas de cada sistema de vectores. Los factores tales como el pH de la solucin, el contenido inico y la osmolaridad influyen en la estabilidad trmica de los vectores virales y no virales. Los carbohidratos orgnicos tales como manitol, sorbitol, sacarosa y trehalosa han sido incorporados en las preparaciones para evitar la disrupcin de la conformacin nativa del
vector en solucin, durante el proceso de congelacin-descongelacin y durante la liofilizacin. Los aminocidos tales como
arginina y leucina han sido incorporados en formulaciones por sus efectos amortiguadores y para evitar la agregacin. Los surfactantes tales como Tweens, Spans y Pluronics han demostrado ser efectivos para evitar la agregacin, pero este efecto es
hasta cierto punto especfico del vector debido a que algunos de los productos del vector se rompen fcilmente con estos
agentes. Asmismo, las protenas de lpidos, de polmeros y extraas (albmina humana y gelatina) se han incorporado en muchas preparaciones de vectores dada su capacidad para evitar la prdida del vector derivada de la interaccin directa con superficies farmacuticas y durante los ciclos de congelacin-descongelacin.
Antes de iniciar un programa formal de seleccin de formulaciones para un vector, se deben considerar los siguientes factores. Se debe establecer la dosis requerida y/o la concentracin de almacenamiento del producto final, as como los aspectos
especficos del sistema de envase y cierre y/o de administracin. Adems, se debe contar con mtodos analticos para evaluar
la potencia e identificar degradantes. Finalmente, deben definirse las expectativas de la formulacin. Algunos criterios pragmticos para el diseo y la seleccin de formulaciones de vacunas para su uso a nivel mundial son: (a) el producto final debe
presentarse en una formulacin que alcance una vida til de 18 a 36 meses cuando se almacena a una temperatura de 28 o
mayor, (b) la formulacin debe tener un perfil de estabilidad aceptable a temperatura ambiente que cubra el almacenamiento
a corto plazo y el transporte en el campo, (c) debe proteger adecuadamente al vector de daos durante el ciclo de congelacin-descongelacin y (d) debe constar de reactivos que sean farmacuticamente aceptables y dentro de las concentraciones
fisiolgicamente aceptables. Los cambios en la formulacin durante el desarrollo clnico se deben respaldar con estudios preclnicos y con datos de estabilidad. Para esto, se debe invertir tiempo suficiente para generar planes para cumplir con este requisito.
A la fecha, es poco el trabajo descrito en el rea de desarrollo de formulaciones de vectores retrovirales con aditivos aprobados para uso humano. El esfuerzo ms significativo para desarrollar formulaciones estables para transferencia gnica se ha dado con adenovirus recombinantes. En los ltimos tiempos, la identificacin de mecanismos mediante los cuales los adenovirus
recombinantes se degradan en solucin ha llevado al desarrollo de diversas formulaciones lquidas que estabilizan el virus por
un periodo de hasta 18 meses a 4. Los virus asociados con adenovirus se consideran como uno de los vectores virales ms
estables. Se ha documentado que este virus permanece estable durante aproximadamente 4 meses en solucin salina amortiguada con fosfatos a 4. La adicin de crioprotectores y surfactantes previene la agregacin de partculas de virus y extiende la
vida til a un ao. Asimismo, se han descrito formulaciones liofilizadas de ambos adenovirus y del VAA con vidas tiles de siete
aos a temperatura ambiente. Aunque se ha demostrado que los vectores no virales son generalmente robustos en soluciones
amortiguadoras estndar a 4, su estabilidad se puede ver ampliamente influenciada por componentes extraos incluidos para
promover la direccin hacia el gen. Se debe considerar la naturaleza de dichos componentes al momento de desarrollar protocolos y estrategias de estabilidad (ver ms adelante).
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la descongelacin, el lavado o la filtracin para eliminar materiales indeseados relacionados con la fabricacin del producto e
incluyen adems el espacio fsico definido con controles ambientales apropiados, personal capacitado, procedimientos operativos estndar detallados y un programa de calidad integral.
La naturaleza nica e irreemplazable de muchos productos de terapia gnica, p.ej., clulas modificadas genticamente, muchos de los cuales se han originado de una fuente tisular autloga o alognica seleccionada, genera consideraciones especiales
para fabricacin, liberacin y administracin del producto. Las cuestiones relacionadas con la administracin de productos derivados de clulas se tratan a detalle en el captulo 1046.
Preparacin In Situ
Captulos
MANIPULACIN DEL PRODUCTO

Antes de la administracin, la preparacin in situ del producto de terapia gnica puede requerir de una o ms manipulaciones, incluidas las siguientes:
Cambio en el envase finalEl producto fabricado puede haber sido almacenado o transportado en un envase pero puede ser necesario transferirlo a un envase distinto para su administracin.
Cambio en el estado fsico o la temperaturaPuede ser necesario descongelar un producto o entibiarlo del estado refrigerado.
Cambio en la solucin o suspensinPuede ser necesario disolver, diluir o suspender un producto en un lquido.
Adicin a un material estructural biocompatiblePuede ser necesario combinar un producto de terapia gnica con
una matriz o tejido estructural vivo, natural o sinttico. Entre los ejemplos de material para matriz se incluyen fibras huecas, lminas fibrosas, geles, tapones, cpsulas, esponjas o grnulos.
Mezcla o preparacin magistral con otros materiales no estructuralesPuede ser necesario mezclar o preparar magistralmente un producto con frmacos, citoquinas, productos biolgicos u otros materiales no estructurales.
Filtracin o lavadoLos materiales no deseados en el producto fabricado tales como partculas, desechos celulares, metabolitos o compuestos remanentes de manipulaciones previas pueden requerir de etapas de lavado o filtracin.
MuestreoPuede ser necesario el muestreo del producto final inmediatamente antes de la administracin para algunos
protocolos clnicos.
REQUISITOS DE LAS INSTALACIONES

Los requisitos de las instalaciones donde se llevan a cabo los procedimientos de preparacin in situ o la administracin de
productos de terapia gnica dependen de la naturaleza de los productos, sus aplicaciones y las manipulaciones necesarias. El
principal determinante de las caractersticas de las instalaciones es el grado de riesgo de contaminacin microbiana relacionado con cada paso. La definicin de condiciones de alto y bajo riesgo se puede establecer tomando en cuenta un marco similar
al definido para Preparaciones Magistrales Estriles de Nivel de Riesgo Bajo (PMEs) y PMEs de Nivel de Riesgo Alto en la seccin
Niveles de Riesgo de Contaminacin Microbiana en las PME del captulo Preparacin MagistralPreparaciones Estriles 797.
LIBERACIN DEL PRODUCTO FINAL

Los productos de terapia gnica que se someten a etapas de preparacin o manipulaciones in situ deben estar sujetas a verificaciones o pruebas adecuadas para asegurarse de que cumplan con las especificaciones de calidad antes de ser liberados para
su administracin a pacientes. La naturaleza y el grado de las manipulaciones determinarn si deben agregarse requisitos de
liberacin o especificaciones fundamentales a los ya exigidos inmediatamente despus de la fabricacin inicial. Los requisitos
previos a la liberacin incluyen:
1. La inspeccin fsica del producto, que, por lo general, incluye medidas para garantizar que el producto tenga el aspecto
adecuado en cuanto a color, turbidez, partculas o materia extraa, integridad del envase, temperatura del producto y
etiquetado apropiado y exacto;
2. Revisin de los registros de los procesos
3. Para productos especficos para un solo paciente, inspeccin administrativa del etiquetado del producto o de los registros
relativos a la identidad del receptor previsto
Adems, los productos considerados como productos de alto riesgo de acuerdo con la descripcin del captulo 797 deben
someterse a anlisis de producto adicionales. Para todos los productos de alto riesgo, se deben definir y efectuar ensayos de
calidad que contemplen la identidad, la potencia y la pureza de los principios activos. Los productos de alto riesgo en la categora II se deben someter a pruebas de esterilidad y de endotoxinas.
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Administracin a Pacientes
REQUISITOS PREVIOS A LA ADMINISTRACIN
TRATAMIENTO DEL PACIENTE

Algunos productos de terapia gnica son especficos para el paciente debido a que se fabrican a partir de una fuente tisular
seleccionada, como tejido autlogo, algeno seleccionado o xengeno. Ciertos productos especficos del paciente tienen un
potencial definido para el beneficio o dao por inmunorreactividad. Se deben establecer sistemas para impedir la administracin de un producto de este tipo al paciente equivocado. Los sistemas recomendados incluyen procesos similares a los empleados para administrar productos sanguneos humanos, y dos personas, por lo menos, deben dedicar especial atencin a la identificacin correcta del paciente y al producto especfico para el paciente inmediatamente antes de la administracin. Estas
cuestiones se tratan a detalle en el captulo 1046. Los productos de terapia gnica se pueden administrar mediante diversas
rutas, las cuales incluyen inyeccin parenteral, inhalacin y vas gastrointestinales. Otras posibilidades son su aplicacin directa
en la vasculatura regional, rganos, tejidos o cavidades corporales mediante agujas o catteres o bien despus de la exposicin
quirrgica del tejido. Aunque la administracin parenteral se puede llevar a cabo en instalaciones habituales para pacientes
ambulatorios o internos, las otras vas pueden exigir lugares especializados, como una sala de operaciones o sala de endoscopia aspticas. En todos los casos, deben existir procedimientos operativos estndar y un programa de calidad para garantizar
que el producto se administre de la manera prevista.
MONITOREO DEL PACIENTE POSTERIOR A LA ADMINISTRACIN

Se debe contar con polticas y procedimientos escritos para monitorear la evolucin de los pacientes y manejar los informes
de efectos adversos. El examen de evolucin del paciente debe incluir indicadores capaces de detectar errores o problemas
relacionados con todo el proceso de fabricacin, con especial atencin a la manipulacin, almacenamiento o transporte despus de la fabricacin inicial del producto. La gestin de las reacciones adversas debe incorporar procedimientos para asegurar
el examen mdico rpido y el tratamiento de pacientes con posibles efectos adversos, as como un sistema para informar y
evaluar los efectos adversos que puedan sealar un posible defecto en el producto administrado. Los procedimientos de informe incluyen suministrar detalles requeridos para los programas de informe de eventos adversos federales, estatales o de USP.
Captulos
Dependiendo de la aplicacin de terapia gnica especfica, el personal capacitado para el cuidado del paciente debe completar etapas para preparar al paciente para la administracin del producto. El objetivo de estos pasos es asegurar que el producto origine el resultado teraputico previsto y minimizar el riesgo de efectos adversos. Los aspectos pertinentes a la administracin de productos derivados de clulas se tratan en el captulo 1046. Por lo general, se debe llevar a cabo una reevaluacin extensa de la condicin general del paciente y de su aptitud para la terapia cerca del momento de la administracin del
producto. Por lo general, esta evaluacin incluye el historial clnico del paciente, una exploracin fsica y estudios de laboratorio tales como hemogramas y analtica. Adems, el personal puede obtener mediciones funcionales y fsicas basales, anlisis de
laboratorio o estudios de diagnstico por imgenes correspondientes a la aplicacin especfica. Algunos ejemplos de estos estudios son las evaluaciones de la funcin pulmonar para un tratamiento destinado a mejorarla, la medicin de los niveles en
sangre de una enzima que es el producto gnico en una aplicacin de terapia gnica y el diagnstico por imgenes de resonancia magntica previo a las terapias contra el cncer.
Pueden ser necesarias diversas intervenciones al paciente relacionadas con la va de administracin antes de la administracin del producto. Para terapias que requieren de administracin intravenosa, puede ser necesario colocar un catter venoso
central a pacientes con acceso venoso deficiente. Para aplicaciones en las que se implantan en el paciente clulas modificadas
genticamente o matrices combinadas con clulas, puede ser necesario preparar el sitio del implante en la sala de operaciones,
lo cual puede requerir de un acceso quirrgico al sitio, eliminando tejido degenerado o daado, cortando el tejido adyacente
para acomodar el implante y eliminando el tejido de un sitio secundario que se usar para sujetar o sostener el implante. Por
ejemplo, si se implantan productos para la cicatrizacin de heridas, es fundamental que el sitio para el injerto no est infectado
y que el lecho de la herida est bien preparado. Cuando las clulas modificadas genticamente estn destinadas a corregir
defectos del cartlago, se debe preparar el sitio daado de manera que las clulas se puedan aplicar en un compartimiento
impermeable al agua. Para aplicaciones que implican la administracin directa del producto a un sistema orgnico (por ejemplo, el sistema broncoalveolar) o red vascular (por ejemplo, las arterias coronarias), puede ser necesario acceder al sitio mediante endoscopia o ciruga.
Adems de estos pasos, siempre se debe evaluar cuidadosamente la necesidad de anestesia y medicacin previa adecuadas
antes de administrar el producto. El examen del paciente antes de la administracin tambin debe evaluar los tratamientos
concomitantes que puedan interactuar con el producto de terapia gnica y modificar sus efectos. Algunos tratamientos pueden considerarse auxiliares de la terapia gnica, como las citoquinas que promueven la proliferacin o la diferenciacin del
tejido infundido o implantado. Se deben analizar otros frmacos frecuentes, como antibiticos, agentes antineoplsicos, anticoagulantes y antiinflamatorios, y determinar sus posibles efectos sobre la eficacia del producto de terapia gnica.
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Se deben implementar procedimientos de seguimiento y monitoreo para pacientes que han recibido vectores de terapia gnica o terapias gnicas ex vivo. Siempre que sea relevante y posible de evaluar, se deben controlar la distribucin biolgica y
persistencia in vivo de vectores o clulas modificadas genticamente. Cuando los vectores se administran directamente, la localizacin en la lnea germinal puede ser un problema. Si bien es posible recurrir a estudios preclnicos para abordar este problema, se puede obtener informacin til mediante el seguimiento del paciente. Cuando se administra un vector retroviral, se
debe controlar a los pacientes para detectar si los retrovirus son competentes para la replicacin (RCR, por sus siglas en ingls),
de acuerdo con el documento Guidance for Industry: Supplemental Guidance on Testing for Replication Competent Retrovirus in
Retroviral Vector-Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors (Gua para
la Industria: Gua Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicacin en Productos de Terapia Gnica Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clnicos con Vectores Retrovirales) de la
FDA (octubre de 2000). Lo anterior implica el monitoreo activo durante el primer ao y posteriormente archivar las muestras
del paciente si no se detectan RCR.
Los sistemas de bases de datos para cotejar y rastrear los resultados de monitoreo del paciente son esenciales para gestionar
esta informacin. Los registros nacionales o los datos publicados deben tomarse en cuenta para establecer la seguridad colectiva de la terapia gnica.
Captulos
MTODOS ANALTICOS
La complejidad y el alcance de los productos de terapia gnica se reflejan en la amplia variedad de procedimientos analticos
y sus mtodos, los cuales se emplean para evaluar la calidad del producto. Los productos de terapia gnica aprobados deben
cumplir con las secciones correspondientes del Ttulo 21 del CFR 211 y 610 para garantizar su identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad. La gua especfica para la identificacin, el desarrollo y la validacin de metodologas analticas para respaldar la
caracterizacin de bancos de clulas y virus, la liberacin del producto final y los estudios de estabilidad actualmente se provee
en las pautas de la FDA para fabricacin y anlisis de productos de terapia gnica (ver el Apndice); en Validacin de Procedimientos Farmacopeicos 1225; y las pautas Q2(R1) y Q6B de la ICH. La mayora de los mtodos analticos especficos para productos de terapia gnica no han sido estandarizados. Incluso pruebas bien definidas, como las descritas en Pruebas de Esterilidad 71, pueden no ser aplicables directamente a ciertos productos de terapia gnica. Es posible que no se disponga de grandes cantidades de material clnico durante el desarrollo clnico inicial de algunos de estos productos. Algunas de las pruebas
requeridas (p.ej. esterilidad) pueden requerir de modificaciones. Se recomienda consultar con las autoridades reglamentarias.
La Tabla 5 ofrece una visin general de los parmetros de prueba para productos especficos para los componentes biolgicos y mtodos o enfoques generales usados para cumplir con los requisitos de las pruebas para productos de terapia gnica
celular modificados genticamente, virales y no virales. El anlisis de productos de terapia gnica se basa, en gran medida, en
valoraciones biolgicas, pero tambin se recurre a metodologas desarrolladas para productos obtenidos por biotecnologa. El
objetivo de esta seccin es resear los tipos de mtodos y sus aplicaciones especficas respecto de las pruebas de caracterizacin, estabilidad y liberacin de productos. La validacin del proceso puede reducir la necesidad de ciertas pruebas especficas
de liberacin de lotes. El desarrollo del producto debe incluir la creacin de materiales de referencia adecuados y estndares
para productos de terapia gnica celular modificados genticamente, virales y no virales. Los materiales de referencia deben
estar bien caracterizados con el fin de proporcionar continuidad entre los estndares a lo largo del tiempo. En los productos de
terapia celular y gnica modificados genticamente, el material de referencia puede ser un tejido sustituto o producto simulado. Los materiales de referencia se tratan brevemente en la Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy
Products (Gua para la Industria: Pruebas de Potencia Para Productos de Terapia Celular y Gnica) de la FDA.
Los productos de terapia gnica celular modificados genticamente, virales y no virales pueden requerir de un mtodo de
liberacin rpida cuando presentan una vida til limitada (ver Productos Derivados de Clulas y Tejidos 1046). Este mtodo no
suele aplicarse a productos de terapia gnica viral y no viral, porque son suficientemente estables para completar las pruebas
antes de su liberacin. Algunos productos de terapia gnica no virales tambin tienen vidas tiles limitadas. En estos casos, se
analizan los componentes individuales antes de la liberacin y no se analiza el complejo formulado. La formacin y estabilidad
del complejo de terapia gnica no viral formulado se establece mediante estudios de validacin durante el desarrollo del producto.
Segn se especifica en el CFR, se deben conservar muestras de productos despus de completar las pruebas de liberacin de
producto. Si se emplean estrategias de liberacin rpida, se deben conservar muestras adicionales para poder reevaluar la calidad del producto con metodologas de prueba alternativas o tradicionales, si fuera necesario.
Tabla 5. Pruebas Analticas para Productos Biolgicos de Terapia Gnica y Celular
Productos de Terapia Gnica
Prueba
Producto de Terapia Gnica o Celular

Genticamente Modificado
Identidad de la
Sustancia
Biolgica
Determinacin del marcador de superficie

Especies
Morfologa
Valoracin Biolgica
Marcador Bioqumico
Mapeo por enzimas de restriccin

PCR
Mapeo por enzimas de restriccin
Inmunoensayo para gen exprePCR
sado
Inmunoensayo para gen expresado
Secuenciacin
Secuenciacin
Viral
No viral
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Tabla 5. Pruebas Analticas para Productos Biolgicos de Terapia Gnica y Celular (Continuacin)
Productos de Terapia Gnica
Prueba
Producto de Terapia Gnica o Celular

Genticamente Modificado
Dosis
Nmero de partculas
Unidades de transduccin (ensa- Peso del ADN plasmdico
Enumeracin de la poblacin celular espec- yo de hibridacin de ADN)
Valoracin por HPLC o electroforesis caProtena total
fica
pilar para determinar el peso del complejo
Ensayo por HPLC usando estn ADN total
formulado usando estndares de referencia
dares de referencia autentificados
Protena total
autentificados
Potencia
Nmero de clulas viables (clulas destinadas a reparacin estructural)

Valoraciones biolgicas
Ensayo de formacin de colonias
Funcin del gen expresado
Induccin de efecto secundario (p.ej., induccin del antgeno leucocitario humano
(HLA, por sus siglas en ingls), secrecin de
citoquinas y regulacin del marcador de superficie)
Funcin del gen expresado (induccin de efecto secundario y

otras valoraciones biolgicas)
Funcin del gen expresado (induccin de

efecto secundario y otras valoraciones biolgicas)
Pureza
Porcentaje de clulas viables

Porcentaje de clulas transducidas
Porcentaje de clulas con marcadores de
superficie especficos
Contaminantes del proceso (p.ej., suero)
ADN residual de clulas anfitrionas

Contaminantes del proceso
(p.ej., suero y cloruro de cesio)
Virus colaborador residual
Cociente de densidad ptica
Protenas residuales de clulas
anfitrionas
Perfil de protenas virales (valoracin por HPLC para partculas
defectuosas o inmaduras)
ARN residual
Porcentaje de forma fsica especfica

(p.ej., porcentaje de superenrollado)
ADN residual de clulas anfitrionas
ARN residual
Protenas residuales de clulas anfitrionas
Disolventes residuales
Cociente de densidad ptica
Contaminantes del proceso (p.ej., cloruro de cesio)
Seguridad
Micoplasma
Esterilidad
Pirgenos y endotoxinas
Virus adventicios
Virus residuales
Vector competente para la replicacin
Seguridad general
Esterilidad
Virus adventicios
VCR
Micoplasma
Esterilidad
Viral
No viral
El muestreo para las pruebas de liberacin de lote se debe basar en la potencial distribucin para el parmetro analizado. Ver
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad en Estabilidad (ms adelante) para consideraciones adicionales. Se deben conservar muestras de cada lote ante la posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un lote. Aunque la vida til del producto sea muy breve, se pueden utilizar estas muestras conservadas para detectar impurezas y otras sustancias. Se resalta la
necesidad de un buen diseo del esquema de obtencin de muestras en la prueba de seguridad de agentes adventicios o en la
evaluacin de VCR para productos de terapia gnica celular o viral modificados genticamente. En estos casos, la validacin
del proceso ayuda a determinar el diseo apropiado de muestreo estadsticamente fundamentado.
Seguridad
Las pruebas de seguridad para productos de terapia gnica tienen tres objetivos: (1) detectar contaminacin por agentes
adventicios durante el procesamiento del producto, (2) prevenir el uso de lneas celulares empaquetadoras y plsmidos que
podran permitir la recombinacin gentica entre vectores y las lneas celulares empaquetadoras o plsmidoso entre los mismos vectores y (3) analizar el producto final para asegurar un nivel seguro de variantes genticas y/o estructurales indeseadas
u otros virus usados en el procesamiento.
Las medidas primarias para evaluar la seguridad son la realizacin de ensayos biolgicos para medir agentes adventicios directamente. Tambin se utilizan valoraciones con tcnicas de biologa molecular para medir ADN o ARN de agentes adventicios o para detectar variantes genticas no deseadas. Aunque los vectores vivos modificados genticamente por ingeniera estn oficialmente fuera de su alcance, se debe consultar la informacin detallada disponible en la pauta Q5A de la ICH, presentada en el captulo 1050, puesto que los principios son aplicables.
PRODUCTOS DE TERAPIA GNICA VIRAL

Una de las cuestiones primarias de seguridad relacionada con vectores virales usados para terapia gnica es la aparicin de
variantes genticas no deseadas, de las cuales, el tipo ms crtico y probablemente mejor estudiado, es el VCR. El VCR est
Captulos
Aspectos sobre el Muestreo
Captulos
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definido de manera ms clara para vectores virales incompetentes para la replicacin, pero para virus condicionalmente competentes para la replicacin se refiere a variantes genticas no deseadas que han perdido selectividad hacia las clulas blanco,
generando as inquietudes sobre la seguridad. Independientemente del virus, estos problemas se fundan en que no siempre es
posible prever la patogenicidad de un virus contaminante para una va especfica de administracin, en especial si no es la va
habitual de infeccin o si los seres humanos no son el anfitrin natural para el virus. Se conoce la patogenia de la infeccin por
adenovirus salvaje, pero no siempre es til para predecir la patogenia por las vas de administracin de vectores adenovirales
recombinantes. En la actualidad, para vectores adenovirales incompetentes para la replicacin, se considera aceptable un lmite de un ACR por 3 1010 partculas virales (ver el documento Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of
Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)
(Gua para Revisores y Auspiciadores de la FDA: Contenido y Revisin de Informacin Qumica, de Fabricacin y Control (CMC)
para Nuevas Aplicaciones Farmacolgicas Investigativas (IND) de Terapia Gnica en Humanos].
Por lo regular, los niveles de ACR se determinan mediante un ensayo basado en clulas que permite amplificar el ACR al
tiempo que evita la replicacin del producto. La lnea celular que se usa ms a menudo para amplificar y detectar ACR es la
A549. Sin embargo, algunos vectores adenovirales recombinantes expresan genes teraputicos que interfieren en el anlisis
con clulas A549. En tales casos, se usan lneas bicelulares basadas en valoraciones biolgicas. La primera lnea de clulas se
selecciona basndose en la resitencia a los efectos de expresin del transgn y con pasaje subsiguiente de lisado celular o sobrenadante sobre clulas A549 para amplificacin y deteccin del ACR. El ACR a menudo se detecta mediante observacin visual del efectos citoptico, pero tambin se puede detectar en el cultivo de clulas A549 por mtodos inmunolgicos o basados en PCR.
La cuantificacin del nivel de ACR se basa en la cantidad de muestra analizada y el lmite de deteccin de la valoracin. Por
lo general, las valoraciones biolgicas de ACR se validan como capaces de detectar 1 unidad formadora de placa o unidad
infecciosa de ACR en la muestra de prueba en una amplia gama de tamaos de muestras de prueba. Los tamaos de muestras
de prueba pueden variar, pero por lo regular se basan en el lmite de aceptacin para ACR de la FDA. Para verificar los lmites
de deteccin, se deben incluir como parte de la prueba controles con cantidades agregadas conocidas, incluso con valoraciones validadas. Para adenovirus recombinantes producidos con clulas HEK293, la deteccin de ACR por PCR en los productos
finales o la progenie de un virus amplificada en las clulas HEK293 puede alterarse por la deteccin de ADN residual de clulas
anfitrionas HEK293 (deteccin de la regin E1). Sin embargo, las valoraciones por PCR se pueden disear para cuantificar especficamente la contaminacin del ADN de clulas anfitrionas y hacerlas especficas para formas particulares de ACR de crecimiento lento. Las ensayos cuantitativos por PCR se pueden utilizar junto con un mtodo basado en clulas para cuantificar los
ACR de manera precisa. Cuando se detecta una muestra de prueba positiva, la identidad del ACR suele confirmarse mediante
un anlisis por PCR. Lo anterior descarta la posibilidad de que la contaminacin del ensayo con adenovirus salvajes exgenos u
otros agentes adventicios sea responsable del resultado positivo.
Para adenovirus condicionalmente competentes para la replicacin u otros vectores virales competentes para la replicacin,
el anlisis de VCR o variantes genticas indeseadas a menudo es ms complicado y especfico del vector. Por lo general, una o
dos lneas celulares no permisivas que no son clulas blanco se infectan con el virus competente para la replicacin con la intencin de producir la progenie del virus. Para poder generar una cantidad suficiente de poblacin de progenie para su anlisis, los analistas someten a la infeccin a mltiples pasajes y a un tiempo de cultivo prolongado. Se han usado dos lneas celulares de fibroblastos normales fciles de cultivar, la WI-38 y la MRC-5, como el modelo de lneas celulares no permisivas para
detectar ACR en productos de adenovirus competentes para la replicacin. Incluso despus de mltiples pasajes en las lneas
celulares no permisivas, puede ser necesario amplificar la progenie (la cual tiende a presentarse en cantidades diminutas) en
lneas celulares permisivas o empaquetadoras hasta una cantidad suficiente para anlisis subsiguiente. La progenie resultante
debe analizarse para determinar cambios en la selectividad biolgica y en la composicin gentica. Por lo regular, la caracterizacin gentica de la poblacin de progenie incluye el mapeo por enzimas de restriccin seguido de transferencia Southern
(blotting), PCR o secuenciacin de nucletidos. Despus de identificar los elementos genticos exclusivos del VCR o las variaciones genticas indeseadas, se pueden disear ensayos cuantitativos por PCR para monitorear el nivel de VCR despus de la
amplificacin en lneas de clulas no permisivas o, en ocasiones, si la sensibilidad es adecuada, directamente en el producto
final sin amplificacin biolgica. Se recomienda el uso de un control de cantidades agregadas conocidas en la valoracin biolgica para detectar VCR, aunque puede no ser aplicable a todos los casos. En la actualidad no existe un lmite aceptable especificado de ARC para adenovirus condicionalmente competentes para la replicacin, aunque se ha informado sobre la seguridad
clnica para una aplicacin oncolgica con varios miles de ACR por dosis.
Para vectores retrovirales, es necesario el anlisis de RCR para bancos de clulas, lotes de produccin de vectores virales y
cualquier lote de producto resultante ex vivo (ver Guidance for Industry: Supplemental Guidance on Testing for Replication-Competent Retrovirus in Retroviral Vector-Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral
Vectors [Gua para la Industria: Gua Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competentes para la Replicacin en Productos de Terapia Gnica Basada en Vectores Retrovirales y Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clnicos con Vectores
Retrovirales] de la FDA). Se han diseado valoraciones estndar para detectar VLM competente para la replicacin. Se desconoce la patogenia y la potencial toxicidad a largo plazo del VLM anfotrpico de bajo nivel en seres humanos. Los mtodos habituales para detectar RCR incluyen una amplificacin del ttulo viral aplicando el producto a una lnea celular que puede replicarse, como Mus dunni. Debido a que la infeccin se ve limitada por la capacidad de un virus de llegar a las clulas mediante
movimiento browniano, se pueden usar procedimientos (p.ej., centrifugacin y filtracin) que fsicamente ponen en contacto
al virus con las clulas a fin de mejorar la deteccin. Sin embargo, el vector recombinante de ttulo alto puede interferir con la
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PRODUCTOS DE TERAPIA GNICA NO VIRAL

El anlisis de seguridad por lo general se centra en mtodos similares a los descritos en los captulos 88 y 71. Las pruebas
de seguridad deberan realizarse en material formulado no viral. Si la vida til del producto no viral formulado es muy corta, los
componentes deben analizarse de manera individual.
Las pruebas de seguridad para variaciones genticas no deseadas que pueden surgir durante el proceso de fabricacin en
productos de terapia gnica no viral son similares a las del anlisis de VCR para vectores virales pero con ms consideraciones
especficas para los vectores. Por lo general, los mtodos basados en biologa molecular se aplican al producto final para probar las variaciones. Cuando la estabilidad gentica se establece mediante validacin del proceso, los ensayos para monitorear
los niveles de variaciones genticas no deseadas se pueden limitar al mapeo por enzimas de restriccin seguido por la confirmacin adicional de elementos genticos crticos (tal como transgenes o elementos reglamentarios) mediante PCR o transferencia Southern.
Ensayos de Determinacin de Dosis

Al ensayo que mide, con precisin, la cantidad de producto se le denomina ensayo de determinacin de dosis y se selecciona basndose en su exactitud y precisin. Un ensayo que mide la actividad teraputica de un producto recibe el nombre de
valoracin de potencia y se disea para medir la funcin del producto. El diseo del ensayo depende del tipo de producto. En
el caso de medicamentos qumicos y proteicos, los ensayos que determinan la cantidad de frmaco (dosis) se llaman valoraciones de contenido. La dosis de producto se puede definir como la concentracin o cantidad del medicamento administrado al
paciente y por lo general se mide como la masa de producto.
La concentracin de partculas es una medicin comnmente usada para dosis de producto de vectores virales. Se puede
medir con ensayos fsicos, biofsicos o celulares in vitro. Por ejemplo, es posible cuantificar las partculas adenovirales purificadas empleando la densidad ptica de una solucin viral en solucin de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en ingls)
al 0,1% (p/v), a 260 nm, porque se ha publicado una relacin entre la absorcin y la concentracin de partculas de adenovi-
Captulos
deteccin de RCR de bajo nivel, y dichos mtodos pueden aumentar esta interferencia. Las clulas infectadas se someten a
varios pasajes para permitir la replicacin viral. El medio de cultivo se cosecha al final del perodo de cultivo y se detecta RCR
mediante una lnea celular indicadora. Si el producto es un VLM anfotrpico, se puede hallar RCR con un ensayo de PG4 S+L
basado en clulas felinas, un ensayo MiCl S+L basado en clulas de visn o un ensayo de rescate con marcadores. En los ensayos S+L, el RCR expresa protenas que conducen a la transformacin y la posterior formacin de placas en la monocapa. En
un ensayo de rescate con marcadores, el RCR infecta una lnea celular que expresa un vector retroviral que codifica un gen
marcador, como la b -galactosidasa, resistencia a frmacos o una protena fluorescente. El vector es empaquetado por las protenas que le son suministradas en trans por el RCR. El sobrenadante potencialmente cargado con vectores se transfiere a clulas blanco vrgenes que se analizan para determinar la expresin del vector marcador.
El anlisis de RCR se lleva a cabo mediante cocultivo de la lnea de clulas o la amplificacin del sobrenadante cargado de
vectores con una lnea de clulas que permite la replicacin de RCR, generalmente M. dunni, durante varios pasajes. El medio
de cultivo se cosecha al final de este proceso de cocultivo y se aplica a una lnea de clulas indicadoras apropiada, como se ha
descrito anteriormente. Es importante sealar que se pueden generar artefactos durante el ensayo de cocultivo por la expresin de un virus endgeno en la lnea de clulas permisivas o mediante fusin, si la lnea de clulas productoras del vector se
cultiva directamente con una lnea de clulas de rescate con marcadores. Asimismo, el cocultivo puede no ser posible para
productos celulares ex vivo con requisitos de cultivo especficos o vidas de cultivo limitadas.
No se especifican las metodologas para analizar la presencia de RCR en crudo, productos de vectores finales o a granel. La
FDA ha presentado a la American Type Culture Collection (Centro Estadounidense de Colecciones de Cultivos o ATCC) un estndar de referencia de un VLM hbrido anfotrpico. A este depsito viral se le ha asignado un ttulo de marcacin, que debe
emplearse en la validacin del ensayo. La validacin del mtodo debe demostrar la capacidad de detectar, de manera reproducible, una nica partcula de RCR en tipos individuales de productos, porque el producto y sus impurezas pueden interferir en
la deteccin del RCR. En la actualidad, no hay lmites aceptables para la contaminacin de productos con RCR. No se pueden
usar en humanos lotes de productos que contengan RCR. No se han desarrollado estndares de referencia para evaluar VCR en
otros vectores virales, como el VLM ecotrpico, xenotrpico o seudotipado, adenovirus y lentivirus. El material de referencia de
adenovirus, que consiste en adenovirus humano salvaje tipo 5, se ha usado como control de cantidades agregadas conocidas y
durante la validacin de ensayos de ACR, pero sta podra no aplicar para todos los ensayo de ACR. La amplificacin y deteccin de VIH competente para la replicacin, especialmente sus variaciones seudotipificadas, pueden requerir procedimientos
de contencin y manipulacin especiales.
Los anlisis de seguridad adicionales por lo general se centran en mtodos similares a los descritos en los captulos Pruebas
de Reactividad Biolgica, In Vivo 88, Pruebas de EsterilidadProductos Biolgicos 71. Para vectores para terapias gnicas virales
producidas con una lnea celular humana, se recomiendan las valoraciones biolgicas con agentes adventicios in vitro utilizando tres lneas celulares. Para vectores adenovirales, tambin se recomiendan las pruebas especficas para virus asociados con
adenovirus. Para virus asociados con adenovirus, se recomiendan pruebas especficas para adenovirus y virus del herpes. El material para anlisis se debe derivar de la etapa de fabricacin que ofrece la mayor posibilidad de deteccin, que puede ser en el
producto previo al granel (p.ej., fermentacin en etapa tarda), a granel o final.
Captulos
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rus. La concentracin de nmero de partculas es equivalente al producto de la absorbancia a 260 nm en una celda de 1 cm, el
factor de dilucin y 1,1 1012 partculas. Un mtodo que se ha estandarizado para determinar la concentracin de partculas
es la integracin del rea del pico viral de absorbancia a 260 nm y/o 280 nm contra un estndar de referencia autenticado en
un ensayo por cromatografa lquida de alta resolucin basada en resina de intercambio aninico (HPLC). En comparacin con
el mtodo de densidad ptica, el mtodo por HPLC presenta como ventaja la eliminacin de la interferencia de ADN libre y/o
protenas de la cpside en la cuantificacin de partculas virales. El material de referencia de adenovirus (ARM, por sus siglas en
ingls) de la ATCC tiene una concentracin de partculas determinada por HPLC derivada de una colaboracin a gran escala
que implic a muchos laboratorios. Siempre que sea posible, se debe usar el ARM para calibrar el mtodo de HPLC interno y el
material de referencia.
La concentracin de virus tambin se puede evaluar midiendo protenas estructurales seleccionadas con masas moleculares
conocidas y nmeros de copias conocidos dentro del virin. Para este mtodo, el virus debe lisarse y las protenas estructurales
deben separarse usando un procedimiento cromatogrfico apropiado de alta recuperacin (p.ej., HPLC de fase reversa). La separacin cromatogrfica y la identidad y la pureza de la protena estructural seleccionada deben verificarse durante la validacin de la valoracin con mtodos, como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), secuenciacin de pptidos y espectroscopa de masas. Las protenas estructurales seleccionadas pueden ser cuantificadas, por ejemplo, integrando los
picos cromatogrficos a 214 nm y comparando el rea con la de un estndar de referencia autenticado. Luego se puede calcular la concentracin viral sobre la base de la masa molecular, el nmero de copias y la masa medida de protena. Cabe sealar
que es posible estimar simultneamente la concentracin viral a partir de mltiples protenas estructurales, lo que permite utilizar esta valoracin en preparados de virus relativamente impuros. Este mtodo ha sido aplicado a adenovirus y debera ser
aplicable a otros tipos de vectores virales.
Los mtodos biofsicos para determinar el nmero de partculas incluyen la cuantificacin directa del cido nucleico del vector mediante hibridacin con sonda radiomarcada y la cuantificacin indirecta mediante amplificacin de un molde de cido
nucleico (p.ej., PCR y RT-PCR) o mediante amplificacin de seal (p.ej., ADN de cadena ramificada usando hibridacin con
sonda mltiple).
Cuando no se dispuso de mtodos biofsicos, se han usado valoraciones biolgicas que miden el ttulo de vector gnico.
Estas incluyen infeccin, transfeccin o transduccin de una lnea celular susceptible in vitro, seguida de alguna medicin de la
respuesta del producto. Los mtodos para cuantificar o estimar el nmero de episodios de infeccin, transfeccin o transduccin incluyen valoraciones de unidades formadoras de placa, valoraciones de dosis infecciosa en cultivo de tejidos basadas en
efectos citopticos de 50% (TCID50) o deteccin inmunofluorescente de una protena expresada del vector o un ensayo cuantitativo de hibridacin de ADN. Los ejemplos incluyen: Para productos de terapia gnica adenoviral competente para la replicacin, el ARM disponible en ATCC tiene un intervalo definido de ttulo TCID50 determinado mediante un esfuerzo colaborativo.
Siempre que sea aplicable, se debe usar en la validacin de un estndar de referencia interno o un control de ensayo para
ensayos de ttulo infeccioso. Sin embargo, debido a la posibilidad de diferencias genticas entre el ARM, que es adenovirus
humano salvaje tipo 5, y el producto de terapia gnica adenoviral competente para la replicacin, puede no ser aconsejable
normalizar el ttulo del vector de inters con el del ARM.
Para productos de terapia gnica retroviral o lentiviral o VAA que portan un marcador seleccionable (p.ej., para resistencia a
la neomicina) o un gen indicador (p.e., b -galactosidasa) adems del gen teraputico, el ttulo infeccioso a menudo se determina midiendo el nmero de clulas transducidas infectadas que expresan estas protenas no teraputicas. Por lo general, el
ttulo del vector se expresa como el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) por mL para clulas transducidas con
vectores virales que contengan marcadores de resistencia a frmacos y se seleccionan para crecer en un medio que contenga
el frmaco. El ttulo basado en b -galactosidasa se puede expresar en ufc azules por mL, despus de teir y contar las clulas
que convierten el sustrato X-Gal de la b -galactosidasa en un cromforo azul. Para vectores sin un gen marcador, la cuantificacin de transduccin se ha medido con presicin usando PCR cuantitativa o se ha estimado usando mtodos de hibridacin.
La mayora de los productos de terapia gnica no virales contiene ADN plasmdico y su medida de dosis habitual es la masa
de ADN. sta se puede determinar en el estado formulado y, si se incluye protena recombinante en la formulacin, se puede
emplear la masa combinada total de todos los componentes, basada en un cociente especfico. La medicin por densidad ptica a 260 nm es la manera ms simple de calcular concentraciones de ADN superiores a 500 ng/mL. Este mtodo, por lo general, no se puede aplicar al ADN en formulacin lipdica. Debido a que el ARN y las protenas tambin presentan absorbancia
significativa a 260 nm, se deben efectuar otros anlisis para demostrar una contaminacin mnima con ARN, protenas o ADN
cromosmico residual de clulas anfitrionas. Los colorantes que se unen especficamente al ADN de doble cadena permiten
medir con exactitud concentraciones de ADN inferiores a 500 ng/mL, cuando se calculan con respecto a una curva estndar
de ADN autenticada. PicoGreen es uno de los colorantes fluorescentes y se ve mnimamente afectado por ADN de cadena simple, ARN, protenas, sales y detergentes. El colorante fluorescente Hoechst 33258 tambin une tanto el ADN de cadena simple
como el de doble cadena y se puede usar para determinar concentraciones de ADN tan bajas como 0,3 ng/mL. El Hoechst
33258 no se une a la protena ni al ARN y puede determinar con exactitud las concentraciones de ADN en muestras crudas.
Asimismo, se pueden emplear mtodos tales como la electroforesis capilar y la HPLC que usan un material de referencia autentificado para determinar el contenido de productos no virales.
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Potencia
Pureza
Los mtodos analticos que separan, aslan y especficamente cuantifican los componentes del producto activo, determinan
la pureza del producto. Las impurezas son componentes relacionados con el producto o el proceso que se pueden trasladar al
producto final. Se debe optimizar el proceso de fabricacin y purificacin a fin de eliminar impurezas constantemente y, al
mismo tiempo, conservar la actividad del producto. El requisito de detectar una impureza particular para la liberacin de un
lote depende de: (1) la capacidad demostrada del proceso de fabricacin y purificacin para eliminar o inactivar la impureza
durante la validacin de proceso y (2) la toxicidad potencial asociada con la impureza.
Entre los ejemplos de impurezas relacionadas con el proceso asociadas con los productos de terapia gnica se incluyen componentes del medio de produccin (p.ej., SFB, suero fetal bovino), antibiticos, citoquinas y ADN cromosmico de E. coli en
un producto plasmdico), productos auxiliares usados en el procesamiento subsiguiente (p.ej., las nucleasas tales como ADNasa I) y humedad residual para productos de vectores liofilizados. Las impurezas pueden ser bioactivas (p.ej., citoquinas y hormonas) o inmunognicas (p.ej., agregados de productos, productos de degradacin, marcadores de seleccin de plsmidos y
protenas no humanas) o bien pueden ejercer otros efectos perjudiciales (p.ej., pueden competir con el producto) si se administran a una dosis igual a la del producto. Las impurezas relacionadas con el producto son especficas para cada tipo de producto. Los ejemplos incluyen formas de plsmidos mellados (nicked) en productos no virales y partculas defectuosas o inmaduras en productos de vectores retrovirales o adenovirales. Las metodologas analticas para evaluar la pureza requieren la
Captulos
La potencia se define como la actividad teraputica del producto farmacutico. Junto con la dosis, la potencia define la actividad biolgica de cada lote (ver Ensayos de Determinacin de Dosis). La potencia se puede evaluar con valoraciones biolgicas
in vitro o in vivo. No es extrao que estas valoraciones tengan coeficientes de variacin entre 30% y 50%, aunque un diseo
de valoracin estricto con buena consideracin estadstica puede ayudar a reducir variaciones en la valoracin. Estas valoraciones requieren un material de referencia representativo bien definido que se pueda usar como control positivo para la valoracin y/o para calcular la potencia relativa del artculo de prueba. Las consideraciones generales para valoraciones biolgicas en
los captulos vigentes de USP sobre diseo y desarrollo de valoraciones biolgicas se deben aplicar al diseo de valoracin de
potencia para productos de terapia gnica. El control positivo califica el rendimiento de una valoracin individual. El desarrollo
de las valoraciones de potencia debe centrarse en la caracterizacin y control de la variabilidad. Las valoraciones de alta precisin son herramientas ms eficaces para controlar la calidad del producto. La informacin sobre la variabilidad en las valoraciones de potencia se debe incluir en el diseo del estudio de estabilidad y en la metodologa estadstica propuesta para asignar la
fecha de caducidad (ver Estabilidad).
Las valoraciones biolgicas empleadas para medir la potencia de productos de terapia gnica viral y no viral por lo general
implican la infeccin, transfeccin o transduccin de una lnea celular susceptible in vitro, seguida por alguna medida funcional del gen de inters expresado. Por lo general, se deben usar valoraciones funcionales para el gen teraputico (p.ej., aquellos
que miden la actividad enzimtica y la estimulacin o inhibicin de crecimiento celular) en lugar de mtodos analticos tales
como enzimoinmunoensayo (ELISA). Cuando la funcin biolgica del transgn expresado presenta una amplia variedad de actividades o nicamente genera resultados semicuantitativos, el ELISA u otras lecturas inmunolgicas o bioqumicas se pueden
usar como valoraciones de potencia sustitutas con un estrecho intervalo de especificacin si se cuenta con datos extensos de
caracterizacin para demostrar que toda protena expresada es biolgicamente activa. Por ejemplo, para los productos de terapia gnica que expresan una citoquina, la expresin de la citoquina por lo regular se cuantifica primero mediante ELISA y el
resultado se usa para ajustar la dilucin de muestra para la valoracin funcional. La potencia de tales vectores se puede controlar mejor mediante los resultados de cuantificacin del ELISA, pero la actividad biolgica de la citoquina expresada se puede
usar para verificar que la masa medida es biolgicamente activa sin tener que cumplir con un intervalo de especificacin estrecho para la actividad biolgica misma.
La HPLC o la citometra de flujo, que proveen informacin sobre el nivel de expresin pero que slo infieren la funcin, tambin se han usado en un contexto parecido al descrito para inmunoensayos. Asimismo, para vectores virales, las mediciones de
ttulo infeccioso por s solas, por lo general, no se consideran como una medida adecuada de potencia del producto. Por ejemplo, el ttulo de TCID50 o las valoraciones de unidades formadoras de placas para vectores adenovirales en clulas
HEK293 pueden indicar que se conserva la infectividad del adenovirus pero no confirma que el producto adenoviral haya mantenido sus funciones biolgicas completas, especialmente la actividad biolgica del transgn. El diseo y la aptitud final de un
sistema de valoraciones para determinar la potencia depende de la relacin entre la clula humana blanco in vivo y: (1) la
eficiencia de transduccin o transfeccin de la lnea celular utilizada in vitro, (2) los niveles de expresin de protenas y (3) el
tiempo de expresin necesario para lograr el efecto teraputico.
Las pruebas in vivo tambin se pueden usar para medir la potencia del vector en el producto. Las lecturas se pueden basar
en una respuesta por animal (p.ej., los niveles sanguneos de la protena teraputica a las 24 horas del tratamiento) o una tasa
de respuesta grupal (p.ej., el porcentaje de animales que obtuvo una respuesta inmunitaria o sobrevivi al desafo del virus). La
disponibilidad de un sistema de pruebas in vivo apropiado depende del intervalo vector-anfitrin (para vectores virales), la farmacocintica y la distribucin biolgica del vector y su producto gnico resultante comparado con su equivalente humano y
del tiempo necesario para observar el efecto teraputico o el efecto indirecto. Factores como el costo, las instalaciones, la validacin y la tica determinan si una prueba de potencia in vivo resulta prctica.
USP 38
cuantificacin de las impurezas o su separacin fsica del producto. El sentido comn debera determinar si es necesario cuantificar las impurezas especficas. La validacin adecuada del proceso de fabricacin puede limitar la necesidad de pruebas de
liberacin para lotes especficas para impurezas. Los fabricantes pueden poner nfasis en demostrar la uniformidad del perfil de
impureza del producto.
La prueba para impurezas es a menudo extensa durante la caracterizacin del producto y la validacin del proceso cuando
se est demostrando la uniformidad del proceso de fabricacin y purificacin. El anlisis de impurezas como parte del anlisis
de liberacin del lote debe reflejar los riesgos de seguridad asociados con la impureza y la capacidad del proceso para eliminar
consistentemente tal impureza.
Captulos

En vectores virales, las impurezas relacionadas con el producto incluyen agregados y partculas defectuosas e inmaduras que
se pueden generar durante la fabricacin o purificacin del vector recombinante. Se pueden formar agregados de vector si el
producto es altamente concentrado, se almacena en ciertas condiciones (p.ej., a un pH o temperatura dados) o reconstituido
despus de la liofilizacin. Las valoraciones para detectar agregados incluyen anlisis de tamao de partcula mediante dispersin de luz con lser y el uso de PAGE no desnaturalizante y no reductora, seguido por tincin de gel o transferencia y deteccin de protenas virales mediante anlisis de transferencia Western. El anlisis de velocidad de sedimentacin tambin puede
permitir la separacin de agregados de monmeros basados en tamao. Los anlisis de densidad ptica de dispersin de luz
tambin se usan para evaluar la agregacin de vectores.
Las partculas defectuosas son partculas virales sin el genoma recombinante apropiadoes decir, contienen algn otro cido nucleico o no contienen ningn genoma o el vector contiene algn componente estructural defectuoso o alterado de alguna otra manera que disminuye su capacidad de transducir una clula. En sistemas de vectores virales con simetra capsomrica,
que requiere la incorporacin apropiada de cido nucleico para la configuracin, es posible distinguir con facilidad las partculas vacas de las que portan genomas. Es probable que no se puedan separar tan fcilmente las partculas vacas de aqullas
con cido nucleico encapsidado en virus con envoltura.
La HPLC analtica es til para separar partculas virales activas de las defectuosas en algunos productos de vectores virales. Se
han empleado resinas de intercambio aninico para separar el adenovirus activo de partculas virales defectuosas. No obstante,
este mtodo puede no ser til para un vector adenoviral purificado mediante cromatografa de intercambio aninico, a menos
que la resina para la valoracin sea diferente de la usada en la fabricacin. Dependiendo de la naturaleza del vector viral y sus
formas no activas o defectuosas, puede ser necesario que otros mtodos de separacin, tales como centrifugacin de equilibrio
en un gradiente de densidad con cloruro de cesio, precedan la cuantificacin de la partcula activa. El mtodo de separacin
idealmente permitir la cuantificacin.
Las partculas defectuosas que portan un oncogn no derivado de la clula u otros genes no deseables pueden representar
una preocupacin especial. Por ejemplo, en lneas de clulas murinas que aportan la envoltura al retrovirus, se pueden empaquetar pequeos elementos virales, llamados secuencias VL30, en aproximadamente un tercio de las partculas. Se puede requerir de valoraciones para cuantificar partculas defectuosas especficas cuando se sepa que estn presentes en cantidades suficientes para representar una preocupacin de seguridad.
La calidad del virus y la comparabilidad de preparaciones tambin se puede evaluar midiendo protenas estructurales seleccionadas con masas moleculares conocidas y nmeros de copia conocidos dentro del virin. Para este mtodo, el virus se lisa y
las protenas estructurales se separan usando HPLC en fase reversa o algn otro procedimiento cromatogrfico de alta recuperacin. La separacin cromatogrfica debe validarse y se debe verificar la identidad de las protenas estructurales seleccionadas
por mtodos tales como SDS-PAGE, secuenciacin de pptidos o espectroscopa de masas. La identificacin gentica de la partida se puede llevar a cabo basndose en la cuantificacin de las protenas estructurales seleccionadas y su comparacin con
un estndar de referencia. Cuando el mtodo incluye la espectroscopa de masas, tambin se pueden identificar impurezas,
como las variantes estructurales. Para las preparaciones de adenovirus, algunos precursores y la mayora de las protenas virinicas maduras se pueden detectar y distinguir, permitiendo el monitoreo del producto y de las formas virinicas inmaduras.
Las protenas derivadas de las clulas anfitrionas se pueden considerar impurezas para algunos productos de vectores virales
y se pueden separar y cuantificar mediante PAGE o HPLC o detectarse mediante anlisis de aminocidos, transferencia Western
(Western blot) o mtodos basados en inmunoensayos. Sin embargo, para virus con envoltura, como los retrovirus, las protenas de membrana derivadas de clulas anfitrionas son una parte integral del producto. En esos sistemas de vectores, puede ser
complicado determinar la presencia de protenas contaminantes exgenas derivadas del anfitrin.
La presencia de impurezas especficas relacionadas con el proceso depende de los procesos de fabricacin y purificacin de
cada tipo de vector o producto. No obstante, la mayora de los productos deben ser analizados para detectar endotoxinas residuales (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas 85). Se han establecido lmites aceptables de endotoxinas, que se pueden aplicar directamente a productos de vectores virales. Histricamente, se ha considerado que el ADN genmico proveniente de
sustratos celulares continuos empleados para fabricar productos biolgicos era potencialmente tumorgeno, pero estudios recientes sugieren que los riesgos son muy bajos. Sin embargo, durante el desarrollo del proceso, debera intentarse reducir los
niveles de ADN contaminantes. La necesidad de analizar el ADN residual como parte de la liberacin de lote de producto se
debe evaluar caso por caso y puede depender de la distribucin del tamao del ADN, su asociacin con el producto o sus
componentes de formulacin y la va de administracin del producto. Los ensayos cuantitativos por PCR pueden analizar la
USP 38
cantidad de ADN residual de clulas anfitrionas usando cebadores diseados para amplificar secuencias blanco conservadas
evolutivamente y abundantes tales como 18S para clulas HEK293.
La cuantificacin de componentes sricos residuales tales como albmina srica bovina (ASB) se puede lograr usando ELISA y
un estndar de referencia de ASB. Puede ser necesario que los investigadores desarrollen mtodos funcionales o inmunolgicos
especficos para otros productos auxiliares, incluyendo otros medios de cultivo o componentes del proceso de purificacin tales como citoquinas o enzimas (p.ej., desoxirribonucleasa 1 o nucleasa benzon).
PRODUCTOS DE VECTORES VIRALES Y NO VIRALES LIOFILIZADOS

La humedad residual puede afectar la estabilidad de un producto de vectores liofilizado. La Gua de Determinacin de Humedad Residual en Productos Biolgicos Secos de la FDA recomienda una humedad residual del 1%, aunque se consideran aceptables los datos que indiquen que no hay efectos adversos sobre la estabilidad del producto a niveles ms altos. Los niveles de
humedad residual se pueden determinar con un mtodo estndar (ver Determinacin de Agua 921) compatible con el producto formulado.
Captulos
Un plsmido usado como frmaco se considera como un producto biolgico bien caracterizado, mientras que las impurezas
clave del proceso de fabricacin son bien conocidas. El anlisis por lo general se lleva a cabo en cada componente individual:
el ADN plasmdico, reactivos lipdicos o lipoplxicos y componentes proteicos si se encuentran presentes en la formulacin. EL
ADN plasmdico se caracteriza para una variedad de impurezas, incluyendo ADN residual de clulas anfitrionas, ARN residual y
protena residual. Las pruebas de protenas residuales se suelen incluir en las pruebas de liberacin de lotes. Con frecuencia, los
cocientes de densidad ptica (usualmente la medicin entre 260 nm y 280 nm) se usan en las especificaciones de pureza para
ADN plasmdico.
Asimismo, el ADN plasmdico se debe caracterizar con respecto a su conformacin en solucin. El ADN plasmdico se presenta en forma monomrica superenrollada, monomrica relajada y lineal. Puesto que todas las formas se pueden generar durante la fermentacin a gran escala y los datos sobre su potencia relativa in vivo son escasos, la cantidad relativa de cada forma
se monitorea para verificar la uniformidad entre partidas en las cantidades relativas de cada conformacin. La electroforesis en
gel de agarosa puede resolver cada una de estas formas pero no es altamente cuantitativa para cada especie individual. La
HPLC analtica de intercambio aninico funciona como anlisis cuantitativo para la conformacin monomrica superenrollada
y de otras conformaciones, como los concatmeros. Otros mtodos analticos que han sido valiosos para la caracterizacin de
construcciones plasmdicas durante el desarrollo del proceso y validacin tales como electroforesis capilar en gel, dicrosmo de
flujo lineal y microscopa de fuerza atmica, tambin son viables para evaluar la pureza de una preparacin plasmdica determinada. El mtodo ms apropiado para la liberacin de lote depende de cmo afecta cada plsmido a la potencia del producto. Los detalles especficos para cada uno de estos mtodos se resaltan en el captulo Tcnicas Basadas en cidos Nucleicos
Generalidades 1125.
Las pruebas deben realizarse para impurezas relacionadas del proceso tales como disolventes orgnicos residuales (fenol, alcohol), sales y ciertos antibiticos tales como kanamicina usados durante el proceso de fermentacin. Se deben analizar tambin los componentes de formulaciones lipdicas y lipoplex para determinar su pureza qumica. Las pruebas para impurezas
qumicas especficas comnmente se realizan con cromatografa de gasesespectroscopa de masas (GCMS), HPLC o cromatografa en capa delgada (TLC). Si la protena forma parte del complejo formulado, tambin se debe comprobar su pureza. La
HPLC es capaz de detectar cantidades de trazas de antibiticos residuales y pueden, por lo tanto, usarse durante la validacin
del proceso o el anlisis de liberacin de lote para confirmar que hayan sido eficazmente eliminadas. Los aspectos especficos
de estos mtodos se detallan en Artculos Obtenidos por BiotecnologaMapeo de Pptidos 1055 o en Artculos Obtenidos por
BiotecnologaValoracin de Protenas Totales 1057.
Las protenas, el ADN, el ARN y las endotoxinas bacterianas son los principales tipos de contaminantes del proceso derivados
del anfitrin. Se pueden emplear valoraciones estndar de protenas (p.ej., Lowry, Bradford o Coomassie), PAGE seguida de
tincin argntica o Western blot, o ELISA a fin de detectar protenas residuales del anfitrin con sensibilidad de nanogramos. El
ADN cromosmico del anfitrin se puede detectar por hibridacin slot blot (deteccin en picogramos) o por PCR en tiempo
real (sensibilidad de deteccin < 1pg) utilizando secuencias altamente conservadas (p.ej., 18S para E. coli). Los ensayos por PCR
para este propsito deben usar polimerasas recombinantes altamente purificadas para minimizar el ADN bacteriano residual
cuya presencia puede crear seales de fondo. Se puede emplear PAGE o electroforesis en gel de agarosa, seguidas de tincin
fluorescente, para detectar ARN residual. Es posible que la cuantificacin no sea necesaria, debido a la naturaleza lbil del ARN
y su escasa toxicidad. La prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL, por sus siglas en ingls) es el mtodo ms sensible y
ampliamente usado para la determinacin de endotoxinas. Los ensayos colorimtricos ofrecen sensibilidades de 0,005 UE/mL.
Los detalles de los mtodos descritos en este captulo se resaltan en los captulos 1057, Artculos Obtenidos por Biotecnologa
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida 1056, Tcnicas Basadas en cidos NucleicosEnfoques para Detectar Trazas de cidos Nucleicos 1130, 1125 y 85.
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Identidad
El anlisis de liberacin de lote para productos de terapia gnica debe incluir una prueba de identidad. Esta prueba identifica
claramente el producto y confirma que no haya ocurrido la sustitucin inadvertida por otro producto. Su complejidad depende de la naturaleza del producto especfico y de la gama de productos que se fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo
pruebas ms exhaustivas y rigurosas para un producto de terapia celular modificado con gen autlogo en una planta donde se
fabrican mltiples productos para pacientes que para un producto de vector viral elaborado en un sitio que fabrica un nico
producto.

Para propsitos de caracterizacin, el mapeo por enzimas de restriccin y la secuenciacin del ADN de la unidad de transcripcin son las metodologas usadas con mayor regularidad. Los mtodos basados en PCR, el mapeo por enzimas de restriccin y los inmunoensayos basados en la expresin del transgn se usan comnmente para confirmar la identidad durante el
anlisis de liberacin de lote.
Captulos

El mapeo por enzimas de restriccin es el mtodo de identidad ms comn para productos derivados de plsmidos. El nmero de enzimas utilizadas para crear el patrn gentico del vector vara segn la complejidad del ADN y la similitud entre
mltiples productos. Si se emplean lpidos, agentes lipoplex o protenas para formular el ADN, tambin se debe analizar y confirmar su identidad. Los procedimientos usados para productos farmacuticos tradicionales, como GCMS, TLC y similares,
permiten identificar lpidos y componentes lipoplex. Los componentes proteicos de la formulacin se pueden identificar mediante mapeo de pptidos u otros medios descritos en 1057.
ESTABILIDAD
La vida til de los productos de terapia gnica vara mucho en funcin de su naturaleza, el uso clnico previsto, sus atributos
especficos y las condiciones recomendadas de almacenamiento, envasado y transporte. Por lo tanto, es difcil redactar pautas
uniformes sobre la duracin de estudios de estabilidad y la frecuencia de las pruebas, para todos los productos. El estudio
siempre debe disearse basndose en principios y metodologas cientficamente slidos, y un conocimiento cabal del producto
teraputico final y su uso previsto. Se debe determinar la estabilidad del producto durante los pasos de espera en el proceso,
de los bancos de clulas y virus, de materias primas fundamentales y de los estndares de referencia. Un programa de estabilidad bien diseado y ejecutado asegurar, en gran medida, que el producto permanezca estable dentro de la vida til especificada.
Para productos de terapia gnica con vectores virales y no virales y productos de terapia gnica celular modificados genticamente no especficos para un solo paciente, la seleccin de partidas para respaldar la solicitud de licencia y el etiquetado del
producto final deberan llevarse a cabo de acuerdo con los principios de las pruebas de estabilidad, como los descritos en la
gua Q5C de la ICH y en el captulo 1049. Adems, se deben reunir datos sobre estabilidad para el material a granel y en
otros puntos dentro del proceso, si el material es almacenado antes del procesamiento y el llenado finales. Los aspectos relacionados con la estabiidad de los productos derivados de clulas se tratan en el captulo 1046.
Los vectores plasmdicos de ADN no viral a menudo se formulan con mezclas especficas de lpidos, protenas o lipoconjugados para formar liposomas o complejos encapsulados. Segn la formulacin empleada, se puede lograr una vida til de horas a
aos. Cuando el producto tiene una vida til corta, puede ser necesario preparar la formulacin final en el sitio clnico justo
antes de su administracin. La inestabilidad con frecuencia se observa como agregacin y precipitacin. La formacin y la estabilidad del complejo formulado se caracterizan y establecen mediante estudios de validacin durante el desarrollo del producto. Asimismo, se deben recolectar datos de estabilidad para los componentes principales del complejo formulado, como lpidos, liposomas y el ADN.
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad

Los estudios de estabilidad verifican que las condiciones de almacenamiento conserven la pureza y la potencia durante un
periodo definido, de manera que cuando el producto se administre al paciente, siga cumpliendo con las especificaciones de
estabilidad. Estas especificaciones pueden diferir de las estipuladas para la liberacin de la fabricacin; no obstante, se deben
verificar con datos clnicos. Los estudios formales de estabilidad para respaldar la autorizacin, as como los planes para reunir
informacin sobre estabilidad del producto en la fase inicial deben estar detallados en un plan escrito que determine cmo se
obtendrn y analizarn los datos de estabilidad a fin de avalar el perodo de caducidad del producto. Los protocolos deben
seguir el formato recomendado en las guas vigentes e incluir el alcance, las condiciones de almacenamiento, el nmero de
lotes que se analizarn, el cronograma de prueba, las valoraciones que se utilizarn, el anlisis de los datos y las especificaciones del producto. Todo ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la autorizacin debe ser validado
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antes de comenzar el estudio. El diseo del estudio especfico debe tomar en cuenta los problemas que el producto puede
enfrentar durante la fabricacin, el transporte y el procesamiento en el sitio clnico (ver Condiciones de Desafo Aceleradas y Ms
Apropiadas, a continuacin). El diseo del estudio tambin debe incluir los conocimientos ms recientes en ciencias biolgicas
y debe tratar los requisitos reglamentarios existentes. Por ejemplo, si la formulacin final del producto se lleva a cabo en el sitio
clnico, los estudios de estabilidad sobre esta formulacin final se deben llevar a cabo para establecer el tiempo y las condiciones en las que se puede conservar el producto.
La evaluacin de la estabilidad debe incluir una evaluacin de funcionalidad de producto (potencia). La valoracin de potencia suele tener un alto grado de variabilidad intrnseca. Medir y calcular el deterioro de la actividad del producto empleando
las metodologas estadsticas estndar puede requerir mltiples y frecuentes intervalos de muestreo en un perodo prolongado
y el anlisis de ms de tres lotes de produccin para compensar la variabilidad de la valoracin. Se deben efectuar estudios
iniciales para establecer una fecha de caducidad provisional antes de la administracin al primer paciente. Estos estudios tambin son tiles para determinar qu valoraciones son indicadoras de estabilidad, es decir, los indicadores ptimos de degradacin del producto. Como los mtodos farmacopeicos vigentes no contemplan las caractersticas singulares de los productos de
terapia gnica, se recomienda desarrollar ensayos que consideren estas caractersticas singulares.
Condiciones de Desafo Aceleradas y Ms Apropiadas
ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE
Las condiciones de almacenamiento adecuadas se seleccionan para preservar la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las especificaciones del producto y de sus ingredientes durante el almacenamiento, transporte y manejo en el sitio clnico.
Antes de la administracin, deben realizarse estudios para determinar si las condiciones de almacenamiento, transporte y manejo son aceptables. No es necesario que las condiciones de almacenamiento y transporte sean las mismas que aquellas previstas para el producto comercial, pero deben garantizar que se mantengan las especificaciones del producto ms all de la fecha
de caducidad inicial. Para productos con vidas tiles cortas, se deben considerar las condiciones de almacenamiento y transporte, incluso dentro de un centro mdico, puesto que el transporte constituye la mayor parte del tiempo de almacenamiento
despus de la fabricacin. Se debe poner especial atencin a la capacidad de los gases para penetrar el envase de transporte,
especialmente si el producto de terapia gnica se almacena o transporta usando hielo seco. Una vez que se hayan desarrollado
los mtodos indicadores de la estabilidad y que se hayan seleccionado la condiciones de almacenamiento y transporte finales,
stas deben validarse de acuerdo con la seccin Estabilidad.
La mayora de los productos con vidas tiles limitadas se transportan mediante sistemas confiables de correo con entrega al
da siguiente. Algunos productos muy frgiles son transportados a mano en aviones comerciales. Los transportistas comerciales
deben obtener permisos especiales para evitar el control con equipos de rayos X en los aeropuertos. Durante el desarrollo de
sistemas de embalaje, se deben disear estudios de transporte de carga para identificar las condiciones adversas que podran
afectar al producto. Luego se deben seleccionar y validar los materiales de refuerzo y aislamiento para armar un sistema de
embalaje que tolere y proteja al producto de las condiciones extremas de transporte.
La mayora de los productos de terapia gnica se pueden liofilizar o formular mediante tcnicas similares a las empleadas
para muchos productos proteicos recombinantes o de terapia celular. Estas formulaciones de almacenamiento tpicamente tienen perodos de caducidad superiores a un ao y carecen de requisitos de transporte especiales. Los productos de terapia gnica no viral, que pueden ser inestables en su formulacin final, pueden tener fechas de caducidad similares si se almacenan en
Captulos
El perfil indicador de estabilidad de un producto de terapia gnica vara con el tiempo por la influencia de una amplia variedad de condiciones ambientales, incluida la temperatura, los extremos en condiciones fisiolgicas de almacenamiento y la luz.
Cuando los investigadores investiguen los efectos de estos parmetros sobre la estabilidad del producto, se deben considerar
las vas de degradacin multifactoriales. Los estudios deben incluir condiciones que superen los intervalos de almacenamiento
especificados, es decir, condiciones de desafo como las halladas durante perodos de almacenamiento, transporte o manejo
anormales. Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras durante un breve periodo, fallas de la incubadora o
del almacenamiento en fro, perodos de fluctuaciones trmicas extremas ocasionadas por el transporte hacia climas calurosos
o fros, condiciones hipobricas en el sector de carga de una aerolnea comercial o temperaturas probables en la sala de operaciones. Una corta exposicin a una condicin ambiental fuera de un lmite establecido y una exposicin prolongada a una condicin ambiental que est justo fuera de un intervalo aceptable establecido puede ser igualmente perjudicial para el perfil general de estabilidad. Si se aplican condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y constante de degradacin
del producto a una temperatura especfica puede aumentar. Si existe una justificacin cientfica, se debe investigar el efecto de
la luz sobre el perfil indicador de estabilidad. Se debe prestar especial atencin a los productos almacenados en lquidos que
contienen componentes sensibles o que reaccionan con la luz, los cuales pueden dar origen a subproductos citotxicos.
Los estudios anlogos a los de envejecimiento acelerado habitualmente usados en programas de monitoreo de estabilidad
farmacutica tambin son tiles para determinar la manera en que el producto se degrada y los ensayos que son indicadores
de la estabilidad. Pueden ser los mismos estudios que algunos de los mencionados en el prrafo precedente. Otros estudios
consisten en exponer un producto a 37 18 cuando su temperatura normal de almacenamiento es de 25 2 o colocar un
producto liofilizado en un ambiente muy hmedo. Este tipo de estudios deben llevarse a cabo antes de los estudios formales
de estabilidad, de manera que estos ltimos puedan incorporar ensayos indicadores de estabilidad validados.
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un equipo de viales mltiples con el cido nucleico en un vial y un vehculo como los lpidos, en el otro. La formulacin final se
elabora en el centro mdico justo antes de la administracin.
ETIQUETADO
Captulos
El etiquetado de un producto est reglamentado por la FDA y se requiere que cumpla con la reglamentacin vigente. Debido a que los productos de terapia gnica son productos biolgicos reglamentados, su etiquetado est sujeto a las reglas mencionadas. Los productos biolgicos y dispositivos deben cumplir con los requisitos de etiquetado especficos para el envase y el
empaque (Ttulo 21 del CFR 610 y 801, respectivamente). Tanto la etiqueta del envase como la del empaque deben incluir la
fecha de caducidad. Si el envase est empacado, se deben incluir las condiciones de almacenamiento recomendadas en la etiqueta del embalaje. Si no est empacado, las condiciones de almacenamiento y todos los dems requisitos de una etiqueta de
embalaje deben aparecer en el envase. El etiquetado debe cumplir adems con los requisitos nacionales e internacionales pertinentes.
Cuando un producto se va a aplicar a un paciente en una orientacin fsica en particular o en un rea especficamente definida, el etiquetado que indique la orientacin y/o el rea correctas debe ser visible incluso despus de abrir el empaque. A menos que el producto haya sido analizado para detectar contaminantes patgenos o microbianos antes de la liberacin, se exige
un etiquetado de riesgo biolgico apropiado. Para productos con vida til muy corta, es necesario ajustar y corregir la fecha de
caducidad segn los husos horarios para brindar al usuario una estimacin exacta de la vida til. Los procedimientos clnicos se
deben programar prximos a estos marcos temporales cruciales. Las etiquetas de productos especficos para un solo paciente
deben tener el nombre completo del paciente, sus iniciales o una combinacin de ambos, adems de la designacin del lote, a
fin de garantizar que el producto se administre al paciente correcto.
REGLAMENTOS Y NORMAS
Las tecnologas implicadas en la fabricacin de productos de terapia gnica han sido ampliamente documentadas en la literatura y continan evolucionando. Estos productos se pueden reglamentar como medicamentos o productos biolgicos, y en
contadas ocasiones como dispositivos, dependiendo de la manera en que se fabrican y emplean. Los nuevos enfoques que
estas tecnologas permitan pueden dificultar la determinacin de qu centros de la FDA estarn a cargo de su reglamentacin;
la FDA ha recomendado a los fabricantes solicitar aclaraciones en las primeras etapas del desarrollo. En la actualidad, el Center
for Biologics Evaluation and Research (Centro para la Evaluacin e Investigacin de Productos Biolgicos o CBER) rige la mayora de los productos de terapia gnica humana. El CBER se basa tanto en la Public Health Service Act (Ley del Servicio de Salud
Pblica) y la Federal Food Drug and Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos). La reglamentacin
es la misma que para los productos obtenidos por biotecnologa. Los requisitos generales se describen principalmente en el
Ttulo 21 del CFR. El gobierno federal ha emitido una gran cantidad de documentos gua como Points to Consider (Puntos a
Considerar) o Guidelines (Pautas) (ver www.fda.gov y, en particular, el sitio Web www.fda.gov/cber/publications.htm). Los documentos gua de la ICH para muchas de las reas relacionadas con la calidad son importantes en diversas magnitudes para
productos de terapia gnica que califican (aunque algunos productos por lo general quedan nominalmente fuera del alcance
de los documentos gua, los principios siguen aplicando; ver www.ifpma.org o www.ich.org). Algunos de estos documentos se
reproducen en los compendios USPNF como captulos generales. Asimismo, la ICH ha celebrado diversas reuniones sobre productos de terapia gnica y cuenta con un Grupo de Discusin sobre Terapia Gnica (Gene Therapy Discussion Group o GTDG)
que trata los aspectos actuales sobre el desarrollo e investigacin de productos de terapia gnica y que ha emitido diversas
Consideraciones de la ICH que reflejan los principios armonizados. Los National Institutes of Health (Institutos Nacionales de
Salud de los Estados Unidos o NIH) han publicado las Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules (Guas para
la Investigacin de Molculas de ADN Recombinante) que requieren la revisin de la investigacin por parte de NIH, incluyendo investigaciones o ensayos clnicos realizados o patrocinados por instituciones que reciben fondos de NIH. Estas guas se aplican a muchos productos de terapia gnica.
Se recomiendan ampliamente los estndares biolgicos y bioqumicos para GC de la produccin y el anlisis de productos
de terapia gnica. La diversidad de productos de terapia gnica, en particular los vectores virales, ha limitado el desarrollo de
estndares con amplia capacidad de aplicacin. Una preparacin de RCR de VLM (VR-1450) con un ttulo de infectividad asignado est disponible en ATCC para el anlisis de vectores retrovirales murinos para determinar la presencia de RCR. Un estndar de referencia de adenovirus salvaje tipo 5 con un nmero de partculas y un ttulo de infectividad asignados para caracterizacin de vectores adenovirales tambin est disponible en ATCC. Se ha etablecido un grupo de trabajo para supervisar el desarrollo de un estndar de referencia de VAA. No obstante, se han presentado diversos obstculos para seleccionar, desarrollar,
establecer y poner en circulacin estndares adecuados, los cuales incluyen tomar decisiones sobre qu serotipo de virus se
usar de manera ms comn y exitosa para terapia gnica, la disponibilidad de materiales preparados conforme a las BPF, la
seguridad, la estabilidad a largo plazo, el transporte y el inicio y culminacin de estudios colaborativos para evaluar los estndares candidatos. Asimismo, el desarrollo de estndares para otros vectores virales, incluyendo vectores lentivirales, del virus
del herpes y poxvirales, sigue siendo un desafo.
En la actualidad se encuentran disponibles nuevas metodologas, incluyendo protemicos, tecnologas basadas en cidos nucleicos (NAT, por sus siglas en ingls) novedosas, mtodos de modificacin de protenas y aislamiento y cultivo de clulas madre, y, en muchos casos, se aplican al desarrollo, caracterizacin y anlisis de productos de terapia gnica. Adems, el uso de
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polmeros sintticos tanto para modificar vectores virales existentes como para el desarrollo de vectores sintticos qumicamente dinmicos ofrece ventajas tales como circulacin sistmica mejorada, mejor direccin y liberacin y menores niveles de inmunoestimulacin e inflamacin. La disponibilidad de poblaciones de clulas madre definidas y los mtodos mejorados de injerto deben llevar a una mayor efectividad de clulas transducidas ex vivo usadas en protocolos de terapia gnica. La introduccin de nuevas metodologas requerir de revisin continua y supervisin reglamentaria para asegurar la calidad y seguridad
de los productos de terapia gnica del futuro.
APNDICE
GLOSARIO DE TRMINOS
AdenovirusVirus perteneciente a la familia Adenoviridae de virus de ADN con un virin sin envoltura con 252 capsmeros y
un dimetro entre 70 y 90 nm; una sola molcula lineal de ADN de doble cadena (36 a 38 kb); al menos 10 protenas estructurales resitentes al ter y estables en cido; los viriones son liberados mediante destruccin celular.
ADN Complementario (ADNc)El ADN sintetizado a partir de un ARNm y no de un molde de ADN. Se usa para clonacin o
como sonda de ADN para localizar genes especficos.
ADN DesnudoADN aislado y purificado que carece de protenas o lpidos.
ADN RecombinanteADN que se produce mediante la unin de fragmentos de ADN de diversas fuentes a travs de manipulaciones in vitro.
Agente AdventicioAgente extrao que se introduce accidental o inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la
contaminacin microbiana, qumica o bioqumica de una sustancia purificada).
Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos derivados de un nico clon celular.
Antgenos Leucocitarios Humanos (HLA, por sus siglas en ingls)Protenas controladas por el complejo principal de histocompatibilidad. Estas protenas tienen un papel preponderante en la determinacin de la compatibilidad para trasplantes.
AutlogoQue se obtiene del organismo propio.
BioensayoMedicin de la efectividad de un compuesto por su efecto en animales o clulas en comparacin con una preparacin estndar. (Ver tambin Potencia.)
Captulos
Los productos de terapia gnica son reglamentados por la FDA como productos biolgicos y, por lo tanto, su fabricacin,
anlisis, etiquetado y dems factores estn sujetos a los requisitos codificados en el CFR y en los documentos gua de la FDA
(www.fda.gov). Las pautas de la ICH ofrecen guas adicionales (www.ich.org). Los fabricantes de productos de terapia gnica
que buscan mercados fuera de los Estados Unidos deben referirse a los documentos reglamentarios de los pases pertinentes.
De manera complementaria a los captulos de USP, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios, adems de las mejores prcticas para el desarrollo, la fabricacin, el control de calidad y la garanta de calidad de los productos de terapia gnica:
CFR
21 CFR 210
21 CFR 211
21 CFR 600s
21 CFR 610 Subparte G
21 CFR 801
21 CFR 820
Documentos Gua de la FDA
Guideline for the Determination of Residual Moisture in Dried Biological Products (enero 1990)
Guidance for Industry: Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy (marzo 1998)
Guidance for Industry: Supplemental Guidance on Testing for Replication-Competent Retrovirus in Retroviral Vector-Based
Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors (octubre 2000)
FDA Guidance for Industry: Investigating Out-of-Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production (octubre
2006)
Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) (abril 2008)
Draft Guidance for Industry: Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products (octubre 2008)
Documentos Reglamentarios Nacionales e Internacionales
Q5A(R1): Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin
ICH Q5C: Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products
ICH Q5D: Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of
Biotechnological/Biological Products
ICH Q6B Specification: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
ICH Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology
NIH Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules (http://www4.od.nih.gov/oba/guidelines.html)
Captulos
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BiotecnologaToda tcnica que utilice organismos vivos (o partes de estos) para producir o modificar productos, mejorar
plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos especficos. La definicin ms nueva se refiere al uso industrial y
farmacutico del ADN recombinante, fusin celular, nuevas tcnicas de bioprocesamiento y terapia gnica.
BPFvAbreviatura para Buenas Prcticas de Fabricacin vigentes. La FDA resalta las BPFv en el Ttulo 21 del CFR y en Federal
Register (Registro Federal), as como en sus Points to Consider (Puntos a Considerar).
Clula GerminalClula reproductiva (esperma u vulo), gameto o clula sexual.
Clula MadreClula inmortal capaz de proliferar y diferenciarse en distintos tipos de clulas especializadas. Se supone que
cada sistema de tejidos importante tiene su propia clula madre.
CFTRRegulador de la conductancia transmembrana de fibrosis qustica.
CitoquinaTodo factor que acta sobre las clulas; por lo general, una protena que favorece el crecimiento.
CitoplasmaMaterial celular contenido entre la membrana celular y el ncleo.
CitotxicoCapaz de causar la muerte celular.
Clasificador de Clulas Activado por Fluorescencia (FACS, por sus siglas en ingls)Equipo que clasifica clulas basndose
en marcadores fluorescentes unidos a las clulas.
Construccin GnicaVector de expresin que contiene la secuencia de codificacin de una protena y los elementos necesarios para su expresin.
Cultivo en SuspensinClulas capaces de crecer en suspensin sin necesidad de adherirse a un sustrato (soporte) para generar la divisin celular.
DiferenciacinProceso de cambios bioqumicos y estructurales mediante el cual las clulas adquieren forma y funcin especializadas.
ElectroporacinMtodo para permitr la transferencia de material a las clulas que implica el uso breve de un campo elctrico para crear poros temporales en la membrana celular.
ELISAEnzimoinmunoensayo. Inmunoensayo que utiliza un antgeno o anticuerpo marcado con una enzima para detectar la
unin de una molcula a una matriz slida.
Endonucleasa de RestriccinEndonucleasa que reconoce una secuencia especfica de bases dentro de un ADN de doble
cadena.
Enfermedad del Injerto Contra el Anfitrin (GVDH, por sus siglas en ingls)Rechazo del tejido transplantado por parte
del anfitrin. Es la causa principal de muerte del paciente cuando se utiliza un tejido alognico mal compatibilizado con el
receptor.
EpisomalPerteneciente a cualquier material gentico extracromosmico accesorio.
Ex VivoProcedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo.
Exento de sueroSe refiere al medio de crecimiento celular que carece de componentes sricos.
Factores de CrecimientoFactores responsables de regular la proliferacin, funcin y diferenciacin celular.
Fase SParte del ciclo celular en la que ocurre la replicacin del ADN (Fase de Sntesis).
FormuladoPreparado de acuerdo con condicones o mtodos prescritos.
FusinUnin de la membrana de dos clulas, para generar una clula hija que contiene algunas de las propiedades de cada
clula paterna. Se usa en la generacin de hibridomas en los que las clulas que producen anticuerpos se fusionan con clulas
de mieloma de ratn.
GenomaMaterial hereditario total de una clula.
HematopoyticoPerteneciente o con influencia sobre la formacin de clulas sanguneas.
HepatocitoClulas predominantes del hgado, que cumplen una funcin importante en el metabolismo y son productoras
de protenas sricas. Por lo general, estas clulas no estn en divisin pero si se daan, se pueden dividir y regenerar hasta
reponer las clulas daadas.
Hibridacin Dot Blot (ADN o ARN)Tcnica para detectar, analizar e identificar protenas; similar a la transferencia Western
(Western blot) pero sin separacin electrofortica de protenas.
HumoralPerteneciente a los elementos encontrados en los fluidos corporales (por ejemplo, inmunidad humoral y anticuerpos neutralizantes).
InmunoensayoTcnica para identificar sustancias basada en el uso de anticuerpos.
In VivoProcedimiento que se lleva a cabo dentro de un organismo vivo.
In VitroProcedimiento que se lleva a cabo fuera de un organismo vivo. Puede involucrar clulas o tejidos derivados de los
organismos.
IntegracinAsimilacin (insercin mediante unin covalente) de material gentico (ADN) en el cromosoma de una clula
receptora.
IntracuerposAnticuerpos intracelulares que no se secretan y que estn diseados para unir e inactivar molculas blanco dentro de las clulas.
LeucemiaNeoplasia maligna de los tejidos formadores de la sangre.
Lnea Celular EmpaquetadoraLnea celular que produce protenas requeridas para empaquetar y producir vectores virales
de manera activa pero que no produce virus competentes para la replicacin. Complementa a nivel proteico las carencias genticas del vector.
Lnea Celular ProductoraLnea celular establecida que se usa para producir vectores de virus, a menudo a gran escala.
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Captulos
Lneas CelularesClulas que derivan de cultivos primarios de embriones, tejido u rganos. Estas lneas celulares pueden tener una vida finita o pueden inmortalizarse (modificadas para replicarlas indefinidamente).
LipoplexFormulacin de lpidos y polmeros y/o protenas.
LiposomaBicapa de lpidos esfrica que encierra un compartimento acuoso.
Materiales AuxiliaresComponentes usados durante la fabricacin que no deben estar presentes en el producto final. Ejemplos: factores de crecimiento, citoquinas, anticuerpos monoclonales, dispositivos de separacin de clulas y componentes de
los medios.
Mutagnesis InsercionalTipo de mutacin ocasionada por la insercin de cido nucleico en un cromosoma de la clula anfitriona. Existen mltiples consecuencias negativas posibles por este evento, incluida la muerte de la clula cuando se inactiva
un gen esencial o predisposicin al cncer si se inactiva un gen supresor de tumores.
OligonucletidoPolmero que consiste en un pequeo nmero de nucletidos, por lo general de 5 a 30.
OncogenesGenes asociados con la proliferacin neoplsica (cncer) despus de una mutacin o perturbacin de su expresin.
OncognicoQue ocasiona cncer.
Par de BaseDos bases de nucletido en cadenas diferentes de la molcula de cido nucleico que se unen.
ParvovirusVirus de ADN de la familia Parvoviridae. La variedad de anfitriones incluye muchas especies de vertebrados. ADN
pequeo de cadena simple lineal con bucles terminales en forma de horquilla.
PlsmidoForma pequea y circular de ADN que porta determinados genes y que es capaz de replicarse de manera independiente en una clula anfitriona.
PotenciaMedicin cuantitativa de la actividad biolgica basada en el atributo del producto vinculado a las propiedades biolgicas relevantes.
Producto BiolgicoCualquier virus, suero teraputico, toxina, antitoxina o producto anlogo aplicable a la prevencin, tratamiento o cura de enfermedades o lesiones en humanos. (En esta definicin derivada de la FDA, el trmino producto anlogo
indica que incluye esencialmente productos obtenidos por biotecnologa y procedimientos que incluyen terapia gnica, productos transgnicos y terapia celular somtica.)
PromotorSecuencia de ADN que se localiza en la parte frontal de un gen y que controla la expresin gnica. Es necesario
para unir la ARN polimerasa e iniciar la transcripcin.
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls)Tcnica para amplificar una secuencia especfica de
nucletidos de ADN o ARN mediante ciclos de copiado que utilizan polimerasa, dando como resultado incrementos geomtricos en el nmero de copias.
RetrovirusVirus que contiene transcriptasa reversa, la cual convierte el ARN viral en ADN que posteriormente se integra a la
clula anfitriona en una forma denominada provirus.
Simulacro de PruebaCorrida de una prueba en la que deliberadamente se omiten algunos reactivos crticos.
Terapia CelularTerapia que utiliza clulas completas para tratar una enfermedad, afeccin o lesin. Es diferente del transplante de tejidos y rganos.
Terapia GnicaTerapia que emplea cidos nucleicos que se expresan de manera subsiguiente como ARN o protenas para
tratar una enfermedad o condicin. La FDA de los EE.UU. define los productos de terapia gnica como productos que contienen material gentico que se administran para modificar o manipular la expresin de material gentico a fin de alterar las propiedades biolgicas de clulas vivas.
TransduccinTransferencia y expresin de material gentico en una clula mediante un vector viral o bacterifago.
TransfeccinTransferencia de ADN a las clulas por medios fsicos tales como coprecipitacin con fosfato de calcio.
Transferencia Western (Western Blot)Mtodo de electrotransferencia de protenas en el que stas se transfieren de un gel
a un soporte rgido y delgado (p.ej., membrana de nitrocelulosa), sobre el que posteriormente se detectan mediante la unin
de anticuerpos unidos a enzimas, que permiten el uso de un sustrato cromognico o quimioluminiscente precipitante, o de
anticuerpos marcados radioactivamente.
TransgnSe refiere al material gentico extrao administrado como parte de una construccin de vectores.
Validacin del ProcesoMtodo para suministrar documentacin probatoria de que el proceso de fabricacin est controlado, es reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que cumple con especificaciones predeterminadas.
VectorAgente (plsmido, virus o complejo liposomaprotena o complejo ADNprotena) usado para introducir ADN en una
clula.
ViabilidadPropiedad de estar vivo y ser funcional.
VirinPartcula viral elemental que consta de material gentico (nucleocpside) y un recubrimiento proteico.
VirusAgente infeccioso submicroscpico que contiene informacin gentica necesaria para la reproduccin. Es un parsito
intracelular obligado.
Virus AnfotrpicoVirus que infecta y se replica en clulas de mltiples especies.
Virus Asociado con Adenovirus (VAA)El parvovirus humano contiene un genoma de ADN de cadena simple y depende de
virus colaboradores (adenovirus, virus del herpes o virus vaccinia) para su replicacin. Sin la coinfeccin, los viriones salvajes se
integran en un sitio especfico en el cromosoma 19 y permanecen latentes.
Virus ColaboradorAyuda al desarrollo de un virus defectuoso suministrando o restaurando la actividad de un gen viral o
permitiendo que el virus defectuoso forme una envoltura funcional.
USP 38
Virus Competente para la Replicacin (VCR)Virus que puede completar un ciclo de replicacin completo sin requerir un
virus colaborador; virus que se replica de manera autnoma.
Virus con EnvolturaVirus que contienen una bicapa lipoproteica que rodea la cpside y que se adquiere mediante gemacin
a travs de la membrana celular de las clulas anfitrionas.
Virus del Herpes Simple (VHS)Virus de ADN miembro de la familia Herpesviridae. Puede infectar tanto a vertebrados de
sangre caliente como de sangre fra por contacto con superficies mucosas hmedas.
Virus EcotrpicoVirus que infecta y se replica en clulas derivadas nicamente de la especie anfitriona original.
XenognicoDe una especie diferente.
1048 CALIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS: ANLISIS DE

LA CONSTRUCCIN EXPRESABLE EN CLULAS USADAS PARA LA
PRODUCCIN DE PRODUCTOS PROTENICOS OBTENIDOS CON ADN
RECOMBINANTE
1
Captulos
I. INTRODUCCIN
Este documento proporciona una gua para caracterizar construcciones expresables para la produccin de productos protenicos a partir de ADN recombinante (ADN-r) en clulas eucariticas y procariticas. El propsito de este documento es describir las clases de informacin importantes para evaluar la estructura de la construccin expresable para producir protenas obtenidas con ADN-r. Este documento no pretende cubrir todos los aspectos relativos a la calidad de los productos medicinales
obtenidos con ADN-r.
La construccin expresable se define como el vector de expresin que contiene la secuencia codificadora de la protena recombinante. Para asegurar la calidad y la uniformidad del producto final, se deben analizar los segmentos de la construccin
expresable utilizando tcnicas para cidos nucleicos junto con otras pruebas realizadas sobre la protena recombinante purificada. Se debe considerar al anlisis de la construccin expresable a nivel del cido nucleico como una parte de la evaluacin
general de calidad, teniendo en cuenta que esta prueba slo evala la secuencia codificadora de un gen recombinante y no la
fidelidad de la traduccin ni otras caractersticas de la protena recombinante, tal como su estructura secundaria, su estructura
terciaria y las modificaciones posteriores a la traduccin.
II. FUNDAMENTOS PARA EL ANLISIS DE LA CONSTRUCCIN EXPRESABLE
El propsito de realizar el anlisis de la construccin expresable es establecer que se ha incorporado la secuencia codificadora correcta del producto en la clula anfitriona y que esta secuencia se mantiene sin cambios desde el comienzo del cultivo
hasta el final de la produccin. La secuencia gentica de las protenas recombinantes que se producen en clulas vivas puede
sufrir mutaciones que podran alterar las propiedades de la protena con probables consecuencias adversas para los pacientes.
No se puede esperar que un nico enfoque experimental detecte todas las modificaciones posibles de una protena. Se pueden
emplear tcnicas de anlisis de protenas para evaluar la secuencia de aminocidos de una protena y las caractersticas estructurales de la protena expresada debidas a modificaciones posteriores a la traduccin, tal como el procesamiento proteoltico,
la glicosilacin, la fosforilacin y la acetilacin. Los datos del anlisis del cido nucleico podran ser tiles ya que los mtodos
de anlisis de protenas pueden no detectar todos los cambios estructurales de la protena que resultan de mutaciones en la
secuencia codificadora de la protena recombinante. La importancia relativa del anlisis del cido nucleico y del anlisis de la
protena varan de un producto a otro.
El anlisis del cido nucleico se puede emplear para verificar la secuencia codificadora y el estado fsico de la construccin
expresable. El anlisis de cido nucleico se realiza para asegurar que la protena expresada tendr la secuencia de aminocidos
correcta, pero no est concebido para detectar niveles bajos de secuencias variantes. Cuando las clulas de produccin tienen
mltiples copias integradas de la construccin expresable y no todas ellas son activas para la transcripcin, un examen del pro1 La presente gua ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional para la Armonizacin de Requisitos
Tcnicos para el Registro de Medicamentos destinados para Uso de Seres Humanos (ICH por sus siglas en ingls) y para su redaccin se han consultado a diversos
organismos regulatorios, de conformidad con los procedimientos de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comit Directivo de la ICH en la Etapa 4 del
procedimiento de la ICH, el 29 de noviembre de 1995. Al llegar a la Etapa 4 del procedimiento, se recomienda la adopcin del borrador final a los organismos
regulatorios de la Unin Europea, Japn y los Estados Unidos. Esta gua ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 23 de febrero de 1996 (61 FR
7006) y es aplicable a frmacos y productos biolgicos. A pesar de que esta gua no crea ni confiere derecho alguno a persona alguna y que no obliga a la
Administracin de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en ingls) ni al sector industrial, este documento representa la posicin actual de la FDA
respecto de la produccin de productos protenicos obtenidos con ADN recombinante. Para obtener copias adicionales de esta gua, comunicarse con: Drug
Information Branch, HFD-210, CDER, FDA, 5600 Fishers Lane, Rockville, MD 20857 (Telfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication
Staff (HFM-42), CBER, FDA, 1401 Rockville Pike, Rockville, MD 20852-1448. Enviar una etiqueta autoadhesiva con nombre y direccin impresos para facilitar el
trmite de la solicitud. Tambin se encuentra disponible una versin en formato electrnico de esta gua en Internet usando la Red Mundial (WWW) (conectarse a
la Pgina Inicial de CDER (CDER Home Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la seccin Regulatory Guidance).
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Informacin General / 1048 Calidad de Productos Biotecnolgicos: Anlisis 991
ducto de transcripcin en s mediante un anlisis de ARN mensajero (ARN-m) o ADN codificador (ADN-c) puede ser ms adecuado que un anlisis del ADN genmico. Los enfoques analticos que examinan el grueso de una poblacin de cidos nucleicos, como por ejemplo los que se realizan sobre combinaciones de clones o sobre material amplificado por reaccin en cadena
con polimerasa, pueden ser considerados como una alternativa a los enfoques que dependen de la seleccin de clones de ADN
individuales. Se podrn tener en cuenta otras tcnicas que permitan la confirmacin rpida y sensible de la secuencia codificadora de la protena recombinante en la construccin expresable.
En las siguientes secciones se describe la informacin que se debe suministrar con respecto a la caracterizacin de la construccin expresable durante el desarrollo y la validacin del sistema de produccin. Deben validarse las metodologas analticas
previstas para la confirmacin de la secuencia. La documentacin de validacin debe incluir, como mnimo, estimaciones de
los lmites de deteccin para las secuencias variantes. Esto debe llevarse a cabo para los mtodos de secuenciacin de cidos
nucleicos y de protenas. Se deben revisar peridicamente la filosofa y las recomendaciones referidas a los anlisis que se expresan en este documento, con el fin de aprovechar los adelantos tecnolgicos y los avances en la informacin cientfica.
III. CARACTERIZACIN DEL SISTEMA DE EXPRESIN
Captulos
A. Construccin Expresable y Clon Celular Utilizado para Desarrollar el Banco de Clulas Maestras
El fabricante debe describir el origen de la secuencia de nucletidos codificadora de la protena. Debe incluirse la identificacin y la fuente de la clula originaria de la secuencia nucleotdica. Tambin se deben describir los mtodos empleados para
preparar el ADN que codifica la protena.
Se deben describir detalladamente los pasos empleados para ensamblar la construccin expresable. Esta descripcin debe
incluir la fuente y la funcin de las partes que componen la construccin expresable, por ejemplo los orgenes de replicacin,
los genes de resistencia a antibiticos, promotores, potenciadores y si la protena se sintetiza como una protena de fusin. Se
debe proporcionar un mapa detallado de los componentes y una secuencia completa del plsmido con anotaciones, indicando
las regiones secuenciadas durante la construccin y las secuencias extradas de la bibliografa. Se deben indicar otras protenas
expresables codificadas por el plsmido. Se deben determinar la secuencia nucleotdica de la regin codificadora del gen de
inters y de las regiones adyacentes asociadas que se insertan en el vector, hasta el empalme de insercin, inclusive, mediante
el secuenciamiento del ADN de la construccin.
Se debe describir del mtodo de transferencia de la construccin expresable a la clula anfitriona. Asimismo, se deben describir detalladamente los mtodos empleados para amplificar la construccin expresable y el criterio utilizado para la seleccin
de clones celulares para su produccin.
B. Sistema de Banco de Clulas
La produccin de protenas recombinantes debe basarse en un Banco de Clulas Maestras y en Bancos de Clulas de Trabajo
bien definidos. Un banco de clulas es un conjunto de ampollas con una composicin uniforme almacenadas en condiciones
definidas; cada ampolla contiene una alcuota de una sola combinacin de clulas. El Banco de Clulas Maestras por lo general
proviene del clon celular seleccionado que contiene la construccin expresable. El Banco de Clulas de Trabajo se obtiene por
propagacin de una o varias ampollas del Banco de Clulas Maestras. Se deben detallar la historia de la lnea celular y la produccin de los bancos celulares, incluyendo los mtodos y los reactivos utilizados durante el cultivo, la edad de las clulas in
vitro y las condiciones de almacenamiento. Todos los bancos de clulas deben caracterizarse mediante los marcadores fenotpicos y genotpicos pertinentes, que podran incluir la expresin de la protena recombinante o la presencia de la construccin
expresable.
Se debe analizar la construccin expresable en el Banco de Clulas Maestras segn se describe a continuacin. Si la prueba
no se puede llevar a cabo en el Banco de Clulas Maestras, se debe realizar en cada Banco de Clulas de Trabajo.
Se debe emplear el mapeo con endonucleasas de restriccin u otras tcnicas adecuadas para analizar la construccin expresable para determinar el nmero de copias, las inserciones o eliminaciones y el nmero de sitios de integracin. Para los sistemas de expresin extracromosmica, se debe determinar el porcentaje de clulas anfitrionas que retienen la construccin expresable.
Se debe verificar la secuencia codificadora de protena para el producto de protena recombinante de la construccin expresable. Para los sistemas de expresin extracromosmica, se debe aislar la construccin expresable y verificar la secuencia nucleotdica codificadora del producto sin clonacin adicional. Para las clulas con copias macrosmicas de la construccin expresable, la secuencia nucleotdica codificadora del producto puede verificarse a travs de una nueva clonacin y secuenciamiento de las copias cromosmicas. Alternativamente, se puede verificar la secuencia nucleotdica codificadora del producto
empleando diversas tcnicas, tales como el secuenciamiento de clones de ADN-c combinados, o amplificando el material por
la reaccin en cadena con polimerasa. La secuencia nucleotdica debe ser idntica a la determinada para la construccin expresable dentro de los lmites de deteccin de la metodologa, segn se describe en la seccin III.A., y debe corresponder a lo
esperado para la secuencia de la protena.
C. Lmite de Edad para las Clulas de Produccin In Vitro
El lmite de edad para las clulas de produccin in vitro se debe basar en datos obtenidos de clulas productoras propagadas
a escala de planta piloto o a escala normal de produccin hasta la edad propuesta para las clulas in vitro o ms. Por lo general, las clulas productoras se obtienen mediante la propagacin del Banco de Clulas de Trabajo; el Banco de Clulas Maestras
podra emplearse para preparar clulas de produccin si se justifica debidamente.
992 1048 Calidad de Productos Biotecnolgicos: Anlisis / Informacin General
USP 38
La construccin expresable de las clulas de produccin debe analizarse una vez para el Banco de Clulas Maestras, segn se
indica en la seccin III.B., pero se podra verificar la secuencia codificadora de la protena de la construccin expresable mediante pruebas de cido nucleico o bien mediante anlisis del producto protenico final. Todo incremento en el lmite de edad
definido para las clulas productoras in vitro debe basarse en datos obtenidos de clulas propagadas in vitro hasta una edad
igual o mayor que el nuevo lmite de edad para las clulas in vitro.
IV. CONCLUSIN
La caracterizacin de la construccin expresable y de la protena purificada final son importantes para asegurar la produccin uniforme de un producto obtenido con ADN-r. Segn se ha descrito anteriormente, para asegurar la calidad de un producto de protena recombinante se deben evaluar los datos del anlisis de cidos nucleicos y de la evaluacin de la protena
purificada final.
Captulos
GLOSARIO DE TRMINOS
Banco de Clulas de Trabajo (BCT)
El Banco de Clulas de Trabajo se prepara a partir de alcuotas de una suspensin homognea de clulas obtenidas del cultivo de material del Banco de Clulas Maestras en condiciones de cultivo definidas.
Banco de Clulas Maestras (BCM)
Es una alcuota de una combinacin nica de clulas que se ha preparado por lo general a partir de un clon celular seleccionado en condiciones definidas, dispensada en mltiples recipientes y almacenada en condiciones definidas. El Banco de Clulas Maestras se emplea para proporcionar todos los bancos de clulas de trabajo. Las pruebas que se realizan en un Banco de
Clulas Maestras nuevo (a partir de un previo clon celular inicial, Banco de Clulas Maestras o Banco de Clulas de Trabajo)
deben ser las mismas que las realizadas en el Banco de Clulas Maestras a menos que se justifique otra cosa.
Construccin Expresable
Es el vector de expresin que contiene la secuencia codificadora de la protena recombinante y los elementos necesarios para su expresin.
Edad de Clulas In Vitro
Es la medida del tiempo transcurrido desde la descongelacin del vial o viales del Banco de Clulas Maestras hasta la cosecha del recipiente de produccin, medido en tiempo cronolgico trascurrido en cultivo, mediante el nmero de duplicaciones
de la poblacin o el nmero de transferencias de las clulas cuando se subcultivan mediante un procedimiento definido para la
dilucin del cultivo.
Escala de Planta Piloto
La produccin de una protena recombinante mediante un procedimiento que simula y es totalmente representativo de una
escala de fabricacin comercial. Los mtodos de propagacin celular, la cosecha y la purificacin del producto deben ser idnticos, excepto por la escala de produccin.
Marcadores Genotpicos y Fenotpicos Relevantes
Son los marcadores que permiten identificar la cepa de la lnea celular y que deben incluir la expresin de la protena recombinante o la presencia de la construccin expresable.
Regiones de Control Adyacentes
Son secuencias nucleotdicas no codificadoras que estn adyacentes a los extremos 5 y 3 de la secuencia codificadora del
producto y que contienen elementos importantes que afectan la transcripcin, traduccin o estabilidad de la secuencia codificadora. Estas regiones incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras, potenciadoras y de empalme y no incluyen los orgenes de la replicacin ni los genes de resistencia a los antibiticos.
Sitio de Integracin
Es el sitio donde una o varias copias de la construccin expresable se integran al genoma de la clula anfitriona.
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Informacin General / 1049 Calidad de Productos Biotecnolgicos: Estabilidad 993
1049 CALIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS: PRUEBAS DE

ESTABILIDAD DE PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS O BIOLGICOS
1
I. INTRODUCCIN (1)
II. ALCANCE DEL ANEXO (2)

Las pautas que se establecen en este anexo para las Pruebas de Estabilidad de Nuevos Frmacos y Productos Farmacuticos son aplicables a protenas y polipptidos bien caracterizados, sus derivados y los productos de los cuales son componentes, y que se aslan de tejidos, fluidos corporales, cultivos celulares, o se producen usando tecnologa de cido desoxirribonucleico recombinante (ADN-r). Por lo tanto, el documento abarca la generacin y presentacin de datos de estabilidad para
productos tales como citocinas (interferones, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral),
eritropoyetinas, activadores de plasmingeno, factores de plasma sanguneo, hormonas y factores del crecimiento, insulinas,
anticuerpos monoclonales y vacunas constituidas por protenas o polipptidos bien caracterizados. Adems, las pautas detalladas en las siguientes secciones pueden aplicarse a otros tipos de productos, tales como vacunas convencionales, despus de
consultar con las autoridades reguladoras correspondientes. El documento no abarca a los antibiticos, extractos alergnicos,
heparinas, vitaminas, sangre entera ni componentes celulares sanguneos.
III. TERMINOLOGA (3)
El lector debe consultar el Glosario en Pruebas de Estabilidad de Nuevos Frmacos y Productos Farmacuticos, para encontrar las definiciones de los trminos bsicos usados en este anexo. No obstante, dado que los fabricantes de productos biotecnolgicos o biolgicos en ocasiones emplean terminologa tradicional, los trminos tradicionales figuran especificados entre
parntesis para ayudar al lector. Tambin se incluye un glosario complementario que explica ciertos trminos usados en la elaboracin de productos biotecnolgicos o biolgicos.
1 La presente gua ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos (en Calidad) de la Conferencia Internacional sobre Armonizacin de Requisitos Tcnicos para el Registro de Productos Farmacuticos destinados para Uso en Seres Humanos (ICH por sus siglas en ingls), y para su redaccin ha sido sometida a
consulta por los diversos organismos reguladores, en conformidad con el proceso de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comit Directivo de la ICH
en la Etapa 4 del proceso de la ICH, el 20 de noviembre de 1995. En la Etapa 4 del proceso, se recomienda la adopcin del borrador final a los organismos reguladores de la Unin Europea, Japn y los Estados Unidos. Esta gua ha sido publicada en el Diario Oficial (Federal Register) el 10 de julio de 1996 (61 FR 36466) y es
aplicable a productos farmacuticos y biolgicos. Pese a que esta gua no crea o confiere derechos a favor de o para persona alguna y que no es vinculante para la
FDA ni para el sector industrial relevante, este documento representa la posicin actual de la agencia respecto a las pruebas de estabilidad de productos biotecnolgicos o biolgicos. Para obtener copias adicionales de esta gua, comunquese con: Drug Information Branch, HFD-210, CDER, FDA, 5600 Fishers Lane, Rockville,
MD 20857 (Telfono: 301-827-4573) o con Manufacturers Assistance and Communication Staff (HFM-42), CBER, FDA, 1401 Rockville Pike, Rockville, MD
20852-1448. Enve una etiqueta autoadhesiva con su nombre y direccin impresos en ella para facilitar el procesamiento de su solicitud. Tambin se encuentra
disponible una versin de esta gua en formato electrnico en Internet usando la World Wide Web (WWW) (conectarse a la Pgina de Inicio de CDER (CDER Home
Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la seccin Regulatory Guidance).
Captulos
Las pautas establecidas en la gua armonizada tripartita de la ICH, titulada Pruebas de Estabilidad de Nuevos Frmacos y
Productos Farmacuticos (publicada por la ICH el 27 de octubre de 1993) son aplicables en general a productos biotecnolgicos o biolgicos. Sin embargo, los productos biotecnolgicos o biolgicos tienen caractersticas distintivas que deben tenerse
en cuenta en cualquier programa de prueba bien definido, diseado para confirmar su estabilidad durante el perodo de almacenamiento deseado. Para tales productos, en los cuales los componentes activos son tpicamente protenas y/o polipptidos,
el mantenimiento de la conformacin molecular y, por lo tanto, de la actividad biolgica, depende tanto de fuerzas no covalentes como de fuerzas covalentes. Los productos son particularmente sensibles a factores ambientales tales como cambios de
temperatura, oxidacin, luz, contenido inico y cizalladura. Para asegurar el mantenimiento de la actividad biolgica y evitar la
degradacin, por lo general son necesarias condiciones rigurosas para su almacenamiento.
Es posible que la evaluacin de la estabilidad necesite metodologas analticas complejas. Las valoraciones de actividad biolgica, cuando correspondan, deben ser parte de los estudios esenciales de estabilidad. Los mtodos fisicoqumicos, bioqumicos
e inmunoqumicos adecuados para el anlisis de la entidad molecular y para la deteccin cuantitativa de productos de degradacin tambin deben formar parte del programa de estabilidad toda vez que la pureza y las caractersticas moleculares del
producto permitan el uso de estas metodologas.
Con estas inquietudes en mente, el solicitante debe desarrollar los datos adecuados que justifiquen la estabilidad de un producto biotecnolgico o biolgico y tener en cuenta numerosas condiciones externas que puedan afectar la potencia, la pureza
y la calidad del producto. Los datos primarios para avalar un perodo de almacenamiento solicitado, ya sea para un frmaco o
un producto farmacutico, deben basarse en estudios de estabilidad a largo plazo, en tiempo real y en condiciones reales. De
este modo, el desarrollo de un programa de estabilidad a largo plazo adecuado resulta fundamental para el desarrollo exitoso
de un producto comercial. El propsito de este documento es dar pautas a los solicitantes respecto del tipo de estudios de
estabilidad que deben proporcionarse para avalar las solicitudes de comercializacin. Se entiende que durante el proceso de
revisin y evaluacin, pueden ocurrir actualizaciones continuas de los datos de estabilidad iniciales.
994 1049 Calidad de Productos Biotecnolgicos: Estabilidad / Informacin General
USP 38
Captulos
IV. SELECCIN DE PARTIDAS (4)

A. Frmaco (Material a Granel) (4.1)
En los casos en los que el material a granel deba almacenarse despus de su fabricacin, pero antes de la formulacin y
fabricacin final, se deben proporcionar datos de estabilidad de al menos tres partidas cuya fabricacin y almacenamiento sean
representativos de la escala de fabricacin. Para los casos en los que se solicitan ms de 6 meses de almacenamiento, debe
suministrarse, al momento de la presentacin, un mnimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para frmacos con perodos de
almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mnima de datos de estabilidad para la presentacin inicial se determinar
basndose en cada caso en particular. Los datos de partidas realizadas a escala de planta piloto correspondientes a un frmaco
producido a una escala reducida de fermentacin y purificacin podrn proporcionarse en el momento en que se presente el
expediente ante las agencias reguladoras, con el compromiso de colocar las primeras tres partidas de escala de fabricacin en
el programa de estabilidad a largo plazo despus de su aprobacin.
La calidad de las partidas de frmaco colocadas en el programa de estabilidad debe ser representativa de la calidad del material utilizado en estudios preclnicos y clnicos y de la calidad del material que se producir a escala de fabricacin. Adems, el
frmaco (material a granel) producido a escala de planta piloto, debe ser elaborado mediante un proceso y almacenado bajo
condiciones representativas de aquellas usadas para la escala de fabricacin. El frmaco ingresado en el programa de estabilidad debe ser almacenado en envases que sean representativos de aquellos usados para contener la sustancia durante la fabricacin. Los envases de tamao reducido sern aceptables para pruebas de estabilidad de frmacos, siempre y cuando estn
fabricados con el mismo material y usen el mismo tipo de sistema de envase/cierre que se pretende utilizar durante la fabricacin.
B. Productos Intermedios (4.2)
Durante la fabricacin de productos biotecnolgicos o biolgicos, la calidad y el control de ciertos productos intermedios
puede ser fundamental para la produccin del producto final. En general, el fabricante debe identificar los productos intermedios y generar datos internos y lmites de procesos que aseguren su estabilidad, dentro de los parmetros del proceso desarrollado. Pese a que se permite el uso de datos a escala de planta piloto, el fabricante debe establecer la conformidad de tales
datos utilizando el proceso a escala de fabricacin.
C. Producto Farmacutico (Producto del Envase Final) (4.3)
Deber proporcionarse informacin sobre la estabilidad de al menos tres partidas del producto del envase final, representativas de aquellas que se usarn a escala de fabricacin. Cuando sea posible, las partidas del producto del envase final incluidas
en la prueba de estabilidad deben provenir de distintas partidas del material a granel. Para los casos en los que se solicitan ms
de 6 meses de almacenamiento, debe suministrarse, al momento de la presentacin, un mnimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para productos farmacuticos con perodos de almacenamiento menores de 6 meses, la cantidad mnima de datos de
estabilidad en la presentacin inicial se determinar en cada caso en particular. La fecha de caducidad del producto debe basarse en los datos reales presentados como aval de la solicitud. Dado que la fecha se basa en los datos de tiempo real/temperatura real presentados para revisin, deben efectuarse actualizaciones continuas de los datos de estabilidad inicial durante los
procesos de revisin y evaluacin. La calidad del producto del envase final sometido a los estudios de estabilidad debe ser representativa de la calidad del material utilizado en los estudios preclnicos y clnicos. Los datos de partidas a escala de planta
piloto del producto farmacutico podrn proporcionarse en el momento en que se presente el expediente ante las agencias
reguladoras, con el compromiso de incluir las primeras tres partidas a escala de fabricacin en el programa de estabilidad a
largo plazo despus de su aprobacin. Cuando las partidas a escala de planta piloto hayan sido presentadas para establecer el
perodo de vida til de un producto y, en caso de que el producto elaborado a escala de fabricacin no cumpla con esas especificaciones de estabilidad a largo plazo durante todo el perodo de vigencia o que no sea representativo del material usado en
estudios preclnicos y clnicos, el solicitante debe notificar a las autoridades reguladoras correspondientes para determinar un
curso de accin adecuado.
D. Seleccin de muestras (4.4)
Cuando un producto es distribuido en partidas que difieran en volumen de llenado (por ejemplo, 1 mililitro (mL), 2 mL o
10 mL), cantidad de unidades (por ejemplo, 10 unidades, 20 unidades o 50 unidades), o masa (por ejemplo, 1 miligramo
(mg), 2 mg o 5 mg), las muestras que se ingresen al programa de estabilidad podrn ser seleccionadas basndose en un sistema de matriz y/o por bracketing (estudio de inferencia por extremos).
El matrizado, es decir, el diseo estadstico de un estudio de estabilidad en el cual se prueban diferentes fracciones de muestras en distintos puntos de muestreo, slo debe aplicarse cuando se proporciona documentacin adecuada que confirma que
la estabilidad de las muestras probadas representa la estabilidad de todas las muestras. Las diferencias en las muestras para el
mismo producto farmacutico deben ser identificadas indicando, por ejemplo, que cubren distintas partidas, distintas concentraciones, distintos tamaos del mismo cierre y, posiblemente, en algunos casos, distintos sistemas de envase y cierre. El matrizado no debe aplicarse a muestras con diferencias que puedan afectar la estabilidad, tales como distintas concentraciones y
distintos envases y cierres, donde no pueda confirmarse que los productos responden de manera similar a las condiciones de
almacenamiento.
Cuando se utilicen la misma concentracin y exactamente el mismo sistema de envase y cierre para tres o ms volmenes
de llenado, el fabricante puede optar por incluir slo los tamaos de envase ms pequeo y ms grande en el programa de
estabilidad, es decir, puede optar por el bracketing. El diseo de un protocolo que incorpore bracketing supone que la
estabilidad de las muestras de condicin intermedia estn representadas por aquellas de los extremos. En ciertos casos, se pue-
USP 38
den necesitar datos para demostrar que todas las muestras estn adecuadamente representadas por los datos reunidos para los
extremos.
V. PERFIL INDICADOR DE ESTABILIDAD (5)
Captulos
En general, no hay una valoracin ni un parmetro nico indicador de estabilidad que ofrezca un perfil de las caractersticas
de estabilidad de un producto biotecnolgico o biolgico. Por consiguiente, el fabricante debe proponer un perfil indicador de
estabilidad que garantice que los cambios en la identidad, pureza y potencia del producto sern detectados.
En el momento de la presentacin, los solicitantes deben haber validado los mtodos que comprenden el perfil indicador de
estabilidad y los datos deben estar disponibles para su revisin. La determinacin de las pruebas que deben incluirse ser especfica para cada producto. Los elementos enfatizados en las siguientes subsecciones no pretenden incluir todas las caractersticas de un producto, sino representar aquellas que tpicamente deben documentarse para demostrar en forma adecuada la estabilidad del mismo.
A. Protocolo (5.1)
El expediente que acompaa la solicitud para autorizacin de comercializacin debe incluir un protocolo detallado de la evaluacin de la estabilidad tanto del frmaco como del producto farmacutico, que justifiquen las condiciones de almacenamiento y los perodos de vida til propuestos. El protocolo debe incluir toda la informacin necesaria que demuestre la estabilidad
del producto biotecnolgico o biolgico durante el perodo de vida til propuesto incluyendo, por ejemplo, especificaciones
bien definidas e intervalos de prueba. Los mtodos estadsticos que deben utilizarse se describen en la gua tripartita sobre
estabilidad.
B. Potencia (5.2)
Cuando el uso previsto de un producto est vinculado a una actividad biolgica definible y mensurable, las pruebas de potencia deben formar parte de los estudios de estabilidad. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en
esta gua, la potencia es la aptitud o capacidad especfica de un producto para lograr su efecto previsto. Se basa en la medida
de algn atributo del producto y se determina por medio de un mtodo cuantitativo in vivo o in vitro adecuado. En general,
las potencias de los productos biotecnolgicos o biolgicos probados por diferentes laboratorios pueden compararse en forma
significativa slo si se expresan en relacin con la de un material de referencia adecuado. Para tal propsito, debe incluirse en
la valoracin un material de referencia calibrado directa o indirectamente con respecto al material de referencia nacional o internacional correspondiente.
Los estudios de potencia deben realizarse a intervalos adecuados, segn se define en el protocolo de estabilidad y los resultados deben expresarse en unidades de actividad biolgica calibradas, siempre que sea posible, en relacin a estndares reconocidos nacional o internacionalmente. Cuando no existan estndares de referencia nacionales ni internacionales, los resultados
de las valoraciones podrn ser informados en unidades obtenidas internamente, utilizando un material de referencia caracterizado.
En algunos productos biotecnolgicos o biolgicos, la potencia depende de la conjugacin del ingrediente o ingredientes
activos a una segunda subunidad o de la unin con un adyuvante. La disociacin del ingrediente o los ingredientes activos del
transportador utilizado en conjugados o adyuvantes debe ser examinada en estudios en tiempo real/temperatura real (incluyendo condiciones que se encuentran durante el transporte). Es posible que la evaluacin de la estabilidad de tales productos
sea dificultosa, ya que, en ciertos casos, las pruebas in vitro de actividad biolgica y de caracterizacin fisicoqumica son poco
prcticas o proporcionan resultados inexactos. Para superar las deficiencias de las pruebas in vitro, habr que considerar estrategias adecuadas (por ejemplo, probar el producto antes de la conjugacin o unin, evaluar la liberacin del compuesto activo
de la segunda subunidad, valoraciones in vivo) o el uso de una prueba alternativa adecuada.
C. Pureza y Caracterizacin Molecular (5.3)
A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta gua, la pureza es un trmino relativo. Debido a los
efectos de la glicosilacin, desamidacin u otras heterogeneidades, la pureza absoluta de un producto biotecnolgico o biolgico es sumamente difcil de determinar. Por consiguiente, la pureza de un producto biotecnolgico o biolgico debe ser evaluada tpicamente por ms de un mtodo y el valor de pureza que se obtenga depender del mtodo. A efectos de las pruebas
de estabilidad, las pruebas de pureza deben concentrarse en los mtodos para la determinacin de los productos de degradacin.
El grado de pureza, al igual que las cantidades individuales y totales de productos de degradacin del producto biotecnolgico o biolgico ingresado en los estudios de estabilidad, deben ser informados y documentados siempre que sea posible. Los
lmites de degradacin aceptables deben derivar de los perfiles analticos de las partidas del frmaco y del producto farmacutico utilizados en los estudios preclnicos y clnicos.
El uso de metodologas analticas fisicoqumicas, bioqumicas e inmunoqumicas pertinentes debera permitir una caracterizacin exhaustiva del frmaco y/o del producto farmacutico (por ejemplo, tamao molecular, carga, hidrofobicidad) y la deteccin exacta de cambios de degradacin que puedan ser consecuencia de desamidacin, oxidacin, sulfoxidacin, agregacin
o fragmentacin durante el almacenamiento. Como ejemplos, entre los mtodos que pueden contribuir a este objetivo se incluyen la electroforesis (SDS09Page, inmunoelectroforesis, Western blot, isoelectroenfoque), la cromatografa de alta resolucin (por ejemplo, cromatografa en fase reversa, filtracin a travs de gel, intercambio inico, cromatografa de afinidad) y el
mapeo de pptidos.
Captulos
USP 38
Siempre que se detecten cambios cualitativos o cuantitativos significativos, que indiquen la formacin de un producto de
degradacin durante los estudios de estabilidad a largo plazo, acelerados y/o de estrs, habr que tener en cuenta los riesgos
potenciales y la necesidad de caracterizacin y cuantificacin de los productos de degradacin dentro del programa de estabilidad a largo plazo. Debern proponerse y justificarse lmites aceptables, teniendo en cuenta los niveles observados en el material utilizado en estudios preclnicos y clnicos.
Para sustancias que no puedan caracterizarse adecuadamente, o productos para los cuales no se pueda determinar un anlisis exacto de la pureza por mtodos analticos de rutina, el solicitante debe proponer y justificar procedimientos de prueba
alternativos.
D. Otras Caractersticas del Producto (5.4)
Las siguientes caractersticas del producto, pese a no estar especficamente relacionadas con productos biotecnolgicos o
biolgicos, deben ser monitoreadas e informadas para el producto farmacutico en su envase final:
El aspecto visual del producto (color y opacidad para soluciones o suspensiones; color, textura y tiempo de disolucin para
polvos), las partculas visibles en soluciones o despus de la reconstitucin de polvos o liofilizados, el pH y el nivel de humedad
de polvos y productos liofilizados.
Las pruebas de esterilidad o pruebas alternativas (por ejemplo, prueba de integridad del envase/cierre) deben realizarse, como mnimo, al inicio y al final de la vida til propuesta.
Los aditivos (por ejemplo, estabilizadores, conservantes) o los excipientes se pueden degradar durante el perodo de vida til
del producto farmacutico. Si hay alguna indicacin, durante los estudios de estabilidad preliminares, de que la reaccin o la
degradacin de tales materiales afectan adversamente la calidad del producto farmacutico, puede que se precise controlar
estos componentes durante el programa de estabilidad.
El envase/cierre tiene el potencial de afectar adversamente al producto y debe ser evaluado cuidadosamente (ver a continuacin).
VI. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO (6)
A. Temperatura (6.1)
Como la mayora de los productos biotecnolgicos o biolgicos terminados necesitan temperaturas de almacenamiento definidas con precisin, las condiciones de almacenamiento para los estudios de estabilidad en tiempo real/temperatura real pueden limitarse a la temperatura de almacenamiento propuesta.
B. Humedad (6.2)
Los productos biotecnolgicos o biolgicos generalmente se distribuyen en envases que los protegen contra la humedad.
Por lo tanto, donde pueda demostrarse que los envases propuestos (y las condiciones de almacenamiento) logran una proteccin suficiente contra la alta y baja humedad, por lo general, se podrn omitir las pruebas de estabilidad a distintas humedades
relativas. Cuando no se utilicen envases que protejan contra la humedad, deben proporcionarse datos de estabilidad adecuados.
C. Condiciones Aceleradas y de Estrs (6.3)
Segn se observ anteriormente, la fecha de caducidad debe basarse en datos de tiempo real/temperatura real. No obstante, se sugiere enfticamente que se realicen estudios sobre el frmaco y el producto farmacutico bajo condiciones aceleradas
y de estrs. Los estudios bajo condiciones aceleradas pueden proporcionar datos tiles para establecer la fecha de caducidad,
proporcionar informacin sobre la estabilidad del producto o sobre el futuro desarrollo del producto (por ejemplo, la evaluacin preliminar de los cambios de fabricacin propuestos tales como cambios en la formulacin, aumento de escala), ayudar a
la validacin de mtodos analticos para el programa de estabilidad, o generar informacin que pueda ayudar a dilucidar el
perfil de degradacin del frmaco o del producto farmacutico. Los estudios bajo condiciones de estrs pueden ser tiles para
determinar si las exposiciones accidentales a condiciones que no sean las propuestas (por ejemplo, durante el transporte) son
perjudiciales para el producto y tambin para evaluar qu parmetros especficos de prueba pueden ser los mejores indicadores de la estabilidad del producto. Los estudios de la exposicin del frmaco o del producto farmacutico a condiciones extremas pueden ayudar a revelar patrones de degradacin; si es as, dichos cambios deben ser monitoreados bajo las condiciones
de almacenamiento propuestas. Pese a que la gua tripartita sobre estabilidad describe las condiciones de los estudios acelerados y de estrs, el solicitante debe tener en cuenta que esas condiciones pueden no ser adecuadas para productos biotecnolgicos o biolgicos. Las condiciones deben seleccionarse cuidadosamente, de acuerdo a cada caso en particular.
D. Luz (6.4)
Los solicitantes deben consultar a las autoridades reguladoras correspondientes, en cada caso, a fin de determinar las pautas
para las pruebas.
E. Envase/Cierre (6.5)
Pueden ocurrir cambios en la calidad del producto, a causa de las interacciones entre el producto biotecnolgico o biolgico
formulado y el envase/cierre. Cuando no pueda excluirse la ausencia de interacciones en productos lquidos (que no sean ampollas selladas), los estudios de estabilidad deben incluir muestras mantenidas en posicin invertida u horizontal (es decir, en
contacto con el cierre), como tambin en posicin vertical, para determinar los efectos del cierre sobre la calidad del producto.
Deben suministrarse datos para todas las combinaciones diferentes de envase/cierre que se vayan a comercializar.
Adems de los datos estndar necesarios para un vial monodosis convencional, el solicitante debe demostrar que el cierre
utilizado en un vial multidosis es capaz de tolerar las condiciones de inserciones y extracciones reiteradas, de modo tal que el
USP 38
producto conserve completamente su potencia, pureza y calidad durante el perodo mximo especificado en las instrucciones
de uso en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Dicho etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
F. Estabilidad despus de la Reconstitucin de Productos Liofilizados (6.6)
Deber demostrarse la estabilidad de los productos liofilizados, despus de su reconstitucin, para las condiciones y el perodo de almacenamiento mximo especificados en los envases, empaques y/o folletos del empaque. Este etiquetado debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
VII. FRECUENCIA DE LAS PRUEBAS (7)
VIII. ESPECIFICACIONES (8)

Pese a que los productos biotecnolgicos o biolgicos pueden estar sujetos a prdidas significativas de actividad, a cambios
fisicoqumicos o a degradacin durante el almacenamiento, las regulaciones internacionales y nacionales han proporcionado
pocas pautas en relacin a especificaciones claras sobre liberacin y fin de la vida til. No se han desarrollado recomendaciones sobre prdidas de actividad mximas aceptables, lmites para cambios fisicoqumicos o degradacin durante la vida til
propuesta, que se refieran a tipos individuales o grupos de productos biotecnolgicos o biolgicos, sino que aquellas se consideran en cada caso en particular. Cada producto debe conservar sus especificaciones dentro de los lmites establecidos para
seguridad, pureza y potencia durante su vida til propuesta. Estas especificaciones y lmites deben derivar de toda la informacin disponible, usando los mtodos estadsticos adecuados. El uso de especificaciones diferentes para liberacin y caducidad
debe estar respaldado por datos suficientes que demuestren que la eficacia clnica no se ve afectada, segn se establece en la
gua tripartita sobre estabilidad.
IX. ETIQUETADO (9)
Se recomienda la definicin precisa de temperaturas de almacenamiento para la mayora de los frmacos y productos farmacuticos biotecnolgicos o biolgicos. Deben establecerse recomendaciones especficas, en particular, para frmacos y productos farmacuticos que no toleren la congelacin. Estas condiciones, y en los casos pertinentes, las recomendaciones sobre proteccin contra la luz o la humedad, deben figurar en los envases, empaques y/o folletos de los empaques. Dicho etiquetado
debe cumplir con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
X. GLOSARIO (10)
Escala de Planta PilotoLa produccin del frmaco o del producto farmacutico por medio de un procedimiento totalmente representativo y que simula el que se aplicar a escala de fabricacin. Los mtodos de expansin celular, la cosecha
y la purificacin del producto deben ser idnticos, excepto por la escala de produccin.
ImpurezaCualquier componente del frmaco (material a granel) o producto farmacutico (producto del envase final)
que no sea la entidad qumica definida como el frmaco, un excipiente u otros aditivos del producto farmacutico.
Produccin a Escala de FabricacinFabricacin a la escala que se encuentra tpicamente en una instalacin destinada a
la elaboracin de productos para su comercializacin.
Producto ConjugadoUn producto conjugado est constituido por un ingrediente activo (por ejemplo, un pptido, un
carbohidrato) unido en forma covalente o no covalente a un transportador (por ejemplo, una protena, un pptido, un
mineral inorgnico), con el objetivo de mejorar la eficacia o la estabilidad del producto.
Captulos
La vida til de los productos biotecnolgicos o biolgicos puede variar entre das y varios aos. Por lo tanto, es difcil elaborar guas uniformes respecto de la duracin de los estudios de estabilidad y de la frecuencia de prueba que corresponderan a
todos los tipos de productos biotecnolgicos o biolgicos. No obstante, slo con unas pocas excepciones, la vida til para los
productos existentes y los futuros productos potenciales oscila entre 0,5 y 5 aos. Por lo tanto, las pautas se basan en la vida
til esperada dentro de ese intervalo. Esto toma en cuenta el hecho de que la degradacin de los productos biotecnolgicos o
biolgicos puede no estar regida por los mismos factores durante intervalos diferentes de un perodo de almacenamiento prolongado.
Cuando se propone una vida til de 1 ao o menos, los estudios de estabilidad en tiempo real deben realizarse mensualmente durante los primeros 3 meses y a intervalos de 3 meses de all en adelante. Para productos con una vida til propuesta
de ms de 1 ao, los estudios deben realizarse cada 3 meses durante el primer ao de almacenamiento, cada 6 meses durante
el segundo ao y anualmente desde ese momento en adelante.
Mientras que los intervalos de prueba mencionados anteriormente pueden ser adecuados en la etapa previa a la aprobacin
o licencia, pruebas de estabilidad reducidas pueden ser adecuadas despus de la aprobacin o licencia, cuando se dispone de
datos que demuestran una estabilidad adecuada. Cuando existan datos que indiquen que la estabilidad de un producto no se
ve comprometida, se recomienda al solicitante presentar un protocolo que avale la eliminacin de intervalos de prueba especficos (por ejemplo, prueba a los 9 meses) para estudios a largo plazo posteriores a la aprobacin o licencia.
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Producto de DegradacinUna molcula que resulta de un cambio en el frmaco (material a granel) ocurrido con el
tiempo. A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta gua, dichos cambios podran ocurrir
como resultado de un proceso o del almacenamiento (por ejemplo, por desamidacin, oxidacin, agregacin, protelisis). En el caso de productos biotecnolgicos o biolgicos, algunos productos de degradacin pueden ser activos.
Producto IntermedioPara los productos biotecnolgicos o biolgicos, un material producido durante un proceso de fabricacin que no sea el frmaco o el producto farmacutico pero cuya fabricacin es fundamental para la produccin exitosa del frmaco o del producto farmacutico. Generalmente, un producto intermedio ser cuantificable y se establecern
especificaciones para determinar la finalizacin exitosa de la etapa de fabricacin antes de la continuacin del correspondiente proceso de fabricacin. Incluye material que podr ser sometido a modificaciones moleculares adicionales o conservado durante un perodo extenso antes de someterse a procesos adicionales.
1050 EVALUACIN DE LA SEGURIDAD VIRAL EN PRODUCTOS

BIOTECNOLGICOS OBTENIDOS DE LNEAS CELULARES DE ORIGEN
HUMANO O ANIMAL
Captulos
I. INTRODUCCIN
Este documento trata sobre el anlisis y la evaluacin de la seguridad viral de productos biotecnolgicos derivados de lneas
caracterizadas de clulas de origen humano o animal (es decir, de mamferos, aves, insectos) y describe brevemente los datos
que debern presentarse en el dossier para la solicitud y/o registro de comercializacin del producto. A los efectos de este documento, el trmino "virus" excluye los agentes transmisibles no convencionales como los asociados con la Encefalopata Espongiforme Bovina (BSE, por sus siglas en ingls) y el scrapie ovino (o tembladera ovina). Se recomienda a los solicitantes tratar los temas asociados con la BSE con las autoridades reguladoras.
El documento abarca los productos obtenidos a partir de cultivos celulares iniciados en bancos de clulas caracterizadas. Cubre los productos derivados del cultivo celular in vitro, como por ejemplo interferones, anticuerpos monoclonales y productos
derivados del cido desoxirribonucleico recombinante (ADN-r), incluyendo las vacunas de subunidades recombinantes y tambin los productos derivados de hibridomas cultivados in vivo, como la ascitis. En este ltimo caso se aplican consideraciones
especiales y el Apndice 1 contiene informacin adicional sobre pruebas de clulas multiplicadas in vivo. Se excluyen de este
documento las vacunas inactivadas, todas las vacunas a virus vivo que contienen agentes autorreplicables y vectores vivos diseados genticamente.
El riesgo de contaminacin viral es una caracterstica comn a todos los productos biotecnolgicos obtenidos a partir de
lneas celulares. Tal contaminacin podra tener consecuencias clnicas graves y puede surgir de la contaminacin de la fuente
misma de las lneas celulares (clulas sustrato) o de la introduccin accidental de un virus durante la produccin. Hasta la fecha, sin embargo, los productos biotecnolgicos derivados de lneas celulares no han estado involucrados en la transmisin de
virus. De todos modos, se estima que la seguridad de estos productos con respecto a la contaminacin viral slo puede garantizarse razonablemente mediante la aplicacin de un programa de pruebas de deteccin viral y la evaluacin de los procesos
de eliminacin e inactivacin viral efectuados durante la fabricacin, como se describe a continuacin.
Se han desarrollado tres enfoques principales y complementarios para controlar la potencial contaminacin viral de los productos biotecnolgicos:
(1) Seleccin y prueba de lneas celulares y otras materias primas, incluso de los componentes de los medios, para determinar la ausencia de virus indeseables que pueden ser infecciosos y/o patgenos para los seres humanos;
(2) Evaluacin de la capacidad de los procesos de produccin para eliminar los virus infecciosos;
(3) Realizacin de pruebas al producto en fases apropiadas de la produccin para verificar la ausencia de virus infecciosos
contaminantes.
Todas las pruebas sufren la limitacin inherente a las valoraciones virales cuantitativas, es decir, que la capacidad para detectar concentraciones virales bajas depende, por razones estadsticas, del tamao de la muestra. Por lo tanto, un solo enfoque no
alcanza para establecer la seguridad de un producto. En muchos casos, la certeza de que el producto final no contiene virus
infecciosos no surge exclusivamente de pruebas directas para determinar su presencia sino tambin de una demostracin de
que el rgimen de purificacin es capaz de eliminar y/o inactivar los virus.
El tipo y el alcance de las pruebas virales y de los estudios de depuracin viral necesarios en diferentes fases de produccin
dependern de diversos factores y debern considerarse para cada caso en particular y paso por paso. Los factores que se debern tener en cuenta incluyen el alcance de la caracterizacin y calificacin del banco de clulas, la naturaleza de los virus
detectados, los componentes del medio de cultivo, los mtodos de cultivo, el diseo de las instalaciones y los equipos, los resultados de las pruebas virales despus del cultivo de las clulas, la capacidad del proceso para eliminar los virus, el tipo de
producto y el uso clnico para el cual est destinado.
Informacin General / 1050 Evaluacin de la Seguridad Viral 999
USP 38
El propsito de este documento es describir un marco de referencia general para las pruebas de deteccin viral, los experimentos para la evaluacin de la depuracin viral y el enfoque recomendado para el diseo de pruebas para la deteccin de
virus y estudios de depuracin viral. En los apndices se incluye informacin relacionada mientras que en el glosario pueden
encontrarse definiciones de algunos trminos seleccionados.
Los fabricantes debern adaptar las recomendaciones presentadas en este documento a su producto y proceso de produccin especficos. Se deber explicar y justificar el enfoque empleado por los fabricantes en su estrategia general para garantizar
la seguridad viral. Adems del detalle de los datos que se proporcionan, podra ser til contar con un resumen general de la
evaluacin de la seguridad viral a fin de facilitar la revisin por parte de las autoridades regulatorias. Este resumen deber contener una breve descripcin de todos los aspectos de los estudios de seguridad viral y de las estrategias empleadas para impedir la contaminacin viral en relacin con este documento.
II. FUENTES POTENCIALES DE CONTAMINACIN VIRAL
III. CALIFICACIN DE LNEAS CELULARES: PRUEBA PARA LA DETECCIN DE VIRUS

Una parte importante de la calificacin de una lnea celular para su uso en la produccin de un producto biotecnolgico es
la realizacin de pruebas apropiadas para detectar la presencia de virus.
A. Pruebas Virales Sugeridas para BCM, Banco de Clulas de Trabajo (BCT) y Clulas en el Lmite de Edad Celular in Vitro
Empleadas para Produccin
La Tabla 1 muestra ejemplos de pruebas virales que se realizan una sola vez a diversos niveles de clulas, incluyendo el BCM,
el BCT y las clulas en el lmite de edad celular in vitro usadas para produccin.
Tabla 1. Ejemplos de Pruebas de Virus a ser Realizadas Una nica Vez a Distintos Niveles Celulares
BCM
BCT1
Clulas en el Lmite2
+3
+3
+4
+4
segn corresponda5
segn corresponda5
Pruebas para Retrovirus y Otros Virus Endgenos

Infectividad
Microscopa
electrnica3
Transcriptasa
inversa4
Otras pruebas especficas para
virus5
Pruebas para Virus No Endgenos o Adventicios

Valoraciones in vitro
Valoraciones in vivo
+7
+8
Pruebas de produccin de anticuerpos7

Otras pruebas especficas para
1
2
3
4
5
6
virus8
Ver textoseccin III.A.2.

Clulas en el Lmite: Clulas en el lmite de edad celular in vitro utilizadas para la produccin (Ver textoseccin III.A.3.).
Tambin puede detectar otros agentes.
No es necesario si es positivo en la prueba de infectividad de retrovirus.
Segn sea adecuado para las lneas celulares que se sabe estn infectadas por tales agentes.
Para el primer BCT, esta prueba deber hacerse sobre clulas en el lmite de la edad celular in vitro generadas a partir de ese BCT; para los BCT subsiguientes al
primer BCT, se puede llevar a cabo una nica prueba in vitro e in vivo ya sea directamente sobre el BCT o sobre clulas en el lmite de la edad celular in vitro.
7 Por ejemplo, MAP, RAP, HAPnormalmente aplicables para las lneas celulares de roedores.
8 Por ejemplo, las pruebas para lneas celulares derivadas de lneas celulares humanas, de primates no humanos, u otras, segn sea adecuado.
Captulos
La contaminacin viral de los productos biotecnolgicos puede surgir de la fuente original de las lneas celulares o de la introduccin accidental de virus durante los procesos de produccin.
A. Virus que Pueden Encontrarse en el Banco de Clulas Maestras (BCM)
Las clulas pueden sufrir una infeccin viral latente o persistente (por ejemplo, virus del herpes) o tener retrovirus endgenos
que pueden transmitirse verticalmente desde una generacin de clulas a la siguiente, ya que el genoma viral persiste dentro
de la clula. Tales virus pueden expresarse constitutivamente o inesperadamente como un virus infeccioso. Los virus pueden
introducirse en el BCM por diferentes vas, como por ejemplo: (1) derivacin de lneas celulares de animales infectados; (2)
empleo de virus para establecer la lnea celular; (3) empleo de reactivos biolgicos contaminados, como por ejemplo, componentes sricos animales; (4) contaminacin durante la manipulacin de las clulas.
B. Virus Adventicios Que Pueden Introducirse Durante la Produccin
Los virus adventicios pueden introducirse en el producto final por diferentes vas que incluyen, entre otras, las siguientes: (1)
empleo de reactivos biolgicos contaminados, como por ejemplo, componentes de suero animal; (2) empleo de un virus para
inducir la expresin de genes especficos que codifican una protena deseada; (3) empleo de un reactivo contaminado, como
por ejemplo, una columna para cromatografa de afinidad con anticuerpos monoclonales; (4) empleo de un excipiente contaminado durante la formulacin; y (5) contaminacin durante la manipulacin de las clulas y del medio. El control de los parmetros de cultivo de clulas puede ser til para la deteccin temprana de la contaminacin potencial por virus adventicios.
Captulos
1000 1050 Evaluacin de la Seguridad Viral / Informacin General
USP 38
1. Banco de Clulas Maestras

En el BCM se deber realizar un examen exhaustivo para detectar la contaminacin viral, tanto endgena como no endgena. En el caso de las lneas celulares heterohbridas en las cuales una o varias clulas asociadas son de origen humano o provienen de primates no humanos, se debern realizar pruebas para detectar los virus de origen humano o provenientes de primates no humanos porque la contaminacin viral que surge de estas clulas puede representar un peligro importante.
Las pruebas para detectar virus no endgenos debern incluir pruebas de inoculacin in vitro e in vivo y otras pruebas especficas, incluyendo pruebas especficas para la especie que sean apropiadas, como por ejemplo la prueba de produccin de
anticuerpos en ratones (MAP, por sus siglas en ingls), segn el historial de resiembra de la lnea celular, para detectar posibles
virus contaminantes.
2. Banco de Clulas de Trabajo
Cada BCT empleado como sustrato inicial de clulas para la produccin de medicamentos deber ser examinado para detectar virus adventicios, ya sea realizando pruebas directas o mediante el anlisis de clulas que estn en el lmite de edad celular
in vitro, obtenidas inicialmente del BCT. Cuando se hayan realizado pruebas adecuadas para detectar virus no endgenos en el
BCM y se hayan obtenido del BCT clulas cultivadas hasta el lmite de edad celular in vitro, o ms all de ese lmite y se las
haya utilizado para detectar la presencia de virus adventicios, no ser necesario realizar pruebas similares en el BCT inicial. Por
lo general, no son necesarias las pruebas de produccin de anticuerpos para el BCT. Tambin se considerara aceptable un
enfoque alternativo en el cual se lleven a cabo pruebas completas sobre el BCT en lugar de hacerlo en el BCM.
3. Clulas en el Lmite de Edad Celular in Vitro Empleadas para Produccin
El lmite de edad celular in vitro usado para la produccin deber estar sustentado en los datos de clulas de produccin
expandidas a escala de planta piloto o condiciones de escala comercial hasta la edad celular in vitro propuesta, o ms all de
sta. Por lo general, las clulas de produccin se obtienen por expansin del BCT; el BCM tambin puede utilizarse para preparar las clulas de produccin. Las clulas que se encuentran en el lmite de la edad celular in vitro debern evaluarse una vez
para detectar los virus endgenos que pueden no haber sido detectados en el BCM y BCT. La realizacin de pruebas adecuadas (por ejemplo, in vitro e in vivo) por lo menos una vez en las clulas utilizadas para la produccin que estn en el lmite de
edad celular in vitro proporcionara una seguridad adicional de que el proceso de produccin no es propenso a la contaminacin por virus adventicios. Si se detecta algn virus adventicio a estos niveles, el proceso se deber controlar cuidadosamente
para determinar la causa de la contaminacin y, si fuera necesario, su diseo deber modificarse por completo.
B. Pruebas Recomendadas para la Deteccin e Identificacin de Virus
Se pueden emplear numerosas pruebas para la deteccin de virus endgenos y adventicios. En la Tabla 2 se enumeran ejemplos de estas pruebas. Estos ejemplos debern ser considerados como protocolos de valoracin recomendados actualmente,
pero la lista no es exhaustiva ni definitiva. Puesto que las tcnicas ms apropiadas pueden cambiar con los avances cientficos,
las propuestas de tcnicas alternativas pueden considerarse aceptables, siempre y cuando se acompaen de datos que las avalen. Se recomienda a los fabricantes tratar estas alternativas con las autoridades reguladoras. Puede ser necesario realizar otras
pruebas conforme a cada caso particular. Las pruebas debern incluir controles apropiados para asegurar una adecuada sensibilidad y especificidad. Pueden requerirse pruebas y/o enfoques especficos en aquellos casos en los que se puede predecir con
una probabilidad relativamente alta la presencia de un virus especfico proveniente de la especie de origen del sustrato celular.
Si la lnea celular usada para la produccin es de origen humano o de primate no humano, debern realizarse pruebas adicionales para detectar virus de humanos, como por ejemplo los que causan enfermedades de inmunodeficiencia y hepatitis, a
menos que se justifiquen otra cosa. La reaccin en cadena de polimerasa (RCP) puede ser apropiada para detectar las secuencias de otros virus humanos, as como otros virus especficos. A continuacin, se incluye una breve descripcin del marco de
referencia general y de los antecedentes filosficos conforme a los cuales el fabricante deber justificar lo realizado.
Tabla 2. Ejemplos de Uso y Lmites de Valoraciones Que Pueden Utilizarse para Detectar Virus
Prueba
Artculo de Prueba
Limitaciones de la Deteccin
Produccin de anticuerpos
Lisado de clulas y su medio de cultivo
Antgenos virales especficos
Antgenos no infecciosos para sistema de prueba en animales
Examen de virus in vivo
Lisado de clulas y su medio de cultivo
Amplia gama de virus patognicos para humanos
Agentes que no se replican ni producen enfermedades en el sistema

de prueba
Amplia gama de virus patognicos para humanos
Agentes que no se replican ni producen enfermedades en el sistema

de prueba
Examen de virus in vitro para:
1. Caracterizacin del banco de clulas
1. Lisado de clulas y su medio de

cultivo (para cultivos conjuntos, las
clulas intactas debern estar en el
artculo de prueba)
2. Examen de produccin
2. Recoleccin a granel no procesada o lisado de clulas y su medio

de cultivo celular del reactor de
produccin
Adems, es difcil distinguir el artculo de prueba de las clulas indicadoras.
USP 38
Tabla 2. Ejemplos de Uso y Lmites de Valoraciones Que Pueden Utilizarse para Detectar Virus (Continuacin)
Prueba
Artculo de Prueba
TEM sobre:
Virus y partculas similares a virus
Limitaciones de la Deteccin
Valoracin cualitativa con evaluacin de identidad
1. Clula sustrato
1. Clulas viables
2. Sobrenadante de cultivo celular
2. Sobrenadante de cultivo libre de

clulas
Transcriptasa inversa (TI)
Sobrenadante de cultivo libre de c- Retrovirus y TI retroviral expresada

lulas
Slo detecta enzimas con actividad

ptima bajo condiciones preferidas. La interpretacin puede ser
difcil debido a la presencia de enzimas celulares; fondo con algunas
muestras concentradas
Infectividad con retrovirus (RV)
Sobrenadante de cultivo libre de c- Retrovirus infecciosos

lulas
RV que no se replican ni forman focos o placas discretos en el sistema

de prueba elegido
Cultivo conjunto
Clulas viables
RV que no se replican
Retrovirus infecciosos
1. Punto final de infectividad
1. Ver ms arriba en
infectividad de RV
2. Punto final de TEM
2. Ver ms arriba en TEM1
3. Punto final de TI
3. Ver ms arriba en TI
Secuencias de virus especficas
Clulas, lquido de cultivo y otros

materiales
Las secuencias de los

iniciadores deben estar presentes.
No indica si el virus es infeccioso.
Adems, es difcil distinguir el artculo de prueba de las clulas indicadoras.
1. Pruebas para Detectar Retrovirus

Para el BCM y para clulas cultivadas hasta el lmite de edad celular in vitro o ms all de ste usadas para la produccin, se
debern realizar pruebas para retrovirus, incluidas las valoraciones de infectividad en cultivos celulares sensibles y estudios de
microscopa electrnica (ME). Si no se detecta infectividad y no se han observado ningn retrovirus o partculas similares a
retrovirus por ME, deber realizarse la valoracin de transcriptasa inversa (TI) u otras valoraciones apropiadas para la deteccin
de retrovirus que pueden no ser infecciosos. Se ha descubierto que los estudios de induccin no son tiles.
2. Valoraciones In Vitro
Las pruebas in vitro se llevan a cabo mediante la inoculacin de un artculo de prueba (ver Tabla 2) en diversos cultivos celulares indicadores, sensibles y capaces de detectar una amplia gama de virus humanos y animales pertinentes. La seleccin de
clulas usadas en la prueba se rige por la especie de origen del banco de clulas a evaluar, pero deber incluir una lnea celular
humana y/o de primates no humanos que sea sensible a los virus humanos. La naturaleza de la valoracin y de la muestra a
analizar estn regidas por el tipo de virus que posiblemente pueda estar presente considerando el origen o manipulacin de las
clulas. Se debern buscar los virus tanto citopticos como hemadsorbentes.
3. Valoraciones In Vivo
Se deber inocular un artculo de prueba (ver Tabla 2) en animales, incluyendo ratones adultos y lactantes, y en huevos embrionados para descubrir virus que no pueden crecer en cultivos celulares. Se pueden emplear otras especies de animales, segn la naturaleza y el origen de las lneas celulares que se van a analizar. Se deber vigilar la salud de los animales y deber
investigarse toda anormalidad para establecer la causa de la enfermedad.
4. Pruebas de Produccin de Anticuerpos
Los virus especficos para la especie, presentes en lneas celulares de roedores, pueden detectarse mediante inoculacin del
artculo de prueba (ver Tabla 2) en animales libres de virus, y mediante el examen, despus de un perodo especfico, del nivel
del anticuerpo srico o la actividad enzimtica. Ejemplos de tales pruebas son la prueba de produccin de anticuerpos en ratones (MAP), la prueba de produccin de anticuerpos en ratas (RAP) y la prueba de produccin de anticuerpos en hmsteres
(HAP). Los virus que actualmente se examinan en las valoraciones de produccin de anticuerpos se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Produccin de Anticuerpos
MAP
HAP
Virus de
Ectromelia2,3
Virus Hantaan1,3
Virus
K2
Virus de Deshidrogenasa Lctica (LDM)1,3

1
2
3
RAP
Hantaan1,3
Virus de Coriomeningitis Linfoctica

(LCM)1,3
Virus
Virus de la Pneumona de Ratn (PVM)2,3
Virus de Rata Kilham (KRV)2,3
Reovirus Tipo 3
(Reo3)1,3
Virus Sendai1,3
Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates.
Virus de los que no se tiene evidencia de su capacidad para infectar a seres humanos.
Virus capaces de replicarse in vitro en clulas de origen humano o de primates.
Virus de la Encefalomielitis de Ratn

(Theilers, GDVII)2
Captulos
RCP (Reaccin de cadena de polimerasa)
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Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Produccin de Anticuerpos (Continuacin)

MAP
Virus de Coriomeningitis Linfoctica
(LCM)1,3
HAP
SV5
RAP
Coronavirus de Rata (RCV)2
Virus Diminuto de Ratn2,3
Reovirus Tipo 3 (Reo3)1,3
Adenovirus de Ratn (MAV)2,3
Virus Sendai1,3
Citomegalovirus de Ratn (MCMV)2,3
Virus de Sialoacrioadenitis (SDAV)2
Virus de la Encefalomielitis de Ratn

(Theilers, GDVII)2
Virus Toolan (HI)2,3
Virus de la Hepatitis de Ratn (MHV)2

Rotavirus de Ratn (EDIM)2,3
Virus de Polioma2
Reovirus Tipo 3 (Reo3)1,3
Virus Sendai1,3
Virus Tmico2
Captulos
1
2
3
Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates.
Virus de los que no se tiene evidencia de su capacidad para infectar a seres humanos.
Virus capaces de replicarse in vitro en clulas de origen humano o de primates.
C. Aceptabilidad de las Lneas Celulares

Se reconoce que algunas lneas celulares usadas para la fabricacin de productos contienen retrovirus endgenos, otros virus
o secuencias virales. En tales circunstancias, el plan de accin recomendado para la fabricacin es el descrito en la Seccin V de
este documento. La aceptabilidad de las lneas celulares que contienen virus distintos de los retrovirus endgenos ser considerada en forma individual por las autoridades regulatorias, teniendo en cuenta un anlisis de riesgo/beneficio basado en el beneficio del producto y el uso clnico al que est destinado, la naturaleza de los virus contaminantes, su potencial para infectar o
causar enfermedades en los seres humanos, el proceso de purificacin del producto (por ejemplo, datos de evaluacin de depuracin viral) y el nivel de pruebas virales realizadas en el material a granel purificado.
IV. COMPROBACIN DE VIRUS EN EL MATERIAL A GRANEL SIN PROCESAR
El material a granel sin procesar est constituido por uno o varios grupos de clulas y medios de cultivo recolectados mezclados. Cuando las clulas no son accesibles fcilmente (por ejemplo, fibra hueca o sistemas similares), el granel sin procesar estara constituido por lquidos extrados del fermentador. Una muestra representativa del material a granel sin procesar, tomada
del reactor de produccin antes del procesamiento adicional, representa uno de los niveles ms apropiados en el cual se puede
determinar la posibilidad de contaminacin viral adventicia con una alta probabilidad de deteccin. Se debern realizar pruebas apropiadas para detectar virus al nivel de granel sin procesar, a menos que la prueba para detectar virus se haga ms sensible mediante un procesamiento inicial parcial (por ejemplo, un granel sin procesar podra ser txico en cultivos de clulas de
prueba, mientras que un granel parcialmente procesado podra no serlo).
En ciertos casos, puede ser ms apropiado probar una mezcla de clulas intactas y deshechas y el sobrenadante del cultivo
celular extrado del reactor de produccin antes del procesamiento adicional. Como parte de la solicitud y/o registro para la
comercializacin de un producto, se debern presentar datos de, por lo menos, tres lotes de granel sin procesar a escala de
planta piloto o comercial.
Se recomienda a los fabricantes elaborar programas para la evaluacin de virus adventicios en lotes de produccin. El alcance, el grado y la frecuencia de pruebas virales en el granel sin procesar debern determinarse tomando en consideracin varios
puntos, incluyendo la naturaleza de las lneas celulares usadas para elaborar los productos deseados, los resultados y el grado
de las pruebas para virus realizadas durante la calificacin de las lneas celulares, el mtodo de cultivo, las fuentes de materia
prima y los resultados de los estudios de depuracin viral. Las pruebas de examen in vitro, utilizando una o varias lneas celulares, generalmente se emplean para probar el material a granel no procesado. Si fuera apropiado, puede utilizarse una prueba
de RCP u otros mtodos apropiados.
En general, el material recolectado en el cual se han detectado virus adventicios no deber utilizarse para elaborar el producto. Si se detectan algunos virus adventicios a este nivel, se deber controlar el proceso con cuidado para determinar la causa
de la contaminacin y tomar las acciones apropiadas al caso.
V. JUSTIFICACIN Y PLAN DE ACCIN PARA LOS ESTUDIOS DE DEPURACIN VIRAL Y PRUEBAS VIRALES EN MATERIAL
A GRANEL PURIFICADO
Es importante disear el protocolo ms adecuado y racional para las pruebas virales a partir del nivel de BCM, a lo largo de
los diversos pasos de la produccin del frmaco hasta la obtencin del producto final, incluyendo la evaluacin y la caracterizacin de la depuracin viral del material a granel sin procesar. La evaluacin y caracterizacin de la depuracin viral cumple una
USP 38
Tabla 4. Plan de Accin para la Evaluacin del Proceso de Depuracin Viral y Pruebas para Virus en Materiales a Granel Purificados
Caso A
Caso B
Caso C2
Caso D2
Caso E2
Estado
Presencia de virus1
(+)3
Partculas similares a virus1
(+)3
Partculas similares a retrovirus1
(+)3
Virus identificado
no corresponde
Virus patgeno para humanos
no corresponde
desconocido
Caracterizacin del proceso de depuracin viral utilizando virus modelo no especficos
s5
s5
s5
s5
s7
Evaluacin de proceso de depuracin

viral utilizando virus relevantes o modelo especficos
no
s6
s6
s6
s7
Prueba para virus en material a granel purificado
no corresponde
s8
s8
s8
s8
Accin
Resultados de las pruebas de deteccin de virus para el substrato celular y/o al nivel de granel no procesado. Los cultivos celulares utilizados para la produccin que estn contaminados con virus generalmente no sern aceptables. Los virus endgenos (tales como retrovirus) o los virus que forman parte integral del
BCM pueden ser aceptables si se utilizan procedimientos de evaluacin de depuracin viral apropiados.
2 El uso de material fuente que est contaminado con virus, ya sea que se sepa o no que son infecciosos y/o patgenos para el ser humano, solamente sern
aceptables en circunstancias muy excepcionales.
3 Se ha observado un virus por mtodos directos o indirectos.
4 Se piensa que es no patgeno.
5 Se deber llevar a cabo la caracterizacin de la depuracin utilizando virus modelo no especficos.
6 Se deber llevar a cabo la evaluacin del proceso con virus relevantes o virus modelo especficos.
7 Ver texto para el Caso E.
8 Deber confirmarse la ausencia de virus detectables para el material a granel purificado utilizando mtodos apropiados de alta especificidad y sensibilidad para
la deteccin del virus en cuestin. Para la autorizacin de su comercializacin, se debern proporcionar los datos de por lo menos 3 lotes de material a granel
purificado y fabricado a escala de planta piloto o comercial. Sin embargo, para lneas celulares tales como clulas CHO, para las cuales las partculas endgenas
han sido caracterizadas extensivamente y se ha demostrado una depuracin adecuada, normalmente no es necesario determinar la presencia de partculas no
infecciosas en el material a granel purificado.
Caso A: Cuando se ha demostrado que no hay ningn virus, partculas similares a virus o partculas similares a retrovirus en
las clulas o en el granel sin procesar, se debern realizar estudios de inactivacin o eliminacin viral con virus modelo no
especficos como se indic anteriormente.
Caso B: Cuando hay presente solamente un retrovirus de roedor (o una partcula similar a un retrovirus que se piensa que
es no patgena, como las partculas de roedor de tipo A y R), se deber realizar la evaluacin del proceso utilizando un virus
modelo especfico, como un virus de leucemia murina. El material a granel purificado deber analizarse utilizando mtodos
apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestin. Para la autorizacin de la comercializacin, se debern proveer datos de al menos tres lotes de material a granel purificado a escala comercial o escala de planta piloto. Se han usado con frecuencia lneas celulares tales como las de ovario de hmsteres chinos (CHO), de C127, de rin
de hmsteres recin nacidos (BHK) y lneas celulares de hibridoma murino como sustratos para la produccin de medicamen-
Captulos
funcin fundamental en este esquema. El objetivo deber ser obtener la mayor seguridad razonable de que un producto est
libre de contaminacin viral.
Al seleccionar los virus que se utilizarn en un estudio de depuracin, resulta til distinguir entre la necesidad de evaluar los
procesos con respecto a su capacidad de eliminar los virus que se sabe estn presentes y el deseo de calcular la solidez del
proceso mediante la caracterizacin de la depuracin de los virus de modelo no especfico (descritos a continuacin). En el
glosario se incluyen las definiciones de virus relevantes y virus modelo especficos y no especficos. La evaluacin de procesos requiere un conocimiento de la cantidad de virus que pueden estar presentes en el proceso, como en el material a granel
no procesado, y cunto puede depurarse a fin de evaluar la seguridad del producto. El conocimiento de la dependencia del
tiempo en los procedimientos de inactivacin es til para asegurar la eficacia del proceso. Cuando se evala la depuracin de
contaminantes conocidos se debern proporcionar estudios profundos de inactivacin dependientes del tiempo, una demostracin de la reproducibilidad de la inactivacin/eliminacin y una evaluacin de los parmetros del proceso. Cuando un proceso de fabricacin est caracterizado por la robustez de depuracin utilizando virus modelo no especficos, en el diseo del
estudio se deber prestar atencin especial a los virus no encapsulados. El alcance de los estudios de caracterizacin de depuracin viral puede estar influenciado por los resultados de las pruebas en las lneas celulares y el material a granel sin procesar.
Estos estudios debern realizarse conforme a la descripcin de la seccin VI que sigue a continuacin.
La Tabla 4 muestra un ejemplo de un plan de accin en relacin con la evaluacin del proceso y la caracterizacin de depuracin viral, as como las pruebas virales en material a granel purificado en respuesta a los resultados de las pruebas virales en
clulas y/o el material a granel sin procesar. Se consideran diversos casos. En todos los casos, se deber realizar la caracterizacin de la depuracin que utiliza virus modelo no especficos. Las situaciones ms comunes son los Casos A y B. Normalmente no se usan sistemas de produccin contaminados con un virus que no sea un retrovirus de roedores. Cuando existen razones convincentes y bien justificadas para la produccin de frmacos usando una lnea celular de los Casos C, D o E, stos debern ser tratados con las autoridades reguladoras. Con los Casos C, D y E, es importante haber validado los pasos eficaces para
inactivar/eliminar el virus en cuestin del proceso de fabricacin.
Captulos
USP 38
tos sobre los cuales no se han informado problemas de seguridad relacionados con la contaminacin viral de los productos.
Para estas lneas celulares en las cuales las partculas endgenas se han caracterizado ampliamente y se ha demostrado la depuracin, generalmente no es necesario hacer pruebas para detectar la presencia de partculas no infecciosas en el material a
granel purificado. Son apropiados los estudios con virus modelo no especficos, como en el Caso A.
Caso C: Cuando se sabe que las clulas o el material a granel no procesado contienen virus, distintos de un retrovirus de
roedores, del que no hay ninguna evidencia de la capacidad de infeccin en seres humanos [como aquellos identificados en la
nota 2 al pie de la Tabla 3, excepto los retrovirus de roedores (Caso B)], los estudios de evaluacin de eliminacin e inactivacin de los virus debern usar el virus identificado. Si no es posible usar el virus identificado, se debern utilizar virus relevantes o modelo especficos para demostrar una depuracin aceptable. Se deber obtener una inactivacin dependiente del
tiempo para los virus identificados (o virus relevantes o modelo especficos) en los pasos de inactivacin fundamentales
como parte de la evaluacin del proceso para estos virus. El material a granel purificado deber analizarse utilizando mtodos
apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestin. Para la autorizacin de la comercializacin, se debern proveer los datos de al menos tres lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso D: En aquellos casos en que se identifica un agente patgeno humano conocido, como los indicados en la nota 1 al
pie de la Tabla 3, el producto puede ser aceptable slo en circunstancias excepcionales. En este caso, se recomienda usar el
virus identificado para los estudios de evaluacin de eliminacin e inactivacin viral y emplear mtodos especficos con alta
especificidad y sensibilidad para detectar el virus en cuestin. Si no es posible usar el virus identificado, se debern utilizar virus
relevantes y/o modelo especficos (descritos a continuacin). Se deber demostrar que el proceso logra la eliminacin e
inactivacin de los virus seleccionados durante los procesos de purificacin e inactivacin. Se debern obtener datos de inactivacin dependientes del tiempo para los pasos de inactivacin fundamentales como parte de la evaluacin del proceso. Debern hacerse pruebas en el granel purificado utilizando mtodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad
para detectar el virus en cuestin. Para la autorizacin de la comercializacin, se debern proveer los datos de al menos tres
lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala comercial.
Caso E: En aquellos casos en que se detecta un virus que no puede clasificarse segn los mtodos actualmente disponibles
en clulas o material a granel no procesado, el producto se considera por lo general inadmisible ya que el virus puede resultar
patgeno. En el caso muy poco frecuente de que haya razones convincentes y bien justificadas para producir el frmaco usando dicha lnea celular, deber tratarse con las autoridades reguladoras antes de continuar avanzando.
VI. EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE LOS PROCEDIMIENTOS DE DEPURACIN VIRAL
La evaluacin y caracterizacin de los procedimientos de eliminacin y/o inactivacin viral desempean un papel importante
a la hora de establecer la seguridad de un producto biotecnolgico. Anteriormente, han ocurrido muchos casos de contaminacin con agentes cuya presencia no se detect ni se sospech y aunque esto sucedi con productos biolgicos obtenidos de
diversas materias primas diferentes de las lneas celulares plenamente caracterizadas, la evaluacin de la depuracin viral proporcionar una medida de seguridad que indica que puede eliminarse cualquier virus desconocido, no sospechado y nocivo.
Se debern realizar estudios de una manera bien documentada y controlada.
El objetivo de los estudios de depuracin viral es evaluar el paso o los pasos del proceso que pueden considerarse eficaces
para la inactivacin o eliminacin de los virus y hacer el clculo cuantitativo del nivel general de reduccin viral obtenido por el
proceso. Esto deber realizarse mediante la introduccin deliberada (adicionado) de cantidades significativas de un virus al
material crudo y/o a diferentes fracciones obtenidas durante los diversos pasos del proceso y la demostracin de su eliminacin
o inactivacin durante los pasos posteriores. No se considera necesario evaluar o caracterizar todos los pasos de un proceso de
fabricacin si se demuestra una depuracin adecuada mediante el uso de menos pasos. Deber tenerse presente que otros
pasos del proceso pueden tener un efecto indirecto sobre la inactivacin o eliminacin viral lograda. Los fabricantes debern
explicar y justificar el enfoque utilizado en los estudios de evaluacin de la depuracin viral.
La reduccin de la infectividad viral puede lograrse mediante la eliminacin de las partculas virales o por inactivacin de la
infectividad viral. Para cada etapa de produccin evaluada, se deber describir el posible mecanismo de prdida de infectividad
viral estableciendo si se debe a inactivacin o eliminacin. Para los pasos de inactivacin, el estudio deber planificarse de tal
manera que las muestras se tomen en diferentes tiempos y se deber elaborar una curva de inactivacin (ver Seccin VI.B.5.).
Los estudios de evaluacin de depuracin viral se realizan para demostrar la depuracin de un virus que se sabe est presente en el BCM y/o para proporcionar cierta seguridad de que se eliminaran los virus adventicios que no pudieron detectarse o
que pudieran llegar a tener acceso al proceso de produccin. Los factores de reduccin se expresan normalmente en escala
logartmica, lo cual implica que, aunque la infectividad viral residual nunca se reducir a cero, puede reducirse considerablemente en forma matemtica.
Adems de los estudios de depuracin para los virus que se sabe estn presentes, debern realizarse estudios para caracterizar la capacidad para eliminar y/o inactivar otros virus. El objetivo de los estudios con virus que presentan una variedad de
propiedades bioqumicas y biofsicas que no se sabe si estn presentes o que no se estima que lo estn es caracterizar la robustez del procedimiento en lugar de lograr una inactivacin o eliminacin especfica. Es aconsejable que se haga una demostracin de la capacidad del proceso de produccin para inactivar o eliminar los virus (ver Seccin VI.C.). Tales estudios no se realizan para evaluar un riesgo especfico de seguridad. Por consiguiente, no se necesita llegar a un valor especfico de depuracin.
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Tabla A-1. Ejemplos de Virus que se Han Utilizado en Estudios de Depuracin Viral
Forma
Resistencia1
Familia
Gnero
Husped
Natural
Genoma
Med.
Amb.
Tamao
(nm)
Virus de la Estomatitis
Vesicular
Rhabdoviridae
Virus vesicular
Equinos, Bovinos
ARN
70 150
Cnica
Baja
Parainfluenzavirus
Paramixoviridae
Virus parami- Varios

xo
ARN
100200
Pleo/Esfrico
Baja
MuL V
Retroviridae
Oncovirus
Tipo C
Ratones
ARN
80110
Esfrico
Baja
Virus de Sindbis
Togaviridae
Alfavirus
Humanos
ARN
6070
Esfrico
Baja
BVDV
Flaviviridae
Pestivirus
Bovinos
ARN
5070
Pleo/Esfrico
Baja
Virus
Virus de la Pseudorabia
Herpesviridae
Porcinos
ADN
120200
Esfrico
Media
Poliovirus Sabn
Tipo 1
Picornaviridae
Enterovirus
Seres humanos
ARN
no
2530
Icosahdrico
Media
Virus de la Encefalomiocarditis (EMC)
Picornaviridae
Cardiovirus
Ratones
ARN
no
2530
Icosahdrico
Media
Reovirus 3
Reoviridae
Ortoreovirus
Varios
ARN
no
6080
Esfrico
SV 40
Papova
Poliomavirus
Monos
ADN
no
4050
Icosahdrico
Muy alta
Parvovirus
Caninos
Porcinos
ADN
no
1824
Icosahdrico
Muy alta
Parvovirus (canino, porci- Parvoviridae

no)
Media
1 Resistencia a tratamientos fsico-qumicos basados en estudios de procesos de produccin. La resistencia se refiere al tratamiento especfico y se utiliza en el
contexto del entendimiento de la biologa del virus y la naturaleza del proceso de fabricacin. Los resultados obtenidos varan segn el tratamiento. Estos virus se
ofrecen a modo de ejemplo y su uso no se considera obligatorio.
Captulos
A. Seleccin de Virus para la Evaluacin y Caracterizacin de la Depuracin Viral

Los virus para la evaluacin de la depuracin y los estudios de caracterizacin de los procesos, debern elegirse de manera
tal que se asemejen a los virus que puedan contaminar el producto y que representen una amplia gama de propiedades fsicoqumicas para probar la capacidad del sistema para eliminar los virus en general. El fabricante deber justificar la eleccin de
los virus en conformidad con los objetivos de la evaluacin y el estudio de caracterizacin y las pautas proporcionadas en este
documento.
1. Virus Relevantes y Virus Modelo
Un aspecto importante en la realizacin de un estudio de depuracin viral es determinar qu virus debern utilizarse. Estos
virus se clasifican en tres categoras: virus relevantes, virus modelo especficos y virus modelo no especficos.
Los virus relevantes son virus utilizados en la evaluacin de los procesos de estudios de depuracin viral, que son los virus
identificados o virus de la misma especie que los virus que se sabe que contaminan las clulas sustrato u otros reactivos o materiales utilizados en el proceso de produccin, o que tienen probabilidades de hacerlo. La purificacin y/o proceso de inactivacin deber demostrar la capacidad para eliminar y/o inactivar tales virus. Cuando un virus relevante no est disponible o no
se adapta bien a la evaluacin del proceso de estudios de depuracin viral (por ejemplo, no puede multiplicarse in vitro a niveles suficientemente altos), se deber utilizar un virus modelo especfico como sustituto. Un virus modelo especfico apropiado puede ser un virus que est relacionado estrechamente con el virus conocido o presunto (del mismo gnero o familia),
con propiedades fsicas y qumicas similares a las del virus observado o presunto.
Generalmente, las lneas celulares derivadas de roedores contienen partculas de retrovirus endgenos o partculas similares a
retrovirus que pueden ser infecciosas (partculas tipo C) o no infecciosas (partculas citoplasmticas tipo A y R). Deber determinarse la capacidad del proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar los retrovirus de roedores de los productos obtenidos de tales clulas. Esto puede realizarse utilizando un virus de leucemia murina, un virus modelo especfico en el caso de
clulas de origen murino. Cuando se han obtenido lneas celulares humanas que secretan anticuerpos monoclonales mediante
la inmortalizacin de linfocitos B por el Virus Epstein-Barr (EBV por sus siglas en ingls), se deber determinar la capacidad del
proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar un virus de herpes. El virus de la pseudo-rabia tambin puede utilizarse como un virus modelo especfico.
Cuando la finalidad es caracterizar la capacidad del proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar los virus en general, es
decir, caracterizar la robustez del proceso de depuracin, los estudios de caracterizacin de depuracin viral debern realizarse
con virus modelo no especficos con propiedades diferentes. Los datos obtenidos de los estudios con virus relevantes y/o
modelo especficos tambin pueden contribuir a esta evaluacin. No es necesario probar todos los tipos de virus. Se deber
dar preferencia a los virus que muestran una resistencia significativa a los tratamientos fsicos y/o qumicos. Los resultados obtenidos para tales virus proporcionan informacin til acerca de la capacidad del proceso de produccin para eliminar y/o
inactivar todo tipo de virus. La seleccin y el nmero de virus utilizados dependern de la calidad y caracterizacin de las lneas
celulares y del proceso de produccin.
En el Apndice 2 y en la Tabla A-1 se incluyen ejemplos de virus modelo tiles con diferentes estructuras fsico-qumicas y
ejemplos de virus que se han utilizado en los estudios de depuracin viral.
Captulos
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2. Otras Consideraciones
Debern considerarse los siguientes puntos adicionales:
(a) Se aconseja usar virus que puedan multiplicarse hasta un ttulo alto, aunque esto no siempre es posible.
(b) Deber existir una prueba eficaz y confiable para la deteccin de cada virus utilizado, para cada etapa de fabricacin
sometida a prueba.
(c) Se debern considerar los riesgos planteados por determinados virus para la salud del personal que realiza los estudios de
depuracin viral.
B. Diseo e Implicaciones de la Evaluacin de la Depuracin Viral y de los Estudios de Caracterizacin
1. Instalaciones y Personal
Es inapropiado introducir cualquier tipo de virus en las instalaciones de produccin debido a las restricciones impuestas por
las buenas prcticas de fabricacin (BPF). Por consiguiente, los estudios de depuracin viral debern ser realizados en un laboratorio separado, equipado para el trabajo virolgico y por personal con experiencia en virologa conjuntamente con el personal de produccin que participa en el diseo y preparacin de una versin a menor escala del proceso de purificacin.
2. Sistema de Produccin a Menor Escala
Se deber demostrar la validez de la produccin a menor escala. El nivel de la purificacin de la versin a menor escala deber ser tan representativo del procedimiento de produccin como sea posible. Para el equipo cromatogrfico, se deber demostrar que la altura del lecho de la columna, la velocidad lineal de flujo, el cociente entre la velocidad de flujo y el volumen del
lecho de la columna (es decir, el tiempo de contacto), los tipos de gel y soluciones amortiguadoras, el pH, la temperatura y la
concentracin de protenas, sales y el producto son representativos de la fabricacin a escala comercial. Deber obtenerse un
perfil similar de elucin. Para otros procedimientos, se aplicarn consideraciones similares. Las desviaciones que no pueden evitarse debern considerarse con respecto a su influencia en los resultados.
3. Anlisis de la Eliminacin Viral Escalonada
Cuando se estn realizando estudios de depuracin viral, es aconsejable evaluar la contribucin a la eliminacin viral de ms
de una etapa de produccin. Los pasos que tienen probabilidad de eliminar virus debern evaluarse individualmente con respecto a su capacidad para eliminar e inactivar el virus y la definicin exacta de paso individual deber considerarse meticulosamente. Se deber tener suficiente virus en el material utilizado en cada paso que se desea probar para obtener una evaluacin
adecuada de la eficacia en cada paso. Por lo general, se debern agregar virus al material en proceso de cada paso que se
desea probar. En algunos casos, simplemente ser suficiente agregar un virus de ttulo alto a un material a granel no purificado
y evaluar su concentracin entre cada uno de los pasos. Cuando la eliminacin viral es el resultado de procedimientos de separacin, se recomienda investigar, si es apropiado y posible, la distribucin de la carga viral en las diferentes fracciones. Cuando
se usan agentes reguladores virucidas en varios pasos dentro del proceso de fabricacin, se pueden utilizar estrategias alternativas como por ejemplo la adicin en paralelo de cantidades conocidas en soluciones amortiguadoras menos virucidas como
parte de la evaluacin general de los procesos. Se deber determinar el ttulo viral antes y despus de cada paso de la prueba.
Las valoraciones cuantitativas de infectividad debern poseer una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas y realizarse con
suficientes repeticiones para asegurar una validez estadstica adecuada del resultado. Se podrn utilizar valoraciones cuantitativas no asociadas con infectividad si se justifica. Se debern incluir controles virales apropiados en todas las valoraciones de infectividad para asegurar la sensibilidad del mtodo. Adems, se debern considerar los datos del muestreo estadstico cuando
el virus tiene baja concentracin (Apndice 3).
4. Determinacin de la Eliminacin Fsica en Funcin de la Inactivacin
Se puede reducir la infectividad viral mediante la eliminacin o inactivacin del virus. Para cada etapa de produccin evaluada, se deber describir el posible mecanismo de prdida de infectividad viral estableciendo si se debe a inactivacin o eliminacin. Si mediante el proceso de produccin se logra una escasa depuracin de la infectividad y se considera que la depuracin
del virus es el factor ms importante para la seguridad del producto, se debern introducir pasos adicionales o especficos de
inactivacin o eliminacin. Puede ser necesario distinguir entre la eliminacin y la inactivacin para un paso en particular, por
ejemplo, cuando existe la posibilidad de que una solucin amortiguadora utilizada en ms de un paso de depuracin pueda
contribuir a la inactivacin en todos ellos; es decir, se deber distinguir entre la contribucin de la inactivacin por una solucin amortiguadora utilizada en varios pasos cromatogrficos y la eliminacin lograda en cada uno de estos pasos cromatogrficos.
5. Evaluacin de la Inactivacin
Para la evaluacin de la inactivacin viral, se deber agregar (spike) un virus infeccioso al material en crudo, no procesado o
al material intermedio y deber calcularse el factor de reduccin. Se debe reconocer que esa inactivacin viral no es una reaccin sencilla de primer orden, sino que generalmente es ms compleja, con una fase 1 rpida y una fase 2 lenta. Por lo
tanto, se deber planificar el estudio de tal manera que las muestras se tomen a diferentes tiempos y se deber elaborar una
curva de inactivacin. Se recomienda que los estudios para determinar la inactivacin incluyan al menos un punto de tiempo
menor al tiempo de exposicin mnima y que sea mayor que cero, adems del tiempo de exposicin mnimo. Los datos adicionales son particularmente importantes cuando el virus es un virus relevante que se sabe que es un agente patgeno humano
y se est diseando un proceso de inactivacin eficaz. Sin embargo, para los estudios de inactivacin en los cuales se usan
virus modelo no especficos o cuando se usan virus modelo especficos como sustitutos de partculas virales, tales como las
partculas intracitoplasmticas de CHO similares a retrovirus, se deber demostrar una depuracin reproducible en al menos
dos estudios independientes. Siempre que sea posible, se deber determinar la carga viral inicial a partir del virus que puede
detectarse en el material inicial con virus agregado. Si esto no fuera posible, la carga viral inicial puede calcularse a partir del
USP 38
Captulos
ttulo de la preparacin viral que se siembra. Cuando la inactivacin es demasiado rpida para graficar una curva de inactivacin con las condiciones del proceso, se debern realizar controles apropiados para demostrar que la infectividad realmente se
pierde mediante la inactivacin.
6. Funcin y Regeneracin de Columnas
Con el transcurso del tiempo y despus de un uso repetido, la capacidad de las columnas cromatogrficas y otros dispositivos utilizados en el sistema de purificacin para eliminar los virus puede variar. Algunas estimaciones de la estabilidad de la
depuracin viral despus de varios usos pueden servir de respaldo para el uso repetido de tales columnas. Se deber asegurar
que cualquier virus potencialmente retenido por el sistema de produccin puede ser adecuadamente destruido o eliminado
antes de la reutilizacin del sistema, por ejemplo demostrando que los procedimientos de limpieza y de regeneracin en realidad inactivan o eliminan el virus.
7. Precauciones Especficas
(a) Se debern tomar las precauciones necesarias al preparar el virus de ttulo alto para evitar la agregacin que puede aumentar la eliminacin fsica y disminuir la inactivacin y, de esta manera, distorsionar la correlacin con la produccin real.
(b) Se deber considerar la cantidad mnima de virus que puede analizarse de manera confiable.
(c) El estudio deber incluir valoraciones de control paralelas para evaluar la prdida de la infectividad del virus debido a
causas tales como dilucin, concentracin, filtracin o almacenamiento de las muestras antes de la titulacin.
(d) El virus agregado (spike) se deber adicionar al producto en un volumen pequeo para no diluir ni cambiar las caractersticas del mismo. La muestra de prueba de protena cuando se diluye ya no es idntica al producto obtenido a escala comercial.
(e) Las diferencias pequeas, como por ejemplo en las soluciones amortiguadoras, el medio, o los reactivos, pueden afectar
sustancialmente la depuracin viral.
(f) La inactivacin viral es una funcin dependiente del tiempo y, por consiguiente, el tiempo durante el cual el producto
con virus agregado permanezca en una solucin amortiguadora especfica o en una columna cromatogrfica especfica deber
reflejar las condiciones del proceso a escala comercial.
(g) Las soluciones amortiguadoras y el producto debern evaluarse independientemente con respecto a la toxicidad o la interferencia en las valoraciones usadas para determinar la valoracin viral, ya que estos componentes pueden afectar negativamente a las clulas indicadoras. Si las soluciones son txicas para las clulas indicadoras, quiz sea necesaria la dilucin, el ajuste del pH o la dilisis de la solucin amortiguadora que contiene el virus agregado. Si el producto en s mismo tiene actividad
antiviral, es posible que se deba realizar el estudio de depuracin sin el producto en una corrida simulada, aunque la omisin
del producto o el uso de una protena similar que no tiene actividad antiviral en su lugar podra afectar el comportamiento del
virus en algunas de las etapas de la produccin. Se debern incluir suficientes controles para demostrar el efecto de los procedimientos utilizados nicamente para preparar la muestra para la valoracin (por ejemplo: dilisis, almacenamiento) en la eliminacin o inactivacin del virus agregado en cantidades conocidas.
(h) Muchos esquemas de purificacin usan repetitivamente las mismas soluciones amortiguadoras o columnas similares. Se
debern considerar los efectos de este enfoque cuando se analicen los datos. La eficacia de la eliminacin viral mediante un
proceso especfico puede variar en las distintas etapas de fabricacin en las cuales se usa.
(i) Los factores generales de reduccin pueden subestimarse cuando las condiciones de produccin o las soluciones amortiguadoras son demasiado citotxicas o virucidas y cada caso deber tratarse individualmente. Tambin se pueden sobreestimar
los factores generales de reduccin debido a las limitaciones inherentes o al diseo inadecuado de los estudios de depuracin
viral.
C. Interpretacin de los Estudios de Depuracin Viral; Aceptabilidad
El objetivo de la evaluacin de la inactivacin o eliminacin viral es evaluar y caracterizar los pasos del proceso que pueden
considerarse eficaces para inactivar o eliminar los virus, y estimar cuantitativamente el nivel general de la reduccin viral obtenida mediante el proceso de fabricacin. En el caso de los contaminantes vricos, como por ejemplo en los Casos B a E, es
importante demostrar que el virus no solamente ha sido eliminado o inactivado, sino que adems existe una capacidad en
exceso de depuracin viral en el proceso de purificacin para garantizar un nivel apropiado de seguridad para el producto final. La cantidad de virus eliminado o inactivado por el proceso de produccin deber compararse con la cantidad de virus que
puede estar presente en el material a granel no procesado.
Para realizar esta comparacin, es importante calcular la cantidad de virus en el material a granel no procesado. Este clculo
estimado deber obtenerse utilizando valoraciones de infectividad u otros mtodos como por ejemplo la microscopa electrnica de transmisin (TEM, por sus siglas en ingls). Todo el proceso de purificacin deber ser capaz de eliminar sustancialmente una cantidad de virus mayor de la que se estima que hay presente en el equivalente de una dosis nica de material a
granel no procesado. Ver el Apndice 4 para el clculo de los factores de reduccin viral y el Apndice 5 para el clculo de partculas estimadas por dosis.
Los fabricantes deben reconocer que los mecanismos de depuracin pueden diferir entre las distintas clases de virus. Se deber tomar en consideracin una serie de factores cuando se evalen los datos que avalan la eficacia de los procedimientos de
inactivacin o eliminacin de virus. Estos incluyen:
(i) La conveniencia de los virus de prueba utilizados;
(ii) El diseo de los estudios de depuracin;
(iii) La reduccin logartmica lograda;
(iv) La dependencia del tiempo de inactivacin;
Captulos
USP 38
(v) Los efectos potenciales de la variacin en los parmetros del proceso sobre la inactivacin o eliminacin viral;
(vi) Los lmites de las sensibilidades de la valoracin;
(vii) La posible selectividad de los procedimientos de inactivacin o eliminacin para ciertas clases de virus.
Se puede lograr la depuracin eficaz mediante cualquiera de los siguientes procedimientos: varios pasos de inactivacin, varios pasos de separacin complementarios o combinaciones de pasos de inactivacin y separacin. Ya que los mtodos de separacin pueden depender de las propiedades fsico-qumicas sumamente especficas de un virus, lo cual influye en su interaccin con las matrices de gel y las propiedades de precipitacin, los virus modelo pueden separarse de una manera diferente
a la de un virus objetivo. Los parmetros de fabricacin que influyen en la separacin debern definirse y controlarse adecuadamente. Las diferencias pueden originarse en cambios de la superficie, como por ejemplo en la glicosilacin. Sin embargo, a
pesar de estas variables potenciales, se puede obtener la eliminacin eficaz mediante la combinacin de pasos de separacin
complementarios o combinaciones de pasos de inactivacin y de separacin. Por lo tanto, los pasos de separacin bien diseados, tales como los procedimientos cromatogrficos, los pasos de filtracin y las extracciones, pueden ser pasos eficaces de
eliminacin viral siempre que se realicen bajo condiciones debidamente controladas. Un paso eficaz de eliminacin viral deber producir una reduccin reproducible de la carga viral en por lo menos dos estudios independientes.
Un factor de reduccin general se expresa normalmente como la suma de los factores individuales. Sin embargo, una reduccin de ttulo viral del orden de 1 log10 o menos se considerara inapreciable, y podra descartarse a menos que se justifique.
Si se logra una escasa reduccin de la infectividad mediante el proceso de produccin, y la eliminacin del virus es el factor
ms importante para la seguridad del producto, se deber introducir uno o ms pasos especficos adicionales de inactivacin o
eliminacin. Los fabricantes debern justificar la aceptabilidad de los factores de reduccin obtenidos para todos los virus. Los
resultados debern evaluarse sobre la base de los factores ya enumerados.
D. Lmites de los Estudios de Depuracin Viral
Los estudios de depuracin viral son tiles para ayudar a garantizar el logro de un nivel de seguridad aceptable en el producto final, pero por s solos no determinan que el producto es seguro. Sin embargo, existen varios factores en el diseo y la ejecucin de los estudios de depuracin viral que pueden conducir a una estimacin incorrecta de la capacidad del proceso para
eliminar la infectividad viral. Estos factores incluyen los siguientes:
1. Las preparaciones virales utilizadas en los estudios de depuracin para un proceso de produccin probablemente se producen en un cultivo tisular. El comportamiento de un virus de cultivo tisular en una etapa de produccin puede ser diferente al
del virus natural, por ejemplo, si los virus naturales y cultivados difieren en la pureza o en el grado de agregacin.
2. A menudo la inactivacin de la infectividad viral sigue una curva bifsica en la cual una fase inicial rpida est seguida de
una fase ms lenta. Es posible que el virus que escapa al primer paso de inactivacin sea ms resistente a los pasos posteriores.
Por ejemplo, si la fraccin resistente toma la forma de agregados virales, la infectividad puede ser resistente a una variedad de
diferentes tratamientos qumicos y al calentamiento.
3. La capacidad del proceso general de eliminar la infectividad se expresa como la suma del logaritmo de las reducciones en
cada paso. La sumatoria de los factores de reduccin de varios pasos, en particular de los pasos con poca reduccin (por ejemplo, por debajo de 1 log10), puede sobreestimar el potencial real de la eliminacin viral. An ms, los valores de reduccin
logrados mediante la repeticin de procedimientos idnticos o casi idnticos no se debern incluir a menos que se justifique.
4. La expresin de los factores de reduccin como reducciones logartmicas de la valoracin implica que, aunque la infectividad viral residual puede reducirse considerablemente, nunca se reducir a cero. Por ejemplo, una reduccin de la infectividad
de una preparacin que contenga 8 log10 unidades infecciosas por mililitro (mL) por un factor de 8 log10 da cero log10 por mL
o una unidad infecciosa por mL, considerando el lmite de la deteccin de la valoracin.
5. El procesamiento a escala de planta piloto puede ser diferente del procesamiento a escala comercial a pesar del cuidado
tomado en el diseo del proceso a menor escala.
6. La suma de factores individuales de reduccin viral que son resultado de mecanismos similares de inactivacin a lo largo
del proceso de fabricacin puede sobreestimar la depuracin viral general.
E. Estadstica
Los estudios de depuracin viral debern incluir el uso del anlisis estadstico de los datos para evaluar los resultados. Los
resultados del estudio debern ser estadsticamente vlidos para avalar las conclusiones (ver Apndice 3).
F. Reevaluacin de la Depuracin Viral
Cuando se hacen cambios significativos en la produccin o en el proceso de purificacin, se deber considerar el efecto de
ese cambio en la depuracin viral, tanto directo como indirecto y deber volver a evaluarse el sistema segn cada caso. Por
ejemplo, los cambios en los procesos de produccin pueden causar cambios significativos en la cantidad de virus producida
por la lnea celular; los cambios en los pasos del proceso pueden cambiar el grado de depuracin de los virus.
VII. RESUMEN
Este documento sugiere enfoques para la evaluacin del riesgo de contaminacin viral y para la eliminacin del virus del
producto, y de este modo contribuye a la produccin de productos biotecnolgicos seguros derivados de lneas celulares de
origen animal o humano, y enfatiza el valor de muchas estrategias, que incluyen:
A. La caracterizacin o examen minucioso del sustrato celular usado como material inicial para identificar los contaminantes
virales presentes, si los hubiera;
B. La evaluacin del riesgo mediante la determinacin del tropismo en seres humanos de los contaminantes;
USP 38
C. La creacin de un programa apropiado de pruebas para detectar virus adventicios en material a granel no procesado;
D. El diseo cuidadoso de los estudios de depuracin viral que utilizan diferentes mtodos de inactivacin o eliminacin viral
en el mismo proceso de produccin para lograr la mxima depuracin viral; y
E. Estudios de rendimiento que evalan la inactivacin y la eliminacin viral.
GLOSARIO
APNDICE 1
Productos Derivados de Bancos de Clulas Caracterizadas que Posteriormente Se Multiplicaron In Vivo
Para productos elaborados a partir de fluidos extrados de animales inoculados con clulas de bancos caracterizados, se deber proporcionar informacin adicional referente a los animales.
Siempre que sea posible, los animales que se utilicen en la fabricacin de productos biotecnolgicos y/o biolgicos se debern obtener a partir de colonias bien definidas y libres de agentes patgenos especficos. Se debern realizar pruebas adecuadas para detectar los virus correspondientes, como por ejemplo los que se enumeran en la Tabla 3. Se debern describir procedimientos de cuarentena para animales recin llegados y enfermos y se debern proporcionar medidas que aseguren que todos los mtodos de confinamiento, limpieza y descontaminacin utilizados dentro de las instalaciones son adecuados para
Captulos
Banco de Clulas de Trabajo (BCT). El BCT est preparado a partir de alcuotas de una suspensin homognea de clulas obtenidas cultivando el BCM bajo condiciones definidas de cultivo.
Banco de Clulas Maestras (BCM). Es una alcuota de una fuente nica de clulas, generalmente preparada a partir de un clon
de clulas seleccionado bajo condiciones definidas, dispensada en envases mltiples y almacenada bajo condiciones definidas.
El Banco de Clulas Maestras se emplea para proporcionar por derivacin todos los bancos de clulas de trabajo. Las pruebas
que se realicen sobre un nuevo BCM (a partir de un clon de clulas inicial previo, BCM o BCT) debern ser las mismas que las
realizadas sobre el BCM, a menos que se justifique otra cosa.
Caracterizacin del Proceso de Depuracin Viral. Estudios de depuracin viral en los cuales se utilizan virus modelo no especficos para evaluar la robustez del proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar virus.
Clulas de Produccin. Las clulas sustrato utilizadas para fabricar el producto.
Depuracin Viral. La eliminacin del virus designado mediante la eliminacin de partculas virales o la inactivacin de la infectividad viral.
Edad Celular in Vitro. Es la medida del transcurso del tiempo entre el descongelamiento del vial o viales del BCM y la cosecha
del recipiente de produccin, calculado ya sea mediante el tiempo cronolgico transcurrido en cultivo, por el nivel de duplicacin de la poblacin de clulas o por el nivel de pasaje de las clulas cuando estn subcultivadas por un procedimiento definido para la dilucin del cultivo.
Eliminacin de Virus. La separacin fsica de partculas de virus del producto previsto.
Estudios de Evaluacin del Proceso de Depuracin Viral. Estudios de depuracin viral en los cuales se utilizan virus relevantes
y/o modelo especficos para determinar la capacidad del proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar virus.
Inactivacin. Reduccin de la infectividad del virus causada por una modificacin qumica o fsica.
Material a Granel sin Procesar. Una o varias extracciones combinadas de clulas y medios de cultivo. Cuando las clulas no
son fcilmente accesibles, el material a granel sin procesar sera el lquido extrado del fermentador.
Partculas Similares a Virus. Las estructuras visibles por microscopa electrnica que aparentan ser, desde un punto de vista
morfolgico, parecidas a virus conocidos.
Perodo Mnimo de Exposicin. El perodo ms corto durante el cual se mantendr una fase de tratamiento.
Sustrato Celular. Clulas utilizadas para la fabricacin del producto.
Virus. Agentes infecciosos que se replican intracelularmente y que son potencialmente patgenos, poseen un nico tipo de
cido nuclico [ya sea cido ribonuclico (ARN) o ADN], no pueden crecer ni dividirse por fisin binaria y se multiplican en la
forma de su material gentico.
Virus Adventicio. Un virus contaminante introducido accidentalmente. (Ver tambin Virus.)
Virus Endgeno. Una entidad viral cuyo genoma es parte de la lnea germinal de la especie de origen de la lnea celular y que
est integrada de manera covalente dentro del genoma del animal del cual se deriv la lnea celular madre. A los efectos de
este documento, estn incluidos en esta categora los virus no integrados introducidos intencionalmente tales como el virus de
la encefalitis bovina (EBV), utilizado para inmortalizar clulas sustrato o el Virus de Papiloma Bovino. (Ver tambin Virus.)
Virus Modelo Especfico. Un virus estrechamente relacionado con el virus conocido o sospechado (del mismo gnero o familia)
y que tiene propiedades fsicas y qumicas similares a aquellas del virus observado o sospechado.
Virus Modelo No Especfico. Un virus utilizado para la caracterizacin del proceso de depuracin viral cuando el objetivo es
caracterizar la capacidad del proceso de fabricacin para eliminar y/o inactivar los virus en general, por ejemplo, para caracterizar la robutez del proceso de purificacin.
Virus No Endgeno. Virus de fuentes externas presentes en el BCM. (Ver tambin Virus.)
Virus Relevante. Los virus utilizados en estudios de evaluacin de procesos, que son o bien el virus identificado o un virus de
la misma especie que el virus conocido, o un contaminante probable del sustrato celular o de cualquier otro reactivo o material
utilizado en el proceso de produccin.
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contener la propagacin de agentes adventicios; esto puede lograrse mediante la aplicacin de un programa de vigilancia.
Tambin se deber incluir una lista de agentes para los cuales se realizan pruebas. Los servicios de soporte veterinario debern
estar disponibles en el sitio o estar en un lugar de fcil acceso. Se deber describir hasta qu grado el bioterio est aislado de
otras reas de la planta de fabricacin. Las prcticas del personal debern ser las adecuadas para garantizar la seguridad.
Se debern describir detalladamente los procedimientos para el mantenimiento de los animales, incluyendo la dieta, los horarios de limpieza y alimentacin, la provisin de un servicio de atencin veterinaria peridica, si correspondiera, y detalles de
manipulacin especial que los animales puedan requerir una vez inoculados. Se deber incluir una descripcin del rgimen de
preparacin de los animales, la preparacin del inculo, el sitio y la va de inoculacin.
El primer material recolectado de los animales puede considerarse como una etapa equivalente a la de recoleccin de material a granel sin procesar de un bioreactor. Por lo tanto, se debern aplicar todas las consideraciones de prueba detalladas previamente en la seccin IV de este documento. Adems, el fabricante deber evaluar la biocarga del material a granel sin procesar, determinar si el material est libre de micoplasma y realizar un anlisis especfico de la especie, adems de una prueba in
vivo en ratones adultos y en ratones lactantes.
Captulos
APNDICE 2
Seleccin de Virus para Estudios de Depuracin Viral
A. Ejemplos de Virus Modelo tiles:
1. Virus modelo no especficos que representan una amplia gama de estructuras fsico-qumicas:
SV40 (Polyomavirus maccacae 1), poliovirus humano 1 (Sabn), parvovirus animal o algn otro virus pequeo no encapsulado;
virus de parainfluenza o virus de influenza, virus Sindbis o algn otro virus ARN de tamao mediano a grande encapsulado;
herpesvirus (por ejemplo, HSV-1 o virus de la pseudo-rabia) u otros virus ADN de tamao mediano a grande.
Estos virus se ofrecen slo a modo de ejemplo y su uso no es obligatorio.
2. Para clulas sustrato de roedores es comn que se empleen retrovirus murinos como virus modelo especficos.
B. Ejemplos de Virus Utilizados en Estudios de Depuracin Viral
En la Tabla A-1 se enumeran varios virus que se han empleado en estudios de depuracin viral. Sin embargo, ya que stos son
solamente ejemplos, el uso de cualquiera de los virus de la tabla no se considera obligatorio y se invita a los fabricantes a que
consideren otros virus, especialmente los que puedan ser ms apropiados para sus procesos de produccin individual. En general, deber evaluarse el proceso con respecto a la capacidad de eliminar al menos tres virus diferentes con distintas caractersticas.
APNDICE 3
A. Consideraciones Estadsticas para la Evaluacin de Valoraciones Virales
Las valoraciones virales sufren los problemas de variacin comunes a todos los sistemas de valoracin biolgica. Deber realizarse una evaluacin de la exactitud de las valoraciones virales y los factores de reduccin derivados de stas y de la validez de
las valoraciones para determinar la confiabilidad de un estudio. El objetivo de la evaluacin estadstica es establecer que el estudio se ha llevado a cabo a un nivel aceptable de competencia virolgica.
1. Los mtodos de valoracin pueden ser cuantales o cuantitativos. Los mtodos cuantales incluyen valoraciones de infeccin en animales o en dosis infectiva en cultivo tisular (TCID), en las cuales el animal o el cultivo de clulas se califica como
infectado o como no infectado. Los ttulos de infectividad son medidos por la proporcin de animales o cultivos infectados. En
los mtodos cuantitativos, la infectividad medida vara continuamente con la entrada de virus. Los mtodos cuantitativos incluyen valoraciones de placa donde cada placa contada corresponde a una sola unidad infecciosa. Tanto las valoraciones cuantales como las cuantitativas son susceptibles de evaluacin estadstica.
2. Puede haber variacin en una valoracin como resultado de errores de dilucin, efectos estadsticos y diferencias en el
sistema de valoracin que son desconocidas o difciles de controlar. Probablemente estos efectos sean mayores cuando se
comparan diferentes ciclos de valoracin (variacin entre valoraciones) que cuando se comparan los resultados dentro de un
solo ciclo de valoracin (variacin intra-valoracin).
3. Los lmites de confianza del 95 por ciento para los resultados de variacin intra-valoracin debern estar normalmente en
el orden de 0,5 log10 de la media. La variacin intra-valoracin puede evaluarse con mtodos estadsticos estndar. La variacin entre valoraciones puede controlarse mediante la inclusin de una preparacin de referencia, cuya estimacin de potencia
deber estar dentro de aproximadamente 0,5 log10 de la estimacin de la media establecida en el laboratorio para el valor
aceptado de la valoracin. Las valoraciones con menor precisin pueden considerarse aceptables con una justificacin apropiada.
4. Los lmites de confianza del 95 por ciento para el factor de reduccin observado debern calcularse, siempre que sea posible, con estudios de depuracin de virus relevantes y modelo especficos. Si los lmites de confianza del 95 por ciento para
las valoraciones virales del material inicial son +s y para las valoraciones virales del material despus del paso son +a, los lmites
de confianza del 95 por ciento para el factor de reduccin son:
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B. Probabilidad de Deteccin de Virus en Concentraciones Bajas

A concentraciones virales bajas (por ejemplo, dentro del intervalo de 10 a 1000 partculas infecciosas por L) es evidente que
una muestra de unos pocos mililitros puede o no contener partculas infecciosas. La probabilidad, p, de que esta muestra no
contenga virus infecciosos es:
p = ((V-v)/V)n
en donde V (L) es el volumen total del material a analizar, v (L) es el volumen de la muestra y n es el nmero absoluto de
partculas infecciosas estadsticamente distribuidas en V.
Si V >> v, se puede realizar una aproximacin a esta ecuacin mediante la distribucin de Poisson:
p = ecv
en la cual c es la concentracin de partculas infecciosas por L.
o, c = ln p/v
Como ejemplo, si se analiza una prueba con un volumen de 1 mL, las probabilidades p a concentraciones virales que varan
desde 10 hasta 1000 partculas infecciosas por L son:
c
10
10
1000
0,99
0,90
0,37
APNDICE 4
Clculo de Factores de Reduccin en Estudios para Determinar la Depuracin Viral
El factor de reduccin viral de un paso de purificacin o inactivacin individual se define como el log10 del cociente de la
carga viral en el material antes de la purificacin y la carga viral en el material una vez purificado cuando est listo para ser
empleado en el prximo paso del proceso. Si se utilizan las siguientes abreviaturas:
Material inicial: volumen v; concentracin 10a;
carga viral: (v)(10a),
Material final: volumen v; ttulo 10a;
carga viral: (v)(10a),
los factores de reduccin individual Ri se calculan segn:
10Ri = (v)(10a) / (v)(10a)
Esta frmula considera las concentraciones y los volmenes de los materiales antes y despus del paso de purificacin.
Debido a la imprecisin inherente de algunas valoraciones virales, un factor de reduccin individual empleado para el clculo de un factor de reduccin general deber ser mayor de 1.
El factor de reduccin total para un proceso de produccin completo es el logaritmo de la suma de los factores de reduccin
de los pasos individuales. Esto representa el logaritmo del cociente entre la carga viral al comienzo del primer paso del proceso
de depuracin y al final del ltimo paso del proceso de depuracin. Los factores de reduccin se expresan normalmente en
una escala logartmica lo cual implica que, mientras que la contaminacin viral residual nunca se reducir a cero, puede reducirse considerablemente en forma matemtica.
APNDICE 5
Clculo de Partculas Estimadas por Dosis
Esto se aplica a aquellos virus para los cuales puede hacerse una estimacin de una cifra inicial, como por ejemplo los retrovirus endgenos.
Ejemplo:
I. Suposiciones
Concentracin estimada o medida de virus en el cultivo celular recolectado: = 106/mL
Factor de depuracin viral calculado = > 1015
Volumen de cultivo recolectado necesario para hacer una dosis del producto = 1 L (l03 mL)
II. Clculo de Partculas/Dosis Estimadas
Captulos
Esto indica que para una concentracin de 1000 virus por L, en un 37 por ciento de las muestras, 1 mL no contendr una partcula viral.
Si solamente se prueba el virus en una porcin de una muestra y la prueba es negativa, se deber calcular la cantidad de
virus que tendra que haber presente en la muestra total para lograr un resultado positivo y este valor debera considerarse al
calcular un factor de reduccin. Es aconsejable que los lmites de confianza alcancen el 95 por ciento. Sin embargo, en algunos
casos, esto quizs no sea factible debido a las limitaciones de los materiales.
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Por lo tanto, se esperara menos de una partcula por milln de dosis.
Captulos
1051 LIMPIEZA DE MATERIAL DE VIDRIO

El xito de muchas valoraciones y pruebas Farmacopeicas depende de la limpieza del material de vidrio utilizado. Siempre
que resulte necesario, se deben usar reactivos inorgnicos o detergentes disponibles comercialmente.
En cualquier caso, es importante verificar que el procedimiento de limpieza sea apropiado para la prueba o valoracin particular que se est llevando a cabo. Esto se puede lograr de diversas maneras, incluyendo el uso de controles experimentales o
verificacin de la limpieza usando anlisis de residuos/residuales para asegurar la eliminacin de cualquier contaminante potencial. El protocolo de limpieza debe incluir una clusula en la que se describa la forma en que se evaluar el xito del procedimiento de limpieza.
Para las mediciones pticas, se debe prestar especial cuidado a la limpieza de los recipientes, pero no debe usarse cido crmico ni soluciones altamente alcalinas.
Las siguientes son algunas de las pruebas en las que el uso de material de vidrio limpio es particularmente crtico para el
xito de las mismas: pruebas para pirgenos y carbono orgnico total, as como valoraciones de heparina sdica y actividad de
vitamina B12.
El Apndice incluye referencias seleccionadas que pueden ser tiles para obtener informacin adicional sobre la limpieza de
material de vidrio. Dichas referencias no estn avaladas por la USP y no representan una lista exhaustiva. Se puede encontrar
informacin adicional sobre los procedimientos de limpieza de material de vidrio mencionados en este captulo en la mayora
de los textos sobre qumica analtica cuantitativa.
APNDICE
Es posible encontrar informacin adicional y pautas en las referencias citadas a continuacin y en una gran cantidad de textos sobre qumica analtica cuantitativa.
1. Parenteral Drug Association. DraftPoints to Consider for Cleaning Validation (Technical Report Number 29). Bethesda,
MD: Parenteral Drug Association; 1998.
2. Anderson NR. Container cleaning and sterilization. En: Olson WP, Groves MJ, eds. Aseptic Pharmaceutical Manufacturing.
1st ed. Buffalo Grove, IL: Interpharm Press; 1987:1522.
3. Green C. Cleaning validationapplication in the laboratory; Montalvo M. The cleaning validation policy and the cleaning
validation plan; Verghese G, Kaiser N. Cleaning agents and cleaning chemistry; Verghese G, Lopolito P. Cleaning engineering and equipment design. En: Pluta PL, ed. Cleaning and Cleaning Validation, Volume 1. Bethesda, MD: Parenteral
Drug Association; 2009.
4. Gordon AJ, Ford RA. Standard glassware cleaning solutions. En: Gordon AJ, Ford RA, eds. The Chemist's Companion. Hoboken, NJ: Wiley and Sons; 1973.
1052 ARTCULOS OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGAANLISIS DE

AMINOCIDOS
Este captulo proporciona guas y procedimientos utilizados para la caracterizacin de artculos obtenidos por biotecnologa
mediante anlisis de aminocidos. Se lo ha armonizado con los captulos correspondientes en la Farmacopea Japonesa (JP) y la
Farmacopea Europea (EP). Algunas partes de este captulo que no estn armonizadas con las otras dos farmacopeas estn marcadas con el smbolo . La nota al pi de pgina se encuentra en la USP, pero no as en la FE o FJ. Tambin se muestran otras
USP 38
pruebas de caracterizacin armonizadas en Electroforesis Capilar 1053, Artculos Obtenidos por BiotecnologaIsoelectroenfoque
1054, Artculos Obtenidos por BiotecnologaMapeo de Pptidos 1055, Artculos Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en
Gel de Poliacrilamida 1056 y Artculos Obtenidos por BiotecnologaValoracin de Protenas Totales 1057.
INTRODUCCIN
El anlisis de aminocidos se refiere a la metodologa usada para determinar la composicin o el contenido de aminocidos
de protenas, pptidos y otras preparaciones farmacuticas. Las protenas y los pptidos son macromolculas formadas por
aminocidos unidos covalentemente organizados como polmeros lineales. La secuencia de los aminocidos en una protena o
un pptido determina las propiedades de la molcula. Las protenas se consideran molculas grandes que existen comnmente como estructuras plegadas con una conformacin especfica, mientras que los pptidos son ms pequeos y pueden estar
formados por pocos aminocidos. El anlisis de aminocidos se puede usar para cuantificar protenas y pptidos, para determinar la identidad de protenas o pptidos basndose en su composicin de aminocidos, para respaldar el anlisis estructural de
protenas y pptidos, para evaluar estrategias de fragmentacin para el mapeo de pptidos y para detectar aminocidos atpicos presentes en una protena o un pptido. Antes del anlisis de aminocidos, es necesario hidrolizar una protena o pptido
descomponindolo en sus aminocidos constituyentes. Despus de la hidrlisis de la protena o el pptido, el procedimiento
de anlisis de aminocidos puede ser igual al utilizado para aminocidos libres en otras preparaciones farmacuticas. Los aminocidos constituyentes de la muestra de prueba normalmente se derivatizan para su anlisis.
APARATOS
PRECAUCIONES GENERALES
La contaminacin de fondo es siempre una preocupacin en el anlisis de aminocidos. Se requieren reactivos de alta pureza
(p.ej., el cido clorhdrico de baja pureza puede contribuir a la contaminacin con glicina). Los reactivos analticos se cambian
rutinariamente cada pocas semanas y se usan solamente disolventes para cromatografa de lquidos de alta presin (grado
HPLC). La posible contaminacin microbiana y los materiales extraos presentes en los disolventes se reducen por filtracin
antes de usarlos, cubriendo los recipientes y colocando el instrumental para anlisis de aminocidos alejado de la luz solar directa.
Las prcticas de laboratorio pueden determinar la calidad del anlisis de aminocidos. Colocar los instrumentos en una zona
de poco trnsito del laboratorio. Mantener limpio el laboratorio. Hay que limpiar y calibrar las pipetas segn un plan de mantenimiento. Mantener las puntas de las pipetas en una caja cubierta; los analistas no deben manipular las puntas de las pipetas
con las manos. Los analistas pueden usar guantes de ltex sin polvo o similares. Limitar la cantidad de veces que se abre y se
cierra un vial de muestra ya que el polvo puede hacer que aparezcan niveles elevados de glicina, serina y alanina.
Se necesitan instrumentos bien mantenidos para que los resultados de los anlisis de aminocidos sean aceptables. Si el instrumento se usa de modo rutinario, se debe revisar diariamente para detectar prdidas, verificar la estabilidad del detector y la
lmpara y la capacidad de la columna para mantener la resolucin de los aminocidos individuales. Limpiar o reemplazar, de
acuerdo a un plan de rutina, todos los filtros de los instrumentos y dems artculos de mantenimiento.
MATERIAL ESTNDAR DE REFERENCIA

Los estndares de aminocidos aptos para este tipo de anlisis estn disponibles comercialmente* y consisten generalmente
en una mezcla acuosa de aminocidos. Cuando se determina la composicin de aminocidos, los estndares de protenas o
pptidos se analizan junto con el material de prueba como un control para demostrar la integridad de todo el procedimiento.
Para este propsito, se ha usado seroalbmina bovina altamente purificada como estndar de protena.
* Se pueden obtener estndares adecuados de NIST (Gaithersburg, MD), Beckman Instruments (Fullerton, CA), Sigma Chemical (St. Louis, MO), Pierce (Rockford,
IL) o Agilent (Palo Alto, CA).
Captulos
Los mtodos usados para el anlisis de aminocidos por lo general se basan en una separacin cromatogrfica de los aminocidos presentes en la muestra de prueba. Las tcnicas actuales aprovechan la instrumentacin cromatogrfica automatizada diseada para las metodologas analticas. Un instrumento de anlisis de aminocidos tpico es un cromatgrafo de lquidos
de baja presin o de alta presin, capaz de generar gradientes de fase mvil que separan los aminocidos en una columna
cromatogrfica. El instrumento debe tener la capacidad de derivatizar los aminocidos despus de pasar por la columna, a menos que la muestra se analice con derivatizacin anterior a la columna. El detector generalmente es de luz UV-visible o de fluorescencia, segn el mtodo de derivatizacin usado. Se usa un dispositivo de registro (p.ej., un integrador) para transformar la
seal analgica del detector y para la cuantificacin. Es preferible que los instrumentos utilizados para el anlisis de aminocidos se destinen especficamente a esos fines.
USP 38
CALIBRACIN DE LOS INSTRUMENTOS

La calibracin del instrumental para anlisis de aminocidos por lo general involucra el anlisis de estndares de aminocidos, que son una mezcla de aminocidos de varias concentraciones, para determinar el factor de respuesta y el intervalo de
anlisis de cada aminocido. Se conoce la concentracin de cada aminocido en el estndar. En el procedimiento de calibracin, el analista diluye el estndar de aminocidos para obtener distintos niveles de concentracin de analito dentro del intervalo lineal esperado de la tcnica de anlisis de aminocidos. Luego, se analizan repetidamente las diversas concentraciones de
analito. Las reas de los picos obtenidos para cada aminocido se grafican en funcin de la concentracin conocida para cada
uno de los aminocidos en la dilucin estndar. Estos resultados permiten al analista determinar el intervalo de concentraciones de aminocidos donde el rea del pico de cada aminocido es una funcin aproximadamente lineal de su concentracin.
Es importante que el analista prepare las muestras para el anlisis de aminocidos de manera que estn dentro de los lmites
analticos (p.ej., intervalo de trabajo lineal) de la tcnica empleada a fin de obtener resultados exactos y repetibles.
Se analizan de cuatro a seis concentraciones del estndar de aminocidos para determinar un factor de respuesta para cada
aminocido. El factor de respuesta se calcula como el rea del pico o la altura del pico promedio por nmol de aminocido
presente en el estndar. Para calcular la concentracin de cada aminocido presente en la muestra de prueba se prepara y se
usa un registro de calibracin con el factor de respuesta de cada aminocido. En este clculo se divide el rea del pico de un
aminocido dado por su correspondiente factor de respuesta, y se obtienen as los nmol del aminocido. Para los anlisis de
rutina, basta una calibracin de un solo punto; sin embargo, el archivo de calibracin se actualiza frecuentemente y se prueba
por anlisis de controles analticos para asegurar su integridad.
Captulos
REPETIBILIDAD
Los resultados uniformes y de alta calidad de los anlisis de aminocidos de un laboratorio analtico exigen prestar atencin
a la repetibilidad de la valoracin. Durante el anlisis de la separacin cromatogrfica de los aminocidos o sus derivados, se
pueden observar numerosos picos en el cromatograma que corresponden a los aminocidos. El gran nmero de picos exige
un sistema de anlisis de aminocidos que los pueda identificar repetidamente basndose en el tiempo de retencin e integrar
las reas de los picos para la cuantificacin. Una evaluacin de repetibilidad tpica involucra la preparacin de una solucin de
aminocidos estndar y el anlisis de varias determinaciones repetidas (es decir, seis anlisis o ms) de la misma solucin estndar. Se determina la desviacin estndar relativa (RSD, por sus siglas en ingls) para el tiempo de retencin y el rea del pico
integrada de cada aminocido. La evaluacin de la repetibilidad se ampla incluyendo mltiples valoraciones realizadas durante
varios das por distintos analistas. Las mltiples valoraciones incluyen la preparacin de diluciones estndar a partir de materiales iniciales para determinar la variacin debida a la manipulacin de la muestra. A menudo, la composicin de aminocidos
de una protena estndar (p.ej., seroalbmina bovina) se analiza como parte de la evaluacin de repetibilidad. La evaluacin de
la variacin de determinaciones repetidas (es decir, la RSD) permite al laboratorio establecer lmites analticos para asegurar
que sus anlisis se encuentran bajo control. Es conveniente establecer los lmites de variacin mnimos practicables para asegurar los mejores resultados. Para disminuir la variabilidad del anlisis de aminocidos, conviene enfocarse en la preparacin de la
muestra, la elevada interferencia espectral de fondo debido a la calidad de los reactivos y/o a las prcticas del laboratorio, el
funcionamiento y mantenimiento de los instrumentos, el anlisis y la interpretacin de los datos y el desempeo y los hbitos
del analista. Todos los parmetros se investigan a fondo como parte del trabajo de validacin.
La obtencin de resultados exactos del anlisis de aminocidos exige muestras purificadas de protenas y pptidos. Los componentes de las soluciones amortiguadoras (p.ej., sales, urea, detergentes) pueden interferir con el anlisis de aminocidos y se
eliminan de la muestra antes del anlisis. Los mtodos que utilizan derivatizacin de aminocidos postcolumna generalmente
no se ven tan afectados por los componentes de la solucin amortiguadora como se observa en los mtodos de derivatizacin
precolumna. Es conveniente limitar el nmero de las manipulaciones de las muestras con el fin de reducir la posible contaminacin de fondo, para mejorar la recuperacin de analitos y para reducir el trabajo. Las tcnicas comunes empleadas para eliminar los componentes de las soluciones amortiguadoras del pH de las muestras de protenas incluyen: (1) inyectar la muestra
de protena en un sistema HPLC en fase reversa, extrayendo la protena con un disolvente voltil que contenga suficiente componente orgnico y secando la muestra en una centrfuga de vaco; (2) dilisis contra una solucin amortiguadora del pH voltil o agua; (3) ultrafiltracin centrfuga para el reemplazo de la solucin amortiguadora del pH por una solucin amortiguadora
del pH voltil o agua; (4) precipitar la protena de la solucin amortiguadora del pH usando un disolvente orgnico (p. ej.:
acetona); y (5) filtracin en gel.
ESTNDARES INTERNOS
Se recomienda usar un estndar interno para controlar las prdidas y variaciones fsicas y qumicas durante el anlisis de aminocidos. Antes de la hidrlisis, se puede agregar a la solucin de protena una cantidad de estndar interno conocida con
exactitud. La recuperacin del estndar interno indica la recuperacin general de los aminocidos de la solucin de protena.
USP 38
Sin embargo, los aminocidos libres no se comportan igual que los aminocidos unidos a protenas durante la hidrlisis ya que
sus velocidades de liberacin o destruccin son variables. Por lo tanto, el uso de un estndar interno para corregir las prdidas
durante la hidrlisis puede proporcionar resultados no confiables. Hay que tener en cuenta este punto cuando se interpretan
los resultados. Tambin se pueden agregar estndares internos a la mezcla de aminocidos despus de la hidrlisis para corregir por las diferencias en la aplicacin de las muestras y los cambios en la estabilidad del reactivo y las velocidades de flujo.
Idealmente, un estndar interno es un aminocido primario que no se encuentra naturalmente y que est disponible comercialmente a bajo precio. Tambin debe ser estable durante la hidrlisis, su factor de respuesta debe ser funcin lineal de su
concentracin y debe eluir con un tiempo de retencin nico, sin superponerse con otros aminocidos. Los estndares de aminocidos comnmente empleados incluyen la norleucina, la nitrotirosina y el cido a-aminobutrico.
HIDRLISIS DE PROTENAS
Mtodo 1
La hidrlisis cida usando cido clorhdrico que contenga fenol es el procedimiento ms comnmente usado para la hidrlisis de protenas o pptidos antes del anlisis de aminocidos. La adicin de fenol a la reaccin evita la halogenacin de la tirosina.
Solucin de Hidrlisis: cido clorhdrico 6 N que contenga entre 0,1% y 1,0% de fenol.
Captulos
La hidrlisis de muestras de protenas y pptidos es necesaria para el anlisis de aminocidos de estas molculas. El material
de vidrio usado para la hidrlisis debe estar muy limpio para evitar resultados errneos. Los polvos para guantes y las huellas
dactilares en los tubos de hidrlisis pueden causar contaminacin. Para limpiar los tubos de vidrio para hidrlisis, hay que hervir los tubos durante 1 hora en cido clorhdrico 1 N o sumergirlos en cido ntrico concentrado o en una mezcla de cido
clorhdrico concentrado y cido ntrico concentrado (1:1). Los tubos de hidrlisis limpios se enjuagan con agua de alta pureza,
seguido por un enjuague con metanol de grado HPLC, se secan de un da para el otro en una estufa y se almacenan cubiertos
hasta su uso. Alternativamente, el material de vidrio limpio se puede someter a pirlisis a 500 durante 4 horas para eliminar la
contaminacin de los tubos para hidrlisis. Tambin se puede usar material de laboratorio desechable adecuado.
La hidrlisis cida es el mtodo ms comn para hidrolizar una muestra de protena antes del anlisis de aminocidos. La
tcnica de hidrlisis cida puede aumentar la variabilidad del anlisis debido a la destruccin completa o parcial de varios aminocidos. El triptfano se destruye; la serina y la treonina se destruyen parcialmente; la metionina puede oxidarse; y la cistena
tpicamente se recupera como cistina (pero la recuperacin de la cistina suele ser mala debido a la destruccin o reduccin
parcial a cistena). La aplicacin de vaco adecuado (menos de 200 mm de mercurio o 26,7 Pa) o la introduccin de un gas
inerte (argn) en la cmara gaseosa superior del recipiente de reaccin puede reducir la destruccin oxidativa. En las uniones
peptdicas que involucran isoleucina y valina, las uniones amida de Ile-Ile, Val-Val, Ile-Val y Val-Ile se escinden parcialmente; y la
asparagina y la glutamina se desamidan, dando como resultado cido asprtico y cido glutmico, respectivamente. La prdida de triptfano, asparagina y glutamina durante una hidrlisis cida limita la cuantificacin a 17 aminocidos. Algunas de las
tcnicas de hidrlisis descritas se usan para tratar estos problemas. Algunas de las tcnicas de hidrlisis descritas (es decir, los
Mtodos 411) pueden modificar otros aminocidos. Por lo tanto, hay que considerar las ventajas de usar una tcnica de hidrlisis en comparacin con sus problemas; estas ventajas se analizan adecuadamente antes de emplear un mtodo que no sea
la hidrlisis cida.
A menudo se emplea un estudio en funcin del tiempo (es decir, un anlisis de aminocidos con tiempos de hidrlisis cida
de 24, 48 y 72 horas) para analizar la concentracin inicial de aminocidos que se destruyen parcialmente o que se escinden
lentamente. Al graficar la concentracin observada de aminocidos lbiles (es decir, serina y treonina) en funcin del tiempo
de hidrlisis, se puede extrapolar la lnea hasta su origen para determinar la concentracin inicial de estos aminocidos. Los
estudios de hidrlisis en funcin del tiempo tambin se usan con aminocidos que se escinden lentamente (p.ej., isoleucina y
valina). Durante el transcurso del tiempo de hidrlisis, el analista observa una meseta en estos residuos. El nivel de esta meseta
se considera la concentracin de residuo. Si el tiempo de hidrlisis es demasiado largo, la concentracin del residuo en la
muestra comienza a disminuir, indicando una destruccin por las condiciones de hidrlisis.
Una alternativa aceptable al estudio en funcin del tiempo es someter un estndar de calibracin de un aminocido a las
mismas condiciones de hidrlisis que la muestra de prueba. El aminocido libre puede no ser totalmente representativo de la
velocidad de destruccin de los aminocidos lbiles dentro de un pptido o una protena durante la hidrlisis. Esto es especialmente vlido para las uniones peptdicas que se escinden lentamente (p.ej., uniones Ile-Val). Sin embargo, esta tcnica permite
al analista dar cuenta de cierta destruccin de residuos. Se ha empleado la hidrlisis cida por microondas y sta es rpida,
pero exige equipo y precauciones especiales. Las condiciones ptimas para la hidrlisis por microondas se deben investigar
para cada muestra de protena o pptido. La tcnica de hidrlisis por microondas tpicamente toma slo unos minutos, pero
una desviacin de 1 minuto puede proporcionar resultados inadecuados (p.ej., hidrlisis incompleta o destruccin de aminocidos lbiles). Se ha empleado la protelisis completa usando una mezcla de proteasas pero puede ser complicada, exige controles adecuados y, por lo general, se puede aplicar ms a pptidos que a protenas. [NOTADurante los anlisis iniciales de
una protena desconocida, se realizan experimentos con diferentes tiempos de hidrlisis y condiciones de temperatura para
determinar las condiciones ptimas.]
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Procedimiento
Hidrlisis en Fase LquidaColocar la muestra de protena o pptido en un tubo para hidrlisis y secar. [NOTALa muestra se
seca para que el agua de la muestra no diluya el cido empleado para la hidrlisis.] Agregar 200 mL de la Solucin de Hidrlisis
por cada 500 mg de protena liofilizada. Congelar el tubo de la muestra en un bao de hielo seco y acetona y sellar a la llama
en vaco. Las muestras tpicamente se hidrolizan a 110 durante 24 horas al vaco o en una atmsfera inerte para evitar la oxidacin. Se investigan tiempos mayores de hidrlisis (p.ej., 48 y 72 horas) si existe la preocupacin de que la protena no est
totalmente hidrolizada.
Hidrlisis en Fase de Vaporste es uno de los procedimientos de hidrlisis cida ms comunes y se prefiere para el microanlisis cuando slo se dispone de pequeas cantidades de muestra. La contaminacin de la muestra por el reactivo cido tambin se minimiza usando la hidrlisis en fase de vapor. Colocar los viales que contengan las muestras secas en un recipiente
con una cantidad adecuada de la Solucin de Hidrlisis. La Solucin de Hidrlisis no entra en contacto con la muestra de prueba.
Aplicar una atmsfera inerte o vaco (menos de 200 mm de mercurio o 26,7 Pa) a la cmara gaseosa del recipiente y calentar
aproximadamente a 110 durante un tiempo de hidrlisis de 24 horas. El vapor cido hidroliza la muestra seca. Minimizar toda
condensacin del cido en los viales de la muestra. Despus de la hidrlisis, secar la muestra al vaco para eliminar el cido
residual.
Captulos
Mtodo 2
La oxidacin del triptfano durante la hidrlisis disminuye si se usa cido mercaptoetanosulfnico (MESA) como cido reductor.
Solucin de Hidrlisis: solucin de MESA 2,5 M.
Hidrlisis en Fase de VaporSecar aproximadamente de 1 a 100 mg de la protena o pptido en anlisis en un tubo de
hidrlisis. Colocar el tubo de hidrlisis en un tubo ms grande con aproximadamente 200 mL de la Solucin de Hidrlisis. Sellar
al vaco el tubo ms grande (aproximadamente a 50 mm de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar la Solucin de Hidrlisis. Calentar
el tubo de hidrlisis entre 170 y 185 durante aproximadamente 12,5 minutos. Despus de la hidrlisis, secar el tubo de hidrlisis al vaco durante 15 minutos para eliminar el cido residual.
Mtodo 3
La oxidacin del triptfano durante la hidrlisis se evita usando cido tiogliclico (TGA) como cido reductor.
Solucin de Hidrlisis: una solucin que contenga cido clorhdrico 7 M, 10% de cido trifluoroactico, 20% de cido
tiogliclico y 1% de fenol.
Hidrlisis en Fase de VaporSecar aproximadamente de 10 mg a 50 mg de la protena o pptido en anlisis en un tubo de
muestra. Colocar el tubo de muestra en un tubo ms grande con aproximadamente 200 mL de la Solucin de Hidrlisis. Sellar el
tubo ms grande al vaco (aproximadamente a 50 mm de mercurio o 6,7 Pa) para vaporizar el TGA. Calentar el tubo de muestra a 166 durante aproximadamente 15 a 30 minutos. Despus de la hidrlisis, secar el tubo de muestra al vaco durante 5
minutos para eliminar el cido residual. La recuperacin de triptfano por medio de este mtodo puede depender de la cantidad de muestra presente.
Mtodo 4
La oxidacin de la cistena-cistina y de la metionina se realiza con cido perfrmico antes de la hidrlisis de la protena.
Solucin de OxidacinPreparar cido perfrmico en el momento de anlisis mezclando cido frmico y perxido de hidrgeno al 30% (9:1) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
ProcedimientoDisolver la muestra de protena o pptido en 20 mL de cido frmico y calentar a 50 durante 5 minutos;
agregar luego 100 mL de la Solucin de Oxidacin. En esta reaccin, la cistena se convierte en cido cisteico y la metionina se
convierte en metionina sulfona. Dejar que la oxidacin contine durante de 10 a 30 minutos. Eliminar el reactivo en exceso de
la muestra en una centrfuga de vaco. Esta tcnica puede modificar los residuos de tirosina en presencia de haluros. Luego se
puede realizar una hidrlisis cida de la protena oxidada usando el Mtodo 1 o el Mtodo 2.
Mtodo 5
La oxidacin de cistena-cistina se logra durante la hidrlisis en fase lquida con azida de sodio.
Solucin de Hidrlisis: agregar azida de sodio a cido clorhdrico 6 N que contenga 0,2% de fenol, para obtener una
concentracin final de 0,2% (p/v). El fenol agregado evita la halogenacin de la tirosina.
Hidrlisis en Fase LquidaRealizar la hidrlisis de la protena o pptido aproximadamente a 110 durante 24 horas. Durante la hidrlisis, la cistena-cistina presente en la muestra se convierte en cido cisteico mediante la azida de sodio presente
en la Solucin de Hidrlisis. Esta tcnica permite una mejor recuperacin de tirosina que el Mtodo 4, pero no es cuantitativa
para la metionina. La metionina se convierte en una mezcla de la metionina original y sus dos productos de oxidacin, metionina sulfxido y metionina sulfona.
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Mtodo 6
La oxidacin de cistena-cistina se logra con dimetil sulfxido (DMSO).
Solucin de Hidrlisis: agregar DMSO a cido clorhdrico 6 N que contenga de 0,1% a 1,0% de fenol, para obtener una
concentracin final de 2% (v/v).
Hidrlisis en Fase de VaporRealizar la hidrlisis de la protena o pptido aproximadamente a 110 durante 24 horas.
Durante la hidrlisis, la cistena-cistina presente en la muestra se convierte en cido cisteico por el DMSO presente en la Solucin de Hidrlisis. Para reducir la variabilidad y compensar la destruccin parcial, se recomienda evaluar la recuperacin de cido cisteico de las hidrlisis oxidativas de protenas estndar que contengan de 1 a 8 moles de cistena. Los factores de respuesta del hidrolizado de protenas o pptidos por lo general son aproximadamente 30% menores que los de los estndares de
cido cisteico no hidrolizado. Como la histidina, la metionina, la tirosina y el triptfano tambin se modifican, con esta tcnica
no se obtiene un anlisis completo de la composicin.
Mtodo 7
Mtodo 8
La reduccin de cistena-cistina y la alquilacin se logran a travs de una reaccin de piridiletilacin en fase lquida.
Soluciones MadrePreparar y filtrar tres soluciones: clorhidrato de Tris 1 M (pH 8,5) que contenga edetato disdico 4 mM
(Solucin Madre 1), clorhidrato de guanidina 8 M (Solucin Madre 2) y 2-mercaptoetanol al 10% en agua (Solucin Madre 3).
Solucin ReductoraPreparar una mezcla de la Solucin Madre 2 y la Solucin Madre 1 (3:1) para obtener una solucin
amortiguada de clorhidrato de guanidina 6 M en clorhidrato de Tris 0,25 M.
ProcedimientoDisolver aproximadamente 10 mg de la muestra de prueba en 50 mL de la Solucin Reductora y agregar
aproximadamente 2,5 mL de la Solucin Madre 3. Almacenar bajo nitrgeno o argn durante 2 horas a temperatura ambiente
en un lugar oscuro. Para lograr la reaccin de piridiletilacin, agregar aproximadamente 2 mL de 4-vinilpiridina a la solucin de
protena, e incubar durante 2 horas adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. La protena o pptido se desaliniza por recoleccin de la fraccin de protena o pptido luego de una separacin por HPLC en fase reversa. La muestra recolectada se puede secar en una centrfuga de vaco antes de la hidrlisis cida.
Mtodo 9
La reduccin de cistena-cistina y la alquilacin se logran a travs de una reaccin de carboximetilacin en fase lquida.
Soluciones MadrePreparar segn se indica en el Mtodo 8.
Solucin de CarboximetilacinPreparar una solucin que contenga 100 mg de yodoacetamida por mL de alcohol.
Solucin AmortiguadoraUsar la Solucin Reductora, preparada segn se indica en el Mtodo 8.
ProcedimientoDisolver la muestra de prueba en 50 mL de la Solucin Amortiguadora y agregar aproximadamente 2,5 mL
de la Solucin Madre 3. Almacenar bajo nitrgeno o argn durante 2 horas a temperatura ambiente en un lugar oscuro. Agregar la Solucin de Carboximetilacin en una relacin de 1,5 veces el contenido terico total de tioles, e incubar durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente en un lugar oscuro. [NOTASi el contenido de tioles de la protena se desconoce,
agregar 5 mL de yodoacetamida 100 mM por cada 20 nmol de protena presente.] La reaccin se detiene agregando un exceso
de 2-mercaptoetanol. La protena o pptido se desaliniza por recoleccin de la fraccin de protena o pptido luego de una
separacin por HPLC en fase reversa. La muestra recolectada se puede secar en una centrfuga de vaco antes de la hidrlisis
cida. La S-carboxiamidometilcistena formada se convierte en S-carboximetilcistena durante la hidrlisis cida.
Captulos
La reduccin y la alquilacin de cistena-cistina se logra a travs de una reaccin de piridiletilacin en fase de vapor.
Solucin ReductoraTransferir 83,3 mL de piridina, 16,7 mL de 4-vinilpiridina, 16,7 mL de tributilfosfina y 83,3 mL de agua a
un recipiente adecuado y mezclar.
ProcedimientoAgregar la protena o pptido (entre 1 y 100 mg) a un tubo de hidrlisis y colocar en un tubo ms grande.
Transferir la Solucin Reductora al tubo ms grande, sellar al vaco (aproximadamente a 50 mm de mercurio o 6,7 Pa), e incubar
aproximadamente a 100 durante 5 minutos. Luego, retirar el tubo de hidrlisis interior y secarlo en un desecador de vaco
durante 15 minutos para eliminar los reactivos residuales. Despus, se puede realizar una hidrlisis cida de la protena o pptido piridiletilados usando los procedimientos descritos previamente. La reaccin de piridiletilacin se realiza simultneamente
con una muestra de un estndar de protena que contenga de 1 a 8 moles de cistena, para mejorar la exactitud de la recuperacin de piridiletil-cistena. Mayores tiempos de incubacin en la reaccin de piridiletilacin pueden modificar el grupo a-amino terminal y el grupo e-amino de la lisina en la protena.
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Mtodo 10
La cistena-cistina se hace reaccionar con el cido ditiodigliclico o el cido ditiodipropinico para producir un disulfuro mixto. [NOTALa eleccin del cido ditiodigliclico o del cido ditiodipropinico depende de la resolucin requerida por el mtodo de anlisis de aminocidos.]
Solucin Reductora: una solucin que contenga 10 mg de cido ditiodigliclico (o cido ditiodipropinico) por mL de
hidrxido de sodio 0,2 M.
ProcedimientoTransferir aproximadamente 20 mg de la muestra de prueba a un tubo de hidrlisis y agregar 5 mL de la
Solucin Reductora. Agregar 10 mL de alcohol isoproplico y luego eliminar todo el lquido de la muestra mediante centrifugacin al vaco. Luego, hidrolizar la muestra usando el Mtodo 1. La ventaja de este mtodo es que no se derivatizan otros residuos aminoacdicos por reacciones secundarias y no es necesario desalinizar la muestra antes de la hidrlisis.
Captulos
Mtodo 11
La asparagina y la glutamina se convierten en cido asprtico y cido glutmico, respectivamente, durante la hidrlisis cida.
Los residuos de asparagina y cido asprtico se suman y se representan con Asx, y los residuos de glutamina y cido glutmico
se suman y se representan con Glx. Las protenas o pptidos pueden hacerse reaccionar con bis(1,1-trifluoroacetoxi)yodobenceno (BTI) para convertir los residuos de asparagina y glutamina en residuos de cido diaminopropinico y cido diaminobutrico, respectivamente, en la hidrlisis cida. Estas conversiones permiten al analista determinar el contenido de asparagina y
glutamina de una protena o pptido en presencia de residuos de cido asprtico y cido glutmico.
Soluciones ReductorasPreparar y filtrar tres soluciones: una solucin de cido trifluoroactico 10 mM (Solucin 1), una
solucin de clorhidrato de guanidina 5 M y cido trifluoroactico 10 mM (Solucin 2) y una solucin recin preparada de dimetilformamida que contenga 36 mg de BTI por mL (Solucin 3).
ProcedimientoA un tubo de hidrlisis limpio, transferir aproximadamente 200 mg de la muestra de prueba y agregar
2 mL de la Solucin 1 o la Solucin 2 y 2 mL de la Solucin 3. Sellar el tubo de hidrlisis al vaco. Calentar la muestra a 60
durante 4 horas en un lugar oscuro. Luego, dializar la muestra con agua para eliminar el exceso de reactivos. Extraer la muestra dializada tres veces con volmenes iguales de acetato de n-butilo y luego liofilizar. Despus, se puede realizar la hidrlisis
cida de la protena usando los procedimientos descritos previamente. Los residuos de cido a-,b -diaminopropinico y cido
a-, g-diaminobutrico tpicamente no se resuelven de los residuos de lisina en la cromatografa de intercambio inico basada en
el anlisis de aminocidos. Por lo tanto, cuando se usa el intercambio inico para separar los aminocidos, el contenido de
asparagina y glutamina es la diferencia cuantitativa entre el cido asprtico y cido glutmico determinados por hidrlisis cida
sin derivatizar y el contenido que se obtiene por derivatizacin con BTI. [NOTAEl contenido determinado para treonina, metionina, cistena, tirosina e histidina puede cambiar por la derivatizacin con BTI; se debe realizar una hidrlisis sin BTI si el
analista est interesado en la composicin de estos otros residuos de aminocidos.]
PRINCIPIOS GENERALES DE LAS METODOLOGAS DE ANLISIS DE AMINOCIDOS

Existen muchas tcnicas de anlisis de aminocidos y la eleccin de una de estas tcnicas a menudo depende de la sensibilidad que requiera la valoracin. En general, aproximadamente la mitad de las tcnicas de anlisis de aminocidos empleadas se
basan en la separacin de los aminocidos libres mediante cromatografa de intercambio inico seguida por derivatizacin
postcolumna (p.ej., con ninhidrina u o-ftalaldehdo). Las tcnicas de deteccin postcolumna se pueden utilizar con muestras
que contienen pequeas cantidades de los componentes de las soluciones amortiguadoras, tales como sales y urea, y por lo
general necesitan entre 5 y 10 mg de muestra de protena por anlisis. Las dems tcnicas de aminocidos generalmente involucran la derivatizacin precolumna de los aminocidos libres (p.ej., isotiocianato de fenilo; carbamato de 6-aminoquinolil-Nhidroxisuccinimidilo u o-ftalaldehdo; cloruro de (dimetilamino)azobencensulfonilo; 9-fluorenil-metilcloroformiato; y 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) seguida de HPLC en fase reversa. Las tcnicas de derivatizacin precolumna son muy sensibles y por lo general necesitan entre 0,5 y 1,0 mg de la muestra de protena por anlisis, aunque pueden ser influenciadas por
sales amortiguadoras presentes en las muestras. Las tcnicas de derivatizacin precolumna tambin pueden producir mltiples
derivados de un aminocido dado, lo cual complica la interpretacin de los resultados. Las tcnicas de derivatizacin postcolumna generalmente estn menos influenciadas por variaciones en el desempeo de la valoracin que las tcnicas de derivatizacin precolumna.
Se pueden usar los siguientes Mtodos para el anlisis cuantitativo de aminocidos. Los instrumentos y reactivos para estos
procedimientos estn disponibles comercialmente. Adems, existen muchas modificaciones de estas metodologas con diferentes preparaciones de reactivos, procedimientos de reaccin y sistemas cromatogrficos. Los parmetros especficos pueden variar segn los equipos y procedimientos usados. Muchos laboratorios usan ms de una tcnica de anlisis de aminocidos para
aprovechar las ventajas de cada una. En cada uno de estos Mtodos, la seal analgica se visualiza mediante un sistema de
captacin de datos y las reas de los picos se integran con fines de cuantificacin.
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Mtodo 1Principio General de Deteccin Postcolumna con Ninhidrina

La cromatografa de intercambio inico con deteccin postcolumna con ninhidrina es uno de los mtodos ms comnmente usados para el anlisis cuantitativo de aminocidos. Por lo general, se emplea un sistema de intercambio catinico a base de
Li para el anlisis de muestras fisiolgicas ms complejas y un sistema de intercambio catinico a base de Na, que es ms rpido, para mezclas de aminocidos ms simples obtenidas de hidrolizados proteicos (que tpicamente contienen 17 aminocidos). La separacin de los aminocidos en una columna de intercambio inico se logra a travs de una combinacin de cambios en el pH y en la fuerza catinica. A menudo se emplea un gradiente de temperatura para mejorar la separacin.
Cuando el aminocido reacciona con la ninhidrina, el reactante adquiere un color prpura o amarillo caracterstico. Los aminocidos, a excepcin de los iminocidos, dan un color prpura y muestran mxima absorcin a 570 nm. Los iminocidos,
como por ejemplo la prolina, dan un color amarillo y muestran una absorcin mxima a 440 nm. La reaccin postcolumna
entre la ninhidrina y cada aminocido eluido de la columna se controla a 440 nm y 570 nm, y el cromatograma obtenido se
usa para determinar la composicin de aminocidos.
Se considera que el lmite de deteccin es 10 pmol para la mayora de los derivados de aminocidos, pero es 50 pmol para la
prolina. Se obtiene una respuesta lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlacin superiores a 0,999. Para obtener
buenos datos de composicin, es mejor contar con muestras de ms de 1 mg antes de la hidrlisis para este anlisis de aminocidos de protenas o pptidos.
Mtodo 2Principio General de Deteccin Fluoromtrica Postcolumna con OPA
Mtodo 3Principio General de Derivatizacin Precolumna con PITC

El fenilisotiocianato (PITC) reacciona con los aminocidos para formar derivados de feniltiocarbamilo (PTC) que se pueden
detectar con alta sensibilidad a 254 nm. Por lo tanto, se usa la derivatizacin precolumna de aminocidos con PITC seguida
por separacin por HPLC en fase reversa con deteccin UV para analizar la composicin de aminocidos.
Despus de eliminar el reactivo al vaco, los aminocidos derivatizados se pueden almacenar secos y congelados durante varias semanas sin degradacin significativa. Si la solucin para inyeccin se mantiene fra, no hay prdida perceptible en la respuesta cromatogrfica despus de tres das.
La separacin de los aminocidos-PTC por HPLC en fase reversa con una columna ODS se logra a travs de una combinacin
de cambios en las concentraciones de acetonitrilo y en la fuerza inica de la solucin amortiguadora. Los aminocidos-PTC
eluidos de la columna se controlan a 254 nm.
Se considera que el lmite de deteccin es 1 pmol para la mayora de los derivados aminoacdicos. Se obtiene una respuesta
lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de correlacin superiores a 0,999. Para obtener buenos datos de la composicin,
en este anlisis de aminocidos de protenas o pptidos es mejor contar con una muestra de ms de 500 ng de protena o
pptido antes de la hidrlisis.
Mtodo 4Principio General de Derivatizacin Precolumna con AQC

Se usa la derivatizacin precolumna de aminocidos con 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) y despus
se separan por HPLC en fase reversa con deteccin fluoromtrica.
Captulos
El o-ftalaldehdo (OPA) reacciona con las aminas primarias en presencia de un tiol para formar productos de isoindol altamente fluorescentes. Esta reaccin se utiliza para la derivatizacin postcolumna en el anlisis de aminocidos por cromatografa de intercambio inico. La regla de separacin es la misma que la del Mtodo I. Los instrumentos y reactivos para esta forma
de anlisis de aminocidos estn disponibles comercialmente. Existen muchas modificaciones de este mtodo.
Si bien el OPA no reacciona con aminas secundarias (iminocidos, como por ejemplo la prolina) para formar sustancias fluorescentes, la oxidacin con hipoclorito de sodio permite que las aminas secundarias reaccionen con OPA. El procedimiento
emplea una columna de intercambio catinico fuertemente cida para la separacin de aminocidos libres seguida de una oxidacin postcolumna con hipoclorito de sodio y derivatizacin postcolumna usando OPA y un compuesto tiol, como por ejemplo N-acetil-L-cistena y 2-mercaptoetanol. La derivatizacin de aminocidos primarios no se altera perceptiblemente con el
aporte continuo de hipoclorito de sodio.
La separacin de los aminocidos en una columna de intercambio inico se logra a travs de una combinacin de cambios
en el pH y en la fuerza catinica. Despus de la derivatizacin postcolumna con OPA de los aminocidos eluidos, el reactante
pasa a travs de un detector fluoromtrico. La intensidad de la fluorescencia de los aminocidos derivatizados con OPA se controla con una longitud de onda de excitacin de 348 nm y una longitud de onda de emisin de 450 nm.
Se considera que el lmite de deteccin es de unas pocas decenas de pmol para la mayora de los derivados de aminocidos.
La respuesta es lineal entre unos pocos pmol y unas pocas decenas de nmol. Para obtener buenos datos de composicin en
este anlisis de aminocidos de protenas o pptidos, es mejor contar con muestras de ms de 500 ng antes de la hidrlisis.
USP 38
El AQC reacciona con los aminocidos para formar derivados de urea estables, fluorescentes y no simtricos (aminocidos
AQC) que se pueden someter fcilmente al anlisis por HPLC en fase reversa. Por lo tanto, se usa la derivatizacin precolumna
de aminocidos con AQC seguida de la separacin por HPLC en fase reversa para analizar la composicin de aminocidos.
La separacin de los aminocidos-AQC en una columna ODS se logra a travs de una combinacin de cambios en las concentraciones de acetonitrilo y sal. La deteccin de fluorescencia selectiva de los derivados con una longitud de onda de excitacin de 250 nm y una longitud de onda de emisin de 395 nm permite la inyeccin directa de la mezcla de reaccin sin ninguna interferencia significativa del nico subproducto fluorescente importante del reactivo, la 6-aminoquinolina. El exceso de
reactivo se hidroliza rpidamente (t1/2< 15 segundos) para producir 6-aminoquinolina-N-hidroxisuccinimida y dixido de carbono y despus de 1 minuto no se puede producir ninguna otra derivatizacin.
Las reas de los picos para los aminocidos-AQC esencialmente no cambian durante al menos 1 semana a temperatura ambiente y los derivados tienen ms que suficiente estabilidad para permitir el anlisis cromatogrfico automatizado durante la
noche.
Se considera que el lmite de deteccin est entre aproximadamente 40 fmol y 320 fmol para cada aminocido, a excepcin
de la Cys. El lmite de deteccin para la Cys es aproximadamente 800 fmol. Se obtiene una respuesta lineal entre 2,5 mM y 200
mM con coeficientes de correlacin superiores a 0,999. Se pueden obtener buenos datos de composicin a partir del anlisis de
hidrolizados proteicos derivatizados que contengan tan solo 30 ng de protena o pptido.
Captulos
Mtodo 5Principio General de Derivatizacin Precolumna con OPA

Se usa la derivatizacin precolumna de aminocidos con OPA y luego se separan por HPLC en fase reversa con deteccin
fluoromtrica. Esta tcnica no detecta los aminocidos que existen como aminas secundarias (p.ej., prolina).
El OPA junto con un reactivo tiol reacciona con grupos amino primarios para formar productos isoindlicos altamente fluorescentes. Se puede usar 2-mercaptoetanol y cido 3-mercaptopropinico como tiol. El OPA por s mismo no muestra fluorescencia y por lo tanto no produce picos que interfieren. Adems, su solubilidad y estabilidad en soluciones acuosas, junto con la
rpida cintica de reaccin permiten la derivatizacin y anlisis automatizados usando un muestreador automtico para mezclar la muestra con el reactivo. Sin embargo, la falta de reactividad con aminocidos secundarios ha sido una desventaja importante. Este mtodo no detecta los aminocidos que son aminas secundarias (p.ej., prolina). Para compensar esta desventaja, esta tcnica se puede combinar con la tcnica descrita en el Mtodo 7 o en el Mtodo 8.
A la derivatizacin precolumna de aminocidos con OPA le sigue la separacin por HPLC en fase reversa. Debido a la inestabilidad de los derivados aminocidos-OPA, la separacin y el anlisis por HPLC se realizan inmediatamente despus de la derivatizacin. El cromatgrafo de lquidos est equipado con un detector fluoromtrico para la deteccin de aminocidos derivatizados. La intensidad de fluorescencia de los aminocidos derivatizados con OPA se controla con una longitud de onda de
excitacin de 348 nm y una longitud de onda de emisin de 450 nm.
Se ha informado de lmites de deteccin de slo 50 fmol a travs de fluorescencia, aunque el lmite prctico de anlisis se
mantiene en 1 pmol.
Mtodo 6Principio General de Derivatizacin Precolumna con DABS-Cl

Se usa derivatizacin precolumna de aminocidos con cloruro de (dimetilamino)azobencenosulfonilo (DABS-Cl) y luego se
separan por HPLC en fase reversa con deteccin en la regin de luz visible.
El DABS-Cl es un reactivo cromofrico empleado para marcar aminocidos. Los aminocidos marcados con DABS-Cl (aminocidos-DABS) son muy estables y muestran la mxima absorcin a 436 nm.
Los aminocidos-DABS, los 19 derivados de aminocidos naturales, se pueden separar en una columna ODS de HPLC en fase
reversa empleando sistemas de gradientes constituidos por una mezcla de acetonitrilo y una solucin amortiguadora acuosa.
Los aminocidos-DABS separados que eluyen de la columna se detectan a 436 nm en la regin visible.
Este mtodo puede analizar los iminocidos, como por ejemplo la prolina, junto con los aminocidos, con igual sensibilidad.
El mtodo de derivatizacin con DABS-Cl permite la cuantificacin simultnea de residuos de triptfano mediante hidrlisis
previa de la protena o pptido con cidos sulfnicos, como por ejemplo cido mercaptoetanosulfnico, cido p-toluensulfnico o cido metanosulfnico, descritos en el Mtodo 2 en Hidrlisis de Protenas. Los otros residuos sensibles a los cidos, asparagina y glutamina, tambin se pueden analizar mediante la conversin previa en cido diaminopropinico y cido diaminobutrico, respectivamente, tratando la protena o pptido con BTI, descrito en el Mtodo 11 en Hidrlisis de Protenas.
El aminocido no proteinognico, norleucina, no se puede usar como un estndar interno en este mtodo ya que eluye en
una regin cromatogrfica abundante en picos de aminocidos primarios. La nitrotirosina se puede usar como estndar interno ya que eluye en una regin despejada.
El lmite de deteccin de aminocidos-DABS es aproximadamente 1 pmol. Se pueden analizar cuantitativamente de 2 a
5 pmol de cada aminocido-DABS con confiabilidad y slo se necesitan entre 10 ng y 30 ng del hidrolizado proteico tratado
con DABS para cada anlisis.
USP 38
Mtodo 7Principio General de Derivatizacin Precolumna con FMOC-Cl

Se usa derivatizacin precolumna de aminocidos con cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (FMOC-Cl) y luego se separan por
HPLC en fase reversa con deteccin fluoromtrica.
El FMOC-Cl reacciona con aminocidos primarios y secundarios para formar productos altamente fluorescentes. La reaccin
del FMOC-Cl con aminocidos se realiza bajo condiciones suaves, en solucin acuosa y se completa en 30 segundos. Los derivados son estables y slo se degrada el derivado de histidina. Si bien el FMOC-Cl es fluorescente por s mismo, el exceso de
reactivo y los subproductos fluorescentes se pueden eliminar sin prdida de aminocidos-FMOC.
Los aminocidos FMOC se separan por HPLC en fase reversa usando una columna ODS. La separacin se lleva a cabo mediante elucin por gradiente que vara linealmente de una mezcla de solucin amortiguadora de cido actico, metanol y acetonitrilo (50:40:10) a una mezcla de acetonitrilo y solucin amortiguadora de cido actico (50:50). En estas condiciones, se
separan 20 derivados de aminocidos en 20 minutos. Cada derivado que eluye de la columna se controla a travs de un detector fluoromtrico ajustado a una longitud de onda de excitacin de 260 nm y una longitud de onda de emisin de 313 nm.
El lmite de deteccin se encuentra en el intervalo inferior de fmol. Para la mayora de los aminocidos la respuesta es lineal
entre 0,1 mM y 50 mM.
Mtodo 8Principio General de Derivatizacin Precolumna con NBD-F
CLCULO Y ANLISIS DE DATOS

Cuando se determina el contenido de aminocidos de un hidrolizado de protena o pptido, se debe tener en cuenta que el
paso de hidrlisis cida destruye el triptfano y la cistena. La serina y la treonina se destruyen parcialmente con la hidrlisis
cida, mientras que la isoleucina y la valina podran escindirse slo parcialmente. La metionina puede oxidarse durante la hidrlisis cida y algunos aminocidos (p.ej., glicina y serina) son contaminantes comunes. La aplicacin de un vaco adecuado
(menos de 200 mm de mercurio o 26,7 Pa) o la introduccin de un gas inerte (argn) en la cmara gaseosa del recipiente de
reaccin durante la hidrlisis en fase de vapor puede reducir la destruccin oxidativa. Por lo tanto, los resultados cuantitativos
obtenidos para cistena, triptfano, treonina, isoleucina, valina, metionina, glicina y serina de un hidrolizado de protenas o
pptidos pueden variar y pueden requerir posterior investigacin y consideracin.
Clculos
Porcentaje Molar de los AminocidosEs el nmero de residuos de cada aminocido por cada 100 residuos en una protena. Este resultado puede ser til para evaluar los datos de anlisis de aminocidos cuando se desconoce el peso molecular de
la protena o pptido a investigar. Esta informacin se puede usar para corroborar la identidad de una protena y tiene otras
aplicaciones. Identificar e integrar cuidadosamente los picos obtenidos segn se indica para cada Procedimiento. Calcular el
porcentaje molar de cada aminocido presente en la muestra de prueba, por la frmula:
100rU/r
en donde rU es la respuesta correspondiente al pico, en nmol, del aminocido en anlisis y r es la suma de respuestas correspondientes a los picos, en nmol, de todos los aminocidos presentes en la muestra de prueba. La comparacin entre el porcentaje molar de aminocidos en anlisis y los datos de protenas conocidas puede ayudar a establecer o corroborar la identidad de la protena de muestra.
Muestras de Protenas DesconocidasEsta tcnica de anlisis de datos se puede usar para estimar la concentracin proteica de una muestra de protena desconocida usando los datos de anlisis de aminocidos. Calcular la masa, en mg, de cada
aminocido recuperado, por la frmula:
Captulos
Se usa la derivatizacin precolumna de aminocidos con 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) y despus se separan por HPLC en fase reversa con deteccin fluoromtrica.
El 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) reacciona con aminocidos primarios y secundarios para formar productos
altamente fluorescentes. Los aminocidos se derivatizan con NBD-F calentndolos a 60 durante 5 minutos.
Los derivados aminocidos-NBD se separan en una columna ODS de HPLC en fase reversa empleando un sistema de elucin
por gradiente constituido por una mezcla de acetonitrilo y una solucin amortiguadora acuosa. En estas condiciones se separan 17 derivados de aminocidos en 35 minutos. Se puede usar el cido E-aminocaproico como estndar interno ya que eluye
en una regin cromatogrfica despejada. Cada derivado que eluye de la columna se controla mediante un detector fluoromtrico ajustado a una longitud de onda de excitacin de 480 nm y una longitud de onda de emisin de 530 nm.
La sensibilidad de este mtodo es casi igual que la del mtodo de derivatizacin precolumna con OPA (Mtodo 5), excluyendo la prolina, que no reacciona con el OPA. Esto puede ser una ventaja del NBD-F con respecto al OPA.
El lmite de deteccin para cada aminocido es aproximadamente 10 fmol. El perfil analtico se logra con aproximadamente
1,5 mg de hidrolizado proteico en la mezcla final de reaccin de marcacin precolumna para HPLC.
USP 38
mMW/1000
en donde m es la cantidad recuperada, en nmoles, del aminocido en anlisis; y MW es el peso molecular para ese aminocido,
corregido por el peso de la molcula de agua que se elimin durante la formacin de la unin peptdica. La suma de las masas
de los aminocidos recuperados permite estimar la masa total de la protena analizada despus de corregir adecuadamente
por los aminocidos destruidos parcial o completamente. Si se dispone del peso molecular de la protena desconocida (es decir, por anlisis SDS-PAGE o espectrometra de masas), se puede predecir la composicin de aminocidos de la protena desconocida. Calcular el nmero de residuos de cada aminocido, por la frmula:
Captulos
m/(1000M/MWT)
en donde m es la cantidad recuperada, en nmol, del aminocido en anlisis; M es la masa total, en mg, de la protena; y MWT es
el peso molecular de la protena desconocida.
Muestras de Protenas ConocidasEsta tcnica de anlisis de datos se puede usar para investigar la composicin de aminocidos y la concentracin proteica de una muestra de protena de peso molecular y composicin aminoacdica conocidos
usando los datos de anlisis de aminocidos. Cuando se conoce la composicin de la protena que se est analizando, se puede aprovechar el hecho de que algunos aminocidos se recuperan bien, mientras que la recuperacin de otros aminocidos
puede verse comprometida debido a la destruccin total o parcial (p.ej., triptfano, cistena, treonina, serina, metionina), la
escisin incompleta de uniones (es decir, para isoleucina y valina) y la contaminacin por aminocidos libres (es decir, por glicina y serina).
Los aminocidos que se recuperan mejor representan a la protena y se eligen para cuantificarla. Los aminocidos que se
recuperan bien son, tpicamente, aspartato-asparagina, glutamato-glutamina, alanina, leucina, fenilananina, lisina y arginina.
Esta lista se puede modificar segn la experiencia propia con el sistema de anlisis utilizado. Dividir la cantidad, en nmol, de
cada uno de los aminocidos bien recuperados por el nmero esperado de residuos de ese aminocido con el fin de obtener el
contenido proteico basado en cada aminocido bien recuperado. Promediar los resultados de contenido proteico calculados.
El contenido proteico determinado para cada uno de los aminocidos bien recuperados se debe distribuir uniformemente en
torno a la media. Descartar los valores de contenido proteico para esos aminocidos que se alejan demasiado de la media.
Tpicamente, una variacin mayor de 5% con respecto a la media se considera inaceptable. Recalcular la media del contenido
proteico de los valores restantes para obtener el contenido proteico de la muestra. Dividir el contenido de cada aminocido
por el contenido proteico medio calculado para determinar la composicin de aminocidos de la muestra.
Calcular el error relativo de composicin, en porcentaje, por la frmula:
100m/mS
en donde m es la cantidad determinada experimentalmente, en nmol por residuo aminoacdico, del aminocido en anlisis; y
mS es el valor conocido para los residuos de ese aminocido. El error relativo composicional promedio es el promedio de los
valores absolutos de los errores relativos composicionales de los aminocidos individuales, excluyendo tpicamente el triptfano y la cistena de este clculo. El error relativo composicional promedio puede proporcionar informacin importante acerca
de la estabilidad de los anlisis en funcin del tiempo. La coincidencia en la composicin aminoacdica entre la muestra de
protena y la composicin conocida se puede usar para corroborar la identidad y pureza de la protena en la muestra.
APNDICE
PROCEDIMIENTOS DE ANLISIS DE AMINOCIDOS
Se presentan los ejemplos de procedimientos especficos para cada Mtodo descrito en Metodologas de Anlisis de Aminocidos.
Mtodo 1Deteccin Postcolumna con Ninhidrina

A continuacin se presenta un mtodo para deteccin postcolumna con ninhidrina. Existen muchos otros mtodos, con instrumental y reactivos disponibles comercialmente.
Preparacin de la Fase Mvil
Solucin ATransferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 1,5 mL de cido clorhdrico a un matraz volumtrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar, si fuera necesario, con cido clorhdrico hasta un
pH de 3,0.
Solucin BTransferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio anhidro y 0,7 mL de cido clorhdrico a un matraz volumtrico de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar con cido clorhdrico, si fuera necesario, hasta un
pH de 4,3.
Solucin CPreparar una solucin que contenga 5% de cloruro de sodio, 1,9% de citrato de sodio anhidro y 0,1% de fenol
en agua y ajustar hasta un pH de 6.
USP 38
Mtodo 2Deteccin Fluoromtrica Postcolumna con OPA

A continuacin se presenta un mtodo de deteccin fluoromtrica postcolumna con OPA.
Solucin APreparar una solucin de hidrxido de sodio, cido ctrico y alcohol en agua de grado HPLC con una concentracin de sodio 0,2 N y que contenga 7% de alcohol (p/v), ajustada hasta un pH de 3,2.
Solucin BPreparar una solucin de hidrxido de sodio y cido ctrico en agua de grado HPLC con una concentracin de
sodio 0,6 N, ajustada a un pH de 10,0.
Solucin C: hidrxido de sodio 0,2 N.
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A, Solucin B y Solucin C segn se indica en Sistema Cromatogrfico.
Preparacin de Reactivo Postcolumna
Solucin Amortiguadora AlcalinaPreparar una solucin que contenga carbonato de sodio 384 mM, cido brico 216 mM y
sulfato de potasio 108 mM y ajustar hasta un pH de 10,0.
Reactivo de HipocloritoAgregar 0,4 mL de una solucin de hipoclorito de sodio (10% de cloro) a 1 L de la Solucin Amortiguadora Alcalina. [NOTALa solucin de hipoclorito es estable durante 2 semanas.]
Reactivo OPATransferir 2 g de N-acetil-L-cistena y 1,6 g de OPA a un matraz volumtrico de 15 mL, disolver con alcohol,
diluir a volumen con alcohol y mezclar. Transferir esta solucin y 4 mL de una solucin acuosa al 10% de ter laurlico de polioxietileno (23) a un matraz volumtrico de 1 L, diluir con 980 mL de Solucin Amortiguadora Alcalina y mezclar.
Sistema CromatogrficoEquipar el cromatgrafo de lquidos con un detector fluoromtrico ajustado a una longitud de
onda de excitacin de 348 nm y una longitud de onda de emisin de 450 nm y con una columna de 4,0 mm 150 mm rellena con material L17 de 7,5 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 0,3 mL por minuto y la temperatura de la columna se ajusta a 50. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con Solucin A; durante los siguientes 20
minutos, cambiar linealmente la composicin de la Fase Mvil a 85% de Solucin A y 15% de Solucin B; luego cambiar abruptamente a 40% de Solucin A y 60% de Solucin B; durante los siguientes 18 minutos, cambiar linealmente la composicin a
100% de Solucin B y mantenerla durante 7 minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de Solucin C y mantenerla durante 6 minutos; luego cambiar abruptamente a la Solucin A, mantener esta composicin durante los siguientes 8 minutos.
Procedimiento y Reaccin PostcolumnaInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminocido
en anlisis y proceder segn se indica en el Sistema Cromatogrfico. Cuando el efluente deja la columna, se mezcla con el
Reactivo de Hipoclorito. La mezcla pasa a travs del primer reactor postcolumna que es un tubo de acero inoxidable de 0,5 mm
2 m. Inmediatamente a continuacin del primer reactor postcolumna se coloca un segundo reactor postcolumna de diseo
similar que se usa para la reaccin postcolumna con OPA. La velocidad de flujo tanto para el Reactivo de Hipoclorito como para
el Reactivo OPA es 0,2 mL por minuto, dando como resultado una velocidad de flujo total (es decir, Reactivo de Hipoclorito,
Captulos
Solucin Regeneradora de la ColumnaPreparar una solucin que contenga 0,8% de hidrxido de sodio en agua y ajustar
hasta un pH de 13.
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A, Solucin B y Solucin C segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
Reactivo PostcolumnaTransferir aproximadamente 18 g de ninhidrina y 0,7 g de hidrindantina a 900 mL de una solucin
que contenga 76,7% de dimetil sulfxido, 0,7% de acetato de litio dihidrato y 0,1% de cido actico y mezclar durante un
mnimo de 3 horas bajo un gas inerte, como por ejemplo nitrgeno. [NOTAEste reactivo es estable durante 30 das si se
mantiene a una temperatura entre 2 y 8 bajo un gas inerte.]
Solucin AmortiguadoraPreparar una solucin que contenga 2% de citrato de sodio anhidro, 1% de cido clorhdrico,
0,5% de tiodiglicol y 0,1% de cido benzoico en agua y ajustar hasta un pH de 2.
Sistema CromatogrficoEquipar un cromatgrafo de lquidos con un detector con filtros de interferencia apropiados a
440; 570 690 nm y una columna de 4,0 mm 120 mm rellena con copolmero sulfonado de estireno-divinilbenceno de 7,5
mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 14 mL por hora. Programar el sistema del siguiente modo. Inicialmente,
equilibrar la columna con Solucin A; a los 25 minutos, cambiar la composicin de la Fase Mvil a 100% de Solucin B; y a los
37 minutos, cambiar la composicin al 100% de Solucin C. A los 75 minutos de la corrida, eluye el ltimo aminocido de la
columna y se regenera la columna con la Solucin Regeneradora de la Columna durante 1 minuto. Equilibrar luego la columna
con Solucin A durante 11 minutos antes de la siguiente inyeccin. Programar la temperatura de la columna del siguiente modo. La temperatura inicial es 48; despus de 11,5 minutos, aumentar la temperatura a 65 a una velocidad de 3 por minuto;
aproximadamente a los 35 minutos, aumentar la temperatura a 77 a una velocidad de 3 por minuto; y finalmente aproximadamente a los 52 minutos, disminuir la temperatura a 48 a una velocidad de 3 por minuto.
Procedimiento y Reaccin PostcolumnaReconstituir el hidrolizado proteico o peptdico liofilizado en la Solucin Amortiguadora, inyectar una cantidad adecuada en el cromatgrafo y proceder segn se indica en Sistema Cromatogrfico. Cuando
los aminocidos eluyen de la columna, se mezclan con el Reactivo Postcolumna, que se suministra a una velocidad de flujo de
7 mL por hora, a travs de una llave T. Despus de mezclar, el efluente de la columna y el Reactivo Postcolumna pasan a travs
de un reactor tubular a una temperatura de 135, donde se forma un color prpura o amarillo caracterstico. Desde el reactor,
el lquido pasa a travs de un colormetro con una cubeta de flujo de 12 mm. La luz que emerge de la cubeta se divide en tres
haces que son analizados por el detector con filtros de interferencia a 440; 570 690 nm. La seal de 690 nm se puede restar
electrnicamente de las otras seales para obtener mejores relaciones seal-ruido. Las seales de 440 nm (iminocidos) y de
570 nm (aminocidos) se pueden sumar para simplificar el manejo de datos.
USP 38
Reactivo OPA y el efluente de la columna) de 0,7 mL por minuto que sale de los reactores posteriores al paso por la columna.
Las reacciones postcolumna se realizan a 55. Esto produce un tiempo de permanencia de aproximadamente 33 segundos en
el reactor postcolumna con OPA. Despus de la derivatizacin postcolumna, el efluente pasa a travs del detector fluoromtrico.
Captulos
Mtodo 3Derivatizacin Precolumna con PITC

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con PITC.
Solucin A: acetato de amonio 0,05 M, ajustado con cido fosfrico a un pH de 6,8.
Solucin BPreparar acetato de amonio 0,1 M, ajustar con cido fosfrico a un pH de 6,8 y luego preparar una mezcla de
esta solucin y acetonitrilo (1:1).
Solucin C: una mezcla de acetonitrilo y agua (70:30).
Fase MvilUsar mezclas variables de la Solucin A, Solucin B y Solucin C segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
Preparacin del Reactivo de Derivatizacin
Solucin Amortiguadora de Acoplamiento: una mezcla de acetonitrilo, piridina, trietilamina y agua (10:5:2:3).
Disolvente de la Muestra: una mezcla de agua y acetonitrilo (7:2).
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraDisolver la muestra de prueba liofilizada en 100 mL de Solucin Amortiguadora de Acoplamiento y luego secar en una centrfuga de vaco para eliminar todo el clorhidrato si se realiz un paso de
hidrlisis de protena. Disolver la muestra de prueba en 100 mL de Solucin Amortiguadora de Acoplamiento, agregar 5 mL de
PITC e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La muestra de prueba se seca nuevamente en una centrfuga de
vaco y se disuelve en 250 mL de Disolvente de la Muestra.
Sistema CromatogrficoEquipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 254 nm y una columna de 4,6 mm
250 mm rellena con material L1 de 5 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de
la columna se mantiene a 52. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la Solucin A; durante los
siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composicin de la Fase Mvil a 85% de Solucin A y 15% de Solucin B; durante
los siguientes 15 minutos, cambiar linealmente la composicin a 50% de Solucin A y 50% de Solucin B; luego cambiar abruptamente a 100% de Solucin C y mantenerla durante 10 minutos; luego cambiar abruptamente a 100% de Solucin A y dejar
que la columna se equilibre antes de la siguiente inyeccin.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 1,0 nmol de cada aminocido-PITC en anlisis (10 mL de la
muestra en el Disolvente de la Muestra) y proceder segn se indica en Sistema Cromatogrfico.
Mtodo 4Derivatizacin de Precolumna con AQC

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con AQC.
Solucin APreparar una solucin de acetato de sodio 140 mM y trietilamina 17 mM y ajustar con cido fosfrico hasta un
pH de 5,02.
Solucin B: una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40).
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A y Solucin B segn se indica en Sistema Cromatogrfico.
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraDisolver aproximadamente 2 mg de la muestra de prueba en 20 mL de
cido clorhdrico 15 mM y diluir con una solucin amortiguadora de borato 0,2 M (pH 8,8) a 80 mL. Iniciar la derivatizacin
agregando 20 mL de AQC 10 mM en acetonitrilo y dejar que prosiga durante 10 minutos a temperatura ambiente.
onda de excitacin de 250 nm, una longitud de onda de emisin de 395 nm y con una columna de 3,9 mm 150 mm rellena
con material L1 de 4 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se
mantiene a 37. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la Solucin A; durante los siguientes 0,5
minutos, cambiar linealmente la composicin de la Fase Mvil a 98% de Solucin A y 2% de Solucin B; luego durante los siguientes 14,5 minutos a 93% de Solucin A y 7% de Solucin B; durante los siguientes 4 minutos a 87% de Solucin A y 13%
de Solucin B; durante los siguientes 14 minutos a 68% de Solucin A y 32% de Solucin B; luego cambiar abruptamente a
100% de Solucin B para un lavado de 5 minutos; durante los siguientes 10 minutos, cambiar abruptamente a 100% de Solucin A y dejar que la columna se equilibre antes de la siguiente inyeccin.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 0,05 nmol de cada aminocido-AQC en anlisis y proceder
segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
Mtodo 5Derivatizacin Precolumna con OPA

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con OPA.
Solucin A: una mezcla de acetato de sodio 100 mM (pH 7,2), metanol y tetrahidrofurano (900:95:5).
USP 38
Mtodo 6Derivatizacin Precolumna con DABS-Cl

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con DABS-Cl.
Solucin A: acetato de sodio 25 mM (pH 6,5) que contenga 4% de dimetilformamida.
Solucin B: acetonitrilo.
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A y de Solucin B segn se indica en Sistema Cromatogrfico.
Solucin Amortiguadora de Muestra: bicarbonato de sodio 50 mM ajustado hasta un pH de 8,1.
Reactivo de DerivatizacinDisolver 1,3 mg de DABS-Cl en 1 mL de acetonitrilo. [NOTAEste reactivo se prepara poco antes
del paso de derivatizacin.]
Solucin Amortiguadora de Dilucin de la MuestraPreparar una mezcla de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) y alcohol (1:1).
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraDisolver la muestra de prueba en 20 mL de Solucin Amortiguadora de
Muestra, agregar 40 mL de Reactivo de Derivatizacin y mezclar. Sellar el recipiente de la muestra con un tapn de goma de
silicona y calentar a 70 durante 10 minutos. Mientras se calienta la muestra, la mezcla se disuelve completamente. Despus
de la derivatizacin, diluir la muestra de prueba con una cantidad adecuada de Solucin Amortiguadora de Dilucin de la Muestra.
Sistema CromatogrficoEquipar un cromatgrafo de lquidos con un detector a 436 nm y una columna de 4,6 mm
250 mm rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 40. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 85% de Solucin A y 15% de Solucin B; durante los siguientes 20 minutos, cambiar la composicin de la Fase Mvil a 60% de Solucin A y 40% de Solucin B;
durante los siguientes 12 minutos, cambiar la composicin a 30% de Solucin A y 70% de Solucin B y mantener durante 2
minutos ms.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 0,05 nmol de los aminocidos-DABS y proceder segn se
indica en Sistema Cromatogrfico.
Mtodo 7Derivatizacin Precolumna con FMOC-Cl

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con FMOC-Cl.
Preparacin de Fase Mvil
Solucin Amortiguadora de cido ActicoTransferir 3 mL de cido actico glacial y 1 mL de trietilamina a un matraz volumtrico de 1 L y diluir a volumen con agua de grado HPLC. Ajustar con hidrxido de sodio hasta un pH de 4,20.
Solucin A: una mezcla de Solucin Amortiguadora de cido Actico, metanol y acetonitrilo (50:40:10).
Solucin B: una mezcla de acetonitrilo y Solucin Amortiguadora de cido Actico (50:50).
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A y de Solucin B segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
Captulos
Solucin B: metanol.
Fase MvilUsar mezclas variables de Solucin A y de Solucin B segn se indica en Sistema Cromatogrfico.
Reactivo de DerivatizacinDisolver 50 mg de OPA en 1,25 mL de metanol (apto para secuenciacin de protena). Agregar 50 mL de 2-mercaptoetanol y 11,2 mL de borato de sodio 0,4 M (pH 9,5) y mezclar. [NOTAEl reactivo es estable durante
1 semana.]
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraTransferir aproximadamente 5 mL de la muestra de prueba a un recipiente adecuado, agregar 5 mL del Reactivo de Derivatizacin y mezclar. Despus de 1 minuto, agregar no menos de 20 mL de
acetato de sodio 0,1 M (pH 7,0). Usar 20 mL de esta solucin para el anlisis. [NOTASe recomienda usar un estndar interno
(p.ej., norleucina) para el anlisis cuantitativo debido a variaciones potenciales en el volumen del reactivo en la derivatizacin
de la muestra. La derivatizacin de la muestra se realiza de manera automatizada en lnea. Debido a la inestabilidad de los
derivados aminocido-OPA, la separacin y anlisis por HPLC se realizan inmediatamente despus de la derivatizacin.]
onda de excitacin de 348 nm y una longitud de onda de emisin de 450 nm y con una columna de 4,6 mm 75 mm rellena
con material L3 de 3 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,7 mL por minuto y la temperatura de la columna se
mantiene a 37. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 92% de Solucin A y 8% de Solucin B;
durante los siguientes 2 minutos, cambiar la composicin de la Fase Mvil a 83% de Solucin A y 17% de Solucin B y mantener
durante 3 minutos ms; despus durante los siguientes 5 minutos cambiar a 54% de Solucin A y 46% de Solucin B y mantener durante 2 minutos ms; despus durante los siguientes 2 minutos cambiar a 34% de Solucin A y 66% de Solucin B y
mantener durante 1 minuto; despus durante los siguientes 0,3 minutos cambiar a 20% de Solucin A y 80% de Solucin B y
mantener durante 2,6 minutos ms; y finalmente durante 0,6 minutos cambiar a 92% de Solucin A y 8% de Solucin B y mantener durante 0,6 minutos ms.
ProcedimientoInyectar aproximadamente 0,02 nmol de cada derivado aminocido-OPA en anlisis en el cromatgrafo y
proceder segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
USP 38

Solucin Amortiguadora de BoratoPreparar una solucin de cido brico 1 M y ajustar con hidrxido de sodio hasta un pH
de 6,2.
Reactivo FMOC-ClDisolver 155 mg de cloroformiato de 9-fluorenilmetilo en 40 mL de acetona y mezclar.
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraAgregar 0,1 mL de Solucin Amortiguadora de Borato y 0,5 mL de Reactivo FMOC-Cl a 0,4 mL de la muestra de prueba. Despus de aproximadamente 40 segundos, extraer la mezcla con 2 mL de
pentano y luego extraer una vez ms con una nueva porcin de pentano. La solucin acuosa con los derivados de aminocidos queda lista para la inyeccin.
onda de excitacin de 260 nm y una longitud de onda de emisin de 313 nm y con una columna de 4,6 mm 125 mm rellena con material L1 de 3 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,3 mL por minuto. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con Solucin A y mantener esta composicin durante 3 minutos; durante los siguientes 9
minutos, cambiar a 100% de Solucin B; durante los siguientes 0,5 minutos, aumentar la velocidad de flujo a 2 mL por minuto
y mantenerla hasta que el ltimo aminocido-FMOC eluya de la columna. El tiempo total de la corrida es de aproximadamente
20 minutos.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo no menos de 0,01 nmol de cada aminocido-FMOC en anlisis y proceder
segn se indica en el Sistema Cromatogrfico. El derivado histidina-FMOC por lo general dar una respuesta menor que los
dems derivados.
Captulos
Mtodo 8Derivatizacin Precolumna con NBD-F

A continuacin se presenta un mtodo de derivatizacin precolumna con NBD-F.
Solucin A: una solucin de citrato de sodio 10 mM y perclorato de sodio 75 mM, ajustada con cido clorhdrico hasta un
pH de 6,2.
Solucin B: una mezcla de acetonitrilo y agua (50:50).
Solucin Amortiguadora de Muestra: una solucin de cido brico 0,1 M ajustada con hidrxido de sodio a un pH de 9,2.
Reactivo de DerivatizacinDisolver 5 mg de NBD-F en 1,0 mL de alcohol y mezclar.
Procedimiento de Derivatizacin de la MuestraDisolver la muestra de prueba en 20 mL de Solucin Amortiguadora de
Muestra, agregar 10 mL de Reactivo de Derivatizacin y mezclar. Calentar el recipiente de la muestra a 60 durante 5 minutos.
Despus de la derivatizacin, diluir la muestra de prueba con 300 mL de la Solucin A.
onda de excitacin de 480 nm y una longitud de onda de emisin de 530 nm y una columna de 4,6 mm 150 mm rellena
con slice ODS con un tamao de partcula de 5 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 1,0 mL por minuto y la
temperatura de la columna se mantiene a 40. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 94% de
Solucin A y 6% de Solucin B; durante los siguientes 16 minutos, cambiar linealmente la composicin a 63% de Solucin A y
37% de Solucin B; durante los siguientes 5 minutos, cambiar linealmente la composicin a 62% de Solucin A y 38% de Solucin B; durante los siguientes 9 minutos, cambiar linealmente la composicin a 100% de Solucin B y mantener durante otros 5
minutos; finalmente durante 2 minutos, cambiar linealmente la composicin a 94% de Solucin A y 6% de Solucin B y luego
dejar equilibrar la columna antes de la siguiente inyeccin.
ProcedimientoInyectar en el cromatgrafo aproximadamente 15 pmol de cada aminocido-NBD en anlisis y proceder
segn se indica en el Sistema Cromatogrfico.
1053 ELECTROFORESIS CAPILAR

Este captulo proporciona guas y procedimientos utilizados para la caracterizacin de artculos obtenidos por biotecnologa
mediante electroforesis capilar. Se lo ha armonizado con los captulos correspondientes en la Farmacopea Japonesa (JP) y la
Farmacopea Europea (EP). Tambin se muestran otras pruebas de caracterizacin armonizadas en Artculos Obtenidos por BiotecnologaAnlisis de Aminocidos 1052, Artculos Obtenidos por BiotecnologaIsoelectroenfoque 1054, Artculos Obtenidos por
BiotecnologaMapeo de Pptidos 1055, Artculos Obtenidos por BiotecnologaElectroforesis en Gel de Poliacrilamida 1056 y
Artculos Obtenidos por BiotecnologaValoracin de Protenas Totales 1057.
INTRODUCCIN
La electroforesis capilar es un mtodo fsico de anlisis basado en la migracin, dentro de un capilar, de analitos cargados
disueltos en una solucin de electrolitos, bajo la influencia de un campo elctrico de corriente continua. En esta seccin se
USP 38
Informacin General / 1053 Electroforesis Capilar 1027
describen cuatro mtodos de electroforesis capilar: Electroforesis Capilar de Zona, Electroforesis Capilar en Gel, Isoelectroenfoque
Capilar y Cromatografa Electrocintica Micelar.
PRINCIPIOS GENERALES
La velocidad de migracin del analito en un campo elctrico de intensidad E est determinada por la movilidad electrofortica del analito y la movilidad electroosmtica de la solucin amortiguadora dentro del capilar. La movilidad electrofortica de
un soluto (mep) depende de las caractersticas del soluto (carga elctrica, tamao molecular y forma) y de las caractersticas de
la solucin amortiguadora en donde ocurre la migracin (tipo y fuerza inica del electrolito, pH, viscosidad y aditivos). La velocidad electrofortica (vep) de un soluto, suponiendo una forma esfrica, es la siguiente:
en donde q es la carga efectiva del soluto; h es la viscosidad de la solucin electroltica; r es el radio de Stoke del soluto; V es el
voltaje aplicado; y L es la longitud total del capilar.
Cuando se aplica un campo elctrico a travs del capilar lleno con solucin amortiguadora, se genera un flujo de disolvente
dentro del capilar que se denomina flujo electroosmtico. Su velocidad depende de la movilidad electroosmtica (meo) que a su
vez depende de la densidad de la carga en la pared interna del capilar y de las caractersticas de la solucin amortiguadora. La
velocidad electroosmtica (veo) est dada por la ecuacin:
v = vep + veo
La movilidad electrofortica del analito y la movilidad electroosmtica pueden actuar en la misma direccin o en direcciones
opuestas, dependiendo de la carga del soluto. En electroforesis capilar normal, los aniones migrarn en la direccin opuesta al
flujo electroosmtico y sus velocidades sern menores que la velocidad electroosmtica. Los cationes migrarn en la misma
direccin del flujo electroosmtico y sus velocidades sern mayores que la velocidad electroosmtica. Bajo condiciones en las
cuales hay una velocidad electroosmtica rpida con respecto a la velocidad electrofortica de los solutos, tanto los cationes
como los aniones se pueden separar en la misma corrida. El tiempo (t) que tarda el soluto en migrar la distancia (l) desde el
extremo de inyeccin del capilar al punto de deteccin (longitud efectiva del capilar) es el siguiente:
en donde los otros trminos son los definidos anteriormente.

En general, los capilares de slice fundida sin recubrimiento con un pH por encima de 3 tienen carga negativa debido a los
grupos silanol ionizados en la pared interna. Por consiguiente, el flujo electroosmtico va del nodo al ctodo. El flujo electroosmtico debe mantenerse constante de corrida a corrida para obtener una buena reproducibilidad en la velocidad de migracin de los solutos. Para algunas aplicaciones, puede ser necesario reducir o suprimir el flujo electroosmtico modificando la
pared interna del capilar o cambiando la concentracin, la composicin y/o el pH de la solucin amortiguadora.
Despus de la introduccin de la muestra dentro del capilar, cada in del analito de la muestra migra dentro del electrolito
de fondo como una zona independiente de acuerdo con su movilidad electrofortica. La dispersin de la zona, o sea el extendido de cada banda de soluto es el resultado de fenmenos diferentes. En condiciones ideales, el ensanchamiento de la zona
del soluto se debe solamente a la difusin molecular del soluto a lo largo del capilar (difusin longitudinal). En este caso ideal,
la eficiencia de la zona, expresada como el nmero de platos tericos (N), est dada por:
en donde D es el coeficiente de difusin molecular del soluto en la solucin amortiguadora.

En la prctica, otros fenmenos, como por ejemplo la disipacin de calor, la adsorcin de la muestra en la pared del capilar,
las diferencias de conductividad entre la muestra y la solucin amortiguadora, la longitud de la zona de inyeccin, el tamao
de celda del detector y los recipientes de solucin amortiguadora no nivelados, pueden contribuir significativamente a la dispersin de banda. La separacin entre dos bandas (expresada por la resolucin, RS) se puede obtener modificando la movilidad
electrofortica de los analitos, la movilidad electroosmtica inducida por el capilar y aumentando la eficiencia para la banda de
cada analito del siguiente modo:
Captulos
en donde e es la constante dielctrica de la solucin amortiguadora; z es el potencial zeta de la superficie del capilar; y los
otros trminos son los definidos anteriormente.
La velocidad del soluto (v) est dada por la ecuacin:
1028 1053 Electroforesis Capilar / Informacin General
USP 38
en donde mepa y mepb son las movilidades electroforticas de los dos analitos a separar; mep es la movilidad electrofortica promedio de los dos analitos calculada como:
mep = 1/2 (mepb + mepa)
Captulos
APARATO
Un aparato de electroforesis capilar se compone de una fuente de alimentacin de corriente continua (directa) regulable, de
alto voltaje; dos recipientes para las soluciones amortiguadoras que se mantienen en el mismo nivel y que contienen las soluciones andica y catdica especificadas; dos conjuntos de electrodos (ctodo y nodo) sumergidos en los recipientes de las
soluciones amortiguadoras y conectados a la fuente de alimentacin; un capilar de separacin, generalmente de slice fundida,
a veces con una ventana de visualizacin ptica alineada con el detector, dependiendo del tipo de detector, con los extremos
del capilar ubicados en los recipientes de las soluciones amortiguadoras y el capilar lleno con una solucin que se especifica en
la monografa correspondiente; un sistema de inyeccin adecuado; un detector capaz de monitorear la cantidad de sustancia
de inters que pasa a travs de un segmento del capilar de separacin en un tiempo dado, generalmente basado en la espectrofotometra de absorcin (UV y visible), fluorometra, o deteccin conductimtrica, amperomtrica o espectromtrica de masas, dependiendo de las aplicaciones especficas, o incluso en la deteccin indirecta para detectar compuestos no fluorescentes
y que no absorben luz UV; un sistema termosttico capaz de mantener una temperatura constante dentro del capilar, recomendada para obtener una buena reproducibilidad de separacin; un registrador y un integrador apropiado o una computadora.
La definicin del proceso de inyeccin y su automatizacin son crticos para realizar anlisis cuantitativos precisos. Los modos de inyeccin incluyen la inyeccin por gravedad, presin o vaco o la inyeccin electrocintica. La cantidad de cada componente de muestra introducida electrocinticamente depende de su movilidad electrofortica, lo cual lleva a una posible discriminacin al usar este modo de inyeccin.
Se espera que el capilar, las soluciones amortiguadoras, el mtodo de preacondicionamiento, la solucin muestra y las condiciones de migracin estn especificadas en la monografa correspondiente. La solucin electroltica empleada se filtra para
eliminar partculas y desgasificar para evitar la formacin de burbujas que pueden interferir con el sistema de deteccin o interrumpir el contacto elctrico en el capilar durante la corrida de separacin. Para lograr un tiempo de migracin reproducible
de los solutos, es necesario desarrollar, para cada mtodo analtico, una rutina de enjuague riguroso despus de cada inyeccin.
ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA

Principio
En la electroforesis capilar de zona, los analitos se separan en un capilar que contiene nicamente una solucin amortiguadora sin ningn medio anticonvectivo. En esta tcnica, la separacin ocurre debido a que los distintos componentes de la
muestra migran como bandas discretas con velocidades diferentes. La velocidad de cada banda depende de la movilidad electrofortica del soluto y del flujo electroosmtico en el capilar (ver Principios Generales). Se pueden usar capilares recubiertos
para aumentar la capacidad de separacin de las sustancias que se adsorben en las superficies de slice fundida.
Este mtodo de electroforesis capilar es apropiado para el anlisis de molculas pequeas (PM < 2000) y grandes (2000 <
PM < 100 000). Debido a la alta eficiencia lograda en la electroforesis capilar de zona se puede efectuar la separacin de molculas que presenten diferencias mnimas en su relacin carga-masa. Este modo de separacin tambin permite la separacin
de compuestos quirales por adicin de selectores quirales a la solucin amortiguadora de separacin.
Optimizacin
La optimizacin de la separacin es un proceso complejo en el que diversos parmetros de separacin pueden desempear
un papel importante. Los principales parmetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los parmetros instrumentales y de la solucin electroltica.
Parmetros Instrumentales
VoltajeUn grfico de calentamiento de Joule es til para optimizar el voltaje aplicado y la temperatura de la columna. El
tiempo de separacin es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje empleado puede producir calor excesivo, dando lugar a un aumento de temperatura y, como resultado, a gradientes de viscosidad en la
solucin amortiguadora dentro del capilar, lo cual ensancha las bandas y disminuye la resolucin.
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PolaridadLa polaridad del electrodo puede ser normal (el nodo en la entrada y el ctodo en la salida) y el flujo electroosmtico se mover hacia el ctodo. Si la polaridad del electrodo se invierte, el flujo electroosmtico queda lejos de la salida y
solo los analitos cargados con movilidades electroosmticas mayores que el flujo electroosmtico pasarn hacia la salida.
TemperaturaEl principal efecto de la temperatura se observa en la viscosidad y conductividad elctrica de la solucin
amortiguadora afectndose, por lo tanto, la velocidad de migracin. En algunos casos, un aumento en la temperatura del capilar puede alterar la conformacin de algunas protenas, modificando su tiempo de migracin y eficiencia de separacin.
CapilarLa longitud y dimetro interno del capilar afectan el tiempo de anlisis, la eficiencia de las separaciones y la capacidad de carga. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total permiten disminuir los campos elctricos, a un voltaje
constante, lo cual aumenta el tiempo de migracin. Para una solucin amortiguadora y un campo elctrico dados, la disipacin de calor (por lo tanto, el ensanchamiento de banda de la muestra) depende del dimetro interno del capilar. Este ltimo
tambin afecta el lmite de deteccin, dependiendo del volumen de muestra inyectado en el capilar y del sistema de deteccin
usado.
La adsorcin de los componentes de la muestra en la pared del capilar limita la eficiencia; por lo tanto, hay que considerar
mtodos para evitar estas interacciones cuando se desarrolla un mtodo de separacin. En el caso especfico de las protenas,
se han diseado varias estrategias para evitar la adsorcin en la pared capilar. Algunas de estas estrategias (uso de pH extremo
y adsorcin de aditivos amortiguadores cargados positivamente) slo necesitan la modificacin de la composicin del amortiguador del pH para evitar la adsorcin de las protenas. Otras estrategias incluyen el recubrimiento de la pared interna del
capilar con un polmero unido covalentemente a la slice lo cual evita la interaccin entre las protenas y la superficie de la slice
negativamente cargada. Para este propsito, se consiguen en el mercado capilares listos para el uso con recubrimiento de polmeros hidrfilos neutros, catinicos y aninicos.
Tipo de Solucin Amortiguadora y ConcentracionesLas soluciones amortiguadoras apropiadas para la electroforesis capilar tienen una capacidad amortiguadora adecuada en el intervalo de pH de eleccin y baja movilidad para minimizar la generacin de corriente.
Para minimizar la distorsin de la banda es importante hacer coincidir la movilidad de los iones en la solucin amortiguadora
con la movilidad del soluto siempre que sea posible. Es importante el tipo de disolvente de la muestra empleado para lograr el
enfoque de la muestra en la columna, lo que aumenta la eficiencia de separacin y mejora la deteccin. Adems, el aumento
en la concentracin de las soluciones amortiguadoras a un pH dado disminuye el flujo electroosmtico y la velocidad del soluto.
pH de la Solucin AmortiguadoraEl pH de la solucin amortiguadora puede afectar la separacin al modificar la carga
del analito o aditivos y al cambiar el flujo electroosmtico. Para la separacin de protenas y pptidos, un cambio en el pH de
la solucin amortiguadora desde un valor superior al punto isoelctrico a un valor inferior al punto isoelctrico cambia la carga
neta del soluto de negativa a positiva. Un aumento en el pH de la solucin amortiguadora generalmente aumenta el flujo electroosmtico.
Disolventes OrgnicosLos modificadores orgnicos, como por ejemplo el metanol, el acetonitrilo y otros, se pueden
agregar a la solucin amortiguadora acuosa para aumentar la solubilidad del soluto o de otros aditivos o para afectar el grado
de ionizacin de los componentes de la muestra. Estos modificadores orgnicos agregados a la solucin amortiguadora suelen
disminuir el flujo electroosmtico.
Aditivos para Separaciones QuiralesPara separar ismeros pticos, se agrega un selector quiral a la solucin amortiguadora de separacin. Los selectores quirales ms comnmente usados son las ciclodextrinas, aunque en algunos casos se pueden usar teres corona, algunos polisacridos o incluso protenas. Como el reconocimiento quiral depende de las distintas interacciones entre el selector quiral y cada uno de los enantimeros, la resolucin lograda para los compuestos quirales depende
en gran medida del tipo de selector quiral usado. Mientras se desarrolla una separacin dada, puede ser til analizar las ciclodextrinas que tengan distintos tamaos de cavidad (a, b o g-ciclodextrina) o ciclodextrinas modificadas con grupos neutros
(metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.) o grupos ionizables (aminometilo, carboximetilo, sulfobutilter, etc.). Al usar ciclodextrinas
modificadas se deben tener en cuenta las variaciones de una partida a otra en el grado de sustitucin de las ciclodextrinas,
puesto que eso influir en la selectividad. La resolucin en la separacin de compuestos quirales tambin est controlada por la
concentracin del selector quiral, la composicin y el pH de la solucin amortiguadora y la temperatura de separacin. Los
aditivos orgnicos, como por ejemplo el metanol o la urea, tambin pueden afectar la resolucin de la separacin.
ELECTROFORESIS CAPILAR EN GEL

En la electroforesis capilar en gel, la separacin ocurre dentro de un capilar lleno con un gel que acta como un tamiz molecular. Las molculas con relaciones carga a masa similares se separan de acuerdo con el tamao molecular dado que las molculas ms pequeas se mueven ms libremente a travs de la red del gel y, por lo tanto, migran ms rpido que las molculas
ms grandes. De esa forma, las diferentes macromolculas biolgicas (por ejemplo, las protenas y los fragmentos de ADN),
que a menudo tienen relaciones carga a masa similares se pueden separar por electroforesis capilar en gel de acuerdo con su
masa molecular.
Captulos
Parmetros de la Solucin Electroltica
USP 38
Captulos
Caractersticas de los Geles

En electroforesis capilar se usan dos tipos de geles: los geles recubiertos permanentemente y los geles recubiertos dinmicamente. Los geles recubiertos permanentemente se preparan dentro del capilar por polimerizacin de monmeros. Un ejemplo
de dicho gel es una poliacrilamida entrecruzada. Este tipo de gel generalmente est unido a la pared de slice fundida y no se
puede eliminar sin destruir el capilar. Para el anlisis de protenas bajo condiciones reductoras, la solucin amortiguadora de
separacin, por lo general, contiene dodecilsulfato de sodio, y la muestra se desnaturaliza por calor en una mezcla de dodecilsulfato de sodio y 2-mercaptoetanol o ditiotreitol antes de la inyeccin. Cuando se emplean condiciones no reductoras (por
ejemplo, durante el anlisis de un anticuerpo intacto), no se utilizan 2-mercaptoetanol y ditiotreitol. La optimizacin de la separacin en un gel entrecruzado se obtiene modificando la solucin amortiguadora de separacin (ver Electroforesis Capilar de
Zona) y controlando la porosidad del gel durante la preparacin del mismo. Para geles de poliacrilamida entrecruzados, la porosidad se puede modificar cambiando la concentracin de acrilamida y/o la relacin del agente de entrecruzamiento. Como
regla general, al disminuir la porosidad del gel se reduce la movilidad de los solutos. Debido a la rigidez de este tipo de gel,
slo se puede usar la inyeccin electrocintica.
Los geles recubiertos dinmicamente son polmeros hidrfilos (es decir, poliacrilamida lineal, derivados de celulosa, dextrano, etc.) que se pueden disolver en soluciones amortiguadoras acuosas de separacin, dando lugar a un medio de separacin
que tambin acta como tamiz molecular. Estos medios de separacin polimricos son ms fciles de preparar que los polmeros entrecruzados. Se pueden preparar en un vial y llenar por presin en un capilar de pared recubierta sin flujo electroosmtico. Si se reemplaza el gel antes de cada inyeccin generalmente mejora la reproducibilidad de la separacin. La porosidad de
los geles recubiertos dinmicamente se puede aumentar usando polmeros de una masa molecular mayor (a una concentracin de polmero dada) o disminuyendo la concentracin de polmero (para una masa molecular de polmero dada.) Al disminuir la porosidad del gel se reduce la movilidad del soluto para la misma solucin amortiguadora. Se pueden usar tcnicas de
inyeccin hidrodinmica y electrocintica ya que la disolucin de estos polmeros en la solucin amortiguadora produce soluciones de baja viscosidad.
ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
Principio
En isoelectroenfoque las molculas migran bajo la influencia del campo elctrico, siempre y cuando estn cargadas, en un
gradiente de pH generado por anfolitos que tienen un intervalo amplio de valores de pI (cidos poliaminocarboxlicos) disueltos en la solucin amortiguadora de separacin.
Los tres pasos bsicos en el isoelectroenfoque capilar son la carga de la muestra, el enfoque y la movilizacin.
CARGA
Se pueden emplear dos mtodos.

Carga en un Solo PasoLa muestra se mezcla con anfolitos y se introduce en el capilar por presin o vaco.
Carga SecuencialSe introducen en el capilar una solucin amortiguadora inicial, luego los anfolitos, luego la muestra
mezclada con anfolitos, otra vez los anfolitos solos y finalmente la solucin amortiguadora final. El volumen de la muestra debe
ser suficientemente pequeo como para no modificar el gradiente de pH.
ENFOQUE
Cuando se aplica voltaje, los anfolitos migran hacia el ctodo o el nodo segn su carga neta, creando un gradiente de pH
desde el nodo (menor pH) al ctodo (mayor pH). Durante este paso los componentes a separar migran hasta que alcanzan el
pH correspondiente a su punto isoelctrico y la corriente cae a valores muy bajos.
MOVILIZACIN
Si se requiere movilizacin para la deteccin, usar uno de los siguientes mtodos. Se cuenta con tres mtodos.
Mtodo 1La movilizacin se consigue durante el Enfoque, bajo la influencia del flujo electroosmtico cuando este flujo es
suficientemente pequeo para permitir el enfoque de los componentes.
Mtodo 2La movilizacin se consigue por aplicacin de presin positiva despus del Enfoque.
Mtodo 3La movilizacin se consigue despus del Enfoque, agregando sales al recipiente del ctodo o del nodo, dependiendo del sentido elegido para la movilizacin, a fin de alterar el pH en el capilar cuando se aplica voltaje. Al cambiar el pH,
las protenas y anfolitos se movilizan hacia el recipiente que contiene las sales agregadas y pasan por el detector.
La separacin lograda se expresa como DpI y depende del gradiente de pH (dpH/dx), el nmero de anfolitos que tienen
valores de pI diferentes, el coeficiente de difusin molecular (D), la intensidad del campo elctrico (E) y la variacin de la movilidad electrofortica del analito en funcin del pH (dm/dpH):
USP 38
Optimizacin
Los principales parmetros que se deben considerar en el desarrollo de las separaciones son los siguientes:
VoltajeEmplear campos altos desde 300 V/cm a 1000 V/cm durante el Enfoque.
CapilarSegn la estrategia de Movilizacin seleccionada (ver ms arriba), el flujo electroosmtico se debe reducir o eliminar. Los capilares recubiertos tienden a reducir el flujo electroosmtico.
SolucionesEl recipiente con el amortiguador correspondiente al nodo se llena con una solucin de pH ms bajo que el
pI del anfolito ms cido y el recipiente del ctodo se llena con una solucin que tiene un pH ms alto que el pI del anfolito
ms bsico. Frecuentemente se usa cido fosfrico para el nodo e hidrxido de sodio para el ctodo.
La adicin de un polmero, como la metilcelulosa, a la solucin del anfolito tiende a suprimir las fuerzas convectivas (si las
hubiese) y el flujo electroosmtico por aumento de la viscosidad. Se dispone comercialmente de anfolitos que abarcan muchos
intervalos de pH, que se pueden mezclar para obtener un intervalo de pH ampliado. Los intervalos de pH ms amplios se usan
para estimar el punto isoelctrico (pI) mientras que los ms estrechos se emplean para mejorar la exactitud. La calibracin se
puede llevar a cabo relacionando el tiempo de migracin con el punto isoelctrico de una serie de marcadores estndar de
protenas. Durante el Enfoque, se puede evitar la precipitacin de protenas en su punto isoelctrico, si fuera necesario, usando
aditivos de amortiguadores como por ejemplo glicerol, agentes tensoactivos, urea o amortiguadores zwiterinicos. Sin embargo, segn las concentraciones, la urea puede desnaturalizar las protenas.
Principio
La separacin se efecta en una solucin electroltica que contiene un agente tensoactivo en una concentracin por encima
de la concentracin micelar crtica (cmc). Las molculas de soluto se distribuyen entre la solucin amortiguadora acuosa y la
fase pseudo-estacionaria compuesta por las micelas segn el coeficiente de particin del soluto. Esta tcnica se puede considerar un hbrido de electroforesis y cromatografa. Es una tcnica que se puede usar para la separacin de solutos neutros o cargados manteniendo la eficiencia, la velocidad y la aptitud del instrumento de electroforesis capilar. Uno de los agentes tensoactivos ms ampliamente usados en CECM es el tensoactivo aninico dodecilsulfato de sodio, aunque se han usado otros
agentes tensoactivos, como por ejemplo las sales de cetiltrimetilamonio tensoactivos catinicos.
El mecanismo de separacin es el siguiente. A pH neutro y alcalino, se genera un flujo electroosmtico fuerte que mueve los
iones de la solucin amortiguadora de separacin hacia el ctodo. Si se usa dodecilsulfato de sodio como agente tensoactivo,
la migracin electrofortica de la micela aninica se produce en el sentido opuesto, hacia el nodo. Como resultado, la velocidad general de migracin de las micelas disminuye en comparacin con el flujo en masa de la solucin electroltica. En el caso
de solutos neutros, como el analito se puede repartir entre la micela y la solucin amortiguadora acuosa y no tiene movilidad
electrofortica, la velocidad de migracin del analito depender nicamente del coeficiente de particin entre la micela y la
solucin amortiguadora acuosa. En el electroferograma, los picos correspondientes a cada soluto sin carga estn siempre entre
el del marcador del flujo electroosmtico y el de la micela; y el tiempo transcurrido entre estos dos picos se denomina ventana
de separacin. Para los solutos con carga elctrica, la velocidad de migracin depende del coeficiente de particin del soluto
entre la micela y la solucin amortiguadora acuosa y de la movilidad electrofortica del soluto en ausencia de micelas.
Dado que el mecanismo de solutos neutros o dbilmente ionizados en CECM es esencialmente cromatogrfico y la migracin del soluto y la resolucin se pueden racionalizar en trminos del factor de retencin del soluto (k), tambin conocido
como cociente de distribucin msica (Dm), que es el cociente entre el nmero de moles de soluto en la micela y los moles en
la fase mvil. Para un compuesto neutro, k es del siguiente modo:
en donde tr es el tiempo de migracin del soluto; t0 es el tiempo de anlisis del soluto no retenido obtenido al inyectar un
marcador de flujo electroosmtico que no entra a la micela (p.ej., metanol); tmc es el tiempo de migracin de la micela medido
al inyectar un marcador de micela, como por ejemplo Sudn III, que migra continuamente asociado con la micela; K es el coeficiente de particin del soluto; VS es el volumen de la fase micelar; y VM es el volumen de la fase mvil.
La resolucin entre dos solutos que migran cerca (RS) es la siguiente:
Captulos
CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR (CECM)
USP 38
en donde N es el nmero de platos tericos para uno de los solutos; a es la selectividad; ka y kb son los factores de retencin
para ambos solutos, respectivamente (kb > ka).
Ecuaciones similares, aunque no idnticas, dan valores de k y RS para solutos con carga elctrica.
Optimizacin
Los principales parmetros a considerar en el desarrollo de separaciones por CECM son los parmetros instrumentales y de la
solucin electroltica.
Captulos
PARMETROS INSTRUMENTALES
VoltajeEl tiempo de separacin es inversamente proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje
podra generar calor excesivo, aumentando los gradientes de temperatura y de viscosidad de la solucin amortiguadora en la
seccin transversal del capilar. Este efecto puede ser significativo con amortiguadores de alta conductividad, como por ejemplo
aquellos que contienen micelas. La disipacin insuficiente del calor ensancha las bandas y disminuye la resolucin.
TemperaturaLas variaciones en la temperatura del capilar afectan el coeficiente de particin del soluto entre la solucin
amortiguadora y las micelas, la concentracin micelar crtica y la viscosidad de la solucin amortiguadora. Estos parmetros
contribuyen al tiempo de migracin de los solutos. El uso de un buen sistema de enfriamiento mejora la reproducibilidad del
tiempo de migracin para los solutos.
CapilarAl igual que en la Electroforesis Capilar de Zona, la longitud y el dimetro interno de los capilares influyen sobre el
tiempo de anlisis y la eficiencia de las separaciones. El aumento de la longitud efectiva y de la longitud total puede disminuir
los campos elctricos, trabajando a un voltaje constante, aumenta el tiempo de migracin y mejora la eficiencia de la separacin. El dimetro interno controla la disipacin de calor, para un amortiguador y campo elctrico dados, y por consiguiente
ensancha las bandas de la muestra.
PARMETROS DE LA SOLUCIN ELECTROLTICA
Tipo de Agente Tensoactivo y ConcentracinEl tipo de agente tensoactivo, al igual que la fase estacionaria en cromatografa, afecta la resolucin ya que modifica la selectividad de la separacin. El log k de un compuesto neutro aumenta linealmente con la concentracin de agente tensoactivo en la fase mvil. Cuando k se acerca al valor de
la resolucin de la CECM alcanza su mximo. La modificacin de la concentracin del agente tensoactivo en la fase mvil cambia la resolucin.
pH de la Solucin AmortiguadoraEl pH no modifica el coeficiente de particin de los solutos no ionizados, pero puede
modificar el flujo electroosmtico en capilares sin recubrimiento. Una disminucin en el pH de la solucin amortiguadora disminuye el flujo electroosmtico y por lo tanto aumenta la resolucin de los solutos neutros en CECM, llevando a un aumento
del tiempo de anlisis.
Disolventes OrgnicosSe pueden agregar modificadores orgnicos (metanol, propanol, acetonitrilo, etc.) a la solucin
electroltica para mejorar la separacin por CECM de compuestos hidrfobos. La adicin de estos modificadores generalmente
disminuye el tiempo de migracin y la selectividad de la separacin. Dado que la adicin de modificadores orgnicos afecta la
concentracin micelar crtica, slo se puede usar una concentracin dada de un agente tensoactivo con un cierto porcentaje
de un modificador orgnico para evitar inhibir o alterar adversamente la micelacin, que dara como resultado la ausencia de
micelas y, por lo tanto, la ausencia de particin. La disociacin de micelas en presencia de un alto conteni

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Especificaciones de Reactivos . . . . . . . . . . . . . 1984

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Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 2058

Soluciones Colorimetricas . . . . . . . . . . . . . 2060

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Gua para los Captulos Generales . . . .

Solubilidades Aproximadas de Artculos de la

Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . xi

Equivalencias de Temperatura . . . . . . . . . . . . 2175

Monografas Oficiales de USP 38, IZ . . . . . . 4207

Indice Combinado de USP 38 y NF 33 . . . . . . . I-1

Gua para los Captulos Generales . . . .

Monografas Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6289

Mision y Prefacio vii

Este apartado brinda informacion

y proporcionar recetas para su preparacion.

As como evolucionan e stas y las ciencias

CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS USPNF

Los captulos generales proporcionan los procedimientos

El Volumen 1 incluye secciones de preliminares (Mision y Prefacio,

incluyen el ndice combinado, as

viii Mision y Prefacio

compendios USPNF o Suplemento. Ver la USP Guideline on Use of

publicado en una publicacion

y se comunican a las partes interesadas mediante su publicacion

Los pesos atomicos

son los recomendados por IUPAC y reflejan la composicion

en equilibrio. Los centros estereogenicos representados con

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